RS65802B1 - Kompozicije i postupci za lečenje egfr pozitivnih kancera - Google Patents

Kompozicije i postupci za lečenje egfr pozitivnih kancera

Info

Publication number
RS65802B1
RS65802B1 RS20240748A RSP20240748A RS65802B1 RS 65802 B1 RS65802 B1 RS 65802B1 RS 20240748 A RS20240748 A RS 20240748A RS P20240748 A RSP20240748 A RS P20240748A RS 65802 B1 RS65802 B1 RS 65802B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sequence
receptor
cells
cell
seq
Prior art date
Application number
RS20240748A
Other languages
English (en)
Inventor
Julyun Oh
Han Xu
Carl Alexander Kamb
Original Assignee
A2 Biotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by A2 Biotherapeutics Inc filed Critical A2 Biotherapeutics Inc
Publication of RS65802B1 publication Critical patent/RS65802B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4203—Receptors for growth factors
    • A61K40/4204—Epidermal growth factor receptors [EGFR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
POVEZANE PRIJAVE
[0001] Ova prijava se poziva na prioritet U.S. privremene prijave br.63/068,249, podnete 20. avgusta 2020; U.S. privremene prijave br.63/105,639, podnete 26. oktobra 2020. i U.S. privremene prijave br.
63/230,632, podnete 6. avgusta 2021.
OBLAST TEHNIKE
[0002] Ova prijava se generalno odnosi na dizajnirane receptore i kompozicije sa imunskim ćelijama koje obuhvataju pomenute receptore za upotrebu u primenama ćelijske terapije.
POZIVANJE NA LISTU SEKVENCI
[0003] Stav prijave sa listom sekvenci sadrži listu sekvenci, koja je podneta u ASCII formatu preko EFS-WEB-a. Pomenuta ASCII verzija, kreirana 17. avgusta 2021. nosi naziv A2BI_021_02WO_SeqList_ST25.txt i ima 675 KB.
POZADINA
[0004] Ćelijska terapija je moćan alat za lečenje raznih bolesti, naročito kancera. U konvencionalnim adoptivnim ćelijskim terapijama, imunske ćelije se dizajniraju da eksprimuju specifične receptore, na primer himerne antigenske receptore (CAR) ili T-ćelijske receptore (TCR), koji usmeravaju dejstvo imunskih ćelija ka ćelijskim ciljevima putem dovođenja receptora u interakciju sa ligandom kog eksprimuje ciljna ćelija. Na primer, WO 2020/065406 A2 obezbeđuje postupak za identifikovanje ciljnog para koji obuhvata i) inhibitorni himerni antigenski receptor (iCAR) ili protektivni himerni antigenski receptor (pCAR), pri čemu je iCAR ili pCAR cilj usmeren ka ciljnom ekstracelularnom polimorfnom epitopu i ii) aktivirajući himerni antigenski receptor (aCAR), gde je taj CAR usmeren ka ciljnom nepolimorfnom membranskom epitopu proteina, kao i postupke za izradu i upotrebu takvih parova u lečenju kancera. Međutim, i dalje je problematično identifikovanje prikladnih ciljnih molekula jer se mnogi ciljevi eksprimuju u normalnim tkivima. Ta ekspresija može dovesti do toksičnosti kada transplantovane ćelije ciljaju normalna tkiva koja eksprimuju ciljne molekule. Zbog toga, u tehnici, postoji potreba za kompozicijama i postupcima korisnim u lečenju bolesti, naročito kancera, adoptivnom ćelijskom terapijom.
KRATAK SADRŽAJ
[0005] Ovo otkrivanje obezbeđuje kompozicije i postupke za povećanje specifičnosti imunskih ćelija koje se koriste u adoptivnoj ćelijskoj terapiji. Ovo otkrivanje obezbeđuje imunske ćelije koje obuhvataju sistem dvaju receptora koji povećava specifičnost imunskih ćelija za ciljne ćelije koje eksprimuju ciljni antigen. Imunske ćelije obuhvataju prvi, receptor aktivatora koji aktivira imunske ćelije kao odgovor na vezivanje prvog receptora od strane ciljnog antigena. Imunske ćelije obuhvataju i drugi, inhibitorni receptor specifičan za neciljni antigen. Taj drugi receptor inhibira aktiviranje imunskih ćelija kada neciljni antigen veže drugi receptor, čak i ako ciljni antigen veže prvi receptor.
[0006] Ovaj pronalazak obezbeđuje imunsku ćeliju, koja obuhvata: a.) prvi receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR) i b.) drugi receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za neciljni antigen koji nestaje kod EGFR+ kancera usled gubitka heterozigotnosti, pri čemu prvi receptor predstavlja receptor aktivatora osetljiv na EGFR i pri čemu drugi receptor predstavlja inhibitorni receptor osetljiv na neciljni antigen, gde ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora specifično vezuje HLA-A*02 i pri čemu ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDR) CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 SEQ ID NO: 154, 155, 156, 151, 152 i 153 i gde ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata regione koji određuju komplementarnost CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 sekvence humanizovanog scFv vezujućeg domena C-002162 PA2.1.14 kao što je prikazano u tabeli 4, pri čemu je CDR-L1 sekvenca RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 101), CDR-L2 sekvenca je KVSNRFSGVPAR, CDR-L3 sekvenca je FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 103), CDR-H1 sekvenca je ASGYTFTSYHIH (SEQ ID NO: 104), CDR-H2 sekvenca je WIYPGNVNTEYNEKFKGK (SEQ ID NO: 105) i CDR-H3 sekvenca je EEITYAMDY (SEQ ID NO: 106), pri čemu imunska ćelija predstavlja CD8+ CD4- T-ćeliju ili CD8-CD4+ T-ćeliju.
[0007] Ovde je opisano da ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora specifično vezuje alelsku varijantu MHC proteina. Ovde je opisano da ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora specifično vezuje alelsku varijantu HLA-A, HLA-B ili HLA-C proteina. Prema ovom pronalasku, ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora specifično vezuje HLA-A*02. Ovde je opisano da ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora specifično vezuje HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*11, HLA-C*07 ili HLA-B*07.
[0008] Ovde je opisano da ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDR) CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 kao što je prikazano u tabeli 5 ili CDR sekvence sa najviše 1, 2 ili 3 supstitucije, brisanja ili umetanja u odnosu na CDR-ove iz tabele 5.
[0009] Ovde je opisano da ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDR) CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 SEQ ID NO: 101-106 ili SEQ ID NO: 106-112 ili CDR sekvence sa najviše 1, 2 ili 3 supstitucije, brisanja ili umetanja u odnosu na CDR-ove iz tabele 5. Prema ovom pronalasku, ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata regione koji određuju komplementarnost CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 sekvence humanizovanog scFv vezujućeg domena C-002162 PA2.1.14 kao što je prikazano u tabeli 4, pri čemu je CDR-L1 sekvenca RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 101), CDR-L2 sekvenca je KVSNRFSGVPAR, CDR-L3 sekvenca je FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 103), CDR-H1 sekvenca je ASGYTFTSYHIH (SEQ ID NO: 104), CDR-H2 sekvenca je WIYPGNVNTEYNEKFKGK (SEQ ID NO: 105) i CDR-H3 sekvenca je EEITYAMDY (SEQ ID NO: 106).
[0010] Ovde je opisano da ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata polipeptidnu sekvencu odabranu iz polipeptidne sekvence prikazane u tabeli 4 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična. Ovde je opisano da ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata bilo koju od SEQ ID NO: 89-100 ili sekvence koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata SEQ ID NO: 93 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična.
[0011] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, prvi receptor predstavlja himerni antigenski receptor (CAR).
[0012] Ovde je opisano i da ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata varijabilni teški (VH) deo koji obuhvata skup regiona teškog lanca koji određuju komplementarnost (HC-CDR) odabran iz grupe sekvenci izloženih u tabeli 3 i/ili varijabilni laki (VL) deo koji obuhvata skup regiona lakog lanca koji određuju komplementarnost (LC-CDR) iz grupe sekvenci izloženih u tabeli 3 ili CDR sekvence sa najviše 1, 2, 3, 4 supstitucije, umetanja ili brisanja u svakom CDR-u.
[0013] Ovde je opisano i da ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata varijabilni teški (VH) deo sa sekvencom odabranom iz VH sekvence izložene u tabeli 2 i/ili varijabilni laki (VL) deo koji obuhvata sekvencu izloženu u tabeli 2 ili sekvence koje su im najmanje 70%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% identične.
[0014] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata varijabilni teški (VH) deo sa sekvencom odabranom iz VH sekvence izložene u SEQ ID NO: 149 i/ili varijabilni laki (VL) deo koji obuhvata sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 150 ili sekvence koje su im najmanje 70%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% identične.
[0015] Ovde je opisano i da ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora koji obuhvata sekvencu odabranu iz grupe sekvenci izloženih u tabeli 1 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična.
[0016] Ovde je opisano i da ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata scFv sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 9-18 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična.
[0017] U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata scFv sekvencu SEQ ID NO: 18 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična.
[0018] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, drugi receptor obuhvata LILRB1 intracelularni domen ili njegovu funkcionalnu varijantu. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, LILRB1 intracelularni domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99% ili potpuno identična SEQ ID NO: 129.
[0019] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, drugi receptor obuhvata LILRB1 transmembranski domen ili njegovu funkcionalnu varijantu. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, LILRB1 transmembranski domen ili njegova funkcionalna varijanta obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99% ili potpuno identična SEQ ID NO: 133.
[0020] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, drugi receptor obuhvata LILRB1 zglobni domen ili njegovu funkcionalnu varijantu. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, LILRB1 zglobni domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99% ili potpuno identična SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126.
[0021] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, drugi receptor obuhvata LILRB1 intracelularni domen, LILRB1 transmembranski domen, LILRB1 zglobni domen, funkcionalnu varijantu bilo kog od njih ili njihove kombinacije. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, LILRB1 intracelularni domen i LILRB1 transmembranski domen obuhvataju SEQ ID NO: 128 ili sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 128.
[0022] U nekim je načinima ostvarivanja ovog pronalaska imunska ćelija ovog pronalaska za upotrebu u lečenju EGFR+ kancera. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, EGFR+ kancer predstavlja EGFR+ tumor sa gubitkom heterozigotnosti u lokusu koji kodira neciljni antigen i/ili EGFR+ kancer obuhvata ćelije EGFR+ kancera sa gubitkom heterozigotnosti u lokusu MHC klase I. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, ćelija EGFR+ kancera je ćelija kancera pluća, ćelija sitnoćelijskog kancera pluća, ćelija nesitnoćelijskog kancera pluća, ćelija duktalnog karcinoma pankreasa, ćelija kolorektalnog kancera, ćelija kancera glave i vrata, ćelija adenokarcinoma jednjaka i želuca, ćelija kancera jajnika, ćelija multiformnog glioblastoma, ćelija karcinoma skvamoznih ćelija grlića materice, ćelija kancera bubrega, ćelija papilarnog kancera bubrega, ćelija svetloćelijskog karcinoma bubrega, ćelija kancera bešike, ćelija kancera dojke, ćelija kancera žučnih kanala, ćelija kancera jetre, ćelija kancera prostate, ćelija sarkoma, ćelija kancera štitne žlezde, ćelija kancera grudne žlezde, ćelija kancera želuca ili ćelija kancera materice.
[0023] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, ćelija EGFR+ kancera predstavlja EGFR+/HLA-A*02- ćeliju kancera koja ne eksprimuje HLA-A*02 ili ćeliju kancera dobijenu od osobe sa HLA-A*02+, koja ne eksprimuje HLA-A*02. U nekim je načinima ostvarivanja ovog pronalaska EGFR+/HLA-A*02- ćelija kancera dobijena od EGFR+/HLA-A*02+ ćelije gubitkom heterozigotnosti na HLA-A što vodi gubitku HLA-A*02.
[0024] U nekim načinima ostvarivanja, prvi receptor i drugi receptor zajedno specifično aktiviraju imunsku ćeliju u prisustvu EGFR/HLA-A*02- ćelije kancera sa gubitkom heterozigotnosti.
[0025] U nekim načinima ostvarivanja, prvi receptor i drugi receptor zajedno ne aktiviraju specifično imunsku ćeliju u prisustvu EGFR+ ćelije koja nije izgubila HLA-A*02 gubitkom heterozigotnosti.
[0026] Ovde je takođe opisano da imunska ćelija predstavlja T-ćeliju, makrofag, NK ćeliju, iNKT-ćeliju ili gama delta T-ćeliju. Prema ovom pronalasku, T-ćelija je CD8+ CD4- T-ćelija ili CD8- CD4+ T-ćelija.
[0027] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, imunska ćelija takođe obuhvata redukovanu ili eliminisanu ekspresiju i/ili funkciju gena MHC klase I.
[0028] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, gen MHC klase I predstavlja beta-2-mikroglobulin (B2M).
[0029] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, imunska ćelija obuhvata i polinukleotid koji obuhvata interferirajuću RNK, gde ta interferirajuća RNK obuhvata sekvencu koja je komplementarna sekvenci B2M iRNK (SEQ ID NO: 172). U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, interferirajuća RNK može indukovati RNKi posredovanu degradaciju B2M iRNK. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, interferirajuća RNK predstavlja RNK sa strukturom ukosnice (shRNK). U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, shRNK obuhvata: a.) prvu sekvencu, koja od 5’ kraja do 3’ kraja ima sekvencu komplementarnu sekvenci B2M iRNK i b.) drugu sekvencu, koja od 5’ kraja do 3’ kraja ima sekvencu komplementarnu prvoj sekvenci, pri čemu prva sekvenca i druga sekvenca obrazuju shRNK.
[0030] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, imunska ćelija obuhvata jednu modifikaciju sekvence koja kodira B2M (SEQ ID NO: 170) ili više njih, pri čemu jedna modifikacija ili više njih redukuje(u) ekspresiju i/ili eliminiše(u) funkciju B2M. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, jedna modifikacija ili više njih obuhvata(ju) jednu inaktivišuću mutaciju endogenog gena koji kodira B2M ili više njih. U nekim načinima ostvarivanja, jedna inaktivišuća mutacija ili više njih obuhvata(ju) brisanje, umetanje, supstituciju ili mutaciju pomeranja okvira čitanja. U nekim je(su) načinima ostvarivanja ovog pronalaska jedna inaktivišuća mutacija ili više njih uvedena(e) endonukleazom koja je vođena nukleinskom kiselinom u kompleks sa najmanje jednom nukleinskom kiselinom vodičem (gNK) koja specifično cilja sekvencu endogenog gena koji kodira B2M (SEQ ID NO: 170).
[0031] U jednom načinu ostvarivanja, gen MHC klase I predstavlja HLA-A*02.
[0032] Ovde je opisano da imunska ćelija obuhvata i polinukleotid koji obuhvata interferirajuću RNK, koja obuhvata sekvencu komplementarnu sekvenci HLA-A*02 iRNK (SEQ ID NO: 171). Ovde je opisano i da interferirajuća RNK može indukovati RNK interferencijom (RNKi) posredovanu degradaciju HLA-A*02 iRNK. Ovde je opisano i da interferirajuća RNK predstavlja RNK sa strukturom ukosnice (shRNK) koja obuhvata: a.) prvu sekvencu, koja od 5’ kraja do 3’ kraja ima sekvencu komplementarnu sekvenci HLA-A*02 iRNK i b.) drugu sekvencu, koja od 5’ kraja do 3’ kraja ima sekvencu komplementarnu prvoj sekvenci, pri čemu prva sekvenca i druga sekvenca obrazuju shRNK.
[0033] Ovde je opisano da imunska ćelija obuhvata jednu modifikaciju sekvence endogenog gena koji kodira HLA-A*02 (SEQ ID NO: 169) ili više njih, pri čemu jedna modifikacija ili više njih redukuje(u) ekspresiju i/ili eliminiše(u) funkciju HLA-A*02. Ovde je opisano i da jedna modifikacija ili više njih obuhvata(ju) jednu inaktivišuću mutaciju endogenog gena koji kodira HLA-A*02 ili više njih. Ovde je opisano i da jedna inaktivišuća mutacija ili više njih obuhvata(ju) brisanje, umetanje, supstituciju ili mutaciju pomeranja okvira čitanja. Ovde je opisano i da je(su) jedna inaktivišuća mutacija ili više njih uvedena(e) endonukleazom koja je vođena nukleinskom kiselinom u kompleks sa najmanje jednom nukleinskom kiselinom vodičem (gNK) koja specifično cilja sekvencu endogenog gena koji kodira HLA-A*02.
[0034] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 177 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta, a drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 174 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0035] Ovde je takođe otkriveno da prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 177 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta, a drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 173 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0036] Ovde je takođe otkriveno da prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 175 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta, a drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 174 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0037] Ovde je takođe otkriveno da prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 175 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta, a drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 173 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0038] Ovde je takođe otkriveno da prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 176 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta, a drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 173 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0039] Ovde je takođe otkriveno da prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 176 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta, a drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 173 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0040] Ovde je takođe otkriveno da imunska ćelija obuhvata i T2A samocepajući peptid, pri čemu T2A samocepajući peptid obuhvata SEQ ID NO: 178 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0041] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, imunska ćelija takođe obuhvata interferirajuću RNK, pri čemu ta interferirajuća RNK obuhvata SEQ ID NO: 179 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0042] U nekim je načinima ostvarivanja ovog pronalaska imunska ćelija autologna. U nekim je načinima ostvarivanja ovog pronalaska imunska ćelija alogena.
[0043] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju, koja obuhvata terapijski efektivnu količinu imunskih ćelija prema ovom pronalasku. U nekim načinima ostvarivanja, imunska ćelija eksprimuje i prvi receptor i drugi receptor. U nekim načinima ostvarivanja, najmanje oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90% ili oko 95% imunskih ćelija eksprimuje i prvi receptor i drugi receptor. U nekim načinima ostvarivanja, najmanje 90% imunskih ćelija eksprimuje i prvi receptor i drugi receptor. U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija obuhvata i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens. U nekim je načinima ostvarivanja ovog pronalaska farmaceutska kompozicija prema ovom pronalasku za upotrebu u lečenju EGFR+ kancera.
[0044] Ovde je takođe opisan polinukleotid ili polinukleotidni sistem, koji obuhvata jedan polinukleotid ili više njih koji obuhvata(ju) polinukleotidne sekvence koje kodiraju: a.) prvi receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za receptor endotelnog faktora rasta (EGFR) i b.) drugi receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za neciljni antigen koji nestaje kod ćelija EGFR+ kancera usled gubitka heterozigotnosti, pri čemu prvi receptor predstavlja receptor aktivatora osetljiv na EGFR kod ćelija EGFR+ kancera i pri čemu drugi receptor predstavlja inhibitorni receptor osetljiv na neciljni antigen.
[0045] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji obuhvata polinukleotidne sekvence koje kodiraju prvi receptor i drugi receptor za stvaranje imunskih ćelija prema ovom pronalasku.
[0046] U nekim načinima ostvarivanja polinukleotida, taj polinukleotid obuhvata sekvencu koja kodira shRNK specifičnu za B2M. U nekim načinima ostvarivanja, isti polinukleotid kodira sekvence koje kodiraju prvi receptor, drugi receptor i shRNK specifičan za B2M.
[0047] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje vektor, koji obuhvata polinukleotid prema ovom pronalasku.
[0048] U jednom aspektu, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje imunsku ćeliju prema ovom pronalasku za upotrebu u lečenju EGFR+ kancera. U jednom načinu ostvarivanja, EGFR+ kancer predstavlja EGFR+ tumor sa gubitkom heterozigotnosti u lokusu koji kodira neciljni antigen. U jednom načinu ostvarivanja, EGFR+ kancer obuhvata ćelije EGFR+ kancera sa gubitkom heterozigotnosti u lokusu MHC klase I.
[0049] U nekim načinima ostvarivanja, ćelija EGFR+ kancera je ćelija kancera pluća, ćelija sitnoćelijskog kancera pluća, ćelija nesitnoćelijskog kancera pluća, ćelija duktalnog karcinoma pankreasa, ćelija kolorektalnog kancera, ćelija kancera glave i vrata, ćelija adenokarcinoma jednjaka i želuca, ćelija kancera jajnika, ćelija multiformnog glioblastoma, ćelija karcinoma skvamoznih ćelija grlića materice, ćelija kancera bubrega, ćelija papilarnog kancera bubrega, ćelija svetloćelijskog karcinoma bubrega, ćelija kancera bešike, ćelija kancera dojke, ćelija kancera žučnih kanala, ćelija kancera jetre, ćelija kancera prostate, ćelija sarkoma, ćelija kancera štitne žlezde, ćelija kancera grudne žlezde, ćelija kancera želuca ili ćelija kancera materice. U nekim načinima ostvarivanja, ćelija EGFR+ kancera je ćelija kancera pluća.
[0050] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, ćelija EGFR+ kancera predstavlja EGFR+/HLA-A*02- ćeliju kancera koja ne eksprimuje HLA-A*02 ili ćeliju kancera dobijenu od osobe sa HLA-A*02+, koja ne eksprimuje HLA-A*02. U nekim je načinima ostvarivanja ovog pronalaska EGFR+/HLA-A*02- ćelija kancera dobijena od EGFR+/HLA-A*02+ ćelije gubitkom heterozigotnosti na HLA-A što vodi gubitku HLA-A*02.
[0051] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje imunsku ćeliju prema ovom pronalasku za upotrebu u lečenju EGFR+ kancera. U jednom načinu ostvarivanja, EGFR+ kancer predstavlja EGFR+ tumor sa gubitkom heterozigotnosti u lokusu koji kodira neciljni antigen. U jednom načinu ostvarivanja, EGFR+ kancer obuhvata ćelije EGFR+ kancera sa gubitkom heterozigotnosti u lokusu MHC klase I.
[0052] Ovde je opisano da je subjekat heterozigotni HLA-A*02 pacijent sa malignitetom koji eksprimuje EGFR i bez ekspresije HLA-A*02.
[0053] Ovde je opisano da je subjekat heterozigotni HLA-A*02 pacijent sa rekurentnim neresektabilnim ili metastatskim solidnim tumorima koji eksprimuju EGFR i bez ekspresije HLA-A*02.
[0054] Ovde je opisan postupak za lečenje kancera kod subjekta, koji obuhvata: a.) utvrđivanje genotipa ili nivoa ekspresije neciljnog antigena u nemalignim ćelijama i ćelijama kancera subjekta; b.) utvrđivanje nivoa ekspresije EGFR-a u ćelijama kancera subjekta i c.) davanje efektivne količine ovde opisane imunske ćelije ili ovde opisane farmaceutske kompozicije subjektu ukoliko nemaligne ćelije eksprimuju neciljni antigen, a ćelije kancera ne eksprimuju neciljni antigen i te su ćelije kancera EGFR pozitivne.
[0055] Ovde je opisano da davanje ovde opisane imunske ćelije ili ovde opisane farmaceutske kompozicije redukuje veličinu tumora kod subjekta.
[0056] Ovde je opisano da se tumor redukuje za oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili oko 100%. Ovde je opisano da se tumor eliminiše.
[0057] Ovde je opisano da davanje imunske ćelije ili farmaceutske kompozicije zaustavlja rast tumora kod subjekta. Ovde je opisano da davanje ovde opisane imunske ćelije ili ovde opisane farmaceutske kompozicije redukuje broj tumora kod subjekta.
[0058] Ovde je opisano da davanje imunske ćelije ili farmaceutske kompozicije dovodi do selektivnog ubijanja ćelije kancera, ali ne i normalne ćelije kod subjekta. Ovde je opisano da najmanje oko 60% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 65% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 70% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 75% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 80% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 85% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 90% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 95% ubijenih ćelija čine ćelije kancera ili oko 100% ubijenih ćelija čine ćelije kancera.
[0059] Ovde je opisano da davanje imunske ćelije ili farmaceutske kompozicije dovodi do ubijanja od oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90% ili svih ćelija kancera subjekta. U nekim načinima ostvarivanja, ćelija kancera obuhvata ćeliju kancera pluća, ćeliju sitnoćelijskog kancera pluća, ćeliju nesitnoćelijskog kancera pluća, ćeliju duktalnog karcinoma pankreasa, ćeliju kolorektalnog kancera, ćeliju kancera glave i vrata, ćeliju adenokarcinoma jednjaka i želuca, ćeliju kancera jajnika, ćeliju multiformnog glioblastoma, ćeliju karcinoma skvamoznih ćelija grlića materice, ćeliju kancera bubrega, ćeliju papilarnog kancera bubrega, ćeliju svetloćelijskog karcinoma bubrega, ćeliju kancera bešike, ćeliju kancera dojke, ćeliju kancera žučnih kanala, ćeliju kancera jetre, ćeliju kancera prostate, ćeliju sarkoma, ćeliju kancera štitne žlezde, ćeliju kancera grudne žlezde, ćeliju kancera želuca ili ćeliju kancera materice. Ovde je opisano da davanje imunske ćelije ili farmaceutske kompozicije izaziva manje nuspojava kod subjekta od davanja na drugi način ekvivalentne imunske ćelije koja obuhvata prvi receptor aktivatora, ali ne i drugi inhibitorni receptor.
[0060] Ovde je takođe opisan postupak za izradu većeg broja imunskih ćelija, koji obuhvata: a.) obezbeđivanje većeg broja imunskih ćelija i b.) transformisanje većeg broja imunskih ćelija ovde opisanim polinukleotidnim sistemom ili ovde opisanim vektorom.
[0061] U jednom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje komplet koji obuhvata ovde opisanu imunsku ćeliju ili ovde opisanu farmaceutsku kompoziciju. Kao što je ovde opisano, komplet obuhvata i uputstva za upotrebu.
Ovaj pronalazak je definisan u pridruženim patentnim zahtevima.
KRATAK OPIS NACRTA
[0062] Patentni ili prijavni spis sadrži najmanje jedan crtež izveden u boji. Verzije ove objave patenta ili patentne prijave sa crtežom(ima) u boji obezbediće Zavod po zahtevu i plaćanju neophodne takse.
FIG.1A je grafik koji prikazuje da EGFR+/HLA-A*02-HeLa ciljne ćelije, ali ne i EGFR+/HLA-A*02+-HeLa ciljne ćelije, aktiviraju Jurkat ćelije koje eksprimuju EGFR CAR aktivator i HLA-A*02 LIR-1 blokator.
FIG.1B je par grafika fluorescencijom aktiviranih sortiranja ćelija (FACS) koji prikazuju ekspresiju receptora aktivatora (CT479) i blokatora (C1765) na Jurkat ćelijama.
FIG.1C je par grafika koji prikazuju ekspresiju antigena aktivatora (EGFR) i antigena blokatora (HLA-A*02) na HeLa ćelijama. Ekspresija HLA-A*02 detektovana je pomoću BB7.2 antitela. FIG.2A prikazuje ekspresiju HLA-A*02 na HeLa ćelijama transdukovanim pomoću HLA-A*02 i HCT116 ćelijama. HeLa i HCT1116 ćelije obeležene su antiHLA-A2 antitelom BB7.2 i FACs sortirane. Zeleno: neobeležene HeLa; narandžasto: neobeležene HCT116; plavo: HCT116 divljeg tipa obeležene pomoću BB7.2; crveno: HeLa ćelije transdukovane pomoću HLA-A*02 i obeležene pomoću BB7.2.
FIG.2B prikazuje ekspresiju EGFR-a na HeLa ćelijama i HCT116 ćelijama. HeLa i HCT1116 ćelije obeležene su antiEGFR antitelom. Zeleno: neobeležene HeLa; narandžasto: neobeležene HCT1116; plavo: HCT116 divljeg tipa obeležene pomoću antiEGFR; crveno: HeLa ćelije transdukovane pomoću HLA-A*02 i obeležene pomoću antiEGFR.
FIG.3A prikazuje EGFR CAR aktiviranje Jurkat ćelija koje eksprimuju EGFR CAR, kada se kokultivišu sa HCT116 ciljnim ćelijama.
FIG.3B pokazuje da se EGFR CAR aktiviranje Jurkat ćelija može blokirati HLA-A*02 LIR-1 inhibitornim receptorom. Koekspresija EGFR CAR i HLA-A*02 LIR-1 inhibitornog receptora od strane Jurkat ćelija dovodi do povećanja u CAREMAXod približno 1,8x kada se Jurkat ćelije izlože HCT116 ciljnim ćelijama koje eksprimuju EGFR i HLA-A*02.
FIG.3C prikazuje EGFR CAR aktiviranje Jurkat ćelija koje eksprimuju EGFR CAR, kada se kokultivišu sa HeLa ciljnim ćelijama.
FIG.3D pokazuje da se EGFR CAR aktiviranje Jurkat ćelija može blokirati HLA-A*02 LIR-1 inhibitornim receptorom. Koekspresija EGFR CAR i HLA-A*02 LIR-1 inhibitornog receptora od strane Jurkat ćelija dovodi do povećanja u CAR EMAXod približno 5,4x kada se Jurkat ćelije izlože HeLa ciljnim ćelijama koje eksprimuju EGFR i HLA-A*02.
FIG.4A prikazuje titraciju antigena aktivatora u analizi na bazi perli kako bi se utvrdila optimalna količina antigena aktivatora.
FIG.4B prikazuje titraciju antigena blokatora u analizi na bazi perli kako bi se utvrdio optimalni odnos antigena aktivatora spram blokatora.
FIG.5 predstavlja niz grafika i tabelu koji pokazuju da je primećen različit stepen blokiranja kada se HLA-A*02 scFv LIR1 inhibitor koristio sa različitim EGFR scFv CAR aktivatorima u primarnim T-ćelijama.
FIG.6A je niz grafika koji pokazuju da je primećen različit stepen blokiranja kada su se dva različita HLA-A*02 scFv LIR1 inhibitora koristila sa različitim EGFR scFv CAR aktivatorima u primarnim T-ćelijama.
FIG.6B je niz grafika koji pokazuju osetljivost aktivirajućih i inhibitornih receptora kada se različiti parovi aktivirajućih i inhibitornih receptora koeksprimuju. Količina aktivatora ili neciljnog antigena u ciljnim ćelijama varira pomoću iRNK titracije.
FIG.6C je niz dijagrama koji pokazuju maksimalno specifično ubijanje (%) ciljnih ćelija od strane ćelija koje eksprimuju receptor aktivatora koji cilja EGFR i bilo humanizovanog inhibitornog receptora ili mišjeg inhibitornog receptora. Prikazan je i odnos selektivnosti ciljnih tumorskih ćelija spram normalnih ćelija za svaki par receptora aktivatora i inhibitora.
FIG.7 je niz grafika koji pokazuju citotoksičnost T-ćelija koje eksprimuju bilo EGFR scFv CAR ili EGFR scFv CAR i HLA-A*02 scFv LIR1 inhibitorne receptore koji su kokultivisani sa HeLa ćelijama u odnosu 1:1. A tumorske ćelije: HeLa ćelije koje eksprimuju EGFR, a ne eksprimuju HLA-A*02; AB normalne ćelije: HeLa ćelije eksprimuju EGFR i HLA-A*02; A-B- normalne ćelije: HeLa ćelije koje nisu eksprimovale ni EGFR niti HLA-A*02; B normalne ćelije: HeLa ćelije koje eksprimuju HLA-A*02, ali ne i EGFR. Y osa prikazuje zeleno područje, koje je proporcionalno zdravim HeLa ćelijama u analizi. UTD: netransdukovane.
FIG.8 je niz grafika koji pokazuju obogaćivanje primarnih T-ćelija koje eksprimuju receptori blokatora i aktivatora (gornji red) i citotoksično dejstvo tih T-ćelija koje eksprimuju EGFR scFv CAR ili su EGFR scFv CAR i HLA-A*02 scFv LIR1 inhibitorni receptor pomešani 1: 1 sa HeLa ćelijama koje eksprimuju bilo EGFR (Cilj A) ili EGFR i HLA-A*02 (Cilj AB).
FIG.9 je niz grafika koji pokazuju citotoksičnost T-ćelija koje eksprimuju bilo EGFR scFv CAR ili EGFR scFv CAR i HLA-A*02 scFv LIR1 inhibitorni receptor, koji su pomešani 1: 1 sa HeLa ćelijama koje eksprimuju bilo EGFR, HLA-A*02 ili oba. A tumorske ćelije: HeLa ćelije koje eksprimuju EGFR, a ne eksprimuju HLA-A*02; AB normalne ćelije: HeLa ćelije ekspresija EGFR i HLA-A*02; B normalne ćelije: HeLa ćelije koje eksprimuju HLA-A*02, ali ne i EGFR. Y osa prikazuje zeleno područje, koje je proporcionalno zdravim HeLa ćelijama u analizi. UTD: netransdukovane.
FIG.10 je niz grafika koji pokazuju citotoksičnost T-ćelija koje eksprimuju bilo EGFR scFv CAR ili EGFR scFv CAR i HLA-A*02 scFv LIR1 inhibitorni receptor, koji su pomešani 1: 1 sa HCT.116 ćelijama koje eksprimuju bilo EGFR (Cilj A) ili EGFR i HLA-A*02 (Cilj AB).
FIG.11A je niz grafika fluorescencijom aktiviranih sortiranja ćelija (FACS) koji prikazuju ekspresiju EGFR scFv CAR receptora aktivatora od strane T-ćelija nakon inkubacije T-ćelija koje eksprimuju različit EGFR scFv CAR i HLA-A*02 scFv LIR1 inhibitor sa HeLa ćelijama koje eksprimuju samo EGFR aktivator (Cilj A), samo inhibitorski cilj (Cilj B) ili aktivatorske i inhibitorske ciljeve (Cilj AB). FIG.11B je grafik koji prikazuje kvantifikacionu ekspresiju receptora aktivatora pre izlaganja ciljnim ćelijama i nakon 120 sati kokultivisanja sa ciljnim ćelijama koje eksprimuju samo ligand aktivatora (Cilj A) ili ciljne ćelije koje eksprimuju ligande i aktivatora i blokatora (Cilj AB).
FIG.12A je grafik koji prikazuje membransku ekspresiju receptora aktivatora na T-ćelijama koje eksprimuju EGFR scFv CAR (CT-482) aktivator i HLA-A*02 scFv LIR1 inhibitor (C1765) nakon kokultivisanja sa populacijama HeLa ćelija koje eksprimuju EGFR (Cilj A), HLA-A*02 (Cilj B), kombinaciju EGFR-a i HLA-A*02 na istoj ćeliji (Cilj AB), pomešanom populacijom HeLa ćelija koje eksprimuju Cilj A i Cilj AB na različitim ćelijama ili pomešanom populacijom HeLa ćelija koje eksprimuju Cilj B i Cilj AB na različitim ćelijama.
FIG.12B je grafik koji prikazuje membransku ekspresiju inhibitornog receptora na T-ćelijama koje eksprimuju EGFR scFv CAR (CT-482) aktivator i HLA-A*02 scFv LIR1 inhibitor (C1765) nakon kokultivisanja sa populacijama HeLa ćelija koje eksprimuju EGFR (Cilj A), HLA-A*02 (Cilj B), kombinaciju EGFR-a i HLA-A*02 na istoj ćeliji (Cilj AB), pomešanom populacijom HeLa ćelija koje eksprimuju Cilj A i Cilj AB na različitim ćelijama ili pomešanom populacijom HeLa ćelija koje eksprimuju Cilj B i Cilj AB na različitim ćelijama.
FIG.13 je dijagram eksperimenta za utvrđivanje je li dejstvo citotoksičnosti ili blokiranja od strane T-ćelija bilo reverzibilno.
FIG.14A je niz grafika koji pokazuju da je dejstvo citotoksičnosti i blokiranja reverzibilno te da odgovara površinskoj ekspresiji aktivatora. T-ćelije su kokulitivisane sa EGFR+/HLA-A2+ ciljnim ćelijama u rundi 1, pa se prešlo na menjanje ciljnih ćelija u sledećim rundama. Gore: prikazano je procentualno ubijanje ciljnih HeLa ćelija T-ćelijama. Dole: ekspresija receptora aktivatora i inhibitora na osnovu analize pomoću FACS-a.
FIG.14B je niz grafika koji pokazuju da je dejstvo citotoksičnosti i blokiranja reverzibilno te da odgovara površinskoj ekspresiji aktivatora. T-ćelije su kokultivisane sa EGFR+/HLA-A2-ciljnim ćelijama u rundi 1, pa se prešlo na menjanje ciljnih ćelija u sledećim rundama. Gore: prikazano je procentualno ubijanje ciljnih HeLa ćelije T-ćelijama. Dole: ekspresija receptora aktivatora i inhibitora na osnovu analize pomoću FACS-a.
FIG.15A je grafik koji pokazuje da je ekspresija EGFR aktivatora CAR na membrani reverzibilno negativno regulisana prisustvom ciljnih ćelija koje eksprimuju ligande i aktivatora i inhibitora.
FIG.15B je niz grafika koji pokazuju da se ekspresija EGFR aktivatora CAR na membrani brzo ponovno uspostavlja kada je prisutan samo aktivator ciljnih ćelija ili kada ciljne ćelije koje eksprimuju aktivatorske i blokatorske ciljeve nisu prisutne.
FIG.16 pokazuje da se aktiviranje Jurkat ćelija koje eksprimuju EGFR scFv CAR pomoću analize na bazi perli može blokirati inhibitornim receptorom na bazi pMHC HLA-A*02 scFv LIR-1 kada su antigeni aktivatora i inhibitora prisutni na perlama u cis, ali ne i kada su antigeni aktivatora i inhibitora prisutni na perlama u trans.
FIG.17A pokazuje da se aktiviranje Jurkat ćelija pomoću EGFR scFv CAR može blokirati inhibitornim receptorom na bazi pMHC HLA-A*02 scFv LIR-1 pomoću SiHa ciljnih ćelija koje eksprimuju HLA-A*02 (SiHa A02), ali ne i pomoću SiHa ćelija koje ne eksprimuju HLA-A*02 (SiHa WT).
FIG.17B pokazuje da se aktiviranje Jurkat ćelija pomoću EGFR scFv CAR može blokirati inhibitornim receptorom na bazi pMHC HLA-A*02 scFv LIR-1 primenom HeLa ciljnih ćelija koje eksprimuju HLA-A*02 (HeLa A02), ali ne i pomoću HeLa ćelija koje ne eksprimuju HLA-A*02 (HeLa WT).
FIG.18 je dijagram koji prikazuje postupak za bioinformatičku pretragu koji se koristio za identifikovanje potencijalnih neciljnih antigenskih gena kandidata.
FIG.19 je dijagram koji prikazuje postavku eksperimenta za utvrđivanje efikasnosti i selektivnosti imunskih ćelija koje eksprimuju receptor aktivatora koji cilja EGFR i inhibitorni receptor in vivo. FIG.20A je grafik koji prikazuje inhibiciju Jurkat NFAT luciferaznih (JNL) ćelija u analizi iRNK titracije uz upotrebu HeLa ćelija transfektovanih pomoću iRNK koja kodira HLA-A*11. HeLa ćelije su transfektovane serijski razblaženom HLA-A*11 iRNK i JNL ćelije su tranzijentno transfektovane EGFR aktivirajućim CAR /- HLA-A*11 inhibitornim receptorom sa scFv HLA-A*11 #4.
Funkcionalni odgovor je procenjen nakon 6 sati kokultivisanja.
FIG.20B prikazuje molekulsku/ćelijsku osetljivost (IC50) inhibitornog receptora sa HLA-A*11 #4. FIG.21 je grafik koji pokazuje da HLA-B*07-scFv-LIR1 inhibitorni receptor inhibira aktiviranje imunskih ćelija posredovano koeksprimovanim receptorom aktivatora koji cilja EGFR.
FIG.22 je niz grafika koji prikazuju ekspresiju receptora EGFR aktivatora (samo EGFR-CAR) i parova receptora EGFR aktivatora/HLA-A inhibitora u primarnim T-ćelijama koje obuhvataju ovde opisane vektore. Procenat ćelija koje eksprimuju jedan receptor ili njih oba prikazan je pre obogaćivanja (pre obogaćivanja) i posle obogaćivanja (posle obogaćivanja), pri čemu obogaćivanje bira ćelije koje eksprimuju receptore. Receptorski parovi se eksprimuju bilo iz dvaju različitih vektora (dvostruki vektor) ili jednog vektora (jedan vektor).
FIG.23A je niz grafika koji prikazuju procenat specifičnog ubijanja HeLa ciljnih ćelija ili HCT116 ciljnih ćelija imunskim ćelijama koje eksprimuju receptor EGFR aktivatora i HLA-A*02 scFv LIR1 inhibitorni receptor. Ciljne ćelije eksprimuju EGFR antigen (A) ili i EGFR antigen i HLA-A*02 neciljni antigen (B). Imunske ćelije koje eksprimuju par receptora aktivatora/inhibitora inkubirane su sa ciljnim ćelijama u odnosu 1:1.
FIG.23B predstavlja grafik i niz slika koji prikazuju specifično i selektivno ubijanje ciljnih ćelija imunskim ćelijama koje eksprimuju receptor EGFR aktivatora i HLA-A*02 scFv LIR1 inhibitorni receptor u pomešanoj kulturi ćelija kancera i normalnih ćelija. UTD = imunske ćelije bez receptora aktivatora ili inhibitora; CAR = imunske ćelije koje eksprimuju samo receptor aktivatora; Tmod = imunske ćelije koje eksprimuju receptore i aktivatora i inhibitora. Na slikama desno: zeleno = normalne ćelije; crveno = tumorske ćelije.
FIG.24 je dijagram koji prikazuje selektivno ćelijsko aktiviranje u Jurkat ćelijama (efektorima) koje eksprimuju receptor EGFR aktivatora (CAR) ili receptor EGFR aktivatora i HLA-A*02 inhibitorni receptor (Tmod). Jurkat ćelije su inkubirane sa panelom ciljnih ćelijskih linija koje eksprimuju HLA-A*02 sa ekspresijom EGFR-a ili bez nje. Tmod Jurkat efektorske ćelije nisu prikazale of-target aktiviranje kada se kokultivišu sa ciljnim ćelijama koje ne eksprimuju EGFR ili ćelijama koje eksprimuju HLA-A*02.
DETALJAN OPIS
[0063] Ovde su opisani kompozicije i postupci za lečenje kancera koji koriste imunske ćelije koje obuhvataju sistem dvaju receptora osetljiv na razlike u ekspresiji gena liganda između kancerskih i normalnih ćelije. Te razlike u ekspresiji mogu biti posledica gubitka heterozigotnosti u ćelijama kancera. Alternativno, do razlika u ekspresiji može doći jer se ekspresija gena ne eksprimuje u ćelijama kancera ili se eksprimuje u ćelijama kancera na nižem nivou od normalnih ćelija. Sistem dvaju receptora eksprimuje se u imunskim ćelijama, na primer imunskim ćelijama koje se koriste u adoptivnoj ćelijskoj terapiji i cilja dejstvo tih imunskih ćelija na ćelije kancera koje doživljavaju gubitak heterozigotnosti ili razlike u ekspresiji. U tom sistemu dvaju receptora, prvi receptor (receptor aktivatora, koji se ovde ponekad naziva A modulom) aktivira ili podstiče aktiviranje imunske ćelije, dok drugi receptor (inhibitorni receptor, koji se ovde ponekad naziva blokatorom ili receptorom inhibitora ili B modulom) deluje kako bi inhibirao aktiviranje imunskih ćelija prvim receptorom. Oba receptora sadrže ligand vezujući domen (LBD) koji vezuje specifični ligand. Imunska ćelija integriše signale iz dvaju receptora nakon vezivanja liganda. Diferencijalna ekspresija liganada za prvi i drugi receptor u kancerskim i normalnim ćelijama, na primer gubitkom heterozigotnosti lokusa koji kodira inhibitorni ligand u ćelijama kancera, ili razlike u nivoima transkripcije, posreduje u aktiviranju imunskih ćelija ciljnim ćelijama kancera koje eksprimuju prvi ligand aktivatora, ali ne i drugi inhibitorni ligand.
[0064] U određenim načinima ostvarivanja ovde opisanih kompozicija i postupaka, imunske ćelije koje obuhvataju ovde opisani sistem dvaju receptora koriste se za lečenje kancera pozitivnih na receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR). Tu su uključeni kanceri pluća, glioblastom, kanceri dojke, kancer glave i vrata te kolorektalni kanceri. U slučaju EGFR pozitivnih kancera, ciljni antigen receptora aktivatora je EGFR ili njegov antigen peptida, u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I). EGFR se eksprimuje u širokom spektru normalnih tkiva, kao što su epitelna, mezenhimalna i nervna tkiva, i ima značajnu ulogu u normalnim ćelijskim procesima kao što su ćelijska proliferacija i diferencijacija, kao i razvoj. Zbog svoje ekspresije u određenim tumorima, EGFR je zgodan antigen specifičan za tumor koji može posredovati u selektivnom ubijanju EGFR+ tumora ukoliko bi se te ćelije kancera mogle specifično ciljati prikladnim terapeutikom. Međutim, normalna ekspresija EGFR-a u nekancerskim (neciljnim) ćelijama sprečavala je efikasnu upotrebu EGFR-a za ciljane terapije kao što su adoptivne ćelijske terapije. Kožne i gastrointestinalne toksičnosti sprečavale su efikasno ciljanje EGFR-a u EGFR pozitivnim kancerima. Uparivanjem receptora EGFR aktivatora sa inhibitornim receptorom, ovde obezbeđeni postupci povećavaju specifičnost EGFR ciljane adoptivne ćelijske terapije i smanjuju štetne efekte povezane sa tim terapijama, kao što je dozno ograničena toksičnost.
[0065] U nekim načinima ostvarivanja, ligand za aktivator je EGFR peptid kompleksiran sa MHC-om klase I. U ovde opisanim postupcima, taj je EGFR ciljani receptor aktivatora uparen sa inhibitornim receptorom, što povećava bezbednosni prozor aktivatora blokiranjem njegovog citolitičkog dejstva na normalna EGFR pozitivna tkiva. Međutim, receptor aktivatora i dalje usmerava ciljano ubijanje tumorskih ćelija imunskim ćelijama koje obuhvataju sistem dvaju receptora, budući da tumorske ćelije ne eksprimuju ligand za receptor inhibitora, ili blokatora. Cilj za drugi, inhibitorni receptor eksprimuju EGFR pozitivna tkiva kao što su epitelna tkiva, ali ne i ćelije kancera, pa inhibitorni receptor prepoznaje taj „neciljni antigenˮ kao inhibitorni stimulans. Primerni cilj za drugi inhibitorni receptor eksprimuje plućno epitelno tkivo, a on nestaje kod EGFR pozitivnih ćelija kancera usled heterozigotnosti (LOH), čime u ćelijama kancera ostaje oblik sa jednim alelom koji se može razlikovati od drugih alela preko alel specifičnog ligand vezujućeg domena na inhibitornom receptoru. Primerni ciljevi inhibitornog receptora uključuju proteine glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) kao što su humani leukocitni antigen A (HLA-A). HLA-B, HLA-C i drugi HLA-ovi. HLA-ove kodiraju varijantni geni, kao što su HLA-A*01, HLA-A*02, HLA*A03, HLA-C*07 i drugi, koji mogu nestati kod EGFR pozitivnih ćelija kancera gubitkom heterozigotnosti. Alternativno, dalji primerni ciljevi inhibitornog receptora uključuju kolektinski podporodični član 12 COLEC12, APC negativno regulisani 1 (APCDD1) i hemokini ligand 16 sa C-X-C motivom (CXCL16). Svaki od njih ima zajednički nesinonimni varijantni oblik, sa aminokiselinskom alteracijom u svom ekstracelularnom domenu dostupnom antitelima, koji se može koristiti kao B modulski cilj za celularni integrator dizajniran za bezbedno lečenje pacijenata sa EGFR pozitivnim kancerima dizajniranim T-ćelijama koje aktivira receptor aktivatora kao što je EGFR ili EGFR pMHC osetljivi receptor aktivatora. Kompozicije i postupci ovog otkrivanja mogu redukovati ili eliminisati DLT izazvan ekspresijom EGFR-a od strane normalnog tkiva. Ovo otkrivanje obezbeđuje postupke za ciljanje EGFR u ćelijama kancera radi lečenja EGFR pozitivnih kancera pomoću adoptivnih ćelijskih terapija dodavanjem drugog inhibitornog receptora koji blokira aktiviranje adoptivnih imunskih ćelija u prisustvu drugog liganda (liganda koji se razlikuje od EGFR-a, nazvanog „neciljni antigenˮ). Pomoću ovde opisanih kompozicija i postupaka, adoptivne imunske ćelije koje eksprimuju dva receptora napadaju tumorske ćelije koje eksprimuju EGFR, budući da te tumorske ćelije eksprimuju samo ligand aktivatora, EGFR. Suprotno tome, normalne ćelije koje eksprimuju EGFR plus neciljni antigen (alternativno nazivan „antigen blokatoraˮ) zaštićene su od adoptivnih imunskih ćelija. Inhibitorni receptora odgovara na neciljni antigen na normalnim ćelijama i time sprečava aktiviranje imunskih ćelija EGFR ciljnim receptorom aktivatora. Taj pristup dvostrukog ciljanja stvara terapijski prozor koji će omogućiti bezbedno i efikasno doziranje EGFR usmerene ćelijske terapije kod pacijenata sa EGFR pozitivnim kancerom.
[0066] Ovo otkrivanje obezbeđuje postupke i kompozicije koji omogućavaju upotrebu potentnog EGFR CAR i TCR-ova koji indukuju on-target toksičnost i čini da ti EGFR ciljani receptori postaju korisni kao terapeutik ublažavanjem njihove toksičnosti.
[0067] U varijacijama, ovde opisane kompozicije i ovde opisani postupci mogu se koristiti za ubijanje ciljnih ćelija i/ili lečenje subjekata, u kojima je ekspresija neciljnog antigena delimično ili kompletno smanjena usled uzroka koji se razlikuju od gubitka heterozigotnosti, uključujući delimično brisanje gena, epigenetsko utišavanje, tačkaste mutacije, skraćivanja.
Definicije
[0068] Pre detaljnijeg izlaganja ovog otkrivanja, za njegovo razumevanje može biti od pomoći da se obezbede definicije određenih pojmova koji će se ovde koristi.
[0069] Kako se ovde koristi, pojam „okoˮ ili „približnoˮ odnosi se na kvantitet, nivo, vrednost, broj, učestalost, procenat, dimenziju, veličinu, količinu, masu ili dužinu koja varira za 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ili 1% u odnosu na referentni kvantitet, nivo, vrednost, broj, učestalost, procenat, dimenziju, veličinu, količinu, masu ili dužinu. Kao što je ovde opisano, pojam „okoˮ ili „približnoˮ odnosi se na opseg kvantiteta, nivoa, vrednosti, broja, učestalosti, procenta, dimenzije, veličine, količine, mase ili dužine ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% ili ± 1% oko referentnog kvantiteta, nivoa, vrednosti, broja, učestalosti, procenta, dimenzije, veličine, količine, mase ili dužine.
[0070] Kako se ovde koristi, pojam „izolovanˮ označava materijal koji suštinski ili u biti ne sadrži komponente koje ga obično prate u njegovom prirodnom stanju. Kako se ovde koristi, pojam „dobijenˮ ili „izvedenˮ koristi se kao sinonim za izolovan.
