RS65746B1 - Varijabilni fragmenti antitela koji mogu da se inseriraju i modifikovani α1-α2 domeni nkg2d liganada, kao i ne-prirodni nkg2d ligandi koji se vezuju za ne-prirodne nkg2d receptore - Google Patents

Description

Opis

OSNOV PRONALASKA

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovo otkriće se uopšteno odnosi na proizvodnju polipeptida koji imaju specifična antigen-vezujuća svojstva Fv domena, na primer, na varijabilne fragmente antitela koji mogu da se inseriraju i modifikovane α1-α2 domene NKG2D liganada.

OSNOVNE INFORMACIJE

[0002] Antitelo (Ab), slika 1, takođe poznato i kao imunoglobulin (Ig), kod mnogih sisara, uključujući ljude, je veliki protein u obliku slova Y koji imuni sistem koristi za identifikaciju i neutralizaciju stranih objekata kao što su bakterije i virusi (Charles Janeway (2001). Immunobiology. (5th ed.), Chapter 3. Garland Publishing. ISBN 0-8153-3642-X. (ceo tekst u elektronskom obliku je dostupan preko NCBI Bookshelf). Antitelo prepoznaje jedinstveni deo stranog ciljnog molekula, koji je označen kao antigen. Vrh svakog kraka "Y" antitela sadrži mesto vezivanja antigena, ili paratop, (struktura analogna bravi) koji je specifičan za jedan konkretni epitop (slično analogno ključu) antigena, čime je omogućeno da se ove dve strukture precizno povežu. Koristeći ovaj mehanizam povezivanja, antitelo može da obeleži mikrob ili inficiranu ćeliju kao cilj za napad od strane drugih delova imunog sistema ili može direktno da neutrališe svoj cilj, na primer, tako što blokira deo mikroba koji je neophodan za njegovu invaziju i opstanak. Proizvodnja antitela je glavna funkcija humoralnog, ili "adaptivnog", imunog sistema. Antitela se sekretuju of strane plazma ćelija. Antitela u prirodi mogu da se javljaju u dva fizička oblika, solubilnom obliku koji se sekretuje iz ćelije i obliku vezanom za membranu koji je vezan za površinu B ćelije preko "stabla" Y.

[0003] Antitela su glikoproteini koji pripadaju superfamiliji imunoglobulina i tipično su napravljena od osnovnih strukturnih jedinica – svaka sa dva velika teška lanca i dva mala laka lanca. Postoji nekoliko različitih tipova teških lanaca antitela i nekoliko različitih vrsta antitela, koja su grupisana u različite izotipove na osnovu toga koji teški lanac poseduju. Kod sisara je poznato pet različitih izotipova antitela (Market E, Papavasiliou FN (October 2003).

"V(D)J recombination and the evolution of the adaptive immune system". PLoS Biol. 1 (1): E16. doi:10.1371/journal.pbio.0000016. PMC 212695. PMID 14551913). Iako je opšta struktura svih antitela veoma slična, mali region na vrhu svakog kraka proteina u obliku slova Y je izuzetno varijabilan, dozvoljavajući milionima antitela sa malo drugačijim strukturama vrha, ili mestima za vezivanje antigena, da postoje. Ovaj region je poznat kao hipervarijabilni ili varijabilni region. Svaka od ovih prirodnih varijanti može da se veže za drugačiji antigen. Ova ogromna raznolikost antitela omogućava imunom sistemu da se adaptira i prepozna jednako širok spektar antigena (Hozumi N, Tonegawa S (1976). "Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73 (10): 3628-3632. doi:10.1073/pnas.73.10.3628. PMC 431171. PMID 824647.)

[0004] Prirodni Ig molekul u obliku slova "Y" sastoji se od četiri polipeptidna lanca; dva identična teška lanca i dva identična laka lanca povezana disulfidnim vezama, slika 1. Svaki teški lanac ima dva glavna regiona, konstantni region (CH) i varijabilni region (VH). Konstantni region je u suštini identičan u svim antitelima istog izotipa, ali se razlikuje u antitelima različitih izotipova. Laki lanac takođe ima dva sukcesivna domena: manji konstantni region (CL) i varijabilni region (VL) (Woof J, Burton D (2004). "Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures." Nat Rev Immunol 4 (2): 89-99. doi: 10.10 38/nri 1266. PMID 15040582).

[0005] Neki delovi antitela imaju iste funkcije. Svaki od dva kraka Y, na primer, sadrži mesta koja mogu da se vežu za antigene i, tako, prepoznaju specifične strane objekte. Ovaj region antitela se naziva Fv (fragment, varijabilni) region. Sastoji se od jednog varijabilnog domena iz teškog lanca (VH) i jednog varijabilnog regiona iz lakog lanca (VL) antitela (Hochman J, Inbar D, Givol D (1973). An active antibody fragment (Fv) composed of the variable portions of heavy and light chains. Biochemistry 12 (6): 1130-1135. doi:10.1021/bi00730a018. PMID 4569769). Paratop je oblikovan na jednom kraju Fv i predstavlja region za vezivanje za antigene. Sastoji se od varijabilnih petlji β-lanaca, po tri na VLi na VHi odgovoran je za vezivanje za antigen, slika 2. Ovih 6 petlji su označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR regioni) (North B, Lehmann A, Dunbrack RL (2010). "A new clustering of antibody CDR loop conformations". J Mol Biol 406 (2): 228-256. doi:10.1016/j.jmb.2010.10.030. PMC 3065967. PMID 21035459).

[0006] Korisni polipeptidi koji poseduju specifičnu antigen-vezujuću funkciju vezivanja antigena mogu da budu izvedeni iz CDR regiona varijabilnih regiona antitela. Ova dva varijabilna domena antitela, jedan iz lakog lanca (VL) i jedan iz teškog lanca (VH), svaki sa po 3 CDR regiona, mogu da se spoje u tandemski, u bilo kom redosledu, pomoću samo jednog kratkog linker peptida od 10 do oko 25 amino-kiselina, kako bi se kreirao linearni jednolančani varijabilni fragment (scFv) polipeptida koji sadrži po jedan varijabilni domen iz teškog i lakog lanca, slika 3 (Bird, R. E., Hardman, K. D., Jacobson, J. W., Johnson, S., Kaufman, B. M., Lee, S. M., Lee, T., Pope, S. H., Riordan, G. S., and Whitlow, M. (1988) Single-chain antigen-binding proteins, Science 242, 423-426; Huston, J. S., Levinson, D, Mudgett-Hunter, M, Tai, M-S, Novotny, J, Margolies, M.N., Ridge, R., Bruccoleri, RE., Haber, E., Crea, R., and Opperman, H. (1988). Protein engineering of antibody binding sites: Recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. PNAS 85: 5879-5883).

[0007] Linker je obično bogat glicinom, kako bi bio fleksibilan, kao i serinom, treoninom ili naelektrisanim amino-kiselinama, kako bi bio solubilan, i može da poveže ili N-terminus VHsa C-terminusom VL, ili vice versa. Ovaj protein zadržava specifičnost originalnog imunoglobulina, uprkos tome što su uklonjeni konstantni regioni i uveden samo jedan linker. Ovaj format omogućava da prosečan stručnjak u oblasti tehnologije rekombinantne DNK genetički fuzioniše linearni scFv sa N- ili C-terminusom roditeljskog proteina kako bi se roditeljskom proteinu obezbedila antigen-vezujuća svojstva koja ima scFv. Postoje brojni drugi predloženi ili kreirani aranžmani polivalentnih i tandemskih scFv regiona, ali je važno da, kao što je opisano u nastavku teksta, svi imaju najmanje dva prostorno udaljena terminusa, slika 4 (Le Gall, F.; Kipriyanov, SM; Moldenhauer, G; Little, M (1999). "Di-, tri- and tetrameric single chain Fv antibody fragments against human CD19: effect of valency on cell binding". FEBSLetters 453 (1): 164-168. doi:10.1016/S0014-5793(99)00713-9. PMID 10403395).

[0008] US 2015-0165065 A1 opisuje ne-prirodne MIC proteine. Sistemska mutacija i termodinamička analiza centralnih tirozinskih parova u interakcijama polispecifičnog NKG2D receptora opisana je kod autora Culpepper, D J et al. 2011. Molecular Immunology, Pergamon, GB 48(4): 516-523. Činjenica da T ćelije izmenjene inženjeringom pomoću himernih antigen-receptora koji ciljaju NK2GD ligande, prikazuju letalnu toksičnost kod miševa, opisana je kod autora Vanseggelen, H et al. 2015. Molecular Therapy, 23(10): 1600KRATAK OPIS PRONALASKA

[0009] Pronalazak obezbeđuje ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen prirodnog molekula NKG2D liganda, pri čemu navedeni modifikovani α1-α2 domen sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 90, 91, 92, 93, 94, 95 ili 96.

[0010] Reference na postupke lečenja u narednim paragrafima ovog opisa treba tumačiti kao reference na ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen prirodnog molekula NKG2D liganda prema predmetnom pronalasku, i njihpve farmaceutske kompozicije i lekove, za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom (ili za dijagnozu).

[0011] Predmetno otkriće se odnosi na modifikovane α1-α2 domene NKG2D liganada, vezane za polipeptide, na primer za antitela ili fragmente antitela. Predmetno otkriće se takođe odnosi na antigen-vezujuće peptide dobijene od varijabilnih domena antitela lakog i teškog lanca, koji sadrže dva linker regiona i podeljeni varijabilni domen.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0012] Patent ili patentna prijava sadrže najmanje jedan crtež koji je urađen u boji. Patentni zavod će na zahtev i po plaćanju neophodne takse, obezbediti kopije objave ovog patenta ili patentne prijave sa crtežom(ima) u boji.

Slika 1. Skica tipičnog sisarskog antitela koja prikazuje njegovu strukturu u obliku slova Y i strukturne komponente.

Slika 2. Skica strukture Fv regiona prirodnog sisarskog antitela koja prikazuje 3 obeležena (regiona koji određuju komplementarnost) CDR regiona iz VHi 3 neobeležene petlje iz VLCDR regiona, which formiraju paratop ili antigen-vezujuće mesto.

Slika 3. Skica dve moguće strukture jednolančanog varijabilnog fragmenta (scFv), sa antigen-vezujućim mestima, uključujući N-terminus sa leve strane i C-terminus sa desne strane. Jednini linker region, ili linker peptid u svakom scFv prikazan je kao strelica.

Slika 4. Polivalentni jednolančani varijabilni fragmenti (scFv' fragmenti). Struktura dvovalentnih (gore) i trovalentnih (dole) scFv fragmenata, u formatu tandema (levo) i di-/trimerizacije (desno). Uočava se da svaki ima 2, ili više, prostorno udaljena slobodna terminusa.

Slika 5. Dijagram varijabilnog fragmenta, iFv, koji može da se inserira. Dijagram varijabilnog fragmenta, iFv, koji može da se inserira. (A) Struktura varijabilnih lakih (VL) i varijabilnih teških (VH) domena iz FGFR3-vezujućeg antitela koja pokazuje topologiju domena u iFv formatu. Sive strelice predstavljaju 2 linker regiona (LR), od kojih se jedan, i samo jedan, tradicionalno koristi za povezivanje VL i VH terminusa, kako bi se kreirao scFv. LR sa ivicom u vidu tačkaste linije povezuje C-terminus VL sa N-terminusom VH (vidi se iza molekula). LR sa ivicom u vidu pune linije povezuje C-terminus VH sa N-terminusom VL. Segmenti podeljenog VL domena su označeni kao Nt i Ct, kao što je opisano u tekstu. Kao rezultat kreiranja ne-prirodnog para N- i C-terminusa između lanca 1 (S1) i lanca 2 (S2), VL je podeljen na N-terminalni segment (VLN) i C-terminalni segment (VLC). 6 CDR regiona iz VL i VH su predstavljeni kao petlje na vrhu slike. (B) Šema rasporeda domena za inserciju iFv fragmenta u petlju 1 (L1) MICA-α3 sa ili bez spejserskog regiona (SR). IFv može na sličan način da se inserira i u petlju 2 (L2) i/ili petlju 3 (L3).

Slika 6. Titracione krive za vezivanje modifikovanih sMICA molekula koji se vezuju za bunarčiće obložene sa FGFR3. Vezani sMICA je detektovan putem ELISA testa u kome se koristi NKG2D-Fc, kako bi se potvrdila bispecifična aktivnost. Obe verzije inseriranih varijabilnih fragmenata (MICA-α3-iFv.1 i MICA-α3-iFv.2) su vezivale FGFR3 uporedivo sa C-terminalnom fuzijom scFv (MICA-scFv).

Slika 7. Termička stabilnost MICA-α3-iFv.2. ELISA krive titracije vezivanja MICA-scFv (A) ili MICA-α3-iFv.2 (B) za bunarčiće obložene sa FGFR3, nakon izlaganja naznačenim temperaturama (stepeni Celzijusa) tokom 1 sata. MICA-α3-iFv je pokazao snažno vezivanje za FGFR3 nakon izlaganja temperaturi od 80°C, dok je MICA-scFv izgubio značajnu aktivnost nakon izlaganja temperaturi od 70°C.

Slika 8. Testovi NK-posredovanog liziranja ciljnih ćelija. NKL efektorske ćelije su ko-inkubirane sa ciljnim ćelijama P815 koje su tretirane kalceinom i eksprimiraju FGFR3, pri odnosu efektor:cilj od 15:1. Povećanje koncentracije MICA negativne kontrole (sMICA) nije imalo uticaja na liziranje ciljnih ćelija, dok su naznačene varijante MICA-α3-iFv koje se vezuju za FGFR3 stimulisale liziranje ciljnih ćelija. U poređenju sa MICA-scFv, obe varijante MICA-α3-iFv su obavile usmeravanje ka intenzivnijem liziranju ciljnih ćelija.

Slika 9. Aktivnost ciljanog vezivanja i liziranja ćelija CD20-specifične sMICA varijante. MICA-α3-iFv.3 je pokazala vezivanje za bunarčiće obložene sa CD20 koje je moguće titrirati u ELISA testu (A), a takođe je poboljšala NK-posredovano liziranje Ramos ćelija koje eksprimiraju CD20 (B). U (B), NKL efektorske ćelije su koinkubirane sa Ramos ćelijama koje su tretirane kalceinom i eksprimiraju CD20, pri odnosu efektor:cilj od 15:1, i rastućim koncentracijama bilo negativne kontrole (sMICA) ili MICA-α3-iFv.3.

Slika 10. Titracione krive za NKG2DL-α3-iFv.2 proteine koji se vezuju za bunarčiće obložene sa FGFR3. Vezani protein je detektovan putem ELISA testa u kome se koristi NKG2D-Fc, kako bi se potvrdila bispecifična aktivnost. Sve verzije testiranih NKG2DL-α3-iFv.2 proteina (OMCP, ULBP1, 2, 3, 4, 6) vezivale su FGFR3 na sličan način.

Slika 11. Testovi NK-posredovanog liziranja ciljnih ćelija. NKL efektorske ćelije su ko-inkubirane sa ciljnim ćelijama P815 koje su tretirane kalceinom i eksprimiraju FGFR3, pri odnosu efektor:cilj od 15:1. Povećanje koncentracije MICA negativne kontrole (sMICA) nije imalo uticaja na liziranje ciljnih ćelija, dok je svaki naznačeni NKG2DL-α3-iFv.2 protein stimulisao liziranje ciljnih ćelija.

