RS65724B1 - Humano antitelo protiv adamts vrste tipa agrekanaze za terapeutike bolesti povezanih sa agrekanazom - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na antitelo protiv humane agrekanaze i njegovu farmaceutsku upotrebu.

STANJE TEHNIKE

[0002] Razgradnja agrekana i naknadna digestija kolagenskih vlakana su centralni put za destrukciju hrskavice kod humanih bolesti zglobova uključujući osteoartritis (OA) i reumatoidni artritis (RA). Razgradnja kolagena se uglavnom vrši pomoću matriksnih metaloproteinaza (MMP) koje razgrađuju kolagen kao što su MMP-1, MMP-8 i MMP-13 [1-3]. S druge strane, smatra se da metaloproteinaze koje razgrađuju agrekan, koje se nazivaju agrekanaze, igraju ključnu ulogu u razgradnji agrekana [4, 5]. Agrekanaze pripadaju porodici gena ADAMTS (dezintegrin i metaloproteinaza sa motivima trombospondina), a poznato je da ADAMTS1, 4, 5, 8, 9 i 15 imaju aktivnost agrekanaze [4, 6]. Nedavne studije koje su koristile ADAMTS4 i ADAMTS5 nokaut miševe su pokazale da ADAMTS5, ali ne ADAMTS4, igra suštinsku ulogu u razgradnji agrekana kod artritisa miševa [7, 8]. Međutim, pošto postoji malo informacija o biohemijskom karakteru, obrascima ekspresije ili strukturama promotora gena ADAMTS4 i ADAMTS5 miša, podaci od nokaut miševa moraju se pažljivo tumačiti i ne treba ih ekstrapolirati na humanu bolest OA i RA [9, 10]. U humanim hondrocitima, ADAMTS4 je inducibilan tretmanom sa citokinima kao što je interleukin-1 (IL-1), ali je ekspresija ADAMTS5 konstitutivna [9, 11-13]. Naša nedavna studija je takođe pokazala da je među vrstama ADAMTS tipa agrekanaze, ADAMTS4 selektivno prekomerno eksprimiran u humanoj osteoartritičnoj hrskavici sa direktnom korelacijom sa stepenom destrukcije hrskavice, dok je ADAMTS5 konstitutivno eksprimiran i u normalnoj i u osteoartritičnoj hrskavici [10]. Ovo sugeriše da je ADAMTS4 glavna agrekanaza u humanoj osteoartritičnoj hrskavici. ADAMTS4 je takođe prekomerno eksprimiran u sinovijalnim ćelijama i zglobnim hondrocitima u RA, što sugeriše učešće ove proteinaze u destrukciju hrskavice RA zglobova. ADAMTS4 i ADAMTS5 mogu digestiraju ne samo agrekan već i druge članove porodice proteoglikana lektika uključujući verzikan i brevikan. Pošto je verzikan glavni proteoglikan u koži i zidu krvnih sudova, njegova destrukcija od strane ADAMTS4 i ADAMTS5 je takođe implicirana u uništavanju tkiva i popravci kože i krvnih sudova u patološkim stanjima kao što su hronični čir i fibroza kože i različiti vaskulitidi, redom. Pored toga, poznato je da tumorske ćelije u multiformnom glioblastomu prekomerno eksprimiraju ADAMTS5, a pretpostavlja se da ADAMTS5 dobijen iz tumorskih ćelija igra ulogu u invaziji cepanjem brevikana [14].

[0003] Postupak prikaza faga je jedna od tehnika prikaza koje su ostvarile in vitro selekciju velike brzine formiranjem korespondencije jedan-na-jedan u obliku čestice faga između funkcionalnog peptida ili proteina i DNK koja ih kodira. Ovaj postupak prikaza faga se primenjuje na selekciju antitela, a mnoga antitela dobijena ovim postupkom su razvijena kao farmaceutski proizvodi [15]. Pored toga, uspostavljen je postupak dobijanja specifičnog antitela kombinacijom biblioteke humanih veštačkih antitela i postupka prikaza faga, a takve postupke su praktikovale više kompanija, o čemu svedoči HuCAL (Human Combinatorial Antibody Library) kompanije MorphoSys.

[0004] WO 2013/109829 se odnosi na izolovane proteine koji se vezuju za antigen, koji sadrže najmanje jedan varijabilni domen imunoglobulina koji je sposoban da se veže za humani ADAMTS4.

[Spisak dokumenata]

[ne-patentni dokumenti]

[0005]

[1] Dahlberg L, Billinghurst RC, Manner P, Nelson F, Webb G, Ionescu M, et al. Selective enhancement of collagenase-mediated cleavage of resident type II collagen in cultured osteoarthritic cartilage and arrest with a synthetic inhibitor that spares collagenase 1 (matrix metalloproteinase 1). Arthritis Rheum.2000; 43: 673-82.

[2] Tortorella MD, Malfait AM, Deccico C, Arner E. The role of ADAM-TS4 (aggrecanase-1) and ADAM-TS5 (aggrecanase-2) in a model of cartilage degradation. Osteoarthritis Cartilage.

2001; 9: 539-52.

[3] Pratta MA, Yao W, Decicco C, Tortorella MD, Liu RQ, Copeland RA, et al. Aggrecan protects cartilage collagen from proteolytic cleavage. J Biol Chem. 2003; 278: 45539-45.

[4] Porter S, Clark IM, Kevorkian L, Edwards DR. The ADAMTS metalloproteinases. Biochem J. 2005; 386: 15-27.

[5] Struglics A, Larsson S, Pratta MA, Kumar S, Lark MW, Lohmander LS. Human osteoarthritis synovial fluid and joint cartilage contain both aggrecanase- and matrix metalloproteinase-generated aggrecan fragments. Osteoarthritis Cartilage.2006;14:101-13.

[6] Okada Y. Proteinases and matrix degradation. In: JHarris ED, Budd RC, Genovese MC, Firestein GS and Sargent JS (ed) Kelley's textbook of Rheumatology Philadelphia: 8th edition, Elsevier Saunders 2008, in press.

[7] Glasson SS, Askew R, Sheppard B, Carito B, Blanchet T, Ma HL, et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature. 2005; 434: 644-8.

[8] Stanton H, Rogerson FM, East CJ, Golub SB, Lawlor KE, Meeker CT, et al. ADAMTS5 is the major aggrecanase in mouse cartilage in vivo and in vitro. Nature.2005; 434: 648-52.

[9] Song RH, Tortorella MD, Malfait AM, Alston JT, Yang Z, Arner EC, et al. Aggrecan degradation in human articular cartilage explants is mediated by both ADAMTS-4 and ADAMTS-5. Arthritis Rheum.2007; 56: 575-85.

[10] Naito S, Shiomi T, Okada A, Kimura T, Chijiiwa M, Fujita Y, et al. Expression of ADAMTS4 (aggrecanase-1) in human osteoarthritic cartilage. Pathol Int.2007; 57: 703-11.

[11] Bau B, Gebhard PM, Haag J, Knorr T, Bartnik E, Aigner T. Relative messenger RNA expression profiling of collagenases and aggrecanases in human articular chondrocytes in vivo and in vitro. Arthritis Rheum.2002; 46: 2648-57.

[12] Moulharat N, Lesur C, Thomas M, Rolland-Valognes G, Pastoureau P, Anract P, et al. Effects of transforming growth factor-beta on aggrecanase production and proteoglycans degradation by human chondrocytes in vitro. Osteoarthritis Cartilage.2004; 12: 296-305.

[13] Hui W, Barksby E, Young DA, Cawston TE, McKie N, Rowan AD. Oncostatin M in combination with tumour necrosis factor alpha induces a chondrocyte membrane-associated aggrecanase that is distinct from ADAMTS aggrecanase-1 or -2. Ann Rheum Dis. 2005; 64: 1624-32.

[14] Nakada M, Miyamori H, Kita D, Takahashi T, Yamashita J, Sato H, Miura R, Yamaguchi Y, Okada Y. Acta Neuropathol 110:239-246, 2005

[15] Rothe, C. et al. J. Mol. Biol.2008; 376:1182-1200 [patentni dokumenti]

[16] WO 2013/109829

REZIME PRONALASKA

TEHNIČKI PROBLEM

[0006] Cilj ovog pronalaska je da obezbedi antitelo protiv humane agrekanaze (posebno antihumano ADAMTS4 antitelo) korisno za profilaksu ili lečenje progresije različitih bolesti predstavljenih artritisom, gde je molekul porodice lektikana, koji je proteoglikan, razložen.