[0071] Pojmovi „subjekatˮ, „pacijentˮ i „osobaˮ ovde se koriste jedan umesto drugog kako bi označili kičmenjaka, poželjno sisara, poželjnije ljudsko biće. Obuhvaćena su i tkiva, ćelije i njihovo potomstvo biološkog entiteta dobijeno in vivo ili kultivisano in vitro. „Subjekatˮ, „pacijentˮ ili „osobaˮ kako se ovde koristi, uključuje bilo koju životinju koja doživljava bol koji se može lečiti ovde razmatranim vektorima, kompozicijama i postupcima. Prikladni subjekti (npr. pacijenti) uključuju laboratorijske životinje (kao što su miš, pacov, kunić ili morsko prase), životinje sa farme i domaće životinje ili kućne ljubimce (kao što su mačka ili pas). Uključeni su i nehumani primati te, poželjno, humani pacijenti.
[0072] Kako se ovde koristi, „lečenjeˮ ili „tretiranjeˮ, uključuje svaki pogodni ili željeni efekat te može uključivati čak i minimalna poboljšanja simptoma. „Lečenjeˮ ne označava nužno potpuno iskorenjivanje ili izlečenje bolesti ili stanja ili simptoma povezanih sa njima.
[0073] Kako se ovde koristi, „sprečavaˮ, i slične reči kao što su „sprečenˮ, „prevencijaˮ itd., označavaju pristup za prevenciju, inhibiranje ili redukovanje mogućnosti simptoma bolesti. Odnosi se i na odlaganje pojave ili rekurencije bolesti ili stanja ili odlaganje pojave ili rekurencije simptoma bolesti. Kako se ovde koristi, „prevencijaˮ i slične reči takođe uključuju redukovanje intenziteta, efekta, simptoma i/ili tereta bolesti pre pojave ili rekurencije.
[0074] Kako se ovde koristi, pojam „količinaˮ odnosi se na „količinu efektivnuˮ ili „efektivnu količinuˮ virusa za postizanje pogodnog ili željenog profilaktičnog ili terapijskog rezultata, uključujući kliničke rezultate.
[0075] „Terapijski efektivna količinaˮ virusa ili ćelije može varirati spram faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i masa osobe te mogućnosti virusa ili ćelije da izazove željeni odgovor kod osobe. Terapijski efektivna količina takođe predstavlja količinu u kojoj terapijski pogodna dejstva nadmašuju sve toksične i štetne efekte virusa ili ćelije. Pojam „terapijski efektivna količinaˮ uključuje količinu koja je efikasna za „lečenjeˮ subjekta (npr. pacijenta).
[0076] „Povećanaˮ ili „poboljšanaˮ količina fiziološkog odgovora, npr. elektrofiziološka aktivnost ili celularna aktivnost, obično predstavlja „statistički značajnu" količinu i može uključivati povećanje u odnosu na nivo aktivnosti u netretiranoj ćeliji od 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ili više puta (npr.500, 1000 puta) (uključujući sve cele brojeve i decimalne zareze između i iznad 1, npr.1,5, 1,6, 1,7.1,8, itd.).
[0077] „Smanjenaˮ ili „redukovanaˮ količina fiziološkog odgovora, npr. elektrofiziološka aktivnost ili celularna aktivnost, obično predstavlja „statistički značajnuˮ količinu i može uključivati smanjenje u odnosu na nivo aktivnosti u netretiranoj ćeliji od 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ili više puta (npr.500, 1000 puta) (uključujući sve cele brojeve i decimalne zareze između i iznad 1, npr.1,5, 1,6, 1,7, 1,8, itd.).
[0078] Pod „održavanjemˮ ili „očuvanjemˮ ili „čuvanjemˮ ili „bez promeneˮ ili „bez suštinske promeneˮ ili „bez suštinskog smanjenjaˮ uglavnom se podrazumeva fiziološki odgovor koji je sličan odgovoru kog izaziva bilo nosač ili kontrolni molekul/kontrolna kompozicija. Sličan odgovor je onaj koji nije značajno različit ili merljivo različit od referentnog odgovora.
[0079] „Identitet sekvenceˮ ili „homologija sekvenceˮ uopšteno se odnosi tačno poklapanje dvaju polinukleotida ili dveju polipeptidnih sekvenci od nukleotida do nukleotida odnosno od aminokiseline do aminokiseline. Tehnike za utvrđivanje identiteta sekvence obično uključuju utvrđivanje nukleotidne sekvence polinukleotida i/ili utvrđivanje njome kodirane aminokiselinske sekvence te poređenje tih sekvenci sa drugom nukleotidnom ili aminokiselinskom sekvencom. Dve sekvence (polinukleotidne ili aminokiselinske) ili više njih može se uporediti utvrđivanjem njihovog „procenta identičnostiˮ. Procenat identičnosti dveju sekvenci, bilo sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina, jeste broj tačnih podudaranja između dveju poravnatih sekvenci podeljen dužinom kraćih sekvenci i pomnožen sa 100. Procenat identičnosti može se utvrditi i, na primer, poređenjem informacija o sekvencama pomoću naprednog BLAST računarskog programa, uključujući verziju 2.2.9, dostupnu u Nacionalnom institutu za zdravlje. BLAST program je zasnovan na postupku za poravnavanje iz Karlin i Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990) i kao što je razmatrano u Altschul, et al., J. Mol. Biol.215:403-410 (1990); Karlin i Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993) i Altschul et al., Nucleic Acids Res.25:3389-3402 (1997). Ukratko, BLAST program definiše identičnost kao broj identičnih poravnatih simbola (obično nukleotida ili aminokiselina), podeljen sa ukupnim brojem simbola u kraćoj od dveju sekvenci. Program se može koristiti za utvrđivanje procenta identičnosti preko čitave dužine proteina koji se porede. Obezbeđeni su podrazumevani parametri kako bi se optimizovale pretrage sa kratkim traženim sekvencama u, na primer, blastp programu. Program omogućava i upotrebu SEG filtera radi raskrinkavanja segmenata traženih sekvenci kao što je utvrđeno SEG programom iz Wootton i Federhen, Computers and Chemistry 17:149-163 (1993). Opsezi željenih stepeni identiteta sekvenci približno iznose 80% do 100% i celobrojne vrednosti između njih. Procentualne identičnosti između navedene sekvence i sekvence za koju se traži zaštita obično iznose najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98%.
[0080] Kako se ovde koristi, „polinukleotidni sistemˮ odnosi se na jedan polinukleotid ili više njih. Jedan polinukleotid ili više njih može(gu) se dizajnirati da rade zajedno za određenu primenu ili da proizvodi(e) željenu transformisanu ćeliju.
[0081] Pojam „egzogenˮ ovde se koristi da označi bilo koji molekul, uključujući nukleinske kiseline, protein ili peptide, mala molekulska jedinjenja i slične koji potiču iz spoljašnjosti organizma. Suprotno tome, pojam „endogenˮ odnosi se na bilo koji molekul koji potiče iz unutrašnjosti organizma (tj. kog organizam prirodno proizvodi).
[0082] Pojam „MOIˮ se ovde koristi da označi mnogostrukost infekcije, koja predstavlja odnos agensa (npr. virusnih čestica) spram ciljeva infekcije (npr. ćelija).
[0083] U ovom se opisu podrazumeva da bilo koji koncentracioni opseg, procentualni opseg, odnosni opseg ili celobrojni opseg uključuje vrednost svakog celog broja unutar navedenog opsega i, po potrebi, njegove decimale (kao što je deseti deo i stoti deo celog broja), osim ukoliko je drugačije naznačeno.
[0084] Kako se ovde koristi, „ciljna ćelijaˮ odnosi se na ćeliju koju cilja adoptivna ćelijska terapija. Na primer, ciljna ćelija može biti ćelija kancera, koju mogu ubiti transplantovane T-ćelije adoptivne ćelijske terapije. Ciljne ćelije ovog otkrivanja eksprimuju ciljni antigen, kao što je ovde opisano, a ne eksprimuju neciljni antigen.
[0085] Kako se ovde koristi, „neciljna ćelijaˮ odnosi se na ćeliju koju ne cilja adoptivna ćelijska terapija. Na primer, u adoptivnoj ćeliji koja cilja ćelije kancera, neciljne ćelije su normalne, zdrave, nekancerske ćelije. Neke ili sve, neciljne ćelije kod subjekta mogu eksprimovati i ciljni antigen i neciljni antigen.
Neciljne ćelije kod subjekta mogu eksprimovati neciljni antigen bez obzira na to da li te ćelije eksprimuju i ciljni antigen ili ne ga ne eksprimuju.
[0086] Kako se ovde koristi, „ciljni antigenˮ, bilo da se odnosi na upotrebu pojma antigen ili naziva konkretnog antigena, odnosi se na antigen kog eksprimuje ciljna ćelija, kao što je ćelija kancera.
Ekspresija ciljnog antigena nije ograničena na ciljne ćelije. Ciljne antigene kod subjekta mogu eksprimovati i ćelije kancera i normalne, nekancerske ćelije.
[0087] Kako se ovde koristi, „neciljni antigenˮ (ili „antigen blokatoraˮ) bilo da se odnosi na upotrebu pojma antigen ili naziva konkretnog antigena, odnosi se na antigen kog eksprimuju normalne, nekancerske ćelije i koji se ne eksprimuje u ćelijama kancera. Ta razlika u ekspresiji omogućava inhibitornom receptoru da inhibira aktiviranje imunskih ćelija u prisustvu of neciljnih ćelija, ali ne i u prisustvu ciljnih ćelija.
[0088] Polimorfizam odnosi se na prisustvo dveju ili više varijanti nukleotidne sekvence u populaciji. Polimorfizam može obuhvatati jednu promenu baze, jedno umetanje, ponavljanje ili brisanje ili više njih. Polimorfizam uključuje npr. jednostruko ponavljanje sekvence (SSR) i jednostruki nukleotidni polimorfizam (SNP), koji predstavlja varijaciju koja se javlja kada se zameni jedan nukleotid adenina (A), timina (T), citozina (C) ili guanina (G).
[0089] Kako se ovde koristi, „afinitetˮ se odnosi na jačinu vezivanja liganda za jedno ligand vezujuće mesto na receptoru, na primer antigena za antigen vezujući domen bilo kog od ovde opisanih receptora. Ligand vezujući domeni mogu imati slabiju interakciju (nizak afinitet) sa svojim ligandima ligand ili jaču interakciju (visok afinitet).
[0090] Kd ili konstanta disocijacije, predstavlja vrstu ravnotežne konstante koja meri sklonost većeg objekta da se reverzibilno deli na manje komponente, kao, na primer, kada se makromolekulski kompleks koji obuhvata receptor i njegov srodni ligand podeli na ligand i receptor. Kad je Kd visok, to znači da je neophodna visoka koncentracija liganda za zauzimanje receptora, a afinitet receptora za ligand je nizak. Obratno, nizak Kd znači da ligand ima visok afinitet za receptor.
[0091] Kako se ovde koristi, receptor koji je „osetljivˮ ili „osetljiv naˮ odnosi se na receptor koji obuhvata intracelularni domen, koji, kada ga veže ligand (tj. antigen), generiše signal koji odgovara poznatoj funkciji intracelularnog domena. Receptor aktivatora vezan za ciljni antigen može generisati signal koji izaziva aktiviranje imunske ćelije koja eksprimuje receptor aktivatora. Inhibitorni receptor vezan za neciljni antigen može generisati inhibitorni signal koji sprečava ili redukuje aktiviranje imunske ćelije koja eksprimuje receptor aktivatora. Osetljivost receptora i njihova mogućnost da aktiviraju ili inhibiraju imunske ćelije koje eksprimuju receptore, može se proceniti bilo kojim sredstvom koje je poznato u tehnici i ovde opisano, uključujući reporterske analize i analize citotoksičnosti.
[0092] Kako se ovde koristi, „aktiviranjeˮ imunske ćelije ili imunska ćelija koja je „aktiviranaˮ predstavlja imunsku ćeliju koja može izvesti jednu funkciju karakterističnu za imunski odgovor ili više njih. Te funkcije uključuju proliferaciju, otpuštanje citokina i citotoksičnost, tj. ubijanje ciljne ćelije. Aktivirane imunske ćelije eksprimuju markere koji će biti poznati stručnjacima iz ove oblasti. Na primer, aktivirane T-ćelije mogu eksprimovati jedan ili više od CD69, CD71, CD25 i HLA-DR. Imunska ćelija koja eksprimuje receptor aktivatora (npr. EGFR CAR) može se aktivirati receptorom aktivatora kada on odreaguje na vezivanje ciljnog antigena (npr. EGFR). „Ciljni antigenˮ se može takođe nazivati „antigenom aktivatoraˮ i ciljna ćelija ga može izolovati ili eksprimovati. Aktiviranje imunske ćelije koja eksprimuje inhibitorni receptor može se redukovati ili sprečiti kada inhibitorni receptor odreaguje na vezivanje neciljnog antigena (npr. HLA-A*02), čak i ako je receptor aktivatora vezan za ciljni ligand aktivatora. „Neciljni antigenˮ se takođe može nazivati „inhibitornim ligandomˮ ili „blokatoromˮ i ciljna ćelija ga može izolovati ili eksprimovati.
[0093] Ekspresija receptora na imunskoj ćeliji može se verifikovati analizama koje prijavljuju prisustvo ovde opisanih receptora aktivatora i inhibitornih receptora. Na primer, populacija imunskih ćelija može se obojiti obeleženim molekulom (npr. antitelom specifičnim za receptore obeležene fluoroforom ili ligandom specifičnim za receptore obeležene fluoroforom) i kvantifikovati pomoću protočne citometrije fluorescencijom aktiviranog sortiranja ćelija (FACS). Taj postupak omogućava karakterizaciju procenta imunskih ćelija u populaciji imunskih ćelija kao ekspresije receptora aktivatora, inhibitornog receptora ili obaju receptora. Odnos receptora aktivatora i inhibitornih receptora koje eksprimuju ovde opisane imunske ćelija može se utvrditi pomoću, na primer, digitalnog kapljičnog PCR-a. Ti se pristupi mogu koristiti radi karakterizacije populacije ćelija za izradu i proizvodnju ovde opisanih imunskih ćelija, farmaceutskih kompozicija i kompleta. Za ovde opisane imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete, podrazumeva se da je prikladan procenat imunskih ćelija koje eksprimuju i receptor aktivatora i inhibitorni receptor utvrđen specifično za ovde opisane postupke. Na primer, prikladan procenat imunskih ćelija koje eksprimuju i receptor aktivatora i inhibitorni receptor može biti najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95%. Na primer, prikladni procenat imunskih ćelija koje eksprimuju i receptor aktivatora i inhibitorni receptor može biti najviše 50%, najviše 55%, najviše 60%, najviše 65%, najviše 70%, najviše 75%, najviše 80%, najviše 85%, najviše 90% ili najviše 95%. Na primer, prikladni odnos receptora aktivatora i inhibitornog receptora u imunskoj ćeliji može biti oko 5:1, oko 4:1, oko 3:1, oko 2:1, oko 1:1, oko 1:2, oko 1:3, oko 1:4 ili oko 1:5. Podrazumeva se da se na populacijama imunskih ćelija mogu primenjivati faze prečišćavanja, obogaćivanja i/ili trošenja kako bi se postigle prikladne vrednosti za ovde opisane imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete.
[0094] Osetljivi receptor kog eksprimuju ovde opisane imunske ćelije može se verifikovati analizama koje mere generisanje signala za koji se očekuje da će ga generisati intracelularni domen receptora. Za karakterizaciju osetljivog receptora mogu se koristiti reporterske ćelijske linije, kao što su Jurkatluciferazne NFAT ćelije (Jurkat ćelije). Jurkat ćelije se izvode iz T-ćelija i obuhvataju stabilno integrisan nuklearni faktor luciferaznog reporterskog sistema koji je inducibilan iz aktiviranih T-ćelija (NFAT). NFAT je porodica transkripcionih faktora neophodnih za aktiviranje imunskih ćelija, čije se aktiviranje može koristiti kao signalni marker za aktiviranje T-ćelija. Jurkat ćelije se mogu transdukovati ili transfektovati ovde opisanim receptorima aktivatora i/ili inhibitornim receptorima. Receptor aktivatora reaguje na vezivanje liganda ukoliko Jurkat ćelija eksprimuje luciferazni reporterski gen pa se nivo osetljivosti može utvrditi pomoću nivoa ekspresije reporterskih gena. Prisustvo luciferaze može se utvrditi pomoću bilo kog poznatog reagensa za detektovanje luciferaze, kao što je luciferin. Inhibitorni receptor reaguje na vezivanje liganda ukoliko, kada se koeksprimuje sa receptorom aktivatora u Jurkat ćelijama, sprečava normalno osetljivu imunsku ćeliju da eksprimuje luciferazu kao odgovor na receptor aktivatora. Na primer, osetljivost inhibitornog receptora može se utvrditi i kvantifikovati kod Jurkat ćelije koja eksprimuje i aktivator i inhibitor uočavanjem sledećeg: 1) Jurkat ćelija eksprimuje luciferazu u prisustvu liganda receptora aktivatora i odsustvu liganda inhibitornog receptora i 2) ekspresija luciferaze u Jurkat ćeliji se redukuje ili eliminiše u prisustvu i liganda receptora aktivatora i liganda inhibitornog receptora. Taj se pristup može koristiti za utvrđivanje osetljivosti, potencije i selektivnosti receptora aktivatora i specifičnih parova receptora aktivatora i inhibitornih receptora. Osetljivost, potencija i selektivnost mogu se kvantifikovati pomoću EC50 ili IC50 vrednosti uz primenu eksperimenata doznih odgovora, u kojima se ligand receptora aktivatora i/ili ligand inhibitornog receptora titrira u kulturu Jurkat ćelija koje eksprimuju receptor aktivatora ili specifičan par receptora aktivatora i inhibitora. Alternativno, EC50 i IC50 vrednosti mogu se utvrditi u kokulturi imunskih ćelija (npr. Jurkat ćelija ili primarnih imunskih ćelija) koje eksprimuju receptor aktivatora ili specifični par receptora aktivatora i inhibitora te ciljnih ćelija koje eksprimuju sve veću količinu liganda aktivatora ili ligand inhibitora. Sve veća količina liganda aktivatora ili liganda inhibitora može se postići u ciljnoj ćeliji, na primer, titracijom liganda aktivatora ili liganda inhibitora koji kodira iRNK u ciljne ćelije ili upotrebom ciljnih ćelija koje prirodno eksprimuju različite nivoe ciljnih liganada. Primerne prikladne EC50 i IC50 vrednosti za receptore aktivatora i inhibitora kao što je utvrđeno uz upotrebu ciljnih ćelija koje eksprimuju varirajuće količine of ciljnih i neciljnih liganda uključuju EC50 od 260 transkripata na milion (TPM) ili manje za receptor aktivatora, na primer EC50 od između 10 i 260 TPM i IC50 od 10 TPM ili manje za inhibitorni receptor, na primer IC501-5 TPM.
[0095] Aktiviranje ovde opisanih imunskih ćelija koje eksprimuju receptor aktivatora ili specifične parove receptora aktivatora i inhibitora može se dalje utvrditi analizama koje mere vijabilnost ciljne ćelije nakon koinkubacije sa pomenutim imunskim ćelijama. Imunske ćelije, koje se ponekad nazivaju i efektorskim ćelijama, koinkubiraju se sa ciljnim ćelijama koje eksprimuju ligand receptora aktivatora, ligand inhibitornog receptora ili i ligand receptora i aktivatora i inhibitora. Nakon koinkubacije, meri se vijabilnost ciljne ćelije pomoću bilo kog postupka za merenje vijabilnosti u kulturi ćelija. Na primer, vijabilnost se može utvrditi pomoću analize funkcije mitohondrija koja koristi supstrat sa tetrazolijumskom solju za merenje aktivnih mitohondrijskih enzima. Vijabilnost se može utvrditi i pomoću postupaka na bazi snimanja. Ciljne ćelije mogu eksprimovati fluorescentni protein, kao što je zeleni fluorescentni protein ili crveni fluorescentni protein. Redukcija ukupne ćelijske fluorescencije označava redukciju vijabilnosti ciljne ćelije. Redukcija vijabilnosti ciljne ćelije nakon inkubacije sa imunskim ćelijama koje eksprimuju receptor aktivatora ili specifični par receptora aktivatora i inhibitora tumači se kao aktiviranje imunskih ćelija posredovano ciljnim ćelijama. Merenje selektivnosti imunskih ćelija može se utvrditi i pomoću ovog pristupa. Imunska ćelija koja eksprimuje par receptora aktivatora i inhibitora selektivna je ukoliko se uoči sledeće: 1) redukovana je vijabilnost ciljnih ćelija koje eksprimuju ligand receptora aktivatora, ali ne i liganda inhibitornog receptora; 2) nije redukovana vijabilnost ciljnih ćelija koje eksprimuju i ligand receptora aktivatora i ligand inhibitornog receptora. Iz tih se merenja može izvesti vrednost „specifičnog ubijanjaˮ koja kvantifikuje procenat aktiviranja imunskih ćelija na osnovu redukcije vijabilnosti ciljne ćelije kao procenat negativne kontrole (imunske ćelije koje ne eksprimuju receptor aktivatora). Iz tih se merenja može izvesti i vrednost „odnosa selektivnostiˮ koja predstavlja odnos specifičnog ubijanja uočenog kod ciljnih ćelija koje eksprimuju ligand receptora aktivatora u odsustvu liganda inhibitornog receptora spram specifičnog ubijanja uočenog kod ciljnih ćelija koje eksprimuju i ligand receptora aktivatora i ligand inhibitornog receptora. Taj se pristup može koristiti radi karakterizacije populacije ćelija za izradu i proizvodnju ovde opisanih imunskih ćelija, farmaceutskih kompozicija i kompleta. Prikladnu vrednost specifičnog ubijanja za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete mogu određivati, na primer, sledeći kriterijumi: 1) najmanje 50% specifičnog ubijanja nakon 48-časovne koinkubacije imunskih ćelija i ciljnih ćelija koje eksprimuju ligand receptora aktivatora u odsustvu liganda inhibitornog receptora; 2) manje od ili tačno 20% specifičnog ubijanja ciljne ćelije koja eksprimuje i ligand receptora aktivatora i ligand inhibitornog receptora. Kao dalji primer, imunske ćelije mogu da ubiju najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% ciljnih ćelija koje eksprimuju ligand aktivatora, a ne eksprimuju ligand inhibitora tokom perioda od 6 sati, 12 sati, 18 sati, 24 sata, 30 sati, 36 sati, 42 sata, 48 sati, 54 sata ili 60 sati, dok je ubijanje manje od 40%, manje od 30%, manje od 20%, manje od 10%, manje od 5%, manje od 3% ili manje od 1% ciljnih ćelija koje eksprimuju ligande aktivatora i inhibitora tokom istog vremenskog perioda.
[0096] Prikladna vrednost specifičnog ubijanja ciljne ćelije koja eksprimuje ligand aktivatora u odsustvu vrednosti inhibitornog liganda za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može biti, na primer, najmanje oko 50% do najmanje oko 95%. Prikladna vrednost specifičnog ubijanja ciljne ćelije koja eksprimuje ligand aktivatora u odsustvu vrednosti inhibitornog liganda za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može biti, na primer, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90% ili najmanje oko 95%. Prikladna vrednost specifičnog ubijanja ciljne ćelije koja eksprimuje ligand aktivatora u odsustvu vrednosti inhibitornog liganda za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može biti, na primer, najviše oko 50%, najviše oko 55%, najviše oko 60%, najviše oko 65%, najviše oko 70%, najviše oko 75%, najviše oko 80%, najviše oko 85%, najviše oko 90% ili najviše oko 95%. Prikladna vrednost specifičnog ubijanja ciljnih ćelija koje eksprimuju i ligand receptora aktivatora i ligand inhibitornog receptora za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može biti manja od oko 50%, manja od oko 45%, manja od oko 40%, manja od oko 35%, manja od oko 30%, manja od oko 25%, manja od oko 20%, manja od oko 15%, manja od oko 10% ili manja od oko 5%. Prikladna vrednost specifičnog ubijanja za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može se utvrditi nakon oko 6 sati, oko 12 sati, oko 18 sati, oko 24 sata, oko 30 sati, oko 36 sati, oko 42 sata, oko 48 sati, oko 54 sata, oko 60 sati, oko 66 sati ili oko 72 sata koinkubacije imunskih ćelija sa ciljnim ćelijama.
[0097] Prikladna vrednost specifičnog ubijanja ciljne ćelije koja eksprimuje ligand aktivatora u odsustvu vrednosti inhibitornog liganda za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može biti, na primer, najmanje oko 50% do najmanje oko 95%. Prikladna vrednost specifičnog ubijanja ciljne ćelije koja eksprimuje ligand aktivatora u odsustvu vrednosti inhibitornog liganda za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može biti, na primer, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90% ili najmanje oko 95%. Prikladna vrednost specifičnog ubijanja ciljne ćelije koja eksprimuje ligand aktivatora u odsustvu vrednosti inhibitornog liganda za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može biti, na primer, najviše oko 50%, najviše oko 55%, najviše oko 60%, najviše oko 65%, najviše oko 70%, najviše oko 75%, najviše oko 80%, najviše oko 85%, najviše oko 90% ili najviše oko 95%. Prikladna vrednost specifičnog ubijanja ciljnih ćelija koje eksprimuju i ligand receptora aktivatora i ligand inhibitornog receptora za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može biti manja od oko 50%, manja od oko 45%, manja od oko 40%, manja od oko 35%, manja od oko 30%, manja od oko 25%, manja od oko 20%, manja od oko 15%, manja od oko 10% ili manja od oko 5%. Prikladna vrednost specifičnog ubijanja za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može se utvrditi nakon oko 6 sati, oko 12 sati, oko 18 sati, oko 24 sata, oko 30 sati, oko 36 sati, oko 42 sata, oko 48 sati, oko 54 sata, oko 60 sati, oko 66 sati ili oko 72 sata koinkubacije imunskih ćelija sa ciljnim ćelijama.
[0098] Prikladna vrednost specifičnog ubijanja ciljne ćelije koja eksprimuje ligand aktivatora u odsustvu vrednosti inhibitornog liganda za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može biti, na primer, najmanje oko 50% do najmanje oko 95%. Prikladna vrednost specifičnog ubijanja ciljne ćelije koja eksprimuje ligand aktivatora u odsustvu vrednosti inhibitornog liganda za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može biti, na primer, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90% ili najmanje oko 95%. Prikladna vrednost specifičnog ubijanja ciljne ćelije koja eksprimuje ligand aktivatora u odsustvu vrednosti inhibitornog liganda za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može biti, na primer, najviše oko 50%, najviše oko 55%, najviše oko 60%, najviše oko 65%, najviše oko 70%, najviše oko 75%, najviše oko 80%, najviše oko 85%, najviše oko 90% ili najviše oko 95%. Prikladna vrednost specifičnog ubijanja ciljnih ćelija koje eksprimuju i ligand receptora aktivatora i ligand inhibitornog receptora za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može biti manja od oko 50%, manja od oko 45%, manja od oko 40%, manja od oko 35%, manja od oko 30%, manja od oko 25%, manja od oko 20%, manja od oko 15%, manja od oko 10% ili manja od oko 5%. Prikladna vrednost specifičnog ubijanja za imunske ćelije, farmaceutske kompozicije i komplete može se utvrditi nakon oko 6 sati, oko 12 sati, oko 18 sati, oko 24 sata, oko 30 sati, oko 36 sati, oko 42 sata, oko 48 sati, oko 54 sata, oko 60 sati, oko 66 sati ili oko 72 sata koinkubacije imunskih ćelija sa ciljnim ćelijama.
[0099] Kako se ovde koristi, pojam „funkcionalna varijantaˮ odnosi se na protein koji ima jednu aminokiselinsku supstituciju, jedno aminokiselinsko umetanje ili brisanje aminokiseline ili više njih u poređenju sa proteinom prethodnikom i koji zadržava jedno željeno dejstvo proteina prethodnika ili više njih. Funkcionalna varijanta može biti fragment proteina (tj. varijanta sa N i/ili C terminalnim brisanjima) koji zadržava jedno željeno dejstvo proteina prethodnika ili više njih.
[0100] Kako se ovde koristi, „neciljna alelska varijantaˮ odnosi se na alel gena čiji produkt eksprimuju neciljne ćelije, ali ne i ciljne ćelije. Na primer, neciljna alelska varijanta je alel gena kog eksprimuju normalne, nekancerske ćelije subjekta, ali ne i ćelije kancera subjekta. Ekspresija neciljne alelske varijante može nestati kod ćelija kancera bilo kojim mehanizmom, uključujući gubitak heterozigotnosti, mutaciju ili epigenetsku modifikaciju gena koji kodira neciljnu alelsku varijantu.
[0101] Kako se ovde koristi, „specifičan zaˮ ili „specifično vezuje zaˮ kada se koristi u odnosu na ligand vezujući domen, kao što je antigen vezujući domen, odnosi se na ligand vezujući domen koji ima visoku specifičnost za imenovani cilj. Specifičnost antitela može se videti kao mera preciznosti uklapanja između ligand vezujućeg domena i odgovarajućeg liganda ili mogućnost ligand vezujućeg domena da pravi razliku između sličnih ili čak različitih liganada. U poređenju sa specifičnošću, afinitet je mera jačine vezivanja između ligand vezujućeg domena i liganda, pa tako ligand vezujući domen niskog afiniteta vezuje slabo, a ligand vezujući domen visokog afiniteta vezuje snažno. Ligand vezujući domen koji je specifičan za ciljni alel jeste onaj koji može da pravi razliku između različitih alela gena. Na primer, ligand vezujući domen koji je specifičan za HLA-A*02 neće se vezivati, ili će se samo slabo vezivati za, druge HLA-A alele kao što je HLA-A*01 ili HLA-A*03. U kontekstu ovde opisanih receptora aktivatora i inhibitora, ligand vezujući domen posreduje u specifičnom aktiviranju ili inhibiciji odgovora imunskih ćelija. Stručnjak iz ove oblasti zna da se za ligand vezujući domen može reći da je specifičan za određeni cilj i da i dalje ima niske nivoe vezivanja za jedan dodatni cilj koji ne utiče na njegovu funkciju u ovde opisanim sistemima receptora ili više njih.
[0102] U slučaju sukoba, prednost će imati ova prijava, uključujući sve definicije iz nje. Međutim, pominjanje bilo koje ovde navedene reference, članka, publikacije, patenta, objave patenta i patentne prijave koja nije i ne treba se tumačiti kao potvrda, ili bilo koji oblik sugestije, da one čine važeće stanje tehnike ili da čine deo zajedničkog opšteg znanja u bilo kojoj zemlji sveta.
Receptori aktivatora
[0103] Ovo otkrivanje obezbeđuje prvi receptor, koji obuhvata prvi ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za ciljni antigen koji obuhvata antigen specifičan za ćelije kancera ili njegov antigen peptida u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I). Prvi receptor je receptor aktivatora i posreduje u aktiviranju imunske ćelije koja eksprimuje prvi receptor nakon vezivanja ciljnog antigena od strane ekstracelularnog ligand vezujućeg domena prvog receptora. Prvi receptor je osetljiv na ciljni antigen (tj. ligand aktivatora). Na primer, kada se ciljni antigen veže za prvi receptor ili stupi u kontakt sa njim, prvi receptor reaguje i aktivira imunsku ćeliju koja eksprimuje prvi receptor nakon vezivanja ciljnog antigena od strane ekstracelularnog ligand vezujućeg domena prvog receptora. U nekim načinima ostvarivanja, prvi receptor predstavlja himerni antigenski receptor (CAR). U nekim načinima ostvarivanja, prvi receptor je T-ćelijski receptor (TCR).
[0104] U nekim načinima ostvarivanja, prvi receptor je humanizovan. Kako se ovde koristi, „humanizovanˮ se odnosi na zamenu sekvence ili supsekvence u transgenu koji je izolovan ili izveden iz nehumane vrste homolognom, ili funkcionalno ekvivalentnom, humanom sekvencom. Na primer, humanizovano antitelo može se napraviti kalemljenjem mišjih CDR-ova na humane sekvence okvira, nakon čega sledi povratna supstitucija određenih humanih ostataka okvira odgovarajućim mišjim ostacima od izvornog antitela.
Aktivatorski ciljevi
[0105] Prema ovom pronalasku, ciljni antigen za prvi receptor je receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR) ili antigen peptida EGFR-a u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I).
[0106] Glavni kompleks histokompatibilnosti klase I (MHC-I) predstavlja proteinski kompleks koji ćelijama imunskog sistema prikazuje antigene, čime izaziva imunski odgovor. Humani leukocitni antigeni (HLA) koji odgovaraju MHC-I su HLA-A, HLA-B i HLA-C.
[0107] Ovde su opisani (nisu prema ovom pronalasku) pMHC antigeni specifični za ćelije kancera koji obuhvataju bilo koji od HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F ili HLA-G. Antigen specifičan za ćelije kancera može obuhvatati HLA-A (nije prema ovom pronalasku). HLA-A receptori su heterodimeri koji obuhvataju teški α lanac i manji β lanac. Varijanta HLA-A kodira α lanac, dok je β lanac (β2-mikroglobulin) konstantan (nije prema ovom pronalasku). Postoji nekoliko hiljada varijantnih HLA-A gena (nisu prema ovom pronalasku). MHC-I može obuhvatati humani leukocitni antigenski A*02 alel (HLA-A*02) (nije prema ovom pronalasku).
[0108] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, antigen specifičan za ćelije kancera obuhvata HLA-B. Poznate su stotine verzija (alela) HLA-B gena, pri čemu je svakoj od njih dodeljen određeni broj (kao što je HLA-B27).
[0109] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, antigen specifičan za ćelije kancera obuhvata HLA-C. HLA-C pripada HLA klasi I paraloga teškog lanca. Taj molekul klase I predstavlja heterodimer koji se sastoji od teškog lanca i lakog lanca (beta-2 mikroglobulin). U tehnici je poznato preko jedne stotine HLA-C alela.
[0110] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, antigen specifičan za ćelije kancera je antigen kancera pluća, antigen glioblastoma, antigen kancera dojke, antigen kancera glave i vrata ili antigen kolorektalnog kancera. Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, antigen specifičan za ćelije kancera je antigen kolorektalnog kancera. Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, antigen specifičan za ćelije kancera je EGFR ili njegov antigen peptida.
[0111] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, antigen specifičan za ćelije kancera je EGFR ili njegov antigen peptida u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I). EGFR je transmembranski protein koji predstavlja članove u obliku receptora iz porodice epidermalnog faktora rasta (EGF) ekstracelularnih proteinskih liganada. EGFR se naširoko eksprimuje u normalnim tkivima, kao što su mezenhimalna, epitelna i nervna tkiva i ima važnu ulogu u ćelijskoj proliferaciji, diferencijaciji i ćelijskom razvoju. EGFR se takođe izraženo eksprimuje u raznim solidnim tumorima pa se ekspresija EGFR-a povezuje sa napredovanjem tumora, rezistencijom na hemoterapiju i lošom prognozom.
[0112] Sve izoforme EGFR-a i klinički relevantne mutacije EGFR-a (npr. EGFRvIII, S468/492R) zamišljene su kao antigeni specifični za ćelije kancera ovog otkrivanja. EGFR izoforma a opisana je pod NCBI brojem zapisa NP_005219.2. U nekim načinima ostvarivanja, EGFR obuhvata aminokiselinsku sekvencu:
EGFR izoforma b opisana je pod NCBI brojem zapisa NP_958439.1. U nekim načinima ostvarivanja, EGFR obuhvata aminokiselinsku sekvencu:
EGFR izoforma c opisana je pod NCBI brojem zapisa NP_958440.1. U nekim načinima ostvarivanja, EGFR obuhvata aminokiselinsku sekvencu:
EGFR izoforma d opisana je pod NCBI brojem zapisa NP_958441.1. U nekim načinima ostvarivanja, EGFR obuhvata aminokiselinsku sekvencu:
EGFR izoforma e opisana je pod NCBI brojem zapisa NP_001333826.1. U nekim načinima ostvarivanja, EGFR obuhvata aminokiselinsku sekvencu:
EGFR izoforma f opisana je pod NCBI brojem zapisa NP_001333827.1. U nekim načinima ostvarivanja, EGFR obuhvata aminokiselinsku sekvencu:
EGFR izoforma h opisana je pod NCBI brojem zapisa NP_001333829.1. U nekim načinima ostvarivanja, EGFR obuhvata aminokiselinsku sekvencu:
EGFR izoforma i opisana je pod NCBI brojem zapisa NP_001333870.1. U nekim načinima ostvarivanja, EGFR obuhvata aminokiselinsku sekvencu:
U nekim načinima ostvarivanja, antigen specifičan za ćelije kancera je antigen peptida izveden iz EGFR-a. Na primer, antigen peptida obuhvata sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična sekvenci ili supsekvenci bilo koje od SEQ ID NO: 1-8. U nekim načinima ostvarivanja, antigen peptida obuhvata sekvencu koja je identična supsekvenci bilo koje od SEQ ID NO: 1-8 ili SEQ ID NO: 918-919.
Ekstracelularni ligand vezujući domen
[0113] Ovo otkrivanje obezbeđuje prvi receptor, koji obuhvata prvi ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za ciljni antigen. U nekim načinima ostvarivanja, ciljni antigen obuhvata antigen specifičan za ćelije kancera.
[0114] U nekim načinima ostvarivanja, antigen specifičan za ćelije kancera je EGFR ili antigen peptida izveden iz EGFR-a kompleksiran sa MHC-I pa ligand vezujući domen prvog receptora prepoznaje EGFR antigen i vezuje se za njega. U nekim načinima ostvarivanja, antigen specifičan za ćelije kancera je klinički relevantan mutant EGFR-a. Na primer, mutirana varijanta EGFR-a može biti mutacija supstitucije (npr. L858R na eksonu 21), mutacija brisanja (npr. EGFRvIII ili brisanja na eksonu 19 ili eksonu 23) ili mutacije amplifikacija na EGFR genu.
[0115] Nije prema ovom pronalasku: Ligand vezujući domen može biti antigen vezujući domen. Primerni antigen vezujući domeni, inter alia, uključuju scFv, SdAb, domene samo za Vβ i TCR antigen vezujuće domene izvedene iz varijabilnih domena α i β lanca TCR-a.
[0116] Na primer, prvi ekstracelularni ligand vezujući domen može biti deo susednog polipeptidnog lanca koji uključuje, na primer, domen samo za Vβ, fragment antitela sa jednim domenom (sdAb) ili antitela teškog lanca HCAb, antitelo sa jednim lancem (scFv) izvedeno iz mišjih, humanizovanih ili humanih antitela (Harlow et al., 1999, u: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; Harlow et al., 1989, u: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). U nekim aspektima, prvi ekstracelularni ligand vezujući domen obuhvata antigen vezujući domen koji obuhvata fragment antitela. U daljim aspektima, prvi ekstracelularni ligand vezujući domen obuhvata fragment antitela koji obuhvata scFv ili sdAb.
[0117] Pojam „antiteloˮ, kako se ovde koristi, odnosi se na proteinske ili polipeptidne sekvence izvedene iz molekula imunoglobulina, koji se specifično vezuje za antigen. Antitela mogu biti netaknuti imunoglobulini poliklonskog ili monoklonskog porekla ili njegovi fragmenti i mogu se izvesti iz prirodnih ili iz rekombinantnih izvora.
[0118] Pojmovi „fragment antitelaˮ ili „antitelo vezujući domenˮ odnose se na najmanje jedan deo antitela, ili njegove rekombinantne varijante, koji sadrži antigen vezujući domen, tj. varijabilni region za antigensko utvrđivanje netaknutog antitela, koji je dovoljan da cilju, kao što je antigen i njegov definisani epitop, prenese prepoznavanje i specifično vezivanje fragmenta antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente, jednolančane (sc)Fv („scFvˮ) fragmente antitela, linearna antitela, antitela sa jednim domenom (skraćeno „sdAbˮ) (bilo VL ili VH), kamilje VHH domene i multispecifična antitela obrazovana od fragmenata antitela.
[0119] Pojam „scFvˮ odnosi se na fuzioni protein koji obuhvata najmanje jedan fragment antitela koji obuhvata varijabilni region lakog lanca i najmanje jedan fragment antitela koji obuhvata varijabilni region teškog lanca, pri čemu su varijabilni regioni lakog i teškog lanca susedno povezani putem kratkog fleksibilnog polipeptidnog veznika i mogu se eksprimovati kao jedan polipeptidni lanac i gde scFv zadržava specifičnost netaknutog antitela iz kog je izveden.
[0120] „Varijabilni region teškog lancaˮ ili „VHˮ (ili, u slučaju antitela sa jednim domenom, npr. nanotela, „VHHˮ) u odnosu na antitelo odnosi se na fragment teškog lanca koji sadrži tri CDR-a umetnuta između bočnih protezanja koji su poznati kao regioni okvira, pri čemu su ti regioni okvira uglavnom očuvaniji od CDR-ova i obrazuju osnovu za nošenje CDR-ova.
[0121] Osim ukoliko je naznačeno, kako se ovde koristi scFv može imati VL i VH varijabilne regione u obama redosledima, npr. u odnosu na N-terminalni i C-terminalni kraj polipeptida, scFv može obuhvatati VL-veznik-VH ili može obuhvatati VH-veznik-VL.
[0122] U nekim načinima ostvarivanja, antigen vezujući domen receptora aktivatora i/ili inhibitora obuhvata scFv. U nekim načinima ostvarivanja, scFv može obuhvatati VL i VH region spojen veznikom. U nekim načinima ostvarivanja, veznik može obuhvatati glicin-serinski veznik, na primer GGGGSGGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 136). U nekim načinima ostvarivanja, scFv može takođe obuhvatati signalnu sekvencu na N terminalu scFv-a. Primerne signalne sekvence uključuju MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC (SEQ ID NO: 137), kog kodira
ili
[0123] Pojam „laki lanac antitelaˮ odnosi se na manji od dveju vrsta polipeptidnih lanaca prisutnih u molekulima antitela u njihovim prirodno nastalim konformacijama. Kapa („Kˮ) i lambda („λˮ) laki lanci odnose se na dva glavna izotopa lakih lanaca antitela.
[0124] Pojam „rekombinantno antiteloˮ odnosi se na antitelo koje se generiše pomoću rekombinantne DNK tehnologije, kao što je, na primer, antitelo koje eksprimuje sistem ekspresije bakteriofaga ili kvasaca. Pojam takođe treba tumačiti tako da označava antitelo, koje je generisano sintezom DNK molekula koji kodira antitelo i gde taj DNK molekul eksprimuje protein antitela ili aminokiselinsku sekvencu koja specifikuje antitelo, pri čemu je DNK ili aminokiselinska sekvenca dobijena pomoću rekombinantne DNK tehnologije ili tehnologije aminokiselinskih sekvenci, koja je dostupna i dobro poznata u tehnici.
[0125] Pojam „Vβ domenˮ, „domen samo za Vβˮ, „varijabilni domen β lancaˮ ili „jednostruki varijabilni domen TCR (svd-TCR)ˮ odnosi se na antigen vezujući domen koji se suštinski sastoji od beta varijabilnog domena jednog T-ćelijskog receptora (TCR) koji se specifično vezuje za antigen u odsustvu drugog TCR varijabilnog domena. Domen samo za Vβ ulazi u zahvat sa antigenom pomoću regiona za utvrđivanje komplementarnosti (CDR). Svaki domen samo za Vβ sadrži tri regiona za utvrđivanje komplementarnosti (CDR1, CDR2 i CDR3). Dodatni elementi mogu se kombinovati pod uslovom da je Vβ domen konfigurisan da vezuje epitop u odsustvu drugog TCR varijabilnog domena.
[0126] U nekim načinima ostvarivanja, ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata fragment antitela, jednolančani Fv fragment antitela (scFv) ili varijabilni domen β lanca (Vβ).
[0127] U nekim načinima ostvarivanja, ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata varijabilni domen α lanca TCR-a i varijabilni domen β lanca TCR-a.
[0128] U nekim načinima ostvarivanja, ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata scFv antigen vezujući domen. Primerni EGFR scFv prikazani su u tabeli 1 koja sledi.
Tabela 1. EGFR scFv domeni
CT-478 EGFR (VH-VL scFv format): CT-478 EGFR:
CT-481 EGFR (VL-VH scFv format): CT-481 EGFR:
CT-486 EGFR (VH-VL scFv format): CT-486 EGFR:
[0129] U nekim načinima ostvarivanja, ligand aktivatora je EGFR ili njegov antigen peptida a domen koji vezuje ligand aktivatora obuhvata EGFR vezujući domen. U nekim načinima ostvarivanja, EGFR ligand vezujući domen obuhvata scFv domen. Na primer, EGFR ligand vezujući domen može obuhvatati sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 9-18.Na primer, EGFR ligand vezujući domen može obuhvatati sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 9-18. U nekim načinima ostvarivanja, EGFR ligand vezujući domen kodira sekvenca odabrana iz grupe sekvenci u tabeli 1. Na primer, EGFR ligand vezujući domen kodira sekvenca koja je najmanje 80% identična, najmanje 85% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična ili najmanje 99% identična sekvenci iz tabele 1. Podrazumeva se da scFv domeni ovog otkrivanja koji vezuju EGFR mogu unakrsno reagovati sa jednom varijantom EGFR-a ili više njih. Na primer, scFv može vezivati najmanje jedan od normalnog EGFR-a, varijante EGFR-a ili mutiranog EGFR-a (npr. EGFRvIII).
[0130] Na primer, ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata scFv antigen vezujući domen koji je najmanje 80% identičan, najmanje 85% identičan, najmanje 90% identičan, najmanje 95% identičan, najmanje 97% identičan ili najmanje 99% identičan bilo kojoj od SEQ ID NO: 9-18. Kao što je ovde opisano, ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata scFv antigen vezujući domen koji obuhvata sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 9-18. Kao što je ovde opisano, ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora suštinski se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 9-18. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata scFv sekvencu SEQ ID NO: 18 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična.
Tabela 2. Varijabilni teški (VH) i varijabilni lak (VL) domeni EGFR-a
[0131] U nekim načinima ostvarivanja, ligand aktivatora je EGFR ili njegov antigen peptida a domen koji vezuje ligand aktivatora obuhvata EGFR ligand vezujući domen. Kao što je ovde opisano, EGFR vezujući domen obuhvata VH i/ili VL domen odabran iz grupe navedene u tabeli 2 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična najmanje 95% identična, najmanje 97% identična ili najmanje 99% identična. Kao što je ovde opisano, EGFR ligand vezujući domen obuhvata VH domen odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 19-24. Kao što je ovde opisano, EGFR ligand vezujući domen obuhvata VH odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 19-24 ili sekvencu koja joj je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% identična. Kao što je ovde opisano, EGFR ligand vezujući domen obuhvata VL domen odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 25-30. Kao što je ovde opisano, EGFR ligand vezujući domen obuhvata VL odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 25-30 ili sekvencu koja joj je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% identična.
Tabela 3. CDR-ovi EGFR antigen vezujućih domena.
[0132] U nekim načinima ostvarivanja, ligand aktivatora je EGFR ili njegov antigen peptida a domen koji vezuje ligand aktivatora je EGFR ligand vezujući domen. Kao što je ovde opisano, EGFR vezujući domen obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDR) odabrane iz grupe CDR-ova navedenih u tabeli 3. Kao što je ovde takođe opisano, EGFR ligand vezujući domen obuhvata CDR-ove koji imaju najmanje 95% identiteta sekvence sa CDR-ovima navedenim u tabeli 3. Kao što je ovde takođe opisano, EGFR ligand vezujući domen obuhvata CDR-ove izabrane od SEQ ID NO: 31-65. Kao što je ovde takođe opisano, EGFR ligand vezujući domen obuhvata CDR 1 teškog lanca (CDR H1) odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 31-36. Kao što je ovde takođe opisano, EGFR ligand vezujući domen obuhvata CDR 2 teškog lanca (CDR H2) odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 37-42. Kao što je ovde takođe opisano, EGFR ligand vezujući domen obuhvata CDR 3 teškog lanca (CDR H3) odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 43-48. Kao što je ovde takođe opisano, EGFR ligand vezujući domen obuhvata CDR 1 lakog lanca (CDR L1) odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 49-54. Kao što je ovde takođe opisano, EGFR ligand vezujući domen obuhvata CDR 2 lakog lanca (CDR L2) odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 55-59. Kao što je ovde takođe opisano, EGFR ligand vezujući domen obuhvata CDR 3 lakog lanca (CDR L3) odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 60-65. Kao što je ovde takođe opisano, EGFR ligand vezujući domen obuhvata CDR H1 izabran od SEQ ID NO: 31-36, CDR H2 izabran od SEQ ID NO: 37-42, CDR H3 izabran od SEQ ID NO: 43-48, CDR L1 izabran od SEQ ID NO: 49-54, CDR L2 izabran od SEQ ID NO: 55-59 i CDRL3 izabran od SEQ ID NO: 60-65.
[0133] Ovde je opisano i da je(su) jedan aminokiselinski ostatak u CDR-u ovde obezbeđenih antigen vezujućih domena ili više njih (npr.1, 2, 3, 4, 5 ili 6) supstituisan(i) drugom aminokiselinom. Supstitucija može biti „konzervativnaˮ u smislu da predstavlja supstituciju unutar iste porodice aminokiselina.
Aminokiseline koje se prirodno javljaju mogu se podeliti u sledeće četiri porodice, pa će se konzervativne supstitucije dešavati unutar tih porodica: (1) aminokiseline sa baznim bočnim lancima: lizin, arginin, histidin; (2) aminokiseline sa kiselim bočnim lancima: asparaginska kiselina, glutaminska kiselina; (3) aminokiseline sa nenaelaktrisanim polarnim bočnim lancima: asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin i (4) aminokiseline sa nepolarnim bočnim lancima: glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan, cistein. Variranjem aminokiselinske sekvence CDR-ova antitela dodavanjem, brisanjem ili supstitucijom aminokiselina, mogu se postići razni efekti kao što je povećan afinitet vezivanja za ciljni antigen.
Himerni antigenski receptori (CAR)
[0134] Ovo otkrivanje obezbeđuje prvi, receptor aktivatora i imunske ćelije koje ga obuhvataju. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, prvi receptor predstavlja himerni antigenski receptor.
