RS65904B1

RS65904B1 - Polipeptidi koji regrutuju t ćelije na osnovu reaktivnosti cd3

Info

Publication number: RS65904B1
Application number: RS20240804A
Authority: RS
Inventors: Annelies Roobrouck; Hoorick Diane Van; Joao Vieira
Original assignee: Ablynx Nv
Priority date: 2015-05-13
Filing date: 2016-05-13
Publication date: 2024-09-30
Also published as: JP7163028B2; CN114920848B; EP3294319B1; CA2985700C; AU2016260909B2; JP7763804B2; FI3294319T3; US20250388672A1; EP4345112A2; US20210363251A1; CN114920847A; US20190382485A1; HUE067423T2; EP3294319A1; JP2018515107A; DK3294319T3; CN114920848A; EP4345112A3; JP7465833B2; JP2021090450A

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak obezbeđuje multispecifične polipeptide koji regrutuju T ćelije, kao što je definisano zahtevima, koji vezuju CD3 na T ćeliji i najmanje jedan antigen na ciljnoj ćeliji. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na jednovalentne polipeptide koji regrutuju T ćelije, kao što je definisano zahtevima, za upotrebu u ovim multispecifičnim polipeptidima. Ovo otkriće takođe obezbeđuje postupke za lečenje i komplete koji to obezbeđuju.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Kancer je uzrok smrti ogromnog broja ljudi širom sveta. Danas je to vodeći globalni uzrok smrti, praćen bolestima srca i moždanim udarom. Kancer je jedan od vodećih uzroka morbiditeta i mortaliteta širom sveta, sa približno 14 miliona novih slučajeva i 8,2 miliona smrtnih slučajeva povezanih sa kancerom u 2012. godini. Očekuje se da će broj novih slučajeva porasti za oko 70% tokom naredne 2 decenije (izvor: WHO Cancer). Ukupni ekonomski uticaj prerane smrti i invaliditeta od kancera širom sveta iznosio je oko 900 milijardi dolara u 2008. godini, što predstavlja 1,5% svetskog bruto domaćeg proizvoda.

[0003] Dostupni režimi lečenja za čvrste tumore obično uključuju kombinaciju hirurške resekcije i hemoterapije i radioterapije. Za 40 godina kliničkog iskustva nije postignut značajan napredak, naročito kod naprednih stadijuma kancera.

[0004] Željno se iščekuju nove terapije za borbu protiv kancera.

[0005] Terapija antitelima sada predstavlja važan deo arsenala lekara za borbu protiv bolesti, a posebno kancera. Monoklonska antitela su ustanovljena kao ključni terapeutski pristup za niz bolesti već nekoliko godina. Sve trenutno odobrene terapije antitelima se oslanjaju na monospecifična monoklonska antitela (mAb). Do danas, većina ciljeva za mAb zahteva agonistički ili antagonistički pristup. Mada ciljanje samih antigena na površini ćelija može posredovati antitumorsku aktivnosti putem indukcije apoptoze, većina aktivnosti na bazi mAb protiv hematoloških maligniteta oslanja se na jednu od Fc-posredovanih efektorskih funkcija kao što su citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) i ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC).

[0006] Imunoterapija se javila kao brzo rastuća oblast istraživanja kancera. Imunoterapija usmerava nadzorni imunski sistem tela, a posebno T ćelije, na ćelije kancera.

[0007] Citotoksične T ćelije (CTL) su T limfociti koji ubijaju ćelije kancera, ćelije koje su zaražene (posebno virusima) ili ćelije koje su oštećene na druge načine. T limfociti (ili T ćelije) eksprimiraju molekul T ćelijskog receptora ili TCR i CD3 receptor na površini ćelije. Kompleks αβ TCR-CD3 (ili „TCR kompleks“) sastoji se od šest različitih bitopskih transmembranskih proteina tipa I: TCRα i TCRβ lanaca koji formiraju TCR heterodimer odgovoran za prepoznavanje liganda, i nekovalentno povezanih CD3γ, CD3δ, CD3ε i ζ lanaca, koji nose motive citoplazmatskih sekvenci koji se fosforiluju nakon aktivacije receptora i regrutuju veliki broj signalnih komponenata (Call et al. 2004, Molecular Immunology 40: 1295-1305).

[0008] α i β lanci T ćelijskog receptora sastoje se od konstantnog domena i varijabilnog domena. Fiziološki, αβ lanci T ćelijskog receptora prepoznaju MHC kompleks koji se nalazi na peptidu i spajaju se nakon aktiviranja CD3 lanaca. Ovi CD3 lanci zatim transdukuju signal za aktiviranje u intracelularno okruženje.

[0009] Uzimajući u obzir potencijal prirodnih citotoksičnih T limfocita (CTL) da posreduju ćelijsku lizu, istraživane su različite strategije za regrutovanje CTL da posreduju u ubijanju ćelija tumora. Pošto T limfociti nemaju ekspresiju Fc receptora, oni se ne regrutuju na mesto tumora preko Fc repa antitumorskog monoklona. Alternativno, T ćelije pacijenta su modifikovane pomoću drugog TCR koji ima poznatu specifičnost za definisani tumorski antigen. Ovaj adoptivni ćelijski transfer je po prirodi veoma personalizovan i zahteva puno rada. Međutim, glavni problem terapije T ćelijama ostaje veliki broj mehanizama za izbegavanje imunskog sistema koji se javljaju kod pacijenata sa kancerom (Nagorsen et al.

2012, Pharmacology & Therapeutics 136: 334-342).

[0010] Umesto da izazivaju specifične odgovore T ćelija, koji se oslanjaju na ekspresiju molekula MHC od strane ćelija kancera i prisustvo, generisanje, transport i prikaz specifičnih peptidnih antigena, skorija istraživanja su pokušala da kombinuju prednosti imunoterapije sa terapijom antitelima tako što aktiviraju sve citotoksične T ćelije pacijenta na poliklonski način putem tehnologija zasnovanih na rekombinantnom antitelu: „bispecifičnih antitela“.

[0011] Bispecifična antitela su konstruisana tako da imaju deo za prepoznavanje tumora na jednom kraku (krak koji vezuje cilj), dok drugi krak molekula ima specifičnost za T ćelijski antigen (krak koji vezuje efektor), uglavnom CD3. Putem istovremenog vezivanja dva kraka za odgovarajuće ciljne antigene, T limfociti se usmeravaju ka ćeliji tumora i tu se aktiviraju tako da mogu da vrše svoju citolitičku funkciju.

[0012] Koncept korišćenja bispecifičnih antitela za aktiviranje T ćelija protiv ćelija tumora opisan je pre više od 20 godina, ali su problemi u proizvodnji i klinički neuspesi doveli do stagnacije ovog polja. Razvijena su bispecifična antitela manjeg formata koja lakše prodiru u tkiva i tumore nego konvencionalna antitela. Pored toga, manji format je bolji u stvaranju citotoksičnih sinapsi, koje ubijaju ciljnu ćeliju. Smatralo se da će bispecifična antitela manjeg formata biti lakša za proizvodnju i manje imunogena od konvencionalnih antitela. Međutim, manji bispecifični BiTE molekuli, koji se sastoje od dva jednolančana varijabilna fragmenta (scFv) spojena preko peptidnog linkera od 5 aminokiselina, pokazuju nedostatak stabilnosti (scFv imaju tendenciju da se agregiraju), nizak ekspresioni titar i slabu rastvorljivost. Štaviše, prva klinička ispitivanja blinatumomaba (BiTE molekul), koji prepoznaje lance CD3, prerano su zaustavljena zbog neuroloških neželjenih događaja, sindroma oslobađanja citokina i infekcija s jedne strane, kao i odsustva objektivnih kliničkih odgovora ili snažnih znakova biološke aktivnosti s druge strane. Izuzimajući efikasnost, BiTE moraju da se primenjuju u vidu kontinualne infuzije - verovatno zbog nedostatka Fc domena - što ne doprinosi komplijansi pacijenta. Isti problem važi i za DART-ove (molekuli za dvojno afinitetno preusmeravanje koje je razvila kompanija MacroGenics), u kojima je teški varijabilni domen jednog antitela (At) povezan sa lakim varijabilnim domenom drugog At. Kompanija MacroGenics sada pokušava da reši ovaj problem fuzionisanjem Fc domena sa DART sledeće generacije, što ne samo da čini molekul većim, već takođe dovodi do problema u proizvodnji i uvođenja drugih funkcija Fc. Veći format sa Fc će imati bolju PK, ali ponovo uvodi rizik od aktivnosti van ciljnog područja. (Garber 2014, Nature reviews 13: 799-801)

[0013] WO 2012/066058 A1 se odnosi na različita konvencionalna antitela specifična za CD3 koja mogu da se koriste kao izvor za CD3-vezujući domen.

[0014] WO 99/42077 A2 opisuje polipeptide koji vezuju CD3 i drugi cilj, npr. izabran od CD4-CD5, CD19-CD22 ili CD45.

[0015] Još uvek postoji potreba za alternativnim bispecifičnim formatima.

SAŽETAK PRONALASKA

[0016] Pronalazak kao što je definisan zahtevima rešava ovaj problem obezbeđivanjem multispecifičnih polipeptida definisanih zahtevima koji se sastoje od prvog i najmanje jednog dodatnog pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina (ISV), pri čemu pomenuti prvi ISV ima visok afinitet prema / vezuje se za CD3; pomenuti najmanje jedan dodatni ISV ima visok afinitet prema / vezuje se za antigen prisutan na ciljnoj ćeliji. U određenom aspektu, vezivanje prvog ISV će aktivirati svojstveni citolitički potencijal T ćelije u odnosu na ciljnu ćeliju nezavisno od MHC1.

[0017] Tako, u prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži prvi i drugi pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), pri čemu

• pomenuti prvi ISV ima visok afinitet prema/vezuje se za klaster diferencijacije 3 (CD3) prisutan na T ćeliji

• pomenuti drugi ISV ima visok afinitet prema / vezuje se za prvi antigen na ciljnoj ćeliji;

pri čemu, pomenuti prvi antigen je različit od pomenutog CD3; i

pri čemu, pomenuta ciljna ćelija je različita od pomenute T ćelije,

pri čemu, pomenuti prvi ISV se suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 81-87; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ. ID NO: 81; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 101-109; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 101; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 123-127; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 123.

[0018] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid usmerava T-ćeliju na ciljnu ćeliju.

[0019] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid indukuje aktivaciju T ćelija.

[0020] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, aktivacija T ćelija je nezavisna od prepoznavanja MHC.