Slika 12. Strukturno usmerena mutageneza α1-α2 domena MICA za pojačan afinitet NKG2D. (A) Struktura α1-α2 domena MICA (PDB 1HYR) sa NKG2D-vezujućom površinom mapiranom na 57 ostataka koji su obojeni tamno sivom bojom. (B) Šest pozicija je identifikovano kao ključna mesta za afinitetne mutacije za NKG2D. Amino-kiselinski ostaci divljeg tipa su obeleženi, a njihovi bočni lanci su prikazani kao tamno sive sfere.

Slika 13. NKG2D-Fc kompetitivni ELISA testovi za rangiranje α1-α2 varijanti po afinitetu. (A) Podaci o titraciji za panel α1-α2 varijanti sa različitim afinitetima (15-18), divljeg tipa (WT) ili WED solubilnih MICA proteina koji inhibiraju vezivanje humanog NKG2D-Fc za ploče obložene sa MICA. (B) Isti set proteina iz (A), titriran pomoću mišjeg NKG2D-Fc. U obe varijante testa, 15, 16, 17 i 18 pokazuju IC50vrednosti značajno manje i od WT i WED proteina. Ravnotežne IC50vrednosti su prikazane u tabeli 3.

Slika 14. Analiza kinetike asocijacije i disocijacije za α1-α2 varijante koje se vezuju za NKG2D, mereno interferometrijom biosloja na instrumentu Octet. Kinetički tragovi za panel α1-α2 varijanti. Faze asocijacije i disocijacije su fitovane korišćenjem jedne eksponencijalne jednačine vezivanja 1:1, a konstante brzine asocijacije i disocijacije izvedene iz fitovanja su prikazane u tabeli 3.

Slika 15. Test NK-posredovanog ubijanja ciljnih ćelija za α1-α2 varijante za ciljanje na ciljne ćelije koje eksprimiraju FGFR3. NKL efektorske ćelije su ko-inkubirane sa ciljnim ćelijama P815 koje su tretirane kalceinom i eksprimiraju FGFR3, pri odnosu efektor:cilj od 15:1. Rastuće koncentracije MICA negativne kontrole (sMICA) nisu imale uticaja na liziranje ciljnih ćelija, dok su naznačene α1-α2 varijante stimulisale liziranje ciljnih ćelija. U odnosu na WT i WED-MICA, varijante 16, 17 i 18 su pokazale značajno povećano ubijanje pri niskim koncentracijama.

Slika 16. Strukturno usmerena mutageneza α1-α2 domena MICA za pojačan afinitet prema NKG2D. Struktura α1-α2 domena MICA (PDB 1HYR) gde je njegova površina koja se vezuje za NKG2D obojena u tamno sivu boju, pri čemu je 57 specifičnih amino-kiselinskih mesta izloženo intenzivnoj mutagenezi.

Slika 17. Tirozinski ostaci Y152 i Y199 u prirodnom NKG2D homodimeru.

Slika 18. Rezultati ELISA testa za vezivanje ektodomena prirodnih i ne-prirodnih NKG2D receptora za prirodne i ne-prirodne α1-α2 domene fuzije NKG2D ligand-Fc. (A), Vezivanje NKG2D divljeg tipa za panel liganda α1-α2 domena-Fc panel prikazuje vezivanje za sve ligande, sa najvećim afinitetom za MICv25-Fc. (B), Neprirodni NKG2D mutant Y199A ne prikazuje aktivnost vezivanja liganda. (C), Neprirodni NKG2D mutant Y152A zadržava visokoafinitetno vezivanje samo za MICv25-Fc. (D), Ne-prirodni NKG2D dvostruki mutant Y152A i Y199A uopšte ne prikazuje aktivnost vezivanja liganda.

Slika 19. Titracije faga ELISA testom ULBP varijanti koje se vezuju za NKG2D. Panel (A) prikazuje eksperimente u kojima su varijante ULBP2 prikazane na fagu titrirane pomoću NKG2D i mereni su relativni afiniteti vezivanja u odnosu na nativni ULBP2 (WT, crni krugovi). Panel (B) prikazuje eksperimente u kojima su varijante ULBP3 prikazane na fagu titrirane pomoću NKG2D i mereni su relativni afiniteti vezivanja u odnosu na nativni ULBP3 (WT, crni krugovi).

Slika 20. Poravnanje proteinske sekvence α1-α2 domena iz MICA i ULBP proteina (MICA, SEQ ID NO: 99; ULBP4, SEQ ID NO: 103; ULBP3, SEQ ID NO: 102; ULBP1, SEQ ID NO:100; ULBP5, SEQ ID NO: 104; ULBP2, SEQ ID NO:101; ULBP6, SEQ ID NO: 105). Amino-kiseline označene sivom bojom odabrane su za NNK mutagenezu u ULBP2 (60 amino-kiselina) i ULBP3 (36 amino-kiselina). Ostaci označeni crnom bojom identifikovani su kao ključne pozicije za selekciju i identifikovane kao mutacije koje moduliraju afinitet vezivanja za NKG2D (tabele 6 i 7).

Slika 21. Fuzije ULBP2 i ULBP3 varijanti α1-α2 domena sa teškim lancem HER2-specifičnog antitela pokazale su povećan afinitet vezivanja za NKG2D. Modifikovane ULBP2 varijante α1-α2 domena R80W (SEQ ID NO: 87) i V151D (SEQ ID NO: 88) i modifikovana ULBP3 varijanta R162G (SEQ ID NO: 89) pokazale su poboljšano vezivanje NKG2D u odnosu na svoje C-u-S prirodne ULBP fuzije (SEQ ID NO: 16 i 17, redom).

Slika 22. Fuzije ULBP2 i ULBP3 varijanti α1-α2 domena posredovana sa teškim lancem HER2-specifičnog antitela pokazale su specifično liziranje SKBR3 ciljnih ćelija NKL ćelijama. Modifikovane ULBP2 varijante α1-α2 domena, R80W (SEQ ID NO: 87) i V151D (SEQ ID NO: 88), prikazale su pojačano ubijanje ciljnih ćelija u odnosu na fuziju C8S i nativnog ULBP2 (SEQ ID NO: 16) (WT) (A). Modifikovana ULBP3 varijanta, R162G (SEQ ID NO: 89), prikazala je pojačano ubijanje ciljnih ćelija u odnosu na fuziju C103S i nativnog ULBP3 (SEQ ID NO: 17) (WT) (B).

Slika 23. Rezultati ELISA testa na fagima, za ne-prirodne α1-α2 domene selektovane na osnovu vezivanja za Y152A NKG2D-Fc. (A) Ortogonalni ULBP2 klonovi, (B) Ortogonalni MICA klonovi i (C) Ortogonalni ULBP3 klonovi.

Slika 24. Rezultati ELISA testa za fuzije R3 antitela sa ne-prirodnim α1-α2 domenima selektovanim za vezivanje za Y152A NKG2D-Fc. (A) Fuzija R3 HC25 antitela nije selektivna za Y152A NKG2D. (B) Fuzija R3 HC25.17 (SEQ ID NO.: 97) antitela je selektivna za Y152A NKG2D u odnosu na prirodni NKG2D-Fc. (C) Fuzija R3 HC.U2RW antitela nije selektivna za Y152A NKG2D u odnosu na prirodni NKG2D-Fc. (D) Fuzija R3 HC.U2S3 (SEQ ID NO.: 98) antitela je selektivna za Y152A NKG2D u odnosu na prirodni NKG2D-Fc.

Slika 25. Anatomija tipičnog CAR (Gill & June, 2015, op cit).

Slika 26. In-vitro CAR-T testovi za ubijanje ciljnih ćelija. (A) Prirodne NKG2D CAR-T ćelije ubijaju P1 viljne ćelije koje eksprimiraju prirodni MICA, dok su Y152A NKG2D CAR-T ćelije onesposobljene i imaju sniženu aktivnost ubijanja ciljnih kategorija koje eksprimiraju MICA. (B) Selektivne otrogonalne fuzije antitela, R3 HC25.17 (SEQ ID NO.: 97) i R3 HC.U2S3 (SEQ ID NO.: 98) selektivno kontrolišu aktivnost ubijanja ćelija koje eksprimiraju FGFR3, od strane Y152A NKG2D CAR-T ćelija.

DETALJAN OPIS

[0013] Primeri izvođenja prema pronalasku su opisani u nekim od aspekata koji su otkriveni u nastavku teksta. Obim pronalaska je definisan priloženim patentnim zahtevima.

[0014] Predmetno otkriće se odnosi na peptide varijabilnog fragmenta koji mogu da se inseriraju (iFv). Pošto su C-terminus i N-terminus scFv molekula, uključujući polivalentne scFv strukture, prostorno udaljeni, scFv strukture ne mogu da se inseriraju u region petlje unutar prevoja roditeljskog ili recipijentnog proteina, bez razaranja ili destabilizacije njegovog(ih) prevoja i/ili bez razaranja Fv okvira neophodnog za pravilno pozicioniranje CDR regiona ili hipervarijabilnih regiona, tako da zadrže svoja antigen-vezujuća svojstva.

[0015] Kako bismo inserirali varijabilni fragment antitela koji sadrži do 6 CDR regiona u jedan ili više regiona petlje nascentnog molekula parentalnog proteina, bez razaranja strukturnih prevoja varijabilnog fragmenta ili parentalnog proteina, pronašli smo novu klasu antigen-vezujućih peptida dobijenih iz varijabilnih domena lakog i teškog lanca antitela. Nove strukture su sadržale dva linker regiona, a ne tradicionalni individualni linker iz scFv struktura, plus podeljeni varijabilni domen. Konceptualno, kanonski terminusi varijabilnih lakih (VL) i teških (VH) domena su fuzionisani u kontinualni ili "cirkularni" peptid. Ova cirkularna peptidna struktura koja sadrži svih 6 CDR regiona Fv fragmenta, može potom konceptualno da se podeli na jednom od nekoliko mogućih novih mesta, kako bi bio kreiran Fv koji može da se inserira (iFv). Ne-prirodno mesto deljenja može da se kreira unutar varijabilnog domena lakog ili teškog lanca na apeksu ili krivini petlje, ili blizu njih, kako bi bili kreirani novi, jedinstveni N- i C-terminusi koji su prostorno pozicionirani jedan blizu drugog, poželjno unutar 0,5 do 1,5 nm, tako da mogu da se inseriraju u petlje drugih

1

(parentalnih ili recipijentnih) proteina ili polipeptida bez razaranja strukture, stabilnosti ili željene funkcije. Ova nova klasa peptida naziva se varijabilni fragment koji može da se inserira (iFv). Specifičnost vezivanja ili ciljanja koju iFv obezbeđuje recipijentnom molekulu, može da se promeni ako se u recipijenta inserira drugi ili drugačiji iFV koji se bazira na drugačijem antitelu ili scFv fragmentu, ili ako se u postojećem iFv koji može da se inserira, zameni 1 ili više CDR regiona.

[0016] Insercija u druge proteine, jednog ili više iFv polipeptida koji prikazuju specifična antigen-vezujuća svojstva Fv domena, čime se obezbeđuju nova svojstva vezivanja, imaće višestruke korisne primene. Ove primene uključuju, ali nisu ograničene na, to da se roditeljskom proteinu omogući da se vezuje za specifični antigen, da vrši ciljanje antigena, da detektuje prisustvo antigena, da ukloni antigen, da dovede nešto u kontakt sa antigenom ili privuče antigenu, da isporuči korisni teret antigenu ili ćeliji koja eksprimira antigen, da regrutuje antigen i vizuelizuje prisustvo antigena. Korisni teret može da bude konjugovan direktno sa amino-terminusom ili karboksi-terminusom iFv fragmenta, ili sa oba, ili indirektno sa iFv preko parentalnog proteina ili peptida. Primeri korisnog tereta uključuju, ali nisu ograničeni na, hromoforu, fluoroforu, farmakoforu, atom, teški ili radioaktivni izotop, agens za vizuelizaciju, hemioterapeutski agens ili toksin. iFv sa korisnim teretom može da se koristi za lociranje ili identifikaciju prisustva ciljnog molekula za koji se iFv specifično vezuje i kao takav može da se koristi kao in vitro ili in vivo agens za vizuelizaciju ili dijagnostički agens koji je mali i stabilan. Osim toga, sa jednim od, ili sa oba terminusa, i aminoterminusom i karboksi-terminusom iFv peptida, može da se konjuguje hemioterapeutski agens ili toksični molekul kako bi bio kreiran konjugat iFv-lek, na primer, kao tretman za malignitet ili infekciju. Sa oba terminusa, i sa amino-terminusom i sa karboksi-terminusom iFv peptida, može da bude konjugovan samo jedan koristan teret, tako da obuhvata ili povezuje dva terminusa; ova obuhvaćenost može dalje da stabilizuje iFv tako što blokira degradaciju terminusa egzopeptidazama ili štiti iFv od denaturacije ili odvijanja.

[0017] Primeri parentalnih ili recipijentnih proteina ili polipeptida koji su kandidati za insercije iFv peptida uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela, proteine sačinjene od Ig prevoja ili Ig domena, globuline, albumene, fibronektine i fibronektinske domene, integrine, fluorescentne proteine, enzime, proteine spoljašnje membrane, receptorske proteine, T-ćelijske receptore, himerne antigenske receptore, virusne antigene, virusne kapside, virusne ligande za ćelijske receptore, bakteriocine visoke molekulske težine, histone, hormone, notine, ciklične peptide ili polipeptide, proteine iz familije glavne histokompatibilnosti (MHC), MIC proteine, lektine i ligande za lektine. Takođe je moguće inserirati iFv strukture u ne-proteinske recipijentne molekule kao što su polisaharidi, dendrimeri, poliglikoli, peptidoglikani, antibiotici i poliketidi.

[0018] Ćelije prirodne ubice (NK) i neke (CD8+ αβ i γδ) T-ćelije imunog sistema imaju važne uloge kod ljudi i drugih sisara, kao urođena odbrana prve linije od neoplastičnih i virusima inficiranih ćelija (Cerwenka, A., and L.L. Lanier. 2001. NK cells, viruses and cancer. Nat. Rev. Immunol. 1:41-49). NK ćelije i neke T-ćelije prikazuju na svojim površinama NKG2D, prominentni, homodimerni, površinski imunoreceptor odgovoran za prepoznavanje ciljnih ćelija i aktivaciju urođene odbrane od patološke ćelije (Lanier, LL, 1998. NK cell receptors. Ann. Rev. Immunol.16: 359-393; Houchins JP et al.1991. DNA sequence analysis of NKG2, a family of related cDNA clones encoding type II integral membrane proteins on human NK cells. J. Exp. Med. 173: 1017-1020; Bauer, S et al., 1999. Activation of NK cells and T cells by NKG2D, a receptor for stress-inducible MICA. Science 285: 727-730). Molekul humanog NKG2D poseduje ekstracelularni domen sličan lektinu C-tipa, koji se vezuje za sebi srodne, sa 84% identičnosti sekvence ili homologe, monomerne MICA i MICB, koji su polimorfni analozi glikoproteina srodnih lancima glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase I (MIC) (Weis et al.1998. The C-type lectin superfamily of the immune system. Immunol. Rev.

