RS65735B1 - Kompozicije za upotrebu u lečenju mijelofibroze - Google Patents

Kompozicije za upotrebu u lečenju mijelofibroze

Info

Publication number
RS65735B1
RS65735B1 RS20240798A RSP20240798A RS65735B1 RS 65735 B1 RS65735 B1 RS 65735B1 RS 20240798 A RS20240798 A RS 20240798A RS P20240798 A RSP20240798 A RS P20240798A RS 65735 B1 RS65735 B1 RS 65735B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
activin
actriib
amino acid
polypeptide
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20240798A
Other languages
English (en)
Inventor
Ravindra Kumar
Sai Rajasekhar Suragani Naga Venkata
Original Assignee
Acceleron Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=61017458&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS65735(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Acceleron Pharma Inc filed Critical Acceleron Pharma Inc
Publication of RS65735B1 publication Critical patent/RS65735B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1796—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNA-REFERENCA SA POVEZANIM PRIJAVAMA
[0001] Ova prijava zahteva prioritet nad privremenom prijavom Sjedinjenih Država serijskog broja 62/367,289, podnete 27. jula 2016.
STANJE TEHNIKE
[0002] Mijelofibroza je retka bolest koja uglavnom pogađa ljude starije dobi. Mijelofibroza je BCR-ABL1-negativna mijeloproliferativna neoplazma koja se de novo prezentuje (primarno) ili joj može prethoditi policitemija vera (post-policitemija vera) ili esencijalna trombocitemija (postesencijalna trombocitemija). Kliničke karakteristike uključuju progresivnu anemiju, upadljivu splenomegaliju, fibrozu (npr., fibrozu koštane srži), konstitucijske simptome (npr., umor, noćno znojenje, bol u kostima, pruritus, i kašalj), i gubitak težine [Tefferi A (2000) N Engl J Med 342:1255-1265]. Prosečno preživljavanje se kreće od manje od 2 godine do preko 15 godina na osnovu trenutno identifikovanih prognostičkih faktora. Mutacije koje obuhvataju JAK2, MPL, TET2, ASXL1, IDH1/IDH2, CBL, IKZF1, LNK, i EZH2 su opisane kod pacijenata sa mijelofibrozom [James C et al. (2005) Nature 434:1144-1148, 2005; Scott L M et al. (2007) N Engl J Med 356:459-468, 2007; Pikman Y et al. (2006) PLoS Med 3:e270; Delhommeau F et al. (2009) N Engl J Med 360:2289-2301; Carbuccia Net al. (2009) Leukemia 23:2183-2186; Green A et al. (2010) N Engl J Med 362:369-370; Tefferi A et al. (2010) Leukemia 24:1302-1309; Grand F H et al. (2009) Blood 113:6182-6192; Jager R et al. (2010) Leukemia 24:1290-1298; Oh S T et al. (2010) Blood 116:988-992; and Ernst T et al., Nat Genet. 42:722-726]. Neke mutacije se javljaju sa velikom učestalosti u mijelofibrozi (npr. JAK2 mutacije kod otprilike 50% pacijenata), i bilo direktno (npr. JAK2 ili MPL mutacije) ili indirektno (npr. LNK ili CBL mutacije) dovode do JAK-STAT hiperaktivacije.
[0003] Jedino lečenje mijelofibroze je transplantacija kostne srži. Ipak, mortalitet povezan sa tretmanom je visok, i samo manjina pacijenata se kvalifikuje za transplantaciju. Mnogi drugi trenutno mogući tretmani nisu efektivni u povlačenu procesa mijelofibroze, bilo da je primarna bilo sekundarna bolest. Tretmani za mijelofibrozu uključuju, na primer, cito-reduktivnu terapiju (npr., tretman sa hidroksiureom); tretman anemije sa androgenima i/ili eritropoetinom; i splenektomiju. Ove terapije nisu nisu pokazale napredak u preživljavanju i u mnogome se vide kao palijativne [Cervantes F., Myelofibrosis: Biology and treatment options, European Journal of Haematology, 2007, 79 (suppl. 68) 13-17]. Skorije, JAK inhibitori se koriste za lečenje mijelofibroze. Ispostavilo se da su JAK inhibitori korisni u smanjivanju splenomegalije kod pacijenata sa mijelofibrozom, ali su njihova dejstva na bolest inače u velikoj meri palijativna [Gupta et al. (2012) Blood 120: 1367-1379]. Preciznije, JAK inhibitori imaju mali ili uopšte nemaju efekat na brojne manifestacije (komplikacije) bolesti uključujući, na primer, citopeniju, zavisnost od transfuzija, ubrzanje ili blastnu fazu bolesti, i fibrozu. Faza-Ib/II studija JAK inhibitora ruksolitiniba (RUX) u kombinaciji sa imunomodulatorskim lekom pomalidomidom (POM) u lečenju mijelofibroze prikazana je u: Stengelmann F. et al., Database Biosis, Database accession no. PREV201600270701, Biosciences Information Service, Philadelphia, PA, US; 3 December 2015. Sem toga, pokazalo se da JAK inhibitori indukuju, ili pogoršavaju, trombocitopeniju, anemiju, i neutropeniju kod nekih pacijenata.
[0004] Tako, postoji velika, nezadovoljena potreba za efektivnim terapijama za lečenje mijelofibroze. Prema tome, predmet ovog izlaganja je obezbeđivanje postupaka za lečenje ili prevenciju mijelofibroze, posebno lečenje ili prevenciju jedne ili više komplikacija mijelofibroze.
SUŠTINA PRONALASKA
[0005] Ovaj pronalazak je definisan pridruženim patentnim zahtevima. Svako ostvarenje koje se ne uklapa u područje zahteva ne čini deo zahtevanog pronalaska. Ma koja od referenci u ovom Opisu na postupke lečenja ili prevencije se odnosi na jedinjenja, (farmaceutske) kompozicije, i lekove ovog pronalaska za primenu u postupku lečenja ili prevencije tela čoveka ili životinje terapijom.
[0006] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na kompoziciju za primenu u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze kod pacijenta, pri čemu kompozicija obuhvata: a) inhibitor Janus kinaze; i b) ActRIIB antagonist, pri čemu se inhibitor Janus kinaze i ActRIIB antagonist primenjuju u efektivnoj količini, gde se inhibitor Janus kinaze bira iz grupe koju čine: ruksolitinib, fedratinib (SAR302503), monoelotinib (CYT387), pakritinib, lestaurtinib, AZD-1480, BMS-911543, NS-018, LY2784544, SEP-701, XL019, i AT-9283, i gde je ActRIIB antagonist ActRIIB polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je bar 90% identična sa sekvencom koja počinje sa ostatkom koji odgovara ma kojoj od aminokiselina 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29 iz SEQ ID NO: 1 i koja završava na ostatku koji odgovara ma kojoj od aminokiselina 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 u SEQ ID NO: 1; i gde ActRIIB polipeptid obuhvata kiselu aminokiselinu na aminokiselinskoj poziciji koja odgovara položaju 79 u SEQ ID NO: 1, i pri čemu ActRIIB polipeptid inhibira GDF11 a da istovremeno ne inhibira aktivin A.
[0007] U poželjnom ostvarenju, kompozicija umanjuje jednu ili više od: fibroze koštane srži, fibroze slezine, fibroze jetre, fibroze pluća, i fibroze limfnih nodusa. U drugom poželjnom ostvarenju, kompozicija povećava nivoe crvenih krvnih ćelija kod pacijenta, i/ili povećava nivoe hemoglobina kod pacijenta.
[0008] U drugom ili još poželjnijem ostvarenju, pacijent ima anemiju, i kompozicija leči anemiju.
[0009] U drugim ili čak još poželjnijim ostvarenjima, pacijentu se primenjuje jedna ili više transfuzija krvnih ćelija pre nego što se počne tretman sa ActRIIB polipeptidom i/ili pacijent je zavisan od transfuzije krvnih ćelija; i kompozicija za primenu smanjuje opterećenje transfuzijama krvnih ćelija za više od otprilike 30% za 4 do 8 nedelja u odnosu na isto vreme pre nego što je tretman sa ActRIIB polipeptidom otpočeo.
[0010] U drugim ili čak još poželjnijim ostvarenjima, pacijent primarno ima mijelofibrozu, mijelofibrozu posle policitemije vere, i/ili mijelofibrozu posle esencijalne trombocitemije.
[0011] U drugom poželjnom ostverenju, mijelofibroza je povezana sa jednom ili više mutacija u JAK2.
[0012] U poželjnim ostvarenjima ovog poslednjeg ostvarenja, JAK2 mutacija je JAK2V617F.
[0013] U drugim ili čak poželjnijim ostvarenjima, pacijent je lečen inhibitorom Janus kinaze, i/ili je intolerantan na inhibitor Janus kinaze.
[0014] U poželjnim ostvarenjima, pacijentu je dalje primenjena hidroksiurea, bio he prethodno lečen sa hidroksiureom, intolerantan je na hidroksiureu, i/ili ima neadekvatan odgovor na hidroksiureu.
[0015] U poželjnim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid je odabran iz grupe koju čine:
a) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinama 29-109 u SEQ ID NO: 1;
b) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinama 25-131 u SEQ ID NO: 1;
c) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2;
d) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 3;
e) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4;
f) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 5;
g) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 6;
h) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 30; i
i) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 54.
[0016] U sledećim poželjnim ostvarenjima, polipeptid sadrži aspartatni ostatak (D) na aminokiselinskom položaju koji odgovara poziciji 79 u SEQ ID NO: 1.
[0017] U alternativnim poželjnim ostvarenjima, polipeptid sadrži glutamatni ostatak (E) na aminokiselinskom položaju koji odgovara poziciji 79 u SEQ ID NO: 1.
[0018] U drugim ili čak poželjnijim ostvarenjima, polipeptid je fuzioni protein koji sadrži imunoglobulinski Fc domen, pri čemu imunoglobulinski Fc domen je iz IgG1 Fc domena, i pri čemu fuzioni protein dalje sadrži linker domen postavljen između ActRIIB polipeptida i imunoglobulinskog Fc domena.
[0019] U poželjnim ostvarenjima ovog poslednjeg ostvarenja, polipeptid je ActRIIB-Fc fuzioni protein koji obuhvata polipeptid odabran od:
a) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 24;
b) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 25;
c) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 28;
d) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 29;
e) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 31;
f) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 45;
g) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 50;
h) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 53; i
i) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 58.
[0020] U drugim ili čak poželjnijim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 53.
[0021] U čak još poželjnijim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53.
[0022] Delom, ovo izlaganje se odnosi na otkriće da ActRIIB antagonist (inhibitor) može da se primeni u lečenju mijelofibroze, posebno za ublažavanje različitih komplikacija bolesti uključujući, na primer, splenomegaliju, ekstramedularnu hematopoezu, i fibrozu. Posebno, podaci koji su ovde predstavljeni pokazuju da GDF trap polipeptid smanjuje splenomegaliju, ekstramedularnu hematopoezu, i fibrozu u JAK2V617F modelu mijelofibroze. Prema tome, izlaganje se šire odnosi na kompozicije za primenu u lečenju mijelofibroze, posebno lečenju ili prevenciji jedne ili više komplikacija mijelofibroze (npr., splenomegalija, ekstramedularna hematopoeza, anemija, i fibroza), primenjivanjem pacijentu kome je to neophodno efektivne količine jednog ili više ActRIIB antagonista, opciono u kombinaciji sa jednom ili više potpornih terapija ili aktivnih agenasa za lečenje mijelofibroze.
[0023] Dok GDF trap polipeptidi mogu uticati na mijelofibrozu preko mehanizama koji su drugačiji u odnosu na ActRIIB antagonizam [npr., inhibicija jednog ili više od GDF11, GDF8, aktivin B, BMP6, GDF3, i BMP 10 može biti indikator tendencije agensa da inhibira aktivnosti spektra dodatnih agenasa, uključujući, možda, druge članove TGFbeta superfamilije, i takva kolektivna inhibicija može dovesti do željenog efekta na, na primer, mijelofibrozu], izlaganje pored toga prikazuje da poželjni terapeutski agensi mogu da se odaberu na bazi ActRIIB antagonizma. Zbog toga, bez želje da se bude vezan za naročit mehanizam dejstva, očekuje se da drugi ActRIIB antagonisti [npr., antagonisti ActRIIB receptora, antagonisti jednog ili više ActRIIB liganada (npr., GDF11, GDF8, aktivin B, BMP6, GDF3, i BMP10), antagonisti jednog ili više tip I receptora (npr., ALK4, ALK5, i/ili ALK7), antagonisti jednog ili više ko-receptora, i/ili antagonisti jedne ili više ActRIIB nishodno signalizirajuće komponente (npr., Smads)], ili kombinacija takvih antagonista] budu korisni u lečenju mijelofibroze, posebno u lečenju ili prevenciji jedne ili više komplikacija mijelofibroze (npr., splenomegalija, ekstramedularna hematopoeza, anemija, i fibroza). Takvi agensi se ovde grupno označavaju kao "ActRIIB antagonisti" ili "ActRIIB inhibitori".
[0024] Prema tome, ovde su izloženi, ali nisu obuhvaćeni patentnim zahtevima, postupci za lečenje mijelofibroze, koji obuhvataju primenjivanje pacijentu kome je to neophodno efektivne količine ActRIIB antagonista. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje jedne ili više komplikacija mijelofibroze, koji obuhvataju primenjivanje pacijentu kome je to neophodno efektivne količine ActRIIB antagonista. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za prevenciju mijelofibroze, koji obuhvataju primenjivanje pacijentu kome je to neophodno efektivne količine ActRIIB antagonista. Isto opisani, ali ne i pokriveni patentnim zahtevima, su postupci za prevenciju jedne ili više komplikacija mijelofibroze, koji obuhvataju primenjivanje pacijentu kome je to neophodno efektivne količine ActRIIB antagonista. U izvesnim nezahtevanim aspektima, izlaganje se odnosi na smanjivanje brzine progresije mijelofibroze, koje obuhvata primenjivanje pacijentu kome je to neophodno efektivne količine ActRIIB antagonista. U izvesnim nezahtevanim ostvarenjima, izlaganje se odnosi na smanjivanje brzine progresije jedne ili više komplikacija mijelofibroze, koje obuhvata primenjivanje pacijentu kome je to neophodno efektivne količine ActRIIB antagonista. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za smanjivanje težine mijelofibroze, koji obuhvataju primenjivanje pacijentu kome je to neophodno efektivne količine ActRIIB antagonista. U izvesnim nezahtevanim ostvarenjima, izlaganje se odnosi na smanjivanje težine jedne ili više komplikacija mijelofibroze, koje obuhvata primenjivanje pacijentu kome je to neophodno efektivne količine ActRIIB antagonista. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent boluje od primarne mijelofibroze. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent boluje od post-policitemija vera mijelofibroze. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent boluje od post-esencijalne trombocitemije mijelofibroze. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent ima nizak rizik od mijelofibroze prema Međunarodnom prognostičkom sistemu skoringa (IPSS). Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent ima intermedijerni-1 rizik od mijelofibroze prema IPSS. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent ima intermedijerni-2 rizik od mijelofibroze prema IPSS IPSS. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent ima visok rizik od mijelofibroze prema IPSS. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent ima nizak rizik od mijelofibroze prema dinamičkom IPSS (DIPSS). Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent ima intermedijerni-1 rizik od mijelofibroze prema DIPSS. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent ima intermedijerni-2 rizik od mijelofibroze prema DIPSS. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent ima visok rizik od mijelofibroze prema DIPSS. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent ima nizak rizik od mijelofibroze prema DIPSS-plus. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent ima intermedijerni-1 rizik od mijelofibroze prema DIPSS-plus. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent ima intermedijerni-2 rizik od mijelofibroze prema DIPSS-plus. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, gde pacijent ima visok rizik od mijelofibroz prema DIPSS-plus. ActRIIB antagonist može da se upotrebi za prevenciju ili odlaganje rizika progresije mijelofibroze prema ma kom od prepoznatih rizika modela stratifikacije za mijelofibrozu (npr., IPSS, DIPPS, i DIPPS-plus). Na primer, ActRIIB antagonist može da se upotrebi za prevenciju ili odlaganje rizika progresije mijelofibroze od niskog rizika do intermedijernog-1 rizika prema IPSS, DIPPS, ili DIPPS-plus. ActRIIB antagonist može da se upotrebi za prevenciju ili odlaganje rizika progresije mijelofibroze od intermedijernog-1 rizika do intermedijernog-2 rizika prema IPSS, DIPPS, ili DIPPS-plus. ActRIIB antagonist može da se upotrebi za prevenciju ili odlaganje rizika progresije mijelofibroze od intermedijernog-2 rizika do visokog rizika prema IPSS, DIPPS, ili DIPPS-plus. ActRIIB antagonist može da se upotrebi za podsticanje ili povećanje opadanja rizika od mijelofibroze prema ma kom od prepoznatih rizika modela stratifikacije za mijelofibrozu (npr., IPSS, DIPPS, i DIPPS-plus). Na primer, ActRIIB antagonist može da se upotrebi za podsticanje ili povećanje opadanja rizika od mijelofibroze od visokog rizika do intermedijernog-2 rizika prema IPSS, DIPPS, ili DIPPS-plus. ActRIIB antagonist može da se upotrebi za podsticanje ili povećanje opadanja rizika od mijelofibroze od intermedijernog-2 rizika do intermedijernog-1 rizika prema IPSS, DIPPS, ili DIPPS-plus. ActRIIB antagonist može da se upotrebi za podsticanje ili povećanje opadanja rizika od mijelofibroze od intermedijernog-1 rizika do niskog rizika prema IPSS, DIPPS, ili DIPPS-plus. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za primenu ActRIIB antagonista za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze pri čemu pacijent ima jednu ili više mutacija gena koje su u vezi sa mijelofibrozom. Na primer, ActRIIB antagonist može da se primeni u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze gde je mijelofibroza u vezi sa jednom ili više genskih mutacija izdvojenih iz grupe, koju čine: nula zigotnost za JAK2 46/1 haplotip, JAK2V617F, IDH1, IDH2, EZH2, SRSF2, ASXL1, JAK1, JAK2, JAK3, TYK2, MPL, CALR, CALR+ASXL1-, CALR-ASKL1+, CALR+ASKL1+, CALR-ASKL1-, TET2, THPO, i LNK.
ActRIIB antagonist može da se primeni u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze gde je mijelofibroza u vezi sa jednom ili više genskih mutacija u Janus kinazi (JAK) (npr., JAK1, JAK2, i/ili JAK3). ActRIIB antagonist može da se primeni u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze gde je mijelofibroza u vezi sa jednom ili više genskih mutacija u JAK2. ActRIIB antagonist može da se primeni u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze gde je mijelofibroza u vezi sa JAK2V617F mutacijom. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za primenu ActRIIB antagonista u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze gde je mijelofibroza u vezi sa povećanjem jednog ili više serumskih markera izdvojenih iz grupe, koju čine: povećani serumski IL-8 nivoi, povećani serumski IL-2R nivoi, i povećani serumski nivoi slobodnih lakih lanaca. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za primenu ActRIIB antagonista u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze pri čemu je pacijent bio tretiran sa inhibitorom Janus kinaze (npr., ruksolitinib, fedratinib (SAR302503), monoelotinib (CYT387), pakritinib, lestaurtinib, AZD-1480, BMS-911543, NS-018, LY2784544, SEP-701, XL019, i AT-9283). ActRIIB antagonist može biti primenjen u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze pri čemu je pacijent intolerantan na inhibitor Janus kinaze. ActRIIB antagonist može biti primenjen u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze pri čemu je pacijent ima neadekvatan odgovor na inhibitor Janus kinaze. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci za primenu ActRIIB antagonista u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze pri čemu je pacijent bio tretiran sa hidroksiureom. ActRIIB antagonist može biti primenjen u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze pri čemu je pacijent intolerantan na hidroksiureu. ActRIIB antagonist može biti primenjen u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze pri čemu je pacijent ima neadekvatan odgovor na hidroksiureu.
[0025] Kako je ovde opisano, mijelofibroza je klonski neoplastični poremećaj hematopoeze koji je povezan sa raznim kliničkim komplikacijama koje mogu da se manifestuju tokom progresije bolesti kod pacijenta. Primeri izlaganja pokazuju da ActRIIB antagonist može da se koristi za ublažavanje brojnih kliničkih komplikacija, ukazujući na to da se ActRIIB antagonist može koristiti za širi tretman različitih komplikacija mijelofibroze što je u suprotnosti sa brojnim današnjim terapijama mijelofibroze, koje leče samo jednu ili ograničen broj komplikacija ove bolesti. Zbog toga, ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine ne-efektivne hematopoeze kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine ekstramedularne hematopoeze kod pacijenata sa mijelofibrozom. Na primer, ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine ekstramedularne hematopoeze u slezini (slezinska ekstramedularna hematopoeza) kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine ekstramedularne hematopoeze u jetri (jetrena ekstramedularna hematopoeza) kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine ekstramedularne hematopoeze u plućima (plućna ekstramedularna hematopoeza) kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine ekstramedularne hematopoeze u limfnim čvorovima (limfatična ekstramedularna hematopoeza) kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine inflamacije i/ili uvećanja (u veličini) organa ili tkiva kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine inflamacije i/ili uvećanja (u veličini) slezine pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine inflamacije i/ili uvećanja (u veličini) jetre pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine inflamacije i/ili uvećanja (u veličini) pluća pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine inflamacije i/ili uvećanja (u veličini) limfnih čvorova pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine splenomegalije kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine hepatomegalije kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine fibroze kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine fibroze kostne srži kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine fibroze slezine kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine fibroze jetre kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine fibroze pluća kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine fibroze limfnih čvorova kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine osteoskleroze kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine osteomijelofibroze. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija mijelofibroze koje se odnose na krv. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine anemije kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine trombocitopenije kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine pancitopenije kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine pojkilocitoze kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine krvarenja kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine jednog ili više konstitucionalnih simptoma mijelofibroze (npr., umor, svrab, gubitak težine, noćna znojenja, groznica, abdominalni bol ili nelagodnost, parestezije, i rana sitost). ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine bola u tkivima i/ili organima kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine bola u kostima kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine artralgije kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mialgije kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine kaheksije kod pacijenata sa mijelofibrozom. U izvesnim aspektima, izlaganje se odnosi na povećavanje nivoa krvnih ćelija kod pacijenata sa mijelofibrozom primenjivanjem efektivne količine ActRIIB antagonista. U izvesnim aspektima, izlaganje se odnosi na povećavanje nivoa hemoglobina kod pacijenata sa mijelofibrozom primenjivanjem efektivne količine ActRIIB antagonista. U izvesnim aspektima, pacijenti sa mijelofibrozom koji treba da se leče ovde opisanim postupcima imaju anemiju. ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine anemije kod pacijenata sa mijelofibrozom. U izvesnim aspektima, ActRIIB antagonist može da se koristi za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili komplikacija mijelofibroze kod pacijenata kojima je bila primenjena jedna ili više transfuzija krvnih ćelija (pune ili transfuzije eritrocita). U nekim ostvarenjima, ActRIIB antagonisti mogu da se koriste za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili komplikacija mijelofibroze kod pacijenata koji su zavisni od transfuzija krvi. U izvesnim aspektima, ActRIIB antagonist može da se primeni za smanjivanje opterećenja transfuzijama krvnih ćelija kod pacijenata sa mijelofibrozom. Na primer, ActRIIB antagonist može da se primeni za smanjivanje transfuzija krvnih ćelija za više od otprilike 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 100% za 4 do 8 nedelja u odnosu na jednak vremenski period do otpočinjanja tretmana ActRIIB antagonistom. ActRIIB antagonist može da se primeni za smanjivanje transfuzija krvnih ćelija za više od otprilike 50% za 4 do 8 nedelja u odnosu na jednak vremenski period pre otpočinjanja tretmana ActRIIB antagonistom kod pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se upotrebi za smanjivanje opterećenja gvožđem kod pacijenata sa mijelofibrozom. Na primer, ActRIIB antagonist može da se upotrebi za smanjivanje opterećenja gvožđem u organu ili tkivu pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se upotrebi za smanjivanje opterećenja gvožđem slezine pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se upotrebi za smanjivanje opterećenja gvožđem jetre pacijenata sa mijelofibrozom. ActRIIB antagonist može da se upotrebi za smanjivanje opterećenja gvožđem srca pacijenata sa mijelofibrozom.
[0026] Pacijentima koji boluju od mijelofibroze može još da se primeni jedan ili više dodatnih aktivnih agenasa i/ili potpornih terapija (pored primenjivanja jednog ili više ActRIIB antagonista) za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze. Na primer, pacijentu dalje može da se primeni jedna ili više potpornih terapija ili aktivnih agenasa koji su izabrani iz grupe, koju čine: transfuzija krvi (puna krv ili transfuzija krvnih ćelija), helatori gvožđa (npr., deferoksamin, deferipron i deferasiroks), kortikosteroidi, prednizon, ESAs (npr., eritropoetin, epoetin alfa, epoetin beta, darbepoetin alfa, i metoksi polietilen glikol-epoetin beta), androgeni, danazol, talidomid, lenalidomid, citoreduktivni agens, hidroksiurea, busulfan, melfaln, kladribin, splenektomija, radioterapija, aspirin, pomalidonmid, inhibitori Janus kinaze, mTOR inhibitori (npr., rapamicin, sirolimus, deforolimus, everolimus, temsirolimus, NVP-BEZ235, BGT226, SF1126, PK1-587, INK128, AZD8055, i AZD2014), i inhibitori histon deacetilaze (npr., givinostat, panobinostat, i pracinostat). Takođe ovde opisani, ipak ne na taj način da budu obuhvaćeni patentnim zahtevima pronalaska, su postupci za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze, koji uključuju primenjivanje pacijentu kome je to neophodno: a) inhibitora Janus kinaze; i b) ActRIIB antagonista, pri čemu se inhibitor Janus kinaze i ActRIIB antagonist primenjuju u efektivnoj količini. ActRIIB antagonist može biti primenjen pre tretmana sa inhibitorom Janus kinaze. ActRIIB antagonist može biti primenjen posle tretmana sa inhibitorom Janus kinaze. ActRIIB antagonist može biti primenjen istovremeno sa inhibitorom Janus kinaze. Inhibitori Janus kinaze mogu biti agensi koji inhibiraju jednu ili više Janus kinaza odabranih iz grupe, koju čine: JAK1, JAK2, i JAK3. Na primer, inhibitor Janus kinaze može biti agens koji inhibira signaliziranje jedne ili više od JAK1, JAK2, i JAK3 u testu na ćelijama. Inhibitor Janus kinaze može biti odabran iz grupe, koju čine: ruksolitinib, fedratinib (SAR302503), monoelotinib (CYT387), pakritinib, lestaurtinib, AZD-1480, BMS-911543, NS-018, LY2784544, SEP-701, XL019, i AT-9283. Inhibitor Janus kinaze može biti ruksolitinib.
[0027] Inhibitori Janus kinaze (npr., ruksolitinib) odobreni su u tretmanu raznih poremećaja uključujući, na primer, mijelofibrozu. Sem toga, postoje brojna druga klinička istraživanja u toku za određivanje efikasnosti inhibitora Janus kinaze u lečenju raznih drugih bolesti. Uobičajeni neželjeni sporedni efekat terapije inhibitorom Janus kinaze je anemija. Dok transfuzija krvnih ćelija i terapija aktivatorom EPO receptora može da se primeni u lečenju anemije kod pacijenata tretiranih sa inhibitorima Janus kinaze, ove terapije za anemiju su, isto tako, povezane sa štetnim efektima kod pacijenata (npr., podstiču ili povećavaju opterećenost gvožđem, neadekvatan odgovor na EPO, i EPO intolerancija). Zbog toga, u struci postoji potreba za alternativnim postupcima za povećavanje nivoa crvenih krvnih ćelija/hemoglobina i lečenje anemija kod pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze. Delom, ovo izlaganje se odnosi na otkriće da ActRIIB antagonist (inhibitor) može da se upotrebi za povećavanje nivoa crvenih krvnih ćelija i hemoglobina kod pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze. Prema tome, isto opisane, još ne i zahtevane, su kompozicije i postupci za povećavanje nivoa crvenih krvnih ćelija/hemoglobina i lečenje ili sprečavanje anemije kod pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze primenjivanjem pacijentu kome je to neophodno efektivne količine jednog ili više ActRIIB antagonista, opciono u kombinaciji sa jednom ili više drugih potpornih terapija ili aktivnih agenasa za lečenje anemije. Dok GDF trap polipeptidi mogu uticati na nivo eritrocita i/ili hemoglobina preko mehanizma koji nije ActRIIB antagonizam [npr., inhibicija jednog ili više od: GDF11, GDF8, aktivin B, BMP6, GDF3, i BMP10 može biti indikator tendencije agensa da inhibira aktivnosti spektra dodatnih agenasa, uključujući, možda, druge članove TGF-beta superfamilije, i takva grupna inhibicija može dovesti do željenog efekta na, na primer, nivo crvenih krvnih ćelija/hemoglobina kod pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze], izlaganje, pored toga, demonstrira da poželjni terapeutski agensi mogu da se biraju na osnovu ActRIIB antagonizma. Zbog toga, bez želje da se bude vezan posebnim mehanizmom dejstva, očekuje se da i drugi ActRIIB antagonisti [npr., antagonisti ActRIIB receptora, antagonisti jednog ili više ActRIIB liganada (npr., GDF11, GDF8, aktivin B, BMP6, GDF3, i BMP10), antagonisti jednog ili više tip I receptora (npr., ALK4, ALK5, i/ili ALK7), antagonisti jednog ili više ko-receptora, i/ili antagonisti jedne ili više ActRIIB nishodno signalizirajućih komponenti (npr., Smads)], ili kombinacija takvih antagonista] budu korisni u tretmanu pacijenata tretiranih sa Janus kinazom, posebno u lečenju ili prevenciji jedne ili više komplikacija udruženih sa terapijom Janus kinazom (npr., anemija, trombocitopenija, i/ili neutropenija). Takvi agensi se zajednički ovde označavaju kao "ActRIIB antagonisti" ili "ActRIIB inhibitori".
[0028] Isto tako, ovde su opisani, još uvek ne i zahtevani, postupci kojima se povećavaju nivoi eritrocita i/ili nivoi hemoglobina kod pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze, putem primenjivanja pacijentu kome je to neophodno efektivne količine ActRIIB antagonista. ActRIIB antagonisti mogu da se upotrebe za lečenje ili sprečavanje anemije kod pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze. Pacijent tretiran sa inhibitorom Janus kinaze je mogao primiti jednu ili više transfuzija krvnih ćelija pre otpočinjanja tretmana sa ActRIIB antagonistom. Pacijent tretiran sa inhibitorom Janus kinaze je zavisan od transfuzije krvi. Isto tako, ovde su opisani, još uvek ne i zahtevani, postupci za korišćenje ActRIIB antagonista za smanjivanje opterećenja transfuzijama krvi kod pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze. Na primer, ActRIIB antagonist može da se koristi za smanjivanje transfuzija krvnih ćelija za više od otprilike 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 100% za 4 do 8 nedelja u odnosu na jednak vremenski period pre otpočinjanja tretmana sa ActRIIB antagonistima kod pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze. ActRIIB antagonist može da se koristi za smanjivanje transfuzija krvnih ćelija za više od otprilike 50% za 4 do 8 nedelja u odnosu na jednak vremenski period pre otpočinjanja tretmana sa ActRIIB antagonistima kod pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze. Isto opisani, još uvek ne i zahtevani, postupci za primenu ActRIIB antagonista u smanjivanju preopterećenja gvožđem kod pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze. ActRIIB antagonisti mogu da se koriste za smanjivanje sadržaja gvožđa u jetri kod pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze. ActRIIB antagonisti mogu da se koriste za smanjivanje sadržaja gvožđa u slezini kod pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze. ActRIIB antagonisti mogu da se koriste za smanjivanje sadržaja gvožđa u srcu kod pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze. ActRIIB antagonist može da se primeni pre tretmana sa inhibitorom Janus kinaze. ActRIIB antagonist može da se primeni posle tretmana sa inhibitorom Janus kinaze. ActRIIB antagonist može da se primeni istovremeno sa inhibitorom Janus kinaze. Pacijenat tretiran sa inhibitorom Janus kinaze može biti tretiran sa agensom koji je inhibitor koji inhibira jednu ili više Janus kinaza izdvojenih iz grupe, koju čine: JAK1, JAK2, i JAK3. Inhibitor Janus kinaze može inhibirati signaliziranje jedne ili više JAK1, JAK2, i JAK3 u testu na ćelijama. Na primer, pacijent može biti tretiran sa jednim ili više inhibitora Janus kinaze odabranih iz grupe koja se sastoji od: ruksolitiniba, fedratiniba (SAR302503), monoelotiniba (CYT387), pakritiniba, lestaurtiniba, AZD-1480, BMS-911543, NS-018, LY2784544, SEP-701, XL019, i AT-9283. Pacijent može biti tretiran sa ruksolitinibom.
[0029] ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, koji će se koristiti prema ovde opisanim postupcima i primenama je agens koji inhibira najmanje GDF11 (npr., GDF11 antagonist). Efekti na GDF11 inhibiciju se mogu odrediti, na primer, korišćenjem testa na ćelijama uključujući one koji su ovde opisani (npr., reporter test Smad signaliziranja). Zbog toga, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za GDF 11. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, primenom testa afiniteta vezivanja uključujući one koji su ovde opisani. ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za GDF 11 sa KDod najmanje 1 x 10<-7>M (npr., najmanje 1 x 10<-8>M, najmanje 1 x 10<-9>M, najmanje 1 x 10<-10>M, najmanje 1 x 10<-11>M, ili najmanje 1 x 10<-12>M). Različiti ActRIIB antagonisti koji inhibiraju GDF11 mogu da se koriste prema ovde opisanim postupcima i primenama uključujući, na primer, ligandne traps (zamke, prim. prev.) (npr., ActRIIB polipeptidi, GDF Traps, folistatinski polipeptidi, i FLRG polipeptidi), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence, i njihove kombinacije. ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, koji inhibira GDF11 može dalje inhibirati jedan ili više od: aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7.
[0030] ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, može biti agens koji inhibira najmanje GDF8 (npr., GDF8 antagonist). Efekti na GDF8 inhibiciju se mogu odrediti, na primer, korišćenjem testa na ćelijama uključujući one koji su ovde opisani (npr., reporter test Smad signaliziranja). Zbog toga, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za GDF8. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, primenom testa afiniteta vezivanja uključujući one koji su ovde opisani. ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za GDF 8 sa KDod najmanje 1 x 10<-7>M (npr., najmanje 1 x 10<-8>M, najmanje 1 x 10<-9>M, najmanje 1 x 10<-10>M, najmanje 1 x 10<-11>M, ili najmanje 1 x 10-
<12>M). Različiti ActRIIB antagonisti koji inhibiraju GDF8 mogu da se koriste, na primer, ligandne zamke (traps) (npr., ActRIIB polipeptidi, GDF Traps, folistatinski polipeptidi, i FLRG polipeptidi), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence, i njihove kombinacije. ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, koji inhibira GDF8 može dalje inhibirati jedan ili više od: aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE), GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7.
[0031] ActRIIB antagonist, antagonist, ili kombinacija antagonista, može biti agens koji inhibira najmanje GDF3 (npr., GDF3 antagonist). Efekti na GDF3 inhibiciju se mogu odrediti, na primer, korišćenjem testa na ćelijama uključujući one koji su ovde opisani (npr., reporter test Smad signaliziranja). Zbog toga, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za GDF3. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, primenom testa afiniteta vezivanja uključujući one koji su ovde opisani. ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za GDF 3 sa KDod najmanje 1 x 10<-7>M (npr., najmanje 1 x 10<-8>M, najmanje 1 x 10<-9>M, najmanje 1 x 10<-10>M, najmanje 1 x 10<-11>M, ili najmanje 1 x 10-
<12>M). Različiti ActRIIB antagonisti koji inhibiraju GDF3 mogu da se koriste uključujući, na primer, ligandne zamke (traps) (npr., ActRIIB polipeptidi, GDF Traps, folistatinski polipeptidi, i FLRG polipeptidi), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence, i njihove kombinacije. ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, koji inhibira GDF3 može dalje inhibirati jedan ili više od: aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7.
[0032] ActRIIB antagonist, antagonist, ili kombinacija antagonista, može biti agens koji inhibira najmanje BMP6 (npr., BMP6 antagonist). Efekti na BMP6 inhibiciju se mogu odrediti, na primer, korišćenjem testa na ćelijama uključujući one koji su ovde opisani (npr., reporter test Smad signaliziranja). Zbog toga, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za BMP6. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, primenom testa afiniteta vezivanja uključujući one koji su ovde opisani. ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za BMP6 sa KDod najmanje 1 x 10<-7>M (npr., najmanje 1 x 10<-8>M, najmanje 1 x 10<-9>M, najmanje 1 x 10<-10>M, najmanje 1 x 10<-11>M, ili najmanje 1 x 10<-12>M). Različiti ActRIIB antagonisti koji inhibiraju BMP6 mogu da se koriste, na primer, ligandne zamke (traps) (npr., ActRIIB polipeptidi, GDF Traps, folistatinski polipeptidi, i FLRG polipeptidi), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence, i njihove kombinacije. ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, koji inhibira BMP6 može dalje inhibirati jedan ili više od: aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7.
[0033] ActRIIB antagonist, antagonist, ili kombinacija antagonista, može biti agens koji inhibira najmanje BMP10 (npr., BMP10 antagonist). Efekti na BMP10 inhibiciju se mogu odrediti, na primer, korišćenjem testa na ćelijama uključujući one koji su ovde opisani (npr., reporter test Smad signaliziranja). Zbog toga, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za BMP10. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, primenom testa afiniteta vezivanja uključujući one koji su ovde opisani. ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za BMP10 sa KDod najmanje 1 x 10<-7>M (npr., najmanje 1 x 10<-8>M, najmanje 1 x 10<-9>M, najmanje 1 x 10<-10>M, najmanje 1 x 10<-11>M, ili najmanje 1 x 10-
<12>M). Različiti ActRIIB antagonisti koji inhibiraju BMP10 mogu da se koriste, na primer, ligandne zamke (traps) (npr., ActRIIB polipeptidi, GDF Traps, folistatinski polipeptidi, i FLRG polipeptidi), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence, i njihove kombinacije. ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, koji inhibira BMP10 može dalje inhibirati jedan ili više od: aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7.
[0034] U izvesnim aspektima koji su takođe ovde opisani, ipak još uvek nisu pokriveni patentnim zahtevima pronalaska, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, može biti agens koji inhibira najmanje aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE) (npr., aktivinski antagonist). Efekti na inhibiciju aktivina se mogu odrediti, na primer, korišćenjem testa na ćelijama uključujući one koji su ovde opisani (npr., reporter test Smad signaliziranja). Zbog toga, u nekim nezahtevanim ostvarenjima koja nisu prema zahtevanom pronalasku, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, izlaganja mogu da se vežu najmanje za aktivin. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, primenom testa afiniteta vezivanja uključujući one koji su ovde opisani. U nekim nezahtevanim ostvarenjima, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, izlaganja vezuju se najmanje za aktivin sa KDod najmanje 1 x 10<-7>M (npr., najmanje 1 x 10<-8>M, najmanje 1 x 10<-9>M, najmanje 1 x 10<-10>M, najmanje 1 x 10<-11>M, ili najmanje 1 x 10<-12>M). Prema zahtevanom pronalasku, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, koji će biti primenjen prema ovde opisanim postupcima i primenama se suštinski ne vezuje za aktivin A (npr., vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., otprilike 1 x 10<-8>M ili oko 1310<-9>M) i/ili inhibira aktivnost aktivina A.
[0035] U izvesnim nezahtevanim aspektima, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, koji će se primeniti prema ovde opisanim postupcima i primenama je agens koji inhibira najmanje ActRIIB (npr., ActRIIB antagonist). Efekti na inhibiciju ActRIIB se mogu odrediti, na primer, korišćenjem testa na ćelijama uključujući one koji su ovde opisani (npr., reporter test Smad signaliziranja). Zbog toga, u nekim nezahtevanim ostvarenjima, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za ActRIIB. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, primenom testa afiniteta vezivanja uključujući one koji su ovde opisani. U nekim nezahtevanim ostvarenjima, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, vezuju se najmanje za ActRIIB sa KDod najmanje 1 x 10<-7>M (npr., najmanje 1 x 10<-8>M, najmanje 1 x 10<-9>M, najmanje 1 x 10<-10>M, najmanje 1 x 10<-11>M, ili najmanje 1 x 10<-12>M). Razni ActRIIB antagonisti koji inhibiraju ActRIIB mogu da se koriste u takvim nezahtevanim ostvarenjima uključujući, na primer, ligandne zamke (traps) (npr., ActRIIB polipeptidi, GDF Traps, folistatinski polipeptidi, i FLRG polipeptidi), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence, i njihove kombinacije. U izvesnim od ovih nezahtevanih ostvarenja, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, koji inhibira ActRIIB može dalje inhibirati jedan ili više od: aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP10, ALK4, ALK5, i ALK7.
[0036] U izvesnim nezahtevanim aspektima, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, može biti agens koji inhibira najmanje ALK4 (npr., ALK4 antagonist). Efekti na inhibiciju ALK4 se mogu odrediti, na primer, korišćenjem testa na ćelijama uključujući one koji su ovde opisani (npr., reporter test Smad signaliziranja). Zbog toga, u nekim od nezahtevanih ostvarenja, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za ALK4. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, primenom testa afiniteta vezivanja uključujući one koji su ovde opisani. U nekim nezahtevanim ostvarenjima, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, vezuju se najmanje za ALK4 sa KDod najmanje 1 x 10<-7>M (npr., najmanje 1 x 10<-8>M, najmanje 1 x 10<-9>M, najmanje 1 x 10<-10>M, najmanje 1 x 10<-11>M, ili najmanje 1 x 10<-12>M). Kako je ovde opisano, razni ActRIIB antagonisti koji inhibiraju ALK4 mogu da se koriste, na primer, ligandne zamke (traps) (npr., ActRIIB polipeptidi, GDF Traps, folistatinski polipeptidi, i FLRG polipeptidi), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence, i njihove kombinacije. U izvesnim od ovih nezahtevanih ostvarenja, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, koji inhibira ALK4 može dalje inhibirati jedan ili više od: aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK5, i ALK7.
[0037] U izvesnim nezahtevanim aspektima, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, može biti agens koji inhibira najmanje ALK5 (npr., ALK5 antagonist). Efekti na inhibiciju ALK5 se mogu odrediti, na primer, korišćenjem testa na ćelijama uključujući one koji su ovde opisani (npr., reporter test Smad signaliziranja). Zbog toga, u nekim od nezahtevanih ostvarenja, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za ALK5. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, primenom testa afiniteta vezivanja uključujući one koji su ovde opisani. U nekim nezahtevanim ostvarenjima, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, vezuju se najmanje za ALK5 sa KDod najmanje 1 x 10<-7>M (npr., najmanje 1 x 10<-8>M, najmanje 1 x 10<-9>M, najmanje 1 x 10<-10>M, najmanje 1 x 10<-11>M, ili najmanje 1 x 10<-12>M). Razni ActRIIB antagonisti koji inhibiraju ALK5 mogu da se koriste, na primer, ligandne zamke (traps) (npr., ActRIIB polipeptidi, GDF Traps, folistatinski polipeptidi, i FLRG polipeptidi), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence, i njihove kombinacije. U izvesnim od ovih nezahtevanih ostvarenja, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, koji inhibira ALK5 može dalje inhibirati jedan ili više od: aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK4, i ALK7.
[0038] U izvesnim nezahtevanim aspektima, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, može biti agens koji inhibira najmanje ALK7 (npr., ALK7 antagonist). Efekti na inhibiciju ALK7 se mogu odrediti, na primer, korišćenjem testa na ćelijama uključujući one koji su ovde opisani (npr., reporter test Smad signaliziranja). Zbog toga, u nekim od nezahtevanih ostvarenja, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, mogu da se vežu najmanje za ALK7. Aktivnost vezivanja liganda može da se odredi, na primer, primenom testa afiniteta vezivanja uključujući one koji su ovde opisani. U nekim nezahtevanim ostvarenjima, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, vezuju se najmanje za ALK7 sa KDod najmanje 1 x 10<-7>M (npr., najmanje 1 x 10<-8>M, najmanje 1 x 10<-9>M, najmanje 1 x 10<-10>M, najmanje 1 x 10<-11>M, ili najmanje 1 x 10<-12>M). Razni ActRIIB antagonisti koji inhibiraju ALK7 mogu da se koriste, na primer, ligandne zamke (traps) (npr., ActRIIB polipeptidi, GDF Traps, folistatinski polipeptidi, i FLRG polipeptidi), antitela, male molekule, nukleotidne sekvence, i njihove kombinacije. U izvesnim od ovih nezahtevanih ostvarenja, ActRIIB antagonist, ili kombinacija antagonista, koji inhibira ALK7 može dalje inhibirati jedan ili više od: aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE), GDF8, GDF3, GDF11, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK5, i ALK4.
[0039] Delom, izlaganje se odnosi na ActRIIB antagoniste koji su ActRIIB polipeptidi. Izraz "ActRIIB polipeptid" kolektivno se odnosi na ActRIIB polipeptide koji se javljaju u prirodi kao i na njihove skraćene oblike i varijante, kao što su one koje su ovde opisane (npr., GDF trap polipeptidi). ActRIIB polipeptidi mogu sadržavati, sastojati se suštinski od, ili biti sastavljeni od ligand-vezujućeg domena ActRIIB polipeptida ili njegovog modifikovanog (varijanta) oblika. Na primer, ActRIIB polipeptid može sadržavati, sastojati se suštinski od, ili biti sastavljen od ActRIIB ligand-vezujućeg domena ActRIIB polipeptida, na primer, dela ActRIIB ekstracelularnog domena. Poželjno, ActRIIB polipeptidi koji će se primenjivati prema postupcima koji su ovde opisani su rastvorljivi polipeptidi.
[0040] U izvesnim aspektima, izlaganje se odnosi na kompozicije koje sadrže ActRIIB polipeptid i njihovu primenu. Prema pronalasku, ActRIIB polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa sekvencom aminokiselina 29-109 u SEQ ID NO: 1, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu [koja se javlja u prirodi (E ili D) ili veštačku kiselu aminokiselinu] na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U drugim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa sekvencom aminokiselina 25-131 u SEQ ID NO: 1. U nekim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom 25-131 u SEQ ID NO: 1, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U drugim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U drugim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 3, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 5, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 6, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U poželjnim ostvarenjima prema zahtevanom pronalasku, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 24. U drugim poželjnim ostvarenjima prema zahtevanom pronalasku, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 25. U drugim poželjnim ostvarenjima prema zahtevanom pronalasku ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 28. U drugim poželjnim ostvarenjima prema zahtevanom pronalasku, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 29. U nekim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 29, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 30, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 31, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 45, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 50, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 53, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U nekim ostvarenjima, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 54, gde ActRIIB polipeptid sadrži kiselu aminokiselinu na položaju 79 u odnosu na SEQ ID NO: 1. U drugim poželjnim ostvarenjima prema zahtevanom pronalasku, ActRIIB polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 58. U izvesnim ostvarenjima koja su takođe ovde opisana, ali nisu pokrivena zahtevima pronalaska, ActRIIB polipeptidi ne sadrže kiselu aminokiselinu na položaju koji odgovara L79 u SEQ ID NO: 1.
[0041] Kako je ovde opisano, ActRIIB polipeptidi i njihove varijante (GDF traps) mogu biti homomultimeri, na primer, homodimer, homotrimeri, homotetrameri, homopentameri, i homomultimerni kompleksi višeg stepena. ActRIIB polipeptidi i njihove varijante mogu biti homodimeri. ActRIIB polipeptidni dimeri koji su ovde opisani mogu imati prvi ActRIIB polipeptid kovalentno, ili ne-kovalentno, udružen sa drugim ActRIIB polipeptidom pri čemu prvi polipeptid sadrži ActRIIB domen i aminokiselinsku sekvencu prvog člana (ili drugog člana) interakcijskog para (npr., konstantni domen imunoglobulina) i drugi polipeptid sadrži ActRIIB polipeptid i aminokiselinsku sekvencu drugog člana (ili prvog člana) interakcijskog para.
[0042] ActRIIB polipeptidi, uključujući njegove varijante (npr., GDF traps), mogu biti fuzioni proteini. Na primer, ActRIIB polipeptid može biti fuzioni protein koji sadrži ActRIIB polipeptidni domen i jedan ili više heterolognih (ne-ActRIIB) polipeptidnih domena. ActRIIB polipeptid može biti fuzioni protein koji ima, kao jedan domen, aminokiselinsku sekvencu izvedenu od ActRIIB polipeptida (npr., ligand-vezujući domen ActRIIB receptora ili njegove varijante) i jedan ili više heterologih domena koji obezbeđuju željeno svojstvo, kao što je poboljšana farmakokinetika, lakše prečišćavanje, ciljanje u posebna tkiva, itd. Na primer, domen fuzionog proteina može povećati jednu ili više in vivo stabilnost, in vivo polu-život, preuzimanje/primenjivanje, tkivnu lokalizaciju ili raspodelu, formiranje kompleksa proteina, multimerizaciju fuzionog proteina, i/ili prečišćavanje. ActRIIB polipeptidni domen fuzionog proteina može biti direktno spojen (fuzionisan) sa jednim ili više heterolognih polipeptidnih domena, ili intervenišućom sekvencom, kao što je linker, može biti pozicioniran između aminokiselinske sekvence ActRIIB polipeptida i aminokiselinske sekvence jednog ili više heterologih domena. ActRIIB fuzioni protein može imati relativno nestrukturisan linker pozicioniran između heterologog domena i ActRIIB domena. Ovaj nestrukturisani linker može odgovarati otprilike nestrukturisanom regionu od 15 aminokiselina na C-terminalnom kraju ekstracelularnog domena ActRIIB ("tail"), ili može biti veštačka sekvenca od između 3 i 15, 20, 30, 50 ili više aminokiselina koje su relativno bez sekundarne strukture. Linker može biti bogat u ostacima glicina i prolina i može, na primer, sadržavati ponavljajuće sekvence treonin/serin i glicina. Primeri linkera uključuju, ali bez ograničenja, sekvence TGGG (SEQ ID NO: 18), SGGG (SEQ ID NO: 19), TGGGG (SEQ ID NO: 16), SGGGG (SEQ ID NO: 17), GGGGS (SEQ ID NO: 20), GGGG (SEQ ID NO: 15), i GGG (SEQ ID NO: 14). ActRIIB fuzioni proteini mogu imati konstantan domen imunoglobulina, uključujući, na primer, Fc deo imunoglobulina. Na primer, aminokiselinska sekvenca koja je izvedena od Fc domena IgG (IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4), IgA (IgA1 ili IgA2), IgE, ili IgM imunoglobulina. Na primer, Fc deo imunoglobulinskog domena može imati, sastojati se suštinski od, ili biti sastavljen od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa ma kojom iz SEQ ID NOs: 9-13. Takvi imunoglobulinski domeni mogu imati jednu ili više aminokiselinskih modifikacija (npr., delecije, adicije, i/ili supstitucije) koje potvrđuju izmenjenu Fc aktivnost, npr., smanjenje jedne ili više Fc efektorne funkcije. ActRIIB fuzioni protein može imati aminokiselinsku sekvencu kako je prikazana u formuli A-B-C. Na primer, B deo može biti N- i C-terminalno skraćeni ActRIIB polipeptid kako je ovde opisano. A i C delovi mogu biti nezavisno nula, jedna, ili više od jedne aminokiseline, i oba i A i C deo su heterologni sa B. A i/ili C delovi mogu biti vezani za B deo preko linker sekvence. ActRIIB fuzioni protein može imati lider sekvencu. Lider sekvenca može biti nativna ActRIIB lider sekvenca ili heterologna lider sekvenca. Lider sekvenca može biti lider sekvenca tkivnog plazminogen aktivatora (TPA).