REŠENJE PROBLEMA

[0007] Da bi rešili gore pomenuti problem, ovi pronalazači su proizveli više antitela protiv humane agrekanaze koja se vezuju za humanu agrekanazu. Kao rezultat toga, otkrili su da proizvedena anti-humana ADAMTS4 antitela inhibiraju enzimsku aktivnost humanog ADAMTS4 i mogu sprečiti razgradnju agrekana od strane zglobnih hondrocita koja se javlja kod artritisa. Pored toga, otkrili su da antitelo koje prepoznaje određeni epitop takođe pokazuje unakrsnu reaktivnost sa agrekanazama koje nisu humane ADAMTS4, a takođe može inhibirati njihovu aktivnost. Na osnovu gore navedenih nalaza, sproveli su dalje studije u pokušaju da razviju terapijski lek za bolesti koje predstavlja artritis, pri čemu agrekanaza deluje na destrukciju tkiva, što je rezultiralo završetkom ovog pronalaska.

[0008] Shodno tome, ovaj pronalazak se odnosi na sledeće.

[1] Antitelo koje se specifično vezuje za humani ADAMTS4 na epitopu koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 9 i inhibira aktivnost agrekanaze humanog ADAMTS4 i humanog ADAMTS5.

[2] Antitelo prema [1], koje sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca, pri čemu

varijabilni region lakog lanca sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 3, i

varijabilni region teškog lanca sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 6.

[3] Antitelo prema [2], gde varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 7, a varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8.

[4] Antitelo prema bilo kom od [1] do [3], koje je humano antitelo.

[5] Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od [1] do [4].

[6] Polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kom od [1] do [4].

[7] Vektor koji sadrži polinukleotid prema [6].

[8] Transformant koji sadrži vektor prema [7].

[9] Antitelo prema bilo kom od [1] do [4], za upotrebu u profilaksi ili lečenju artritisa.

[10] Farmaceutska kompozicija prema [5], za primenu u profilaksi ili lečenju artritisa.

POGODAN EFEKAT PRONALASKA

[0009] Prema ovom pronalasku, obezbeđeno je antitelo protiv humane agrekanaze (posebno anti-humano ADAMTS4 antitelo) korisno za profilaksu ili lečenje progresije artritisa.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0010]

Slika 1. Imunoreaktivnost kandidata Fabs sa ADAMTS4 i ADAMTS5, i njihova inhibicija aktivnosti ADAMTS4 agrekanaze. (A) Rekombinantni ADAMTS4 (levo) i ADAMTS5 (desno) (100 ng/svaku traku) prebačeni na PVDF membrane su reagovali sa svakim kandidatom Fab (klon 237-1, 237-5, 237-21, 237-43 ili 237-53), nakon čega sledi imunoblotiranje. (B) Inhibicija aktivnosti ADAMTS4 od strane Fabs. Rekombinantni ADAMTS4 (180 ng) je reagovao sa svakim Fab (klon 237-1, 237-5, 237-21, 237-43 ili 237-53) ili kontrolnim Fab u molarnom odnosu 1:1, a zatim je inkubiran sa agrekanom (100 ug) tokom 16 h na 37°C. Aktivnost agrekanaze ADAMTS4 je procenjena imunoblotiranjem sa antitelom sa antiagrekanskim neoepitopom (NITEGE<392>). TS(-), sam pufer; Fab(-), ADAMTS4 inkubiran bez Fab; Kontrola, kontrola Fab.

Slika 2. Imunoreaktivnost anti-ADAMTS antitela (klon 237-53) sa ADAMTS, ADAM i MMP vrstama. (A) Srebrom obojeni gelovi ADAMTS4, 5 i 1, ADAM10, 12 i 17 i MMP1, 2, 3, 9 i 13. Uzorci (100 ng/traci) su podvrgnuti SDS-PAGE, a gelovi su obojeni kompletom za bojenje sreebrom. (B) Imunoreaktivnost antitela (klon 237-53) sa vrstama ADAMTS, ADAM i MMP. Uzorci preneti na PVDF membrane su imunoblotirani sa klonom anti-ADAMTS antitela 237-53. Imajte na umu da antitelo reaguje sa ADAMTS4 i ADAMTS5, ali ne i sa drugim vrstama ADAMTS, ADAM i MMP.

Slika 3. Analiza mapiranja domena anti-ADAMTS antitela (klon 237-53). (A i B) Imunoreaktivnost antitela sa svakim domenom ADAMTS4. Rekombinantni FLAG/DHFR-obeleženi proteini koji odgovaraju domenu metaloproteinaze (Met), domenu dezintegrina i trombospondina (Dis/TSP), domenu dezintegrina (Dis) ili trombospondinskom (TSP) domenu ADAMTS4 pripremljeni su pomoću PUREfrex. Ovi proteini su imunoblotirani sa anti-FLAG antitelom (pozitivne kontrole; levo) ili klonom antitela 237-53 (desno).

Slika 4. Inhibicija aktivnosti agrekanaze ADAMTS4 i ADAMTS5 anti-ADAMTS antitelom (klon 237-53), i efekat antitela na ekspresiju ADAMTS vrste i aktivnost agrekanaze u IL-1αstimulisanim hondrocitima. (A) Inhibicija aktivnosti agrekanaze ADAMTS4 i ADAMTS5 anti-ADAMTS antitelom (klon 237-53). Rekombinantni ADAMTS proteini su reagovali sa anti-ADAMTS antitelom u molarnim odnosima od 1:0.2-5 (enzim:antitelo) ili kontrolnim normalnim IgG (kontrolni; molarni odnos 1:5), a zatim su inkubirani sa agrekanom. Digestija agrekana je praćena imunoblotingom sa anti-agrekanskim neoepitopskim antitelom (gornjim). Inhibicija je procenjena denzitometrijskom analizom imunoblotova (niži). (B) Efekat antitela (klon 237-53) na ekspresiju iRNK ADAMTS4 i ADAMTS5 i aktivnost agrekanaze u IL-1αstimulisanim hondrocitima. Osteoartritični hondrociti su kultivisani u prisustvu i odsustvu IL-1α i anti-ADAMTS antitela ili kontrolnog normalnog IgG (kontrola). Zatim, ekspresija iRNK ovih ADAMTS vrsta (levo) i aktivnost agrekanaze u kondicioniranom medijumu (desno) su ispitane pomoću RT-PCR i imunoblotinga sa anti-agrekanskim neoepitopskim antitelom, respektivno. GAPDH, kontrola za učitane uzorke.

OPIS PRIMERA IZVOĐENJA

[0011] Ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje ima specifično vezujuće dejstvo za humanu agrekanazu i inhibira agrekanaznu aktivnost agrekanaze.

[0012] Agrekanaza je poznata proteaza koja je član porodice proteina ADAMTS (dezintegrin i metaloproteinaza sa motivima trombospondina) i deluje na i razgrađuje proteoglikan poznat kao agrekan. Agrekanaza obuhvata ADAMTS4, ADAMTS5, ADAMTS1, ADAMTS8, ADAMTS9, ADAMTS15 i slično.

Reprezentativna aminokiselinska sekvenca humanog ADAMTS4 je prikazana u SEQ ID NO: 15,

reprezentativna cDNK sekvenca humanog ADAMTS4 je prikazana u SEQ ID NO: 14, reprezentativna aminokiselinska sekvenca humanog ADAMTS5 je prikazana u SEQ ID NO: 17, i

reprezentativna cDNK sekvenca humanog ADAMTS5 je prikazana u SEQ ID NO: 16.

[0013] Antitelo ovog pronalaska ima specifičnu vezujuću aktivnost za humanu agrekanazu.

[0014] "Humana agrekanaza" znači da sekvenca aminokiselina ili nukleotidna sekvenca agrekanaze ima aminokiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu koja je ista kao ili suštinski ista kao aminokiselinska sekvenca ili nukleotidna sekvenca agrekanaze koja je prirodno eksprimirana kod ljudi. "U suštini isto" znači da aminokiselinska sekvenca ili nukleotidna sekvenca od interesa ima 70% ili više (poželjno 80% ili više, poželjnije 90% ili više, dalje poželjno 95% ili više, najpoželjnije 99% ili više) identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom ili nukleotidnom sekvencom određene agrekanaze koja je prirodno eksprimirana kod ljudi, i ima funkciju određene humane agrekanaze. Biološke vrste koje nisu ljudske, proteini osim agrekanaze, gen i njihovi fragmenti se takođe tumače na isti način.

[0015] „Specifično vezivanje“ antitela za antigen X znači da je afinitet vezivanja antitela za antigen X u reakciji antigen-antitelo veći od afiniteta vezivanja za nespecifičan antigen (npr., albumin goveđeg seruma (BSA)).