163: 19-34; Bahram et al. 1994. A second lineage of mammalian MHC class I genes. PNAS 91:6259-6263; Bahram et al. 1996a. Nucleotide sequence of the human MHC class I MICA gene. Immunogenetics 44: 80-81; Bahram and Spies TA. 1996. Nucleotide sequence of human MHC class I MICB cDNA. Immunogenetics 43: 230-233). Nepatološka ekspresija MICA i MICB ograničena je na crevni epitel, keratinocite, endotelne ćelije i monocite, ali aberantna površinska ekspresija ovih MIC proteina se javlja kao odgovor na mnoge vrste ćelijskog stresa kao što su proliferacija, oksidacija i toplotni šok i obeležava ćeliju kao patološku (Groh et al. 1996. Cell stress-regulated human MHC class I gene expressed in GI epithelium. PNAS 93: 12445-12450; Groh et al. 1998. Recognition of stress-induced MHC molecules by intestinal γδT cells. Science 279: 1737-1740; Zwirner et al. 1999. Differential expression of MICA by endothelial cells, fibroblasts, keratinocytes and monocytes. Human Immunol. 60: 323-330). Patološka ekspresija MIC proteina takođe je izgleda uključena u neke autoimune bolesti (Ravetch, JV and Lanier LL. 2000. Immune Inhibitory Receptors. Science 290: 84-89; Burgess, SJ. 2008. Immunol. Res. 40: 18-34). Diferencijalna regulacija NKG2D liganada, kao što su polimorfni MICA i MICB, važna je da bi se imunom sistemu obezbedilo sredstvo za identifikaciju i reagovanje na širok spektar hitnih znakova, pri čemu se zdrave ćelije i dalje štite od neželjenog napada. (Stephens HA, (2001) MICA and MICB genes: can the enigma of their polymorphism be resolved? Trends Immunol. 22: 378-85; Spies, T. 2008.

Regulation of NKG2D ligands: a purposeful but delicate affair. Nature Immunol. 9: 1013-1015).

[0019] Virusna infekcija je uobičajen induktor ekspresije MIC proteina i identifikuje ćeliju inficiranu virusom za napad od strane NK ili T-ćelija (Groh et al. 1998; Groh et al.2001. Costimulation of CD8+ αβT-cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2: 255-260; Cerwenka, A., and L.L. Lanier.2001). U stvari, da bi izbegli takav napad na ćeliju domaćina, citomegalovirus i drugi virusi su razvili mehanizme koji sprečavaju ekspresiju MIC proteina na površini ćelije koju inficiraju, kako bi izbegli burnu reakciju urođenog imunog sistema. (Lodoen, M., K. Ogasawara, J.A. Hamerman, H. Arase, J.P. Houchins, E.S. Mocarski, and L.L. Lanier. 2003. NKG2D-mediated NK cell protection against cytomegalovirus is impaired by gp40 modulation of RAE-1 molecules. J. Exp. Med.

197:1245-1253; Stem-Ginossar et al., (2007) Host immune system gene targeting by viral miRNA. Science 317: 376-381; Stem-Ginossar et al., (2008) Human microRNAs regulate stress-induced immune responses mediated by the receptor NKG2D. Nature Immunology 9: 1065-73; Slavuljica, I A Busche, M Babic, M Mitrovic, I Gašparovic, Ð Cekinovic, E Markova Car, EP Pugel, A Cikovic, VJ Lisnic, WJ Britt, U Koszinowski, M Messerle, A Krmpotic and S Jonjic. 2010. Recombinant mouse cytomegalovirus expressing a ligand for the NKG2D receptor is attenuated and has improved vaccine properties. J. Clin. Invest. 120: 4532-4545).

[0020] Uprkos svom stresu, mnoge maligne ćelije, kao što su one kod raka pluća i glioblastoma, raka mozga, takođe izbegavaju ekspresiju MIC proteina i kao rezultat toga mogu da budu posebno agresivne jer i one izbegavaju urođeni imuni sistem. (Busche, A et al.

2006, NK cell mediated rejection of experimental human lung cancer by genetic over expression of MHC class I chain-related gene A. Human Gene Therapy 17: 135-146; Doubrovina, ES, MM Doubrovin, E Vider, RB Sisson, RJ O'Reilly, B Dupont, and YM Vyas, 2003. Evasion from NK Cell Immunity by MHC Class I Chain-Related Molecules Expressing Colon Adenocarcinoma (2003) J. Immunology 6891-99; Friese, M. et al. 2003. MICA/NKG2D-mediated immunogene therapy of experimental gliomas. Cancer Research 63: 8996-9006; Fuertes, MB, MV Girart, LL Molinero, CI Domaica, LE Rossi, MM Barrio, J Mordoh, GA Rabinovich and NW Zwirner. (2008) Intracellular Retention of the NKG2D Ligand MHC Class I Chain-Related Gene A in Human Melanomas Confers Immune Privilege and Prevents NK Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Immunology, 180: 4606 -4614).

[0021] Struktura visoke rezolucije humanog MICA kada je vezan za NKG2D je rešena i pokazuje da α3 domen MICA nema direktnu interakciju sa NKG2D (Li et al. 2001. Complex

1

structure of the activating immunoreceptor NKG2D and its MHC class I-like ligand MICA. Nature Immunol. 2: 443-451; Protein Data Bank pristupni kod 1HYR). α3 domen MICA, kao i kod MICB, povezan je sa domenom α1-α2 platforme pomoću kratkog, fleksibilnog linker peptide, i sam je prirodno pozicioniran kao „spejser“ između platforme i površine ćelije koja eksprimira MIC. Trodimenzionalne stukture humanih MICA i MICB α3 domena su skoro identične (srednja kvadratna udaljenost <1 Å na 94 C-αα) i funkcionalno zamenljive (Holmes et al. 2001. Structural Studies of Allelic Diversity of the MHC Class I Homolog MICB, a Stress-Inducible Ligand for the Activating Immunoreceptor NKG2D. J Immunol. 169: 1395-1400).

[0022] Opisani su izvesni ne-prirodni α1-α2 domeni NKG2D liganada, modifikovani tako da vezuju prirodne humane NKG2D receptore sa većim afinitetima od prirodnih α1-α2 domena (Candice S. E. Lengyel, Lindsey J. Willis, Patrick Mann, David Baker, Tanja Kortemme, Roland K. Strong and Benjamin J. McFarland. Mutations Designed to Destabilize the Receptor-Bound Conformation Increase MICA-NKG2D Association Rate and Affinity. Journal of Biological Chemistry Vol. 282, no. 42, pp. 30658-30666, 2007; Samuel H. Henager, Melissa A. Hale, Nicholas J. Maurice, Erin C. Dunnington, Carter J. Swanson, Megan J. Peterson, Joseph J. Ban, David J. Culpepper, Luke D. Davies, Lisa K. Sanders, and Benjamin J. McFarland. Combining different design strategies for rational affinity maturation of the MICA-NKG2D interface. Protein Science 2012 VOL 21:1396-1402. U ovom tekstu opisujemo ne-prirodne α1-α2 domene NKG2D liganada koji su modifikovani tako da vezuju ne-prirodne NKG2D receptore koji su i sami mutirani na mestima koja posledično dovode do narušenog vezivanja ili gubitka vezivanja za prirodne α1-α2 domene NKG2D liganada (David J. Culpepper, Michael K. Maddox, Andrew B. Caldwell, and Benjamin J. McFarland. Systematic mutation and thermodynamic analysis of central tyrosine pairs in polyspecific NKG2D receptor interactions. Mol Immunol. 2011 January ; 48(4): 516-523; USPTO patentna prijava 14/562,534; USPTO privremena patentna prijava 62/088,456)). Ovim otkrićem kreirani su bispecifični molekuli koji se sastoje od specifično modifikovanih neprirodnih α1-α2 domena i specifičnih heterologih molekula za ciljanje, uključujući, ali ne ograničeno na, heterologe peptide ili polipeptide, koji vezuju himerne antigenske receptore (CAR), pri čemu se receptor CAR sastoji od ne-prirodnog ektodomena NKG2D receptora koji vezuje modifikovane α1-α2 domene sa većim afinitetom nego prirodne α1-α2 domene. Genetski modifikovane ćelije imunog sistema koji se sastoje od takvih CAR receptora mogu tako da prevaziđu mnoge nedostatke, uključujući poznate ozbiljne sistemske toksičnosti i izbegavanje od strane antigena, aktuelnih CAR-T i CAR-NK ćelijskih terapeutika kao što je opisano u nastavku teksta (Kalos M, Levine, BL, Porter, DL, Katz, S, Grupp, SA, Bagg, A and June, C.. T Cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med 2011;3:95ra73; Morgan RA, Yang JC, Kitano M, Dudley ME, Laurencot CM, Rosenberg SA. Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2. Mol Ther 2010, 18:843-851; Gill and June 2015).

[0023] T-ćelije i NK-ćelije mogu da se modifikuju tehnologijama za transfer gena, tako da direktno i stabilno eksprimiraju na svojoj površini domene vezivanja antitela koje daju nove specifičnosti antigena (Saar Gill & Carl H. June. Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunological Reviews 2015. Vol. 263: 68-89; Wolfgang Glienke, Ruth Esser, Christoph Priesner, Julia D. Suerth, Axel Schambach, Winfried S. Wels, Manuel Grez, Stephan Kloess, Lubomir Arseniev and Ulrike Koehl. 2015. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front. Pharmacol. doi: 10.3389/fphar.2015.00021). CAR-T ćelije predstavljaju primene ovog pristupa koje kombinuju domen za prepoznavanje antigena specifičnog antitela sa intracelularnim domenom CD3-ζ lanca, koji je primarni transmiter signala od endogenih T-ćelijskih receptora (TCR receptori), u jedinstven himerni protein, zajedno sa ko-stimulatornim molekulom, kao što je CD27, CD28, ICOS, 4-1BB ili OX40, slika 16. CAR receptori mogu da budu okidač za aktivaciju T ćelija po vezivanju ciljanog antigena, na način sličan endogenom T ćelijskom receptoru, ali nezavisno od glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC).

[0024] Kako se ovde koristi, "solubilni MIC protein", "solubilni MICA" i "solubilni MICB", odnose se na MIC protein koji sadrži α1, α2, and α3 domene MIC proteina, ali bez transmembranskog ili intracelularnog domena. NKG2D ligandi, ULBP1-6, prirodno ne poseduju α3 domen (Cerwenka A, Lanier LL. 2004. NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi: 10.1034/j. 1399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652). "α1-α2 domen" NKG2D liganda odnosi se na proteinski domen liganda koji se vezuje za NKG2D receptor.

[0025] U nekim aspektima otkrića, α1-α2 domeni ne-prirodnih proteina NKG2D liganda prema otkriću su najmanje 80% identični ili homologi sa nativnim ili prirodnim α1-α2 domenom NKG2D liganda, SEQ ID NO: 36-54. U drugim aspektima otkrića, modifikovani α1-α2 domen je 85% identičan sa nativnim ili prirodnim α1-α2 domenom NKG2D liganda. U još nekim aspektima otkrića, modifikovani α1-α2 domen je 90% identičan sa nativnim ili

1

prirodnim α1-α2 domenom prirodnog NKG2D ligand proteina i vezuje se za ne-prirodni NKG2D.

[0026] Domen α1-α2 platforme solubilnog MIC proteina je vezan za α3 domen i difunduje u međućelijskom ili intravaskularnom prostoru sisara. Poželjno je da domeni α1-α2 platforme ne-prirodnih MIC proteina iz ovog otkrića budu najmanje 80% identični ili homologi sa nativnim ili prirodnim α1-α2 domenom humanog MICA ili MICB proteina i da se vezuju za NKG2D. U nekim aspektima otkrića, domen α1-α2 platforme je 85% identičan sa nativnim ili prirodnim domenom α1-α2 platforme humanih MICA ili MICB proteina i vezuje NKG2D. U drugim aspektima otkrića, domen α1-α2 platforme je 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sa nativnim ili prirodnim domenom α1-α2 platforme humanih MICA ili MICB proteina i vezuje NKG2D.

[0027] U nekim aspektima otkrića, heterologi peptidni tag može da se fuzioniše sa N-terminusom ili C-terminusom α1-α2 domena ili solubilnog MIC proteina da bi se potpomoglo prečišćavanju solubilnog MIC proteina. Tag sekvence uključuju peptide kao što su polihistidin, myc-peptid ili FLAG tag. Ovi tagovi mogu, nakon izolacije MIC molekula, da se uklone postupcima koji su poznati stručnjaku u oblasti.

[0028] U drugim aspektima otkrića, mogu da se napravespecifične mutacije u α1-α2 domenima NKG2D liganda, kako bi se kreirali ne-prirodni α1-α2 domeni koji vezuju neprirodne NKG2D receptore, koji su i sami inženjeringom izmenjeni tako da imaju smanjen afinitet za prirodne NKG2D ligande. Ovo može da se uradi, na primer, genetskim inženjeringom. Tako modifikovani ne-prirodni NKG2D receptor može da se koristi tako da se na površini NK- ili T-ćelija imunog sistema kreira NKG2D-baziran himerni antigenski receptor (CAR) koji se preferencijalno može da se veže i aktivira molekulima koji se sastoje od ne-prirodnih α1-α2 domena prema pronalasku. Ovi parovi ne-prirodnih NKG2D receptora i njihovih srodnih ne-prirodnih NKG2D liganada prema pronalasku, obezbediće prednosti u vidu bezbednost, efikasnosti i proizvodnje, koje su važne za lečenje kancera i virusnih infekcija, u odnosu na aktuelne CAR-T ćelije i CAR-NK ćelije, kao što je opisano u nastavku teksta.

[0029] Izmene T ćelija sa CAR receptorima, pomoću inženjeringa, pojavile su se kao perspektivan pristup adoptivnoj T ćelijskoj terapiji za kancer, a CAR receptori koji ciljaju veliki broj različitih molekula testirani su u CAR-T ćelijama kao terapeutici za malignitete. (Porter DL, Levine BL, Kalos M,, Bagg A, June CH. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365:725-733.). Dok je izuzetna klinička efikasnost uočena kod stotina pacijenata koji primaju adoptivni transfer T ćelija koje

1

eksprimiraju CD19-specifične himerne antigen receptore, procesi prilagođenog inženjeringa CAR receptora kako bi ciljali specifični antigen, izolovanje autologih T-ćelija od pacijenta, genetski inženjering autologe T-ćelije u cilju ekspresije personalizovanog CAR, ekspanzija modifikovanih ćelija in vitro i kontrola kvaliteta njihove proizvodnje, bili su naporni i skupi. Trenutno je ovo izvodljivo samo u kontekstu velikih akademskih centara sa velikom stručnošću i resursima (Gill & June, 2015).

[0030] Kada se autologe CAR-T ćelije ponovo infuzijom unesu u pacijenta-donora, njihova ekspanzija in vivo ne može da se kontroliše --- "živa terapija", i ne postoji odnos dozaodgovor sa efikasnošću (Gill & June, 2015). Osim toga, evazija tumora CAR T-ćelijama može da se dešava putem evazije usled gubitka through antigena (Stephan A. Grupp, M.D., Ph.D., Michael Kalos, Ph.D., David Barrett, M.D., Ph.D., Richard Aplenc, M.D., Ph.D., David L. Porter, M.D., Susan R. Rheingold, M.D., David T. Teachey, M.D., Anne Chew, Ph.D., Bernd Hauck, Ph.D., J. Fraser Wright, Ph.D., Michael C. Milone, M.D., Ph.D., Bruce L. Levine, Ph.D., and Carl H. June, M.D. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells for Acute Lymphoid Leukemia. N Engl J Med 2013;368:1509-1518), a ovaj put evazije najlakše može da se rešava sekvencijalnom terapijom pomoću različito usmerenih CAR-T ćelija ili inicijalnom infuzijom proizvoda od T-ćelija koji sadrži CAR receptore sa dve ili više specificičnosti, što dodatno komplikuje procese proizvodnje i kontrolu kvaliteta.