[0021] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuta aktivacija T ćelija zavisi od prezentovanja T ćeliji pomenutog polipeptida vezanog za prvi antigen na ciljnoj ćeliji.

[0022] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu aktivacija T ćelija izaziva jedan ili više ćelijskih odgovora pomenute T ćelije, pri čemu, pomenuti ćelijski odgovor je odabran iz grupe koja se sastoji od proliferacije, diferencijacije, sekrecije citokina, oslobađanja citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksične aktivnosti, ekspresije aktivacionih markera i preusmerene lize ciljnih ćelija.

[0023] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuta aktivacija T ćelija izaziva inhibiciju aktivnosti pomenute ciljne ćelije za više od oko 10%, na primer 20%, 30%, ili 40% ili čak više od 50%, na primer više od 60%, recimo 70%, 80% ili čak više od 90%, na primer 100%.

[0024] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti prvi ISV se vezuje za CD3γ (SEQ ID NO: 292), za CD3δ (SEQ ID NO: 291) i/ili CD3ε (SEQ ID NO: 293) TCR kompleksa, ili za njihove polimorfne varijante ili izooblike.

[0025] Alternativno, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti prvi ISV se vezuje za CD3γ (SEQ ID NO: 379), za CD3δ (SEQ ID NO: 291) i/ili CD3ε (SEQ ID NO: 380) TCR kompleksa, ili za njihove polimorfne varijante ili izooblike.

[0026] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid i/ili prvi ISV ima konstantu brzine asocijacije (Kon) za vezivanje za pomenuti CD3 izabranu iz grupe koja obuhvata najmanje oko 10<2>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<3>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<4>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<5>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<6>M<-1>s<-1>, 10<7>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<8>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<9>M<-1>s<-1>, i najmanje oko 10<10>M<-1>s<-1>, poželjno kao što je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom.

[0027] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid i/ili prvi ISV ima konstantu brzine disocijacije (Koff) za vezivanje za pomenuti CD3 izabranu iz grupe koja obuhvata najviše oko 10<-3>s<-1>, najviše oko 10<-4>s<-1>, najviše oko 10<-5>s<-1>, najviše oko 10<-6>s<-1>, najviše oko 10<-7>s<-1>, najviše oko 10<-8>s<-1>, najviše oko 10<-9>s<-1>, i najviše oko 10<-10>s<-1>, poželjno kao što je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom.

[0028] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti prvi ISV se vezuje za pomenuti CD3 sa vrednošću EC50 od 100 nM do 1 pM, kao što je prosečna vrednost EC50 od 100 nM ili manja, još poželjnije sa prosečnom vrednošću EC50 od 90 nM ili manjom, kao što je manje od 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM ili čak i manje, kao što je manje od 4, 3, 2 ili 1 nM ili čak i manje, kao što je manje od 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 pM, ili čak i manje, kao što je manje od 4 pM, poželjno izmereno protočnom citometrijom.

[0029] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti prvi ISV se vezuje za pomenuti CD3 sa prosečnom vrednošću KD od 100 nM do 10 pM, kao što je prosečna vrednost KD od 90 nM ili manje, još poželjnije sa prosečnom vrednošću KD od 80 nM ili manjom, kao što je manje od 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM ili čak i manje, kao što je manje od 4, 3, 2 ili 1 nM, kao što je manje od 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 pM ili čak i manje, recimo manje od 10 pM. KD se poželjno određuje putem SPR, na primer kao što određuje Proteon.

[0030] Predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 81-87; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 81; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 101-109; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 123-127; i

[0031] U daljem aspektu, predmetni prolazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 81-87; ili (b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 81, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR1 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR1 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 101-109; ili (d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 101, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR2 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR2 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 123-127; ili (f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 123, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR3 sa 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR3 bez 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0032] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome je CDR1 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 81; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1 ili 2 aminokiseline razlike u odnosu na SEQ ID NO: 81, pri čemu

o na poziciji 1, G je promenjeno u R;

o na poziciji 3, T je promenjeno u A;

o na poziciji 4, Y je promenjeno u F;

o na poziciji 8, S je promenjeno u G; i/ili

o na poziciji 10, G je promenjeno u A.

[0033] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome je CDR2 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 101; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1, 2 ili 3 aminokiseline razlike u odnosu na SEQ ID NO: 101, pri čemu

o na poziciji 3, V je promenjeno u T ili A;

o na poziciji 5, S je promenjeno u T;

o na poziciji 6, G je promenjeno u D ili E; i/ili

o na poziciji 9, T je promenjeno u S, A ili P.

[0034] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome je CDR3 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 123; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1 ili 2 aminokiseline razlike u odnosu na SEQ ID NO: 123, pri čemu

o na poziciji 2, I je promenjeno u T;

o na poziciji 9, I je promenjeno u V; i/ili

o na poziciji 10, A je promenjeno u P.

[0035] Poželjno, polipeptid koji obuhvata jedan ili više CDR sa 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR bez 3, 2 ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0036] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 81; i

− na poziciji 1, G je promenjeno u R;

− na poziciji 3, T je promenjeno u A;

− na poziciji 4, Y je promenjeno u F;

− na poziciji 8, S je promenjeno u G; i/ili

− na poziciji 10, G je promenjeno u A,

pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR1 sa 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR1 bez 2 ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom;

i u kome

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 101; i

− na poziciji 3, V je promenjeno u T ili A;

− na poziciji 5, S je promenjeno u T;

− na poziciji 6, G je promenjeno u D ili E; i/ili

− na poziciji 9, T je promenjeno u S, A ili P,

pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR2 sa 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR2 bez 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom;

i u kome

(iii) CDR3 se bira iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 123; i

− na poziciji 2, I je promenjeno u T;

− na poziciji 9, I je promenjeno u V; i/ili

− na poziciji 10, A je promenjeno u P,

pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR3 sa 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR3 bez 2 ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0037] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 81, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 101, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 123.

[0038] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, u kome je pomenuti prvi ISV izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-50.

[0039] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, u kome pomenuti prvi ISV unakrsno blokira vezivanje za CD3 putem najmanje jednog polipeptida sa SEQ ID NO: 1-50.

[0040] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, u kome je pomenuti prvi ISV unakrsno blokiran u pogledu vezivanja za CD3 putem najmanje jednog polipeptida sa SEQ ID NO: 1-50.

[0041] Ovde je otkriven, ali ne predstavlja deo ovog pronalaska, polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR1 je SEQ ID NO: 88.

[0042] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR2 je SEQ ID NO: 110.

[0043] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR3 je SEQ ID NO: 128.

[0044] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, pri čemu, pomenuti prvi ISV suštinski se sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 88; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 1, 2, 3 ili 4 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 88; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 110; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 1, 2, 3 ili 4 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 110; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 128; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 1, 2, 3 ili 4 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 128.

[0045] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 88; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 88, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR1 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR1 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 110; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 110, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR2 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR2 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 128; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 128, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR3 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR3 bez 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0046] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 88, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 110, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 128.

[0047] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome, pomenuti prvi ISV je SEQ ID NO: 51.

[0048] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome pomenuti prvi ISV unakrsno blokira vezivanje za CD3 putem polipeptida sa SEQ ID NO: 51.

[0049] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome je pomenuti prvi ISV unakrsno blokiran u pogledu vezivanja za CD3 putem polipeptida sa SEQ ID NO: 51.

[0050] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR1 je SEQ ID NO: 90.

[0051] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome je CDR2 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 112; i

(b) aminokiselinske sekvence koja ima 1 aminokiselinu razlike u odnosu na SEQ ID NO:

112, pri čemu

o na poziciji 2, V je promenjen u A.

[0052] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR3 je SEQ ID NO: 130.

[0053] Poželjno, polipeptid koji obuhvata jedan ili više CDR sa 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR bez 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0054] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je SEQ ID NO: 90; i

i u kome

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 112; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1 aminokiselinu razlike u odnosu na SEQ ID NO: 112, pri čemu

− na poziciji 2, V je promenjeno u A,

pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR2 sa 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR2 bez 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom;

i u kome

(iii) CDR3 je SEQ ID NO: 130.

[0055] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, pri čemu, pomenuti prvi ISV suštinski se sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 90; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 1, 2, 3 ili 4 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 90; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 112-113; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 1, 2, 3 ili 4 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 112; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 130; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 1, 2, 3 ili 4 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 130.

[0056] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 90; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 90, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR1 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR1 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 112-113; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 112, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR2

sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR2 bez 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 130; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 130, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR3 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR3 bez 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0057] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 90, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 112, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 130.

[0058] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome je pomenuti prvi ISV izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 53-56.

[0059] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome pomenuti prvi ISV unakrsno blokira vezivanje za CD3 putem najmanje jednog polipeptida sa SEQ ID NO: 53-56.

[0060] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome je pomenuti prvi ISV unakrsno blokiran u pogledu vezivanja za CD3 putem najmanje jednog polipeptida sa SEQ ID NO: 53-56.

[0061] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR1 je SEQ ID NO: 89.

[0062] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR2 je SEQ ID NO: 111.

[0063] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR3 je SEQ ID NO: 129.

[0064] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, pri čemu, pomenuti prvi ISV suštinski se sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 89; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 1, 2, 3 ili 4 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 89; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 111; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 1, 2, 3 ili 4 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 111; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 129; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 1, 2, 3 ili 4 aminokiselina od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 129.

[0065] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 89; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 89, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR1 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR1 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 111; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 111, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR2 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR2 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 129; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 129, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR3 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR3 bez 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0066] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 89, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 111, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 129.

[0067] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome, pomenuti prvi ISV je SEQ ID NO: 52.

[0068] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome pomenuti prvi ISV unakrsno blokira vezivanje za CD3 putem polipeptida sa SEQ ID NO: 52.

[0069] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome čemu je pomenuti prvi ISV unakrsno blokiran u pogledu vezivanja za CD3 putem polipeptida sa SEQ ID NO: 52.

[0070] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome je CDR1 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 91; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1, 2 ili 3 aminokiseline razlike u odnosu na SEQ ID NO: 91, pri čemu

o na poziciji 6, R je promenjeno u N ili T;

o na poziciji 7, N je promenjeno u H; i/ili

o na poziciji 8, M je promenjeno u T.

[0071] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome je CDR2 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 114; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1, 2 ili 3 aminokiseline razlike u odnosu na SEQ ID NO: 114, pri čemu

o na poziciji 1, R je promenjeno u Q;

o na poziciji 3, T je promenjeno u S; i/ili

o na poziciji 7, D je promenjeno u A ili K.

