RS65794B1 - Antitela protiv pd-l1 - Google Patents

Antitela protiv pd-l1

Info

Publication number
RS65794B1
RS65794B1 RS20240875A RSP20240875A RS65794B1 RS 65794 B1 RS65794 B1 RS 65794B1 RS 20240875 A RS20240875 A RS 20240875A RS P20240875 A RSP20240875 A RS P20240875A RS 65794 B1 RS65794 B1 RS 65794B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
binding
sequence
seq
heavy chain
Prior art date
Application number
RS20240875A
Other languages
English (en)
Inventor
Isil Altintas
David Satijn
Den Brink Edward Van
Dennis Verzijl
Rik Rademaker
Paul Parren
Goeij Bart De
Original Assignee
Genmab As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genmab As filed Critical Genmab As
Publication of RS65794B1 publication Critical patent/RS65794B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/112—Retroviridae (F), e.g. leukemia viruses
    • C07K16/114—Lentivirus (G), e.g. human immunodeficiency virus [HIV], feline immunodeficiency virus [FIV] or simian immunodeficiency virus [SIV]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na nova antitela i njihovu upotrebu u medicini. Konkretno, pronalazak se odnosi na bispecifična antitela sposobna da vežu humani PD-L1 i sposobna da vežu humani CD3. Nove klase antitela sposobnih da vežu humani PD-L1 su takođe obezbeđene. Pronalazak se dalјe odnosi na upotrebu antitela pronalaska i na postupke, konstrukte nukleinske kiseline i ćelije domaćina za proizvodnju antitela pronalaska.
STANјE TEHNIKE PRONALASKA
[0002] Ligand programirane smrti 1 (PD-L1, PDL1, CD274, B7H1, B7-H1) je 33 kDa, transmembranski protein tipa I. Opisane su tri izoforme PD-L1, zasnovane na alternativnom splajsovanju. PD-L1 pripada superfamiliji imunoglobulina (Ig) i sadrži jedan domen C2-tipa sličan Ig i jedan domen V-tipa sličan Ig. Sveže izolovane T i B ćelije eksprimiraju zanemarlјive količine PD-L1, a frakcija (oko 16%) CD14+ monocita konstitutivno eksprimira PD-L1 (Rietz and Chen, 2004. Am J Transplant 4: 8-14). Poznato je da interferon-γ (IFN-γ) pozitivno reguliše PD-L1 na tumorskim ćelijama (Abiko et al., 2015 Br J Cancer 112:1501-1509; Dong et al., 2002 Nature Medicine 8(8): 793-800).
[0003] PD-L1 ometa antitumorski imunitet tako što 1) indukuje toleranciju tumor reaktivne T ćelije vezivanjem za svoj PD-1 receptor (CD279) na aktiviranim T ćelijama (Dong et al., supra; Latchman et al., 2004 Proc Natl Acad Sci USA 101, 10691-6); 2) obezbeđuje da tumorske ćelije budu otporne na CD8+ T ćelije i Fas ligandom posredovanu lizu putem PD-1 signalizacije kroz PD-L1 eksprimiran na tumorskim ćelijama (Azuma et al., 2008 Blood 111, 3635-43); 3) indukuje toleranciju T ćelija putem reverzne signalizacije preko CD80 (B7.1) eksprimiranih na T ćelijama (Butte et al., 2007 Immunity 27, 111-22; Park et al.,., 2010. Blood 116, 1291-8); i 4) promoviše razvoj i održavanje indukovanih T regulatornih ćelija (Francisco et al., 2009. J Exp Med 206, 3015-29). PD-L1 se eksprimira u mnogim vrstama kancera kod lјudi, uklјučujući melanom, rak jajnika, pluća i debelog creva (Dong et al., supra).
[0004] Antitela koja blokiraju PD-L1 pokazala su kliničku aktivnost kod nekoliko kancera za koje se zna da prekomerno eksprimiraju PD-L1 (uklјučujući melanom, NSCLC). Na primer, atezolizumab je humanizovano IgG1 monoklonsko antitelo protiv PD-L1. On je trenutno u kliničkim ispitivanjima kao imunoterapija za nekoliko indikacija uklјučujući različite tipove solidnih tumora (videti npr. Rittmeyer et al., 2017 Lancet 389:255-265). Avelumab, PD-L1 antitelo, (Kaufman et al., Lancet Oncol. 2016; 17(10): 1374-1385) je odobren od strane FDA za lečenje odraslih i pedijatrijskih pacijenata starijih od 12 godina sa metastatskim karcinomom Merkelovih ćelija, i trenutno je u kliničkim ispitivanjima za nekoliko indikacija kancera, uklјučujući kancer mokraćne bešike, kancer želuca, kancere glave i vrata, mezoteliom, NSCLC, kancer jajnika i kancer bubrega. Durvalumab, PD-L1 antitelo, je odobren za indikacije lokalno uznapredovalog ili metastatskog urotelnog karcinoma i nalazi se u kliničkom razvoju kod višestrukih solidnih tumora i kancera krvi (videti npr. Massard et al., 2016 J Clin Oncol. 34(26): 3119-25). Druga anti-PD-L1 antitela su opisana u WO2004004771, WO2007005874, WO2010036959, WO2010077634, WO2013079174, WO2013164694, WO2013173223 i WO2014022758.
[0005] Iako je postignut značajan napredak u iskorenjivanju kancera, još uvek postoji potreba za dalјim pobolјšanjem terapije kancera zasnovane na antitelima.
[0006] US 8779108 B2 odnosi se na humana monoklonska antitela usmerena protiv B7-H1 i upotrebe ovih antitela u dijagnostici i za lečenje bolesti povezanih sa aktivnošću i/ili ekspresijom B7-H1. Dodatno, opisani su hibridomi ili druge ćelijske linije koje eksprimiraju takva antitela.
[0007] ULRICH STORZ „Intellectual property issues of immune checkpoint inhibitors” [MABS, vol.8, no.
1, 14 October 2015. (2015-10-14), strane 10-26, XP055454739, ISSN: 1942-0862, DOI: 10.1080/19420862.2015.1107688] se odnosi na pozadinu patenta i govori o klјučnim akterima i slučajevima u vezi sa inhibitorima imunoloških kontrolnih tačaka.
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0008] U prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje nova anti-PD-L1 antitela koja obuhvataju region za vezivanje antigena koji ima sposobnost da se veže za humani PD-L1, pri čemu pomenuti region za vezivanje antigena koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 sadrži VH sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VH sekvencom navedenom u: SEQ ID NO: 18 i VL sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VL sekvencom navedenom u: SEQ ID NO: 22. Antitela ovog drugog aspekta pronalaska mogu biti monospecifična ili multispecifična, i, ako su multispecifična, navedena multispecifična antitela mogu, ili ne moraju, da sadrže region koji vezuje antigen sposoban da se veže za humani CD3ε.
[0009] Pronalazak dalјe obezbeđuje bispecifična antitela koja sadrže region za vezivanje antigena i koji ima sposobnost da se veže za humani PD-L1 i region za vezivanje antigena i koji ima sposobnost da se veže za humani CD3ε (epsilon), pri čemu je pomenuti region za vezivanje antigena, koji je sposoban da se veže za humani PD-L1, sadrži VH sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvence sa VH sekvencom navedenom u: SEQ ID NO: 18 i VL sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvence sa VL sekvencom navedenom u: SEQ ID NO: 22. Takvo bispecifično antitelo ima dvostruki efekat:
Prvo, preko svog regiona za vezivanje za PD-L1, antitelo se vezuje za tumorske ćelije koje eksprimiraju PD-L1, dok kroz svoj region koji se vezuje za CD3, antitelo vezuje T ćelije. Antitelo tako dovodi T ćelije u neposrednu blizinu tumorskih ćelija, čime olakšava ubijanje tumorskih ćelija od strane T ćelija. Štaviše, bez ograničenja bilo kakvom specifičnom teorijom, pretpostavlјa se da bi dovođenje ćelija koje eksprimiraju PD-L1 i efektorskih T ćelija u neposrednu blizinu jedna drugoj moglo pokrenuti oslobađanje interferona-γ koji bi zauzvrat mogao povećati PD-L1 na tumorskim ćelijama, čime se olakšava regrutovanje većeg broja antitela na tumor i dodatno pojačava njegovo ubijanje.
Drugo, bispecifična antitela pronalaska inhibiraju vezivanje humanog PD-L1 za humani PD-1, čime sprečavaju PD-L1 da opstruira antitumorski imunitet preko PD-1.
[0010] CD3xPD-L1 bispecifična antitela su posebno korisna u terapijskim okruženjima u kojima je poželјno specifično cilјanje i ubijanje ćelija posredovano T ćelijama koje eksprimiraju PD-L1. CD3xPDL1 bispecifična antitela su visoko efikasna u posredovanju u ubijanju ćelija koje eksprimiraju PD-L1, uklјučujući, u nekim realizacijama, ćelije sa malim brojem kopija PD-L1.
[0011] Antitela pronalaska su sposobna da se vežu za ćelije koje eksprimiraju PD-L1, kao što su MDA-MB-231, PC3 ili HELA ćelije. Štaviše, antitela pronalaska inhibiraju interakciju između PD-L1 i PD-1 i mogu posredovati u ubijanju MDA-MB-231, PC3 i/ili HELA ćelija pomoću prečišćenih T-ćelija ili PBMC.
[0012] U dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu antitela pronalaska u medicini, posebno za lečenje kancera.
[0013] Ovi i drugi aspekti pronalaska su detalјnije opisani u nastavku.
KRATAK OPIS NACRTA
[0014]
Slika 1: Vezivanje bispecifičnih CD3xPD-L1 i b12xPD-L1 antitela i njihovih monospecifičnih, bivalentnih PD-L1 parnjaka za MDA-MB-231 ćelije. (A) Vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR i IgG1-338-FEAR, (B) Vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR i IgG1-547-FEAR, (C) Vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR i IgG1-511-LC33S-FEAR, (D) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR (E) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR, (F) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) određene protočnom citometrijom, za jedan reprezentativan eksperiment.
Slika 2: Vezivanje bispecifičnih CD3xPD-L1 i b12xPD-L1 antitela i njihovih monospecifičnih, bivalentnih PD-L1 parnjaka za PC3 ćelije. (A) Vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR i IgG1-338-FEAR, (B) Vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR i IgG1-547-FEAR, (C) Vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR i IgG1-511-LC33S-FEAR, (D) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR, (E) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR, (F) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) određene protočnom citometrijom, za jedan reprezentativan eksperiment.
Slika 3: Vezivanje bispecifičnih CD3xPD-L1 i b12xPD-L1 antitela i njihovih monospecifičnih, bivalentnih PD-L1 parnjaka za HELA ćelije. (A) Vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR i IgG1-338-FEAR, (B) Vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR i IgG1-547-FEAR, (C) Vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR i IgG1-511-LC33S-FEAR, (D) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR (E) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR, (F) Binding of bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) određene protočnom citometrijom, za jedan reprezentativan eksperiment.
Slika 4: Vezivanje bispecifičnih b12xPD-L1 antitela i njihovih monospecifičnih, bivalentnih PD-L1 parnjaka za SK-MES-1 ćelije. (A) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR i IgG1-338-FEAR, (B) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR i IgG1-547-FEAR, (C) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR i IgG1-511-LC33S-FEAR. Prikazani podaci su srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) određene protočnom citometrijom, za jedan reprezentativan eksperiment.
Slika 5: Vezivanje bispecifičnih CD3xPD-L1 i b12xPD-L1 antitela i njihovih monospecifičnih, bivalentnih PD-L1 parnjaka za CHO ćelije transfektovane cinomolgusnim PD-L1. (A) Vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR i IgG1-338-FEAR, (B) Vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR i IgG1-547-FEAR, (C) Vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR i IgG1-511-LC33S-FEAR, (D) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR, (E) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR, (F) Vezivanje bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR. Podaci su prikazani srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) određene protočnom citometrijom, za jedan reprezentativan eksperiment.
Slika 6: Unakrsni blok antitela. Određivanje međusobnog blokiranja antitela je izvedeno primenom bioslojne interferometrije. Sva antitela su proizvedena u FEAR IgG1 okosnici. U tabeli, odgovori ≥ 0,1 nm su smatrani parovima antitela koja se ne blokiraju (rezultati su označeni običnim brojevima u tabeli), odgovori ispod 0,1 su smatrani parovima antitela koji se blokiraju (rezultati su označeni podeblјanim brojevima u tabeli), dok su neki odgovori, koji nisu ni blokirajući ni neblokirajući, označeni kao antitela koja pokazuju ponašanje pomeranja (rezultati su označeni zvezdicom (*) u tabeli). MEDI = MEDI4736; MPDL = MPDL3280A. Reprezentativne brojke su prikazane za (A) pomeranje, (B) blokiranje i (C) parove antitela koja se ne blokiraju.
Slika 7: Efekat bispecifičnih b12xPD-L1 antitela i njihovih monospecifičnih, bivalentnih PD-L1 parnjaka na interakciju PD-1/PD-L1. Efekat (A) bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR i IgG1-338-FEAR, (B) bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR i IgG1-547-FEAR, (C) bsIgG1-b12-FEALx511-FEAR i IgG1-511-LC33S-FEAR je određen u biotestu blokade PD-1/PD-L1. Prikazani podaci su indukcija pregiba u odnosu na kontrolu (bez dodavanja antitela), za jedan reprezentativni eksperiment. Prikazani podaci su veličine indukcije u odnosu na kontrolu (bez dodatog antitela) za jedan reprezentativan eksperiment
Figura 8: Indukcija citotoksičnosti in vitro pomoću bispecifičnih antitela CD3xPD-L1 u MDA-MB-231 ćelijama. MDA-MB-231 ćelije su inkubirane sa bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR i bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR. Prečišćene T ćelije (A) ili PBMCs (B) su korišćene kao efektorske ćelije. Prikazani podaci su % vijabilnih ćelija za jedan reprezentativan eksperiment.
Slika 9: Indukcija citotoksičnosti in vitro pomoću bispecifičnih antitela CD3xPD-L1 u PC-3 ćelijama. PC-3 ćelije su inkubirane sa bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR i bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR. Prečišćene T ćelije (A) ili PBMCs (B) su korišćene kao efektorske ćelije. Prikazani podaci su % vijabilnih ćelija za jedan reprezentativan eksperiment.
Slika 10: Indukcija citotoksičnosti in vitro pomoću CD3xPD-L1 bispecifičnih antitela u HELA ćelijama. HELA ćelije su inkubirane sa bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR i bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR. Prečišćene T ćelije (A) ili PBMCs (B) su korišćene kao efektorske ćelije. Prikazani podaci su % vijabilnih ćelija za jedan reprezentativan eksperiment.
Slika 11: Proliferacija T ćelija i aktivacija pomoću CD3xPD-L1 bispecifičnih antitela. CD3xPD-L1 bispecifična antitela su testirana u in vitro testu za merenje aktivacije i proliferacije T ćelija, upotrebom MDA-MB-231 ćelija kao cilјnih ćelija i prečišćenih T ćelija kao efektorskih ćelija. (A) Ukupan broj T ćelija, (B) Broj CD69<pos>T ćelija, (C) Broj CD25<pos>T ćelija. Slika 12 : Veličina promene u vezivanju PD-L1 antitela za varijante PD-L1 sa mutacijama alanina na pozicijama od 42 do 131. Veličina promene je definisana kao Log10(Normalizovani gMFI[alamutant]/Normalizovani gMFI[wt]). Rezidue kod kojih je veličina promena u vezivanju bila manja od srednje vrednosti veličine promene - 1,5 x SD (označeno tačkastom linijom) su smatrane 'gubitkom vezivanja mutanata'. Rezidue sa pozitivnom veličinom promene u vezivanju su gubitak vezivnih rezidua za kontrolno antitelo IgG1-625-FEAR-A488 (ostaci 75 i 86). Broj iznad x-ose odnosi se na pozicije aminokiselina.
Slika 12: Veličina promene u vezivanju PD-L1 antitela za varijante PD-L1 sa mutacijama alanina na pozicijama 42 do 131 Veličina promene je definisana kao Log10(Normalizovani gMFI[ala mutant]/Normalizovani gMFI[wt]). Rezidue kod kojih je veličina promena u vezivanju bila manja od srednje vrednosti veličine promene - 1,5 x SD (označeno tačkastom linijom) su smatrane 'gubitkom vezivanja mutanata'. Rezidue sa pozitivnom veličinom promene u vezivanju su gubitak vezivnih rezidua za kontrolno antitelo IgG1-625-FEAR-A488 (ostaci 75 i 86). Broj iznad x-ose odnosi se na pozicije aminokiselina.
Slika 13: Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela MDA-MB-231 ćelija pomoću PD-L1 antitela, određena u testu raspadanja<51>Cr. ADCC MDA-MB-231 ćelija je određena u in vitro testu raspadanja<51>Cr sa sveže izolovanim PBMC od zdravog humanog donora u E:T odnosu 100:1. Za svaku tačku podataka, prikazani su srednja vrednost i standardna devijacija od 3 uzorka koji su ponovlјeni. Prikazan je reprezentativan primer sa PBMC jednog donatora.
Slika 14: Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela MDA-MB-231 ćelija pomoću PD-L1 antitela, određena u luminescentnom ADCC Reporter BioAssay-u. ADCC MDA-MB-231 ćelija pomoću PD-L1 antitela je kvantifikovan upotrebom Jurkat reporterskih ćelija koje eksprimiraju FcγRIIIa i koje eksprimiraju luciferazu nakon vezivanja FcγRIIIa. Produkcija luciferaze je predstavlјena relativnim jedinicama luminescencije (RLU). Za svaku tačku podataka, prikazani su srednja vrednost i standardna devijacija duplikata.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Definicije
[0015] Pojam "imunoglobulin" se odnosi na klasu strukturno povezanih glikoproteina koji se sastoje od dva para polipeptidnih lanaca, jednog para lakih (L) lanaca niske molekulske težine i jednog para teških (H) lanaca, sva četiri su međusobno povezana disulfidnim vezama. Struktura imunoglobulina je dobro okarakterisana. Videti na primer u Fundamental Immunology Ch.7 (Paul, V., ed., 2. ed. Raven Press, N.Y. (1989.)). Ukratko, svaki teški lanac se tipično sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde je skraćeno naveden kao VH ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca (ovde je skraćeno naveden kao CH ili CH). Konstantni region teškog lanca se obično sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Zglobni region je region između CH1 i CH2 domena teškog lanca i veoma je fleksibilan. Disulfidne veze u zglobnom regionu predstavljaju vezu i deo su interakcija između dva teška lanca u IgG molekulu. Svaki laki lanac se tipično sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde je skraćeno naveden kao VL ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca (ovde je skarćeno naveden kao CL ili CL). Konstantni region lakog lanca se tipično sastoji od jednog domena, CL. VH i VL regioni se mogu dalјe podeliti na regione hipervarijabilnosti (ili hipervarijabilne regione koji mogu biti hipervarijabilni u sekvenci i/ili obliku strukturno definisanih petlјi), koji se takođe nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR), i ispresecani su regionima koji su više konzervirani, nazvanim okvirnim regionima (FR). Svaki VH i VL se obično sastoji od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređenih od amino-kraja do karboksi-kraja u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (videti takođe u Chothia and Lesk J. Mol. Biol.196, 901-917 (1987)). Osim ako nije drugačije navedeno ili jasno suprotstavljeno kontekstom, CDR sekvence se ovde identifikuju prema IMGT pravilima upotrebom DomainGapAlign Version 4.9.2 (2016-09-26) (Lefranc MP., Nucleic Acids Research 1999; 27: 209-212, i Ehrenmann F., Kaas Q. and Lefranc M.-P. Nucleic Acids Res., 38, D301-307 (2010); pogledajte i internet http adresu http://www.imqt.org/). Osim ako nije drugačije navedeno ili jasno suprotstavljeno kontekstom, pozivanje na pozicije aminokiselina u konstantnim regionima u ovom pronalasku je prema EU-numerisanju (Edelman et al., Proc Natl Acad Sci USA.1969. May; 63(1): 78-85; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition.1991 NIH Publikacija br.91-3242). Na primer, SEQ ID NO:93 ovde navodi pozicije aminokiselina 118-447 prema EU numerisanju, konstantnog regiona teškog lanca IgG1m(f).
[0016] Pojam „aminokiselina koja odgovara položaju...“ kako se ovde koristi, odnosi se na broj pozicije aminokiseline u teškom lancu humanog IgG1. Odgovarajuće pozicije aminokiselina u drugim imunoglobulinima mogu se naći poravnanjem sa humanim IgG1. Dakle, aminokiselina ili segment u jednoj sekvenci koja „odgovara“ aminokiselini ili segmentu u drugoj sekvenci je ona koja se poravnava sa drugom aminokiselinom ili segmentom upotrebom standardnog programa za poravnanje sekvence kao što je ALIGN, ClustalW ili slični, obično setovani na podrazumevana podešavanja i ima najmanje 50%, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sa teškim lancem humanog IgG1. Smatra se da je dobro poznato u tehnici kako da se poravna sekvenca ili segment u sekvenci i na taj način odredi odgovarajuća pozicija u sekvenci na poziciju aminokiseline u skladu sa ovim pronalaskom.
[0017] Pojam „antitelo“ (Ab) u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na molekul imunoglobulina, fragment molekula imunoglobulina, ili derivat bilo kojeg od njih, koji ima sposobnost da se specifično veže za antigen pod tipičnim fiziološkim uslovima sa značajnom dužinom poluživota, kao što je najmanje oko 30 minuta, najmanje oko 45 minuta, najmanje oko jedan sat, najmanje oko dva sata, najmanje oko četiri sata, najmanje oko 8 sati, najmanje oko 12 sati, oko 24 sata ili više, oko 48 sati ili više, oko 3, 4, 5, 6, 7 ili više dana, itd., ili bilo koji drugi relevantan funkcionalno definisan period (kao što je vreme dovolјno da se indukuje, promoviše, pojača i/ili moduliše fiziološki odgovor povezan sa vezivanjem antitela za antigen i/ili vreme koje je dovolјno da antitelo regrutuje efektorsku aktivnost). Promenlјivi regioni teških i lakih lanaca molekula imunoglobulina sadrže vezujući domen koji je u interakciji sa antigenom. Termin „region koji se vezuje za antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na region koji je u interakciji sa antigenom i obuhvata i VH i VL regione. Termin antitelo kada se ovde koristi obuhvata ne samo monospecifična antitela, već i multispecifična antitela koja obuhvataju višestruka, kao što su dva ili više, npr. tri ili više različitih regiona koji vezuju antigen. Konstantni regioni antitela (Abs) mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uklјučujući različite ćelije imunskog sistema (kao što su efektorske ćelije) i komponente sistema komplementa kao što je C1q, prva komponenta u klasičnom putu aktivacije komplementa. Kao što je gore navedeno, termin antitelo ovde, osim ako nije drugačije navedeno ili jasno suprotstavljeno kontekstom, uklјučuje fragmente antitela koji su fragmenti koji se vezuju za antigen, tj. zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen. Pokazano je da funkciju vezivanja antigena antitela mogu obavlјati fragmenti antitela pune dužine. Primeri fragmenata koji vezuju antigen obuhvaćenih terminom „antitelo“ uklјučuju (i) Fab` ili Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena, ili monovalentno antitelo kao što je opisano u WO2007059782 (Genmab); (ii) F(ab`)2fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba; (iii) Fd fragment koji se u osnovi sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se u osnovi sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragment (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), koji se u osnovi sastoji od VH domena i koji se takođe nazivaju antitela domena (Holt et al; Trends Biotechnol.2003 Nov; 21(11): 484-90); (vi) kamelid ili nano antitelatela (Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan; 5(1): 111-24) i (vii) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR). Štaviše, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana odvojenim genima, oni mogu biti spojeni, upotrebom rekombinantnih postupaka, pomoću sintetičkog linkera koji im omogućava da budu napravlјeni kao jedinstven proteinski lanac u kome se VL i VH regioni uparuju kako bi formirali monovalentne molekule (poznate kao jednolančana antitela ili jednolančani Fv (scFv), vidi npr. Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) i Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988.)). Takva jednolančana antitela su obuhvaćena terminom antitelo, osim ako nije drugačije navedeno ili jasno naznačeno kontekstom. Iako su takvi fragmenti generalno uklјučeni u značenje antitela, oni zajedno i svaki nezavisno predstavlјaju jedinstvene karakteristike ovog pronalaska, koji pokazuju različita biološka svojstva i upotrebu. Ovi i drugi korisni fragmenti antitela u kontekstu ovog pronalaska, kao i bispecifični formati takvih fragmenata, su dalјe ovde diskutovani. Takođe treba razumeti da izraz antitelo, osim ako nije drugačije naznačeno, takođe uklјučuje poliklonska antitela, monoklonalna antitela (mAbs), polipeptide slične antitelu, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela, i fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen (fragmenti koji se vezuju za antigen) i koji su obezbeđeni bilo kojom poznatom tehnikom, kao što su enzimsko cepanje, sinteza peptida i rekombinantne tehnike. Nastalo antitelo može posedovati bilo koji izotip. Kako se ovde koristi, termin „izotip“ se odnosi na klasu imunoglobulina (na primer IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM) koja je kodirana genima konstantnog regiona teškog lanca. Kada je određeni izotip, npr. IgG1, ovde pomenut, termin nije ograničen na specifičnu sekvencu izotipa, npr. određenu IgG1 sekvencu, ali se koristi da ukaže da je antitelo po sekvenci bliže tom izotipu, npr. IgG1, nego drugim izotipovima. Tako, npr. IgG1 antitelo pronalaska može biti varijanta sekvence prirodnog IgG1 antitela, uklјučujući varijacije u konstantnim regionima.
[0018] Pojam „monoklonsko antitelo“ kako se ovde koristi odnosi se na dobijanje molekula antitela sa jednomolekulskim sastavom. Kompozicija monoklonskog antitela pokazuje jedinstvenu specifičnost vezivanja i afiniteta za određeni epitop. Shodno tome, termin „humano monoklonsko antitelo“ odnosi se na antitela koja pokazuju jedninstvenu specifičnost vezivanja i koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih sekvenci germinativne linije imunoglobulina. Humana monoklonska antitela mogu biti generisana hibridomom koji uklјučuje B ćeliju dobijenu od transgene ili transhromozomske nehumane životinje, kao što je transgeni miš, koji ima genom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen lakog lanca, fuzionisan sa immortalizovanom ćelijom.
[0019] Pojam „bispecifično antitelo“ ili „bs“ u kontekstu ovog pronalaska se odnosi na antitelo koje ima dva različita regiona za vezivanje antigena definisana sa različitim sekvencama antitela. U nekim realizacijama, navedeni različiti regioni koji vezuju antigen vezuju različite epitope na istom antigenu. Međutim, u poželјnim realizacijama, navedeni različiti regioni za vezivanje antigena vezuju različite cilјne antigene. Bispecifično antitelo može biti bilo kog formata, uklјučujući bilo koji od formata bispecifičnih antitela opisanih u nastavku.