[0031] Pored CAR-T ćelija koje ciljaju tumore pomoću jednolančanih antigen-vezujućih domena (scFv), CAR-T ćelije koje koriste ligand-vezujući domen NKG2D receptora su proučavane kod životinja, a nedavno i kod ljudi (Sentman CL, Meehan KR. NKG2D CARs as cell therapy for cancer. Cancer J. 2014 Mar-Apr;20(2):156-9. doi: 10.1097/PPO.0000000000000029; Manfred Lehner, Gabriel Götz, Julia Proff, Niels Schaft, Jan Dörrie, Florian Full, Armin Ensser, Yves A. Muller, Adelheid Cerwenka, Hinrich Abken, Ornella Parolini, Peter F. Ambros, Heinrich Kovar, Wolfgang Holter. Redirecting T Cells to Ewing's Sarcoma Family of Tumors by a Chimeric NKG2D Receptor Expressed by Lentiviral Transduction or mRNA Transfection Research Article | published 15 Feb 2012 | PLOS ONE 10.1371/journal.pone.0031210; www.clinicaltrials.gov NCT02203825). Pošto je ekspresija NKG2D liganda povećana na površini ćelija pod stresom, kao što su tumorske ćelije, postoji začajan interes za ovu familiju prirodnih NKG2D liganada koji bi mogli da budu ciljni molekuli za imunoterapije kancera (Spear P, Wu MR, Sentman ML, Sentman CL. NKG2D ligands as therapeutic targets. Cancer Immun. 2013 May 1;13:8.; Song DG, Ye Q, Santoro S, Fang C, Best A, Powell DJ Jr., Chimeric NKG2D CAR-expressing T cell-mediated attack of human ovarian cancer is enhanced by histone deacetylase inhibition. Hum Gene Ther. 2013

1

Mar;24(3):295-305). Jedan NKG2D CAR je bio fuzija NKG2D receptora pune dužine i CD3ζ (NKG2Dζ); drugi je bio samo sa ektodomenom NKG2D fuzionisanim u suprotnoj orijentaciji sa CAR skafoldom druge generacije sačinjenim od transmembranskih i intracelularnih domena iz CD28 i signalnog domena iz CD3ζ (NKG2D28ζ). Pošto aktivacija NKG2D zavisi od prisustva DAP10, konstruisana je CAR-T ćelija u kojoj je DAP10 bio koeksprimiran sa NKG2Dζ (NKG2Dζ10). T ćelije koje eksprimiraju bilo koji od prethodno navedenih NKG2D CAR receptora proizvele su IFNy i TNFα u odgovor na stimulaciju NKG2D liganda i in vitro su efikasno ubijale tumorske ciljne kategorije koje eksprimiraju NKG2D ligande (Heather VanSeggelen, Joanne A. Hammill, Anna Dvorkin-Gheva, Daniela G.M. Tantalo, Jacek M. Kwiecien, Galina F. Denisova, Brian Rabinovich, Yonghong Wan, Jonathan L. Bramson, T cells engineered with chimeric antigen receptors targeting NKG2D ligands display lethal toxicity in mice, Molecular Therapy accepted article preview online 30 June 2015; doi:10.1038/mt.2015.119). Citotoksični potencijal NK ćelija protiv širokog spektra tumorskih podtipova takođe može da bude značajno poboljšan ekspresijom CAR na bazi NKG2D-DAP10-CD3ζ (Yu-Hsiang Chang, John Connolly, Noriko Shimasaki, Kousaku Mimura, Koji Kono, and Dario Campana. Chimeric Receptor with NKG2D Specificity Enhances Natural Killer Cell Activation and Killing of Tumor Cells. Cancer Res; 73(6) March 15, 2013).

[0032] Međutim, nakon infuzije u singene miševe-domaćine, došlo je do značajne toksičnosti kod ovih CAR-T konstrukata koji se vezuju i aktiviraju prirodnim ligandima prirodnog NKG2D receptora. Znaci toksičnosti, uključujući loše stanje tela, pogrbljeno držanje, otežano disanje i sniženu telesnu temperaturu, primećeni su kod miševa sa tumorima i bez tumora tretiranih CAR-T ćelijama zasnovanim na NKG2D, u poređenju sa netretiranim kontrolnim miševima. Ozbiljnost NKG2D CAR-T ćelijske toksičnosti je varirala, pri čemu je NKG2Dζ10 jako toksičan, NKG2D28ζ prikazuje srednju toksičnost, a NKG2Dζ može da se toleriše. Klinički simptomi toksičnosti i stope mortalitata su se pogoršali kada su miševi primili hemioterapiju pre adoptivnog transfera T ćelija koje eksprimiraju bilo koji od NKG2D CAR receptora (VanSeggelen et al.2015). Poznato je da hemoterapija i zračenje indukuju NKG2D ligande na inače zdravim tkivima (Xiulong Xu, Geetha S Rao, Veronika Groh, Thomas Spies, Paolo Gattuso, Howard L Kaufman, Janet Plate and Richard A Prinz. Major histocompatibility complex class I-related chain A/B (MICAB) expression in tumor tissue and serum of pancreatic cancer: Role of uric acid accumulation in gemcitabine-induced MICA/B expression. BMC Cancer 2011, 11:194 doi: 10.1186/1471-2407-11-194; Gannagé M, Buzyn A, Bogiatzi SI, Lambert M, Soumelis V, Dal Cortivo L, Cavazzana-Calvo M, Brousse N,

1

Caillat-Zucman Induction of NKG2D ligands by gamma radiation and tumor necrosis factoralpha may participate in the tissue damage during acute graft-versus-host disease. Transplantation. 2008 Mar 27;85(6):911-5. doi: 10.1097/TP.0b013e31816691ef.). Dalja karakterizacija je otkrila da se toksičnost poklopila sa sistemskom olujom citokina i smrtonosnim nivoima inflamacije unutar pluća. Ovi podaci upozoravaju da se mora preduzeti krajnji oprez kada se koriste prirodni NKG2D ligandi za ciljanu imunoterapiju i pokazuju da povećanje ekspresije T ćelija kod snažno aktivirajućih CAR može da bude štetno in vivo (VanSeggelen et al.2015).

[0033] CAR-T ili CAR-NK ćelije koje su sačinjene od ektodomena ne-prirodnih NKG2D receptora koji ne vezuju ili samo slabo vezuju prirodne NKG2D ligande, neće biti podvrgnute prethodno navedenom obliku aktivacije i stoga neće biti toksične kao ćelije koje eksprimiraju CAR na bazi prirodnog NKG2D receptor. Štaviše, ektodomeni ne-prirodnih NKG2D receptora na ćelijama neće biti podvrgnuti smanjenoj regulaciji prirodnim NKG2D ligandima u solubilnom formatu ili na mijeloidnim supresorskim ćelijama. (MDSC) (Deng W, Gowen BG, Zhang L, Wang L, Lau S, Iannello A, Xu J, Rovis TL, Xiong N,Raulet DH, 2015. Antitumor immunity. A shed NKG2D ligand that promotes natural killer cell activation and tumor rejection. Science. 2015 Apr 3;348(6230):136-9. doi: 10.1126/science.1258867. Epub 2015 Mar 5). Međutim, kada se takve CAR ćelije koje nose ektodomene ne-prirodnih NKG2D receptora angažuju sa bispecifičnim molekulima sa srodnim ne-prirodnim α1-α2 domenima prema aktuelnom otkriću i njegovim heterologim motivom za ciljanje koji je pronašao i vezao svoju predviđenu ciljnu kategoriju, CAR će biti aktiviran i efektorske funkcije CAR ćelije će biti eksprimirane.

[0034] Pošto CAR-T ili CAR-NK ćelije koje su sačinjene od ne-prirodnih NKG2D receptorskih ektodomena nisu aktivirane osim u prisustvu angažovanog bispecifičnog molekula koga čine srodni ne-prirodni α1-α2 domeni, njihova aktivacija može da se kontroliše primenjenim bispecifičnim molekulima, koji će kao biofarmaceutici pokazati farmakokinetiku i farmakodinamiku koje su dobro poznate u ovoj oblasti. U slučaju da se pojavi neželjeni događaj, lekar može jednostavno da modifikuje režim doziranja primenjenog bispecifičnog molekula umesto što mora da primeni mehanizam indukovanog samoubistva kako bi uništio infuzijom primenjene CAR ćelije, kao što se to sada radi. (Monica Casucci and Attilio Bondanza. Suicide Gene Therapy to Increase the Safety of Chimeric Antigen Receptor-Redirected T Lymphocytes. J Cancer. 2011; 2: 378-382). Štaviše, takvi bispecifični molekuli sa različitim specifičnim motivima za ciljanje mogu da se primenjuju istovremeno ili sekvencijalno, kako bi pomogli u rešavanju rezistencije tumora i evazije usled gubitka ciljnog

1

antigena, a da pri tom nisu neophodni kreiranje, ekspanzija i infuzija više različitih autologih CAR ćelija (Gill & June, 2015). Pošto sve CAR konstrukcije mogu da bude identične za sve CAR ćelije i specifičnost usmeravanja na cilj može da se odredi jednostavno pomoću motiva za ciljanje proizvedenog bispecifičnog molekula prema predmetnom otkriću, postupci proizvodnje će biti pojednostavljeni i jeftiniji.

[0035] Dakle, predmetno otkriće proširuje raznolikost i praktičnost ovog izvanrednog, veoma perspektivnog imunološkog pristupa u lečenju raka pomoću CAR-T ćelija i CAR-NK ćelija, uz istovremeno prevezilaženje većeg broja ovih aktuelnih, prepoznatih teškoća.

[0036] Kako se ovde koristi "peptid", "polipeptid" i "protein" se koriste u istom značenju; i "heterologi molekul", "heterologi peptid", "heterologa sekvenca" ili "heterologi atom" je molekul, peptid, sekvenca nukleinske kiseline ili amino kiseline, odnosno atom, koji se prirodno ili normalno ne nalazi u fizičkoj vezi sa predmetnim molekulom. Kako se ovde koristi, "ne-prirodne" i "modifikovani" se koriste u istom značenju. Kako se ovde koristi, "prirodni" i "nativni" se koriste u istom značenju, a "NKG2D" i "NKG2D receptor" se koriste u istom značenju. Termin "antitelo" ovde se koristi u najširem smislu i posebno pokriva monoklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost. "Fragmenti antitela" obuhvataju deo intaktnog antitela, poželjno koji obuhvata njegov region vezivanja za antigen. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela; i multispecifična antitela formirana od fragmenta antitela.

[0037] Termin "sadrži", koji se koristi naizmenično sa "uključujuči", "koji sadrži" ili "naznačen time", je inkluzivan ili otvoren jezik i ne isključuje dodatne, elemente ili korake postupka koji nisu navedeni. Fraza „sastoji se od“ isključuje bilo koji element, korak ili sastojak koji nisu navedeni u zahtevu. Fraza "sastoji se u suštini od" ograničava obim zahteva na određene materijale ili korake i one koji materijalno ne utiču na osnovne i nove karakteristike otkrića. Ovo otkriće razmatra kompozicije i postupke koje odgovaraju obimu svake od ovih fraza. Prema tome, kompozicija ili postupak koji sadrži navedene elemente ili korake razmatra određene aspekte otkrića u kojima se kompozicija ili postupak u suštini sastoje, ili se sastoje, od tih elemenata ili koraka.

[0038] Kako se ovde koriste, predviđeno je da neodređeni termini za imenice u jednini uključuju i oblike jednine i oblike množine.

PRIMERI iFv i modifikovanih α1- α2 domena NKG2D liganada

2

[0039] Primer 1 (iFv). Kao specifične primere, sintetisali smo fragment DNK od 1126 bp i 1144 bp (SEQ ID NO: 1 i 2, redom) koji kodiraju sledećim redosledom: α3 domen humanog MICA (kao parentalni peptid) amino-kiselina 182 do amino-kiseline 194 (početak petlje 1 α3 domena), odsustvo spejsera ili GGS amino-kiselinski spejser region (SR), iFv peptid na bazi strukture antitela koje se vezuje za receptor za faktor rasta fibroblasta 3 (FGFR3) (MAbR3;Qing, J., Du, X., Chen, Y., Chan, P., Li, H., Wu, P., Marsters, S., Stawicki, S., Tien, J., Totpal, K., Ross, S., Stinson, S., Dornan, D., French, D., Wang, Q. R., Stephan, J. P., Wu, Y., Wiesmann, C., and Ashkenazi, A. (2009) Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice, The Journal of clinical investigation 119, 1216-1229.), odsustvo spejsera ili još jedan GGS spejser region, distalni deo petlje 1 α3 domena koji počinje od amino-kiseline 196 i uključuje preostali karboksiterminalni deo α3 domena do amino kiseline 276 solubilnog MICA molekula. Svaki sintetički dvolančani DNK polinukleotid je zatim kodirao polipeptid koji je sadržao 6 CDR regiona u obliku iFv inseriranog u petlju 1 α3 domena MICA.

[0040] Sam ovaj iFv peptid (SEQ ID NO.:3), kodiran sa SEQ ID NO.:4, sadržao je dva identična, tipična linker regiona (LR) koji odgovaraju ostacima GGSSRSSSSGGGGSGGGG (SEQ ID NO.:5) (Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C., and Barbas, C. F., 3rd. (2011) Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011). Jedan LR spojio je C-terminus VL sa N-terminusom VH domena, a drugi LR je spojio C-terminus VH domena sa N-terminusom VL. Konceptualno, ova nova struktura je kontinuirani ili "cirkularni" peptid koji je pomenut prethodno u tekstu, i sadrži 6 CDR regiona polaznog Fv. Varijabilni VL lanac antitela je efektivno podeljen unutar regiona petlje između beta-lanaca 1 i 2 (S1 i S2) i na taj način je kreirao novi N-terminalni segment (VLN) i novi C-terminalni segment (VLC) sa pratećim parom novih, ne-prirodnih C- i N-terminusa, redom, slika 5, panel A. Ovaj par terminusa je kreirao jedino mesto za vezivanje ili konjugaciju iFv sa recipijentnim molekulom kao što je protein. Šema umetnutog iFv u parentalni α3 domen je prikazana na slici 5, panel B.

[0041] Da bismo proizveli solubilne MICA proteine sa heterologim iFv peptidom inseriranim u α3 domen, generisali smo bakulovirusni ekspresioni vektor za smeštanje DNK sekvenci (SEQ ID NO: 1 i 2) koje kodiraju α3-iFv.1 (SEQ ID NO.:6) i α3-iFv.2 (SEQ ID NO.:7), redom. DNK fragmenti su amplifikovani pomoću PCR reakcije, digerirani NcoI i EcoRI restrikcionim enzimima i subklonirani u bakulovirusni ekspresioni vektor, SW403, čime je zamenjen α3 domen divljeg tipa. SW403 je bakulovirusni ekspresioni vektor izveden iz pVL1393 (Invitrogen, Inc.) u koji je prethodno kloniran sMICA divljeg tipa (ostaci 1-276) korišćenjem 5' BamHI i 3' EcoRI mesta. Novi ekspresioni vektor je ko-transfektovan bakulovirusnom DNK u ćelije insekata SF9, a bakulovirus je gajen tokom dva ciklusa amplifikacije i korišćen za ekspresiju His-označenih MICA-α3-iFv proteina u T.ni ćelijama insekata prema protokolu proizvođača (Invitrogen). Ekspresija je izvedena u zapremini od 100 mL tokom tri dana i medijum za gajenje je sakupljen u cilju prečišćavanja sekretovanog solubilnog proteina pomoću Ni-afinitetne hromatografije. Monomerni MICA-α3-iFv je prečišćen do >90% čistoće sa očekivanom molekulskom težinom od 60,9 kDa kao što je određeno pomoću SDS-PAGE. Funkcionalna karakterizacija je sprovedena korišćenjem ELISA testova vezivanja i in vitro testova ubijanja ciljnih ćelija.