[0043] ActRIIB polipeptid, uključujući njegove varijante (npr., GDF traps), može imati prečišćavajuću podsekvencu, kao što je epitop tag, FLAG tag, polihistidinska sekvenca, i GST fuzija. Opciono, ActRIIB polipeptid može imati jedan ili više modifikovanih aminokiselinskih ostataka odabranih od: glikozilovana aminokiselina, PEGilovana aminokiselina, famezilovana aminokiselina, acetilovana aminokiselina, biotinilovana aminokiselina, i/ili aminokiselina konjugovana sa lipidnim delom. ActRIIB polipeptidi može imati najmanje jedan N-povezani šećer, i može uključivati dva, tri ili više N-povezanih šećera. Takvi polipeptidi mogu, isto tako, imati O-povezane šećere. Generalno, poželjno je da se ActRIIB polipeptidi ekspresuju u ćelijskoj liniji sisara koja posreduje pogodnu prirodnu glikozilaciju polipeptida tako da se umanji verovatnost nepoželjnog imunog odgovora kod pacijenta. ActRIIB polipeptidi mogu biti proizvedeni u različitim ćelijskim linijama koje glikoziliraju protein na način da je pogodan za korišćenje kod pacijenata, uključujući konstruisane ćelije insekata ili gljivica, i ćelije sisara kao što su: COS ćelije, CHO ćelije, HEK ćelije i NSO ćelije. ActRIIB polipeptid može biti glikoziliran i može imati glikozilacioni profil koji se može dobiti sa ovarijalnom ćelijskom linijom kineskog hamstera. ActRIIB polipeptidi mogu ispoljiti serumski polu-život od najmanje 4, 6, 12, 24, 36, 48, ili 72 sata kod sisara (npr., miša ili čoveka). Opciono, ActRIIB može ispoljiti serumski polu-život od najmanje 6, 8, 10, 12, 14, 20, 25, ili 30 dana kod sisara (npr., miš ili čovek).
[0044] Isto tako, ovde su izloženi farmaceutski preparati koji sadrže jedan ili više ActRIIB antagonista ovog izlaganja i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutski preparat može takođe sadržavati jedan ili više dodatnih aktivnih agenasa kao što je jedinjenje koje se koristi za lečenje mijelofibroze, posebno lečenje ili prevenciju jedne ili više komplikacija mijelofibroze (npr., splenomegalije, ekstramedularne hematopoeze, anemije, i fibroze), i/ili pacijenta tretiranog sa inhibitorom Janus kinaze. Generalno, farmaceutski preparat će poželjno biti bez pirogena (što znači bez pirogena do stepena koji se zahteva pravilima koja upravljaju kvalitetom proizvoda za terapeutsku upotrebu).
[0045] U izvesnim slučajevima, kada je u pitanju primenjivanje ActRIIB antagonista, ili kombinacije antagonista, izlaganja za ovde opisane poremećaje ili stanja, može biti poželjno da se prate efekti na eritrocite tokom primenjivanja ActRIIB antagonista, ili da se odredi ili podesi doziranje ActRIIB antagonista, u cilju smanjivanja neželjenih efekata na eritrocite. Na primer, porasti nivoa eritrocita, nivoa hemoglobina, ili nivoa hematokrita mogu proizvesti neželjeni porast krvnog pritiska.
[0046] U izvesnim aspektima, koji su ovde takođe opisani, ipak ne i obuhvaćeni zahtevanim pronalaskom, ActRIIB antagonist je antitelo, ili kombinacija antitela. Antitelo može da se veže najmanje za ActRIIB. Antitelo koje se vezuje za ActRIIB može inhibirati ActRIIB signaliziranje, opciono kako je izmereno u testu na ćelijama kao što su oni koji su ovde opisani. Antitelo koje se vezuje za ActRIIB može inhibirati jedan ili više liganada TGF-beta superfamilije, tip I receptore TGF-beta superfamilije, ili ko-receptore TGF-beta superfamilije od vezivanja za ActRIIB. Antitelo koje se vezuje za ActRIIB može inhibirati jedan ili više liganada TGF-beta superfamilije od vezivanja za ActRIIB izabranih iz grupe, koju čine: aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE), GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, BMP9, i BMP5. Antitelo može da se veže bar za GDF 11. Antitelo koje se vezuje za GDF 11 može inhibirati ActRIIB signaliziranje, opciono kako je izmereno u testu na ćelijama kao što su oni koji su ovde opisani. Antitelo koje se vezuje za GDF11 može inhibirati GDF11-ActRIIB vezivanje. Antitelo može da se veže najmanje za GDF8. Antitelo koje se vezuje za GDF8 može inhibirati ActRIIB signaliziranje, opciono kako je izmereno u testu na ćelijama kao što su oni koji su ovde opisani. Antitelo koje se vezuje za GDF8 može inhibirati GDF8-ActRIIB vezivanje. Antitelo može da se veže najmanje za BMP6. Antitelo koje se vezuje za BMP6 može inhibirati ActRIIB signaliziranje, opciono kako je izmereno u testu na ćelijama kao što su oni koji su ovde opisani. Antitelo koje se vezuje za BMP6 može inhibirati BMP6-ActRIIB vezivanje. Antitelo može da se veže za BMP10. Antitelo koje se vezuje za at least BMP10 može inhibirati ActRIIB signaliziranje, opciono kako je izmereno u testu na ćelijama kao što su oni koji su ovde opisani. Antitelo koje se vezuje za BMP10 može inhibirati BMP10-ActRIIB vezivanje. Antitelo može da se veže najmanje za GDF3. Antitelo koje se vezuje za GDF3 može inhibirati ActRIIB signaliziranje, opciono kako je izmereno u testu na ćelijama kao što su oni koji su ovde opisani. Antitelo koje se vezuje za GDF3 može inhibirati GDF3-ActRIIB vezivanje. Antitelo može da se veže najmanje za aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE). Antitelo koje se vezuje za aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE) može inhibirati ActRIIB signaliziranje, opciono kako je izmereno u testu na ćelijama kao što su oni koji su ovde opisani.
Antitelo koje se vezuje za aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE) može inhibirati aktivin-ActRIIB vezivanje. Antitelo može da se veže za aktivin B. Antitelo koje se vezuje za aktivin B može inhibirati ActRIIB signaliziranje, opciono kako je izmereno u testu na ćelijama kao što su oni koji su ovde opisani. Antitelo koje se vezuje za aktivin B može inhibirati aktivin B-ActRIIB vezivanje. Antitelo može biti multispecifično antitelo, ili kombinacija multispecifičnih antitela koja vezuje jedan ili više od: ActRIIB, GDF11, GDF8, aktivin A, aktivin B, BMP6, i BMP10. Antitelo može da se veže najmanje za ALK4. Antitelo koje se vezuje za ALK4 može inhibirati ALK4 signaliziranje, opciono kako je izmereno u testu na ćelijama kao što su oni koji su ovde opisani. Antitelo koje se vezuje za ALK4 može inhibirati jedan ili više ActRIIB liganada, tip II receptora, ili ko-receptora od vezivanja za ALK4. Antitelo koje se vezuje za ALK4 može inhibirati jedan ili više ActRIIB liganada od vezivanja za ALK4 odabrana iz grupe, koju čine: aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, i GDF3. Antitelo može da se veže najmanje za ALK5. Antitelo koje se vezuje za ALK5 može inhibirati ALK5 signaliziranje, opciono kako je izmereno u testu na ćelijama kao što su oni koji su ovde opisani. Antitelo koje se vezuje za ALK5 može inhibirati jedan ili više ActRIIB liganada, tip II receptora, ili ko-receptora od vezivanja za ALK5. Antitelo koje se vezuje za ALK5 može inhibirati jedan ili više ActRIIB liganada od vezivanja za ALK5 odabrana iz grupe, koju čine: aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, i GDF3. Antitelo može da se veže najmanje za ALK7. Antitelo koje se vezuje za ALK7 može inhibirati ALK7 signaliziranje, opciono kako je izmereno u testu na ćelijama kao što su oni koji su ovde opisani. Antitelo koje se vezuje za ALK7 može inhibirati jedan ili više ActRIIB liganada, tip II receptora, ili ko-receptora od vezivanja za ALK7. Antitelo koje se vezuje za ALK7 može inhibirati jedan ili više ActRIIB liganada od vezivanja za ALK7 odabrana iz grupe, koju čine: aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP10, i GDF3. Antitelo može da se veže najmanje za GDF11. Multispecifično antitelo, ili kombinacija multispecifičnih antitela, može inhibisati signaliziranje, u testu na ćelijama, jednog ili više od: ActRIIB, GDF11, GDF8, aktivin A, aktivin B, GDF3, BMP6, i BMP10. Antitelo može biti himerično antitelo, humanizovano antitelo, ili humano antitelo. Antitelo može biti jednolančano antitelo, F(ab’)2 fragment, jednolančano diatelo, tandem jednolančanog Fv fragmenta, tandem jednolančanog diatela, ili fuzioni protein koji sadrži jednolančano diatelo i najmanje deo konstantnog regiona teškog lanca iunoglobulina.
[0047] U izvesnim aspektima, koji su ovde takođe opisani, još uvek ne i obuhvaćeni zahtevanim pronalaskom, ActRIIB antagonist je mali molekulski inhibitor ili kombinacija malih molekulskih inhibitora. Mali molekulski inhibitor može biti inhibitor najmanje ActRIIB. Mali molekulski inhibitor može biti inhibitor najmanje ALK4. Mali molekulski inhibitor može biti inhibitor najmanje ALK5. Mali molekulski inhibitor može biti inhibitor najmanje ALK7. Mali molekulski inhibitor može biti inhibitor najmanje GDF 11. Mali molekulski inhibitor može biti inhibitor najmanje GDF8. Mali molekulski inhibitor može biti inhibitor najmanje BMP6. Mali molekulski inhibitor može biti inhibitor najmanje BMP10. Mali molekulski inhibitor može biti inhibitor najmanje GDF3. Mali molekulski inhibitor može biti inhibitor najmanje aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE). Mali molekulski inhibitor može biti inhibitor najmanje aktivina B.
[0048] U izvesnim aspektima, koji su ovde takođe opisani, još uvek ne i obuhvaćeni zahtevanim pronalaskom, ActRIIB antagonist je nukleinsko kiselinski inhibitor ili kombinacija nukleinsko kiselinskih inhibitora. Nukleinsko kiselinski inhibitor može da inhibira najmanje ActRIIB. Nukleinsko kiselinski inhibitor može biti inhibitor najmanje ALK4. Nukleinsko kiselinski inhibitor može biti inhibitor najmanje ALK5. Nukleinsko kiselinski inhibitor može biti inhibitor najmanje ALK7. Nukleinsko kiselinski inhibitor može biti inhibitor najmanje GDF11. Nukleinsko kiselinski inhibitor može biti inhibitor najmanje GDF8. Nukleinsko kiselinski inhibitor može biti inhibitor najmanje BMP6. Nukleinsko kiselinski inhibitor može biti inhibitor najmanje BMP10. Nukleinsko kiselinski inhibitor može biti inhibitor najmanje GDF3. Nukleinsko kiselinski inhibitor može biti inhibitor najmanje aktivina (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin AC, aktivin BC, aktivin E, aktivin AE, i/ili aktivin BE). Nukleinsko kiselinski inhibitor može biti inhibitor najmanje aktivina B.
[0049] U izvesnim aspektima koji su isto tako ovde opisani, ipak još uvek nisu obuhvaćeni patentnim zahtevima, ActRIIB antagonist je folistatinski polipeptid. Folistatinski polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 63. Folistatinski polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 64. Folistatinski polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 65. Folistatinski polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 66. Folistatinski polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 67.
[0050] U izvesnim aspektima koji su isto tako ovde opisani, ipak još uvek nisu obuhvaćeni patentnim zahtevima, ActRIIB antagonist je FLRG polipeptid. FLRG polipeptid može imati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 68.
KRATAK OPIS SLIKA
[0051]
Slika 1 prikazuje poravnavanje ekstracelularnih domena humanih ActRIIA (SEQ ID NO: 36) i humanih ActRIIB (SEQ ID NO: 2) sa ostacima, koji su ovde utvrđeni, na osnovu složene analize multiplih kristalnih struktura ActRIIB i ActRIIA, za direktni kontak s ligandom, označenim kvadratima.
Slika 2 prikazuje višestruko poravnavanje raznih ActRIIB proteina kičmenjaka i humanih ActRIIA (SEQ ID NOs: 37-43), kao i konsenzus sekvencu ActRII, proisteklu iz poravnavanja (SEQ ID NO: 44).
Slika 3 prikazuje punu aminokiselinsku sekvencu za GDF trap ActRIIB(L79D 20-134)-hFc (SEQ ID NO: 45), uključujući lider sekvencu TPA (dvostruko podvučena), ekstracelularni domen ActRIIB (ostaci 20-134 u SEQ ID NO: 1; jednom podvučeno), i hFc domen. Aspartat, koji je supstituisan na poziciji 79 u nativnoj sekvenci je dvostruko podvučen i označen, budući da je sekvenciranjem otkriveno da je glicin N-terminalni ostatak u zrelom fuzionom proteinu.
Slike 4A i 4B prikazuju nukleotidnu sekvencu koja kodira ActRIIB(L79D 20-134)-hFc. SEQ ID NO: 48 odgovara sens lancu, a SEQ ID NO: 49 odgovara antisens lancu. TPA lider (nukleotidi 1-66) je dvostruko podvučen, a ekstracelularni domen ActRIIB (nukleotidi 76-420) je jednom podvučen.
Slika 5 prikazuje punu aminokiselinsku sekvencu za skraćeni GDF trap ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (SEQ ID NO: 50), uključujući lider sekvencu TPA (dvostruko podvučena), skraćeni ekstracelularni domen ActRIIB (ostaci 25-131 u SEQ ID NO:1; jednom podvučeno) i hFc domain. Aspartat, koji je supstituisan na poziciji 79 u nativnoj sekvenci je dvostruko podvučen i označen, budući da je sekvenciranjem otkriveno da je glutamat N-terminalni ostatak u zrelom fuzionom proteinu.
Slike 6A i 6B prikazuju nukleotidnu sekvencu koja kodira ActRIIB(L79D 25-131)-hFc. SEQ ID NO: 51 odgovara sens lancu, a SEQ ID NO: 52 odgovara antisens lancu. TPA lider (nukleotidi 1-66) je dvostruko podvučan, a skraćeni ekstracelularni domen ActRIIB (nukleotidi 76-396) je jednom podvučen. Takođe je prikazana aminokiselinska sekvenca za ekstracelularni domen ActRIIB (ostaci 25-131 u SEQ ID NO: 1).
Slika 7 prikazuje aminokiselinsku sekvencu za skraćeni GDF trap ActRIIB(L79D 25-131)-hFc bez lidera (SEQ ID NO: 53). Skraćeni ekstracelularni domen ActRIIB (ostaci 25-131 u SEQ ID NO: 1) je podvučen. Aspartat, koji je supstituisan na poziciji 79 u nativnoj sekvenci je dvostruko podvučen i označen, budući da je sekvenciranjem otkriveno da je glutamat N-terminalni ostatak u zrelom fuzionom proteinu.
Slika 8 prikazuje aminokiselinsku sekvencu za skraćeni GDF trap ActRIIB(L79D 25-131), bez lidera, hFc domen i linker (SEQ ID NO: 54). Aspartat, koji je supstituisan na poziciji 79 u nativnoj sekvenci je podvučen i označen, budući da je sekvenciranjem otkriveno da je glutamat N-terminalni ostatak u zrelom fuzionom proteinu.
Slike 9A i 9B prikazuju alternativnu nukleotidnu sekvencu, koja kodira ActRIIB(L79D 25-131)-hFc. SEQ ID NO: 55 odgovara sens lancu, a SEQ ID NO: 56 odgovara antisens lancu.
TPA lider (nukleotidi 1-66) je dvostruko podvučen, skraćeni ekstracelularni domen ActRIIB (nukleotidi 76-396) je podvučen, a supstitucije u nukleotidnoj sekvenci ekstracelularnog domena divljeg tipa su dvostruko podvučene i istaknute (poređenje sa SEQ ID NO: 51, Slike 6A i 6B). Takođe je prikazana aminokiselinska sekvenca za ekstracelularni domen ActRIIB (ostaci 25-131 u SEQ ID NO: 1).
Slika 10 prikazuje nukleotide 76-396 (SEQ ID NO: 57) iz alternativne nukleotidne sekvence, koja je prikazana na Slikama 9A i 9B (SEQ ID NO: 55). Nukleotidne supstitucije, istovetne onima, koje su naznačene na Slikama 9A i 9B, ovde su, takođe, podvučene i istaknute. SEQ ID NO: 57 kodira samo skraćeni ekstracelularni domen ActRIIB (koji odgovara ostacima 25-131 u SEQ ID NO: 1) sa L79D supstitucijom, npr., ActRIIB(L79D 25-131).
Slika 11 prikazuje poravnavanja više sekvenci Fc domena iz izotipova humanog IgG, korišćenjem Clustal 2.1. Zglobni regioni su naznačeni tako što su tačkasto podvučeni.
Slika 12 prikazuje punu, neobrađenu aminokiselinsku sekvencu ActRIIB(25-131)-hFc (SEQ ID NO: 58). I sekvenca TPA lidera (ostaci 1-22) i dvostruko-skraćeni ekstracelularni domen ActRIIB (ostaci 24-131, koristeći numerisanje na osnovu nativne sekvence u SEQ ID NO: 1) su podvučeni. Istaknut je glutamat, za koji je posredstvom sekvenciranja, otkriveno da je N-terminalna aminokiselina zrelog fuzionog proteina, koji se nalazi na poziciji 25 u odnosu na SEQ ID NO: 1.
Slike 13A i 13B prikazuje nukleotidnu sekvencu koja kodira ActRIIB(25-131)-hFc (kodirajući lanac je prikazan na vrhu, SEQ ID NO: 59, a komplement je prikazan na kraju 3’-5’, SEQ ID NO: 60). Sekvence koje kodiraju TPA lider sekvencu (nukleotidi 1-66) i ekstracelularni domen ActRIIB (nukleotidi 73-396) su podvučene. Takođe je prikazana odgovarajuća aminokiselinska sekvenca za ActRIIB(25-131).
Slike 14A i 14B prikazuju alternativnu nukleotidnu sekvencu, koja kodira ActRIIB(25-131)-hFc (kodirajući lanac je prikazan na vrhu, SEQ ID NO: 61, a komplement je prikazan na 3’-5’ kraju, SEQ ID NO: 62). Ova sekvenca pruža viši nivo ekspresije proteina u inicijalnim transformantima, čineći razvoj ćelijskog niza mnogo bržim procesom. Sekvence koje kodiraju sekvencu TPA lidera (nukleotidi 1-66) i ekstracelularni domen ActRIIB (nukleotidi 73-396) su podvučeni, a supstitucije nukleotidne sekvence divljeg tipa iz ECD (videti Slike 13A i 13B) su označene. Takođe je prikazana odgovarajuća aminokiselinska sekvenca za ActRIIB(25-131).
DETALJNI OPIS PRONALASKA
1. Pregled
[0052] Superfamilija transformišućeg faktora rasta-beta (TGF-beta) sadrži brojne faktore rasta, koji dele zajedničke elemente sekvence i strukturne motive. Poznato je da ovi proteini ispoljavaju biološka dejstva na širokom varijetetu ćelijskih tipova i kod kičmenjaka i kod beskičmenjaka. Članovi ove superfamilije vrše važne funkcije tokom embrionalnog razvoja u obrazovanju struktura i specifikaciji tkiva, a mogu imati uticaja i na brojne procese diferencijacije, uključujući adipogenezu, miogenezu, hondrogenezu, kardiogenezu, hematopoezu, neurogenezu i diferencijaciju epitelnih ćelija. Posredstvom uticanja na aktivnost članova familije TGF-beta, često je moguće izazvati značajne fiziološke promene u organizmu. Na primer, rase pijemontskog i belgijskog plavog goveda nose mutaciju tipa gubitka funkcije u genu GDF8 (označava se, takođe, kao miostatin), što uzrokuje značajno povećanje mišićne mase [videti, npr., Grobet et al. (1997) Nat Genet. 17(1):71-4]. Pored toga, kod ljudi su inaktivni aleli GDF8 udruženi sa povećanom mišićnom masom i, navodno, izuzetnom snagom [videti, npr., Schuelke et al. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8].
[0053] TGF-β signali su posredovani heteromernim kompleksima kinaza receptora tipa I i tipa II serin/treonin, koji vrše fosforilaciju i nishodno aktiviraju SMAD proteine (npr., SMAD proteini 1, 2, 3, 5 i 8), usled stimulacije liganda [videti, npr., Massagué (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
1:169-178]. Ovi receptori tipa I i tipa II su transmembranski proteini, sastavljeni od ligandvezujućeg ekstracelularnog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena i citoplazmatskog domena sa predviđenom specifičnošću serin/treonin. Receptori tipa I su od suštinskog značaja za signalizaciju. Receptori tipa II su neophodni za vezivanje liganada i aktivaciju receptora tipa I. Aktivinski receptori tipa I i II obrazuju stabilni kompleks nakon vezivanja liganda, što dovodi do fosforilacije receptora tipa I, posredstvom receptora tipa II.
[0054] Dva srodna receptora tipa II (ActRII), ActRIIA i ActRIIB, identifikovana su kao receptori tipa II za aktivine [videti, npr., Mathews i Vale (1991) Cell 65:973-982; i Attisano et al. (1992) Cell 68: 97-108]. Pored aktivina, ActRIIA i ActRIIB mogu ulaziti u biohemijsku interakciju sa nekolicinom drugih proteina familije TGF-β, koji uključuju, primera radi, BMP6, BMP7, Nodal, GDF8 i GDF11 [videti, npr., Yamashita et al. (1995) J. Cell Biol. 130:217-226; Lee i McPherron(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9306-9311; Yeo i Whitman (2001) Mol. Cell 7: 949-957; i Oh et al. (2002) Genes Dev. 16:2749-54]. ALK4 je primarni receptor tipa I za aktivine, posebno za aktivin A, a ALK-7 može, takođe, služiti kao receptor za druge aktivine, posebno za aktivin B.
[0055] Aktivini su dimerni polipeptidni faktori rasta, koji pripadaju superfamiliji TGF-beta. Postoje tri glavne forme aktivina (A, B i AB), koji su homo/heterodimeri dve β subjedinice bliske srodnosti (βAβA, βBβB, odnosno βAβB). Humani genom kodira, takođe, aktivin C i aktivin E, koji se primarno ekspresuju u jetri, a isto tako su poznate heterodimerne forme koje sadrže βCili βE.
[0056] U superfamiliji TGF-beta, aktivini su jedinstveni i multifunkcionalni faktori, koji mogu stimulisati proizvodnju hormona u ovarijalnim i placentalnim ćelijama, podupirati preživljavanje neuronskih ćelija, uticati na tok ćelijskog ciklusa, pozitivno ili negativno, u zavisnosti od tipa ćelija, i indukovati mezodermalnu diferencijaciju, barem u embrionima vodozemaca [DePaolo et al. (1991) Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson et al. (1997) Curr Biol. 7:81-84; i Woodruff (1998) Biochem Pharmacol. 55:953-963]. Pored toga, utvrđeno je da je faktor eritroidne diferencijacije (EDF), izolovan iz stimulisanih humanih monocitnih leukemijskih ćelija, identičan aktivinu A [Murata et al. (1988) PNAS, 85:2434]. Sugeriše se da aktivin A podstiče eritropoezu u kostnoj srži. U nekolicini tkiva, signalizacija aktivina je antagonizirana od strane njemu srodnog heterodimera, inhibina. Na primer, tokom oslobađanja folikulostimulišućeg hormona (FSH) iz hipofize, aktivin podstiče sekreciju i sintezu FSH, dok inhibin sprečava sekreciju i sintezu FSH. Ostali proteini, koji mogu regulisati bioaktivnost aktivina i/ili vezivanje za aktivin uključuju: folistatin (FS), folistatinu srodan protein (FSRP, poznat, takođe, kao FLRG ili FSTL3) i α2-makroglobulin.
[0057] Kako je ovde opisano, agensi, koji se vezuju za "aktivin A" su agensi koji se specifično vezuju za βa subjedinicu, bilo u vidu izolovane βa subjedinice, bilo u sklopu dimernog kompleksa (npr., βAβAhomodimer ili βAβBheterodimer). U slučaju heterodimernog kompleksa (npr., βAβBheterodimer), agensi koji se vezuju za "aktivin A" su specifični za epitope, koji su prisutni u okviru βa subjedinice, ali se ne vezuju za epitope, koji su prisutni van okvira βA subjedinice kompleksa (npr., βBsubjedinica kompleksa). Na sličan način, ovde izloženi agensi koji ulaze u antagonizam (inhibiraju) "aktivin A" su agensi koji inhibiraju jednu ili više aktivnosti koje su posredovane βa subjedinicom, bez obzira da li se nalazi u vidu izolovane βa subjedinice, ili u sklopu dimernog kompleksa (npr., βAβAhomodimer ili βAβBheterodimer). U slučaju βAβB heterodimera, agensi koji inhibiraju "aktivin A" su agensi koji specifično inhibiraju jednu ili više aktivnosti βa subjedinice, ali ne inhibiraju aktivnost subjedinice, koja nije βa subjedinica kompleksa (npr., βBsubjedinica kompleksa). Ovaj princip je, takođe, primenjiv na agense koji se vezuju za i/ili inhibiraju "aktivin B", "aktivin C" i "aktivin E". Ovde prikazani agensi koji ulaze u antagonizam sa "aktivinom AB" su agensi koji inhibiraju jednu ili više aktivnosti koje su posredovane βBsubjedinicom.
[0058] Faktor-8, faktor rast i diferencijacije (GDF8), poznat je, takođe, kao miostatin. GDF8 je negativni regulator skeletne mišićne mase. GDF8 je izrazito ekspresovan u skeletnim mišićima u fazi razvoja i u adultnim skeletnim mišićima. GDF8 nulta mutacija kod transgenskih miševa je karakterisana izrazitom hipertrofijom i hiperplazijom skeletnih mišića [McPherron et al., Nature (1997) 387:83-90]. Slična povećanja skeletne mišićne mase su evidentirana kod stoke, sa mutacijama u GDF8, koje postoje u prirodi [videti, npr., Ashmore et al. (1974) Growth, 38:501-507; Swatland i Kieffer (1994) J. Anim. Sci. 38:752-757; McPherron i Lee (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12457-12461; i Kambadur et al. (1997) Genome Res. 7:910-915] i, u značajnoj meri, kod ljudi [videti, npr., Schuelke et al. (2004) N Engl J Med 350:2682-8]. Studije su, takođe, pokazale da je gubitak mišića, udružen sa HIV-infekcijom kod ljudi, povezan sa povećanjem ekspresije GDF8 proteina [videti, npr., Gonzalez-Cadavid et al. (1998) PNAS 95:14938-43]. Pored toga, GDF8 može modulirati proizvodnju enzima, specifičnih za mišiće (npr., kreatin kinaza) i modulirati proliferaciju ćelija mioblasta [videti, npr., International patent application publication no. WO 00/43781]. Propeptid GDF8 se može, nekovalentno, vezivati za domen dimera zrelog GDF8, inaktivirajući njegovu biološku aktivnost [videti, npr., Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 7646-7654; i Brown et al. (1990) Growth Factors, 3: 35-43]. Ostali proteini koji se vezuju za GDF8 ili strukturno srodne proteine i inhibiraju njihovu biološku aktivnost, uključuju folistatin i, mogućno, proteine srodne folistatinu [videti, npr., Gamer et al. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232].
[0059] Faktor-11, faktor rasta i diferencijacije (GDF11), koji je, takođe, poznat kao BMP11, je sekretovani protein [McPherron et al. (1999) Nat. Genet. 22: 260-264]. GDF11 se ekspresuje u začecima repa, začecima nogu, maksilarnim i mandibularnim svodovima i dorzalnim korenima ganglija tokom razvoja miševa [videti, npr., Nakashima et al. (1999) Mech. Dev. 80: 185-189]. GDF11 igra jedinstvenu ulogu u strukturnom razvoju i mezodermalnih i neuralnih tkiva [videti, npr., Gamer et al. (1999) Dev Biol., 208:222-32]. Pokazalo se da je GDF11 negativni regulator hondrogeneze i miogeneze pri razvoju nogu pileta [videti, npr., Gamer et al. (2001) Dev Biol.
229:407-20]. Ekspresija GDF11 u mišićima navodi, takođe, na njegovu ulogu u regulisanju mišićnog rasta na način sličan onom kod GDF8. Pored toga, ekspresija GDF11 u mozgu sugeriše da GDF11 može, isto tako, posedovati i u aktivnostima, koje se tiču funkcije nervnog sistema. Kao zanimljivost, utvrđeno je da GDF 11 inhibira neurogenezu u olfaktornom epitelu [videti, npr., Wu et al. (2003) Neuron. 37:197-207].
[0060] Ovaj pronalazak se, delom, odnosi na otkriće da se antagonist (inhibitor) ActRIIB može koristiti za lečenje pacijenata sa mijelofibrozom, posebno za ublažavanje raznih komplikacija bolesti, uključujući, na primer, splenomegaliju, ekstramedularnu hematopoezu i fibrozu. Podaci, koji su ovde predstavljeni, pokazuju, naročito, da GDF trap polipeptid smanjuje splenomegaliju, ekstramedularnu hematopoezu i fibrozu na JAK2V617F modelu mijelofibroze. Sledstveno tome, pronalazak se odnosi na kompozicije za korišćenje u lečenju mijelofibroze, posebno za lečenje ili prevenciju jedne ili više komplikacija mijelofibroze (splenomegalija, ekstramedularna hematopoeza, anemija i fibroza), kako je definisano posredstvom priključenih patentnih zahteva.
[0061] Nazivi, korišćeni u ovoj specifikaciji, generalno imaju značenja, uobičajena u ovoj oblasti, unutar konteksta ovog pronalaska i unutar specifičnog konteksta u kom je svaki naziv upotrebljen. Određeni nazivi su razmotreni u nastavku ili na drugim mestima u specifikaciji, da bi se stručnom licu pružila dodatna uputstva u opisu kompozicija i postupaka pronalaska, kao i načina njihove izrade i korišćenja. Cilj ili značenje bilo kog korišćenja naziva biće očigledni iz specifičnog konteksta u kom je naziv korišćen.
[0062] "Homolognost" u svim svojim gramatičkim oblicima i varijantama izgovora, tiče se odnosa između dva proteina koji poseduju "zajedničko evolutivno poreklo", uključujući proteine iz superfamilija organizma istog speciesa, kao i homologne proteine iz speciesa različitih organizama. Takvi proteini (i njihove kodirajuće nukleinske kiseline) poseduju sekvencnu homologiju, što se odražava preko istovetnosti njihovih sekvenci, bilo posredstvom procenta identiteta, bilo preko prisustva specifičnih ostataka ili motiva i konzervisanih položaja. Međutim, u uobičajenoj upotrebi, kao i u ovoj aplikaciji, izraz "homologan", kada se modifikuje prilogom, kao što je "visoko", može se odnositi na sličnost sekvenci, i može se, ali ne mora, odnositi na zajedničko evolutivno poreklo.
[0063] Izraz "sličnost sekvenci", u svim gramatičkim oblicima, odnosi se na stepen identiteta ili podudaranja između sekvenci nukleinskih kiselina ili aminokiselina, koje mogu, ali ne moraju, deliti zajedničko evolutivno poreklo.
[0064] "Procenat (%) identiteta sekvenci" u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida (ili nukleotida) definiše se kao procenat ostataka aminokiselina (ili nukleinskih kiselina), u kandidat sekvenci, koji su identični ostacima aminokiselina (ili nukleinskih kiselina) u sekvenci referentnog polipeptida (nukleotida), nakon poravnavanja sekvenci, i uvođenja šupljina, ukoliko je to potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identiteta sekvenci, a ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvenci. Poravnavanje za potrebe određivanja procenta identiteta aminokiselinskih sekvenci može se izvršiti na razne načine, koji su u okvirima stručnosti u ovoj oblasti, na primer, korišćenjem javno dostupnih kompjuterskih softvera, kao što su, BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Lica, stručna u ovoj oblasti, mogu utvrditi odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, koji uključuju bilo kakve algoritme, potrebne za postizanje maksimalnog slaganja tokom pune dužine sekvenci koje se upoređuju. Za potrebe ovog pronalaska, međutim, vrednosti % identiteta sekvenci aminokiselina (nukleinskih kiselina) dobijaju se korišćenjem kompjuterskog programa ALIGN-2 za poređenje sekvenci. Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 autorizovan je od strane Genentech, Inc., a izvorni kod je podnesen sa vlasničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan posredstvom Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornija, ili može biti skinut sa izvornog koda. Program ALIGN-2 bi se skidao za korišćenje na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Svi parametri poređenja su navedeni u programu ALIGN-2, bez mogućnosti varijacija.
[0065] "Agonizam", u svim svojim gramatičkim oblicima, odnosi se na proces aktivacije proteina i/ili gena (npr., putem aktivacije ili amplifikovanja ekspresije gena tog proteina ili posredstvom indukcije inaktivnog proteina da bi ušao u aktivni status) ili povećanja aktivnosti proteina i/ili gena.
[0066] "Antagonizam", u svim svojim gramatičkim oblicima, odnosi se na proces inhibicije proteina i/ili gena (npr., posredstvom inhibicije ili smanjivanja ekspresije gena tog proteina ili posredstvom indukcije aktivnog proteina da bi ušao u inaktivni status) ili smanjivanja aktivnosti proteina i/ili gena.
[0067] Izrazi "oko" i "približno", kako su korišćeni u vezi sa numeričkom vrednosti tokom specifikacije, i patentnih zahteva, označava interval tačnosti, koji je blizak i prihvatljiv licu, stručnom u ovoj oblasti. Uopšteno, takav interval tačnosti je ± 10%. Alternativno, a naročito u biološkim sistemima, izrazi "oko" i "približno" mogu označavati vrednosti koje se nalaze u okviru odstupanja reda veličine, koji, poželjno, iznose ≤ 5-puta i, još poželjnije, ≤ 2-puta u odnosu na datu vrednost.
[0068] Ovde izložene brojčane vrednosti uključuju brojeve koji definišu raspone.
[0069] Nazivi u jednini uključuju reference u množini, izuzev ukoliko kontekst u kome se izraz koristi jasno ne diktira drugačije. Izrazi u jednini, kao i izrazi "jedan ili više" i "najmanje jedan" mogu biti korišćeni naizmenično, kao zamena jedan drugom. Pored toga, kada je ovde korišćen izraz "i/ili", trebalo bi ga prihvatiti kao specifično izlaganje da se odnosi na jednu od dve ili više navedenih karakteristika ili komponenti sa ili bez drugog. Sledstveno tome, ovde je izraz "i/ili", kako je korišćen u nazivu, kao što je "A i/ili B", utvrđen kako bi uključio "A i B," "A ili B," "A" (sam) i "B" (sam). Isto tako, izraz "i/ili", kako je korišćen u nazivu kao što je "A, B i/ili C" utvrđen je kako uključio svaki od sledećih: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (sam); B (sam) i C (sam).
[0070] Tokom ove specifikacije, reč "sadrži" ili varijacije, kao što su "sadržavati" ili "uključivati", biće shvaćeni tako da podrazumevaju uključivanje navedenih celih brojeva ili grupa celih brojeva, ali ne isključuju bilo koji drugi ceo broj ili grupu celih brojeva.
2. Antagonisti ActRIIB
[0071] Ovaj pronalazak se, delom, odnosi na otkriće da se antagonist ActRIIB (inhibitor) može koristiti za lečenje pacijenata sa mijelofibrozom, posebno za ublažavanje raznih komplikacija bolesti, koje uključuju, na primer, splenomegaliju, ekstramedularnu hematopoezu i fibrozu. Određenije, ovde prikazani podaci pokazuju da GDF trap polipeptid smanjuje splenomegaliju, ekstramedularnu hematopoezu i fibrozu na JAK2V617F modelu mijelofibroze. Budući da rastvorljivi GDF trap polipeptidi mogu uticati na mijelofibrozu posredstvom mehanizma koji nije antagonizam prema ActRIIB [npr., inhibicija jednog ili više od sledećih: GDF11, GDF8, aktivin B, BMP6, GDF3 i BMP10 može biti indikator tendencije sredstva da inhibira aktivnosti spektra dodatnih agenasa, koji moguće, uključuju, ostale članove superfamilije TGF-beta, a takva kolektivna inhibicija može dovesti do željenog efekta na, na primer, mijelofibrozu], ovo izlaganje, ipak, demonstrira kako željena terapeutska sredstva mogu biti izabrana na bazi antagonizma prema ActRIIB. Sledstveno tome, bez želje za vezivanjem za određeni mehanizam dejstva, očekuje se da će ostali antagonisti ActRIIB [npr., antagonisti receptora ActRIIB, antagonisti jednog ili više ActRIIB-vezujućih liganada (npr., GDF11, GDF8, aktivin, BMP6, GDF3 i BMP10), antagonisti jednog ili više receptora tipa I (npr., ALK4, ALK5 i/ili ALK7), antagonisti jednog ili više ko-receptora, antagonisti jedne ili više komponenti nishodne signalizacije ActRIIB (npr., Smad), ili kombinacija takvih antagonista] biti od koristi u lečenju mijelofibroze, posebno u lečenju ili prevenciji raznih komplikacija, povezanih sa mijelofibrozom (npr., splenomegalija, ekstramedularna hematopoeza i fibroza). Takve sredstva se, ovde, zajednički označavaju kao "antagonisti ActRIIB" ili "inhibitori ActRIIB".
A. Polipeptidi ActRIIB i njihove varijante
[0072] U određenim aspektima, ovaj pronalazak se odnosi na polipeptide ActRIIB i njihove varijante (npr., GDF trap-ovi). Određenije, pronalazak obezbeđuje postupke korišćenja polipeptida ActRIIB, samih ili u kombinaciji sa jednom ili više dodatnih pomoćnih terapija, za lečenje mijelofibroze, posebno za lečenje ili prevenciju jedne ili više komplikacija mijelofibroze (npr., splenomegalija, ekstramedularna hematopoeza, anemija i fibroza), i/ili pacijenta, koji je lečen inhibitorom Janus kinaze. Kako je ovde korišćen, naziv "ActRIIB" odnosi se na familiju proteina aktivinskog receptora tipa IIB (ActRIIB) iz bilo kog speciesa, i varijante, dobijene iz takvih proteina ActRIIB, putem mutageneze ili drugih modifikacija. Ovde se podrazumeva da se reference na ActRIIB odnose na bilo koji od ovde identifikovanih oblika. Članovi familije ActRIIB su, uopšteno, transmembranski proteini, sastavljeni od ligand-vezujućeg ekstracelularnog domena, koji sadrži region bogat cisteinom, transmembranski domen i citoplazmatski domen sa predikcijom aktivnosti serin/treonin.
[0073] Naziv "polipeptid ActRIIB" uključuje polipeptide, koji sadrže u prirodi postojeće članove familije polipeptida ActRIIB, kao i bilo koje njihove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzione i peptidomimetičke oblike), koji zadržavaju korisnu aktivnost. Primeri takvih varijanti polipeptida ActRIIB dati su tokom ovog pronalaska, kao i u International Patent Application Publication No. WO 2006/012627 i WO 2008/097541. Brojčano označavanje aminokiselina za sve, ovde opisane, ActRIIB-srodne polipeptide, bazirano je na numerisanju sekvence prekursorskog proteina humanog ActRIIB, koja je data u nastavku (SEQ ID NO: 1), ukoliko nije specifično naznačeno drugačije.
[0074] Sekvenca prekursorskog proteina humanog ActRIIB je sledeća:
[0075] Signalni peptid je označen tako što je jednom podvučen; ekstracelularni domen je označen masnim slovima; a potencijalni, endogeni N-vezani glikozilacijski položaji su označeni tako što su dvostruko podvučeni.
[0076] Sekvenca procesuiranog (zrelog) ekstracelularnog ActRIIB polipeptida je sledeća:
[0077] Protein može biti proizveden sa "SGR..." sekvencom na N-kraju. C-terminalni "tail" ekstracelularnog domena je označen tako što je jednom podvučen. Sekvenca sa izbrisanim "tail" (Δ15 sekvenca) je sledeća:
[0078] Oblik ActRIIB sa alaninom na poziciji 64 u SEQ ID NO: 1 (A64) takođe je prikazan u literaturi [Hilden et al. (1994) Blood, 83(8): 2163-2170]. Podnosioci prijave su utvrdili da fuzioni protein ActRIIB-Fc, koji sadrži ekstracelularni domen ActRIIB sa A64 supstitucijom ima slab afinitet za aktivin i GDF11. Za razliku od navedenog, istovetni ActRIIB-Fc fuzioni protein sa argininom na poziciji 64 (R64) poseduje afinitet za aktivin i GDF 11, koji se kreće u rasponu od nisko-nanomolarnog do visoko-pikomolarnog nivoa. Sledstveno tome, sekvence sa R64 korišćene su, u ovom pronalasku, kao referentna sekvenca "divljeg-tipa" za humani ActRIIB.
[0079] Oblik ActRIIB sa alaninom na poziciji 64 je sledeći:
[0080] Signalni peptid je naznačen tako što je jednom podvučen a ekstracelularni domen je naznačen masnim slovima.
[0081] Sekvenca procesuiranog (zrelog) ekstracelularnog ActRIIB polipeptida alternativnog A64 oblika je sledeća:
[0082] Protein može biti proizveden sa "SGR..." sekvencom na N-kraju. C-terminalni "tail" ekstracelularnog domena je označen tako što je jednom podvučen. Sekvenca sa izbrisanim "tail" (Δ15 sekvenca) je sledeća:
[0083] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira prekursorski protein humanog ActRIIB prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 7), a sastoji se od nukleotida 25-1560 referentne sekvence iz Genbank Reference Sequence NM_001106.3, koji kodiraju aminokiseline 1-513 prekursora ActRIIB. Kako je prikazano, sekvenca obezbeđuje arginin na poziciji 64 i može se modifikovati da bi umesto njega sadržavala alanin. Signalna sekvenca je podvučena.
[0084] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira procesuirani ekstracelularni polipeptid humanog ActRIIB je sledeća (SEQ ID NO: 8):
Kako je prikazana, sekvenca obezbeđuje arginin na poziciji 64, a može biti modifikovana kako bi, umesto njega, sadržavala alanin.
[0085] Poravnavanje aminokiselinskih sekvenci ekstracelularnog domena humanog ActRIIB i ekstracelularnog domena humanog ActRIIA ilustrativno je prikazano na Slici 1. Ovo poravnavanje označava aminokiselinske ostatke unutar oba receptora, za koje se veruje da ulaze u direktan kontakt sa ligandima ActRII. Na primer, složene strukture ActRII su označene tako da je džep vezivanja ActRIIB-liganda, delom, definisan posredstvom ostataka Y31, N33, N35, L38 do T41, E47, E50, Q53 do K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 do N83, Y85, R87, A92 i E94 do F101. Očekuje se da će na ovim pozicijama konzervativne mutacije biti tolerisane.
[0086] Pored toga, ActRIIB je uopšteno, među kičmenjacima, dobro očuvan, pri čemu su veliki rasponi ekstracelularnih domena u potpunosti očuvani. Primera radi, Slika 2 prikazuje poravnavanje više sekvenci ekstracelularnog domena humanog ActRIIB u poređenju sa raznim ortolozima ActRIIB. Mnogi od liganada koji se vezuju za ActRIIB su, takođe, veoma očuvani. Sledstveno tome, iz ovih poravnavanja je moguće predvideti ključne aminokiselinske pozicije unutar ligand-vezujućeg domena, koje su od značaja za normalne aktivnosti vezivanja ActRIIB-liganda, kao što je moguće predvideti aminokiselinske pozicije za koje je verovatno da će biti tolerantne na supstituciju bez značajno izmenjenih aktivnosti normalnog vezivanja ActRIIB-liganda. Sledstveno tome, aktivna varijanta polipeptida humanog ActRIIB, koja je od koristi prema ovde izloženim postupcima, može uključiti jednu ili više aminokiselina na odgovarajućim pozicijama u odnosu na sekvencu ActRIIB drugog kičmenjaka, ili može uključiti ostatak koji je sličan ostatku u sekvencama koje su humanog porekla ili pripadaju drugim kičmenjacima.
[0087] Primeri koji slede, a koje ne bi trebalo shvatiti kao ograničenje, ilustrativno prikazuju ovaj pristup definisanju aktivne varijante ActRIIB. L46 u humanom ekstracelularnom domenu (SEQ ID NO: 2) je valin u ActRIIB Xenopusa (SEQ ID NO: 42), tako da ta pozicija može biti izmenjena, a, opciono, može biti zamenjena drugim hidrofobnim ostatkom, kao što je V, I ili F, ili ne-polarnim ostatkom, kao što je A. E52 u humanom ekstracelularnom domenu je K u Xenopusu, indikujući da taj položaj može biti tolerantan na široki varijetet izmena, uključujući polarne ostatke, kao što su E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y i, moguće A. T93 u humanom ekstracelularnom domenu je K u Xenopusu, čime se indikuje da se na toj poziciji toleriše veliki broj strukturnih varijacija, pri čemu su favorizovani polarni ostaci, kao što su S, K, R, E, D, H, G, P, G i Y. F108 u humanom ekstracelularnom domenu je Y u Xenopusu, tako da bi se tolerisale Y ili druge hidrofobne grupe, kao što su I, V ili L. E111 u humanom ekstracelularnom domenu je K u Xenopusu, čime se indikuje da se, na toj poziciji tolerišu ostaci sa naelektrisanjem, koji uključuju D, R, K i H, kao i Q i N. R112 u humanom ekstracelularnom domenu je K u Xenopusu, čime se indikuje da se na toj poziciji dobro tolerišu bazni ostaci, uključujući R i H. A na poziciji 119 u humanom ekstracelularnom domenu je relativno slabo očuvana, i čini se kao P kod glodara (SEQ ID NO: 37 i 39), i V kod Xenopusa, tako da bi suštinski svaka aminokiselina na toj poziciji bila tolerisana.
[0088] Pored toga, proteini ActRII su u ovoj oblasti, okarakterisani posredstvom njihovih strukturno/funkcionalnih karakteristika, posebno u odnosu na vezivanje liganda [Attisano et al. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald et al. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph et al. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson et al. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; kao i U.S. Patent No: 7,709,605, 7,612,041 i 7,842,663]. Pored objašnjenja u njima, ove reference pružaju opširno uputstvo kako da se proizvedu varijante ActRII, koje zadržavaju jednu ili više željenih aktivnosti (npr., aktivnost vezivanja liganda).
[0089] Primera radi, definišući strukturni motiv, poznat kao toksinski tro-prstni zavijeni lanac, značajan je za vezivanje liganda za receptore tipa I i tipa II, a obrazuje se posredstvom konzervisanih cistenskih ostataka, lociranih na raznim pozicijama unutar ekstracelularnog domena svakog monomernog receptora [Greenwald et al. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; i Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. Sledstveno tome, središnji domeni vezivanja liganda u humanom ActRIIB, kako su razgraničeni spoljnim linijama ovih konzervisanih cisteina, odgovaraju pozicijama 29-109 iz SEQ ID NO: 1 (prekursor ActRIIB). Tako, strukturno slabo poređane aminokiseline, koje zaposedaju ove središnje sekvence razgraničene cisteinom, mogu biti skraćene za približno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ili 28 ostataka na N-kraju i/ili za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 ostataka na C-kraju, bez neophodnosti promene vezivanja liganda. Primeri ekstracelularnih domena ActRIIB za N-terminalno i/ili C-terminalno skraćivanje uključuju SEQ ID NO: 2, 3, 5 i 6.