[0020] Kada se ovde koriste, izrazi „pola molekula“, „Fab-ruka“ („Fab-fragment“) i „ruka“ odnose se na jedan par težkog i lankog lanca.
[0021] Kada je opisano da bispecifično antitelo obuhvata polumolekulsko antitelo „izvedeno iz” prvog antitela i polumolekulsko antitelo „izvedeno iz” drugog antitela, termin „izvedeno iz” ukazuje na to da je bispecifično antitelo generisano rekombinacijom, bilo kojim poznatim postupkom, navedenih polumolekula iz svakog od navedenih prvih i drugih antitela u rezultujuće bispecifično antitelo. U ovom kontekstu, „rekombinovanje“ nije ograničeno na bilo koji posebni postupak rekombinovanja i stoga uklјučuje sve postupke za proizvodnju bispecifičnih antitela koji su ovde opisani u nastavku, uklјučujući na primer, rekombinovanje razmenom polumolekula, kao i rekombinovanje na nivou nukleinske kiseline i/ili kroz koekspresiju dva polumolekula u istim ćelijama.
[0022] Pojam „monovalentno antitelo“ znači u kontekstu ovog pronalaska da je molekul antitela sposoban da veže jedan molekul antigena, i stoga nije sposoban da unakrsno umreži antigene ili ćelije.
[0023] Pojam „puna dužina“ kada se koristi u kontekstu antitela označava da antitelo nije fragment, već sadrži sve domene određenog izotipa koji se normalno nalaze za taj izotip u prirodi, npr. VH, CH1, CH2, CH3, region zgloba, VL i CL domeni za IgG1 antitelo.
[0024] Kada se ovde koristi, osim ako nije jasno suprotstavljeno kontekstom, pojam „Fc region“ se odnosi na region antitela koji se sastoji od dve Fc sekvence teških lanaca imunoglobulina, pri čemu navedene Fc sekvence sadrže najmanje region zgloba, CH2 domen i CH3 domen.
[0025] Kada se ovde koristi pojam „heterodimerna interakcija između prvog i drugog CH3 regiona“ odnosi se na interakciju između prvog CH3 regiona i drugog CH3 regiona u prvom-CH3/drugom-CH3 heterodimernom proteinu.
[0026] Kada se ovde koristi pojam „homodimerne interakcije prvog i drugog CH3 regiona“ odnosi se na interakciju između prvog CH3 regiona i drugog prvog CH3 regiona u prvom-CH3/prvom-CH3 homodimernom proteinu i interakciju između drugog CH3 regiona i drugog drugog CH3 regiona u drugom-CH3/drugom-CH3 homodimernom proteinu.
[0027] Kako se ovde koristi, pojam „sposoban za vezivanje“ ili „vezivanje“ u kontekstu vezivanja antitela za unapred određeni antigen ili epitop, obično podrazumeva vezivanje sa afinitetom koji odgovara KDod oko 10<-6>M ili manje, kao što je oko 10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje, oko 10<-10>M ili manje, ili oko 10<-11>M ili čak manje, kada se određuje upotrebom bioslojne interferometrije (BLI), npr. kao što je opisano u Primeru 8, ili, na primer, kada se odredi korišćenjem tehnologije rezonancije površinskog plazmona (SPR) u BIAcore 3000 instrumentu koji koristi antigen kao ligand i antitelo kao analit. Antitelo se vezuje za unapred određeni antigen sa afinitetom koji odgovara KDkoji je najmanje deset puta niži, kao što je najmanje 100 puta niži, na primer najmanje 1.000 puta niži, kao što je najmanje 10.000 puta niži, na primer najmanje 100.000 puta niži od njegovog afiniteta za vezivanje za nespecifični antigen (npr. BSA, kazein) koji nije unapred određeni antigen ili blisko srodan antigen. Vrednost za koju je afinitet niži zavisi od KDantitela, tako da kada je KDantitela veoma niska (to jest, antitelo je visoko specifično), tada je stepen do koga je afinitet za antigen niži u odnosu na afinitet za nespecifični antigen, može biti do najmanje 10.000 puta.
[0028] Pojam "kd“ (sec<-1>), kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu brzine disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Navedena vrednost se takođe naziva koffili kdisvrednost.
[0029] Pojam "KD"(M), kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu ravnoteže disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Dobija se delјenjem kd sa ka.
[0030] Pojam "ka“ (M<-1>x sec<-1>), kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu brzine vezivanja određene interakcije antitelo-antigen. Navedena vrednost se takođe naziva konvrednost ili „on-rate“.
[0031] U poželјnom izvođenju, antitelo pronalaska je izolovano. „Izolovano antitelo“ kako se ovde koristi, se odnosi na antitelo koje je u suštini bez drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti. U poželјnom izvođenju, izolovano bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za PD-L1 i drugi target, kao što je CD3, je u suštini bez monospecifičnih antitela koja se specifično vezuju za PD-L1 ili za drugu target, npr. CD3. U drugom poželјnom izvođenju, antitelo, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo, je u suštini bez antitela koja prirodno nastaju a koja nisu sposobna da se vežu za PD-L1. U dalјem poželјnom izvođenju, antitelo pronalaska poseduje strukturnu promenu u svojoj aminokiselinskoj sekvenci, u odnosu na strukturu prirodnog anti-PD-L1 antitela, pri čemu pomenuta strukturna promena uzrokuje da pomenuto antitelo pokazuje izmenjenu funkcionalnost u odnosu na funkcionalnost koju pokazuje navedeno prirodno anti-PD-L1 antitelo, pri čemu je navedena funkcionalnost izabrana iz grupe koju čine: (i) afinitet vezivanja PD-L1, (ii) sposobnost da inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1 i (iii) sposobnost da indukuje Fc-posredovane efektorske funkcije.
[0032] Pojam „PD-L1“ kada se ovde koristi, odnosi se na protein: ligand programirane smrtni 1. PD-L1 se nalazi kod lјudi i drugih vrsta, i stoga, izraz „PD-L1“ nije ograničen na humani PD-L1 osim ako nije jasno suprotstavljeno kontekstom. PD-L1 sekvence kod ljudi, makaka i miša mogu se naći preko Genbank pristupnog br. NP_054862.1, XP_005581836 i NP_068693, tim redom.
[0033] Pojam „PD-L2“ kada se ovde koristi, odnosi se na humani protein ligand programirane smrtni 1-ligand 2 (Genbank pristupni broj NP_079515).
[0034] Pojam „PD-1“ kada se koristi ovde, odnosi se na humani protein programirane smrti-1, takođe poznat kao CD279.
[0035] Pojam „CD3“ kako se ovde koristi, odnosi se na humani protein klastera diferencijacije 3 koji je deo kompleksa proteina koreceptora T-ćelija i sastoji se od četiri različita lanca. CD3 se takođe nalazi i kod drugih vrsta, i stoga pojam „CD3“ nije ograničen na CD3 kod lјudi osim ako nije jasno suprotstavljeno kontekstom. Kod sisara, kompleks sadrži CD3γ (gama) lanac (humani CD3γ lanac UniProtKB/Swiss-Prot No P09693, ili cinomolgus majmuna CD3γ UniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI7), CD3δ (delta) lanac (humani CD3δ UniProtKB/Swiss-Prot No P04234, ili cinomolgus majmuna CD3δ UniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI8), dva CD3ε (epsilon) lanca (humani CD3ε UniProtKB/Swiss-Prot No P07766 (SEQ ID NO:95); cinomolgus CD3ε UniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI5; ili rezus CD3ε UniProtKB/Swiss-Prot No G7NCB9), i CD3ζ-lanac (zeta) lanac (humani CD3ζ UniProtKB/Swiss-Prot No P20963, cinomolgus majmuna CD3ζ UniProtKB/Swiss-Prot No Q09TK0). Ovi lanci se povezuju sa molekulom poznatim kao T-ćelijski receptor (TCR) i stvaraju aktivacioni signal u T limfocitima. TCR i CD3 molekuli zajedno čine TCR kompleks.
[0036] „PD-L1 antitelo“ ili „anti-PD-L1 antitelo“ je antitelo kao što je iznad opisano, koje se specifično vezuje za antigen PD-L1, posebno za humani PD-L1.
[0037] „CD3 antitelo“ ili „anti-CD3 antitelo“ je antitelo kao što je iznad opisano, koje se specifično vezuje za antigen CD3, posebno za humani CD3ε (epsilon).
[0038] „CD3xPD-L1 antitelo“, „anti-CD3xPD-L1 antitelo“, „PD-L1xCD3 antitelo“ ili „anti-PD-L1xCD3 antitelo“ je bispecifično antitelo, koje obuhvata dva različita regiona za vezivanje antigena, od kojih se jedan vezuje specifično za antigen PD-L1 i drugi se specifično vezuje za CD3.
[0039] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitela koja sadrže funkcionalne varijante VL regiona, VH regiona ili jedan ili više CDR antitela iz primera. Funkcionalna varijanta VL, VH ili CDR koja se koristi u kontekstu antitela i dalјe dozvolјava antitelu da zadrži barem značajan udeo (najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više) afiniteta i/ili specifičnosti/selektivnosti „referentnog“ ili „roditelјskog“ antitela i u nekim slučajevima, takvo antitelo može biti povezano sa većim afinitetom, selektivnošću i/ili specifičnošću od roditelјskog antitela.
[0040] Takve funkcionalne varijante obično zadržavaju značajnu sličnost u sekvenci sa roditelјskim antitelom. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence (tj., % homologije = # identičnih pozicija/ukupan # pozicija x 100), uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, koje je potrebno uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat identičnosti između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence može se odrediti npr. korišćenjem algoritma E. Meyers i W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988), koji je uključen u program ALIGN (verzija 2.0), koristeći PAM120 tabelu težine ostataka, kaznu za dužinu praznine od 12 i kaznu za prazninu od 4. Pored toga, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti pomoću algoritma Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.48, 444-453 (1970).
[0041] Primeri varijanti uklјučuju one koje se razlikuju od VH i/ili VL i/ili CDR regiona roditelјskih sekvenci antitela uglavnom u konzervativnim supstitucijama; na primer, 10, kao što su 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 supstitucija u varijanti su konzervativne zamene aminokiselinskih ostataka.
[0042] U kontekstu predmetnog pronalaska, konzervativne supstitucije se mogu definisati supstitucijama unutar klasa aminokiselina prikazanih u sledećoj tabeli:
Klase aminokiselinskih ostataka za konzervativne supstitucije
[0043]
[0044] U kontekstu ovog predmetnog pronalaska, sledeće oznake se, osim ako nije drugačije naznačeno, koriste za opisivanje mutacije; i) supstitucija aminokiseline na datoj poziciji zapisuje se kao npr. K409R što znači supstituciju lizina na poziciji 409 sa argininom; i ii) za specifične varijante se koriste specifični kodovi od tri ili jednog slova, uklјučujući kodove Xaa i X za označavanje bilo kog aminokiselinskog ostatka. Dakle, supstitucija lizina sa argininom na poziciji 409 označena je kao: K409R, a supstitucija lizina sa bilo kojim aminokiselinskim ostatkom na poziciji 409 označena je kao K409X. U slučaju delecije lizina na poziciji 409 to je označeno sa K409*.
[0045] U kontekstu ovog predmetnog pronalaska, „kompeticija“ se odnosi na svako značajno smanjenje sklonosti određenog molekula da veže određenog partnera za vezivanje u prisustvu drugog molekula koji vezuje datog partnera za vezivanje. „Kompeticija“ se može odnositi i na „blokiranje“ i na „izmeštanje“, tj. konkurentski molekul može biti ili blokirajući ili molekul zamene. „Izmeštanje“ se odnosi na stanje u kome drugo antitelo može da istisne (izmesti) antigen iz kompleksa antigen-antitelo (formiranog ranije) što dovodi do razmene antigena (Abdiche et al., 2017 Plos One 12(1): e0169535). Kompeticija za vezivanje za PD-L1 od strane dva ili više anti-PD-L1 antitela može se odrediti bilo kojom pogodnom tehnikom. U jednom aspektu izvođenja, kompeticija je određena kao što je opisano u Primeru 9 ovde.
[0046] Slično, u kontekstu ovog predmetnog pronalaska, „inhibicija vezivanja PD-L1 za PD-1“ se odnosi na bilo koje otkriveno značajno smanjenje vezivanja PD-L1 za PD-1 u prisustvu antitela sposobnog da veže PD-L1. Tipično, inhibicija znači smanjenje od najmanje oko 10%, kao što je najmanje oko 15%, npr. najmanje oko 20%, kao što je najmanje 40% smanjenja vezivanja između PD-L1 i PD-1, što je uzrokovano prisustvom anti-PD-L1 antitela. Inhibicija vezivanja PD-L1 za PD-1 može se odrediti bilo kojom pogodnom tehnikom. U jednom aspektu izvođenja, inhibicija je određena kao što je opisano u Primeru 10 ovde.
[0047] Pojam „epitop“ se odnosi na proteinsku determinantu sposobnu da se specifično veže za antitelo. Epitopi se obično sastoje od površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera, i generalno imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekoformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prvi (konformacioni epitop), ali ne i za drugi (nekoformacioni epitopi), gubi u prisustvu denaturirajućih rastvarača. Epitop može obuhvatati aminokiselinske ostatke direktno uklјučene u vezivanje i druge aminokiselinske ostatke, koji nisu direktno uklјučeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci koji su efikasno blokirani ili pokriveni peptidom koji se specifično vezuje za antigen (drugim rečima, aminokiselinski ostatak je unutar “footprint-a” specifičnog peptida koji se vezuje za antigen).
[0048] Pojam „himerno antitelo“ kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo u kome je varijabilni region poreklom koje nije humano (npr. poreklom iz glodara), a konstantni region je poreklom iz druge vrste, kao što je lјudska. Himerna monoklonska antitela za terapeutske primene su razvijena da smanje imunogenost antitela. Izrazi „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ kako se koriste u kontekstu himernih antitela, odnose se na region koji sadrži CDR i okvirne regione i teškog i lakog lanca imunoglobulina. Himerna antitela se mogu generisati upotrebom standardnih DNK tehnika kao što je opisano u Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ch. 15. Himerno antitelo može biti genetski ili enzimski konstruisano rekombinantno antitelo. Stručnoj osobi iz oblasti je u okviru znanja poznato kako da generiše himerno antitelo, i prema tome, stvaranje himernog antitela u skladu sa ovim predmetnim pronalaskom može biti izvedeno drugim postupcima osim ovde opisanim.
[0049] Termin „humanizovano antitelo“ kako se ovde koristi, odnosi se na genetski modifikovano nehumano antitelo, koje sadrži konstantne domene humanog antitela i nehumane varijabilne domene modifikovane da imaju visok nivo homologije sekvence sa humanim varijabilnim domenima. Ovo se može postići presađivanjem šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR) nehumanog antitela, koji zajedno čine mesto vezivanja antigena, na homologni humani akceptorski okvirni region (FR) (videti u WO92/22653 i EP0629240). Da bi se u potpunosti rekonstituisao afinitet vezivanja i specifičnost roditelјskog antitela, može biti potrebna zamena okvirnih rezidua roditelјskog antitela (tj. nehumanog antitela) u humane okvirne regione (povratne mutacije). Modeliranje strukturne homologije može pomoći da se identifikuju aminokiselinski ostaci u okvirnim regionima koji su važni za svojstva vezivanja antitela. Prema tome, humanizovano antitelo može da sadrži nehumane CDR sekvence, prvenstveno humane okvirne regione koji opciono sadrže jednu ili više povratnih mutacija aminokiselina u nehumanoj sekvenci aminokiselina, i potpuno humane konstantne regione. Opciono, dodatne modifikacije aminokiselina, koje nisu nužno povratne mutacije, mogu se primeniti da bi se dobilo humanizovano antitelo sa poželјnim karakteristikama, kao što su afinitet i biohemijska svojstva.
[0050] Termin „humano antitelo“ kako se ovde koristi, odnosi se na antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci germinativne linije humanog imunoglobulina. Humana antitela mogu uklјučivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama humanog imunoglobulina germinativne linije (npr. mutacije uvedene in vitro nasumičnom ili mutagenezom specifičnom za mesto ili in vivo somatskom mutacijom). Međutim, termin „humano antitelo“, kako se ovde koristi, ne podrazumeva da obuhvata antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije drugih vrsta sisara, kao što je npr. miš, ugrađene u humane okvirne sekvence. Humana monoklonska antitela predmetnog pronalasku mogu se dobiti različitim tehnikama, uklјučujući konvencionalne postupke dobijanja monoklonskih antitela, npr. standardnu tehniku hibridizacije somatskih ćelija po Kohler-u i Milstein-u (Nature 256: 495 (1975)). Iako su procedure hibridizacije somatskih ćelija poželјne, u principu, mogu se koristiti druge tehnike za produkciju monoklonskih antitela, npr. virusna ili onkogena transformacija B-limfocita ili tehnike fagnog prikaza („phagedisplay“) fragmenata antitela na fagu upotrebom biblioteka gena humanih antitela. Pogodan životinjski sistem za pripremu hibridoma koji luče humana monoklonska antitela je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma kod miša je vrlo dobro uspostavlјena procedura. Protokoli i tehnike imunizacije za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u tehnici. Fuzion partneri (npr., ćelije mijeloma miša) i postupci fuzije su takođe poznati. Humana monoklonska antitela tako mogu npr. biti generisana upotrebom transgenih ili transhromozomskih miševa ili pacova koji nose delove humanog imunskog sistema, a ne samo sisteme miša ili pacova. Shodno tome, u jednom primeru izvođenja, humano antitelo se dobija od transgene životinje, kao što je miš ili pacov, koja nosi sekvence germinativne linije humanog imunoglobulina umesto sekvenci životinjskog imunoglobulina. U takvim realizacijama, antitelo potiče od sekvenci germinativne linije humanog imunoglobulina introdukovane u životinju, ali konačna sekvenca antitela je rezultat dalјe modifikacije putem somatskih hipermutacija i sazrevanja afiniteta navedene sekvence germinativne linije humanog imunoglobulina pomoću mašinerije endogenih životinjskih antitela, videti npr. u Mendez et al.1997 Nat Genet.15(2): 146-56. Izraz „uslovi redukcije“ ili „redukujuća sredina“ odnosi se na stanje ili okruženje u kome je veća verovatnoća da će supstrat, ovde cisteinski ostatak u zglobnom regionu antitela, postati redukovan nego oksidovan.
[0051] Pojam „rekombinantna ćelija domaćin“ (ili jednostavno „ćelija domaćin“), kako se ovde koristi, ima za cilј da se odnosi na ćeliju u koju je uveden ekspresioni vektor, npr. ekspresioni vektor koji kodira antitelo pronalaska. Rekombinantne ćelije domaćini uklјučuju, na primer, transfektome, kao što su CHO, CHO-S, HEK, HEK293, HEK-293F, Expi293F, PER.C6 ili NS0 ćelije, i limfocitne ćelije.
[0052] Pojam „tretman" se odnosi na primenu efikasne količine terapeutski aktivnog antitela iz ovog pronalaska sa svrhom ublažavanja, poboljšanja, zaustavlјanja ili iskorenjivanja (lečenja) simptoma ili stanja bolesti.
[0053] Pojam „efikasna količina“ ili „terapeutski efikasna količina“ se odnosi na efektivnu količinu, u dozama i tokom određenog vremenskog perioda, koji su neophodni za postizanje želјenog terapeutskog rezultata. Terapeutski efikasna količina antitela može da varira u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pojedinca, kao i sposobnost antitela da izazove želјeni odgovor kod pojedinca. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj su bilo koji toksični ili štetni efekti antitela ili dela antitela nadjačani terapeutski korisnim efektima.
[0054] Pojam "antiidiotipsko antitelo" se odnosi na antitelo koje prepoznaje jedinstvene determinante koje su uglavnom povezane sa mestom vezivanja antigena antitela.
Dalјi aspekti i realizacije pronalaska
[0055] Kao što je gore opisano, u prvom aspektu, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje obuhvata antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 i region koji je sposoban da se veže za humani CD3ε (epsilon), pri čemu je navedeni antigen- vezujući region sposoban da se veže za humani PD-L1 obuhvata VH sekvencu koja ima 100% identičnost u aminokiselinskoj sekvenci sa VH sekvencom navedenoj u: SEQ ID NO: 18 i VL sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvence sa VL sekvencom navedenoj u: SEQ ID NO:22, pri čemu antitelo inhibira vezivanje humanog PD-L1 za humani PD-1. Takva bispecifična antitela stoga obuhvataju dva različita regiona za vezivanje antigena, jedan koji ima specifičnost vezivanja za PD-L1 i drugi koji ima specifičnost vezivanja za CD3.
[0056] Navedeni antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence, pri čemu VH CDR3 sekvenca je navedena u: SEQ ID NO:21.
[0057] Navedeni antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 19, 20 i 21, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:23, sekvencu DDN i sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:24, tim redom. U drugom izvođenju, pomenuti antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 obuhvata VH sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvence sa VH sekvencom navedenom u: SEQ ID NO:18.
[0058] Pomenuti antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 obuhvata VL sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvence sa VL sekvencom navedenom u: SEQ ID NO:22.
[0059] Navedeni antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 obuhvata VH sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvence sa VH sekvencom navedenom u: SEQ ID NO:18 i VL sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VL sekvencom datom u: SEQ ID NO:22.
[0060] Prema pronalasku, pomenuti antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 obuhvata VH sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:18 i VL sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:22.
[0061] Kao što je gore opisano, iznad pomenuta bispecifična antitela iz prvog aspekta pronalaska obuhvataju region koji antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani CD3ε.
[0062] U jednom izvođenju, antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani CD3ε, obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što su navedene u SEQ ID NO: 26, 27, i 28, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:31, tim redom.
[0063] Šest sekvenci CDR, kako su iznad definisane, su izvedene iz mišjeg antitela označenog kao SP34. Humanizovane verzije ovog antitela su generisane, a humanizovana antitela su ovde označena kao huCD3 i dalјe su otkrivena u WO2015001085 (Genmab).
[0064] U poželјnoj realizaciji bispecifičnog antitela pronalaska, pomenuto bispecifično antitelo obuhvata antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani PD-L1, sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence kao što je navedeno u SE ID NO: 19, 20 i 21, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO: 23, sekvencu DDN i sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:24, tim redom, i antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani CD3ε koji obuhvata (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO: 26, 27 i 28, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:31, tim redom.
[0065] U jednom izvođenju, bispecifično antitelo obuhvata antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani CD3ε koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH), pri čemu navedena VH sekvenca ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99% ili 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvence sa sekvencom aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO:25.
[0066] U drugom izvođenju, bispecifično antitelo obuhvata antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani CD3ε koji sadrži varijabilni region lakog lanca (VL), pri čemu navedena VL sekvenca ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99% ili 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa sekvencom aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO:29.
[0067] U poželјnoj realizaciji, antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani CD3ε obuhvata VH sekvencu kako je navedena u SEQ ID NO:25 i VL sekvencu kako je navedena u SEQ ID NO:29.
[0068] U jednom izvođenju, bispecifična antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti modifikovana da bi se smanjio afinitet antitela. Ovo može biti korisno u nekim okruženjima i dovesti do povećane efikasnosti. Konkretno, nizak afinitet vezivanja za humani CD3ε može imati efekta na pokretlјivost T ćelija u cirkulaciji i na mestu tumora, što dovodi do bolјeg angažovanja T ćelija sa tumorskim ćelijama, cf. Mølhøj et al., Molecular Immunology 44 (2007).
[0069] Shodno tome, u različitoj realizaciji bispecifično antitelo pronalaska koje obuhvata antigenvezujući region koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 i antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani CD3ε, navedeno bispecifično antitelo:
(i) ima niži afinitet vezivanja za humani CD3ε u poređenju sa antitelom koje ima antigenvezujući region koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 25 i VL sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 29, poželјno je da je navedeni afinitet najmanje 2 puta niži, npr. najmanje 5 puta niži, kao što je najmanje 10 puta niži, npr. najmanje 25 puta niži, kao što je najmanje 50 puta niži, i
(ii) je sposobno da posreduje u koncentracijski zavisnoj citotoksičnosti ćelija MDA-MB-231, PC-3 ćelija i/ili HELA ćelija kada se koriste PBMC ili prečišćene T ćelije kao efektorske ćelije.
[0070] Slično, u jednoj realizaciji, antitelo pronalaska obuhvata antigen-vezujući region koji je sposoban da se veže za humani CD3ε, pri čemu je pomenuti region za vezivanje antigena sposoban da se veže za humani CD3ε:
(i) ima niži afinitet vezivanja za humani CD3ε u poređenju sa antitelom koje ima antigenvezujući region koji može da sadrži VH sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 25 i VL sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 29, poželјno je da je navedeni afinitet najmanje 2 puta niži, npr. najmanje 5 puta niži, kao što je najmanje 10 puta niži, npr. najmanje 25 puta niži, kao što je najmanje 50 puta niži, i
(ii) je sposobno da posreduje u koncentracijski zavisnoj citotoksičnosti ćelija MDA-MB-231, PC-3 ćelija i/ili HELA ćelija kada se koriste PBMC ili prečišćene T ćelije kao efektorske ćelije.
[0071] Afinitet za humani CD3ε može se npr. meriti upotrebom određivanja afiniteta vezivanja okteta kao što je opisano u Primeru 7 od WO2017009442.
[0072] Sposobnost antitela da posreduje u citotoksičnosti PBMC ili prečišćenih T ćelija može npr. biti određena kao što je ovde opisano u Primeru 11, gde su A-MB-231, PC-3 ćelije ili HELA ćelije zasejane i gajene u bunarićima. Potom su dodate tumorske ćelije, PBMC i serijska razblaženja antitela, a nakon inkubacije tumorske ćelije su obojene radi procene vijabilnosti.
[0073] Ovde se huCD3-H1L1 odnosi na anti-CD3 antitelo koje ima VH i VL sekvence kao što su navedene u SEQ ID NOs: 25 i 29. IgG1-huCD3-FEAL se odnosi na njegovu varijantu koja obuhvata supstitucije L234F, L235E, D255A i F405 (videti i negde ovde drugde).
[0074] Primeri varijanti IgG1-huCD3-FEAL sa smanjenim afinitetom za humani CD3ε opisani su u WO2017009442 (Genmab). Primer 7 (Tabela 6) u WO2017009442 otkriva afinitete IgG1-huCD3-FEAL i sedam njegovih varijanti, merene pomoću određivanja afiniteta vezivanja okteta:
[0075] U jednoj realizaciji bispecifičnog antitela pronalaska, region koji se vezuje za antigen sposoban da se veže za humani CD3ε obuhvata:
(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO: 99, 27 i 28, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:31, tim redom, ili
(ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO: 100, 27 i 28, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:31, tim redom, ili
(iii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO: 26, 27 i 101, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:31, tim redom, ili
(iv) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO: 26, 27 i 102, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:31, tim redom, ili
(v) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO: 26, 27 i 103, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:31, tim redom, ili
(vi) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO: 26, 27 i 104, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:31, tim redom, ili
(vii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO: 26, 27 i 105, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:31, tim redom.