[0135] Ovde je opisano da prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 175 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Ovde je takođe opisano da prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 176 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 177 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0136] Pojam „himerni antigenski receptori (CAR)ˮ kako se ovde koristi, može se odnositi na veštačke receptore izvedene iz T-ćelijskih receptora i obuhvata dizajnirane receptore koji kaleme veštačku specifičnost na određenu imunsku efektorsku ćeliju. CAR-ovi se mogu koristiti da prenesu specifičnost monoklonskog antitela na T-ćeliju, čime omogućavaju stvaranje velikog broja specifičnih T-ćelija, na primer, za upotrebu u adoptivnoj ćelijskoj terapiji. U specifičnim načinima ostvarivanja, CAR-ovi, na primer, usmeravaju specifičnost ćelije ka antigenu povezanom sa tumorom. Primerni CAR-ovi obuhvataju intracelularni aktivirajući domen, transmembranski domen i ekstracelularni domen koji obuhvata region koji vezuje antigene povezane sa tumorom. U nekim načinima ostvarivanja, CAR-ovi obuhvataju i zglobni domen. U određenim aspektima, CAR-ovi obuhvataju fuzije jednolančanih varijabilnih fragmenata (scFv) izvedenih iz monoklonskih antitela, koji su spojeni sa CD3 transmembranskim domenom i endodomenom. Specifičnost drugih CAR dizajna može se izvesti iz liganada receptora (npr. peptida). U određenim slučajevima, CAR-ovi obuhvataju domene za dodatno kostimulatorno signaliziranje, kao što su CD3, 4-1BB, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10 i/ili OX40. U nekim se slučajevima molekuli mogu koeksprimovati sa CAR-om, uključujući kostimulatorne molekule, reporterske gene za snimanje, genske produkte koji uslovno vrše ablaciju T-ćelija nakon dodavanja proleka, homing receptora, citokina i receptora citokina.
[0137] U nekim je načinima ostvarivanja ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora spojen sa ekstracelularnim domenom CAR-a.
[0138] U nekim načinima ostvarivanja, CAR-ovi ovog otkrivanja mogu obuhvatati ekstracelularni zglobni region. Uključivanje zglobnog regiona može uticati na proizvodnju citokina iz CAR-T-ćelija i poboljšati širenje CAR-T-ćelija in vivo. Primerni zglobovi se mogu izolovati ili izvesti iz IgD i CD8 domena, na primer IgG1. Zglob se, na primer, može izolovati ili izvesti iz CD8α ili CD28.
[0139] Na primer, zglob se može izolovati ili izvesti iz CD8α ili CD28. CD8α zglob može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili potpuno identična sekvenci TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 66). CD8α zglob može obuhvatati SEQ ID NO: 66. CD8α zglob se suštinski može sastojati od SEQ ID NO: 66. CD8α zglob može kodirati nukleotidna sekvenca koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili može biti potpuno identična sekvenci
CD8α zglob može biti kodiran od strane SEQ ID NO: 67.
[0140] CD28 zglob obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili može biti potpuno identična sekvenci CTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 68). CD28 zglob može obuhvatati ili se suštinski sastojati od SEQ ID NO: 68. CD28 zglob može kodirati nukleotidna sekvenca koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili može biti potpuno identična sekvenci TGTACCATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGA AACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC(SEQ ID NO: 69). CD28 zglob može biti kodiran od strane SEQ ID NO: 69.
[0141] CAR-ovi ovog otkrivanja mogu se dizajnirati tako da obuhvataju transmembranski domen koji je spojen sa ekstracelularnim domenom CAR-a. Može se koristiti transmembranski domen koji je prirodno povezan sa jednim od domena u CAR-u. Na primer, CAR koji obuhvata CD28 kostimulatorni domen takođe može koristiti CD28 transmembranski domen. Transmembranski domen se može izabrati ili modifikovati aminokiselinskom supstitucijom kako bi se izbeglo vezivanje takvih domena za transmembranske domene istih ili različitih površinskih membranskih proteina kako bi se interakcije sa drugim članovima receptorskog kompleksa svele na minimum.
[0142] Transmembranski domen može se izvesti bilo iz prirodnog ili iz sintetičkog izvora. Kada je izvor prirodan, domen se može izvoditi bilo kog membranski vezanog ili transmembranskog proteina.
Transmembranski regioni mogu se izolovati ili izvesti iz (tj. obuhvatati najmanje transmembranski(e) region(e)) alfa, beta ili zeta lanca T-ćelijskog receptora, CD28, CD3 epsilona, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 ili iz imunoglobulina kao što je IgG4. Alternativno, transmembranski domen može biti sintetički, pri čemu će u tom slučaju pretežno obuhvatati hidrofobne ostatke kao što su leucin i valin. Na primer, trojka fenilalanina, triptofana i valina naći će se na svakom kraju sintetičkog transmembranskog domena. Kratki oligo ili poli peptidni veznik, poželjno između 2 aminokiseline i 10 aminokiselina dug može opciono obrazovati vezu između transmembranskog domena i citoplazmatskog signalnog domena CAR-a. Glicin-serinska dvojka predstavlja naročito prikladan veznik.
[0143] CAR-ovi ovog otkrivanja mogu obuhvatati CD28 transmembranski domen. Na primer, CD28 transmembranski domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili potpuno identična sekvenci FWVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 70). Kao što je ovde opisano, CD28 transmembranski domen obuhvata ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 70. Kao što je ovde takođe opisano, CD28 transmembranski domen kodira nukleotidna sekvenca koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili potpuno identična sekvenci TTCTGGGTGCTGGTCGTTGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTG GGTG (SEQ ID NO: 71). U nekim je načinima ostvarivanja CD28 transmembranski domen kodiran od strane SEQ ID NO: 71.
[0144] CAR-ovi ovog otkrivanja mogu obuhvatati IL-2Rbeta transmembranski domen. Na primer, IL-2Rbeta transmembranski domen može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili može biti potpuno identična sekvenci IPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLI (SEQ ID NO: 72). Na primer, IL-2Rbeta transmembranski domen može obuhvatati ili se suštinski sastojati od SEQ ID NO: 72. Na primer, IL-2Rbeta transmembranski domen može kodirati nukleotidna sekvenca koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili može biti potpuno identična sekvenci
ATTCCGTGGC TCGGCCACCT CCTCGTGGGC CTCAGCGGGG CTTTTGGCTT CATCATCTTA GTGTACTTGC TGATC
(SEQ ID NO: 73). Na primer, IL-2Rbeta transmembranski domen može biti kodiran od strane SEQ ID NO: 73.
[0145] Citoplazmatski domen ili drugačije intracelularni signalni domen CAR-ova ovog otkrivanja odgovaran je za aktiviranje najmanje jedne od normalnih efektorskih funkcija imunske ćelije u koju se CAR postavi. Pojam „efektroska funkcijaˮ odnosi se na specijalizovanu funkciju ćelije. Samim tim se pojam „intracelularni signalni domenˮ odnosi na deo proteina, koji transdukuje signal efektroske funkcije i usmerava ćeliju da izvodi specijalizovanu funkciju. Iako se obično može koristiti čitav intracelularni signalni domen, u mnogim slučajevima nije neophodno koristiti čitav domen. Kada se koristi skraćeni deo intracelularnog signalnog domena, takav se skraćeni deo može koristiti umesto netaknutog lanca dokle god transdukuje signal efektroske funkcije. U nekim slučajevima, višestruki intracelularni domeni mogu se kombinovati kako bi se postigle željene funkcije CAR-T-ćelija ovog otkrivanja. Stoga se pojmom intracelularni signalni domen uključuje bilo koji skraćeni deo jednog intracelularnog signalnog domena koji je dovoljan da transdukuje signal efektroske funkcije ili više njih.
[0146] Primeri intracelularnih signalnih domena za upotrebu u CAR-ovima ovog otkrivanja uključuju citoplazmatske sekvence T-ćelijskog receptora (TCR) i koreceptora koji zajednički deluju da pokrenu transdukciju signala nakon sprezanja receptora antigena, kao i bilo koji derivat ili bilo koju varijantu tih sekvenci i bilo koju sintetičku sekvencu koja ima isti funkcionalni kapacitet.
[0147] Prema tome, intracelularni domen CAR-ova ovog otkrivanja obuhvata najmanje jedan citoplazmatski aktivirajući domen. Kao što je ovde opisano, intracelularni aktivirajući domen osigurava signaliziranje T-ćelijskih receptora (TCR) neophodno za aktiviranje efektorskih funkcija CAR T-ćelija. Na primer, najmanje jedno citoplazmatsko aktiviranje je CD247 molekulski (CD3ζ) aktivirajući domen, stimulatorni ubici imunoglobulina sličan receptorski (KIR) KIR2DS2 aktivirajući domen ili DNAX-aktivirajući proteinski od 12 kDa (DAP12) aktivirajućeg domena.
[0148] Na primer, CD3ζ aktivirajući domen može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili može biti potpuno identična sekvenci RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEG LYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 74). Na primer, CD3ζ aktivirajući domen može obuhvatati ili se suštinski sastojati od SEQ ID NO: 74. Na primer, CD3ζ aktivirajući domen može kodirati nukleotidna sekvenca koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili može biti potpuno identična sekvenci AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAAT CTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGCGTAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAG AAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGG GATGAAA GGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGACTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGA CGC CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC (SEQ ID NO: 75). Kao što je ovde opisano, CD3ζ aktivirajući domen može biti kodiran od strane SEQ ID NO: 75.
[0149] Poznato je da su signali generisani putem samo TCR-a često nedovoljni za potpuno aktiviranje T-ćelije i da je takođe neophodan sekundarni ili kostimulatorni signal. Dakle, može se reći da će T-ćelijsko aktiviranje biti posredovano dvema različitim klasama citoplazmatske signalne sekvence: onih koje pokreću antigen zavisno primarno aktiviranje putem TCR-a (primarnih citoplazmatskih signalnih sekvenci) i onih koje deluju na antigen zavisan način kako bi obezbedile sekundarni ili kostimulatorni signal (sekundarnih citoplazmatskih signalnih sekvenci).
[0150] Primarne citoplazmatske signalne sekvence regulišu primarno aktiviranje kompleksa TCR-a bilo na stimulatorni način ili na inhibitorni način. Primarne citoplazmatske signalne sekvence koje deluju na stimulatorni način mogu sadržati signalne motive, koji su poznati kao imunoreceptorski tirozin bazirani aktivirajući motivi ili ITAM. Kao što je ovde opisano, ITAM može sadržati tirozin odvojen od leucina ili izoleucina dvema drugim aminokiselinama (YxxL/1) (SEQ ID NO: 157). Kao što je ovde takođe opisano, citoplazmatski domen može sadržati 1, 2, 3, 4 ili 5 ITAM-ova. Primerni ITAM koji sadrži citoplazmatski domen predstavlja CD3ζ aktivirajući domen. Dalji primeri ITAM-a koji sadrži primarne citoplazmatske signalne sekvence koje se mogu koristiti u CAR-ovima ovog otkrivanja mogu uključivati one izvedene iz TCRζ, FcRy, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD5, CD22, CD79a, CD79b i CD66d.
[0151] Na primer, CD3ζ aktivirajući domen koji obuhvata jedan ITAM može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili može biti potpuno identična sekvenci RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR (SEQ ID NO: 76). Na primer, CD3ζ aktivirajući domen može obuhvatati SEQ ID NO: 76. Na primer, CD3ζ aktivirajući domen koji obuhvata jedan ITAM suštinski se može sastojati od aminokiselinske sekvence RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLHMQALPPR (SEQ ID NO: 76). Na primer, CD3ζ aktivirajući domen koji obuhvata jedan ITAM može kodirati nukleotidna sekvenca koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili može biti potpuno identična sekvenci
AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGACGCC CCCGCGTACC AGCAGGGCCA GAACCAGCTC TATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG GAGTACGATG TTTTGCACAT GCAGGCCCTG CCCCCTCGC (SEQ ID NO: 77). Kao što je ovde opisano, CD3ζ aktivirajući domen može biti kodiran od strane SEQ ID NO: 77.
[0152] Citoplazmatski domen CAR-a može biti dizajniran tako da obuhvata sam CD3ζ signalni domen ili u kombinaciji sa bilo kojim drugim željenim citoplazmatskim domenom(ima) korisnim u kontekstu CAR-a ovog otkrivanja. Na primer, citoplazmatski domen CAR-a može obuhvatati CD3ζ deo lanca i kostimulatorni domen. Kostimulatorni domen odnosi se na deo CAR-a koji obuhvata intracelularni domen kostimulatornog molekula. Kostimulatorni molekul je membranski molekul koji se razlikuje od receptora antigena ili njegovih liganada koji je neophodan za efikasan odgovor limfocita na antigen.
Primeri takvih molekula uključuju kostimulatorni domen odabran iz grupe koju čine IL-2Rβ, Fc receptor gama (FcRy), Fc receptor beta (FcRβ), CD3g molekul gama (CD3y), CD3δ, CD3ε, CD5 molekul (CD5), CD22 molekul (CD22), CD79a molekul (CD79a), CD79b molekul (CD79b), karcinoembrionski antigenski povezan ćelijski adhezioni molekul 3 (CD66d), CD27 molekul (CD27), CD28 molekul (CD28), TNF receptorski superporodični član 9 (4-1BB), TNF receptorski superporodični član 4 (OX40), TNF receptorski superporodični član 8 (CD30), CD40 molekul (CD40), programirana ćelijska smrt 1 (PD-1), inducibilni T-ćelijski kostimulator (ICOS), sa limfocitnom funkcijom povezan antigen-1 (LFA-1), CD2 molekul (CD2), CD7 molekul (CD7), TNF superporodični član 14 (LIGHT), ćelijama ubicama lektinu sličan receptor C2 (NKG2C) i CD276 molekul (B7-H3) c-stimulatorni domeni ili njihovi funkcionalni fragmenti. Intracelularni domeni CAR-ova ovog otkrivanja obuhvataju najmanje jedan kostimulatorni domen. Na primer, kostimulatorni domen je izolovan ili izveden iz CD28.
[0153] Intracelularni domeni CAR-ova ovog otkrivanja obuhvataju najmanje jedan kostimulatorni domen. Na primer, kostimulatorni domen je izolovan ili izveden iz CD28. Na primer, CD28 kostimulatorni domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili potpuno identična sekvenci RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 78). Na primer, CD28 kostimulatorni domen obuhvata ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 78. Na primer, CD28 kostimulatorni domen kodira nukleotidna sekvenca koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili potpuno identična sekvenci AGGAGCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGAG GCCTGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCTCCCAGGGATTTCGCCGC CTACCGGAGC (SEQ ID NO: 79). Kao što je ovde opisano, CD28 kostimulatorni domen kodiran je od strane SEQ ID NO: 79.
Citoplazmatski domeni unutar citoplazmatskog signalnog dela CAR-ova ovog otkrivanja mogu se međusobno povezati po nasumičnom ili određenom redosledu. Kratki oligo ili poli peptidni veznik, na primer između 2 aminokiseline i 10 aminokiselina dug može opciono obrazovati vezu. Glicin-serinska dvojka predstavlja primer prikladnog veznika.
[0154] Na primer, kostimulatorni domen je izolovan ili izveden iz 4-1BB. Na primer, 4-1BB kostimulatorni domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili potpuno identična sekvenci KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 159). Kao što je ovde opisano, 4-1BB kostimulatorni domen obuhvata ili se suštinski sastoji od KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 159). Na primer, 4-1BB kostimulatorni domen kodira nukleotidna sekvenca koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična ili potpuno identična sekvenci
[0155] Intracelularni domen CAR-a može obuhvatati CD28 kostimulatorni domen, 4-1BB kostimulatorni domen i CD3ζ aktivirajući domen. Na primer, intracelularni domen CAR-a može obuhvatati sekvencu RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRP VQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDV LDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 158) ili sekvencu koja joj je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 99% identična.
[0156] Citoplazmatski domeni unutar citoplazmatskog signalnog dela CAR-ova ovog otkrivanja mogu se međusobno povezati po nasumičnom ili određenom redosledu. Kratki oligo ili poli peptidni veznik, na primer između 2 aminokiseline i 10 aminokiselina dug može opciono obrazovati vezu. Glicin-serinska dvojka predstavlja primer prikladnog veznika. Primerni veznik obuhvata sekvencu GGGGSGGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 136).
[0157] Citoplazmatski domeni unutar citoplazmatskog signalnog dela CAR-ova ovog otkrivanja mogu se međusobno povezati po nasumičnom ili određenom redosledu. Kratki oligo ili poli peptidni veznik, na primer između 2 aminokiseline i 10 aminokiselina dug može opciono obrazovati vezu. Glicin-serinska dvojka predstavlja primer prikladnog veznika.
T-ćelijski receptori (TCR)
[0158] Ovo otkrivanje obezbeđuje prvi, receptor aktivatora i imunske ćelije koje ga obuhvataju. Prvi receptor može biti T-ćelijski receptor (TCR).
[0159] Primerni TCR-ovi koji obuhvataju intracelularne domene za upotrebu u ovom otkrivanju opisani su u PCT/US2020/045250 podnetom 6. septembra 2020.
[0160] Kako se ovde koristi, „TCRˮ, koji se ponekad zove i „kompleks TCR-aˮ ili „TCR/CD3 kompleksˮ odnosi se na proteinski kompleks koji obuhvata alfa lanac TCR-a, beta lanac TCR-a i jedan konstantni CD3 lanac ili više njih (zeta, gama, delta i epsilon), koji se ponekad nazivaju podjedinicama. Alfa i beta lanci TCR-a mogu biti disulfidno povezani sa funkcijom kao heterodimer kako bi se vezali za peptid-MHC komplekse. Kada TCR alfa/beta heterodimer uđe u zahvat sa peptid-MHC-om, indukuju se konformacione promene u kompleksu TCR-a u povezanim konstantnim CD3 podjedinicama, što dovodi do njihove fosforilacije i povezivanja sa nishodnim proteinima, čime se transdukuje primarni stimulatorni signal. U primernom kompleksu TCR-a, TCR alfa i TCR beta polipeptidi obrazuju heterodimer, CD3 epsilon i CD3 delta obrazuju heterodimer, CD3 epsilon i CD3 gama obrazuju za heterodimer i dva CD3 zeta obrazuju homodimer.
[0161] Bilo koji prikladni ligand vezujući domen može se spojiti sa ovde opisani ekstracelularnim domenom, zglobnim domenom ili transmembranskim TCR-ova. Na primer, ligand vezujući domen može biti antigen vezujući domen antitela ili TCR-a ili obuhvatati fragment antitela, domen samo za Vβ, linearno antitelo, jednolančani varijabilni fragment (scFv) ili antitelo sa jednim domenom (sdAb).
[0162] Ligand vezujući domen može se spojiti sa jednim ekstracelularnim domenom ili transmembranskim domenom ili više njih jedne TCR podjedinice ili više njih. TCR podjedinica može biti TCR alfa, TCR beta, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 gama ili CD3 zeta. Na primer, ligand vezujući domen može se spojiti sa TCR alfa ili TCR beta ili se delovi ligand vezujućeg mogu spojiti sa dvema podjedinicama, na primer delovi ligand vezujućeg domena mogu se spojiti i sa TCR alfa i sa TCR beta.
[0163] TCR podjedinice uključuju TCR alfa, TCR beta, CD3 zeta, CD3 delta, CD3 gama i CD3 epsilon. Bilo koji ili više od TCR alfa, TCR beta lanca, CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon ili CD3 zeta ili njihovih fragmenata ili derivata, može(gu) se spojiti sa jednim domenom koji može da obezbedi stimulatorni signal ovog otkrivanja ili više njih, čime se poboljšava funkcija i dejstvo TCR-a.
[0164] Zamišljeno je da su transmembranski domeni TCR-a izolovani ili izvedeni iz bilo kog izvora unutar obima ovog otkrivanja. Transmembranski domen može se izvesti bilo iz prirodnog ili iz rekombinantnog izvora. Kada je izvor prirodan, domen se može izvesti iz bilo kog membranski vezanog ili transmembranskog proteina.
[0165] Transmembranski domen može da signalizira intracelularnom(im) domenu(ima) kadgod se kompleks TCR-a veže za cilj. Transmembranski domen naročite upotrebe u ovom otkrivanju može uključivati najmanje transmembranski(e) region(e) npr. alfa, beta ili zeta lanca TCR-a, CD3 delta, CD3 epsilon ili CD3 gama, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154.
[0166] Transmembranski domen može se pričvrstiti za ekstracelularni region polipeptida TCR-a, npr. antigen vezujući domen alfa ili beta lanca TCR-a, preko zgloba, npr. zgloba iz humanog proteina. Na primer, zglob može biti humani imunoglobulinski (Ig) zglob, npr. IgG4 zglob ili CD8a zglob. Zglob se može izolovati ili izvesti iz CD8α ili CD28.
[0167] Ekstracelularni ligand vezujući domen može se pričvrstiti za jedan transmembranski domen TCR-a ili više njih. Transmembranski domen može obuhvatati TCR alfa transmembranski domen, TCR beta transmembranski domen ili oba. Transmembranski može obuhvatati CD3 zeta transmembranski domen.
[0168] Transmembranski domen može uključivati jednu dodatnu aminokiselinu susednu transmembranskom regionu ili više njih, npr. jednu aminokiselinu povezanu sa ekstracelularnim regionom proteina iz kog je transmembranski izveden ili više njih (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili do 15 aminokiselina ekstracelularnog regiona) i/ili jednu dodatnu aminokiselinu povezanu sa intracelularnim regionom proteina iz kog je transmembranski protein izveden ili više njih (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili do 15 aminokiselina intracelularnog regiona).
[0169] Transmembranski domen se može izabrati ili modifikovati aminokiselinskom supstitucijom kako bi se izbeglo vezivanje takvih domena za transmembranske domene istih ili različitih površinskih membranskih proteina, npr. kako bi se interakcije sa drugim članovima receptorskog kompleksa svele na minimum.
[0170] Kada je prisutan, transmembranski domen može biti prirodni transmembranski domen TCR-a, prirodni transmembranski domen iz heterolognog membranskog proteina ili veštački transmembranski domen. Transmembranski domen može biti membranski vezan domen. Bez ograničavanja, prirodni ili veštački transmembranski domen može obuhvatati hidrofobnu a-spiralu od oko 20 aminokiselina, često sa pozitivnim naelektrisanjima koja flankiraju transmembranski segment. Transmembranski domen može imati jedan transmembranski segment ili više od jednog transmembranskog segmenta. Predikcija transmembranskih domena/segmenata može se izvesti pomoću javno dostupnih predikcionih alata (npr. TMHMM, Krogh et al. Journal of Molecular Biology 2001; 305(3):567-580 ili TMpred, Hofmann & Stoffel Biol. Chem. Hoppe-Seyler 1993; 347: 166). Neograničavajući primeri membranski vezanih sistema uključuju transmembranski domen receptora faktora rasta izvedenog iz trombocita (PDGFR), glikozilfosfatidilinozitolskog (GPI) sidra (dodatog posle translacije u signalnu sekvencu) i slične.
[0171] Transmembranski domen može obuhvatati TCR alfa transmembranski domen. TCR alfa transmembranski domen može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 96% identična, najmanje 97% identična, najmanje 98% identična, najmanje 99% identična ili može biti potpuno identična sekvenci:
VIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLW (SEQ ID NO: 80). TCR alfa transmembranski domen može obuhvatati ili se suštinski sastojati od SEQ ID NO: 80. TCR alfa transmembranski domen može kodirati sekvenca
[0172] Transmembranski domen može obuhvatati TCR beta transmembranski domen. TCR beta transmembranski domen može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 96% identična, najmanje 97% identična, najmanje 98% identična, najmanje 99% identična ili može biti potpuno identična sekvenci:
TILYEILLGKATLYAVLVSALVL (SEQ ID NO : 82). TCR beta transmembranski domen može obuhvatati ili se suštinski sastojati od SEQ ID NO: 82. TCR beta transmembranski domen može kodirati sekvenca ACCATCCTCTATGAGATCTTGCTAGGGAAGGCCACCTTGTATGCCGTGCTGGTCAGTGCCCTCGTGCTG (SEQ ID NO: 83).
[0173] TCR-ovi ovog otkrivanja mogu obuhvatati jedan intracelularni domen ili više njih. Intracelularni domen može obuhvatati jedan domen koji može da obezbedi stimulatorni signal transmembranskom domenu ili više njih. Intracelularni domen može obuhvatati prvi intracelularni domen koji može da obezbedi stimulatorni signal i drugi intracelularni domen koji može da obezbedi stimulatorni signal. Intracelularni domen može obuhvatati prvi, drugi i treći intracelularni domen koji može da obezbedi stimulatorni signal. Intracelularni domeni koji mogu da obezbede stimulatorni signal mogu se odabrati iz grupe koju čine CD28 molekulski (CD28) domen, LCK proto-onkogen, Src porodični tirozin kinazni (Lck) domen, TNF receptorski superporodični članski 9 (4-1BB) domen, TNF receptorski superporodični članski 18 (GITR) domen, CD4 molekulski (CD4) domen, CD8a molekulski (CD8a) domen, FYN proto-onkogen, Src porodični tirozin kinazni (Fyn) domen, zeta lanac domena proteinske kinazne 70 povezane sa T-ćelijskim receptorom (ZAP70), veznik za aktiviranje T-ćelijskog (LAT) domena, limfocitni citozolni proteinski 2 (SLP76) domen, (TCR) alfa, TCR beta, CD3 delta, CD3 gama i CD3 epsilon intracelularni domeni.
[0174] Intracelularni domen može obuhvatati najmanje jedan intracelularni signalni domen.
Intracelularni signalni domen generiše signal koji podstiče funkciju ćelije, na primer imunske efektroske funkcije ćelije koja sadrži TCR-ove, npr. T-ćelije koja eksprimuje TCR-ove. Intracelularni domen prvog receptora ovog otkrivanja može uključivati najmanje jedan intracelularni signalni domen. Na primer, intracelularni domeni CD3 game, delte ili epsilona mogu obuhvatati signalne domene.
[0175] Ekstracelularni domen, transmembranski domen i intracelularni domen mogu se izolovati ili izvesti iz istog proteina, na primer T-ćelijskog receptora (TCR) alfa, TCR beta, CD3 delta, CD3 gama, CD3 epsilon ili CD3 zeta.
[0176] Primeri intracelularnih domena za upotrebu u receptorima aktivatora ovog otkrivanja mogu uključivati citoplazmatske sekvence TCR alfa, TCR beta, CD3 zeta i 4-1BB te intracelularne signalne koreceptore koji zajedno deluju da pokrenu transdukciju signala nakon sprezanja receptora antigena, kao i bilo koji derivat ili bilo koju varijantu tih sekvenci i bilo koju rekombinantnu sekvencu koja ima istu funkcionalnu mogućnost.
[0177] Intracelularni signalni domen može obuhvatati primarni intracelularni signalni domen. Primerni primarni intracelularni signalni domeni mogu uključivati domene izvedene iz proteina odgovornih za primarnu stimulaciju ili antigen zavisnu stimulaciju.
[0178] Intracelularni domen može obuhvatati CD3 delta intracelularni domen, CD3 epsilon intracelularni domen, CD3 gama intracelularni domen, CD3 zeta intracelularni domen, TCR alfa intracelularni domen ili TCR beta intracelularni domen.
[0179] Intracelularni domen može obuhvatati TCR alfa intracelularni domen. TCR alfa intracelularni domen može obuhvatati Ser-Ser. TCR alfa intracelularni domen može kodirati sekvenca TCCAGC.
[0180] Intracelularni domen može obuhvatati TCR beta intracelularni domen. TCR beta intracelularni domen može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična, najmanje 90% identična ili može biti potpuno identična sekvenci: MAMVKRKDSR (SEQ ID NO: 84). TCR beta intracelularni domen može obuhvatati ili se suštinski sastojati od SEQ ID NO: 84. TCR beta intracelularni domen može kodirati sekvenca ATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTCCAGA (SEQ ID NO: 85).
[0181] Intracelularni signalni domen može obuhvatati najmanje jedan stimulatorni intracelularni domen. Intracelularni signalni domen može obuhvatati primarni intracelularni signalni domen, kao što je CD3 delta, CD3 gama i CD3 epsilon intracelularni domen i jedan dodatni stimulatorni intracelularni domen, na primer kostimulatorni domen. Intracelularni signalni domen može obuhvatati primarni intracelularni signalni domen, kao što je CD3 delta, CD3 gama i CD3 epsilon intracelularni domen i dva dodatna stimulatorna intracelularna domena.
[0182] Primeri kostimulatornih intracelularnih signalnih domena uključuju domene izvedene iz proteina odgovornih za kostimulatorne signale ili antigen nezavisnu stimulaciju. Kostimulatorni molekuli uključuju molekul MHC klase I, BTLA, tolični receptor liganda, kao i DAP10, DAP12, CD30, LIGHT, OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) 4-1BB (CD137, TNF receptorski superporodični član 9) i CD28 molekul (CD28). Kostimulatorni protein može imati predstavnika u sledećim proteinskim porodicama: TNF receptorski proteini, imunoglobulinu slični proteini, citokinski receptori, integrini, molekuli signalnog limfocitnog aktiviranja (SLAM proteini) i aktivirajući NK ćelijski receptori. Primeri takvih molekula uključuju CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, sa limfocitnom funkcijom povezan antigen-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, ligand koji se specifično vezuje sa CD83, CD4 i slične. Kostimulatorni domen može obuhvatati čitav intracelularni deo, ili čitav nativni intracelularni signalni domen, molekula iz kog je izveden ili njegovu funkcionalnu varijantu.
[0183] Stimulatorni domen može obuhvatati kostimulatorni domen. Taj kostimulatorni domen može obuhvatati CD28 ili 4-1BB kostimulatorni domen. CD28 i 4-1BB su dobro okarakterisani kostimulatorni molekuli neophodni za potpuno T-ćelijsko aktiviranje i poznati po poboljšavanju T-ćelijske efektroske funkcije. Na primer, CD28 i 4-1BB su korišćeni u himernim antigenskim receptorima (CAR) da pojačaju oslobađanje citokina, citolitičku funkciju i istrajnost u prvoj generaciji CAR-ova koji sadrže samo CD3 zeta signalni domen. Slično tome, uključivanje kostimulatornih domena, na primer CD28 i 4-1BB domena, u TCR-ovima može povećati T-ćeliju efektrosku funkciju i specifično omogućiti kostimulaciju u odsustvu kostimulatornog liganda, koji je tipično negativno regulisan na površini tumorskih ćelija. Kao što je ovde takođe opisano, stimulatorni domen obuhvata CD28 intracelularni domen ili 4-1BB intracelularni domen.
Inhibitorni receptori
[0184] Ovo otkrivanje obezbeđuje drugi receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za neciljni antigen koji nestaje kod ćelija kancera, kao što je alelska varijanta gena. Neciljna alelska varijanta može nestati kod ćelije kancera bilo kojim mehanizmom, kao što su, bez ograničavanja, epigenske promene koje utiču na ekspresiju neciljne alelske varijante, mutacije gena koji kodira neciljnu alelsku varijantu, prekidanje ćelijskog signaliziranja koje reguliše ekspresiju neciljne alelske varijante, gubitak hromozoma, delimično ili potpuno brisanje genomskog lokusa, utišavanje gena modifikacijom nukleinskih kiselina ili heterohromatina ili gubitak ekspresije drugim mehanizmima. U varijacijama ovde otkrivenih kompozicija i postupaka, tretirane ćelije ili lečeni subjekat mogu doživeti gubitak ekspresije neciljne alelske varijante usled negenetskih promena. Zbog toga, ovo otkrivanje obezbeđuje kompozicije i postupke za ubijanje ćelija i/ili lečenje subjekta kom iz bilo kog razloga nedostaje ekspresija neciljnog antigena, uključujući, ali ne ograničavajući se na, gubitak heterozigotnosti.
[0185] Neciljni antigen može biti protein ili njegov antigenski peptid u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I), pri čemu taj neciljni antigen obuhvata polimorfizam. Budući da je neciljni antigen polimorfan, gubitak jedne verzije gena koji kodira neciljni antigen, koji se može desiti gubitkom heterozigotnosti u ćeliji kancera, daje ćeliju kancera koja zadržava drugu polimorfnu varijantu gena, ali gubi neciljni antigen. Na primer, subjekat sa HLA-A*02 i HLA-A*01 alelima na HLA lokusu može imati kancer u kom nestaje samo HLA-A* 02 alel. Kod takvog subjekta, HLA-A* 01 protein ostaje prisutan, ali ga ne prepoznaje inhibitorni receptor imunskih ćelija koji nailazi na ćeliju kancera, zato što je inhibitorni receptor dizajniran da bude specifičan za HLA-A*02 (ili drugi neciljni antigen). U normalnim nemalignim ćelijama, prisutan je HLA-A*02 (ili drugi neciljni antigen) i inhibira aktiviranje dizajnirane imunske ćelije. U ćelijama kancera sa gubitkom heterozigotnosti, nestaje HLA-A*02 alelska varijanta (ili drugi neciljni antigen). Imunske ćelije dizajnirane da eksprimuju inhibitorni receptor ne primaju inhibitorni signal od inhibitornog receptora jer inhibitorni receptor odgovara isključivo na HLA-A*02 (ili drugi neciljni antigen), koji je odsutan kod ćelija kancera. Tim se mehanizmom imunska ćelija selektivno aktivira i ona selektivno ubija ćelije kancera koje eksprimuju EGFR, ali koje su ostale bez HLA-A*02 (ili drugog neciljnog antigena) usled gubitka heterozigotnosti. Ovde se, primera radi, koristi HLA-A. Slična se polimorfna varijacija javlja u populaciji kod drugih MHC gena i takođe kod drugih neMHC gena. Prema tome, neciljni antigen može obuhvatati polimorfnu varijantu COLEC12, APCDD1 ili CXCL16, ili HLA-A*02. Neciljni antigen može biti alel HLA klase I ili antigen manje histokompatibilnosti (MiHA). Alel HLA klase I može obuhvatati HLA-A, HLA-B, HLA-C ili HLA-E. U nekim načinima ostvarivanja, alel HLA klase I predstavlja HLA-A*02. U nekim načinima ostvarivanja, HLA-A*02 neciljni antigen eksprimuju zdrave ćelije subjekta. U nekim načinima ostvarivanja, neciljni antigen je neciljna alelska varijanta. U nekim se načinima ostvarivanja neciljni antigen ne eksprimuje u ćeliji kancera subjekta. U nekim se načinima ostvarivanja neciljni antigen ne eksprimuje kod frakcije ćelija u tumoru kod subjekta. U nekim je načinima ostvarivanja ćelija kancera kod subjekta izgubila ekspresiju neciljnog antigena. Gubitak ekspresije ili nedostatak ekspresije neciljnog antigena u ćeliji može se desiti bilo kojim mehanizmom, kao što su, epigenske promene koje utiču na ekspresiju neciljnog gena, mutacije gena koji kodira neciljni antigen ili prekidanje ćelijskog signaliziranja koje reguliše ekspresiju neciljnog gena.
[0186] U nekim načinima ostvarivanja, drugi receptor je inhibitorni himerni antigenski receptor (tj. inhibitorni receptor). U nekim načinima ostvarivanja, drugi receptor je inhibitorni receptor. U nekim načinima ostvarivanja, drugi receptor je humanizovan.
[0187] Kao što je ovde opisano, drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 173 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde opisano, drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 174 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0188] Ovo otkrivanje obezbeđuje drugi receptor, koji je inhibitorni receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući koji može da pravi razliku između alela jedne varijante aminokiseline neciljnog antigena. Ta mogućnost pravljenja razlike između alelskih varijanti neciljnog antigena omogućava drugom receptoru da inhibira aktiviranje imunskih ćelija koje obuhvata drugi receptor u prisustvu neciljnih ćelija koje eksprimuju da je ligand vezujući domen prepoznao alel. Međutim, aktiviranje imunskih ćelija se ne inhibira u prisustvu ciljnih ćelija koje su izgubile alel, na primer ćelija kancera koje su izgubile jedan alel gena gubitkom heterozigotnosti.
[0189] Ovo otkrivanje obezbeđuje drugi receptor, koji je inhibitorni receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući koji može da pravi razliku između različitih nivoa ekspresije neciljnog antigena. To drugom receptoru omogućava da inhibira aktiviranje imunskih ćelija koje obuhvataju drugi receptor u prisustvu neciljnih ćelija koje eksprimuju ligand za drugi receptor, ali i da omogući aktiviranje imunskih ćelija u prisustvu ćelija kancera koje eksprimuju niske nivoe, ili nemaju ekspresiju, liganda za drugi receptor.
Ligandi inhibitora
[0190] U nekim načinima ostvarivanja, neciljni antigen ne eksprimuju ciljne ćelije već ga eksprimuju neciljne ćelije. U nekim načinima ostvarivanja, neciljni antigen eksprimuju zdrave ćelije, tj. ćelije koje nisu ćelije kancera. U nekim načinima ostvarivanja, ciljne ćelije predstavljaju veći broj ćelija kancera koje su izgubile ekspresiju neciljnog antigena gubitkom heterozigotnosti (LOH). U nekim načinima ostvarivanja, neciljne ćelije predstavljaju veći broj zdravih ćelija (tj. nekancerskih, normalnih ili zdravih ćelija), koje eksprimuju i ciljni i neciljni antigen.
[0191] Bilo koji membranski molekul kog eksprimuju neciljne ćelije, a ne eksprimuju ciljne ćelije može biti prikladan neciljni antigen za drugi receptorski ekstracelularni ligand vezujući domen. Na primer, kao neciljni antigen mogu se koristiti ćelijski adhezioni molekul, ćelija-ćelija signalni molekul, ekstracelularni domen, molekul uključen u hemotaksu, glikoprotein, G proteinski uparen receptor, transmembranski, receptor za neurotransmiter ili naponski zavisni jonski kanal.
[0192] U nekim načinima ostvarivanja, ciljni antigen je antigen peptida antigena specifičnog za ćelije kancera u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I).
[0193] U nekim načinima ostvarivanja, neciljni antigen nestaje kod ćelija kancera usled gubitka heterozigotnosti. Primerni neciljni antigeni nestali kod ćelija kancera usled gubitka heterozigotnosti uključuju COLEC12, APCDD1, CXCL16 i HLA-A*02. Kao što je ovde opisano, neciljni antigen je odabran iz grupe koju čine polimorfna varijanta COLEC12, APCDD1 i CXCL166 ili njen antigen peptida u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I), ili HLA-A*02. Kao što je ovde opisano, neciljni antigen je antigenski peptid koji obuhvata polimorfni ostatak COLEC12, APCDD1 i CXCL16 u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I).
[0194] Ovde su opisani neciljni MHC-1 (MHC) antigeni koji obuhvataju bilo koji od HLA-A, HLA-B ili HLA-C (nisu prema ovom pronalasku). Neciljni antigen može obuhvatati HLA-A (nije prema ovom pronalasku). Neciljni antigen može obuhvatati humani leukocitni antigenski A*02 alelni produkt (HLA-A*02) (nije prema ovom pronalasku). Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata humani leukocitni antigen A*69. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata HLA-B. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata HLA-C.
[0195] U nekim načinima ostvarivanja, neciljni antigen obuhvata HLA-A*02.
[0196] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata hemokini ligand 16 sa C-X-C motivom (CXCL16) ili njegov antigenski peptid u kompleksu sa MHC-I. Humani CXCL16 prekursor opisan je pod NCBI brojem zapisa NP_001094282.1. Kao što je ovde opisano, CXCL16 obuhvata aminokiselinsku sekvencu:
[0197] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata polimorfizam CXCL16. Na primer, neciljni antigen obuhvata peptid izveden iz CXCL16 koji obuhvata polimorfni ostatak CXCL16. Polimorfni ostaci CXCL16 uključuju položaje 142 i 200 SEQ ID NO: 86. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid CXCL16 koji obuhvata aminokiselinu 142 ili 200 SEQ ID NO: 86. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid CXCL16 koji obuhvata A kod aminokiseline 200 SEQ ID NO: 86. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid CXCL16 koji obuhvata V kod aminokiseline 200 SEQ ID NO: 86. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid CXCL16 koji obuhvata I kod aminokiseline 142 SEQ ID NO: 86. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid CXCL16 koji obuhvata T kod aminokiseline 142 SEQ ID NO: 86.
[0198] Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata polimorfizam CXCL16. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid CXCL16 koji obuhvata A kod aminokiseline 200 SEQ ID NO: 86, a drugi receptor obuhvata ligand vezujući domen sa višim afinitetom za CXCL16 ligand sa A na položaju 200 SEQ ID NO: 86 nego za CXCL16 ligand sa V na položaju 200 SEQ ID NO: 86. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid CXCL16 koji obuhvata V kod aminokiseline 200 SEQ ID NO: 86, a drugi receptor obuhvata ligand vezujući domen sa višim afinitetom za CXCL16 ligand sa V na položaju 200 SEQ ID NO: 86 nego za CXCL16 ligand sa A na položaju 200 SEQ ID NO: 86. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid CXCL16 koji obuhvata I kod aminokiseline 142 SEQ ID NO: 86, a drugi receptor obuhvata ligand vezujući domen sa višim afinitetom za CXCL16 ligand sa I na položaju 142 SEQ ID NO: 86 nego za CXCL16 ligand sa T na položaju 142 SEQ ID NO: 86. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid CXCL16 koji obuhvata T kod aminokiseline 142 SEQ ID NO: 86, a drugi receptor obuhvata ligand vezujući domen sa višim afinitetom za CXCL16 ligand sa T na položaju 142 SEQ ID NO: 86 nego za CXCL16 ligand sa I na položaju 142 SEQ ID NO: 86.
[0199] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata kolektinskog podporodičnog člana 12 (COLEC12) ili njegov antigenski peptid u kompleksu sa MHC-I. Humani COLEC12 opisana je pod NCBI brojem zapisa NP_569057.2. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, COLEC12 obuhvata aminokiselinsku sekvencu:
[0200] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata polimorfizam COLEC12. Na primer, neciljni antigen obuhvata peptid izveden iz COLEC12 koji obuhvata polimorfni ostatak COLEC12. Polimorfni ostaci COLEC12 uključuju položaj 522 SEQ ID NO: 87. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid COLEC12 koji obuhvata aminokiselinu 522 SEQ ID NO: 87. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid COLEC12 koji obuhvata S kod aminokiseline 522 SEQ ID NO: 87. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid COLEC12 koji obuhvata P kod aminokiseline 522 SEQ ID NO: 87.
[0201] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata APC negativno regulisani 1 (APCDD1) ili njegov antigenski peptid u kompleksu sa MHC-I. Primerni humani APCDD1 opisan je pod UniProtKB brojem zapisa Q8J025. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, APCDD1 obuhvata aminokiselinsku sekvencu:
[0202] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata polimorfizam APCDD1. Primerni polimorfizmi APCDD1 uključuju rs3748415, koji može biti V, I ili L na položaju 150 SEQ ID NO: 88. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid APCDD1 koji obuhvata aminokiselinu 150 SEQ ID NO: 88. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid APCDD1 koji obuhvata V kod aminokiseline 150 SEQ ID NO: 88. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid APCDD1 koji obuhvata I kod aminokiseline 150 SEQ ID NO: 88. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid APCDD1 koji obuhvata L kod aminokiseline 150 SEQ ID NO: 88.
[0203] Dalji primerni humani APCDD1 opisan je pod UniProtKB brojem zapisa V9GY82. Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, APCDD1 obuhvata aminokiselinsku sekvencu:
[0204] Primerni polimorfizmi APCDD1 uključuju rs1786683, koji mogu biti Y ili S na položaju 165 SEQ ID NO: 133. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid APCDD1 koji obuhvata aminokiselinu 165 SEQ ID NO: 134. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid APCDD1 koji obuhvata Y kod aminokiseline 165 SEQ ID NO: 134. Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata peptid APCDD1 koji obuhvata S kod aminokiseline 165 SEQ ID NO: 134.
[0205] Dalji primerni humani APCDD1 opisan je pod UniProt brojem zapisa J3QSE3. Kao što je ovde opisano, APCDD1 obuhvata aminokiselinsku sekvencu:
[0206] Primerni polimorfizmi APCDD1 uključuju rs9952598, koji može biti Q ili R na položaju 28 SEQ ID NO: 135. Kao što je ovde opisano, neciljni antigen obuhvata peptid APCDD1 koji obuhvata aminokiselinu 28 SEQ ID NO: 135. Kao što je ovde takođe opisano, neciljni antigen obuhvata peptid APCDD1 koji obuhvata Q kod aminokiseline 28 SEQ ID NO: 135. Kao što je ovde takođe opisano, neciljni antigen obuhvata peptid APCDD1 koji obuhvata R kod aminokiseline 28 SEQ ID NO: 135.
[0207] Na primer, APCDD1 obuhvata sekvencu koja deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 94%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sa bilo kojom od SEQ ID NO: 88 ili 134-135. Polimorfni ostaci APCDD1 su u SEQ ID NO: 88 ili 134-135 podebljani i podvučeni.
[0208] U nekim načinima ostvarivanja, neciljni antigen obuhvata HLA-A*02. Za upotrebu u načinima ostvarivanja prikladni su razni jednostruki varijabilni domeni poznati u tehnici ili ovde otkriveni koji se vezuju za i prepoznaju HLA-A*02.
[0209] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata HLA-B*07. Prikladni su razni jednostruki varijabilni domeni poznati u tehnici ili ovde otkriveni koji se vezuju za i prepoznaju HLA-B*07.
[0210] Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata HLA-A*11. Prikladni su razni jednostruki varijabilni domeni poznati u tehnici i ovde otkriveni koji se vezuju za i prepoznaju HLA-A* 11.
[0211] Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata HLA-A*01. Prikladni su razni jednostruki varijabilni domeni poznati u tehnici i ovde otkriveni koji se vezuju za i prepoznaju HLA-A *01.
[0212] Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata HLA-A*03. Prikladni su razni jednostruki varijabilni domeni poznati u tehnici i ovde otkriveni koji se vezuju za i prepoznaju HLA-A*03.
[0213] Kao što je ovde takođe opisano, ali nije prema ovom pronalasku, neciljni antigen obuhvata HLA-C*07. Prikladni su razni jednostruki varijabilni domeni poznati u tehnici i ovde otkriveni koji se vezuju za i prepoznaju HLA-C*07.
[0214] Takvi scFv-ovi uključuju, na primer, sledeća mišja i humanizovana scFv antitela koja vezuju neciljne antigene (npr. HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*11, HLA-B*07 ili HLA-C*07) na peptidno nezavisan način prikazan u tabeli 4 koja sledi (gde je naznačeno, podvučeni su regioni koji određuju komplementarnost):
Tabela 4. scFv vezujući domeni
HLA-A*02 antigen vezujući domeni izvedeni iz BB7.2 mAb
HLA-B*07 antigen vezujući domeni
HLA-A*11 antigen vezujući domeni
HLA-C*07 antigen vezujući domeni
HLA-A*03 scFv sekvence
HLA-A*01 scFv sekvence
[0215] Primerni CDR-ovi teškog lanca i lakog lanca (CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 odnosno CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3) za neciljne ligand vezujuće domene prikazani su u tabeli 5 koja sledi.
Tabela 5. CDR-ovi koji odgovaraju antigen vezujućim domenima
HLA-A*02 CDR-ovi
(prema ovom ovom ovom ma ovom pronalasku) ovom pronalasku) pronalasku) (pre
pronalasku)
HLA-A*03 CDR-ovi (nisu prema ovom pronalasku)
HLA-A*11 CDR-ovi (nisu prema ovom pronalasku)
HLA-C*07 CDR-ovi (nisu prema ovom pronalasku)
Q
HLA-A*01 CDR-ovi (nisu prema ovom pronalasku)
[0216] U nekim načinima ostvarivanja, neciljni antigen koji obuhvata HLA-A*02 i ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata HLA-A*02 ligand vezujući domen. U nekim načinima ostvarivanja, ligand vezujući domen vezuje HLA-A*02 nezavisno od peptida u pMHC kompleksu koji obuhvata HLA-A*02. U nekim načinima ostvarivanja, HLA-A*02 ligand vezujući domen obuhvata scFv domen. U nekim načinima ostvarivanja, HLA-A*02 ligand vezujući domen obuhvata sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 89-100. U nekim načinima ostvarivanja, HLA-A*02 ligand vezujući domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% identična sekvenci bilo koje od SEQ ID NO: 89-100.
[0217] Kao što je ovde opisano, HLA-A*02 scFv obuhvata regione za utvrđivanje komplementarnosti (CDR) bilo koje od SEQ ID NO: 101-112. Kao što je ovde opisano, scFv obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 101-112. Kao što je ovde opisano, scFv obuhvata sekvencu koja je identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 101-112. Kao što je ovde opisano, težak lanac antigen vezujućeg domena obuhvata CDR-ove teškog lanca bilo koje od SEQ ID NO: 101-112, a pri čemu laki lanac antigen vezujućeg domena obuhvata CDR-ove lakog lanca bilo koje od SEQ ID NO: 101-112. Kao što je ovde opisano, HLA-A*02 antigen vezujući domen obuhvata težak lanac i lak lanac, a teški lanac obuhvata CDR-ove izabrane od SEQ ID NO: 104-106 i 110-112 i laki lanac obuhvata CDR-ove izabrane od SEQ ID NO: 101-103 i 107-109. Ovde je opisano da, za bilo koji od ligand vezujućih domena, svaka CDR sekvenca može imati 1, 2, 3 ili više supstitucija, umetanja ili brisanja. CDR sekvence mogu da tolerišu supstitucije, brisanja ili umetanja. Pomoću alata za poravnavanje sekvenci, rutinskog eksperimentisanja i poznatih analiza, stručnjaci iz ove oblasti mogu generisati i ispitne varijantne sekvence sa 1, 2, 3 ili više supstitucija, umetanja ili brisanja u CDR sekvencama bez nepotrebnog eksperimentisanja.
[0218] Kao što je ovde opisano, HLA-A*02 antigen vezujući domen obuhvata težak lanac i lak lanac, a teški lanac obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična delu teškog lanca bilo koje od SEQ ID NO: 89-100 i laki lanac obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična delu lakog lanca bilo koje od SEQ ID NO: 89-100.
[0219] Kao što je ovde opisano, težak lanac obuhvata sekvencu koja je identična delu teškog lanca bilo koje od SEQ ID NO: 89-100, a pri čemu laki lanac obuhvata sekvencu koja je identična delu lakog lanca bilo koje od SEQ ID NO: 89-100.
[0220] Nije prema ovom pronalasku: Kao što je ovde takođe opisano, neciljni antigen obuhvata HLA-B*07, a ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata HLA-B*07 ligand vezujući domen. Kao što je ovde takođe opisano, ligand vezujući domen vezuje HLA-B*07 nezavisno od peptida u pMHC kompleksu koji obuhvata HLA-B*07. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-B*07 ligand vezujući domen obuhvata scFv domen. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-B*07 ligand vezujući domen obuhvata sekvencu bilo kog od B7 vezujućih domena navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-B*07 ligand vezujući domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% identična sekvenci bilo kog od HLA-B*07 vezujućih domena navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-B*07 scFv obuhvata bilo koji od HLA-B*07 regiona za utvrđivanje komplementarnosti (CDR) navedenih u tabeli 5. Kao što je ovde takođe opisano, scFv obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična bilo kojoj od HLA-B*07 scFv sekvenci navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, scFv obuhvata sekvencu koja je identična bilo kojoj od HLA-B*07 scFv sekvenci navedenih u tabeli 4.