[0042] Prečišćeni MICA-α3-iFv proteini su testirani u ELISA testu FGFR3-vezivanja, da bi se potvrdilo istovremeno vezivanje za FGFR3 cilj i NKG2D receptor. Maxisorp ploče su obložene sa FGFR3 u fosfatnom puferu (PBS) u koncentraciji od 2 ug/ml. Svaki MICA protein je titriran, ostavljen da se veže za FGFR3 tokom 1 sata, i ispran da bi se uklonio nevezani sMICA protein. Vezani MICA-α3-iFv protein je detektovan korišćenjem NKG2D-Fc i anti-Fc-HRP konjugata. Slika 6 pokazuje da je vezivanje i MICA-α3-iFv.1 i MICA-α3-iFv.2 za FGFR3 bilo uporedivo sa vezivanjem MICA-scFv, koji je napravljen fuzionisanjem tradicionalnog scFv konstruisanog od MAbR3, sa C-terminusom solubilnog MICA. Ovi rezultati ELISA testa takođe su pokazali da je modifikovani MICA zadržao specifičnosti vezivanja scFv i α1-α2 domena za FGFR3 i NKG2D, redom, i pokazali su da je iFv peptid inseriran korišćenjem različitih formata spejsera funkcionalan.

[0043] Testirali smo i uporedili termičku stabilnost sMICA-α3-iFv.2 sa stabilnošću sMICA-scFv. Oba proteina su podvrgnuta rastućim temperaturama od 60-90 °C tokom 1 sata, a zatim ostavljena da se ekvilibrišu na sobnoj temperaturi 1 sat pre nego što su njihova svojstva vezivanja ispitana ELISA testom. Rezultati na slici 7 su pokazali da MICA-α3-iFv.2 može da se izloži temperaturama do 80°C, bez gubitka specifičnog vezivanja za FGFR3. Tradicionalni MICA-scFv je izgubio aktivnost vezivanja na 70°C. Ovaj rezultat je pokazao da je solubilni MICA koji sadrži iFv format prema pronalasku značajno stabilniji od terminalnih fuzija tradicionalnog scFv (Miller, B. R., Demarest, S. J., Lugovskoy, A., Huang, F., Wu, X., Snyder, W. B., Croner, L. J., Wang, N., Amatucci, A., Michaelson, J. S., and Glaser, S. M. (2010) Stability engineering of scFvs for the development of bispecific and multivalent antibodies, Protein engineering, design & selection : PEDS 23, 549-557; Weatherill, E. E., Cain, K. L., Heywood, S. P., Compson, J. E., Heads, J. T., Adams, R., and Humphreys, D. P. (2012) Towards a universal disulphide stabilised single chain Fv format: importance of interchain disulphide bond location and vL-vH orientation, Protein engineering, design & selection : PEDS 25, 321-329).

[0044] Sposobnost MICA-α3-iFv da preusmere liziranje ciljnih ćelija koje eksprimiraju FGFR3, posredovano NK ćelijama, demonstrirana je in vitro testom oslobađanja kalceina. Linija ćelija prirodnih ubica (NK), NKL, gajena je zajedno sa P815 ciljnim ćelijama sa preuzetim kalceinom, koje ektopično eksprimiraju FGFR3. Rezultati sa slike 8 pokazali su da su dva MICA-α3-iFv molekula indukovala značajno veće NK-posredovano liziranje u poređenju sa tradicionalnom fuzijom MICA-scFv, dok solubilna MICA kontrola na koju nije bilo ciljanja, nije pokazala aktivnost ubijanja. Ovi rezultati su potvrdili da se iFv prema pronalasku vezuje za FGFR3 na ciljnim ćelijama i da je u kontekstu celovitog parentalnog molekula proteina, solubilni MICA indukovao potentno liziranje posredovano NK ćelijama.

[0045] Primenljivost iFv formata na druge varijabilne domene antitela je demonstrirana sličnim konstruisanjem α3-iFv.3 (SEQ ID NO.:8), koji je sadržao iFv izveden iz CD20-specifičnog antitela (Du, J., Wang, H., Zhong, C., Peng, B., Zhang, M., Li, B., Huo, S., Guo, Y., and Ding, J. (2007) Structural basis for recognition of CD20 by therapeutic antibody Rituximab, The Journal of biological chemistry 282, 15073-15080). Slika 9 pokazuje da je MICA-α3-iFv.3 bio u stanju da se specifično veže za bunarčiće obložene sa CD20 u ELISA testu u formatu ploče kao što je prethodno u tekstu opisano i takođe da indukuje NK-posredovanu liziranje Ramos ćelija koje eksprimiraju CD20 u testu oslobađanja kalceina.

[0046] Primer 2 (Modifikovani α1- α2 domeni NKG2D liganada). Humani proteini označeni sa ULBP-1 do ULBP-6 su, kao i MICA i MICB, prirodni, stresom izazvani ligandi ćelijske površine koji vezuju NKG2D receptore na humanim NK ćelijama i nekim T-ćelijama (15; Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi:10.1034/j.1399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652). Osim toga, protein virusa kravljih boginja OMCP je sekretovani domen koji, kao i α1-α2 domen MIC proteina, vezuje NKG2D. OMCP pokazuje veoma visok afinitet prema NKG2D, očigledno da bi blokirao prepoznavanje od strane NKG2D prirodnih stres liganada koje virus indukuje na svojoj inficiranoj ćeliji domaćinu (Eric Lazear, Lance W. Peterson, Chris A. Nelson, David H. Fremont. J Virol.2013 January; 87(2): 840-850. doi: 10.1128/JVI.01948-12). Dok se ULBP proteini i OMCP smatraju NKG2D ligandima (NKG2DL) koji dele kanonsku strukturu α1-α2 domena, homologija sekvence sa MICA α1-α2 je manja od 27%, a svima njima prirodno nedostaje α3 domen za povezivanje domena za ciljanje. Konstruisali smo seriju ne-prirodnih ULB i OMCP proteina vezivanjem heterolognih polipeptida koji su specifično ciljali i ubijali ćelije koje

2

eksprimiraju FGFR3 kao rezultat spajanja sa svakim od ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-6 i OMCP, modifikovani α3 domen MICA u koji je inseriran iFv za ciljanje. Osim toga, modifikovali smo α1-α2 domen MICA da bismo poboljšali afinitet α1-α2 domena za NKG2D, a zatim smo sa modifikovanim α1-α2 domenima povezali heterologe molekule kao što su polipeptidi. Da bismo proizveli proteine koji se sastoje od ULBP i OMCP α1-α2 domena vezanih za modifikovane α3-iFv domene, generisali smo bakulovirusni ekspresioni vektor za smeštanje fragmenata DNK (SEQ ID NO: 9-14) koji su kodirali različite α1-α2 domene ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-6 i OMCP (SEQ ID NO: 15-20, redom). Fragmenti DNK su amplifikovani PCR reakcijom, digerirani korišćenjem restrikcionih enzima BlpI i NcoI i pojedinačno subklonirani u bakulovirusni ekspresioni vektor, KLM44, čime su zamenili MICA α1-α2 domen. KLM44 je bio bakulovirusni ekspresioni vektor izveden iz SW403 u koji je MICA-α3-iFv.2 prethodno kloniran (primer 1). Nove NKG2DL-α3-iFv.2 konstrukti koji sadrže fuzije α1-α2 domena ULBP proteina i OMCP sa α3-iFv.2 (ULBP1-α3-iFv.2, ULBP2-α3-iFv.2, ULBP3-α3-iFv.2, ULBP4-α3-iFv.2, ULBP6-α3-iFv.2 i OMCP-α3-iFv.2, redom), ko-transfektovani su bakulovirusnom DNK u ćelije insekata SF9; Bakulovirus je gajen tokom dva ciklusa amplifikacije i korišćen za ekspresiju ovih His-tagovanih NKG2DL-α3-iFv.2 proteina u T.ni ćelijama insekata prema protokolu proizvođača (Invitrogen). Ekspresija je izvedena u zapremini od 100 mL tokom tri dana i medijum za gajenje je sakupljen u cilju prečišćavanja sekretovanog solubilnog proteina pomoću Ni-afinitetne hromatografije. Monomerni proteini korektne molekulske težine su prečišćeni do >90% čistoće, što je određeno pomoću SDS-PAGE. Funkcionalna karakterizacija je sprovedena korišćenjem ELISA testova vezivanja i in vitro testova ubijanja ciljnih ćelija.

[0047] 6 prečiščenih NKG2DL-α3-iFv.2 proteina je testirano ELISA testom vezivanja FGFR3 kako bi se potvrdilo istovremeno vezivanje za FGFR3 cilj i NKG2D receptor. FGFR3 u fosfatnom puferu (PBS) je korišćen za oblaganje Maxisorp ploča, pri koncentraciji od 2 ug/ml. Svaki NKG2DL-α3-iFv.2 protein je titriran, ostavljen da se veže za FGFR3 tokom 1 sata i ispran, da bi se uklonio nevezani protein. Vezani NKG2DL-α3-iFv.2 protein je detektovan pomoću konjugata NKG2D-Fc i anti-Fc-HRP. Slika 10 pokazuje da se svih 6 NKG2DL-α3-iFv.2 proteina potentno vezalo za FGFR3, kao što je i očekivano, putem interakcije sa iFv.2 domenom, i da su NKG2DL α1-α2 domeni zadržali aktivnost vezivanja za NKG2D, čime je demonstirano da vezani α3-iFv domen obezbeđuje funkcionalnu aktivnost vezivanja FGFR3 proteinima ULBP i OMPC, koji, kao i MIC proteini, vezuju NKG2D.

[0048] Sposobnost NKG2DL-α3-iFv.2 proteina da preusmere liziranje ciljnih ćelija koje eksprimiraju FGFR3, posredovano NK ćelijama, demonstrirana je in vitro testom oslobađanja kalceina. Linija ćelija prirodnih ubica (NK), NKL, gajena je zajedno sa P815 ciljnim ćelijama sa preuzetim kalceinom, koje ektopično eksprimiraju FGFR3. Rezultati sa slike 11 pokazali su da OMCP-α3-iFv.2 indukuje najveće NK-posredovano liziranje, dok su svi drugi NKG2DL-α3-iFv.2 proteini prikazali specifičnu aktivnost ubijanja, sa različitim stepenima potencije i količine liziranja. Ovi rezultati su potvrdili da iFv prema pronalasku obezbeđuje specifičnu aktivnost vezivanja za druge proteine koji su zadržali svoje sopstvene funkcionalne karakteristike i indukovali različite nivoe ćelijski posredovanog liziranja ćelija koje su pomoću iFv markirane kao ciljne.

[0049] Primer 3 (Modifikovani α1-α2 domeni NKG2D liganada). Ovo su primeri vezivanja polipeptida za NKG2DL koji su modifikovani kako bi im se značajno poboljšao afinitet vezivanja za humani NKG2D receptor. α1-α2 domen MIC proteina je NKG2DL za NKG2D receptor. Ovaj afinitet je dovoljan za fiziološku aktivaciju NK ćelija i stimulisanje liziranja ćelija koje eksprimiraju nativne MIC proteine potpune dužine ireverzibilno vezani za dvodimenzionalnu površinu plazma membrane "ciljne ćelije" (Bauer S, Groh V, Wu J, Steinle A, Phillips JH, Lanier LL, Spies T., Science. 1999 Jul 30;285(5428):727-9.). Međutim, pošto konstruisani solubilni MIC proteini iz ovog otkrića reverzibilno vezuju specifične ciljne antigene na površini ciljne ćelije, afinitet vezivanja konstruisanog solubilnog MIC proteina za NKG2D će direktno uticati na stabilnost solubilnog MIC-zavisnog kompleksa formiranog između NK ćelija i ćelija koje eksprimiraju ciljne antigene. Naročito ako je afinitet između sMICA i NKG2D povećan znatno sporijom stopom disocijacije ili stopom otpuštanja modifikovanog sMICA od NKG2D, očekivalo bi se da će ubijanje zasnovano na NK ćelijama biti veće pri nižim gustinama solubilnih MIC molekula vezanih za ciljnu ćeliju. Pre predmetnog otkrića nije identifikovana nijedna α1-α2 mutacija koja menja aktivnost ubijanja koju pokazuju solubilni MIC proteini ili koja značajno smanjuje brzinu otpuštanja kako bi se povećao afinitet MIC proteina za NKG2D. Napori uloženi u kompjutersko dizajniranje su pokazali su da tri mutacije u α1-α2 domenu divljeg tipa MICA: N69W, K152E i K154D (WED-MICA), u kombinaciji, mogu umereno da utiču na afinitet vezivanja NKG2D tako što utiču na stabilnost nevezanog MICA i samim tim na njegovu stopu asocijacije ili stopu vezivanja za NKG2D (Lengyel CS, Willis LJ, Mann P, Baker D, Kortemme T, Strong RK, McFarland BJ.J Biol Chem. 2007 Oct 19;282(42):30658-66. Epub 2007 Aug 8); Naknadni opsežni rad na računarskom dizajnu iste grupe skeniranjem iterativnim proračunima 22 aminokiselinske pozicije MICA teoretski u kontaktu sa NKG2D, prema objavljenim

2

strukturnim opisima (Li P, Morris DL, Willcox BE, Steinle A, Spies T, Strong RK., Nat Immunol. 2001 May;2(5):443-451), eksperimentalno je pokazao da, kada se kombinuje sa ranije dizajnirane 3 promene, dalji racionalni, iterativni računarski dizajn MICA kvalitativno menja njegov afinitet za NKG2D od slabog (Kd ~2.5 µM) u umereno visok (Kd = 51 nM) sa ukupno sedam kombinovanih mutacija (Henager, Samuel H., Melissa A. Hale, Nicholas J. Maurice, Erin C. Dunnington, Carter J. Swanson, Megan J. Peterson, Joseph J. Ban, David J. Culpepper, Luke D. Davies, Lisa K. Sanders, and Benjamin J. McFarland, 2102, Combining different design strategies for rational affinity maturation of the MICA-NKG2D interface. Protein Science 21:1396-1402). Nasuprot tome, prema ovde opisanom eksperimentalnom pristupu, eksperimentalno su odabrane modifikacije amino-kiselina u MICA, koje su usporile stopu otpuštanja isključenja između α1-α2 domena MICA i NKG2D, počevši od MICA stabilizovanog sa 3 WED promene prema autorima Lengiel et al. (Lengyel CS, Willis LJ, Mann P, Baker D, Kortemme T, Strong RK, McFarland BJ., J Biol Chem. 2007 Oct 19;282(42):30658-66. Epub 2007 Aug 8).