[0016] Antitelo ovog pronalaska ima aktivnost da inhibira enzimsku aktivnost humane agrekanaze. Enzimska aktivnost humane agrekanaze posebno označava aktivnost humane agrekanaze da cepa agrekan (npr. humani ili svinjski agrekan). Aktivnost humane agrekanaze za cepanje agrekana može se proceniti inkubacijom svinjskog agrekana i humane agrekanaze na 37°C tokom 16 sati, deglikozilacijom sa hondroitinazom ABC i keratanazom i analizom dobijenog proizvoda reakcije imunoblotiranjem upotrebom antitela sa anti-NITEGE<392>agrekanskim neo-epitopom prema, na primer, postupcima opisanim u Yatabe T, et.al. Ann Rheum Dis. 2009;68:1051-8 i Hashimoto G, et al. J Biol Chem. 2004;279:32483-91.

[0017] Antitelo ovog pronalaska ima specifično vezujuće dejstvo za humani ADAMTS4, i inhibira aktivnost agrekanaze humanog ADAMTS4.

[0018] Antitelo takođe inhibira, pored aktivnosti agrekanaze humanog ADAMTS4, agrekanaznu aktivnost humanog ADAMTS5.

[0019] U ovoj specifikaciji, "antitelo" se koristi kao ono koje obuhvata antitelo pune dužine i bilo koji njegov fragment koji se vezuje za antigen (tj. "deo koji se vezuje za antigen") ili njegov pojedinačni lanac. "Antitelo" se odnosi na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška lanca (H) i dva laka lanca (L), koji su povezani disulfidnom vezom, ili njihov deo koji se vezuje za antigen. Svaki teški lanac je građen od varijabilnog regiona teškog lanca (skraćeno kao VHovde) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca je građen od 3 domena CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac je građen od varijabilnog regiona lakog lanca (koji će biti skraćen kao VLovde) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca je građen od jednog domena CL. VHi VLregioni su dalje podeljeni na regione sa većom varijabilnosti koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR), koji sadrže visoko konzervativnije regione koji se nazivaju okvirni regioni (FR) koji su rasuti u njima. Svaki VHi VLj građen od 3 CDR i 4 FR, koji su poređani sledećim redosledom, tj. FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 od amino terminusa do karboksi terminusa. Varijabilni regioni pomenutog teškog i lakog lanca sadrže vezujuće domene koji stupaju u interakciju sa antigenom. Konstantni region antitela može posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije (npr. efektorske ćelije) imunog sistema i prvu komponentu (C1q) konvencionalnog sistema komplementa.

[0020] U ovoj specifikaciji, "deo koji se vezuje za antigen" antitela se koristi za označavanje jednog ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen (npr., humani ADAMTS4). Pojašnjeno je da funkciju vezivanja antigena antitela vrši fragment antitela pune dužine. Primeri vezujućeg fragmenta uključenog u termin "deo koji se vezuje za antigen" antitela uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment građen od VL, VH, CLi CH1domena, (ii) F(ab')2fragment, dvovalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnom vezom u zglobnom regionu, (iii) Fab' fragment, inherentni Fab koji ima deo zglobnog regiona (videti FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, Paul ed., 3. sup. rd ed. 1993), (iv) Fd fragment građen od VHi CH1domena, (v) Fv fragment građen od VLi VHdomena u jednom kraku antitela, (vi) dAb fragment građen od VHdomena (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), (vii) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) i (viii) nanotelo koje je varijabilni region teškog lanca koji sadrži jedan varijabilni domen i dva konstantna regiona. Dok je VLi VH, koji su dva domena Fv fragmenta, kodirani su različitim genima, mogu biti povezani sintetičkim linkerom da bi se proizveo jedan proteinski lanac od njih rekombinantnim tehnikama, pri čemu, u ovom lancu, VLi VHregioni se sparuju jedni sa drugima da bi formirali monovalentni molekul (poznat kao jednolančani Fv (scFv); videti, na primer, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; i Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Takvo jednolančano antitelo je takođe obuhvaćeno "delom koji se vezuje za antigen" antitela. Takve fragmente antitela dobijaju oni sa uobičajenim iskustvom u ovoj tehnici poznatim konvencionalnim tehnikama, i proveravaju upotrebljivost na isti način kao kod nemodifikovanog antitela.

[0021] Antitelo ovog pronalaska je poželjno monoklonsko antitelo. "Monoklonsko antitelo" se odnosi na pripremu molekula antitela od jednog molekula. Kompozicija monoklonskog antitela pokazuje jednokratnu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop.

[0022] Antitelo ovog pronalaska je poželjno humano antitelo ili humanizovano antitelo. "Humano antitelo" se odnosi na antitelo koje ima varijabilne regione izvedene iz sekvence humanog imunoglobulina klicine linije u okvirima i CDR regionima. Pored toga, kada antitelo sadrži konstantni region, konstantni region takođe potiče od sekvence imunoglobulina humane klicine linije. U ovoj specifikaciji, "humano antitelo" takođe obuhvata čak i varijantu koja uključuje aminokiselinski ostatak koji nije kodiran sekvencom imunoglobulina humane klicine linije (npr. mutacija uvedena nasumičnom ili mutagenezom usmerenom na mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). U ovoj specifikaciji, pored toga, "humanizovano antitelo" se odnosi na antitelo gde je CDR sekvenca izvedena iz klicine linije životinjske vrste koja nije ljudska, kao što je miš, fuzionisana na sekvenci humanog okvira.

[0023] U ovoj specifikaciji, humano antitelo obuhvata "rekonstituisano humano antitelo". Rekonstituisano humano antitelo se odnosi na modifikovano antitelo gde se najmanje jedan CDR sadržan u prvom humanom donorskom antitelu koristi u drugom humanom akceptorskom antitelu, umesto CDR drugog humanog akceptorskog antitela. Poželjno, svih 6 CDR su supstituisani. Još poželjnije, ceo region vezivanja antigena (npr., Fv, Fab ili F(ab')2) prvog humanog donorskog antitela se koristi umesto odgovarajućeg regiona u drugom humanom akceptorskom antitelu. Još poželjnije, Fab region prvog humanog donorskog antitela je operativno vezan za odgovarajući konstantni region drugog humanog akceptorskog antitela da bi se formiralo antitelo pune dužine.

[0024] Rekonstituisano humano antitelo se može proizvesti konvencionalnim genskim rekombinantnim tehnikama otkrivenim u, na primer, EP125023, WO96/02576, gore pomenutom dokumentu 15 i slično. Da budemo specifični, na primer, DNK sekvenca dizajnirana da poveže željeni CDR u donatorskom humanom antitelu i željeni okvirni region (FR) u humanom akceptorskom antitelu je sintetisana PCR postupkom korišćenjem, kao prajmera, nekoliko oligonukleotida proizvedenih tako da imaju region koji se preklapa sa krajnjim regionima i CDR i FR (pogledajte postupak opisan u WO98/13388). Dobijena DNK je povezana sa DNK koja kodira konstantni region humanog antitela ili mutant konstantnog regiona humanog antitela, koji je ugrađen u vektor ekspresije i vektor se uvodi u domaćina da bi omogućio proizvodnju, pri čemu se može dobiti rekonstituisano humano antitelo (videti EP125023, WO96/02576).

[0025] U ovoj specifikaciji, pored toga, humano antitelo obuhvata "veštačko humano antitelo". Veštačko humano antitelo se može proizvesti konvencionalnim tehnikama rekombinacije gena koje su otkrivene u, na primer, gore pomenutom dokumentu 15 i slično.

1

[0026] Antitelo iz ovog pronalaska može takođe uključiti fuzioni protein gde su prethodno pomenuto antitelo i drugi peptid ili protein fuzionisani. Postupak proizvodnje fuzionog proteina uključuje povezivanje polinukleotida koji kodira antitelo ovog pronalaska i polinukleotida koji kodira drugi peptid ili polipeptid da bi odgovarao okviru, uvođenje istog u ekspresioni vektor i omogućavanje njegove ekspresije kod domaćina, kao i tehnike poznate stručnjacima iz date oblasti tehnike da se mogu koristiti. Kao drugi peptid koji se spaja sa antitelom iz ovog pronalaska, poznati peptidi kao što je FLAG (Hopp, T.P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6×His koji se sastoji od šest His (histidinskih) ostataka, 10×His, humanog c-myc fragmenta, VSV-GP fragmenta, p18HIV fragmenta, T7-obeleživača, HSV-obeleživača, E-obeleživača, fragmenta SV40T antigena, lck obeleživača, fragmenta α-tubulina, B-obeleživača, fragmenta proteina C i slično. Primeri drugih polipeptida koji se spajaju sa antitelom iz ovog pronalaska uključuju GST (glutation-S-transferazu), HA (hemaglutinin gripa), konstantni region imunoglobulina, β-galaktozidazu, MBP (protein koji vezuje maltozu) i slično. Komercijalno dostupan polinukleotid koji kodira takav peptid ili polipeptid je fuzionisan sa polinukleotidom koji kodira antitelo ovog pronalaska, i fuzioni polinukleotid pripremljen na taj način se eksprimira, pri čemu se može pripremiti fuzioni polipeptid.