[0221] Nije prema ovom pronalasku: Kao što je ovde takođe opisano, neciljni antigen obuhvata HLA-A*11, a ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata HLA-A*11 ligand vezujući domen. Kao što je ovde takođe opisano, ligand vezujući domen vezuje HLA-A*11 nezavisno od peptida u pMHC kompleksu koji obuhvata HLA-A*11. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-A* 11 ligand vezujući domen obuhvata scFv domen. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-A* 11 ligand vezujući domen obuhvata sekvencu bilo kog od HLA-A* 11 vezujućih domena navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-A* 11 ligand vezujući domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% identična sekvenci bilo kog od HLA-A* 11 vezujućih domena navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-A* 11 scFv obuhvata bilo koji od HLA-A* 11 regiona za utvrđivanje komplementarnosti (CDR) navedenih u tabeli 5. Kao što je ovde takođe opisano, scFv obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična bilo kojoj od HLA-A* 11 scFv sekvenci navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, scFv obuhvata sekvencu koja je identična bilo kojoj od HLA-A* 11 scFv sekvenci navedenih u tabeli 4.
[0222] Nije prema ovom pronalasku: Kao što je ovde opisano, neciljni antigen obuhvata HLA-A *01, a ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata HLA-A*01 ligand vezujući domen. Kao što je ovde takođe opisano, ligand vezujući domen vezuje HLA-A*01 nezavisno od peptida u pMHC kompleksu koji obuhvata HLA-A*01. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-A *01 ligand vezujući domen obuhvata scFv domen. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-A*01 ligand vezujući domen obuhvata sekvencu bilo kog od HLA-A *01 vezujućih domena navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-A *01 ligand vezujući domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% identična sekvenci bilo kog od HLA-A *01 vezujućih domena u navedenih tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-A *01 scFv obuhvata bilo koji od HLA-A *01 regiona za utvrđivanje komplementarnosti (CDR) navedenih u tabeli 5. Kao što je ovde takođe opisano, scFv obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična bilo kojoj od HLA-A*01 scFv sekvenci navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, scFv obuhvata sekvencu koja je identična bilo kojoj od HLA-A*01 scFv sekvenci navedenih u tabeli 4.
[0223] Nije prema ovom pronalasku: Kao što je ovde takođe opisano, neciljni antigen obuhvata HLA-A*03, a ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata HLA-A*03 ligand vezujući domen. Kao što je ovde takođe opisano, ligand vezujući domen vezuje HLA-A*03 nezavisno od peptida u pMHC kompleksu koji obuhvata HLA-A*03. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-A*03 ligand vezujući domen obuhvata scFv domen. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-A*03 ligand vezujući domen obuhvata sekvencu bilo kog od HLA-A*03 vezujućih domena navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-A*03 ligand vezujući domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% identična sekvenci bilo kog od HLA-A*03 vezujućih domena navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-A*03 scFv obuhvata bilo koji od HLA-A*03 regiona za utvrđivanje komplementarnosti (CDR) navedenih u tabeli 5. Kao što je ovde takođe opisano, scFv obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična bilo kojoj od HLA-A*03 scFv sekvenci navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, scFv obuhvata sekvencu koja je identična bilo kojoj od HLA-A*03 scFv sekvenci navedenih u tabeli 4.
[0224] Nije prema ovom pronalasku: Kao što je ovde takođe opisano, neciljni antigen obuhvata HLA-C*07, a ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata HLA-C*07 ligand vezujući domen. Kao što je ovde takođe opisano, ligand vezujući domen vezuje HLA-C*07 nezavisno od peptida u pMHC kompleksu koji obuhvata HLA-C*07. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-C*07 ligand vezujući domen obuhvata scFv domen. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-C*07 ligand vezujući domen obuhvata sekvencu bilo kog od HLA-C*07 vezujućih domena navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, HLA-C*07 ligand vezujući domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% identična sekvenci bilo kog od HLA-C*07 vezujućih domena navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, HLA- C*07 scFv obuhvata bilo koji od HLA-C*07 regiona za utvrđivanje komplementarnosti (CDR) navedenih u tabeli 5. Kao što je ovde takođe opisano, scFv obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična bilo kojoj od HLA-C*07 scFv sekvenci navedenih u tabeli 4. Kao što je ovde takođe opisano, scFv obuhvata sekvencu koja je identična bilo kojoj od HLA-C*07 scFv sekvenci navedenih u tabeli 4.
Inhibitorni receptori
[0225] Ovo otkrivanje obezbeđuje drugi receptor koji predstavlja inhibitorni himerni antigenski receptor (tj. inhibitorni receptor). Inhibitorni receptor može obuhvatati ekstracelularni ligand vezujući domen koji se vezuje za i prepoznaje neciljni antigen ili njegov peptidni derivat u MHC-1 kompleksu.
[0226] Primerni inhibitorni receptori opisani su u PCT/US2020/045228 podnetoj 6. septembra 2020, PCT/US2020/064607, podnetoj 11. decembra 2020, PCT/US2021/029907, podnetoj 29. aprila 2021 i PCT/US2020/059856 podnetoj 10. novembra 2020.
[0227] Neciljni antigen može biti neciljna alelska varijanta. „Neciljna alelska varijantaˮ kako se ovde koristi odnosi se na alel (npr. alelska varijanta gena MHC klase I), čija je ekspresija redukovana ili eliminisana u ciljnoj ćeliji (npr. ćeliji kancera) usled gubitka heterozigotnosti, ili drugog mehanizma gubitka ekspresije, ali se eksprimuje ili detektabilno eksprimuje u normalnoj ili zdravoj ćeliji.
[0228] Pojam „inhibitorni himerni antigenski receptorˮ ili „inhibitorni receptorˮ kako se ovde koristi odnosi se na antigen vezujući domen koji je spojen sa intracelularnim signalnim domenom koji može da transdukuje inhibitorni signal koji inhibira ili suzbija imunsko dejstvo imunske ćelije. Inhibitorni receptori imaju potencijal inhibicije imunskih ćelija i različiti su i razlikuju se od CAR-ova, koji su receptori sa potencijalom aktiviranja imunskih ćelija. Na primer, CAR-ovi su aktivirajući receptori jer uključuju intracelularne stimulatorne i/ili kostimulatorne domene. Inhibitorni receptori su inhibirajući receptori koji sadrže intracelularne inhibitorne domene.
[0229] Kako se ovde koristi, „inhibitorni signalˮ se odnosi na transdukciju signala ili promene u ekspresiji proteina u imunskoj ćeliji koje dovode do suzbijanja imunskog odgovora (npr. smanjenja u proizvodnji citokina ili redukcije aktiviranja imunskih ćelija). Inhibicija ili suzbijanje imunskih ćelija može biti selektivno i/ili reverzibilno ili neselektivno i/ili nereverzibilno. Inhibitorni receptori reaguju na neciljne antigene (npr. HLA-A*02). Na primer, kada se neciljni antigen (npr. HLA-A*02) veže za inhibitorni receptor ili stupi u kontakt sa njim, inhibitorni receptor reaguje i aktivira inhibitorni signal u imunskoj ćeliji koja eksprimuje inhibitorni receptor nakon vezivanja neciljnog antigena od strane ekstracelularnog ligand vezujućeg domena inhibitornog receptora.
[0230] Inhibitorni receptori ovog otkrivanja mogu obuhvatati ekstracelularni ligand vezujući domen.
[0231] Ligand vezujući domen može biti antigen vezujući domen (nije prema ovom pronalasku). Primerni antigen vezujući domeni, inter alia, uključuju scFv, SdAb, domene samo za Vβ i antigen vezujuće domene TCR-a izvedene iz varijabilnih domena α i β lanaca TCR-a.
[0232] Kao što je ovde opisano, ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora vezuje se za i prepoznaje polimorfnu varijantu COLEC12, APCDD1, CXCL16 ili njen antigenski peptid u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I), ili HLA-A*02. U nekim načinima ostvarivanja, ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora predstavlja scFv.
[0233] U nekim je načinima ostvarivanja ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora spojen sa ekstracelularnim domenom inhibitornog receptora.
[0234] U nekim načinima ostvarivanja, inhibitorni receptori ovog otkrivanja obuhvataju ekstracelularni zglobni region. Primerni zglobovi mogu se izolovati ili izvesti iz IgD i CD8 domena, na primer IgG1. Zglob se može izolovati ili izvesti iz CD8α ili CD28.
[0235] Inhibitorni receptori ovog otkrivanja mogu se dizajnirati tako da obuhvataju transmembranski domen koji je spojen sa ekstracelularnim domenom inhibitornih receptora. U nekim se slučajevima transmembranski domen može izabrati ili modifikovati aminokiselinom supstitucijom kako bi se izbeglo vezivanje takvih domena za transmembranske domene istih ili različitih površinskih membranskih proteina kako bi se interakcije sa drugim članovima receptorskog kompleksa svele na minimum.
[0236] Transmembranski domen može se izvesti bilo iz prirodnog ili iz sintetičkog izvora. Kada je izvor prirodan, domen se može izvesti iz bilo kog membranski vezanog ili transmembranskog proteina.
Transmembranski regioni mogu se izolovati ili izvesti iz (tj. obuhvataju najmanje transmembranski(e) region(e)) alfa, beta ili zeta lanca T-ćelijskog receptora, CD28, CD3 epsilona, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 ili iz imunoglobulina kao što je IgG4. Alternativno, transmembranski domen može biti sintetički, u kom će slučaju pretežno obuhvatati hidrofobne ostatke kao što su leucin i valin. U nekim će se načinima ostvarivanja trojka fenilalanina, triptofana i valina naći na svakom kraju sintetičkog transmembranskog domena. Kratki oligo ili poli peptidni veznik, poželjno između 2 aminokiseline i 10 aminokiselina dug može opciono obrazovati vezu između transmembranskog domena i intracelularnog domena inhibitornih receptora. Glicin-serinska dvojka predstavlja naročito prikladan veznik.
[0237] Ovo otkrivanje obezbeđuje inhibitorne receptore koji obuhvataju intracelularni domen.
Intracelularni domen inhibitornih receptora ovog otkrivanja odgovoran je za inhibiranje aktiviranja imunskih ćelija koje obuhvataju inhibitorne receptore, koji bi se inače aktivirale kao odgovor na aktiviranje signala od strane prvog receptora. Inhibitorni intracelularni domen može obuhvatati imunoreceptorski tirozin bazirani inhibitorni motiv (ITIM). Inhibitorni intracelularni domen koji obuhvata ITIM može se izolovati ili izvesti iz inhibitora imunskih kontrolnih punktova kao što su CTLA-4 i PD-1. CTLA-4 i PD-1 su imunski inhibitorni receptori koji se eksprimuju na površini T-ćelija i imaju centralnu ulogu u ublažavanju ili okončavanju T-ćelijskih odgovora.
[0238] Inhibitorni intracelularni domen može se izolovati iz receptora liganda koji indukuje apoptozu povezanu sa humanim tumorskim faktorom nekroze (TRAIL) i CD200 receptora 1. TRAIL receptor obuhvata TR10A, TR10B ili TR10D.
[0239] Inhibitorni intracelularni domen može se izolovati iz fosfoproteinskog membranskog sidra glikosfingolipidnim mikrodomenima 1 (PAG1). U nekim je načinima ostvarivanja ovog pronalaska inhibitorni intracelularni domen izolovan iz leukocitski imunoglobulinu sličnog receptora B1 (LILRB 1).
[0240] Inhibitorni domen može se izolovati ili izvesti iz humanog proteina, na primer humanog TRAIL receptora, CTLA-4, PD-1, PAG1 ili LILRB1 proteina.
[0241] U nekim načinima ostvarivanja, inhibitorni domen obuhvata intracelularni domen, transmembranski ili njihovu kombinaciju. U nekim načinima ostvarivanja, inhibitorni domen obuhvata intracelularni domen, transmembranski domen, zglobni region ili njihovu kombinaciju.
[0242] Inhibitorni domen može se izolovati ili izvesti iz ćelijama ubicama imunoglobulina sličnog receptora, triju Ig domena i dugog citoplazmatskog repa 2 (KIR3DL2), ćelijama ubicama imunoglobulina sličnog receptora, triju Ig domena i dugog citoplazmatskog repa 3 (KIR3DL3), leukocitskog imunoglobulinu sličnog receptora B1 (LIR1, koji se takođe naziva LIR-1 i LILRB1), programirane ćelijske smrti 1 (PD-1), Fc gama receptora IIB (FcgRIIB), ćelijama ubicama lektina sličnog receptora K1 (NKG2D), CTLA-4, domena koji sadrži sintetički konsenzusni ITIM, ZAP70 SH2 domena (npr. jednog ili obaju od N i C terminalnih SH2 domena) ili ZAP70 KI_K369A (kinaze neaktivnog ZAP70).
[0243] U nekim je načinima ostvarivanja inhibitorni domen izolovan ili izveden iz humanog proteina.
[0244] U nekim načinima ostvarivanja, drugi, inhibitorni receptor obuhvata inhibitorni domen. U nekim načinima ostvarivanja, drugi, inhibitorni receptor obuhvata inhibitorni intracelularni domen i/ili inhibitorni transmembranski domen. U nekim je načinima ostvarivanja inhibitorni intracelularni domen spojen sa intracelularnim domenom inhibitornog receptora. U nekim je načinima ostvarivanja inhibitorni intracelularni domen spojen sa transmembranskim domenom inhibitornog receptora.
[0245] U nekim načinima ostvarivanja, drugi, inhibitorni receptor obuhvata citoplazmatski domen, transmembranski domen i ekstracelularni domen ili njegov deo izolovan ili izveden iz istog proteina, na primer proteina koji sadrži ITIM. U nekim načinima ostvarivanja, drugi, inhibitorni receptor obuhvata zglobni region izolovan ili izveden iz istog proteina kao intracelularni domen i/ili transmembranski domen, na primer proteina koji sadrži ITIM.
[0246] U nekim načinima ostvarivanja, drugi receptor je TCR koji obuhvata inhibitorni domen (inhibitorni TCR). U nekim načinima ostvarivanja, inhibitorni TCR obuhvata inhibitorni intracelularni domen i/ili inhibitorni transmembranski domen. U nekim je načinima ostvarivanja inhibitorni intracelularni domen spojen sa intracelularnim domenom TCR alfa, TCR beta, CD3 delta, CD3 gama ili CD3 epsilon ili njegovim delom TCR. U nekim je načinima ostvarivanja inhibitorni intracelularni domen spojen sa transmembranskim domenom TCR alfa, TCR beta, CD3 delta, CD3 gama ili CD3 epsilon.
[0247] U nekim načinima ostvarivanja, drugi receptor je TCR koji obuhvata inhibitorni domen (inhibitorni TCR). U nekim načinima ostvarivanja, inhibitorni domen je izolovan ili izveden iz LILRB1.
LILRB1 inhibitorni receptori
[0248] Ovo otkrivanje obezbeđuje drugi, inhibitorni receptor koji obuhvata LILRB 1 inhibitorni domen i opciono, LILRB1 transmembranski i/ili zglobni domen ili njihove funkcionalne varijante. Uključivanje LILRB1 transmembranskog domena i/ili LILRB1 zglobnog domena u inhibitorni receptor može pojačati inhibitorni signal kog generiše inhibitorni receptor u poređenju sa referentnim inhibitornim receptorom koji ima drugi transmembranski domen ili druge zglobne domene. Drugi, inhibitorni receptor koji obuhvata LILRB 1 inhibitorni domen može biti CAR ili TCR, kao što je ovde opisano. Bilo koji prikladan ligand vezujući domen, kao što je ovde opisano, može se spojiti sa LILRB1 baziranim drugim, inhibitornim receptorima.
[0249] Leukocitski imunoglobulinu sličan receptorske familije B član 1 (LILRB1), koji je takođe poznat kao leukocitski imunoglobulinu sličan receptor B1, kao i ILT2, LIR1, MIR7, PIRB, CD85J, ILT-2 LIR-1, MIR-7 i PIR-B, predstavlja člana leukocitske imunoglobulinu slične receptorske (LIR) porodice. LILRB1 protein pripada podporodičnoj B klasi LIR receptora. Ti receptori sadrže dva do četiri ekstracelularna imunoglobulinska domena, transmembranski domen i dva do četiri citoplazmatska imunoreceptorska tirozin bazirana inhibitorna motiva (ITIM). LILRB 1 receptor se eksprimuje na imunskim ćelijama, gde se vezuje za molekule MHC klase I na antigen prezentujućim ćelijama koje i transdukuje negativnih signal koji inhibira stimulaciju imunskog odgovora. Smatra se da LILRB 1 reguliše inflamatorne odgovore, kao i citotoksičnost, i da ima ulogu u ograničavanju autoreaktivnosti. Postoje višestruke transkriptne varijante koje kodiraju različite izoforme LII,RB1.
[0250] Inhibitorni receptor može obuhvatati jedan domen izolovan ili izveden iz LILRB1 ili više njih. Za receptore koji imaju jedan domen izolovan ili izveden iz LII,RB1 ili više njih, taj jedan domen LILRB 1 ili više njih može(gu) obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili može biti potpuno identična sekvenci ili supsekvenci SEQ ID NO: 113. Jedan domen LILRB 1 ili više njih može(gu) obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja je identična sekvenci ili supsekvenci SEQ ID NO: 113. Jedan domen LILRB 1 ili više njih može(gu) se sastojati od aminokiselinske sekvenca koja je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili može biti potpuno identična sekvenci ili supsekvenci SEQ ID NO: 113. Jedan domen LILRB 1 ili više njih može se sastojati od aminokiselinske sekvence koja je identična sekvenci ili supsekvenci SEQ ID NO: 113.
[0251] Za receptore koji imaju jedan domen izolovan ili izveden iz LII,RB1 ili više njih, taj jedan domen LILRB 1 ili više njih može kodirati polinukleotidna sekvenca koja je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili može biti potpuno identična sekvenci ili supsekvenci
[0252] Za receptore koji imaju jedan domen LILRB 1 ili više njih, taj jedan domen LILRB 1 ili više njih može kodirati polinukleotidna sekvenca koja je identična sekvenci ili supsekvenci SEQ ID NO: 114.
[0253] Inhibitorni receptor može obuhvatati polipeptid, pri čemu taj polipeptid obuhvata jedan ili više od: LILRB1 zglobnog domena ili njegovog funkcionalnog fragmenta ili njegove funkcionalne varijante; LILRB 1 transmembranskog domena ili njegove funkcionalne varijante i LILRB 1 intracelularnog domena ili intracelularnog domena koji obuhvata najmanje jedan imunoreceptorski tirozin bazirani inhibitorni motiv (ITIM) ili najmanje njih dva, pri čemu se svaki ITIM može nezavisno izabrati od NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118).
[0254] Kako se ovde koristi, „imunoreceptorski tirozin bazirani inhibitorni motivˮ ili „ITIMˮ može se odnositi na očuvanu sekvencu aminokiselina sa sekvencom konsenzusa S/I/V/LxYxxI/V/L (SEQ ID NO: 423), koja se nalazi u citoplazmatskim repovima mnogih inhibitornih receptora imunskog sistema. Nakon što inhibitorni receptori koji poseduju ITIM stupe u interakciju sa svojim ligandom, ITIM motiv se može fosforilovati, što inhibitornom receptoru omogućava da angažuje druge enzime, kao što su fosfotirozin fosfataze SHP-1 i SHP-2 ili inozitol-fosfatazu zvanu SHIP.
[0255] U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid može obuhvatati intracelularni domen koji obuhvata najmanje jedan imunoreceptorski tirozin baziran inhibitorni motiv (ITIM), najmanje dva ITIM-a, najmanje 3 ITIM-a, najmanje 4 ITIM-a, najmanje 5 ITIM-ova ili najmanje 6 ITIM-ova. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može imati 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 ITIM-ova.
[0256] U nekim načinima ostvarivanja, polipeptid može obuhvatati intracelularni domen koji obuhvata najmanje jedan ITIM odabran iz grupe ITIM-ova koju čine NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118).
[0257] U dalje naročitim načinima ostvarivanja, polipeptid može obuhvatati intracelularni domen koji obuhvata najmanje dva imunoreceptorska tirozin bazirana inhibitorna motiva (ITIM), pri čemu se svaki ITIM nezavisno bira od NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118).
[0258] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati ITIM-ove i NLYAAV (SEQ ID NO: 115) i VTYAEV (SEQ ID NO: 116). U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 119. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati ili se suštinski sastojati od sekvence identične SEQ ID NO: 119.
[0259] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati ITIM-ove i VTYAEV (SEQ ID NO: 116) i VTYAQL (SEQ ID NO: 117). U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 120. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati ili se suštinski sastojati od sekvence identične SEQ ID NO: 120.
[0260] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati ITIM-ove i VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118). U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 121. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati ili se suštinski sastojati od sekvence identične SEQ ID NO: 121.
[0261] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati ITIM-ove NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116) i VTYAQL (SEQ ID NO: 117). U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 122. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati ili se suštinski sastojati od sekvence identične SEQ ID NO: 122.
[0262] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati ITIM-ove VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118). U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 123. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen obuhvata ili se suštinski sastoji od sekvence identične SEQ ID NO: 123.
[0263] U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati TTIM-ove NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118). U načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 124. U nekim načinima ostvarivanja, intracelularni domen obuhvata ili se suštinski sastoji od sekvence identične SEQ ID NO: 124.
[0264] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, intracelularni domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična LILRB1 intracelularnom domenu (SEQ ID NO: 129). U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, intracelularni domen obuhvata ili se suštinski sastoji od sekvence identične LILRB 1 intracelularnom domenu (SEQ ID NO: 129).
[0265] LILRB 1 intracelularni domeni ili njihove funkcionalne varijante ovog otkrivanja mogu imati najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7 ili najmanje 8 ITIM-ova. U nekim načinima ostvarivanja, LILRB 1 intracelularni domen ili njegova funkcionalna varijanta ima 2, 3, 4, 5 ili 6 ITIM-ova.
[0266] U određenim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati dva, tri, četiri, pet ili šest imunoreceptorski tirozin baziranih inhibitornih motiva (ITIM), pri čemu se svaki ITIM može nezavisno izabrati od NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118).
[0267] U određenim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati najmanje tri imunoreceptorski tirozin bazirana inhibitorna motiva (ITIM), pri čemu se svaki ITIM može nezavisno izabrati od NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118).
[0268] U određenim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati tri imunoreceptorski tirozin bazirana inhibitorna motiva (ITIM), pri čemu se svaki TIM može nezavisno izabrati od NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118).
[0269] U određenim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati četiri imunoreceptorski tirozin bazirana inhibitorna motiva (ITIM), pri čemu se svaki TIM može nezavisno izabrati od NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118).
[0270] U određenim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati pet imunoreceptorski tirozin baziranih inhibitornih motiva (ITIM), pri čemu se svaki TIM može nezavisno izabrati od NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118).
[0271] U određenim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati šest imunoreceptorski tirozin baziranih inhibitornih motiva (ITIM), pri čemu se svaki TIM može nezavisno izabrati od NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118).
[0272] U određenim načinima ostvarivanja, intracelularni domen može obuhvatati najmanje sedam imunoreceptorski tirozin baziranih inhibitornih motiva (ITIM), pri čemu se svaki TIM može nezavisno izabrati od NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118).
[0273] LILRB1 protein ima četiri imunoglobulinu (Ig) slična domena nazvana D1, D2, D3 i D4. U nekim načinima ostvarivanja, LILRB1 zglobni domen može obuhvatati LILRB1 D3D4 domen ili njegovu funkcionalnu varijantu. U nekim načinima ostvarivanja, LILRB 1 D3D4 domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili potpuno identična SEQ ID NO: 125. U nekim načinima ostvarivanja, LILRB1 D3D4 domen obuhvata ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 125.
[0274] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, polipeptid obuhvata LILRB 1 zglobni domen ili njegov funkcionalni fragment ili njegovu funkcionalnu varijantu. U načinima ostvarivanja ovog pronalaska, LILRB 1 zglobni domen ili njegov funkcionalni fragment ili njegova funkcionalna varijanta obuhvata sekvencu koja je najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identična ili potpuno identična SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 125 ili SEQ ID NO: 126. U načinima ostvarivanja ovog pronalaska, LILRB 1 zglobni domen ili njegov funkcionalni fragment ili njegova funkcionalna varijanta obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 125 ili SEQ ID NO: 126.
[0275] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, LILRB1 zglobni domen obuhvata sekvencu koja je identična SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 125 ili SEQ ID NO: 126.
[0276] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, LILRB 1 zglobni domen sastoji se suštinski od sekvence identične SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 125 ili SEQ ID NO: 126.
[0277] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, transmembranski domen je LILRB 1 transmembranski domen ili njegova funkcionalna varijanta. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, LILRB 1 transmembranski domen ili njegova funkcionalna varijanta obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična, najmanje 96% identična, najmanje 97% identična, najmanje 98% identična ili najmanje 99% SEQ ID NO: 133. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, LILRB 1 transmembranski domen ili njegova funkcionalna varijanta obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 133. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, LILRB 1 transmembranski domen obuhvata sekvencu koja je identična SEQ ID NO: 133. U načinima ostvarivanja ovog pronalaska, LILRB1 transmembranski domen suštinski se sastoji od sekvence identične SEQ ID NO: 133.
[0278] U nekim se načinima ostvarivanja transmembranski domen može pričvrstiti za ekstracelularni region drugog, inhibitornog receptora, npr. antigen vezujući domen ili ligand vezujući domen, preko zgloba, npr. zgloba iz humanog proteina. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, zglob može biti humani imunoglobulinski (Ig) zglob, npr. IgG4 zglob, CD8a zglob ili LILRB 1 zglob.
[0279] U nekim načinima ostvarivanja, drugi, inhibitorni receptor obuhvata inhibitorni domen. U nekim načinima ostvarivanja, drugi, inhibitorni receptor obuhvata inhibitorni intracelularni domen i/ili inhibitorni transmembranski domen. U nekim načinima ostvarivanja, inhibitorni domen je izolovan ili izveden iz LILR1B.
Inhibitorni receptori koji obuhvataju kombinacije LILRB1 domena
[0280] U nekim načinima ostvarivanja, LILRB1 bazirani inhibitorni receptori ovog otkrivanja obuhvataju više od jednog LILRB1 domena ili njegovog funkcionalnog ekvivalenta. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, inhibitorni receptor obuhvata LII,RB1 transmembranski domen i intracelularni domen ili LILRB 1 zglobni domen, transmembranski domen i intracelularni domen.
[0281] U određenim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, inhibitorni receptor obuhvata LII,RB1 zglobni domen ili njegov funkcionalni fragment ili njegovu funkcionalnu varijantu i LII,RB1 transmembranski domen ili njegovu funkcionalnu varijantu. Polipeptid može obuhvatati sekvencu koja je najmanje 95% identična, najmanje 96% identična, najmanje 97% identična, najmanje 98% identična, najmanje 99% identična ili može biti potpuno identična SEQ ID NO: 127. Polipeptid može obuhvatati sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 127. Polipeptid može obuhvatati sekvencu koja je identična SEQ ID NO: 127.
[0282] Inhibitorni receptor može obuhvatati: LILRB 1 transmembranski domen ili njegovu funkcionalnu varijantu i LILRB 1 intracelularni domen i/ili intracelularni domen koji obuhvata najmanje jedan imunoreceptorski tirozin baziran inhibitorni motiv (ITIM), pri čemu se ITIM može izabrati od NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118). Polipeptid može obuhvatati LILRB 1 transmembranski domen ili njegovu funkcionalnu varijantu i LILRB 1 intracelularni domen i/ili intracelularni domen koji obuhvata najmanje dva ITIM, pri čemu se svaki TIM može nezavisno izabrati od NLYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAEV (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118).
[0283] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, inhibitorni receptor obuhvata LILRB 1 transmembranski domen i intracelularni domen. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, polipeptid obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična, najmanje 96% identična, najmanje 97% identična, najmanje 98% identična, najmanje 99% identična ili potpuno identična SEQ ID NO: 128. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, polipeptid obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 128. U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, polipeptid obuhvata sekvencu koja je identična SEQ ID NO: 128.
[0284] U poželjnim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, inhibitorni receptor obuhvata: LILRB 1 zglobni domen ili njegov funkcionalni fragment ili njegovu funkcionalnu varijantu; LILRB 1 transmembranski domen ili njegovu funkcionalnu varijantu i LILRB1 intracelularni domen. Inhibitorni receptor može obuhvatati intracelularni domen koji obuhvata najmanje dva imunoreceptorska tirozin bazirana inhibitorna motiva (ITIM), pri čemu se svaki ITIM nezavisno bira od LYAAV (SEQ ID NO: 115), VTYAE (SEQ ID NO: 116), VTYAQL (SEQ ID NO: 117) i SIYATL (SEQ ID NO: 118).
[0285] Inhibitorni receptor može obuhvatati sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 130 ili SEQ ID NO: 131 ili najmanje 99% identična SEQ ID NO: 130 ili SEQ ID NO: 131 ili potpuno identična SEQ ID NO: 130 ili SEQ ID NO: 131.
[0286] Polipeptid može obuhvatati sekvencu koja je najmanje 99% identična SEQ ID NO: 127 ili najmanje 99% identična SEQ ID NO: 127 ili potpuno identična SEQ ID NO: 127.
[0287] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, polipeptid obuhvata sekvencu koja je najmanje 99% identična SEQ ID NO: 128 ili najmanje 99% identična SEQ ID NO: 128 ili potpuno identična SEQ ID NO: 128.
Tabela 6. Polipeptidne sekvence za ilustrativne LILRB1 bazirane inhibitorne receptore Naziv Sekvenca
transmembranski-intracelularni domen
LILRB 1 zglobni-transmembranski-
intracelularni domen (bez YGS Q S SKP
YLLTHPSD PLEL)
SEQ ID NO: 115
ITIM2 VTYAEV
SEQ ID NO: 116
ITIM3 VTYAQL
SEQ ID NO: 117
ITIM4 SIYATL
SEQ ID NO: 118
ITIM 1-2 NLYAAVKHTQPEDGVEMDTRSPHDEDPQAVTYAEV
SEQ ID NO: 119
Dugačak zglob 1
Dugačak zglob 2
Transmembranski-intracelularni domen.
Polinukleotidi i vektori
[0288] Ovaj pronalazak obezbeđuje polinukleotide koji obuhvataju polinukleotidne sekvence koje kodiraju prvi i drugi receptor kao što se koriste u ovom pronalasku. U nekim načinima ostvarivanja, polinukleotidi mogu obuhvatati i ovde opisani shRNK. Ovaj pronalazak obezbeđuje vektore koji obuhvataju polinukleotide prema ovom pronalasku. Ovo otkrivanje obezbeđuje imunske ćelije koje obuhvataju ovde opisane polinukleotide i vektore.
[0289] Kao što je ovde opisano, polinukleotid ili polinukleotidni sistem obuhvata SEQ ID NO: 180 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, polinukleotid ili polinukleotidni sistem obuhvata SEQ ID NO: 181 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, polinukleotid ili polinukleotidni sistem obuhvata SEQ ID NO: 182 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, polinukleotid ili polinukleotidni sistem obuhvata SEQ ID NO: 183 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, polinukleotid ili polinukleotidni sistem obuhvata SEQ ID NO: 184 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0290] Kao što je ovde takođe opisano, polinukleotid ili polinukleotidni sistem obuhvata SEQ ID NO: 185 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, polinukleotid ili polinukleotidni sistem obuhvata SEQ ID NO: 187 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, polinukleotid ili polinukleotidni sistem obuhvata SEQ ID NO: 189 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, polinukleotid ili polinukleotidni sistem obuhvata SEQ ID NO: 191 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, polinukleotid ili polinukleotidni sistem obuhvata SEQ ID NO: 193 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0291] Kao što je ovde opisano, sekvenca prvog i/ili drugog receptora operativno je povezana sa promotorom. Kao što je ovde takođe opisano, sekvenca koja kodira prvi receptor operativno je povezana sa prvim promotorom i sekvenca koja kodira drugi receptor operativno je povezana sa drugim promotorom.
[0292] Ovaj pronalazak obezbeđuje vektore koji obuhvataju polinukleotide prema ovom pronalasku.
[0293] U nekim načinima ostvarivanja, prvi receptor kodira prvi vektor, a drugi receptor kodira drugi vektor. U nekim načinima ostvarivanja, oba receptora kodira jedan vektor.
[0294] U nekim načinima ostvarivanja, prvi i drugi receptor kodira jedan vektor. Postupci za kodiranje višestrukih polipeptida pomoću jednog vektora biće poznati stručnjacima iz ove oblasti i, inter alia, uključuju kodiranje višestrukih polipeptida pod kontrolom različitih promotora ili, ukoliko se jedan promotor koristi za upravljanje transkripcijom višestrukih polipeptida, upotrebu sekvenci koje kodiraju unutrašnja ribozomska ulazna mesta (IRES) i/ili samocepajuće peptide. Primerni samocepajući peptidi uključuju T2A, P2A, E2A i F2A samocepajuće peptide. Kao što je ovde opisano, T2A samocepajući peptid obuhvata sekvencu EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 430). Kao što je ovde takođe opisano, P2A samocepajući peptid obuhvata sekvencu ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 431). Kao što je ovde takođe opisano, E2A samocepajući peptid obuhvata sekvencu QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 432). Kao što je ovde takođe opisano, F2A samocepajući peptid obuhvata sekvencu VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 433). Kao što je ovde takođe opisano, T2A samocepajući peptid obuhvata sekvencu EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 430). Bilo koji od gorenavedenih može uključivati i N terminalni GSG veznik. Na primer, T2A samocepajući peptid može takođe obuhvatati sekvencu GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 178), koju može kodirati sekvenca GGATCCGGAGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACATGTGGCGACGTGGAAGAGAACC CTGGCCCC (SEQ ID NO: 434).
[0295] Kao što je ovde opisano, vektor obuhvata SEQ ID NO: 180 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, vektor obuhvata SEQ ID NO: 181 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, vektor obuhvata SEQ ID NO: 182 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, vektor obuhvata SEQ ID NO: 183 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, vektor obuhvata SEQ ID NO: 184 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0296] Kao što je ovde takođe opisano, vektor obuhvata SEQ ID NO: 185 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, vektor obuhvata SEQ ID NO: 187 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, vektor obuhvata SEQ ID NO: 189 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, vektor obuhvata SEQ ID NO: 191 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, vektor obuhvata SEQ ID NO: 193 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0297] Kao što je ovde opisano, vektor kodira polipeptidnu sekvencu koja obuhvata SEQ ID NO: 186 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, vektor kodira polipeptidnu sekvencu koja obuhvata SEQ ID NO: 188 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, vektor kodira polipeptidnu sekvencu koja obuhvata SEQ ID NO: 190 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, vektor kodira polipeptidnu sekvencu koja obuhvata SEQ ID NO: 192 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, vektor kodira polipeptidnu sekvencu koja obuhvata SEQ ID NO: 194 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0298] U nekim načinima ostvarivanja, vektor je vektor za ekspresiju, tj. za ekspresiju prvog i/ili drugog receptora u prikladnoj ćeliji.
[0299] Vektori izvedeni iz retrovirusa kao što je lentivirus predstavljaju prikladne alate za postizanje dugoročnog genskog transfera budući da omogućavaju dugoročnu, stabilnu integraciju transgena i njegovo širenje u ćelijama ćerkama. Lentivirusni vektori imaju dodatu prednost u odnosu na vektore izvedene iz onkoretrovirusa kao što su mišji virusi leukemije koja se ogleda u tome što oni mogu da transdukuju neproliferišuće ćelije, kao što su hepatociti. Takođe imaju dodatu prednost niske imunogenosti.
[0300] Ekspresija prirodnih ili sintetičkih nukleinskih kiselina koje kodiraju receptore obično se postiže operativnim povezivanjem nukleinske kiseline koja kodira receptor ili njegovih delova za promotor i uključivanjem tog konstrukta u ekspresioni vektor. Vektori mogu biti prikladni za replikaciju i integraciju eukariota. Tipični klonirajući vektori sadrže transkripcione i translacione terminatore, incijacione sekvence i promotore korisne za regulisanje ekspresije željene sekvence nukleinske kiseline.
[0301] Polinukleotidi koji kodiraju receptore mogu se klonirati u određeni broj vrsta vektora. Na primer, polinukleotidi se mogu klonirati u vektor koji uključuje plazmid, fagmid, derivat faga, životinjski virus i kozmid. Vektori od naročitog interesa uključuju ekspresione vektore, replikacione vektore, sonda generacione vektore i sekvencirajuće vektore.
[0302] Nadalje, ekspresioni vektor može se obezbediti ćelijama, kao što su imunske ćelije, u obliku virusnog vektora. U struci je dobro poznata virusna vektorska tehnologija i opisana je, na primer, u Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Njujork) i u drugim virusološkim i molekularno-biološkim priručnicima. Virusi, koji su korisni kao vektori uključuju retroviruse, adenoviruse, adeno asocirane viruse, herpes viruse i lentiviruse. Uglavnom, prikladni vektor sadrži poreklo replikacione funkcije u najmanje jednom organizmu, promotorskoj sekvenci, pogodnim mestima za restrikcione endonukleaze, i jedan selektabilan marker ili više njih, (npr. WO 01/96584; WO 01/29058 i U.S. pat. br.6,326,193).
[0303] Određeni broj sistema na bazi virusa razvijen je za genski transfer u sisarske ćelije. Na primer, retrovirusi obezbeđuju prikladnu pogodnu platformu za genske dostavne sisteme. Odabrani gen može se umetnuti u vektor i upakovati u retrovirusne čestice pomoću tehnika poznatih u tehnici. Rekombinantni virus se potom može izolovati i dostaviti ćelijama subjekta bilo in vivo ili ex vivo. U tehnici je poznat određeni broj retrovirusnih sistema. U nekim se načinima ostvarivanja koriste adenovirusni vektori. U tehnici je poznat određeni broj adenovirusnih vektora. U jednom se načinu ostvarivanja koriste lentivirusni vektori.
[0304] Dodatni promotorski elementi, npr. pojačivači, regulišu učestalost pokretanja transkripcije. Oni su obično smešteni u regionu 30-110 baznih parova (bp) ushodno od početnog mesta, iako se skoro pokazalo da određeni broj promotora takođe sadrži funkcionalne elemente nishodno od početnog mesta. Razmak između promotorskih elemenata često je fleksibilan, tako da se promotorska funkcija čuva kada se elementi obrnu ili međusobno pomere. U timidin kinazom (tk) promotoru, razmak između promotorskih elemenata može se povećati na 50 bp pre nego što dejstvo počne da opada. U zavisnosti od promotora, čini se da pojedinačni elementi mogu funkcionisati bilo kooperativno ili nezavisno kako bi aktivirali transkripciju.
[0305] Jedan primer prikladnog promotora je neposredna rana promotorska sekvenca citomegalovirusa (CMV). Ta je promotorska sekvenca snažna konstitutivna promotorska sekvenca koja može da pokrene visoke nivoe ekspresije bilo koje polinukleotidne sekvence koja je operativno povezana sa njom. Drugi primer prikladnog promotora je elongacioni faktor rasta-1α (EF-1α). Međutim, mogu se koristiti i druge konstitutivne promotorske sekvence, uključujući rani promotor majmunskog virusa 40 (SV40), mišji mlečni tumorski virus (MMTV), promotor dugog terminalnog pojavljivanja (LTR) virusa humane imunodeficijencije (HIV), MoMuLV promotor, promotor virusa ptičje leukemije, neposredni rani promotor Epštajn-Barovog virusa, promotor virusa Rousovog sarkoma, U6 promotor, kao i humane genske promotore kao što su aktinski promotor, miozinski promotor, hemoglobinski promotor i kreatinski kinazni promotor. Ovo otkrivanje uključuje i upotrebu konstitutivnih promotora. Inducibilni promotori se takođe razmatraju kao deo ovog otkrivanja. Upotreba inducibilnog promotora obezbeđuje molekulski prekidač koji može da uključi ekspresiju polinukleotidne sekvence, koja je operativno povezana kada je takva ekspresija poželjna, ili da isključi ekspresiju kada ekspresija nije poželjna. Primeri inducibilnih promotora uključuju metalotioninski promotor, glukokortikoidni promotor, progesteronski promotor i tetraciklinski promotor.
[0306] Kako bi se procenila ekspresija receptora, ekspresioni vektor kog treba uvesti u ćeliju takođe može sadržati bilo selektabilan markerski gen ili reporterski gen ili oba kako bi se olakšala identifikacija i selekcija eksprimujućih ćelije iz populacije ćelija koja se želi transfektovati ili inficirati virusnim vektorima. U drugim se aspektima selektabilni marker može nositi na različitom delu DNK i koristiti u proceduri kotransfekcije. I selektabilni markeri i reporterski geni mogu se flankirati sa odgovarajućim regulatornim sekvencama kako bi se omogućila ekspresija u ćelijama domaćinima. Korisni selektabilni markeri uključuju, na primer, gene koji su otporni na antibiotike, kao što je neo.
[0307] Reporterski geni se koriste za identifikovanje potencijalno transfektovanih ili transdukovanih ćelija i za procenu funkcionalnosti regulatornih sekvenci. Reporterski gen je uglavnom gen koji nije prisutan u organizmu ili tkivu primaocu niti ga oni eksprimuju i koji kodira polipeptid čija se ekspresija manifestuje nekim lako detektabilnim svojstvom, npr. enzimskom aktivnosti. Ekspresija reporterskog gena procenjuje se u prikladno vreme nakon uvođenja DNK u ćelije primaoce. Prikladni reporterski geni mogu uključivati gene koji kodiraju luciferazu, beta-galaktozidazu, hloramfenikolacetiltransferazu, izlučenu alkalnu fosfatazu ili zeleno fluorescentni proteinski gen (npr. Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Prikladni sistemi ekspresije dobro su poznati i mogu se pripremati primenom poznatih tehnika ili se dobiti komercijalno. Uglavnom se kao promotor identifikuje konstrukt sa minimalnim 5' flankirajućim regionom koji pokazuje najviši nivo ekspresije reporterskog gena. Takvi promotorski regioni mogu se povezati sa reporterskim genom i koristiti za procenjivanje mogućnosti agensa da moduliše promotorski pokretanu transkripciju.
[0308] U tehnici su poznati postupci za uvođenje gena u ćelije i njihovo eksprimovanje u njima. U kontekstu ekspresionog vektora, taj se vektor može lako uvesti u ćeliju domaćina, npr. ćeliju sisara, bakterije, kvasca ili insekta pomoću postupka iz tehnike. Na primer, ekspresioni vektor se može prebaciti u ćeliju domaćina fizičkim, hemijskim ili biološkim sredstvima.
[0309] Fizički postupci za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina uključuju taloženje kalcijumfosfata, lipofekciju, bombardovanje česticama, mikroinjektovanje i elektroporaciju. U tehnici su dobro poznati postupci za proizvodnju ćelija koje obuhvataju vektore i/ili egzogene nukleinske kiseline. Vidi, na primer, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Njujork). Kalcijumfosfatna transfekcija predstavlja jedan postupak za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina.
[0310] Biološki postupci za uvođenje polinukleotida od interesa u ćeliju domaćina uključuju upotrebu DNK i RNK vektora. Virusni vektori, a naročito retrovirusni vektori, postali su najšire korišćeni postupak za umetanje gena u ćelije sisara, npr. humane ćelije. Drugi virusni vektori mogu se izvesti iz lentivirusa, poksvirusa, herpes simpleks virusa I, adenovirusa i adeno asociranih virusa. Vidi, na primer, U.S. pat. br.
5,350,674 i 5,585,362.
[0311] Hemijska sredstava za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina uključuju koloidalne disperzione sisteme, kao što su makromolekulski kompleksi, nanokapsule, mikrosfere, perle i lipid bazirani sistemi koji uključuju emulzije ulja u vodi, micele, pomešane micele i lipozome. Primerni koloidalni sistem za upotrebu kao dostavni nosač in vitro i in vivo jeste lipozom (npr. veštačka membranska vezikula).
[0312] Bez obzira na postupak koji se koristi za uvođenje egzogenih nukleinskih kiselina u ćeliju domaćina ili na drugi način izlaganje ćelije inhibitoru ovog otkrivanja, može se izvesti veći broj analiza kako bi se potvrdilo prisustvo rekombinantne DNK sekvence u ćeliji domaćinu. Takve analize uključuju, na primer, „molekularne biološkeˮ analize dobro poznate stručnjacima iz ove oblasti, kao što su Sadern i Nortern blotovanje, RT-PCR i PCR; „biohemijskeˮ analize, kao što su detektovanje prisustva ili odsustva određenog peptida, npr. imunološkim sredstvima (ELISA-e i Vestern blotovi) ili ovde opisanim analizama kako bi se identifikovali agensi koji upadaju u obim ovog otkrivanja.
Imunske ćelije
[0313] Ovaj pronalazak obezbeđuje imunske ćelije prema priloženim patentnim zahtevima.
[0314] Kao što je ovde otkriveno, imunske ćelije obuhvataju: (a) prvi receptor, koji obuhvata prvi ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za ciljni antigen izabran od: (i) antigena specifičnog za ćelije kancera ili njegovog antigena peptida u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I) ili (ii) EGFR-a ili njegovog antigena peptida u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I) i (b) drugi receptor, koji obuhvata drugi ekstracelularni ligand koji se vezuje specifično za neciljni antigen čija je ekspresija izgubljena kod ćelije kancera usled gubitka heterozigotnosti ili drugog mehanizma. Kao što je ovde opisano, neciljni antigen se bira od CXCL16, COLEC12 i APCDD1, HLA-A*01, HLA-A*02, HLA-A*03, HLA-A*11, HLA-B*07, HLA-C*07 ili njegovog antigenskog peptida u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I). U nekim načinima ostvarivanja, neciljni antigen je HLA-A*02 ili njegova alelska varijanta. U nekim načinima ostvarivanja, prvi receptor je CAR ili TCR. U nekim načinima ostvarivanja, drugi receptor je inhibitorni receptor.
[0315] U nekim načinima ostvarivanja, imunska ćelija obuhvata shRNK. U nekim načinima ostvarivanja, shRNK redukuje ili eliminiše ekspresiju B2M. U nekim načinima ostvarivanja, shRNK redukuje ili eliminiše ekspresiju HLA-A*02.
[0316] U nekim načinima ostvarivanja, imunska ćelija obuhvata modifikaciju gena MHC klase I ili B2M gena. U nekim načinima ostvarivanja, gen MHC klase I predstavlja HLA-A* 02 ili njegovu alelsku varijantu. U nekim načinima ostvarivanja, modifikacija redukuje ili eliminiše ekspresiju gena MHC klase I ili B2M gena.
[0317] U nekim načinima ostvarivanja, imunska ćelija obuhvata polinukleotid prema ovom pronalasku. U nekim načinima ostvarivanja, polinukleotid obuhvata sekvencu koja kodira prvi receptor koji se koristi u ovom pronalasku. U nekim načinima ostvarivanja, polinukleotid obuhvata sekvencu koja kodira drugi receptor kakav se koristi u ovom pronalasku. U nekim načinima ostvarivanja, polinukleotid kodira shRNK kakav je ovde opisano. U nekim načinima ostvarivanja, polinukleotid obuhvata sekvencu koja kodira prvi receptor kakav se koristi u ovom pronalasku i drugi receptor kakav se koristi u ovom pronalasku. U nekim načinima ostvarivanja, polinukleotid obuhvata sekvencu koja kodira prvi receptor kakav se koristi u ovom pronalasku, drugi receptor kakav se koristi u ovom pronalasku i shRNK kakva je ovde opisana.
[0318] Kako se ovde koristi, pojam „imunska ćelijaˮ odnosi se na ćeliju koja je uključena u urođene ili adaptivne (stečene) imunske sisteme. Primerne urođene imunske ćelije uključuju fagocitne ćelije kao što su neutrofili, monociti i makrofagi, ćelije prirodne ubice (NK), polimorfonuklearne leukocite kao što su neutrofili, eozinofili i bazofili, i mononuklearne ćelije kao što su monociti, makrofagi i mastociti. Imunske ćelije koje imaju uloge u stečenom imunitetu uključuju limfocite kao što su T-ćelije i B-ćelije.
[0319] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 177 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta, a drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 174 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde opisano, prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 177 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta, a drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 173 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 175 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta, a drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 174 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 175 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta, a drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 173 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 176 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta, a drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 173 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta. Kao što je ovde takođe opisano, prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 176 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta, a drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 174 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0320] Kao što je ovde takođe opisano, imunska ćelija obuhvata i T2A samocepajući peptid, pri čemu T2A samocepajući peptid obuhvata SEQ ID NO: 178 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0321] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, imunska ćelija takođe obuhvata interferirajuću RNK, pri čemu ta interferirajuća RNK obuhvata SEQ ID NO: 179 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0322] Kako se ovde koristi, „T-ćelijaˮ se odnosi na vrstu limfocita koja potiče od prekursora koštane srži koji se razvija u grudnoj žlezdi. Postoji nekoliko različitih vrsta T-ćelija, koje se razvijaju nakon migracije u grudnu žlezdu, koje uključuju pomoćničke CD4+ T-ćelije, citotoksične CD8+ T-ćelije, memorijske T-ćelije, regulatorne CD4+ T-ćelije, NK T-ćelije, γδ T-ćelije, mukozalno asocirane konstantne T (MAIT) ćelije i matične memorijske T-ćelije. Stručnjak iz ove oblasti može razlikovati različite vrste T-ćelija na osnovu njihove ekspresije markera. Stručnjak iz ove oblasti zna postupke za razlikovanje vrsta T-ćelija.
[0323] Kao što je ovde opisano, imunska ćelija se bira iz grupe koju čine T-ćelije, B-ćelije i ćelije prirodne ubice (NK). Kao što je ovde takođe opisano, imunska ćelija je T-ćelija. Kao što je ovde takođe opisano, imunska ćelija je B-ćelija. Kao što je ovde takođe opisano, imunska ćelija je ćelija prirodni ubica (NK). Kao što je ovde takođe opisano, imunska ćelija je CD8-. Kao što je ovde takođe opisano, imunska ćelija je CD8+. Kao što je ovde takođe opisano, imunska ćelija je CD4+. Kao što je ovde takođe opisano, imunska ćelija je CD4-. Prema ovom pronalasku, imunska ćelija je CD8- CD4+ T-ćelija ili CD8+ CD4- T-ćelija.
[0324] Kao što je ovde opisano, imunska ćelija je gama delta (γδ) T-ćelija. Kao što je ovde takođe opisano, imunska ćelija je konstantna T-ćelija. Kao što je ovde takođe opisano, imunska ćelija je konstantna T-ćelija prirodni ubica (iNKT ćelija).
[0325] Kao što je ovde opisano, prvi receptor i drugi receptor zajedno specifično aktiviraju imunsku ćeliju u prisustvu ciljne ćelije.
[0326] Imunska ćelija može biti neprirodna. Imunska ćelija može biti izolovana.