[0090] Attisano i saradnici su pokazali da se delecijom prolinskog čvora na C-kraju ekstracelularnog domena ActRIIB smanjuje afinitet receptora za aktivin. Fuzioni protein ActRIIB-Fc, koji sadrži aminokiseline 20-119 iz tekuće SEQ ID NO: 1, "ActRIIB(20-119)-Fc", ispoljava smanjeno vezivanje za GDF11 i aktivin, u odnosu na ActRIIB(20-134)-Fc, koji uključuje region prolinskog čvora i kompletni jukstamembranski domen (videti, npr., U.S. Patent No. 7,842,663). Međutim, ActRIIB(20-129)-Fc protein zadržava sličnu, mada donekle smanjenu aktivnost, u odnosu na sekvencu divljeg tipa, čak iako je prolinski čvor prekinut. Sledstveno tome, očekuje se da su svi ekstracelularni domeni ActRIIB, koji su prekinuti na pozicijama aminokiselina 134, 133, 132, 131, 130 i 129 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) aktivni, dok konstrukcije, prekinute na pozicijama 134 ili 133, mogu biti najaktivnije. Na sličan način, ne očekuje se da mutacije na bilo kom od ostataka 129-134 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) menjaju afinitet vezivanja liganda u velikoj meri. U prilog navedenom, u ovoj oblasti je poznato da mutacije P129 i P130 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) ne smanjuju, u značajnoj meri, vezivanje liganda. Prema tome, polipeptid ActRIIB iz tekućeg pronalaska može završavati već na aminokiselini 109 (završni cistein), ali se, međutim, očekuje da završeci strukture na ili između aminokiselina 109 i 119 (npr., 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 ili 119) dovode do smanjenja vezivanja liganda. Aminokiselina 119 (u odnosu na tekuću SEQ ID NO: 1) je slabo očuvana, tako da se lako menja ili skraćuje. Polipeptidi ActRIIB, koji završavaju na aminokiselini 128 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) ili kasnije, zadržavali bi svoju aktivnost vezivanja liganda. Polipeptidi ActRIIB, koji završavaju na ili između aminokiselina 119 i 127 (npr., 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 ili 127), u odnosu na SEQ ID NO: 1, posedovaće srednju sposobnost vezivanje. Svaki od ovih oblika može biti poželjan za korišćenje, u zavisnosti od kliničkih ili eksperimentalnih postavki.
[0091] Očekuje se da će na N-kraju ActRIIB, protein koji započinje na aminokiselinskoj poziciji 29 ili pre nje (u odnosu na SEQ ID NO: 1) zadržati aktivnost vezivanja liganda. Aminokiselina 29 predstavlja početni cistein. Mutacija alanin-u-asparagin na poziciji 24 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) uvodi N-vezanu glikozilacijsku sekvencu bez suštinskog uticaja na vezivanje liganda [U.S. Patent No. 7,842,663]. Ovim se potvrđuje da se mutacije u regionu između peptida signalnog cepanja i cisteinskog unakrsno-vezanog regiona, koji odgovara aminokiselinama 20-29, dobro toleriše. Određenije, polipeptidi ActRIIB, koji započinju na poziciji 20, 21, 22, 23 i 24 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) zadržali bi opštu aktivnost vezivanja liganda, a, takođe se očekuje da polipeptidi ActRIIB, koji započinju na pozicijama 25, 26, 27, 28 i 29 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) zadržavaju aktivnost vezivanja liganda. Pokazalo se, npr., u U.S. Patentu No.7,842,663, da će, neočekivano, konstrukcija ActRIIB, koja započinje na pozicijama 22, 23, 24 ili 25, imati najveću aktivnost.
[0092] Uzevši sve zajedno, opšta formula za aktivni deo (npr., ligand-vezujući deo) ActRIIB sadrži aminokiseline 29-109 iz SEQ ID NO: 1. Sledstveno tome, polipeptidi ActRIIB mogu, primera radi, sadržavati, biti suštinski sastavljeni od ili biti sačinjeni od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa delom ActRIIB, koji započinje na ostatku, koji odgovara bilo kojoj od aminokiselina na pozicijama 20-29 (npr., sa započinjanjem na bilo kojoj od aminokiselina 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ili 29) iz SEQ ID NO: 1 i završavanjem na poziciji koja odgovara bilo kojoj od aminokiselina na pozicijama 109-134 (npr., sa završavanjem na bilo kojoj od aminokiselina 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 ili 134) iz SEQ ID NO: 1. Ostali primeri uključuju polipeptide koji započinju na poziciji od 20-29 (npr., bilo koja od pozicija 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ili 29) ili 21-29 (npr., bilo koja od pozicija 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ili 29), a završavaju na poziciji od 119-134 (npr., bilo koja od pozicija 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 ili 134), 119-133 (npr., bilo koja od pozicija 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 ili 133), 129-134 (npr., bilo koja od pozicija 129, 130, 131, 132, 133 ili 134) ili 129-133 (npr., bilo koja od pozicija 129, 130, 131, 132 ili 133) iz SEQ ID NO: 1. Ostali primeri uključuju konstrukcije koje započinju na poziciji od 20-24 (npr., bilo koja od pozicija 20, 21, 22, 23 ili 24), 21-24 (npr., bilo koja od pozicija 21, 22, 23 ili 24) ili 22-25 (npr., bilo koja od pozicija 22, 22, 23 ili 25) i završavaju na poziciji od 109-134 (npr., bilo koja od pozicija 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 ili 134), 119-134 (npr., bilo koja od pozicija 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 ili 134) ili 129-134 (npr., bilo koja od pozicija 129, 130, 131, 132, 133 ili 134) iz SEQ ID NO: 1. Razmotrene su, takođe, varijante unutar ovih raspona, posebno one varijante koje poseduju najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta u odnosu na odgovarajući deo SEQ ID NO: 1.
[0093] Ovde opisane varijacije mogu se kombinovati na razne načine. Varijante ActRIIB mogu sadržavati ne više od 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 15 izmena konzervativnih aminokiselina u ligandvezujućem džepu, i nijednu, jednu ili više ne-konzervativnih izmena na pozicijama 40, 53, 55, 74, 79 i/ili 82 u ligand-vezujućem džepu. Pozicije van vezujućeg džepa, na kojima varijabilnost može biti posebno dobro tolerisana, uključuju amino i karboksi krajeve ekstracelularnih domena (kao što je prethodno navedeno), i pozicije 42-46 i 65-73 (u odnosu na SEQ ID NO: 1). Izmena asparagin-u-alanin na poziciji 65 (N65A) poboljšava, zapravo, vezivanje liganda na osnovi A64, tako da se, sledstveno, očekuje da nema nepovoljnog efekta na vezivanje liganda na osnovi R64 [U.S. Patent No. 7,842,663]. Postoji mogućnost da ova izmena eliminiše glikozilaciju na N65 u osnovi A64, pokazujući tako da se, značajna izmena u ovom regionu, verovatno, toleriše. Dok se izmena R64A slabo toleriše, R64K se dobro toleriše, tako da se drugi bazni ostatak, kao što je H, može tolerisati na poziciji 64 [U.S. Patent No. 7,842,663]. Pored toga, rezultati programa mutageneze, opisani u ovoj oblasti, pokazuju da postoje aminokiselinske pozicije u ActRIIB, koje su, često, povoljne za konzervisanje. U odnosu na SEQ ID NO: 1, one uključuju poziciju 80 (kisela ili hidrofobna aminokiselina), poziciju 78 (hidrofobna aminokiselina, posebno triptofan), poziciju 37 (kisela aminokiselina, posebno asparaginska ili glutaminska kiselina), poziciju 56 (bazna aminokiselina), poziciju 60 (hidrofobna aminokiselina, posebno fenilalanin ili tirozin). Sledstveno tome, pronalazak obezbeđuje konstrukciju aminokiselina koja se može konzervisati u polipeptidima ActRIIB. Ostale pozicije koje mogu biti poželjne za konzervisanje su sledeće: pozicija 52 (kisela aminokiselina), pozicija 55 (bazna aminokiselina), pozicija 81 (kisela aminokiselina), 98 (polarna ili naelektrisana aminokiselina, posebno E, D, R ili K), sve u odnosu na SEQ ID NO: 1.
[0094] Prethodno je demonstrirano da se dodavanje daljeg N-vezanog glikozilacijskog položaja (N-X-S/T) u ekstracelularni domen ActRIIB dobro toleriše (videti, npr., U.S. Patent No.
7,842,663). Sledstveno tome, N-X-S/T sekvence mogu biti uopšteno uvedene na pozicije izvan ligand-vezujućeg džepa, definisanog na Slici 1, u polipeptidu ActRIIB iz tekućeg pronalaska. Posebno pogodni položaji za uvođenje ne-endogenih sekvenci N-X-S/T uključuju aminokiseline 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 ili 129-134 (u odnosu na SEQ ID NO: 1). Sekvence N-X-S/T mogu, isto tako, biti uvedene u linker između sekvence ActRIIB i Fc domena ili druge fuzione komponente. Takav položaj može biti uključen sa minimalnim naporom, uvođenjem N u korektnoj poziciji u odnosu na prethodno-prisutni S ili T, ili uvođenjem S ili T na poziciji koja odgovara prethodno-prisutnom N. Sledstveno tome, poželjne izmene, kojima bi se kreirao N-vezani glikozilacijski položaj su: A24N, R64N, S67N (moguće u kombinaciji sa izmenom N65A), E105N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S i R112T (u odnosu na SEQ ID NO: 1). Bilo koji S, koji je predviđen da bude glikozilovan, može biti izmenjen u T, bez kreiranja imunogenog položaja, zbog zaštite, koju pruža glikozilacija. Isto tako, bilo koji T koji je predviđen da bude glikozilovan, može biti zamenjen sa S. Sledstveno tome, razmotrene su zamene S67T i S44T (u odnosu na SEQ ID NO: 1). Takođe, u varijanti A24N, može biti korišćena zamena S26T. Sledstveno tome, polipeptid ActRIIB iz tekućeg izlaganja može biti varijanta koja poseduje jednu ili više dodatnih, ne-endogenih N-vezanih glikozilacijskih konsenzus sekvenci, kako je prethodno opisano.
[0095] U određenim ostvarenjima, pronalazak se odnosi na antagoniste ActRIIB, koji sadrže najmanje jedan polipeptid ActRIIB, koji uključuje fragmente, funkcionalne varijante i njihove modifikovane oblike. Poželjno, polipeptidi ActRIIB, koji su namenjeni korišćenju u skladu sa pronalaskom, su rastvorljivi (npr., ekstracelularni domen ActRIIB). U nekim ostvarenjima, polipeptidi ActRIIB za korišćenje u skladu sa pronalaskom inhibiraju (antagoniziraju) aktivnost (npr., Smad signalizacija) jedan ili više liganada TGF-beta superfamilije [npr., GDF11, GDF8, aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin E) BMP6, GDF3 i/ili BMP10. U nekim ostvarenjima, polipeptidi ActRIIB za korišćenje u skladu sa izlaganjem, vezuju se sa jednim ili više liganada TGF-beta superfamilije [npr., GDF11, GDF8, aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, aktivin E) BMP6, GDF3, BMP10 i/ili BMP9]. U nekim ostvarenjima, polipeptid ActRIIB ovog pronalaska sadrži, suštinski je sastavljen od ili je sačinjen od aminokiselinske sekvence, koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa delom ActRIIB koji započinje na ostatku, koji odgovara aminokiselinama 20-29 (npr., započinjući na bilo kojoj od aminokiselina 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ili 29) iz SEQ ID NO: 1 i završavajući na poziciji koja odgovara aminokiselinama 109-134 (npr., završavajući na bilo kojoj od aminokiselina 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 ili 134) iz SEQ ID NO: 1. U nekim ostvarenjima, polipeptidi ActRIIB ovog pronalaska sadrže, suštinski su sastavljeni od ili su sačinjeni od aminokiselinske sekvence, koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinama 29-109 iz SEQ ID NO: 1. U nekim ostvarenjima, polipeptidi ActRIIB ovog pronalaska sadrže, sačinjeni su ili su suštinski sastavljeni od aminokiselinske sekvence, koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinama 29-109 iz SEQ ID NO: 1, pri čemu je na poziciji koja odgovara L79 u SEQ ID NO: 1 kisela aminokiselina (u prirodi postojeće kisele aminokiseline D i E ili veštačka kisela aminokiselina). U određenim poželjnim ostvarenjima, polipeptidi ActRIIB ovog pronalaska sadrže, sačinjeni su ili su suštinski sastavljeni od aminokiselinske sekvence, koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinama 25-131 u SEQ ID NO: 1. U određenim poželjnim ostvarenjima, polipeptidi ActRIIB ovog pronalaska sadrže, sačinjeni su ili su suštinski sastavljeni od aminokiselinske sekvence, koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinama 25-131 u SEQ ID NO: 1, pri čemu je na poziciji koja odgovara L79 u SEQ ID NO: 1 kisela aminokiselina. U nekim ostvarenjima, polipeptid ActRIIB ovog pronalaska sadrži, sastavljen je ili je suštinski sačinjen od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci iz bilo koje od SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 24, 25, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 45, 50, 53, 54 i 58. U nekim ostvarenjima, polipeptid ActRIIB ovog pronalaska sadrži, sastavljen je ili je suštinski sačinjen od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci iz bilo koje od SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 24, 25, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 45, 50, 53, 54 i 58, pri čemu je na poziciji koja odgovara L79 u SEQ ID NO: 1 kisela aminokiselina. U nekim ostvarenjima, polipeptidi ActRIIB ovog pronalaska sadrže najmanje jedan polipeptid ActRIIB, u kome na poziciji koja odgovara L79 u SEQ ID NO: 1 nije kisela aminokiselina (t.j., nisu kisele aminokiseline D ili E koje postoje u prirodi ili ostatak veštačke kisele aminokiseline).
[0096] U određenim aspektima, ovaj pronalazak se odnosi na GDF trap polipeptide (označavaju se, takođe, kao "GDF trap-ovi"). U nekim ostvarenjima, GDF trap-ove ovog pronalaska čine varijante polipeptida ActRIIB, koji sadrže jednu ili više mutacija (npr., adicije, delecije i supstitucije aminokiselina i njihove kombinacije) u ekstracelularnom domenu (koji se, takođe, označava kao ligand-vezujući domen) polipeptida ActRIIB (npr., ActRII polipeptid "divljeg tipa" ili nemodifikovani polipeptid ActRII), tako da varijanta polipeptida ActRIIB poseduje jednu ili više izmenjenih aktivnosti vezivanja liganda, nego što postoje u odgovarajućem ActRIIB polipeptidu divljeg tipa. U poželjnim ostvarenjima, GDF trap polipeptidi tekućeg pronalaska zadržavaju najmanje jednu aktivnost, koja je slična aktivnosti odgovarajućeg polipeptida ActRIIB divljeg tipa. Na primer, poželjni GDF trap-ovi se vezuju i inhibiraju (npr., ulaze u antagonizam) funkciju GDF11 i/ili GDF8. U nekim ostvarenjima, GDF trap-ovi ovog pronalaska dalje se vezuju i inhibiraju jedan ili više liganada iz superfamilije TGF-beta. Sledstveno tome, ovaj pronalazak obezbeđuje GDF trap polipeptide koji poseduju izmenjenu specifičnost vezivanja za jedan ili više liganada ActRIIB.
[0097] Radi ilustracije, može se izabrati jedna ili više mutacija, kojom se povećava selektivnost izmenjenog ligand-vezujućeg domena GDF11 i/ili GDF8, prema jednom ili više ActRIIB-vezujućih liganada, kao što su aktivini (aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C i/ili aktivin E), a posebno aktivin A. Opciono, izmenjeni ligand-vezujući domen ima odnos Kdza vezivanje aktivina prema Kdza vezivanje GDF11 i/ili GDF8, koji je najmanje 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100- ili čak 1000-puta veći od odnosa koji se tiče ligand-vezujućeg domena divljeg tipa. Opciono, izmenjeni ligand-vezujući domen ima odnos IC50za inhibiranje aktivina prema IC50za inhibiranje GDF11 i/ili GDF8, koji je najmanje 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100- ili čak 1000- puta veći u odnosu na vrednost za ligand-vezujući domen divljeg tipa. Opciono, izmenjeni ligand-vezujući domen inhibira GDF11 i/ili GDF8 sa IC50koji je najmanje 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100- ili čak 1000-puta manji od IC50za inhibiranje aktivina (npr., aktivin A).
[0098] U određenim poželjnim ostvarenjima, GDF trap-ovi ovog pronalaska su dizajnirani za prvenstvo vezivanja za GDF11 i/ili GDF8 (poznat, takođe, kao miostatin). Opciono, GDF11 i/ili GDF8-vezujući trap-ovi mogu se dalje vezivati za aktivin B. Opciono, GDF11 i/ili GDF8-vezujući trap-ovi se mogu, dalje vezivati za BMP6. Opciono, GDF11 i/ili GDF8-vezujući trapovi se, dalje, mogu vezivati za BMP10. Opciono, GDF11 i/ili GDF8-vezujući trap-ovi se mogu, dalje, vezivati za aktivin B i BMP6. U određenim ostvarenjima, GDF trap-ovi tekućeg pronalaska poseduju smanjeni afinitet vezivanja za aktivine (npr., aktivin A, aktivin A/B, aktivin B, aktivin C, aktivin E), npr., ako se uporede sa polipeptidom ActRIIB divljeg tipa. U određenim poželjnim ostvarenjima, GDF trap polipeptid tekućeg pronalaska poseduje smanjeni afinitet vezivanja za aktivin A.
[0099] Aminokiselinski ostaci proteina ActRIIB (npr., E39, K55, Y60, K74, W78, L79, D80 i F101) se nalaze u ActRIIB ligand-vezujućem džepu i pomažu u posredovanju za vezivanje za svoje ligande, uključujući, primera radi, aktivin A, GDF11 i GDF8. Sledstveno tome, tekući pronalazak obezbeđuje GDF trap polipeptide, koji sadrže izmenjeni ligand-vezujući domen (npr., GDF8/GDF11-vezujući domen) na receptoru ActRIIB, koji poseduje jednu ili više mutacija na tim aminokiselinskim ostacima.
[0100] Kao specifični primer, aminokiselinski ostatak pozitivnog naelektrisanja Asp (D80) u ligand-vezujućem domenu ActRIIB može biti mutiran u različiti aminokiselinski ostatak, da bi se proizveo GDF trap polipeptid, koji se prvenstveno veže za GDF8, ali ne za aktivin. Poželjno, ostatak D80 u odnosu na SEQ ID NO: 1 menja se u aminokiselinski ostatak, koji je odabran iz grupe koju sačinjavaju: aminokiselinski ostatak bez naelekstrisanja, negativno naelektrisani aminokiselinski ostatak i hidrofobni aminokiselinski ostatak. Kao dodatni specifični primer, hidrofobni ostatak L79 u SEQ ID NO: 1 može biti izmenjen kako bi se dobile izmenjene vezujuće karakteristike u odnosu na aktivin-GDF11/GDF8. Na primer, supstitucijom L79P smanjuje se, do većeg stepena, vezivanje GDF11 u odnosu na vezivanje aktivina. Suprotno tome, zamena L79 sa kiselom aminokiselinom [asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina; L79D ili L79E supstitucija] u velikoj meri smanjuje afinitet vezivanja za aktivin A, dok se zadržava afinitet vezivanja za GDF11. U ovde opisanim postupcima može se koristiti GDF trap polipeptid, koji predstavlja varijantu polipeptida ActRIIB, koja sadrži kiselu aminokiselinu (npr., D ili E) na poziciji, koja odgovara poziciji 79 u SEQ ID NO: 1, opciono u kombinaciji sa jednom ili više dodatnih aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija.
[0101] Ovaj pronalazak razmatra izradu funkcionalnih varijanti posredstvom modifikovanja strukture polipeptida ActRIIB, za potrebe kao što su povećanje terapeutske efikasnosti ili stabilnosti (npr., rok trajanja i otpornost na proteolitičku degradaciju in vivo). Varijante se mogu proizvesti posredstvom aminokiselinske supstitucije, delecije i adicije, ili njihovim kombinacijama. Na primer, razumljivo je očekivanje da izolovana zamena leucina sa izoleucinom ili valinom, aspartata sa glutamatom, treonina sa serinom, ili slična zamena aminokiseline sa strukturno srodnom aminokiselinom (npr., konzervativne mutacije) neće imati velikog uticaja na biološku aktivnost dobijenog molekula. Konzervativne zamene su one zamene koje se odvijaju unutar familije aminokiselina koje imaju srodne bočne lance. Da li izmena aminokiselinske sekvence polipeptida ovog pronalaska dovodi do stvaranja funkcionalnog homologa, lako se može utvrditi posredstvom procene sposobnosti varijante polipeptida da proizvodi odgovor u ćelijama na način, sličan odgovoru polipeptida divljeg tipa, ili da se vezuje za jedan ili više TGF-beta liganada, koji uključuju, na primer, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, nodalni neurotrofni faktor, izveden iz glijalne ćelijske linije (GDNF), neurturin, artemin, persefin, MIS i Lefty.
[0102] Ovaj pronalazak razmatra specifične mutacije na polipeptidu ActRIIB, tako da se izmeni glikozilacija polipeptida. Takve mutacije se mogu odabrati na takav način da se uvodi ili eliminiše jedan ili više glikozilacijskih položaja, kao što su O-vezani ili N-vezani glikozilacijski položaji. Asparagin-vezani glikozilacijski položaji prepoznavanja uopšteno sadrže tripeptidnu sekvencu, asparagin-X-treonin ili asparagin-X-serin (pri čemu je "X" bilo koja aminokiselina), koja se specifično prepoznaje od strane odgovarajućih ćelijskih glikozilacijskih enzima. Izmena se, takođe, može izvršiti putem adicije, ili supstitucije sa jednim ili više ostataka serina ili treonina u sekvenci polipeptida (za O-vezane glikozilacijske položaje). Brojne aminokiselinske supstitucije ili delecije na jednoj ili obe od prvih ili trećih aminokiselinskih pozicija na glikozilacijskom položaju prepoznavanja (i/ili delecija aminokiselina na drugoj poziciji) dovode do odsustva glikozilacije u modifikovanoj tripeptidnoj sekvenci. Druge načine povećavanja broja delova ugljenih hidrata u polipeptidu čine postupci hemijskog ili enzimskog kuplovanja glikozida na polipeptid. U zavisnosti od korišćenog načina kuplovanja, šećer(šećeri) može biti vezan na (a) arginin i histidin; (b) slobodne karboksilne grupe; (c) slobodne sulfhidrilne grupe, kao što su navedene grupe u cisteinu; (d) slobodne hidroksilne grupe, kao što su one u serinu, treoninu ili hidroksiprolinu; (e) aromatične ostatke, kao što su oni u fenilalaninu, tirozinu ili triptofanu; ili (f) amidnu grupu glutamina. Odstranjivanje jednog ili više ugljenohidratnih delova, prisutnih u polipeptidu, može se izvršiti hemijskim i/ili enzimskim putem. Hemijska deglikozilacija može uključiti, na primer, izlaganje polipeptida jedinjenju trifluorometansulfonske kiseline, ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovakva obrada dovodi do otcepljivanja najvećeg dela ili svih šećera, izuzev povezujućeg šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), pri čemu aminokiselinska sekvenca ostaje intaktna. Enzimsko otcepljivanje ugljenohidratnih delova u polipeptidu može se izvršiti korišćenjem brojnih endo- i egzoglikozidaza, kao što je opisano u Thotakura et al. [Meth. Enzymol. (1987) 138:350]. Može se izvršiti podešavanje sekvence polipeptida, na pogodan način, u zavisnosti od vrste ekspresionog sistema koji je korišćen, budući da svaka od ćelija sisara, kvasaca, insekata i biljaka, može uvoditi različite modele glikozilacije, na koje može imati uticaja aminokiselinska sekvenca peptida. Uopšteno, polipeptidi tekućeg izlaganja, namenjeni za korišćenje kod ljudi, mogu biti ekspresovani u ćelijskoj liniji sisara, čime se obezbeđuje ispravna glikozilacija, kao što su ćelijske linije HEK293 ili CHO, mada se očekuje da bi, isto tako, od koristi bile i ekspresione ćelijske linije drugih sisara.
[0103] Ovaj pronalazak, dalje, razmatra postupak proizvodnje mutanata, posebno setova kombinatornih mutanata ActRIIB polipeptida, kao i mutanata, dobijenih skraćivanjem. Pulovi kombinatornih mutanata su posebno od koristi za identifikovanje funkcionalno aktivnih (npr., vezivanje liganada TGF-beta superfamilije) sekvenci ActRIIB. Svrha skriniranja takvih kombinatornih biblioteka može biti da se proizvedu, primera radi, varijante polipeptida, koje poseduju izmenjene karakteristike, kao što je izmenjena farmakokinetika ili izmenjeno vezivanje liganda. U nastavku su obezbeđeni brojni testovi skriniranja, a takvi testovi mogu biti korišćeni za evaluaciju varijanti. Na primer, varijante ActRIIB mogu biti skrinirane na osnovu njihove sposobnosti da se vezuju sa jednim ili više liganada iz superfamilije TGF-beta (npr., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin AC, nodalni neurotrofni faktor, izveden iz glijalne ćelijske linije (GDNF), neurturin, artemin, persefin, MIS i Lefty), da bi se sprečilo vezivanje liganda iz superfamilije TGF-beta za receptore superfamilije TGF-beta, i/ili izvršila interferencija sa signalizacijom, koju izaziva ligand iz superfamilije TGF-beta.
[0104] Aktivnost polipeptida ActRIIB može se, takođe, testirati testovima na ćelijskoj bazi ili in vivo testovima. Primera radi, može se proceniti efekat polipeptida ActRIIB na ekspresiju gena, uključenih u ozbiljnost mijelofibroze. Ovo se, po potrebi, može izvršiti u prisustvu jednog ili više rekombinantnih proteina ActRII liganda (npr., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, nodalni neurotrofni faktor, izveden iz glijalne ćelijske linije (GDNF), neurturin, artemin, persefin, MIS i Lefty), i može se izvršiti transfekcija ćelija, da bi se proizveo polipeptid ActRIIB i, opciono, ligand ActRIIB. Isto tako, polipeptid ActRIIB se može primenjivati na mišu ili drugoj životinji, a efekti na mijelofibrozu se mogu proceniti korišćenjem postupaka, prepoznatih u struci. Na sličan način, aktivnost polipeptida ActRIIB ili njihove varijante može se testirati na ćelijama prekursorima krvnih ćelija, ispitivanjem bilo kakvog efekta na rast ovih ćelija, na primer, posredstvom testova kao što su ovde opisani testovi i testovi, koji pripadaju opštem znanju iz ove oblasti. Na tim ćelijskim linijama se može koristiti SMAD-odgovorni reporter gen, kako bi se pratili efekti na nishodnu signalizaciju.
[0105] Mogu se razviti kombinatorikom dobijene varijante koje poseduju povećanu selektivnost ili, uopšteno, povećanu snagu, u odnosu na referentni polipeptid ActRIIB. Takve varijante, kada se ekspresuju iz rekombinantnih konstrukcija DNA, mogu biti korišćene u protokolima genske terapije. Isto tako, mutagenezom se mogu proizvesti varijante koje poseduju intracelularne poluživote koji se dramatično razlikuju od onih kod odgovarajućeg nemodifikovanog polipeptida ActRIIB. Na primer, izmenjeni protein se može učiniti ili više stabilnim ili manje stabilnim u odnosu na proteolitičku razgradnju ili druge ćelijske procese koji dovode do razgradnje, ili drugačije inaktivacije, nemodifikovanog polipeptida. Takve varijante i geni, koji ih kodiraju, mogu biti iskorišćeni za izmenu nivoa polipeptidnih kompleksa, posredstvom moduliranja poluživota polipeptida. Na primer, kratak polu-život može dovesti do kratkotrajnijih bioloških efekata, a, kada čine deo inducibilnog ekspresionog sistema, mogu omogućiti strožu kontrolu nivoa rekombinantnih polipeptidnih kompleksa unutar ćelije. U Fc fuzionom proteinu, mutacije mogu biti izvršene u linkeru (ukoliko ih ima) i/ili u Fc delu, da bi se izmenio polu-život polipeptida ActRIIB.
[0106] Kombinatorna biblioteka se može proizvesti posredstvom degenerativne biblioteke gena, koji kodiraju biblioteku polipeptida, od kojih svaki uključuje barem deo potencijalnih sekvenci ActRIIB. Na primer, mešavina sintetskih oligonukleotida se može enzimski uvezati u genske sekvence, tako da je degenerisani set potencijalnih ActRIIB kodirajućih nukleotidnih sekvenci moguće izraziti kao pojedinačne polipeptide, ili alternativno, kao set većih fuzionih proteina (npr., za prikaz faga).
[0107] Postoji mnogo načina posredstvom kojih se biblioteka potencijalnih homologa može proizvesti iz degenerisane oligonukleotidne sekvence. Hemijska sinteza degenerisane genske sekvence može se izvršiti u automatskom DNA sintetizeru, a sintetski geni se, zatim, mogu uvezati u odgovarajući vektor za ekspresiju. Sinteza degenerisanih oligonukleotida dobro je poznata u ovoj oblasti [Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; i Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477]. Takve tehnike su bile korišćene u dirigovanoj evoluciji drugih proteina [Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; kao i U.S. Patent No: 5,223,409, 5,198,346 i 5,096,815].
[0108] Alternativno, ostali oblici mutageneze mogu biti korišćeni za proizvođenje kombinatorne biblioteke. Na primer, polipeptidi ActRIIB ovog pronalaska mogu se proizvesti i izolovati iz biblioteke posredstvom skrininga, uz korišćenje, na primer, alanin skenirajuće mutageneze [Ruf et al. (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al. (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al. (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al. (1991) Biochemistry 30:10832-10838; i Cunningham et al. (1989) Science 244:1081-1085], posredstvom linker skenirajuće mutageneze [Gustin et al. (1993) Virology 193:653-660; i Brown et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al. (1982) Science 232:316], posredstvom saturacione mutageneze [Meyers et al., (1986) Science 232:613]; posredstvom PCR mutageneze [Leung et al. (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19]; ili posredstvom nasumične mutageneze, uključujući hemijsku mutagenezu [Miller et al. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; i Greener et al. (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]. Linker skenirajuća mutageneza, posebno u kombinatornoj postavci, predstavlja atraktivan postupak za identifikovanje skraćenih (bioaktivnih) oblika polipeptida ActRIIB.
[0109] U ovoj oblasti je poznat širok spektar tehnika za skriniranje genskih proizvoda kombinatornih biblioteka, dobijenih posredstvom tačkastih mutacija i skraćivanja, i, u tom slučaju, za skriniranje biblioteka cDNA, na genske proizvode koji poseduju određenu karakteristiku. Takve tehnike će, uopšteno, biti prilagodljive za brzo skriniranje biblioteka gena, proizvedenih kombinatornom mutagenezom polipeptida ActRIIB. Tehnika koja se najčešće koristi za skriniranje velikih biblioteka gena, obično uključuje kloniranje genske biblioteke u ekspresione vektore koji se mogu replikovati, transformisanje odgovarajućih ćelija sa dobijenom bibliotekom vektora i ekspresiju kombinatornih gena pod uslovima u kojima detekcija željene aktivnosti omogućuje relativno lako izolovanje gena koji kodira vektor, čiji proizvod se detektuje. Poželjni testovi uključuju: testove vezivanja TGF-beta liganda (npr., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, nodalni neurotrofni faktor, izveden iz glijalne ćelijske linije (GDNF), neurturin, artemin, persefin, MIS i Lefty) i/ili testove ćelijske signalizacije, posredovane TGF-beta ligandom.
[0110] Kao što će lice, stručno u ovoj oblasti, prepoznati, najveći broj opisanih mutacija, varijanti ili ovde opisanih modifikacija, može biti izvršen na nivou nukleinskih kiselina, ili, u nekim slučajevima, posredstvom post-translacionih modifikacija ili hemijske sinteze. Takve tehnike su, u ovoj oblasti, dobro poznate, a neke od njih su ovde opisane. Ovaj pronalazak, u jednom delu, identifikuje funkcionalno aktivne delove (fragmente) i varijante polipeptida ActRIIB, koje se mogu koristiti kao vodič za razvijanje i korišćenje drugih varijanti ActRIIB polipeptida, koje se nalaze unutar, ovde opisanih, okvira pronalaska.
[0111] Funkcionalno aktivni fragmenti polipeptida ActRIIB iz ovog pronalaska mogu se dobiti skriniranjem polipeptida, koji su rekombinantno proizvedeni iz odgovarajućeg fragmenta nukleinske kiseline koja kodira polipeptid ActRIIB (npr., SEQ ID NO: 7, 8, 26, 32, 48, 49, 51, 52, 55, 56, 57, 59, 60, 61 i 62). Pored toga, fragmenti se mogu hemijski sintetisati korišćenjem tehnika, poznatih u struci, kao što konvencionalna Merrifield hemija čvrste faze f-Moc ili t-Boc. Fragmenti se mogu proizvesti (rekombinantnim putem ili putem hemijske sinteze) i testirati, kako bi se identifikovali oni peptidil fragmenti, koji mogu funkcionisati kao antagonisti (inhibitori) receptora ActRII i/ili jednog ili više liganada (npr., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, nodalni neurotrofni faktor, izveden iz glijalne ćelijske linije (GDNF), neurturin, artemin, persefin, MIS i Lefty).
[0112] Polipeptidi ActRIIB iz ovog pronalaska mogu, dalje, sadržavati post-translacijske modifikacije pored bilo kojih koje su već prisutne u polipeptidu ActRIIB, koji postoji u prirodi. Takve modifikacije uključuju, ali bez ograničavanja na njih, acetilaciju, karboksilaciju, glikozilaciju, fosforilaciju, lipidaciju i acilaciju. Kao rezultat modifikacije, polipeptid ActRIIB može sadržavati elemente koji nisu aminokiseline, kao što su: polietilen glikoli, lipidi, polisaharid ili monosaharid, i fosfati. Efekti takvih ne-aminokiselinskih elemenata na funkcionalnost ligand trap polipeptida može se testirati kao što je ovde opisano za druge varijante ActRIIB. Kada se polipeptid ovog pronalaska proizvodi u ćelijama posredstvom cepanja urođenog oblika polipeptida, od značaja može, isto tako, biti podvrgavanje posttranslacijskim postupcima, radi ispravnog nabiranja i/ili funkcionisanja proteina. Različite ćelije (npr., CHO, HeLa, MDCK,293, WI38, NIH-3T3 ili HEK293) poseduju specifičnu celularnu mašineriju i karakteristične mehanizme za takve post-translacijske aktivnosti, a mogu se odabrati kako bi se obezbedila korektno modifikovanje i procesuiranje polipeptida ActRII.
[0113] U određenim aspektima, polipeptidi ActRIIB iz ovog pronalaska uključuju fuzione proteine koji poseduju najmanje deo (domen) polipeptida ActRIIB i jedan ili više heterolognih delova (domena). Dobro-poznati primeri takvih fuzionih domena uključuju, ali bez ograničavanja na njih, polihistidin, Glu-Glu, glutation S-transferazu (GST), tioredoksin, protein A, protein G i konstantni region teškog lanca imunoglobulina (Fc), maltoza-vezujući protein (MBP) ili humani serumski albumin. Izbor fuzionog domena može se izvršiti tako da se dobije željena karakteristika. Na primer, neki fuzioni domeni su posebno korisni za izolovanje fuzionih proteina putem afinitetne hromatografije. Za potrebe prečišćavanja afinitetnom hromatografijom, korišćeni su relevantni matriksi za afinitetnu hromatografiju, kao što su glutation-, amilaza- i nikl- ili kobalt-konjugovane smole. Mnogi od tih matriksa raspoloživi su u formi "kita", kao što je sistem prečišćavanja Pharmacia GST i sistem QIAexpress™ (Qiagen), koji je od koristi sa (HIS6) fuzionim partnerima. Kao drugi primer, može se odabrati takav fuzioni domen da se olakša detekcija polipeptida ActRIIB. Primeri takvih detekcionih domena uključuju razne fluorescentne proteine (npr., GFP), kao "tagove epitopa", koji su uglavnom kratke peptidne sekvence prema kojima su raspoloživa specifična antitela. Dobro poznati tagovi epitopa, za koje su lako dostupna specifična monoklonska antitela, uključuju: FLAG, hemaglutinin virusa gripa (HA) i c-myc tagove. U nekim slučajevima, fuzioni domeni poseduju položaj proteaznog cepanja, kao što je položaj za Faktor Xa ili trombin, čime se omogućuje parcijalna digestija fuzionih proteina posredstvom odgovarajućih proteaza, i, time, oslobađanje rekombinantnih proteina iz njih. Oslobođeni proteini se mogu, nakon toga, izolovati iz fuzionog domena sledstvenim podvrgavanjem hromatografskoj separaciji. Ostali tipovi fuzionih domena koji se mogu odabrati uključuju multimerizaciju (npr., dimerizaciju, tetramerizaciju) domena i funkcionalnih domena (koji dele dodatnu biološku funkciju), uključujući, na primer, konstantne domene iz imunoglobulina (npr., Fc domeni).
[0114] U određenim aspektima, polipeptidi ActRIIB iz ovog pronalaska sadrže jednu ili više modifikacija, koje su u stanju da "stabilizuju" polipeptide. Pod "stabilizacijom" se podrazumeva bilo koji postupak kojim se povećava in vitro polu-život, serumski polu-život, bez obzira da li se isti postižu smanjenom razgradnjom, smanjenim klirensom preko bubrega ili drugim farmakokinetičkim efektom sredstva. Na primer, takvim modifikacijama se produžava rok trajanja polipeptida, produžava polu-život polipeptida u cirkulaciji i/ili smanjuje proteolitička razgradnja polipeptida. Takve stabilizacijske modifikacije uključuju, ali bez ograničavanja na njih, fuzione proteine (uključujući, na primer, fuzione proteine koji sadrže domen polipeptida ActRIIB i stabilizatorski domen), modifikacije glikozilacijskog položaja (uključujući, na primer, dodavanje glikozilacijskog položaja na polipeptid ovog pronalaska) i modifikacije na delu ugljenog hidrata (uključujući, na primer, uklanjanje ugljenohidratnih delova iz polipeptida pronalaska). Kako je ovde korišćen, izraz "stabilizatorski domen" ne odnosi se samo na fuzioni domen (npr., Fc domen imunoglobulina) kao što je to u slučaju fuzionih proteina, već, isto tako, uključuje ne-proteinske modifikacije, kao što su modifikacije dela ugljenih hidrata, ili neproteinski deo, kao što je polietilen glikol. Polipeptid ActRIIB može biti spojen sa heterolognim domenom, čime se stabilizuje polipeptid ("stabilizatorski" domen), poželjno sa heterolognim domenom kojim se povećava stabilnost polipeptida in vivo. Poznato je da se fuzijama sa konstantnim domenom imunoglobulina (npr., Fc domen) postižu željene farmakokinetičke karakteristike na velikom rasponu proteina. Isto tako, fuzijama sa humanim serumskim albuminom mogu se proizvesti željene karakteristike.
[0115] Primer nativne aminokiselinske sekvence, koja se može koristiti za Fc deo humanog IgG1 (G1Fc) prikazan je u nastavku (SEQ ID NO: 9). Deo podvučen tačkicama označava zglobni region, a deo podvučen punom linijom označava pozicije sa varijantama koje postoje u prirodi. Ovaj pronalazak, delom, obezbeđuje polipeptide koji sadrže, suštinski su sastavljeni od ili su sačinjeni od aminokiselinskih sekvenci sa 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta SEQ ID NO: 9. U prirodi postojeće varijante u G1Fc uključivale bi E134D i M136L, prema sistemu numerisanja, koji je korišćen u SEQ ID NO: 9 (videti Uniprot P01857).
[0116] Opciono, Fc domen IgG1 Fc poseduje jednu ili više mutacija na ostacima, kao što su Asp-265, lizin 322 i Asn434. U određenim slučajevima, Fc domen mutant IgG1, koji poseduje jednu ili više ovih mutacija (npr., mutacija Asp-265) ima smanjenu sposobnost vezivanja za Fcy receptor u odnosu na Fc domen divljeg tipa. U ostalim slučajevima, mutant Fc domen, koji poseduje jednu ili više ovih mutacija (npr., mutacija Asn-434) ima povećanu sposobnost vezivanja za Fc receptor, koji je srodan MHC klasi I (FcRN), u odnosu na Fc domen IgG1 divljeg tipa.
[0117] Primer nativne aminokiselinske sekvence, koja se može koristiti za Fc deo humanog IgG2 (G2Fc) prikazan je u nastavku (SEQ ID NO: 10). Deo podvučen tačkicama označava zglobni region, a deo podvučen dvostrukom linijom označava pozicije gde postoji konflikt baza u sekvenci (u skladu sa UniProt P01859). Pronalazak, delom, obezbeđuje polipeptide koji sadrže, suštinski su sastavljeni od ili su sačinjeni od aminokiselinskih sekvenci sa 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta SEQ ID NO: 10.
[0118] Dva primera aminokiselinskih sekvenci, koje se mogu koristiti za Fc deo humanog IgG3 (G3Fc) prikazana su u nastavku. Zglobni region uG3Fc može biti do četiri puta veće dužine nego u drugim Fc lancima i sadrže tri identična segmenta sa 15-ostatkom, kojima prethodi sličan segment sa 17-ostatkom. Prva G3Fc sekvenca, prikazana ispod (SEQ ID NO: 11) sadrži kratki zglobni region koga čini jedan segment sa 15-ostatkom, dok druga G3Fc sekvenca (SEQ ID NO: 12) sadrži zglobni region pune dužine. U svakom slučaju, deo podvučen tačkicama označava zglobni region, a deo podvučen punom linijom označava pozicije sa varijantama koje postoje u prirodi, prema UniProt P01859. Pronalazak, delom, obezbeđuje polipeptide koji sadrže, suštinski su sastavljeni od ili su sačinjeni od aminokiselinskih sekvenci sa 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta SEQ ID NO: 11 i 12.
[0119] U prirodi postojeće varijante u G3Fc (videti, na primer, Uniprot P01860) uključuju: E68Q, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, F221Y, kada se konvertuju na sistem numerisanja, koji je korišćen u SEQ ID NO: 11, a ovaj pronalazak obezbeđuje fuzione proteine, koji sadrže G3Fc domene, koji uključuju jednu ili više ovih varijacija. Pored toga, gen humanog imunoglobulina IgG3 (IGHG3) pokazuje strukturni polimorfizam, karakterisan različitim dužinama zgloba [videti Uniprot P01859]. Specifično, varijanta WIS je bez najvećeg dela V regiona i sa celokupnim CH1 regionom. Ona poseduje dodatnu unutarlančanu disulfidnu vezu na poziciji 7, pored one na poziciji 11, koja je normalno prisutna u zglobnom regionu. Varijanta ZUC je bez najvećeg dela V regiona, sa celokupnim CH1 regionom i delom zgloba. Varijanta OMM može predstavljati alelni oblik ili drugu subklasu gama lanca. Ovaj pronalazak obezbeđuje dodatne fuzione proteine, koji sadrže G3Fc domene, koji uključuju jednu ili više ovih varijanti.
[0120] Primer nativne aminokiselinske sekvence, koja se može koristiti za Fc deo humanog IgG4 (G4Fc) prikazan je u nastavku (SEQ ID NO: 13). Deo podvučen tačkicama označava zglobni region. U delu, pronalazak obezbeđuje polipeptide koji sadrže, suštinski su sastavljeni od ili su sačinjeni od aminokiselinskih sekvenci sa 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta SEQ ID NO: 13.
[0121] Mnoštvo mutacija u Fc domenu, proizvedenih inženjeringom, predstavljeno je ovde u odnosu na sekvencu G1Fc (SEQ ID NO: 9), a analogne mutacije u: G2Fc, G3Fc i G4Fc mogu se proizvesti iz njihovog poravnavanja sa G1Fc na Slici 11. Zbog nejednakih dužina zgloba, analogne pozicije Fc, na bazi izotipskog poravnavanja (Slika 11) poseduju različite aminokiselinske brojeve u SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 i 13. Takođe se može proceniti da će data aminokiselinska pozicija u imunoglobulinskoj sekvenci, koja je sastavljena od zglobnog regiona, CH2 regiona i CH3 regiona (npr., SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 i 13) biti identifikovana preko brojčane oznake koja se razlikuje od one na istoj poziciji, kada numerisanje obuhvata ceo konstantni domen teškog lanca punog IgG1 (koji se sastoji od: CH1 regiona, zglobnog regiona, CH2 regiona i CH3 regiona), kao u bazi podataka Uniprot. Primera radi, predstavljanje između odabranih CH3 pozicija u humanoj G1Fc sekvenci (SEQ ID NO: 9) konstantnog domena teškog lanca humanog IgG1 (Uniprot P01857) i teškog lanca humanog IgG1 je sledeće.
[0122] Podrazumeva se da se različiti elementi fuzionih proteina (npr., fuzioni proteini Fc imunoglobulina) mogu aranžirati na bilo koji način, koji je u skladu sa željenom funkcionalnošću. Na primer, domen polipeptida ActRIIB može biti postavljen C-terminalno u odnosu na heterologni domen, ili alternativno, heterologni domen može biti postavljen C-terminalno u odnosu na domen polipeptida ActRIIB. Neophodno je da domen polipeptida ActRIIB i heterologni domen ne budu u blizini u fuzionom proteinu, a dodatni domeni ili aminokiselinske sekvence mogu biti uključeni C- ili N-terminalno prema bilo kom domenu ili između domena.
[0123] Na primer, ActRIIB receptorski fuzioni protein može sadržavati aminokiselinsku sekvencu kako je navedena u formuli A-B-C. Deo B odgovara domenu polipeptida ActRIIB. Delovi A i C mogu, nezavisno, biti: nijedna, jedna ili više od jedne aminokiseline, a oba dela, A i C, kada su prisutni, su heterologna u odnosu na B. Delovi A i/ili C mogu biti povezani na deo B preko sekvence linkera. Linker može biti bogat glicinom (npr., 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 glicinskih ostataka) ili glicinskim i prolinskim ostacima, i može, na primer, sadržavati jednu sekvencu treonin/serina i glicina ili ponavljajuće sekvence treonin/serina i/ili glicina, npr., GGG (SEQ ID NO: 14), GGGG (SEQ ID NO: 15), TGGGG(SEQ ID NO: 16), SGGGG(SEQ ID NO: 17), TGGG (SEQ ID NO: 18), SGGG(SEQ ID NO: 19) ili GGGGS (SEQ ID NO: 20) singleti ili ponovci. Fuzioni protein ActRIIB može sadržavati aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedena u formuli A-B-C, pri čemu A predstavlja lider (signal) sekvencu, B je sastavljen od domena ActRIIB polipeptida, a C je polipeptidni deo, koji pojačava jednu ili više od sledećih: in vivo stabilnost, in vivo polu-život, prihvatanje/primena, tkivna lokalizacija ili distribucija, obrazovanje proteinskih kompleksa i/ili prečišćavanje. ActRIIB fuzioni protein može sadržavati aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u formuli A-B-C, pri čemu je A sekvenca TPA lidera, B je sastavljen od domena ActRIIB receptorskog polipeptida, a C je Fc domen imunoglobulina. Poželjni fuzioni proteini sadrže aminokiselinsku sekvencu, koja je data u bilo kojoj od: SEQ ID NO: 24, 25, 28, 29, 31, 33, 34, 45, 50, 53 i 58.
[0124] Polipeptidi ActRIIB za korišćenje u skladu sa, ovde opisanim, postupcima, mogu biti izolovani polipeptidi. Kako je ovde korišćen, naziv izolovani protein ili polipeptid je onaj koji se može izdvojiti iz komponente svog prirodnog okruženja. Polipeptid pronalaska može biti prečišćen do stepena čistoće koji je veći od 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% čistoće, ako se utvrđuje, primera radi, elektroforezom (npr., SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografski (npr., jon-izmenjivačka ili reverzno-fazna HPLC). Postupci za procenu čistoće antitela dobro su poznati u ovoj oblasti [videti, npr., Flatman et al., (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87]. Polipeptidi ActRIIB za korišćenje u skladu sa, ovde opisanim, postupcima, su rekombinantni polipeptidi.
[0125] Polipeptidi ActRIIB ovog pronalaska mogu biti proizvedeni raznim postupcima, poznatim u struci. Primera radi, polipeptidi pronalaska mogu biti sintetisani korišćenjem standardnih tehnika proteinske hemije, kao što su tehnike koje su opisane u: Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) i Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User’s Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992). Pored toga, komercijalno su dostupni automatizovani peptidni sintetizeri (npr., Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). Alternativno, polipeptidi pronalaska, uključujući i njihove fragmente ili varijante, mogu biti proizvedeni rekombinantno, korišćenjem raznih ekspresionih sistema [npr., E. coli, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), COS ćelije, bakulovirus], kao što je poznato u struci. Modifikovani ili nemodifikovani polipeptidi pronalaska mogu biti proizvedeni posredstvom digestije rekombinantno proizvedenih ActRIIB polipeptida pune dužine, korišćenjem, primera radi, proteaze, npr., tripsina, termolizina, himotripsina, pepsina ili konvertujećeg enzima sparenih baznih aminokiselina (PACE). Kompjuterska analiza (korišćenjem komercijalno dostupnog softvera, npr., MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) može biti korišćena za identifikovanje položaja proteolitičkog cepanja. Alternativno, takvi polipeptidi se mogu proizvesti iz rekombinantno razvijenih polipeptida ActRIIB pune dužine, uz korišćenje hemijskog otcepljivanja (npr., cijanogen bromid, hidroksilamin, itd.).
B. Nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide ActRIIB
[0126] Ovde su, takođe, obezbeđene, ali nisu zahtevane, izolovane i/ili rekombinantne nukleinske kiseline, koje kodiraju polipeptide ActRIIB (uključujući njihove fragmente, funkcionalne varijante (npr., GDF trap) i fuzione proteine). Na primer, SEQ ID NO: 7 kodira prekursorski polipeptid humanog ActRIIB koji postoji u prirodi (prethodno opisana varijanta R64), dok SEQ ID NO: 8 kodira procesuirani ekstracelularni domen ActRIIB (prethodno opisana varijanta R64). Predmetne nukeinske kiseline mogu jedno-struke ili dvo-struke. Takve nukleinske kiseline mogu biti molekuli DNA ili RNA. Te nukleinske kiseline mogu biti korišćene, na primer, u postupcima za izradu ActRII-baziranih ligand trap polipeptida, kao što je ovde opisano.
[0127] Kako je ovde korišćen, izraz izolovana nukleinska kiselina(kiseline) odnosi se na molekul nukleinske kiseline, koji je izdvojen iz komponente njenog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji je sadržan u ćeliji koja uobičajeno sadrži molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan van hromozoma ili na poziciji u hromozomu, koja se razlikuje od njene prirodne pozicije u hromozomu.