[0050] Ovaj primer predmetnog otkrića se odnosi na modifikaciju afiniteta vezivanja solubilnih MIC proteina za NKG2D, kroz uvođenje putem inženjeringa, specifičnih mutacija na odabranim pozicijama amino-kiselina unutar α1-α2 domena, koje utiču na vezujuću kinetiku stope otpuštanja i na taj način menjaju aktivnost ubijanja posredovanu NK ćelijama, ne-prirodnih, ciljanih MIC molekula prema pronalasku.

[0051] Da bi se konstruisali solubilni ne-prirodni α1-α2 domeni sa izmenjenim afinitetom za NKG2D, 57 ostataka u α1-α2 domenu je izabrano za ekstenzivnu mutagenezu (slika 12). Sintetisane su biblioteke sintetičke DNK koja kodira α1-α2 domen i sadrži NNK mutagene kodone na svakoj od 57 pozicija amino-kiselina, individualno klonirane kao fuzije sa pIII manjeg proteina omotača M13 faga, i čestice faga koje prikazuju mutagene varijante α1-α2 su proizvedeni u ćelijama SS320 E.coli prema standardnim metodologijama (Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C., and Barbas, C. F., 3rd. (2011) Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011). α1-α2 fagne biblioteke su sortirane po rastućem afinitetu vezivanja pomoću rekombinantnog biotinilisanog NKG2D kao ciljnog antigena i provedene kroz cikluse iterativnih rundi namerno produženog vezivanja, produženog ispiranja i elucije fagnih klonova, kako bi bile selektovane visokoafinitetne varijante sa povećanim sadržajem varijanti sa niskim stopama disocijacije ili otpuštanja. Set specifičnih amino-kiselinskih mutacija javio se sa velikom učestalošću na 6 pozicija u α1-α2 i

2

one su odabrane kao poželjne amino-kiselinske supstitucije sa pojačanim afinitetom vezivanja za NKG2D (slika 12, tabela 1).

Tabela 1. Odabrane afinitetne mutacije na naznačenih 6 amino-kiselinskih pozicija α1-α2 domena u MIC. Amino-kiseline u SEQ ID NO: 35 na svakoj od 6 pozicija su prikazane podebljanim slovima u prvom redu tabele. Identifikovane afinitetne mutacije su navedene po opadajućoj učestalosti, odozgo na dole. Sve amino-kiseline su predstavljene jednoslovnim skraćenicama po IUPAC-u.

[0052] Sintetisali smo DNK polinukleotide (SEQ ID NO. 27-30) koji kodiraju α1-α2 domene 4 reprezentativne varijante 15, 16, 17, 18, koje su sadržale različite kombinacije specifičnih otkrivenih mutacija (tabela 2).

2

Tabela 2. Sekvence specifičnih varijanti α1-α2 domena. Specifične amino kiselinske supstitucije za varijante 15, 16, 17 i 18 (SEQ ID NOS.: 31-34, redom) navedene su u odnosu na podebljane amino kiseline iz SEQ ID NO.:35. Sve amino kiseline su predstavljene jednoslovnim skraćenicama po IUPAC-u.

[0053] Za NKG2DL ligande iz prethodnih primera smo direkno vezali heterologe molekule kao što su polipeptidi, za svaki od ova 4 modifikovana α1-α2 NKG2DL liganda, koristeći linker peptide. Četiri proteina sa His tagom (SEQ ID NO.: 31-34) koji se sastoje od modifikovanih NKG2DL liganada sa vezanim heterologim molekulima, eksprimirani su u ćelijama insekata i prečišćeni kako bi se okarakterisale njihove aktivnosti vezivanja za NKG2D i kinetički parametri vezivanja. Koristeći ELISA test kompetitivnog vezivanja, odredili smo relativne NKG2D-vezujuče aktivnosti za 4 modifikovane α1-α2 varijante. Solubilni NKG2DL divljeg tipa (WT), sMICA protein, korišćen je za oblaganje maxisorp ELISA ploča, kako bi se obezbedio partner za vezivanje za humani NKG2D-Fc reagens. Rastvori sa četiri α1-α2 varijante kao i sa WT i WED- α1-α2 domenima (SEQ ID NO.: 35) titrirani su u bunarčićima za ELISA test i ostavljeni su da kompetitivno inhibiraju vezivanje 2nM humanog NKG2D-Fc za WT sMICA kojim je ploča bila obložena. Nivo humanog NKG2D-Fc koji se vezao za WT NKG2DL na ploči, detektovan je pomoću anti-Fc-HRP antitela. Slika 13, panel A, pokazuje da su varijante 16, 17 i 18 prikazale IC50vrednosti 0,7, 0,6, 0,5 nM, dok je varijanta 15 prikazala IC50vrednost od 1,7 nM, pri čemu su sve posedovala značajno bolje vezivanje za NKG2D, 27, 32, 38 i 11 puta boljeod WT NKG2DL, redom, kao i značajno bolje od WED-MICA (tabela 3).

Tabela 3. Ravnotežni i kinetički parametri vezivanja za α1-α2 varijante. IC50vrednosti su izvedene iz četvoroparametarskog fitovanja titracija kompetitivnog vezivanja (slika 12), a kinetički parametri vezivanja su izvedeni iz pojedinačnog eksponencijalnog fitovanja kinetike vezivanja (slika 13). Ravnotežne konstante vezivanja (Kd) izvedene su iz kinetičkih parametara vezivanja pomoću jednačine Kd= kOFF/ kON.

2

[0054] Važno je reći da su se relativne IC50razlike takođe očitovale u vidu boljeg vezivanja za mišji NKG2D-Fc (slika 13, panel B), i da su pokazale sposobnost da poboljšaju vezivanje solubilnih modifikovanih α1-α2 domena i kod humanih i ne-humanih NKG2D receptora, što predstavlja važno svojstvo za preklinički razvoj lekova.

[0055] Da bi se razumela kinetička osnova za izmenjene afinitete, merene su i stope vezivanja i otpuštanja za α1-α2 varijantu NKG2DL liganada koja se vezuje za biotinilovani humani NKG2D kojim je obložena površina, pomoću interferometrije biosloja (Octet) na 100 nM svakog od modifikovanih α1-α2 proteini. U skladu sa rezultatima za IC50iz ELISA testa, svaka od varijanti 16, 17 i 18, pokazala je značajno smanjenje stope otpuštanja (18 puta u odnosu na WT), što je u velikoj meri odgovorno za povećanje afiniteta (~30 puta u odnosu na WT a1- a2)(slika 14; tabela 3). Iako je varijanta 15 pokazala sličnu sporu stopu otpuštanja kao i 16, 17 i 18, njena stopa vezivanja je smanjena, što je rezultiralo afinitetom jačim od WT, ali slabijim od varijanti 16, 17 i 18. Zato što je jedina razlika između varijante 15 ( SEQ ID NO.:31) i 16 (SEQ ID NO.:32) je bio K125N u odnosu na K125L, mutacija na poziciji 125 je jasno promenila stopu vezivanja, dok je smanjena stopa otpuštanja pripisana mutaciji H161R. Stoga, dok je odabrani set NKG2DL mutacija (tabela 1) korišćen za povećanje afiniteta α1-α2 za NKG2D putem značajnog smanjenja stope otpuštanja, određene supstitucije su takođe promenile stopu vezivanja što je dovelo do niza postepenih povećanja afiniteta za koje smo u ovom otkriću pokazali da imaju diferencijalnu aktivnost u testovima ubijanja posredovanog NK ćelijama, kao što je opisano u nastavku teksta.

[0056] Sposobnost α1-α2 afinitetnih varijanti da preusmere liziranje ciljnih ćelija koje eksprimiraju FGFR3, posredovano NK ćelijama, demonstrirana je in vitro testom oslobađanja

2

kalceina. Humana linija ćelija prirodnih ubica (NK), NKL, gajena je zajedno sa P815 ciljnim ćelijama sa preuzetim kalceinom, koje ektopično eksprimiraju FGFR3 i titrirana je solubilnim modifikovanim MIC proteinima. Rezultati sa slike 15 pokazali su da su aktivnosti ubijanja FGFR3-specifičnih solubilnih MIC varijanti u korelaciji sa njihovim projektovanim α1-α2 afinitetima. Konkretno, varijante 16, 17 i 18 su pokazale ~15 puta više ubijanja od WT pri 0,78 nM. WED-MICA (SEQ ID NO.:35) je bio samo nešto bolji od WT. Dakle, otkriće opisuje supstitucije amino-kiselina unutar α1-α2 domena koje su povećale afinitet vezivanja NKG2D smanjenjem stope vezivanja solubilnog MIC proteina za humani NKG2D i posledično dovele do predvidljivo povećane sposobnosti ubijanja. WED-MICA, koji je pokazao nešto veći afinitet od WT MICA prema NKG2D (slika 13, panel A) povećanjem stope vezivanja, a ne smanjenjem stope otpuštanja (slika 14), nije pokazao značajno poboljšanje ubijanja ciljnih ćelija (slika 15). Štaviše, kao što je prikazano na slici 13, panel B, WED-MICA je pokazao znatno slabije vezivanje za mišji NKG2D nego čak i WT MICA, dok je svaka od varijanti 15, 16, 17 i 18 pokazivala veći afinitet i za humani i za mišji NKG2D, slika 13, paneli A i B.

[0057] Ove α1-α2 NKG2DL afinitetne varijante 15, 16, 17 i 18 pojačale su afinitet vezivanja vezanog polipeptida za NKG2D receptor i time poboljšale liziranje ciljanih ćelija posredovano NK ćelijama, slika 15.

Primer 4 (Ne-prirodni α1- α2 domeni NKG2D liganada i srodni ne-prirodni NKG2D receptori za koje se oni vezuju)

[0058] α1-α2 domen MICA i drugih NKG2D liganada vezuje NKG2D receptor na poznatom specifičnom mestu (Li et al 2001; Benjamin J. McFarland, Tanja Kortemme, Shuyuarn F. Yu, David Baker, and Roland K. Strong. Symmetry Recognizing Asymmetry: Analysis of the Interactions between the C-Type Lectin-like Immunoreceptor NKG2D and MHC Class I-like Ligands. Structure, Vol.11, 411-422, April, 2003) i pokreće aktivaciju imune ćelije koja nosi NKG2D receptor, što posledično ubija ciljne ćelije koje prikazuju MICA ili druge ligande. Iskoristili smo fagni displej kako bi inženjeringom izmenili ne-prirodne α1-α2 domene MICA ekstenzivnom mutagenezom na 57 specifičnih mesta koja su verovatno uključena u vezivanje za NKG2D (slika 16). Biblioteke sintetičkih DNK koje kodiraju α1-α2 domen i sadrže NNK mutagene kodone na svakoj od 57 amino-kiseinskih pozicija, su sintetisane i individualno klonirane kao fuzije sa pIII manjim proteinom omotača M13 faga, i čestice faga koje prikazuju mutagenizovane α1-α2 varijante su proizvedene u SS320 E.coli ćelijama u skladu sa standardnim metodologijama (Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C., and Barbas, C. F., 3rd, 2011. Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011). α1-α2 fagne biblioteke su sortirane po rastućem afinitetu vezivanja pomoću rekombinantnog biotinilisanog NKG2D kao ciljnog antigena i provedene kroz cikluse iterativnih rundi namerno produženog vezivanja, produženog ispiranja i elucije fagnih klonova, kako bi bile selektovane visokoafinitetne varijante sa povećanim sadržajem varijanti sa niskim stopama disocijacije ili otpuštanja. Set specifičnih amino-kiselinskih mutacija na 9 pozicija u α1-α2 domenu je odabrano kao poželjna mesta amino-kiselinskih supstitucija sa pojačanim afinitetom vezivanja za NKG2D. Sintetisali smo DNK polinukleotide koji kodiraju α1-α2 domene 8 reprezentativnih varijanti (SEQ ID NO: 55-62) koje sadrže različite kombinacije specifičnih mutacija (tabela 4).

Tabela 4. Ne-prirodne varijante α1-α2 domena, odabrane na osnovu rastućeg afiniteta za prirodni NKG2D receptor i prethodno opisana MICwed varijanta (McFarland et al., 2003). Pozicije naznačenih amino-kiselinskih promena su navedene u odnosu na pozicije ostataka u SEQ ID NO.: 42 i obezbeđena su uobičajena imena varijanti kao i njihov SEQ ID NO.

1

[0059] DNK polinukleotidi koji kodiraju 8 varijanzi α1-α2 domena, amplifikovani su pomoću PCR prajmera (SEQ ID NO.: 63-64). Pomoću Blp1 i Sap1 restrikcionih enzima, svaki je subkloniran u α1-α2-α3-Fv fuzioni ekspresioni konstrukt (SEQ ID NO.:65) sa His tagom kako bi se mutiranim α1-α2 sekvencama zamenila sekvenca koja kodira prirodne (wt) α1-α2 sekvence. 9 fuzionih proteina (SEQ ID NO.: 66-74) je eksprimirano u ćelijama 293 (Expi293<™>Expression System, Life Technologies, Thermo Fisher, Inc.) i afinitetno prečišćeno pomoću Ni-afinitetne hromatografije (HisTrap HP, GE Healthcare Life Sciences).

[0060] Kako bismo konstruisali NKG2D receptorske proteine, sintetisali smo DNK koja kodira ekstracelularni domen ("ektodomen") receptora divljeg tipa (SEQ ID No.:75) i koristili PCR prajmere (SEQ ID NO.: 76-77) i XbaI i BamHI mesta kako bismo klonirali sintetičku DNK u N-terminalni His-avitag ekspresioni vektor (SEQ ID NO.: 78). His-avitag-prirodni NKG2D (SEQ ID NO.:79) je prolazno eksprimiran u ćelijama 293 i prečišćen pomoću Niafinitetne hromatografije. Nakon prečišćavanja, NKG2D proteini su mesto-specifično biotinilisani tako što je upotrebljen BirA kako bi se biotinska grupa vezala za avitag sekvencu (komplet za standardnu reakciju BirA biotin-protein ligaza, Avidity, LLC, Aurora, CO.).

[0061] Kako bismo okarakterisali i uporedili kinetičke parametre vezivanja prirodnog α1-α2 domena, kao i njegovih 8 varijanti, za prirodni NKG2D, merili smo njihovo vezivanje za biotinilisani prirodni NKG2D ektodomen kojim je obložena površina, koristeći interferometriju slojeva (Octet) na 100 nM svakog od α1-α2-α3-Fv fuzionih proteina. Rezultati su prikazani u tabeli 5.

Tabela 5: Kinetički parametri divljeg tipa (wt ili prirodnog) i 8 varijanti α1-α2 domena α3-Fv fuzionih proteina koji se vezuju za prirodni NKG2D. MICwed-Fv je ovde proučavan u 2 zasebne Octet analize, jednom tako što je poređen sa wt α1-α2 domen α3-Fv fuzijom, a drugi put sa 7 drugih ne-prirodnih α1-α2 domen α3-Fv fuzije. Uobičajena imena svake varijante α1-α2 domena i SEQ ID NO. za njihove α3-Fv fuzione proteine su obezbeđeni zajedno sa njihovim vrednostima afiniteta (Kd) u molovima (M), stopama vezivanja (kon) u recipročnim mol sekundama (1/Ms), i stopama disocijacije ili otpuštanja (kdis) u recipročnim sekundama.