[0327] Stručnjak iz ove oblasti zna postupke za transformisanje populacija imunskih ćelija, kao što su T-ćelije, pomoću vektora iz ovog otkrivanja. Na primer, CD3+ T-ćelije mogu da se izoluju iz PBMC-ova uz upotrebu kompleta za negativnu izolaciju CD3+ T-ćelija (Miltenyi), prema uputstvima proizvođača. T-ćelije se mogu kultivisati u gustini od 1 × 10<6>ćelija/mL u X-Vivo 15 podlozi sa dodatkom 5% humanog A/B seruma i 1% Pen/strep u prisustvu CD3/28 Dynabeads (odnos ćelije i perle 1:1) i 300 jedinica/mL IL-2 (Miltenyi). Nakon 2 dana, T-ćelije se mogu transdukovati virusnim vektorima, kao što su lentivirusni vektori, pomoću postupaka poznatih u tehnici. Virusni vektor se može transdukovati sa mnogostrukošću infekcije (MOI) od 5. Ćelije se zatim mogu kultivisati u IL-2 ili drugim citokinima kao što su kombinacije IL-7/15/21 još 5 dana pre obogaćivanja. Stručnjak iz ove oblasti zna postupke za izolovanje i kultivisanje drugih populacija imunskih ćelija, kao što su B-ćelije ili druge populacije T-ćelija. Iako ovaj postupak ugrubo predstavlja potencijalan pristup, važno je napomenuti da se te tehnologije brzo razvijaju. Na primer, odlična virusna transdukcija mononuklearnih ćelija iz periferne krvi može da se postigne nakon 5 dana rasta kako bi se generisala populacija sa > 99% CD3+ visoko transdukovanih ćelija.
[0328] Stručnjak iz ove oblasti zna postupke za aktiviranje i kultivisanje populacija T-ćelija koje uključuju TCR-ove, CAR-ove, inhibitorne receptore, receptore ili vektore koji ih kodiraju.
[0329] Bilo pre ili nakon genetičke modifikacije T-ćelija radi eksprimovanja TCR-a, T-ćelije se mogu aktivirati i širiti uglavnom pomoću postupaka kao što su opisani, na primer, u U.S. pat. br.
6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041, 10040846 i U.S. obj. pat. prij. br.2006/0121005.
[0330] T-ćelije ovog otkrivanja mogu se širiti i aktivirati in vitro. T-ćelije ovog pronalaska se uglavnom šire in vitro dolaskom u kontakt sa površinom za koju je pričvršćen agens koji stimuliše signal povezan sa CD3/TCR kompleksom i ligand koji stimuliše kostimulatorni molekul na površini T-ćelije. Konkretno, populacije T-ćelija mogu se stimulisati kao što je ovde opisano, na primer, dolaskom u kontakt sa antiCD3 antitelom. Za kostimulaciju pomoćnog molekula na površini T-ćelije, koristi se ligand koji vezuje taj dodatni molekul. Na primer, populacija T-ćelija može biti dovedena u kontakt sa antiCD3 antitelom i antiCD28 antitelom, u uslovima koji su prikladni za stimulaciju proliferacije T-ćelija. Da bi se stimulisala proliferacija bilo CD4+ T-ćelija ili CD8+ T-ćelija, može se koristiti antiCD3 antitelo i antiCD28 antitelo. Mogu da se koriste primeri antiCD28 antitela koji uključuju 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Bezanson, Francuska) kao što se mogu koristiti i drugi postupci uobičajeno poznati u tehnici (Berg et al., Transplant Proc.30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med.190(9):13191328, 1999; Garland et al., J.
Immunol Meth.227(1-2):53-63, 1999).
[0331] Primarni stimulatorni signal i kostimulatorni signal za T-ćeliju mogu se obezbediti pomoću različitih protokola. Na primer, agensi koji obezbeđuju svaki signal mogu biti u rastvoru ili spregnuti sa površinom. Kada su spregnuti sa površinom, agensi mogu biti spregnuti sa istom površinom (tj. u „cisˮ formaciji) ili sa različitim površinama (tj. u „transˮ formaciji). Alternativno, jedan agens može biti spregnut sa površinom, dok je drugi agens u rastvoru. Agens koji obezbeđuje kostimulatorni signal može biti vezan za površinu ćelije, dok agens koji obezbeđuje primarni aktivacioni signal može biti u rastvoru ili spregnut sa površinom. Oba agensa mogu biti u rastvoru. Agensi mogu biti u rastvorljivom obliku, pa potom umreženi sa površinom, kao što su ćelije koje eksprimuju Fc receptore ili antitela ili drugi vezujući agens, koji će se vezati za agense. S tim u vezi, vidi na primer U.S. objave patentnih prijava br.
20040101519 i 20060034810 za veštačke antigen prezentujuće ćelije (aAPC) koje se razmatraju za upotrebu u aktiviranju i širenju T-ćelija u ovom otkrivanju.
[0332] Dva agensa su imobilizovana na perlama, bilo na istoj perli, tj. „cisˮ, ili na različitim perlama, tj. „transˮ. Primera radi, agens koji obezbeđuje primarni aktivacioni signal je antiCD3 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, dok je agens koji obezbeđuje kostimulatorni signal antiCD28 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, i oba agensa su koimobilizovana na istoj perli u ekvivalentnim molekulskim količinama. Može se koristiti odnos 1:1 obaju antitela vezanih za perle za širenje CD4+ T-ćelija i rast T-ćelija. Odnos CD3:CD28 antitela vezanog za perle može varirati od 100:1 do 1:100, uključujući sve celobrojne vrednosti između njih. U jednom je aspektu prema ovom otkrivanju više antiCD28 antitela vezano za čestice od antiCD3 antitela, tj. odnos CD3:CD28 je manji od jedan. Odnos anti CD28 antitela spram anti CD3 antitela vezanog za perle može biti veći od 2:1.
[0333] Odnosi čestica i ćelija od 1:500 do 500:1, uključujući sve celobrojne vrednosti između njih, mogu se koristiti za stimulaciju T-ćelija ili drugih ciljnih ćelija. Stručnjaci iz ove oblasti već znaju da odnos čestica i ćelija može zavisiti od veličine čestica u odnosu na ciljnu ćeliju. Na primer, male perle mogu da vežu samo nekoliko ćelija, dok veće perle mogu da vežu mnogo više. Za stimulaciju T-ćelija može se takođe odnos ćelija i čestica koji može varirati od 1:100 do 100:1, uključujući sve celobrojne vrednosti između njih, a u daljim načinima ostvarivanja odnos može iznositi od 1:9 do 9:1, uključujući sve celobrojne vrednosti između njih. Može se koristiti odnos ćelija i perli od 1:1. Stručnjak iz ove oblasti zna da različiti odnosi mogu biti prikladni za upotrebu u ovom otkrivanju. Konkretno, odnosi će varirati u zavisnosti od veličine čestica i veličine i vrste ćelije.
[0334] U ovom se otkrivanju, ćelije, kao što su T-ćelije, mogu kombinovati sa perlama koje su obložene agensima, pri čemu se te perle i ćelije potom razdvajaju i onda se ćelije kultivišu. Perle obložene agensima i ćelije ne moraju se razdvajati pre kultivisanja već se mogu kultivisati zajedno. Perle i ćelije se mogu prvo koncentrovati primenom sile, kao što je magnetska sila, što dovodi do povećane ligacije membranskih markera, čime se indukuje stimulacija ćelija.
[0335] Primera radi, membranski proteini se mogu povezati ligacijom omogućavanjem paramagnetskim perlama za koje su pričvršćena antiCD3 i antiCD28 da dođu u kontakt sa T-ćelijama. U puferu se mogu kombinovati ćelije (na primer, CD4+ T-ćelije) i perle (na primer, DYNABEADS CD3/CD28 T paramagnetske perle u odnosu 1:1). Stručnjaci iz ove oblasti opet znaju da se može koristiti bilo koja koncentracija ćelija. Može biti poželjno značajno smanjiti zapreminu u kojoj se čestice i ćelije zajedno mešaju (tj. povećati koncentraciju ćelija) kako bi se obezbedio maksimalan kontakt ćelija i čestica. Na primer, može se koristiti koncentracija od oko 2 milijarde ćelija/ml. Može se koristiti koncentracija veća od 100 miliona ćelija/ml. Može se koristiti koncentracija ćelija od 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 miliona ćelija/ml. Može se koristiti koncentracija ćelija od 75, 80, 85, 90, 95 ili 100 miliona ćelija/ml. Mogu se koristiti koncentracije od 125 ili 150 miliona ćelija/ml. Mogu se koristiti ćelije koje se kultivišu u gustini od 1 × 10<6>ćelija/ml.
[0336] Mešavina se može kultivisati tokom nekoliko sati (oko 3 sata) do oko 14 dana ili bilo koju satnu celobrojnu vrednost između njih. Perle i T-ćelije mogu se kultivisati zajedno tokom 2-3 dana. Uslovi prikladni za kultivisanje T-ćelija uključuju odgovarajuću podlogu (npr. minimalnu esencijalnu podlogu ili RPMI podlogu 1640 ili X-Vivo 15 (Lonza)) koja može da sadrži faktore neophodne za proliferaciju i vijabilnost, uključujući serum (npr. fetalni goveđi ili humani serum), interleukin-2 (IL-2), insulin, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ i TNF-α, ili bilo koje druge dodatke za rast ćelija koji su poznati stručnjaku iz ove oblasti. Drugi dodaci za rast ćelija mogu obuhvatati surfaktante, plazmanate i redukciona sredstva kao što su N-acetil-cistein i 2-merkaptoetanol. Podloge mogu uključivati RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 i X-Vivo 20, Optimizer, sa dodatim aminokiselinama, natrijumpiruvatom i vitaminima, bilo bez seruma ili sa dodatkom odgovarajuće količine seruma (ili plazme), ili definisanog skupa hormona i/ili količine jednog citokina ili više njih dovoljne za rast i širenje T-ćelija. Podloga može da obuhvata X-Vivo 15 podlogu sa dodatkom 5% humanog A/B seruma, 1% penicilina/streptomicina (pen/strep) i 300 jedinica/ml IL-2 (Miltenyi).
[0337] T-ćelije se mogu održavati pod uslovima koji su potrebni za podršku rastu, na primer, odgovarajuća temperatura (npr.37°C) i atmosfera (npr. vazduh plus 5% CO2).
[0338] T-ćelije koje obuhvataju TCR-ove, CAR-ove i inhibitorne receptore ovog otkrivanja mogu biti autologne. Pre širenja i genetske modifikacije, izvor T-ćelija može biti dobijen od subjekta. Imunske ćelije kao što su T-ćelije mogu se dobiti iz različitih izvora, uključujući mononuklearne ćelije iz periferne krvi, koštanu srž, tkivo limfnih čvorova, krv iz pupčanika, tkivo grudne žlezde, tkivo sa mesta infekcije, ascites, pleuralnu efuziju, tkivo slezine i tumore. U ovom se otkrivanju može koristiti bilo koji broj linija T-ćelija dostupnih u tehnici. U ovom otkrivanju, T-ćelije mogu biti dobijene iz jedinice krvi uzete od subjekta pomoću različitih tehnika poznatih stručnjaku iz ove oblasti, kao što je Ficoll<™>razdvajanje.
[0339] Ćelije iz krvotoka osobe mogu da se dobiju aferezom. Proizvod afereze obično može da sadrži limfocite, koji uključuju T-ćelije, monocite, granulocite, B-ćelije, druga nukleisana bela krvna zrnca, crvena krvna zrnca i trombocite. Ćelije prikupljene aferezom mogu se ispirati radi uklanjanja frakcije plazme i smeštanja ćelija u odgovarajući pufer ili podlogu za dalje faze obrade. Ćelije se mogu ispirati fosfatom puferisanim fiziološkim rastvorom (PBS). Rastvoru za ispiranje može nedostajati kalcijum i može nedostajati magnezijum ili može nedostajati većina dvovalentnih katjona, ako ne i svi. Stručnjaci iz ove oblasti znaju da se faza ispiranja može izvoditi postupcima poznatim stručnjacima iz ove oblasti, kao što je poluautomatska „protočnaˮ centrifuga (na primer, Cobe 2991 procesor ćelija, Baxter CytoMate ili Haemonetics Cell Saver 5), prema uputstvima proizvođača. Nakon ispiranja, ćelije se mogu ponovo suspendovati u različitim biokompatibilnim puferima, kao što su, na primer, PBS bez Ca2<+>i bez Mg2<+>, PlasmaLyte A ili drugi fiziološki rastvori sa puferom ili bez njega. Alternativno, nepoželjne komponente uzorka afereze mogu biti uklonjene, a ćelije se mogu direktno ponovo suspendovati u podlozi za kultivisanje.
[0340] Imunske ćelije kao što su T-ćelije mogu da budu izolovane iz limfocita iz periferne krvi lizom crvenih krvnih zrnaca i trošenjem monocita, na primer, centrifugiranjem kroz PERCOLL™ gradijent ili kontraprotočnom centrifugalnom elutriacijom. Specifične subpopulacije imunskih ćelija, kao što su T-ćelije, B-ćelije ili CD4+ T-ćelije, mogu se dalje izolovati tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. Na primer, T-ćelije se mogu izolovati inkubacijom sa antiCD4-konjugovanim perlama, tokom vremenskog perioda dovoljnog za pozitivnu selekciju željenih T-ćelija.
[0341] Obogaćivanje populacije imunskih ćelija, kao što je populacija T-ćelija, putem negativne selekcije može se postići kombinacijom antitela usmerenih ka površinskim markerima koji su jedinstveni za negativno izabrane ćelije. Jedan postupka je sortiranje i/ili selekcija ćelija putem negativne magnetne imunoadhezije ili protočne citometrije koja koristi koktel monoklonskih antitela usmerenih ka površinskim markerima ćelija prisutnim na negativno izabranim ćelijama. Na primer, za obogaćivanje CD4+ ćelija putem negativne selekcije, koktel monoklonskih antitela obično uključuje antitela za CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR i CD8.
[0342] Koncentracija ćelija i površinskih čestica (npr. kao što su perle) može da varira za izolaciju željene populacije imunskih ćelija putem pozitivne ili negativne selekcije. Može biti poželjno značajno smanjiti zapreminu, u kojoj se perle i ćelije mešaju (tj. povećati koncentraciju ćelija), kako bi se osigurao maksimalan kontakt ćelija i perli.
[0343] Ćelije mogu biti inkubirane na rotatoru tokom različitih dužina vremena pri brzinama koje variraju bilo na 2-10°C ili na sobnoj temperaturi.
[0344] T-ćelije za stimulaciju, ili PBMC-ovi iz kojih su izolovane imunske ćelije kao što su T-ćelije, takođe se mogu zamrznuti nakon faze ispiranja. Bez želje za vezivanjem za teoriju, faza zamrzavanja i potom odmrzavanja obezbeđuje uniformniji proizvod uklanjanjem granulocita i donekle monocita u populaciji ćelija. Nakon faze ispiranja koja uklanja plazmu i trombocite, ćelije se mogu suspendovati u rastvoru za zamrzavanje. Iako su u tehnici poznati mnogi rastvori za zamrzavanje i parametri te će biti korisni u ovom kontekstu, jedan od postupaka uključuje upotrebu PBS-a koji sadrži 20% DMSO-a i 8% humanog serumskog albumina ili podloge za kultivisanje koja sadrži 10% dekstrana 40 i 5% dekstroze, 20% humanog serumskog albumina i 7,5% DMSO-a ili 31,25% Plasmalyte-A, 31,25% dekstroze 5%, 0,45% NaCl, 10% dekstrana 40 i 5% dekstroze, 20% humanog serumskog albumina i 7,5% DMSO-a ili drugu prikladnu podlogu za zamrzavanje ćelija koja može da sadrži na primer Hespan i PlasmaLyte A, zatim se ćelije zamrzavaju na -80°C brzinom od 1°C u minutu i skladište se u parnoj fazi rezervoara sa tečnim azotom. Mogu se koristiti i drugi kontrolisani postupci za kontrolisano zamrzavanje, kao i nekontrolisano zamrzavanje direktno na -20°C ili u tečnom azotu.
[0345] Ovo otkrivanje obezbeđuje imunsku ćeliju koja eksprimuje ovde opisane receptore aktivatora i/ili ihibitora, pri čemu imunska ćelija redukuje ekspresiju i/ili funkciju kompleksa glavne histokompatibilnosti (MHC) klase I.
[0346] U nekim je načinima ostvarivanja ovog pronalaska imunska ćelija autologna. Na primer, imunske ćelije se izoluju ili dobijaju iz istog subjekta koji će ih primiti kao deo terapijskog režima. Može biti poželjno modifikovati autologne imunske ćelije tako da imaju redukovanu ekspresiju i/ili funkciju MHC klase I, pri čemu je inhibitorni receptor specifičan za antigen MHC klase I. Bez želje za vezivanjem za teoriju, modifikacija autolognih imunskih ćelija sa redukovanom ekspresijom i/ili funkcijom MHC klase I redukuje vezivanje inhibitornih receptora MHC klasom I koju eksprimuju imunske ćelije, bilo u cis ili trans.
[0347] U nekim je načinima ostvarivanja ovog pronalaska imunska ćelija alogena. Alogene imunske ćelije mogu se izvesti iz davaoca koji nije subjekat kom će se dati te imunske ćelije. Alogene imunske ćelije često se u ćelijskoj terapiji nazivaju „ćelijama iz postojećih zalihaˮ ili „univerzalnimˮ, zbog mogućnosti alogenih ćelija da se pripreme i skladište za upotrebu kod subjekata različitih genotipova.
[0348] Predviđeno je da su svi prikladni postupci za redukovanje ekspresije i/ili funkcije kompleksa MHC klase I unutar obima ovog otkrivanja i, inter alia, uključuju ekspresiju interferirajućih RNK koje nokdaunuju jednu RNK koja kodira komponente MHC klase I ili više njih ili modifikacije gena koji kodiraju komponente MHC klase I.
[0349] Glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) je lokus na genomu kičmenjaka koji kodira skup polipeptida potrebnih za adaptivni imunski sistem. Među njima su polipeptidi MHC klase I koji uključuju HLA-A, HLA-B i HLA-C i njihove alele. Aleli MHC klase I visoko su polimorfni i eksprimuju se u svim nukleisanim ćelijama. Polipeptidi MHC klase I koje kodiraju HLA-A, HLA-B i HLA-C i njihovi aleli obrazuju heterodimere sa β2 mikroglobulinom (B2M) i prisutni su u kompleksu sa antigenima na površini ćelija. Kao što se ovde navodi, gen ili polipeptid MHC klase I može se odnositi na bilo koji polipeptid koji se nalazi u MHC-u ili odgovarajući gen koji kodira pomenuti polipeptid. Imunske ćelije ovog otkrivanja mogu biti inaktivirane ligandom inhibitora koji uključuje polipeptid MHC klase I, npr. HLA-A, HLA-B i HLA-C i njihove alele. Aleli HLA-A mogu biti, na primer, HLA-A*02, HLA-A*02:01, HLA-A*02:01:01, HLA-A*02:01:01:01 i/ili bilo koji gen koji kodira protein identičan ili sličan HLA-A*02 proteinu. Zbog toga je, radi sprečavanja autokrinog signaliziranja/vezivanja kao što je ovde opisano, poželjno eliminisati ili redukovati ekspresiju polipeptida koje kodiraju HLA-A, HLA-B i HLA-C i njihovih aleli u imunskim ćelijama.
Imunske ćelije sa redukovanom ekspresijom polipeptida MHC klase I
[0350] Ovde opisane imunske ćelije mogu biti modifikovane da inaktiviraju, redukuju ili eliminišu ekspresiju ili funkciju endogenog gena koji kodira alel endogenog polipeptida MHC klase I. Kao što je ovde opisano, gen koji kodira polipeptid MHC klase I je HLA-A, HLA-B i/ili HLA-C. HLA-A, HLA-B i HLA-C kodiraju HLA-A, HLA-B i HLA-C lokusi. Svaki od HLA-A, HLA-B i HLA-C uključuje mnoge varijantne alele. Kao što je ovde opisano, gen koji kodira polipeptid MHC klase I je HLA-A. U nekim načinima ostvarivanja ovog otkrivanja, gen koji kodira polipeptid MHC klase I je HLA-A*02. U nekim načinima ostvarivanja ovog otkrivanja, gen koji kodira polipeptid MHC klase I je HLA-A*02:01. U nekim načinima ostvarivanja ovog otkrivanja, gen koji kodira polipeptid MHC klase I je HLA-A*02:01:01. U nekim načinima ostvarivanja ovog otkrivanja, gen koji kodira polipeptid MHC klase I je HLA-A*02:01:01:01.
[0351] U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, genetski dizajnirane imunske ćelije se modifikuju da redukuju ili eliminišu ekspresiju produkta gena B2M. Gen beta-2 mikroglobulina (B2M) kodira protein koji se povezuje sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC) klase I, tj. MHC-I kompleksom. MHC-I kompleks je neophodan za prezentaciju antigena na ćelijskoj membrani. MHC-I kompleks je prekinut i nefunkcionalan kada je B2M obrisan (Wang D et al. Stem Cells Transl Med.4:1234-1245 (2015)). Osim toga, B2M gen se može visokoefikasno prekinuti primenom tehnika genetskog uređivanja poznatih u tehnici (Ren et al. Clin. Cancer Res.23:2255-2266 (2017)). Redukovanje ili eliminisanje B2M može redukovati ili eliminisati funkcionalni MHC I na površini imunske ćelije.
[0352] Ovo otkrivanje obezbeđuje sisteme za genetsko uređivanje radi uređivanja endogenog ciljnog gena u imunskoj ćeliji. Ovo otkrivanje obezbeđuje interferirajuće RNK specifične za sekvence ciljnih gena.
Sistemi za genetsko uređivanje kao što su CRISPR/Cas sistemi, TALEN-i i cinkovi prsti mogu se koristiti za generisanje dvolančanih prekida, koji se, putem mehanizama popravke gena kao što su usmerena homologna reparacija ili nehomologno spajanje krajeva (NHEJ), mogu koristiti za uvođenje mutacija. NHEJ nakon resekcije krajeva prekida, ili nepravilnog spajanja krajeva, može se koristiti za uvođenje brisanja. U nekim načinima ostvarivanja, ciljni gen obuhvata gen koji kodira podjedinicu MHC-I kompleksa.
[0353] Ciljne genske sekvence uključuju promotore, pojačivače, introne, eksone, spojeve introna/eksona, transkripcione produkte (pre-iRNK, iRNK i varijante splajsovanja) i/ili 3' i 5' netranslirane regione (UTR). Bilo koji genetski element ili bilo koja kombinacija genetskih elemenata može biti cilj za potrebe genetskog uređivanja u opisanim imunskim ćelijama. Modifikacije ciljnih gena mogu se sprovesti korišćenjem bilo kog, u tehnici poznatog, postupka za uređivanje ciljnog gena koji dovodi do promenjene ili poremećene ekspresije ili funkcije ciljnog gena ili genetskog proizvoda.
[0354] U nekim načinima ostvarivanja, modifikovanje gena koji kodira polipeptid MHC klase I obuhvata brisanje svih gena ili dela jednog gena. U nekim načinima ostvarivanja, modifikovanje gena koji kodira polipeptid MHC klase I obuhvata uvođenje mutacije u gen. U nekim načinima ostvarivanja, mutacija obuhvata brisanje, umetanje, supstituciju ili mutaciju pomeranja okvira čitanja. U nekim načinima ostvarivanja, modifikovanje gena obuhvata upotrebu endonukleaze vođene nukleinskom kiselinom.
[0355] U tehnici su poznate sekvence gena za ovde opisane ciljne gene. Sekvence mogu da se pronađu u javno dostupnim bazama podataka, kao što su NCBI GenBank ili NCBI baza podataka nukleotida.
Sekvence mogu da se nađu upotrebom identifikatora gena, na primer, HLA-A gen ima NCBI ID gena: 3105, HLA-B gen ima NCBI ID gena: 3106, HLA-C gen ima NCBI ID gena: 3107 a B2M gen ima NCBI ID gena: 567 i NCBI referentnu sekvencu: NC_000015.10. Sekvence gena se mogu naći i pretragom javno dostupnih baza podataka pomoću ključnih reči. Na primer, HLA-A aleli mogu da se nađu u NCBI bazi podataka nukleotida pretragom ključnih reči, „HLA-A*02ˮ, „HLA-A*02:01ˮ, „HLA-A*02:01:01ˮ ili „HLA-A*02:01:01:01ˮ. Te sekvence mogu da se koriste za ciljanje u raznim tehnikama za genetsko uređivanje poznatim u tehnici. Tabela 7 pruža neograničavajuće ilustrativne sekvence HLA-A alela i sekvence B2M gena koje se ciljaju radi modifikacije kao što je ovde opisano.
Tabela 7. Primerne sekvence ciljnih gena
[0356] Stručnjak iz ove oblasti zna da se T može supstituisati sa U radi pretvaranja RNK sekvence u DNK sekvencu i obratno, a obe su predviđene kao sekvence ciljnog gena ovog otkrivanja.
[0357] Ciljni gen se uređuje u ovde opisanim imunskim ćelijama pomoću endonukleaze vođene nukleinskom kiselinom. Primerne endonukleaze vođene nukleinskom kiselinom uključuju endonukleaze Klase II, kao što je CRISPR/Cas9.
[0358] „CRISPRˮ ili „CRISPR uređivanje genaˮ kako se ovde koristi odnosi se na skup grupisanih pravilno razmaknutih kratkih palindromskih ponavljanja ili na sistem koji obuhvata takav skup ponavljanja. „Casˮ, kako se koristi ovde, označava protein povezan sa CRISPR-om. „CRISPR/Casˮ sistem se odnosi na sistem koji je izveden iz CRISPR-a i Cas-a, koji može biti korišćen za utišavanje, nokautiranje ili mutiranje ciljnog gena. Taj sistem je vrsta prokariotskog imunskog sistema koji daje otpornost na strane genetske elemente kao što su plazmidi i fagi te obezbeđuje oblik stečenog imuniteta. CRISPR/Cas sistem je modifikovan za upotrebu u genetskom uređivanju. To se postiže uvođenjem jedne specifično dizajnirane nukleinske kiseline vodiča (gNK), obično RNK vodiča (gRNK), ili više njih i odgovarajuće Cas endonukleaze u eukariotsku ćeliju, čime se obrazuje ribonukleoproteinski kompleks sa gNK-om. gNK vodi gNK-endonukleazni kompleks do ciljne genomske lokacije, pa endonukleaza uvodi prekid u lancu na toj ciljnoj genomskoj lokaciji. Taj dvolančani prekid može biti popravljen ćelijskim mehanizmima poput nehomolognog spajanja krajeva (što dovodi do brisanja) ili homolognog popravljanja (koje može generisati umetanja), čime se uvode genetske modifikacije u genom ćelije domaćina.
[0359] CRISPR/Cas sistemi se klasifikuju prema klasi i tipu. Trenutno, sistemi klase 2 predstavljaju jednostruki interferirajući protein koji je kategorizovan u tri različita tipa (tip II, V i VI). Zamišljeno je da su svi CRISPR/Cas sistemi klase 2 pogodni za genetsko uređivanje, na primer sistem tipa II, tipa V ili tipa VI, unutar obima ovog otkrivanja. Primerni CRISPR sistemi klase 2 tipa II uključuju Cas9, Csn2 i Cas4. Primerni CRISPR sistemi klase 2 tipa V uključuju Cas12, Cas12a (Cpf1), Cas12b (C2c1), Cas12c (C2c3), Cas12d (CasY), Cas12e (CasX), Cas12f, Cas12g, Cas12h, Cas12i i Cas12k (C2c5). Primerni sistemi klase 2 tipa IV uključuju Cas13, Cas13a (C2c2) Cas13b, Cas13c i Cas13d.
[0360] CRISPR sekvenca, koja se ponekad naziva CRISPR lokusom, obuhvata ponavljanja i spejsere koji se smenjuju. U prirodno nastalom CRISPR-u, spejseri obično sadrže sekvence strane bakteriji, kao što su sekvence plazmida ili faga. Kako je ovde opisano, spejserske sekvence se takođe mogu nazivati „ciljnim sekvencamaˮ. U CRISPR/Cas sistemima za genetički inženjering, spejseri se izvode iz ciljne genetske sekvence (gNK).
[0361] Primerni CRISPR sistem klase 2 tipa II oslanja se na protein Cas9, koji je nukleaza sa dvama aktivnim mestima za sečenje, jedno za svaki lanac dvostruke spirale. Kombinovanjem Cas9 i modifikovanog CRISPR lokusa, RNK se može koristiti u sistemu za genetsko uređivanje. Pennisi (2013) Science 341: 833-836. Cas protein koji se može koristiti za modifikaciju imunskih ćelija jeste Cas9.
[0362] Dakle, CRISPR/Cas sistem može biti korišćen za uređivanje ciljnog gena, kao što je gen ciljan za uređivanje u ovde opisanim imunskim ćelijama, dodavanjem ili brisanjem baznog para ili uvođenjem preuranjenog stop koda, čime se tada smanjuje ekspresija cilja. CRISPR/Cas sistem može se takođe alternativno korisiti kao RNK interferencija, reverzibilno isključujući ciljni gen. Na primer, u ćelijama sisara, RNK može da vodi Cas protein ka promotoru ciljnog gena, pri čemu se sterički blokiraju RNK polimeraze.
[0363] Cas protein može se izvesti iz bilo kog bakterijskog ili arhejskog Cas proteina. Zamišljeno je da je svaki prikladan CRISPR/Cas sistem u okviru ovog otkrivanja. U drugim aspektima, Cas protein može da uključuje jedan ili više od: Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a (Cpf1), Cas13, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, CasX, CasY, njihove homologe ili njihove modifikovane verzije. Cas protein može biti Cas9 protein, Cpf1 protein, C2c1 protein, C2c2 protein, C2c3 protein, Cas3, Cas3-HD, Cas5, Cas7, Cas8, Cas10, ili njihove kombinacije ili njihovi kompleksi. Cas protein može biti Cas9 protein.
[0364] Mogu se generisati veštački CRISPR/Cas sistemi koji inhibiraju ciljni gen, uz upotrebu tehnologije poznate u tehnici, npr. tehnologiju opisanu u U.S. objavi br.20140068797 i Cong (2013) Science 339: 819-823.Mogu se generisati drugi veštački CRISPR/Cas sistemi koji su poznati u tehnici i koji inhibiraju ciljni gen, npr. sistemi opisani u Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6569-576, U.S. pat. br.8,871,445;
8,865,406; 8,795,965; 8,771,945 i 8,697,359. Stručnjacima iz ove oblasti poznati su postupci za dizajniranje prikladnih gNK-ova za određeni Cas protein.
[0365] Ovo otkrivanje obezbeđuje nukleinske kiseline vodiče (gNK) koje ciljaju gen i koje mogu usmeriti dejstva povezanog polipeptida (npr. endonukleaze vođene nukleinskom kiselinom) ka specifičnoj sekvenci ciljnog gena unutar ciljnog genoma nukleinske kiseline. Nukleinska kiselina koja cilja genom može biti RNK. RNK koja cilja genom naziva se „RNK vodičemˮ ili „gRNKˮ. RNK vodič može da sadrži najmanje jednu ciljajuću sekvencu koja se hibridizuje sa ciljnom sekvencom od interesa nukleinske kiseline i CRISPR sekvencu ponavljanja. U nekim sistemima Tipa II, gRNK takođe obuhvata drugu RNK nazvanu tracrRNK sekvencom, koja se ovde takođe naziva sekvenca „osnoveˮ. U RNK vodiču (gRNK) Tipa II se CRISPR sekvenca ponavljanja i sekvenca osnove međusobno hibridizuju kako bi obrazovale dupleks. U RNK vodiču (gRNK) tipa V, crRNK obrazuje dupleks. U obama sistemima, dupleks može da vezuje polipeptid usmeren ka mestu, tako da RNK vodič i polipeptid usmeren ka mestu obrazuju kompleks. Nukleinska kiselina koja cilja gen može obezbediti kompleksu ciljnu specifičnost zahvaljujući svom povezivanju sa polipeptidom usmerenim ka mestu. Tako nukleinska kiselina koja cilja gen može usmeriti dejstvo polipeptida usmerenog ka mestu.
[0366] Ovo otkrivanje obezbeđuje RNK vodič koji obuhvata ciljajuću sekvencu i sekvencu osnove RNK vodiča, pri čemu je ciljajuća sekvenca komplementarna sekvenci ciljnog gena.
[0367] Primerni RNK vodiči uključuju ciljajuće sekvence od približno 15-20 baza. Stručnjak iz ove oblasti zna da svaki RNK vodič može biti dizajniran tako da uključuje ciljajuću sekvencu koja je komplementarna njenoj genomskoj ciljnoj sekvenci. Na primer, svaka od ciljajućih sekvenci, npr. RNK verzija DNK sekvenci prikazanih u tabeli 8, bez poslednja tri 3' nukleotida koji predstavljaju PAM mesto, može biti uključena u jednu RNK himeru ili crRNK.
[0368] Nukleinska kiselina koja cilja gen može biti dvostruki molekulski RNK vodič. Nukleinska kiselina koja cilja gen može biti jednomolekulski RNK vodič. Nukleinska kiselina koja cilja gen može biti bilo koja konfiguracija RNK vodiča poznata u tehnici, koja, na primer, uključuje uparenu gRNK ili višestruke gRNK koje se koriste u jednoj fazi. Iako je iz genomskih sekvenci jasno gde su kodirajuće sekvence i splajsni spojevi, druge karakteristike potrebne za ekspresiju gena mogu biti svojstvene i nejasne.
[0369] Dvostruki molekulski RNK vodič može da obuhvata dva lanca RNK. Prvi lanac obuhvata sekvencu u smeru od 5' do 3', opciono sekvencu širenja spejsera, ciljajuću sekvencu i minimalnu CRISPR sekvencu ponavljanja. Drugi lanac može da obuhvata minimalnu tracrRNK sekvencu (komplementarnu sa minimalnom CRISPR sekvencom ponavljanja), 3' tracrRNK sekvencu i opcionu tracrRNK sekvencu širenja.
[0370] Jednostruki molekulski RNK vodič (sgRNK) u sistema Tipa II može uključivati, u smeru od 5' ka 3', opciono sekvencu širenja spejsera, ciljajuću sekvencu, minimalnu CRISPR sekvencu ponavljanja, veznik jednostrukog molekulskog vodiča, minimalnu tracrRNK sekvencu, 3' tracrRNK sekvencu i opcionu tracrRNK sekvencu širenja. Opciono tracrRNK širenje može da obuhvata elemente koji doprinose dodatnoj funkcionalnosti (npr. stabilnosti) RNK vodiča. Veznik jednostrukog molekulskog vodiča može povezati minimalnu CRISPR sekvencu ponavljanja i minimalnu tracrRNK sekvencu kako bi obrazovao strukturu ukosnice. Opcionu tracrRNK širenje može obuhvatati jednu ukosnicu ili više njih.
[0371] RNK vodič ili jednomolekulski RNK vodič (sgRNK) može da obuhvata ciljajuću sekvencu i sekvencu osnove. Sekvenca osnove može da bude Cas9 gRNK sekvenca. Sekvencu osnove može da kodira DNK sekvenca koja obuhvata sekvencu koja deli najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sa GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAA AGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT (SEQ ID NO: 435). Sekvencu osnove može da kodira DNK sekvenca koja obuhvata GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA ATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT (SEQ ID NO: 435).
[0372] Na primer, u načinima ostvarivanja u kojima CRISPR/Cas sistem predstavlja Cas9 sistem, sgRNK može da obuhvata ciljajuću sekvencu od 20 nukleotida na 5' kraju sgRNK sekvence. sgRNK može da obuhvata ciljajuću sekvencu od manje od 20 nukleotida na 5' kraju sgRNK sekvence sgRNK može da obuhvata ciljajuću sekvencu od više od 20 nukleotida na 5' kraju sgRNK sekvence. sgRNK može da obuhvata ciljajuću sekvencu promenljive dužine, sa 17-30 nukleotida na 5' kraju sgRNK sekvence.
[0373] Stručnjaci iz ove oblasti znaju da će prikladne sekvence osnove i raspored ciljnih sekvenci osnove zavisiti od izbora endonukleaze.
[0374] Jednostruka molekulska RNK vodiča (sgRNK) u sistemu Tipa II, npr. Cas9, može da obuhvata, u smeru od 5' ka 3', minimalnu CRISPR sekvencu ponavljanja i ciljajuću sekvencu.
[0375] Ilustracije radi, RNK vodiči koji se koriste u CRISPR/Cas9 ili CRISPR/Cpf1 sistemu ili druge manje RNK mogu se lako sintetisati hemijskim putem, kao što je ilustrovano u nastavku i opisano u tehnici. Dok se postupci za hemijsko sintetisanje neprestano šire, prečišćavanja takvih RNK pomoću postupaka kao što je tečna hromatografija visokih performansi (HPLC, koja izbegava korišćenje gelova kao što je PAGE) imaju tendenciju da postaju izazovnije kako se dužine polinukleotida značajno povećaju preko stotinak nukleotida. Jedan pristup koji se koristi za generisanje RNK veće dužine jeste proizvodnja dvaju ili više molekula koji se međusobno spajaju ligacijom. Dosta duže RNK, kao što su one koje kodiraju Cas9 ili Cpf1 endonukleazu, lakše se generišu enzimski. Različite vrste modifikacija RNK mogu se uvoditi tokom ili nakon hemijske sinteze i/ili enzimatske generacije RNK, npr. modifikacija koje poboljšavaju stabilnost, smanjuju verovatnoću ili stepen urođenog imunskog odgovora i/ili poboljšavaju druge karakteristike, kao što je opisano u tehnici.
[0376] Ciljajuća sekvenca gRNK hibridizuje se sa sekvencom u ciljnoj nukleinskoj kiselini od interesa. Ciljajuća sekvenca nukleinske kiseline koja cilja genom može da stupa u interakciju sa ciljnom nukleinskom kiselinom na način koji je specifičan za sekvencu putem hibridizacije (tj. sparivanja baza).
Nukleotidna sekvenca ciljajuće sekvence može da varira u zavisnosti od sekvence ciljne nukleinske kiseline od interesa.
[0377] U ovde opisanom Cas9 sistemu, ciljajuća sekvenca može biti dizajnirana tako da se hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom koja se nalazi na 5' reverznog komplementa PAM-a Cas9 enzima koji se koristi u sistemu. Ciljajuća sekvenca može savršeno da se poklapa sa ciljnom sekvencom ili može imati neslaganja. Svaki protein u CRISPR/Cas sistemu može imati specifičnu PAM sekvencu, u određenoj orijentaciji i položaju, koju prepoznaje u ciljnoj DNK. Na primer, Cas9 iz S. pyogenesa prepoznaje u ciljnoj nukleinskoj kiselini PAM koji obuhvata sekvencu 5'-NRG-3', gde R obuhvata bilo A ili G, gde je N bilo koji nukleotid i N je odmah 3' ciljajuće sekvence nukleinske kiseline koja se cilja ciljajućom sekvencom.
Odabir odgovarajućih PAM sekvenci biće očigledan stručnjaku iz ove oblasti.
[0378] Ciljna sekvenca je komplementarna i hibridizuje se sa ciljajućom sekvencom gRNK. Sekvenca ciljne nukleinske kiseline može sadržati 20 nukleotida. Ciljna nukleinska kiselina može obuhvatati manje od 20 nukleotida. Ciljna nukleinska kiselina može obuhvatati više od 20 nukleotida. Ciljna nukleinska kiselina može obuhvatati najmanje: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 ili više nukleotida. Na primer, u načinima ostvarivanja u kojima CRISPR/Cas sistem predstavlja Cas9 sistem, sekvenca ciljne nukleinske kiseline može obuhvatati 20 nukleotida odmah 5' prvog nukleotida reverznog komplementa PAM sekvence. Ta ciljna sekvenca nukleinske kiseline često se naziva PAM lancem ili ciljnim lancem, dok se komplementarna sekvenca nukleinske kiseline često naziva nePAM lancem ili neciljnim lancem.
Stručnjak iz ove oblasti zna da se ciljajuća sekvenca hibridizuje sa nePAM lancem ciljne nukleinske kiseline, vidi npr. US20190185849A1.
[0379] U nekim je primerima procenat komplementarnosti između ciljajuće sekvence i ciljne nukleinske kiseline najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100%. U drugim je primerima procenat komplementarnosti između ciljajuće sekvence i ciljne nukleinske kiseline najviše oko 30%, najviše oko 40%, najviše oko 50%, najviše oko 60%, najviše oko 65%, najviše oko 70%, najviše oko 75%, najviše oko 80%, najviše oko 85%, najviše oko 90%, najviše oko 95%, najviše oko 97%, najviše oko 98%, najviše oko 99% ili 100%. U nekim je primerima procenat komplementarnosti između ciljajuće sekvence i ciljne nukleinske kiseline 100% preko šest susednih 5' najbližih nukleotida ciljne sekvence komplementarnog lanca ciljne nukleinske kiseline. Procenat komplementarnosti između ciljajuće sekvence i ciljne nukleinske kiseline može biti najmanje 60% preko približno 20 susednih nukleotida. Dužina ciljajuće sekvence i ciljne nukleinske kiseline može se razlikovati za 1 do 6 nukleotida, što se može smatrati izbočinom ili izbočinama.
[0380] Ciljajuća sekvenca može biti dizajnirana ili odabrana pomoću računarskih programa poznatih stručnjacima iz ove oblasti. Računarski program može koristiti promenljive kao što su predviđena temperatura topljenja, formiranje sekundarne strukture, predviđena temperatura žarenja, identitet sekvence, genomski kontekst, pristupačnost hromatina, % GC, učestalost genomskog javljanja (npr. sekvenci koje su identične ili koje su slične, ali se razlikuju u jednom mestu ili više njih kao posledica neslaganja, umetanja ili brisanja), status metilacije, prisustvo SNP-ova i slične. Dostupni računarski programi mogu koristiti kao ulaz NCBI ID-jeve gena, zvanične simbole gena, Ensembl ID-jeve gena, genomske koordinate ili DNK sekvence i stvoriti izlazni dokument koji sadrži sgRNK koje ciljaju prikladne genomske regione naznačene kao ulazni podaci. Računarski program takođe može obezbediti sažetak statistika i ocena koje ukazuju na on ili of target vezivanje sgRNK za ciljni gen (Doench et al. Nat Biotechnol.34:184-191 (2016)). Ovo otkrivanje obezbeđuje RNK vodiče koji uključuju ciljajuću sekvencu. RNK vodič može dalje da obuhvata sekvencu osnove RNK vodiča. Kao što je opisano ovde, ciljajuća sekvenca je komplementarna sekvenci ciljnog gena odabranog iz grupe koju čine HLA-A, HLA-B, HLA-C, B2M ili njihovi aleli. Kao što je takođe opisano ovde, ciljni gen je HLA-A gen. Kao što je takođe opisano ovde, ciljni gen je HLA-B gen. Kao što je takođe opisano ovde, ciljni gen je HLA-C gen. Kao što je takođe opisano ovde, ciljni gen je HLA-A, HLA-B, HLA-C ili njihova kombinacija. Ciljajuća sekvenca može obuhvatiti sekvencu koja deli oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% identiteta ili može biti potpuno identična sekvenci otkrivenoj u tabeli 7.
[0381] Kao što je opisano ovde, gNK specifično ciljaju sekvencu endogenog HLA-A lokusa. Kako je ovde takođe opisano, gNK koji specifično ciljaju sekvencu HLA-A lokusa obuhvataju sekvencu koja deli oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identiteta sa sekvencom izabranom od sekvenci navedenih u tabeli 8. Kako je ovde takođe opisano, gNK koji specifično ciljaju sekvencu HLA-A lokusa obuhvataju sekvencu izabranu od sekvenci navedenih u tabeli 8.
[0382] U nekim načinima ostvarivanja, gNK specifično ciljaju sekvencu HLA-A*02 alela. Na primer, gRNK specifično ciljaju sekvencu, i hibridizuju se njom, koju dele svi HLA-A*02 aleli, ali koju ne dele HLA-A*02 i HLA-A*03 aleli. U nekim načinima ostvarivanja, gNK specifično ciljaju sekvencu HLA-A*02:01 alela. U nekim načinima ostvarivanja, gNK specifično ciljaju sekvencu HLA-A*02:01:01 alela. U nekim načinima ostvarivanja, gNK specifično ciljaju sekvencu HLA-A*02:01:01:01 alela.
[0383] U nekim načinima ostvarivanja, gNK specifično ciljaju kodirajuću DNK sekvencu HLA-A*02.
[0384] U nekim načinima ostvarivanja, gNK specifično ciljaju kodirajuću DNK sekvencu koju deli više od 1000 HLA-A*02 alela. U nekim načinima ostvarivanja, gNK koji specifično ciljaju kodirajuću DNK sekvencu u više od 1000 HLA-A*02 alela obuhvataju sekvencu koja deli oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% identiteta sa sekvencom odabranom iz SEQ ID NO: 400-465 ili joj je identična.
Tabela 8. Ilustrativne sekvence koje ciljaju HLA-A i HLA-A alele
SEQ ID NO Sekvence koje ciljaju nukleinske kiseline vodiče
[0385] Sekvence navedene u tabeli 8 uključuju odgovarajuće genomske sekvence, uključujući PAM sekvencu. Stručnjak iz ove oblasti zna da ciljajuća sekvenca gRNK ne uključuje poslednja tri 3' terminalna nukleotida sekvenci iz tabele 8, koji predstavljaju odgovarajuće PAM mesto za gRNK.
[0386] Ovo otkrivanje obezbeđuje gNK koji obuhvataju ciljajuću sekvencu specifičnu za B2M gen. U nekim načinima ostvarivanja, gNK specifično ciljaju kodirajuću sekvencu (CDS) sekvencu B2M gena. U nekim načinima ostvarivanja, gNK obuhvata sekvencu koja cilja promotorsku sekvencu B2M gena.
[0387] U nekim načinima ostvarivanja, gNK obuhvata ciljajuću sekvencu i sekvencu osnove gNK. U nekim načinima ostvarivanja, ciljajuća sekvenca obuhvata sekvencu izloženu u tabeli 9 ili sekvencu koja sa njom deli oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% identiteta.
[0388] U nekim načinima ostvarivanja, ciljajuća sekvenca je komplementarna sa sekvencom B2M gena. U nekim načinima ostvarivanja, B2M gen obuhvata sekvencu koja deli oko 90%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% identiteta sa B2M sekvencom izloženom u tabeli 7.
Tabela 9. Ilustrativne sekvence koje ciljaju B2M
[0389] Ovde opisane imunske ćelije mogu biti uređivane pomoću TALEN genetskog uređivanja.
[0390] „TALENˮ ili „TALEN genetsko uređivanjeˮ odnosi se na transkripcionom aktivatoru sličnu efektorsku nukleazu, koja predstavlja veštačku nukleazu koja se koristi za uređivanje ciljnog gena.
[0391] TALEN-i se proizvode veštački spajanjem TAL efektorskog DNK vezujućeg domena sa DNK cepajućim domenom. Transkripcionom aktivatoru slični efektori (TALE) izvedeni iz bakterija Xanthomonas mogu biti dizajnirani tako da se vezuju za bilo koju željenu DNK sekvencu, uključujući deo ciljnih gena kao što su podjedinice TCR-a, komponente kompleksa MHC klase I ili CD52. Spajanjem konstruisanog TALE sa DNK cepajućim domenom, može se proizvesti restrikcioni enzim koji je specifičan za bilo koju željenu DNK sekvencu, uključujući sekvencu ciljnog gena. Ti se enzimi mogu uvoditi u ćeliju, pri čemu se oni koriste za uređivanje genoma.
[0392] Da bi se proizveo TALEN, TALE protein se spaja sa nukleazom (N), koja predstavlja divlji tip Fold endonukleaza ili mutirane Fold endonukleaze. Izvedeno je nekoliko mutacija FokI-a za njeogvu upotrebu u TALEN-ima; one, na primer, poboljšavaju specifičnost ili dejstvo cepanja.
[0393] FokI domen funkcioniše kao dimer, pri čemu zahteva dva konstrukta sa jedinstvenim DNK vezujućim domenima za mesta u ciljnom genomu sa tačnom orijentacijom i razmakom. Čini se da su i broj aminokiselinskih ostataka između TALE DNK vezujućeg domena i FokI cepajućeg domena, i broj baza između dvaju pojedinačnih TALEN vezujućih mesta važni parametri za postizanje visokih nivoa aktivnosti.
[0394] TALEN-i specifični za sekvence u ciljnom genu mogu biti konstruisani pomoću bilo kog postupka poznatog u tehnici, uključujući razne šeme koje koriste modularne komponente.
[0395] Ciljni gen može da se uređuje u ovde opisanim imunskim ćelijama pomoću ZFN genetskog uređivanja.
[0396] „ZFNˮ ili „nukleaza cinkovog prstaˮ ili „ZFN genetskog uređivanjaˮ odnosi se na nukleazu cinkovog prsta, veštačku nukleazu koja se može koristiti za uređivanje ciljnog gena.
[0397] Kao TALEN, ZFN obuhvata Fold nukleazni domen (ili njegov derivat) spojen sa DNK vezujućim domenom. U slučaju ZFN, DNK vezujući domen obuhvata jedan cinkov prst ili više njih.
[0398] Cinkov prst je mali proteinski strukturni motiv stabilizovan jednim jonom cinka ili sa više njih. Cinkov prst može da obuhvata, na primer, Cys2His2, i može da prepozna sekvencu sa približno 3 bp-a. Različiti cinkovi prsti poznate specifičnosti mogu biti kombinovani kako bi se proizveli polipeptidi sa više prstiju, koji prepoznaju sekvence sa oko 6, 9, 12, 15 ili 18 bp-ova. Različite tehnike selekcije i modularnog sklapanja dostupne su za generisanje cinkovih prstiju (i njihovih kombinacija) koji prepoznaju specifične sekvence, uključujući prikaz faga, jednohibridne sisteme kvasca, jednohibridne i dvohibridne sisteme bakterija i ćelije sisara.
[0399] Kao TALEN, i ZFN mora da se dimerizuje da bi pocepao DNK. Stoga je, za ciljanje nepalindromnih DNK mesta, potreban par ZFN-ova. Dva individualna ZFN-a moraju da vežu suprotne lance DNK sa njihovim nukleazama pravilno razmaknutim.
[0400] Isto kao TALEN, i ZFN može da napravi dvolančani prekid u DNK, koji može da napravi mutaciju pomeranja okvira čitanja ako se nepravilno popravi, što dovodi do smanjenja ekspresije i količine ciljnog gena ili produkta gena u ćeliji. ZFN-ovi takođe mogu biti korišćeni sa homolognom rekombinacijom da bi mutirali u ciljnom genu.
[0401] ZFN-ovi specifični za sekvence u ciljnom genu mogu biti konstruisani korišćenjem bilo kog postupka poznatog u tehnici.
[0402] Ekspresija i funkcija jedne MCH-I komponente ili više njih može biti redukovana korišćenjem RNK interferencije. „RNKiˮ ili „RNK interferencijaˮ odnosi se na postupak za sekvencijalno specifično posttranskripciono utišavanje gena posredovano dvostrukim lancem RNK (dsRNK). Dupleks RNK kao što su siRNK (mala interferirajuća RNK), miRNK (mikro RNK), shRNK (RNK sa strukturom ukosnice), ddRNK (RNK usmerena ka DNK), piRNK (Pivi interagujuća RNK) ili rasiRNK (siRNK povezana sa ponavljanjem) i njihovi modifikovani oblici, sve mogu da posreduju u RNK interferenciji. Ti dsRNK molekuli mogu biti komercijalno dostupni ili mogu biti dizajnirani i pripremljeni na osnovu poznatih informacija o sekvencama. Antisens lanac tih molekula može uključivati RNK, DNK, PNK ili njihovu kombinaciju.