[0076] U drugom aspektu, region koji se vezuje za antigen sposoban da se veže za humani CD3ε obuhvata:
(i) VH Sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:39 i VL sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:29, ili
(ii) VH sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:40 i VL sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:29, ili
(iii) VH sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:41 i VL sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:29, ili
(iv) VH sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:42 i VL sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:29, ili
(v) VH sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:43 i VL sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:29, ili
(vi) VH sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:44 i VL sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:29, ili
(vii) VH sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:45 i VL sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:29.
[0077] U dalјim poželјnim realizacijama bispecifičnog antitela pronalaska, svaki od regiona koji vezuju antigen sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), i pri čemu svaki navedeni varijabilni region sadrži tri CDR sekvence, CDR1 , CDR2 i CDR3, tim redom, i četiri sekvence okvirnog regiona, FR1, FR2, FR3 i FR4, tim redom.
[0078] U dalјim poželјnim realizacijama bispecifičnog antitela pronalaska, antitelo obuhvata dva konstantna regiona teškog lanca (CH) i dva konstantna regiona lanca (CL).
[0079] U poželјnoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi i drugi teški lanac, pri čemu svaki od navedenih teških lanca sadrži najmanje region zgloba, CH2 i CH3 region, pri čemu u pomenutom prvom teškom lancu najmanje jedna od aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji izabranoj iz grupe koju čine T366, L368, K370, D399, F405, Y407 i K409 (prema EU numerisanju) je zamenjena, a u navedenom drugom teškom lancu najmanje jedna od aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji izabranoj iz grupe koju čine T366, L368, K370, D399, F405, y407 i K409 (prema EU numerisanju) je zamenjena, i pri čemu u navedenom prvom i navedenom drugom teškom lancu nisu zamene na istim pozicijama.
[0080] Najpoželјnije, (i) aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 (prema EU numerisanju) je L u pomenutom prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 (prema EU numerisanju) je R u pomenutom drugom teškom lancu, ili (ii) aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 (prema EU numerisanju) je R u pomenutom prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 (prema EU numerisanju) je L u navedenom drugom teškom lancu.
[0081] U dalјem posebno poželјnom izvođenju, antitelo je bispecifično antitelo CD3xPD-L1 koje sadrži prvi i drugi teški lanac, pri čemu pozicije koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 su F i E u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju i prvog teškog lanca i drugog teškog lanca, tim redom, i pri čemu (i) pozicija koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju prvog teškog lanca je L, a pozicija koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju drugog teškog lanca je R, ili (ii) pozicija koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju prvog teškog lanca je R, a pozicija koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju drugog teškog lanca je L.
[0082] U dalјem posebno poželјnom izvođenju, antitelo je bispecifično antitelo CD3xPD-L1 koje sadrži prvi i drugi teški lanac, pri čemu pozicije koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 su F, E i A u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju i prvog teškog lanca i drugog teškog lanca, tim redom, i pri čemu (i) pozicija koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju prvog teškog lanca je L, a pozicija koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju drugog teškog lanca je R, ili (ii) pozicija koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju prvog teškog lanca je R, a pozicija koja odgovara do F405 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju drugog teškog lanca je L.
Nove klase PD-L1 antitela
[0083] U dalјem aspektu, pronalazak obezbeđuje nova anti-PD-L1 antitela koja sadrže region koji se vezuje za antigen i koji je sposoban da se veže za humani PD-L1, pri čemu pomenuti region za vezivanje antigena sposoban da se veže za humani PD-L1 obuhvata VH sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VH sekvencom navedenom u: SEQ ID NO: 18 i VL sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VL sekvencom navedenom u: SEQ ID NO: 22. Antitela ovog aspekta pronalaska mogu biti monospecifična ili multispecifična, i, ako su multispecifična, navedena multispecifična antitela mogu, ili ne moraju, da sadrže region koji se vezuje za antigen koji je sposoban da se veže za humani CD3ε.
[0084] U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži region koji se vezuje za antigen i koji je sposoban da se veže za humani PD-L1, pri čemu pomenuti region za vezivanje antigena sposoban da se veže za humani PD-L1 ima karakteristike kao što je iznad definisano.
[0085] U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži region koji se vezuje za antigen i koji je sposoban da se veže za humani PD-L1, pri čemu je vezivanje antitela za mutantni PD-L1 u kome je supstituisan sa alaninom aminokiselinski ostatak bilo koji, jedan ili više njih, na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 58 (E58) i 113 (R113) u SEQ ID NO: 94. Vezivanje ovakvog antitela je smanjeno u poređenju sa divlјim tipom PD-L1 koji ima aminokiselinsku sekvencu datu u SEQ ID NO: 94; smanjeno vezivanje se određuje kao veličina promene (eng. fold change) u vezivanju pomenutog antitela koja je manja od srednje vrednosti veličine promene u vezivanju za sve mutante alanina - 1,5xSD, pri čemu je SD standardna devijacija svih izračunatih veličina promene za antitelo za mutirani PDL1, i stepen promene u vezivanju se izračunava kao što je navedeno u Primeru 13.
[0086] Antitelo se može vezati za epitop na PD-L1 (SEQ ID NO: 94), pri čemu navedeni epitop obuhvata aminokiselinski ostatak na poziciji 58 (E58) i/ili aminokiselinski ostatak na poziciji 113 (R113) SEQ ID NO: 94.
[0087] U dalјim realizacijama, antitelo prema pronalasku je sposobno da indukuje dozno zavisnu lizu epitelnih ćelija adenokarcinoma, kao što su MDA-MB-231, što je zaključeno kroz ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC).
[0088] U dalјim realizacijama, antitelo prema pronalasku je sposobno da smanji broj ćelija u kulturi navedenih epitelnih ćelija za najmanje 5%, kao što je najmanje 6%, 7%, 8%, 9% ili najmanje 10% kao rezultat lize ćelija.
[0089] ADCC se može odrediti in vitro u testu raspadanja<51>Cr, kao što je test ovde otkriven u primeru 14. Posebno se određuje ADCC in vitro, inkubacijom navedenih epitelnih ćelija sa kompozicijom koja obuhvata antitelo i efektorske ćelije, kao što su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), tokom 4 sata na 37°C, 5% COz, pri čemu je količina antitela u pomenutoj kompoziciji u opsegu od 0,1 - 1 µg/mL i odnos efektorskih ćelija prema epitelnim ćelijama je 100:1.
[0090] Liziranje epitelnih ćelija se može se odrediti in vitro u testu reportera luciferaze kao surogata za ADCC, kao što je luminiscentni ADCC reporter biotest ovde otkriven u primeru 14.
[0091] ADCC se može posebno odrediti in vitro, na sledeći način:
i) dovođenje u kontakt kulture navedenih epitelnih ćelija sa kompozicijom koja sadrži antitelo i Jurkat humane T-ćelije koje stabilno eksprimiraju FcγRIIIa (CD16) i luciferazu iz svitca (efektorske ćelije), u odnosu efektorska ćelija:epitelna ćelija od 1:1.
ii) podešavanje kulture epitelnih ćelija i efektorskih ćelija na sobnu temperaturu tokom 15 minuta,
iii) inkubiranje kulture epitelnih ćelija i efektorskih ćelija sa supstratom luciferaze, i
iv) određivanje proizvodnje luciferaze u pomenutoj ćelijskoj kulturi;
količina antitela u pomenutoj kompoziciji je u opsegu od 0,5-250 ng/mL i odnos efektorskih ćelija prema epitelnim ćelijama je 1:1.
[0092] ADCC navedenih epitelnih ćelija se može odrediti u testu reportera luciferaze, kao što je test reportera definisan u patentnom zahtevu 23 ili 24, zatim ADCC zabeležen nakon inkubacije kulture epitelnih ćelija sa test kompozicijom koja sadrži pomenuto antitelo je najmanje 1,5 puta dobijen ADCC nakon inkubacije kulture epitelnih ćelija sa kompozicijom koja sadrži referentno antitelo; ADCC se određuje kao relativna jedinice luminiscencije (RLU), koncentracija antitela u pomenutoj test kompoziciji i u pomenutoj kompoziciji koja sadrži referentno antitelo je isto i u opsegu od 20 do 250 ng/ml, a referentno antitelo se bira između:
a) antitelo koje obuhvata VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 74 i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 78; i
b) antitelo koje obuhvata VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 81 i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 85.
[0093] U jednom aspektu, obezbeđeno je antitelo koje obuhvata antigen vezujući
[0094] Prema pronalasku, obezbeđeno je antitelo koje obuhvata region koji se vezuje za antigen i koje je sposobno da se veže za humani PD-L1, pri čemu pomenuti region za vezivanje antigena koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 sadrži VH sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VH sekvencom navedenom u: SEQ ID NO:18 i VL sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VL sekvencom navedenom u: SEQ ID
[0095] Prema pronalasku, obezbeđeno je antitelo koje obuhvata region koji se vezuje za antigen i sposobno je da se veže za humani PD-L1, pri čemu pomenuti region za vezivanje antigena koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 sadrži VH sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO :18 i VL sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:22.
[0096] U jednom izvođenju, antitelo koje obuhvata region za vezivanje antigena sposobno je da se veže za humani PD-L1 je monovalentno.
[0097] U drugom izvođenju, antitelo koje obuhvata region za vezivanje antigena sposobno za vezivanje za humani PD-L1, je monospecifično antitelo koje obuhvata dva ili više identičnih regiona za vezivanje antigena.
[0098] U daljoj realizaciji, antitelo koje obuhvata region za vezivanje antigena i koji je sposoban za vezivanje za humani PD-L1, je dvovalentno antitelo koje ima dva regiona za vezivanje antigena sposobna da se vežu za humani PD-L1 i gde navedena dva regiona za vezivanje antigena imaju identičnu sekvencu varijabilnog regiona.
[0099] U drugoj realizaciji, antitelo koje obuhvata region za vezivanje antigena sposobnog za vezivanje za humani PD-L1, je bivalentno bispecifično antitelo koje pored navedenog (prvog) regiona za vezivanje antigena sposobnog da se veže za humani PD-L1, sadrži (drugi) region za vezivanje antigena koji je sposoban da se veže za drugi antigen, pri čemu je pomenuti drugi antigen humani CD3ε.
[0100] U drugoj realizaciji, antitelo koje obuhvata region za vezivanje antigena sposobnog za vezivanje za humani PD-L1, je bivalentno bispecifično antitelo, koje, pored navedenog (prvog) regiona za vezivanje antigena sposobnog da se veže za humani PD-L1, sadrži (drugi) region za vezivanje antigena koji je sposoban da se veže za drugi antigen ili različit
[0101] Prema pronalasku, navedeni region za vezivanje antigena koji je sposoban za vezivanje za humani PD-L1 obuhvata VH sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VH sekvencom navedenom u: SEQ ID NO:18 i VL sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VL sekvencom navedenom u: SEQ ID NO:22.
[0102] Prema pronalasku, pomenuti region za vezivanje antigena koji je sposoban za vezivanje za humani PD-L1 obuhvata VH sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:18 i VL sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:22.
[0103] U jednom izvođenju ovog pronalaska, antitelo inhibira vezivanje humanog PD-L1 za humani PD-1.
[0104] U dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na bivalentno bispecifično antitelo koje sadrži prvi region za vezivanje antigena koji je sposoban za vezivanje za humani PD-L1 i drugi region za vezivanje antigena koji je sposoban za vezivanje za drugi antigen ili za drugi epitop humanog PD-L1, gde pomenuti drugi antigen opciono nije humani CD3ε, i gde pomenuti region za vezivanje antigena koji je sposoban za vezivanje za humani PD-L1 obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence, pri čemu je
[0105] Prema pronalasku, navedeni region za vezivanje antigena koji je sposoban za vezivanje za humani PD-L1 sadrži VH sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VH sekvencom navedenom u: SEQ ID NO:18 i VL sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvence sa VL sekvencom navedenom u: SEQ ID NO:22.
[0106] Prema pronalasku, pomenuti region za vezivanje antigena koji je sposoban za vezivanje za humani PD-L1 sadrži VH sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 18 i VL sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 22.
[0107] U jednom izvođenju ovog pronalaska, antitelo inhibira vezivanje humanog PD-L1 za humani PD-1.
Dalјe realizacije antitela pronalaska
[0108] U jednoj realizaciji, antitelo prema predmetnom pronalasku vezuje humani PD-L1 sa KD od oko 10<-8>M ili manje, na primer oko 10<-9>M ili manje, npr. oko 10<-10>M ili manje, kada je određeno kao što je opisano u Primeru 8 ovde.
[0109] U dalјoj realizaciji, antitelo pronalaska posreduje u citotoksičnosti zavisnoj od koncentracije MDA-MB-231 ćelija, PC-3 ćelija i/ili HELA ćelija kada se koriste prečišćene T ćelije kao efektorske ćelije, kada se testira kao što je opisano ovde u Primeru 11.
[0110] Antitelo pronalaska se ne vezuje za humani PD-L2.
Formati antitela
[0111] Kao što je iznad opisano, različiti formati antitela su opisani u stanju tehnike. Antitelo pronalaska u principu može biti bilo kog izotipa. Izbor izotipa će tipično biti vođen želјenim efektorskim funkcijama posredovanim Fc, kao što je indukcija ADCC, ili zahtevom za antitelom lišenim efektorske funkcije posredovane Fc („inertno“ antitelo). Primeri izotipova su IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Mogu se koristiti bilo koji od konstantnih regiona humanog lakog lanca, kapa ili lambda. Efektorska funkcija antitela iz predmetnog pronalaska može da se promeni prebacivanjem izotipa na, npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM antitelo za različite terapeutske upotrebe. U jednom aspektu, oba teška lanca antitela iz predmetnog pronalaska su izotipa IgG1, na primer IgG1,κ. Opciono, teški lanac može biti modifikovan u zglobnom i/ili CH3 regionu kao što je opisano na drugom mestu ovde.
[0112] Poželјno, svaki od regiona koji se vezuju za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), i pri čemu svaki navedeni varijabilni region sadrži tri CDR sekvence, CDR1, CDR2 i CDR3, i četiri sekvence okvirnog regiona, FR1, FR2, FR3 i FR4, tim redom. Dalјe, poželјno je, antitelo sadrži dva konstantna regiona teškog lanca (CH) i dva konstantna regiona lakog lanca (CL).
[0113] U jednoj realizaciji izvođenju, antitelo je antitelo pune dužine, kao što je IgG1 antitelo pune dužine. U drugoj realizaciji, antitelo je IgG4 antitelo pune dužine, poželјno sa stabilizovanim regionom zgloba. Opisane su u tehnici modifikacije koje stabilizuju IgG4 region zgloba, kao što je mutacija S228P u centralnom delu zgloba, videti npr. Labrijn et al., 2009 Nat Biotechnol.27(8): 767-71.
[0114] U drugim realizacijama, antitelo pronalaska je fragment antitela, kao što je Fab' ili Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena, monovalentno antitelo kao što je opisano u WO2007059782 (Genmab), F(ab')2fragment, Fd fragment ili Fv fragment.
[0115] Antitela pronalaska su poželјno humana, humanizovana ili himerna. U realizacijama u kojima je antitelo bispecifično antitelo, oba polumolekula mogu biti humana, humanizovana ili himerna, ili se polumolekuli mogu razlikovati po karakteru u pogledu porekla sekvence.
[0116] Na primer, u jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži dva polumolekula od kojih svaki sadrži region za vezivanje antigena, pri čemu
(i) polumolekul(i) koji sadrži(e) region za vezivanje antigena ima sposobnost za vezivanje za humani PD-L1 je/su himeran/i, i/ili
(ii) polumolekul koji sadrži region za vezivanje antigena ima sposobnost za vezivanje za humani CD3ε (epsilon), ako je prisutan, je himerni.
[0117] Na primer, u drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži dva polumolekula od kojih svaki sadrži region za vezivanje antigena, pri čemu
(i) polumolekul(i) koji sadrži(e) region za vezivanje antigena ima sposobnost za vezivanje za humani PD-L1 je/su humanizovan/i, i/ili
(ii) polumolekul koji sadrži region za vezivanje antigena ima sposobnost za vezivanje za humani CD3ε (epsilon), ako je prisutan, je humanizovan.
[0118] Na primer, u dalјoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži dva polumolekula od kojih svaki sadrži region za vezivanje antigena, pri čemu
(i) polumolekul(i) koji sadrži(e) region za vezivanje antigena ima sposobnost za vezivanje za humani PD-L1 je/su human/i, i/ili
(ii) polumolekul koji sadrži region za vezivanje antigena ima sposobnost za vezivanje za humani CD3ε (epsilon), ako je prisutan, je humani.
[0119] Tako, na primer, u jednoj realizaciji, region(i) za vezivanje antigena ima(ju) sposobnost za vezivanje za humani PD-L1 je/su humanizovan(i), a region za vezivanje antigena ima sposobnost za vezivanje za humani CD3ε (epsilon), ako je prisutan, je humanizovan.
[0120] U drugoj različitoj realizaciji, region(i) za vezivanje antigena ima(ju) sposobnost za vezivanje za humani PD-L1 je/su humani, a region za vezivanje antigena ima sposobnost za vezivanje za humani CD3ε (epsilon), ako je prisutan, je humani.
[0121] U dalјem izvođenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži region za vezivanje antigena koji ima sposobnost za vezivanje za humani PD-L1 i region za vezivanje antigena koji ima sposobnost za vezivanje za humani CD3ε (epsilon), pri čemu polumolekul koji obuhvata region za vezivanje antigena koji ima sposobnost za vezivanje za humani PD-L1 je humani, humanizovan ili himeričan, a polumolekul koji obuhvata region za vezivanje antigena koji ima sposobnost za vezivanje za humani CD3ε (epsilon) je humanizovan.
[0122] Poželјno, polumolekul koji sadrži region za vezivanje antigena koji ima sposobnost za vezivanje za humani PD-L1 je humani, a polumolekul koji sadrži region za vezivanje antigena koji ima sposobnost za vezivanje za humani CD3ε (epsilon) je humanizovan.
Formati bispecifičnih antitela
[0123] Mnogi različiti formati i upotreba bispecifičnih antitela su poznati u tehnici i pregledno su predstavljeni od strane Kontermann; Drug Discov Today, 2015. jul; 20(7): 838-47 i; MAbs, 2012 Mar-Apr; 4(2): 182-97.
[0124] Bispecifično antitelo u skladu sa ovim pronalaskom nije ograničeno na bilo koji određeni bispecifični format ili postupak njegove proizvodnje.
[0125] Primeri molekula bispecifičnih antitela koji se mogu koristiti u ovom predmetnom pronalasku obuhvataju (i) jedno antitelo koje ima dva kraka koja sadrže različite regione za vezivanje antigena; (ii) jednolančano antitelo koje ima specifičnost za dva različita epitopa, npr., preko dva scFvs povezana u tandemu dodatnim peptidnim poveznikom; (iii) antitelo sa dvostrukim varijabilnim domenom (DVD-Ig), gde svaki laki lanac i teški lanac sadrže dva varijabilna domena u tandemu kroz kratku peptidnu vezu (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, in: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010.)); (iv) hemijski vezan bispecifični (Fab')2 fragment; (v) „Tandab“, koji je fuzija dva jednolančana dijatela što rezultuje nastajanjem tetravalentnog bispecifičnog antitela koje ima dva mesta vezivanja za svaki od cilјnih antigena; (vi) fleksibilno telo, koje je kombinacija scFvs sa dijatelom što rezultuje nastajanjem multivalentnog molekula; (vii) takozvani molekul „pristani i zaklјučaj“, koji je zasnovan na „dimerizaciji i povezivanju domena“ protein kinaze A, koji kada se primeni na Fab-ove može dati trovalentni bispecifični vezujući protein koji se sastoji od dva identična Fab fragmenta povezana sa različitim Fab fragmentom; (viii) takozvani molekul „Škorpion“, koji sadrži, npr., dva scFv-a spojena na oba kraja humanog Fab-fragmenta; i (ix) dijatelo.
[0126] U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo predmetnog pronalaska je dijatelo, unakrsno ili bispecifično antitelo dobijeno putem kontrolisane razmene Fab-fragmenata (kao što je opisano u WO2011131746 (Genmab)).
[0127] Primeri različitih klasa bispecifičnih antitela uklјučuju, ali nisu ograničeni na (i) molekule slične IgG sa komplementarnim CH3 domenima kako bi se forsirala heterodimerizacija; (ii) rekombinantne molekule slične IgG sa dvostrukim ciljem, pri čemu svaka od dve strane molekula sadrži Fab fragment ili deo Fab fragmenta od najmanje dva različita antitela; (iii) IgG fuzione molekule, gde su IgG antitela pune dužine spojena sa dodatnim Fab fragmentom ili delovima Fab fragmenta; (iv) Fc fuzione molekule, gde su jednolančani Fv molekuli ili stabilizovana dijatela fuzionisana sa konstantnim domenima teškog lanca, Fc regionima ili njihovim delovima; (v) Fab fuzione molekule, gde su različiti Fab-fragmenti fuzionisani zajedno, fuzionisani za konstantne domene teškog lanca, Fc regione ili njihove delove; i (vi) na bazi ScFv- i dijatela, i antitela teškog lanca (npr. domenska antitela, nanotela), pri čemu su različiti jednolančani Fv molekuli ili različita dijatela ili različita antitela teškog lanca (npr. domenska antitela, nanotela) fuzionisana jedno sa drugim ili na druge proteine ili molekule nosača fuzionisane za konstantne domene teškog lanca, Fc regione ili njihove delove.
[0128] Primeri molekula sličnih IgG sa komplementarnim molekulima CH3 domena uklјučuju, ali nisu ograničeni na molekule „Triomab/Quadroma“ (Trion Pharma/Fresenius Biotech; Roche, WO2011069104), takozvani molekuli „Knobs-into-Holes“ (Genentech, WO9850431), „CrossMAbs“ (Roche, WO2011117329) i elektrostatički podudarni molekuli (Amgen, EP1870459 i WO2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, WO2010129304), molekuli „LUZ-Y“ (Genentech, Wranik et al. J. Biol. Chem.2012, 287(52): 43331-9, doi: 10.1074/jbc.M112.397869. Epub 2012 Nov 1), molekuli „DIG-body“ i „PIG-body“ (Pharmabcine, WO2010134666, WO2014081202), molekuli tela domena projektovanog za razmenu lanaca („SEEDbody“) (EMD Serono, WO2007110205), molekuli „Biclonics“ (Merus, WO2013157953), „FcΔAdp“ molekuli (Regeneron, WO201015792), bispecifični IgG1 i IgG2 molekuli (Pfizer/Rinat, WO11143545), Azimetrični molekuli potke (Zymeworks/Merck, WO2012058768), mAb-Fv molekuli (Xencor, WO2011028952), bivalentna bispecifična antitela (WO2009080254) i „DuoBodi<®>“ molekuli (Genmab, WO2011131746).
[0129] Primeri rekombinantnih IgG-u sličnih molekula sa dvostrukim cilјem uklјučuju, ali nisu ograničeni na: molekule „Dual Targeting (DT)-Ig” (WO2009058383), antitelo dva u jednom („Two-inone Antibody“) (Genentech; Bostrom, et al 2009. Science 323, 1610-1614.), „Cross-linked Mabs“ (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star, WO2008003116), „Zybodi“ molekule (Zyngenia; LaFleur et al. MAbs. 2013. Mar-Apr; 5(2): 208-18), pristupe sa zajedničkim lakim lancem (Crucell/Merus, US7,262,028), „κλTela“ (NovImmune, WO2012023053) i „CovX-body“ (CovKs/Pfizer; Doppalapudi, V.R., et al 2007. Bioorg. Med. Chem. Lett.17,501-506.).
[0130] Primeri fuzionih molekula IgG uklјučuju, ali nisu ograničeni na: molekule sa dvostrukim varijabilnim domenom (DVD)-Ig („Dual Variable Domain (DVD)-Ig“) (Abbott, US7,612,181), dvoglava antitela sa dualnim domenima (Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923), bispecifične molekule slične IgG (ImClone/Eli Lilly, Levis et al. Nat Biotechnol. 2014 Feb; 32(2): 191-8), „Ts2Ab“ (MedImmune/AZ; Dimasi i dr. J Mol Biol. 2009 Oct. 30; 393(3): 672-92) i „BsAb“ molekule (Zymogenetics, WO2010111625), „HERCULES“ molekule (Biogen Idec, US007951918), scFv fuzione molekule (Novartis), scFv fuzione molekule (Changzhou Adam Biotech Inc, CN 102250246) i TvAb molekule (Roche, WO2012025525, WO2012025530).
[0131] Primeri Fc fuzionih molekula uklјučuju, ali nisu ograničeni na: ScFv/Fc fuzije (Pearce et al., Biochem Mol Biol Int. 1997 Sep; 42(6): 1179-88), molekule „SCORPION“ (Emergent BioSolutions/Trubion, Blankenship JW, et al. AACR 100th Annual meeting 2009 (Abstract # 5465); Zymogenetics/BMS, WO2010111625), molekule tehnologije dvostrukog afiniteta („Fc-DART“) (MacroGenics, WO2008157379, WO2010080538) i Dual(ScFv)2-Fab molekuli (Nacionalni istraživački centar za medicinu antitela – Kina).
[0132] Primeri Fab fuzionih bispecifičnih antitela uklјučuju, ali nisu ograničeni na molekule F(ab)2 (Medarex/AMGEN; Deo et al. J Immunol. 1998. Feb 15; 160(4): 1677-86.), „Dual-Action“ ili Bis-Fab molekuli (Genentech, Bostrom, et al 2009. Science 323, 1610-1614.), „Dock-and-Lock“ (DNL) molekuli (ImmunoMedics, WO2003074569, WO2005004809), Bivalentni bispecifični molekuli (Biotecnol, Schoonjans, J Immunol. 2000, Dec 15; 165(12): 7050-7.) i Fab-Fv molekuli (UCB-Celltech, WO 2009040562 A1).
[0133] Primeri antitela na bazi ScFv-a, dijatela i antitela sa domenom uklјučuju, ali nisu ograničeni na, molekule bispecifičnih „T Cell Engager“ (BiTE) (Micromet, WO2005061547), molekule tandem dijatela (TandAb) (Affimed) Le Gall et al., Protein Eng Des Sel.2004 Apr; 17(4): 357-66.), molekule „Dual Affinity Retargeting Technology” (DART) (MacroGenics, WO2008157379, WO2010080538), jednolančane molekule dijatela (Lawrence, FEBS Lett. 1998 Apr 3; 425(3): 479-84), antitela slična TCR (AIT, ReceptorLogics), fuzije humanog serumskog albumina ScFv (Merrimack, WO2010059315) i molekule „COMBODY“ (Epigen Biotech, Zhu et al. Immunol Cell Biol. 2010 Aug; 88(6): 667-75.), nanotela sa dvostrukim ciljem (Ablynx, Hmila et al., FASEB J.2010) i antitela sa dvostrukim ciljem samo na domen teškog lanca.