[0128] Može se razumeti da nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide ActRIIB ovog pronalaska uključuju nukleinske kiseline koje su varijante bilo koje od sledećih: SEQ ID NO: 7, 8, 26, 32, 48, 49, 51, 52, 55, 56, 57, 59, 60, 61 i 62. Varijante nukleotidnih sekvenci uključuju sekvence koje se razlikuju po jednoj ili više nukleotidnih supstitucija, adicija ili delecija, uključujući alelske varijante, tako da će, sledstveno tome, uključiti i kodirajuće sekvence koje se razlikuju od nukleotidne sekvence, navedene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 7, 8, 26, 32, 48, 49, 51, 52, 55, 56, 57, 59, 60, 61 i 62.
[0129] Polipeptidi ActRIIB ovog pronalaska mogu biti kodirani od strane izolovanih i/ili rekombinantnih sekvenci nukleinske kiseline, koje su najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa bilo kojom od SEQ ID NO: 7, 8, 26, 32, 48, 49, 51, 52, 55, 56, 57, 59, 60, 61 i 62. Lice uobičajene stručnosti u ovoj oblasti proceniće da se sekvence nukleinskih kiselina koje su najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sekvencama koje su komplementarne SEQ ID NO: 7, 8, 26, 32, 48, 49, 51, 52, 55, 56, 57, 59, 60, 61 i 62, i njihove varijante, nalaze unutar okvira tekućeg pronalaska. Sekvence nukleinskih kiselina ovog pronalaska mogu biti podvrgnute izolovanju, rekombinovanju i/ili fuziji sa heterolognom nukleotidnom sekvencom, ili u biblioteci DNA.
[0130] Nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu, takođe, uključivati, nukleotidne sekvence, koje se podvrgavaju hibridizaciji pod veoma strogim uslovima, sa nukleotidnom sekvencom, koja je navedena u SEQ ID NO: 7, 8, 26, 32, 48, 49, 51, 52, 55, 56, 57, 59, 60, 61 i 62, komplementarnim sekvencama SEQ ID NO: 7, 8, 26, 32, 48, 49, 51, 52, 55, 56, 57, 59, 60, 61 i 62, ili njihovim fragmentima. Kako je prethodno razmotreno, lice uobičajene stručnosti u ovoj oblasti lako će razumeti da odgovarajući uslovi strogosti koji podstiču hibridizaciju DNA mogu varirati. Lice uobičajene stručnosti u ovoj oblasti lako će razumeti da odgovarajući uslovi strogosti koji podstiču hibridizaciju DNA mogu varirati. Na primer, hibridizaciju je moguće izvršiti sa 6.0 x natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC), na približno 45 °C, nakon čega je sledilo ispiranje sa 2.0 x SSC, na 50 °C. Na primer, koncentracija soli u koraku ispiranja može biti odabrana od niske strogosti sa približno 2.0 x SSC, na 50 °C, do visoke strogosti sa približno 0.2 x SSC, na 50 °C. Pored toga, temperatura u koraku ispiranja može se povećavati pod uslovima niske strogosti, na sobnoj temperaturi, na približno 22 °C, do uslova visoke strogosti, na približno 65 °C. I uslovi temperature i uslovi koncentracije soli mogu varirati, ili se temperatura ili koncentracija soli mogu držati konstantnim, dok se menja druga varijabla. Pronalazak može obezbediti nukleinske kiseline koje se podvrgavaju hibridizaciji pod uslovima niske strogosti, sa 6 x SSC, na sobnoj temperaturi, nakon čega je sledilo ispiranje sa 2 x SSC, na sobnoj temperaturi.
[0131] Izolovane nukleinske kiseline koje se razlikuju od nukleinskih kiselina, navedenih u SEQ ID NO: 7, 8, 26, 32, 48, 49, 51, 52, 55, 56, 57, 59, 60, 61 i 62, do degeneracije u genetskom kodu, takođe se nalaze unutar okvira pronalaska. Na primer, utvrđen je broj aminokiselina za više od jednog tripleta. Kodoni, koji specifikuju istu aminokiselinu, ili sinonimi (na primer, CAU i CAC su sinonimi za histidin) mogu dovesti do "tihih" mutacija, koje nemaju uticja na aminokiselinsku sekvencu proteina. Očekuje se, međutim, da će polimorfizmi sekvence DNA, koji dovode do izmena u aminokiselinskoj sekvenci predmetnih proteina, opstati u ćelijama sisara. Lice stručno u ovoj oblasti proceniće da ove varijacije u jednom ili više nukleotida (sve do približno 3-5% nukleotida) nukleinskih kiselina, koje kodiraju određeni protein, mogu postojati među pojedincima date vrste, zbog prirodne varijacije alela. Bilo koje i sve takve varijacije nukleotida i rezultirajući polimerfizmi aminokiselina nalaze se unutar okvira ovog pronalaska.
[0132] Rekombinantne nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu biti operativno vezane za jednu ili više regulatornih nukleotidnih sekvenci u ekspresionoj konstrukciji. Regulatorne nukleotidne sekvence će, uopšteno, odgovarati ćeliji domaćina koja je korišćena za ekspresiju. Brojni tipovi pogodnih ekspresionih vektora i pogodnih regulatornih sekvenci poznati su u struci i mogu se koristiti u raznim ćelijama domaćina. Uobičajeno, jedna ili više regulatornih nukleotidnih sekvenci može uključiti, ali bez ograničavanja na njih, sekvence promotera, lider sekvence ili signalne sekvence, ribozomske vezujuće položaje, start sekvence i terminacione sekvence transkripcije, start sekvence i terminacione sekvence translacije, i sekvence pojačivača ili aktivatora. Konstitutivni ili inducibilni promoteri su poznati u ovoj oblasti i razmotreni su u ovom pronalasku. Promoteri mogu biti ili promoteri koji postoje u prirodi ili hibridni promoteri, u kojima su sjedinjeni elementi više od jednog promotera. Ekspresiona konstrukcija može biti prisutna u ćeliji, na episomu, kao što je plazmid, ili ekspresiona konstrukcija može biti ugrađena u hromozom. U nekim ostvarenjima, ekspresioni vektor sadrži gen selektivnog markera, kako bi se omogućila selekcija transformisanih ćelija domaćina. Geni selektivnog markera dobro su poznati i mogu varirati u odnosu na korišćenu ćeliju domaćina.
[0133] Predmetna nukleinska kiselina može biti obezbeđena u ekspresionom vektoru, koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid ActRIIB i operativno je vezana za najmanje jednu regulatornu sekvencu. Regulatorne sekvence su poznate u struci, a odabrane su da bi usmeravale ekspresiju polipeptida ActRIIB. Sledstveno tome, izraz regulatorna sekvenca uključuje: promotere, pojačivače i druge kontrolne elemente ekspresije. Primeri regulatornih sekvenci su opisani u Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Primera radi, bilo koja sekvenca iz širokog varijeteta ekspresionih kontrolnih sekvenci, koje kontrolišu ekspresiju sekvence DNA, kada se za nju operativno vežu, može biti korišćena u ovim vektorima za ekspresiju sekvenci DNA, koje kodiraju polipeptid ActRIIB. Takve korisne kontrolne sekvence ekspresije, uključuju, primera radi, rane i kasne promotere SV40, tet promoter, adenovirusni ili citomegalovirusni hitni rani promoter, RSV promotere, lac sistem, trp sistem, TAC ili TRC sistem, T7 promoter, čiju ekspresiju usmerava T7 RNA polimeraza, glavne operatorske i promoterske regione lambda faga, kontrolne regione za fd omotač protein, promoter za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, promotere kisele fosfataze, npr., Pho5, promotere faktora a-sparivanja kvasaca, polihedron promoter sistema bakulovirusa i druge sekvence, za koje se zna da kontrolišu ekspresiju gena prokariotskih ili eukariotskih ćelija ili njihovih virusa, i razne njihove kombinacije. Podrazumevalo bi se da dizajn ekspresionog vektora može zavisiti od faktora, kao što su, izbor ćelije domaćina koja bi se podvrgla transformaciji i/ili vrste proteina, koje želimo izraziti. Pored toga, takođe se u razmatranje može uzeti broj kopija vektora, sposobnost kontrole tog broja kopija i ekspresije bilo kog drugog proteina, kodiranog od strane vektora, kao što su antibiotski markeri.
[0134] Rekombinantna nukleinska kiselina tekućeg pronalaska može se proizvesti ligacijom kloniranog gena, ili njegovog dela, u vektor, koji je pogodan za ekspresiju ili u prokariotskim ćelijama ili u eukariotskim ćelijama (kvasci, ptice, insekti ili sisari) ili u obe. Ekspresiona sredstva za proizvodnju rekombinantnih polipeptida ActRIIB uključuju plazmide i druge vektore. Primera radi, pogodni vektori uključuju plazmide sledećih tipova: pBR322-dobijeni plazmidi, pEMBL-izvedeni plazmidi, pEX-izvedeni plazmidi, pBTac-izvedeni plazmidi i pUC-dobijeni plazmidi za ekspresiju u prokariotskim ćelijama, kao što je E. coli.
[0135] Neki ekspresioni vektori sisara sadrže i prokariotske sekvence za olakšavanje širenja vektora u bakterijama i jednu ili više eukariotskih transkripcionih jedinica, koje se ekspresuju u eukaiotskim ćelijama. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo i pHyg-dobijeni vektori su primeri ekspresionih vektora sisara, koji su pogodni za transfekciju eukariotskih ćelija. Neki od ovih vektora su modifikovani sa sekvencama iz bakterijskih plazmida, kao što je pBR322, da bi se olakšala replikacija i selekcija prema rezistenciji na lekove i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama. Alternativno, i derivati virusa, kao što je goveđi papiloma virus (BPV-1) ili Epstein-Barr virus (pHEBo, pREP-izvedeni virus i p205) mogu biti korišćeni za prolaznu ekspresiju proteina u eukariotskim ćelijama. Primeri drugih virusnih (uključujući retroviruse) ekspresionih sistema mogu se naći u nastavku, u opisu sistema za oslobađanje genske terapije. Razni postupci, korišćeni u izradi plazmida i u transformaciji organizama domaćina, dobro su poznati u ovoj oblasti. Ostali pogodni ekspresioni sistemi, koji su pogodni i za prokariotske i za eukariotske ćelije, kao i opšte procedure rekombinovanja, mogu se naći, npr., u Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. od Sambrooka, Fritscha i Maniatisa (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). U nekim slučajevima, može biti poželjno da se ekspresuju rekombinantni polipeptidi, korišćenjem bakulovirusnog ekspresionog sistema. Primeri takvih bakulovirusnih ekspresionih sistema uključuju pVL-dobijene vektore (kao što su pVL1392, pVL1393 i pVL941), pAcUW-dobijene vektore (kao što je pAcUW1) i pBlueBac-dobijene vektore (kao što je pBlueBac III, koji sadrži b-gal).
[0136] Može biti dizajniran vektor za proizvodnju predmetnih polipeptida ActRIIB u CHO ćelijama, kao što su Pcmv-Script vektor (Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 vektori (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) i pCI-neo vektori (Promega, Madison, Wisc.). Kao što je očigledno, predmetne genske konstrukcije mogu biti korišćene za izazivanje ekspresije predmetnih polipeptida ActRII u ćelijama, umnoženim u kulturi, npr., za proizvodnju proteina, uključujući fuzione proteine ili varijante proteina, za prečišćavanje.
[0137] Ovaj pronalazak se, takođe, odnosi na ćeliju domaćina, podvrgnutu transfekciji sa rekombinantnim genom, uključujući kodirajuću sekvencu za jedan ili više predmetnih polipeptida ActRIIB. Ćelija domaćina može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija. Na primer, polipeptid ActRIIB ovog pronalaska može biti ekspresovan u bakterijskim ćelijama, kao što su: E. coli, ćelije insekata (npr., uz korišćenje bakulovirusnog ekspresionog sistema), ćelije kvasaca ili ćelije sisara [npr., ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO)]. Ostale pogodne ćelije domaćina poznate su stručnjacima u ovoj oblasti.
[0138] Sledstveno tome, ovaj pronalazak se, dalje, odnosi na postupke za proizvodnju predmetnih polipeptida ActRIIB. Na primer, ćelija domaćina, podvrgnuta transfekciji sa ekspresionim vektorom, koji kodira polipeptid ActRIIB, može biti kultivisana pod pogodnim uslovima, koji omogućuju da se odvija ekspresija polipeptida ActRIIB. Polipeptid se može sekretovati i izolovati iz mešavine ćelija i medijuma koji sadrže polipeptid. Alternativno, polipeptid ActRIIB može biti zadržan u citoplazmi ili u membranskoj frakciji, a ćelije mogu biti uzete i lizirane, a protein izolovan. Ćelijska kultura uključuje ćelije domaćina, medijume i nusprodukte. Medijumi, pogodni za ćelijsku kulturu dobro su poznati u ovoj oblasti. Predmetni polipeptidi mogu biti izolovani iz medijuma ćelijske kulture, iz ćelija domaćina ili iz oboje, uz korišćenje, u ovoj oblasti, poznatih postupaka, za prečišćavanje proteina, uključujući jonizmenjivačku hromatografiju, gel-filtracionu hromatografiju, ultrafiltraciju, elektroforezu, imunoafinitetno prečišćavanje sa antitelima, specifičnim prema određenim epitopima polipeptida ActRIIB i afinitetno prečišćavanje sa sredstvom koje se vezuje za domen, koji je spojen sa polipeptidom ActRIIB (npr., kolona proteina A može biti korišćena za prečišćavanje ActRIIB-Fc fuzionog proteina). Polipeptid ActRIIB može biti fuzioni protein, koji sadrži domen, koji olakšava njegovo prečišćavanje.
[0139] Prečišćavanje može se izvesti serijama koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, bez obzira na red: protein A hromatografija, Q sefaroza hromatografija, fenilsefaroza hromatografija, hromatografija isključivanja prema veličini, i katjon-izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje bi moglo da se upotpuni pomoću filtracije virusa i izmenom pufera. ActRIIB protein se može prečistiti do čistoće od >90%, >95%, >96%, >98%, ili >99% ako se odredi hromatografijom isključivanja prema veličini i >90%, >95%, >96%, >98%, ili >99% ako se odredi pomoću SDS PAGE. Ciljni nivo čistoće bi trebao biti onaj koji je dovoljan da bi se postigli željeni rezultati kod sisarskih sistema, naročito ne-humanih primata, glodara (miševi) i ljudi.
[0140] Fuzioni gen koji kodira vodeću sekvencu prečišćavanja, kao što je sekvenca položaja cepanja poli-(His)/enterokinaze na N-kraju željenog dela rekombinantnog ActRIIB polipeptida omogućava prečišćavanje ekspresovanog fuzionog proteina putem afinitetne hromatografije korišćenjem smole sa Ni<2+>metalom. Vodeća sekvenca prečišćavanja se onda može naknadno ukloniti tretmanom sa enterokinazom da bi se obezbedio prečišćeni ActRIIB polipeptid. Videti, npr., Hochuli et al. (1987) J. Chromatography 411:177; and Janknecht et al. (1991) PNAS USA 88:8972.
[0141] Tehnike za stvaranje fuzionih gena su dobro poznate. Suštinski, spajanje različitih DNA fragmenata koji kodiraju različite polipeptidne sekvence se izvodi prema konvencionalnim tehnikama, korišćenjem tupo-završenih ili nepostojano-završenih krajeva za vezivanje, digestijom restrikcionim enzimom radi obezbeđivanja odgovarajućeg kraja, popunjavanjem kohezivnih krajeva po potrebi, tretmanom sa alkalnom fosfatazom da bi se izbeglo nepoželjno vezivanje, i enzimskom ligacijom. Fuzioni gen se može sintetisati konvencionalnim tehnikama uključujući automatizovane DNA sintetizere. Alternativno, PCR amplifikacija genskih fragmenata se može izvesti primenom učvršćujućih prajmera koji dovode do komplementarnih ispusta između dva uzastopna genska fragmenta koji naknadno mogu biti očvrsnuti kako stvaraju himeričnu gensku sekvencu. Videti, npr., Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992.
C. Antagonisti antitela
[0142] U izvesnim aspektima, nisu obuhvaćeni patentnim zahtevima pronalaska, ActRIIB antagonist koji će se koristiti prema postupku i primenama koje su ovde izložene jeste antitelo (ActRIIB antagonistčko antitelo), ili kombinacija antitela. ActRIIB antagonističko antitelo, ili kombinacija antitela, može se vezati za, na primer, jedan ili više ActRIIB-vezujućih liganda (npr., aktivin, GDF11, GDF8, GDF3, BMP10, i BMP6), ActRIIB receptor, tip I receptor (npr., ALK4, ALK5, i/ili ALK7), i/ili ActRIIB ko-receptor. Kako je ovde opisano, ActRIIB antagonistčka antitela mogu se primeniti sama ili u kombinaciji sa jednom ili više potpornih terapija ili aktivnim agensima, u lečenju mijelofibroze, naročito lečenju ili prevenciji jedne ili više komplikacija mijelofibroze (npr., splenomegalija, ekstramedularna hematopoeza, anemija, i fibroza), i/ili pacijenata tretiranih sa inhibitorom Janus kinaze.
[0143] ActRIIB antagonističko antitelo, ili kombinacija antitela, može biti antitelo koje inhibira bar aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE, i/ili aktivin BE). Prema tome, ActRIIB antagonistčko antitelo, ili kombinacija antitela, mogu da se vežu najmanje za aktivin. Kako je ovde korišćeno, aktivinsko antitelo (ili anti-aktivinsko antitelo) generalno se odnosi na antitelo koje se vezuje za aktivin sa dovoljno afiniteta tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje aktivina. Stepen vezivanja aktivinskog antitela za nesrodne, ne-aktivin proteine može biti manji od otprilike 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za aktivin kako je izmereno, na primer, radioimunotehnikom (RIA), Biacore, ili drugim testom proteinske interakcije ili testom afiniteta vezivanja. Aktivinsko antitelo se može vezati za epitop aktivina koji je konzerviran u aktivinu od različitih vrsta. Anti-aktivinsko antitelo se može vezati za humani aktivin. Aktivinsko antitelo može inhibirati aktivin za vezivanje za tip I i/ili tip II receptor (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7) i tako inhibirati aktivin-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). Aktivinsko antitelo može inhibirati aktivin za vezivanje za ActRIIB ko-receptor i na taj način inhibirati aktivin-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). Treba naglasiti da aktivin A ima sličnu homologiju sekvence sa aktivinom B i, zbog toga, antitela koja se vezuju za aktivin A, do neke instance, mogu takođe da se vezuju za i/ili inhibiraju aktivin B, što se takođe odnosi i na anti-aktivin B antitela. Takođe je izloženo, ipak nije pokriveno zahtevanim pronalaskom, multispecifično antitelo (npr., bispecifično antitelo), i njegove primene, koje se vezuje za aktivin i dalje se vezuje za, na primer, jedan ili više dodatnih ActRIIB liganada [npr., GDF11, GDF8, GDF3, BMP10, i BMP6], jedan ili više tip I receptora i/ili tip II receptora (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora. Multispecifično antitelo koje se vezuje za aktivin ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za BMP9 (npr., vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1x10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1x10<-8>M ili oko 1x10<-9>M). Multispecifično antitelo koje se vezuje za aktivin ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za aktivin A (npr., vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1x10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1x10<-8>M ili oko 1x10<-9>M). Takođe su izložene, ali nisu zahtevane, kombinacije antitela, i njihova upotreba, pri čemu kombinacije antitela obuhvataju aktivinsko antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju za, na primer, jedan ili više dodatnih liganada ActRIIB superfamilije [npr., GDF8, GDF11, GDF3, i BMP6], jedan ili više tip I receptora i/ili tip II receptora (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora.
Kombinacija antitela koja obuhvata aktivinsko antitelo ne mora da sadrži BMP9 antitelo. Kombinacija antitela koja obuhvata aktivinsko antitelo ne mora da sadrži aktivin A antitelo.
[0144] ActRIIB antagonističko antitelo, ili kombinacija antitela, može biti antitelo koje inhibira bar aktivin B. Prema tome, ActRIIB antagonistčko antitelo, ili kombinacija antitela, mogu da se vežu najmanje za aktivin B. Kako je ovde korišćeno, aktivinsko B antitelo (ili anti-aktivinsko B antitelo) generalno se odnosi na antitelo koje se vezuje za aktivin B sa dovoljno afiniteta tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje aktivina B. Stepen vezivanja aktivinskog B antitela za nesrodne, ne-aktivin B proteine može biti manji od otprilike 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za aktivin kako je izmereno, na primer, radioimunotehnikom (RIA), Biacore, ili drugim testom proteinske interakcije ili testom afiniteta vezivanja. Aktivinsko B antitelo se može vezati za epitop aktivina B koji je konzerviran u aktivinu B od različitih vrsta. Anti-aktivinsko B antitelo se može vezati za humani aktivin B. Aktivinsko B antitelo može inhibirati aktivin B za vezivanje za tip I i/ili tip II receptor (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7) i tako inhibirati aktivin B-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). Aktivin B antitelo može inhibisati aktivin B da se veže za ko-receptor i na taj način inhibisati aktivin B-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). Treba naglasiti da aktivin B ima sličnu homologiju sekvence sa aktivinom A i, zbog toga, antitela koja se vezuju za aktivin B, do neke instance, mogu takođe da se vezuju za i/ili inhibiraju aktivin A. Takođe je izloženo, ali nije zahtevano, multispecifično antitelo (npr., bispecifično antitelo), i njegove primene, koje se vezuje za aktivin B i dalje se vezuje za, na primer, jedan ili više dodatnih ActRIIB liganada [npr., GDF11, GDF8, GDF3, BMP10, i BMP6], jedan ili više tip I receptora i/ili tip II receptora (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora. Multispecifično antitelo koje se vezuje za aktivin B ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za BMP9 (npr., vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1x10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1x10<-8>M ili oko 1x10<-9>M). Multispecifično antitelo koje se vezuje za aktivin B ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za aktivin A (npr., vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1x10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1x10<-8>M ili oko 1x10<-9>M). Takođe su izložene, ali nisu zahtevane, kombinacije antitela, i njihova upotreba, pri čemu kombinacije antitela obuhvataju aktivinsko B antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju za, na primer, jedan ili više dodatnih liganada ActRIIB [npr., GDF8, GDF11, GDF3, i BMP6], jedan ili više tip I receptora i/ili tip II receptora (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora. Kombinacija antitela koja obuhvata aktivinsko B antitelo ne mora da sadrži BMP9 antitelo. Kombinacija antitela koja obuhvata aktivinsko B antitelo ne mora da sadrži aktivin A antitelo.
[0145] ActRIIB antagonističko antitelo, ili kombinacija antitela, može biti antitelo koje inhibira najmanje GDF8. Prema tome, ActRIIB antagonistčko antitelo, ili kombinacija antitela, mogu da se vežu najmanje za GDF8. Kako je ovde korišćeno, GDF8 antitelo (ili anti-GDF8 antitelo) generalno se odnosi na antitelo koje se vezuje za GDF8 sa dovoljno afiniteta tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje GDF8. Stepen vezivanja GDF8 antitela za nesrodni, ne-GDF8 protein može biti manji od otprilike 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za GDF8 kako je izmereno, na primer, radioimunotehnikom (RIA), Biacore, ili drugim testom proteinske interakcije ili testom afiniteta vezivanja. GDF8 antitelo se može vezati za epitop GDF8 koji je konzerviran u GDF8 od različitih vrsta. Anti-GDF8 antitelo se može vezati za humani GDF8. GDF8 antitelo može inhibisati GDF8 da se veže za tip I i/ili tip II receptor (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7) i na taj način inhibisati GDF8-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). GDF8 antitelo može inhibisati GDF8 da se ne veže za ko-receptor i na taj način inhibisati GDF8-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). Treba naglasiti da GDF 8 ima visoku homologiju sekvence sa GDF11 i zbog toga antitela koja se vezuju za GDF8, u nekoj meri mogu isto tako da se vezuju i/ili inhibiraju GDF11. Isto tako, ovde su opisana ali nisu zahtevana, multispecifična antitela (npr., bi-specifilna antitela), i njihove primene, koja se vezuju za GDF8 i dalje se vezuju za, na primer, jedan ili više dodatnih ActRIIB liganada [npr., aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF11, GDF3, BMP10, i BMP6], jedan ili više tip I receptor i/ili tip II receptore (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora. Multispecifično antitelo koje se vezuje za GDF8 ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za BMP9 (npr., vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1 x 10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1 x 10<-8>M ili oko 1 x 10<-9>M). Multispecifično antitelo koje se vezuje za GDF8 ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za aktivin A (npr., vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1 x 10<-8>M ili oko 1 x 10<-9>M). Takođe, ovde su opisane ali nisu zahtevane kroz patentne zahteve, kombinacije antitela, i njihova korišćenja, pri čemu kombinacije antitela obuhvataju GDF8 antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju za, na primer, jedan ili više ActRIIB liganada [npr., aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE) GDF11, GDF3, BMP6, i BMP10], jedan ili više tip I receptore i/ili tip II receptore (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7) i/ili jedan ili više ko-receptora. Kombinacija antitela koja sadrži GDF8 antitelo ne mora da sadrži BMP9 antitelo. Kombinacija antitela koja sadrži GDF8 antitelo ne mora da sadrži aktivin A antitelo.
[0146] ActRIIB antagonističko antitelo, ili kombinacija antitela, može biti antitelo koje inhibira najmanje GDF11. Prema tome, ActRIIB antagonistčko antitelo, ili kombinacija antitela, mogu da se vežu najmanje za GDF11. Kako je ovde korišćeno, GDF11 antitelo (ili anti-GDF11 antitelo) generalno se odnosi na antitelo koje se vezuje za GDF11 sa dovoljno afiniteta tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje GDF11. Stepen vezivanja GDF11 antitela za nesrodni, ne-GDF11 protein može biti manji od otprilike 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za GDF11 kako je izmereno, na primer, radioimunotehnikom (RIA), Biacore, ili drugim testom proteinske interakcije ili testom afiniteta vezivanja. GDF11 antitelo se može vezati za epitop GDF11 koji je konzerviran u GDF11 od različitih vrsta. Anti-GDF11 antitelo se može vezati za humani GDF11. GDF11 antitelo može inhibisati GDF11 da se veže za tip I i/ili tip II receptor (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7) i na taj način inhibisati GDF11-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). GDF11 antitelo može inhibisati GDF11 da se ne veže za ko-receptor i na taj način inhibisati GDF11-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). Treba naglasiti da GDF 11 ima visoku homologiju sekvence sa GDF8 i zbog toga antitela koja se vezuju za GDF11, u nekoj meri mogu isto tako da se vezuju i/ili inhibiraju GDF8. Isto tako, ovde su opisana ali nisu zahtevana, multispecifična antitela (npr., bi-specifilna antitela), i njihove primene, koja se vezuju za GDF11 i dalje se vezuju za, na primer, jedan ili više dodatnih ActRIIB liganada [npr., aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF8, GDF3, BMP10, i BMP6], jedan ili više tip I receptor i/ili tip II receptore (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora. Multispecifično antitelo koje se vezuje za GDF11 ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za BMP9 (npr., vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1 x 10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1 x 10<-8>M ili oko 1 x 10<-9>M). Multispecifično antitelo koje se vezuje za GDF11 ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za aktivin A (npr., vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1 x 10<-8>M ili oko 1 x 10<-9>M). Takođe, ovde su opisane ali nisu zahtevane kroz patentne zahteve, kombinacije antitela, i njihova korišćenja, pri čemu kombinacije antitela obuhvataju GDF11 antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju za, na primer, jedan ili više ActRIIB liganada [npr., aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE) GDF8, GDF3, BMP6, i BMP10], jedan ili više tip I receptore i/ili tip II receptore (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7) i/ili jedan ili više ko-receptora. Kombinacija antitela koja sadrži GDF11 antitelo ne mora da sadrži BMP9 antitelo. Kombinacija antitela koja sadrži GDF11 antitelo ne mora da sadrži aktivin A antitelo.
[0147] ActRIIB antagonističko antitelo, ili kombinacija antitela, može biti antitelo koje inhibira najmanje BMP6. Prema tome, ActRIIB antagonistčko antitelo, ili kombinacija antitela, mogu da se vežu najmanje za BMP6. Kako je ovde korišćeno, BMP6 antitelo (ili anti-BMP6 antitelo) generalno se odnosi na antitelo koje se vezuje za BMP6 sa dovoljno afiniteta tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje BMP6. Stepen vezivanja BMP6 antitela za nesrodni, ne-BMP6 protein može biti manji od otprilike 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za BMP6 kako je izmereno, na primer, radioimunotehnikom (RIA), Biacore, ili drugim testom proteinske interakcije ili testom afiniteta vezivanja. BMP6 antitelo se može vezati za epitop BMP6 koji je konzerviran u BMP6 od različitih vrsta. Anti-BMP6 antitelo se može vezati za humani BMP6. BMP6 antitelo može inhibisati BMP6 da se veže za tip I i/ili tip II receptor (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7) i na taj način inhibisati BMP6-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). BMP6 antitelo može inhibisati BMP6 da se ne veže za ko-receptor i na taj način inhibisati BMP6-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). Isto tako, ovde su opisana ali nisu zahtevana, multispecifična antitela (npr., bi-specifilna antitela), i njihove primene, koja se vezuju za BMP6 i dalje se vezuju za, na primer, jedan ili više dodatnih ActRIIB liganada [npr., aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF8, GDF3, BMP10, i GDF11], jedan ili više tip I receptor i/ili tip II receptore (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora. Multispecifično antitelo koje se vezuje za BMP6 ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za BMP9 (npr., vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1 x 10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1 x 10<-8>M ili oko 1 x 10<-9>M). Multispecifično antitelo koje se vezuje za BMP6 ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za aktivin A (npr., vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1 x 10<-8>M ili oko 1 x 10<-9>M). Takođe, ovde su opisane ali nisu zahtevane kroz patentne zahteve, kombinacije antitela, i njihova korišćenja, pri čemu kombinacije antitela obuhvataju BMP6 antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju za, na primer, jedan ili više ActRIIB liganada [npr., aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE) GDF8, GDF11. GDF3, i BMP10, i], jedan ili više tip I receptore i/ili tip II receptore (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7) i/ili jedan ili više ko-receptora. Kombinacija antitela koja sadrži BMP6 antitelo ne mora da sadrži BMP9 antitelo. Kombinacija antitela koja sadrži BMP6 antitelo ne mora da sadrži aktivin A antitelo.
[0148] ActRIIB antagonističko antitelo, ili kombinacija antitela, može biti antitelo koje inhibira najmanje GDF3. Prema tome, ActRIIB antagonistčko antitelo, ili kombinacija antitela, mogu da se vežu najmanje za GDF3. Kako je ovde korišćeno, GDF3 antitelo (ili anti-GDF3 antitelo) generalno se odnosi na antitelo koje se vezuje za GDF3 sa dovoljno afiniteta tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje GDF3. Stepen vezivanja GDF3 antitela za nesrodni, ne-GDF3 protein može biti manji od otprilike 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za GDF3 kako je izmereno, na primer, radioimunotehnikom (RIA), Biacore, ili drugim testom proteinske interakcije ili testom afiniteta vezivanja. GDF3 antitelo se može vezati za epitop GDF3 koji je konzerviran u GDF3 od različitih vrsta. Anti-GDF3 antitelo se može vezati za humani GDF3. GDF3 antitelo može inhibisati GDF3 da se veže za tip I i/ili tip II receptor (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7) i na taj način inhibisati GDF3-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). GDF3 antitelo može inhibisati GDF3 da se ne veže za ko-receptor i na taj način inhibisati GDF3-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). Isto tako, ovde su opisana ali nisu zahtevana, multispecifična antitela (npr., bi-specifilna antitela), i njihove primene, koja se vezuju za GDF3 i dalje se vezuju za, na primer, jedan ili više dodatnih ActRIIB liganada [npr., aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF8, BMP6, BMP10, i GDF11], jedan ili više tip I receptor i/ili tip II receptore (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora. Multispecifično antitelo koje se vezuje za GDF3 ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za BMP9 (npr., vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1 x 10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1 x 10<-8>M ili oko 1 x 10<-9>M). Multispecifično antitelo koje se vezuje za GDF3 ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za aktivin A (npr., vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1 x 10<-8>M ili oko 1 x 10<-9>M). Takođe, ovde su opisane ali nisu zahtevane kroz patentne zahteve, kombinacije antitela, i njihova korišćenja, pri čemu kombinacije antitela obuhvataju GDF3 antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju za, na primer, jedan ili više ActRIIB liganada [npr., aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE) GDF8, GDF11, BMP6, BMP10], jedan ili više tip I receptore i/ili tip II receptore (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7) i/ili jedan ili više ko-receptora. Kombinacija antitela koja sadrži GDF3 antitelo ne mora da sadrži BMP9 antitelo. Kombinacija antitela koja sadrži GDF3 antitelo ne mora da sadrži aktivin A antitelo.
[0149] ActRIIB antagonističko antitelo, ili kombinacija antitela, može biti antitelo koje inhibira najmanje BMP10. Prema tome, ActRIIB antagonistčko antitelo, ili kombinacija antitela, mogu da se vežu najmanje za BMP10. Kako je ovde korišćeno, BMP10 antitelo (ili anti-BMP10 antitelo) generalno se odnosi na antitelo koje se vezuje za BMP10 sa dovoljno afiniteta tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje BMP10. Stepen vezivanja BMP10 antitela za nesrodni, ne-BMP10 protein može biti manji od otprilike 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za BMP10 kako je izmereno, na primer, radioimunotehnikom (RIA), Biacore, ili drugim testom proteinske interakcije ili testom afiniteta vezivanja. BMP10 antitelo se može vezati za epitop BMP10 koji je konzerviran u BMP10 od različitih vrsta. Anti-BMP10 antitelo se može vezati za humani BMP10. BMP10 antitelo može inhibisati BMP10 da se veže za tip I i/ili tip II receptor (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7) i na taj način inhibisati BMP10-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). BMP10 antitelo može inhibisati BMP10 da se veže za ko-receptor i na taj način inhibisati BMP10-posredovano signaliziranje (npr., Smad signaliziranje). Isto tako, ovde su opisana ali nisu zahtevana, multispecifična antitela (npr., bi-specifilna antitela), i njihove primene, koja se vezuju za BMP10 i dalje se vezuju za, na primer, jedan ili više dodatnih ActRIIB liganada [npr., aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF8, GDF11, GDF3, i BMP6], jedan ili više tip I receptor i/ili tip II receptore (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7), i/ili jedan ili više ko-receptora. Multispecifično antitelo koje se vezuje za BMP10 ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za BMP9 (npr., vezuje se za BMP9 sa KDvećom od 1 x 10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1 x 10<-8>M ili oko 1 x 10<-9>M). Multispecifično antitelo koje se vezuje za BMP10 ne mora da se vezuje ili ne mora suštinski da se vezuje za aktivin A (npr., vezuje se za aktivin A sa KDvećom od 1 x 10<-7>M ili ima relativno skromno vezivanje, npr., oko 1 x 10<-8>M ili oko 1 x 10<-9>M). Takođe, ovde su opisane ali nisu zahtevane kroz patentne zahteve, kombinacije antitela, i njihova korišćenja, pri čemu kombinacije antitela obuhvataju BMP10 antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju za, na primer, jedan ili više ActRIIB liganada [npr., aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE) GDF8, GDF3, BMP6, BMP10, i GDF11], jedan ili više tip I receptore i/ili tip II receptore (npr., ActRIIB, ALK4, ALK5, i/ili ALK7) i/ili jedan ili više ko-receptora. Kombinacija antitela koja sadrži BMP10 antitelo ne mora da sadrži BMP9 antitelo. Kombinacija antitela koja sadrži BMP10 antitelo ne mora da sadrži aktivin A antitelo.
[0150] ActRIIB antagonističko antitelo, ili kombinacija antitela, može biti antitelo koje inhibira najmanje ActRIIB. Prema tome, ActRIIB antagonistčko antitelo, ili kombinacija antitela, mogu da se vežu najmanje za ActRIIB. Kako je ovde korišćeno, ActRIIB antitelo (ili anti-ActRIIB antitelo) generalno se odnosi na antitelo koje se vezuje za ActRIIB sa dovoljno afiniteta tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje ActRIIB. Stepen vezivanja ActRIIB antitela za nesrodni, ne-ActRIIB protein može biti manji od otprilike 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za ActRIIB kako je izmereno, na primer, radioimunotehnikom (RIA), Biacore, ili drugim testom proteinske interakcije ili testom afiniteta vezivanja. Anti-ActRIIB antitelo može da se veže za epitop na ActRIIB koji je konzerviran u okviru ActRIIB iz različitih vrsta. Anti-ActRIIB antitelo može da se veže za humani ActRIIB. Anti-ActRIIB antitelo može da inhibira jedan ili više ActRIIB liganada [npr., GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF11, BMP6, GDF3, i BMP10] da se vežu za ActRIIB. Anti-ActRIIB antitelo može biti multispecifično antitelo (npr., bi-specifično antitelo) koje se vezuje za ActRIIB i jedan ili više ActRIIB liganada [npr., GDF11, GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC) GDF3, BMP6, i BMP10], tip I receptor (npr., ALK4, ALK5 i/ili ALK7), ko-receptor, i/ili dodatni tip II receptor (npr., ActRIIB). Takođe, ovde su opisane ali nisu zahtevane kroz patentne zahteve, kombinacije antitela, i njihova korišćenja, pri čemu kombinacije antitela obuhvataju anti-ActRIIB antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju za, na primer, jedan ili više ActRIIB liganada [npr., GDF11, GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE) BMP6, GDF3, i BMP10], ko-receptore, tip I receptor (npr., ALK4, ALK5 i/ili ALK7), i/ili dodatne tip II receptore (npr., ActRIIB). Treba naglasiti da ActRIIB ima sekvencu sličnu ActRIIA i da zbog toga antitela koja se vezuju za ActRIIB, donekle mogu takođe da se vežu i/ili inhibiraju ActRIIA.
[0151] ActRIIB antagonističko antitelo, ili kombinacija antitela, može biti antitelo koje inhibira najmanje ALK4. Prema tome, ActRIIB antagonistčko antitelo, ili kombinacija antitela, mogu da se vežu najmanje za ALK4. Kako je ovde korišćeno, ALK4 antitelo (ili anti-ALK4 antitelo) generalno se odnosi na antitelo koje se vezuje za ALK4 sa dovoljno afiniteta tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje ALK4. Stepen vezivanja ALK4 antitela za nesrodni, ne-ALK4 protein može biti manji od otprilike 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za ALK4 kako je izmereno, na primer, radioimunotehnikom (RIA), Biacore, ili drugim testom proteinske interakcije ili testom afiniteta vezivanja. Anti-ALK4 antitelo može da se veže za epitop na ALK4 koji je konzerviran u okviru ALK4 iz različitih vrsta. Anti-ALK4 antitelo može da se veže za humani ALK4. Anti-ALK4 antitelo može da inhibira jedan ili više ActRIIB liganada [npr., GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF11, BMP6, GDF3, i BMP10] da se vežu za ALK4. Anti-ALK4 antitelo može biti multispecifično antitelo (npr., bi-specifično antitelo) koje se vezuje za ALK4 i jedan ili više GDF/BMP liganada [npr., GDF11, GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC) GDF3, BMP6, i BMP10], tip II receptor (npr., ActRIIB), ko-receptor, i/ili dodatni tip I receptor (npr., ALK5 i/ili ALK7). Takođe, ovde su opisane ali nisu zahtevane kroz patentne zahteve, kombinacije antitela, i njihova korišćenja, pri čemu kombinacije antitela obuhvataju anti-ALK4 antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju za, na primer, jedan ili više ActRIIB liganada [npr., GDF11, GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE) BMP6, i BMP10], koreceptore, tip II receptore (npr., ActRIIB), i/ili dodatne tip I receptore (npr., ALK5 i/ili ALK7).
[0152] ActRIIB antagonističko antitelo, ili kombinacija antitela, može biti antitelo koje inhibira najmanje ALK5. Prema tome, ActRIIB antagonistčko antitelo, ili kombinacija antitela, mogu da se vežu najmanje za ALK5. Kako je ovde korišćeno, ALK5 antitelo (ili anti-ALK5 antitelo) generalno se odnosi na antitelo koje se vezuje za ALK5 sa dovoljno afiniteta tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje ALK5. Stepen vezivanja ALK5 antitela za nesrodni, ne-ALK5 protein može biti manji od otprilike 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za ALK5 kako je izmereno, na primer, radioimunotehnikom (RIA), Biacore, ili drugim testom proteinske interakcije ili testom afiniteta vezivanja. Anti-ALK5 antitelo može da se veže za epitop na ALK5 koji je konzerviran u okviru ALK5 iz različitih vrsta. Anti-ALK5 antitelo može da se veže za humani ALK5. Anti-ALK5 antitelo može da inhibira jedan ili više ActRIIB liganada [npr., GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE), GDF11, BMP6, GDF3, i BMP10] da se vežu za ALK5. Anti-ALK5 antitelo može biti multispecifično antitelo (npr., bi-specifično antitelo) koje se vezuje za ALK5 i jedan ili više ActRIIB liganada [npr., GDF11, GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC) GDF3, BMP6, i BMP10], tip II receptor (npr., ActRIIB), ko-receptor, i/ili dodatni tip I receptor (npr., ALK4 i/ili ALK7). Takođe, ovde su opisane ali nisu zahtevane kroz patentne zahteve, kombinacije antitela, i njihova korišćenja, pri čemu kombinacije antitela obuhvataju anti-ALK5 antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju za, na primer, jedan ili više ActRIIB liganada [npr., GDF11, GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE) BMP6, i BMP10], koreceptore, tip II receptore (npr., ActRIIB), i/ili dodatne tip I receptore (npr., ALK4 i/ili ALK7).
[0153] ActRIIB antagonističko antitelo, ili kombinacija antitela, može biti antitelo koje inhibira najmanje ALK7. Prema tome, ActRIIB antagonistčko antitelo, ili kombinacija antitela, mogu da se vežu najmanje za ALK7. Kako je ovde korišćeno, ALK7 antitelo (ili anti-ALK7 antitelo) generalno se odnosi na antitelo koje se vezuje za ALK7 sa dovoljno afiniteta tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje ALK7. Stepen vezivanja ALK7 antitela za nesrodni, ne-ALK7 protein može biti manji od otprilike 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, ili manji od oko 1% vezivanja antitela za ALK7 kako je izmereno, na primer, radioimunotehnikom (RIA), Biacore, ili drugim testom proteinske interakcije ili testom afiniteta vezivanja. Anti-ALK7 antitelo može da se veže za epitop na ALK7 koji je konzerviran u okviru ALK7 iz različitih vrsta. Anti-ALK7 antitelo može da se veže za humani ALK7. Anti-ALK7 antitelo može da inhibira jedan ili više ActRIIB liganada [npr., GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE) GDF11, BMP6, GDF3, i BMP10] da se vežu za ALK7. Anti-ALK7 antitelo može biti multispecifično antitelo (npr., bi-specifično antitelo) koje se vezuje za ALK7 i jedan ili više ActRIIB liganada [npr., GDF11, GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC) GDF3, BMP6, i BMP10], tip II receptor (npr., ActRIIB), ko-receptor, i/ili dodatni tip I receptor (npr., ALK4 i/ili ALK5). Takođe, ovde su opisane ali nisu zahtevane kroz patentne zahteve, kombinacije antitela, i njihova korišćenja, pri čemu kombinacije antitela obuhvataju anti-ALK7 antitelo i jedno ili više dodatnih antitela koja se vezuju za, na primer, jedan ili više ActRIIB liganada [npr., GDF11, GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i aktivin BE) BMP6, i BMP10], koreceptore, tip II receptore (npr., ActRIIB), i/ili dodatne tip I receptore (npr., ALK4 i/ili ALK5).
[0154] Izraz antitelo je ovde korišćeno u širem smislu i obuhvata razne strukture antitela, uključujući ali bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), i fragmente antitela sve dotle dok ispoljavaju željenu antigen-vezujuću aktivnost. Fragmenti antitela se odnose na molekul koji nije intaktno antitelo, a koji obuhvata deo intaktnog antitela koji vezuje antigen za koje se vezuje intaktno antitelo. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali bez ograničenja, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; dijatela; linearna antitela; molekule jednolančanih antitela (npr., scFv); i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela [videti, npr., Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134; Plćckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; kao i U.S. Pat. Nos.
5,571,894; 5,587,458; i 5,869,046]. Dijatela su fragmenti antitela sa dva antigen-vezujuća položaja, koja mogu biti bivalentna ili bispecifična [videti, npr., EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al. (2003) Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]. Trijatela i tetratela su, isto tako, opisana u Hudson et al. (2003) Nat. Med.
9:129-134. Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže sve ili deo varijabilnog domena teškog lanca ili sve ili deo varijabilnog domena laškog lanca antitela. Antitela sa jednim domenom mogu biti humana antitela sa jednim domenom [videti, npr., U.S. Pat. No.6,248,516]. Ovde izložena antitela mogu biti poliklonska antitela ili monoklonska antitela. Antitela koja su takođe ovde izložena ali nisu zahtevana u patentnim zahtevima, mogu imati na sebi vezan obeleživač pa se mogu detektovati (npr., obeleživač može biti radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim, ili enzimski ko-faktor). Antitela mogu biti izolovana antitela. Antitela mogu biti rekombinantna antitela.
[0155] Antitela ovde, mogu da budu ma koje klase. Klasa antitela se odnosi na vrstu konstantnog domena ili konstantni region koji se nalazi na teškom lancu. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, i nekoliko ovih mogu biti dalje podeljene u podklase (izotipove), na primer, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teških lanaca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina se nazivaju alfa, delta, epsilon, gama, i mu.
[0156] Generalno, antitelo koje se koristi u ovde opisanim postupcima specifično se vezuje za ciljni antigen, poželjno sa velikim afinitetom vezivanja. Afinitet se može izraziti kao KDvrednost i odslikava unutrašnji afinitet vezivanja (npr., sa minimizovanim ukupnim efektima). Obično, afinitet vezivanja se meri in vitro, bez obzira na uslove bez ćelija ili sa ćelijama. Ma koji od brojnih testova poznatih u struci, uključujući one koji su ovde izloženi, mogu da se koriste da se ostvare merenja afiniteta vezivanja uključujući, na primer, Biacore, radio-obeleženi antigenvezujući test (RIA), kao i ELISA. Antitela mogu da se vežu za njihove ciljne antigene (npr. ALK4, ALK5, ALK7, ActRIIB, GDF3, aktivin, GDF11, GDF8, BMP10, i/ili BMP6) sa KDod barem 1x10<-7>ili jače, 1x10<-8>ili jače, 1x10<-9>ili jače, 1x10<-10>ili jače, 1x10<-11>ili jače, 1x10<-12>ili jače, 1x10<-13>ili jače, ili 1x10<-14>ili jače.
[0157] KDse može izmeriti pomoću RIA izvedenom sa Fab verzijom antitela od značaja i njegovog ciljnog antigena kako je opisano sledećim testom. Afinitet vezivanja u rastvoru Fabs za antigen se meri ujednačavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom radio-obeleženog antigena (npr.,<125>I-obeležen) u prisustvu serija titracija neobeleženog antigena, zatim zarobljavanjem vezanog antigena na anti-Fab antitelom obloženoj ploči [videti, npr., Chen et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881]. Za utvrđivanje uslova testa, ploče sa velikim brojem pozicija (npr., MICROTITER® od Thermo Scientific) se oblože (npr., preko noći) sa anti-Fab antitelom zarobljavanja (npr., od Cappel Labs) i zatim blokiraju sa goveđim serum albuminom, poželjno na sobnoj temperaturi (otprilike 23°C). U pločama bez adsorpcije, radio-obeleženi antigen se meša sa serijom razblaženja Fab koji se ispituje [npr., konzistentno sa ispitivanjem anti-VEGF antitela, Fab-12, u: Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]. Fab koji se ispituje se onda inkubira, poželjno preko noći mada inkubacija može da se produži u dužem periodu (npr., oko 65 sati) da bi se osiguralo postizanje ekvilibrijuma. Posle toga, mešavine se prenose na ploču za zarobljavanje radi inkubacije, poželjno na sobnoj temperaturi tokom otprilike jednog sata.
Rastvor se onda uklanja i ploča se ispira nekoliko puta, poželjno sa polisorbatom 20 i PBS smešom. Kada se ploče osuše, dodaje se scintilant (npr., MICROSCINT® od Packard) i, ploče se broje na gama brojaču (npr., TOPCOUNT® od Packard).
[0158] KDmay alternatively be measured using surface plasmon resonance assays using, for example a BIACORE® 2000 or a BIACORE® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) with immobilized antigen CM5 chips at about 10 response units (RU). Briefly, carboxymethylated dextran biosensor chips (CM5, BIACORE, Inc.) are activated with N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) according to the supplier’s instructions. For example, an antigen can be diluted with 10 mM sodium acetate, pH 4.8, to 5 µg/ml (about 0.2 µM) before injection at a flow rate of 5 µl/minute to achieve approximately 10 response units (RU) of coupled protein. Posle injekcije antigena, 1 M etanolamin se injektuje da bi se blokirale grupe koje nisu izreagovale. Za kinetička merenja, dvostruka serijska razblaženja Fab (0.78 nM do 500 nM) se injektuju u PBS sa 0.05% polisorbata 20 (TWEEN-20®) surfaktanta (PBST) pri brzini protoka od otprilike 25 µl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) se računaju korišćenjem, na primer, jednostavnog jedan-na-jedan Langmuir modela vezivanja (BIACORE® Evaluation Software version 3.2) istovremenim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Konstanta disocijacije u ravnoteži (KD) se izračunava kao odnos koff/ kon[videti, npr., Chen et al., (1999) J. Mol. Biol.293:865-881]. Ukoliko on-brzina pređe, na primer, 10<6>M<-1>s<-1>mereno gornjim testom površinske plazmon rezonance, onda se on-brzina (stvaranja) može odrediti primenom tehnike fluorescentnog gašenja kojom se meri porast ili pad intenziteta fluorescentne emisije (npr., eksxcitacija=295 nm; emisija=340 nm, 16 nm traka prolaza) 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS u prisustvu rastućih koncentracija antigena mereno na spektrometru, kao što je spektrofometar opremljen zaustavnim protokom (Aviv Instruments) ili 8000-serije SLM-AMINCO® spektrofotometar (ThermoSpectronic) sa mešajućom kivetom.