2

[0062] Kao što je prikazano u tabeli 5, odabrane mutacije α1-α2 domena kao fuzije sa heterologim polipeptidima α3-Fv iz SEQ ID NO.: 68-74 povećale su afinitet α1-α2 domena za prirodni NKG2D kroz značajno smanjenje stope otpuštanja. Stope otpuštanja su se kretale od 20 do više od 100 puta sporije od onih kod Wt (SEQ ID NO.:66) i prethodno opisane varijante α1-α2 domena, MICwed (SEQ ID NO.:67).

[0063] U ovom primeru predmetnog otkrića, mi smo dalje demonstrirali, kao što je opisano u nastavku teksta, da je ne-prirodni α1-α2 domen (DSM25, SEQ ID NO.:57, tabela 4) koji je kao α1-α2-α3-Fv fuzija imao visok afinitet za prirodni NKG2D i veoma sporu stopu otpuštanja (tabela 2; SEQ ID NO.:69), prikazao čvrst afinitet vezivanja za ne-prirodni NKG2D receptor koji sadrži specifičnu mutaciju koja je ukinula njegovo vezivanje za prirodne NKG2D ligande. Drugi su pokazali da mutacije na tirozinu 152 i tirozinu 199 u humanom NKG2D, što je ekvivalentno pozicijama 73 i 120 ektodomena NKG2D (SEQ ID NO.:75 i slika 17), ukidaju vezivanje za prirodni ligand, MICA (David J. Culpepper, Michael K. Maddox1, Andrew B. Caldwell, and Benjamin J. McFarland. Systematic mutation and thermodynamic analysis of central tyrosine pairs in polyspecific NKG2D receptor interactions. Mol Immunol. 2011 January ; 48(4): 516-523).

[0064] Kako bi konstruisali ne-prirodne NKG2D receptorske proteine, koristili smo PCR prajmere (SEQ ID NO.:76-77) da bi klonirali DNK koja kodira prirodni NKG2D ektodomen (SEQ ID NO.:75) i inserirali je u N-terminalni His-avitag ekspresioni vektor SEQ ID NO.:78 u cilju dobijanja His-avitag-NKG2D (SEQ ID NO.:79). Mesto-usmerena mutageneza je sprovedena na DNK konstruktima prirodnog NKG2D ektodomena da bi se uvele mutacije Y152A, Y199A ili Y152A plus Y199A, i kreirale tri ne-prirodne varijante humanog NKG2D (SEQ ID NO.: 80-82, redom). Prirodni NKG2D i 3 ne-prirodna NKG2D mutanta sa Hisavitagovima su prolazno eksprimirani u ćelijama 293 i prečišćeni pomoću Ni-afinitetne hromatografije. Nakon prečišćavanja, NKG2D proteini su mesto-specifično biotinilisani tako što je upotrebljen BirA kako bi se biotinska grupa vezala za avitag sekvencu (komplet za standardnu reakciju BirA biotin-protein ligaza, Avidity, LLC, Aurora, CO.).

[0065] Da bi se generisale fuzije α3-Fc heterologih polipeptida sa α1-α2 domenom MICwed (SEQ ID NO.:55) i DSM25 α1-α2 domenom (SEQ ID NO.: 57), DNK polinukleotidi koji kodiraju α1-α2 domene, amplifikovani su pomoću PCR prajmera (SEQ ID NO.: 63-64). Koristeći XbaI i NcoI restrikcione enzime, svaki je subkloniran u α1-α2-α3-Fc fuzioni ekspresioni konstrukt (SEQ ID NO.:83) da bi se sekvenca koja kodira prirodne (wt) α1-α2 sekvence zamenila mutiranim α1-α2 sekvencama. 3 fuziona proteina, MICA-Fc (SEQ ID NO.: 84), MICwed-Fc (SEQ ID NO.: 85) i MICv25-Fc (SEQ ID NO.: 86) su eksprimirani u ćelijama 293 (Expi293™ Expression System, Life Technologies, Thermo Fisher, Inc.) i afinitetno prečišćeni korišćenjem afinitetne hromatografije sa proteinom A (kat. br. 20334, Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

[0066] Pored prečišćavanja gornja 3 Fc-fuziona proteina, NKG2D ligand-Fc fuzioni proteini MICB-Fc, ULBP1-Fc, ULBP2-Fc, ULBP3-Fc i ULBP4-Fc su kupljeni od R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). Vezivanje različitih fuzija α1-α2 domen-Fc za prirodne i ne-prirodne proteine NKG2D ektodomena je analizirano korišćenjem ELISA metode u formatu ploče. Sve prirodne i ne-prirodne fuzije α1-α2 domen-Fc su obložene preko noći na 4°C na Odvojeni bunarčići Maxisorp ploča sa 96 bunarčića obloženi su preko noći na 4°C sa svim prirodnim i ne-prirodnim fuzijama α1-α2 domen-Fc, koristeći koncentraciju za oblaganje od 2µg/ml u fosfatnom puferu (PBS). Ploče su isprane 3 puta u PBS/0,05% Tween20 na 20-22°C i blokirane sa 0,5% goveđeg serumskog albumina tokom 2 sata. Biotinilovani prirodni i neprirodni proteini NKG2D receptora su titrirani pomožu NKG2D liganda vezanih za ploču 2 sata na 20-22°C, isprani 3 puta sa PBS/0,05% Tween20 na 20-22°C i vezani NKG2D proteini su nakon toga detektovani pomoću streptavidin-HRP sekundarnog koraka detekcije i razvijeni reagensom 1-Step Ultra TMB Elisa. Prirodni oblik ektodomena NKG2D (SEQ ID NO.:75) bio je sposoban da veže sve testirane fuzije α1-α2 domena-Fc (slika 18, panel A). Ne-prirodni ligand MIC-v25 α1-α2 domena vezan sa najvećim afinitetom (EC50= 14 nM), koji je bio 8 puta bolji od MICwed i više od 100 puta bolji od svih testiranih prirodnih liganda α1-α2 domena (slika 18, panel A). Svi testirani ligandi, i prirodni i ne-prirodni α1-α2 domeni, izgubili su vezivanje za Y199A (SEQ ID NO.:81; slika 18, panel B) i za dvostruke, Y152A

4

plus Y199A (SEQ ID NO.:82; slika 18, panel D) mutantne NKG2D receptore. Međutim, od svih testiranih prirodnih i ne-prirodnih liganada α1-α2 domena, samo je ne-prirodni α1-α2 domen (SEQ ID NO.:57) iz MICv25-Fc (SEQ ID NO.:86) zadržao vezivanje za Y152A mutantni NKG2D ektodomen (SEQ ID NO.:80) sa EC50 od 50 nM (slika 18, panel C).

[0067] Dok specifičnost vezivanja prirodnog NKG2D pokazuje preferenciju za ne-prirodne ligande visokog afiniteta, njegovo snažno vezivanje za prirodne NKG2D ligande, koji su prisutni na određenim zdravim tkivima i mnogim tkivima pod stresom, stvara ekstremni rizik od toksičnosti ako se koriste aktuelni NKG2D CAR pristupi (VanSeggelen et al. 2015). Y152A ne-prirodni NKG2D receptor specifično se vezuje samo za protein koji se sastoji od visokoafinitetnog ne-prirodnog α1-α2 domena koji je inženjeringom izmenjen tako da ima istaknuto smanjenje stope otpuštanja. Ovaj prototipski primer je istakao sposobnost neprirodnih α1-α2 domena da se vežu za ne-prirodne NKG2D receptore, čime je omogućena selektivna kontrola ne-prirodnih NKG2D CAR receptora pomoću bispecifičnih proteina koji sadrže ne-prirodne α1-α2 domene NKG2D liganada prema pronalasku.

Primer 5 (modifikovani α1-α2 domeni NKG2D liganada).

[0068] Ovaj aspekt otkrića se odnosi na dodatne afinitetne varijante α1-α2 NKG2DL dobijene inženjeringom α1-α2 domena ULBP proteina. ULBP proteini sadrže α1-α2 domene, koji su NKG2D ligandi sposobni da se vežu za NKG2D receptor (Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi: 10.1034/j. 1399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652). Ovaj afinitet NKG2D vezivanja je dovoljan za fiziološku aktivaciju NK ćelija i stimulaciju liziranja ćelija koje eksprimiraju prirodne ULBP proteine pune dužine prirodno i ireverzibilno vezane za dvodimenzionalnu površinu plazma membrane "ciljne ćelije" (Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi: 10.1034/j. 1399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652). Međutim, pošto inženjeringom dobijeni solubilni α1-α2 domeni, fuzionisani sa heterologim polipeptidima u određenim aspektima ovog otkrića, reverzibilno vezuju specifične ciljne antigene na površini ciljne ćelije, afinitet vezivanja inženjeringom dobijenih ULBP α1-α2 domena za NKG2D direktno će uticati na stabilnost veštačke sinapse koja se formira između NK ćelija i ćelija koje eksprimiraju ciljne antigene, kao što je već pokazano za inženjeringom dobijene solubilne MIC proteine (primeri 2-4). Da bi se diverzifikovao repertoar inženjeringom dobijenih ne-prirodnih α1-α2 domena kao NKG2D liganada, ULBP proteini su korišćeni kao supstrat ili polazna tačka za inženjering na bazi fagnog displeja, njihovog afiniteta vezivanja za NKG2D. Uprkos strukturnoj homologiji uočenoj kod ULBP proteine i MICA (Radaev, S., Rostro, B., Brooks, AG., Colonna, M., Sun, PD. (2001) Conformational plasticity revealed by the cocrystal structure of NKG2D and its class I MHC-like Ligand ULBP3. Immunity 15, 1039-49.), homologija sekvence je <50% za ULBP α1-α2 domene u odnosu na MICA. Stoga smo pokušali da utvrdimo koje su to pozicije kodona u ULBP α1-α2 domenima koje poboljšavaju afinitet vezivanja NKG2D.

[0069] Da bi se konstruisali solubilni, ne-prirodni α1-α2 domeni iz ULBP proteina, ULBP2 i ULBP3 su izabrani za fagni displej i selekciju mutanata sa visokim afinitetom vezivanja za NKG2D. Šezdeset amino-kiselinskih pozicija u α1-α2 domenu ULBP2 (SEQ ID NO: 16), i trideset šest amino-kiselinskih pozicija u α1-α2 domenu ULBP3 (SEQ ID NO: 17), izabrano je za ekstenzivnu mutagenezu. Pored toga, napravljene su konzervativne mutacije cistein-userin na C8S u ULBP2 (SEQ ID NO: 16) i C103S u ULBP3 (SEQ ID NO: 17) čime su eliminisani neuparene slobodni cisteini kako bi se povećala stabilnost i funkcionisanje NKG2D liganda sa vezanim polipeptidima kao i za poboljšanje procesa panovanja faga. Biblioteke sintetičke DNK koje kodiraju ove α1-α2 domene modifikovane tako što je cistein zamenjen serinom, i koje sadrže NNK mutagene kodone na svakoj od odabranih aminokiselinskih pozicija, sintetisane su pojedinačno; klonirani kao fuzije sa pIII manjim proteinom omotača M13 faga; i čestice faga koje prikazuju mutagenizovane α1-α2 ULBP2 ili ULBP3 varijante proizvedene su u ćelijama SS320 E.coli prema standardnim metodologijama (Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C., and Barbas, C. F., 3rd. (2011). Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011). α1-α2 fagne biblioteke su sortirane po rastućem afinitetu vezivanja za NKG2D pomoću humanog NKG2D-Fc kao ciljnog antigena i provedene kroz cikluse iterativnih rundi namerno produženog vezivanja, produženog ispiranja i elucije fagnih klonova, kako bi bile selektovane visokoafinitetne varijante sa povećanim sadržajem varijanti sa niskim stopama disocijacije ili otpuštanja. Za ULBP2 su nađene specifične amino-kiselinske mutacije sa visokom učestalošću na pozicijama R80, V151, V152 i A153 u α1-α2, i identifikovane su kao poželjne amino-kiselinske supstitucije sa pojačanim afinitetom vezivanja NKG2D (slika 19, panel A; i tabela 6).

Tabela 6. Odabrane afinitetne mutacije na naznačene 4 amino-kiselinske pozicije α1-α2 domena ULBP2. Amino-kiseline iz SEQ ID NO: 16 na svakoj od 4 pozicije su prikazane podebljanim slovima u prvom redu tabele. Identifikovane afinitetne mutacije su navedene po opadajućoj učestalosti odozgo na dole. Sve amino-kiseline su predstavljene jednoslovnim skraćenicama po IUPAC-u.

[0070] Za ULBP3, specifične mutacije aminokiselina su pronađene sa visokim učestalostima na različitim lokacijama u odnosu na ULBP2. Pozicije R162 i K165 u α1-α2 domenu ULBP3 sadržale su specifične mutacije koje su identifikovane kao poželjne supstitucije aminokiselina sa pojačanim afinitetom za vezivanje NKG2D (slika 19, panel B; i tabela 7). Ovi modifikovani ne-prirodni α1-α2 domeni izvedeni iz ULBP2 i ULBP3 mogu da se koriste za pojačano vezivanje NKG2D u višestrukim terapeutskim formatima kao pojedinačni proteini ili fuzije sa heterologim peptidima ili polipeptidima.

Tabela 7. Odabrane afinitetne mutacije na naznačene 2 amino-kiselinske pozicije α1-α2 domena ULBP3. Amino-kiseline iz SEQ ID NO: 17 na svakoj od 2 pozicije su prikazane podebljanim slovima u prvom redu tabele. Identifikovane afinitetne mutacije su navedene po opadajućoj učestalosti odozgo na dole. Sve amino-kiseline su predstavljene jednoslovnim skraćenicama po IUPAC-u.

Primer 6 (vezivanje i citoliza pomoću modifikovanih α1-α2 domena ULBP proteina, fuzionisanih sa peptidima antitela).

[0071] Sledeći primer se odnosi na vezivanje polipeptida antitela za NKG2DL koji su modifikovani da značajno poboljšaju njihov afinitet vezivanja za humani i mišji NKG2D receptor. α1-α2 domen svakog ULBP proteina je prirodni ligand za NKG2D receptor, tj. NKG2DL. Antitela su visoko stabilni glikoproteini sastavljeni od dva velika teška lanca i dva mala laka lanca (slika 1). U struci nije postojao format IgG antitela koji može direktno da aktivira imune ćelije koristeći ne-prirodne ULBP α1-α2 domene koji se čvršće vezuju od nativnih ULBP domena za NKG2D receptor. Štaviše, ULBP α1-α2 domeni obezbeđuju alternativne NKG2DL za konstruisanje fuzije antitela koje mogu imati različita svojstva in vivo u odnosu na MICA α1-α2 domene. Na primer, in vivo odgovor antitela na lekove na MICA α1-α2 domene unutar fuzije antitela verovatno neće reagovati na ili ometati modifikovane ULBP α1-α2 domene zbog niske homologije sekvence između ULBP i MICA α1-α2 domena (slika 20). Ovaj primer pokazuje da su fuzije između konstruisanih ULBP α1-α2 NKG2D liganda (tabela 6 i 7) i teškog lanca IgG molekula poboljšale vezivanje NKG2D i ubijanje ciljnih ćelija u odnosu na prirodne ULBP α1-α2 NKG2D ligande. Ovo dalje pokazuje korisnost fuzije modifikovanih α1-α2 domena sa heterologim proteinima ili peptidima.