DNK/RNK himerni polinukleotidi mogu uključivati hibridnom strukturom mogu uključivati dvolančani polinukleotid koji se sastoji od DNK i RNK koji inhibira ekspresiju ciljnog gena. Molekuli dsRNK mogu takođe uključivati jedan modifikovani nukleotid ili više njih, kao što je ovde opisano, koji se mogu uključiti u bilo koji lanac ili njih oba.
[0403] Kod RNK genetskog utišavanja ili nokaduna, u organizam se uvodi dsRNK koji obuhvata prvi (antisens) lanac koji je komplementaran delu ciljnog gena i drugi (sens) lanac koji je potpuno ili delimično komplementaran prvom antisens lancu. Nakon uvođenja u organizam, dsRNK specifična za ciljni gen se obrađuje u relativno male fragmente (siRNK) i može zatim biti distribuiran kroz organizam, smanjiti informacionu RNK ciljnog gena, što dovodi do fenotipa koji može blisko nalikovati fenotipu koji nastaje potpunim ili delimičnim brisanjem ciljnog gena.
[0404] Određene dsRNK u ćelijama mogu se podvrgnuti dejstvu Dicer enzima, ribonukleaznog III enzima. Dicer može da obrađuje dsRNK na kraće delove dsRNK, tj. siRNK. RNKi takođe uključuje endonukleazni kompleks poznat kao RNK indukovani utišavajući kompleks (RISC). Nakon cepanja Dicerom, siRNK ulaze u RISC kompleks i usmeravaju cepanje jednolančani RNK cilj sa sekvencom komplementarnom antisens lancu siRNK dupleksa. Drugi lanac siRNK se naziva prenosni lanac. Cepanje ciljne RNK dešava se usred regiona koji je komplementaran antisens lancu siRNK dupleksa. Na taj način, siRNK efikasno mogu da negativno regulišu ili nokdaunuju ekspresiju gena posredujućom RNK interferencijom na način koji je specifičan za sekvence.
[0405] Kako se ovde koristi u odnosu na RNK interferenciju, „ciljni genˮ ili „ciljna sekvencaˮ odnosi se na gen ili gensku sekvencu čija je odgovarajuća RNK usmerena ka degradaciji kroz RNKi put korišćenjem dsRNK ili siRNK, kao što je ovde opisano. Primerne ciljne genske sekvence prikazane su u tabeli 7. Za ciljni gen, na primer, uz upotrebu siRNK, siRNK obuhvata antisens region koji je komplementaran, ili suštinski komplementaran, najmanje delu ciljnog gena ili ciljne sekvence, i sens lanac koji je komplementaran antisens lancu. Nakon uvođenja u ćeliju, siRNK usmerava RISC kompleks da pocepa RNK koja sadrži ciljnu sekvencu, čime se degradira ta RNK. Ovo otkrivanje obezbeđuje interferirajuće RNK. Dvolančani RNK molekul ovog otkrivanja može biti u obliku bilo koje vrste RNK interferirajućeg molekula poznatog u tehnici. U nekim načinima ostvarivanja, dvolančani RNK molekul je mala interferirajuća RNK (siRNK). U drugim načinima ostvarivanja, dvolančani RNK molekul je RNK sa strukturom ukosnice (shRNK). U drugim načinima ostvarivanja, dvolančani RNK molekul je Dicer supstrat koji se obrađuje u ćeliji kako bi se obrazovala siRNK. U drugim načinima ostvarivanja, dvolančani RNK molekul je deo mikroRNK prekursorskog molekula.
[0406] U nekim načinima ostvarivanja, shRNK predstavlja dužinu treba da bude prikladna kao Dicer supstrat, koja može da se obrađuje kako bi se proizveo RISC aktivni siRNK molekul. Vidi, npr. Rossi et al., US2005/0244858.
[0407] Dicer supstrat dvolančane RNK (npr. shRNK) može biti dovoljne dužine da ga Dicer obradi radi proizvodnje aktivne siRNK i može dodatno da uključuje jednu sledeću osobinu ili više njih: (i) Dicer supstrat shRNK može biti asimetričan, na primer, sa 3' prepuštenim na antisens lancu, (ii) Dicer supstratska shRNK može imati modifikovan 3' kraj na sens lancu za usmeravanje orijentacije Dicera vezivanja i obradu dsRNK u aktivnu siRNK, na primer, uključivanjem jednog DNK nukleotida ili više njih i (iii) prvi i drugi lanci Dicer supstratske dsRNK mogu biti dužine od 21-30 bp-ova.
[0408] U nekim načinima ostvarivanja, interferirajuće RNK obuhvataju sekvencu koja je komplementarna sekvenci B2M iRNK. U nekim načinima ostvarivanja, interferirajuća RNK može indukovati RNKi posredovanu degradaciju B2M iRNK. U nekim načinima ostvarivanja, B2M iRNK sekvenca obuhvata kodirajuću sekvencu. U nekim načinima ostvarivanja, B2M iRNK sekvenca obuhvata netranslirani region.
[0409] U nekim načinima ostvarivanja, interferirajuće RNK obuhvataju sekvencu koja je komplementarna sekvenci HLA-A*02 iRNK. U nekim načinima ostvarivanja, interferirajuća RNK može indukovati RNKi posredovanu degradaciju HLA-A*02 iRNK. U nekim načinima ostvarivanja, HLA-A*02 iRNK sekvenca obuhvata kodirajuću sekvencu. U nekim načinima ostvarivanja, HLA-A*02 iRNK sekvenca obuhvata netranslirani region.
[0410] U nekim načinima ostvarivanja, interferirajuća RNK predstavlja RNK sa strukturom ukosnice (shRNK). U nekim načinima ostvarivanja, shRNK obuhvata prvu sekvencu, koja od 5' do 3' kraja ima sekvencu koja je komplementarna B2M iRNK i drugu sekvencu, koja od 5' do 3' kraja ima sekvencu koja je komplementarna prvoj sekvenci, pri čemu prva sekvenca i druga sekvenca obrazuju shRNK.
[0411] Prva sekvenca može da ima 18, 19, 20, 21 ili 22 nukleotida. Ta prva sekvenca može biti komplementarna sekvenci izabranoj od sekvenci izloženih u tabelama 10 i 11. Prva sekvenca može da ima GC sadržaj veći od ili tačno 25% i manji od 60%. Prva sekvenca može biti komplementarna sa sekvencom izabranom od sekvenci izloženih u tabelama 10 i 11. Prva sekvenca ne mora da obuhvata četiri nukleotida iste baze ili niz od sedam C ili G nukleotidnih baza. Prva sekvenca može imati 21 nukleotid.
[0412] Ilustrativne ciljne B2M sekvence komplementarne sa prvom sekvencom prikazane su u tabeli 10.
[0413] U nekim slučajevima, prva sekvenca može biti 100% identična, tj. potpuno identična, homologna, komplementarna ciljnoj nukleinskoj kiselini. U drugim slučajevima, može da postoji jedno neslaganje između prve sekvence i ciljne nukleinske kiseline ili više njih. Na primer, može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 neslaganja između sens regiona i ciljne nukleinske kiseline.
[0414] Sekvence izložene u tabeli 10 prikazane su kao DNK sekvence. U svim sekvencama izloženim u tabeli 10, timin (T) može biti zamenjen uracilom (U) kako bi se dobila sekvenca ciljne iRNK sekvence.
Tabela 10. Ilustrativne ciljne B2M sekvence komplementarne prvoj sekvenci.
[0415] U nekim načinima ostvarivanja, interferirajuće RNK obuhvataju sekvencu koja je komplementarna sekvenci HLA-A*02 iRNK. U nekim slučajevima, interferirajuća RNK može indukovati RNKi posredovanu degradaciju HLA-A*02 iRNK. U nekim načinima ostvarivanja, HLA-A*02 iRNK sekvenca obuhvata kodirajuću sekvencu. U drugim načinima ostvarivanja, HLA-A*02 iRNK sekvenca obuhvata netranslirani region.
[0416] U jednom načinu ostvarivanja imunske ćelije ovog pronalaska, sekvenca koja kodira B2M shRNK obuhvata sekvencu GCACTCAAAGCTTGTTAAGATCGAAATCTTAACAAGCTTTGAGTGC (SEQ ID NO: 179) ili sekvencu koja joj je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična. Dodatna primerna sekvenca koja kodira B2M shRNK obuhvata sekvencu GTTAACTTCCAATTTACATACCGAAGTATGTAAATTGGAAGTTAAC (SEQ ID NO: 808) ili sekvencu koja joj je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična.
[0417] U jednom načinu ostvarivanja imunske ćelije ovog pronalaska, interferirajuća RNK predstavlja RNK sa strukturom ukosnice (shRNK). U jednom načinu ostvarivanja imunske ćelije ovog pronalaska, shRNK obuhvata prvu sekvencu, koja od 5' do 3' kraja obuhvata sekvencu koja je komplementarna HLA-A*02 iRNK i drugu sekvencu, koja od 5' do 3' kraja obuhvata sekvencu koja je komplementarna prvoj sekvenci, pri čemu prva sekvenca i druga sekvenca obrazuju shRNK.
[0418] Ilustrativne ciljne HLA sekvence komplementarne prvoj sekvenci prikazane su u tabeli 11.
Tabela 11. Ilustrativne ciljne HLA sekvence komplementarne prvoj sekvenci
[0419] U nekim su načinima ostvarivanja prva sekvenca i druga sekvenca razdvojene veznikom, koji se ponekad naziva petljom. U nekim načinima ostvarivanja, i prvu sekvencu i drugu sekvencu kodira jednolančani RNK ili DNK vektor. U nekim načinima ostvarivanja, petlja se nalazi između prve i druge sekvence. U tim se načinima ostvarivanja i prva sekvenca i druga sekvenca hibridizuju kako bi formirale dupleksni region. Prva sekvenca i druga sekvenca spojene su veznom sekvencom, čime obrazuju strukturu „ukosniceˮ ili „matične petljeˮ. ShRNK može imati komplementarne prve sekvence i druge sekvence na suprotnim krajevima jednolančanog molekula, tako da taj molekul može da obrazuje dupleksni region sa komplementarnim delovima sekvenci, a lanci su povezani na jednom kraju dupleksnog regiona veznikom (tj. sekvencom petlje). Veznik, ili sekvenca petlje, može biti bilo nukleotidni ili nenukleotidni veznik. Veznik može stupati u interakciju sa prvom sekvencom i opciono, drugom sekvencom putem kovalentnih veza ili nekovalentnih interakcija.
[0420] Predviđeno je da je svaka odgovarajuća nukleotidna petlja unutar opsega ovog otkrivanja. shRNA ovog otkrivanja može uključivati nukleotidni, nenukleotidni ili mešoviti nukleotidni/nenukleotidni veznik koji povezuje prvu sekvencu shRNA sa drugom sekvencom shRNA. Sekvenca nukleotidne petlje može imati ≥ 2 nukleotida u dužini, na primer oko 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleotida u dužini. Ilustrativne sekvence petlji navedene su u tabeli 12.
[0421] U nekim načinima ostvarivanja, shRNK dodatno obuhvata 5' bočnu sekvencu i 3' bočnu sekvencu. U nekim načinima ostvarivanja, pri čemu je 5' bočna sekvenca spojena sa 5' krajem prve sekvence i pri čemu je 3' bočna sekvenca spojena sa 3' krajem druge sekvence.
[0422] Bez vezivanja za teoriju, smatra se da flankirajuća shRNK sekvenca matične petlje sa 5' i 3' sekvencama sličnim sekvencama pronađenim u mikroRNK može da cilja shRNK radi obrade od strane mašinerije za obradu endogene mikroRNK, čime se povećava efikasnost obrade shRNK. Alternativno, ili dodatno, flankirajuće sekvence mogu da povećaju shRNK kompatibilnost sa promotorima polimeraze II ili polimeraze III, što dovodi do efikasnije regulacije shRNK ekspresije.
[0423] 5' bočna sekvenca može se birati od sekvenci izloženih u tabeli 12. Ilustrativne bočne sekvence prikazane su u tabeli 12.
Tabela 12. Ilustrativne bočne sekvence
[0424] Prva i druga sekvenca mogu biti prisutne na jednolančanom polinukleotidu, pri čemu se prva sekvenca i druga sekvenca mogu biti razdvojene sa 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleotida, pri čemu tih 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleotida obrazuju region petlje u shRNK. Region petlje može da obuhvata sekvencu izabranu od sekvenci izloženih u tabeli 13.
Tabela 13. Ilustrativna sekvenca regiona petlje
[0425] shRNK ovog otkrivanja mogu se generisati egzogeno hemijskom sintezom, in vitro transkripcijom ili cepanjem duže dvolančane RNK pomoću Dicera ili neke druge prikladne nukleaze sa sličnim dejstvom. Hemijski sintetisani siRNK, proizvedeni od zaštićenih ribonukleozid fosforamidita korišćenjem konvencionalnog DNK/RNK sintetizera, mogu se nabaviti od komercijalnih dobavljača kao što su Millipore Sigma (Hjuston, Teksas), Ambion Inc. (Ostin, Teksas), Invitrogen (Karlzbad, Kalifornija) ili Dharmacon (Lafajet, Kolorado). siRNK se mogu prečistiti ekstrakcijom rastvaračem ili smolom, precipitacijom, elektroforezom, hromatografijom ili njihovom kombinacijom, na primer. Alternativno, siRNK se mogu koristiti sa malo ili bez pročišćavanja kako bi se izbegli gubici usled obrade uzorka.
[0426] shRNK ovog otkrivanja mogu da se proizvedu pomoću ekspresionog vektora u koji je klonirana nukleinska kiselina koja kodira dvolančanu RNK, na primer pod kontrolom prikladnog promotora.
Farmaceutske kompozicije
[0427] Ovo otkrivanje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju imunske ćelije koje obuhvataju prvi i drugi receptor ovog otkrivanja i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač ili ekscipijens.
[0428] Takve kompozicije mogu da obuhvataju pufere kao što je neutralni puferisani fiziološki rastvor, fosfatom puferisani fiziološki rastvor i njima slične; ugljovodonike kao što je glukoza, manoza, saharoza ili dekstrani, manitol; proteini; polipeptide ili aminokiseline kao što je glicin; antioksidanse; helatne agense kao što je EDTA ili glutation i konzervanse.
[0429] Imunska ćelija može da eksprimuje i prvi receptor i drugi receptor. Najmanje oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90% ili oko 95% imunskih ćelija može da eksprimuje i prvi receptor i drugi receptor. Najmanje 90% imunskih ćelija može da eksprimuje i prvi receptor i drugi receptor.
Lečenje kancera
[0430] Ovde su obezbeđeni postupci za ubijanje većeg broja ćelija kancera, ili lečenje kancera, kod subjekta, koji obuhvataju davanje subjektu terapijski efikasne količine kompozicije koja obuhvata imunske ćelije koje obuhvataju prvi i drugi receptor ovog otkrivanja. Imunske ćelije eksprimuju oba receptora u istoj ćeliji.
[0431] Kancer je bolest u kojoj se abnormalne ćelije dele bez kontrole i šire na okolno tkivo. Kancer može da obuhvata tečni tumor ili solidni tumor. Kanceri mogu da se jave u praktično svakom organu u telu, uključujući epitelna tkiva. Na primer, EGFR pozitivni kanceri koji mogu da se leče pomoću ovde opisanih postupaka (nisu prema ovom pronalasku) uključuju kancer pluća, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, duktalni karcinom pankreasa, kolorektalni kancer, kancer glave i vrata, adenokarcinom jednjaka i želuca, kancer jajnika, multiformni glioblastom, karcinom skvamoznih ćelija grlića materice, kancer bubrega, papilarni kancer bubrega, svetloćelijski karcinom bubrega, kancer bešike, kancer dojke, kancer žučnih kanala, kancer jetre, kancer prostate, sarkom, kancer štitne žlezde, kancer grudne žlezde, kancer želuca ili kancer materice i sve druge tumore koji eksprimuju ciljne EGFR tumore.
[0432] U nekim načinima ostvarivanja, veći broj ćelija kancera eksprimuju ciljni antigen. U nekim načinima ostvarivanja, veći broj ćelija kancera subjekta eksprimuju EGFR. EGFR pozitivni kanceri uključuju, kancer pluća, sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, duktalni karcinom pankreasa, kolorektalni kancer, kancer glave i vrata, adenokarcinom jednjaka i želuca, kancer jajnika, multiformni glioblastom, karcinom skvamoznih ćelija grlića materice, kancer bubrega, papilarni kancer bubrega, svetloćelijski karcinom bubrega, kancer bešike, kancer dojke, kancer žučnih kanala, kancer jetre, kancer prostate, sarkom, kancer štitne žlezde, kancer grudne žlezde, kancer želuca ili kancer materice.
[0433] Kao što je ovde opisano, veći broj ćelija kancera ne eksprimuje polimorfni alel COLEC12, APCDD1 ili CXCL16. Kao što je ovde opisano, veći broj ćelija kancera ne eksprimuje neciljni antigen. Kao što je ovde opisano, veći broj ćelija kancera ne eksprimuje HLA-A*02. Kao što je ovde opisano, veći broj ćelija kancera ne eksprimuje alelsku varijantu HLA-A*02. Kao što je ovde opisano, veći broj ćelija kancera ne eksprimuje HLA-A*01. Kao što je ovde takođe opisano, veći broj ćelija kancera ne eksprimuje HLA-A*03. Kao što je ovde takođe opisano, veći broj ćelija kancera ne eksprimuje HLA-A*11. Kao što je ovde takođe opisano, veći broj ćelija kancera ne eksprimuje HLA-B*07. Kao što je ovde takođe opisano, veći broj ćelija kancera ne eksprimuje HLA-C*07. Kao što je ovde takođe opisano, ćelije kancera su izgubile alel COLEC12, APCDD1 ili CXCL16, ili HLA-A*02 kroz gubitak heterozigotnosti na tom lokusu.
[0434] Davanje ovde opisanih imunskih ćelija ili farmaceutskih kompozicija može da smanji veličinu tumora kod subjekta. Veličina tumora može da se smanji za oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili oko 100% u odnosu na veličinu tumora pre davanja imunskih ćelija ili farmaceutskih kompozicija. Tumor može biti eliminisan.
[0435] Davanje ovde opisanih imunskih ćelija ili farmaceutskih kompozicija može da zaustavi rast tumora kod subjekta. Na primer, imunske ćelije ili farmaceutske kompozicije mogu da ubiju tumorske ćelije, pa tako tumor prestaje da raste ili se smanjuje njegova veličina. U nekim slučajevima, imunske ćelije ili farmaceutske kompozicije mogu da spreče obrazovanje dodatnih tumora ili da redukuju ukupan broj tumora kod subjekta.
[0436] Davanje ovde opisanih imunskih ćelija ili farmaceutskih kompozicija može da dovede do selektivnog ubijanja ćelije kancera, ali ne i normalne ćelija kod subjekta. Oko 60% ubijenih ćelija mogu biti ćelije kancera, oko 65% ubijenih ćelija mogu biti ćelije kancera, oko 70% ubijenih ćelija mogu biti ćelije kancera, oko 75% ubijenih ćelija mogu biti ćelije kancera, oko 80% ubijenih ćelija mogu biti ćelije kancera, oko 85% ubijenih ćelija mogu biti ćelije kancera, oko 90% ubijenih ćelija mogu biti ćelije kancera, oko 95% ubijenih ćelija mogu biti ćelije kancera ili oko 100% ubijenih ćelija mogu biti ćelije kancera.
[0437] Davanje ovde opisanih imunskih ćelija ili farmaceutskih kompozicija može da dovede do ubijanja od oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90% ili svih ćelija kancera subjekta.
[0438] Davanje ovde opisanih imunskih ćelija ili farmaceutskih kompozicija može da dovede do manjeg broja nuspojava kod subjekta od davanja na drugi način ekvivalentne imunske ćelije koja obuhvata prvi receptor aktivatora, ali ne i drugi inhibitorni receptor. Na primer, davanje ovde opisanih imunskih ćelija ili farmaceutskih kompozicija može da smanji dozno ograničenu toksičnost u odnosu na EGFR CAR ili EGFR TCR koji se primenjuju bez drugog inhibitornog receptora.
[0439] Ovo otkrivanje obezbeđuje postupke za lečenje kancera kod subjekta koji obuhvataju: (a) utvrđivanje genotipa normalnih ćelija i većeg broja ćelija kancera subjekta na polimorfnom lokusu odabranom iz grupe koju čine polimorfni lokus COLEC12, polimorfni lokus APCDD1 i polimorfni lokus CXCL16 ili lokus HLA-A*02; (b) utvrđivanje ekspresije EGFR-a u većem broju ćelija kancera; (c) davanje subjektu većeg broja imunskih ćelija ako su normalne ćelije heterozigotne za polimorfni lokus a veći broj ćelija kancera je hemizigotan za polimorfni lokus ili su izgubile HLA-A*02 i veći broj ćelija kancera EGFR je pozitivan, pri čemu veći broj imunskih ćelija obuhvata: (i) prvi receptor, opciono himerni antigenski receptor (CAR) ili T-ćelijski receptor (TCR) koji ima ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za EGFR ili njegov peptidni antigen u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I) i (ii) drugi receptor, opciono inhibitorni himerni antigenski receptor (tj. inhibitorni receptori), koji ima ekstracelularni ligand vezujući za neciljni antigen izabran od COLEC12, APCDD1 i CXCL16 ili njegov peptidni antigen u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I), ili HLA-A*02, pri čemu nećelijski antigen obuhvata polimorfizam.
[0440] Stručnjacima iz ove oblasti dobro su poznati postupci za genotipizaciju ćelija kancera i normalnih ćelija kod subjekta radi utvrđivanja prisustva ili odsustva SNP-ova. Postupci za genotipizaciju SNP-ova uključuju, inter alia, postupke na bazi PCR-a kao što su dualne probne TaqMan analize, postupke za hibridizaciju na bazi čipova i sekvenciranje.
[0441] Stručnjacima iz ove oblasti dobro su poznati postupci za merenje ekspresije ciljnog antigena u kancerskim ili normalnim ćelijama kod subjekta. Oni, inter alia, uključuju postupke za merenje RNK ekspresije kao što su RNK sekvenciranje i polimerazna lančana reakcija sa reverznom transkripcijom (RT-PCR), kao i postupke za merenje ekspresije proteina kao što su postupci na bazi imunohistohemije. Postupci za merenje gubitka heterozigotnosti u većem broju ćelija kancera uključuju, inter alia, visokoprotočno sekvenciranje genomske DNK ekstrahovane iz ćelija kancera korišćenjem postupaka poznatih u tehnici.
[0442] Stručnjaci iz ove oblasti znaju postupke za merenje ekspresije ciljnog antigena u kancerskim ili normalnim ćelijama kod subjekta. Oni, inter alia, uključuju postupke za merenje RNK ekspresije kao što su RNK sekvenciranje i polimerazna lančana reakcija sa reverznom transkripcijom (RT-PCR), kao i postupke za merenje proteinske ekspresije kao što su postupci na bazi imunohistohemije.
[0443] Kao što je ovde opisano, imunske ćelije su T-ćelije.
[0444] U nekim načinima ostvarivanja, imunske ćelije su alogene ili autologne.
[0445] U nekim načinima ostvarivanja, drugi receptor povećava specifičnost imunskih ćelija za EGFR pozitivne kancerske ćelije u poređenju sa imunskim ćelijama koje eksprimuju prvi receptor, ali ne i drugi receptor. U nekim načinima ostvarivanja, imunske ćelije mogu imati redukovane neželjene efekte u poređenju sa imunskim ćelijama koje eksprimuju prvi receptor, a ne i drugi receptor.
[0446] Lečenje kancera može da dovede do redukovanja veličine tumora. Redukovanje veličine tumora može se nazivati „regresijom tumoraˮ. Nakon terapije, veličina tumora može biti redukovana za 5% ili više u odnosu na njegovu veličinu pre terapije; veličina tumora može biti redukovana za 10% ili više; redukovana za 20% ili više; redukovana za 30% ili više; redukovana za 40% ili više; redukovana za 50% ili više ili redukovana za više od 75%. Veličina tumora može se meriti bilo kojim pouzdanim sredstvom za merenje. Veličina tumora može se meriti kao prečnik tumora.
[0447] Lečenje kancera takođe može da dovede do redukovanja zapremine tumora. Nakon terapije, zapremina tumora može biti redukovana za 5% ili više u odnosu na njegovu veličinu pre terapije; zapremina tumora može biti redukovana za 10% ili više; redukovana za 20% ili više; redukovana za 30% ili više; redukovana za 40% ili više; redukovana za 50% ili više ili redukovana za više od 75%. Zapremina tumora može se meriti bilo kojim pouzdanim sredstvom za merenje.
[0448] Lečenje kancera dovodi do redukovanja broja tumora. Nakon terapije, broj tumora može biti redukovan za 5% ili više u odnosu na broj pre terapije; broj tumora može biti redukovan za 10% ili više; redukovan za 20% ili više; redukovan za 30% ili više; redukovan za 40% ili više; redukovan za 50% ili više ili redukovan za više od 75%. Broj tumora može se meriti bilo kojim pouzdanim sredstvom za merenje. Broj tumora može se meriti brojanjem tumora vidljivih golim okom ili pod određenim uvećanjem. Naznačeno uvećanje može biti 2x, 3x, 4x, 5x, 10x ili 50x.
[0449] Lečenje kancera može da dovede do smanjenja broja metastatskih lezija u drugim tkivima ili organima udaljenim od primarnog mesta tumora. Nakon terapije, broj metastatskih lezija može biti redukovan za 5% ili više u odnosu na broj pre terapije; broj metastatskih lezija može biti redukovan za 10% ili više; redukovan za 20% ili više; redukovan za 30% ili više; redukovan za 40% ili više; redukovan za 50% ili više ili za više od 75%. Broj metastatskih lezija može se meriti bilo kojim pouzdanim sredstvom za merenje. Broj metastatskih lezija može se meriti brojanjem metastatskih lezija vidljivih golim okom ili pod određenim uvećanjem. Naznačeno uvećanje može biti 2x, 3x, 4x, 5x, 10x ili 50x.
[0450] Lečenje kancera može da dovede do povećanja prosečnog vremena preživljavanja populacije lečenih subjekata u poređenju sa populacijom koja prima samo nosač. Prosečno vreme preživljavanja može biti povećano za više od 30 dana; za više od 60 dana; za više od 90 dana ili za više od 120 dana. Povećanje prosečnog vremena preživljavanja populacije može da se meri bilo kojim pouzdanim sredstvom. Na primer, povećanje prosečnog vremena preživljavanja populacije može da se meri izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja populacije nakon početka terapije aktivnim jedinjenjem. Takođe, povećanje prosečnog vremena preživljavanja populacije može da se meri, na primer, izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja nakon završetka prve runde terapije aktivnim jedinjenjem.
[0451] Lečenje kancera može da dovede do povećanja prosečnog vremena preživljavanja populacije lečenih subjekata u poređenju sa populacijom nelečenih subjekata. Prosečno vreme preživljavanja može biti povećano za više od 30 dana; za više od 60 dana; za više od 90 dana ili za više od 120 dana.
Povećanje prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti bilo kojim pouzdanim sredstvom. Na primer, povećanje prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti izračunavanjem dužine preživljavanja populacije nakon početka terapije aktivnim jedinjenjem. Takođe, povećanje prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti, na primer, izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja populacije nakon završetka prvog runde terapije aktivnim jedinjenjem.
[0452] Lečenje kancera može da dovede do povećanja prosečnog vremena preživljavanja populacije lečenih subjekata u poređenju sa populacijom koja prima monoterapiju lekom koji nije jedinjenje ovog otkrivanja ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju, njegovim prolekom, metabolitom, analogom ili derivatom. Prosečno vreme preživljavanja može biti povećano za više od 30 dana; za više od 60 dana; za više od 90 dana ili za više od 120 dana. Povećanje prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti bilo kojim pouzdanim sredstvom. Na primer, povećanje prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja populacije nakon početka terapije aktivnim jedinjenjem. Takođe, povećanje prosečnog vremena preživljavanja populacije može se meriti, na primer, izračunavanjem prosečne dužine preživljavanja populacije nakon završetka prve runde terapije aktivnim jedinjenjem.
[0453] Lečenje kancera može da dovede do smanjenja stope smernosti populacije lečenih subjekata u poređenju sa populacijom koja prima samo nosač. Lečenje kancera može da dovede do smanjenja stope smrtnosti populacije lečenih subjekata u poređenju sa nelečenom populacijom. Lečenje kancera može dovesti do smanjenja stope smrtnosti populacije lečenih subjekata u poređenju sa populacijom koja prima monoterapiju lekom koji nije jedinjenje prema ovom otkrivanju ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju, njegovim prolekom, metabolitom, analognim ili derivatom. Kao što je opisano, stopa smrtnosti može biti smanjena za više od 2%; za više od 5%; za više od 10% ili za više od 25%. Smanjenje stope smrtnosti populacije lečenih subjekata može se meriti bilo kojim pouzdanim sredstvom. Na primer, smanjenje stope smrtnosti populacije može se meriti izračunavanjem prosečnog broja smrtnih slučajeva u populaciji povezanih sa bolešću u jedinici vremena nakon početka terapije aktivnim jedinjenjem.
Takođe, smanjenje stope smrtnosti populacije može se meriti, na primer, izračunavanjem prosečnog broja smrtnih slučajeva u populaciji povezanih sa bolešću u jedinici vremena nakon završetka prve runde terapije aktivnim jedinjenjem.
[0454] Lečenje kancera može da dovede do smanjenja stope rasta tumora. Nakon terapije, stopa rasta tumora može biti redukovana za najmanje 5% u odnosu na vrednost pre terapije; brzina rasta tumora može biti redukovana za najmanje 10%; za najmanje 20%; za najmanje 30%; za najmanje 40%; za najmanje 50%, najmanje 50% ili za najmanje 75%. Stopa rasta tumora može se meriti bilo kojim pouzdanim sredstvom za merenje. Stopa rasta tumora može se meriti na osnovu promene prečnika tumora u jedinici vremena.
[0455] Lečenje kancera takođe može da dovede do smanjenja ponovnog rasta tumora. Nakon terapije, ponovni rast tumora može biti manji od 5%; ponovni rast tumora može biti manji od 10%; manji od 20%; manji od 30%; manji od 40%; manji od 50%; manji od 50% ili manji od 75%. Ponovni rast tumora može se meriti bilo kojim pouzdanim sredstvom za merenje. Na primer, ponovni rast tumora može se meriti izračunavanjem povećanja prečnika tumora nakon prethodnog skupljanja tumora koje je nastupilo nakon terapije. Smanjenje ponovnog rasta tumora pokazuje se time što tumor ne raste ponovo nakon što je terapija prekinuta.
[0456] Lečenje ili prevencija kancera može da dovede do redukovanja brzine proliferacije ćelija. Nakon terapije, brzina proliferacije ćelija može biti redukovana za najmanje 5%; za najmanje 10%; za najmanje 20%; za najmanje 30%; za najmanje 40%; za najmanje 50%; za najmanje 50% ili za najmanje 75%. Brzina proliferacije ćelija može se meriti bilo kojim pouzdanim sredstvom za merenje. Na primer, brzina proliferacije ćelija se može meriti izračunavanjem broja ćelija koje se dele u uzorku tkiva u jedinici vremena.
[0457] Lečenje ili prevencija kancera može da dovede do redukovanja proporcije proliferišućih ćelija. Nakon terapije, proporcija proliferišućih ćelija može biti redukovana za najmanje 5%; za najmanje 10%; za najmanje 20%; za najmanje 30%; za najmanje 40%; za najmanje 50%; za najmanje 50% ili za najmanje 75%. Proporcija proliferišućih ćelija može se meriti bilo kojim pouzdanim sredstvom za merenje. Na primer, proporcija proliferišućih ćelija može se izmeriti kvantifikacijom broja ćelija koje se dele u odnosu na broj ćelija koje se ne dele u uzorku tkiva. Proporcija proliferišućih ćelija može biti ekvivalentna mitotskom indeksu.
[0458] Lečenje ili prevencija kancera može da dovede do smanjenja veličine oblasti ili zone proliferacije ćelija. Nakon terapije, veličina oblasti ili zone proliferacije ćelija može biti redukovana za najmanje 5% u odnosu na njenu veličinu pre terapije; redukovana za najmanje 10%; redukovana za najmanje 20%; redukovana za najmanje 30%; redukovana za najmanje 40%; redukovana za najmanje 50%; za najmanje 50% ili redukovana za najmanje 75%. Veličina oblasti ili zone proliferacije ćelija može se meriti bilo kojim pouzdanim sredstvom za merenje. Veličina oblasti ili zone proliferacije ćelija može se meriti kao prečnik ili širina oblasti ili zone proliferacije ćelija.
[0459] Lečenje ili prevencija kancera može da dovede do smanjenja broja ili proporcije ćelija sa abnormalnim izgledom ili abnormalnom morfologijom. Nakon terapije, određeni broj ćelija sa abnormalnom morfologijom može biti redukovan za najmanje 5% u odnosu na njihovu veličinu pre terapije; redukovan za najmanje 10%; redukovan za najmanje 20%; redukovan za najmanje 30%; redukovan za najmanje 40%; redukovan za najmanje 50%; najmanje 50% ili redukovan za najmanje 75%. Abnormalni izgled ili morfologija ćelija mogu se meriti bilo kojim pouzdanim sredstvom za merenje. Abnormalna morfologija ćelija može se meriti mikroskopijom, na primer, korišćenjem invertovanog mikroskopa za kulturu tkiva. Abnormalna morfologija ćelija može se manifestovati kao nuklearni pleomorfizam.
Doziranje i primena
[0460] Imunske ćelije i ovog otkrivanja mogu da se primenjuju na brojne načine u zavisnosti od toga da li se želi lokalno ili sistemsko lečenje.
[0461] Davanje uglavnom može biti parenteralno.
[0462] Poznati su postupci za primenu ćelija u adoptivnoj ćelijskoj terapiji i mogu se koristiti u vezi sa obezbeđenim postupcima i kompozicijama. Na primer, postupci za adoptivnu T-ćelijsku terapiju opisani su, na primer, u US objavi patentne prijave br.2003/0170238 od Gruenberg et al. i U.S. pat. br.4,690,915 od Rosenberg.
[0463] Kompozicije ovog otkrivanja su pogodne za parenteralno davanje. Kako se koristi ovde, „parenteralno davanjeˮ farmaceutskih kompozicija uključuje svaki način davanja koji podrazumeva fizičko probijanje tkiva subjekta i davanje farmaceutske kompozicije kroz to probijanje tkiva, što generalno dovodi do direktnog davanja u krvotok, u mišić ili u unutrašnji organ. Parenteralno davanje tako uključuje davanje farmaceutskih kompozicija putem injekcije kompozicije, primenu kompozicije kroz hirurški rez, primenom kompozicije kroz nehiruršku ranu koja probija tkivo. Određenije, parenteralno davanje podrazumeva potkožnu, intraperitonealnu, intramuskularnu, intrasteriornu, intravensku, intraarterijalnu, intratekalnu, intraventrikularnu, intrauretralnu, intrakranijalnu, intratumoralnu, intrasinovijalnu injekciju ili infuzije i tehnike infuzije bubrežne dijalize. Kao što je opisano, parenteralno davanje kompozicija ovog otkrivanja obuhvata intravensko ili intraarterijalno davanje.
[0464] Ovo otkrivanje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju veći broj imunskih ćelija ovog otkrivanja i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.
[0465] Formulacije farmaceutskih kompozicija pogodnih za parenteralno davanje obično uključuju imunske ćelije u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, kao što su sterilna voda ili sterilan izotonični fiziološki rastvor. Takve formulacije mogu biti pripremljene, upakovane ili prodavane u obliku pogodnom za davanje u bolus ili kontinuirano davanje. Injektabilne formulacije mogu biti pripremljene, upakovane ili prodavane u jediničnim doznim oblicima, kao što su ampule ili višedozni kontejneri koji sadrže konzervans. Formulacije za parenteralno davanje uključuju suspenzije, rastvore, emulzije u uljanim ili vodenim vehikulumima i paste. Takve formulacije mogu dodatno da sadrže jedan dodatni sastojak ili više njih, uključujući agense za suspenziju, stabilizaciju ili disperziju. Parenteralne formulacije takođe uključuju vodene rastvore, koji mogu da sadrže ekscipijense kao što su soli, ugljeni hidrati i agensi za puferovanje. Primerni oblici parenteralnog davanja uključuju rastvore ili suspenzije u sterilnim vodenim rastvorima, na primer, vodenim rastvorima propilen glikola ili dekstroze. Takvi oblici doziranja mogu, po potrebi, biti puferisani na odgovarajući način. Formulacije za parenteralno davanje mogu biti formulisane tako da imaju trenutno i/ili modifikovano oslobađanje. Formulacije sa modifikovanim oslobađanjem uključuju odloženo, produženo, pulsirajuće, kontrolisano, ciljno i programirano oslobađanje.
[0466] Kao što je ovde opisano, formulisana kompozicija koja uključuje imunske ćelije pogodna je za davanje putem injekcije. Kako je ovde takođe opisano, formulisana kompozicija koja uključuje imunske ćelije pogodna je za davanje putem infuzije.
[0467] Farmaceutske kompozicije prema ovom otkrivanju, koje se mogu konvencionalno upakovati u obliku jedinične doze, mogu biti pripremljene prema konvencionalnim tehnikama dobro poznatim u farmaceutskoj industriji. Takve tehnike uključuju fazu združivanja imunskih ćelija sa farmaceutskim nosačem(ima) ili ekscipijensom(ima), kao što su tečni nosači.
[0468] Vodene suspenzije mogu dodatno da sadrže supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije uključujući, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol i/ili dekstran. Suspenzija takođe može da sadrži stabilizatore.
[0469] Kompozicije prema ovom otkrivanju dodatno mogu da sadrže i druge dodatne komponente koje su uobičajene u farmaceutskim kompozicijama. Stoga, na primer, kompozicije mogu da sadrže dodatne, kompatibilne, farmaceutski aktivne materijale kao što su, na primer, antipruritici, astrigenti, lokalni anestetici ili antiinflamatorni agensi ili mogu da sadrže dodatne materijale koji su korisni za fizičko formiranje različitih oblika doziranja kompozicija ovog otkrivanja, kao što su boje, konzervansi, antioksidansi, zamućivači, sredstva za zgušnjavanje i stabilizatori. Međutim, kada se dodaju, takvi materijali ne bi trebali neopravdano da ometaju biološka dejstva imunskih ćelija iz kompozicije prema ovom otkrivanju.
[0470] Formulacija ili kompozicija takođe može da sadrži više od jednog aktivnog sastojka koji je koristan za određenu indikaciju, bolest ili stanje koje se tretira imunskim ćelijama, pod uslovom da njihove odgovarajuće aktivnosti ne štete jedna drugoj. Takvi aktivni sastojci su prikladno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za predviđenu svrhu. Stoga, u nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska kompozicija dodatno može da uključuje druge farmaceutski aktivne agense ili lekove, kao što su hemoterapijski agensi.
[0471] Farmaceutska kompozicija u nekim aspektima može koristiti sisteme oslobađanja sa vremenskim, odloženim ili produženim oslobađanjem, tako da do davanja kompozicije dođe pre senzibilizacije mesta koje treba se leči, i sa dovoljnim vremenom da se ona izazove. Postoji i poznato je mnogo vrsta sistema isporuke sa oslobađanjem. Takvi sistemi mogu da izbegnu ponovljena davanja kompozicije, čime se povećava praktičnost za subjekta i lekara.
[0472] Davanje može biti realizovano u jednoj dozi, kontinuirano ili intermitentno tokom lečenja.
Jednostruko ili višestruko davanje može biti sprovedeno sa nivoom doze i obrascem koji odabere lekar koji sprovodi lečenje.
[0473] Farmaceutska kompozicija u nekim načinima ostvarivanja sadrži imunske ćelije u količinama efikasnim za lečenje ili prevenciju kancera, kao što su terapijski efikasna ili profilaktički efikasna količina. Terapijska ili profilaktička efikasnost u nekim načinima ostvarivanja prati se periodičnim procenama lečenih subjekata. Za ponovljena davanja tokom dana, nedelja ili meseci, u zavisnosti od stanja, lečenje može biti ponavljano dok se ne postigne željeno redukovanje znakova ili simptoma kancera. Međutim, drugi dozni režimi mogu biti korisni i mogu da se odrede. Željena doza može biti primenjena jednim davanjem u bolus ili jednom infuzijom kompozicije ili putem višestrukih davanja u bolus ili infuzija kompozicije.
[0474] Kao što je ovde opisano, ćelije ili populacija ćelija može da se primenjuje u jednoj dozi ili više njih. Kao što je ovde opisano, efikasna količina ćelija može da se primenjuje kao pojedinačna doza. Kao što je ovde opisano, efikasna količina ćelija može da se primenjuje kao više od jedne doze tokom nekog vremenskog perioda. Vreme davanja procenjuje ordinirajući lekar i zavisi od kliničkog stanja pacijenta.
[0475] Ćelije ili populacija ćelija mogu se dobiti iz bilo kog izvora, kao što su banka krvi ili davalac ili sami pacijenti.
[0476] Efikasna količina označava količinu koja obezbeđuje terapijsku ili profilaktičku korist. Doza koja se primenjuje zavisiće od starosti, zdravstvenog stanja i telesne mase primaoca, vrste istovremene terapije, ako postoji, učestalosti terapije i prirode željenog efekta. Kao što je ovde opisano, efikasna količina ćelija ili kompozicije koja obuhvata te ćelije daje se parenteralno. Kao što je ovde opisano, davanje može biti intravensko davanje. Kao što je ovde opisano, davanje se može direktno izvršiti ubrizgavanjem u tumor.
[0477] U svrhe ovog otkrivanja, analiza koja obuhvata, na primer, upoređivanje stepena lize ciljnih ćelija ili sekreciju jednog citokina ili više njih od strane imunskih ćelija koje eksprimuju receptore, nakon davanja određene doze takvih imunskih ćelija sisaru, u skupu sisara od kojih je svaki dobio različitu dozu imunskih ćelija, može se koristiti za određivanje početne doze koja će se dati sisaru.
[0478] Kao što je ovde opisano, ćelije se daju kao deo kombinovane terapije, kao što je istovremeno sa ili sekvencijalno sa, bilo kojim redom, drugom terapijskom intervencijom, kao što je antitelo ili dizajnirana ćelija ili dizajniran receptor ili agens, kao što je citotoksični ili terapijski agens. Imunske ćelije ovog otkrivanja primenjuju se zajedno sa jednim dodatnim terapijskim agensom ili više njih ili u vezi sa drugim terapijskim intervencijama, bilo istovremeno ili sekvencijalno bilo kojim redom. U nekim se kontekstima imunske ćelije primenjuju zajedno sa drugom terapijom vremenski dovoljno blizu da populacija imunskih ćelija pojačava efekat jednog dodatnog terapijskog agensa ili više njih ili obratno. Kao što je ovde opisano, imunske ćelije se daju pre jednog dodatnog terapijskog agensa ili više njih. Kao što je ovde opisano, imunske ćelije se daju nakon jednog dodatnog terapijskog agensa ili više njih.
[0479] Kao što je ovde opisano, limfodepletivna hemoterapija se daje subjektu pre davanja, istovremeno sa njim ili nakon davanja (npr. infuzije) adoptivnih imunskih ćelija. Na primer, limfodepletivna hemoterapija se daje subjektu pre davanja imunskih ćelija. Na primer, limfodepletivna hemoterapija se završava 1-4 dana (npr.1, 2, 3 ili 4 dana) pre infuzije adoptivnih ćelija. Kao što je ovde opisano, primenjuju se višestruke doze adoptivnih ćelija. Kao što je ovde opisano, limfodepletivna hemoterapija se daje subjektu pre davanja, istovremeno sa njim ili nakon davanja (npr. infuzije) ovde opisanih imunskih ćelija. Primeri limfodepletivnih terapija uključuju nemijeloablativnu limfodepletivnu hemoterapiju, mijeloablativnu limfodepletivnu hemoterapiju, zračenje celog tela, itd. Primeri limfodepletivnih agensa uključuju antitimocitni globulin, antiCD3 antitela, antiCD4 antitela, antiCD8 antitela, antiCD52 antitela, antiCD2 antitela, TCRαβ blokatore, antiCD20 antitela, antiCD19 antitela, bortezomib, rituksimab, antiCD154 antitela, rapamicin, CD3 imunotoksin, fludarabin, ciklofosfamid, busulfan, melfalan, Mabthera, takrolimus, alefacept, alemtuzumab, OKT3, OKT4, OKT8, OKT11, fingolimod, antiCD40 antitela, antiBR3 antitela, Campath-1H, antiCD25 antitela, inhibitore kalcineurina, mikofenolat i steroide, koji se mogu koristiti samostalno ili u kombinaciji. Kao što je ovde opisano, režim limfodeplecije može uključivati davanje alemtuzumaba, ciklofosfamida, benduamustina, rituksimaba, pentostatina i/ili fludarabina. Kao što je ovde opisano, režim limfodeplecije može se primenjivati u jednom ciklusu ili više njih dok se ne postigne željeni rezultat redukovanja cirkulišućih imunskih ćelija. Kao što je ovde opisano, limfodepletivna terapija obuhvata davanje agensa koji specifično cilja i redukuje ili eliminiše CD52+ ćelije kod subjekta, dok su imunske ćelije modifikovane da redukuju ili eliminišu ekspresiju CD52.
[0480] Kao što je ovde opisano, imunostimulativna terapija se daje subjektu pre davanja, istovremeno sa njim ili nakon davanja (npr. infuzije) adoptivnih imunskih ćelija. Kao što je ovde takođe opisano, imunostimulativna terapija obuhvata homeostatske citokine. Kao što je ovde takođe opisano, imunostimulativna terapija obuhvata imunostimulatorne molekule. Kao što je ovde takođe opisano, imunostimulativna terapija obuhvata IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-9 ili njihov funkcionalni fragment. Kao što je ovde takođe opisano, imunostimulativna terapija obuhvata IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-9 ili njihove kombinacije. Kao što je ovde takođe opisano, imunostimulativna terapija obuhvata IL-2 ili njegov funkcionalni fragment.
[0481] Postupci za adoptivnu ćelijsku terapiju korišćenjem autolognih ćelija uključuju izolaciju imunskih ćelija iz krvi pacijenta, sprovođenje niza modifikacija na izolovanim ćelijama uključujući transdukciju ćelija jednim vektorom koji kodira ovde opisan sistem dvaju receptora ili sa više njih i davanje ćelija pacijentu. Obezbeđivanje imunskih ćelija od subjekta koji boluje od kancera ili hematološkog maligniteta ili je u riziku od njih zahteva izolaciju imunskih ćelija iz krvi pacijenta i može se izvesti pomoću postupaka poznatih u tehnici, na primer, leukafereze. Tokom leukafereze, krv se uzima od subjekta te se razdvajaju periferne krvne mononuklearne (PBMC) ćelije, dok se ostatak krvi vraća u cirkulaciju subjekta. PBMC-ovi se čuvaju bilo zamrznuti ili kriokonzervirani kao uzorak imunskih ćelija i obezbeđuju se za dalje faze obrade, kao što su, npr. ovde opisane modifikacije.
[0482] Kao što je ovde opisano, ovde opisani postupak za lečenje subjekta obuhvata modifikacije imunskih ćelija subjekta koje uključuju niz modifikacija koje obuhvataju obogaćivanje i/ili trošenje, aktiviranje, genetsku modifikaciju, širenje, formulaciju i kriokonzervaciju.
[0483] Ovo otkrivanje omogućava faze obogaćivanja i/ili trošenja koje mogu uključivati, na primer, postupke za ispiranje i frakcionisanje koji su poznati u tehnici za pripremu PMBC-ova subjekta za nishodne postupke, npr. ovde opisane modifikacije. Na primer, postupci mogu uključivati uređaje za uklanjanje vidljivih crvenih krvnih zrnaca i kontaminanata trombocita, sisteme za frakcionisanje na osnovu veličine ćelija radi trošenja monocita i izolacije limfocita i/ili sisteme koji omogućavaju obogaćivanje ili trošenje specifičnih podskupova T-ćelija, kao što su, npr. CD4+, CD8+, CD25+ ili CD62L+ T-ćelije. Nakon faza obogaćivanja, ciljna podpopulacija imunskih ćelija biće izolovana iz PMBC-ova subjekta za dalju obradu. Stručnjaci iz ove oblasti znaju da faze obogaćivanja, kako su ovde navedene, mogu da obuhvataju i bilo koji novootkriveni postupak, uređaj, reagens ili njihovu kombinaciju.
[0484] Ovo otkrivanje obezbeđuje faze aktiviranja koje može predstavljati bilo koji postupak poznat u tehnici koji indukuje aktiviranje imunskih ćelija, npr. T-ćelija, potrebnih za njihovo ex vivo širenje.
Aktiviranje imunskih ćelija može se postići, na primer, kultivisanjem imunskih ćelija subjekta u prisustvu dendritskih ćelija, kultivisanjem imunskih ćelija subjekta u prisustvu veštačkih antigen prezentujućih ćelija (AAPC) ili kultivisanjem imunskih ćelija u prisustvu ozračenih AAPC dobijenih iz K562. Drugi postupci za aktiviranje imunskih ćelija subjekta mogu, na primer, biti kultivisanje imunskih ćelija u prisustvu izolovanih faktora i kompozicija za aktiviranje, npr. perli, površina ili čestica funkcionalizovanih faktorima za aktiviranje. Faktori za aktiviranje mogu uključivati, na primer, antitela, npr. antiCD3 i/ili antiCD28 antitela. Takođe, faktori za aktiviranje mogu, na primer, biti citokini, npr. interleukin (IL)-2 ili IL-21. Faktori za aktiviranje mogu biti i kostimulatorni molekuli, kao što su CD40, CD40L, CD70, CD80, CD83, CD86, CD137L, ICOSL, GITRL i CD134L. Stručnjaci iz ove oblasti znaju da faktori za aktiviranje, kako su ovde navedeni, mogu obuhvatati bilo koji novootkriveni faktor za aktiviranje, reagens, kompoziciju ili njihovu kombinaciju koja može aktivirati imunske ćelije.
[0485] Ovo otkrivanje obezbeđuje faze genetske modifikacije za modifikaciju imunskih ćelija subjekta. Na primer, genetska modifikacija obuhvata transdukovanje imunske ćelije vektorom koji obuhvata ovde opisanu shRNK koja je komplementarna sa B2M ili HLA-A. Genetska modifikacija može obuhvatiti modifikaciju genoma imunskih ćelija radi indukovanja mutacija u B2M ili HLA-A pomoću CRISPR/Cas posredovanog dizajniranja genoma. Na primer, postupak obuhvata transdukciju imunskih ćelija jednim vektorom koji kodira receptore aktivatora i inhibitora ili sa više njih, čime se proizvode imunske ćelije koje eksprimuju te receptore aktivatora i inhibitora.