[0134] U jednom aspektu, bispecifično antitelo pronalaska obuhvata prvu Fc sekvencu koja obuhvata prvi CH3 region, i drugu Fc Sskvencu koja obuhvata drugi CH3 region, pri čemu su sekvence prvog i drugog CH3 regiona različite i takve su da heterodimerna interakcija između pomenutog prvog i drugog CH3 regiona je jača od svake od homodimernih interakcija pomenutog prvog i drugog CH3 regiona. Više detalјa o ovim interakcijama i načinu na koji se one mogu postići je dato u WO2011131746 i WO2013060867 (Genmab).
[0135] Kao što je dalјe ovde opisano, stabilno bispecifično antitelo, kao što je bispecifično CD3xPD-L1 antitelo, može se dobiti sa visokim prinosom upotrebom određenog postupka na osnovu jednog homodimernog početnog PD-L1 antitela i jednog homodimernog početnog antitela sposobnog da veže različite PD-L1 epitope ili različit antigen (kao što je homodimerno početno CD3 antitelo) koji sadrži samo nekoliko, konzervativnih, asimetričnih mutacija u CH3 regionima. Asimetrične mutacije znače da sekvence pomenutog prvog i drugog CH3 regiona sadrže aminokiselinske supstitucije različitim pozicijama.
[0136] U jednoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od varijanti koje su ovde opisane, prvi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji izabranoj iz grupe koju čine: 366, 368, 370, 399, 405, 407 i 409, a drugi CH3 region ima aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koju čine: 366, 368, 370, 399, 405, 407 i 409, i pri čemu u prvom i drugom CH3 regionu supstitucije nisu na istim pozicijama.
[0137] U jednoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, prvi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji 366, a pomenuti drugi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji izabranoj iz grupe koju čine: 368, 370, 399, 405, 407 i 409. U jednoj realizaciji, aminokiselina na poziciji 366 je izabrana između Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val ili Gln.
[0138] U jednoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, prvi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji 368, a pomenuti drugi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji izabranoj iz grupe koju čine: 366, 370, 399, 405, 407 i 409.
[0139] U jednoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, prvi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji 370, a pomenuti drugi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji izabranoj iz grupe koju čine: 366, 368, 399, 405, 407 i 409.
[0140] U jednoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, prvi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji 399, a pomenuti drugi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji izabranoj iz grupe koju čine: 366, 368, 370, 405, 407 i 409.
[0141] U jednoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, prvi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji 405, a pomenuti drugi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji izabranoj iz grupe koju čine: 366, 368, 370, 399, 407 i 409.
[0142] U jednoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, prvi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji 407, a pomenuti drugi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji izabranoj iz grupe koju čine: 366, 368, 370, 399, 405 i 409.
[0143] U jednoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, prvi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji 409, a pomenuti drugi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji izabranoj iz grupe koju čine: 366, 368, 370, 399, 405 i 407.
[0144] Shodno tome, u jednoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, sekvence pomenutog prvog i drugog CH3 regiona sadrže asimetrične mutacije, tj. mutacije na različitim pozicijama u dva CH3 regiona, npr. mutaciju na poziciji 405 u jednom od CH3 regiona i mutaciju na poziciji 409 u drugom CH3 regionu.
[0145] U jednoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, prvi CH3 region ima aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409 i pomenuti drugi CH3 region ima supstituciju aminokiseline na poziciji koja je izabrana iz grupe koju čine: 366, 368, 370, 399, 405 i 407. U jednom takvom izvođenju, pomenuti prvi CH3 region ima aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409 i pomenuti drugi CH3 region ima aminokiselinu koja nije Phe, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, Cys, Lys ili Leu, na poziciji 405. U sledećem izvođenju ovde, rečeno je da prvi CH3 region ima aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gin, Pro, Trp, Tir ili Cys, na poziciji 409 i pomenuti drugi CH3 region ima aminokiselinu koja nije Phe, Arg ili Gly, npr. Leu, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Met, Lys, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 405.
[0146] U sledećoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region sadrži Phe na poziciji 405 i aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409 i pomenuti drugi CH3 region sadrži aminokiselinu koja nije Phe , na primer. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr, Leu, Met ili Cys, na poziciji 405 i Lys na poziciji 409. U sledećoj realizaciji ovoga, pomenuti prvi CH3 region sadrži Phe na poziciji 405 i aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409 i pomenuti drugi CH3 region sadrži aminokiselinu koja nije Phe , Arg ili Gly, npr. Leu, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Met, Lys, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 405 i Lys na poziciji 409.
[0147] U sledećoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region sadrži Phe na poziciji 405 i aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409 i pomenuti drugi CH3 region sadrži Leu na poziciji 405 i Lys na poziciji 409. U sledećoj realizaciji ovoga, navedeni prvi CH3 region sadrži Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409, a pomenuti drugi CH3 region sadrži aminokiselinu koja nije Phe, Arg ili Gly, npr. Leu, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Met, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 405 i Lis na poziciji 409. U drugoj realizaciji,navedeni prvi CH3 region sadrži Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409, a pomenuti drugi CH3 region sadrži Leu na poziciji 405 i Lys na poziciji 409.
[0148] U sledećoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region sadrži aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409 i pomenuti drugi CH3 region sadrži Lys na poziciji 409, a Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405. U dalјem izvođenju, pomenuti prvi CH3 region sadrži Arg na poziciji 409, a pomenuti drugi CH3 region sadrži Lys na poziciji 409, Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0149] U još dalјoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region sadrži Lys na poziciji 370, Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409, a pomenuti drugi CH3 region sadrži Lys na poziciji pozicija 409, Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0150] U sledećoj varijanti bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region sadrži aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409 i pomenuti drugi CH3 region sadrži Lys na poziciji 409 i : a) Ile na poziciji 350 i Leu na poziciji 405, ili b) Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0151] U sledećoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region sadrži Arg na poziciji 409, a pomenuti drugi CH3 region sadrži Lys na poziciji 409 i: a) Ile na poziciji 350 i Leu na poziciji 405, ili b) Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0152] U sledećoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region sadrži Thr na poziciji 350, Lys na poziciji 370, Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409 i pomenuti drugi CH3 region sadrži Lys na poziciji 409 i: a) Ile na poziciji 350 i Leu na poziciji 405, ili b) Thr na poziciji 370 i Leu na poziciji 405.
[0153] U sledećoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region sadrži Thr na poziciji 350, Lys na poziciji 370, Phe na poziciji 405 i Arg na poziciji 409 i pomenuti drugi CH3 region sadrži Ile na poziciji 350, Thr na poziciji 370, Leu na poziciji 405 i Lys na poziciji 409.
[0154] U jednoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region ima aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met na poziciji 409, a navedeni drugi CH3 region ima aminokiselinu različitu od Phe na poziciji 405, kao što je različita aminokiselina od Phe, Arg ili Gly na poziciji 405; ili pomenuti prvi CH3 region ima aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met na poziciji 409, a pomenuti drugi CH3 region ima aminokiselinu različitu od Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ili Thr na poziciji 407.
[0155] U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo kao što je definisano u bilo kom od ovde opisanih izvođenja obuhvata prvi CH3 region koji ima aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met na poziciji 409 i drugi CH3 region koji ima aminokiselinu koja nije Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ili Thr na poziciji 407.
[0156] U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo kao što je definisano u bilo kom od ovde opisanih izvođenja obuhvata prvi CH3 region koji ima Tyr na poziciji 407 i aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met na poziciji 409 i drugi CH3 region koji ima aminokiselinu koja nije Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ili Thr na poziciji 407 i Lys na poziciji 409.
[0157] U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo kao što je definisano u bilo kom od ovde opisanih izvođenja obuhvata prvi CH3 region koji ima Tyr na poziciji 407 i Arg na poziciji 409 i drugi CH3 region koji ima aminokiselinu različitu od Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ili Thr na poziciji 407 i Lys na poziciji 409.
[0158] U drugoj realizaciji, pomenuti prvi CH3 region ima aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409 i pomenuti drugi CH3 region ima aminokiselinu koja nije Tyr , Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ili Thr, npr. Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, His, Asn, Pro, Trp ili Cys, na poziciji 407. U drugom aspektu, pomenuti prvi CH3 region ima aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409 i navedeni drugi CH3 region ima Ala, Gly, His , Ile, Leu, Met, Asn, Val ili Trp na poziciji 407.
[0159] U sledećoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region ima aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409 i navedeni drugi CH3 region ima Gly, Leu, Met , Asn ili Trp na poziciji 407.
[0160] U sledećoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region ima Tyr na poziciji 407 i aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409 i pomenuti drugi CH3 region ima aminokiselinu koja nije Tyr , Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ili Thr, npr. Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, His, Asn, Pro, Trp ili Cys, na poziciji 407 i Lys na poziciji 409.
[0161] U sledećoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region ima Tyr na poziciji 407 i aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409 i navedeni drugi CH3 region ima Ala, Gly, His , Ile, Leu, Met, Asn, Val ili Trp na poziciji 407 i Lys na poziciji 409.
[0162] U sledećoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region ima Tyr na poziciji 407 i aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409 i navedeni drugi CH3 region ima Gly, Leu, Met , Asn ili Trp na poziciji 407 i Lys na poziciji 409.
[0163] U sledećoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region ima Tyr na poziciji 407 i Arg na poziciji 409, a pomenuti drugi CH3 region ima aminokiselinu različitu od Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser ili Thr, npr. Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, His, Asn, Pro, Trp ili Cys, na poziciji 407 i Lys na poziciji 409.
[0164] U drugoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kom od ovde otkrivenih izvođenja, navedeni prvi CH3 region ima Tyr na poziciji 407 i Arg na poziciji 409, a pomenuti drugi CH3 region ima Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val ili Trp na poziciji 407 i Lys na poziciji 409.
[0165] U sledećoj realizaciji bispecifičnog antitela kako je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, pomenuti prvi CH3 region ima Tyr na poziciji 407 i Arg na poziciji 409, a pomenuti drugi CH3 region ima Gly, Leu, Met, Asn ili Trp na pozicija 407 i Lys na poziciji 409.
[0166] U sledećoj realizaciji bispecifičnog antitela kao što je definisano u bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, prvi CH3 region ima aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Phe, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 409, a drugi CH3 region ima
(i) aminokiselinu koja nije Phe, Leu i Met, npr. Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lis, Arg, His, Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 368, ili
(ii) Trp na poziciji 370, ili
(iii) aminokiselinu koja nije Asp, Cys, Pro, Glu ili Gin, npr. Phe, Leu, Met, Gly, Ala, Val, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Asn, Trp, Tyr ili Cys, na poziciji 399 ili
(iv) aminokiselinu različitu od Lys, Arg, Ser, Thr ili Trp, npr. Phe, Leu, Met, Ala, Val, Gly, Ile, Asn, His, Asp, Glu, Gln, Pro, Tyr ili Cys, na poziciji 366.
[0167] U jednoj realizaciji, prvi CH3 region ima Arg, Ala, Hys ili Gly na poziciji 409, a drugi CH3 region ima
(i) Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val ili Trp na poziciji 368, ili
(ii) Trp na poziciji 370, ili
(iii) Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lis, Arg ili Tyr na poziciji 399, ili
(iv) Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val, Gln, Phe, Gly, Ile, Leu, Met ili Tyr na poziciji 366.
[0168] U jednoj realizaciji, prvi CH3 region ima Arg na poziciji 409, a drugi CH3 region ima
(i) Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val ili Trp na poziciji 368, ili
(ii) Trp na poziciji 370, ili
(iii) Phe, His, Lys, Arg ili Tyr na poziciji 399, ili
(iv) Ala, Asp, Glu, His, Asn, Val, Gln na poziciji 366.
[0169] U poželјnoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi i drugi teški lanac, pri čemu svaki od navedenih teških lanaca, prvog i drugog, sadrži najmanje region zgloba, CH2 i CH3 region, pri čemu (i) aminokiselina na poziciji koja odgovara do F405 (prema EU numerisanju) je L u pomenutom prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 (prema EU numerisanju) je R u navedenom drugom teškom lancu, ili (ii) aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 (prema EU numerisanju) je R u pomenutom prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 (prema EU numerisanju) je L u pomenutom drugom teškom lancu.
[0170] Pored gore navedenih supstitucija aminokiselina, navedeni prvi i drugi teški lanci mogu sadržati dalјe supstitucije aminokiselina, deleciju ili insercije u odnosu na sekvence teškog lanca divlјeg tipa.
[0171] U dalјem izvođenju, pomenuta prva i druga Fab-fragmenta (ili konstantni domeni teškog lanca) obuhvataju, osim za određene mutacije, CH3 sekvencu nezavisno izabranu od sledećeg: (IgG1m(a)) (SEQ ID NO:96), (IgG1m(f)) (SEQ ID NO:97) i (IgG1m(ax) (SEQ ID NO:98).
[0172] U jednom izvođenju, ni navedena prva ni druga Fc sekvenca ne obuhvataju Cys-Pro-Ser-Cys sekvencu u (centralnom) regionu zgloba.
[0173] U dalјem izvođenju, i pomenuta prva i druga Fc sekvenca obuhvataju Cys-Pro-Pro-Cys sekvencu u (centralnom) regionu zgloba.
Postupci pripreme bispecifičnih antitela
[0174] Tradicionalni postupci kao što su hibridni hibridom i postupci hemijske konjugacije (Marvin and Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26:649) se mogu koristiti u pripremi bispecifičnih antitela prema pronalasku. Koekspresija dva antitela u ćeliji domaćinu, koja se sastoje od različitih teških i lakih lanaca, dovodi do mešavine mogućih proizvoda antitela pored želјenog bispecifičnog antitela, koji se zatim može izolovati, na primer, afinitetnom hromatografijom ili sličnim postupcima.
[0175] Takođe se mogu koristiti strategije koje favorizuju formiranje funkcionalnog bispecifičnog proizvoda nakon koekspresije različitih konstrukata antitela, npr. postupak je opisan u Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219). Fuzija hibridoma pacova i miša koji proizvode različita antitela dovodi do ograničenog broja heterodimernih proteina zbog preferencijalnog uparivanja teškog/lakog lanca prema vrsti. Druga strategija za promovisanje formiranja heterodimera u odnosu na homodimere je strategija „knob-into-hole” („izbočina-u-šuplinu“) u kojoj se izbočina uvodi na prvi polipeptid teškog lanca i u odgovarajuću šuplјinu u drugom polipeptidu teškog lanca, tako da izbočina može biti pozicionirana u udubljenju na dodirnoj površini (interfejsu) ova dva teška lanca tako da stimuliše formiranje heterodimera i ometa formiranje homodimera. „Izbočine“ nastaju zamenom malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog polipeptida većim bočnim lancima. Kompenzatorne "šuplјine" identične ili slične veličine kao izbočine se stvaraju u interfejsu drugog polipeptida zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina sa manjima (US patent 5,731,168). EP1870459 (Chugai) i WO2009089004 (Amgen) opisuju druge strategije za favorizovanje formiranja heterodimera nakon koekspresije različitih domena antitela u ćeliji domaćinu. Ovim postupcima, jedna ili više rezidua koje formiraju CH3-CH3 interfejs u oba CH3 domena biva zamenjena sa naelektrisanom aminokiselinom tako da formiranje homodimera biva elektrostatički nepovolјno, a heterodimerizacija elektrostatički povolјna. WO2007110205 (Merck) opisuju još jednu strategiju, u kojoj se razlike između CH3 domena IgA i IgG koriste za promovisanje heterodimerizacije.
[0176] Drugi in vitro postupak za proizvodnju bispecifičnih antitela je opisan u WO2008119353 (Genmab), pri čemu se bispecifično antitelo formira razmenom „Fab-ruku“ („Fab-fragmenata“) ili „polumolekula“ (zamena teškog lanca i pričvršćenog lakog lanca) između dva monospecifična IgG4- ili IgG4-slična antitela nakon inkubacije u redukujućim uslovima. Dobijeni proizvod je bispecifično antitelo koje ima dva „Fab-kraka“ koji mogu da obuhvataju različite sekvence.
[0177] Poželјan postupak za pripremu bispecifičnih antitela, kao što je bispecifično antitelo CD3xPD-L1, ovog predmetnog pronalaska obuhvata postupak opisan u WO2011131746 i WO2013060867 (Genmab) koji se sastoji od sledećih koraka:
a) obezbeđivanje prvog antitela koje sadrži Fc region, gde navedeni Fc region sadrži prvi CH3 region;
b) obezbeđivanje drugog antitela koje sadrži drugi Fc region, gde navedeni Fc region sadrži drugi CH3 region,
pri čemu je prvo antitelo PD-L1 antitelo prema pronalasku, a drugo antitelo je antitelo koje je sposobno da se veže za drugačiji PD-L1 epitop ili drugi antigen, kao što je humani CD3, ili obrnuto; i
gde su sekvence pomenutog prvog i drugog CH3 regiona različite i takve su da je heterodimerna interakcija između pomenutih prvog i drugog CH3 regiona jača od svake od homodimernih interakcija pomenutih prvog i drugog CH3 regiona;
c) inkubiranje navedenog prvog antitela zajedno sa navedenim drugim antitelom u redukujućim uslovima; i
d) dobijanje pomenutog bispecifičnog antitela, npr. bispecifičnog antitela PD-L1xCD3.
[0178] Slično, obezbeđen je postupak za proizvodnju antitela prema predmetnom pronalasku, koji obuhvata sledeće korake:
a) gajenje ćelije domaćina koja proizvodi prvo antitelo koje sadrži region za vezivanje antigena i koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 kako je ovde definisan i prečišćavanje pomenutog prvog antitela iz kulture;
b) gajenje ćelije domaćina koja proizvodi drugo antitelo koje sadrži region za vezivanje antigena i koji je sposoban da se veže za drugačiji PD-L1 epitop ili drugi antigen, npr. humani CD3ε region za vezivanje kao što je ovde definisano, prečišćavanje pomenutog drugog antitela iz kulture;
c) inkubiranje navedenog prvog antitela zajedno sa navedenim drugim antitelom u redukujućim uslovima dovolјnim da omoguće da cisteini u regionu zgloba prođu izomerizaciju disulfidne veze, i
d) dobijanje pomenutog bispecifičnog antitela.
[0179] U jednom izvođenju, pomenuto prvo antitelo zajedno sa navedenim drugim antitelom se inkubiraju pod redukujućim uslovima dovolјnim da omoguće da cisteini u regionu zgloba prođu izomerizaciju disulfidne veze, pri čemu je heterodimerna interakcija između pomenutog prvog i drugog antitela u rezultujućem heterodimernom antitelu takva da ne dolazi do razmene „Fab-fragmenata“ na 0,5 mM GSH posle 24 sata na 37°C.
[0180] Bez ograničenja na teoriju, u koraku c), disulfidne veze teškog lanca u regionima zgloba roditelјskih antitela su redukovane i rezultujući cisteini su tada u stanju da formiraju disulfidnu vezu između teškog lanca sa cisteinskim ostacima drugog roditelјskog molekula antitela. (prvobitno sa drugačijom specifičnošću). U jednoj realizaciji ovog postupka, uslovi redukcije u koraku c) obuhvataju dodavanje redukujućog agensa, npr. redukujućog sredstva izabranog iz grupe koju čine: 2-merkaptoetilamin (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutation, tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP), L-cistein i beta-merkapto- etanol, poželјno redukujućo sredstvo izabrano iz grupe koju čine: 2-merkaptoetilamin, ditiotreitol i tris(2-karboksietil)fosfin. U sledećoj realizaciji, korak c) obuhvata uspostavlјanje uslova da postanu neredukujući ili manje redukujući uslovi, na primer uklanjanjem redukujućog agensa, npr. odsolјavanjem.
[0181] Za ovaj postupak, bilo koje od antitela koja sadrže prvi i/ili drugi Fc region, npr. iznad opisana antitela CD3 i PD-L1 mogu se koristiti uklјučujući prvo i drugo antitelo CD3 i PD-L1, tim redom. Primeri takvih prvih i drugih Fc regiona, uklјučujući kombinaciju takvih prvih i drugih Fc fragmenta, mogu uklјučivati bilo koji od onih koji su iznad opisani. U posebnom izvođenju, prvo i drugo antitelo, npr. antitela CD3 i PD-L1, tim redom, mogu se izabrati tako da se dobije bispecifično antitelo kao što je ovde opisano.
[0182] U jednom izvođenju ovog postupka, navedena prva i/ili druga antitela su antitela pune dužine.
[0183] Fc regioni prvog i drugog antitela mogu biti bilo kog izotipa, uklјučujući, ali bez ograničenja, IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. U jednoj realizaciji ovog postupka, Fc regioni oba pomenuta antitela, i prvog i drugog, su izotipa IgG1. U drugoj realizaciji, jedan od Fc regiona navedenih antitela je izotip IgG1, a drugi je izotip IgG4. U poslednjoj realizaciji, rezultujuće bispecifično antitelo sadrži Fc sekvencu IgG1 i Fc sekvencu IgG4 i stoga može imati interesantna posredna svojstva u pogledu aktivacije efektorskih funkcija.
[0184] U sledećoj realizaciji, jedan od početnih proteina antitela je konstruisan tako da ne vezuje protein A, čime je omogućeno da se heterodimerni protein odvoji od navedenog homodimernog početnog proteina propuštanjem proizvoda preko kolone proteina A.
[0185] Kao što je gore opisano, sekvence prvog i drugog CH3 regiona homodimernih početnih antitela su različite i takve da je heterodimerna interakcija između pomenutog prvog i drugog CH3 regiona jača od svake od homodimernih interakcija pomenutog prvog i drugog CH3 regiona. Više detalјa o ovim interakcijama i načinu na koji se one mogu postići je dato u WO2011131746 i WO2013060867 (Genmab).
[0186] Posebno, stabilno bispecifično antitelo, npr. bispecifično CD3xPD-L1 antitelo, može se dobiti sa visokim prinosom upotrebom gore navedenog postupka pronalaska a na osnovu dva homodimerna početna antitela koja vezuju PD-L1 i drugačiji antigen ili različit epitop PD-L1, npr. CD3, odnosno, i sadrže samo nekoliko, konzervativnih, asimetričnih mutacija u CH3 regionima. Asimetrične mutacije znače da sekvence pomenutog prvog i drugog CH3 regiona sadrže aminokiselinske supstitucije na različitim pozicijama.
[0187] Bispecifična antitela predmetnog pronalaska se takođe mogu dobiti koekspresijom konstrukta koji kodiraju prvi i drugi polipeptid u jednoj ćeliji. Prema tome, u dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela, pri čemu navedeni postupak obuhvata sledeće korake:
a) obezbeđuje konstrukt prve nukleinske kiseline koja kodira prvi polipeptid koji sadrži prvu Fc sekvencu i prvi region prvog teškog lanca antitela koji se vezuje za antigen, pri čemu navedena prva Fc sekvenca obuhvata prvi CH3 region,
b) obezbeđuje drugi konstrukt nukleinske kiseline koji kodira drugi polipeptid koji sadrži drugu Fc sekvencu i drugi region drugog teškog lanca antitela koji se vezuje za antigen, pri čemu navedena druga Fc sekvenca obuhvata drugi CH3 region, pri čemu su sekvence pomenutih, prvog i drugog, CH3 regiona različite i takve su da je heterodimerna interakcija između pomenutih, prvog i drugog, CH3 regiona jača od svake od homodimernih interakcija pomenutih, prvog i drugog, CH3 regiona, i pri čemu navedeni prvi homodimerni protein ima aminokiselinu koja nije Lys, Leu ili Met na poziciji 409 i pomenuti drugi homodimerni protein ima aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj iz grupe koju čine: 366, 368, 370, 399, 405 i 407, opciono pri čemu navedeni prvi i drugi konstrukti nukleinske kiseline kodiraju sekvence lakog lanca navedenog prvog i drugog antitela,
c) koekspresiju pomenutih prvih i drugih konstrukata nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu, i
d) dobijanje pomenutog heterodimernog proteina iz ćelijske kulture.
Materijali i postupci za produkciju antitela pronalaska
[0188] U dalјim aspektima, pronalazak se odnosi na materijale i postupke za rekombinantnu proizvodnju antitela prema pronalasku. Dobro poznati u tehnici pogodni vektori ekspresije, uklјučujući promotore, pojačivače, itd., i pogodne ćelije domaćina za produkciju antitela.
[0189] Dakle, u jednom aspektu, obezbeđen je konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži:
(i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu teškog lanca antitela koji sadrži region koji se vezuje za antigen i koji ima sposobnost da se veže za humani PD-L1 kako je ovde definisano, i/ili
(ii) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu lakog lanca antitela koja sadrži region koji se vezuje za antigen i koji ima sposobnost da se veže za humani PD-L1 kao što je ovde definisano.
[0190] U jednom izvođenju, konstrukt nukleinske kiseline dalјe sadrži:
(i) ekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu teškog lanca antitela koja sadrži region koji se vezuje za antigen i koji ima sposobnost da se veže za različit epitop PD-L1 ili drugi antigen, npr. humani CD3ε kako je ovde definisano, i
(ii) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu lakog lanca antitela koja sadrži region koji se vezuje za antigen i koji ima sposobnost da se veže za različit epitop PD-L1 ili drugi antigen, npr. humani CD3ε kako je ovde definisano.
[0191] U još dalјem izvođenju, pronalazak se odnosi na vektor ekspresije koji sadrži konstrukte nukleinske kiseline kao što je iznad definisano.
[0192] Ekspresioni vektor u kontekstu ovog pronalaska može biti bilo koji pogodan vektor, uklјučujući hromozomske, nehromozomske i sintetičke vektore nukleinskih kiselina (sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži odgovarajući skup elemenata za kontrolu ekspresije). Primeri takvih vektora uklјučuju derivate SV40, bakterijske plazmide, DNK faga, bakulovirus, plazmide kvasca, vektore izvedene iz kombinacija plazmida i DNK faga, i vektore nukleinskih kiselina virusa (RNA ili DNK). U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr. PD-L1 ili nukleinska kiselina koja kodira CD3 antitelo, sadržana je u „golom“ DNK ili RNK vektoru, uklјučujući, na primer, element linearne ekspresije (kao što je opisano u npr. Sykes and Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), kompaktni vektor nukleinske kiseline (kao što je opisano u npr. US 6,077, 835 i/ili WO 00/70087), plazmidni vektor kao što je pBR322, pUC 19/18 ili pUC 118/119, „mušica“ vektor nukleinske kiseline minimalne veličine (kao što je opisano u npr. Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001.)), ili konstrukt vektora precipitirane nukleinske kiseline, kao što je precipitiran konstrukt Ca3(P04)2 (kao što je opisano u npr.
WO200046147, Benvenisti and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986.), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), and Coraro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Takvi vektori nukleinske kiseline i njihova upotreba su dobro poznati u tehnici (videti npr US 5,589,466 i US 5,973,972).