[0072] Da bi se generisale konstruisane fuzije α1-α2 domena sa antitelima, DNK sekvence koje kodiraju C8S modifikovane α1-α2 domene ULBP2 (SEQ ID NO.: 16) varijanti R80W i V151D (SEQ ID NO.: 87 i 88, respektivno) i C103S modifikovani α1-α2 domen ULBP3 (SEQ ID NO.: 17) varijante R162G (SEQ ID NO.: 89) je sintetisan i kloniran kao Cterminalne fuzije u sekvencu teškog lanca iz Her2-specifičnog antitela (Carter, P., Presta, L., Gorman, CM., Ridgway, JB., Henner, D., Wong, WL., Rowland, AM., Kotts, C., Carver, ME., Shepard, HM. (1992) Proc Natl Acad Sci 15, 4285-9.). Dobijene fuzije su klonirane u ekspresioni vektor sisara pD2509 i eksprimirane sa lakim lancem roditeljskog antitela kao uparena puna IgG antitela. Prolazne ekspresije su izvedene u ćelijama HEK293 korišćenjem sistema ekspresije Expi293 prema protokolu proizvođača (Life Technologies) i prečišćene korišćenjem standardne afinitetne hromatografije sa proteinom A. ELISA testiranje vezivanja sprovedeno na ULBP2 i ULBP3 α1-α2 fuziji teških lanaca antitela demonstriralo je modifikovane ULBP2 fuzije (HC_R80W i HC_V151D) i UBLP3 fuziju (HC_R162G) vezane sa većim afinitetom za humane NKG2D domene u odnosu na njihove odgovarajuće prirodne α1-α2 domene fuzionisane sa istim teškim lancem (slika 21, paneli A i B).

[0073] Da bi se okarakterisala svojstva ubijanja ciljnih ćelija koja pokazuju modifikovane fuzije ULBP antitela, humana linija ćelija prirodnih ubica (NK), NKL, je gajena zajedno sa ciljnim ćelijama SKBR3, sa preuzetim kalceinom, koje eksprimiraju Her2, i titrirana je sa konstruisanim fuzionim proteinima antitela. Rezultati na slici 22, paneli A i B, pokazali su da pojačane citolitičke (ubijajuće) aktivnosti Her2-specifičnih ne-prirodnih ULBP2 i neprirodnih ULBP3 α1-α2-antitela fuzije odražavaju poboljšane afinitete njihovih konstruisanih α1-α2 domena za NKG2D. Konkretno, fuzije ULBP2 varijante HC_R80W i HCV151D, i ULBP3 varijante fuzije HC R162G, ubijale su SKBR3 ćelije efikasnije nego fuzije antitela koje sadrže bilo koji nativni α1-α2 domen. Ovi podaci su dalje pokazali da su modifikovane fuzije varijante α1-α2 antitela univerzalna platforma za omogućavanje IgG molekulima da se čvrsto vežu za NKG2D i da usmere antigen-specifično liziranje ćelija.

Primer 7 (konstruisanje ortogonalnih ne-prirodnih α1-α2 domena sa selektivnim vezivanjem za Y152A ne-prirodni NKG2D)

[0074] Aktivno se traže sredstva za selektivnu kontrolu lečenja pomoću CAR-T ćelija, kako bi se ublažila toksičnost i poboljšala efikasnost protiv tumora (Gill and June, op cit). Postoje prethodni pokušaji da se razviju CAR receptori pomoću ektodomena iz CD16 koji zatim može da se angažuje preko Fc domena terapeutskih monoklonskih antitela, čime je omogućena kontrola usmeravanja pomoću CAR-T na bazi antitela (Chang et al., op cit. Međutim, CAR-T ćelije na bazi CD16, mogu da prepoznaju sve endogene molekule antitela u krvi i tkivima, pa će se terapeutska antitela koja se koriste za kontrolu ovih ćelija susretati sa interferencijom od strane endogenih CD16 receptora na NK ćelijama. Obe ove karakteristike mogu da kreiraju probleme sa toksičnošću izvan tumora i lošom farmakokinetikom, redom.

[0075] Da bismo rešili ove probleme, inežnjeringom smo kreirali ne-prirodne NKG2D CAR-T ćelije koje se ne vezuju ni za jedan prirodni NKG2D ligand i mogu da se kontrolišu vezivanjem visoko-afinitetnih ne-prirodnih α1-α2 domena, kao što je demonstrirano u primeru 4. Još jedan zahtev je da ne-prirodni α1-α2 domeni zadrže visoki afinitet za ne-prirodne NKG2D, a izbegnu vezivanje za prirodne NKG2D domene. Dakle, inženjeringom izmenjeni α1-α2 domeni koji ispoljavaju snažnu selektivnost za ne-prirodne NKG2D receptore u odnosu na prirodni NKG2D, predstavljaju idealan sistem za selektivnu kontrolu ne-prirodnih NKG2D CAR receptora, ili bilo kog receptora ili proteina fuzionisanog sa ne-prirodnim NKG2D ektodomenima koje selektivno mogu da angažuju ne-prirodni α1-α2 domeni.

[0076] Upotrebili smo prikazivanje na fagima kako bi inženjeringom dobili ortogonalne neprirodne α1-α2 domene koji ispoljavaju selektivno vezivanje za Y152A NKG2D receptor. Početna tačka je bio odabir tri ne-prirodna α1-α2 domena sa visokim afinitetom za prirodni NKG2D kao parentalnih domena za dalju mutagenezu i skrining putem prikaza na fagima. Biblioteke sintetičke DNK su generisane za pojedine varijante α1-α2 domena DSM25, ULBP2 R80W i ULBP3 R162G (SEQ ID NO: 57, 87 i 89), pri čemu su kodoni za aminokiselinske ostatke koji su u vezanom stanju pozicionirani blizu Y152 pozicije na NKG2D receptoru, zamenjeni NNK kodonima. DSM 25 biblioteke su se sastojale od NNK pozicija na ostacima 71-75 i 155-159, ULBP2 R80W biblioteke sa NNK kodonima na pozicijama 154-159 i ULBP3 R162G biblioteke sa NNK kodonima na pozicijama 155 -159. Biblioteke su klonirane kao fuzije sa pill sporednim proteinom omotača M13 faga; i čestice faga koje prikazuju mutagenizovane varijante α1-α2 domena proizvedene su u ćelijama SS320 E.coli prema standardnim metodologijama (Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C., and Barbas, C. F., 3rd. (2011). Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011). Biblioteke α1-α2 prikazane na fagima su sortirane prema visokoafinitetnom vezivanju za ne-prirodne Y152A NKG2D receptore, putem selektivnog hvatanja klonova faga, vezanih za biotinilisani Y152A NKG2D-Fc protein u prisustvu nebiotinilisanog prirodnog NKG2D-Fc kompetitivnog proteina. Selektivni klonovi su obogaćeni prolaskom kroz višestruke runde ciklusa kompetitivne selekcije sa rastućim koncentracijama nebiotinilisanog prirodnog NKG2D-Fc.

[0077] Posle četiri runde selekcije, klonovi faga su sekvencirani kako bi se identifikovale specifične mutacije unutar NNK mutagenih regiona. Tabele 8, 9 i 10 prikazuju odabrane

4

amino-kiseinske ostatke za koje je utvrđeno da su preovlađujući za svaki α1-α2 domen dobijen Y152A NKG2D selektivnim skriningom.

Tabela 8. Odabrane mutacije unutar DSM25 koje su dovele do Y152A-specifičnih klonova faga.

Tabela 9. Odabrane mutacije unutar ULBP2 R80W koje su dovele do Y152A-specifičnih klonova faga.

Tabela 10. Odabrane mutacije unutar ULBP3 R162G koje su dovele do Y152A-specifičnih klonova faga.

[0078] Da bi se potvrdilo da klonovi faga prikazuju korektno selektivno vezivanje, proizvedeni su fagi za pojedinačne klonove: MICA25.17, MICA25.18, ULBP2.S1, ULBP2.S2, ULBP2.S3, ULBP3.S1 i ULBP3.S2 (SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93, 94, 95 i 96, redom) i titrirani pomoću Y152A ili prirodnog NKG2D u ELISA testovima vezivanja. Slika 23, paneli A-C, pokazuju da svih 7 klonova faga prikazuju više od 10 puta intenzivnije selektivno vezivanje za ne-prirodne Y152A NKG2D u odnosu na prirodne NKG2D, odnosno NKG2D divljeg tipa.

[0079] Kako bismo potvrdili da Y152A-selektivne varijante α1-α2 domena zadržavaju specifične osobine vezivanja u kontekstu fuzija sa antitelima, klonirali smo MICA25.17 i ULBP2.S3 kao C-terminalne fuzije sa teškim lancem FGFR3-specifičnog antitela koje je prethodno opisano (Qing et al, 2009. op cit; SEQ ID NO.: 97 i 98, redom). Dobijene fuzije su klonirane u sisarski ekspresioni vektor pD2509 i koeksprimirane sa lakim lancem parentalnog antitela u vidu sparenih potpunih IgG antitela (R3 HC25.17 i R3 HC.U2S3). Prolazne ekspresije su izvedene u HEK293 ćelijama pomoću ekspresionog sistema Expi293 u skladu sa protokolom proizvođača (Life Technologies), i prečišćene standardnom afinitetnom hromatografijom pomoću proteina A. ELISA testovi koji mere vezivanje R3 HC25.17 i R3 HC.U2S3 fuzija α1-α2 teškog lanca antitela sa ne-prirodnim Y152A NKG2D i prirodnim NKG2D, demonstrirali su njihov značajno veći afinitet vezivanja za Y152A NKG2D u odnosu na prirodni NKG2D (slika 24, paneli B i D). Nasuprot tome, fuzije antitela sa DSM25 i ULBP2 R80W, ispoljile su favorizovano vezivanje za prirodni NKG2D-Fc (slika 24, paneli A i C). Ovi podaci zajedno demonstriraju otkriće ne-prirodnih ortogonalnih α1-α2 domena koji poseduju visok afinitet vezivanja za ne-prirodne NKG2D receptore i značajno smanjen afinitet vezivanja za prirodni NKG2D receptor. Osim toga, fuzije ortogonalnih α1-α2 domena sa polipeptidima antitela zadržavaju njihova svojstva selektivnog vezivanja i mogu da se koriste za preusmeravanje ne-prirodnih NKG2D receptora ka novim antigenima, na primer u kontekstu CAR-T ćelija.

Primer 8 (Aktivnost ciljanja i ubijanja CAR-T ćelija sa ne-prirodnim NKG2D ektodomenom se kontroliše pomoću ortogonalnih α1-α2 domena fuzionisanih sa antitelima za ciljanje).

[0080] Da bismo demonstrirali selektivnu kontrolu CAR-T ćelija konstruisanih sa himernim receptorom u kome se koristi ne-prirodni NKG2D ektodomen, konstruisali smo CAR receptore ili sa prirodnim NKG2D ili sa ne-prirodnim Y152A NKG2D ektodomenom, na osnovu prethodnog rada u kome su korišćeni 4-1BB/CD3zeta CAR konstrukti (Campana patent 8,399,645) u kojima je fuzionisan respektivni NKG2D ektodomen sa CD8 zglobnim regionom (slika 25) CAR receptora. Ovi konstrukti su klonirani u lentivirusni vektor i eksprimirani u primarnim humanim CD8-pozitivnim T-ćelijama putem lentivirusne transdukcije. Dobijene prirodne NKG2D CAR-T ćelije ispoljile su specifičnu aktivnost ubijanja ćelija in vitro, u skladu sa prepoznavanjem prirodnog MICA liganda koji je eksprimiran na ciljnim ćelijama. Konkretno, slika 26, panel A, prikazuje da iako NKG2D CAR-T ćelije ubijaju P1 ćelije koje eksprimiraju prirodne MICA ligande, ne-prirodne Y152A NKG2D CAR-T ćelije su u značajnoj meri onesposobljene i ispoljavaju dosta smanjeno ubijanje P1 ćelija koje eksprimiraju MICA. Osim toga, slika 26, panel B, prikazuje da ortogonalne fuzije α1-α2 teškog lanca antitela, R3 HC25.17 i R3 HC.U2S3, selektivno aktiviraju ne-prirodne Y152A CAR-T ćelije da ubijaju P1 ciljne ćelije koje eksprimiraju FGFR3, ali da nisu u stanju da preusmere aktivnost ubijanja prirodnih NKG2D CAR-T ćelija. Ovo je razlika u odnosu na R3 HC25 i R3 HC.U2R80W fuzije sa α1-α2 teškim lancima antitela koje nisu selektivne za ne-prirodni Y152A NKG2D i aktiviraju i prirodne i neprirodne CAR-T ćelije da ubijaju P1 ciljne ćelije. Ovi podaci pokazuju da ne-prirodni ortogonalni α1-α2 domeni, izmenjeni inženjeringom tako da se selektivno vezuju za neprirodni Y152A NKG2D, specifično aktiviraju ne-prirodne Y152A NKG2D CAR-T ćelije, u isto vreme izbegavajući prirodne NKG2D receptore.

4

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen prirodnog molekula NKG2D liganda, naznačen time što navedeni modifikovani α1-α2 domen sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 90, 91, 92, 93, 94, 95 ili 96.

2. Ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen prema patentnom zahtevu 1, koji dodatno sadrži vezani heterologi molekul za ciljanje, čime je kreiran bispecifični molekul.

3. Ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što je heterologi molekul peptid ili polipeptid.

4. Ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što je polipeptid antitelo ili fragment antitela.

5. Ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 4, za upotrebu u terapiji.

6. Ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen prema bilo kom od patentnih zahteva 2 do 5, za upotrebu u postupku lečenja kancera.

7. Ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen za upotrebu prema patentnom zahtevu 5 ili 6, naznačen time što se heterologi molekul za ciljanje isporučuje u sisarsku ćeliju koja ima za sebe vezan ne-prirodni ektodomen NKG2D receptora, pri čemu ne-prirodni ektodomen NKG2D receptora sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75, ali u kojoj je tirozin na poziciji 73 u SEQ ID NO: 75, zamenjen alaninom.

8. Ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 7, naznačen time što modifikovani α1-α2 domen ispoljava pojačanu aktivaciju ćelije koja eksprimira ne-prirodni NKG2D ektodomen, što dovodi do toga da ćelija ispoljava veću potenciju ubijanja ciljnih ćelija nego prirodni NKG2D ligand ili bispecifični molekul sa prirodnim ili nativnim α1-α2 domenom kada se isporuči u ćeliju,

pri čemu ne-prirodni ektodomen NKG2D receptora sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75, ali u kojoj je tirozin na poziciji 73 u SEQ ID NO: 75 zamenjen alaninom.

9. Ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen ispoljava veću aktivaciju ćelije koja eksprimira ne-prirodni NKG2D ektodomen nego ćelije koja eksprimira prirodni NKG2D ektodomen ćelije, što dovodi do toga da ćelija koja eksprimira ne-prirodni NKG2D ektodomen ispoljava veću potenciju ubijanja ciljnih ćelija nego ćelija koja eksprimira prirodni NKG2D ektodomen.

10. Ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što ne-prirodni, modifikovani α1-α2 domen ispoljava veću aktivaciju ćelije koja eksprimira ne-prirodni NKG2D ektodomen nego ćelije koja eksprimira prirodni NKG2D ektodomen ćelije, što dovodi do toga da ćelija koja eksprimira ne-prirodni NKG2D ektodomen ispoljava manju toksičnost nego ćelija koja eksprimira prirodni NKG2D ektodomen.

4