[0027] Antitelo ovog pronalaska može biti konjugovano antitelo vezano za različite molekule, na primer, polimerne supstance kao što su polietilen glikol (PEG), hijaluronska kiselina i slično, radioaktivna supstanca, fluorescentna supstanca, luminiscentna supstanca, enzim, toksin i slično. Takvo konjugovano antitelo se može dobiti hemijskom modifikacijom dobijenog antitela. Postupak modifikacije antitela je već uspostavljen u ovoj oblasti (npr. US5057313, US5156840).

[0028] Antitelo ovog pronalaska je poželjno izolovano ili prečišćeno. Biti "izolovan ili prečišćen" znači da je operacija uklanjanja komponenti koje nisu komponente od interesa primenjena na stanje prirodnog prisustva. Čistoća izolovanog ili prečišćenog antitela iz ovog pronalaska (odnos težine antitela iz ovog pronalaska prema ukupnoj težini proteina) je generalno 50% ili više, poželjno 70% ili više, poželjnije 90% ili više, najpoželjnije 95% ili više (na primer, suštinski 1000).

[0029] Antitelo ovog pronalaska se specifično vezuje za humani ADAMTS4 u epitopu koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 9 (YCEGRRTRF), i inhibira aktivnost agrekanaze humanih ADAMTS4 i ADAMTS5.

[0030] Epitop koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 9, konkretno, je epitop koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 9.

[0031] Aminokiselinska sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 9 je delimična aminokiselinska sekvenca humanog ADAMTS4 i ne pokazuje veoma visok identičnosti sa odgovarajućom delimičnom sekvencom humanog ADAMTS5. Međutim, iznenađujuće, antitelo koje se specifično vezuje za humani ADAMTS4 u epitopu koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 9 takođe može inhibirati aktivnost agrekanaze humanog ADAMTS5 pored agrekanazne aktivnosti humanog ADAMTS4.

[0032] Specifični primeri antitela koje se specifično vezuje za humani ADAMTS4 i inhibira aktivnost agrekanaze humanog ADAMTS4 uključuju antitela opisana u (1) ili (2) u nastavku:

(1) antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 3, i varijabilni region teškog lanca sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 6; i

(2) antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 3, i varijabilni region teškog lanca sadrži CDR1 koja sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 6, osim što 1 do 3 aminokiseline su supstituisane, deletirane, inserirane i/ili adirane u najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1 do 3, i/ili 1 do 3 aminokiseline su supstituisane, deletirane, inserirane i/ili adirane u najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4 do 6.

[0033] U (2), 1 - 3 (poželjno 1 ili 2, poželjnije 1) aminokiseline su poželjno supstituisane, deletirane, inserirane i/ili adirane samo u aminokiselinsku sekvencu CDR3 u varijabilnom regionu lakog lanca.

[0034] Primeri postupka za supstituciju jednog ili više aminokiselinskih ostataka sa drugom željenom aminokiselinom uključuju postupak mutageneze usmerene na mesto (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotidedirected dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275; Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz, HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotidedirected mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492). Korišćenjem ovih postupaka, željena aminokiselina u antitelu može biti supstituisana drugom aminokiselinom od interesa. Takođe, korišćenjem tehnike biblioteke kao što je mešanje okvira (Mol Immunol.2007 Apr; 44(11):3049-60) i popravka CDR (US2006/0122377) i slično, aminokiselina u okviru ili CDR takođe može biti supstituisana drugom odgovarajućom aminokiselinom.

[0035] Kao okvirni region (FR) antitela koji treba da se poveže sa CDR, izabran je okvir koji omogućava CDR regionu da formira dobro mesto za vezivanje antigena. Dok FR koji se koristi za antitelo iz ovog pronalaska nije posebno ograničen i može se koristiti bilo koji FR, poželjno se koristi FR humanog antitela. Kao FR humanog antitela, može se koristiti ono koje ima prirodnu sekvencu, ili jedna ili više aminokiselina u okviru regiona koji imaju prirodnu sekvencu mogu biti supstituisane, deletirane, adirane i/ili inserirane i slično po potrebi, tako da CDR će formirati odgovarajuće mesto za vezivanje antigena. Na primer, mutantna FR sekvenca koja ima željena svojstva može se izabrati merenjem i procenom aktivnosti vezivanja antitela koje ima FR sa supstituisanom aminokiselinom za antigen (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993)53, 851-856).

[0036] U antitelima (1) i (2), FR Vk4 (Kabat baza podataka) humanog antitela se poželjno koristi za laki lanac, a FR VH1a (Kabat baza podataka) humanog antitela se poželjno koristi za teški lanac.

[0037] Konstantni region koji se koristi za antitelo iz ovog pronalaska nije posebno ograničen i može se koristiti bilo koji konstantni region. Poželjni primeri konstantnog regiona koji se koristi za antitelo iz ovog pronalaska obuhvataju konstantne regione humanog antitela (konstantni regioni izvedeni iz IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM i slično). Na primer, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cµ, Cδ, Cα1, Cα2, Cε se mogu koristiti u H lancu, a Cκ, Cλ se mogu koristiti u L lancu.

[0038] U antitelima (1) i (2), poželjno je da se konstantni region Cκ humanog antitela koristi za laki lanac, a konstantni region Cγ1 humanog antitela se poželjno koristi za teški lanac.

[0039] Poželjno antitelo ovog pronalaska uključuje sledeće:

1

(1') Antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 7 i varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8.

[0040] Antitelo gore pomenutog (1') odgovara poželjnom primeru izvođenja antitela gore pomenutog (1).

[0041] Antitela gore pomenutih (1) i (2) poželjno takođe inhibiraju aktivnost agrekanaze humanog ADAMTS5 pored aktivnosti agrekanaze humanog ADAMTS4.

[0042] U posebnom primeru izvođenja, antitela gore pomenutih (1) i (2) se specifično vezuju za humani ADAMTS4 u epitopu koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 9 i inhibiraju aktivnost agrekanaze humanog ADAMTS4. Navedena antitela takođe mogu inhibirati aktivnost agrekanaze humanog ADAMTS5 pored aktivnosti agrekanaze humanog ADAMTS4.

[0043] Ovaj pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira gore pomenuto antitelo iz ovog pronalaska. Polinukleotid može biti DNK ili RNK, ili DNK/RNK himera. Polinukleotid može biti dvolančani ili jednolančani. Kada je polinukleotid dvolančani, to može biti dvolančana DNK, dvolančana RNK ili hibrid DNK:RNK.

[0044] Polinukleotid ovog pronalaska obuhvata polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira i varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca antitela iz ovog pronalaska, i kombinaciju polinukleotida koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca antitela iz ovog pronalaska i polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela iz ovog pronalaska.

[0045] Polinukleotid ovog pronalaska može se lako proizvesti na osnovu informacija o aminokiselinskoj sekvenci antitela iz ovog pronalaska, poznatih informacija o sekvenci i informacija o sekvenci opisanih u Listingu sekvenci u ovoj specifikaciji, i korišćenjem poznatih tehnika rekombinacije gena. Na primer, pogodni prajmeri su dizajnirani na osnovu informacija o sekvenci, DNK koja kodira elemente koji čine antitelo ovog pronalaska se amplificira PCR reakcijom, DNK fragmenti se vezuju odgovarajućim enzimima kao što je ligaza i slično, pri čemu se može proizesti polinukleotid ovog pronalaska. Alternativno, polinukleotid koji kodira svaki element može se sintetisati polinukleotidnim sintetizatorom, na osnovu informacija o aminokiselinskoj sekvenci antitela iz ovog pronalaska.

[0046] Dobijeni polinukleotid koji kodira antitelo iz ovog pronalaska može se, u zavisnosti od cilja, direktno koristiti ili koristiti nakon digestije sa reestrikcionim enzimom kada se želi, ili dodavanjem linkera. Polinukleotid može imati ATG kao kodon za inicijaciju translacije na strani 5' terminusa, a može imati TAA, TGA ili TAG kao kodon za zaustavljanje translacije na strani 3' terminusa. Ovi kodoni za inicijaciju translacije i kodon za zaustavljanje translacije mogu se dodati korišćenjem odgovarajućeg sintetisanog DNK adaptera.

[0047] Polinukleotid ovog pronalaska je poželjno izolovan ili prečišćen. Izolovani ili prečišćeni polinukleotid ovog pronalaska ima čistoću (odnos težine polinukleotida iz ovog pronalaska prema ukupnoj težini polinukleotida) generalno 50% ili više, poželjno 70% ili više, poželjnije 90% ili više, najpoželjnije 95% ili više (na primer, suštinski 1000).