[0072] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome je CDR3 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 131; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1 aminokiselinu razlike u odnosu na SEQ ID NO:

131, pri čemu

o na poziciji 2, S je promenjeno u R; i/ili

o na poziciji 6, S je promenjeno u V.

[0073] Poželjno, polipeptid koji obuhvata jedan ili više CDR sa 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR bez 3, 2 ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0074] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 91; i

− na poziciji 6, R je promenjeno u N ili T;

− na poziciji 7, N je promenjeno u H; i/ili

− na poziciji 8, M je promenjeno u T,

pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR1 sa 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR1 bez 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom;

i u kome

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 114; i

− na poziciji 1, R je promenjeno u Q;

− na poziciji 3, T je promenjeno u S; i/ili

− na poziciji 7, D je promenjeno u A ili K,

i u kome

(iii) CDR3 se bira iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 131; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1 aminokiselinu razlike u odnosu na SEQ ID NO: 131, pri čemu

− na poziciji 2, S je promenjeno u R; i/ili

− na poziciji 6, S je promenjeno u V,

pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR3 sa 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR3 bez 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0075] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 91-93; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 91; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 114-117; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 114; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 131-133; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 131.

[0076] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 91-93; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 91, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR1 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR1 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 114-117; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 114, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR2 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR2 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 131-133; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 131, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR3 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR3 bez 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0077] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 91, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 114, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 131.

[0078] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome je pomenuti prvi ISV izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 57-65.

[0079] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome pomenuti prvi ISV unakrsno blokira vezivanje za CD3 putem najmanje jednog polipeptida sa SEQ ID NO: 57-65.

[0080] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome je pomenuti prvi ISV unakrsno blokiran u pogledu vezivanja za CD3 putem najmanje jednog polipeptida sa SEQ ID NO: 57-65.

[0081] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome je CDR1 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 94; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline razlike u odnosu na SEQ ID NO: 94, pri čemu

o na poziciji 3, S je promenjeno u T, A ili G;

o na poziciji 5, N je promenjeno u S;

o na poziciji 6, M je promenjeno u T ili A; i/ili

o na poziciji 9, L je promenjeno u M.

[0082] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome je CDR2 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 118; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1, 2 ili 3 aminokiseline razlike u odnosu na SEQ ID NO: 118, pri čemu

o na poziciji 2, H je promenjeno u V;

o na poziciji 5, S je promenjeno u H ili A;

o na poziciji 8, N je promenjeno u S; i/ili

o na poziciji 10, Y je promenjeno u F.

[0083] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome je CDR3 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 134; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina razlike u odnosu na SEQ ID NO: 134, pri čemu

o na poziciji 6, A je promenjeno u S ili D;

o na poziciji 7, F je promenjeno u Y ili A;

o na poziciji 8, R je promenjeno u H;

o na poziciji 9, S je promenjeno u A;

o na poziciji 11, G je promenjeno u D, T, N, S, K ili R; i/ili

o na poziciji 14, V je promenjeno u I.

[0084] Poželjno, polipeptid koji obuhvata jedan ili više CDR sa 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR bez 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0085] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 94; i

− na poziciji 3, S je promenjeno u T, A ili G;

− na poziciji 5, N je promenjeno u S;

− na poziciji 6, M je promenjeno u T ili A; i/ili

− na poziciji 9, L je promenjeno u M,

pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR1 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR1 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i u kome

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 118; i

− na poziciji 2, H je promenjeno u V;

− na poziciji 5, S je promenjeno u H ili A;

− na poziciji 8, N je promenjeno u S; i/ili

− na poziciji 10, Y je promenjeno u F,

i u kome

(iii) CDR3 se bira iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 134; i

− na poziciji 6, A je promenjeno u S ili D;

− na poziciji 7, F je promenjeno u Y ili A;

− na poziciji 8, R je promenjeno u H;

− na poziciji 9, S je promenjeno u A;

− na poziciji 11, G je promenjeno u D, T, N, S, K ili R; i/ili

− na poziciji 14, V je promenjeno u I,

pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR3 sa 5, 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR3 bez 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0086] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 94-100; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 94; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 118-122; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 118; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 134-143; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 134.

[0087] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 94-100; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 94, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR1 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR1 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 118-122; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 118, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR2 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR2 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 134-143; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 134, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR3 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR3 bez 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0088] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 94, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 118, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 134.

[0089] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome je pomenuti prvi ISV izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 66-80.

[0090] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome pomenuti prvi ISV unakrsno blokira vezivanje za CD3 putem najmanje jednog polipeptida sa SEQ ID NO: 66-80.

[0091] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, u kome je pomenuti prvi ISV unakrsno blokiran u pogledu vezivanja za CD3 putem najmanje jednog polipeptida sa SEQ ID NO: 66-80.

[0092] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu je pomenuti prvi antigen na ciljnoj ćeliji tumorski antigen, poželjno antigen povezan sa tumorom (TAA).

[0093] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, koji dalje obuhvata treći ISV, koji ima visok afinitet prema drugom antigenu na ciljnoj ćeliji / vezuje se za njega, pri čemu se pomenuti drugi antigen razlikuje od pomenutog prvog antigena.

[0094] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu je pomenuti drugi antigen na ciljnoj ćeliji tumorski antigen, poželjno antigen povezan sa tumorom (TAA).

[0095] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti prvi antigen i pomenuti drugi antigen su prisutni na istim ciljnim ćelijama.

[0096] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu su pomenuti prvi antigen i pomenuti drugi antigen prisutni na različitim ciljnim ćelijama.

[0097] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti TAA su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od hondroitin sulfat proteoglikana povezanog sa melanomom (MCSP), receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), proteina aktivacije fibroblasta (FAP), MART-1, karcinoembrionskog antigena (CEA), gp100, MAGE-1, HER-2, Luisovih<Y>antigena, CD123, CD44, CLL-1, CD96, CD47, CD32, CXCR4, Tim-3, CD25, TAG-72, Ep-CAM, PSMA, PSA, GD2, GD3, CD4, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD45, CD52, CD147, receptora faktora rasta uključujući ErbB3 i ErbB4, receptora citokina uključujući gama lanac receptora interleukina-2 (CD132 antigen), alfa lanca receptora interleukina-10 (IL-10R-A), beta lanca receptora interleukina-10 (IL-10R-B), beta-1 lanca receptora interleukina-12 (IL-12R-beta1), beta-2 lanca receptora interleukina-12 (IL-12 receptor beta-2), alfa-1 lanca receptora interleukina-13 (IL-13R-alfa-1) (CD213a1 antigen), alfa-2 lanca receptora interleukina-13 (interleukin-13 vezujući protein), receptora interleukina-17 (IL-17 receptor), receptora interleukina-17B (IL-17B receptor), prekursora receptora interleukina 21 (IL-21R), receptora interleukina-1 tip I (IL-1R-1) (CD121a), receptora interleukina-1 tip II (IL-1R-beta) (CDw121b), antagonističkog proteina receptora interleukina-1 (IL-1ra), alfa lanca receptora interleukina-2 (CD25 antigen), beta lanca receptora interleukina-2 (CD122 antigen), alfa lanca receptora interleukina-3 (IL-3R-alfa) (CD123 antigen), CD30, IL23R, IGF-1R, IL5R, IgE, CD248 (endosijalin), CD44v6, gpA33, Ron, Trop2, PSCA, klaudin 6, klaudina 18.2, CLEC12A, CD38, ephA2, c-Met, CD56, MUC16, EGFRvIII, AGS-16, CD27L, nektina-4, SLITRK6, mezotelina, receptora folata, faktora tkiva, axl, glipikana-3, CA9, kripto, CD138, CD37, MUC1, CD70, receptora peptida koji oslobađa gastrin, PAP, CEACAM5, CEACAM6, CXCR7, N-kadherina, FXYD2 gama a, CD21, CD133, Na/K-ATPaze, mlgM (IgM vezan za membranu), mlgA (IgA vezan za membranu), Mer, Tyro2, CD120, CD95, CA 195, DR5, DR6, DcR3 i CAlX, uključujući povezane polimorfne varijante i izooblike.

[0098] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti TAA je CD20 (UniProt 11836), HER2 (UniProt P04626), njihove polimorfne varijante ili izooblici.

[0099] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti prvi antigen i pomenuti drugi antigen su izabrani iz grupe koja sadrži:

• EGFR kao prvi antigen i CEA kao drugi antigen;

• CD19 kao prvi antigen i CD20 kao drugi antigen;

• CD19 kao prvi antigen i CD22 kao drugi antigen;

• CD123 kao prvi antigen i Tim-3 kao drugi antigen; i

• CD132 kao prvi antigen i CD69 kao drugi antigen.

[0100] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, koji dalje obuhvata vezujući ostatak serumskog proteina.

[0101] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuti vezujući ostatak serumskog proteina vezuje serumski albumin.

[0102] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti vezujući ostatak serumskog proteina je ISV koji vezuje serumski albumin.

[0103] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti ISV koji vezuje serumski albumin suštinski se sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), pri čemu, CDR1 je SFGMS (SEQ ID NO: 373), CDR2 je SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 374) i CDR3 je GGSLSR (SEQ ID NO: 375), CDR određen prema Kabatovoj definiciji; i/ili pri čemu, CDR1 je GFTFSSFGMS (SEQ ID NO: 376) ili GFTFRSFGMS (SEQ ID NO: 377), CDR2 je SISGSGSDTL (SEQ ID NO: 378) i CDR3 je GGSLSR (SEQ ID NO: 375), CDR određen prema Kontermanu 2010.

[0104] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti ISV koji vezuje serumski albumin je izabran od Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG i Alb82-GGG (SEQ ID NO: 348 do 360). U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti ISV su direktno međusobno vezani ili su vezani preko linkera.

[0105] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti prvi ISV i/ili pomenuti drugi ISV i/ili eventualno pomenuti treći ISV i/ili moguće pomenuti ISV koji vezuje serumski albumin povezani su putem linkera.

[0106] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti linker je izabran iz grupe koja se sastoji od linkera 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS i 35GS (SEQ ID NO: 362 do 372).

[0107] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti vezujući ostatak serumskog proteina je polipeptid koji se ne zasniva na antitelu.

[0108] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, koji dalje obuhvata PEG.

[0109] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti ISV je Nanobody<®>, VHH, humanizovani VHH, ili kamelizovani VH.

[0110] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti prvi ISV je izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1 do 50.

[0111] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti prvi ISV je izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1 do 50, i pri čemu, pomenuti drugi ISV je izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 297 do 304.