[0193] U jednoj realizaciji, vektor je pogodan za ekspresiju antitela, npr. PD-L1 antitela i/ili CD3 antitela u bakterijskoj ćeliji. Primeri takvih vektora uklјučuju ekspresione vektore kao što su BlueScript (Stratagene), pIN vektori (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989.), pET vektori (Novagen, Madison VI) i slične).
[0194] Ekspresioni vektor može takođe ili alternativno biti vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca. Može se koristiti bilo koji vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca. Pogodni vektori uklјučuju, na primer, vektore koji sadrže konstitutivne ili inducibilne promotore kao što su alfa faktor, alkohol oksidaza i PGH (pregledno prikazano u: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), i u Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).
[0195] Ekspresioni vektor može takođe ili alternativno biti vektor pogodan za ekspresiju u ćelijama sisara, npr. vektor koji sadrži glutamin sintetazu kao selektabilni marker, kao što su vektori opisani u Bebbington (1992) Biotechnology (NY) 10:169-175.
[0196] Nukleinska kiselina i/ili vektor mogu takođe sadržati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu sekrecije/lokalizacije, koja može da usmerava polipeptid, kao što je nascentni polipeptidni lanac, ka periplazmatskom prostoru ili u medijum ćelijske kulture. Takve sekvence su poznate u tehnici i uklјučuju lidere sekrecije ili signalne peptide.
[0197] Ekspresioni vektor može obuhvatiti ili da bude povezan sa bilo kojim pogodnim promotorom, pojačivačem i drugim elementima koji olakšavaju ekspresiju. Primeri takvih elemenata uklјučuju snažne promotore ekspresije (npr. humani CMV IE promotor/pojačivač, kao i RSV, SV40, SL3-3, MMTV i HIV LTR promotore), efikasne poli(A) terminacione sekvence, početak replikacije za plazmid produkt u E. coli, gen otpornosti na antibiotike kao selektivni marker, i/ili pogodna mesto za kloniranje (npr. polilinker). Nukleinske kiseline takođe mogu sadržati inducibilni promotor za razliku od konstitutivnog promotora kao što je CMV IE.
[0198] U jednoj realizaciji, vektor ekspresije koji kodira antitelo, npr. ekspresioni vektor koji kodira PD-L1 i/ili CD3 antitelo može biti pozicioniran i/ili isporučen u ćeliju domaćina ili životinju domaćina preko virusnog vektora.
[0199] U još dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži jedan ili više konstrukata nukleinske kiseline ili ekspresioni vektor koji je naveden ovde iznad.
[0200] Dakle, predmetni pronalazak se takođe odnosi na rekombinantnu eukariotsku ili prokariotsku ćeliju domaćina koja produkuje antitelo predmetnog pronalaska, kao što je transfektom.
[0201] Primeri ćelija domaćina uklјučuju ćelije kvasca, bakterija, bilјaka i sisara, kao što su CHO, CHO-S, HEK, HEK293, HEK-293F, Expi293F, PER.C6 ili NS0 ćelije ili limfocitne ćelije. Poželјna ćelija domaćin je CHO-K1 ćelija.
[0202] Na primer, u jednoj realizaciji, ćelija domaćin može sadržati i prvi i drugi konstrukt nukleinske kiseline stabilno integrisan u ćelijski genom. U drugoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju koja sadrži neintegrisanu nukleinsku kiselinu, kao što je plazmid, kosmid, fagemid ili element linearne ekspresije, koji sadrže prvi i drugi konstrukt nukleinske kiseline kao što je gore navedeno.
[0203] U dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na hibridom koji proizvodi PD-L1 antitelo kao što je ovde definisano.
Fc regioni
[0204] U nekim realizacijama, antitelo prema ovom pronalasku sadrži, pored regiona koji se vezuju za antigen, Fc region koji se sastoji od Fc sekvenci dva teška lanca.
[0205] Svaka prva i druga Fc sekvenca mogu biti bilo kog izotipa, uklјučujući, ali bez ograničenja, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, i mogu sadržati jednu ili više mutacija ili modifikacija. U jednom izvođenju, svaka od Fc sekvence, i prve i druge, je izotipa IgG4 ili je izvedena iz njega, opciono sa jednom ili više mutacija ili modifikacija. U drugom izvođenju, svaka od Fc sekvence, i prve i druge je, izotipa IgG1 ili je izvedena iz njega, opciono sa jednom ili više mutacija ili modifikacija. U drugom izvođenju, jedna od Fc sekvenci je izotipa IgG1, a druga je izotipa IgG4, ili je izvedena iz takvih odgovarajućih izotipova, opciono sa jednom ili više mutacija ili modifikacija.
[0206] U jednoj realizaciji, jedna ili obe Fc sekvence su sa nedostatkom u funkciji efektora. Na primer, Fc sekvenca(e) može biti izotipa IgG4, ili ne-IgG4 tipa, npr. IgG1, IgG2 ili IgG3, koji je sa mutacijom tako da je njegova sposobnost posredovanja u efektorskoj funkcija, kao što je ADCC, smanjena ili čak eliminisana. Takve mutacije imaju npr. odnosno su opisane u Dall'Acqua WF et al., J Immunol.177(2): 1129-1138 (2006) i Hezareh M, J Virol.; 75(24): 12161-12168 (2001). U drugoj realizaciji, jedna ili obe Fc sekvence sadrže sekvencu divlјeg tipa IgG1.
[0207] Antitela prema ovom predmetnom pronalasku mogu da sadrže modifikacije u Fc regionu. Kada antitelo sadrži takve modifikacije, ono može postati inertno ili neaktivirajuće antitelo. Termin „inertnost“, „inertan“ ili „neaktivirajući“ kako se ovde koristi, odnosi se na Fc region koji barem nije u stanju da veže bilo koji Fcγ receptor, da indukuje Fc-posredovano umrežavanje FcR-a ili indukuje FcR-posredovano unakrsno povezivanje cilјnih antigena preko dva Fc regiona pojedinačnih antitela, ili nije u stanju da veže C1q. Inertnost Fc regiona antitela, npr. humanizovanog ili himernog CD3 antitela, je poželјno testirano korišćenjem antitela u monospecifičnom formatu.
[0208] Da bi se Fc region antitela učinio neaktivnim za interakcije sa Fcγ (gama) receptorima i sa C1q za terapijski razvoj antitela može se konstruisati nekoliko varijanti. Ovde su opisani primeri takvih varijanti.
[0209] Prema tome, u jednoj realizaciji antitela pronalaska, pomenuto antitelo sadrži prvi i drugi teški lanac, pri čemu su jedan ili oba teška lanca modifikovana tako da antitelo indukuje u manjoj meri efektorsku funkciju posredovanu Fc-om u odnosu na antitelo koje je identično, osim što sadrži nemodifikovane prve i druge teške lance. Navedena efektorska funkcija posredovana Fc-om može se meriti određivanjem ekspresije CD69 posredovane Fc-om, vezivanjem za Fcγ receptore, vezivanjem za C1q, ili indukcijom umrežavanja FcRs posredovanog Fc.
[0210] U jednom takvom izvođenju, konstantne sekvence teškog lanca su modifikovane tako da navedeno antitelo smanjuje ekspresiju CD69 posredovanu Fc-om za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100% u poređenju sa divlјim tipom antitela (nemodifikovanim antitelom), pri čemu je pomenuta ekspresija CD69 posredovana sa Fc-om određena u funkcionalnom testu zasnovanom na PBMC, npr. kao što je opisano u Primeru 3 u WO2015001085.
[0211] U drugom takvom izvođenju, konstantne sekvence teškog i lakog lanca su modifikovane tako da je smanjeno vezivanje C1q za pomenuto antitelo u poređenju sa nemodifikovanim antitelom za najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95% , najmanje 97% ili 100%, pri čemu se C1q vezivanje određuje pomoću ELISA.
[0212] U drugom izvođenju, antitelo sadrži Fc region koji je modifikovan tako da navedeno antitelo posreduje u smanjenju proliferacije T-ćelija posredovanu sa Fc u poređenju sa nemodifikovanim antitelom za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100%, pri čemu se navedena proliferacija T-ćelija meri u funkcionalnom testu zasnovanom na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC).
[0213] Dakle, aminokiseline u Fc regionu koje igraju dominantnu ulogu u interakcijama sa C1q i Fcγ receptorima mogu biti modifikovane.
[0214] Primeri pozicija aminokiselina koji se mogu modifikovati, npr. u antitelu izotipa IgG1, uklјučuju pozicije L234, L235 i P331. Nјihove kombinacije, kao što je L234F/L235E/P331S, mogu izazvati duboko smanjenje vezivanja za humani CD64, CD32, CD16 i C1q.
[0215] Dakle, u jednom izvođenju, aminokiselina na najmanje jednoj poziciji koja odgovara L234, L235 i P331, može biti A, A i S, tim redom (Xu et al., 2000, Cell Immunol.200(1): 16-26; Oganesyan et al., 2008, Acta Crist. (D64): 700-4). Takođe, supstitucije aminokiselina L234F i L235E mogu dovesti do ukidanja interakcija Fc regiona sa Fcγ receptorima i C1q (Canfield et al., 1991, J. Exp. Med. (173): 1483-91; Duncan et al., 1988, Nature (332): 738-40). Stoga, u jednom izvođenju, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235, mogu biti F i E, tim redom. Zamena aminokiselina D265A može smanjiti vezivanje za sve Fcγ receptore i sprečiti ADCC (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276): 6591-604). Prema tome, u jednom izvođenju, aminokiselina na poziciji koja odgovara D265 može biti A. Vezivanje za C1q može biti poništeno mutiranjem pozija D270, K322, P329 i P331. Mutiranje ovih pozicija na na bilo kojoj D270A ili K322A ili P329A ili P331A može dovesti do nedostatka u CDC aktivnosti antitela Idusogie EE, et al., 2000, J Immunol. 164: 4178-84). Stoga, u jednom izvođenju, aminokiseline na najmanje jednoj poziciji koja odgovara D270, K322, P329 i P331, mogu biti A, A, A i A, tim redom.
[0216] Alternativni pristup za smanjenje interakcije Fc regiona sa Fcγ receptorima i C1q je uklanjanjem mesta glikozilacije antitela. Mutiranje pozicije N297 u npr. Q, A ili E uklanja mesto glikozilacije koje je kritično za interakcije IgG-Fc gama receptora. Stoga, u jednoj realizaciji, aminokiselina na poziciji koja odgovara N297, može biti G, Q, A ili E Leabman et al., 2013, MAbs; 5(6): 896-903). Drugi alternativni pristup za minimizovanje interakcije Fc regiona sa Fcγ receptorima može se postići sledećim mutacijama; P238A, A327Q, P329A ili E233P/L234V/L235A/G236del (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276): 6591-604).
[0217] Alternativno, humane podklase IgG2 i IgG4 se smatraju prirodno kompromitovanim u interakcijama sa C1q i Fc gama receptorima iako su prijavlјene interakcije sa Fcγ receptorima (Parren et al., 1992, J. Clin Invest. 90: 1537-1546; Bruhns et al., 2009, Blood 113: 3716-3725). Mutacije koje poništavaju ove rezidualne interakcije mogu se indukovati u oba izotipa, što rezultira smanjenjem neželјenih nuspojava povezanih sa vezivanjem FcR. Za IgG2, ovo uklјučuje L234A i G237A, a za IgG4, L235E. Stoga, u jednom izvođenju, aminokiselina na poziciji koja odgovara L234 i G237 u teškom lancu humanog IgG2, može biti A i A, tim redom. U jednom izvođenju, aminokiselina na poziciji koja odgovara L235 u teškom lancu humanog IgG4, može biti E.
[0218] Drugi pristupi za dalјe smanjenje interakcije sa Fcγ receptorima i C1q u IgG2 antitelima uklјučuju one opisane u WO2011066501 i Lightle, S., et al., 2010, Protein Science (19): 753-62.
[0219] Region zgloba antitela takođe može biti važan u pogledu interakcija sa Fcγ receptora i komplementom (Brekke et al., 2006, J Immunol 177: 1129-1138; Dall'Acqua WF, et al., 2006, J Immunol 177: 1129-1138). Shodno tome, mutacije ili delecije u regionu zgloba mogu uticati na efektorske funkcije antitela.
[0220] Prema tome, u jednoj realizaciji, antitelo sadrži prvi i drugi teški lanac imunoglobulina, pri čemu u najmanje jednom od navedenih teških lanaca, prvog i drugog, imunoglobulina jedna ili više aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235, D265, N297, i P331 u teškom lancu humanog IgG1, nisu L, L, D, N i P, tim redom.
[0221] U jednoj realizaciji, u oba i u prvom i u drugom teškom lancu jedna ili više aminokiselina na poziciji koja odgovara pozicijama L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1, nisu L, L, D, N, i P, tim redom.
[0222] U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara položaju D265 u teškom lancu humanog IgG1 nije D.
[0223] Prema tome, u jednom izvođenju, i u pomenutom prvom i drugom teškom lancu, aminokiselina na poziciji koja odgovara položaju D265 u teškom lancu humanog IgG1 se bira iz grupe koju čine: A i E.
[0224] U dalјem izvođenju, u najmanje jednom od pomenutih prvog i drugog teškog lanca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1, nisu L i L, tim redom.
[0225] U posebnom izvođenju, u najmanje jednom od pomenutih prvog i drugog teškog lanca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su F i E, tim redom.
[0226] U jednom izvođenju, i u prvom i u drugom teškom lancu, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su F i E, tim redom.
[0227] U posebnom izvođenju, u najmanje jednom od pomenutih teških lanaca prvog i drugog, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom.
[0228] U posebno poželјnom izvođenju, i u pomenutom prvom i drugom teškom lancu, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, tim redom.
[0229] U dalјem posebno poželјnom izvođenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži oba, i prvi i drugi teški lanac, pri čemu pozicije koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju i prvog teškog lanca i drugog teškog lanca su F i E, tim redom, i pri čemu (i) pozicija koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju prvog teškog lanca je L, a pozicija koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju drugog teškog lanca je R, ili (ii) pozicija koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju prvog teškog lanca je R, a pozicija koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju drugog teškog lanca je L.
[0230] U daljem posebno poželјnom izvođenju, antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži oba, i prvi i drugi teški lanac, pri čemu su pozicije koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju i prvog teškog lanca i drugog teškog lanac su F, E i A, tim redom, i pri čemu (i) pozicija koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju prvog teškog lanca je L, a pozicija koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju drugog teškog lanca je R, ili (ii) pozicija koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju prvog teškog lanca je R, a pozicija koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju drugog teškog lanca je L.
[0231] Varijante antitela koje imaju kombinaciju supstitucija tri aminokiselinske L234F, L235E i D265A i pored toga mutacije K409R ili F405L, se ovde nazivaju sufiksom "FEAR" ili "FEAL", tim redom.
[0232] Ovde, huCD3-H1L1 se odnosi na humanizovano SP34 anti-CD3 antitelo koje ima VH i VL sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 25 i 29.
[0233] U poželјnoj realizaciji, bispecifično antitelo pronalaska sadrži:
(i) antitelo sa pola molekula izvedeno iz IgG1-huCD3-H1L1-FEAL, i antitelo sa pola molekula izvedeno iz IgG1-PDL1-338-FEAR, IgG1-PDL1-511-FEAR ili IgG1-PDL1-547-FEAR, ili
(ii) antitelo sa pola molekula izvedeno iz IgG1-huCD3-H1L1-FEAR, i antitelo sa pola molekula izvedeno iz i antitelo sa pola molekula antitelo izvedeno iz IgG1-PDL1-338-FEAL, IgG1-PDL1-511-FEAL ili IgG1-PDL1-547-FEAL.
[0234] U dalјem izvođenju, prvi teški lanac ili polumolekul sadrži sekvencu datu u SEQ ID NO: 90, a drugi teški lanac sadrži sekvencu datu u SEQ ID NO: 89.
[0235] U sledećoj realizaciji pronalaska, jedno ili oba antitela koja čine deo bispecifičnog antitela su projektovana tako da smanje ili povećaju vezivanje za neonatalni Fc receptor (FcRn) kako bi se manipulisalo poluživotom bispecifičnog antitela u serumu. Tehnike za povećanje ili smanjenje poluživota u serumu su dobro poznate u struci. Videti na primer u Dall'Acqua et al.2006, J. Biol. Chem., 281: 23514-24; Hinton et al.2006, J. Immunol., 176: 346-56; i Zalevsky et al.2010 Nat. Biotechnol., 28: 157-9.
Konjugati
[0236] U dalјem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja su povezana ili konjugovana sa jednim ili više terapeutskih delova, kao što su citokin, imunosupresiv, imunostimulacioni molekul i/ili radioizotop. Takvi konjugati se ovde nazivaju "imunokonjugati" ili "konjugati leka". Imunokonjugati koji uklјučuju jedan ili više citotoksina se nazivaju "imunotoksini".
[0237] U jednom izvođenju, prva i/ili druga Fc sekvenca je konjugovana sa lekom ili pro-lekom ili sadrži akceptorsku grupu za isti. Takva akceptorska grupa može biti npr. neprirodna aminokiselina.
Kompozicije
[0238] U dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo prema bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane i farmaceutski prihvatlјiv nosač.
[0239] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može da sadrži jedno antitelo ovog predmetnog pronalaska ili kombinaciju različitih antitela iz ovog predmetnog pronalaska.
[0240] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane u skladu sa konvencionalnim tehnikama kao što su one opisane u Remington „The Science and Practice of Pharmacy“, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Farmaceutska kompozicija ovog predmetnog pronalaska može npr. da sadrži razređivače, punioce, soli, pufere, deterdžente (npr. nejonski deterdžent, kao što je Tween-20 ili Tween-80), stabilizatore (npr. šećere ili aminokiseline bez proteina), konzervanse, sredstva za fiksiranje tkiva, solubilizatore i/ ili druge materijale pogodne za uklјučivanje u farmaceutsku kompoziciju.
[0241] Farmaceutski prihvatlјivi nosači uklјučuju bilo koji ili sve pogodne rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense, antioksidanse i sredstva za odlaganje apsorpcije i slično, koji su fiziološki kompatibilni sa antitelom iz predmetnog pronalaska. Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama ovog predmetnog pronalaska uklјučuju vodu, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor puferovan fosfatom, etanol, dekstrozu, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slični), i njihove pogodne smeše, bilјna ulјa, koloidni rastvori karboksimetil celuloze, tragakant gumu i injekcijske organske estre, kao što je etil oleat, i/ili različitie pufere. Farmaceutski prihvatlјivi nosači uklјučuju sterilne vodene rastvore ili disperzije, i sterilne prahove za ekstemporanu pripremu sterilnih rastvora ili disperzija za injekcije. Odgovarajuća tečnost se može održavati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i korišćenjem surfaktanata.
[0242] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe da sadrže farmaceutski prihvatlјive antioksidanse, na primer (1) antioksidante rastvorlјive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slične; (2) antioksidanse rastvorlјive u ulјu, kao što su askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen, lecitin, propil galat, alfa-tokoferol i slične; i (3) agense za helatiranje metala, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetraacetatna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slične.
[0243] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe da sadrže agense za izotoničnost, kao što su šećeri, polialkoholi, kao što su manitol, sorbitol, glicerol ili natrijum hlorid u kompozicijama.
[0244] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe sadržati jedan ili više adjuvanasa koji su odgovarajući za izabrani put primene, poput konzervanasa, sredstava za vlaženje, emulgatora, sredstava za dispergovanje, konzervanasa ili pufera, koji mogu da produže rok trajanja ili efikasnost farmaceutske kompozicije. Antitela predmetnog pronalaska mogu biti pripremlјena sa nosačima koji će štititi antitelo od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, koja uključuje implantate, transdermalne flastere i mikroinkapsulirane sisteme za dostavu. Takvi nosači mogu uklјučivati želatin, gliceril monostearat, gliceril distearat, biorazgradive i biokompatibilne polimere kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina, same ili sa voskom ili drugim materijalima koji su dobro poznati u struci. Postupci za pripremu takvih formulacija su generalno dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
[0245] Sterilni rastvori za injekcije se mogu pripremiti uključivanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili sa kombinacijom sastojaka, npr. kao što je nabrojano iznad, prema potrebi, praćeno sterilizacijom mikrofiltriranjem. Generalno, disperzije se pripremaju uključivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke, npr. od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, primeri postupaka pripreme su sušenje na vakuumu i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koje daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni želјeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora istog.
[0246] Stvarni nivoi doza aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama mogu da variraju tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje želјenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način primene, a da nije toksična za pacijenta. Odabrani nivo doze zavisiće od različitih farmakokinetičkih faktora, uklјučujući aktivnost određenih kompozicija koje se koriste iz ovog pronalaska, ili njihovog amida, način davanja, vremena davanja, brzine izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanja tretmana, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa određenim kompozicijama koje se koriste, starosti, pola, telesne mase, opšteg stanja organizma, opšteg zdravlјa, kao i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora koji su dobro poznati u medicinskoj praksi.
[0247] Farmaceutska kompozicija se može primeniti na bilo koji pogodan način i postupak. U jednom izvođenju, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska se primenjuje parenteralno. „Primenjen parenteralno“ kako se ovde koristi označava načine primene osim enteralne i topikalne primene, obično injekcijom, i obuhvata epidermalnu, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalanu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, intratevezivnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, intrakranijalnu, intratorakalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.
[0248] U jednoj realizaciji, ta farmaceutska kompozicija se primenjuje intravenskom ili subkutanom injekcijom ili infuzijom.
Upotrebe
[0249] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na antitelo u skladu sa bilo kojom od realizacija koje su ovde opisane, ili na farmaceutsku kompoziciju kako je ovde opisana, za upotrebu kao lek.
[0250] U dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na antitelo u skladu sa bilo kojom od realizacija koje su ovde opisane, ili na farmaceutsku kompoziciju kako je ovde opisana za upotrebu u lečenju bolesti, kao što je kancer.
[0251] U dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak lečenja bolesti koji se sastoji od davanja efikasne količine antitela prema bilo kojoj od ovde opisanih realizacija, ili farmaceutske kompozicije, koja je ovde opisana, subjektu kome je to potrebno.
[0252] Konkretno, bispecifična antitela prema pronalasku mogu biti korisna u terapijskim postavkama u kojima je poželјno specifično cilјanje i ubijanje posredovano T ćelijama ćelija koje eksprimiraju PD-L1, i ova bispecifična antitela mogu biti efikasnija u poređenju sa redovnim anti-PD-L1 antitelom u određenim takvim indikacijama i postavkama.
[0253] Antitela prema pronalasku takođe imaju dodatnu upotrebu u terapiji i dijagnostici raznih bolesti povezanih sa PD-L1. Na primer, antitela se mogu koristiti za izazivanje in vivo ili in vitro jedne ili više sledećih bioloških aktivnosti: da inhibiraju rast i/ili diferencijaciju ćelije koja eksprimira PD-L1; da ubiju ćeliju koja eksprimira PD-L1; da posreduju u fagocitozi ili ADCC ćelije koje eksprimira PD-L1 u prisustvu humanih efektorskih ćelija; da posreduju u CDC ćelije koja eksprimira PD-L1 u prisustvu komplementa; da posreduju u apoptozi ćelije koja eksprimira PD-L1; i/ili da izazovu translokaciju u lipidne raftove nakon vezivanja PD-L1.
[0254] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na antitelo u skladu sa bilo kojom od realizacija koje su ovde opisane, ili na farmaceutsku kompoziciju koja je ovde opisana za upotrebu u lečenju kancera.
[0255] U dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na antitelo u skladu sa bilo kojom od realizacija koje su ovde opisane, ili farmaceutsku kompoziciju koja je ovde opisana za upotrebu u lečenju bolesti kancera koju karakteriše prisustvo solidnih tumora.
[0256] U dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na antitelo prema bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane, ili na farmaceutsku kompoziciju koja je ovde opisana za upotrebu u lečenju bolesti kancera izabranih iz grupe koju čine: melanom, kancer jajnika, kancer pluća , kolorektalni karcinom, kancer glave i vrata, rak želuca, rak dojke, rak bubrega, rak mokraćne bešike, rak jednjaka, rak pankreasa, rak jetre, timom i karcinom timusa, rak mozga, gliom, adrenokortikalni karcinom, rak štitne žlezde, drugi karcinomi kože, sarkom, multipli mijelom, leukemija, limfom, mijelodisplastični sindromi, rak jajnika, kancer endometrioze, rak prostate, kancer penisa, Hočkinov limfom, ne-Hočkinov limfom, karcinom Merkelovih ćelija i mezoteliom.
[0257] U dalјem aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu antitela prema bilo kojoj od realizacija koje su ovde opisane za proizvodnju leka, kao što je lek za lečenje kancera, npr. bolest kancera koju karakteriše prisustvo solidnih tumora ili bolest kancera izabranog iz grupe koju čine: melanom, rak jajnika, rak pluća, rak debelog creva i kancer glave i vrata.
[0258] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za inhibiciju rasta i/ili proliferacije jedne ili više tumorskih ćelija koje eksprimiraju PD-L1, postupak obuhvata davanje antitela predmetnog pronalaska osobi kojoj je to potrebno.
[0259] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za lečenje kancera, koji obuhvata
a) odabir subjekta koji boluje od raka koji sadrži tumorske ćelije koje eksprimiraju PD-L1, i
b) davanje subjektu antitela iz ovog pronalaska ili farmaceutske kompozicije ovog pronalaska.
[0260] Režimi doziranja u gornjim postupcima lečenja i upotrebe su prilagođeni da obezbede optimalan želјeni odgovor (npr. terapijski odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti nekoliko podelјenih doza tokom vremena ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno zahtevima terapijske situacije. Parenteralne kompozicije mogu biti formulisane u obliku jedinične doze radi lakše primene i uniformnosti doziranja.
[0261] Efikasne doze i režimi doziranja za antitela zavise od bolesti ili stanja koje treba lečiti i mogu ih odrediti stručnjaci iz ove oblasti. Primerni, neograničavajući opseg za terapijski efikasnu količinu jedinjenja predmetnog pronalaska je oko 0,001-10 mg/kg, kao što je oko 0,001-5 mg/kg, na primer oko 0,001-2 mg/kg, kao što je oko 0,001-1 mg/kg, na primer oko 0,001, oko 0,01, oko 0,1, oko 1 ili oko 10 mg/kg. Drugi primerni, neograničavajući opseg za terapijski efikasnu količinu antitela predmetnog pronalaska je oko 0,1-100 mg/kg, kao što je oko 0,1-50 mg/kg, na primer oko 0,1-20 mg/kg, kao npr. oko 0,1-10 mg/kg, na primer oko 0,5, oko 0,3, oko 1, oko 3, oko 5 ili oko 8 mg/kg.