[0048] Ovaj pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži gore pomenuti polinukleotid ovog pronalaska. Vektor predmetnog pronalaska obuhvata vektor koji sadrži polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira i varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca antitela iz ovog pronalaska, i kombinaciju vektora koji sadrži polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koji kodira varijabilni region teškog lanca antitela iz ovog pronalaska i vektor koji sadrži polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca antitela iz ovog pronalaska. Vektor je poželjno izolovan ili prečišćen. Primeri vektora uključuju ekspresioni vektor, vektor za kloniranje i slično, koji se mogu izabrati prema objektu. Poželjno, vektor je ekspresioni vektor. Ekspresioni vektor može da eksprimira antitelo ovog pronalaska. Ekspresioni vektor se može proizvesti operativnim povezivanjem polinukleotida iz ovog pronalaska nishodno od promotora u pogodnom ekspresionom vektoru. Vrsta vektora uključuje, na primer, plazmidni vektor, virusni vektor i slično, koji se mogu na odgovarajući način izabrati prema domaćinu koji će se koristiti.

[0049] Kao domaćin, koriste se rod Escherichia (Escherichia coli itd.), rod Bacillus (Bacillus subtilis itd.), kvasac (Saccharomyces cerevisiae itd.), ćelija insekata (uspostavljena ćelijska linija izvedena iz larve Mamestra brassicae (ćelija Spodoptera frugiperda; Sf-ćelija) itd.), insekata (larva Bombyx mori itd.), ćelije sisara (nervna ćelija pacova, ćelija majmuna (COS-7 itd.), ćelija kineskog hrčka (CHO ćelija itd.) itd.) i slično.

[0050] Primeri sisara uključuju, ali nisu ograničeni na, eksperimentalne životinje kao što su glodari kao što su miš, pacov, hrčak i zamorac i slično, zec i slično, domaće životinje kao što su svinje, goveda, koze, konji, ovce, kune i slično, životinje pratioci kao što su pas, mačka i slično, primati kao što su čovek, majmun, Macaca fascicularis, Macaca mulatta, marmozet, orangutan, šimpanza i slično, i slično.

[0051] Primeri plazmidnog vektora obuhvataju plazmidne vektore izvedene iz Escherichia coli (npr. pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), plazmidne vektore izvedene iz Bacillus subtilis (npr. pUB110, pTP5, pC194), plazmidne vektore izvedene od kvasca (npr., pSH19, pSH15) i slično, koji se mogu na odgovarajući način izabrati prema vrsti domaćina koja će se koristiti i cilju upotrebe.

1

[0052] Vrsta vektora virusa može biti izabrana na odgovarajući način prema vrsti domaćina koji će se koristiti i cilju upotrebe. Na primer, kada se ćelija insekta koristi kao domaćin, može se koristiti bakulovirusni vektor i slično. Kada se ćelija sisara koristi kao domaćin, retrovirusni vektori kao što su vektor virusa moloney mišje leukemije, vektor lentivirusa, vektor sindbis virusa i slično, vektor adenovirusa, vektor virusa herpesa, vektor adeno-povezanog virusa, vektor parvovirusa, vektor virusa vakcinije, sendai virusni vektor i slično mogu se koristiti.

[0053] Promotor se može izabrati prema vrsti domaćina koji će se koristiti, a može se izabrati i onaj koji može da pokrene transkripciju u domaćinu. Na primer, kada je domaćin rod Escherichia, poželjni su trp promotor, lac promotor, T7 promotor i slično. Kada je domaćin rod Bacillus, poželjni su SPO1 promotor, SPO2 promotor, penP promotor i slično. Kada je domaćin kvasac, poželjni su PHOS promotor, PGK promotor i slično. Kada je domaćin ćelija insekta, poželjniji su promotor polihedrina, P10 promotor i slično. Kada je domaćin ćelija sisara, poželjniji su subgenomski (26S) promotor, CMV promotor, SRα promotor i slično.

[0054] Vektor ovog pronalaska može da sadrži signalnu sekvencu za sekreciju antitela. Kao signalna sekvenca za sekreciju antitela kada se ono proizvodi u periplazmi Escherichia coli, može se koristiti signalna sekvenca pelB (Lei, S. P. et al. J. Bacteriol. (1987) 169, 4379).

[0055] Kada se želi, vektor ovog pronalaska može da sadrži pojačivač, splajsing signal, signal adicije poliA, marker selekcije, oridžin replikacije SV40 (u daljem tekstu ponekad skraćeno kao SV40ori) i slično, svaki na operativan način. Primeri selekcionog markera uključuju gen dihidrofolat reduktaze (u daljem tekstu se ponekad skraćuje kao dhfr) [rezistencija na metotreksat (MTX)], gen rezistencije na ampicilin (ponekad se skraćuje kao Amp<r>), gen za otpornost na neomicin (ponekad se skraćeno naziva Neo<r>, G418 otpor) i slično.

[0056] Uvođenjem gore pomenutog vektora iz ovog pronalaska u gore pomenutog domaćina pomoću postupka transfera gena poznatih per se (npr. postupak lipofekcije, postupak kalcijum fosfata, postupak mikroinjekcije, postupak fuzije proplasta, postupak elektroporacije, postupak DEAE dekstrana, postupak transfera gena pomoću Gene Gun itd.), može se proizvesti transformant sa vektorom koji je u njega uveden (transformant ovog pronalaska). Kada se ekspresioni vektor koristi kao vektor koji se uvodi, transformant može da eksprimira antitelo ovog pronalaska. Transformant ovog pronalaska je koristan za proizvodnju antitela iz ovog pronalaska i slično.

[0057] Antitelo ovog pronalaska se može proizvesti kultivisanjem transformanta iz ovog pronalaska postupkom koji je sam po sebi poznat prema vrsti domaćina, i izolovanjem antitela iz ovog pronalaska iz kulture. Kada je domaćin rod Escherichia, transformant se kultiviše u odgovarajućem medijumu kao što je LB medijum, M9 medijum i slično na generalno oko 15 -

1

43°C tokom oko 3 - 24 sata. Kada je domaćin rod Bacillus, transformant se kultiviše u odgovarajućem medijumu generalno na oko 30 - 40°C oko 6 - 24 sata. Kada je domaćin kvasac, transformant se kultiviše u odgovarajućem medijumu kao što je Burkholderov medijum i slično generalno na oko 20°C - 35°C tokom oko 24 - 72 sata. Kada je domaćin ćelija insekta ili insekt, transformant se kultiviše u odgovarajućem medijumu kao što je Grace-ov Insect medijum sa oko 10% goveđeg seruma i slično generalno na oko 27°C tokom oko 3 - 5 dana. Kada je domaćin životinjska ćelija, transformant se uzgaja u odgovarajućem medijumu kao što je MEM medijum sa dodatkom oko 10% goveđeg seruma i slično generalno na oko 30°C - 40°C tokom oko 15 - 60 sati. U bilo kojoj kulturi, aeracija i mešanje se mogu izvršiti po potrebi.

[0058] Što se tiče postupka proizvodnje antitela genetskim inženjeringom, npr. moguće je uputiti na Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137 i slično.

[0059] Odvajanje i prečišćavanje antitela ovog pronalaska iz kulture nije ograničeno ni na koji način, i mogu se koristiti postupci odvajanja i prečišćavanja koje se generalno koriste za prečišćavanje antitela. Na primer, antitelo se može odvojiti i prečistiti odgovarajućom selekcijom i kombinovanjem hromatografske kolone, filtracije, ultrafiltracije, odsoljavanja, precipitacije rastvaračem, ekstrakcije rastvaračem, destilacije, imunoprecipitacije, elektroforeze u SDS-poliakrilamidnom gelu, izoelektričnog fokusiranja, dijalize i rekristalizacije.

[0060] Primeri hromatografije uključuju afinitetnu hromatografiju, jono-izmenjivačku hromatografiju, hidrofobnu hromatografiju, gelfiltraciju, hromatografiju reverzne faze, adsorpcionu hromatografiju i slično (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Ove hromatografije se mogu izvesti korišćenjem hromatografije tečne faze, na primer, hromatografije tečne faze kao što su HPLC, FPLC i slično. Primeri kolone koja se koristi za afinitetnu hromatografiju uključuju kolonu proteina A i kolonu proteina G. Na primer, kao kolona koja koristi protein A, mogu se pomenuti Hyper D, POROS, Sepharose FF (proizvođač GE Amersham Biosciences) i slično. Ovaj pronalazak takođe obuhvata antitelo visoko prečišćeno ovim postupcima prečišćavanja.