[0159] Fragmenti antitela se mogu proizvesti raznim tehnikama, uključujući ali bez ograničavanja, proteolitičku digestiju intaktnog antitela kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr., E. coli ili fag), kako je ovde opisano. Sekvence nukleinske kiseline i aminokiselina kiselina humanih ALK4, ALK5, ALK7, ActRIIB, aktivina (aktivin A, aktivin B, aktivin C, i aktivin E), GDF11, GDF8, BMP10, GDF3, i BMP6, poznate su u struci. Sem toga, brojni postupci za stvaranje antitela su takođe dobro poznati u struci, od kojih su neki ovde i opisani. Prema tome, vešte stručne osobe mogu rutinski proizvesti antagoniste antitela za primenu prema ovom izlaganju na bazi svog stručnog znanja i tehnika koje su ovde obezbeđene.
[0160] Antitelo može biti himerično antitelo. Himerično antitelo se odnosi na antitelo u kom je deo teškog i/ili lakog lanca poreklom iz posebnih izvora ili vrsta, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca poreklom iz različitih izvora ili vrsta. Izvesna himerična antitela su opisana, na primer, u U.S. Pat. No.4,816,567; i kod Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855. Himerično antitelo može imati ne-humani varijabilni region (npr., varijabilni region poreklom iz miša, pacova, hamstera, zeca, ili ne-humanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. Himerično antitelo može biti "klasno zamenjeno" antitelo u kom je klasa ili podklasa izmenjena u odnosu na onu kod matičnog antitela. Uopšteno, himerična antitela obuhvataju njihove antigen vezujuće fragmente.
[0161] Himerično antitelo može biti humanizovano antitelo. Humanizovano antitelo se odnosi na himerično antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke iz ne-humanih hipervarijabilnih regiona (HVRs) i aminokiselinske ostatke iz humanih okvirnih regiona (FRs). Humanizovano antitelo može obuhvatiti suštinski sve bar jednog, i obično dva, varijabilnih domena, gde svi ili suštinski svi HVRs (npr., CDRs) odgovaraju onima iz ne-humanog antitela, i svi ili suštinski svi FRs odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo eventualno može uključiti najmanje deo konstantnog regiona antitela poreklom iz humanog antitela. "Humanizovani oblik" antitela, npr., ne-humano antitelo, odnosi se na antitelo koje je podvrgnuto humanizaciji. Humanizovana antitela i postupci njihove izrade su prikazani, na primer, u Almagro and Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633 i dalje su opisani, na primer, u Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329; Queen et al. (1989) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; U.S. Pat. Nos. 5,821,337; 7,527,791; 6,982,321; i 7,087,409; Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34 [gde se opisuje SDR (a-CDR) presađivanje]; Padlan, Mol. Immunol. (1991) 28:489-498 (gde se opisuje "obnavljanje površine"); Dall’Acqua et al. (2005) Methods 36:43-60 (gde se opisuje "FR mešanje"); Osbourn et al. (2005) Methods 36:61-68; i Klimka et al. Br. J. Cancer (2000) 83:252-260 (gde se opisuje "vođeni izbor" pristup FR mešanju). Humani okvirni regioni koji mogu da se koriste za humanizaciju obuhvataju, ali nisu ograničeni sledećim: okvirni regioni odabrani korišćenjem "best-fit" postupka [videti, npr., Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296]; okvirni regioni izvedeni iz konsenzus sekvenci humanih antitela naročitih podgrupa varijabilnih regiona lakih ili teških lanaca [videti, npr., Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; i Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623]; humani zreli (somatski mutirani) okvirni regioni ili humani okvirni regioni zametne linije [videti, npr., Almagro and Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633]; i okvirni regioni izvedeni iz skrining FR biblioteka [videti, npr., Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; i Rosok et al., (1996) J. Biol. Chem.
271:22611-22618].
[0162] Antitelo može biti humano antitelo. Humana antitela mogu da se proizvedu primenom raznovrsnih tehnika, poznatih u ovoj stručnoj oblasti. Humana antitela su generalno opisana u: van Dijk and van de Winkel (2008) Curr. Opin. Pharmacol.5: 368-74 (2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459. Na primer, humana antitela se mogu proizvesti primenjivanjem imunogena (npr., GDF11 polipeptida, aktivin B polipeptida, ActRIIA polipeptida, ili ActRIIB polipeptida) transgenoj životinji koja je modifikovana da proizvodi intaktna humana antitela ili intaktna antitela sa humanim varijabilnim regionima u odgovoru na antigeni izazov. Ovakve životinje obično sadrže sve ili deo humanih imunoglobulinskih lokusa, koji zamenjuju endogene imunoglobulinske lokuse, ili one koji su prisutni ekstrahromozomalno ili integrisani nasumično u hromozome životinje. U takvim transgenim životinjama, endogeni imunoglobulinski lokusi su generalno inaktivirani. Za pregled postupaka za dobijanje humanih antitela iz transgenih životinja videti, na primer, Lonberg (2005) Nat. Biotech. 23:1117-1125; U.S. Pat. Nos.
6,075,181 i 6,150,584 (opisuje se XENOMOUSE™ tehnologija); U.S. Pat. No. 5,770,429 (opisuje se HuMab® tehnologija); U.S. Pat. No. 7,041,870 (opisuje se KM MOUSE® tehnologija); i U.S. Publikacija patentne prijave br. 2007/0061900 (opisuje se VelociMouse® tehnologija). Humani varijabilni regioni iz intaktnih antitela koje su takve životinje stvorile mogu se dalje modifikovati, na primer, kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionima.
[0163] Humana antitela koja su ovde obezbeđena se, isto tako, mogu proizvesti postupcima na bazi hibridoma.Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i miš-čovek heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela [videti, npr., Kozbor J. Immunol., (1984) 133: 3001; Brodeur et al. (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.
51-63, Marcel Dekker, Inc., New York; and Boerner et al. (1991) J. Immunol., 147: 86]. Humana antitela generisana putem tehnologije hibridoma humanih B-ćelija su takođe opisana kod Li et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562. Dodatni postupci obuhvataju one opisane, na primer, u U.S. Pat. No.7,189,826 (opisana proizvodnja monoklonskih humanih IgM antitela od hibridoma ćelijskih linija) i Ni, Xiandai Mianyixue (2006) 26(4):265-268 (2006) (opisani human-humani hibridomi). Humana hibridoma tehnologija (Trioma technology) je takođe opisana u Vollmers and Brandlein (2005) Histol. Histopathol., 20(3):927-937 (2005) and Vollmers and Brandlein (2005) Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27(3):185-91. Humana antitela koja su ovde obezbeđena mogu takođe biti generisana izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona odabranog iz biblioteka izlaganja faga poreklom od čoveka. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda de se kombinuju sa željenim konstantnim domenom čoveka. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su poznate u struci i ovde su opisane.
[0164] Na primer, antitela ovog izlaganja mogu da se izoluju skrinigom kombinatorijskih biblioteka na antitela sa željenom aktivnosti ili aktivnostima. U ovoj oblasti su poznati razni postupci za stvaranje biblioteka izlaganja faga i skriniranje takvih biblioteka na antitela koja imaju željene osobine vezivanja. Takvi postupci su prikazani, na primer, kod Hoogenboom et al. (2001) u Methods in Molecular Biology 178:1-37, O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J. i dalje objašnjeni, na primer, u McCafferty et al. (1991) Nature 348:552-554; Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628; Marks et al. (1992) J. Mol. Biol. 222:581-597; Marks and Bradbury (2003) in Methods in Molecular Biology 248:161-175, Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J.; Sidhu et al. (2004) J. Mol. Biol. 338(2):299-310; Lee et al. (2004) J. Mol. Biol.
340(5):1073-1093; Fellouse (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472; and Lee et al. (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132.
[0165] U izvesnim postupcima izlaganja faga, repertoari VH i VL gena se zasbno kloniraju lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i nasumično rekombinuju u bibliotekama faga, koje onda mogu da se skriniraju na antigen-vezujući fag kako je opisano u Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455. Fag obično izlaže fragmente antitela, ili kao jednolančane Fv (scFv) fragmente ili kao Fab fragmente. Biblioteke iz imunizovanih izvora obezbeđuju antitela visokog afiniteta prema imunogenu (npe., ALK4, ALK5, ALK7, ActRIIB, aktivin, GDF11, GDF8, GDF3, BMP10, ili BMP6) bez potrebe za konstruisanjem hibridoma. Alternativno, prirodan repertoar može da se klonira (npr., od čoveka) da bi se obezbedio jedan izvor antitela do širokog raspona ne-samo i takođe samo-antigena, bez bilo kakve imunizacije kako je opisao Griffiths et al. (1993) EMBO J, 12: 725-734. Na kraju, prirodne biblioteke se, isto tako, mogu proizvesti sintetski kloniranjem nerearanžiranih segmenata V-gena iz stem ćelija, i korišćenjem PCR prajmera koji sadrže random sekvencu za kodiranje visoko varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje rearanžmana in vitro, kako je opisano u: Hoogenboom and Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381-388. Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela uključuju, na primer: U.S. Pat. No. 5,750,373, i U.S. Patent Publication Nos. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, i 2009/0002360.
[0166] Ovde obezbeđeno antitelo može biti multispecifično antitelo, na primer, bispecifično antitelo. Multispecifična antitela (obično monoklonska antitela) koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita epitopa (npr., dva, tri, četiri, pet, ili šest ili više) na jednom ili više (e.g., dva, tri, četiri, pet, šest ili više) antigena.
[0167] Tehnike za proizvodnju multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ovima ograničene, rekombinantnu ko-ekspresiju dva para imunoglobulinskih teških lanaca/lakih lanaca koji imaju različite specifičnosti [videti, npr., Milstein and Cuello (1983) Nature 305: 537; International patent publication no. WO 93/08829; i Traunecker et al. (1991) EMBO J. 10: 3655, i U.S. Pat. No. 5,731,168 ("knob-in-hole" inženjering)]. Multispecifična antitela mogu, isto tako, biti proizvedena inženjeringom efekata elektrostatičkog upravljanja za proizvodnju antitela Fcheterodimernih molekula (videti, npr., WO 2009/089004A1); unakrsnim povezivanjem dva ili više antitela ili fragmenata [videti, npr., U.S. Pat. No.4,676,980; i Brennan et al. (1985) Science, 229: 81]; primenom leucinskih rajsferšlusa za proizvodnju bispecifičnih antitela [videti, npr., Kostelny et al. (1992) J. Immunol., 148(5):1547-1553]; primenom tehnologije "dijatela" za proizvodnju fragmenata bispecifičnih antitela [videti, npr., Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448]; korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera [videti, npr., Gruber et al. (1994) J. Immunol., 152:5368]; i proizvodnjom trispecifičnih antitela (videti, npr., Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147: 60. Multispecifična antitela se mogu proizvesti kao antitela u punoj dužini ili kao fragmenti antitela. Konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih antigenvezujućih položaja, uključujući "oktopus antitela," su takođe ovde obuhvaćena [videti, npr., US 2006/0025576A1].
[0168] Antitelo može biti monoklonsko antitelo. Monoklonsko antitelo se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična i/ili vezuju se za isti epitop, osim kod moguće varijante antitela, npr., koje sadrži mutacije koje su se prirodno javile ili su nastale tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, takve varijante su generalno prisutne u minornim količinama. Suprotno proizvodnji poliklonskih antitela, koja obično obuhvataju različita antitela usmerena prema različitim epitopima, svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskih antitela je usmereno prema jednom epitopu na antigenu. Tako, izraz "monoklonski" indikuje osobinu antitela kako je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, a ne da se tumači kao da je neophodna proizvodnja antitela nekim naročitim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti prema ovde opisanim postupcima mogu da se proizvedu različitim tehnikama, uključujući ali bez ograničavanja na ove, hibridoma postupak, postupci rekombinantne DNA, postupcima izlaganja faga, i postupcima koji koriste transgene životinje koje sadrže kompletne ili deo humanih imunoglobulinskih lokusa, takvi postupci i drugi postupci koji su prikazani kao primer za proizvodnju monoklonskih antitela su ovde opisani.
[0169] Na primer, korišćenjem imunogena izvedenih od aktivina, mogu se proizvesti antiprotein/anti-peptid antiserum ili monoklonska antitela standardnim protokolima [videti, npr., Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (1988) Cold Spring Harbor Press: 1988]. Sisar kao što je miš, hamster, ili zec, može da se imunizuje sa imunogenim oblikom aktivinskog polipeptida, antigenim fragmentom koji je sposoban da izazove odgovor antitelima, ili fuzionim proteinom. Tehnike kojima se potvrđuje imunogenost na protein ili peptid uključuju konjugaciju na nosače ili druge tehnike veoma dobro poznate u struci. Imunogeni deo polipeptida aktivina se može primeniti u prisustvu adjuvansa. Progres imunizacije se može pratiti otkrivanjem titra antitela u plazmi ili serumu. Standardna ELISA ili druge imunotehnike se mogu koristiti sa imunogenom u vidu antigena da bi se dostigli nivoi produkcije antitela i/ili nivo afiniteta vezivanja.
[0170] Posle imunizacije životinje sa antigenim preparatom aktivina, može se dobiti antiserum i, ukoliko se želi, iz seruma se mogu izolovati poliklonska antitela. Da bi se proizvela monoklonska antitela, iz imunizovane životinje se mogu sakupiti ćelije koje proizvode antitela (limfociti) i, putem standardnih procedura fuzionisanja somatskih ćelija, fuzionisati sa obesmrćenim ćelijama kao što su ćelije mijeloma da bi se dobile hibridoma ćelije. Takve tehnike su dobro poznate u struci, i uključuju, na primer, hibridoma tehnike [videti, npr., Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-497], the human B cell hybridoma technique [videti, e.g., Kozbar et al. (1983) Immunology Today, 4:72], i EBV-hibridoma tehniku za proizvodnju humanih monoklonskih antitela [Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp.77-96]. Hibridoma ćelije se mogu imunohemijski skrinirati radi produkcije antitela koja su specifično reaktivna sa aktivinskim polipeptidom, i monoklonska antitela se izoluju iz kulture koja sadrži hibridoma ćelije.
[0171] Jedna ili više aminokiselinskih modifikacija mogu da se uvedu u Fc region antitela koje je ovde obezbeđeno čime se stvara varijanta Fc regiona. Varijanta Fc regiona može imati sekvencu humanog Fc regiona (npr., humani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc region) koja sadrži aminokiselinsku modifikaciju (npr., supstituciju, deleciju, i/ili adiciju) na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija.
[0172] Na primer, ovo izlaganje razmatra varijantu antitela koja poseduje neke ali ne i sve efektorne funkcije, što je čini poželjnim kandidatom za primene u kojima je polu-život antitela in vivo važan ipak izvesne efektorne funkcije [npr., komplement-zavisna citotoksičnost (CDC) i antitelo-zavisna celularna citotoksičnost (ADCC)] su nepotrebne ili štetne. Testovi citotoksičnosti in vitro i/ili in vivo mogu da se izvedu radi potvrde redukcije/smanjenja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, test vezivanja Fc receptora (FcR) može se izvesti da se osigura da antitelo nema FcyR vezivanje (otuda verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, ekspresuju samo FcyRIII, dok monociti ekspresuju FcyRI, FcyRII i FcyRIII. FcR ekspresija u hematopoetskim ćelijama je zbirno prikazana u, na primer, Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492. Primeri, koji nisu ograničavajući, za in vitro testove za ispitivanje ADCC aktivnosti molekula od značaja su opisani u U.S. Pat. No. 5,500,362; Hellstrom, I. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063]; Hellstrom, I et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502; U.S. Pat. No. 5,821,337; Bruggemann, M. et al. (1987) J. Exp. Med. 166:1351-1361. Alternativno, mogu se upotrebiti postupci ne-radioaktivnih testova (npr., ACTI™, ne-radioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju; CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; i CytoTox 96® ne-radioaktivni test citotoksičnosti, Promega, Madison, Wis.). Korisne efektorne ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od značaja se može ispitati in vivo, na primer, u životinjskom modelu, kao što je onaj izložen kod Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656. Test C1q vezivanja može takođe da se izvede da bi se potvrdilo da antitelo nije u mogućnosti da veže C1q i stoga nema CDC aktivnost [videti, npr., C1q i C3c ELISA vezivanje u WO 2006/029879 i WO 2005/100402]. Za ispitivanje aktivacije komplementa, može se izvesti CDC test [videti, npr, Gazzano-Santoro et al. (1996) J. Immunol. Methods 202:163; Cragg, M. S. et al. (2003) Blood 101:1045-1052; i Cragg, M. S, and M. J. Glennie (2004) Blood 103:2738-2743]. Takođe mogu da se izvedu i FcRn vezivanje i in vivo određivanja klirensa/poluživota korišćenjem postupaka poznatih u struci [videti, npr., Petkova, S. B. et al. (2006) Intl. Immunol. 18(12):1759-1769]. Antitela ovog izlaganja sa smanjenom efektornom funkcijom obuhvataju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Pat. No. 6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dve ili više aminokiselinskih položaja 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući tzv. "DANA" Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 u alanin (U.S. Pat. No.7,332,581).
[0173] Može biti poželjno da se kreiraju cistein konstruisana antitela, npr., "tioMAbs," u kojima su jedan ili više ostataka antitela supstituisani sa cisteinskim ostacima. Supstituisani ostaci mogu da se jave na pristupačnim položajima u antitelu. Supstituisanjem ovih ostataka sa cisteinom, reaktivne tiol grupe su na taj način pozicionirane na pristupačnim položajima u antitelu i mogu da se upotrebe za konjugovanje antitela sa drugim delovima, kao što su delovi lekova ili linkerlek delovi, kako se kreira imunokonjugat, kako je dalje ovde opisano. Bilo koji ili više sledećih ostataka može biti supstituisano sa cisteinom: V205 (Kabat numerisanje) lakog lanca; A118 (EU numerisanje) teškog lanca; i S400 (EU numerisanje) teškog lanca Fc regiona. Cisteinska konstruisana antitela mogu se generisati kako je opisano, na primer, u U.S. Pat. No.7,521,541.
[0174] Sem toga, tehnike koje se koriste za skriniranje antitela u cilju identifikacije željenog antitela mogu uticati na svojstva dobijenog antitela. Na primer, ukoliko antitelo treba da se koristi za vezivanje antigena u rastvoru, može biti poželjno da se testira vezivanje u rastvoru. Raznovrsne različite tehnike su dostupne za testiranje interakcija između antitela i antigena za identifikaciju naročito poželjnih antitela. Takve tehnike uključuju ELISAs, testove vezivanja površinskom plazmon rezonancom (npr., Biacore test vezivanja, Biacore AB, Uppsala, Sweden), sandvič testove (npr., sistem paramagnetskih zrnaca IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), western blot, imunoprecipitacione testove, i imunohistohemiju.
[0175] Razmatrane su varijante aminokiselinske sekvence antitela i/ili vezujućih polipeptida. Na primer, može biti poželjno da se unapredi afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela i/ili vezujućeg polipeptida. Varijante aminokiselinske sekvence antitela i/ili vezujućih polipeptida se mogu proizvesti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo i/ili vezujući polipeptid, ili peptidnom sintezom. Takve modifikacije uključuju, na primer, delecije od, i/ili insercije u i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci antitela i/ili vezujućeg polipeptida. Svaka kombinacija delecije, insercije, i supstitucije se može napraviti tako da se pojavi u završnoj konstrukciji, obezbeđujući da završna konstrukcija poseduje željene karakteristike, npr., ciljno-vezivanje (npr., aktivin kao što je aktivin E i/ili aktivin C vezivanje).
[0176] Izmene (npr., supstitucije) mogu da se naprave u HVRs, na primer, da bi se poboljšao afinitet antitela. Takve izmene mogu da se naprave u HVR "vrućim tačkama," tj., ostacima kodiranim kodonima koji su podvrgnuti mutaciji sa visokom učestalošću tokom somatskih procesa sazrevanja [videti, npr., Chowdhury (2008) Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)], i/ili SDRs (a-CDRs), sa nastalom varijantom VH ili VL koja je testirana na afinitet vezivanja. Sazrevanje afiniteta konstruisanjem i reselektovanjem iz sekundarnih biblioteka je opisano u struci [videti, npr., Hoogenboom et al., u: Methods in Molecular Biology 178:1-37, O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001). U nekim slučajevima sazrevanje afiniteta, može biti uvedena raznolikost u varijabilne gene izabrane za sazrevanje ma kojim od raznovrsnih postupaka (npr., PCR sklon greškama, mešanjem lanaca, ili oligonukleotidno-usmerenom mutagenezom). Onda se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim skrinira da bi se identifikovalo svaka varijanta antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznolikosti uključuje HVR-usmerene pristupe, u kojima nekoliko HVR ostataka (npr., 4-6 ostataka u vreme) su randomizovani. HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr., korišćenjem alanin skenirajuće mutageneze ili modeliranja. CDRH3 i CDR-L3 su posebno često ciljani.
[0177] Supstitucije, insercije, ili delecije mogu da se jave unutar jednog ili više HVRs sve dotle dok takve izmene suštinski ne smanjuju sposobnost antitela da se veže za antigen. Na primer, konzervativne izmene (npr., konzervativne supstitucije kako su ovde obezbeđene) koje suštinski ne smanjuju afinitet vezivanja mogu da se naprave u HVRs. Takve izmene mogu biti izvan HVR "vrućih tačaka" ili SDRs. U izvesnim slučajevima varijanti VH i VL sekvenci koje su ovde obezbeđene, svaki HVR ili je neizmenjen, ili sadrži ne više od jedne, dve ili tri aminokiselinske supstitucije.
[0178] Koristan postupak za identifikaciju ostataka ili regiona antitela i/ili vezujućeg polipeptida koji može biti ciljan za mutagenezu se naziva "alanin skanirajuća mutageneza" kako je opisao Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U ovom postupku, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr., naelektrisani ostaci, kao što su Arg, Asp, His, Lys, i Glu) se identifikuju i zamene neutralnim ili negativno naelektrisanim aminokiselinama (npr., alanin ili polialanin) da bi se odredilo da li postoji uticaj na interakciju antitelo-antigen. Dalje supstitucije se mogu uvesti na aminokiselinskim lokacijama koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na početne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, određuje se kristalna struktura antigen-antitelo kompleksa da bi se identifikovale kontaktne tačke između antitela i antigena. Ovi kontaktni ostaci i ostaci u susedstvu mogu da se ciljaju ili da se eliminišu kao kandidati za supstituciju. Varijante mogu da se skriniraju da bi se odredilo da li one imaju željena svojstva.
[0179] Insercije aminokiselinske sekvence uključuju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije koje se u dužini kreću od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrasekvencne insercije jednog ili više aminokiselinskog ostatka. Primeri terminalnih insercija obuhvataju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge insercione varijante molekula antitela obuhvataju fuziju N- ili C-terminusa antitela sa enzimom (npr., za ADEPT) ili polipeptidom koji povećava serumski polu-život antitela.
[0180] Antitelo i/ili vezujući polipeptid mogu dalje biti modifikovani da sadrže dodatne neproteinske delove koji su poznati u struci i lako su dostupni. Delovi pogodni za derivatizaciju antitela i/ili vezujućeg polipeptida uključuju ali bez ograničenja polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri polimera rastvorljivih u vodi uključuju, ali bez ograničenja, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, etilen/maleinski anhidrid kopolimer, poliaminokiseline (bilo homopolimeri ili random kopolimeri), i dekstran ili poli(nvinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, prolipropilen oksid/etilen oksid kopolimere, polioksietilovane poliole (npr., glicerol), polivinil alkohol, i njihove mešavine. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zahvaljujući svojoj stabilnosti u vodi. Polimer može imati ma koju molekulsku težinu, i može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera vezanih za antitelo i/ili vezujući polipeptid može varirati, i ukoliko je više od jednog polimera vezano, oni mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera koja se koristi za derivatizaciju može da se odredi na osnovu razmatranja, uključujući, ali bez ograničenja, naročita svojstva ili funkcije antitela i/ili vezujućeg polipeptida koje treba unaprediti, bilo da li će se derivat antitela i/ili derivat vezujućeg polipeptida primeniti u terapiji pod definisanim uslovima.
D. Antagonisti malih molekula
[0181] U drugim aspektima koji se ne zahtevaju, ActRIIB antagonist koji će se primeniti prema ovde opisanim postupcima i primenama može biti mali molekul (ActRIIB antagonisti malog molekula), ili kombinacija antagonista malih molekula. ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, može inhibirati, na primer, jedan ili više ActRIIB liganada (npr., aktivin, GDF11, GDF8, GDF3, BMP6, i/ili BMP10), tip I receptor (npr., ALK4, ALK5, i/ili ALK7), tip II receptor (npr., ActRIIB), i/ili ko-receptor. ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, može inhibirati signaliziranje posredovano jednim ili više ActRIIB liganada, na primer, kako je određeno u testu na ćelijama kao što je onaj, koji je ovde opisan. ActRIIB antagonist malog molekula može da se koristi, sam ili u kombinaciji sa jednom ili više potpornih terapija ili aktivnih agenasa, za lečenje, prevenciju, ili smanjenje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze naročito lečenje, prevenciju, ili smanjenje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija povezanih sa mijelofibrozom (npr., splenomegalija, ekstramedularna hematopoeza, anemija i fibroza i/ili lečenje pacijenta tretiranog sa inhibitorom Janus kinaze.
[0182] ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, mogu da inhibiraju najmanje GDF11, opciono dalje inhibiraju jedan ili više GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. ActRIIB malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, mogu da inhibiraju najmanje GDF8, opciono dalje inhibiraju jedan ili više GDF11, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, mogu da inhibiraju najmanje aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, mogu da inhibiraju najmanje aktivin B, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, mogu da inhibiraju najmanje BMP6, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, GDF11, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, mogu da inhibiraju najmanje GDF3, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, mogu da inhibiraju najmanje BMP10, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, mogu da inhibiraju najmanje ActRIIB, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, BMP10, ALK4, ALK5, i ALK7. ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, mogu da inhibiraju najmanje ALK4, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIB, BMP10, ALK5, i ALK7. ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, mogu da inhibiraju najmanje ALK5, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIB, ALK4, BMP10, i ALK7. ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, mogu da inhibiraju najmanje ALK7, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP15, BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIB, ALK4, ALK5, i BMP10. ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, kako su ovde izloženi ne moraju da inhibiraju ili ne moraju suštinski da inhibiraju BMP9. ActRIIB antagonist malog molekula, ili kombinacija antagonista malih molekula, ne moraju da inhibiraju ili ne moraju suštinski da inhibiraju aktivin A.
[0183] ActRIIB antagonist malog molekula može biti direktan ili indirektan inhibitor. Na primer, indirektan antagonist malog molekula ili kombinacija antagonista malih molekula, mogu da inhibiraju ekspresiju (npr., transkripciju, translaciju, ćelijsku sekreciju, ili kombinaciju ovoga) najmanje jednog ili više ActRIIB liganada [npr., aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin B, aktivin BC, aktivin AE, ili aktivin BE), GDF11, BMP10, BMP9, BMP6, BMP5, GDF3, i/ili GDF8], tip I receptora (npr., ALK4, ALK5, i/ili ALK7), tip II receptora (npr., ActRIIB), ko-receptora, i/ili jedne ili više komponenti nishodnog ActRIIB signaliziranja (npr., Smads). Alternativno, direktan antagonist malog molekula ili kombinacija antagonista malih molekula, mogu da direktno vežu i inhibiraju, na primer, jedan ili više ActRIIB liganada [npr., aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin B, aktivin BC, aktivin AE, ili aktivin BE), GDF11, BMP10, BMP9, BMP6, BMP5, GDF3, i/ili GDF8], tip I receptor (npr., ALK4, ALK5, i/ili ALK7), tip II receptor (npr., ActRIIB), ko-receptor, i/ili jednu ili više komponenti nishodnog ActRIIB signaliziranja (npr., Smads). Kombinacije jednog ili više indirektnog i jednog ili više direktnog ActRIIB antagonista malih molekula mogu da se koriste prema ovde opisanim postupcima.
[0184] Vezivanje antagonista malog molekula ovog izlaganja može da se identifikuje i hemijski sintetiše primenom poznate metodologije (videti, npr., PCT Publication Nos. WO 00/00823 i WO 00/39585). Generalno, antagonisti malih molekula izlaganja su obično manji od otprilike 2000 daltona u veličini, alternativno manji su od otprilike 1500, 750, 500, 250 ili 200 daltona u veličini, pri čemu se takvi organski mali molekuli koji su sposobni da se vezuju, poželjno vezuju specifično, za polipeptid kako je ovde opisan. Ovi antagonisti malih molekula mogu da se identifikuju i bez nepodesnog eksperimentisanja, korišćenjem dobro poznatih tehnika. U tom smislu, primećeno je da su tehnike za skrining biblioteka organskih malih molekula na molekule koji su sposobni da se vežu za polipeptidnu metu dobro poznate u struci (videti, npr., međunarodnu patentnu publikaciju br. WO00/00823 i WO00/39585).
[0185] Vezujući organski mali molekuli ovog izlaganja mogu biti, na primer, aldehidi, ketoni, oksimi, hidrazoni, semikarbazoni, karbazidi, primarni amini, sekundarni amini, tercijarni amini, N-supstituisani hidrazini, hidrazidi, alkoholi, etri, tioli, tioetri, disulfidi, karboksilne kiseline, estri, amidi, urea, karbamati, karbonati, ketali, tioketali, acetali, tioacetali, aril halidi, aril sulfonati, alkil halidi, alkil sulfonati, aromatična jedinjenja, heterociklična jedinjenja, anilini, alkeni, alkini, dioli, amino alkoholi, oksazolidini, oksazolini, tiazolidini, tiazolini, enamini, sulfonamidi, epoksidi, aziridini, izocijanati, sulfonil hloridi, dijazo jedinjenja, i kiseli hloridi.
E. Polinukleotidni antagonisti
[0186] U drugim aspektima, ActRIIB antagonist koji će se koristiti prema postupcima i primenama koje su ovde izložene je polinukleotid (polinukleotidni ActRIIB antagonist), ili kombinacija polinukleotida. Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, može inhibirati, na primer, jedan ili više ActRIIB liganada (npr., aktivin, GDF11, GDF8, GDF3, BMP6, i/ili BMP10,), tip I receptore (npr., ALK4, ALK5, i/ili ALK7), tip II receptore (npr., ActRIIB), ko-receptor, i/ili nishodno signalizirajuću komponentu (npr., Smads). U nekim ostvarenjima, Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, inhibira signaliziranje posredovano jednim ili više ActRIIB liganada, na primer, kako je određeno testom na ćelijama, kao što je onaj koji je ovde opisan. Kako je ovde opisano, polinukleotidni ActRIIB antagonist može da se primeni, sam ili u kombinaciji sa jednom ili više potpornih terapija ili aktivnih agenasa, za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze, posebno lečenje, prevenciju ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija povezanih sa mijelofibrozom (npr., splenomegalija, ekstramedularna hematopoeza, anemija, i fibroza) i/ili lečenje pacijenta tretiranog sa inhibitorom Janus kinaze.
[0187] Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, mogu da inhibiraju najmanje GDF11, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, mogu da inhibiraju najmanje GDF8, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF11, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, mogu da inhibiraju najmanje aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, mogu da inhibiraju najmanje aktivin B, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, mogu da inhibiraju najmanje BMP6, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), GDF3, GDF11, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, mogu da inhibiraju najmanje GDF3, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP6, GDF11, BMP10, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, mogu da inhibiraju najmanje BMP10, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIB, ALK4, ALK5, i ALK7. Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, mogu da inhibiraju najmanje ActRIIB, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP6, GDF11, GDF3, BMP10, ALK4, ALK5, i ALK7. GDF/BMP polinukleotidni antagonist polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, mogu da inhibiraju najmanje ALK4, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIB, BMP10, ALK5, i ALK7. Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, mogu da inhibiraju najmanje ALK5, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIB, ALK4, BMP10, i ALK7. Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, mogu da inhibiraju najmanje ALK7, opciono dalje inhibiraju jedan ili više od: GDF8, aktivin (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin BC, aktivin AE i/ili aktivin BE), BMP6, GDF11, GDF3, ActRIIB, ALK4, ALK5, i BMP10. Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, ne moraju inhibirati ili ne moraju suštinski inhibirati BMP9. Polinukleotidni ActRIIB antagonist, ili kombinacija polinukleotidnih antagonista, ne moraju inhibirati ili ne moraju suštinski inhibirati aktivin A.
[0188] Polinukleotidni antagonisti mogu biti antisens nukleinska kiselina, RNAi molekul [npr., mala interferirajuća RNA (siRNA), RNA sa strukturom ukosnice (shRNA), mikroRNA (miRNA)], aptamer i/ili ribozim. Nukleinsko kiselinske i aminokiselinske sekvence humanih GDF11, GDF8, aktivina (aktivin A, aktivin B, aktivin C, i aktivin E), BMP6, GDF3, ActRIIB, ALK4, ALK5, ALK7, i BMP10 su poznate u struci. Sem toga, mnogi različiti postupci generisanja polinukleotidnih antagonista su takođe dobro poznati u struci. Zbog toga, stručno lice može rutinski proizvesti polinukleotidne antagoniste za korišćenje prema ovom izlaganju na osnovu stručnog znanja i ovde obezbeđenih izlaganja.
[0189] Antisens tehnologija može da se koristi za kontrolu genske ekspresije kroz antisens DNA ili RNA, ili kroz formiranje tripl-heliksa. Antisens tehnike su razmatrane, na primer, u Okano (1991) J. Neurochem. 56:560; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988). Tripl-heliks formacija je razmatrana u, na primer, Cooney et al. (1988) Science 241:456; i Dervan et al., (1991) Science 251:1300. Postupci se zasnivaju na vezivanju polinukleotida sa komplementarnom DNA ili RNA. Antisens nukleinske kiseline mogu imati jednolančanu RNA ili DNA sekvencu koja je komplementarna sa najmanje delom RNA transkripta ovde izloženog gena. Ipak, apsolutna komplementarnost, iako poželjna, nije neophodna.
[0190] Sekvenca "komplementarna sa najmanje delom RNA," kako je ovde označena, označava sekvencu koja ima dovoljnu komplementarnost da može da hibridizuje sa RNA, formirajući stabilan dupleks; u slučaju dvolančanih antisens nukleinskih kiselina ovde izloženog gena, jednolančani dupleks DNA bi tako mogao biti testiran, ili tripleks formacija može biti testirana. Mogućnost da hibridizuje zavisiće i od stepena komplementarnosti i od dužine antisens nukleinske kiseline. Generalno, što veća hibridizujuća nukleinska kiselina, to više nepodudaranja baza sa RNA može sadržavati a ipak formirati stabilan dupleks (ili tripleks kako može biti slučaj). Stručno lice može utvrditi stepen tolerisanja nepodudaranja korišćenjem standardnih procedura za određivanje tačke topljenja hibridizovanog kompleksa.
[0191] Polinukleotidi koji su komplementarni sa 5’ krajem poruke, na primer, 5’-netranslatovana sekvenca sve do i uključujući AUG inicijacioni kodon, trebalo bi da najefektivnije rade u inhibisanju translacije. Međutim, ispostavilo se da su sekvence komplementarne sa 3’-netranslatovanim sekvencama mRNAs takođe efektivne u inhibisanju translacije mRNAs [videti, npr., Wagner, R., (1994) Nature 372:333-335]. Tako, oligonukleotidi komplementarni sa bilo 5’bilo 3’-ne-translatovanim, ne-kodirajućim regionima gena izlaganja, mogli bi biti korišćeni u antisens pristupu inhibisanja translacije endogene mRNA. Polinukleotidi komplementarni sa 5’-ne-translatovanim regionom mRNA trebalo bi da obuhvataju komplement AUG start kodona. Antisens polinukleotidi komplementarni sa mRNA koje kodiraju regions su manje efektivni u inhibisanju translacije ali bi se mogli upotrebiti prema postupcima ovog izlaganja. Bez obzira da li su dizajnirani da hibridizuju sa 5’-, 3’- ili kodirajućim regionom mRNA izlaganja, antisens nukleinske kiseline trebalo bi da budu dugačke najmanje šest nukleotida i, poželjno su oligonukleotidi dužine u rasponu od 6 do otprilike 50 nukleotida. Oligonukleotid može biti od najmanje 10 nukleotida, najmanje 17 nukleotida, najmanje 25 nukleotida ili najmanje 50 nukleotida.
[0192] Antisens nukleinska kiselina može da se proizvede intracelularno transkripcijom od egzogene sekvence. Na primer, vektor ili njegov deo se transkribuje, proizvodeći antisens nukleinsku kiselinu (RNA) gena izlaganja. Takav vektor bi sadržavao sekvencu koja kodira željenu antisens nukleinsku kiselinu. Takav vektor može da ostane epizomalan ili da postane hromozomski integrisan, sve dotle dok može da se transkribuje da bi proizveo željenu antisens RNA. Takvi vektori mogu biti konstruisani pomoću postupaka rekombinantne DNA tehnologije, standardnih u struci. Vektori mogu biti plazmid, virusni, ili drugi, poznati u struci, koji se koriste za replikaciju i ekspresiju u ćelijama vertebrata. Ekspresija sekvence koja kodira željene gene ovog izlaganja, ili njihove fragmente, može se postići ma kojim promoterom poznatim u struci da deluje u vertebratima, poželjno ćelijama ljudi. Takvi promoteri mogu biti inducibilni ili konstitutivni. Takvi promoteri uključuju, ali bez ograničenja, SV40 rani promoter region [videti, npr., Benoist and Chambon (1981) Nature 290:304-310], promoter sadržan u 3’ dugotrajno ponavljanje terminala Rous sarkoma virusa [videti, npr., Yamamoto et al. (1980) Cell 22:787-797], herpes timidin promoter [videti, npr., Wagner et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
78:1441-1445], i regulatorne sekvence metalotionein gena [videti, npr., Brinster, et al. (1982) Nature 296:39-42].
[0193] Polinukleotidni antagonisti mogu da interferiraju sa RNA (RNAi) molekulima koji ciljaju ekspresiju jednog ili više od: GDF11, GDF8, aktivin (aktivin A, aktivin B, aktivin C, i aktivin E), BMP6, ActRIIB, GDF3, ALK4, ALK5, ALK7, i BMP10. RNAi se odnosi na ekspresiju RNA koje interferiraju sa ekspresijom ciljne mRNA. Specifično, RNAi ućutkuje ciljni gen putem interakcije sa specifičnom mRNA preko siRNA (male interferišuće RNA). ds RNA kompleks se onda cilja za degradaciju od strane ćelije. siRNA molekul je dvolančani RNA dupleks od 10 do 50 nukleotida dužine, koji interferira sa ekspresijom ciljnog gena koji je dovoljno komplementaran (npr. najmanje 80% identiteta sa genom). siRNA molekul može imati nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100% identična sa nukleotidnom sekvencom ciljnog gena.
[0194] Dodatni RNAi molekuli obuhvataju RNA sa strukturom ukosnice (shRNA); takođe malu interferirajuću ukosnicu i mikroRNA (miRNA). shRNA molekul sadrži sens i antisens sekvence ciljnog gena povezanog petljom. shRNA se transportuje iz jedra u citoplazmu, i degradira se duž mRNA. Pol III ili U6 promoteri se mogu koristiti da se ekpresuju RNAs umesto RNAi. Paddison et al. [Genes & Dev. (2002) 16:948-958, 2002] su koristili male RNA molekule sklopljene u ukosnice kao sredstva za uticaj na RNAi. Prema tome, ovakvi molekuli RNA sa strukturom ukosnice (shRNA) se takođe koriste u ovde opisanim postupcima. Dužina struka i petlje funkcionalnih shRNAs varira; dužine struka se mogu kretati od otprilike 25 do otprilike 30 nt, i veličina petlje može biti u opsegu između 4 do oko 25 nt bez uticaja na aktivnost ućutkivanja. Bez želje da se bude vezan ni jednom posebnom teorijom, veruje se da ove shRNAs podsećaju na dvolančane RNA (dsRNA) proizvode DICER RNase i, u svakom slučaju, imaju isti kapacitet za inhibiranje ekspresije specifičnog gena. shRNA mogu da se ekspresuju iz lentivirusnog vektora. miRNA je jednolančana RNA od otprilike 10 do 70 nukleotida u dužini koja se inicijalno transkribuje kao pre-miRNA okarakterisana kao "struk-petlja" struktura, koja se zatim obrađuje u zrelu miRNA posle daljeg procesa obrade kroz RISC.
[0195] Molekuli koji posreduju RNAi, uključujući bez ograničenja siRNA, mogu da se proizvedu in vitro hemijskom sintezom (Hohjoh, FEBS Lett 521:195-199, 2002), hidrolizom dsRNA (Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002), putem in vitro transkripcije sa T7 RNA polimerazom (Donzeet et al., Nucleic Acids Res 30:e46, 2002; Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002), i putem hidrolize dvolančane RNA korišćenjem nukleaze kao što je E. coli RNase III (Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002).
[0196] Takođe, ovde su opisani, ali nisu zahtevani, polinukleotidni antagonisti koji uključuju ali bez ograničenja, mamac DNA, dvolančanu DNA, jednolančanu DNA, DNA u kompleksu, inkapsuliranu DNA, virusnu DNA, DNA iz plazmida, golu RNA, inkapsuliranu RNA, virusnu RNA, dvolančanu RNA, molekul koji može generisati RNA interferenciju, ili njihove kombinacije.
[0197] Polinukleotidni antagonisti mogu biti aptameri. Aptameri su molekuli nukleinskih kiselina, uključujući molekule dvolančane DNA i jednolančane RNA, koji se vezuju i formiraju tercijerne strukture koje se specifično vezuju za ciljni molekul. Izrada i terapijska primena aptamera je dobro utvrđena u struci (videti, npr., U.S. Pat. No. 5,475,096). Dodatne informacije o aptamerima se mogu naći u U.S. Patent Application Publication No.20060148748. Nukleinsko kiselinski aptameri se biraju korišćenjem postupaka poznatih u struci, na primer putem procesa Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX) (Sistematski razvoj liganada eksponencijalnim obogaćivanjem, prim. prev.). SELEX je postupak za in vitro razvoj nukleinsko kiselinskih molekula sa visoko specifičnim vezivanjem za ciljne molekule kako je opisano u, npr., U.S. Pat. Nos. 5,475,096; 5,580,737; 5,567,588; 5,707,796; 5,763,177; 6,011,577; i 6,699,843. Još jedan skrining postupak za identifikaciju aptamera je opisan u U.S. Pat. No. 5,270,163. SELEX proces se zasniva na kapacitetu nukleinskih kiselina da formiraju razne dvo- i trodimenzionalne strukture, kao i na hemijskoj promenljivosti dostupnoj unutar nukleotidnih monomera da se ponašaju kao ligandi (formiraju specifične vezujuće parove) sa praktično svakim hemijskim jedinjenjem, bez obzira da li je monomerno ili je polimerno, uključujući druge molekule nukleinskih kiselina i polipeptide. Molekuli ma koje veličine ili sastava mogu poslužiti kao mete. SELEX postupak uključuje selekciju iz mešavine kandidatnih oligonukleotida i ponavljanja vezivanja, odvajanja i amplifikacije u vidu koraka, primenom iste opšte selekcione šeme, da bi se dostigao željeni afinitet vezivanja i selektivnost. Polazeći od mešavine nukleinskih kiselina, koje mogu sadržavati segment randomizovane sekvence, SELEX postupak obuhvata korake dovođenja u kontakt mešavine sa metom u uslovima koji favorizuju vezivanje; odvajanja nevezanih nukleinskih kiselina od onih nukleinskih kiselina koje su se specifično vezale za ciljne molekule; disocijacije kompleksa nukleinska kiselina-meta; amplifikacije nukleinskih kiselina disociranih iz kompleksa nukleinska kiselina-meta da bi se dobila mešavina nukleinskih kiselina obogaćena ligandima. Koraci vezivanja, odvajanja, disocijacije i amplifikacije se ponavljaju kroz onoliko ciklusa koliko se želi da bi se dobili nukleinsko kiselinski ligandi koji se vezuju sa većim afinitetom i specifičnosti za ciljni molekul.
[0198] Obično, takvi vezujući molekuli se zasebno primenjuju životinji [videti, npr., O’Connor (1991) J. Neurochem. 56:560], ali takvi vezujući molekuli mogu, isto tako, da budu ekspresovani in vivo od polinukleotida koje je preuzela ćelija domaćin i ekspresovala in vivo [videti, npr., Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)].
F. Folistatin i FLRG antagonisti
[0199] U drugim aspektima, koji nisu zahtevani, ActRIIB antagonist je folistatin ili FLRG polipeptid. Kako je ovde opisano, folistatin i/ili FLRG polipeptidi mogu da se koriste, sami ili u kombinaciji sa jednom ili više potpornih terapija ili aktivnih agenasa, za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze, naročito lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija povezanih sa mijelofibrozom (npr., splenomegalija, ekstramedularna hematopoeza, anemija, i fibroza) i/ili lečenje pacijenta tretiranog sa inhibitorom Janus kinaze.
[0200] Izraz "folistatinski polipeptid" obuhvata polipeptide koji uključuju svaki polipeptid folistatina koji se javlja u prirodi kao i ma koju njihovu varijantu (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koje zadržavaju korisnu aktivnost, i dalje obuhvata svaki funkcionalan monomer ili multimer folistatina. Folistatinski polipeptidi mogu da se vežu za i/ili inhibiraju aktivnost aktivina, naročito aktivina A. Varijante folistatinskih polipeptida koje zadržavaju svojstva vezivanja aktivina mogu da se identifikuju na osnovu prethodnih studija koje koriste interakcije folistatina i aktivina. Na primer, WO2008/030367 izlaže specifične folistatinske domene ("FSDs") za koje se pokazalo da su važni za vezivanje aktivina. Kako je ispod prikazano u SEQ ID NOs: 65-67, folistatinski N-terminalni domen ("FSND" SEQ ID NO: 65), FSD2 (SEQ ID NO: 67), i u manjoj meri FSD1 (SEQ ID NO: 66) predstavljaju domene primere u okviru folistatina koji su bitni za vezivanje aktivina. Sem toga, postupci za izradu i testiranje biblioteka polipeptida su prethodno opisani u kontekstu ActRII polipeptida, i ti postupci se takođe odnose i na izradu i testiranje varijanti folistatina. Folistatinski polipeptidi uključuju polipeptide izvedene iz sekvence ma kog poznatog folistatina koji ima sekvencu koja je najmanje 80% identična sa sekvencom folistatinskog polipeptida, i opciono najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična. Primeri folistatinskih polipeptida obuhvataju zreli folistatinski polipeptid ili kraće izoforme ili druge varijante prekursora humanog folistatinskog polipeptida (SEQ ID NO: 63) kako je opisano, na primer, u WO2005/025601.
[0201] Prekursor humanog folistatina, polipeptidna izoforma FST344 je sledeća:
[0202] Signalni peptid je podvučen; takođe, gore je podvučeno najmanje 27 ostataka koji predstavljaju C-terminalnu ekstenziju koja razlikuje folistatinsku izoformu od kraće folistatinske izoforme FST317 koja je prikazana u nastavku.
[0203] Polipeptidna izoforma prekursora humanog folistatina FST317 je sledeća:
Signalni peptid je podvučen.
[0204] Sekvenca N-terminalnog domena folistatina (FSND) je sledeća:
[0205] Sekvence FSD1 i FSD2 su sledeće:
ETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCV (SEQ ID NO: 66; FSD1) KTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVT (SEQ ID NO: 67; FSD2)
[0206] U jednom aspektu koji je takođe ovde opisan, ali nije zahtevan, agens za korišćenje prema ovde izloženim postupcima je folistatinu sličan srodan gen (FLRG), takođe poznat kao folistatinu srodan protein 3 (FSTL3). Izraz "FLRG polipeptid" obuhvata polipeptide koji sadrže ma koji polipeptid FLRG koji se javlja u prirodi kao i ma koju njegovu varijantu (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koji zadržava korisnu aktivnost. FLRG polipeptidi mogu da se vežu za i/ili inhibiraju aktivnost aktivina, naročito aktivina A. Varijante FLRG polipeptida koji zadržavaju svojstva vezivanja aktivina mogu da se identifikuju korišćenjem rutinskih postupaka za testiranje FLRG i interakcija aktivina (videti, npr., US 6,537,966). Osim toga, postupci za izradu i testiranje biblioteka polipeptida su prethodno opisane u kontekstu ActRII polipeptida i takvi postupci se takođe odnose i na izradu i testiranje varijanti FLRG. FLRG polipeptidi obuhvataju polipeptide izvedene iz sekvence ma kog poznatog FLRG koji ima sekvencu koja je najmanje otprilike 80% identična sa sekvencom FLRG polipeptida, i opciono najmanje 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ili većeg identiteta.
[0207] Prekursor humanog FLRG (prekursor folistatinu srodnog proteina 3) polipeptida je kako sledi:
Signalni peptid je podvučen.
[0208] Funkcionalne varijante ili modifikovani oblici folistatinskih polipeptida i FLRG polipeptida mogu da uključe fuzione proteine koji imaju najmanje deo folistatinskog polipeptida ili FLRG polipeptida i jedan ili više fuzionih domena, kao što su, na primer, domeni koji olakšavaju izolaciju, detekciju, stabilizaciju ili multimerizaciju polipeptida. Pogodni fuzioni domeni su prethodno detaljno razmotreni sa naglaskom na ActRIIB polipeptide. U jednom ostvarenju, antagonistički agens izlaganja je fuzioni protein koji sadrži aktivin-vezujući deo folistatinskog polipeptida fuzionisan sa Fc domenom. U drugom ostvarenju, antagonistički agens izlaganja je fuzioni protein koji sadrži aktivin-vezujući deo FLRG polipeptida fuzionisan sa Fc domenom.
3. Skrining testovi
[0209] U izvesnim aspektima koji su ovde takođe opisani, ali nisu zahtevani, ovo izlaganje se odnosi na upotrebu predmetnih ActRIIB polipeptida i njihovih varijanti (npr., GDF8 traps) za identifikaciju jedinjenja (agenasa) koji su agonisti ili antagonisti ActRIIB polipeptida. Jedinjenja koja se identifikuju kroz ovaj skrining mogu da se testiraju da bi se ispitala njihova sposobnost za lečenje mijelofibroze, na primer, u životinjskim modelima.