[0262] Lekar ili veterinar koji ima uobičajene veštine u ovoj oblasti može lako da odredi i prepiše efikasnu količinu potrebne farmaceutske kompozicije. Na primer, lekar ili veterinar bi mogli da započnu sa dozama antitela u farmaceutskoj kompoziciji na nivoima nižim od onih potrebnih za postizanje želјenog terapijskog efekta i potom postepeno povećavati dozu dok se ne postigne želјeni efekat. Generalno, pogodna dnevna doza antitela predmetnog pronalaska biće ona količina jedinjenja koja je najniža doza efikasna da proizvede terapeutski efekat. Administracija može npr. biti parenteralna, kao što je intravenozna, intramuskularna ili subkutana. U jednoj realizaciji, antitela se mogu dati infuzijom u nedelјnoj dozi izračunatoj u mg/m<2>. Takve doze mogu se, na primer, zasnivati na dozama u mg/kg datim iznad prema sledećem: doza (mg/kg) × 70: 1.8. Takva primena se može ponoviti, na primer, 1 do 8 puta, kao što je 3 do 5 puta. Primena se može izvršiti kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 2 do 24 sata, kao što je od 2 do 12 sati. U jednom izvođenju, antitela se mogu davati sporom kontinuiranom infuzijom tokom dužeg perioda, kao što je više od 24 sata, kako bi se smanjili toksični sporedni efekti.
[0263] U jednoj realizaciji, antitela se mogu davati u nedelјnoj dozi izračunatoj kao fiksna doza do 8 puta, kao što je od 4 do 6 puta kada se daju jednom nedelјno. Takav režim se može ponoviti jednom ili više puta po potrebi, na primer, nakon 6 meseci ili 12 meseci. Takve fiksne doze mogu se, na primer, zasnivati na dozama mg/kg datim iznad, sa procenom telesne težine od 70 kg. Doziranje se može odrediti ili prilagoditi merenjem količine antitela predmetnog pronalaska u krvi nakon davanja, na primer, uzimanjem biološkog uzorka i upotrebom antiidiotipskih antitela koja cilјaju region vezivanja antigena PD-L1 antigena. predmetnog pronalaska.
[0264] U jednoj realizaciji, antitela se mogu davati kao terapija održavanja, kao što je, na primer, jednom nedelјno tokom perioda od 6 meseci ili više.
[0265] Antitelo se takođe može davati profilaktički da bi se smanjio rizik od razvoja kancera, odložio početak pojave događaja u progresiji kancera i/ili smanjio rizik od ponovnog pojavlјivanja kada je kancer u remisiji.
[0266] Antitela pronalaska se takođe mogu davati u kombinovanoj terapiji, tj., u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima relevantnim za bolest ili stanje koje se leči. Prema tome, u jednoj realizaciji, medikament koji sadrži antitelo je u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa, kao što su citotoksični, hemoterapeutski ili anti-angiogeni agensi.
[0267] Sve reference u opisu postupaka lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku terapijskog lečenja lјudskog (ili životinjskog) tela.
[0268] Predmetni pronalazak je dalјe ilustrovan sledećim primerima, koji ne bi trebalo da se tumače kao ograničavajući za obim pronalaska.
PRIMERI
Primer 1: Stvaranje PD-L1 antitela
Imunizacija OmniRat životinja i generisanje hibridoma
[0269] Imunizacija i generisanje hibridoma obavlјeni su u Aldevron GmbH (Freiburg, Nemačka). cDNK koja kodira aminokiseline 19-238 humanog PD-L1 je klonirana u Aldevron ekspresione plazmide. Grupe OmniRat životinja (transgeni pacovi koji eksprimiraju raznolik repertoar antitela sa potpuno humanim idiotipovima; Ligand Pharmaceuticals Inc., San Dijego, SAD) su imunizovane intradermalnom aplikacijom zlatnih čestica obloženih sa DNK, upotrebom ručnog uređaja za bombardovanje česticama („genski pištolј“). Ekspresija površine ćelije na tranzijentno transfektovanim HEK ćelijama je potvrđena anti-PD-L1 antitelom zasnovanim na MPDL3280A iz Genentech-a. Uzorci seruma su sakuplјeni nakon serija imunizacija i testirani protočnom citometrijom na HEK ćelije koje su tranzijentno transfektovane sa predhodno pomenutim ekspresionim plazmidima. Ćelije koje proizvode antitela su izolovane i spojene sa ćelijama mijeloma miša (Ag8) prema standardnim procedurama. Hibridomi koji proizvode antitela specifična za PD-L1 su identifikovani skriningom u istom testu kao što je iznad opisano. Ćelijski peleti pozitivnih ćelija hibridoma su pripremlјeni upotrebom agensa za zaštitu RNK (RNAlater, ThermoFisher Scientific, kat. br. AM7020) i dalјe obrađene za sekvenciranje varijabilnih domena antitela.
Analiza sekvence varijabilnih domena PD-L1 antitela i kloniranje u ekspresionim vektorima
[0270] Ukupna RNK je pripremlјena od 0,2 do 5×10<6>ćelija hibridoma, a 5'-RACE-komplementarna DNK (cDNK) je pripremlјena od ukupne RNK, upotrebom SMART RACE cDNA Amplification kit-a (Clontech), prema uputstvima proizvođača. VH i VL regioni kodiranja su amplifikovani PCR-om i klonirani direktno u okvir, u pOMTG1f-FEAR-LIC (humani IgG1) i pEFC33D-Kappa (humani Kapa) ili pOMTL-LIC (humani Lambda) ekspresione vektore, kloniranjem nezavisno od ligacije (Aslanidis, C. i P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990; 18(20): 6069-74). U ovim plazmidima, sekvence antitela se eksprimiraju upotrebom promotora CMV. Za svako antitelo, sekvencirano je 8 VL klonova i 8 VH klonova. CDR sekvence su definisane prema IMGT definicijama [Lefranc MP. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999; Brochet X. Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008)]. Klonovi sa ispravnim otvorenim okvirom čitanja (ORF) su odabrani za dalјe proučavanje i ekspresiju. LEE PCR proizvodi svih kombinacija teških i lakih lanaca koji su pronađeni po kulturi hibridoma bili su tranzijentno koeksprimirani u Expi293F ćelijama upotrebom ExpiFectamine. Po hibridomu, HC/LC par koji je pokazao najbolјe vezivanje u homogenom pregledu doza-odgovor izabran je kao vodeći kandidat.
[0271] Tri PD-L1 antitela, označena brojevima 338, 511 i 547, izabrana su za dalјe eksperimentisanje. Nјihove sekvence varijabilnog regiona su prikazane ovde u listi sekvenci.
[0272] Za antitelo IgG1-PDL1-511-FEAR generisana je varijanta sa tačkastom mutacijom u varijabilnom domenu kako bi se uklonio cisteinski ostatak koji bi potencijalno mogao da generiše neželјene disulfidne mostove: IgG1-PDL1-511-FEAR-LC33S. Ovaj mutant je generisan sintezom gena (Geneart).
LEE PCR
[0273] Elementi linearne ekspresije (LEE) su produkovani amplifikacijom fragmenta koji sadrži CMV promotor, HC ili LC kodirajuće regione i poli A signal koji sadrži elemente iz ekspresionih plazmida. Za ovo su regioni amplifikovani upotrebom Accuprime TakqDNK polimeraze (Life Technologies) i prajmera CMVPf(BsaI)2 i TkpA(BsaI)r, izvodeći 35 ciklusa od 45 sekundi na 94°C, 30 sekundi na 55°C i 2 ( LC) ili 3 (HC) minuta na 68°C, upotrebom 50x razblaženog plazmidog miniprep materijala, kao DNK templejta.
Prolazna ekspresija LEE fragmenata u Expi293F ćelijama
[0274] Za LEE ekspresiju antitela (Abs), 1,11 µl HC LEE PCR reakcione smeše i 1,11 µl LC PCR reakcione smeše je pomešano i transfektovano u Expi293F ćelije u ukupnoj zapremini od 125 µl upotrebom ExpiFectamin 293 kao reagensa za transfekciju, prema uputstvima proizvođača (Thermo Fisher Scientific, SAD), koristeći ploče sa 96 bunara kao posudu.
Ekspresija antitela
[0275] Antitela su eksprimirana kao IgG1, Kapa (za 338) ili IgG1, Lambda (za 511 i 547). Mešavine plazmidne DNK koje kodiraju i teške i lake lance antitela su tranzijentno eksprimirane upotrebom platforme za ekspresiju Expi293F (Thermo Fisher Scientific, SAD) u suštini kako je opisano od strane proizvođača.
Test homogenog vezivanja
[0276] Antitela su testirana na vezivanje u homogenom testu zavisnosti doze-odgovora upotrebom CHO ćelija transfektovanih sa PDL1, PDL1mm ili PDL1Mf (videti takođe Primer 2). Netransfektovane CHO ćelije su korišćene kao negativna kontrola.
[0277] Ćelije (2,5 × 10<5>ćelija/ml) su pomešane sa kozjim anti-humanim IgG Alexa 647, specifičnim za Fcγ fragment (0,2 µg/ml; Jackson ImmunoResearch Laboratories, 109-605-098). Pripremlјena su serijska razblaženja testnih i kontrolnih antitela (opseg 0,001 do 3 µg/mL u 2-strukim koracima razblaživanja), i 2 µl razblaženja antitela je dodato u 5 µl smeše ćelija/konjugata u pločama sa 1536 bunara (Greiner, 789866). Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 9 sati, a nakon toga je određen intenzitet fluorescencije pomoću ImageXpress Velos Laser Scanning Cytometer-a (Molecular Devices).
Prečišćavanje antitela
[0278] Supernatant kulture je filtriran kroz 0,2 µm „dead-end“ filter, napunjen na kolone MabSelect SuRe od 5 mL (GE Healthcare) i eluiran sa 0,1 M natrijum citrat-NaOH, pH 3. Eluat je odmah neutralizovan sa 2M Tris-HCl, pH 9 i dijalizovan preko noći do 8,7 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4140.3 mM, 140,3 mM NaCl, pH 7,4 (B.Braun ili GE Healthcare). Alternativno, nakon prečišćavanja, eluat je stavlјen na HiPrep Desalting kolonu i antitelo je zamenjeno sa 8,7 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4,140,3 mM NaCl, pH 7,4 (B.Braun ili GE Healthcare) puferom. Posle dijalize ili zamene pufera, uzorci su sterilno filtrirani kroz 0,2 µm „dead-end“ filter. Čistoća je određena pomoću CE-SDS pomoću LabChip GXII (Caliper Life Sciences, MA) i koncentracija IgG je izmerena korišćenjem Nanodrop ND-1000 spektrofotometra (Isogen Life Science, Maarssen, Holandija). Prečišćena antitela su čuvana na 4°C.
Primer 2: Generisanje preglednog materijala
Ekspresioni konstrukti za PD-L1
[0279] Generisani su sledeći konstrukti sa optimizovanim kodonom za ekspresiju PD-L1 pune dužine: humani (Homo sapiens) PD-L1 (Genbank pristupni broj NP_054862), cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis) PD-L1 (Genbank pristupni broj KSP_0365) , mišji (Mus musculus) PD-L1 (Genbank pristupni broj NP_068693).
[0280] Pored toga, generisan je sledeći konstrukt sa optimizovanim kodonom za ekspresiju za PD-L1 ECD: ekstracelularni domen (ECD) humanog PD-L1 (aa 1-238) sa His-obeleženim i C-obeleženim C-krajem (PDLoneECDHisCtag).
[0281] Konstrukti su sadržali pogodna restrikciona mesta za kloniranje i optimalnu Kozak (GCCGCCACC) sekvencu [Kozak et al. (1999) Gene 234: 187-208]. Konstrukti su klonirani u sisarskom vektoru ekspresije pMA (Geneart).
Ekspresioni konstrukt za PD-L2
[0282] Slično, generisan je sledeći konstrukt sa optimizovanim kodonom za ekspresiju humanog PD-L2 pune dužine: humani (Homo sapiens) PD-L2 (Genbank pristupni broj NP_079515)
Ekspresija u CHO-S ćelijama
[0283] CHO-S ćelije su tranzijentno transfektovane sa pMA vektorom koji sadrži kodirajuću sekvencu za ceo humani, ceo cinomolgus majmuna i ceo miša PD-L1, tim redom.
Prečišćavanje His-obeleženog PD-L1
[0284] PDLoneECDHisCtag je eksprimiran u ćelijama HEK-293F. His-obeležen omogućava prečišćavanje imobilizovanom metal-afinitetnom hromatografijom. U ovom procesu, helator fiksiran na hromatografskoj smoli se puni sa Co<2+>katjonima. Supernatanti koji sadrže His-obeležen protein su inkubirani sa smolom u šaržnom režimu (tj. rastvor). His-obeležen protein se snažno vezuje za kuglice smole, dok se drugi proteini prisutni u supernatantu kulture ne vezuju ili slabo vezuju u poređenju sa His-obeleženim proteinima. Nakon inkubacije, kuglice se izvlače iz supernatanta i pakuju u kolonu. Kolona je isprana da bi se uklonili slabo vezani proteini. Snažno vezani His-obeleženi proteini se zatim eluiraju puferom koji sadrži imidazol, koji se takmiči sa vezivanjem His-a za Co<2+>. Eluent se uklanja iz proteina razmenom pufera na koloni za odsolјavanje.
Primer 3: Humanizovano CD3 antitelo za stvaranje CD3xPDL1 bispecifičnih antitela
[0285] Generisanje humanizovanog antitela IgG1-huCD3-H1L1 je opisano u Primeru 1 WO2015001085. Antitelo huCD3-H1L1-FEAL je njegova varijanta koja ima sledeće supstitucije: L234F, L235E, D265A i F405L, kao što je iznad opisano.
Primer 4: Stvaranje bispecifičnih antitela razmenom Fab-„ruku“ izazvanom 2-MEA
[0286] Bispecifična IgG1 antitela su generisana razmenom Fab-fragmenata (Fab-„ruku“) pod kontrolisanim redukujućim uslovima. Osnova za ovaj postupak je upotreba komplementarnih CH3 domena, koji stimulišu formiranje heterodimera pod specifičnim uslovima eseja kao što je opisano u WO2011/131746. F405L i K409R (EU numerisanje) mutacije su uvedene u relevantna antitela da bi se stvorili parovi antitela sa komplementarnim CH3 domenima.
[0287] Da bi se generisala bispecifična antitela, dva roditelјska komplementarna antitela (svako antitelo u finalnoj koncentraciji od 0,5 mg/mL) su inkubirana sa 75 mM 2-merkaptoetilamin-HCl (2-MEA) u ukupnoj zapremini od 100 µL TE na 31°C tokom 5 sati. Reakcija redukcije je zaustavlјena uklanjanjem redukujućeg agensa 2-MEA upotrebom kolona za centrifugiranje (Microcon centrifugalni filteri, 30k, Millipore) prema uputstvu proizvođača.
[0288] U primerima su korišćena sledeća antitela:
CD3 antitela
IgG1-huCD3-H1L1-FEAL (koji imaju VH i VL sekvence navedene u SEQ ID NO:25 i SEQ ID NO:29, tim redom)
bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR je bispecifično antitelo koje koristi kao drugu „ruku“ antitelo b12 koje je gp120 specifično antitelo (Barbas, CF. J Mol Biol.1993 Apr 5; 230(3): 812-23).
PDL1 antitela i CD3xPDL1 bispecifična antitela
IgG1-338-FEAR (koji imaju VH i VL sekvence navedene u SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:5, tim redom) IgG1-338-F405L
bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR
bsIgG 1-b 12-FEALx338-FEAR
IgG1-511-LC33S-FEAR (koji imaju VH i VL sekvence navedene u SEQ ID NO: 8 i SEQ ID NO: 15, tim redom)
IgG1-511-F405L-LC33S
bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR
bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR
IgG1-547-FEAR (koji imaju VH i VL sekvence navedene u SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 22, tim redom)
IgG1-547-F405L
bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR
bsIgG 1-b12 -FEALx547-FEAR
IgG1-321-FEAR (koji imaju VH i VL sekvence navedene u SEQ ID NO:32 i SEQ ID NO:36, tim redom)
IgG1-421-LC91S-FEAR (koji imaju VH i VL sekvence navedene u SEQ ID NO:46 i SEQ ID NO:50, tim redom)
IgG1-476-N101Q-LC33S-FEAR (koji imaju VH i VL sekvence navedene u SEQ ID NO:53 i SEQ ID NO:57, tim redom)
IgG1-625-FEAR (koji imaju VH i VL sekvence navedene u SEQ ID NO: 106 i SEQ ID NO: 110, tim redom)
IgG1-632-FEAR (koji imaju VH i VL sekvence navedene u SEQ ID NO:67 i SEQ ID NO:71, tim redom)
IgG1-516-FEAR (koji imaju VH i VL sekvence navedene u SEQ ID NO:60 i SEQ ID NO:64, tim redom)
IgG1-MPDL3280A-FEAR (zasnovano na PDL1 antitelu MPDL3280A kompanije Genentech; ima VH i VL sekvence navedene u SEQ ID NO:74 i SEQ ID NO:78, tim redom) IgG1-MPDL3280A-K409R
IgG1-MEDI4736-FEAR (zasnovano na PDL1 antitelu MEDI4736 kompanije MedImmune; ima VH i VL sekvence navedene u SEQ ID NO:81 i SEQ ID NO:85, tim redom) IgG 1-MEDI4736-F405L
Primer 5: Vezivanje PD-L1 antitela ili CD3xPD-L1 ili b12xPD-L1 bispecifičnih antitela za tumorske ćelije
[0289] Vezivanja PD-L1 antitela i bispecifičnih antitela CD3xPD-L1 i b12xPD-L1 za ćelijske linije humanih tumora SK-MES-1 (karcinom skvamoznih ćelija pluća; ATCC; kat. br. HTB-58), MDA-MB-231 (adenokarcinom dojke; ATCC; kat. br. HTB-26), PC-3 (adenokarcinom prostate; kat. Br. CRL-1435) i HELA (adenokarcinom cerviksa; kat. br. CCL-2) su analizirana citometrijom.
[0290] Ćelije (3-5 × 10<4>ćelija/bunaru) su inkubirane u polistirenskim pločama sa okruglim dnom sa 96-mesta (Greiner bio-one, kat. br. 650101) sa serijskim razblaženjima antitela (opsega 0,0001 do 10 µg/mL i sa 5-strukim koracima razblaživanja) u 50 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azid (pufer za bojenje) na 4°C tokom 30 min.
[0291] Nakon dva ponovljena ispiranja u puferu za bojenje, ćelije su inkubirane u 50 µL sekundarnog antitela na 4°C tokom 30 min. Kao sekundarno antitelo za sve eksperimente korišćen je R-fikoeritrin (PE)-konjugovani kozji anti-humani IgG F(ab')z (kat. br. 109-116-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) razblažen u odnosu 1 :500 u puferu za bojenje. Zatim su ćelije isprane dva puta u puferu za bojenje, resuspendovane u 20 µL pufera za bojenje i analizirane na iQue ekranu (Intellicyt Corporation, SAD). Krive vezivanja su analizirane postupkom nelinearne regresije (sigmoidalni dozni odgovor sa promenlјivim nagibom) korišćenjem softvera GraphPad Prism V75.04 (GraphPad Softvare, San Dijego, Kalifornija, SAD).
[0292] Kvantitativna protočna citometrija (QIFIKIT<®>, Dako; kat. br. K0078) je urađena kako je opisano (Poncelet i Carayon, 1985, J. Immunol. Meth.85: 65-74), kako bi se kvantifikovala cilјna ekspresija na plazma membrani MDA-MB-231, PC-3 i HELA ćelija, i da bi se odredio broj vezanih PDL1 molekula. Utvrđeno je da ćelijske linije imaju sledeću PD-L1 antigensku gustinu (ABC, kapacitet vezivanja antitela):
● SK-MES-1: pribl.30.000 ABC/ćelija
● MDA-MB-231: pribl.21.000 ABC/ćelija
● PC-3: pribl.6.000 ABC/ćelija
● HELA ćelije: pribl.2,000 ABC/ćelija.
Vezivanje za MDA-MB-231 ćelije
[0293] Slika 1 pokazuje da bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR (A), bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR (D), bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR (B) i bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR (E) pokazuju vezivanje zavisno od doze za MDA-MB-231 ćelije sa većim maksimalnim vezivanjem od vezivanja monospecifičnih, bivalentnih PD-L1 antitela IgG1-338-FEAR i IgG1-547-FEAR. Maksimalno vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR (C) i bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR (F) je bilo niže od bivalentnog, monospecifičnog PD-L1 antitela IgG1-511-LC33S-FEAR.
Vezivanje za PC-3 ćelije
[0294] Slika 2 pokazuje da bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR (A), bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR (D), bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR (B) i bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR (E) pokazuju vezivanje zavisno od doze za PC3 ćelije. Maksimalno vezivanje bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR (C) i bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR (F) je bilo niže od bivalentnog, monospecifičnog PD-L1 antitela IgG1-511-LC33S-FEAR.
Vezivanje za HELA ćelije
[0295] Slika 3 pokazuje da su bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR (A) i bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR (B) pokazali vezivanje zavisno od doze za HELA ćelije. Maksimalno vezivanje monospecifičnih, bivalentnih PD-L1 antitela IgG1-338-FEAR i IgG1-547-FEAR nije moglo da se odredi u opsegu koncentracije koja je korišćena. (C) bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR i IgG1-511-LC33S-FEAR nisu se vezali za HELA ćelije.
Vezivanje za SK-MES-1 ćelije
[0296] Slika 4 pokazuje da su bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR (A) i bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR (B) pokazali vezivanje zavisno od doze za SK-MES-1 ćelije, sa većim maksimalnim vezivanjem od monospecifičnih, bivalentnih PD-L1 antitela IgG1-338-FEAR i IgG1-547-FEAR. Maksimalno vezivanje bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR (C) bilo je niže od bivalentnog, monospecifičnog PD-L1 antitela IgG1-511-LC33S-FEAR.
Primer 6: Vezivanje za humani PD-L2
[0297] Da bi se pokazalo specifično vezivanje za PD-L1 ali ne za humani PD-L2, vezivanja bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR i IgG1-338-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR i IgG1-547-FEAR i vezivanja bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR i IgG1-511-LC33S-FEAR za CHO ćelija koje eksprimiraju humani PD-L2 je određeno protočnom citometrijom upotrebom postupka kako je opisano iznad. PE-konjugovano PD-L2 specifično antitelo (Mylteni, klon MIH18; kat. br.130-098-651) korišćeno je kao pozitivna kontrola. Ni jedno od testiranih antitela nije se vezalo za CHO-PD-L2 ćelije.
Primer 7: Vezivanje PD-L1 antitela ili CD3xPD-L1 ili b12xPD-L1 bispecifičnih antitela za cinomolgus PD-L1
[0298] Vezivanje za CHO ćelije koje eksprimiraju cinomolgus PD-L1 je određeno protočnom citometrijom korišćenjem postupka koji je opisan u tekstu iznad. Slika 5 pokazuje da bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR (A), bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR (B), bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR (C), bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR (D), bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR (E) i bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR (F), su pokazali vezivanje zavisno od doze za CHO ćelije koje eksprimiraju cinomolgus PD-L1, sa većim maksimalnim vezivanjem od vezivanja monospecifičnih, bivalentnih PD-L1 antitela IgG1-338-FEAR, IgG1-547-FEAR i IgG1-511-LC33S-FEAR.
Primer 8: Određivanje afiniteta humanog i cinomolgusa PD-L1 upotrebom bioslojne interferometrije
[0299] U prvom setu eksperimenata, afiniteti za rekombinantno eksprimirani humani PD-L1 protein su određeni korišćenjem bioslojne interferometrije (BLI) na Octet HTX instrumentu (ForteBio). Biosenzori za hvatanje anti-humanog IgG Fc (AHC) (ForteBio) su učitavani 900 s sa antitelima (1 µg/ml). Nakon postizanja početne vrednosti (100 s), određene su asocijacija (1000 s) i disocijacija (2000 s) PDLoneECDHisCtag u diluentu uzorka (ForteBio), koristeći opseg koncentracija od 2,67 µg/ml-0,14 µg/ml (100 nM-1,56). nM) sa dvostrukim koracima razblaživanja. Eksperiment je izveden uz mućkanje na 1000 rpm na 30°C. Podaci su analizirani pomoću „Data Analysis Software v9.0.0.12 (ForteBio)“ koristeći model 1:1 i globalno potpuno uklapanje sa vremenom asocijacije od 1000 s i vremenom disocijacije od 200 ili 1000 s. Podaci su korigovani oduzimanjem puferske reference, Y-osa je poravnata sa poslednjih 10 s osnovne linije, a primenjene su korekcije između koraka kao i filtriranje Savitzky-Golay. Tragovi podataka sa odgovorom <0,05 nm su isklјučeni iz analize. Kao podrazumevano, korišćeno je uklapanje koje koristi vreme disocijacije od 1000 s. Vreme disocijacije od 200 s je korišćeno za IgG1-511-FEAR-LC33S, na osnovu R<2>vrednost i vizuelni pregleda uklapanja.
[0300] Tabela 1 prikazuje rezultate.
Tabela 1: Afiniteti vezivanja monospecifičnih bivalentnih PD-L1 antitela za humani PD-L1 određeni interferometrijom biosloja.
[0301] U drugom setu eksperimenata (n=3), upoređeni su afiniteti antitela PD-L1, antitela na humani i cinomolgus PD-L1, određeni upotrebom BLI. Eksperimentalna postavka je bila kao što je gore opisano, sa izuzetkom
● Vreme učitavanja AHC biosenzora antitelima bilo je 600 s;
● Osnovna linija je bila 300 s;
● Pored PDLoneECD-HisCtag (humani PD-L1, teorijska molekulska težina 29 kDa), korišćen je protein cinomolgus PD-L1/B7-H1 iz (Acro Biosystems, kat. br. PD1-C52H4-100, teorijska molekulska težina 27,1 kDa kao antigen;
● Opseg koncentracije antigena bio je 0,156 - 10 nM (u prvom eksperimentu) ili 0,39 - 25 nM (u drugom i trećem eksperimentu).
[0302] Tabela 2 prikazuje rezultate (prosek od 3 eksperimenta). Afiniteti vezivanja IgG1-338-FEAR, IgG1-547-FEAR i IgG1-511-LC33S-FEAR za humani PD-L1 su bili u istom opsegu kao što je prikazano u Tabeli 1, sa odstupanjem verovatno zbog postojanja varijacija u uslovima analize. Afiniteti vezivanja ovih antitela za cinomolgus PD-L1 su bili veoma slični onima za humani PD-L1. Takođe su određeni afiniteti vezivanja za IgG1-MEDI4738-FEAR i IgG1-MPDL3280A-FEAR. IgG1-MEDI4738-FEAR je pokazao sličan afinitet vezivanja za humani i cinomolgus PD-L1. IgG1-MEDI4738-FEAR je pokazao veliku razliku u afinitetu vezivanja, sa u prosekuu 19,7 nižim afinitetom (većim KD) za cinomolgus PD-L1 nego za humani PD-L1.
Tabela 2: Afiniteti vezivanja (prosek od 3 nezavisna eksperimenta) monospecifičnih bivalentnih PD-L1 antitela za humani i cinomolgus PD-L1 određeni bioslojnom interferometrijom.