[0061] Pored toga, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži gore pomenuto antitelo iz ovog pronalaska kao aktivni sastojak. Agrekanaze (posebno ADAMTS4 i

1

5) razgrađuju agrekan i doprinose razaranju hrskavice kod artritisa kao što je osteoartritis, reumatoidni artritis i slično. Prema tome, primena antitela iz ovog pronalaska inhibira aktivnost agrekanaze, potiskuje razlaganje agrekana, potiskuje destrukciju hrskavice i, kao rezultat, može sprečiti ili lečiti napredovanje artritisa. Shodno tome, antitelo ovog pronalaska i farmaceutska kompozicija ovog pronalaska su korisni kao profilaktički ili terapeutski agensi za progresiju artritisa i slično. Konkretno, antitelo ovog pronalaska, gde antitelo inhibira ne samo aktivnost agrekanaze humanog ADAMTS4, već i aktivnost agrekanaze humanog ADAMTS5, može istovremeno da inhibira više vrsta agrekanaza. Stoga se može očekivati superiorni efekat denaturacije ili destrukcije hrskavice, kao i superiorni profilaktički ili terapeutski efekat na artritis. Vrsta artritisa nije posebno ograničena sve dok prati destrukciju ili denaturaciju hrskavice usled razlaganja agrekana pomoću agrekanaze (posebno ADAMTS4 i 5), a antitelo ovog pronalaska obezbeđuje profilaktički ili terapeutski efekat. Njihovi primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, denaturaciju ili destrukciju zglobne hrskavice usled degradacije agrekana kod, na primer, osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, ankilozirajućeg artritisa, psorijatičnog artritisa i slično, denaturacije i destrukcije intervertebralnog diska kod hernije diska i slično.

[0062] Pored toga, budući da su ADAMTS4 i 5 uključeni u infiltraciju ćelija tumora mozga usled Brevican degradacije u tumoru mozga (multiformni glioblastom), vaskularna destrukcija usled Versican degradacije u neuhvatljivom vaskulitisu, destrukcija kožnog tkiva, prekomerno delovanje popravke i sl. do versikanske degradacije i njenog proizvoda kod hroničnog čira na koži, keloida i slično je istaknuto, antitelo ovog pronalaska i farmaceutska kompozicija ovog pronalaska su takođe korisni kao profilaktički ili terapeutski agensi za progresiju ovih bolesti i slično.

[0063] Kada je antitelo iz ovog pronalaska "sadržano kao aktivni sastojak", to znači da je antitelo ovog pronalaska sadržano kao najmanje jedan od aktivnih sastojaka i da ne ograničava njegov sadržaj. Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može da sadrži drugi aktivni sastojak(e) zajedno sa antitelom iz ovog pronalaska.

[0064] Antitelo ovog pronalaska može biti formulisano prema konvencionalnom postupku (npr. Remington's Pharmaceutical Science, najnovije izdanje, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.). Pored toga, tamo gde je potrebno, može sadržati farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili aditiv. Na primer, može da sadrži surfaktant (PEG, Tween itd.), ekscipijens, antioksidans (askorbinska kiselina itd.), boju, aromu, konzervans, stabilizator, pufersko sredstvo (fosfat, citrat, druga organska kiselina itd.), agens za helatiranje (EDTA itd.), sredstvo za suspendovanje, sredstvo za izotonizaciju, vezujuće sredstvo, sredstvo za raspadanje, lubrikant, klizajuće sredstvo, korektor i slično. Bez ograničenja na njih, farmaceutska kompozicija ovog

1

pronalaska može da sadrži druge konvencionalne nosače prema potrebi. Specifični primeri uključuju laku anhidrovanu silicijumsku kiselinu, laktozu, kristalnu celulozu, manitol, skrob, karmeloza kalcijum, karmeloza natrijum, hidroksipropilcelulozu, hidroksipropilmetilcelulozu, polivinil acetaldietilaminoacetat, polivinilpirolidon, želatin, triglicerid masne kiseline srednjeg lanca, polioksietilen hidrogenisano ricinusovo ulje 60, saharozu, karboksimetilcelulozu, kukuruzni skrob, neorganske soli i slično. Takođe može da sadrži druge polipeptide niske molekularne težine, serumski albumin, želatin i proteine kao što su imunoglobulin i slično, kao i aminokiseline. Kada se formuliše vodeni rastvor za injekcije, antitelo ovog pronalaska se rastvori u, na primer, izotoničnom rastvoru koji sadrži fiziološki rastvor, glukozu ili drugi pomoćni agens. Primeri pomoćnog agensa uključuju D-sorbitol, D-manozu, D-manitol i natrijum hlorid i mogu se koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim agensima za rastvaranje, na primer, alkoholom (etanol itd.), polialkoholom (propilen glikol, PEG itd.), nejonski surfaktant (polisorbat80, HCO-50) i slično.

[0065] Tamo gde je potrebno, polipeptid takođe može biti uključen u mikrokapsulu (mikrokapsule napravljene od hidroksimetilceluloze, želatina, poli[metilmetakrilata] i slično), ili formulisan kao sistem za isporuku koloidnog leka (lipozom, albuminska mikrosfera, mikroemulzija, nanočestice i nanokapsule itd.) (videti Remington's Pharmaceutical Science 16th edition &, Oslo Ed. (1980) itd.). Pored toga, poznat je i postupak formulisanja leka kao leka sa produženim oslobađanjem, koji je primenljiv na polipeptid (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981)15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982)12: 98-105; US Patent br.

3,773,919; EP-A-58,481; Sidman et al., Biopolymers (1983) 22: 547-56; EP br.133,988). Pored toga, takođe je moguće povećati količinu tečnosti koja će se subkutano primeniti dodavanjem ili mešanjem hijaluronidaze u ili sa ovim agensom (npr. WO 2004/078140 itd.).

[0066] Sadržaj antitela iz ovog pronalaska u farmaceutskoj kompoziciji je, na primer, oko 0.01 - 100 tež%, poželjno 0.1 – 99.9 % cele farmaceutske kompozicije.

[0067] Dok se farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može primeniti i oralno i parenteralno, poželjno je da se primenjuje parenteralno. Specifično, on se primenjuje na pacijente injekcijom ili transdermalnom primenom. Kao primer doznog oblika injekcije, može se primeniti sistemski ili lokalno intravenskom injekcijom, intramuskularnom injekcijom, subkutanom injekcijom i slično. Takođe se može primeniti na mesto tretmana ili u njegovoj blizini putem lokalne injekcije, posebno intramuskularne injekcije. Primeri doznih oblika za transdermalnu primenu uključuju mast, gel, kremu, flaster, flaster i slično, koji se mogu primeniti sistemski ili lokalno. Pored toga, način primene se može izabrati na odgovarajući način prema starosti i simptomima pacijenata. Doza se može izabrati iz, na primer, opsega od

1

0.5 mg - 10 mg/kg telesne težine kao antitela ovog pronalaska. Međutim, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska nije ograničena ovim dozama.

PRIMERI

[0068] Ovaj pronalazak je detaljnije objašnjen u nastavku pozivanjem na Primere, koji se ne mogu tumačiti kao ograničavajući. Različite manipulacije genima u Primerima pratile su postupak opisan u Molecular cloning third. ed. (Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001).

Materijali i metode

Paning biblioteke displeja faga i generisanje Fab.

[0069] Proizvodnja monoklonskih Fab antitela specifičnih za ADAMTS4 i ADAMTS5 generisana je korišćenjem biblioteke humanih kombinatornih antitela (HuCAL; MorphoSys AG, Martinried, Germany). Rekombinantni ADAMTS4 i ADAMTS5 (R&D Sistems Inc., Minneapolis, MN) su biotinilovani i inkubirani sa HuCAL. Vezani Fab eksprimirajući fagi obogaćeni su u tri uzastopna kruga paninga. Skup Fab gena je izolovan iz fagemida i inseriran u Escherichia coli ekspresione vektore koji dovode do funkcionalne periplazmatske ekspresije Fab opremljenog Strep-obeleživačem II. Nakon transformacije, pojedinačne kolonije su pokupljene i uzgajane u mikrotitarskim pločama. Posle indukcije ekspresije antitela inkubacijom sa izopropil-β-tiogalaktopiranozidom preko noći, ćelije su enzimski lizirane, a sirovi ekstrakti su testirani enzimskim imunosorbentnim testom (ELISA). DNK sekvence VH CDR regiona antitela su određene za klonove koji su davali jake signale na antigene u ELISA testu. Kolonije koje sadrže Fabs izabrane su za naknadno prečišćavanje, a neke od Fabs su preformatirane u celi humani IgG1 za dalje eksperimente.

Rekombinantni humani ADAMTS4 i ADAMTS5.

[0070] Ekspresioni vektori koji sadrže cDNK fragmente koji kodiraju ostatke Phe<213>-Cys<685>humanog ADAMTS4, koji odgovaraju domenima ADAMTS4 bogatim metaloproteinazom, dezintegrinom, trombospondinom i cisteinom, sa Strep-obeleživačem II na C-terminusu, transfektovani su u ćelije HEK293T korišćenjem lipofektamina (Life Technologies, Rockville, MD). Mediji za kulturu su sakupljeni 2 dana nakon transfekcije, a rekombinantni humani

2

ADAMTS4 je prečišćen korišćenjem Strep-Tactin Sepharose prema uputstvima proizvođača (IBA Biotechnica, Hanover, Germany). Rekombinantni ADAMTS5 protein koji sadrži domene metaloproteinaze, dezintegrina i trombospondina (ostaci Ser<262>-Pro<622>iz ADAMTS5) je kupljen od R&D Sistems Inc.