[0210] Postoje brojni pristupi za skriniranje na terapeutske agense za lečenje mijelofibroze ciljanjem ActRIIB signaliziranja (npr., Smad signaliziranje). Može se izvesti skriniranje visoke propusnosti radi identifikovanja agenasa koji narušavaju ActRIIB-posredovane efekte na izabranu ćelijsku liniju. Test se može izvesti da se skriniraju i identifikuju jedinjenja koja specifično inhibiraju ili smanjuju vezivanje ActRIIB polipeptida za svoje vezujuće partnere, kao što su ActRIIB ligandi (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin C, GDF8, GDF3, GDF11 ili BMP10). Alternativno, test se može upotrebiti za identifikaciju jedinjenja koja uvećavaju vezivanje ActRII polipeptida za svoje vezujuće partnere, kao što je ActRIIB ligand. Jedinjenja se mogu identifikovati njihovom sposobnošću da interreaguju sa ActRIIB polipeptidom.
[0211] Raznovrsni test formati će biti dovoljni i, u svetlu ovog izlaganja, oni koji ovde nisu naročito opisani će ipak biti shvaćeni od strane stručnih lica. Kako je ovde opisano, test jedinjenja (agensi) pronalaska mogu da se kreiraju ma kojim postupkom kombinatorne hemije. Alternativno, predmetna jedinjenja mogu biti biomolekuli koji se prirodno javljaju sintetisani in vivo ili in vitro. Jedinjenja (agensi) koja će se testirati na svoju sposobnost da deluju kao modulatori tkivnog rasta mogu da proizvedu, na primer, bakterije, kvasci, biljke ili drugi organizmi (npr., prirodni proizvodi), mogu da se proizvedu hemijski (npr., mali molekuli, uključujući peptidomimetike), ili da se proizvedu rekombinantno. Test jedinjenja koja su razmatrana u ovom pronalasku uključuju ne-peptidil organske molekule, peptide, polipeptide, peptidomimetike, šećere, hormone, i molekule nukleinskih kiselina. Test agens može biti mali organski molekul koji ima molekularnu težinu manju od otprilike 2,000 Daltona.
[0212] Test jedinjenja izlaganja mogu da se obezbede u vidu pojedinačnog, izolovanog entiteta, ili da se obezbede biblioteke veće kompleksnosti, kao što se proizvode kombinatornom hemijom. Ove biblioteke mogu obuhvatati, na primer, alkohole, alkil halide, amine, amide, estre, aldehide, etre i druge klase organskih jedinjenja. Prezentacija test jedinjenja u test sistemu može biti ili u izolovanom obliku ili kao mešavina jedinjenja, pogotovu u početnim skrining koracima. Opciono, jedinjenja mogu biti opciono derivatizovana sa drugim jedinjenjima i imati derivatne grupe koje olakšavaju izolaciju jedinjenja. Neograničavajući primeri derivatnih grupa obuhvataju biotin, fluorescein, digoksigenin, zeleni fluorescentni protein, izotope, polihistidin, magnetska zrnca, glutation S-transferazu (GST), fotoaktivativne unakrsne linkere ili ma koju njihovu kombinaciju.
[0213] U mnogim programima skriniranja lekova koji testiraju biblioteke jedinjenja i prirodnih ekstrakata, poželjni su testovi visoke propusnosti u cilju maksimizacije broja pregledanih jedinjenja u datom vremenskom periodu. Testovi koji se izvode u sistemima bez ćelija, kao što mogu biti izvedeni sa prečišćenim ili polu-prečišćenim proteinima, često su poželjni kao "primarni" skrinovi zbog toga što mogu biti generisani da omoguće brzi razvoj i relativno laku detekciju izmena u molekularnoj meti koja je posredovana test jedinjenjem. Sem toga, efekti ćelijske toksičnosti ili bioraspoloživosti test jedinjenja se mogu generalno ignorisati u in vitro sistemu, test umesto da bude fokusiran primarno na efekat leka na molekularnu metu može se manifestovati u izmenama afiniteta vezivanja između ActRIIB polipeptida i njegovog vezujućeg partnera (npr., ActRIIB ligand).
[0214] Samo za ilustraciju, u skrining testu kao primer ovog izlaganja, jedinjenje od interesa se dovodi u kontakt sa izolovanim i prečišćenim ActRIIB polipeptidom koji je uobičajeno sposoban da vezuje ActRIIB ligand, što je odgovarajuće za svrhu testa. U mešavinu jedinjenja i ActRIIB polipeptida se doda kompozicija koja sadrži ActRIIB ligand (npr., GDF11). Detekcija i kvantitativno određivanje ActRIIB/ActRIIB-ligand kompleksa obezbeđuje način za određivanje efikasnosti jedinjenja u inhibisanju (ili potenciranju) formiranja kompleksa između ActRIIB polipeptida i njegovog vezujućeg proteina. Efikasnost jedinjenja se može ispitati generisanjem krivi doznog odgovora iz podataka dobijenih primenom različitih koncentracija test jedinjenja. Sem toga, kontrolni test se takođe može izvesti da bi se obezbedila polazna osnova za poređenje. Na primer, u kontrolnom testu, izolovani i prečišćeni ActRIIB ligand se dodaje u kompoziciju koja sadrži ActRIIB polipeptid, i formiranje ActRIIB/ActRIIB ligand kompleksa se kvantitativno određuje bez prisustva test jedinjenja. Shvatiće se da, generalno, redosled kojim se reaktanti mešaju i dodaju može varirati, i može se izmešati istovremeno. Sem toga, umesto prečišćenih proteina, mogu da se koriste ćelijski ekstrakti i lizati da bi se zadržao pogodan test sistem bez ćelija.
[0215] Formiranje kompleksa između ActRIIB polipeptida i njegovog vezujućeg proteina mođe se detektovati različitim tehnikama. Na primer, modulacija formiranja kompleksa može se kvantitativno odrediti korišćenjem, na primer, detektabilno obeleženih proteina kao što je radioobeleženi (npr.,<32>P,<35>S,<14>C ili<3>H), fluorescentno obeleženi (npr., FITC), ili enzimski obeleženi ActRIIB polipeptid i/ili njegov vezujući protein, putem imunotesta, ili hromatografskom detekcijom.
[0216] Ovo izlaganje razmatra upotrebu testa polarizacije fluorescencije i testove transfera rezonantne enrgije fluorescencije (FRET) za merenje, bilo direktno bilo indirektno, stepena interakcije između ActRIIB polipeptida i njegovog vezujućeg proteina. Dalje, drugi načini detekcije, kao što su oni zasnovani na optičkim talasovodima (videti, npr., PCT Publication WO 96/26432 i U.S. Pat. No. 5,677,196), površinska plazmon rezonanca (SPR), površinski senzori naelektrisanja, i površinski senzori snage, su kompatibilni sa mnogim ostvarenjima izlaganja.
[0217] Sem toga, ovo izlaganje razmatra upotrebu testa interakcije zamke (trap), takođe poznat kao "dvohibridni test," za identifikovanje agenasa koji prekidaju ili potenciraju interakciju između ActRIIB polipeptida i njegovog vezujućeg partnera. Videti, npr., U.S. Pat. No.
5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; i Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). U specifičnom nezahtevanom ostvarenju, ovo izlaganje razmatra upotrebu reverznih dvohibridnih sistema za identifikaciju jedinjenja (npr., mali molekuli ili peptidi) koji disociraju interakcije između ActRII polipeptida ili GDF trap i njihovog vezujućeg proteina [videti, npr., Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; i U.S. Pat. Nos.5,525,490; 5,955,280; i 5,965,368].
[0218] Jedinjenja mogu da se identifikuju prema svojoj sposobnosti da interreaguju sa ActRIIB polipeptidom. Interakcija između jedinjenja i ActRIIB polipeptida može biti kovalentna ili nekovalentna. Na primer, takva interakcija može da se identifikuje na nivou proteina korišćenjem in vitro biohemijskih postupaka, uključujući foto-unakrsno povezivanje, vezivanje radioobeleženih liganada, i afinitetne hromatografije [videti, npr., Jakoby WB et al. (1974) Methods in Enzymology 46:1]. U izvesnim slučajevima, jedinjenja mogu biti skrinirana testom na bazi mehanizma, kao što je test za detekciju jedinjenja koja se vežu za ActRIIB polipeptid. Ovo može da obuhvati dešavanja vezivanja na čvrstoj fazi ili na tečnoj fazi. Alternativno, gen koji kodira ActRIIB polipeptid može da se transfektuje sa reporter sistemom (npr., b-galaktozidaza, luciferaza, ili zeleni fluorescentni protein) u ćeliju i skrinira prema biblioteci poželjno skriningom visoke propusnosti ili sa pojedinačnim članovima biblioteke. Mogu se koristiti i drugi testovi vezivanja na osnovu mehanizma; na primer, test vezivanja koji detektuje promene u slobodnoj energiji. Test vezivanja se može izvesti sa metom fiksiranom u poziciji ploče, na zrncima ili na čipu ili metom zarobljenoj na imobilisanom antitelu ili odrediti kapilarnom elektroforezom. Vezana jedinjenja mogu da se detektuju obično korišćenjem kolorimetrijskih završnih tačaka ili fluorescencije ili površinske plazmon rezonance.
4. Primeri terapeutske upotrebe
[0219] Kako je opisano u izlaganju, otkriveno je da ActRIIB antagonist (inhibitor) može da se koristi za lečenje pacijenata sa mijelofibrozom, posebno ublažavajući razne komplikacije bolesti, uključujući, na primer, splenomegaliju, ekstramedularnu hematopoezu, i fibrozu. Naročito, ovde prikazani podaci pokazuju da GDF trap polipeptid smanjuje splenomegaliju, ekstramedularnu hematopoezu, i fibrozu u JAK2V617F modelu mijelofibroze. Prema tome, u izvesnim aspektima, izlaganje se odnosi na kompozicije i postupke za lečenje mijelofibroze, naročito lečenje ili prevenciju jedne ili više komplikacija mijelofibroze (splenomegalije, ekstramedularne hematopoeze, anemije, i fibroze), primenjivanjem pacijentu kome je to neophodno efektivne količine jednog ili više ActRIIB antagonista, opciono u kombinaciji sa jednom ili više drugih potpornih terapija ili aktivnih agenasa za lečenje mijelofibroze.
[0220] Kako je ovde korišćeno, terapeutik koji "sprečava" poremećaj ili stanje se odnosi na jedinjenje koje, u statističkom uzorku, smanjuje pojavu poremećaja ili stanja u tretiranom uzorku u odnosu na netretirani kontrolni uzorak, ili odlaže početak ili umanjuje težinu jednog ili više simptoma poremećaja ili stanja u odnosu na netretirani kontrolni uzorak. Izraz "lečenje", kako je ovde korišćen, obuhvata ublažavanje ili otklanjanje stanja jednom kada je utvrđeno. U drugom slučaju, sprečavanje ili lečenje se mogu raspoznati u dijagnozi koju postavlja lekar ili drugi zdravstveni radnik i nameravani rezultat primene terapeutskog agensa.
[0221] Generalno, lečenje ili sprečavanje bolesti ili stanja kako je opisano u ovom izlaganju, postiže se primenjivanjem ActRIIB antagonista u efektivnoj količini. Efektivna količina agensa se odnosi na količinu koja je efikasna, u dozi i u neophodnom vremenskom periodu, da postigne željeni terapeutski ili profilaktički rezultat. Terapeutski efektivna količina agensa ovog izlaganja može varirati spram faktora kao što su: stanje bolesti, starost, pol, i težina pojedinca, i sposobnosti agensa da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Profilaktički efektivna količina se odnosi na količinu koja je efikasna, u dozi i u neophodnom vremenskom periodu, da postigne željeni profilaktički rezultat.
[0222] Izrazi "subjekt," "pojedinac," ili "pacijent" mogu da se koriste jedan umesto drugog kroz Opis i generalno se odnose na sisare. Sisari uključuju, ali bez ograničenja, domaće životinje (npr., krave, ovce, mačke, psi, i konji), primate (npr., ljudi i ne-humani primati, kao majmuni), zečeve, i glodare (npr., miševi i pacovi).
[0223] Mijelofibroza je klonski neoplastični poremećaj hematopoeze, generalno se odlikuje progresivnom fibrozom kostne srži dovodeći do rasta ne-efektivne hematopoeze, ekstramedularne hematopoeze, raznih inflamatornih komplikacija, i skraćenog preživljavanja [Mascarenhas et al. (2012) Curr Med Chem 19:4399-4413; i Vannucchi et al. (2011) Hematol Am Soc Hematol Educ Prog 2011:222-230]. To je jedan od mijeloproliferativnih poremećaja kostne srži u kom se proizvodi višak ćelija. Produkcija citokina kao što je fibroblastni faktor rasta od strane abnormalnog hematopoetskog ćelijskog klona dovodi do zamene hematopoetskog tkiva kostne srži vezivnim tkivom putem kolagene fibroze. Smanjenje hematopoetskog tkiva narušava sposobnost pacijenta da generiše nove krvne ćelije, što dovodi do progresivne pancitopenije, nedostatka svih krvnih vrsta. Međutim, proliferacija i fibroblasta i gomilanje kolagena je sekundarni fenomen, i sami fibroblasti nisu deo abnormalnog ćelijskog klona. Kao rezultat progresivnog ožiljavanja, ili fibroze, koštane srži, pacijenti razvijaju ekstramedularnu hematopoezu jer su hemopoetske ćelije prinuđene da migriraju u druga područja, naročito jetru i slezinu. Ovo dovodi do uvećanja ovih organa. U jetri, stanje se naziva hepatomegalija. Uvećanje slezine se naziva splenomegalija, što takođe doprinosi pancitopeniji, posebno je istaknuta trombocitopenija i anemija. Zabeleženo je takođe da se ekstramedularna hematopoeza javlja i u plućima i limfnim čvorovima. Druga komplikacija ekstramedularne hematopoeze je pojkilocitoza tj., prisustvo abnormalno oblikovanih eritrocita. Uobičajne kliničke manifestacije mijelofibroze uključuju progresivnu hepatosplenomegaliju, abnormalan broj krvnih ćelija, i simptomi iscrpljivanja, kao što su umor, gubitak težine, noćno znojenje, groznica, svrab, bol u kostima, rana sitost, abdominalni bol ili nelagoda, artralgija, mijalgija, parastezije, kaheksija, infarkt slezine i krvarenje. Sve do nedavno, jedini tretman sa jasno demonstriranim uticajem na progresiju bolesti bila je transplantacija alogene hematopoetske stem ćelije, alloHSCT, ali je mortalitet povezan sa tretmanom visok i samo se manjina pacijenata kvalifikuje za ovu intenzivnu terapiju [Gupta et al. (2012) Blood 120: 1367-1379].
[0224] ActRIIB antagonisti mogu da se primene, sami ili u kombinaciji sa jednom ili više potpornih terapija ili aktivnih agenasa, za lečenje, sprečavanje, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze (npr., primarna mijelofibroza, post-policitemija vera mijelofibroza, i post-esencijalna trombocitemijska mijelofibroza). Posebno, ActRIIB antagonisti mogu da se primene, sami ili u kombinaciji sa jednom ili više potpornih terapija ili aktivnih agenasa, za lečenje, sprečavanje, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija mijelofibroze koje uključuju, na primer, ne-efektivnu hematopoezu, anemiju, inflamaciju, fibrozu (npr., fibrozu koštane srži, fibrozu slezine, i fibrozu jetre), pancitopeniju, trombocitopeniju, ekstramedularnu hematopoezu (npr., ekstramedularna hematopoeza u slezini, ekstramedularna hematopoeza u jetri, ekstramedularna hematopoeza u plućima, i limfatična ekstramedularna hematopoeza), hepatomegaliju, splenomegaliju, osteosklerozu, osteomijelofibrozu, pojkilocitozu, umor, gubitak teđine, noćno znojenje, groznicu, svrab, bol u kostima, ranu sitost, abdominalni bol ili nelagodu, artralgiju, mijalgiju, parastezije, kaheksiju, infarkt slezine i krvarenje.
[0225] Trenutno se primarna dijagnoza mijelofibroze (PMF) zasniva na kriterijumu Svetske zdravstvene organizacije (WHO) i uključuje složenu procenu kliničkih i laboratorijskih karakteristika [Tefferi A et al. (2007) Blood. 110: 1092-1097]. Postoje tri WHO dijagnostička primarna kriterijuma: 1) proliferacija megakariocita i atipija (mali do veliki megakariociti sa nenormalnim odnosom jedro/citoplazma i hiperhromatinsko i nepravilno savijeno jedro i gustina grupisanja) zajedno sa retikulinskom i/ili kolagenskom fibrozom ili, kada nema retikulinske fibroze, izmene megakariocita moraju biti praćene porastom celularnosti srži, granulocitnom proliferacijom, i često smanjenom eritropoezom (tj., pre-fibrotska primarna mijelofibroza), 2) nema podudaranja WHO kriterijuma za hroničnu mijelogenu leukemiju, policitemiju vera, mijelodisplazni sindrom, ili drugu mijeloidnu neoplazmu, i 3) demonstracija JAK2V617F ili drugog klonalnog markera ili bez evidencije o reaktivnoj fibrozi kostne srži. Sem toga, postoje i četiri WHO dijagnostička minorna kriterijuma: 1) leukoeritroblastoza, 2) povećani serumski nivoi LDH, 3) anemija, i 4) palpabilna splenomegalija. Leukoeritroblastoza u perifernoj krvi (tj., prisustvo eritrocita sa jedrom, nezrelih granulocita, i dakriocita) je uobičajena ali ne i nepromenljiva karakteristika PMF; pre-fibrotična PMF može da ne ispolji otvorenu leukoeritroblastozu [Kvasnicka et al. (2010) Am J Hematol. 85:62-69]. Fibroza kostne srži u PMF je obično povezana sa JAK2V617F ili mutantnim CALR, ili MPL, trizomijom 9, ili del(13q) [Hussein et al. (2009) Eur J Haematol. 82:329-338]. Prisustvo ovih genetskih markera, tako, snažno podržava dijagnozu PMF, u prisustvu mijeloidne neoplazme povezane sa fibrozom kostne srži. Takođe su opisani, ipak još uvek ne i zahtevani, postupci i primene ActRIIB antagonista za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine primarne mijelofibroze, naročito lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija primarne mijelofibroze.
[0226] Trenutno dijagnostikovanje post-policitemija vera mijelofibroze (post-PV MF) i postesencijalna trombocitemija mijelofibroze (post-ET MF) se zasniva na kriterijumu koji je objavila Međunarodna radna grupa za MPN istraživanja i lečenje (IWG-MRT) [Barosi G et al. (2008) Leukemia. 22:437-438]. Postoje dva IWG-MRT primarna kriterijuma za post-PV MF: 1) dokumentacija o prethodnoj dijagnozi policitemije vere kako je definisana WHO kriterijumom, i 2) stepen fibroze kostne srži 2-3 (na skali 0-3) ili stepen 3-4 (na skali 0-4). Stepen 2-3 prema Evropskoj klasifikaciji: difuzna, često mreža sa grubim vlaknima bez evidencije kolagenizacije (negativno trihromno bojenje) ili difuzna, mreža sa grubim vlaknima bez područja kolagenizacije (positivno trihromno bojenje) [Thiele et al. (2005) Haematologica. 90:1128-1132]. Stepen 3-4 prema standardnoj klasifikaciji: difuzna i sa gustim povećanjem retikulina sa opsežnim ukrštanjima, povremeno samo sa fokalnim paketima kolagena i/ili fokalnom osteosklerozom ili difuzna i sa gustim povećanjem retikulina sa opsežnim ukrštanjima sa grubim paketima kolagena, često praćena značajnom osteosklerozom [Manoharan et al. (1979) Br J Haematol 43:185-190]. Sem toga, postoje četiri IWG-MRT dijagnostička sekundarna kriterijuma, od kojih dva moraju biti otkrivena kod pacijenta zajedno sa IWG-MRT primarnim kriterijumom za post-PV MF dijagnostikovanje: 1) anemija ili neprekidan gubitak zahteva za flebotomiju u odsustvu citoreduktivne terapije, 2) leukoeritroblastična slika periferne krvi, 3) uvećanje splenomegalije definisano bilo kao porast palpabilne splenomegalije od ≥ 5 cm bilo pojava novo palpabilne splenomegalije, 4) razvoj ≥ 1 tri konstitucionalna simptoma: > 10% gubitak težine za šest meseci, noćno znojenje, neobjašnjiva groznica. Postoje dva IWG-MRT primarna kriterijuma za post-ET MF: 1) dokumentacija o prethodnoj dijagnozi policitemije vere kako je definisana WHO kriterijumom, 2) stepen fibroze kostne srži 2-3 (na skali 0-3) ili stepen 3-4 (na skali 0-4). Sem toga, postoji pet IWG-MRT dijagnostičkih sekundarnih kriterijuma, od kojih dva moraju biti otkrivena kod pacijenta zajedno sa IWG-MRT primarnim kriterijumom za post-ET MF dijagnozu: 1) anemija i ≥ 2 g/dL pad nivoa hemoglobina od početnog, 2) leukoeritroblastna slika periferne krvi, 3) uvećanje splenomegalije definisano bilo kao porast palpabilne splenomegalije od ≥ 5 cm bilo pojava novo palpabilne splenomegalije, 4) povećanje laktat dehidrogenaze, i 5) razvoj ≥ 1 tri konstitucionalna simptoma: > 10% gubitak težine za šest meseci, noćno znojenje, neobjašnjiva groznica. Also described, yet not claimed, are methods and uses of ActRIIB antagonists to treat, prevent, or reduce the progression rate and/or severity of post-polycythemia vera mijelofibroza, particularly treating, preventing, or reducing the progression rate and/or severity of one or more complications of post-polycythemia vera mijelofibroza. Takođe su opisani, ipak još uvek ne i zahtevani, postupci i primene ActRIIB antagonista za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine post-esencijalne trombocitemijske mijelofibroze, naročito lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine jedne ili više komplikacija post-esencijalne trombocitemijske mijelofibroze.
[0227] Robustno prognostičko modeliranje u mijelofibrozi počelo je razvojem Međunarodnog prognostičkog skoring sistema (IPSS) 2009. godine [Cervantes F et al. (2009) Blood 113:2895-2901]. IPSS za mijelofibrozu je primenjiv za pacijente koji su procenjeni u vreme početne dijagnoze i koristi pet nezavisnih prediktora lošijeg preživljavanja: starost >65 godina, hemoglobin <10 g/dL, broj leukocita >25x10<9>/L, cirkulišući blasti ≥1%, i prisustvo konstitucionalnih simptoma. Prisustvo 0, 1, 2, i ≥3 neželjena faktora definiše nisko, intermedijarno-1, intermedijarno-2, odnosno, visoko rizičnu bolest. Odgovarajuće medijane preživljavanja su bile 11.3, 7.9, 4, odnosno, 2.3 godina. Takođe su opisani, ipak još uvek ne i zahtevani, postupci i primene ActRIIB antagonista za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze kod pacijenata sa nisko, intermedijarno-1, intermedijarno-2, ili visoko rizičnom mijelofibrozom prema IPSS. U nekim ostvarenjima, izlaganje se odnosi na postupke i primene ActRIIB antagonista za sprečavanje ili odlaganje rizika progresije mijelofibroze prema IPSS (npr., sprečavanje ili odlaganje rizika progresije sa niskog na intermedijarni-1 rizik, intermedijarni-1 na intermedijarni-2 rizik, i intermedijarni-2 na visoko rizičan prema IPSS). U nekim ostvarenjima, izlaganje se odnosi na postupke i primene ActRIIB antagonista za podsticanje ili uvećanje regresije rizika od mijelofibroze prema IPSS (npr., podsticanje ili uvećanje regresije rizika od visokog na intermedijarni-2 rizik, intermedijarni-2 na intermedijarni-1 rizik, i intermedijarni-1 na nizak rizik prema IPSS).
[0228] IWG-MRT naknadno razvija dinamički prognostički model (dinamički međunarodni prognostički sistem skoringa [DIPSS]) koji koristi iste prognostičke promenljive koje se koriste u IPSS ali se može primeniti u bilo kom vremenu tokom javljanja bolesti [Passamonti F et al. (2010) Blood. 115:1703-1708]. DIPSS označava dve, umesto jedne, neželjene tačke za hemoglobin <10 g/dL i kategorizacija rizika je stoga modifikovana: nizak (0 neželjenih tačaka), intermedijarni-1 (1 ili 2 tačke), intermedijarni-2 (3 ili 4 tačke), i visok (5 ili 6 tačaka). Odgovarajuće medijane preživljavanja nisu dostignute, 14.2, 4, i 1.5 godina. U izvesnim aspektima, izlaganje se odnosi na primenu ActRIIB antagonista za lečenje, prevenciju, ili smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze kod pacijenata koji imaju nizak, intermedijarni-1, intermedijarni-2, ili visok rizik mijelofibroze prema DIPSS. U nekim ostvarenjima, izlaganje se odnosi na primenu ActRIIB antagonista u sprečavanju ili odlaganju progresije rizika mijelofibroze prema DIPSS (npr., sprečavanje ili odlaganje rizika progresije sa niskog na intermedijarni-1 rizik, intermedijarnog-1 na intermedijarni-2 rizik, i intermedijarnog-2 na visok rizik prema DIPSS). U nekim ostvarenjima, izlaganje se odnosi na primenu ActRIIB antagonista za podsticanje ili povećavanje regresije rizika mijelofibroze prema DIPSS (npr., za podsticanje ili povećavanje regresije od visokog do intermedijarnog-2 rizika, intermedijarnog-2 do intermedijarnog-1 rizika, i intermedijarnog-1 do niskog rizika prema DIPSS).
[0229] IPSS- i DIPSS-nezavisni rizik faktori za preživljavanje kod mijelofibroze naknadno su identifikovani i uključili su nepovoljan kariotip (tj., kompleksni kariotip ili jedna ili dve abnormalnosti koje uključuju 8, -7/7q-, i(17q), inv(3), -5/5q-, 12p-, ili 11q23 rearanžman) [Hussein et al. (2010) Blood. 115:496-499], potreba za transfuzijom eritrocita [Tefferi et al. (2009) Am J Hematol. 85:14-17], i broj trombocita <100 x 10<9>/L [Patnaik et al. (2010) Eur J Haematol. 84:105-108]. Prema tome, DIPSS je modifikovan u DIPSS-plus ugrađivanjem ova tri dodatna DIPSS-nezavisna riziko faktora: broj trombocita <100 x 10<9>/L, potreba za transfuzijom, i nepovoljan kariotip. Četiri DIPSS-plus rizik kategorije na bazi prethodno pomenutih osam riziko faktora su nizak (bez riziko faktora), intermedijarni-1 (jedan riziko faktor), intermedijarni-2 (dva ili tri riziko faktora), i visok (četiri ili više riziko faktora) sa medijanom preživljavanja od 15.4, 6.5, 2.9, odnosno, 1.3 godine. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci i primene ActRIIB antagonista u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze kod pacijenata koji imaju nizak, intermedijarni-1, intermedijarni-2, ili visok rizik mijelofibroze prema DIPSS-plus. U nekim ostvarenjima, izlaganje se odnosi na primenu ActRIIB antagonista u sprečavanju ili odlaganju rizika progresije mijelofibroze prema DIPSS-plus (npr., sprečavanju ili odlaganju rizika progresije od niskog do intermedijarnog-1 rizika, intermedijarnog-1 do intermedijarnog-2 rizika, i intermedijarnog-2 do visokog rizika prema DIPSS-plus). U nekim ostvarenjima, izlaganje se odnosi na primenu ActRIIB antagonista u podsticanju ili povećavanju regresije rizika mijelofibroze prema DIPSS-plus (npr., podsticanju ili povećavanju regresije od visokog do intermedijarnog-2 rizika, intermedijarnog-2 do intermedijarnog-1 rizika, i intermedijarnog-1 do niskog rizika prema DIPSS-plus).
[0230] Od publikovanja DIPSS-plus, publikovano je nekoliko studija koje su sugerisale dodatne prognostičke informacije. Na primer, >80% 2-godišnji mortalitet kod mijelofibroze je predviđen monozomalnim kariotipom, inv(3)/i(17q) abnormalnostima, ili ma koja dva od cirkulišući blasti >9%, leukociti ≥40 x 10<9>/L ili drugim nepoželjnim kariotipom [Tefferi et al. (2011) Blood.
118:4595-4598.]. Slično, inferiorno preživljavanje kod mijelofibroze je povezano sa nula zigot za JAK2 46/1 haplotip, nisko JAK2V617F alel opterećenje, ili prisustvo IDH, EZH2, SRSF2, ili ASXL1 mutacija [Tefferi, Ayalew (2014) Am. J. Hematol. 89:916-925]. Suprotno, prisustvo ili odsustvo JAK2V617F, MPL, ili TET2 mutacija nije se činilo da utiče na preživljavanje. Na preživljavanje kod mijelofibroze takođe je uticao porast serumskih nivoa IL-8 i IL-2R kao i serumskih nivoa slobodnih lakih lanaca, oba nezavisno od DIPSS-plus. Najskorije, Tefferi et al. su ispitivali 254 pacijenta sa mijelofibrozom i prijavili učestalosti mutacija od 58% za JAK2, 25% CALR, 8% MPL, i 9% divlji tip za sve tri mutacije (tj., tripl-negativno) [Tefferi et al. (2014) Leukemia. prepublished as DOI 10.1038/leu.2014.3]. Učestalost CALR mutacije kod JAK2/MPL-nemutiranih slučajeva je bila 74%. CALR mutacije su povezane sa mlađom starosnom dobi, većim brojem trombocita, i nižim DIPSS-plus skorom. Pacijenti sa CALR mutacijom su, isto tako, češće bili anemični, zahtevali transfuzije, ili prikazali leukocitozu. Mutacije splajsozoma su bile retke kod pacijenata sa CALR mutacijom. U naknadnoj međunarodnoj studiji od 570 pacijenata, autori su prijavili najduže preživljavanje kod pacijenata sa CALR+ASXL1- (medijana 10.4 godine) i najkraće kod CALR-ASXL1+ pacijenata (medijana 2.3 godine) [Tefferi et al. (2014) Leukemia. prepublished as DOI 10.1038/leu.2014.57].
CALR+ASXL1+ i CALR-ASXLL- pacijenti su imali slično preživljavanje i bili su grupisani zajedno u kategoriju intermedijarnog rizika (medijana preživljavanja 5.8 godina). Kako je postalo evidentno za ukupno preživljavanje, preživljavanje bez leukemije je takođe značajno kompromitovano kod pacijenata koji nose izvesne mutacije uključujući IDH i SRSF2 [Tefferi et al. (2012) Leukemia. 26:475-480; Lasho et al. (2012) Blood. 120:4168-4171]. Sem toga, mutacije u LNK i THPO su takođe povezane sa mijelofibrozom.
[0231] Otkriće gain-of-function mutacije, JAK2V617F, Janus kinaze 2 (JAK2) dovelo je do značajnih unapređenja razumevanja biologije koja leži u osnovi mijelofibroze, kao i do razvoja ruksolitiniba, JAK2 inhibitora koji je prvi lek odobren od FDA za lečenje mijelofibroze [Baxter et al. (2005) Lancet 365:1054-1061; James C. et al. (2005) Nature 434:1144-1148; Kralovics et al. (2005) N Engl J Med.352:1779-1790; i Levine et al. (2005) Cancer Cell 7:387-397]. Familija Janus kinaza receptora tirozin kinaza obuhvata četiri različita proteina (JAK1, JAK2, JAK3 i TYK2), i poznato je da ova familija proteina ima ključnu ulogu u rastu i razvoju mijeloidnih i limfoidnih ćelija. Naročito, posreduju intraćelijske interakcije od citokinskih receptora, dovodeći do aktivacije aktivatora signalne transdukcije faktora transkripcije (STAT) i nishodnoh organizovanja gena koji regulišu ćelijsku proliferaciju i diferencijaciju [Quintas-Cardama et al. (2011) Nat Rev Drug Discov 10:127-140]. JAK2V617F mutacija dovodi do konstitutivne aktivacije JAK2 i tako podstiče mijeloidnu ćelijsku proliferaciju i diferencijaciju. Drugi inhibitori Janus kinaze koji su podvrgnuti kliničkim ispitivanjima uključuju, na primer, fedratinib (SAR302503), monoelotinib (CYT387), pakritinib, lestaurtinib, AZD-1480, BMS-911543, NS-018, LY2784544, SEP-701, XL019, i AT-9283.
[0232] Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci i primene ActRIIB antagonista lečenje, prevenciju, i smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze kod pacijenata koji imaju jedno ili više od: monozomski kariotip, inv(3)/i(17q) abnormalnosti, cirkulišuće blaste >9% i/ili leukocite ≥40 x 10<9>/L, nula zigot za JAK246/1 haplotip, JAK2V617F mutaciju, IDH1 mutaciju, IDH2 mutaciju, EZH2 mutaciju, SRSF2 mutaciju, ASXL1 mutaciju, povišene nivoe serumskog IL-8, povišene nivoe serumskog IL-2R, povišene nivoe serumskih slobodnih lakih lanaca, JAK1 mutaciju, JAK2 mutaciju, JAK3 mutaciju, TYK2 mutaciju, MPL mutaciju, CALR mutaciju, CALR+ASXL1-, CALR-ASKL1+, CALR+ASKL1+, CALR-ASKL1-, TET2 mutaciju, THPO mutaciju, i LNK mutaciju.
[0233] Rešavanje problema anemije može biti jedan od najizazovnijih aspekata lečenja pacijenata koji boluju od mijelofibroze [Tefferi A. (2011) Blood 117(13):3949-3504; Barosi et al. (2011) Expert Opin Pharmacother 12(10): 1597-1611]. Transfuzija krvi (transfuzija pune krvi ili eritrocita) je standardna terapija za simptomatski anemične pacijente sa mijelofibrozom. Osim transfuzije, postoje različiti konvencionalni agensi koji su u upotrebi za lečenje anemija kod ovih pacijenata. Na primer, eritropoeza-stimulišuća sredstva [npr., ESAs kao eritropoetin (EPO) i njegovi derivati], androgeni (npr., testosteron enantat i fluoksimesteron), prednizon, danazol, talidomid, prednizon, i lenalidomid se obično koriste za lečenje anemije kod pacijenata sa mijelofibrozom. Generalno, ESAs se koriste kod pacijenata sa umerenom, nezavisnom od transfuzija anemijom i niskim serumskim nivoima eritropoetina. Stope odgovora variraju od 20-60% bez jasne podrške darbepoetinu-alfa naspram konvencionalnog rekombinantnog eritropoietina. ESAs odgovori su obično kratko-živući (oko 1 godine). Ukoliko ESAs ne radi ili ima slabu efikasnost, obično se koriste danazol ili preparati androgena za lečenje anemičnih pacijenata sa stopom odgovora oko 20%. Niska doza talidomida zajedno sa suženim prednizonom proizvodi odgovore u anmiji kod otprilike 20-40% pacijenata [Thapaliya et al. (2011) Am J Hematol 86(1):86-98]. Međutim, talidomidni tretman je često slabo tolerisan uz periferne neuropatije, konstipaciju, i somnolenciju što vodi u prekid konzumiranja leka kod većine pacijenata. Kod pacijenata sa mijelofibrozom i sa del(5q31)-povezanom anemijom, preporučena prva linija terapije je lenalidomid zbog toga što je prijavljeno značajno poboljšanje, sa rezolucijom anemije i povremeno evidencijom molekularne remisije [Tefferi et al. (2007) Leukemia 21(8):1827-1828]. Isto opisani, ali ne i zahtevani, su postupci i primene ActRIIB antagonista lečenje, prevenciju, i smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze kod pacijenata koji imaju anemiju. U nekim ostvarenjima, izlaganje se odnosi na primenu ActRIIB antagonista za lečenje, prevenciju, i smanjivanje brzine progresije i/ili težine anemije kod pacijenata sa mijelofibrozom. Isto opisan, ali ne i zahtevan, je postupak za lečenje, prevenciju, i smanjivanje brzine progresije i/ili težine mijelofibroze kod pacijenata kojima je to neophodno i koji obuhvata primenjivanje jednog ili više ActRIIB antagonista zajedno sa jednim ili više dodatnih aktivnih agenasa odabranih iz grupe, koju čine: eritropoeza-stimulišući agens [npr., ESAs kao eritropoetin (EPO) i njegovi derivati], androgen (npr., testosteron enantat i fluoksimesteron), prednizon, danazol, talidomid, prednizon, i lenalidomid. Isto ovde opisan, ali ne i zahtevan, je postupak za lečenje, prevenciju, i smanjivanje brzine progresije i/ili težine anemije u mijelofibrozi kod pacijenata kojima je to neophodno i koji obuhvata primenjivanje jednog ili više ActRIIB antagonista zajedno sa jednim ili više dodatnih aktivnih agenasa odabranih iz grupe, koju čine: eritropoeza-stimulišući agens [npr., ESAs kao eritropoetin (EPO) i njegovi derivati], androgen (npr., testosteron enantat i fluoksimesteron), prednizon, danazol, talidomid, prednizon, i lenalidomid. Isto ovde opisan, ali ne i zahtevan, je postupak za lečenje, prevenciju, i smanjivanje brzine progresije i/ili težine anemije u mijelofibrozi kod pacijenata kojima je to neophodno i koji obuhvata primenjivanje jednog ili više ActRIIB antagonista zajedno sa transfuzijom krvi (transfuzija pune krvi ili eritrocita).
[0234] Kada se prate nivoi hemoglobina i/ili hematokrita kod ljudi, nivo koji je manji od normalnog za odgovarajuće kategorije starosti i pola mogu da ukazuju na anemiju, iako se individualne varijacije uzimaju u obzir. Na primer, nivo hemoglobina od 10-12.5 g/dl, i uobičajeno 11.0 g/dl se smatra da je ugranici normalnog raspona kod zdravih odraslih jedinki, mada, u pogledu terapije, niži ciljni nivo može prouzrokovati nekoliko kardiovaskularnih sporednih efekata. Videti, npr., Jacobs et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 15-19. Alternativno, nivoi hematokrita (zapreminski procenat uzorka krvi koji zauzimaju ćelije) može da se upotrebi kao mera anemije. Nivoi hematokrita za zdrave pojedince se kreću od oko 41-51% kod zdravih muškaraca i od 35-45% za zdrave žene. Pacijent može biti tretiran u doznom režimu namenjenom vraćanju pacijenta na ciljni nivo eritrocita, hemoglobina, i/ili hematokrita ili da omogući smanjivanje ili eliminiše transfuzije eritrocita (smanjivanje opterećenja transfuzijom) uz održavanje prihvatljivog nivoa eritrocita, hemoglobina i/ili hematokrita. Kako nivoi hemoglobina i hematokrita variraju od osobe do osobe, optimalno, ciljni nivo hemoglobina i/ili hematokrita može biti individualizovan za svakog pacijenta.
[0235] Kod pacijenata koji primaju česte transfuzije pune krvi ili eritrocita, normalni mehanizmi homeostaza gvožđa može biti zatrpana, eventualno dovodeći do toksičnih i potencijalno fatalnih akumulacija gvožđa u vitalnim tkivima, kao u srcu, jetri, i endokrinim žlezdama. Regularne transfuzije eritrocitima zahtevaju izlaganje raznim donorskim jedinicama krvi i time visokom riziku od alloimunizacije. Poteškoće sa vaskularnim uvidom, raspoloživosti i pristanka na heliranje gvožđa, i visoki troškovi su neki od razloga zašto bi bilo korisno ograničiti broj transfuzija eritrocita.
[0236] Jedan ili više ActRIIB antagonista, opciono kombinovanih sa aktivatorom EPO receptora, može se koristiti u kombinaciji sa jednim ili više molekula koji heliraju gvožđe kako bi se podstaklo izlučivanje gvožđa urinom i/ili fecesom i na taj način sprečilo ili povuklo gomilanje gvožđa u tkivu kod pacijenata sa mijelofibrozom. Efikasni agensi koji heliraju gvožđe trebalo bi da se selektivno vežu i da neutrališu trovalentno gvožđe, oksidovani oblik ne-transferinski vezanog gvožđa koje se računa kao najviše toksično gvožđe preko katalitičke proizvodnje hidroksil radikala i oksidacionih proizvoda [videti, npr., Esposito et al. (2003) Blood 102:2670-2677]. Ovi agensi su strukturno različiti, ali svi imaju kao donor atoma kiseonik ili azot koji su sposobni da formiraju neutrališuće oktahedralne koordinatne komplekse sa pojedinačnim atomima gvožđa u stehiometrijskom odnosu 1:1 (heksadentatni agensi), 2:1 (tridentatni), ili 3:1 (bidentatni) [Kalinowski et al. (2005) Pharmacol Rev 57:547-583]. Generalno, efikasni agensi koji heliraju gvožđe takođe imaju relativno malu molekulsku masu (npr., manje od 700 daltona), i rastvorljivi su i u vodi i u mastima čime se omogućava pristup pogođenim tkivima. Specifični primeri molekula koji heliraju gvožđe obuhvataju deferoksamin, a heksadentatni agens bakterijskog porekla koji zahteva dnevno parenteralno primenjivanje, i oralno aktivne sintetske agense deferipron (bidentat) i deferasiroks (tridentat). Kombinovana terapija koja se sastoji od primenjivanja dva agensa koji heliraju gvožđe istog dana pokazuje nadu za pacijente koji ne odgovaraju na monoterapiju heliranja i, isto tako, u prevazilaženju pitanja slabe saglasnosti pacijenta za sam dereroksamin [Cao et al. (2011) Pediatr Rep 3(2):e17; i Galanello et al. (2010) Ann NY Acad Sci 1202:79-86].
[0237] Jedan ili više ActRIIB antagonista izlaganja mogu da se koriste u kombinaciji sa aktivatorom EPO receptora da bi se postiglo povećanje eritrocita, posebno u nižim opsezima doze. Ovo može biti korisno za smanjivanje poznatih off-target efekata i rizika povezanih sa visokim dozama aktivatora EPO receptora. Primarni neželjeni efekti ESAs obuhvataju, na primer, preterano povećanje hematokrita ili nivoa hemoglobina i policitemiju. Povišeni nivoi hematokrita mogu dovesti do hipertenzije (preciznije pogoršanja hipertenzije). Drugi neželjeni efekti ESAs koji su prijavljeni, od kojih se neki odnose na hipertenziju, su glavobolje, sindrom nalik influenci, opstrukcija šantova, infarkti miokarda i cerebralne konvulzije zahvaljujući trombozi, hipertenzivna encefalopatija, i eritrocitna aplazija. Videti, npr., Singibarti (1994) J. Clin Investig 72(suppl 6), S36-S43; Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15(suppl 4), 51-56; Delanty et al. (1997) Neurology 49, 686-689; and Bunn (2002) N Engl J Med 346(7), 522-523). Isto tako, ovde su opisani, ali nisu zahtevani, postupci za lečenje ili prevenciju anemije kod pacijenata sa mijelofibrozom primenjivanjem pacijentu terapeutski efektivne količine jednog ili više ActRIIB antagonista i aktivatora EPO receptora. ActRIIB antagonist može da se koristi u kombinaciji sa aktivatorima EPO receptora da bi se smanjila potrebna doza ovih aktivatora kod pacijenata koji su suspektni na neželjene efekte ESAs. Ovi postupci mogu da se primene u terapeutskim i profilaktičkim tretmanima pacijenata.
[0238] Uz uslov da ActRIIB antagonisti ovog izlaganja deluju različitim mehanizmom od ESAs, ovi antagonisti mogu biti korisni za povećanje nivoa eritrocita i hemoglobina kod pacijenata koji ne odgovaraju dobro na ESAs ili druge aktivatore EPO receptora. Na primer, ActRIIB antagonist ovog izlaganja može biti koristan za pacijenta kod koga primenjivanje normalne do povećane (> 300 IU/kg/nedeljno) doze ESA ne dovodi do povećanja nivoa hemoglobina na ciljni nivo. Neadekvatan odgovor na ESAs može biti ili konstitutivan (zapažen tokom prvog tretmana sa ESA) ili stečen (zapažen tokom ponavljanih tretmana sa ESA).
[0239] Citoreduktivni agensi su bili tretman izbora za većinu pacijenata sa simptomatskom splenomegalijom. Hidroksikarbamid (hidroksiurea, HC) je najčešće korišćen citoreduktivni agens, koji obično proizvodi skromne odgovore pri visokim dozama. Međutim, HC može često pogoršati citopenije i zbog toga se često ne toleriše dobro. Smanjenje veličine slezine od 25%-50% je zabeleženo kod najviše 35% pacijenata tretiranih sa HC [Martinez-Trillos et al. (2010) Ann Hematol. 89(12):1233-1237]. Kod pacijenata koji ne odgovaraju na HC, busulfan ili melfalan može da se upotrebi, posebno kod starijih pacijenata, s obzirom na to da postoji evidencija da ovi agensi mogu povećati učestalost leukemijske transformacije. Odgovori slezine sa niskom dozom talidomida su niski (<20%). Međutim, lenalidomid je pokazao da dovodi do 33% stepena odgovora u studiji koja je uključivala neke pacijente kojima je bila neuspešna prethodna terapija sa talidomidom. U slučajevima masivne refraktorne splenomegalije, mesečni ciklusi intravenskog kladribina su doveli do odgovora od 50%, sa teškim ali reverzibilnim citopenijama kao primarnom toksičnošću [Faoro et al. (2005) Eur J Haematol 74(2):117-120]. Ruksolitinib je dokazao superiornost nad HC u nedavnim studijama i tako je postao agens prve linije za kontrolu simptomatske ili progresivne splenomegalije. Na žalost, uobičajeni sporedni efekat ruksolitiniba je razvoj, ili pogoršanje, anemije kod pacijenata sa mijelofibrozom. Zbog toga, dok JAK inhibitori mogu biti korisni u lečenju splenomegalije, oni mogu zapravo pogoršati druge komplikacije mijelofibroze, naročito anemiju i poremećaje povezane sa anemijom.
[0240] Sem JAK2 inhibicije, istražuje se nekoliko drugih strategija lečenja mijeloproliferativnih poremećaja, koje uključuju imunomodulatorne lekove (npr., pomalidomid), inhibitore mete mTOR puta kod sisara (npr., rapamicin, sirolimus, deforolimus, everolimus, temsirolimus, NVP-BEZ235, BGT226, SF1126, PK1-587, INK128, AZD8055, i AZD2014), i modulatore epigenetskih faktora (npr., inhibitori histon deacetilaza, kao što su givinostat (ITF2357), panobinostat (LBH589) i pracinostat) [Mascarenhas et al. (2013) Haematologica 98(10):1499-1509].
[0241] Ovo izlaganje dalje razmatra primenu ActRIIB antagonista u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutskih modaliteta u lečenju pacijenata kako je ovde opisano. Na primer, ActRIIB antagonisti se mogu primenjivati u kombinaciji sa: citotoksinima, imunosupresivnim agensima, radiotoksičnim agensima, i/ili terapeutskim antitelima. Naročiti ko-terapeutici koji su razmatrani u ovom pronalasku uključuju, ali bez ograničenja, steroide (npr., kortikosteroide, kao prednizon), imunosupresive i/ili antiinflamatorne agense (npr., gama-interferon, ciklofosfamid, azatioprin, metotreksat, penicilamin, ciklosporin, kolhicin, antitimocitni globulin, mikofenolat mofetil, i hidroksihlorohin), citotoksične lekove, blokatore kalcijumskih kanala (npr., nifedipin), inhibitore angiotenzin konvertirajućeg enzima (ACE) inhibitori, para-aminobenzojeva kiselina (PABA), dimetil sulfoksid, inhibitore transformišućeg faktora rasta beta (TGFb), inhibitore interleukina-5 (IL-5), i inhibitore pan caspaze. Dodatni agensi koji mogu da se upotrebe u kombinaciji sa ActRIIB antagonistima uključuju, ali bez ograničenja, lektine (kako je opisano u, na primer, U.S. Patent No.: 7,026,283), kao i anti-fibrotske agense koje je opisao Wynn et al (2007, J Clin Invest 117:524-529). Na primer, dodatni anti-fibrotski agensi i terapije uključuju, ali bez ograničenja, različite anti-inflamatorne/ imunosupresivne/citotoksične lekove (uključujući: kolhicin, azatioprin, ciklofosfamid, prednizon, talidomid, pentoksifilin i teofilin), modifikatore TGFb signaliziranja (uključujući relaksin, SMAD7, HGF, i BMP7, kao i TGFbl, TbRI, TbRII, EGR-I, i CTGF inhibitore), citokine i antagoniste citokinskog receptora (inhibitori IL-lb, IL-5, IL-6, IL-13, IL-21, IL-4R, IL-13Ral, GM-CSF, TNF-a, onkostatin M, WlSP-I, i PDGFs), citokine i hemokine (IFN-g, IFN-a/b, IL-12, IL-10, HGF, CXCLl0, i CXCL11), antagoniste hemokina (inhibitori CXCLl, CXCL2, CXCL12, CCL2, CCL3, CCL6, CCL17, i CCL18), antagoniste hemokinskog receptora (inhibitori CCR2, CCR3, CCR5, CCR7, CXCR2, i CXCR4), TLR antagoniste (inhibitori TLR3, TLR4, i TLR9), antagoniste angiogeneze (VEGF-specifična antitela i terapija nadoknade adenozin deaminaze), antihipertenzivni lekovi (beta blokatori i inhibitori ANG 11, ACE, i aldosterona), vazoaktivne supstance (antagonisti ET-1 receptora i bosetan), inhibitori enzima koji sintetišu i obrađuju kolagen (inhibitori prolil hidroksilaze), B ćelijski antagonisti (rituksimab), antagonisti integrin/adhezionog molekula (molekuli koji blokiraju albl and avb6 integrine, kao i inhibitore integrin-vezane kinaze, i antitela specifična za ICAM-I i VCAM-I), proapoptotske lekove koji ciljaju mijofibroblaste, MMP inhibitore (inhibitori MMP2, MMP9, i MMP12), i TlMP inhibitore (antitela specifična za TIMP-1 ).
[0242] ActRIIB antagonist se može koristiti sam za lečenje pacijenta kome je to neophodno. Alternativno, ActRIIB antagonisti mogu da se koriste u kombinaciji sa konvencionalnim terapeutskim pristupima usmerenim na lečenje ili prevenciju ovde opisanih proliferativnih poremećaja, uključujući, na primer, hirurgiju (npr., splenektomija), citotoksične agense, radiološke tretmane koji obuhvataju zračenje ili primenu radioaktivnih supstanci, hemoterapeutske agense, anti-hormonske agense, agense koji inhibiraju rast, anti-neoplastične kompozicije, i tretman sa anti-kancerskim agensima koji su ovde nabrojani i poznati u struci, ili njihove kombinacije.