[0112] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 265-267, 273, 279-283, 286, 288-289, 322-324, 330, 336-340 i 345-346.

[0113] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji se specifično vezuje za CD3 i koji se sastoji ili se suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 81-87; ili

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence bilo koje SEQ ID NO: 81, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR1 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR1 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 101-109; ili

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence bilo koje SEQ ID NO: 101, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR2 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR2 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 123-127; ili

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselina od aminokiselinske sekvence bilo koje SEQ ID NO: 123, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR3 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR3 bez 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0114] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, gde je CDR1 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 81; i

o na poziciji 1, G je promenjeno u R;

o na poziciji 3, T je promenjeno u A;

o na poziciji 4, Y je promenjeno u F;

o na poziciji 8, S je promenjeno u G; i/ili

o na poziciji 10, G je promenjeno u A.

[0115] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, gde je CDR2 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 101; i

o na poziciji 3, V je promenjeno u T ili A;

o na poziciji 5, S je promenjeno u T;

o na poziciji 6, G je promenjeno u D ili E; i/ili

o na poziciji 9, T je promenjeno u S, A ili P.

[0116] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, gde je CDR3 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 123; i

o na poziciji 2, I je promenjeno u T;

o na poziciji 9, I je promenjeno u V; i/ili

o na poziciji 10, A je promenjeno u P.

[0117] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 81, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 101, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 123.

[0118] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 88; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 110; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 128; i

[0119] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR1 je SEQ ID NO: 88.

[0120] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR2 je SEQ ID NO: 110.

[0121] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR3 je SEQ ID NO: 128.

[0122] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 88, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 110, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 128.

[0123] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 90; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 112-113; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 112, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR2 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR2 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 130; i

[0124] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR1 je SEQ ID NO: 90.

[0125] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 112; i

112, pri čemu

o na poziciji 2, V je promenjen u A.

[0126] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR3 je SEQ ID NO: 130.

[0127] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 90, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 112, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 130.

[0128] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 89; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 111; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 129; i

[0129] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR1 je SEQ ID NO: 89.

[0130] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR2 je SEQ ID NO: 111.

[0131] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR3 je SEQ ID NO: 129.

[0132] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 89, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 111, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 129.

[0133] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 91-93; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 114-117; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 131-133; i

[0134] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde je CDR1 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 91; i

o na poziciji 6, R je promenjeno u N ili T;

o na poziciji 7, N je promenjeno u H; i/ili

o na poziciji 8, M je promenjeno u T.

[0135] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde je CDR2 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 114; i

o na poziciji 1, R je promenjeno u Q;

o na poziciji 3, T je promenjeno u S; i/ili

o na poziciji 7, D je promenjeno u A ili K.

[0136] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde je CDR3 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 131; i

131, pri čemu

o na poziciji 2, S je promenjeno u R; i/ili

o na poziciji 6, S je promenjeno u V.

[0137] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 91, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 114, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 131.

[0138] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 94-100; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 118-122; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 134-143; i

[0139] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde je CDR1 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 94; i

o na poziciji 3, S je promenjeno u T, A ili G;

o na poziciji 5, N je promenjeno u S;

o na poziciji 6, M je promenjeno u T ili A; i/ili

o na poziciji 9, L je promenjeno u M.

[0140] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde je CDR2 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 118; i

o na poziciji 2, H je promenjeno u V;

o na poziciji 5, S je promenjeno u H ili A;

o na poziciji 8, N je promenjeno u S; i/ili

o na poziciji 10, Y je promenjeno u F.

[0141] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde je CDR3 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 134; i

o na poziciji 6, A je promenjeno u S ili D;

o na poziciji 7, F je promenjeno u Y ili A;

o na poziciji 8, R je promenjeno u H;

o na poziciji 9, S je promenjeno u A;

o na poziciji 11, G je promenjeno u D, T, N, S, K ili R; i/ili

o na poziciji 14, V je promenjeno u I.

[0142] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 94, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 118, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 134.

[0143] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, koji je Nanobody, VHH, humanizovani VHHili kamelizovani VH.

[0144] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, koji dalje obuhvata vezujući ostatak serumskog proteina.

[0145] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuti vezujući ostatak serumskog proteina vezuje serumski albumin.

[0146] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti vezujući ostatak serumskog proteina je ISV koji vezuje serumski albumin.

[0147] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti ISV koji vezuje serumski albumin suštinski se sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), pri čemu, CDR1 je SFGMS (SEQ ID NO: 373), CDR2 je SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 374) i CDR3 je GGSLSR (SEQ ID NO: 375), CDR kao što je određen prema Kabatovoj definiciji; i/ili pri čemu, CDR1 je GFTFSSFGMS (SEQ ID NO: 376) ili GFTFRSFGMS (SEQ ID NO: 377), CDR2 je SISGSGSDTL (SEQ ID NO: 378) i CDR3 je GGSLSR (SEQ ID NO: 375), CDR kao što je određen prema Kontermanu 2010.

[0148] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti ISV koji vezuje serumski albumin izabran je od Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG i Alb82-GGG (SEQ ID NO: 348 do 360).

[0149] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti ISV je direktno vezan ili je vezan preko linkera.

[0150] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti linker je izabran iz grupe koja se sastoji od linkera 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS i 35GS (SEQ ID NO: 362 do 372).

[0151] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, koji dalje obuhvata PEG ostatak.

[0152] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu ili sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid kao što je definisan zahtevima.

[0153] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu ili sekvencu nukleinske kiseline kao što je definisana zahtevima.

[0154] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina transformisanu ili transficiranu nukleinskom kiselinom ili sekvencom nukleinske kiseline definisanom zahtevima ili vektorom definisanim zahtevima.

[0155] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje proces proizvodnje polipeptida, kao što je definisano zahtevima, pri čemu se pomenuti proces sastoji od uzgajanja ćelija domaćina, kao što je definisano zahtevima, pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju polipeptida, kao što je definisano zahtevima, i izolovanje proizvedenog polipeptida iz kulture.

[0156] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata polipeptid kao što je definisano zahtevima ili polipeptid proizveden u skladu sa procesom definisanom u zahtevu.

[0157] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima za upotrebu u lečenju ispitanika kome je to potrebno.

[0158] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupak za isporuku profilaktičkog ili terapeutskog polipeptida na određenu lokaciju, tkivo ili tip ćelija u telu, pri čemu taj postupak obuhvata korake primene na ispitaniku polipeptida kao što je ovde opisan ili je proizveden kao što je ovde opisano.

[0159] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, za upotrebu u prevenciji, lečenju ili poboljšanju bolesti izabrane iz grupe koja obuhvata proliferativnu bolest, inflamatornu bolest, infektivnu bolest i autoimunsku bolest.

[0160] U daljem aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupak za prevenciju, lečenje ili poboljšanje bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od proliferativne bolesti, inflamatorne bolesti, infektivne bolesti i autoimune bolesti, koji obuhvata korak primene na ispitaniku kome je to potrebno polipeptida kao što je ovde opisan, ili je proizveden kao što je ovde opisano.

[0161] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid za upotrebu u postupku, ili postupak za prevenciju, lečenje ili poboljšanje bolesti, kao što je definisano zahtevima, pri čemu, pomenuta proliferativna bolest je kancer.

[0162] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid za upotrebu u postupku, ili postupak za prevenciju, lečenje ili poboljšanje bolesti, kao što je definisano zahtevima, pri čemu, pomenuti kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od karcinoma, glioma, mezotelioma, melanoma, limfoma, leukemija, adenokarcinoma: kancera dojke, kancera jajnika, kancera grlića materice, glioblastoma, multiplog mijeloma (uključujući monoklonsku gameopatiju neodređenog značaja, asimptomatski i simptomatski mijelom), kancera prostate, Burkitovog limfoma, kancera glave i vrata, kancera debelog creva, kolorektalnog kancera, nemikrocelularnog kancera pluća, mikrocelularnog kancera pluća, kancera jednjaka, kancera želuca, kancera pankreasa, hepatobilijarnog kancera, kancera žučne kese, kancera tankog creva, kancera rektuma, kancera bubrega, kancera bešike, kancera prostate, kancera penisa, kancera uretre, kancera testisa, vaginalnog kancera, kancera materice, kancera štitne žlezde, paratiroidnog kancera, adrenalnog kancera, endokrinog kancera pankreasa, karcinoidnog kancera, kancera kostiju, kancera kože, retinoblastoma, Hodžkinovog limfoma, nonHodžkinovog limfoma, Kapošijevog sarkoma, multicentrične Kastelmanove bolesti ili primarnog efuzionog limfoma povezanog sa sindromom stečene imunodeficijencije, neuroektodermalnih tumora, rabdomiosarkoma, kao i bilo kojih metastaza bilo kog od prethodnih kancera.

[0163] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima za upotrebu u postupku, ili postupak za prevenciju, lečenje ili poboljšanje bolesti, pri čemu, lečenje se primenjuje u okviru kombinovane terapije.

[0164] U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet koji se sastoji od polipeptida kao što je definisano zahtevima, nukleinske kiseline ili sekvence nukleinske kiseline kao što je definisano zahtevima, vektora kao što je definisano zahtevima, ili ćelije domaćina kao što je definisano zahtevima.

LEGENDA SLIKA

[0165]

Slika 1: QC humanih TCR/CD3 i humanih CD3 transficiranih ćelijskih linija koristeći 100 nM anti-humano TCR α/β antitelo (klon BW242/412) (crno) i 100 nM anti-humano CD3 antitelo (klon OKT-3) (sivo). Vrednost MCF (srednja fluorescencija kanala) nanosi se za svaku ćelijsku liniju.

Slike 2A i 2B: Vezivanje jednovalentnih CD3 nanotela zavisno od doze za humani TCR/CD3 eksprimiran na CHO-K1 ćelijama (slika 2A) i za prečišćene primarne humane T ćelije (slika 2B). Vrednost MCF (srednja fluorescencija kanala) naneta je u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 3: Vezivanje jednovalentnih CD3 nanotela zavisno od doze za HEK293H humani TCR(2IAL)/CD3 (zatvoreni krug), HEK293H humani CD3 (krst) i za HEK293H matičnu ćelijsku liniju (otvoreni krugovi). Vrednost MCF (srednja fluorescencija kanala) naneta je u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slike 4A i 4B: Podaci o aktivaciji T ćelija za jednovalentna CD3 nanotela spojena s perlicama (slika 4A). Podaci o aktivaciji T ćelija za jednovalentna CD3 nanotela prezentovana u rastvoru (slika 4B). Aktivacija se meri praćenjem ushodne regulacije CD69 na primarnim humanim T ćelijama. Vrednost MCF (srednja fluorescencija kanala) nanosi se za svako nanotelo.