Primer 9: PD-L1 klasični „sendvič“ test unakrsnog blokiranja
[0303] Test unakrsnog-blokiranja antitela je izvedeno upotrebom bioslojne interferometrije (BLI) na Octet HTX instrumentu (ForteBio). Antitela (20 µg/ml u 10 mM natrijum acetatnom puferu pH 6,0 (ForteBio)) su imobilizovana, prema uputstvima proizvođača, na biosenzorima druge generacije reaktivnog amina (AR2G) (ForteBio). Nakon početne vrednosti (50 s) u diluentu uzorka (ForteBio), biosenzori koji sadrže imobilizovana antitela su nanošeni tokom 500 s sa PDLoneECDHisCtag (100 nM ili 2,7 µg/ml), nakon čega je odgovor asocijacije drugog antitela (10 µg/ml) praćen tokom 500 s. Biosenzori su regenerisani naizmeničnim izlaganjem 3 puta po 5 s 10 mM glicinu pH 2,5 i diluentu uzorka. Eksperiment je ponovlјen sa novim setom drugih antitela počevši od osnovnog koraka. Svaki biosenzor je korišćen 6 puta. Eksperiment je izveden na 30°C uz upotrebu šejkera na brzini od 1000 rpm. Podaci su analizirani upotrebom „Data Analysis Software v9.0.0.12 (ForteBio)“. Y-osa je poravnata sa korakom asocijacije i primenjeno je filtriranje Savicky-Golay. Prosečan odgovor pufera je oduzet od asocijacijskog odgovora drugog antitela da bi se korigovala disocijacija PDLoneECDHisCtag od imobilizovanog antitela. Korigovani odgovori asocijacija su ispisani u matričnom formatu. Odgovori ≥ 0,1 nm smatrani su neblokirajućim parovima antitela (rezultati su označeni kao obični brojevi u Tabeli na Slici 6), odgovori ispod 0,1 su smatrani blokirajućim parovima antitela (rezultati označeni podeblјanim brojevima u tabeli na slici 6). Neki parovi antitela su pokazali pomeranje (što je označeno zvezdicom (*) u Tabeli na Slici 6). Reprezentativni grafikoni su prikazani na Slici (A) za parove antitela koji zamenjuju, (B), blokiraju i (C) ne blokiraju.
[0304] Eksperimenti sa unakrsnim blokiranjem su izvedeni za antitela IgG1-338-FEAR, IgG1-547-FEAR, IgG1-511-LC33S-FEAR, IgG1-321-FEAR, IgG1-421-LC91S-FEAR, IgG1-476-N101Q-FEAR, IgG1-632-FEAR, IgG1-516-FEAR, IgG1-MPDL3280A-FEAR i IgG1-MEDI4736-FEAR. Rezultati su sumirani na Slici 6.
[0305] Podaci pokazuju da antitelo IgG1-511-LC33S-FEAR definiše jedinstvenu unakrsnu blok grupu, jer blokira IgG1-321-FEAR, IgG1-338-FEAR, IgG1-476-N101Q-LC33S-FEAR, IgG1-632-FEAR , IgG1-MPDL3280A-FEAR i IgG1-MEDI4736-FEAR, ali ne blokira vezivanje IgG1-547-FEAR, IgG1-421-LC91S-FEAR ili IgG1-516-FEAR za humani PDL1.
[0306] Štaviše, antitelo IgG1-547-FEAR definiše jedinstvenu unakrsnu blok grupu, jer blokira IgG1-321-FEAR, IgG1-338-FEAR, IgG1-421-LC91S-FEAR, IgG1-MPDL3280A-FEAR i IgG1-MEDI4736-FEAR, ali ne blokira vezivanje IgG1-511-LC33S-FEAR, IgG1-476-N101Q-LC33S-FEAR, IgG1-632-FEAR, IgG1-516-FEAR za humani PD1.
[0307] Nadalje, antitelo IgG1-476-N101Q-LC33S-FEAR je pokazalo ponašanje izmeštanja u kombinaciji sa IgG1-321-FEAR, IgG1-338-FEAR, IgG1-MPDL3280A-FEAR i IgG1-MEDI4736-FEAR, što ukazuje na to da se antitela IgG1-321-FEAR, IgG1-338-FEAR, IgG1-MEDI4736-FEAR and IgG1-MPDL3280A-FEAR različito vezuju za humani PD-L1 u poređenju sa IgG1-421-LC19S-FEAR, IgG1-547-FEAR, IgG1-LC33S-FEAR, IgG1-632-FEAR i IgG1-516-FEAR.
Primer 10: Efekat PD-L1 antitela na interakciju PD-1/PD-L1
[0308] Efekat bivalentnih i monovalentnih PD-L1 antitela na interakciju PD-1 i PD-L1 određen je biotestom blokade PD-1/PD-L1 koji je razvila Promega (Medison, SAD). Ovo je bioluminiscentni ćelijski test koji se sastoji od dve genetski konstruisane ćelijske linije: efektorske ćelije PD-1, su Jurkat T ćelije koje eksprimiraju humani PD-1 i reporter luciferaze vođen NFAT responsivnim elementom (NFAT-RE), i PD-L1 aAPC/CHO-K1 ćelije, koje su CHO-K1 ćelije koje eksprimiraju humani PD-L1 i inženjerski konstruisan površinski protein ćelije koji je dizajniran tako da aktivira srodne TCR na antigen nezavisan način. Kada su dva tipa ćelija zajedno gajena u kulturi, interakcija PD-1/PD-L1 inhibira TCR signalizaciju i luminescenciju posredovanu NFAT-RE. Dodavanje antitela koje blokira interakciju PD-1/PD-L1 oslobađa inhibitorni signal i dovodi do aktiviranja TCR-a i luminescencije posredovane NFAT-RE.
[0309] PD-L1 aAPC/CHO-K1 ćelije (Promega, kat. br. J109A) su odmrznute u skladu sa protokolom proizvođača, resuspendovane u Hamovom F12 medijumu (Promega, kat. br. J123A) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS; Promega, kat. br. J121A), i potom zasejane u ploče za kulturu sa 96 bunara sa ravnim dnom (CulturPlate-96, Perkin Elmer, kat. br.6005680). Ploče su inkubirane tokom 16 sati na 37°C, 5% COz. Supernatant je uklonjen i dodata su serijska razblaženja antitela (finalna koncentracija je bila u rasponu od 5 do 0,001 µg/mL; 4-struka razblaženja u RPMI 1640 [Lonza, kat. br. BE12-115F] medijumu koji je sadržao 1% fetalnog goveđeg seruma [FBS; Promega, kat. br. J121A]). Dodate su efektorske ćelije PD-1 (Promega, kat. br. J115A; odmrznute prema protokolu proizvođača i resuspendovane u RPMI/1% FBS). Ploče su inkubirane tokom 6 h na 37°C, 5% COz. Nakon ekvilibracije na sobnoj temperaturi, 40 µl Bio-Glo reagensa (supstrat za Bio-Glo esej luciferaze [Promega kat. br. G720B] je rekonstituisan u puferu za Bio-Glo esej luciferaze [Promega, kat. br. G7198]) prema protokolu proizvođača je dodato u svaki bunar. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 5-10 minuta i luminiscencija je merena upotrebom EnVision Multilabel Reader-a (PerkinElmer). Efekat na interakciju PD1-PD-L1, u odnosu na kontrolu (bez dodavanja antitela), izračunat je na sledeći način:
Veličina indukcije = RLU (indukovani-pozadina)/RLU (kontrolna pozadina bez antitela), RLU predstavlja relativne svetlosne jedinice
[0310] Slika 7 pokazuje da bivalentna, monospecifična antitela IgG1-338-FEAR, IgG1-547-FEAR i IgG1-511-LC33S-FEAR efikasno blokiraju interakciju između PD1 i PD-L1 na način koji zavisi od doze. Monovalentna antitela bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR i bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR takođe su efikasno blokirala interakciju PD1-PD-L1. bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR je takođe blokirao ovu interakciju, iako manje efikasno.
Primer 11: In vitro citotoksičnost CD3xPD-L1 bispecifičnih antitela
[0311] CD3xPD-L1 bispecifična antitela su testirana u in vitro testu citotoksičnosti koristeći tumorske ćelijske linije kao cilјne ćelije i prečišćene T ćelije ili mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) kao efektorske ćelije. T ćelije su izolovane od donora (Sanquin, Amsterdam, Holandija) uz upotrebu RosetteSep koktela za bogatiju izolaciju humanih T ćelija (Kat.: 15021C.1, Stemcell Technologies, Francuska), prema uputstvima proizvođača. PBMC su izolovane iz 40 mL vazdušastog sloja (Sanquin) korišćenjem Ficoll gradijenta (Lonza; medijum za odvajanje limfocita, kat. br. 17-829E) prema uputstvima proizvođača.
[0312] MDA-MB-231 ćelije (16.000 ćelija/bunar), PC-3 ćelije (16.000 ćelija/bunar) ili HELA ćelije (10.000 ćelija/bunar) su zasejane u ploče sa 96 bunara koje imaju ravno dno (kat. br.655180, Greiner-bio-one, Holandija) i gajene preko noći na 37°C. T ćelije su dodane tumorskim ćelijama u E:T odnosu = 4:1 za MDA-MB-231 ili PC-3 ćelije, i E:T = 8:1 za HELA ćelije. PBMC su dodate tumorskim ćelijama u E:T odnosu = 10:1. Serijska razblaženja antitela (konačna koncentracija je bila u rasponu od 1000 do 0,06 ng/mL; 4-struka razblaženja) su dodata, i ploče su inkubirane tokom 48 sati na 37°C. Zatim su supernatanti odliveni i prileplјene ćelije su isprane dva puta sa PBS-om.150 µL 10% alamar plavog rastvora (kat. br.: DAL1100, Life Technologies, Holandija), pripremlјenog u RPMI-1640 medijumu (kat. br.: BE12-115F, Lonza, Švajcarska) koji je sadržao 10% goveđeg seruma sa gvožđem (kat. br. 371-10 029, Life Technologies, Holandija), je dodato u bunare i inkubacija je trajala 5 h na 37°C. Apsorbanca je merena u Envision čitaču ploča (PerkinElmer, SAD). Ćelije tretirane sa staurosporinom (kat. br.: S6942, Sigma-Aldrich, SAD) su postavlјene kao 0% vijabilnost, a netretirane ćelije su postavlјene kao 100% vijabilnost. „Procenat vijabilnih ćelija“ je izračunat na sledeći način:
% vijabilnih ćelija = (apsorbanca uzorka – apsorbanca ciljne ćelije tretirane staurosporinom)/(apsorbanca netretirane ciljne ćelije – apsorbanca ciljne ćelije tretirane staurosporinom) x 100
Citotoksičnost CD3xPD-L1 bispecifičnih antitela u MDA-MB-231 ćelijama
[0313] Slika 8 prikazuje da bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR i bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR indukuju citotoksičnost zavisnu od koncentracije u MDA-MB-231 ćelijama, koje eksprimiraju relativno visoke nivoe PD-L1, i kada se koriste prečišćene T ćelije (A) i PBMC (B) kao efektorske ćelije.
Citotoksičnost CD3xPD-L1 bispecifičnih antitela u PC-3 ćelijama
[0314] Slika 9 prikazuje da bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR, bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR i bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR indukuju citotoksičnost zavisnu od koncentracije u PC3 ćelijama, i kada se koriste prečišćene T ćelije (A) i PBMC (B) kao efektorske ćelije. bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR je bio najmanje efikasan u indukovanju citotoksičnosti u PC-3 ćelijama, koje eksprimiraju umerene nivoe PD-L1.
Citotoksičnost CD3xPD-L1 bispecifičnih antitela u HELA ćelijama
[0315] Slika 10 prikazuje da je bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR bio sposoban da izazove citotoksičnost u HELA ćelijama, koje eksprimiraju niske nivoe PD-L1, i kada se T ćelije koriste kao efektorske ćelije, a za jednog donora takođe kada se koriste PBMC. bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR je bio manje sposoban da izazove citotoksičnost u HELA ćelijama, a bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR nije indukovao citotoksičnost u HELA ćelijama.
Primer 12: Aktivacija i proliferacija T ćelija pomoću CD3xPD-L1 bispecifičnih antitela
[0316] CD3xPD-L1 bispecifična antitela su testirana u in vitro testu za merenje aktivacije i proliferacije T ćelija, koristeći MDA-MB-231 ćelije kao cilјne ćelije i prečišćene T ćelije kao efektorske ćelije. IgG1-b12 (sa Fc regionom sposobnim za interakciju sa Fcγ receptorima i C1q) je korišćen kao negativna kontrola. PBMCs su izolovane iz 40 mL vazdušastog sloja (Sanquin) upotrebom Ficoll gradijenta (Lonza; medijum za separaciju limfocita, kat. br.17-829E) prema uputstvima proizvođača. Iz prečišćenih PBMC, T ćelije su izolovane korišćenjem RosetteSep koktela za bogatiju izolaciju humanih T ćelija (Stemcell Technologies, Francuska; kat. br. 15021C.1) prema uputstvima proizvođača. MDA-MB-231 ćelije su obeležene sa 0,07 µM CellTrace CFSE (ThermoFisher Scientific, kat. br. C34554) prema uputstvu proizvođača i zasejane (5.000 ćelija/bunar) u ploče sa 96 bunara koji imaju ravno dno (Greiner-bio-one, Holandija, kat. br.655180) i potom puštene da se zalepe za dno bunara tokom 4 h na 37°C. T ćelije su dodane tumorskim ćelijama u E:T odnosu = 8:1, dakle 40.000 ćelija po bunaru. Dodata su serijska razblaženja antitela (konačna koncentracije u rasponu od 10000 do 1,5 ng/mL; trostruka razblaženja) i ploče su inkubirane tokom 4 dana na 37°C.
[0317] Zatim su supernatanti (koji sadrže ćelije koje nisu adherirale) prebačeni na ploču sa 96-bunara koji imaju U-dno (Greiner-bio-one), preostale ćelije su sakuplјene kroz tretmanom sa tripsin-EDTA (Lonza) i kombinovane sa ćelijskim supernatantom u ploči sa 96-bunara sa U-dnom. Ćelije su isprane sa PBS (B.Braun) i obojene 30 minuta na 4°C koktelom antitela: 1:200 anti-huCD4-pacifik plavom (Biolegend, kat. br. 300521), 1:50 anti-huCD8-FITC (BD, kat. br. 345772), 1:100 anti-huCD25-PE-Cγ7 (eBiosciences, kat. br. 25-0259-42) i anti-huCD69-PE (BD, kat. br. 555531). Ćelije su jednom isprane ledeno hladnim FACS-puferom i resuspendovane u 80 µL FACS-pufera sa dodatkom 1:6000 razblaženog topro-3-joda (ThermoFisher Scientific, kat. br. T3605). Proliferacija T ćelija je određena brojanjem ukupnog broja CD4<pos>i CD8<pos>T ćelija u fiksnoj zapremini od 50 µL na protočnom citometru. Aktivacija T ćelija je merena brojanjem CD69<pos>(rani marker aktivacije T ćelija) i CD25<pos>(marker kasne aktivacije T ćelija) ćelija u fiksnoj zapremini od 50 µL na protočnom citometru. Slika 11 pokazuje da su sva CD3xPD-L1 bispecifična antitela izazvala proliferaciju T ćelija (indikovano povećanjem ukupnog broja T ćelija). Međutim, uočene su razlike u količini aktiviranih i ukupnih T ćelija između različitih CD3xPD-L1 bispecifičnih antitela pri čemu je bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR bio manje efikasan, a bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR je bio najefikasniji.
Primer 13. Određivanje doprinosa PD-L1 aminokiselinskih ostataka u vezivanju antitela korišćenjem skeniranja alanina.
Dizajn biblioteke
[0318] Sintetizovana je biblioteka PD-L1 sa jednim ostatkom alanina (Uniprot Q9NZQ7) (Geneart) u kojoj su svi ostaci aminokiselina u ekstracelularnom domenu humanog PD-L1 pojedinačno mutirani u alanine osim na pozicijama koje već sadrže alanine ili cisteine. Cisteini nisu mutirani da bi se smanjila mogućnost strukturnog narušavanja antigena. Biblioteka je klonirana u pMAC ekspresioni vektor koji sadrži CMV/TK-polyA ekspresionu kasetu, gen otpornosti na Amp i početak replikacije pBR322.
Produkcija biblioteke i nadgledanje
[0319] Divlјi tip PD-L1 i alaninski mutanti su eksprimirani pojedinačno u FreeStyle HEK293 ćelijama prema uputstvima proizvođača (Thermo Scientific). Ćelije su sakuplјene jedan dan nakon transfekcije. Približno 100.000 ćelija je inkubirano sa 20 µL Alexa488 konjugovanog antitela od interesa u FACS puferu (Tabela 3). Ćelije su inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim je dodato 150 uL FACS pufera i ćelije su isprane centrifugiranjem. Ćelije su resuspendovane u 20 µL svežeg FACS pufera (PBS [bez Ca<++>, Mg<++>i fenol crvene]/1% BSA frakcija V/0,02% NaN3) i čuvane na 4°C do analize protočnom citometrijom korišćenjem „iQue screener“-a.
[0320] Ceo eksperiment je izveden 4 puta.
Tabela 3: Antitela korišćena u određivanju doprinosa PD-L1 aminokiselinskih ostataka u vezivanju antitela korišćenjem skeniranja alanina.
Analiza podataka
[0321] Za svaki uzorak, prosečno vezivanje antitela po ćeliji je određeno kao geometrijska sredina intenziteta fluorescencije (gMFI) za populaciju ćelija bez ograničavanja (utišavanja) signala. Na gMFI utiče afinitet antitela za mutirani PD-L1 i nivo ekspresije mutiranog PD-L1 po ćeliji. Pošto specifične mutacije alanina mogu uticati na nivo površinske ekspresije mutiranog PD-L1, i da bi se korigovale razlike u ekspresiji za svaki PD-L1 mutant uopšte, podaci su normalizovani prema intenzitetu vezivanja specifične kontrole za PD-L1 koja ne blokira unakrsno antitelo (IgG1-625-FEAR-A488; koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) prikazan u SEQ ID NO: 106 i varijabilni region lakog lanca (VL) datog u SEQ ID NO: 110), koristeći sledeću jednačinu :
[0322] U kojoj se 'aa pozicija' odnosi ili na određeni ala mutirani PD-L1 ili na divlјi tip (wt) PD-L1.
[0323] Da bi se izrazio gubitak ili povećanje vezivanja antitela na linearnoj skali veličine promene, korišćen je sledeći proračun:
[0324] Povećanje vezivanja u većini slučajeva će biti uzrokovano gubitkom vezivanja referentnog antitela za specifične ala mutante.
[0325] Nakon ovih proračuna, pozicije aminokiselina za koje, nakon zamene aminokiseline alaninom, ukoliko nema gubitka ili povećanja vezivanja od strane određenog antitela daće kao rezultat ’0', povećanje vezivanja će rezultirati sa '>0' i gubitak vezivanja će rezultirati '<0'. Da bi se korigovala varijacija uzorka, samo PD-L1 aminokiselinski ostaci kod kojih je veličina promene u vezivanju bila niža od srednje veličina promene - 1,5 × SD (označeno isprekidanom linijom na Slici 12), gde je SD standardna devijacija izračunate veličine promene iz četiri nezavisna eksperimenta za određeno testirano antitelo, su smatrani kao da su izgubili sposobnost vezivanja u mutiranom antitelu.
[0326] U slučaju da je gMFI kontrolnog antitela za određeni mutirani PD-L1 bio niži od srednjeg gMFI -2,5 × SD srednjeg gMFIKontrolno Ab, takav podatak je isklјučen iz analize podataka (pretpostavlјeno je da su nedovoljni nivoi ekspresije ovih mutiranih PD-L1).
[0327] Slika 12 prikazuje veličinu promene u vezivanju PD-L1 antitela za varijante PD-L1 sa ala mutacijama na pozicijama 42 do 131 (prema SEQ ID No 94). Rezultati ukazuju na to
● vezivanje antitela 338 najmanje zavisi od aa R113, Y123 i R125 humanog PD-L1,
● vezivanje antitela 511 najmanje zavisi od aa F19, F42, E45, K46, L94 i I116 humanog PD-L1;
aminokiseline E45, K46 i L94 koje su direktno uklјučene u vezivanje antitela, a F19, F42 i I116 su indirektno uklјučene u vezivanje antitela zbog svojih sakrivenih bočnih lanaca,
● vezivanje antitela 547 najmanje zavisi od aa E58 i R113 humanog PD-L1,
● vezivanje antitela MEDI4736 najmanje zavisi od aa R113 i R125 humanog PD-L1,
● i vezivanje antitela MPDL3280A najmanje zavisi od aa R125 i I126 humanog PD-L1, pri čemu I126 zbog svog sakrivenog bočnog lanca može biti indirektno uklјučen u vezivanje antitela.
Primer 14: Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC)
ADCC određen u testu raspadanja<51>Cr
[0328] MDA-MB-231 ćelije (ATCC, kat. br.HTB-26) su sakuplјene (da bi se dobilo 7×10<6>ćelija), isprane (dva puta u PBS, 1500 rpm, 5 min) i sakuplјene u 2 mL RPMI 1640 medijuma sa dodatkom 10% „cosmic“ telećeg seruma (CCS) (HyClone, Logan, UT, SAD)), u koji je dodato 200 µCi<51>Cr (Chromium-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Holandija). Smeša je inkubirana 1 sat na 37°C uz mućkanje. Posle ispiranja (dva puta u PBS-u, 1500 rpm, 5 min), ćelije su ponovo resuspendovane u medijumu RPMI 1640/10% CCS i izbrojane postupkom isklјučenja tripan plavog. Ćelije su podešene na koncentraciju od 1×10<5>ćelija/mL.
[0329] U međuvremenu, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz svežeg vazdušastog sloja (Sanquin, Amsterdam, Holandija) upotrebom standardnog Ficoll gradijentnog centrifugiranja prema uputstvima proizvođača (medijum za separaciju limfocita; Lonza, Verviers, Francuska). Nakon resuspendovanja ćelija u medijumu RPMI 1640/10% CCS, ćelije su prebrojane postupkom iskjučenja tripan plavog i podešene na 1×10<7>ćelija/mL.
[0330] 50 µL<51>Cr obeleženin cilјnih ćelija je prebačeno u mikrotitar bunare u koje je dodato 50 µL 30 µg/mL PD-L1 antitela (razblaženo u RPMI/10% CCS). Kao pozitivna kontrola, korišćeno je antitelo na nepovezani ciljni antigen eksprimiran na MDA-MB-231 ćelijama. Ćelije su inkubirane 15 minuta na sobnoj temperaturi i potom je dodato 50 µL efektorskih ćelija (PBMC), što je rezultiralo odnosom efektornih i ciljnih ćelija 100:1. Da bi se odredila maksimalna količina ćelijskog lizata, 100 µL 5% Triton-X100 je dodato umesto efektorskih ćelija. Dodato je 100 µL RPMI 1640/10% CCS umesto efektorskih ćelija i antitela da bi se odredila veličina spontanog liziranja. Pored toga, da bi se odredio nivo liziranja ćelija nezavisno od antitela, dodato je 50 µL efektorskih ćelija i 50 µL medijuma (umesto antitela). Uzorci su inkubirani 4 sata na 37°C, 5% CO2. Da bi se odredilo stepen liziranja cilјnih ćelija, uzorci su centrifugirani (1200 rpm, 3 min) i 75 µL supernatanta je prebačeno u mikronske epruvete, nakon čega je mereno raspadanje<51>Cr pomoću gama brojača. Procenat liziranja posredovanog antitelima izračunat je na sledeći način:
[0331] Slika 13 pokazuje da je IgG1-547-F405L indukovao ~10% dozno zavisnog liziranja MDA-MB-231 ćelija preko ADCC. Antitelo pozitivne kontrole izazvalo je samo 20% maksimalnog liziranja, što ukazuje da je ukupno liziranje u ovom eksperimentu bilo prilično nisko. IgG1-511-F405L-LC33S i IgG1-338-F405L nisu izazvali liziranje MDA-MB-231.
ADCC određen u luminescentnom ADCC reporter bioeseju
[0332] Sposobnost PD-L1 antitela da indukuju unakrsno povezivanje FcγRIIIa (CD16), kao surogat za ADCC, takođe je određen na MDA-MB-231 ćelijama upotrebom luminescentnog ADCC reporter bioeseja (Promega, Cat # G7018) prema preporukama proizvođača. Kao efektorske ćelije, kit sadrži Jurkat humane T ćelije koje su konstruisane da stabilno eksprimiraju FcγRIIIa (V158) visokog afiniteta i nuklearni faktor povezan sa aktiviranim T ćelijama (NFAT) koji pokreće ekspresiju luciferaze svitca. Ukratko, MDA-MB-231 ćelije (12.500 ćelija/bunar) su zasejane na „Culture OptiPlates“ (Perkin Elmer) u ADCC puferu [RPMI-1640 medijum [(Lonza, Cat # BE12-115F) sa dodatkom 3,5% seruma sa niskim IgG] i inkubirane tokom 6 sati na 37°C/5% CO2u ukupnoj zapremini od 75 µL sa serijom koncentracija antitela (0,5-250 ng/mL finalne koncentracije u 3,5-strukim razblaženjima) i odmrznute ADCC efektorske ćelije bioeseja. Nakon temperiranja ploča tokom 15 minuta na sobnu temperaturu (RT), dodato je 75 uL Bio Glo reagensa luciferaze i ploče su inkubirane 5 minuta na RT. Produkcija luciferaze je kvantifikovana očitavanjem luminiscencije na „EnVision Multilabel Reader“-u (Perkin Elmer). Osnovni nivoi su izmereni u bunarima u kojima su prisutne samo cilјne ćelije i antitelo (bez efektorskih ćelija). Kao negativna kontrola, korišćeni su bunari koji sadrže samo cilјne i efektorske ćelije (bez antitela).
[0333] Slika 14 pokazuje da je IgG1-547-F405L bio veoma efikasan u indukovanju ADCC kao što je utvrđeno u reporterskom eseju. Takođe IgG1-MEDI4736-F405L i IgG1-MPDL3280A-K409R indukuju ADCC, ali ne u istoj meri kao IgG1-547-F405L. IgG1-511-F405L-LC33S i IgG1-338-F405L nisu indukovali ADCC.