[0243] Generalno, citotoksični agens se odnosi na supstancu koja inhibira ili sprečava funkcionisanje ćelije i/ili dovodi do ćelijskog uništenja. Izraz treba da obuhvati radioaktivne izotope (npr., At<211>, 1<131>, 1<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>i radioaktivne izotope Lu), hemoterapeutske agense npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloide (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalatne agense, enzime i njihove fragmente kao što su nukleolitički enzimi, antibiotike, i toksine kao što su toksini malih molekula ili enzimatski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante, i različite antitumorske ili antikancer agense koji su izloženi u nastavku. Drugi citotoksični agensi su opisani u nastvaku. Tumoricidni agens prouzrokuje destrukciju ćelija tumora.
[0244] Generalno, hemoterapeutski agens je hemijsko jedinjenje korisno u lečenju kancera. Primeri hemoterapeutskih agensa obuhvataju: alkilirajuće agense kao tiotepa i CITOKSAN® ciklosfosfamid; alkil sulfonate kao busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao benzodopa, karbohon, meturedop, i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenine (posebno bulatakin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); betalapahon; lapahol; kolhicine; betulinsku kiselinu; kamptotecin (uključujući sintetske analoge topotekan (HICAMTIN®), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR®), acetilkamptotecin, skopolektin, i 9-aminokamptotecin); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove adozelesin, karzelesin i bizelesin sintetske analoge); podofilotoksin; podofilinsku kiselinu; tenipozid; kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetske analoge, KW-2189 i CBl-TMl); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktiin; spongistatin; azotne mustarde kao hlorambucil, hlomafazin, ciklofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil mustard; nitrozureje kao karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, i ranimnustin; antibiotike kao enediinske antibiotike (npr., kalihemicin, naročito kalihemicin gamal i kalihemicin omegal (videti, npr., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodne hromoproteinske enediinske antibiotske hromofore), aklacinomizine, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicine, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, ADRIAMICIN ® doksorubicin (uključujući morfolino-doksorubicin, cijanomorfolinodoksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine kao mitomicin C, mikofenolnu kiselinu, nogalamicin, olivomicine, peplomicin, porfiromicin, puromicin, helamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metabolite kao metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge kao fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tiogvanin; pirimidinske analoge kao ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenale kao aminoglutetimid, mitotan, trilostan; dopuna folne kiseline kao folinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinsku kiselinu; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; demekolcin; diazihon; elfornitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; maitansinoidi kao maitansin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; lozoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazihon; 2,2’,2"-trihlorotrietilamin; trihoteceni (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin (ELDISINE®, FILDESIN®); dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); tiotepa; taksoidi, npr., TAKSOL® paklitaksel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAKSANE™ Cremophor-free, albumin-konstruisane formulacije nanočestica paklitaksela (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), i TAKSOTERE® doksetaksel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); hlorambucil; gemcitabin (GEMZAR®); 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; platinum analozi kao cisplatin i karboplatin; vinblastin (VELBAN®); platinum; etopozid (VP- 16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin (ONCOVIN®); oksaliplatin; leukovorin; vinorelbin (NAVELBINE®); novantron; edatreksat; daunomicin; aminopterin; ibandronat; inhibitor topoizomerazse RFS 2000; difluorometilornitin (DMIJELOFIBROZA O); retinoidi kao retinolna kiselina; kapecitabin (KSELODA®); farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati svega pomenutog; kao i kombinacije dva ili više prethodnog kao CHOP, skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamid, doksorubicin, vinkristine, i prednizolon, i FOLFOKS, skraćenica za tretmanski režim sa oksaliplatinom (ELOKSATIN ™) u kombinaciji sa 5-FU i leukovorinom.
[0245] Takođe anti-hormonski agensi deluju u smislu regulacije, smanjivanja, blokiranja, ili inhibiranja efekata hormona koji podstiču rast kancera, i često su u obliku sistemskog, ili tretmana celog tela. Oni sami mogu biti hormoni. Primeri obuhvataju anti-estrogene i selektivne modulatore estrogenog receptora (SERMs), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEKS® tamoksifen), EVISTA® raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LYl 17018, onapriston, i FARESTON® toremifen; anti-progesterone; nishodne regulatore estrogenog receptora (ERDs); agense koji funkcionišu tako što vrše supresiju ili gase jajnike, na primer, agonisti luteinizirajući hormon-oslobađajućeg hormona (LHRH) kao što su LUPRON® i ELIGARD® leuprolid acetat, gozerelin acetat, buzerelin acetat i tripterelin; druge anti-androgene kao flutamid, nilutamid i bikalutamid; i inhibitore aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u adrenalnim žlezdama, kao, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® megestrol acetat, AROMASIN® eksemestan, formestan, fadrozol, RIVIS OR® vorozol, FEMARA® letrozol, i ARIMIDEX® anastrozol. Osim toga, takva definicija hemoterapeutskih agenasa uključuje bisfosfonate kao klodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), DIDROC AL® etidronat, NE-58095, ZOMET A® zoledronska kiselina/zoledronat, FOSAMAX® alendronat, AREDIA® pamidronat, SKELID® tiludronat, ili ACTONEL® risedronat; kao i troksacitabin (1,3-dioksolan nukleozid citozinski analog); antisens oligonukleotide, posebno one koji inhibiraju ekspresiju gena u putevima signalizacije koji su uključeni u aberantnu ćelijsku proliferaciju, kao, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras, i receptor epidermalnog faktora rasta (EGF-R); vakcine kao THERATOPE ® vakcina i vakcine genske terapije, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® vakcina, i VAXID® vakcina; LURTOTECAN® inhibitor topoizomeraze 1; ABARELIX® rmRH; lapatinib ditozilat (ErbB-2 i EGFR dualni mali molekulski inhibitor tirozin kinaze takođe poznat kao GW572016); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati svega pomenutog.
[0246] Agens koji inhibitorno deluje na rast generalno se označava kao jedinjenje ili kompozicija kojom se inhibira rast ćelija bilo in vitro ili in vivo. Tako, agens koji inhibitorno deluje na rast može biti onaj koji značajno smanjuje procenat ćelija u S fazi. Primeri agenasa inhibitora rasta uključuju agense koji blokiraju progresiju ćelijskog ciklusa (na drugom mestu od S faze), kao što su agensi koji uključuju zaustavljanje Gl i M-faze. Klasični blokatori M-faze obuhvataju vinka alkaloide (vinkristin i vinblastin), taksane, i inhibitore topoizomeraze II kao što su doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopozid, i bleomicin. Oni agensi koji zaustavljaju Gl fazu se takođe prelivaju i na S-fazu u smislu da je zaustavljaju, na primer, DNA alkilirajući agensi kao tamoksifen, prednizon, dakarbazin, mehloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluorouracil, i ara-C. Dalje informacije se mogu naći u: The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), naročito p.13. Taksani (paklitaksel i docetaksel) su antikancer lekovi, oba poreklom iz taksus drveta - tisa. Docetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), je poreklom iz evropskog tisa, polusintetski analog paklitaksela (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paklitaksel i docetaksel podstiču sklapanje mikrotubula od dimera tubulina i stabilizuju mikrotubule sprečavanjem depolimerizacije, što dovodi do inhibicije mitoze u ćelijama.
[0247] ActRIIB antagonist i dodatni aktivan agens (npr., ko-terapeutski agens) mogu da se primene u istoj formulaciji ili zasebno. U slučaju zasebnog primenjivanja, ActRIIB antagonist se može primeniti pre, posle, ili istovremeno sa dodatnim aktivnim agensom. Jedan agens može prethoditi ili slediti primenjivanje drugog agensa u intervalima koji se kreću od minuta do nedelja. Kada se dve ili više različitih vrsta terapeutskih agenasa primenjuju zasebno subjektu, trebalo bi generalno osigurati da ne istekne značajan period vremena između vremena svakog oslobađanja, tako da bi ove različite vrste agenasa još uvek bile u mogućnosti da izvrše koristan kombinovani efekat na ciljna tkiva ili ćelije.
[0248] Takođe su ovde opisani, ali nisu zahtevani, postupci za postupanje sa pacijentom koji je tretiran sa, ili je kandidat za tretman sa, jednim ili više ActRIIB antagonista izlaganja u smislu merenja jednog ili više hematoloških parametara pacijentu. Hematološki parametri mogu da se koriste za ispitivanje odgovarajućeg doziranja za pacijenta koji je kandidat za tretman sa antagonistom ovog izlaganja, za praćenje hematoloških parametara tokom tretmana, za procenjivanje da li treba podešavati dozu tokom tretmana sa jednim ili više antagonista izlaganja, i/ili za ispitivanje odgovarajuće doze održavanja jednog ili više antagonista izlaganja. Ukoliko je jedan ili više hematoloških parametara izvan normalnog nivoa, doziranje sa jednim ili više ActRIIB antagonista se može smanjiti, odložiti ili okončati.
[0249] Hematološki parametri koji se mogu meriti u skladu sa postupcima koji su ovde obezbeđeni uključuju, na primer, nivoe crvenih krvnih ćelija, krvni pritisak, zalihe gvožđa, i druge parametre koji se određuju u telesnim tečnostima a koji su u korelaciji sa povećanjem nivoa crvenih krvnih ćelija, primenom postupaka prepoznatljivih u struci. Ovi parametri se mogu odrediti primenom uzoraka krvi od pacijenta. Povećanje nivoa crvenih krvnih ćelija, nivoa hemoglobina, i/ili nivoa hematokrita može dovesti do povećanja krvnog pritiska.
[0250] Ukoliko je jedan ili više hematoloških parametara izvan normalnog opsega ili na gornjoj granici normale kod pacijenta koji je kandidat za lečenje sa jednim ili više ActRIIB antagonista, onda početak primenjivanja jednog ili više antagonista izlaganja može da kasni sve dok se hematološki parametri ne vrate na normalu ili prihvatljiv nivo bilo prirodno bilo putem terapeutske intervencije. Na primer, ukoliko kandidat-pacijent ima hipertenziju ili prehipertenzivno stanje, onda se pacijent može tretirati sa agensom za snižavanje krvnog pritiska u cilju snižavanja krvnog pritiska pacijenta. Svaki agens za snižavanje krvnog pritiska koji je odgovarajuć za stanje pojedinog pacijenta može da se koristi uključujući, na primer, diuretike, adrenergične inhibitore (uključujući alfa blokatore i beta blokatore), vazodilatatore, blokatore kalcijumskog kanala, inhibitore angiotenzin-konvertujućeg enzima (ACE), ili blokatore angiotenzin II receptora. Krvni pritisak može alternativno biti tretiran primenom dijete i režima fizičkih vežbi. Slično, ukoliko kndidat-pacijent ima zalihe gvožđa koje su niže od normalnih, ili su na donjoj granici normale, onda pacijent može da se tretira sa odgovarajućim režimom ishrane i/ili dodacima gvožđa sve dok se zalihe gvožđa pacijenta ne vrate na normalu ili prihvatljiv nivo.
Za pacijente koji imaju novoe crvenih krvnih ćelija više od normale i/ili nivoe hemoglobina, onda primenjivanje jednog ili više antagonista izlaganja može da kasni sve dok se nivoi ne vrate na normalu ili prihvatljiv nivo.
[0251] Ukoliko su jedan ili više hematoloških parametara izvan normalnog opsega ili su na gornjoj granici normale kod pacijenta koji je kandidat za lečenje sa jednim ili više ActRIIB antagonista, onda početak primenjivanja ne mora da kasni. Ipak, količina ili učestalost doze u doziranju jednog ili više antagonista izlaganja može biti podešena na količinu koja će smanjiti rizik od neprihvatljivog porasta hematoloških parametara koje se javlja tokom primenjivanja jednog ili više antagonista izlaganja. Alternativno, može se razviti terapeutski režim za pacijenta koji kombinuje jedan ili više ActRIIB antagonista sa terapeutskim agensom koji naglašava neželjeni nivo hematološkog parametra. Na primer, ukoliko pacijent ima povišen krvni pritisak, onda terapeutski režim može biti osmišljen tako da uključi primenu jednog ili više ActRIIB antagonista izlaganja i agens za snižavanje krvnog pritiska. Za pacijenta koji ima niže od poželjnih zaliha gvožđa, terapeutski režim se može razviti tako da obuhvati jedan ili više ActRIIB antagonista izlaganja i suplementaciju gvožđem.
[0252] Polazni parametar(i) za jedan ili više hematoloških parametara može se utvrditi za pacijenta koji je kandidat za tretman sa jednim ili više ActRIIB antagonista izlaganja i utvrditi odgovarajući dozni režim za tog pacijenta na osnovu polazne(ih) vrednosti. Alternativno, utvrđeni polazni parametri koji su zasnovani na istoriji bolesti pacijenta, mogu se iskoristiti za prijavljivanje režima doziranja odgovarajućeg antagonista za pacijenta. Na primer, ukoliko zdrav pacijent ima utvrđen izmereni polazni krvni pritisak koji je iznad definisanog normalnog opsega, ne mora biti neophodno da se krvni pritisak pacijenta dovede u opseg koji se smatra normalnim za opštu populaciju pre otpočinjanja tretmana sa jednim ili više antagonista izlaganja. Polazne vrednosti pacijenta za jedan ili više hematoloških parametara pre tretmana sa jednim ili više ActRIIB antagonista izlaganja, takođe mogu da se koriste kao relevantne komparativne vrednosti za praćenje svake promene hematoloških parametara tokom tretmana sa jednim ili više antagonista izlaganja.
[0253] Jedan ili više hematoloških parametara se mere kod pacijenata koji su tretirani sa jednim ili više ActRIIB antagonista. Hematološki parametri se mogu koristiti za praćenje pacijenta tokom tretmana i omogućiti podešavanje ili završetak doziranja sa jednim ili više antagonista izlaganja ili dodatnog doziranja sa drugim terapeutskim agensom. Na primer, ukoliko primenjivanje jednog ili više ActRIIB antagonista dovede do povećanja krvnog pritiska, nivoa crvenih krvnih ćelija, ili nivoa hemoglobina, ili smanjenja zaliha gvožđa, onda se doza jednog ili više antagonista izlaganja može sniziti u količini ili učestalosti sa ciljem smanjivanja efekata jednog ili više antagonista izlaganja na jedan ili više hematoloških parametara. Ukoliko primena jednog ili više ActRIIB antagonista dovede do promene jednog ili više hematoloških parametara što je štetno za pacijenta, onda se doziranje jednog ili više antagonista izlaganja može okončati bilo privremeno, dok se hematološki parametar(i) ne povrate na prihvatljiv nivo, bilo permanentno. Slično, ukoliko jedan ili više hematoloških parametara nisu dovedeni unutar prihvatljivog opsega posle smanjivanja doze ili učestalosti primenjivanja jednog ili više antagonista izlaganja, onda se doziranje može okončati. Kao alternativa, ili kao dodatak, smanjivanje ili okončanje doziranja jednog ili više antagonista izlaganja, pacijentu se može dozirati dodatni terapeutski agens koji naglašava neželjeni nivo hematološkog(ih) parametra(ara), kao, na primer, agens za snižavanje krvnog pritiska ili dopuna gvožđa. Na primer, ukoliko pacijent tretiran sa jednim ili više ActRIIB antagonista ima povišen krvni pritisak, onda doziranje jednim ili više antagonista izlaganja može da se nastavi na istom nivou i da se agens za snižavanje krvnog pritiska doda režimu tretmana, može da se doziranje jednim ili više antagonista izlaganja smanji (npr., u količini i/ili učestalosti) i da se agens za snižavanje krvnog pritiska doda režimu tretmana, ili da se doziranje jednim ili više antagonista izlaganja okonča i da se pacijent tretira sa agensom za snižavanje krvnog pritiska.
[0254] Kako je ovde korišćeno, primenjivanje "u kombinaciji sa", "kombinacije’, ili "zajedničko" primenjivanje se odnosi na svaki oblik primenjivanja tako da su dodatne terapije (npr., druga, treća, četvrta, itd.) još uvek efektivne u telu (npr., veći broj jedinjenja je istovremeno deluje u pacijentu, što može uključiti sinergističke efekte ovih jedinjenja). Efektivnost ne mora da bude u korelaciji sa merljivim koncentracijama sredstva u krvi, serumu, ili plazmi. Na primer, različita terapeutska jedinjenja mogu da se primene bilo u istoj formulaciji bilo u zasebnim formulacijama, bilo istovremeno bilo jedno za drugim, kao i po različitim šemama. Tako, osoba koja prima takav tretman može imati koristi od kombinovanog efekta različitih terapija. Jedan ili više ActRIIB antagonista, ili kombinacija takvih polipeptida izlaganja se može primeniti istovremeno sa, pre nego, ili posle, jednog ili više drugih dodatnih agenasa ili potpornih terapija. Uopšteno, svaki tearpeutski agens će se primeniti u dozi i/ili po vremenskoj šemi koja se određuje za taj poseban agens. Naročita kombinacija koja će se primeniti u režimu uzeće u obzir kompatibilnost antagonista ovog izlaganja sa terapijom i/ili željenog.
5. Farmaceutske kompozicije
[0255] Terapeutski agensi koji su ovde opisani (npr., ActRIIB antagonist) mogu da se formulišu u farmaceutske kompozicije. Farmaceutske kompozicije za primenu prema ovom izlaganju mogu da se formulišu na konvencionalan način korišćenjem jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača ili podloga. Takve formulacije će generalno biti suštinski bez pirogena, u saglasju sa većinom regulatornih pravila.
[0256] Terapeutski postupak može obuhvatiti primenjivanje kompozicije sistemski, ili lokalno u vidu implanta ili uređaja. Kada se primeni, terapeutska kompozicija za primenu u ovom izlaganju je bez pirogena, u fiziološki prihvatljivom obliku. Terapeutski korisni agensi koji nisu ActRIIB signalizirajući antagonist koji isto tako mogu opciono biti uključeni u kompoziciju kako je prethodno opisano, mogu da se primenjuju istovremeno ili uzastopno sa predmetnim jedinjenjima (npr., ActRIIB polipeptidi) u ovde izloženim postupcima.
[0257] Obično, ovde izloženi proteinski terapeutski agensi će se primenjivati parentalno, i posebno, intravenski ili subkutano. Farmaceutske kompozicije pogodne za parenteralno primenjivanje mogu sadržavati jedan ili više ActRIIB antagonista u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivim sterilnim izotonim vodenim ili ne-vodenim rastvorima, disperzijama, suspenzijama ili emulzijama, ili sterilnim praškom koji se može rekonstituisati u sterilne injektabilne rastvore ili disperzije neposredno pre upotrebe, koje mogu da sadrže antioksidanse, pufere, bakteriostatike, rastvorke koji čine formulaciju izotonom sa krvlju primaoca ili agense za suspendovanje ili zgušnjavanje. Primeri pogodnih vodenih i ne-vodenih nosača koji mogu da se upotrebe u farmaceutskim kompozicijama izlaganja uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slične), i njihove pogodne mešavine, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i injektabilne organske estre, kao što je etil oleat. Potrebna fluidnost se može održavati, na primer, korišćenjem materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem zahtevane veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom surfaktanata.
[0258] Kompozicije i formulacije mogu, ukoliko se želi, biti predstavljene u pakovanju ili dispenzer uređaju koji mogu da sadrže jednu ili više jediničnih doznih formi koje sadrže aktivni sastojak. Pakovanje može, na primer, imati metalnu ili plastičnu foliju, kao blister pakovanje. Pakovanje ili dispenzer uređaj mogu imati i uputstva za primenjivanje.
[0259] Dalje, kompozicija može biti inkapsulirana ili injektovana u obliku za dostavljanje u ciljni položaj u tkivu. U izvesnim ostvarenjima, kompozicije ovog pronalaska mogu obuhvatiti matriks koji može osloboditi jedno ili više terapeutskih jedinjenja (npr., ActRIIB polipeptide) na ciljni položaj u tkivu, obezbeđujući strukturu za razvijanje tkiva i optimalnu mogućnost da se resorbuje u telo. Na primer, matriks može obezbediti sporo oslobađanje ActRIIB antagonista. Ovakvi matriksi mogu da se formiraju od materijala koji se danas koriste za druge implantirane medicinske aplikacije.
[0260] Izbor matriksnog materijala se zasniva na biokompatibilnosti, biodegradabilnosti, mehaničkim svojstvima, kozmetičkom izgledu i svojstvima interfejsa. Posebna primena predmetnih kompozicija definisaće odgovarajuću formulaciju. Potencijalni matriksi za kompozicije mogu biti biodegradabilni i hemijski definisani kalcijum sulfat, trikalcijum fosfat, hidroksiapatit, polilaktatna kiselina i polianhidridi. Drugi potencijalni materijali su biodegradabilni i biološki dobro definisani, kao što su koštani ili kožni kolagen. Sledeći matriksi se sastoje od čistih proteina ili komponenti ekstracelularnog matriksa. Drugi potencijalni materijali su ne-biodegradabilni i hemijski definisani, kao što je sinterovani hidroksiapatit, biostaklo, aluminati, ili druga keramika. Matriksi mogu da se sastoje od kombinacija ma kojih od prethodno pomenutih vrsta materijala, kao što je polilaktatna kiselina i hidroksiapatit ili kolagen i trikalcijum fosfat. Biokeramike mogu da se izmene u sastavu, kao kod kalcijum-aluminat-fosfata i obrade da bi se izmenila veličina pora, veličina čestica, oblik čestica, i biodegradabilnost.
[0261] U izvesnim ostvarenjima, kompozicije pronalaska se mogu primenjivati oralno, npr., u obliku kapsula, kesica, pilula, tableta, lozengi (korišćenjem aromatične osnove, obično saharoze i akacije ili tragakante), praškova, granula, ili rastvora ili suspenzija u vodenim ili ne-vodenim tečnostima, ili kao ulje-u-vodi ili voda-u-ulju tečnih emulzija, ili eliksira ili sirupa, ili u vidu pastila (korišćenjem inertne osnove, kao što je želatin i glicerin, ili saharoza i akacija) i/ili u vidu tečnosti za ispiranje usta i slično, gde svaki oblik sadrži prethodno određenu količinu agensa kao aktivnog sastojka. Agens takođe može biti primenjen u vidu bolusa, elektuara ili paste.
[0262] U čvrstim doznim oblicima za oralno primenjivanje (kapsule, tablete, pilule, dražeje, praškovi, granule, i slično), jedno ili više terapeutskih jedinjenja ovog pronalaska može biti pomešano sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, kao što su natrijum citrat ili dikalcijum fosfat, i/ili neki od sledećeg: (1) punjači ili ekstenderi, kao što su skrobovi, laktoza, saharoza, glukoza, manitol, i/ili silicijumska kiselina; (2) vezujuća sredstva, kao što su, na primer, karboksimetilceluloza, alginati, želatin, polivinil pirolidon, saharoza, i/ili akcacija; (3) humektansu, kao što je glicerol; (4) dezintegrišuća sredstva, kao što su agar-agar, kalcijum karbonat, krompirov ili tapioka skrob, alginska kiselina, izvesni silikati, i natrijum karbonat; (5) agensi za usporavanje rastvora, kao parafin; (6) pojačivači apsorpcije, kao kvaternerna amonijum jedinjenja; (7) vlažeća sredstva, kao, na primer, cetil alkohol i glicerol monostearat; (8) absorbensi, kao kaolin i bentonit glina; (9) lubrikansi, kao talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat, i njihove mešavine; i (10) sredstva za bojenje. U nekim slučajevima kapsula, tableta i pilula, farmaceutske kompozicije mogu takođe uključiti sredstva za puferovanje. Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu isto tako da koriste punjače u mekim i tvrdim želatinskim kapsulama primenom takvih podloga kao što su laktoza ili mlečni šećeri, kao i polietilen glikoli velikuh molekulskih težina i slično.
[0263] Tečni dozni oblici za oralno primenjivanje obuhvataju farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe i eliksire. Osim aktivnog sastojka, tečni dozni oblici mogu sadržavati inertne razblaživače koji se uobičajeno koriste u struci, kao što su voda ili drugi rastvarači, solubilizirajući agensi i emulgatori, kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, ulja (posebno, semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, maslinovo, ricinusovo, i susamovo ulje), glicerol, tetrahidrofuril alkohol, polietilen glikoli i estri masnih kiselina sorbitana, i njihove mešavine. Osim inertnih razblaživača, oralne kompozicije mogu, isto tako, uključiti adjuvanse kao što su vlažeći agensi, emulgatori i suspendujući agensi, zaslađivači, arome, boje, mirisi, i konzervišuća sredstva.
[0264] Suspenzije, osim aktivnog jedinjenja, mogu sadržavati suspendujuće agense kao što su etoksilirani izostearil alkoholi, polioksietilen sorbitol, i sorbitan estri, mikrokristalna celuloza, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar i tragakanta, i njihove mešavine.
[0265] Kompozicije pronalaska mogu takođe sadržavati adjuvanse, kao što su konzervansi, vlažeća sredstva, emulgujuća sredstva i dispergujuća sredstva. Sprečavanje dejstva mikroorganizama može se osigurati dodavanjem različitih antibakterijskih i antigljivičnih agenasa, na primer, paraben, hlorobutanol, fenol sorbinska kiselina, i slično. Takođe, može biti poželjno uključiti izotone agense, kao što su šećeri, natrijum hlorid, i slična u kompozicije. Sem toga, produžena absorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika mogla bi se postići uključivanjem agenasa koji odlažu absorpciju, kao što je aluminijum monostearat i želatin.
[0266] Shvata se da će dozni režim odrediti dodeljeni lekar razmatrajući različite faktore koji modifikuju dejstvo predmetnog jedinjenja pronalaska (npr., TbRII polipeptidi). Različiti faktori obuhvataju, ali bez ograničenja, starost, pol, i ishranu pacijenta, težinu bolesti, vreme primenjivanja, i druge kliničke faktore. Opciono, doza može varirati sa vrstom korišćenog matriksa u rekonstituisanju i vrsta jedinjenja u kompoziciji. Dodavanje drugih poznatih faktora rasta u finalnu kompoziciju, takože može uticati na dozu. Progres se može pratiti periodičnom procenom rasta kosti i/ili oporavka, na primer, X-zracima (uključujući DEXA), histomorfometrijskim određivanjima, i tetraciklinskim obeležavanjem.
[0267] Ovde je takođe opisana, ali nije zahtevana, genska terapija za in vivo produkciju ActRIIB antagonista. Ovakva terapija bi postigla svoj terapeutski efekat uvođenjem ActRIIB polinukleotidnih sekvenci u ćelije ili tkiva koje imaju gore nabrojane poremećaje. Dostavljanje ActRIIB polinukleotidnij sekvenci se može postići korišćenjem rekombinantnih ekspresionih vektora kao što su himerični virus ili koloidalni disperzioni sistem. Poželjno za terapeutsku dostavu ActRIIB polinukleotidnih sekvenci je upotreba ciljnih lipozoma.
[0268] Različiti virusni vektori koji se mogu upotrebiti za gensku terapiju kako je ovde objašnjeno, uključuju adenovirus, herpes virus, vakcinia, ili, poželjno, RNA virus kao što je retrovirus. Poželjno, retrovirusni vektor je derivat mišijeg ili ptičijeg retrovirusa. Primeri retrovirusnih vektora u kojima može biti insertovan pojedinačni strani gen uključuju, ali bez ograničenja: Moloney virus mišije leukemije (MoMuLV), Harvey mišiji sarkoma virus (HaMuSV), mišiji sisarski tumor virus (MuMTV), i Rous sarkoma virus (RSV). Brojni drugi retrovirusni vektori mogu inkorporirati višestruke gene. Svi ovi vektori mogu preneti ili ugraditi gen za selektabilni marker tako da se transdukovane ćelije mogu identifikovati i generisati. Retrovirusni vektori mogu da se naprave ciljno-specifičnim povezivanjem, na primer, šećera, glikolipida, ili proteina. Poželjno ciljanje se postiže korišćenjem antitela. Stručno lice će prepoznati da specifične polinukleotidne sekvence mogu da budu insertovane u retrovirusni genom ili vezane u virusni omotač da bi omogućile ciljno specifično dostavljanje retrovirusnog vektora koji sadrži ActRIIB polinukleotid. Vektor može biti ciljan na kost ili hrskavicu.
[0269] Alternativno, ćelije tkivne kulture mogu direktno da se transfektuju sa plazmidima koji kodiraju retrovirusne strukturne gene: gag, pol i env, konvencionalnom kalcijum fosfatnom transfekcijom. Ove ćelije se onda transfektuju sa plazmidnim vektorom koji sadrži željene gene. Nastale ćelije oslobađaju retrovirusni vektor u medijum kulture.
[0270] Drugi ciljni sistem za oslobađanje polinukleotida ActRIIB antagonista je koloidni disperzioni sistem. Koloidni disperzioni sistemi obuhvataju makromolekulske komplekse, nanokapsule, mikrosfere, zrnca, i sisteme na bazi lipida uključujući ulje-u-vodi emulzije, micele, mešane micele, i lipozome. Poželjni koloidni sistem ovog pronalaska je lipozom. Lipozomi su vezikule veštačkih membrana koji su korisni kao dostavna sredstva in vitro i in vivo. RNA, DNA i intaktni virioni mogu biti inkapsulirani unutar vodene unutrašnjosti i biti oslobođeni u ćelijama u biološki aktivnom obliku (videti npr., Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Postupci za efikasan prenos gena korišćenjem lipozomnog dostavnog sredstva, su poznati u struci, videti npr., Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. Kompozicija lipozoma je obično kombinacija fosfolipida, često u kombinaciji sa steroidima, naročito holesterolom. Mogu se upotrebiti i drugi fosfolipidi ili drugi lipidi. Fizičke karakteristike lipozoma zavise od pH, jonske jačine, i prisustva dvovalentnih katjona.
[0271] Primeri lipida koji se mogu koristiti u proizvodnji lipozoma obuhvataju fosfatidilna jedinjenja, kao što su fosfatidilglicerol, fosfatidilholin, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin, sfingolipide, cerebrozide, i gangliozide. Ilustrativni fosfolipidi uključuju fosfatidilholin iz jaja, dipalmitoilfosfatidilholin, i distearoilfosfatidilholin. Ciljanje lipozoma je isto tako moguće na osnovu, na primer, specifičnosti organa, specifičnosti ćelija, i specifičnosti organela i, poznato je u struci.
[0272] Izlaganje obezbeđuje formulacije koje mogu biti promenljive da bi obuhvatile kiseline i baze za podešavanje pH; i sredstva za puferovanje kako bi se održao pH unutar uskog opsega.
PRIKAZ PRIMERA
[0273] Pronalazak, koji je do sada bio uopšteno opisan, lakše će se shvatiti pozivanjem na sledeće primere, koji su uključeni samo u svrhu ilustracije izvesnih ostvarenja ovog pronalaska, i nemaju cilj da ograniče pronalazak.
Primer 1: Generisanje ActRIIB-Fc fuzionih proteina
[0274] Prijavljivači su konstruisali rastvorljiv ActRIIB fuzioni protein koji ima ekstracelularni domen humanog ActRIIB fuzionisan sa humanim ili mišijim Fc domenom sa sisarskim linkerom (tri glicin aminokiseline) između njih. Konstrukcije se označavaju kao ActRIIB-hFc , odnosno ActRIIB-Fc.
[0275] ActRIIB-hFc je prikazan u nastavku kao prečišćen iz CHO ćelijske linije (SEQ ID NO: 24):
[0276] ActRIIB-hFc i ActRIIB-Fc proteini su ekspresovani u CHO ćelijskim linijama. Razmotrene su tri različite vodeće sekvence: (i) melitin medonosne pčele (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 21), ii) aktivator tkivnog plazminogena (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 22), i (iii) nativna: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 23).
[0277] Izabrani oblik koristi TPA lider i ima sledeću neobrađenu aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 25):
[0278] Ovaj polipeptid je kodiran sledećom nukleinsko kiselinskom sekvencom (SEQ ID NO: 26):
[0279] N-terminalno sekvenciranje CHO-ćelijski-proizvedenog materijala otkrilo je glavnu sekvencu -GRGEAE (SEQ ID NO: 27). Naročito, druge konstrukcije koje su objavljene u literaturi počinju sa -SGR... sekvencom.
[0280] Prečišćavanje se može izvesti serijom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, ma kojim redosledom: protein A hromatografiju, Q sefaroza hromatografiju, fenilsefaroza hromatografiju, hromatografiju isključivanja prema veličini, i katijon izmenjivačku hromatografiju. Prečišćavanje se može upotpuniti filtracijom virusa i izmenom pufera.
[0281] ActRIIB-Fc fuzoni proteini se takođe ekspresuju u HEK293 ćelijama i COS ćelijama. Iako materijal iz svih ćelijskih linija i racionalni uslovi uzgajanja u kulturi obezbeđuju protein sa aktivnošću izgradnje mišića in vivo, varijabilnost u potencijalu koja je zapažena verovatno je povezana sa izborom ćelijske linije i/ili uslova uzgajanja.
[0282] Prijavljivači su stvorili serije mutacija u ekstracelularnom domenu ActRIIB i proizveli ove mutantne proteine u vidu rastvorljivih fuzionih proteina između ekstracelularnog ActRIIB i Fc domena. Kičma ActRIIB-Fc fuzije ima sekvencu SEQ ID NO: 24.
[0283] Različite mutacije, uključujući N- i C-terminalna skraćivanja, uvedene su u osnovu ActRIIB-Fc proteina. Na osnovu ovde prezentovanih podataka, očekuje se da ove konstrukcije, ukoliko se ekspresuju sa TPA lider, neće imati N-terminalni serin. Mutacije su generisane u ActRIIB ekstracelularnom domenu putem PCR mutageneze. Posle PCR, fragmenti se prečiste preko Qiagen kolone, svare pomoću SfoI i AgeI i prečiste na gelu. Ovi fragmenti se povezuju u ekspresioni vektor pAID4 (videti WO2006/012627) tako da se tokom povezivanja stvara fuziona himera sa humanim IgG1. Tokom transformacije u E. coli DH5 alfa, kolonije se sakupe i izoluju se DNAs. Za mišije konstrukcije (mFc), mišiji IgG2a je zamenjen za humani IgG1. Sekvence svih mutanata su verifikovane.
Svi mutanti su proizvedeni u HEK293T ćelijama prolaznom transfekcijom. Ukratko, u 500ml-ski spineru, HEK293T ćelije se podese na 6x10<5>ćelija/ml u Freestyle (Invitrogen) medijumu u 250ml volumenu i uzgajaju se preko noći. Sledećeg dana, ove ćelije se tretiraju sa DNA:PEI (1:1) kompleksom u 0.5 ug/ml konačne DNA koncentracije. Posle 4 hrs, 250 ml medijua se doda i ćelije se uzgajaju tokom 7 dana. Kondicionirani medijum se sakupi okretanjem ćelija na dole i koncentrisanjem.
[0284] Mutanti se prečišćavaju korišćenjem raznih vrsta tehnika, uključujući, na primer, a protein A kolonu i eluiraju se pri niskom pH (3.0), glicinskim puferom. Posle neutralizacije, podvrgnu se dijalizi prema PBS.
[0285] Mutanti su takođe proizvedeni u CHO ćelijama sličnom metodologijom. Mutanti su testirani testovima vezivanja i/ili biotestovima opisanim u WO 2008/097541 i WO 2006/012627. U nekim slučajevima, testovi su izvedeni sa medijumom za kondicioniranje pre nego sa prečišćenim proteinima. Dodatne varijacije ActRIIB su opisane u U.S. Patent No.7,842,663.
[0286] Prijavljivači su stvorili ActRIIB(25-131)-hFc fuzioni protein, koji sadrži humani ActRIIB ekstracelularni domen sa N-terminalnim i C-terminalnim skraćenjima (ostaci 25-131 nativnog proteina SEQ ID NO: 1) fuzionisan sa N-krajem sa TPA lider sekvencom supstituisanom za nativnu ActRIIB lider i C-krajem sa humanim Fc domenom preko minimalnog linkera (tri glicinska ostatka) (Slika 12). Nukleotidna sekvenca koja kodira ovaj fuzioni protein je prikazana na Slici 13. Prijavljivači su modifikovali kodone i iznašli varijantu nukleinske kiseline koja kodira ActRIIB(25-131)-hFc protein čime je obezbeđeno suštinsko unapređenje u nivoima ekspresije početnih transformanata (Slika 14).
[0287] Zreli protein ima sledeću aminokiselinsku sekvencu (N-terminus je potvrđen N-terminalnim sekvenciranjem)(SEQ ID NO: 28):
Aminokiseline 1-107 su izvedene od ActRIIB.
[0288] Ekspresovani molekul je prečišćen primenom serije koraka hromatografije na koloni, uključujući na primer, tri ili više od sledećeg, ma kojim redosledom: protein A hromatografiju, Q sefaroza hromatografiju, fenilsefaroza hromatografiju, hromatografiju isključivanja prema veličini, i katijon izmenjivačku hromatografiju. Prečišćavanje se može upotpuniti filtracijom virusa i izmenom pufera.
[0289] Afiniteti nekoliko liganada za ActRIIB(25-131)-hFc i njihovih pandana pune dužine ActRIIB(20-134)-hFc ispitani su in vitro na Biacore™ instrumentu, i rezultati su zbirno prikazani u tabeli u nastavku. Kd vrednosti su dobijene putem podešavanja afiniteta u stabilnom stanju zbog veoma brze asocijacije i disocijacije kompleksa, što je sprečilo tačno određivanje koni koff. ActRIIB(25-131)-hFc vezuje aktivin A, aktivin B, i GDF11 sa velikim afinitetom.
Afiniteti liganada ActRIIB-hFc oblika:
[0290]
Primer 2: Generisanje GDF Trap
[0291] Prijavljivači su konstruisali GDF trap na sledeći način. Polipeptid koji ima modifikovan ekstracelularni domen ActRIIB (aminokiseline 20-134 u SEQ ID NO: 1 sa L79D supstitucijom) sa značajno sniženim vezivanjem aktivina A u odnosu na GDF11 i/ili miostatin (kao posledica leucin-u-aspartat supstitucije na položaju 79 u SEQ ID NO: 1) je fuzionisan sa humanim ili mišijim Fc domenom sa minimalnim linkerom (tri glicin aminokiseline) između. Konstrukcija je označena kao ActRIIB(L79D 20-134)-hFc odnosno ActRIIB(L79D 20-134)-Fc. Alternativni oblici sa glutamatom pre nego sa aspartatom na polžaju 79 izvode se na sličan način (L79E). Alternativni oblici sa alaninom pre nego sa valinom na položaju 226 u odnosu na SEQ ID NO: 44, ispod, takođe su generisani i izvedeni ekvivalentno u svakom ispitanom pogledu. Aspartat na položaju 79 (u odnosu na SEQ ID NO: 1, ili položaju 60 u odnosu na SEQ ID NO: 29) je označen dvostrukim podvučenim u nastavku. Valin na položaju 226 u odnosu na SEQ ID NO: 29 je takođe označen dvostrukim podvučenim u nastavku.
[0292] GDF trap ActRIIB(L79D 20-134)-hFc je prikazan ispod kao prečišćen iz CHO ćelijskih linija (SEQ ID NO: 29).
[0293] ActRIIB-izvedeni deo u GDF trap ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u nastavku (SEQ ID NO: 30), i taj deo bi mogao da se koristi kao monomer ili kao ne-Fc fuzioni protein u vidu monomera, dimera, ili kompleksa većeg reda.
[0294] GDF trap protein je ekspresovan u CHO ćelijskim linijama. Tri različite lider sekvence su razmotrene: (i) melitin medonosne pčele (HBML), (ii) aktivator tkivnog plazminogena (TPA), i (iii) nativna.
[0295] Izabrani oblik koristi TPA lider i ima sledeću neobrađenu aminokiselinsku sekvencu:
[0296] Ovaj polipeptid je kodirala sledeća nukleinsko kiselinska sekvenca (SEQ ID NO: 32):
[0297] Prečišćavanje se može postići serijama hromatografskih koraka na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, ma kojim redosledom: protein A hromatografiju, Q sefaroza hromatografiju, fenilsefaroza hromatografiju, hromatografiju isključivanja prema veličini, i katjon izmenjivačku hromatografiju. Prečišćavanje se može upotpuniti filtracijom virusa i izmenom pufera. U primeru šeme prečišćavanja, medijum ćelijske kulture se propušta preko protein A kolone, ispira u 150 mM Tris/NaCl (pH 8.0), zatim ispira u 50 mM Tris/NaCl (pH 8.0) i eluira sa 0.1 M glicinom, pH 3.0. Eluat niskog pH se drži na sobnoj temperaturi 30 minuta za korak uklanjanja virusa. Eluat se onda neutrališe i propušta preko Q-sefaroza jon-izmenjivačke kolone i ispira u 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, i eluira u 50 mM Tris pH 8.0, sa NaCl koncentracijom između 150 mM i 300 mM. Eluat se onda izmeni u 50 mM Tris pH 8.0, 1.1 M amonijum sulfat i propušta preko fenil sefaroza kolone, ispira, i eluira u 50 mM Tris pH 8.0 sa amonijum sulfatom između 150 i 300 mM. Eluat se podvrgne dijalizi i filtrira se za upotrebu.
[0298] Dodatne GDF traps (ActRIIB-Fc fuzioni proteini modifikovani tako da smanjuju odnos aktivin A vezivanja u odnosu na miostatin ili GDF 11 vezivanje) su opisani u WO 2008/097541 i WO 2006/012627.
Primer 3: Biotestiranje za GDF-11- i aktivin-posredovano signaliziranje
[0299] A-204 reporter gen test je korišćen za ispitivanje efekata ActRIIB-Fc proteina i GDF traps na signaliziranje GDF-11 i aktivina A. Ćelijska linija: humani rabdomiosarkom (mišićnog porekla). Reporter vektor: pGL3(CAGA)12 (opisan u Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100). CAGA12 motiv je prisutan u TGF-beta odgovarajućim genima (npr., PAI-1 gen), tako da je ovaj vektor za opštu upotrebu za faktore koji signaliziraju preko SMAD2 i 3.
[0300] Dan 1: Podeliti A-204 ćelije u ploči sa 48-pozicija.
[0301] Dan 2: A-204 ćelije transfektovati sa 10 ug pGL3(CAGA)12 ili pGL3(CAGA)12(10 ug) pRLCMV (1 µg) i Fugene.
[0302] Dan 3: Dodati faktore (razblažene u medijumu 0.1 % BSA). Inhibitore treba prethodno inkubirati sa faktorima tokom 1 hr pre dodavanja ćelijama. Šest sati kasnije, ćelije se ispiraju sa PBS i liziraju.
[0303] Ovo prati test luciferaze. U odsustvu bilo kakvih inhibitora, aktivin A pokazuje 10-puta stimulaciju ekspresije reporter gena i ED50 ~ 2 ng/ml. GDF-11: 16 puta stimulaciju, ED50: ~1.5 ng/ml.
[0304] ActRIIB(20-134) je potentni inhibitor aktivina A, GDF-8, i GDF-11 aktivnosti u ovom testu. Kako je u nastavku opisano, ActRIIB varijante su takođe testirane ovim testom.
Primer 4: ActRIIB-Fc varijante, aktivnost u ćelijama
[0305] Aktivnost ActRIIB-Fc proteina i GDF traps je testirana u testu na ćelijama kako je gore opisano. Rezultati su zbirno prikazani u tabeli u nastavku. Neke varijante su testirane u različitim konstrukcijama C-terminalnog skraćivanjas. Kako je gore diskutovano, skraćenja od pet ili petnaest aminokiselina prouzrokuju smanjenje u aktivnosti. GDF traps (L79D i L79E varijante) pokazuju suštinski gubitak u inhibiciji aktivina A dok zadržavaju inhibiciju GDF-11 skoro kao divlji tip.
Rastvorljivi ActRIIB-Fc se vezuje za GDF11 i Aktivin A:
[0306]
[0307] Nekoliko varijanti je bilo ispitano na serumski polu-život kod pacova. ActRIIB(20-134)-Fc ima serumski polu-život od otprilike 70 sati. ActRIIB(A24N 20-134)-Fc ima serumski poluživot od oko 100-150 sati. Bilo koja od gore testiranih varijanti, može da se kombinuje sa GDF trap molekulima.
Primer 5: GDF-11 i Aktivin A vezivanje
[0308] Vezivanje izvesnih ActRIIB-Fc proteina i GDF traps za ligande je testirana Biacore™ testom.
[0309] ActRIIB-Fc varijante ili divlji tip proteina se zarobe na sistemu primenom anti-hFc antitela. Ligandi se injektuju i propuste preko zarobljenih receptor proteina. Rezultati su zbirno prikazani u tabeli u nastavku.
Specifičnost vezivanja liganda IIB varijanti
[0310]
[0311] Ovi podaci, dobijeni testiranjem bez ćelija, potvrđuju podatke testa na ćelijama, demonstrirajući da A24N varijanta zadržava aktivnost vezivanja liganda koja je slična onoj kod ActRIIB(20-134)-hFc molekula i da L79D ili L79E molekul zadržavaju vezivanje miostatina i GDF11 ali pokazuju značajan pad (nije merljiv kvantitativno) vezivanja za aktivin A.
[0312] Generisane su i testirane druge varijante, kako je prikazano u WO2006/012627. Videti, npr., pp. 59-60, korišćenjem liganada kuplovanih sa uređajem i protokom receptora preko kuplovanih liganada. Pre svega, K74Y, K74F, K74I (i verovatno druge hidrofobne supstitucije na K74, kao K74L), i D80I, dovode do pada u odnosu vezivanje aktivina A (ActA) prema vezivanju GDF11, u odnosu na molekul divljeg tipa K74. Tabela sa podacima koji se odnose na ove varijante je u nastavku:
Rastvorljive ActRIIB-Fc varijante se vezuju za GDF11 i Aktivin A (BiacoreTM test)
[0313]
Primer 6: Generisanje GDF Trap sa skraćenim ActRIIB ekstracelularnim domenom
[0314] GDF trap se označava kao ActRIIB(L79D 20-134)-hFc, generisan N-terminalnom fuzijom TPA lider sa ActRIIB ekstracelularnim domenom (ostaci 20-134 u SEQ ID NO:1) koji sadrži leucin-u-aspartat supstituciju (na ostatku 79 u SEQ ID NO:1) i C-terminalnu fuziju humanog Fc domena sa minimalnim linkerom (tri glicinska ostatka) (Slika 3). Nukleotidna sekvenca koja odgovara ovom fuzionom proteinu je prikazana na Slici 4.
[0315] GDF trap sa skraćenim ActRIIB ekstracelularnim domenom, označen kao ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, generisan N-terminalnom fuzijom TPA lider sa skraćenim ekstracelularnim domenom (ostaci 25-131 u SEQ ID NO:1) koji sadrži leucin-u-aspartat supstituciju (na ostatku 79 u SEQ ID NO:1) i C-terminalnu fuziju humanog Fc domena sa minimalnim linkerom (tri glicinska ostatka) (Slika 5, SEQ ID NO: 50). Jedna nukleotidna sekvenca koja kodira ovaj fuzioni protein je prikazana na Slici 6 (SEQ ID NO: 51), i alternativna nukleotidna sekvenca koja kodira tačno isti fuzioni protein je prikazana na Slici 9 (SEQ ID NO: 55).
Primer 7: Selektivno vezivanje liganda GDF Trap sa dvostruko skraćenim ActRIIB ekstracelularnim domenom
[0316] Afinitet GDF traps i drugih ActRIIB-hFc proteina za nekoliko liganada je ispitan in vitro sa Biacore™ instrumentom. Rezultati su zbirno prikazani u tabeli u nastavku. Kd vrednosti su dobijene podešavanjem afiniteta u stabilnom stanju zbog veoma brze asocijacije i disocijacije kompleksa, što bi sprečilo pouzdano određivanje koni koff.
Selektivnost ActRIIB-hFc varijanti za ligande:
[0317]
[0318] GDF trap sa skraćenim ekstracelularnim domenom, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, je imao jednaku ili je nadmašio ligand-selektivnost ispoljenu dužom varijantom, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc, sa naglašenim gubitkom vezivanja za aktivin A, delimičnim gubitkom za aktivin B, i skoro potpunim zadržavanjem GDF11 vezivanja u poređenju sa ActRIIB-hFc partnerima kojima nedostaje L79D supstitucija. Zapaziti da samo skraćivanje (bez L79D supstitucije) nije izmenilo selektivnost među ligandima koji su ovde prikazani [uporediti ActRIIB(L79 25-131)-hFc sa ActRIIB(L79 20-134)-hFc]. ActRIIB(L79D 25-131)-hFc takođe zadržava snažno do intermedijerno vezivanje za Smad 2/3 signalizirajući ligand GDF8 i Smad 1/5/8 ligande BMP6 i BMP10.
Primer8: GDF Trap izvedena iz ActRIIB5
[0319] Drugi su prijavili rezervni, rastvorljivi oblik ActRIIB (označen kao ActRIIB5), u kome je ekson 4, uključujući ActRIIB transmembranski domen, zamenjen različitom C-terminalnom sekvencom (videti, npr., WO 2007/053775).
[0320] Sekvenca nativnog humanog ActRIIB5 bez njegove lider je sledeća:
[0321] Supstitucija leucin-u-aspartat, ili druge kiselinske supstitucije, mogu da se izvedu u nativnom položaju 79 (podvučen) kako je opisano za konstrukciju varijante ActRIIB5(L79D), koja ima sledeću sekvencu:
[0322] Ova varijanta može biti povezana sa humanim Fc (dvostruko podvučeno) sa TGGG linkerom (jednom podvučeno) da bi se stvorio humani ActRIIB5(L79D)-hFc fuzioni protein koji ima sledeću sekvencu:
[0323] Ova konstrukcija se može izraziti u CHO ćelijama.
Primer 9: Efekat GDF Trap u JAK2V617F životinjskom modelu
[0324] Transgeni JAK2V617F mutant miševi [A linija kako je opisano u Xing et al. (2008) Blood 111: 5109-5117] su korišćeni za razumevanje efekata ActRIIB(L79D 25-131)-Fc na mijelofibrozu.