Imunoblotiranje humanih anti-ADAMTS antitela.

[0071] Rekombinantni proteini humanog ADAMTS1 (R&D Systems), ADAMTS4, ADAMTS5 (R&D Systems), ADAMTS15 (R&D Systems), ADAM10 (R&D Systems), ADAM12 (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan), ADAM17 (R&D Systems) i MMP-13 (Millipore, Billerica, MA) i prečišćeni humani MMP-1, MMP-2, MMP-3 i MMP-9 (Daiichi Fine Chemical, Co., Ltd., Toyama, Japan) podvrgnuti su natrijum dodecil sulfat -poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) u redukcionim uslovima, a uzorci rastvoreni na gelovima su prebačeni na poliviniliden difluorid (PVDF) membrane. Membrane su inkubirane sa kandidatima Fabs protiv ADAMTS vrsta (5 µg/ml; klonovi 237-1, 237-5, 237-21, 237-43 i 237-53) na 4°C tokom 16 h. Posle ispiranja sa fosfatnim puferom fiziološkim rastvorom koji sadrži 0.1% Tween 20, membrane su reagovale sa sekundarnim antitelom konjugovanim s peroksidazom rena protiv humanog IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA) tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Hemiluminiscentni reagens (Pierce ECL western blotting supstrat; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) je korišćen da bi obeležene proteinske trake bile vidljive. Svi uzorci su takođe ispitani na gelovima obojenim srebrom, koji su pripremljeni pomoću kompleta za bojenje srebrom (Cosmo Bio Co., Ltd, Carlsbad, CA).

Inhibicija aktivnosti agrekanaze ADAMTS4 i 5 sa humanim anti-ADAMTS antitelom (klon 237-53).

[0072] Rekombinantni ADAMTS4 (180 ng) i ADAMTS5 (180 ng) su inkubirani 30 minuta na 37°C sa humanim anti-ADAMTS antitelom (IgG1; klon 237-53) u molarnom odnosu 1:0.2-5 (enzim: antitelo) ili humanim kontrolnim normalnim IgG1 (R&D Systems), a zatim reagovali sa svinjskim agrekanom (100 µg) tokom 16 h na 37°C. Nakon deglikozilacije agrekana sa hondroitinazom ABC i keratanazom (Seikagaku Corporation, Tokyo, Japan), aktivnost agrekanaze je praćena imunoblotiranjem korišćenjem anti-NITEGE<392>agrekansko neoepitop antitelo (1.2 µg/ml) (Hashimoto G, et al. J Biol Chem.2004;279:32483-91). Gustina proteinske trake je procenjena denzitometrijom korišćenjem softvera za analizu Image J (National Institute of Health, Bethesda, MD).

Mapiranje domena anti-ADAMTS antitela (klon 237-53).

[0073] Rekombinantni proteini obeleženi sa FLAG i reduktazom dihidrofolne kiseline (DHFR) svakog domena ADAMTS4 i trombospondinskog domena sa NH2- ili COOH-terminalnom delecijom je sintetisana korišćenjem translacionog sistema bez ćelija (PUREfrex) (Gene Frontier Corporation, Chiba, Japan). Ovi uzorci su podvrgnuti SDS-PAGE i zatim imunoblotirani sa anti-FLAG antitelom (Sigma-Aldrich, St Louis, MO; 2 µg/ml) ili humanim anti-ADAMTS antitelom (klon 237-53; 2 µg/ml).

Analiza površinske plazma rezonantne interakcije (BIAcore).

[0074] Rekombinantne vrste ADAMTS su kovalentno imobilisane preko aminske sprege na protočnim komora CM5 senzorskog čipa (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK). IgG1 klona 237-53 je injektiran u komore korišćenjem BIAcore 3000 (GE Healthcare Life Sciences). KD(afinitet) je izračunat iz utvrđenih Kai Kdvrednosti.

Inhibicija aktivnosti agrekanaze u kultivisanim hondrocitima sa anti-ADAMTS antitelom (klon 237-53).

[0075] Hondrociti izolovani enzimskom disocijacijom iz humane osteoartritične hrskavice kultivisani su u Dulbecco-ovom modifikovanom medijumu Eagle / Hamovom medijumu F-12 (Sigma-Aldrich) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma i 25 µg/ml askorbinske kiseline, i tretiranih sa ili bez interleukina. 1α (IL-1α (1 ng/ml; Dainippon Sumitomo Pharmaceutical Company Ltd., Okada, Japan) u trajanju od 24 h nakon serumskog gladovanja kultivisanjem u medijumu koji sadrži 0.2% hidrolizata laktalbumina. Tretirani su ADAMTS antitelom (5 µg/ ml, klon 237-53) ili humanim kontrolnim IgG (5 µg/ml; Invitrogen, Carlsbad, CA) tokom 1 h, a zatim inkubirani u prisustvu agrekana (100 µg) tokom 16 h. Koncentrovani medijum je podvrgnut SDS-PAGE nakon deglikozilacije i prenet na PVDF membrane. Aktivnost agrekanaze je procenjena imunoblotingom sa anti-NITEGE<392>neoepitopskim antitelom (1.2 µg/ml). Od pacijenata sa osteoartritisom dobijen je informisani pristanak za eksperimentalnu upotrebu hirurških uzoraka u skladu sa bolničkim etičkim smernicama.

[0076] Da bi se ispitala ekspresija iRNK ADAMTS4 i 5, ukupna RNK je pripremljena od hondrocita tretiranih sa ili bez IL-1α (1 ng/ml) i humanog anti-ADAMTS antitela (klon 237-53) tokom 18 h, i reverzno transkribovana na cDNK koristeći SuperScript II reverznu transkriptazu (Life Technologies, Rockville, MD). cDNK su amplifikovane PCR-om sa prajmerima specifičnim za ADAMTS4 i 5 i genom za održavanje gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) kao što je prethodno opisano (Naito S, et. al. Pathol Int.2007;57:703-11).

Rezultati

Skrining humanih antitela protiv ADAMTS4 i ADAMTS5

[0077] Skriningom biblioteke humanih antitela (HuCAL) korišćenjem postupka prikaza faga, pomoću ELISA dobijeno je ukupno 5 klonova (237-1, 237-5, 237-21, 237-43 i 237-53) koji su reaktivni sa oba, ADAMTS4 i ADAMTS5. Imunobloting analiza je pokazala da svi klonovi prepoznaju rekombinantne ADAMTS4 i ADAMTS5, iako je reaktivnost na ADAMTS5 bila različita među klonovima (Slika 1A). Da bi se ispitalo da li kandidati klonovi inhibiraju aktivnost agrekanaze ADAMTS4, Fab vrste klonova su inkubirane sa ADAMTS4 u molarnom odnosu 1:1, a zatim je aktivnost praćena imunoblotiranjem upotrebom neo-epitop (NITEGE<392>)-specifičnog antitela. Kao što je prikazano na slici 1B, klon 237-53 je inhibirao aktivnost agrekanaze među pet klonova kandidata.

Imunoreaktivnost klona 237-53 sa ADAMTS4 i ADAMTS5

[0078] Pošto je klon 237-53 pokazao inhibitornu aktivnost na ADAMTS4, ovo antitelo je bilo fokusirano. Kada je unakrsna reaktivnost antitela na ADAMTS, ADAM i MMP vrste ispitana imunoblotingom, klon 237-53 je reagovao sa ADAMTS4 i ADAMTS5. Međutim, nije dobijena imunoreaktivnost sa ADAMTS1, ADAMTS15, ADAM10, ADAM12, ADAM17, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 ili MMP-13 (Slika 2). Podaci sugerišu da klon 237-53 reaguje sa nekim regionom koji je obično prisutan u ADAMTS4 i ADAMTS5.

Određivanje epitopa ADAMTS4 prepoznatog pomoću klona 237-53

[0079] Da bismo odredili imunoreaktivni domen ADAMTS4 pomoću klona antitela 237-53, prvo smo ispitali reaktivnost na rekombinantne proteine samog domena metaloproteinaze ili

2

dezintegrin i trombospondin domene ADAMTS4 koje generiše PUREfrex. Kao što je prikazano na slici 3A, antitelo je prepoznalo samo protein domena dezintegrina i trombospondina. Stoga smo dalje ispitali imunoreaktivnost sa domenom dezintegrina ili trombospondina i otkrili da antitelo prepoznaje samo trombospondinski domen (Slika 3B), što ukazuje da trombospondinski domen ADAMTS4 sadrži epitop za antitelo.