LISTA SEKVENCI
[0334]
<211> 8
<212> PRT 64 <213> Homo Sapiens
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 65
66
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Phe Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr
<400> 12 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence 68
1 5 10
<212> PRT
<213> Homo Sapiens 70
<210> 23
<211> 6 71 <212> PRT
72
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
35 40 45
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 74 Glu Trp Val 35 40 45
1 5 10 15
Gln Gln Tyr His Ser Ser Ser Tyr Thr 76 1 5
1 5 10 15
78
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
Ala Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 79
115 120 125
<400> 44
80
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr 8 T1yr Ala Asp 50 55 60
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 82
115 120
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala 8 P3ro Lys Leu 35 40 45
Glu Val Gln Met Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 84 Pro Gly Gly 1 5 10 15
<210> 56
<211> 20 85 <212> PRT
<210> 58 86 <211> 6
100 105 110
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 88
89
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ala Arg Asp Arg Val Lys Tyr Gly Ser Pro Gly Ser Leu Phe Asp Tyr 1 5 10 15 90
<400> 73
91
Tyr Ser Thr Ala Ser Ser Gly Asp His Arg Val
<210> 76 92 <211> 8
100 105
Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe As 9p4 Tyr Trp Gly 100 105 110
95
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
<210> 89
<211> 330 96 <212> PRT
180 185 190
98
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
245 250 255
101
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
260 265 270
115 120 125
1 5 10 15
1 5 10 15
85 90 95
<210> 100 107 <211> 8
108
<210> 104
109
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
<400> 110 110
<212> PRT
<213> Homo Sapiens 111
112
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 11 L3eu Tyr Ser 50 55 60
114
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Le 1u15 Phe Pro Pro 115 120 125

Claims (38)

Patentni zahtevi
1. Antitelo koje obuhvata region za vezivanje antigena koji je sposoban da se veže za humani PD-L1, pri čemu navedeni region za vezivanje antigena koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 obuhvata VH sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VH sekvencom navedenom u: SEQ ID NO:18 i VL sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VL sekvencom navedenom u: SEQ ID NO:22.
2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, gde je navedeno antitelo monovalentno.
3. Antitelo prema zahtevu 1, gde je pomenuto antitelo dvovalentno antitelo koje ima dva regiona za vezivanje antigena sposobna da se vežu za humani PD-L1 i gde navedena dva regiona za vezivanje antigena imaju identične sekvence varijabilnog regiona.
4. Antitelo prema zahtevu 1 ili 3, gde je pomenuto antitelo bivalentno bispecifično antitelo, koje, pored pomenutog (prvog) regiona za vezivanje antigena ima sposobnost da se veže za humani PD-L1, obuhvata (drugi) region za vezivanje antigena koji ima sposobnost da se veže za drugi antigen ili za drugi epitop humanog PD-L1, pri čemu pomenuti drugi antigen nije humani CD3ε.
5. Bispecifično antitelo koje sadrži region za vezivanje antigena koji ima sposobnost da se veže za humani PD-L1 i region za vezivanje antigena koji ima sposobnost da se veže za humani CD3ε (epsilon), pri čemu region za vezivanje antigena sposoban da se veže za humani PD-L1 obuhvata VH sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VH sekvencom navedenom u: SEQ ID NO:18 i VL sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VL sekvencom navedenom u: SEQ ID NO:22.
6. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 5, gde region koji se vezuje za antigen ima sposobnost da se veže za humani CD3ε obuhvata (a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što su navedene u SEQ ID NO: 26, 27 i 28, respektivno, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što su navedene u SEQ ID NO: 30, sekvencu GTN i sekvencu kako je data u SEQ ID NO:31, respektivno.
7. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 6, pri čemu region koji se vezuje za antigen ima sposobnost da se veže za humani CD3ε obuhvata VH sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO: 25 i VL sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO: 29.
8. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 5, gde pomenuto bispecifično antitelo:
(i) ima niži afinitet za vezivanje humanog CD3ε u poređenju sa antitelom koje ima region za vezivanje antigena koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 25 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 29, poželјno pri čemu je navedeni afinitet najmanje 2 puta niži, npr. najmanje 5 puta niži, kao što je najmanje 10 puta niži, npr. najmanje 25 puta niži, kao što je najmanje 50 puta niži, i
(ii) je sposobno da posreduje u koncentracijsko-zavisnoj citotoksičnosti ćelija MDA-MB-231, PC-3 ćelija i/ili HELA ćelija kada se koriste PBMC ili prečišćene T ćelije kao efektorske ćelije, npr. kada se analizira kao što je ovde opisano u Primeru 11.
9. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 8, gde region koji se vezuje za antigen koji je sposoban da se veže za humani CD3ε obuhvata:
(i) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što su navedene u SEQ ID NOs: 99, 27 i 28, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što su navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:31, tim redom, ili
(ii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što su navedene u SEQ ID NOs: 100, 27 i 28, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što su navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:31, tim redom, ili
(iii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što su navedene u SEQ ID NOs: 26, 27 i 101, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:31, tim redom, ili
(iv) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što su navedene u SEQ ID NOs: 26, 27 i 102, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, skvencu GTN i sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:31, tim redom, ili
(v) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što su navedene u SEQ ID NOs: 26, 27 i 103, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:31, tim redom, ili
(vi) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što su navedene u SEQ ID NOs: 26, 27 i 104, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:31, tim redom, ili
(vii) varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što su navedene u SEQ ID NOs: 26, 27 i 105, tim redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) koji obuhvata CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence navedene u SEQ ID NO:30, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:31, tim redom.
10. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 8 ili 9, gde je region koji se vezuje za antigen sposoban da se veže za humani CD3ε obuhvata:
(i) VH Sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:39 i VL sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:29, ili
(ii) VH Sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:40 i VL sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:29, ili
(iii) VH Sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:41 i VL sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:29, ili
(iv) VH Sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:42 i VL sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:29, ili
(v) VH Sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:43 i VL sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:29, ili
(vi) VH Sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:44 i VL sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:29, ili
(vii) VH Sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:45 i VL sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO:29.
11. Multispecifično antitelo koje obuhvata prvi region za vezivanje antigena koji je sposoban da se veže za humani PD-L1 i drugi region za vezivanje antigena koji je sposoban da se veže za drugi antigen ili za drugačiji epitop humanog PD-L1, pri čemu je navedeni region za vezivanje antigena sposoban za vezivanje za humani PD-L1, obuhvata VH sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvenci sa VH sekvencom navedenom u: SEQ ID NO: 18 i VL sekvencu koja ima 100% identičnosti u aminokiselinskoj sekvence sa VL sekvencom koja je navedena u: SEQ ID NO:22.
12. Multispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 11, pri čemu je antitelo bispecifično.
13. Multispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 11 ili 12, gde je antitelo sposobno da veže drugi antigen i navedeni drugi antigen nije humani CD3ε.
14. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 i 3-13, pri čemu je antitelo antitelo pune dužine.
15. Antitelo prema patentnom zahtevu 14, gde je antitelo IgG1 antitelo pune dužine.
16. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je antitelo fragment antitela.
17. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo obuhvata prvi i drugi teški lanac, pri čemu svaki od navedenih, prvi i drugi, teških lanaca obuhvata najmanje zglobni region, CH2 i CH3 region, pri čemu u pomenutom prvom teškom lancu najmanje jedne od aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji izabranoj iz grupe koju čine T366, L368, K370, D399, F405, Y407 i K409 prema EU numerisanju, je supstituisana, a u navedenom drugom teškom lancu najmanje jedna od aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji izabranoj iz grupe koju čine T366, L368, K370, D399, F405, Y407 i K409 prema EU numerisanju, je supstituisana, i gde su navedeni prvi i navedeni drugi teški lanci nisu supstituisani na istim pozicijama.
18. Antitelo prema patentnom zahtevu 17, gde (i) aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 prema EU numerisanju je L u pomenutom prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 prema EU numerisanju je R u navedenom drugom teškom lancu, ili (ii) aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 prema EU numerisanju je R u navedenom prvom teškom lancu, a aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 prema EU numerisanju je L u navedenom drugom teškom lancu.
19. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde pomenuto antitelo obuhvata prvi i drugi teški lanac i gde su jedan ili oba teška lanca modifikovana tako da antitelo indukuje Fcposredovanu efektorsku funkciju u manjoj meri u odnosu na antitelo koje je identično, osim što obuhvata nemodifikovane prve i druge teške lance.
20. Antitelo prema patentnom zahtevu 17, gde se navedena efektorska funkcija posredovana sa Fc meri određivanjem ekspresije CD69 posredovane Fc, vezivanjem za Fcy receptore, vezivanjem za C1q, ili indukcijom Fc-posredovanog umrežavanja FcRs.
21. Antitelo prema patentnom zahtevu 17 ili 20, gde su konstantne sekvenci teškog i lakog lanca modifikovane tako da navedeno antitelo smanjuje ekspresiju CD69 posredovanu Fc za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% , najmanje 90%, najmanje 99% ili 100% u poređenju sa antitelom divlјeg tipa gde je pomenuta ekspresija CD69 posredovana sa Fc određena u funkcionalnom testu zasnovanom na PBMC.
22. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde pomenuto antitelo obuhvata prvi i drugi teški lanac, pri čemu u najmanje jednom od navedenih prvih i drugih teških lanaca jedna ili više aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju nisu L, L, D, N i P, tim redom.
23. Antitelo prema patentnom zahtevu 22, pri čemu su pozicije koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju F i E, tim redom, u pomenutim prvom i drugom teškom lancu.
24. Antitelo prema patentnom zahtevu 23, gde je antitelo bispecifično antitelo koje obuhvata prvi i drugi teški lanac i gde pozicije koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju, oba i prvog teškog lanca i drugog teškog lanca su F i E, tim redom, i pri čemu (i) pozicija koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju prvog teškog lanca je L, a pozicija koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju drugog teškog lanca je R, ili (ii) pozicija koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju prvog teškog lanca je R, a pozicija koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju drugog teškog lanca je L.
25. Antitelo prema patentnom zahtevu 22, gde su pozicije koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju F, E i A, tim redom, u pomenutim prvom i drugom teškom lancu.
26. Antitelo prema patentnom zahtevu 25, gde je antitelo bispecifično antitelo koje sadrži prvi i drugi teški lanac i gde pozicije koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju oba prvog teškog lanca i drugog teškog lanca su F, E i A, tim redom, i pri čemu (i) pozicija koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju prvog teškog lanca je L, a pozicija koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju drugog teškog lanca je R, ili (ii) pozicija koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju prvog teškog lanca je R, a pozicija koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 prema EU numerisanju drugog teškog lanca je L.
27. Konstrukt nukleinske kiseline koji obuhvata:
(i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu teškog lanca antitela koja obuhvata region koji se vezuje za antigen sposoban da se veže za humani PD-L1 kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, i
(ii) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu lakog lanca antitela koja obuhvata region koji se vezuje za antigen sposoban da se veže za humani PD-L1 kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.
28. Konstrukt nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 27, koji dalјe obuhvata
(i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu teškog lanca antitela koja obuhvata region koji se vezuje za antigen sposoban da se veže za humani CD3ε kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 6 do 10, i
(ii) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu lakog lanca antitela koja obuhvata region koji se vezuje za antigen sposoban da se veže za humani CD3ε kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 6 do 10.
29. Ekspresioni vektor koji obuhvata konstrukt nukleinske kiseline kao što je definisano u patentnom zahtevu 27 ili 28.
30. Ćelija domaćin koja obuhvata konstrukt nukleinske kiseline kao što je definisano u patentnom zahtevu 27 ili 28 ili vektor ekspresije kao što je definisano u patentnom zahtevu 29.
31. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 30, gde je navedena ćelija domaćina ćelija sisara, kao što je ćelija janika kineskog hrčka.
32. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 26 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
33. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 26 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 32 za upotrebu kao medikament.
34. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 26 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 32 za upotrebu u lečenju kancera.
35. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 26 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 32 za upotrebu u lečenju bolesti kancera koju karakteriše prisustvo solidnih tumora.
36. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 26 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 32 za upotrebu u lečenju bolesti kancera izabranih iz grupe koju čine: melanom, rak jajnika, rak pluća, rak debelog creva i kanceri glave i vrata.
37. Antitelo ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 33 do 36, pri čemu upotreba obuhvata kombinaciju sa jednim ili više daljih terapeutskih agenasa, kao što je hemioterapijsko sredstvo.
38. Postupak za proizvodnju antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 10 ili 12 do 26, koji sadrži korake:
a) kultivisanje ćelije domaćina koja proizvodi prvo antitelo koje sadrži region koji se vezuje za antigen sposoban da se veže za humani PD-L1 kao što je definisano u patentnom zahtevu 1 i prečišćavanje pomenutog prvog antitela iz kulture;
b) kultivisanje ćelije domaćina koja proizvodi drugo antitelo koje sadrži region koji se vezuje za antigen sposoban da se veže za drugačiji epitop PD-L1 ili drugi antigen, npr. humani CD3εvezujući region kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 6 do 10, i prečišćavanje pomenutog drugog antitela iz kulture;
c) inkubiranje navedenog prvog antitela zajedno sa navedenim drugim antitelom u redukujućim uslovima dovolјnim da omoguće da cisteini u zglobnom regionu prođu izomerizaciju disulfidne veze, i
d) dobijanje pomenutog bispecifičnog antitela.
RS20240875A 2017-03-09 2018-03-09 Antitela protiv pd-l1 RS65794B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201700164 2017-03-09
DKPA201700408 2017-07-11
EP18712124.9A EP3592769B1 (en) 2017-03-09 2018-03-09 Antibodies against pd-l1
PCT/EP2018/055977 WO2018162749A1 (en) 2017-03-09 2018-03-09 Antibodies against pd-l1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65794B1 true RS65794B1 (sr) 2024-08-30

Family

ID=61691950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240875A RS65794B1 (sr) 2017-03-09 2018-03-09 Antitela protiv pd-l1

Country Status (25)

Country Link
US (2) US20200239579A1 (sr)
EP (2) EP3592769B1 (sr)
JP (3) JP7293121B2 (sr)
KR (2) KR20250007025A (sr)
CN (2) CN116836285A (sr)
AU (2) AU2018231618B2 (sr)
BR (1) BR112019018533A2 (sr)
CA (1) CA3055127C (sr)
DK (1) DK3592769T3 (sr)
ES (1) ES2983922T3 (sr)
FI (1) FI3592769T3 (sr)
HR (1) HRP20241023T1 (sr)
HU (1) HUE067490T2 (sr)
IL (2) IL322509A (sr)
LT (1) LT3592769T (sr)
MA (1) MA49823B1 (sr)
MX (2) MX2019010583A (sr)
PL (1) PL3592769T3 (sr)
PT (1) PT3592769T (sr)
RS (1) RS65794B1 (sr)
SG (1) SG11201908088RA (sr)
SI (1) SI3592769T1 (sr)
SM (1) SMT202400323T1 (sr)
WO (1) WO2018162749A1 (sr)
ZA (1) ZA201905822B (sr)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160113158A (ko) 2014-01-27 2016-09-28 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. 폴리펩티드를 전달하는 mhc 클래스 i 항원결정기
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
JP6444486B2 (ja) * 2015-02-05 2018-12-26 モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. 志賀毒素ａサブユニットエフェクター領域を含む多価ｃｄ２０結合分子及びそれらの強化組成物
JP6771492B2 (ja) 2015-05-30 2020-10-21 モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. 脱免疫化された志賀毒素ａサブユニット足場及びそれを含む細胞標的化分子
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
TWI640536B (zh) 2016-06-20 2018-11-11 克馬伯有限公司 抗體
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
JP7075134B2 (ja) 2016-12-07 2022-05-25 モレキュラー テンプレーツ，インク． 部位特異的コンジュゲーションのための志賀毒素ａサブユニットエフェクターポリペプチド、志賀毒素エフェクター足場、及び細胞標的化分子
KR102590672B1 (ko) 2017-01-25 2023-10-18 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. 탈면역된 시가 독소 a 서브유닛 이펙터 및 cd8+ t-세포 에피토프를 포함하는 세포-표적화 분자
BR112019025188A2 (pt) 2017-06-01 2020-06-23 Cytomx Therapeutics, Inc. Anticorpos anti-pdl1 ativáveis e métodos de uso dos mesmos
WO2019025545A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 Genmab A/S BINDING AGENTS BINDING TO PD-L1 AND CD137 AND THEIR USE
MX2019009726A (es) 2018-04-17 2020-02-05 Molecular Templates Inc Moleculas con direccion hacia her2 que comprenden andamiajes de la sub-unidad a de la toxina shiga desinmunizados.
KR20210011919A (ko) 2018-04-17 2021-02-02 셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크. 항-cd27 항체 및 항-pd-l1 항체 및 이중특이적 작제물
CN109053891B (zh) 2018-09-17 2021-12-21 苏州泓迅生物科技股份有限公司 一种抗pd-l1抗体及其制备方法和应用
WO2020081493A1 (en) * 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
MA54139A (fr) * 2018-11-06 2021-09-15 BioNTech SE Formulation d'anticorps
BR112021008795A2 (pt) * 2018-11-13 2021-08-31 Compass Therapeutics Llc Construtos de ligação multiespecíficos contra moléculas de ponto de verificação e seus usos
CN114423793A (zh) 2019-09-18 2022-04-29 分子模板公司 包含志贺菌毒素a亚基支架的pd-l1结合分子
US11918649B2 (en) 2019-09-18 2024-03-05 Molecular Templates, Inc. PD-L1-binding molecules comprising Shiga toxin a subunit scaffolds
WO2021155916A1 (en) * 2020-02-04 2021-08-12 BioNTech SE Treatment involving antigen vaccination and binding agents binding to pd-l1 and cd137
WO2021156326A1 (en) * 2020-02-04 2021-08-12 Genmab A/S Antibodies for use in therapy
EP3881866A1 (en) * 2020-03-16 2021-09-22 GEMoaB GmbH A targeting module comprising pd-l1 and/or pd-l2 for use in a method for stimulating a chimeric antigen receptor mediated response in a mammal
CN116390951A (zh) * 2020-08-04 2023-07-04 埃克塞里艾克西斯公司 Pd-l1结合剂及其用途
US12180284B2 (en) 2020-12-16 2024-12-31 Molecular Templates, Inc. Clinical methods for use of a PD-L1-binding molecule comprising a Shiga toxin effector
US11814437B2 (en) * 2021-10-08 2023-11-14 Genmab A/S Antibodies binding to CD30 and CD3
US20250223361A1 (en) * 2022-04-01 2025-07-10 Mabtree Biologics Ag Human antibody or antigen binding fragment thereof specific against pd-l1 to enhance t-cell function
WO2024107731A2 (en) * 2022-11-14 2024-05-23 Ablexis, Llc Anti-pd-l1 antibodies
JP2026504180A (ja) 2023-01-30 2026-02-03 カイマブ・リミテッド 抗体
WO2025064369A1 (en) * 2023-09-18 2025-03-27 Modernatx, Inc. Humanized anti-cd3 binding molecules and uses thereof

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US835A (en) 1838-07-12 X i i i x
US6077A (en) 1849-01-30 Improved hinged claw-wrench
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
DK0979281T3 (da) 1997-05-02 2005-11-21 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele
DE60013773T2 (de) 1999-02-03 2005-11-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Methoden zur Herstellung von therapeutischen Kalziumphosphat Partikeln
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
US20100081792A1 (en) 2001-06-28 2010-04-01 Smithkline Beecham Corporation Ligand
CA2478011C (en) 2002-03-01 2013-05-21 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
EP2206517B1 (en) 2002-07-03 2023-08-02 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Immunopotentiating compositions comprising anti-PD-L1 antibodies
PT2314629E (pt) 2002-07-18 2014-01-22 Merus B V Produção recombinante de misturas de anticorpos
US20050100543A1 (en) 2003-07-01 2005-05-12 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
US7741568B2 (en) 2005-01-13 2010-06-22 The Wiremold Company Downward facing receptacle assembly for cable raceway
TWI671403B (zh) 2005-03-31 2019-09-11 中外製藥股份有限公司 控制組裝之多肽的製造方法
EA019344B1 (ru) 2005-07-01 2014-03-31 МЕДАРЕКС, Эл.Эл.Си. Человеческие моноклональные антитела против лиганда-1 запрограммированной гибели клеток (pd-l1) и их применения
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AU2006317242A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
GEP20135917B (en) 2006-03-17 2013-09-10 Biogen Idec Inc Stabilized polypeptide compositions
ES2395969T3 (es) 2006-03-24 2013-02-18 Merck Patent Gmbh Dominios de proteínas heterodiméricas genéticamente modificados
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
EP2139924B1 (en) 2007-03-29 2016-07-06 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
ES2702087T3 (es) 2007-06-21 2019-02-27 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y sus usos
JP5592792B2 (ja) 2007-09-26 2014-09-17 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 二重特異性抗体の融合体
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
WO2010015792A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Argenta Discovery Limited Nitrogen containing heterocyclic compounds useful as bifunctional modulators of m3 receptors and beta-2 receptors
BRPI0919377A2 (pt) 2008-09-26 2016-09-27 Dana Farber Cancer Inst Inc anticorpo isolado ou um fragmento ligante de antígeno do memso, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica, método de produzir o referido anticorpo ou fragmento, uso dos mesmos, e composição compreendendo o referido anticorpo ou fragmento
JP5677972B2 (ja) 2008-11-18 2015-02-25 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ヒト血清アルブミンリンカーおよびそのコンジュゲート
HUE065752T2 (hu) 2008-12-09 2024-06-28 Hoffmann La Roche Anti-PD-L1 antitestek és felhasználásuk T-sejt funkció elõsegítésére
SG172254A1 (en) 2008-12-19 2011-07-28 Macrogenics Inc Covalent diabodies and uses thereof
CN102448984A (zh) 2009-03-27 2012-05-09 酶遗传学股份有限公司 使用包含抗体-受体组合的多特异性结合蛋白的组合物和方法
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
KR101224468B1 (ko) 2009-05-20 2013-01-23 주식회사 파멥신 신규한 형태의 이중표적항체 및 그 용도
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
PT2504364T (pt) * 2009-11-24 2017-11-14 Medimmune Ltd Agentes de ligação direcionados contra b7-h1
PL2506871T3 (pl) 2009-11-30 2017-03-31 Janssen Biotech, Inc Przeciwciała ze zmutowanymi regionami Fc i utraconymi funkcjami efektorowymi
MX2012006406A (es) 2009-12-04 2012-07-25 Genentech Inc Anticuerpos multiespecificos, analogos de anticuerpo, composiciones y metodos.
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
PL2560993T3 (pl) * 2010-04-20 2024-11-04 Genmab A/S Heterodimeryczne białka zawierające region FC przeciwciała i sposoby ich wytwarzania
CA2797981C (en) 2010-05-14 2019-04-23 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
RU2608640C2 (ru) 2010-08-16 2017-01-23 Новиммун С.А. Способы получения мультиспецифичных и мультивалентных антител
RU2013110875A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, СОДЕРЖАЩИЕ СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ ДИСУЛЬФИДОМ ФРАГМЕНТ Fv
RU2013110876A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Рош Гликарт Аг Активируемые биспецифические антитела
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
CN102250246A (zh) 2011-06-10 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
HUE044633T2 (hu) 2011-10-27 2019-11-28 Genmab As Heterodimer fehérjék elõállítása
KR101981873B1 (ko) 2011-11-28 2019-05-23 메르크 파텐트 게엠베하 항-ｐｄ-ｌ1 항체 및 그의 용도
DK2838917T3 (da) 2012-04-20 2019-08-26 Merus Nv Fremgangsmåder og midler til frembringelse af heterodimere ig-lignende molekyler
MY174248A (en) 2012-04-30 2020-04-01 Biocon Ltd Targeted/immunomodulatory fusion proteins and methods for making same
US9212224B2 (en) 2012-05-15 2015-12-15 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies that bind PD-L1 and uses thereof
CN104936982B (zh) 2012-08-03 2020-04-24 丹娜法伯癌症研究院 抗-pd-l1和pd-l2双结合抗体单一试剂及其使用方法
CA2886433C (en) * 2012-10-04 2022-01-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human monoclonal anti-pd-l1 antibodies and methods of use
ES2744267T3 (es) 2012-11-21 2020-02-24 Pharmabcine Inc Anticuerpo de doble diana que se dirige a VEGFR-2 y DLL4, y composición farmacéutica que comprende el mismo
HUE048722T2 (hu) * 2013-07-05 2020-08-28 Genmab As Humanizált vagy kiméra CD3 ellenanyagok
CN105669862A (zh) * 2014-11-21 2016-06-15 上海中信国健药业股份有限公司 抗人pd-l1/kir双特异性抗体及其制备方法和应用
AU2016293073B2 (en) * 2015-07-15 2022-12-22 Genmab A/S Humanized or chimeric CD3 antibodies
WO2019025545A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 Genmab A/S BINDING AGENTS BINDING TO PD-L1 AND CD137 AND THEIR USE

Also Published As

Publication number Publication date
US20240317861A1 (en) 2024-09-26
AU2018231618B2 (en) 2025-02-13
EP4527854A2 (en) 2025-03-26
DK3592769T3 (da) 2024-08-12
JP7640614B2 (ja) 2025-03-05
CN116836285A (zh) 2023-10-03
FI3592769T3 (fi) 2024-07-30
MX2024006992A (es) 2024-06-19
CN110573524B (zh) 2023-07-18
MX2019010583A (es) 2019-11-25
WO2018162749A1 (en) 2018-09-13
SG11201908088RA (en) 2019-10-30
LT3592769T (lt) 2024-08-26
HRP20241023T1 (hr) 2024-11-08
CA3055127A1 (en) 2018-09-13
PL3592769T3 (pl) 2024-10-14
IL269002B1 (en) 2025-09-01
IL322509A (en) 2025-10-01
KR102745587B1 (ko) 2024-12-24
MA49823B1 (fr) 2024-08-30
EP3592769B1 (en) 2024-05-08
PT3592769T (pt) 2024-07-31
ZA201905822B (en) 2024-01-31
JP2020511133A (ja) 2020-04-16
CN110573524A (zh) 2019-12-13
JP2023116610A (ja) 2023-08-22
ES2983922T3 (es) 2024-10-28
IL269002B2 (en) 2026-01-01
EP4527854A3 (en) 2025-06-25
IL269002A (en) 2019-10-31
KR20250007025A (ko) 2025-01-13
JP2025081535A (ja) 2025-05-27
US20200239579A1 (en) 2020-07-30
NZ757193A (en) 2025-07-25
AU2018231618A1 (en) 2019-10-03
JP7293121B2 (ja) 2023-06-19
KR20190128667A (ko) 2019-11-18
AU2025203350A1 (en) 2025-05-29
CA3055127C (en) 2025-12-16
BR112019018533A2 (pt) 2020-04-14
SMT202400323T1 (it) 2024-11-15
SI3592769T1 (sl) 2024-10-30
HUE067490T2 (hu) 2024-10-28
MA49823A (fr) 2021-04-21
EP3592769A1 (en) 2020-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7640614B2 (ja) Ｐｄ－ｌ１に対する抗体
JP7596342B2 (ja) Ｃｄ３およびｃｄ２０に対する二重特異性抗体
HK40101651A (zh) 针对pd-l1的抗体
HK40021859A (en) Antibodies against pd-l1
HK40021859B (en) Antibodies against pd-l1
HK40074511A (en) Bispecific antibodies against cd3 and cd20
EA048744B1 (ru) Антитела против pd-l1
BR122024010593A2 (pt) Método para produzir um anticorpo biespecífico
BR122024010585A2 (pt) Uso de um anticorpo biespecífico