[0325] Za razumevanje otpočinjanja i progresije mijelofibrozne bolesti, upoređeni su kompletnih krvni brojevi i stepen fibroze kod JAK2V617F miševa, u raznim starosnim grupama, sa podacima dobijenim od kontrolnih životinja (divlji tip miševa koji je bio starosno podudaran). Nivoi eritrocita (RBC) i trombocita su bili povišeni kod JAK2V617F miševa u svim starosnim grupama u poređenju sa divljim tipom, sa trendom ka rastućim nivoima kod mutantnih životinja između 2 do 5 meseci nakon progresivnog pada između 8 do 12 meseci. Fibroza je bila detektabilna u koštanoj srži JAK2V617F miševa počevši oko 5 meseci, što se starenjem pogoršava. JAK2V617F miševi takođe ispoljavaju splenomegaliju oko 3 do 4 meseca, koja se takođe starenjem pogoršava.
[0326] Za GDF trap studiju, tretman je započeo sa 12 meseci starosti, što korespondira starijem stadijumu mijelofibroze. Miševi su grupisani u jednu od dve grupe: i) tretman JAK2V617F miševa sa ActRIIB(L79D 25-131)-Fc po doznoj šemi od 10 mg/kg dva puta nedeljno; i ii) tretman JAK2V617F miševa vehikulumom (TBS) dva puta nedeljno (tj., kontrolne životinje). Sledećih 10 nedelja, ActRIIB(L79D 25-131)-Fc tretirane životinje su ispoljile smanjenu veličinu slezine (-12.5%) u poređenju sa kontrolnim životinjama. Dosledno ovom zapažanju, histopatologija je otkrila pad ekstramedularne hematopoeze u slezini ActRIIB(L79D 25-131)-Fc tretiranih miševa u poređenju sa kontrolnim životinjama. Histopatologija je isto tako pokazala pad fibroze kostne srži kod ActRIIB(L79D 25-131)-Fc tretiranih miševa u poređenju sa kontrolnim životinjama.
[0327] Prema tome, tretman sa GDF trap je efikasan u poboljšavanju raznih komplikacija mijelofibroze u ovom JAK2V617F modelu, posebno u smanjivanju splenomegalije, ekstramedularne hematopoeze, i fibroze. Tako, ovi podaci ukazuju na to da ActRIIB antagonisti mogu da se primenjuju za lečenje mijelofibroze. Na primer, ActRIIB antagonisti mogu biti posebno korisni u tretmanu različitih komplikacija mijelofibroze uključujući, na primer, smanjivanju splenomegalije, smanjivanju ekstramedularne hematopoeze, povećanju nivoa eritrocita, i/ili smanjivanju fibroze (npr., fibroze kostne srži).
Primer 10: Efekat GDF Trap kod životinja tretiranih ruksolitinibom
[0328] Ruksolitinib je inhibitor Janus kinaze koji je odobren za tretman mijelofibroze intermedijarnog ili visokog rizika. Naročito, ruksolitinib pokazuje značajne efekte u smanjivanju veličine slezine i ublažavanju simptoma povezanih sa splenomegalijom kod pacijenata sa mijelofibrozom. Međutim, zapaženi su brojni hematološki sporedni efekti kod pacijenata tretiranih sa ruksolitinibom uključujući, na primer, anemiju. Devet meseci stari C57BL/6 miševi su korišćeni za razumevanje efekata ActRIIB(L79D 25-131)-Fc tretmana na različite hematološke parametre kod ruksolitinibom tretiranih miševa.
[0329] Za ovo ispitivanje, tretman je otpočeo u starosti od 6-7 meseci. Miševi su podeljeni u četiri grupe: i) tretman sa ActRIIB(L79D 25-131)-Fc po šemi doziranja od 10 mg/kg dva puta nedeljno; ii) tretman sa ruksolitinibom po šemi doziranja od 60 mg/kg dva puta dnevno; iii) tretman sa ActRIIB(L79D 25-131)-Fc po šemi doziranja od 10 mg/kg dva puta nedeljno i ruksolitinib po šemi doziranja od 60 mg/kg dva puta dnevno; i iv) tretman sa vehikulumom (TBS) dva puta nedeljno (tj., kontrolne životinje). Posle četiri nedelje tretmana, zapaženo je da ActRIIB(L79D 25-131)-Fc miševi imaju povećanje eritrocita (-15%) i nivoa hemoglobina (-13%) u poređenju sa kontrolnim (TBS tretirani) miševima, demonstrirajući da ActRIIB(L79D 25-131)-Fc povećava eritropoetsku aktivnost kod C57BL/6 miševa. Suprotno, tretman sa ruksolitinibom doveo je do pada eritrocita (-4%) i nivoa hemoglobina (~4%) u poređenju sa kontrolnim životinjama. Miševi tretirani sa ActRIIB(L79D 25-131)-Fc zajedno sa ruksolitinibom pokazuju porast eritrocita (-8%) i nivoa hemoglobina (~5%) u poređenju sa kontrolnim životinjama.
[0330] Ovi podaci pokazuju da ActRIIB(L79D 25-131)-Fc može zadržati ruksolitinibindukovanu anemiju kod normalnih, zdravih miševa. Zbog toga, podaci sugerišu da ActRIIB antagonisti mogu biti korisni u ublažavanju anemija indukovanih inhibitorima Janus kinaze kod brojnih populacija pacijenata uključujući, na primer, pacijente sa mijelofibrozom koji su bili ili podležu tretmanu sa jednim ili više inhibitora Janus kinaze. Prema tome, ActRIIB antagonisti mogu biti korisni kao deo zajedničke terapije sa inhibitorima Janus kinaze u lečenju različitih populacija pacijenata uključujući, na primer, pacijente sa mijelofibrozom koji su bili ili podležu tretmanu sa jednim ili više inhibitora Janus kinaze, naročito onih koji ispoljavaju anemiju.
[0331] Dok su raspravljalo o specifičnim realizacijama predmeta, gornji opis je ilustrativan, a ne ograničavajući. Mnoge varijacije će postati očigledne stručnjacima u ovoj oblasti nakon pregleda opisa i dole navedenih zahteva. Puni obim pronalaska treba da bude određen pozivanjem na patentne zahteve i opis, zajedno sa takvim varijacijama.
LISTA SEKVENCI
<110> ACCELERON PHARMA INC.
<120> POSTUPCI I KOMPOZICIJE ZA LEČENJE MIJELOFIBROZE
<130> 1848179-0002-111-WO1
<140> PCT/US2017/043967
<141> 2017-07-26
<150> 62/367,289
<151> 2016-07-27
<160> 74
<170> Patentna verzija 3.5
<210> 1
<211> 512
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125
1 1
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr 145 150 155 160
Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro
165 170 175
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu
180 185 190
Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln 195 200 205
Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys 210 215 220
Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys 225 230 235 240
His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn
245 250 255
Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser
260 265 270
Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys 275 280 285
His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp 290 295 300
Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg 305 310 315 320
Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val
325 330 335
1 2
Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro
340 345 350
Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu 355 360 365
Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile 370 375 380
Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys 385 390 395 400
Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu
405 410 415
Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val
420 425 430
His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro 435 440 445
Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp 450 455 460
Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu 465 470 475 480
Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu
485 490 495
Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile
500 505 510
<210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15
1
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn 50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr
115
<210> 3
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn 50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80
1 4
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala
100
<210> 4
<211> 512
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr 145 150 155 160
1
Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro
165 170 175
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu
180 185 190
Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln 195 200 205
Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys 210 215 220
Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys 225 230 235 240
His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn
245 250 255
Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser
260 265 270
Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys 275 280 285
His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp 290 295 300
Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg 305 310 315 320
Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val
325 330 335
Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro
340 345 350
Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu 355 360 365
Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile 370 375 380
1
Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys 385 390 395 400
Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu
405 410 415
Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val
420 425 430
His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro 435 440 445
Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp 450 455 460
Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu 465 470 475 480
Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu
485 490 495
Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile
500 505 510
<210> 5
<211> 115
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser Ser 35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn 50 55 60
1
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr
115
<210> 6
<211> 100
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser Ser 35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn 50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala
100
<210> 7
<211> 1536
1
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
atgacggcgc cctgggtggc cctcgccctc ctctggggat cgctgtgcgc cggctctggg 60
cgtggggagg ctgagacacg ggagtgcatc tactacaacg ccaactggga gctggagcgc 120
accaaccaga gcggcctgga gcgctgcgaa ggcgagcagg acaagcggct gcactgctac 180
gcctcctggc gcaacagctc tggcaccatc gagctcgtga agaagggctg ctggctagat 240
gacttcaact gctacgatag gcaggagtgt gtggccactg aggagaaccc ccaggtgtac 300
ttctgctgct gtgaaggcaa cttctgcaac gaacgcttca ctcatttgcc agaggctggg 360
ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca ccctgctcac ggtgctggcc 420
tactcactgc tgcccatcgg gggcctttcc ctcatcgtcc tgctggcctt ttggatgtac 480
cggcatcgca agccccccta cggtcatgtg gacatccatg aggaccctgg gcctccacca 540
ccatcccctc tggtgggcct gaagccactg cagctgctgg agatcaaggc tcgggggcgc 600
tttggctgtg tctggaaggc ccagctcatg aatgactttg tagctgtcaa gatcttccca 660
ctccaggaca agcagtcgtg gcagagtgaa cgggagatct tcagcacacc tggcatgaag 720
cacgagaacc tgctacagtt cattgctgcc gagaagcgag gctccaacct cgaagtagag 780
ctgtggctca tcacggcctt ccatgacaag ggctccctca cggattacct caaggggaac 840
atcatcacat ggaacgaact gtgtcatgta gcagagacga tgtcacgagg cctctcatac 900
ctgcatgagg atgtgccctg gtgccgtggc gagggccaca agccgtctat tgcccacagg 960
gactttaaaa gtaagaatgt attgctgaag agcgacctca cagccgtgct ggctgacttt 1020
1
ggcttggctg ttcgatttga gccagggaaa cctccagggg acacccacgg acaggtaggc 1080
acgagacggt acatggctcc tgaggtgctc gagggagcca tcaacttcca gagagatgcc 1140
ttcctgcgca ttgacatgta tgccatgggg ttggtgctgt gggagcttgt gtctcgctgc 1200
aaggctgcag acggacccgt ggatgagtac atgctgccct ttgaggaaga gattggccag 1260
cacccttcgt tggaggagct gcaggaggtg gtggtgcaca agaagatgag gcccaccatt 1320
aaagatcact ggttgaaaca cccgggcctg gcccagcttt gtgtgaccat cgaggagtgc 1380
tgggaccatg atgcagaggc tcgcttgtcc gcgggctgtg tggaggagcg ggtgtccctg 1440
attcggaggt cggtcaacgg cactacctcg gactgtctcg tttccctggt gacctctgtc 1500
accaatgtgg acctgccccc taaagagtca agcatc
1536
<210> 8
<211> 345
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
gggcgtgggg aggctgagac acgggagtgc atctactaca acgccaactg ggagctggag 60
cgcaccaacc agagcggcct ggagcgctgc gaaggcgagc aggacaagcg gctgcactgc 120
tacgcctcct ggcgcaacag ctctggcacc atcgagctcg tgaagaaggg ctgctggcta 180
gatgacttca actgctacga taggcaggag tgtgtggcca ctgaggagaa cccccaggtg 240
tacttctgct gctgtgaagg caacttctgc aacgaacgct tcactcattt gccagaggct 300
gggggcccgg aagtcacgta cgagccaccc ccgacagccc ccacc
345
1
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
1 1
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220
Lys
225
<210> 10
<211> 223
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 65 70 75 80
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140
1 2
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220
<210> 11
<211> 232
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala 1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val 50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
1
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro 115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe 195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys 210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 12
<211> 279
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro 50 55 60
1 4
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 65 70 75 80
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
85 90 95
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp
100 105 110
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 115 120 125
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 130 135 140
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 145 150 155 160
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
165 170 175
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
180 185 190
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 195 200 205
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn 210 215 220
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 225 230 235 240
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser
245 250 255
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser
260 265 270
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275
1
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
1
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
peptid
<400> 14
Gly Gly Gly
1
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
peptid
<400> 15
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
peptid
<400> 16
Thr Gly Gly Gly Gly
1 5
1
<211> 5
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički peptid
<400> 17
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički peptid
<400> 18
Thr Gly Gly Gly
1
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički peptid
<400> 19
Ser Gly Gly Gly
1
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički peptid
<400> 20
1 Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> Apis mellifera
<400> 21
Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile 1 5 10 15
Ser Tyr Ile Tyr Ala
20
<210> 22
<211> 22
<212> PRT
<213> Nepoznat
<220>
<223> Opis nepoznatog:
Sekvenca aktivatora tkivnog plazminogena (TPA)
<400> 22
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro
20
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> Nepoznat
<220>
<223> Opis nepoznatog:
Izvorna liderska sekvenca
<400> 23
Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15
Ser Ser Gly Ala
20
1
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 24
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn 50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
1
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 210 215 220
Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 25
<211> 368
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 25
1 1
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn 35 40 45
Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His 50 55 60
Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys 65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
85 90 95
Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro 115 120 125
Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr 130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 210 215 220
1 2
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 360 365
<210> 26
<211> 1107
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polinukleotid
<400> 26
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
1
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240
aagggctgct ggctagatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300
gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gtccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080
agcctctccc tgtctccggg taaatga
1107
<210> 27
<211> 6
1 4
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
peptid
<400> 27
Gly Arg Gly Glu Ala Glu
1 5
<210> 28
<211> 335
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 28
Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15
Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg
20 25 30
Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45
Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60
Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80
Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly
85 90 95
Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His
100 105 110
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 115 120 125
1
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 130 135 140
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 145 150 155 160
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
165 170 175
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
180 185 190
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 195 200 205
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 210 215 220
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 225 230 235 240
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
245 250 255
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
260 265 270
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 275 280 285
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 290 295 300
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 29
<211> 343
1
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 29
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn 50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
1
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 210 215 220
Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 30
<211> 115
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 30
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15
1
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn 50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr
115
<210> 31
<211> 368
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 31
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn 35 40 45
Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His 50 55 60
1
Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys 65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
85 90 95
Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro 115 120 125
Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr 130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
1
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 360 365
<210> 32
<211> 1107
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polinukleotid
<400> 32
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240
aagggctgct gggacgatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300
gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
1 1
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gtccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080
agcctctccc tgtctccggg taaatga
1107
<210> 33
<211> 141
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45
1 2
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn 50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Gly Pro Trp Ala Ser Thr Thr Ile
100 105 110
Pro Ser Gly Gly Pro Glu Ala Thr Ala Ala Ala Gly Asp Gln Gly Ser 115 120 125
Gly Ala Leu Trp Leu Cys Leu Glu Gly Pro Ala His Glu
130 135 140
<210> 34
<211> 141
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 34
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn 50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80
1
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Gly Pro Trp Ala Ser Thr Thr Ile
100 105 110
Pro Ser Gly Gly Pro Glu Ala Thr Ala Ala Ala Gly Asp Gln Gly Ser 115 120 125
Gly Ala Leu Trp Leu Cys Leu Glu Gly Pro Ala His Glu
130 135 140
<210> 35
<211> 370
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 35
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn 50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Gly Pro Trp Ala Ser Thr Thr Ile
100 105 110
1 4
Pro Ser Gly Gly Pro Glu Ala Thr Ala Ala Ala Gly Asp Gln Gly Ser 115 120 125
Gly Ala Leu Trp Leu Cys Leu Glu Gly Pro Ala His Glu Thr Gly Gly 130 135 140
Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 145 150 155 160
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
165 170 175
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
180 185 190
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 195 200 205
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 210 215 220
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 225 230 235 240
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
245 250 255
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
260 265 270
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 275 280 285
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 290 295 300
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 305 310 315 320
1
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
325 330 335
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
340 345 350
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 355 360 365
Gly Lys
370
<210> 36
<211> 115
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 36
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn 50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val 65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
1
Lys Pro Pro
115
<210> 37
<211> 150
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 37
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Pro 50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Pro Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 38
<211> 150
<212> PRT
<213> Sus scrofa
1
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15
Val Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 39
<211> 150
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 39
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
1
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Pro Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 40
<211> 150
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60
1
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 41
<211> 150
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 41
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45
Cys Glu Gly Glu Arg Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
1
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140
Pro Val Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 42
<211> 150
<212> PRT
<213> Xenopus sp.
<400> 42
Met Gly Ala Ser Val Ala Leu Thr Phe Leu Leu Leu Leu Ala Thr Phe 1 5 10 15
Arg Ala Gly Ser Gly His Asp Glu Val Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr
20 25 30
Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Lys Thr Asn Gln Ser Gly Val Glu 35 40 45
Arg Leu Val Glu Gly Lys Lys Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser 50 55 60
Trp Arg Asn Asn Ser Gly Phe Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp 65 70 75 80
Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Ile Ala Lys Glu
85 90 95
Glu Asn Pro Gln Val Phe Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Tyr Cys Asn
100 105 110
Lys Lys Phe Thr His Leu Pro Glu Val Glu Thr Phe Asp Pro Lys Pro 115 120 125
1 1
Gln Pro Ser Ala Ser Val Leu Asn Ile Leu Ile Tyr Ser Leu Leu Pro 130 135 140
Ile Val Gly Leu Ser Met
145 150
<210> 43
<211> 150
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15
Ser Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe
20 25 30
Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu 35 40 45
Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp 50 55 60
Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu 65 70 75 80
Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp
85 90 95
Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu
100 105 110
Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn 115 120 125
Pro Val Thr Pro Lys Pro Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Leu Tyr Ser Leu 130 135 140
Val Pro Leu Met Leu Ile
145 150
1 2
<211> 154
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetička
konsenzus sekvenca
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Thr, Ala ili odsutan
<220>
<221> MOD_RES
<222> (121)..(121)
<223> Pro, Ala, Val ili Met
<400> 44
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Xaa Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu 1 5 10 15
Cys Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr
20 25 30
Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu 35 40 45
Arg Leu Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser 50 55 60
Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp 65 70 75 80
Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu
85 90 95
Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn
100 105 110
Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Xaa Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr 115 120 125
1
Glu Pro Lys Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr 130 135 140
Ser Leu Leu Pro Ile Gly Gly Leu Ser Met
145 150
<210> 45
<211> 368
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 45
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn 35 40 45
Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His 50 55 60
Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys 65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
85 90 95
Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro 115 120 125
Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr 130 135 140
1 4
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1
<210> 46
<400> 46
000
<210> 47
<400> 47
000
<210> 48
<211> 1107
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polinukleotid
<400> 48
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240
aagggctgct gggatgatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300
gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
1
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080
agcctctccc tgtccccggg taaatga
1107
<210> 49
<211> 1107
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polinukleotid
<400> 49
tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60
catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120
gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180
ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240
caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300
1
cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360
gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420
gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480
cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540
gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600
cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660
cggtgggcat gtgtgagttc caccaccggt gggggctgtc gggggtggct cgtacgtgac 720
ttccgggccc ccagcctctg gcaaatgagt gaagcgctcg ttgcagaagt tgccttcaca 780
gcagcagaag tacacctggg ggttctcctc agtggccaca cactcctgcc tatcgtagca 840
gttgaagtca tcatcccagc agcccttctt cacgagctcg atggtgccag agctgttgcg 900
ccaggaggcg tagcagtgca gccgcttgtc ctgctcgcct tcgcagcgct ccaggccgct 960
ctggttggtg cgctccagct cccagttggc gttgtagtag atgcactccc gtgtctcagc 1020
ctccccacgc ccagaggcgc cgggcgaaac gaagactgct ccacacagca gcagcacaca 1080
gcagagccct ctcttcattg catccat
1107
<210> 50
<211> 360
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 50
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr
20 25 30
Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu 35 40 45
Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp 50 55 60
Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp 65 70 75 80
Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu
85 90 95
Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu
100 105 110
Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu 115 120 125
Pro Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 130 135 140
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 210 215 220
1
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 225 230 235 240
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 305 310 315 320
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 51
<211> 1083
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polinukleotid
<400> 51
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg ccgctgagac acgggagtgc atctactaca acgccaactg ggagctggag 120
cgcaccaacc agagcggcct ggagcgctgc gaaggcgagc aggacaagcg gctgcactgc
2
tacgcctcct ggcgcaacag ctctggcacc atcgagctcg tgaagaaggg ctgctgggac 240
gatgacttca actgctacga taggcaggag tgtgtggcca ctgaggagaa cccccaggtg 300
tacttctgct gctgtgaagg caacttctgc aacgagcgct tcactcattt gccagaggct 360
gggggcccgg aagtcacgta cgagccaccc ccgacaggtg gtggaactca cacatgccca 420
ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 480
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 540
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 600
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 660
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 720
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 780
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 840
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 900
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctat 960
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1020
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 1080
tga
1083
<210> 52
<211> 1083
<212> DNA
2 1
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polinukleotid
<400> 52
tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60
catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120
gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180
ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240
caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300
cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360
gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420
gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480
cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540
gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600
cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660
cggtgggcat gtgtgagttc caccacctgt cgggggtggc tcgtacgtga cttccgggcc 720
cccagcctct ggcaaatgag tgaagcgctc gttgcagaag ttgccttcac agcagcagaa 780
gtacacctgg gggttctcct cagtggccac acactcctgc ctatcgtagc agttgaagtc 840
atcgtcccag cagcccttct tcacgagctc gatggtgcca gagctgttgc gccaggaggc 900
gtagcagtgc agccgcttgt cctgctcgcc ttcgcagcgc tccaggccgc tctggttggt 960
2 2
gcgctccagc tcccagttgg cgttgtagta gatgcactcc cgtgtctcag cggcgccggg 1020
cgaaacgaag actgctccac acagcagcag cacacagcag agccctctct tcattgcatc 1080
cat
1083
<210> 53
<211> 335
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 53
Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15
Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg
20 25 30
Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45
Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60
Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80
Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly
85 90 95
Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His
100 105 110
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 115 120 125
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
2
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 145 150 155 160
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
165 170 175
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
180 185 190
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 195 200 205
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 210 215 220
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 225 230 235 240
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
245 250 255
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
260 265 270
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 275 280 285
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 290 295 300
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
2 4
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 54
Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg 1 5 10 15
Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg
20 25 30
Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu 35 40 45
Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln 50 55 60
Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys 65 70 75 80
Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly
85 90 95
Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105
<210> 55
<211> 1083
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polinukleotid
<400> 55
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg ccgccgaaac ccgcgaatgt atttattaca atgctaattg ggaactcgaa 120
cggacgaacc aatccgggct cgaacggtgt gagggggaac aggataaacg cctccattgc 180
2
tatgcgtcgt ggaggaactc ctccgggacg attgaactgg tcaagaaagg gtgctgggac 240
gacgatttca attgttatga ccgccaggaa tgtgtcgcga ccgaagagaa tccgcaggtc 300
tatttctgtt gttgcgaggg gaatttctgt aatgaacggt ttacccacct ccccgaagcc 360
ggcgggcccg aggtgaccta tgaacccccg cccaccggtg gtggaactca cacatgccca 420
ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 480
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 540
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 600
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 660
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 720
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 780
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 840
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 900
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctat 960
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1020
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 1080
tga
1083
<210> 56
<211> 1083
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
2
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polinukleotid
<400> 56
tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60
catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120
gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180
ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240
caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300
cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360
gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420
gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480
cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540
gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600
cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660
cggtgggcat gtgtgagttc caccaccggt gggcgggggt tcataggtca cctcgggccc 720
gccggcttcg gggaggtggg taaaccgttc attacagaaa ttcccctcgc aacaacagaa 780
atagacctgc ggattctctt cggtcgcgac acattcctgg cggtcataac aattgaaatc 840
gtcgtcccag caccctttct tgaccagttc aatcgtcccg gaggagttcc tccacgacgc 900
atagcaatgg aggcgtttat cctgttcccc ctcacaccgt tcgagcccgg attggttcgt 960
ccgttcgagt tcccaattag cattgtaata aatacattcg cgggtttcgg cggcgccggg
2
cgaaacgaag actgctccac acagcagcag cacacagcag agccctctct tcattgcatc 1080
cat
1083
<210> 57
<211> 321
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polinukleotid
<400> 57
gaaacccgcg aatgtattta ttacaatgct aattgggaac tcgaacggac gaaccaatcc 60
gggctcgaac ggtgtgaggg ggaacaggat aaacgcctcc attgctatgc gtcgtggagg 120
aactcctccg ggacgattga actggtcaag aaagggtgct gggacgacga tttcaattgt 180
tatgaccgcc aggaatgtgt cgcgaccgaa gagaatccgc aggtctattt ctgttgttgc 240
gaggggaatt tctgtaatga acggtttacc cacctccccg aagccggcgg gcccgaggtg 300
acctatgaac ccccgcccac c
321
<210> 58
<211> 360
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 58
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr
20 25 30
2
Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu 35 40 45
Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp 50 55 60
Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu 65 70 75 80
Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu
85 90 95
Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu
100 105 110
Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu 115 120 125
Pro Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 130 135 140
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 225 230 235 240
2
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 305 310 315 320
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 59
<211> 1083
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polinukleotid
<400> 59
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg ccgctgagac acgggagtgc atctactaca acgccaactg ggagctggag 120
cgcaccaacc agagcggcct ggagcgctgc gaaggcgagc aggacaagcg gctgcactgc 180
tacgcctcct ggcgcaacag ctctggcacc atcgagctcg tgaagaaggg ctgctggcta 240
21
gatgacttca actgctacga taggcaggag tgtgtggcca ctgaggagaa cccccaggtg 300
tacttctgct gctgtgaagg caacttctgc aacgagcgct tcactcattt gccagaggct 360
gggggcccgg aagtcacgta cgagccaccc ccgacaggtg gtggaactca cacatgccca 420
ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 480
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 540
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 600
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 660
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 720
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 780
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 840
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 900
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctat 960
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1020
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 1080
tga
1083
<210> 60
<211> 1083
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polinukleotid
tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60
catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120
gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180
ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240
caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300
cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360
gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420
gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480
cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540
gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600
cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660
cggtgggcat gtgtgagttc caccacctgt cgggggtggc tcgtacgtga cttccgggcc 720
cccagcctct ggcaaatgag tgaagcgctc gttgcagaag ttgccttcac agcagcagaa 780
gtacacctgg gggttctcct cagtggccac acactcctgc ctatcgtagc agttgaagtc 840
atctagccag cagcccttct tcacgagctc gatggtgcca gagctgttgc gccaggaggc 900
gtagcagtgc agccgcttgt cctgctcgcc ttcgcagcgc tccaggccgc tctggttggt 960
gcgctccagc tcccagttgg cgttgtagta gatgcactcc cgtgtctcag cggcgccggg 1020
cgaaacgaag actgctccac acagcagcag cacacagcag agccctctct tcattgcatc cat
1083
<210> 61
<211> 1083
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polinukleotid
<400> 61
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg ccgccgaaac ccgcgaatgt atttattaca atgctaattg ggaactcgaa 120
cggacgaacc aatccgggct cgaacggtgt gagggggaac aggataaacg cctccattgc 180
tatgcgtcgt ggaggaactc ctccgggacg attgaactgg tcaagaaagg gtgctggctg 240
gacgatttca attgttatga ccgccaggaa tgtgtcgcga ccgaagagaa tccgcaggtc 300
tatttctgtt gttgcgaggg gaatttctgt aatgaacggt ttacccacct ccccgaagcc 360
ggcgggcccg aggtgaccta tgaacccccg cccaccggtg gtggaactca cacatgccca 420
ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 480
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 540
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 600
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 660
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 720
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 780
21
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 840
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 900
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctat 960
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1020
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 1080
tga
1083
<210> 62
<211> 1083
<212> DNA
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polinukleotid
<400> 62
tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60
catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120
gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180
ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240
caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300
cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360
gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420
gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480
cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540
gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600
cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660
cggtgggcat gtgtgagttc caccaccggt gggcgggggt tcataggtca cctcgggccc 720
gccggcttcg gggaggtggg taaaccgttc attacagaaa ttcccctcgc aacaacagaa 780
atagacctgc ggattctctt cggtcgcgac acattcctgg cggtcataac aattgaaatc 840
gtccagccag caccctttct tgaccagttc aatcgtcccg gaggagttcc tccacgacgc 900
atagcaatgg aggcgtttat cctgttcccc ctcacaccgt tcgagcccgg attggttcgt 960
ccgttcgagt tcccaattag cattgtaata aatacattcg cgggtttcgg cggcgccggg 1020
cgaaacgaag actgctccac acagcagcag cacacagcag agccctctct tcattgcatc 1080
cat
1083
<210> 63
<211> 344
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys
20 25 30
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr 35 40 45
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 50 55 60
21
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile 65 70 75 80
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu
85 90 95
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn
100 105 110
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys 115 120 125
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 130 135 140
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr 145 150 155 160
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser
165 170 175
Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys
180 185 190
Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly 195 200 205
Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr 210 215 220
Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile 225 230 235 240
Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys
245 250 255
Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu
260 265 270
21
Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn 275 280 285
Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser 290 295 300
Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser 305 310 315 320
Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe
325 330 335
Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp
340
<210> 64
<211> 317
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys
20 25 30
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr 35 40 45
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 50 55 60
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile 65 70 75 80
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu
85 90 95
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn
100 105 110
21
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys 115 120 125
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 130 135 140
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr 145 150 155 160
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser
165 170 175
Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys
180 185 190
Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly 195 200 205
Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr 210 215 220
Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile 225 230 235 240
Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys
245 250 255
Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu
260 265 270
Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn 275 280 285
Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser 290 295 300
Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn
305 310 315
<210> 65
<211> 63
21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu 1 5 10 15
Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu
20 25 30
Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 35 40 45
Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys 50 55 60
<210> 66
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Glu Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met 1 5 10 15
Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val
20 25
<210> 67
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser Ser Thr Cys Val Val 1 5 10 15
Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr
20 25
<210> 68
<211> 263
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
21
Met Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Leu Trp Pro Leu Pro Trp Gly Ala 1 5 10 15
Leu Ala Trp Ala Val Gly Phe Val Ser Ser Met Gly Ser Gly Asn Pro
20 25 30
Ala Pro Gly Gly Val Cys Trp Leu Gln Gln Gly Gln Glu Ala Thr Cys 35 40 45
Ser Leu Val Leu Gln Thr Asp Val Thr Arg Ala Glu Cys Cys Ala Ser 50 55 60
Gly Asn Ile Asp Thr Ala Trp Ser Asn Leu Thr His Pro Gly Asn Lys 65 70 75 80
Ile Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gly Leu Val His Cys Leu Pro Cys Lys
85 90 95
Asp Ser Cys Asp Gly Val Glu Cys Gly Pro Gly Lys Ala Cys Arg Met
100 105 110
Leu Gly Gly Arg Pro Arg Cys Glu Cys Ala Pro Asp Cys Ser Gly Leu 115 120 125
Pro Ala Arg Leu Gln Val Cys Gly Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Arg Asp 130 135 140
Glu Cys Glu Leu Arg Ala Ala Arg Cys Arg Gly His Pro Asp Leu Ser 145 150 155 160
Val Met Tyr Arg Gly Arg Cys Arg Lys Ser Cys Glu His Val Val Cys
165 170 175
Pro Arg Pro Gln Ser Cys Val Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys
180 185 190
Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val Pro Ser Ser Pro Gly Gln 195 200 205
Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr Ile Ser Ser Cys His Met 210 215 220
22
Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser Ile Gly Val Arg His Ala 225 230 235 240
Gly Ser Cys Ala Gly Thr Pro Glu Glu Pro Pro Gly Gly Glu Ser Ala
245 250 255
Glu Glu Glu Glu Asn Phe Val
260
<210> 69
<211> 225
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220
Lys
225
<210> 70
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 71
<211> 223
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45
22
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 65 70 75 80
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220
<210> 72
<211> 232
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val 50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro 115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe 195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys 210 215 220
22
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 73
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
polipeptid
<400> 73
Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu 1 5 10 15
Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys
20 25 30
Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu 35 40 45
Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg 50 55 60
Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys 65 70 75 80
Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala
85 90 95
Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105
<210> 74
<211> 6
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Opis veštačke sekvence: sintetički
6xHis tag
<400> 74
His His His His His His
1 5
22

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Kompozicija za upotrebu u lečenju, prevenciji, ili smanjivanju brzine progresije i/ili težine mijelofibroze ili jedne ili više komplikacija mijelofibroze kod pacijenta, pri čemu kompozicija obuhvata: a) inhibitor Janus kinaze; i b) ActRIIB antagonist, pri čemu se inhibitor Janus kinaze i ActRIIB antagonist primenjuju u efektivnoj količini, gde se inhibitor Janus kinaze bira iz grupe koju čine: ruksolitinib, fedratinib (SAR302503), monoelotinib (CYT387), pakritinib, lestaurtinib, AZD-1480, BMS-911543, NS-018, LY2784544, SEP-701, XL019 i AT-9283 i gde je ActRIIB antagonist ActRIIB polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa sekvencom koja počinje sa ostatkom koji odgovara ma kojoj od aminokiselina 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ili 29 iz SEQ ID NO: 1 i koja završava na ostatku koji odgovara ma kojoj od aminokiselina 109, 110,
111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128,
129, 130, 131, 132, 133 ili 134 u SEQ ID NO: 1; i gde ActRIIB polipeptid obuhvata kiselu aminokiselinu na aminokiselinskoj poziciji koja odgovara položaju 79 u SEQ ID NO: 1 i pri čemu ActRIIB polipeptid inhibira GDF11 bez inhibicije aktivina A.
2. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu kompozicija umanjuje jednu ili više od:
fibroze koštane srži, fibroze slezine, fibroze jetre, fibroze pluća i fibroze limfnih nodusa.
3. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu kompozicija povećava nivoe crvenih krvnih ćelija kod pacijenta, i/ili povećava nivoe hemoglobina kod pacijenta.
4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu pacijent ima anemiju i gde kompozicija leči anemiju.
5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu se pacijentu primenjuje jedna ili više transfuzija krvnih ćelija pre početka tretmana ActRIIB polipeptidom i/ili pri čemu je pacijent zavisan od transfuzije krvnih ćelija; i pri čemu kompozicija za primenu smanjuje opterećenje transfuzijama krvnih ćelija za više od 30% tokom 4 do 8 nedelja u odnosu na isto vreme pre početka tretmana ActRIIB polipeptidom.
6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu pacijent primarno ima mijelofibrozu, mijelofibrozu posle policitemije vere i/ili mijelofibrozu posle esencijalne trombocitemije.
7. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu je mijelofibroza povezana sa jednom ili više mutacija u JAK2.
8. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 7, pri čemu JAK2 mutacija je JAK2V617F.
9. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-8, pri čemu je pacijent lečen inhibitorom Janus kinaze i/ili je intolerantan na inhibitor Janus kinaze.
10. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-9, pri čemu je pacijentu dalje primenjena hidroksiurea, prethodno je lečen sa hidroksiureom, intolerantan je na hidroksiureu i/ili ima neadekvatan odgovor na hidroksiureu.
11. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-10, pri čemu je ActRIIB polipeptid odabran iz grupe koju čine:
a) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinama 29-109 u SEQ ID NO: 1;
b) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinama 25-131 u SEQ ID NO: 1;
c) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2;
d) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 3;
e) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 4;
f) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 5;
g) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 6;
h) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 30; i
i) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 54.
12. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-11, pri čemu polipeptid sadrži ostatak aspartata (D) na aminokiselinskom položaju koji odgovara poziciji 79 u SEQ ID NO: 1.
13. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-11, pri čemu polipeptid sadrži ostatak glutamata (E) na aminokiselinskom položaju koji odgovara poziciji 79 u SEQ ID NO: 1.
14. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-13, pri čemu je polipeptid fuzioni protein koji sadrži imunoglobulinski Fc domen, pri čemu je imunoglobulinski Fc domen iz IgG1 Fc domena i pri čemu fuzioni protein dalje sadrži linker domen pozicioniran između ActRIIB polipeptida i imunoglobulinskog Fc domena.
15. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu polipeptid je ActRIIB-Fc fuzioni protein koji obuhvata polipeptid odabran od:
a) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 24;
b) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 25;
c) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 28;
d) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 29;
e) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 31;
f) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 45;
g) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 50;
h) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 53; i
i) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 58.
16. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-15, pri čemu ActRIIB polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 53.
17. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-15, pri čemu ActRIIB polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53.
RS20240798A 2016-07-27 2017-07-26 Kompozicije za upotrebu u lečenju mijelofibroze RS65735B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662367289P 2016-07-27 2016-07-27
EP17835212.6A EP3490582B1 (en) 2016-07-27 2017-07-26 Compositions for use in treating myelofibrosis
PCT/US2017/043967 WO2018022762A1 (en) 2016-07-27 2017-07-26 Methods and compositions for treating myelofibrosis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65735B1 true RS65735B1 (sr) 2024-08-30

Family

ID=61017458

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240798A RS65735B1 (sr) 2016-07-27 2017-07-26 Kompozicije za upotrebu u lečenju mijelofibroze

Country Status (23)

Country Link
US (3) US20180050085A1 (sr)
EP (1) EP3490582B1 (sr)
JP (2) JP7264580B2 (sr)
KR (1) KR20190040972A (sr)
CN (1) CN109789184A (sr)
AU (1) AU2017302282B2 (sr)
BR (1) BR112019001615A2 (sr)
CA (1) CA3031909A1 (sr)
DK (1) DK3490582T3 (sr)
EA (1) EA201990226A1 (sr)
ES (1) ES2984470T3 (sr)
FI (1) FI3490582T3 (sr)
HR (1) HRP20240974T1 (sr)
HU (1) HUE067225T2 (sr)
LT (1) LT3490582T (sr)
MA (1) MA45811A (sr)
MX (1) MX2019001043A (sr)
PL (1) PL3490582T3 (sr)
PT (1) PT3490582T (sr)
RS (1) RS65735B1 (sr)
SI (1) SI3490582T1 (sr)
SM (1) SMT202400299T1 (sr)
WO (1) WO2018022762A1 (sr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2018145985A (ru) 2012-11-02 2019-02-18 Селджин Корпорейшн Антагонисты активина-actrii и их применение для лечения нарушений костной ткани и других нарушений
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
DK3227675T3 (da) 2014-12-03 2023-05-30 Celgene Corp Activin-actrii-antagonister og anvendelser til behandling af myelodysplastisk syndrom
CN108350057A (zh) 2015-05-20 2018-07-31 细胞基因公司 使用II型活化素受体配体阱的用于β-地中海贫血的体外细胞培养方法
CA3005975A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating eye disorders
EA201990226A1 (ru) 2016-07-27 2019-08-30 Акселерон Фарма Инк. Способы и композиции для лечения миелофиброза
WO2018089715A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
SMT202400437T1 (it) 2017-06-14 2024-11-15 Celgene Corp Metodi per trattare mielofibrosi associata a neoplasia mieloproliferativa e anemia
KR20250059538A (ko) 2017-11-09 2025-05-02 케로스 테라퓨틱스, 인크. 액티빈 수용체 유형 iia 변이체 및 그의 사용 방법
JP7510875B2 (ja) 2018-01-12 2024-07-04 ケロス セラピューティクス インコーポレイテッド アクチビンｉｉｂ型受容体変異体および同変異体を含む医薬組成物
KR20250133994A (ko) 2018-05-09 2025-09-09 케로스 테라퓨틱스, 인크. 액티빈 수용체 유형 iia 변이체 및 그의 사용 방법
WO2021062171A1 (en) * 2019-09-27 2021-04-01 Disc Medicine, Inc. Methods for treating anemia of chronic disease
US20220372135A1 (en) * 2019-09-27 2022-11-24 Disc Medicine, Inc. Methods for treating myelofibrosis and related conditions
US12441707B2 (en) 2019-12-30 2025-10-14 Tyra Biosciences, Inc. Indazole compounds
EP4121088A4 (en) 2020-03-20 2024-07-03 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iib variants
KR20230004515A (ko) 2020-03-20 2023-01-06 케로스 테라퓨틱스, 인크. 액티빈 수용체 유형 ii 키메라 및 이의 사용 방법
MX2022012610A (es) * 2020-04-13 2022-11-07 Celgene Corp Metodos para tratar anemia usando una trampa de ligando de receptor de activina de tipo iib (actriib) y fedratinib.
CA3177830A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Maria BECONI Anti-hemojuvelin (hjv) antibodies for treating myelofibrosis
KR20230010641A (ko) * 2020-05-15 2023-01-19 셀진 코포레이션 ACTRIIB 리간드 트랩 및 mTOR 억제제를 사용한 빈혈 치료 방법 및 조성물
US12186370B1 (en) 2020-11-05 2025-01-07 Celgene Corporation ACTRIIB ligand trap compositions and uses thereof
WO2023023345A2 (en) * 2021-08-19 2023-02-23 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type ii signaling inhibitors
WO2023108137A1 (en) * 2021-12-10 2023-06-15 Biogen Ma Inc. Modified actriib proteins and methods of use thereof
WO2025184284A1 (en) * 2024-02-27 2025-09-04 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type ii signaling inhibitors

Family Cites Families (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
FI903489A0 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Ligander med en enda sektion, receptorer innehaollande naemnda ligander, foerfaranden foer deras framstaellning samt anvaendning av liganderna och receptorerna.
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
CA2084987C (en) 1990-06-11 2007-02-13 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligands
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5707796A (en) 1990-06-11 1998-01-13 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
US5763177A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992004913A1 (en) 1990-09-13 1992-04-02 Children's Hospital Medical Center Of Northern California Method for increasing red blood cell production by treatment with activin or activin-related peptides
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
US5677196A (en) 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
US5525490A (en) 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5885574A (en) 1994-07-26 1999-03-23 Amgen Inc. Antibodies which activate an erythropoietin receptor
US5814565A (en) 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
ATE352638T1 (de) 1995-04-11 2007-02-15 Gen Hospital Corp REVERSE ßTWO-HYBRIDß-SYSTEME
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6699843B2 (en) 1995-06-07 2004-03-02 Gilead Sciences, Inc. Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to PDGF
US6423501B2 (en) 1996-12-13 2002-07-23 Beth Israel Deaconess Medical Center Calcium-independent negative regulation by CD81 of receptor signaling
US6011577A (en) 1997-06-30 2000-01-04 Polaroid Corporation Modular optical print head assembly
US6953662B2 (en) 1997-08-29 2005-10-11 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
AU8921698A (en) 1997-08-29 1999-03-16 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
US6335155B1 (en) 1998-06-26 2002-01-01 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapidly identifying small organic molecule ligands for binding to biological target molecules
EP1141708A1 (en) 1998-12-28 2001-10-10 Sunesis Pharmaceuticals Inc. Identifying small organic molecule ligands for binding
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP1147413B1 (en) 1999-01-21 2006-04-05 Metamorphix, Inc. Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor
GB9912350D0 (en) * 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
DE60042021D1 (de) 1999-07-29 2009-05-28 Gilead Sciences Inc Nukleinsäureliganden für den hepatozytischen wachstumsfaktor/dispersionsfaktor (hgf/sf) und seines c-met rezeptors
WO2001044463A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
ES2637801T3 (es) 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
PL374966A1 (en) 2002-02-21 2005-11-14 Wyeth Follistatin domain containing proteins
JP4753578B2 (ja) 2002-06-03 2011-08-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 合成抗体ファージライブラリー
US7842691B2 (en) 2002-10-15 2010-11-30 Celgene Corporation Method for the treatment of myelodysplastic syndromes using cyclopropanecarboxylic acid {2-[1-(3-ethoxy-4-methoxy-phenyl)-2-methanesulfonyl-ethyl]-3-OXO-2,3-dihydro-1 H-isoindol-4-yl}-amide
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2005028517A2 (en) 2003-05-09 2005-03-31 The General Hospital Corporation SOLUBLE TGF-β TYPE III RECEPTOR FUSION PROTEINS
WO2005025601A1 (en) 2003-09-15 2005-03-24 Monash University Follistatin isoforms and uses thereof
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CN1942483B (zh) 2004-04-13 2012-09-26 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗p型选凝素抗体
ES2561048T3 (es) 2004-07-23 2016-02-24 Acceleron Pharma Inc. Polipéptidos del receptor ActRII
US20060034831A1 (en) 2004-08-12 2006-02-16 Wyeth Combination therapy for diabetes, obesity and cardiovascular diseases using GDF-8 inhibitors
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
WO2006052842A2 (en) 2004-11-09 2006-05-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for diagnosis of myelodysplastic syndromes (mds)
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
ME00380B (me) 2005-11-23 2011-10-10 Acceleron Pharma Inc Amtagonisti aktivin-actriia i primjene za stimulaciju rasta kosti
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2007134050A2 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
WO2008030367A2 (en) 2006-09-01 2008-03-13 The General Hospital Corporation Selective myostatin inhibitors
US20100003190A1 (en) 2006-12-08 2010-01-07 Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for protecting renal tubular epithelial cells from radiocontrast nephropathy (RCN)
CN104524548A (zh) 2006-12-18 2015-04-22 阿塞勒隆制药公司 活化素-actrii拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
AU2013221910B2 (en) 2006-12-18 2016-11-17 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRII antagonists and uses for increasing red blood cell levels
US20100028332A1 (en) * 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
US9526759B2 (en) 2007-02-01 2016-12-27 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for treating or preventing breast cancer
TW201940502A (zh) 2007-02-02 2019-10-16 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
KR101871510B1 (ko) 2008-06-26 2018-06-26 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉａ 길항물질을 투약하는 방법 및 치료된 환자의 모니터링
CN107252486B (zh) 2008-06-26 2021-10-22 阿塞勒隆制药公司 激活素-actrii的拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
LT3750552T (lt) 2008-08-14 2023-06-26 Acceleron Pharma Inc. Gdf gaudyklės
US8216997B2 (en) * 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
CA2770822C (en) * 2009-08-13 2020-03-24 Acceleron Pharma Inc. Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
WO2012027065A2 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 Celgene Corporation Combination therapy for treatment of disease
WO2012060847A1 (en) 2010-11-07 2012-05-10 Targegen, Inc. Compositions and methods for treating myelofibrosis
JP6472999B2 (ja) 2011-07-01 2019-02-20 ノバルティス アーゲー 代謝障害を治療するための方法
EP3520805B1 (en) 2011-10-17 2021-03-10 Acceleron Pharma Inc. Compositions for treating myelofibrosis
JP6401172B2 (ja) 2012-10-24 2018-10-10 セルジーン コーポレイション 貧血の治療方法
CA2889209C (en) 2012-10-24 2023-08-22 Celgene Corporation Biomarker for use in treating anemia
AU2014212014A1 (en) 2013-02-01 2015-08-27 Amgen Inc. Administration of an anti-activin-A compound to a subject
US20150148345A1 (en) * 2013-11-26 2015-05-28 Gilead Sciences, Inc. Therapies for treating myeloproliferative disorders
KR102520970B1 (ko) 2014-03-21 2023-04-12 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈 b 및/또는 gdf11을 억제함으로써 적혈 혈액 세포 수준을 증가시키고 비효율적인 적혈구 생성을 치료하는 방법
MX388380B (es) 2014-04-18 2025-03-19 Acceleron Pharma Inc Composiciones para usarse en el incremento de los niveles de glóbulos rojos y el tratamiento de enfermedad de células falciformes.
TN2016000553A1 (en) * 2014-06-13 2018-04-04 Acceleron Pharma Inc Methods and compositions for treating ulcers
MA41119A (fr) 2014-12-03 2017-10-10 Acceleron Pharma Inc Méthodes de traitement de syndromes myélodysplasiques et d'anémie sidéroblastique
DK3227675T3 (da) 2014-12-03 2023-05-30 Celgene Corp Activin-actrii-antagonister og anvendelser til behandling af myelodysplastisk syndrom
DK3286206T3 (da) 2015-04-22 2021-05-03 Biogen Ma Inc Hidtil ukendte hybride actriib-ligand-trap-proteiner til behandling af muskelsvindsygdomme
WO2016183280A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 Celgene Corporation Treatment of beta-thalassemia using actrii ligand traps
WO2017024171A1 (en) 2015-08-04 2017-02-09 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating myeloproliferative disorders
EP3370754A4 (en) * 2015-11-04 2019-10-23 Acceleron Pharma Inc. METHOD FOR INCREASING ERYTHROCYTE CONCENTRATION AND TREATMENT OF INEFFICIENT ERYTHROPOIESE
CA3005975A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating eye disorders
RU2748278C2 (ru) 2016-07-15 2021-05-21 Акселерон Фарма Инк. Композиции и способы лечения легочной гипертензии
EA201990226A1 (ru) 2016-07-27 2019-08-30 Акселерон Фарма Инк. Способы и композиции для лечения миелофиброза
SMT202400437T1 (it) * 2017-06-14 2024-11-15 Celgene Corp Metodi per trattare mielofibrosi associata a neoplasia mieloproliferativa e anemia

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019522022A (ja) 2019-08-08
AU2017302282A1 (en) 2019-02-07
HUE067225T2 (hu) 2024-10-28
EP3490582A1 (en) 2019-06-05
JP7264580B2 (ja) 2023-04-25
CN109789184A (zh) 2019-05-21
HRP20240974T1 (hr) 2024-10-25
MX2019001043A (es) 2019-09-26
DK3490582T3 (da) 2024-07-29
MA45811A (fr) 2019-06-05
ES2984470T3 (es) 2024-10-29
KR20190040972A (ko) 2019-04-19
LT3490582T (lt) 2024-07-25
FI3490582T3 (fi) 2024-08-01
JP2023014373A (ja) 2023-01-26
US20210322514A1 (en) 2021-10-21
EP3490582B1 (en) 2024-06-12
EA201990226A1 (ru) 2019-08-30
SI3490582T1 (sl) 2024-09-30
PT3490582T (pt) 2024-08-21
CA3031909A1 (en) 2018-02-01
US12194076B2 (en) 2025-01-14
WO2018022762A1 (en) 2018-02-01
EP3490582A4 (en) 2020-04-01
US20250222069A1 (en) 2025-07-10
US20180050085A1 (en) 2018-02-22
PL3490582T3 (pl) 2024-09-23
BR112019001615A2 (pt) 2019-04-30
SMT202400299T1 (it) 2024-09-16
AU2017302282B2 (en) 2024-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS65735B1 (sr) Kompozicije za upotrebu u lečenju mijelofibroze
KR102603899B1 (ko) 골수형성이상 증후군 및 철적혈모구 빈혈을 치료하기 위한 방법
US20250042963A1 (en) Methods for treating myeloproliferative disorders
CN107135646B (zh) 用于治疗溃疡的方法和组合物
EP3119418B1 (en) Composition for use in a method of treating or preventing anemia by inhibiting activin b and gdf11
HK1243640B (en) Methods and compositions for treating ulcers
EA043914B1 (ru) Способы увеличения уровней эритроцитов и/или гемоглобина и лечения миелофиброза
HK40008525A (en) Methods and compositions for treating myelofibrosis