Slike 5A–5C: Vezivanje serija razblaženja CD20xCD3 (puna linija) i CD3xCD20 (isprekidana linija) bispecifičnih nanotela za humani TCR/CD3 eksprimiran na CHO-K1 ćelijama (slika 5A), primarnim humanim T ćelijama (slika 5B) i Ramosovim ćelijama (slika 5C). Vrednost MCF (srednja fluorescencija kanala) naneta je u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slike 6A i 6B: Efekat ubijanja zavisan od doze CD20xCD3 (puna linija) i CD3xCD20 (isprekidana linija) bispecifičnih nanotela na testu ubijanja Ramosovih (slika 6A) i Radžijevih (slika 6B) B ćelija posredovanog humanim T ćelijama na bazi protočne citometrije. % ćelijske smrti (% TOPRO pozitivnih ćelija) nanosi se u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 7: Vezivanje anti-CD20 nanotela zavisno od doze za humane CD20 Ramosove (otvoreni simboli) i Radžijeve (zatvoreni simboli) ćelije. Vrednost MCF (srednja fluorescencija kanala) naneta je u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 8: Efekat ubijanja zavisan od doze CD20xCD3 (puna linija) i CD3xCD20 (isprekidana linija) bispecifičnih nanotela na testu ubijanja CHO-K1 humanih CD20 posredovanog humanim T ćelijama na bazi xCELLigence. Cl se nanosi u odnosi na koncentraciju nanotela.

Slika 9: Efekat ubijanja 1 µM CD20xCD3 i irelevantnog konstrukta na testu ubijanja na bazi xCELLigence koristeći CHO-K1 humane CD20 ćelije (crne trake) i koristeći CHO-K1 matičnu ćelijsku liniju (sive trake) da se prikaže ubijanje zavisno od TAA. Ćelijski indeks (CI) nanosi se u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 10: Efekat ubijanja zavisan od doze CD20xCD3 nanoćelija sa 9GS linkerom (otvoreni krugovi - isprekidana linija) i 35GS linkerom (zatvoreni kvadrati - isprekidana linija) i CD3xCD20 nanotela sa 35GS linkerom (zatvoreni romboidi - puna linija) na testu ubijanja na bazi protočne citometrije koristeći Ramosove ćelije. % ćelijske smrti (TORPRO pozitivne ćelije) nanosi se u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 11: Ubijanje zavisno od doze T017000062 na testu ubijanja Ramosovih B ćelija posredovanog humanim T ćelijama na bazi protočne citometrije koristeći različite odnose efektora (E) prema cilju (T) (odnos E:T 10:1 - zatvoreni krugovi, odnos E:T 5:1 - otvoreni kvadrati, odnos E:T 2:1 - zatvoreni trouglovi i odnos E:T 1:1 - otvoreni romboidi. % ćelijske smrti (% TOPRO pozitivnih ćelija) nanosi se u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 12: Vremenski zavisna citolitička aktivnost CD20/CD3 na testu ubijanja posredovanog prečišćenim primarnim humanim T ćelijama u xCELLigence koristeći CHO-K1 humane CD20 ciljne ćelije. % specifične lize se nanosi u odnosu na koncentraciju konstrukta. Različite krive predstavljaju vreme analize nakon dodavanja T ćelija.

Slike 13A–13C: Vezivanje serijskog razblaženja HLE konstrukta za humani TCR/CD3 eksprimiran na CHO-K1 ćelijama (slika 13A), primarnim humanim T ćelijama (slika 13B) i Ramosovim ćelijama (slika 13C). Vrednost MCF (srednja fluorescencija kanala) naneta je u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slike 14A–14D: Ubijanje zavisno od doze CD20xCD3 bispecifičnog nanotela (puna linija - romboidi) u odnosu na konstrukte CD20xCD3xALB11 (puna linija - zatvoreni trougao) (slika 14A, slika 14C) i efekat ubijanja zavisan od doze konstrukta CD20xCD3xALB11 u odsustvu (puna linija - zatvoreni trougao) ili prisustvu 30 µM HSA (isprekidana linija - otvoreni trougao) na testu ubijanja Ramosovih B ćelija posredovanog humanim T ćelijama na bazi protočne citometrije (slika 14B, slika 14D). % ćelijske smrti (% TOPRO pozitivnih ćelija) nanosi se u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 15: Vezivanje 100 nM jednovalentnog anti-HER2 nanotela (5F07) za SK-BR-3, MCF-7 i MDA-MB-468 ćelijske linije u protočnoj citometriji za poređenje nivoa ekspresije HER2. Vrednost MCF (srednja fluorescencija kanala) nanosi se za svaku ćelijsku liniju.

Slika 16: Efekat ubijanja zavisan od doze bispecifičnih CD3xHER2 nanotela (isprekidana linija) i bispecifičnog HER2xCD3 (puna linija) na testu ubijanja posredovanog humanim T ćelijama na bazi xCELLigence. Podaci su analizirani nakon 18 h. Ćelijski indeks (CI) nanosi se u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 17: Proizvodnja INF-γ od strane humanih T ćelija zavisna od doze nakon inkubacije humanih CD20 pozitivnih CHO-K1 ćelija sa bispecifičnim CD20xCD3 nanotelima na testu ubijanja na bazi protočne citometrije. Podaci su analizirani nakon 72 h inkubacije. OD na 405 nm nanosi se u odnosu na koncentraciju nanotela.

Slika 18: Dizajn studije za model iscrpljivanja PBMC B ćelija. PBMC su intraperitonalno ubrizgane životinjama 3. dana (D3). Miševi su tretirani od D3 do D7 sa T017000084 (CD3/CD20) i.v. Q1Dx5 ili T017000088 i.v. Q1Dx5 (irelevantno nanotelo).

Slika 19: Apsolutni broj B ćelija dobijenih iz PBMC na log skali. Ovde su prikazani rezultati za pojedinačne životinje. Broj B ćelija je prikazan u funkciji različitih terapijskih grupa.

Slika 20: Dizajn studije za Ramosov model. Ramosove ćelije su intravenski ubrizgane miševima dana D1. PBMC su intraperitonalno ubrizgane životinjama dana D3. Miševi su tretirani od D3 do D7 sa T017000084 (CD3/CD20) i.v. Q1Dx5 ili T017000088 i.v. Q1Dx5 (irelevantno nanotelo).

Slika 21: Apsolutni broj Ramosovih B ćelija na log skali. Ovde su prikazani rezultati za pojedinačne životinje. Otvoreni krugovi na vrhu grafikona pokazuju koje aktivne doze su statistički značajno različite od irelevantnog NB (T017000088) na osnovu F-testova iz ANOVA analize mešovitih efekata. Svi efekti su statistički značajni na nivou značajnosti od 5%.

Slika 22: Apsolutni broj B ćelija dobijenih iz PBMC na log skali. Ovde su prikazani rezultati za pojedinačne životinje. Otvoreni krugovi na vrhu grafikona pokazuju koje aktivne doze su statistički značajno različite od irelevantnog NB (T017000088) na osnovu F-testova iz ANOVA analize mešovitih efekata. Svi efekti su statistički značajni na nivou značajnosti od 5%.

Slike 23A i 23B: Određivanje nivoa ekspresije EGFR (slika 23A; Santa Cruz, sc-120 PE) ili CEACAM5 (slika 23B; Sino Biological, 11077-MM02-P) na ćelijskim linijama HER14, Hela, LoVo i LS174-T u protočnoj citometriji. Vrednost MCF (srednja fluorescencija kanala) nanosi se za svaku ćelijsku liniju.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0166] Predmetni pronalazači su shvatili da formati koji povezuju T ćelije i tumorske ćelije kako bi se indukovao imunološki odgovor treba da budu u skladu sa različitim i često suprotstavljenim zahtevima. Dati format bi trebalo da bude široko primenljiv. Konkretno, format poželjno treba da bude koristan za širok spektar pacijenata, a poželjno i protiv širokog spektra tumora. Format poželjno treba da bude bezbedan i da cilja samo predviđene ćelije. Pored toga, format poželjno treba da bude dovoljno mali da lako prodre u tkiva i tumore, dok s druge strane format treba da bude prihvatljiv za pacijenta. Na primer, format treba da ima produžen poluživot, tako da se format ne uklanja odmah nakon primene putem bubrežnog klirensa. Međutim, produženje poluživota poželjno ne treba da dovede do aktivnosti van cilja i neželjenih dejstava niti da ograniči prodiranje u tkiva i tumore. Pored toga, prepoznato je da tumorske ćelije često stvaraju mehanizme za bekstvo putem nishodne regulacije ciljanih antigena unutar terapije. U skladu sa tim, u daljoj poželjnoj verziji, format treba da cilja istovremeno više antigena.

[0167] Predmetni pronalazak ispunjava bar jedan od ovih zahteva.

[0168] Konkretno, pretpostavljeno je da će pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina (ISV) u principu biti idealni kandidati, pošto su dovoljno mali da lako prodru u tkivo (tumora) i mogu se kombinovati sa drugim ISV kao gradivni blokovi. Dalje, ISV usmereni na CD3, a posebno CD3ε, treba da imaju široku primenu.

[0169] Identifikovano je šest klastera povezanih ISV, koji su imali neočekivani opseg povoljnih karakteristika. Prvo, ISV su imali neočekivano široku primenu, tj. CD3 ISV su mogli da se vežu za T ćelije različitih donora sa visokim afinitetom. Kada su formatirane u multispecifični polipeptid, CD3 ISV omogućavaju ubijanje ćelija tumora sa različitim antigenima povezanim sa tumorom. Dakle, CD3 ISV mogu da se koriste protiv mnoštva kancera. Pored toga, multispecifični polipeptidi koji obuhvataju CD3 ISV ostaju aktivni kada su vezani za albumin. To doprinosi povoljnom PK profilu i komplijansi pacijenta, uz smanjenje neželjenih dejstava. Polipeptidi iz pronalaska su ispoljili dejstvo samo kada su vezani za T ćeliju kao i za ciljnu ćeliju, što ukazuje na njihovu bezbednost.

[0170] Predmetni pronalazači su smatrali da istovremno ciljanje više antigena smanjuje verovatnoću generisanja varijanti za bekstvo tumora, zbog čega je terapeutska aktivnost strategije angažovanja T ćelija poboljšana. Obezbeđeni su multispecifični polipeptidi koji obuhvataju CD3 ISV u kombinaciji sa pojedinačnim varijabilnim domenima imunoglobulina na različite ciljne antigene i/ili različite epitope na određenom antigenu (biparatopski).