[0486] Ovo otkrivanje obezbeđuje faze širenja genetski modifikovanih imunskih ćelija subjekta. Genetski modifikovane imunske ćelije subjekta mogu se širiti u bilo kom sistemu za širenje imunskih ćelija koji je poznat u tehnici radi generisanja terapijskih doza imunskih ćelija za primenu. Za širenje imunskih ćelija mogu se, na primer, koristiti bioreaktorske vreće za upotrebu u sistemu koji obuhvata kontrolne pumpe i sonde koje omogućavaju automatsko uvođenje i uklanjanje otpada. Za širenje imunskih ćelija mogu se koristiti posude za kulturu ćelija sa gasnopropusnim membranama na osnovi. Svaki takav sistem poznat u tehnici koji omogućava širenje imunskih ćelija za kliničku upotrebu obuhvaćen je ovde obezbeđenom fazom širenja. Imunske ćelije se šire u sistemima kultura u podlogama formulisanim konkretno za širenje. Širenje takođe može biti olakšano kultivisanjem imunskih ćelija ovog otkrivanja u prisustvu faktora za aktiviranje kao što je ovde opisano. Stručnjaci iz ove oblasti znaju da faze širenja, kako su ovde navedene, mogu obuhvatiti i bilo koji novootkriveni sistem za kulturu, podlogu ili faktor za aktiviranje koji se mogu koristiti za širenje imunskih ćelija.
[0487] Ovo otkrivanje obezbeđuje faze formulacije i kriokonzervacije za proširene genetski modifikovane imunske ćelije subjekta. Obezbeđene faze formulacije uključuju, na primer, ispiranje viška komponenti korišćenih u pripremi i širenju imunskih ćelija u ovde opisanim postupcima za lečenje (nisu prema ovom pronalasku). Bilo koja farmaceutski prihvatljiva podloga za formulaciju ili pufer za ispiranje koji su kompatibilna sa imunskim ćelijama i poznati u tehnici mogu se koristiti za ispiranje, razblaživanje/koncentrovanje imunskih ćelija i pripremu doza za davanje. Formulaciona podloga može biti prihvatljiva za davanje imunskih ćelija, kao što su, na primer kristaloidni rastvori za intravensku infuziju.
[0488] Kriokonzervacija se opciono može koristiti za dugoročno skladištenje imunskih ćelija.
Kriokonzervacija se može postići korišćenjem postupaka poznatih u tehnici, uključujući na primer, skladištenje ćelija u podlozi za kriokonzervaciju koja sadrži komponente za kriokonzervaciju. Komponente za kriokonzervaciju mogu uključivati, na primer, dimetil sulfoksid ili glicerin. Imunske ćelije skladištene u podlozi za kriokonzervaciju mogu se kriokonzervirati snižavanjem temperature skladištenja na -80°C do -196°C.
[0489] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, postupak za lečenje obuhvata utvrđivanje tipa HLA linije klice subjekta. Kao što je ovde opisano, tip HLA linije klice se određuje u koštanoj srži.
[0490] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, postupak za lečenje obuhvata utvrđivanje nivoa ekspresije EGFR-a. Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, nivo ekspresije EGFR-a se utvrđuje u uzorcima tumorskog tkiva subjekta. Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, nivo ekspresije EGFR-a se određuje korišćenjem sekvenciranja sledeće generacije. Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, nivo ekspresije EGFR-a se određuje korišćenjem sekvenciranja RNK. Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, nivo EGFR-a se određuje korišćenjem imunohistohemije.
[0491] Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, postupak za lečenje obuhvata davanje terapijski efikasne doze imunskih ćelija koje obuhvataju inhibitorni receptor HLA-A*02 subjektu kom je to potrebno, pri čemu je subjekat utvrđen kao HLA linija klice HLA-A*02 heterozigotan i ima ćelije kancera sa gubitkom HLA-A*02. Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, postupak za lečenje obuhvata davanje terapijski efikasne doze imunskih ćelija koje obuhvataju HLA-A*01 inhibitorni receptor subjektu kom je to potrebno, pri čemu je subjekat utvrđen kao heterozigotan za HLA liniju klice HLA-A*01 i ima ćelije kancera sa gubitkom HLA-A*01. Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, postupak za lečenje obuhvata davanje terapijski efikasne doze imunskih ćelija koje obuhvataju HLA-A*03 subjektu kom je to potrebno, pri čemu je subjekat utvrđen kao heterozigotan za HLA liniju klice HLA-A03 i ima ćelije kancera sa gubitkom HLA-A*03. Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, postupak za lečenje obuhvata davanje terapijski efikasne doze imunskih ćelija koje obuhvataju inhibitorni receptor HLA-A*07 subjektu kom je to potrebno, pri čemu je subjekat utvrđen kao heterozigotan za HLA liniju klice HLA-A*07 i ima ćelije kancera sa gubitkom HLA-A*07. Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, postupak za lečenje obuhvata davanje terapijski efikasne doze imunskih ćelija koje obuhvataju inhibitorni receptor HLA-C*07 subjektu kom je to potrebno, pri čemu je subjekat utvrđen kao heterozigotan za HLA liniju klice HLA-C*07 i ima ćelije kancera sa gubitkom HLA-C*07. Kao što je ovde opisano, ali nije prema ovom pronalasku, postupak za lečenje obuhvata davanje terapijski efikasne doze imunskih ćelija koje obuhvataju inhibitorni receptor HLA-B*07 subjektu kom je to potrebno, pri čemu je subjekat utvrđen kao heterozigotan za HLA liniju klice HLA-B*07 i ima ćelije kancera sa gubitkom HLA-B*07.
[0492] Ovde je opisan, ali nije prema ovom pronalasku, postupak za lečenje heterozigotnih HLA-A*02 pacijenata sa malignitetima koji eksprimuju EGFR i bez HLA-A*02 ekspresije i/ili lečenje odraslih heterozigotnih HLA-A*02 pacijenata sa rekurentnim neresektabilnim ili metastatskim solidnim tumorima koji eksprimuju EGFR i bez ekspresije HLA-A*02.
[0493] Kao što je ovde opisano, primenjuje se ovde opisana terapijski efikasna doza imunskih ćelija. Kao što je ovde opisano, imunske ćelije ovog otkrivanja primenjuju se intravenskom injekcijom. Kao što je ovde opisano, imunske ćelije ovog otkrivanja daju se intraperitonealnom injekcijom. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<6>ćelija, oko 1×10<6>ćelija, oko 2×10<6>ćelija, oko 3×10<6>ćelija, 4×10<6>ćelija, oko 5×10<6>ćelija, oko 6×10<6>ćelija, oko 7×10<6>ćelija, oko 8×10<6>ćelija, oko 9×10<6>ćelija, oko 1×10<7>, oko 2×10<7>, oko 3×10<7>, oko 4×10<7>, oko 5×10<7>, oko 6×10<7>, oko 7×10<7>, oko 8×10<7>, oko 9×10<7>, oko 1×10<8>ćelija, oko 2×10<8>ćelija, oko 3×10<8>ćelija, oko 4×10<8>ćelija, oko 5×10<8>ćelija, oko 6×10<8>ćelija, oko 7×10<8>ćelija, oko 8×10<8>ćelija, oko 9×10<8>ćelija, oko 1×10<9>ćelija, oko 2×10<9>ćelija, oko 3×10<9>ćelija, oko 3×10<9>ćelija, oko 4×10<9>ćelija, oko 5×10<9>ćelija, oko 5×10<9>ćelija, oko 6×10<9>ćelija, oko 7×10<9>ćelija, oko 8×10<9>ćelija, oko 9×10<9>ćelija, oko 1×10<10>ćelija, oko 2×10<10>ćelija, oko 3×10<10>ćelija, oko 4×10<10>ćelija, oko 5×10<10>ćelija, oko 6×10<10>ćelija, oko 7×10<10>ćelija, oko 8×10<10>ćelija ili oko 9×10<10>ćelija.
[0494] Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<6>ćelija do oko 9×10<10>ćelija, oko 1×10<6>ćelija do oko 5×10<10>ćelija, oko 2×10<6>ćelija do oko 5×10<9>ćelija, oko 3×10<6>ćelija do oko 5×10<9>ćelija, oko 4×10<6>ćelija do oko 3×10<9>ćelija, oko 5×10<6>ćelija do oko 2×10<9>ćelija, oko 6×10<6>ćelija do oko 1×10<9>ćelija, 0,5×10<6>ćelija do oko 6×10<9>ćelija, oko 1×10<6>ćelija do oko 5×10<9>ćelija, oko 2×10<6>ćelija do oko 5×10<9>ćelija, oko 3×10<6>ćelija do oko 4×10<9>ćelija, oko 4×10<6>ćelija do oko 3×10<9>ćelija, oko 5×10<6>ćelija do oko 2×10<9>ćelija, oko 6×10<6>ćelija do oko 1×10<9>ćelija, 0,5×10<6>ćelija do oko 6×10<8>ćelija, oko 1×10<6>ćelija do oko 5×10<8>ćelija, oko 2×10<6>ćelija do oko 5×10<8>ćelija, oko 3×10<6>ćelija do oko 4×10<8>ćelija, oko 4×10<6>ćelija do oko 3×10<8>ćelija, oko 5×10<6>ćelija do oko 2×10<8>ćelija, oko 6×10<6>ćelija do oko 1×10<8>ćelija, oko 7×10<6>ćelija do oko 9×10<8>ćelija, oko 8×10<6>ćelija do oko 8×10<8>ćelija, oko 9×10<6>ćelija do oko 7×10<8>ćelija, oko 1×10<7>ćelija do oko 6×10<8>ćelija, oko 2×10<7>ćelija do oko 5×10<8>ćelija, oko 7×10<6>ćelija do oko 9×10<7>ćelija, oko 8×10<6>ćelija do oko 8×10<7>ćelija, oko 9×10<6>ćelija do oko 7×10<7>ćelija, oko 1×10<7>ćelija do oko 6×10<7>ćelija ili oko 2×10<7>ćelija do oko 5×10<7>ćelija.
[0495] Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<5>ćelija do oko 9×10<10>ćelija. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<6>ćelija do oko 1×10<10>ćelija. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<6>ćelija do oko 5×10<9>ćelija. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<6>ćelija do oko 1×10<9>ćelija. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<6>ćelija do oko 6×10<8>ćelija. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<6>ćelija do oko 9×10<10>ćelija. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<7>ćelija do oko 1×10<10>ćelija. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<7>ćelija do oko 5×10<9>ćelija. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<7>ćelija do oko 1×10<9>ćelija. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<7>ćelija do oko 6×10<8>ćelija. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<8>ćelija do oko 9×10<10>ćelija. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<8>ćelija do oko 1×10<10>ćelija. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<8>ćelija do oko 5×10<9>ćelija. Kao što je ovde opisano, terapijski efikasna doza obuhvata oko 0,5×10<8>ćelija do oko 1×10<9>ćelija. Pojam „okoˮ koji se koristi u terapijskoj dozi, može biti, na primer, ± 0,5×10<6>ćelija, ± 0,5×10<7>ćelija ili ± 0,5×10<8>ćelija.
Kompleti i proizvodni elementi
[0496] Ovo otkrivanje obezbeđuje komplete i proizvodne elemente koji obuhvataju polinukleotide i vektore koji kodiraju ovde opisane receptore, i imunske ćelije koje obuhvataju ovde opisane receptore. Kao što je ovde opisano, komplet obuhvata elemente kao što su bočice, špricevi i uputstva za upotrebu.
[0497] Kao što je ovde takođe opisano, komplet obuhvata polinukleotid ili vektor koji obuhvata sekvencu koja kodira jedan receptor ovog otkrivanja ili više njih.
[0498] Kao što je ovde takođe opisano, komplet obuhvata veći broj imunskih ćelija koje obuhvataju prvi i drugi receptor kao što je ovde opisano. Veći broj imunskih ćelija može da obuhvata veći broj T-ćelija.
[0499] Kao što je ovde takođe opisano, komplet obuhvata uputstva za upotrebu.
NUMERISANE STAVKE (NISU PREMA OVOM PRONALASKU)
[0500] Ovaj pronalazak je definisan u pridruženim patentnim zahtevima.
[0501] Stavka 1. Imunska ćelija, koja obuhvata:
a.) prvi receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR) i
b.) drugi receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za neciljni antigen koji nestaje kod EGFR+ kancera usled gubitka heterozigotnosti,
pri čemu prvi receptor predstavlja receptor aktivatora osetljiv na EGFR i pri čemu drugi receptor predstavlja inhibitorni receptor osetljiv na neciljni antigen.
[0502] Stavka 2. Imunska ćelija prema stavki 1, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora specifično vezuje alelsku varijantu MHC proteina. Stavka 3. Imunska ćelija prema stavki 1, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora specifično vezuje alelsku varijantu HLA-A, HLA-B ili HLA-C proteina.
[0503] Stavka 4. Imunska ćelija prema stavki 1, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora specifično vezuje HLA-A*02.
[0504] Stavka 5. Imunska ćelija prema stavki 1, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora specifično vezuje HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*11, HLA-C*07 ili HLA-B*07.
[0505] Stavka 6. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 3-5, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDR) CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 kao što je navedeno u tabeli 5 ili CDR sekvence sa najviše 1, 2 ili 3 supstitucije, brisanja ili umetanja u odnosu na CDR-ove iz tabele 5.
[0506] Stavka 7. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 3-5, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDR) CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 SEQ ID NO: 101-106 ili SEQ ID NO: 106-112 ili CDR sekvence sa najviše 1, 2 ili 3 supstitucije, brisanja ili umetanja u odnosu na CDR-ove iz tabele 5.
[0507] Stavka 8. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 3-5, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata polipeptidnu sekvencu odabranu iz polipeptidne sekvence navedene u tabeli 4 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična.
[0508] Stavka 9. Imunska ćelija prema stavki 4, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata bilo koju od SEQ ID NO: 89-100 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična.
[0509] Stavka 10. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-9, u kojoj prvi receptor predstavlja himerni antigenski receptor (CAR).
[0510] Stavka 11. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-10, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata varijabilni teški (VH) deo koji obuhvata skup regiona teškog lanca koji određuju komplementarnost (HC-CDR) odabran iz grupe sekvenci izloženih u tabeli 3 i/ili varijabilni laki (VL) deo koji obuhvata skup regiona lakog lanca koji određuju komplementarnost (LC-CDR) iz grupe sekvenci izloženih u tabeli 3 ili CDR sekvence sa najviše 1, 2, 3, 4 supstitucije, umetanja ili brisanja u svakom CDR.
[0511] Stavka 12. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-11, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata varijabilni teški (VH) deo sa sekvencom odabranom iz VH sekvence izložene u tabeli 2 i/ili varijabilni laki (VL) deo koji obuhvata sekvencu izloženu u tabeli 2 ili sekvence koje su im najmanje 70%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% identične.
[0512] Stavka 13. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-12, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora koji obuhvata sekvencu odabranu iz grupe sekvenci izloženih u tabeli 1 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična. Stavka 14. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-13, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata scFv sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 9-18 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična. Stavka 15. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-14, u kojoj drugi receptor obuhvata LILRB1 intracelularni domen ili njegovu funkcionalnu varijantu.
[0513] Stavka 16. Imunska ćelija prema stavki 15, u kojoj LILRB1 intracelularni domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99% ili potpuno identična SEQ ID NO: 129.
[0514] Stavka 17. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-16, u kojoj drugi receptor obuhvata LILRB1 transmembranski domen ili njegovu funkcionalnu varijantu.
[0515] Stavka 18. Imunska ćelija prema stavki 17, u kojoj LILRB1 transmembranski domen ili njegova funkcionalna varijanta obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99% ili potpuno identična SEQ ID NO: 133.
[0516] Stavka 19. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-18, u kojoj drugi receptor obuhvata LILRB1 zglobni domen ili njegovu funkcionalnu varijantu.
[0517] Stavka 20. Imunska ćelija prema stavki 19, u kojoj LILRB1 zglobni domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99% ili potpuno identična SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126.
[0518] Stavka 21. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-20, u kojoj drugi receptor obuhvata LILRB1 intracelularni domen, LILRB1 transmembranski domen, LILRB1 zglobni domen, funkcionalnu varijantu bilo kog od njih ili njihove kombinacije.
[0519] Stavka 22. Imunska ćelija prema stavki 21, u kojoj LILRB1 intracelularni domen i LILRB1 transmembranski domen obuhvataju SEQ ID NO: 128 ili sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 128.
[0520] Stavka 23. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-22, pri čemu je ćelija EGFR+ kancera ćelija kancera pluća, ćelija sitnoćelijskog kancera pluća, ćelija nesitnoćelijskog kancera pluća, ćelija duktalnog karcinoma pankreasa, ćelija kolorektalnog kancera, ćelija kancera glave i vrata, ćelija adenokarcinoma jednjaka i želuca, ćelija kancera jajnika, ćelija multiformnog glioblastoma, ćelija karcinoma skvamoznih ćelija grlića materice, ćelija kancera bubrega, ćelija papilarnog kancera bubrega, ćelija svetloćelijskog karcinoma bubrega, ćelija kancera bešike, ćelija kancera dojke, ćelija kancera žučnih kanala, ćelija kancera jetre, ćelija kancera prostate, ćelija sarkoma, ćelija kancera štitne žlezde, ćelija kancera grudne žlezde, ćelija kancera želuca ili ćelija kancera materice.
[0521] Stavka 24. Imunska ćelija prema stavki 23, pri čemu je ćelija EGFR+ kancera ćelija kancera pluća.
[0522] Stavka 25. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-24, pri čemu ćelija EGFR+ kancera predstavlja EGFR+/HLA-A*02- ćeliju kancera koja ne eksprimuje HLA-A*02 ili ćeliju kancera dobijenu od osobe sa HLA-A*02+, koja ne eksprimuje HLA-A*02.
[0523] Stavka 26. Imunska ćelija prema stavki 25, pri čemu je EGFR+/HLA-A*02- ćelija kancera dobijena od EGFR+/HLA-A*02+ ćelije gubitkom heterozigotnosti na HLA-A što vodi gubitku HLA-A*02.
[0524] Stavka 27. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-26, u kojoj prvi receptor i drugi receptor zajedno specifično aktiviraju imunsku ćeliju u prisustvu EGFR/HLA-A*02- ćelije kancera sa gubitkom heterozigotnosti.
[0525] Stavka 28. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-27, u kojoj prvi receptor i drugi receptor zajedno ne aktiviraju specifično imunsku ćeliju u prisustvu EGFR+ ćelije koja nije izgubila HLA-A* 02 gubitkom heterozigotnosti.
[0526] Stavka 29. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-28, pri čemu je ta imunska ćelija T-ćelija, makrofag, NK ćelija, iNKT-ćelija ili gama delta T-ćelija. Stavka 30. Imunska ćelija prema stavki 29, pri čemu je T-ćelija CD8+ CD4- T-ćelija.
[0527] Stavka 31. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-30, u kojoj je ekspresija i/ili funkcija gena MHC klase I redukovana ili eliminisana.
[0528] Stavka 32. Imunska ćelija prema stavki 30, u kojoj gen MHC klase I predstavlja beta-2-mikroglobulin (B2M).
[0529] Stavka 33. Imunska ćelija prema stavki 32, koja dodatno obuhvata polinukleotid koji obuhvata interferirajuću RNK, pri čemu ta interferirajuća RNK obuhvata sekvencu koja je komplementarna sekvenci B2M iRNK (SEQ ID NO: 172).
[0530] Stavka 34. Imunska ćelija prema stavki 33, u kojoj interferirajuća RNK može indukovati RNKi posredovanu degradaciju B2M iRNK.
[0531] Stavka 35. Imunska ćelija prema stavki 33, u kojoj interferirajuća RNK predstavlja RNK sa strukturom ukosnice (shRNK).
[0532] Stavka 36. Imunska ćelija prema stavki 35, u kojoj shRNK obuhvata:
a.) prvu sekvencu, koja od 5’ kraja do 3’ kraja ima sekvencu komplementarnu sekvenci B2M iRNK i
b.) drugu sekvencu, koja od 5’ kraja do 3’ kraja ima sekvencu komplementarnu prvoj sekvenci,
pri čemu prva sekvenca i druga sekvenca obrazuju shRNK.
[0533] Stavka 37. Imunska ćelija prema stavki 32, koja obuhvata jednu modifikaciju sekvence koja kodira B2M (SEQ ID NO: 170) ili više njih, pri čemu jedna modifikacija ili više njih redukuje(u) ekspresiju i/ili eliminiše(u) funkciju B2M.
[0534] Stavka 38. Imunska ćelija prema stavki 37, u kojoj jedna modifikacija ili više njih obuhvata(ju) jednu inaktivirajuću mutaciju endogenog gena koji kodira B2M ili više njih.
[0535] Stavka 39. Imunska ćelija prema stavki 38, u kojoj jedna inaktivirajuća mutacija ili više njih obuhvata(ju) brisanje, umetanje, supstituciju ili mutaciju pomeranja okvira čitanja.
[0536] Stavka 40. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 38-39, u kojoj je(su) jedna inaktivirajuća mutacija ili više njih uvedena(e) endonukleazom koja je vođena nukleinskom kiselinom u kompleks sa najmanje jednom nukleinskom kiselinom vodičem (gNK) koja specifično cilja sekvencu endogenog gena koji kodira B2M (SEQ ID NO: 170).
[0537] Stavka 41. Imunska ćelija prema stavki 31, u kojoj gen MHC klase I predstavlja HLA-A*02. Stavka 42. Imunska ćelija prema stavki 41, koja dodatno obuhvata polinukleotid koji obuhvata interferirajuću RNK, koja obuhvata sekvencu komplementarnu sekvenci HLA-A*02 iRNK (SEQ ID NO: 171).
[0538] Stavka 43. Imunska ćelija prema stavki 42, u kojoj interferirajuća RNK može indukovati RNK interferencijom (RNKi) posredovanu degradaciju HLA-A*02 iRNK.
[0539] Stavka 44. Imunska ćelija prema stavki 43, u kojoj interferirajuća RNK predstavlja RNK sa strukturom ukosnice (shRNK) koja obuhvata:
a.) prvu sekvencu, koja od 5’ kraja do 3’ kraja ima sekvencu komplementarnu sekvenci HLA-A*02 iRNK i
b.) drugu sekvencu, koja od 5’ kraja do 3’ kraja ima sekvencu komplementarnu prvoj sekvenci,
pri čemu prva sekvenca i druga sekvenca obrazuju shRNK.
[0540] Stavka 45. Imunska ćelija prema stavki 41, koja obuhvata jednu modifikaciju sekvence endogenog gena koji kodira HLA-A*02 (SEQ ID NO: 169) ili više njih, pri čemu jedna modifikacija ili više njih redukuje(u) ekspresiju i/ili eliminiše funkciju HLA-A*02. Stavka 46. Imunska ćelija prema stavki 45, u kojoj jedna modifikacija ili više njih obuhvata(ju) jednu inaktivirajuću mutaciju endogenog gena koji kodira HLA-A*02 ili više njih.
[0541] Stavka 47. Imunska ćelija prema stavki 45 ili stavke 46, u kojoj je(su) jedna inaktivirajuća mutacija ili više njih uvedena(e) endonukleazom koja je vođena nukleinskom kiselinom u kompleks sa najmanje jednom nukleinskom kiselinom vodičem (gNK) koja specifično cilja sekvencu endogenog gena koji kodira HLA-A*02.
[0542] Stavka 48. Imunska ćelija prema stavki 1, u kojoj:
a.) prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 177 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta i
b.) drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 174 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0543] Stavka 49. Imunska ćelija prema stavki 1, u kojoj:
a.) prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 177 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta i
b.) drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 173 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0544] Stavka 50. Imunska ćelija prema stavki 1, u kojoj:
a.) prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 175 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta i
b.) drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 174 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0545] Stavka 51. Imunska ćelija prema stavki 1, u kojoj:
a.) prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 175 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta i
b.) drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 173 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0546] Stavka 52. Imunska ćelija prema stavki 1, u kojoj:
a.) prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 176 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta i
b.) drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 173 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0547] Stavka 53. Imunska ćelija prema stavki 1, u kojoj:
a.) prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 176 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta i
b.) drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 173 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0548] Stavka 54. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 48 do 53, koja dodatno obuhvata T2A samocepajući peptid, pri čemu T2A samocepajući peptid obuhvata SEQ ID NO: 178 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0549] Stavka 55. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 48 do 54, koja dodatno obuhvata interferirajuću RNK, pri čemu ta interferirajuća RNK obuhvata SEQ ID NO: 179 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
[0550] Stavka 56. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-55, pri čemu je ta imunska ćelija autologna.
[0551] Stavka 57. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki1-55, pri čemu je ta imunska ćelija alogena.
[0552] Stavka 58. Farmaceutska kompozicija, koja obuhvata terapijski efikasnu količinu imunskih ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-57.
[0553] Stavka 59. Farmaceutska kompozicija prema stavki 58, u kojoj imunska ćelija eksprimuje i prvi receptor i drugi receptor.
[0554] Stavka 60. Farmaceutska kompozicija prema stavki 59, u kojoj najmanje oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90% ili oko 95% imunskih ćelija eksprimuje i prvi receptor i drugi receptor.
[0555] Stavka 61. Farmaceutska kompozicija prema stavki 59, u kojoj najmanje 90% imunskih ćelija eksprimuje i prvi receptor i drugi receptor.
[0556] Stavka 62. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od stavki 58-61, koja dodatno obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.
[0557] Stavka 63. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojoj od stavki 58-62, za upotrebu kao lek u lečenju EGFR+ kancera.
[0558] Stavka 64. Polinukleotid ili polinukleotidni sistem, koji obuhvata jedan polinukleotid ili više njih koji obuhvata(ju) polinukleotidne sekvence koje kodiraju:
a.) prvi receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za receptor endotelnog faktora rasta (EGFR) i
b.) drugi receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za neciljni antigen koji nestaje kod ćelija EGFR+ kancera usled gubitka heterozigotnosti,
pri čemu prvi receptor predstavlja receptor aktivatora osetljiv na EGFR kod ćelija EGFR+ kancera i pri čemu drugi receptor predstavlja inhibitorni receptor osetljiv na neciljni antigen.
[0559] Stavka 65. Polinukleotid ili polinukleotidni sistem, koji obuhvata jedan polinukleotid ili više njih koji obuhvata(ju) polinukleotidne sekvence koje kodiraju prvi receptor i drugi receptor za upotrebu u generisanju imunskih ćelija prema bilo kojoj od stavki 1-57.
[0560] Stavka 66. Vektor, koji obuhvata jedan polinukleotid prema stavki 64 ili 65 ili više njih.
[0561] Stavka 67. Postupak za ubijanje ćelija EGFR+ kancera sa gubitkom heterozigotnosti u lokusu MHC klase I, koja obuhvata davanje subjektu efikasne količine imunske ćelije prema bilo kojoj od stavki 1-57 ili farmaceutske kompozicije prema bilo kojoj od stavki 58-62.
[0562] Stavka 68. Postupak prema stavki 67, u kom je ćelija EGFR+ kancera ćelija kancera pluća, ćelija sitnoćelijskog kancera pluća, ćelija nesitnoćelijskog kancera pluća, ćelija duktalnog karcinoma pankreasa, ćelija kolorektalnog kancera, ćelija kancera glave i vrata, ćelija adenokarcinoma jednjaka i želuca, ćelija kancera jajnika, ćelija multiformnog glioblastoma, ćelija karcinoma skvamoznih ćelija grlića materice, ćelija kancera bubrega, ćelija papilarnog kancera bubrega, ćelija svetloćelijskog karcinoma bubrega, ćelija kancera bešike, ćelija kancera dojke, ćelija kancera žučnih kanala, ćelija kancera jetre, ćelija kancera prostate, ćelija sarkoma, ćelija kancera štitne žlezde, ćelija kancera grudne žlezde, ćelija kancera želuca ili ćelija kancera materice.
[0563] Stavka 69. Postupak prema stavki 67, u kom je ćelija EGFR+ kancera ćelija kancera pluća.
[0564] Stavka 70. Postupak prema stavki 67, u kom ćelija EGFR+ kancera predstavlja EGFR+/HLA-A*02-ćeliju kancera koja ne eksprimuje HLA-A*02 ili ćeliju kancera dobijenu od osobe sa HLA-A*02+, koja ne eksprimuje HLA-A*02.
[0565] Stavka 71. Postupak prema stavki 70, u kom je EGFR+/HLA-A*02- ćelija kancera dobijena od EGFR+/HLA-A*02+ ćelije gubitkom heterozigotnosti na HLA-A što vodi gubitku HLA-A* 02.
[0566] Stavka 72. Postupak za lečenje EGFR+ kancera kod subjekta sa EGFR+ tumorom sa gubitkom heterozigotnosti u lokusu koji kodira neciljni antigen, koja obuhvata davanje subjektu efikasne količine imunske ćelije prema bilo kojoj od stavki 1-57 ili farmaceutske kompozicije prema bilo kojoj od stavki 58-62.
[0567] Stavke 73. Postupak prema stavki 72, pri čemu je subjekat heterozigotni HLA-A*02 pacijent sa malignitetom koji eksprimuje EGFR i bez ekspresije HLA-A *02.
[0568] Stavka 74. Postupak prema stavki 72, pri čemu je subjekat heterozigotni HLA-A* 02 pacijent sa rekurentnim neresektabilnim ili metastatskim solidnim tumorima koji eksprimuju EGFR i bez ekspresije HLA-A*02.
[0569] Stavka 75. Postupak za lečenje kancera kod subjekta, koji obuhvata:
a.) utvrđivanje genotipa ili nivoa ekspresije neciljnog antigena u nemalignim ćelijama i ćelijama kancera subjekta;
b.) utvrđivanje nivoa ekspresije EGFR-a u ćelijama kancera subjekta i
c.) davanje subjektu efikasne količine imunske ćelije prema bilo kojoj od stavki 1-57 ili farmaceutske kompozicije prema bilo kojoj od stavki 58-62 ukoliko nemaligne ćelije eksprimuju neciljni antigen, a ćelije kancera ne eksprimuju neciljni antigen i te su ćelije kancera su pozitivne na EGFR.
[0570] Stavka 76. Postupak prema bilo kojoj od stavki 67-75, u kom davanje imunske ćelije prema bilo kojoj od stavki 1-57 ili farmaceutske kompozicije prema bilo kojoj od stavki 58-62 redukuje veličinu tumora kod subjekta.
[0571] Stavka 77. Postupak prema stavki 76, u kom se tumor redukuje za oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% ili oko 100%.
[0572] Stavka 78. Postupak prema stavki 76, u kom se tumor eliminiše.
[0573] Stavka 79. Postupak prema bilo kojoj od stavki 67-75, u kom davanje imunske ćelije ili farmaceutske kompozicije zaustavlja rast tumora kod subjekta.
[0574] Stavka 80. Postupak prema bilo kojoj od stavki 67-75, u kom davanje imunske ćelije prema bilo kojoj od stavki 1-57 ili farmaceutske kompozicije prema bilo kojoj od stavki 58-62 redukuje broj tumora kod subjekta.
[0575] Stavka 81. Postupak prema bilo kojoj od stavki 67-80, u kom davanje imunske ćelije ili farmaceutske kompozicije dovodi do selektivnog ubijanja ćelije kancera, ali ne i normalne ćelije kod subjekta.
[0576] Stavka 82. Postupak prema stavki 81, u kom najmanje oko 60% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 65% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 70% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 75% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 80% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 85% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 90% ubijenih ćelija čine ćelije kancera, najmanje oko 95% ubijenih ćelija čine ćelije kancera ili oko 100% ubijenih ćelija čine ćelije kancera.
[0577] Stavka 83. Postupak prema stavki 81, u kom davanje imunske ćelije ili farmaceutske kompozicije dovodi do ubijanja od oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90% ili svih ćelija kancera subjekta.
[0578] Stavka 84. Postupak prema bilo kojoj od stavki 67-83, u kom davanje imunske ćelije ili farmaceutske kompozicije izaziva manje nuspojava kod subjekta od davanja na drugi način ekvivalentne imunske ćelije koja obuhvata prvi receptor aktivatora, ali ne i drugi inhibitorni receptor.
[0579] Stavka 85. Postupak za izradu većeg broja imunskih ćelija, koji obuhvata:
a.) obezbeđivanje većeg broja imunskih ćelija i
b.) transformisanje većeg broja imunskih ćelija polinukleotidnim sistemom prema stavki 64 ili stavke 65 ili vektorom prema stavki 66.
[0580] Stavka 86. Komplet koji obuhvata imunsku ćeliju prema bilo kojoj od stavki 1-57 ili farmaceutsku kompoziciju prema bilo kojoj od stavki 58-62.
[0581] Stavka 87. Komplet prema stavki 86, koji dodatno obuhvata uputstva za upotrebu.
[0582] Stavka 88. Imunska ćelija koja reaguje na gubitak heterozigotnosti u ćeliji kancera, koja obuhvata: a. prvi receptor, opciono himerni antigenski receptor (CAR) ili T-ćelijski receptor (TCR), koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za ciljni antigen izabran od:
i. antigena specifičnog za ćelije kancera ili njegovog antigena peptida u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I) ili
ii. receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) ili njegovog antigena peptida u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I) i
b. drugi receptor, opciono inhibitorni receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za neciljni antigen koji je izgubljen u ćeliji kancera usled gubitka heterozigotnosti.
[0583] Stavka 89. Postupak prema stavki 88, u kom neciljni antigen obuhvata polimorfizam.
[0584] Stavka 90. Imunska ćelija prema stavki 89, u kom neciljni antigen obuhvata COLEC12 antigen koji deli najmanje 95% identiteta sa SEQ ID NO: 8 i polimorfizam obuhvata S ili P na položaju 522 SEQ ID NO: 87.
[0585] Stavka 91. Imunska ćelija prema stavki 89, u kom neciljni antigen obuhvata APCDD1 antigen koji deli najmanje 95% identiteta sa SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 134 ili SEQ ID NO: 135 i polimorfizam je odabran iz grupe koju čine:
a. A, V, I ili L na položaju 150 SEQ ID NO: 88;
b. Y ili S na položaju 165 SEQ ID NO: 134 i
c. A, Q ili R na položaju 28 SEQ ID NO: 135.
[0586] Stavka 92. Imunska ćelija prema stavki 89, pri čemu neciljni antigen obuhvata CXCL16 antigen koji deli najmanje 95% identiteta sa SEQ ID NO: 86 i polimorfizam je odabran iz grupe koju čine:
a. I ili T na položaju 142 SEQ ID NO: 86 i
b. A ili V na položaju 200 SEQ ID NO: 86.
[0587] Stavka 93. Imunska ćelija prema stavki 88 ili 89, pri čemu neciljni antigen obuhvata HLA-A*02.
[0588] Stavka 94. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-93, pri čemu ciljni antigen eksprimuje ćelija kancera.
[0589] Stavka 95. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-94, pri čemu neciljni antigen ne eksprimuje ćelija kancera.
[0590] Stavka 96. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-95, pri čemu neciljni antigen eksprimuje neciljna ćelija.
[0591] Stavka 97. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-96, pri čemu neciljna ćelija eksprimuje i ciljni antigen i neciljni antigen.
[0592] Stavka 98. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-97, pri čemu ciljni antigen predstavlja antigen specifičan za ćelije kancera.
[0593] Stavka 99. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-98, pri čemu ciljni antigen predstavlja antigen peptida antigena specifičnog za ćelije kancera u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I).
[0594] Stavka 100. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-99, pri čemu ćelija kancera predstavlja ćeliju kancera pluća, ćeliju glioblastoma, ćeliju kancera dojke, ćeliju kancera glave i vrata ili ćeliju kolorektalnog kancera.
[0595] Stavka 101. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-100, pri čemu ćelija kancera eksprimuje EGFR.
[0596] Stavka 102. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-101, u kojoj prvi receptor i drugi receptor zajedno specifično aktiviraju imunsku ćeliju u prisustvu ćelije kancera.
[0597] Stavka 103. Imunska ćelija prema stavki 102, pri čemu je imunska ćelija T-ćelija, makrofag, NK ćelija, iNKT-ćelija ili gama delta T-ćelija.
[0598] Stavka 104. Imunska ćelija prema stavki 103, pri čemu je T-ćelija CD8+ CD4- T-ćelija.
[0599] Stavka 105. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-104, pri čemu EGFR obuhvata sekvencu koja deli najmanje 95% identiteta sa bilo kojom od SEQ ID NO: 1-8.
[0600] Stavka 106. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-105, u kojoj je prvi receptor T-ćelijski receptor (TCR).
[0601] Stavka 107. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-106, u kojoj je prvi receptor himerni antigenski receptor (CAR).
[0602] Stavka 108. Imunska ćelija prema stavki 106 ili 107, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata fragment antitela, jednolančani Fv fragment antitela (scFv), varijabilni domen β lanca (Vβ) ili varijabilni domen lakog α lanca TCR-a i varijabilni domen β lanca TCR-a.
[0603] Stavka 109. Imunska ćelija prema stavki 106 ili 107, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata scFv.
[0604] Stavka 110. Imunska ćelija prema stavki 109, u kojoj scFv obuhvata sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 9-18 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična.
[0605] Stavka 111. Imunska ćelija prema stavki 109, u kojoj scFv obuhvata ili se suštinski sastoji od sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 9-18.
[0606] Stavka 112. Imunska ćelija prema stavki 106 ili 107, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata VH i VL domen.
[0607] Stavka 113. Imunska ćelija prema stavki 112, u kojoj VH domen obuhvata sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 19-24 ili VH sekvencu navedenu u tabeli 2 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična.
[0608] Stavka 114. Imunska ćelija prema stavki 112, u kojoj VH domen obuhvata ili se suštinski sastoji od sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 19-24 ili VH sekvence navedene u tabeli 2.
[0609] Stavka 115. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 112-114, u kojoj VL domen obuhvata sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 25-30 ili VH sekvencu navedenu u tabeli 2 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična.
[0610] Stavka 116. Ćelija prema bilo kojoj od stavki 112-114, u kojoj VL domen obuhvata ili se suštinski sastoji od sekvence odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 25-30 ili VL sekvence navedene u tabeli 2.
[0611] Stavka 117. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 105-107, u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDR) odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 31-65 ili CDR sekvencu otkrivenu u tabeli 3.
[0612] Stavka 118. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-117, gde ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata fragment antitela, jednolančani Fv fragment antitela (scFv), varijabilni domen β lanca (Vβ) ili varijabilni domen α lanca TCR-a i varijabilni domen β lanca TCR-a.
[0613] Stavka 119. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88 ili 93-118, gde ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata scFv.
[0614] Stavka 120. Imunska ćelija prema stavki 119, u kojoj scFv obuhvata sekvencu sa najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identiteta sa bilo kojom od SEQ ID NO: 89-100.
[0615] Stavka 121. Imunska ćelija prema stavki 119, u kojoj scFv obuhvata ili se suštinski sastoji od sekvence iz bilo koje od SEQ ID NO: 89-100.
[0616] Stavka 122. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88 ili 93-118, gde ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata CDR odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 101-112.
[0617] Stavka 123. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-122, u kojoj drugi receptor obuhvata LILRB1 intracelularni domen ili njegovu funkcionalnu varijantu.
[0618] Stavka 124. Imunska ćelija prema stavki 123, u kojoj LILRB1 intracelularni domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 124.
[0619] Stavka 125. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-124, u kojoj drugi receptor obuhvata LILRB1 transmembranski domen ili njegovu funkcionalnu varijantu.
[0620] Stavka 126. Imunska ćelija prema stavki 125, u kojoj LILRB1 transmembranski domen ili njegova funkcionalna varijanta obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 133.
[0621] Stavka 127. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-126, u kojoj drugi receptor obuhvata LILRB1 zglobni domen ili funkcionalni fragment ili njegovu varijantu.
[0622] Stavka 128. Imunska ćelija prema stavki 127, u kojoj LILRB1 zglobni domen obuhvata sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 125 ili SEQ ID NO: 126.
[0623] Stavka 129. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-128, u kojoj drugi receptor obuhvata LILRB1 intracelularni domen i LILRB1 transmembranski domen ili njegovu funkcionalnu varijantu.
[0624] Stavka 130. Imunska ćelija prema stavki 129, u kojoj LILRB1 intracelularni domen i LILRB1 transmembranski domen obuhvataju SEQ ID NO: 128 ili sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 128.
[0625] Stavka 131. Imunska ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-130, u kojoj imunska ćelija je T-ćelija, makrofag, NK ćelija, iNKT-ćelija ili gama delta T-ćelija.
[0626] Stavka 132. Imunska ćelija prema stavki 131, u kojoj T-ćelija je CD8+ CD4- T-ćelija.
[0627] Stavka 133. Farmaceutska kompozicija, koja obuhvata terapijski efikasnu količinu imunskih ćelija prema bilo kojoj od stavki 88-132.
[0628] Stavka 134. Farmaceutska kompozicija prema stavki 133, koja dodatno obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.
[0629] Stavka 135. Farmaceutska kompozicija prema stavki 133 ili 134, za upotrebu kao lek u lečenju kancera.
[0630] Stavka 136. Polinukleotidni sistem, koji obuhvata polinukleotide koji obuhvataju polinukleotidne sekvence koje kodiraju:
a. prvi receptor, opciono himerni antigenski receptor (CAR) ILI T-ćelijski receptor (TCR), koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za ciljni antigen izabran od:
i. antigena specifičnog za ćelije kancera ili njegovog antigena peptida u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I) ili
ii. receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) ili njegovog antigena peptida u kompleksu sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti klase I (MHC-I) i
b. drugi receptor, opciono inhibitorni receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za neciljni antigen koji je izgubljen u ćeliji kancera usled gubitka heterozigotnosti.
[0631] Stavka 137. Polinukleotidni sistem prema stavki 136, pri čemu neciljni antigen obuhvata polimorfizam.
[0632] Stavka 138. Polinukleotidni sistem prema stavki 137, pri čemu je neciljni antigen COLEC12 antigen koji deli najmanje 95% identiteta sa SEQ ID NO: 87 i polimorfizam obuhvata S ili P na položaju 522 SEQ ID NO: 87.
[0633] Stavka 139. Polinukleotidni sistem prema stavki 137, pri čemu je neciljni antigen APCDD1 antigen koji deli najmanje 95% identiteta sa SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 134 ili SEQ ID NO: 135 i polimorfizam je odabran iz grupe koju čine:
a. A, V, I ili L na položaju 150 SEQ ID NO: 88;
b. Y ili S na položaju 165 SEQ ID NO: 134 i
c. A, Q ili R na položaju 28 SEQ ID NO: 135.
[0634] Stavka 140. Polinukleotidni sistem prema stavki 137, pri čemu je neciljni antigen CXCL16 antigen koji deli najmanje 95% identiteta sa SEQ ID NO: 86 i polimorfizam je odabran iz grupe koju čine:
a. I ili T na položaju 142 SEQ ID NO: 86 i
b. A ili V na položaju 200 SEQ ID NO: 86.
[0635] Stavka 141. Polinukleotidni sistem prema stavki 136 ili 137, pri čemu je neciljni antigen HLA-A*02.
[0636] Stavka 142. Vektor, koji obuhvata jedan polinukleotid ili više njih prema bilo kojoj od stavki 136-141.
[0637] Stavka 143. Postupak za ubijanje većeg broja ćelija kancera i/ili lečenja kancer kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu efikasne količine imunske ćelije prema bilo kojoj od stavki 88-132 ili farmaceutske kompozicije prema bilo kojoj od stavki 46-48.
[0638] Stavka 144. Upotreba imunskih ćelija u postupku prema stavki143, u kojoj veći broj ćelija kancera eksprimuje ciljni antigen.
[0639] Stavka 145. Postupak prema stavki 143 ili 144, u kom veći broj ćelija kancera ne eksprimuje neciljni antigen.
[0640] Stavka 146. Postupak za izradu većeg broja imunskih ćelija, koji obuhvata:
a. obezbeđivanje većeg broja imunskih ćelija i
b. transformisanje većeg broja imunskih ćelija polinukleotidnim sistemom prema bilo kojoj od stavki 136-141 ili vektorom prema stavki 142.
[0641] Stavka 147. Komplet koji obuhvata imunsku ćeliju prema bilo kojoj od stavki 88-132 ili farmaceutsku kompoziciju prema bilo kojoj od stavki 133-135.
[0642] Stavka 148. Komplet prema stavki 147, koji dodatno obuhvata uputstva za upotrebu.
PRIMERI
[0643] U primerima se za opisivanje neciljnog antigena koristi pojam „antigen blokatoraˮ.
Primer 1: Identifikacija blokatorskih ciljeva izgubljenih kod ćelija kancera usled gubitka heterozigotnosti
[0644] Bioinformatički algoritmi su korišćeni za identifikaciju kandidata blokatorskih ciljeva. Skup humanih gena je pretražen za gene sa uobičajenim nesinonimnim varijantama u ekstracelularnim domenima koji imaju visok gubitak heterozigotnosti (veći od 0,5) kod kolorektalnih kancera. Geni sa nesinonimnim varijantama su pretraženi u dbSNP-u, bazi podataka jednonukleotidnih polimorfizama, koja takođe uključuje manja umetanja i brisanja, zajedno sa informacijama o publikaciji, učestalosti u populaciji, molekulskim posledicama i genomskom mapiranju. Uobičajene varijacije su definisane kao one sa učestalošću manje ili najmanje zastupljenih alela (MAF) većom od ili tačno 0,01 u najmanje jednoj značajnoj populaciji i sa najmanje dvema nepovezanim osobama koje imaju manje ili najmanje zastupljen alel u NCBI. MAF veća od ili tačno 0,1 predstavlja kriterijum za uobičajene varijacije. Fokus je bio na hromozomima 17 i 18, s obzirom da ti hromozomi imaju visok LOH kod kolorektalnih kancera. Geni su filtrirani po membranskim proteinima, ekspresiji u kolonu i uobičajenim nesinonimnim varijantama u ekstracelularnim domenima, kao što je prethodno opisano. Pregled postupka pretrage prikazan je na FIG.18.
[0645] Dodatne baze podataka koje su korišćene u ovom otkrivanju uključuju sledeće: Uniprot (The Universal Protein Resource), koja je korišćena kao resurs za proteinske sekvence i podatke o anotaciji koji se čuvaju kod EMBL-EBI, SIB i PIR. GTEx (The Genotype-Tissue Expression) korišćena je kao javni resurs za ekspresiju i regulaciju gena specifičnog za tkivo. On sadrži uzorke sa 54 mesta neobolelih tkiva od skoro 1000 osoba. TCGA (The Cancer Genome Atlas) korišćena je kao resurs za preko 20.000 uzoraka primarnih kancera i uparenih normalnih uzoraka kancera koji obuhvataju 33 vrste kancera. TCGA-COADREAD skup podataka je skup podataka o adenokarcinomu debelog creva i adenokarcinomu rektuma. CCLE (Cancer cell line Encyclopedia) sadrži informacije o 57 ćelijskih linija kolorektalnog kancera (CRC).
[0646] RNKSeqDB je baza obrađenih podataka iz GTEx-a i TCGA uz upotrebu istih algoritama, što omogućava komparativne studije iz Memorial Sloan Kettering Cancer Centre-a. Analizirano je 372 uzorka TCGA-COADREAD i 339 normalnih uzoraka kolona iz GTEx-a.
[0647] COLEC12, CXCL16 i APCDD1 identifikovani su kao potencijalni blokatorski ciljevi. Tabela 14 rezimira podatke o ekspresiji ovih gena kod kolorektalnih kancera. Podaci o ekspresiji iz UCSC Xena pretraživača (za TCGA) i uzoraka CCLE-a.
Tabela 14. Ekspresija
Naziv TCGA-Kolorektalni Srednja ekspresija _CCLE_ Kolon - Kolon -gena adenokarcinom (Srednji-FPKM kolorektalni_RPKM (57 ćelijskih Sigmoidno Poprečno
[0648] Tabela 15 rezimira varijante i učestalosti manje ili najmanje zastupljenih alela.
Tabela 15. Položaj, karakteristike i varijacija
Nazivi Sve varijante TCGA-Kolorektalni Položaj proteina Aminokiselinska MAF
Tabela 16. LOH frekvencije u raznim kancerima
Primer 2: Identifikacija blokatorskih ligand vezujućih domena
[0649] Ukoliko su CDR sekvence nepoznate, za kandidate antigena blokatora su sekvencirana javno dostupna antitela. Ukoliko nema dostupnih antitela za kandidate blokatorskih ciljeva, ta se antitela generišu imunizacijom miševa, pacova ili kunića prečišćenim proteinom (npr. COLEC12, CXCL16 i drugi ciljevi opisani u primerima). Serumi imunizovanih životinja koriste se za pretragu mAb-ova koji se vezuju za blokatorske ciljeve. Antitela za blokatorske ciljeve se takođe generišu korišćenjem sistema huTARG. Antitela sa željenom specifičnošću se zatim izoluju i sekvenciraju radi utvrđivanja CDR sekvenci.
[0650] CDR sekvence iz antitela za blokatorske ciljeve koriste se za generisanje scFv-a uz upotrebu standardnih tehnika molekularne biologije. Kandidati za scFv se spajaju sa inhibitornim receptoroskim zglobnim ili transmembranskim domenima kako bi se generisali inhibitorni receptori pomoću standardnih tehnika molekularne biologije. Kandidati za scFv se takođe spajaju sa zglobnim ili transmembranskim domenima receptora aktivatora (npr. CAR) kako bi se generisali receptori aktivatora pune dužine koji se koriste kao pozitivna kontrola za scFv vezivanje za ciljne antigene. Mogućnost kandidata za scFv da deluju u kontekstu inhibitornog receptora ispituje se u Jurkat ćelijama pomoću ispitivanja reportera NFAT-luciferaze.
Primer 3: Postupci za eksperimente aktiviranja Jurkat i primarnih T-ćelija
Ćelijska kultura
[0651] Jurkat ćelije koje kodiraju reportera NFAT Luciferaze dobijene su od BPS Bioscience. U kulturi su Jurkat ćelije održavane u RPMI podlozi sa dodatkom 10% FBS, 1% Pen/Strep i 0,4mg/mL G418/gentamicina. Sve ostale ćelijske linije korišćene u ovom ispitivanju dobijene su od ATCC i održavane kako je predloženo od strane ATCC.
Transfekcija Jurkat T-ćelija
[0652] Jurkat ćelije su privremeno transfektovane putem Neonskog elektroporacionog sistema (Lonza) u formatu od 100 µL prema protokolu proizvođača koristeći sledeća podešavanja: 3 impulsa, 1500V, 10 ms. Kotransfekcija je izvedena sa 1-3 µg aktivatorskog CAR ili TCR konstrukta i 1-3 µg konstrukata blokatora ili praznog vektora na 1e6 ćelija i oporavljena u RPMI podlozi sa dodatkom 20% toplotom inaktiviranog FBS-a i 0,1% Pen/Strep.