[0080] Za detaljniju identifikaciju epitopa, za mapiranje epitopa klona antitela 237-53 korišćen je peptidni niz sa imobilisanim parcijalnim peptidima humanog ADAMTS4. Da budemo specifični, kao što je prikazano u sledećoj tabeli, peptidni niz koji se sastoji od peptida koji imaju broj ostataka od 12 aminokiselinskih ostataka i pomak od 3 aminokiselinska ostatka proizveden je u odnosu na sekvencu koja pokriva trombospondinski domen humanog ADAMTS4. HRP-obeleženi klon 237-53 antitela je reagovao sa peptidnim nizom.

Tabela 1

1 AGGWGPWGPWGD 16 TCGGGVQFSSRD 31 PVPRNGGKYCEG

(SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 33) (SEQ ID NO: 48)

2 GGWGPWGPWGDC 17 CGGGVQFSSRDC 32 VPRNGGKYCEGR

(SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 34) (SEQ ID NO: 49)

3 GWGPWGPWGDCS 18 GGGVQFSSRDCT 33 PRNGGKYCEGRR

(SEQ ID NO: 20) (SEQ ID NO: 35) (SEQ ID NO: 50)

4 WGPWGPWGDCSR 19 GGVQFSSRDCTR 34 RNGGKYCEGRRT

(SEQ ID NO: 21) (SEQ ID NO: 36) (SEQ ID NO: 51)

5 GPWGPWGDCSRT 20 GVQFSSRDCTRP 35 NGGKYCEGRRTR

(SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO: 37) (SEQ ID NO: 52)

6 PWGPWGDCSRTC 21 VQFSSRDCTRPV 36 GGKYCEGRRTRF

(SEQ ID NO: 23) (SEQ ID NO: 38) (SEQ ID NO: 10)

7 WGPWGDCSRTCG 22 QFSSRDCTRPVP 37 GKYCEGRRTRFR

(SEQ ID NO: 24) (SEQ ID NO: 39) (SEQ ID NO: 11)

8 GPWGDCSRTCGG 23 FSSRDCTRPVPR 38 KYCEGRRTRFRS

(SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 40) (SEQ ID NO: 12)

9 PWGDCSRTCGGG 24 SSRDCTRPVPRN 39 YCEGRRTRFRSC

(SEQ ID NO: 26) (SEQ ID NO: 41) (SEQ ID NO: 13)

10 WGDCSRTCGGGV 25 SRDCTRPVPRNG 40 CEGRRTRFRSCN

(SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 42) (SEQ ID NO: 53)

11 GDCSRTCGGGVQ 26 RDCTRPVPRNGG 41 EGRRTRFRSCNT

(SEQ ID NO: 28) (SEQ ID NO: 43) (SEQ ID NO: 54)

12 DCSRTCGGGVQF 27 DCTRPVPRNGGK 42 GRRTRFRSCNTE

(SEQ ID NO: 29) (SEQ ID NO: 44) (SEQ ID NO: 55)

13 CSRTCGGGVQFS 28 CTRPVPRNGGKY 43 RRTRFRSCNTED

(SEQ ID NO: 30) (SEQ ID NO: 45) (SEQ ID NO: 56)

14 SRTCGGGVQFSS 29 TRPVPRNGGKYC 44 RTRFRSCNTEDC

(SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 46) (SEQ ID NO: 57)

15 RTCGGGVQFSSR 30 RPVPRNGGKYCE 45 TRFRSCNTEDCP

(SEQ ID NO: 32) (SEQ ID NO: 47) (SEQ ID NO: 58)

[0081] Kao rezultat, 237-53 se specifično vezuje za gore pomenute peptide #36 - #39. Rezultati sugerišu da epitop 237-53 sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 9 (YCEGRRTRF) koja je zajednička za peptide #36 - #39.

[0082] Escherichia coli dobijenog klona 237-53 je kultivisana, a plazmid je dobijen (QIAprep Spin MiniPrep kit: proizvođača QIAGEN) i korišćen za analizu DNK sekvence. Tabela 2 prikazuje aminokiselinske sekvence CDR regiona (regiona koji određuju komplementarnost) 237-53 H lanca i L lanca.

Tabela 2

[0083] Aminokiselinske sekvence pune dužine varijabilnih regiona H lanca i L lanca od 237-53 bile su sledeće.

L lanac VLk4

H lanac VH1a

2

Inhibicija aktivnosti agrekanaze ADAMTS4 i ADAMTS5 pomoću klona 237-53 antitela

[0084] Aktivnost agrekanaze ADAMTS4 i ADAMTS5 je analizirana demonstracijom imunoblotiranja fragmenata agrekana od 65 kDa sa COOH-terminalnom sekvencom NITEGE<392>koristeći agrekan neoepitop-specifično antitelo. Kao što je prikazano na slici 4A, klon antitela 237-53 blokirao je aktivnost ADAMTS4 na manje od 20% prvobitne aktivnosti, dok je aktivnost ADAMTS5 bila blago inhibirana na približno 70% prvobitne aktivnosti. Nije primećena inhibicija sa normalnim kontrolnim IgG (Slika 4A). Kinetička analiza korišćenjem BIAcore je pokazala visoko afinitetno vezivanje ovog antitela za ADAMTS vrste, pokazujući KDvrednosti 1.17×10<-8>M i 1.46×10<-9>M za ADAMTS4 i ADAMTS5, respektivno.

[0085] Kultivisani hondrociti iz osteoartritične hrskavice su eksprimirali ADAMTS5, ali ne ADAMTS4 (slika 4B, levo). Kada su hondrociti tretirani sa IL-1α, ADAMTS4 je indukovan, ali je ekspresija ADAMTS5 ostala nepromenjena (Slika 4B, levo). Aktivnost agrekanaze netretiranih hondrocita bila je minimalna, ali je povećana nakon stimulacije sa IL-1α (Slika 4B, desno). Kada su IL-1α-stimulisani hondrociti tretirani klonom antitela 237-53, aktivnost agrekanaze je značajno smanjena na kontrolni nivo, ali nije primećena inhibicija tretmanom sa normalnim kontrolnim IgG (Slika 4B, desno).

INDUSTRIJSKA PRIMENLJIVOST

[0086] Prema ovom pronalasku, obezbeđeno je antitelo protiv humane agrekanaze korisno za profilaksu ili lečenje artritisa.

[0087] Ova prijava je zasnovana na US privremenoj patentnoj prijavi serijski br. 61/891,087 (datum podnošenja: 15.10.2013.).

[Tabela 3-1]

SEQ ID NO: 1

237-53 LCDR1

RSSQSILYSSNNNYLA

2

SEQ ID NO: 2

237-53 LCDR2 HTASARES

SEQ ID NO: 3

237-53 LCDR3 QQYYSVSI

SEQ ID NO: 4

237-53 HCDR1 GTFSSFAIS

SEQ ID NO: 5

237-53 HCDR2 GIFPIFGQANYAQKFQG

SEQ ID NO: 6

237-53 HCDR3 FSDWWEWQMDY

SEQ ID NO: 7

237-53 VL(kapa4)

2

[Tabela 3-2] SEQ ID NO: 9

237-53 epitop

YCEGRRTRF

SEQ ID NO: 10

237-53 epitop

GGKYCEGRRTRF

SEQ ID NO: 11

237-53 epitop

GKYCEGRRTRFR

SEQ ID NO: 12

237-53 epitop

KYCEGRRTRFRS

SEQ ID NO: 13

237-53 epitop

YCEGRRTRFRSC

SEQ ID NO: 14

humana ADAMTS4 cDNK sekvenca

2

�

[Tabela 3-3]

[Tabela 3-4]

SEQ ID NO : 15

humana ADAMTS4 aminokiselinska sekvenca

1

SEQ ID NO: 16

humana ADAMTS5 cDNK sekvenca ATAAATTCATTGTTCCACCTCCTCGCATCTTCACAGCGCTCGCGCTGCTCTCGGCG CTCGCAGCTGCCGA

2

[Tabela 3-5]

[Tabela 3-6]

4

[Tabela 3-7]

[Tabela 3-8]

SEQ ID NO: 17

Humana ADAMTS5 aminokiselinska sekvenca

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje se specifično vezuje za humani ADAMTS4 na epitopu koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 9 i inhibira aktivnost agrekanaze humanog ADAMTS4 i humanog ADAMTS5.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca, pri čemu

varijabilni region lakog lanca sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 3, i

varijabilni region teškog lanca sadrži CDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4, CDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 5 i CDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 6.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 2, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 7 i varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8.

4. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, koje je humano antitelo.

5. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4.

6. Polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4.

7. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 6.

8. Transformant koji sadrži vektor prema patentnom zahtevu 7.

9. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, za upotrebu u profilaksi ili lečenju artritisa.

10. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 5, za upotrebu u profilaksi ili lečenju artritisa.