[0171] Sekvence imunoglobulina, kao što su antitela i antigen vezujući fragmenti dobijeni od njih (npr. pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina ili ISV) koriste se za specifično ciljanje njima odgovarajućih antigena u istraživanjima i terapeutskim primenama. Generisanje pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina kao što su npr. VHH ili nanotela može da uključi imunizaciju eksperimentalne životinje kao što je lama, konstruisanje biblioteke faga iz imunog tkiva, odabir faga koji pokazuje pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina koji vezuju antigen i skrining pomenutih domena i njihovih konstruisanih konstrukta za željene specifičnosti (WO 94/04678). Alternativno, slični pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina kao što su npr. dAb mogu se generisati odabirom faga koji pokazuje pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina koji vezuju antigen direktno iz naivnih ili sintetičkih biblioteka i zatim skriningom pomenutih domena i konstruisanih konstrukta za željene specifičnosti (Ward et al., Nature, 1989, 341: 544-6; Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; kao i, na primer, WO 06/030220, WO 06/003388 i druge objavljene patentne prijave Domantis Ltd.). Nažalost, upotreba monoklonskih i/ili u velikoj meri konstruisanih antitela takođe dovodi do visoke cene proizvodnje i može dovesti do suboptimalne penetracije u tumor u poređenju sa drugim strategijama.

[0172] Predmetni pronalazak obezbeđuje multispecifične polipeptide definisane zahtevima koji se specifično vezuju za CD3 kompleksa T ćelijskog receptora, sa neočekivanim rasponom povoljnih karakteristika. Prvo, polipeptidi se lako proizvode. Štaviše, ISV imaju neočekivano široku primenu, tj. CD3 ISV mogu da se vežu za T ćelije različitih donora sa visokim afinitetom. Kada su formatirane u multispecifični polipeptid, CD3 ISV omogućavaju ubijanje ćelija tumora sa različitim antigenima povezanim sa tumorom. Nasuprot tome, nije primećeno nikakvo ubijanje kada polipeptidi nisu vezani za T ćelije i ciljne ćelije, što naglašava bezbednost polipeptida iz pronalaska. Dakle, CD3 ISV mogu da se koriste protiv mnoštva kancera. Pored toga, CD3 ISV se mogu smatrati bezbednim. Pored toga, multispecifični polipeptidi koji obuhvataju CD3 ISV ostaju aktivni kada su vezani za albumin. To će doprineti povoljnom PK profilu i komplijansi pacijenta, uz smanjenje neželjenih dejstava.

[0173] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid definisan zahtevima koji obuhvata prvi i drugi pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), pri čemu prvi ISV ima visok afinitet prema/vezuje se za CD3, a drugi ISV ima visok afinitet prema/vezuje se za antigen na ćeliji (ciljna ćelija), poželjno ćeliji tumora. Antigen je poželjno specifičan za pomenutu ciljnu ćeliju, kao što je npr. antigen povezan sa tumorom (TAA). Multispecifični polipeptid iz pronalaska usmerava T ćeliju na ćeliju, npr. ćeliju tumora, i indukuje aktivaciju T ćelija kako bi se omogućilo da pomenuta T ćelija inhibira ili ubije pomenutu ciljnu ćeliju, npr. ćeliju tumora. „Polipeptidi iz pronalaska“ su polipeptidi definisani zahtevima.

Definicije:

[0174]

a) Ukoliko nije drugačije naznačeno ili definisano, svi korišćeni termini imaju svoje uobičajeno značenje poznato u struci, koje će biti jasno stručnjaku. Upućuje se, na primer, na standardne priručnike navedene u paragrafu a) na strani 46 WO 08/020079.

b) Termin „pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina“, koji se koristi naizmenično sa terminima „pojedinačni varijabilni domen“ i „ISV“, definiše molekule u kojima je mesto vezivanja antigena prisutno na pojedinačnom domenu imunoglobulina i on ga formira. To pravi razliku između pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina i „konvencionalnih“ imunoglobulina ili njihovih fragmenata (kao što su Fab, scFv, itd.), pri čemu dva domena imunoglobulina, naročito dva varijabilna domena, interaguju kako bi se formiralo mesto vezivanja antigena. Tipično, kod konvencionalnih imunoglobulina, varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL) interaguju da formiraju mesto vezivanja antigena. U ovom slučaju, regioni koji određuju komplementarnost (CDR) VH kao i VL doprineće mestu vezivanja antigena, tj. ukupno 6 CDR će biti uključeno u formiranje mesta vezivanja antigena. Nasuprot tome, mesto vezivanja pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina se formira od strane jednog VH ili VL domena. Prema tome, mesto vezivanja antigena pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina se formira od najviše tri CDR-a.

[0175] Termini „pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina“, „pojedinačni varijabilni domen“ i „ISV“ stoga ne obuhvataju konvencionalne imunoglobuline ili njihove fragmente koji zahtevaju interakciju najmanje dva varijabilna domena za formiranje mesta vezivanja antigena. Međutim, ovi termini obuhvataju fragmente konvencionalnih imunoglobulina kod kojih se mesto vezivanja antigena formira jednim varijabilnim domenom.

[0176] Termin „pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina“ ili „ISV“ uključuje (bez ograničenja) antigen vezujuće domene ili fragmente kao što su VHHdomeni ili VH, odnosno VLdomeni. Termini antigen vezujući molekuli ili antigen vezujući protein koriste se naizmenično i obuhvataju i termin nanotela. Pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina mogu da budu sekvence varijabilnog domena lakog lanca (npr.VL-sekvenca) ili sekvence varijabilnog domena teškog lanca (npr. VH-sekvenca); konkretnije, oni mogu biti sekvence varijabilnog domena teškog lanca koje su dobijene od konvencionalnog antitela sa četiri lanca ili sekvence varijabilnog domena teškog lanca koje su dobijene od antitela teškog lanca. Shodno tome, pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina mogu biti domenska antitela, ili sekvence imunoglobulina koje su pogodne za upotrebu kao domenska antitela, jednodomenska antitela, ili sekvence imunoglobulina koje su pogodne za upotrebu kao jednodomenska antitela, „dAb“ ili sekvence imunoglobulina koje su pogodne za upotrebu kao dAb, ili nanotela, uključujući, bez ograničenja, VHHsekvence, humanizovane VHH sekvence ili kamelizovane VH sekvence. Pronalazak obuhvata sekvence imunoglobulina različitog porekla, koje obuhvataju sekvence imunoglobulina miša, pacova, zeca, magarca, čoveka i kamelida. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina obuhvata potpuno humane, humanizovane, na drugi način optimizovane sekvence ili himerne sekvence imunoglobulina. Može se smatrati, bez ograničenja na to, da se pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina i struktura pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina sastoje od četiri regiona okvira ili „FR“, koji se u struci i ovde nazivaju „region okvira 1“ ili „FR1“; „region okvira 2“ ili „FR2“; „region okvira 3“ ili „FR3“; odnosno „region okvira 4“ ili „FR4“; pri čemu su ti regioni okvira prekinuti sa tri regiona koja određuju komplementarnost ili „CDR“, koji se u struci nazivaju „region koji određuje komplementarnost 1“ ili „CDR1“; „region koji određuje komplementarnost 2“ ili „CDR2“; odnosno „region koji određuje komplementarnost 3“ ili „CDR3“. Napominje se da su termini nanotelo ili nanotela registrovani zaštitni znaci kompanije Ablynx N.V. te tako takođe mogu da se označavaju kao Nanobody<®>odnosno Nanobodies<®>.

[0177] c) Osim ako nije drugačije naznačeno, termini „sekvenca imunoglobulina“, „sekvenca“, „sekvenca nukleotida“ i „nukleinska kiselina“ su kao što je opisano u paragrafu b) na strani 46 WO 08/020079.

[0178] d) Osim ako nije drugačije naznačeno, svi postupci, koraci, tehnike i obrade koji nisu detaljno opisani mogu se izvesti i izvode se na način koji je već poznat, što će biti jasno stručnjaku za oblast. Na primer, ponovo se poziva na standardne priručnike i opšte stanje struke koji su ovde pomenuti i na dalje reference navedene u njima; kao i, na primer, na sledeće recenzije Presta 2006 (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6):640-656), Levin i Weiss 2006 (Mol. Biosyst. 2(1):49-57), Irving et al.2005 (J. Immunol. Methods 248(1-2):31-45), Schmitz et al.

2000 (Placenta 21 Suppl. A: S106-112, Gonzales et al.2005 (Tumour Biol.26(1):31-43), koje opisuju tehnike za konstruisanje proteina, kao što je afinitetno sazrevanje i druge tehnike za poboljšanje specifičnosti i drugih željenih svojstava proteina kao što su imunoglobulini.

[0179] e) Aminokiselinski ostaci će biti označeni u skladu sa standardnom troslovnom ili jednoslovnom oznakom za aminokiseline. Poziva se na tabelu A-2 na strani 48 međunarodne prijave WO 08/020079 kompanije Ablynx N.V. pod naslovom „Immunoglobulin single variable domains directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with Il-6 mediated signalling“.

[0180] f) Za potrebe poređenja dve ili više nukleotidnih sekvenci, procenat „identičnosti sekvence“ između prve nukleotidne sekvence i druge nukleotidne sekvence može se izračunati ili odrediti kao što je opisano u paragrafu e) na strani 49 WO 08/020079, na primer, deljenjem [broja nukleotida u prvoj nukleotidnoj sekvenci koji su identični nukleotidima na odgovarajućim pozicijama u drugoj nukleotidnoj sekvenci] sa [ukupnim brojem nukleotida u prvoj nukleotidnoj sekvenci] i množenjem sa [100%], gde se svaka delecija, umetanje, supstitucija ili dodavanje nukleotida u drugoj nukleotidnoj sekvenci, u poređenju sa prvom nukleotidnom sekvencom, smatra razlikom pojedinačnog nukleotida (pozicije); ili koristeći odgovarajuće računarske algoritme ili tehniku, ponovo kao što je opisano u paragrafu e) na strani 49 WO 08/020079.