Ispitivanja aktiviranja Jurkat-NFAT-luciferaze
[0653] Jurkat ćelije su ponovo suspendovane u 15 µL RPMI sa dodatkom 10% toplotom inaktiviranog FBS-a i 0,1% Pen/Strep, dodate perlama opterećenim peptidima i kokultivisane 6 sati. Jednofazni sistem za analiziranje luciferaze (BPS Bioscience) korišćen je za procenu Jurkat luminescencije. Analize su izvedene u tehničkim duplikatima.
Transdukcija, širenje i obogaćivanje primarnih T-ćelija
[0654] Zamrznuti PBMC-ovi odmrznuti su u vodenoj kupki na 37°C i kultivisane pri 1e6 ćelija/mL u LymphoONE (Takara) sa 1% humanog seruma i aktivirane pomoću 1:100 T-ćelijskog TransAct (Miltenyi), uz dodatak 300 IU/ml IL-2. Nakon 24 sata, lentivirus je dodat PBMC-ovima pri MOI-ju od 5. PBMC-ovi su kultivisani još 2-3 dana radi širenja ćelija pod stimulacijom TransAct-a. Nakon širenja, aktivatorske i blokatorske transdukovane primarne T-ćelije obogaćene su pomoću antiPE mikroperli (Miltenyi) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, primarne T-ćelije su inkubirane sa EGFR-Fc (R&D Systems) pri razblaženju 1:25 tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi u MACS puferu (0,5% BSA 2mM EDTA u PBS-u). Ćelije su isprane tri puta u MACS puferu i inkubirane u sekundarnom antitelu (1:1200) 30 minuta na sobnoj temperaturi u MACS puferu. Zatim su ćelije inkubirane u antiPE mikroperlama i prošle kroz LS kolonu (Miltenyi)
Ispitivanja in vitro citotoksičnosti primarnih T-ćelija
[0655] Za ispitivanja citotoksičnosti sa pMHC ciljevima, obogaćene primarne T-ćelije su inkubirane sa HeLa ili HCT116 ciljnim ćelijama koje eksprimuju GFP ili RFP. Za „tumorskeˮ ćelije korišćene su WT HeLa ili HLA-A*02 nokautirane HCT116 ćelije, dok su za „normalneˮ ćelije korišćene HLA-A*02 transdukovane HeLa ili WT HCT116 ćelije. Kokulture su snimljene pomoću IncuCyte uređaja za snimanje ćelija uživo, dok je površina fluorescentne obojenosti ciljnih ćelija korišćena za kvantifikaciju živih ciljnih ćelija.
Primer 4: HLA-A*02 Inhibitorni receptor blokira EGFR posredovano aktiviranje Jurkat ćelija
[0656] Mogućnost inhibitornog receptora sa HLA-A-A* 02 antigen vezujućim domenom i LIR-1 ICD (C1765 (nije prema ovom pronalasku) ili C2162 (prema ovom pronalasku)) da blokira aktiviranje Jurkat ćelija koje eksprimuju CAR aktivator, EGFR antigen vezujućim domenom (npr. CT479 (nije prema ovom pronalasku), CT486 (nije prema ovom pronalasku) ili CT489 (prema ovom pronalasku)) ispitana je pomoću reporterskog sistema NFAT-luciferaze kao što je prethodno opisano. Kao ciljne ćelije korišćene su normalne HeLa tumorske ćelije, koje su bile EGFR+ i HLA-A*02-. EGFR+ / HLA-A*02- HeLa ćelije su takođe transdukovane polinukleotidom koji kodira HLA-A*02+ kako bi se generisale EGFR+ / HLA-A*02+ HeLa ćelije koje se koriste kao ciljne ćelije koje eksprimuju antigene i aktivatora i blokatora.
[0657] Kao što je prikazano na FIG.1A, ekspresija HLA-A*02 LIR-1 blokatora (C1765, nije prema ovom pronalasku) u Jurkat ćelijama koje eksprimuju EGFR CAR (CT479, nije prema ovom pronalasku) povećava CAR EMAXza > 5 puta u poređenju sa CAR Emax Jurkat ćelija koje ne eksprimuju blokator.
[0658] Dalje, uočeno je manje blokiranje pri nižim nivoima ekspresije HLA-A*02 na ciljnim ćelijama. Normalne HCT116 ćelije su EGFR+ i HLA-A*02+. Nivoi EGFR-a i HLA-A*02 analizirani su na HCT116 ćelijama i HeLa ćelijama koje su transdukovane polinukleotidima koji kodiraju HLA-A*02 pomoću antiEGFR antitela i antiHLA-A*02 antitela (BB7.2), nakon čega je izvršeno FACS sortiranje. Kao što je prikazano na FIG.2A i 2B, HCT116 ćelije imaju niže nivoe blokatorskog HLA-A*02 antigena od transdukovanih HeLa ćelija. Kada su Jurkat ćelije koje eksprimuju EGFR CAR i HLA-A*02 LIR-1 blokator bile izložene HCT116 ciljnim ćelijama koje eksprimuju EGFR i HLA-A*02 antigene, prisustvo HLA-A*02 LIR-1 blokatora povećava EMAXEGFR CAR za 1,8 puta (FIG.3B). Nasuprot tome, transdukovane HeLa ćelije, koje eksprimuju viši nivo HLA-A*02 antigena, mogle su da posreduju u porastu EGFR CAR EMAXod > 5 puta (FIG.1B, FIG.17B i FIG.3D). Kao kontrola, primećeno je minimalno aktiviranje EGFR nokaut HCT116 ćelijama (FIG.3A).
[0659] Odnos blokatora prema aktivatoru neophodan za postizanje 50% blokiranja korišćenjem EGFR CAR i HLA-A*02 LIR-1 blokatora ispitivan je korišćenjem sistema zasnovanog na mikrosferama, što je prikazano na FIG.4A i FIG.4B.
[0660] Da bi se utvrdio EC50 antigena aktivatora, aktivatorske perle su obložene antigenom aktivatora u različitim koncentracijama kako bi se utvrdio EC50. Svakoj je koncentraciji dodat nevažan protein kako bi ukupna koncentracija proteina bila ista, dok je konstantna količina perli dodata Jurkat efektorskim ćelijama koje eksprimuju EGFR CAR (FIG.4A).
[0661] Da bi se utvrdio IC50 antigen blokatora, perle su obložene antigenom aktivatora u EC50 koncentraciji (utvrđenoj na FIG.4A) i obložene antigenom blokatora u različitim koncentracijama. Svakoj je koncentraciji dodat nevažan protein kako bi ukupna koncentracija proteina ostala ista, dok je konstantna količina perli dodata Jurkat efektorskim ćelijama koje eksprimuju bilo EGFR CAR ili EGFR CAR i HLA-A*02 LIR-1 blokator (FIG.4B).
Primer 5: Karakterizacija specifičnih receptorskih parova
[0662] T-ćelije transfektovane bilo EGFR scFv CAR aktivatorom (CT-479 (nije prema ovom pronalasku), CT-482 (nije prema ovom pronalasku), CT-486 (nije prema ovom pronalasku), CT-487 (nije prema ovom pronalasku), CT-488 (nije prema ovom pronalasku) ili CT-489 (prema ovom pronalasku), kao što je naznačeno na FIG.5 i 7-9), ili EGFR scFv CAR aktivatorom i HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 inhibitorom (C1765 (nije prema ovom pronalasku) ili C2162 (prema ovom pronalasku)), bile su kokultivisane sa HeLa ciljnim ćelijama. Normalne HeLa ćelijske linije koje eksprimuju EGFR, ali ne i HLA-A*02, transdukovane su kako bi se eksprimovao HLA-A*02 inhibitorni receptorski cilj. Ćelije su kokultivisane u odnosu efektora i cilja (E) 1:1. U donjem desnom uglu FIG.5, prvo je naznačena ekspresija receptora efektorskih ćelija, dok je ekspresija HeLa ćelija u zagradi. Kao što se može videti sa FIG.5, primećen je različit stepen blokiranja kada je isti HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 inhibitor korišćen sa različitim receptorima EGFR aktivatora.
[0663] Ispitana je i mogućnost HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 inhibitora (C1765, nije prema ovom pronalasku) da blokira aktiviranje EGFR scFv CAR T-ćelija kokultivisanih sa HCT116 ćelijama koje eksprimuju samo EGFR (Cilj A) ili EGFR i HLA-A*02 (Cilj AB) (FIG.10). Kao i sa HeLa ćelijama, primećen je različit stepen blokiranja kada je isti HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 inhibitor korišćen sa različitim receptorima EGFR aktivatora.
[0664] Ispitana je i mogućnost HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 inhibitora (C1765, nije prema ovom pronalasku) da blokira EGFR scFv CAR aktiviranje Jurkat ćelija kada se Jurkat ćelije kokultivišu sa HeLa ciljnim ćelijama. Rezultati su prikazani na FIG.2. Slično rezultatima sa primarnim T-ćelijama, primećen je različit stepen blokiranja kada je isti HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 inhibitor korišćen sa različitim receptorima EGFR aktivatora.
[0665] Aktiviranje imunskih ćelija mereno je kod imunskih ćelija koje eksprimuju aktivator ili specifičan par aktivatora/blokatora u prisustvu ciljne ćelije koja eksprimuje samo aktivacioni ligand, ili ciljne ćelije koja eksprimuje i ligand aktivatora i blokirajući ligand (FIG.6A). Za ispitane parove CAR aktivatora i blokatora izračunati su odnosi selektivnosti (SR). SR se određuje izračunavanjem odnosa aktiviranja imunske ćelije koja eksprimuje par aktivatora/blokatora u prisustvu ciljne ćelije koja eksprimuje samo aktivacioni ligand, u odnosu na aktiviranje imunske ćelije koja eksprimuje par aktivatora/blokatora u prisustvu ciljne ćelije koja eksprimuje i ligand aktivatora i blokirajući ligand. Izabrani EGFR ciljni CAR aktivatori eksprimovani su kao par bilo sa humanizovanim blokatorom (C2162, prema ovom pronalasku) ili mišjim blokatorom (C1765, nije prema ovom pronalasku). Među EGFR ciljnim CAR aktivatorima uparenim sa humanizovanim blokatorom, odnos selektivnosti za CT489 (prema ovom pronalasku) dostigao je 24,2; odnos selektivnosti za CT486 (nije prema ovom pronalasku) dostigao je 17; odnos selektivnosti za CT487 (nije prema ovom pronalasku) dostigao je 5,0 i odnos selektivnosti za CT487 (nije prema ovom pronalasku) dostigao je 5,0. Među EGFR ciljnim CAR aktivatorima uparenim sa mišjim blokatorom, odnos selektivnosti za CT489 (prema ovom pronalasku) bio je 21,6; odnos selektivnosti za CT486 (nije prema ovom pronalasku) bio je 15,7; odnos selektivnosti za CT487 (nije prema ovom pronalasku) bio je 18,4 i odnos selektivnosti za CT487 (nije prema ovom pronalasku) bio je 21,2 (FIG.6A).
Maksimalno specifično ubijanje je takođe određeno za svaki od parova EGFR ciljnih receptora aktivatora i inhibitora. Za sve parove, specifično ubijanje je premašilo oko 60%, što ukazuje na to da izbor blokatora nije značajno uticao na aktiviranje T-ćelija EGFR ciljnim receptorima aktivatora. Međutim, uparivanje para specifičnog aktivatora i specifičnog blokatora imalo je uticaja na odnos selektivnosti, što ukazuje da nije predvidivo of-target ubijanje olakšano specifičnim parom receptora aktivatora/inhibitora.
[0666] Osetljivost aktivatora i blokatora određena je kod imunskih ćelija koje eksprimuju samo CAR aktivator ili CAR aktivator i bilo humanizovani blokator ili mišji blokator (FIG.6B). Da bi se odredila osetljivost aktivatora, imunske ćelije su inkubirane u prisustvu EGFR negativnih ciljnih ćelija. Pre inkubacije, ciljne ćelije su titrirane pomoću EGFR iRNK, što je dovelo do povećanja nivoa ekspresije EGFR-a (FIG.6B, levi panel). Da bi se odredila osetljivost blokatora, imunske ćelije su inkubirane u prisustvu HLA-A*02 negativnih ciljnih ćelija koje eksprimuju EGFR (oko 53.000 EGFR molekula po ćeliji). Pre inkubacije, ciljne ćelije su titrirane pomoću HLA-A*02 iRNK, što je dovelo do povećanja nivoa ekspresije HLA-A*02 (FIG.6B, desni panel). EC50 vrednosti su izračunate za svaki CAR aktivator i blokator u kombinaciji sa različitim CAR aktivatorima (tabela 5.1). Rezultati dodatno potvrđuju da specifični receptor aktivatora ima uticaj na osetljivost inhibitornog receptora.
Tabela 5.1
Primer 6: Inhibitorni receptori reverzibilno smanjuju površinski nivo receptora aktivatora kod T-ćelija
[0667] Primarne T-ćelije od dvaju HLA-A*02 negativnih davalaca transdukovane su EGFR scFv CAR aktivatorom (CT-479 (nije prema ovom pronalasku), CT-482 (nije prema ovom pronalasku), CT-486 (nije prema ovom pronalasku), CT-487 (nije prema ovom pronalasku) ili CT-488 (nije prema ovom pronalasku)) i HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 inhibitorom (C1765, nije prema ovom pronalasku). Transdukovane ćelije su obogaćene sortiranjem FACS-om na receptore blokatora i aktivatora ili dvostrukim kolonskim prečišćavanjem na receptore blokatora i aktivatora. Transdukovane T-ćelije kokultivisane su sa HeLa ciljnim ćelijama. Normalne HeLa ćelijske linije eksprimuju EGFR, ali ne i HLA-A*02, ali su transdukovane da eksprimuju HLA-A*02 inhibitorni receptorski cilj. Ćelije su kokultivisane u odnosu efektora prema cilju (E:T) 1:1. Površinska ekspresija EGFR CAR aktivatora analizirana je nakon 120 sati pomoću obeleženih peptida koji vezuju receptore aktivatora i inhibitora i fluorescencijom aktiviranog sortiranja ćelija.
Promena nivoa površinskog aktivatora nakon kokultivisanja sa HeLa ćelijama koje eksprimuju ligand i aktivatora i blokatora odgovarala je mogućnosti T-ćelija da ubiju ciljne ćelije (uporediti FIG.5 i FIG.11A).
[0668] T-ćelije koje eksprimuju CT-482 EGFR scFv CAR aktivator (nije prema ovom pronalasku) i HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 inhibitor (C1765, nije prema ovom pronalasku) kombinaciju, kokultivisane su sa HeLa ćelijama koje eksprimuju EGFR (Cilj A), HLA-A*02 (Cilj B), kombinacijom EGFR-a i HLA-A*02 na istoj ćeliji (Cilj AB), mešanom populacijom HeLa ćelija koje eksprimuju Cilj A i Cilj AB na različitim ćelijama ili mešanom populacijom HeLa ćelija koje eksprimuju Cilj B i Cilj AB na različitim ćelijama (FIG.12A-12B). T-ćelije su kultivisane sa HeLa ciljnim ćelijama u odnosu efektorske ćelija prema ciljnoj ćeliji 1:1. Kada su T-ćelije kokultivisane sa populacijom HeLa ćelija koje eksprimuju Cilj A plus Cilj AB, nivoi aktivatora su se smanjili, da bi se zatim oporavili (FIG.12A). Osim toga, antigeni aktivatora i blokatora moraju biti prisutni zajedno na istoj ćeliji da bi izazvali gubitak površinske ekspresije aktivatora na efektorskim T-ćelijama. Za razliku od aktivatora, ekspresija blokatora je uglavnom ostala nepromenjena (FIG.12B).
[0669] FIG.13 predstavlja šematski prikaz eksperimenta za utvrđivanje da li su gubitak citotoksičnosti, blokirajuća aktivnost i ekspresija receptora aktivatora od strane T-ćelija reverzibilni. T-ćelije koje eksprimuju EGFR scFv CAR receptor aktivatora (CT-487, nije prema ovom pronalasku) i HLA-A*02 PA2.1 scFv LIR1 (C1765, nije prema ovom pronalasku) inhibitorni receptor kokultivisane su sa HeLa ciljnim ćelijama koje eksprimuju receptorske ciljeve i aktivatora i inhibitora (AB). Nakon 3 dana kokultivisanja, HeLa ćelije su uklonjene koristeći antiEGFR kolonu i T-ćelije su bilo obojene za receptore aktivatora i inhibitora ili kokultivisane sa HeLa ćelijama koje eksprimuju samo EGFR aktivatorski cilj još dodatna 3 dana. Nakon dodatna 3 dana kokultivisanja, HeLa ćelije su ponovo uklonjene koristeći antiEGFR kolonu i T-ćelije su bilo obojene za receptore aktivatora i inhibitora ili su kokultivisane još dodatna 3 dana sa HeLa ćelijama koje eksprimuju samo EGFR aktivatorski cilj ili i aktivatorski i blokatorski cilj (AB), pre bojenja. T-ćelije su analizirane na prisustvo receptora aktivatora i inhibitora (obojene) koristeći obeležene EGFR i A2 sonde, a nivoi ekspresije receptora su kvantifikovani korišćenjem fluorescentno aktiviranog sortiranja ćelija. Rezultati eksperimenta su prikazani na FIG.14A-14B. Kao što je prikazano na FIG.14A-14B, kokultivisanje T-ćelija sa HeLa ćelijama koje eksprimuju i aktivatorski i inhibitorski cilj redukuje bojenje EGFR aktivatora (FIG.14A-14B, levi panel). Kada su T-ćelije kokultivisane sa HeLa ćelijama koje eksprimuju samo aktivator (samo Cilj A) u rundi 2, rasla je ekspresija EGFR aktivatora. Dakle, gubitak površinske ekspresije aktivatora je reverzibilan i prati citotoksičnost T-ćelija.
[0670] FIG.15A-15B prikazuju rezultate dodatnog eksperimenta koji pokazuje da je gubitak ekspresije receptora aktivatora brzo reverzibilan. Membranska ekspresija CAR aktivatora smanjena je u T-ćelijama koje eksprimuju receptore i aktivatora i inhibitora kada su se te T-ćelije kokultivisale sa modelskim „normalnimˮ ćelijama koje eksprimuju ligand i aktivatora i inhibitora. Međutim, kada su T-ćelije prebačene u kokulturu sa modelskim „kancerskimˮ ćelijama koje samo eksprimuju ligand aktivatora, T-ćelije su mogle brzo (u roku od nekoliko sati) obnoviti membransku ekspresiju aktivatora CAR. Odsustvo modelskih „normalnihˮ ćelija koje eksprimuju ligand i aktivatora i inhibitora takođe je omogućilo obnovu membranske ekspresije aktivatora CAR, bez obzira na prisustvo tumorskih ćelija, u sličnom vremenskom okviru.
Primer 7: Inhibitorni receptori na bazi HLA-A*02 LIR-1 mogu da blokiraju aktiviranje EGFR CAR aktivatorom
[0671] Aktiviranje Jurkat efektorskih ćelija koje eksprimuju EGFR CAR aktivator i pMHC HLA-A*02 scFv LIR-1 bazirani inhibitorni receptor (koji obuhvata LIR-1 zglob, transmembranu i ICD) analizirano je ispitivanjem NFAT luciferaze opisanim u primeru 3.
[0672] Jurkat ćelije su transfektovane receptorom DNK aktivatora i inhibitora i aktiviranje je ispitano u analizi na bazi perli bez ćelija (FIG.16). Perle su opterećene bilo antigenom aktivatora, antigenom blokatora ili antigenima aktivatora i inhibitora, i odnos perli prema Jurkat ćelijama je varirao. U analizi na bazi perli bez ćelija, HLA-A*02 scFv LIR-1 inhibitorni receptor je mogao da blokira aktiviranje Jurkat ćelija kada su ćelije bile u kontaktu sa perlama koje nose HLA-A*02 blokator i EGFR aktivator u cis konfiguraciji, ali ne i kada su HLA-A*02 blokator i EGFR aktivator bili u trans konfiguraciji (na različitim kuglicama). Prisustvo HLA-A*02 blokatora na kuglicama je moglo da poveća EMAXEGFR CAR za više od ili tačno 9X (FIG.16).
[0673] Aktiviranje Jurkat ćelija koje eksprimuju EGFR CAR aktivator i HLA-A*02 scFv LIR-1 bazirani inhibitorni receptor takođe je analizirano korišćenjem HeLa i SiHa ćelija kao ciljnih ćelija. Normalne HeLa i SiHa ćelijske linije eksprimuju EGFR, ali ne i HLA-A*02 (SiHa WT i HeLa WT), ali su transdukovane da eksprimuju HLA-A*02 inhibitorni receptorski cilj (SiHa A02 i HeLa A02). Kao što se može videti na FIG. 17A i FIG.17B, HLA-A*02 scFv LIR-1 bazirani inhibitorni receptor je mogao da poveća EGFR EMAXza više od 4X pomoću SiHa ciljnih ćelija (FIG.17A) i više od 5X pomoću HeLa ciljnih ćelija (FIG.17B).
Primer 8: In vivo efikasnost receptora EGFR CAR aktivatora i inhibitora koji eksprimuje T-ćelije
[0674] Efikasnost i selektivnost tumorskih vs. normalnih ćelija za imunske ćelije koje eksprimuju parove receptora aktivatora (EGFR CAR) i inhibitornih receptora (blokatora) uspostavljeni su u in vivo okruženju (FIG.19). Korišćen je mišji model sa ksenotransplantatima u NSG (NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ) koristeći humane EGFR+/HLA-A*02+ HeLa ćelije kao predstavnika „normalnihˮ ćelija i izogene EGFR+/HLA-A*02(-) nokaut HeLa ćelije kao „tumorskeˮ ćelije. In vivo terapijski prozor uspostavljen je upoređivanjem efekta parova receptora aktivatora/inhibitora na normalne vs. tumorske ćelije. Ti podaci pružaju in vivo podršku za on-target, of-tumorski terapijski prozor. Optimalne doze za parove receptora aktivatora/inhibitora uspostavljene su i optimizovane za osetljivost i selektivnost.
[0675] In vivo model podrazumeva potkožne ksenotranslpantate „normalnihˮ ćelija na desnom boku i „tumorskihˮ ćelija na levom boku. Imunske ćelije koje eksprimuju receptor aktivatora, par receptora aktivator/inhibitor ili netransdukovane kontrolne ćelije daju se životinjama u različitim vremenskim tačkama.
[0676] Životinje se prate u pogledu opšteg zdravstvenog stanja putem kliničkih posmatranja i uticaja na telesnu masu. Veličina tumorskih ksenotransplantata procenjuje se kaliperom i snimanjem. U svakoj vremenskoj tački, humane T-ćelije se broje pomoću protočne citometrije i procenjuju se površinski markeri uključujući CD3, CD4, CD8, ekspresija receptora aktivatora i inhibitornog receptora. Utvrđeni su nivoi citokina u serumu, uključujući IFNγ i interleukin-2 (IL-2). U analizi nakon smrti se histološki procenjuju tkiva specifična za protokol, uključujući mesto injekcije i tumor, na tumorske infiltrirajuće T-ćelije i ekspresiju antigena receptora aktivatora (npr. EGFR) i antigena blokatora (npr. HLA-A*02) od strane patologa sertifikovanog od strane ACVP.
Primer 9: B7 i HLA-A*11 su ligandi inhibitornog receptora (nije prema ovom pronalasku)
[0677] HLA-A*011 inhibitorni receptor napravljen je spajanjem scFv #4 (tabela) sa zglobom, TM i ICD izvedenim iz LIR-1. Genetski segmenti su kombinovani korišćenjem Golden gejt kloniranja i umetnuti su nishodno od humanog EF1alfa promotora koji se nalazi u lentivirusnom ekspresionom plazmidu.
[0678] Jurkat NFAT-luciferazne efektorske ćelije su transformisane kao što je opisano CAR aktivatorom, ili CAR aktivatorom i inhibitornim (blokatorskim) receptorom scFv #4 HLA-A011. Sekvence HLA-A011 inhibitornog receptora prikazane su u tabeli 9.1 u nastavku i kokultivisane su sa HeLa ćelijama koje eksprimuju i ligand aktivatora i HLA-A*011:01. Analize NFAT-luciferaze sprovedene su koristeći HeLa umesto ciljnih T2 ćelija.
[0679] Rezultati su prikazani na FIG.20A i FIG.20B. Kao što je prikazano na FIG.20A, scFv #4, kada je spojen sa zglobom, TM i ICD domenima LIR-1, može da inhibira aktiviranje Jurkat efektorskih ćelija kokultivisanih sa ciljnim ćelijama koje eksprimuju i ligand aktivatora i HLA-A*011.
Tabela 9.1. HLA-A*011 inhibitorne receptorske sekvence.
Naziv Proteinska sekvenca DNK sekvenca
[0680] Aktiviranje ćelija Jurkat NFAT luciferaze (JNL) mereno je u iRNK titracijskom analiziranju pomoću HeLa ćelije koje su transfektovane pomoću iRNK. HeLa ćelije su transfektovane serijski razblaženom iRNK koja kodira HLA-B*07:02. JNL ćelije su privremeno transfektovane EGFR aktivirajućim CAR-om i HLA-B*07 blokatorom (krug) ili negativnim kontrolnim vektorom (trougao). Funkcionalni odgovor je procenjen nakon 6 sati kokultivisanja. Rezultati prikazani na FIG.21 pokazuju da HLA-B*07 blokator blokira aktiviranje EGFR ciljajućih CAR-ova u prisustvu titriranog HLA-B*07:02, ali ne i u odsustvu blokatora.
Primer 10: Karakterizacija ekspresije receptora EGFR aktivatora i HLA-A*02 inhibitora u primarnim T-ćelijama
[0681] Da bi se obojio EGFR aktivator, primarne T-ćelije su inkubirane sa EGFR-Fc (R&D Systems) u razblaženju 1:25 tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi u FACS puferu (1% BSA u PBS-u). Ćelije su isprane 2 puta u FACS puferu i inkubirane sa antiFc antitelom (1:100) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi u FACS puferu. Da bi se obojio HLA-A*02 inhibitorni receptor, T-ćelije su inkubirane sa HLA-A*02 tetramerskom sondom tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi u FACS puferu. Ekspresija receptora je analizirana protočnom citometrijom nakon bojenja.
[0682] Primarne T-ćelije su transdukovane polinukleotidima koji kodiraju EGFR ciljajući receptor aktivatora i bilo humanog ili mišjeg HLA-A*02 koji cilja inhibitorni receptor. Ispitano je nekoliko specifičnih parova EGFR ciljajućih aktivatora i HLA-A*02 ciljajućih inhibitornih receptora. Transdukcija je izvršena bilo jednim vektorom koji kodira receptor i aktivatora i inhibitora, ili dvama vektorima, jednim koji kodira receptor aktivatora i drugim koji kodira inhibitorni receptor. Ćelije su analizirane sa obogaćivanjem i bez njega kako bi se utvrdio procenat ćelija koje eksprimuju receptor i aktivator i inhibitora (FIG.22).
[0683] U primarnim T-ćelijama transdukovanim dvama vektorima, jednim koji kodira receptor aktivatora i drugim koji kodira inhibitorni receptor, procenat ćelija u populaciji transdukovanih T-ćelija koje eksprimuju oba receptora bio je oko 22,5% (FIG.22A, levi panel) pre obogaćivanja. Nakon obogaćivanja, procenat ćelija u populaciji transdukovanih T-ćelija koje eksprimuju oba receptora povećao se na oko 91,6%.
[0684] U primarnim T-ćelijama transdukovanim jednim vektorom koji kodira i receptor aktivatora i receptor inhibitora, procenat ćelija u populaciji transdukovanih T-ćelija koje eksprimuju oba receptora bio je u opsegu između približno 6,29% i 13,2% pre obogaćivanja. Nakon obogaćivanja, procenat ćelija koje eksprimuju oba receptora je bio u opsegu od 22,6% do 82,8%. Procenat ćelija koje eksprimuju oba receptora zavisio je od specifičnog para receptora aktivatora i inhibitora.
Primer 11: Karakterizacija selektivnosti aktiviranja imunskih ćelija u primarnim T-ćelijama koje eksprimuju receptor aktivatora i inhibitora
[0685] Za analiziranje selektivne citotoksičnosti, obogaćene primarne T-ćelije inkubirane su sa HeLa ili HCT116 ciljnim ćelijama koje eksprimuju GFP ili RFP. Za „tumorskeˮ ćelije korišćene su WT HeLa ili HLA

Claims (14)

  1. A*02 nokautirane HCT116, dok su za „normalneˮ ćelije korišćene HLA-A*02 transdukovane HeLa ili WT HCT116. Kokulture su snimane koristeći IncuCyte uređaj za snimanje ćelija uživo, a fluorescentna oblast ciljnih ćelija korišćena je za kvantifikaciju živih ciljnih ćelija (FIG.23A). Za merenje selektivne citotoksičnosti u mešovitoj ciljnoj kulturi, RFP koje eksprimuju „tumorskeˮ WT HeLa ćelije i GFP koje eksprimuju „normalneˮ HeLa ćelije transdukovane pomoću HLA-A*02 mešane su u odnosu 1:1.
    Obogaćene primarne T-ćelije dodate su mešovitoj ciljnoj kulturi i snimljene pomoću IncuCyte uređaja za snimanje ćelija uživo i fluorescentna oblast ciljnih ćelija korišćena je za kvantifikaciju živih ciljnih ćelija. (FIG.23B).
    [0686] FIG.23A je niz grafika koji prikazuju procenat specifičnog ubijanja HeLa ciljnih ćelija ili HCT116 ciljnih ćelija od strane imunskih ćelija koje eksprimuju receptor EGFR aktivatora i HLA-A*02 scFv LIR1 inhibitorni receptor. Ciljne ćelije eksprimuju EGFR antigen (A), HLA-A*02 neciljni antigen (B) ili oba (AB). Imunske ćelije koje eksprimuju par receptora aktivatora/inhibitora inkubirane su sa ciljnim ćelijama u odnosu 1:1.
    [0687] FIG.23B predstavlja grafik i niz slika koje prikazuju specifično i selektivno ubijanje ciljnih ćelija imunskim ćelijama koje eksprimuju receptor EGFR aktivatora i HLA-A*02 scFv LIR1 inhibitorni receptor u mešovitoj kulturi kancerskih ćelija i normalnih ćelija. UTD = imunske ćelije bez receptora aktivatora ili inhibitorna; CAR = imunske ćelije koje eksprimuju samo receptor aktivatora; Tmod = imunske ćelije koje eksprimuju receptor i aktivatora i inhibitora.
    Primer 12: Karakterizacija selektivnosti aktiviranja imunskih ćelija u Jurkat ćelijama koje eksprimuju receptor aktivatora i inhibitora
    [0688] FIG.24 je dijagram koji prikazuje aktiviranje imunskih ćelija u Jurkat ćelijama (efektorima) koje eksprimuju receptor EGFR aktivatora (CAR) ili receptor EGFR aktivatora i HLA-A*02 inhibitorni receptor (Tmod). Jurkat ćelije su inkubirane sa panelom ciljnih ćelijskih linija koje eksprimuju HLA-A*02 bilo bez ekspresije EGFR-a ili eksprimuju HLA-A*02 sa EGFR-om. EGFR negativne ćelijske linije generisane su nokautiranjem EGFR-a pomoću CRISPR/Cas9. Tmod Jurkat efektorske ćelije nisu pokazale of-target aktiviranje kada su bile kokultivisane sa EGFR negativnim ćelijama.
    Patentni zahtevi
    1. Imunska ćelija, koja obuhvata:
    a. prvi receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR) i
    b. drugi receptor, koji obuhvata ekstracelularni ligand vezujući domen specifičan za neciljni antigen koji nestaje kod EGFR+ kancera usled gubitka heterozigotnosti,
    pri čemu prvi receptor predstavlja receptor aktivatora osetljiv na EGFR i pri čemu drugi receptor predstavlja inhibitorni receptor osetljiv na neciljni antigen, gde ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora specifično vezuje HLA-A*02 i
    pri čemu ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata regione koji određuju komplementarnost (CDR) CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 SEQ ID NO: 154, 155, 156, 151, 152 i 153 i
    gde ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata regione koji određuju komplementarnost CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 sekvence humanizovanog scFv vezujućeg domena C-002162 PA2.1.14 kao što je prikazano u tabeli 4, pri čemu je CDR-L1 sekvenca RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 101), CDR-L2 sekvenca je KVSNRFSGVPAR, CDR-L3 sekvenca je FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 103), CDR-H1 sekvenca je ASGYTFTSYHIH (SEQ ID NO: 104), CDR-H2 sekvenca je WIYPGNVNTEYNEKFKGK (SEQ ID NO: 105) i CDR-H3 sekvenca je EEITYAMDY (SEQ ID NO: 106),
    pri čemu imunska ćelija predstavlja CD8+ CD4- T-ćeliju ili CD8- CD4+ T-ćeliju.
  2. 2. Imunska ćelija prema zahtevu 1,
    u kojoj ekstracelularni ligand vezujući domen drugog receptora obuhvata SEQ ID NO: 93 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična.
  3. 3. Imunska ćelija prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, u kojoj prvi receptor predstavlja himerni antigenski receptor (CAR);
    pri čemu ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata varijabilni teški (VH) deo sa sekvencom odabranom iz VH sekvence izložene u SEQ ID NO: 149 i/ili varijabilni laki (VL) deo koji obuhvata sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 150 ili sekvence koje su im najmanje 70%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% identične i/ili
    gde ekstracelularni ligand vezujući domen prvog receptora obuhvata scFv sekvencu SEQ ID NO: 18 ili sekvencu koja joj je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična.
  4. 4. Imunska ćelija prema bilo kom od zahteva 1-3, u kojoj drugi receptor obuhvata LILRB1 intracelularni domen ili njegovu funkcionalnu varijantu, gde LILRB1 intracelularni domen opciono obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99% ili potpuno identična SEQ ID NO: 129;
    pri čemu drugi receptor obuhvata LILRB1 transmembranski domen ili njegovu funkcionalnu varijantu, gde LILRB1 transmembranski domen ili njegova funkcionalna varijanta opciono obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99% ili potpuno identična SEQ ID NO: 133 i/ili
    pri čemu drugi receptor obuhvata LILRB1 zglobni domen ili njegovu funkcionalnu varijantu, gde LILRB1 zglobni domen opciono obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99% ili potpuno identična SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 125 ili SEQ ID NO: 126.
  5. 5. Imunska ćelija prema bilo kom od zahteva 1-4, u kojoj drugi receptor obuhvata LILRB1 intracelularni domen, LILRB1 transmembranski domen, LILRB1 zglobni domen, funkcionalnu varijantu bilo kog od njih ili njihove kombinacije, gde LILRB1 intracelularni domen i LILRB1 transmembranski domen opciono obuhvataju SEQ ID NO: 128 ili sekvencu koja je najmanje 95% identična SEQ ID NO: 128.
  6. 6. Imunska ćelija prema bilo kom od zahteva 1-5, u kojoj je ekspresija i/ili funkcija gena MHC klase I redukovana ili eliminisana, gde gen MHC klase I opciono predstavlja beta-2-mikroglobulin (B2M) i/ili pri čemu ta imunska ćelija obuhvata polinukleotid koji obuhvata interferirajuću RNK, gde ta interferirajuća RNK obuhvata sekvencu koja je komplementarna sekvenci B2M iRNK (SEQ ID NO: 172), pri čemu ta interferirajuća RNK opciono može indukovati RNKi posredovanu degradaciju B2M iRNK.
  7. 7. Imunska ćelija prema zahtevu 6, u kojoj interferirajuća RNK predstavlja RNK sa strukturom ukosnice (shRNK) i gde shRNK opciono obuhvata:
    a. Prvu sekvencu, koja od 5’ kraja do 3’ kraja ima sekvencu koja je komplementarna sekvenci B2M iRNK i
    b. Drugu sekvencu, koja od 5’ kraja do 3’ kraja ima sekvencu koja je komplementarna prvoj sekvenci,
    pri čemu prva sekvenca i druga sekvenca obrazuju shRNK.
  8. 8. Imunska ćelija prema zahtevu 6, koja obuhvata jednu modifikaciju sekvence koja kodira B2M (SEQ ID NO: 170) ili više njih, pri čemu jedna modifikacija ili više njih opciono obuhvata(ju) jednu inaktivišuću mutaciju endogenog gena koji kodira B2M ili više njih, gde je(su) jedna inaktivišuća mutacija ili više njih opciono uvedena(e) endonukleazom koja je vođena nukleinskom kiselinom u kompleks sa najmanje jednom nukleinskom kiselinom vodičem (gNK) koja specifično cilja sekvencu endogenog gena koji kodira B2M (SEQ ID NO: 170).
  9. 9. Imunska ćelija prema bilo kom od zahteva 1-8, u kojoj:
    a. prvi receptor obuhvata SEQ ID NO: 177 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta i
    b. drugi receptor obuhvata SEQ ID NO: 174 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta.
  10. 10. Imunska ćelija prema bilo kom od zahteva 1-9, koja takođe obuhvata interferirajuću RNK, gde ta interferirajuća RNK obuhvata SEQ ID NO: 179 ili sekvencu koja sa njom deli najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta, pri čemu je imunska ćelija opciono autologna ili pri čemu je imunska ćelija opciono alogena.
  11. 11. Farmaceutska kompozicija, koja obuhvata terapijski efektivnu količinu imunskih ćelija prema bilo kom od zahteva 1-10.
  12. 12. Polinukleotid koji obuhvata polinukleotidne sekvence koje kodiraju prvi receptor i drugi receptor za stvaranje imunskih ćelija prema bilo kom od zahteva 1-10 ili vektor, koji obuhvata taj polinukleotid.
  13. 13. Imunska ćelija prema bilo kom od zahteva 1-10 za upotrebu u lečenju EGFR+ kancera, pri čemu EGFR+ kancer opciono predstavlja EGFR+ tumor sa gubitkom heterozigotnosti u lokusu koji kodira neciljni antigen i/ili gde EGFR+ kancer opciono obuhvata ćelije EGFR+ kancera sa gubitkom heterozigotnosti u lokusu MHC klase I,
    pri čemu je ćelija EGFR+ kancera opciono ćelija kancera pluća, ćelija sitnoćelijskog kancera pluća, ćelija nesitnoćelijskog kancera pluća, ćelija duktalnog karcinoma pankreasa, ćelija kolorektalnog kancera, ćelija kancera glave i vrata, ćelija adenokarcinoma jednjaka i želuca, ćelija kancera jajnika, ćelija multiformnog glioblastoma, ćelija karcinoma skvamoznih ćelija grlića materice, ćelija kancera bubrega, ćelija papilarnog kancera bubrega, ćelija svetloćelijskog karcinoma bubrega, ćelija kancera bešike, ćelija kancera dojke, ćelija kancera žučnih kanala, ćelija kancera jetre, ćelija kancera prostate, ćelija sarkoma, ćelija kancera štitne žlezde, ćelija kancera grudne žlezde, ćelija kancera želuca ili ćelija kancera materice.
  14. 14. Imunska ćelija za upotrebu prema zahtevu 13, u kojoj ćelija EGFR+ kancera predstavlja ćeliju kancera pluća;
    gde ćelija EGFR+ kancera predstavlja EGFR+/HLA-A*02-ćeliju kancera koja ne eksprimuje HLA-A*02 ili ćeliju kancera dobijenu od osobe sa HLA-A*02+, koja ne eksprimuje HLA-A*02; pri čemu je EGFR+/HLA-A*02-ćelija kancera opciono dobijena od EGFR+/HLA-A*02+ ćelije gubitkom heterozigotnosti na HLA-A što vodi gubitku HLA-A*02.
RS20240748A 2020-08-20 2021-08-19 Kompozicije i postupci za lečenje egfr pozitivnih kancera RS65802B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063068249P 2020-08-20 2020-08-20
US202063105639P 2020-10-26 2020-10-26
US202163230632P 2021-08-06 2021-08-06
PCT/US2021/046733 WO2022040444A1 (en) 2020-08-20 2021-08-19 Compositions and methods for treating egfr positive cancers
EP21769291.2A EP4058474B1 (en) 2020-08-20 2021-08-19 Compositions and methods for treating egfr positive cancers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65802B1 true RS65802B1 (sr) 2024-08-30

Family

ID=77711489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240748A RS65802B1 (sr) 2020-08-20 2021-08-19 Kompozicije i postupci za lečenje egfr pozitivnih kancera

Country Status (19)

Country Link
US (2) US11602544B2 (sr)
EP (2) EP4058474B1 (sr)
JP (2) JP7621461B2 (sr)
AU (1) AU2021328478A1 (sr)
BR (1) BR112023002668A2 (sr)
CA (1) CA3189510A1 (sr)
DK (1) DK4058474T3 (sr)
ES (1) ES2984902T3 (sr)
FI (1) FI4058474T3 (sr)
HR (1) HRP20240903T1 (sr)
HU (1) HUE067417T2 (sr)
IL (1) IL300629A (sr)
LT (1) LT4058474T (sr)
MX (1) MX2023002104A (sr)
PL (1) PL4058474T3 (sr)
PT (1) PT4058474T (sr)
RS (1) RS65802B1 (sr)
SI (1) SI4058474T1 (sr)
WO (1) WO2022040444A1 (sr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022040444A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating egfr positive cancers
WO2022212858A2 (en) * 2021-04-01 2022-10-06 A2 Biotherapeutics, Inc. Polypeptides targeting hla-a*11 and methods of use thereof
WO2025030141A1 (en) * 2023-08-02 2025-02-06 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating cancers with hla-a*03 loss of expression
WO2025085846A1 (en) * 2023-10-20 2025-04-24 A2 Biotherapeutics, Inc. Engineered interleukins and uses thereof
WO2025085867A1 (en) * 2023-10-20 2025-04-24 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating blood cancers

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
HK1047109A1 (zh) 1999-10-15 2003-02-07 University Of Massachusetts 作为指定基因干预工具的rna干预轨迹基因
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
KR20030032922A (ko) 2000-02-24 2003-04-26 싸이트 테라피스 인코포레이티드 세포의 동시 자극 및 농축
AU2001275474A1 (en) 2000-06-12 2001-12-24 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US20030170238A1 (en) 2002-03-07 2003-09-11 Gruenberg Micheal L. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
CA2559955C (en) 2004-03-15 2016-02-16 City Of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna
CA2560305C (en) * 2004-03-19 2016-07-05 Imclone Systems Incorporated Human anti-epidermal growth factor receptor antibody
WO2005118788A2 (en) 2004-05-27 2005-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
CA3285826A1 (en) 2012-02-22 2026-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for generating a persisting population of t cells useful for the treatment of cancer
AU2013266968B2 (en) 2012-05-25 2017-06-29 Emmanuelle CHARPENTIER Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription
US20150183877A1 (en) * 2012-07-18 2015-07-02 Eli Lilly And Company Multi-Specific IgG-(Fab)2 Constructs Containing T-Cell Receptor Constant Domains
CN113355357B (zh) 2012-12-12 2024-12-03 布罗德研究所有限公司 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
EP2840140B2 (en) 2012-12-12 2023-02-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas based method for mutation of prokaryotic cells
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014145252A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Milone Michael C Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
IL311390A (en) 2013-03-15 2024-05-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Preparations and methods for immunotherapy
EP3925618A1 (en) 2013-07-29 2021-12-22 2seventy bio, Inc. Multipartite signaling proteins and uses thereof
MX373687B (es) 2013-11-21 2020-07-07 Ucl Business Ltd Célula natural (nk)
AU2015214145A1 (en) 2014-02-04 2016-08-25 Kite Pharma. Inc. Methods for producing autologous T cells useful to treat B cell malignancies and other cancers and compositions thereof
JP6681837B2 (ja) * 2014-03-11 2020-04-15 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 同種移植に適合するｔ細胞を作製するための方法
WO2016075612A1 (en) 2014-11-12 2016-05-19 Rinat Neuroscience Corp. Inhibitory chimeric antigen receptors
CA2969384A1 (en) 2014-12-17 2016-06-23 Cellectis Inhibitory chimeric antigen receptor (icar or n-car) expressing non-t cell transduction domain
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
KR102624023B1 (ko) 2015-02-24 2024-01-11 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 결합-촉발된 전사 스위치 및 이들의 이용 방법
JP2018509148A (ja) 2015-03-11 2018-04-05 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 患者における持続性および／または生着を増加させるために同種ｔ細胞を改変する方法
AU2016243128A1 (en) 2015-03-27 2017-11-02 University Of Southern California HLA-G as a novel target for CAR T-cell immunotherapy
GB201509413D0 (en) 2015-06-01 2015-07-15 Ucl Business Plc Fusion protein
HK1255161A1 (zh) 2015-07-15 2019-08-09 Juno Therapeutics, Inc. 用於过继性细胞治疗的工程细胞
BR112018008442A2 (pt) 2015-11-05 2018-11-06 Juno Therapeutics Inc receptores quiméricos contendo domínios induto-res de traf e composições e métodos relacionados
US20210206826A1 (en) 2015-11-19 2021-07-08 The Regents Of The University Of California Conditionally repressible immune cell receptors and methods of use thereof
KR20180075689A (ko) 2015-11-23 2018-07-04 트르스티스 오브 보스톤 유니버시티 키메라 항원 수용체에 관한 방법 및 조성물
AU2016363696B2 (en) 2015-12-02 2021-05-20 Innovative Targeting Solutions Inc. Single variable domain T-cell receptors
JP2019509738A (ja) 2016-03-11 2019-04-11 ブルーバード バイオ， インコーポレイテッド ゲノム編集された免疫エフェクター細胞
AU2017286835B2 (en) 2016-06-29 2023-12-14 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing
EP3263595A1 (en) 2016-06-30 2018-01-03 Medizinische Hochschule Hannover Fusion protein for use in the treatment of hvg disease
BR112019006006A2 (pt) 2016-09-28 2019-06-25 Gavish-Galilee Bio Applications Ltd. molécula de ácido nucleico, vetor, métodos para preparação de um receptor de antígeno quimérico inibidor, para preparar uma célula imune efetora segura, para selecionar um biomarcador personalizado e para tratar o câncer em um paciente com um tumor, célula imune efetora segura, e, combinação de duas ou mais moléculas de ácido nucleico.
CN110582509A (zh) 2017-01-31 2019-12-17 诺华股份有限公司 使用具有多特异性的嵌合t细胞受体蛋白治疗癌症
US20190359678A1 (en) 2017-02-09 2019-11-28 The Regents Of The University Of California Chimeric t cell antigen receptors and methods of use thereof
GB201707779D0 (en) 2017-05-15 2017-06-28 Autolus Ltd Cell
JP7132249B2 (ja) 2017-05-15 2022-09-06 オートラス リミテッド キメラ抗原受容体（ｃａｒ）を含む細胞
GB201707783D0 (en) 2017-05-15 2017-06-28 Autolus Ltd Cell
SG11202002520UA (en) 2017-09-19 2020-04-29 Univ British Columbia Anti-hla-a2 antibodies and methods of using the same
WO2019068007A1 (en) 2017-09-28 2019-04-04 Immpact-Bio Ltd. UNIVERSAL PLATFORM FOR PREPARING AN INHIBITORY CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (ICAR)
EP3707166A4 (en) 2017-11-06 2021-11-24 Daniel J. Monticello CHEMICAL ANTIGENIC RECEPTOR SYSTEMS WITH NEGATIVE DOMINANT LIGAND
WO2019241549A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 A2 Biotherapeutics, Inc. Foxp3-expressing car-t regulatory cells
BR112021006100A2 (pt) 2018-09-28 2021-07-20 Immpact-Bio Ltd. métodos para identificação de pares de receptor de antígeno ativador (acar)/receptor de antígeno quimérico inibitório (icar) para uso em terapias de câncer
EP3632461A1 (en) 2018-10-05 2020-04-08 St. Anna Kinderkrebsforschung A group of chimeric antigen receptors (cars)
WO2020070290A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 St. Anna Kinderkrebsforschung A group of chimeric antigen receptors (cars)
CA3143519A1 (en) * 2019-06-26 2020-12-30 Volker Schellenberger Cd3 antigen binding fragments and compositions comprising same
MX2022001711A (es) * 2019-08-09 2022-05-10 A2 Biotherapeutics Inc Receptores en la superficie celular que responden a la perdida de heterocigosidad.
WO2021030153A2 (en) 2019-08-09 2021-02-18 A2 Biotherapeutics, Inc. Engineered t cell receptors and uses thereof
WO2021030182A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 A2 Biotherapeutics, Inc. Bifunctional single variable domain t cell receptors and uses thereof
JP2022546315A (ja) 2019-08-20 2022-11-04 センティ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド キメラ抑制性受容体
EP4058561A1 (en) 2019-11-12 2022-09-21 A2 Biotherapeutics, Inc. Engineered t cell receptors and uses thereof
CN115052887B (zh) 2019-12-11 2026-03-31 A2生物治疗公司 基于lilrb1的嵌合抗原受体
WO2021222576A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 A2 Biotherapeutics, Inc. Pag1 fusion proteins and methods of making and using same
WO2022040444A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating egfr positive cancers

Also Published As

Publication number Publication date
CA3189510A1 (en) 2022-02-24
US20220273721A1 (en) 2022-09-01
US11602544B2 (en) 2023-03-14
HRP20240903T1 (hr) 2024-10-11
AU2021328478A1 (en) 2023-04-20
EP4442815A3 (en) 2025-01-01
EP4058474A1 (en) 2022-09-21
JP2023538116A (ja) 2023-09-06
TW202214846A (zh) 2022-04-16
HUE067417T2 (hu) 2024-10-28
PT4058474T (pt) 2024-07-09
JP7621461B2 (ja) 2025-01-24
KR20230052289A (ko) 2023-04-19
BR112023002668A2 (pt) 2023-05-02
WO2022040444A1 (en) 2022-02-24
US20230277593A1 (en) 2023-09-07
IL300629A (en) 2023-04-01
PL4058474T3 (pl) 2024-09-23
EP4442815A2 (en) 2024-10-09
MX2023002104A (es) 2023-07-10
DK4058474T3 (da) 2024-07-22
JP2024159820A (ja) 2024-11-08
FI4058474T3 (fi) 2024-07-01
SI4058474T1 (sl) 2024-09-30
LT4058474T (lt) 2024-08-26
EP4058474B1 (en) 2024-05-08
ES2984902T3 (es) 2024-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7634653B2 (ja) メソテリン陽性がんを治療するための組成物及び方法
JP7657292B2 (ja) Ｃｅａｃａｍ陽性がんを治療するための組成物及び方法
EP4058474B1 (en) Compositions and methods for treating egfr positive cancers
US11730764B2 (en) Compositions and methods for treating HER2 positive cancers
WO2022040470A1 (en) Compositions and methods for treating ceacam positive cancers
WO2022115472A1 (en) Adoptive cell therapy for treatment of cancer associated with loss of heterozygosity
CN116635043A (zh) 用于治疗egfr阳性癌症的组合物和方法
US20250177445A1 (en) Engineered receptors specific to hla-e and methods of use
HK40080722B (en) Compositions and methods for treating egfr positive cancers
HK40080722A (en) Compositions and methods for treating egfr positive cancers
BR112023002871B1 (pt) Composição farmacêutica, uso da mesma para tratar cânceres positivos para ceacam e polinucleotídeo ou sistema de polinucleotídeos