[0181] g) Za potrebe poređenja dva ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina ili drugih aminokiselinskih sekvenci kao što su, npr. polipeptidi iz pronalaska, itd., procenat „identičnosti sekvence“ između prve aminokiselinske sekvence i druge aminokiselinske sekvence (ovde se takođe naziva „identičnost aminokiselina“) može se izračunati ili odrediti kao što je opisano u paragrafu f) na stranama 49 i 50 WO 08/020079, na primer, deljenjem [broja aminokiselinskih ostataka u prvoj aminokiselinskoj sekvenci koji su identični aminokiselinskim ostacima na odgovarajućim pozicijama u drugoj aminokiselinskoj sekvenci] sa [ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka u prvoj aminokiselinskoj sekvenci] i množenjem sa [100%], gde se svaka delecija, umetanje, supstitucija ili dodavanje aminokiselinskog ostatka u drugoj aminokiselinskoj sekvenci, u poređenju sa prvom aminokiselinskom sekvencom, smatra razlikom pojedinačnog aminokiselinskog ostatka (pozicije), tj. „aminokiselinskom razlikom“ kao što je ovde definisano; ili koristeći odgovarajuće računarske algoritme ili tehniku, ponovo kao što je opisano u paragrafu f) na strani 49 i 50 WO 08/020079).

[0182] Takođe, prilikom određivanja stepena identičnosti sekvence između dva pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina, stručnjak može uzeti u obzir takozvane „konzervativne“ aminokiselinske supstitucije, kao što je opisano na strani 50 WO 08/020079.

[0183] Bilo koja aminokiselinska supstitucija primenjena na polipeptide koji su ovde opisani takođe može da se zasniva na analizi učestalosti aminokiselinskih varijacija između homolognih proteina različitih vrsta koju su razvili Schulz et al. 1978 (Principles of Protein Structure, Springer-Verlag), na analizama potencijala za formiranje strukture koje su razvili Chou i Fasman 1975 (Biochemistry 13: 211) i 1978 (Adv. Enzymol.47: 45-149), i na analizi obrazaca hidrofobnosti u proteinima koju su razvili Eisenberg et al. 1984 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 140-144), Kyte i Doolittle 1981 (J Molec. Biol.157: 105-132), i Goldman et al.

1986 (Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353). Informacije o primarnoj, sekundarnoj i tercijarnoj strukturi nanotela navedene su u opisu ovog teksta i u opštoj tehničkoj literaturi navedenoj iznad. Takođe, u tu svrhu, kristalnu strukturu VHHdomena lama, na primer, daju Desmyter et al.1996 (Nature Structural Biology, 3: 803), Spinelli et al.1996 (Natural Structural Biology 3: 752-757), i Decanniere et al.1999 (Structure, 7: 361). Dodatne informacije o nekim aminokiselinskim ostacima koji u konvencionalnim VHdomenima formiraju VH/VLmeđupovršinu i potencijalne kamelizujuće supstitucije na ovim pozicijama nalaze se u prethodnoj tehničkoj literaturi navedenoj iznad.

[0184] h) Za pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina i sekvence nukleinskih kiselina se kaže da su „potpuno isti“ ako imaju 100% identičnosti sekvence (kao što je ovde definisano) celom dužinom.

[0185] i) Kada se porede dva pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina, termin „aminokiselinska razlika“ odnosi se na inserciju, deleciju ili supstituciju jednog aminokiselinskog ostatka na poziciji u prvoj sekvenci, u poređenju sa drugom sekvencom. Jasno je da dva pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina mogu da imaju jednu, dve ili više takvih aminokiselinskih razlika.

[0186] j) Kada se za sekvencu nukleotida ili aminokiselinsku sekvencu kaže da „obuhvata“ drugu nukleotidnu sekvencu, odnosno aminokiselinsku sekvencu, ili da se „suštinski sastoji od“ druge nukleotidne sekvence ili aminokiselinske sekvence, to ima značenje dato u paragrafu i) na stranama 51-52 WO 08/020079.

[0187] k) Termin „u suštinski izolovanom obliku“ ima značenje dato u paragrafu j) na stranama 52 i 53 WO 08/020079.

[0188] l) Termini „domen“ i „vezujući domen“ imaju značenje dato u paragrafu k) na strani 53 WO 08/020079.

[0189] m) Termini „antigenska determinanta“ i „epitop“, koji se ovde takođe mogu koristiti naizmenično, imaju značenje dato u paragrafu I) na strani 53 WO 08/020079.

[0190] n) Kao što je dalje opisano u paragrafu m) na strani 53 WO 08/020079, za aminokiselinsku sekvencu (kao što je antitelo, polipeptid iz pronalaska, ili uopšteno antigen vezujući protein ili polipeptid ili njegov fragment) koja se može (specifično) vezati za, koja ima afinitet prema i/ili koja ima specifičnost za određenu antigensku determinantu, epitop, antigen ili protein (ili najmanje za deo, fragment ili epitop prethodnog) kaže se da je „protiv“ ili „usmerena na“ pomenutu antigensku determinantu, epitop, antigen ili protein.

[0191] o) Termin „specifičnost“ se odnosi na broj različitih vrsta antigena ili antigenskih determinanti za koje se određeni antigen vezujući molekul ili antigen vezujući protein (kao što je ISV, nanotelo ili polipeptid iz pronalaska) može vezivati. Specifičnost antigen vezujućeg proteina može da se odredi na osnovu afiniteta i/ili avidnosti.

[0192] Afinitet, predstavljen ravnotežnom konstantnom disocijacije antigena sa antigen vezujućim proteinom (KDili KD), predstavlja meru jačine vezivanja između antigenske determinante, tj. cilja, i antigen vezujućeg mesta na antigen vezujućem proteinu, tj. ISV ili nanotelu: što je manja vrednost KD, veća je jačina vezivanja između antigenske determinante i antigen vezujućeg molekula (alternativno, afinitet takođe može da se izrazi kao konstanta afiniteta (KA), koja je 1/KD). Kao što će stručnjaku biti jasno (na primer, na osnovu daljeg otkrivanja u ovom tekstu), afinitet može da se odredi na način koji je već poznat, u zavisnosti od specifičnog antigena od interesa.

[0193] Avidnost je afinitet polipeptida, tj. ligand može da se veže preko dve (ili više) farmakofora (ISV) gde dolazi do sinergije između više reakcija kako bi se povećao „prividni“ afinitet. Avidnost je mera jačine vezivanja između polipeptida iz pronalaska i relevantnih antigena. Polipeptid iz pronalaska može da se vezuje preko svoja dva gradivna bloka (ili više njih), kao što su ISV ili nanotela, za najmanje dva cilja, gde dolazi do sinergije više interakcija, npr. prvi gradivni blok, ISV ili nanotelo se vezuje za prvi cilj, a drugi gradivni blok, ISV ili nanotelo se vezuje za drugi cilj, tako da se poveća „prividni“ afinitet. Avidnost se odnosi na afinitet između antigenske determinante i njenog mesta vezivanja antigena na antigen vezujućem molekulu kao i na broj relevantnih mesta vezivanja koja su prisutna na antigen vezujućim molekulima. Na primer, i bez ograničenja, polipeptidi koji sadrže dva ili više gradivnih blokova, kao što su ISV ili nanotela usmerena na različite ciljeve na ćeliji mogu (obično i hoće) da se vežu sa većom avidnošću od svakog pojedinačnog monomera ili pojedinačnog gradivnog bloka, kao što su, na primer, jednovalentna ISV ili nanotela, sadržana u polipeptidima iz pronalaska.

[0194] Obično se smatra da bilo koja vrednost KDveća od 10<-4>mol/litar (ili bilo koja vrednost KAmanja od 10<4>M<-1>) litar/mol ukazuje na nespecifično vezivanje.

[0195] Polipeptidi iz pronalaska obuhvataju prvi i drugi gradivni blok, npr. prvi i drugi ISV, ili prvo i drugo nanotelo. Afinitet svakog gradivnog bloka, npr. ISV ili nanotela, poželjno se određuje pojedinačno. Drugim rečima, afinitet se određuje za jednovalentan gradivni blok, ISV ili nanotelo, nezavisno od dejstva avidnosti usled drugog gradivnog bloka, ISV ili nanotela, koji može i ne mora biti prisutan. Afinitet za jednovalentni gradivni blok, ISV ili nanotelo, može da se odredi za sam jednovalentni gradivni blok, ISV ili nanotelo, tj. kada pomenuti jednovalentni gradivni blok, ISV ili nanotelo nisu sadržani u polipeptidu iz pronalaska. Alternativno ili dodatno, afinitet za jednovalentni gradivni blok, ISV ili nanotelo može da se odredi prema jednom cilju, dok je drugi cilj odsutan.

[0196] Vezivanje antigen vezujućeg proteina za antigen ili antigenu determinantu može da se odredi na bilo koji odgovarajući način koji je već poznat, uključujući, na primer, Skačardovu analizu i/ili testove konkurentskog vezivanja, kao što su radioimunološki testovi (RIA), enzimski imunološki testovi (EIA) i sendvič konkurentski testovi, i njihove različite varijante poznate u struci; kao i drugim tehnikama koje su ovde pomenute.

[0197] Konstanta disocijacije može biti stvarna ili prividna konstanta disocijacije, što će biti jasno stručnjaku. Postupci za utvrđivanje konstante disocijacije će biti jasni stručnjaku, a, na primer, uključuju tehnike koje su ovde navedene. U tom smislu, takođe će biti jasno da možda neće biti moguće izmeriti konstante disocijacije veće od 10<-4>mol/litar ili 10<-3>mol/litar (npr. od 10<-2>mol/litar). Opciono, kao što će takođe biti jasno stručnjaku, konstanta disocijacije (stvarna ili prividna) može se izračunati na osnovu (stvarne ili prividne) konstante asocijacije (KA), putem veze [KD= 1/KA].

[0198] Afinitet označava jačinu ili stabilnost molekulske interakcije. Afinitet se obično daje kao KD, ili konstanta disocijacije, koja ima jedinice mol/litar (ili M). Afinitet se takođe može izraziti kao konstanta asocijacije, KA, koja je jednaka 1/KDi ima jedinice (mol/litar)<-1>(ili M<-1>). U predmetnoj specifikaciji, stabilnost interakcije između dva molekula (kao što je aminokiselinska sekvenca, nanotelo ili polipeptid iz pronalaska i njegov predviđeni cilj) prvenstveno će se izražavati kao KDvrednost njihove interakcije. Stručnjaku je jasno da, imajući u vidu odnos KA=1/KD, navođenje jačine molekulske interakcije na osnovu vrednosti KDtakođe može da se koristi za izračunavanje odgovarajuće vrednosti KA. Vrednost KDkarakteriše jačinu molekulske interakcije takođe u termodinamičkom smislu jer je povezana sa slobodnom energijom (DG) vezivanja putem poznatog odnosa DG=RT.In(KD) (ekvivalentno DG=-RT.In(KA)), gde je R gasna konstanta, T je apsolutna temperatura, a In označava prirodni logaritam.

[0199] KDbioloških interakcija koje se smatraju značajnim (npr. specifičnim) obično su u rasponu od 10<-10>M (0,1 nM) do 10<-5>M (10000 nM). Što je interakcija jača, njena KDvrednost je manja.

[0200] KDse takođe može izraziti kao odnos konstante brzine disocijacije kompleksa, označene sa koff, prema brzini njene asocijacije, označene sa kon(tako da KD=koff/koni KA= kon/koff). Brzina disocijacije koffima jedinice s<-1>(gde s predstavlja oznaku za sekundu iz SI). Brzina asocijacije konima jedinice M<-1>s<-1>. Brzina asocijacije može da varira od 10<2>M<-1>s<-1>do oko 10<7>M<-1>s<-1>, približavajući se konstanti brzine asocijacije za biomolekulske interakcije koja je ograničena difuzijom. Brzina disocijacije je povezana sa poluživotom date molekulske interakcije na osnovu odnosa t1/2=In(2)/koff. Brzina disocijacije može da varira od 10<-6>s<-1>(skoro ireverzibilni kompleks sa t1/2od nekoliko dana) do 1s<-1>(t1/2= 0,69 s).

[0201] Afinitet molekulske interakcije između dva molekula može da se meri različitim već poznatim tehnikama, kao što je dobro poznata biosenzorska tehnika površinske plazmonske rezonance (SPR) (vidite, na primer, Ober et al. 2001, Intern. Immunology, 13: 1551-1559). Termin „površinska plazmonska rezonanca“, kao što se ovde koristi, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu putem otkrivanja promena koncentracija proteina u biosenzorskoj matrici, pri čemu je jedan molekul imobilisan na biosenzorskom čipu, a drugi molekul prolazi preko imobilisanog molekula u protočnim uslovima što daje merenje kon, koffa tako i vrednosti KD(ili KA). Ovo se, na primer, može izvesti pomoću dobro poznatog BIACore(R) sistema (BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Švedska i Piscataway, NJ). Za dalje opise, vidite Jonsson et al.

1993 (Ann. Biol. Clin.51: 19-26), Jonsson et al.1991 (Biotechniques 11: 620-627), Johnsson, et al.1995 (J. Mol. Recognit.8: 125-131), i Johnnson, et al.1991 (Anal. Biochem.198: 268-277).

[0202] Alternativno, afiniteti se mogu meriti na testu kinetičke ekskluzije (KinExA) (vidite, na primer, Drake et al. 2004, Anal. Biochem., 328: 35-43), koristeći platformu KinExA<®>(Sapidyne Instruments Inc, Boise, SAD). Termin „KinExA“, kao što se ovde koristi, odnosi se na postupak zasnovan na rastvoru za merenje stvarnog ravnotežnog afiniteta vezivanja i kinetičkih podataka nemodifikovanih molekula. Uravnoteženi rastvori kompleksa antitelo/antigen se propuštaju preko kolone sa perlicama prethodno obloženim antigenom (ili antitelom), što omogućava da se slobodno antitelo (ili antigen) veže za obloženi molekul. Detekcija tako uhvaćenog antitela (ili antigena) postiže se sa fluorescentno obeleženim proteinom koji vezuje antitelo (ili antigen).

[0203] Stručnjaku će takođe biti jasno da izmerena vrednost KDmože da odgovara prividnoj vrednosti KDako proces merenja nekako utiče na svojstveni afinitet vezivanja impliciranih molekula, na primer, putem artefakta povezanih sa oblaganjem biosenzora jednim molekulom. Takođe, prividna vrednost KDmože da se izmeri ako jedan molekul sadrži više od jednog mesta prepoznavanja za drugi molekul. U takvoj situaciji izmereni afinitet može da utiče na avidnost interakcije dva molekula.

[0204] Još jedan pristup koji može da se koristi za procenu afiniteta je ELISA (test sa imunosorbentom vezanim za enzim) procedura u 2 koraka autora Friguet et al. 1985 (J. Immunol. Methods, 77: 305-19). Ovaj postupak uspostavlja merenje ravnoteže vezivanja faze rastvora i izbegava moguće artefakte povezane sa adsorpcijom jednog od molekula na podlozi kao što je plastika.

[0205] Međutim, precizno merenje KDmože zahtevati dosta rada i, usled toga, prividne vrednosti KDse obično određuju za procenu jačine vezivanja dva molekula. Treba napomenuti da, sve dok se sva merenja vrše na konzistentan način (npr. održavanje nepromenjenih uslova testiranja), merenje prividne KDmože da se koristi kao aproksimacija za stvarnu KD, te stoga, u predmetnom dokumentu, KDi prividnu KDtreba tretirati kao da imaju jednak značaj i relevantnost.

[0206] Na kraju, treba napomenuti da u mnogim situacijama iskusni naučnik može da proceni da je pogodno odrediti afinitet vezivanja u odnosu na neki referentni molekul. Na primer, da bi se procenila snaga vezivanja između molekula A i B, može se koristiti, npr. referentni molekul C za koji je poznato da se vezuje za B i koji je na odgovarajući način obeležen fluorofornom ili hromofornom grupom ili drugim hemijskim ostatkom, kao što je biotin za jednostavnu detekciju u ELISA ili FACS (fluorescentno aktivirano ćelijsko sortiranje) ili drugom formatu (fluorofor za detekciju fluorescencije, hromofor za detekciju apsorpcije svetlosti, biotin za ELISA detekciju posredovanu streptavidinom). Tipično, referentni molekul C se održava u fiksnoj koncentraciji, a koncentracija A se menja za datu koncentraciju ili količinu B. Posledično, dobija se vrednost IC50koja odgovara koncentraciji A pri kojoj je signal izmeren za C u odsustvu A prepolovljen. Pod uslovom da je poznata KD ref, vrednost KDreferentnog molekula, kao i ukupna koncentracija crefreferentnog molekula, prividna vrednost KDza interakciju A-B se može dobiti iz sledeće formule: KD=IC50/(1+cref/ KD ref). Imajte u vidu da, ako je cref<< KD ref, KD≈ IC50. Pod uslovom da se merenje IC50obavlja na dosledan način (npr. gde je creffiksno) za vezivače koji se porede, jačina ili stabilnost molekulske interakcije može da se proceni na osnovu IC50i ovo merenje se u ovom tekstu smatra ekvivalentnim sa KDili prividnom KD.

[0207] p) Poluživot aminokiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida iz pronalaska generalno može da se definiše kao što je opisano u paragrafu o) na strani 57 WO 08/020079 i, kao što je tamo pomenuto, odnosi se na vreme koje je potrebno da se koncentracija aminokiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida u serumu smanji za 50%, in vivo, na primer, usled razgradnje sekvence ili jedinjenja i/ili klirensa ili sekvestracije sekvence ili jedinjenja prirodnim mehanizmima. In vivo poluživot aminokiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida iz pronalaska može da se odredi na bilo koji poznati način, na primer, farmakokinetičkom analizom. Odgovarajuće tehnike će biti jasne stručnjaku za oblast, i mogu, na primer, uopšteno biti kao što je opisano u paragrafu o) na strani 57 WO 08/020079. Kao što je takođe pomenuto u paragrafu o) na strani 57 WO 08/020079, poluživot se može izraziti koristeći parametre kao što su t1/2-alfa, t1/2-beta i površina ispod krive (AUC). Na primer, poziva se na eksperimentalni deo u nastavku, kao i na standardne priručnike, kao što su Kenneth et al. 1996 (Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists) i Peters et al. 1996 (Pharmacokinete analysis: A Practical Approach). Takođe se poziva na Gibaldi i Perron 1982 (Pharmacokinetics, Dekker M, 2. Rev. izdanje). Termini „produžetak poluživota“ ili „produženi poluživot“ definisani su u paragrafu o) na strani 57 WO 08/020079 i konkretno se odnose na povećanje t1/2-beta, sa povećanjem t1/2-alfa i/ili AUC ili oba, ili bez njihovog povećanja.

[0208] q) Što se tiče cilja ili antigena, termin „mesto interakcije“ na cilju ili antigenu označava mesto, epitop, antigensku determinantu, deo, domen ili niz aminokiselinskih ostataka na cilju ili antigenu koji predstavljaju mesto za vezivanje za ligand, receptor ili drugi vezujući partner, katalitičko mesto, mesto raskidanja, mesto za alosternu interakciju, mesto koje učestvuje u multimerizaciji (kao što je homomerizacija ili heterodimerizacija) cilja ili antigena; ili bilo koje drugo mesto, epitop, antigensku determinantu, deo, domen ili niz aminokiselinskih ostataka na cilju ili antigenu koji učestvuju u biološkom dejstvu ili mehanizmu cilja ili antigena. Uopšteno govoreći, „mesto interakcije“ može biti bilo koje mesto, epitop, antigenska determinanta, deo, domen ili niz aminokiselinskih ostataka na cilju ili antigenu za koje aminokiselinska sekvenca ili polipeptid iz pronalaska mogu da se vezuju tako da cilj ili antigen (i/ili bilo koji put, interakcija, signalizacija, biološki mehanizam ili biološko dejstvo u kom učestvuje cilj ili antigen) bude izmenjen.

[0209] r) Kaže se da je pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina ili polipeptid „specifičan za“ prvi cilj ili antigen u poređenju sa drugim ciljem ili antigenom kada se vezuje za prvi antigen sa afinitetom/avidnošću (kao što je prethodno opisano, i pogodno izraženo kao vrednost KD, vrednost KA, brzina Koffi/ili brzina Kon) najmanje 10 puta većim, kao što je najmanje 100 puta veći, a poželjno najmanje 1000 puta, i do 10.000 puta ili više bolji od afiniteta sa kojim se pomenuta aminokiselina ili polipeptid vezuje za drugi cilj ili polipeptid. Na primer, prvi antigen može da se vezuje za cilj ili antigen sa vrednošću KDkoja je najmanje 10 puta manja, na primer najmanje 100 puta manja, a poželjno najmanje 1000 puta manja, na primer 10.000 puta manja ili čak i manja od toga, nego KDsa kojom se pomenuta aminokiselinska sekvenca ili polipeptid vezuje za drugi cilj ili polipeptid. Poželjno, kada je pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina ili polipeptid „specifičan za“ prvi cilj ili antigen u poređenju sa drugim ciljem ili antigenom, on je usmeren na (kao što je ovde definisano) pomenuti prvi cilj ili antigen, ali nije usmeren na pomenuti drugi cilj ili antigen.

[0210] s) Termini „unakrsno blokira“, „unakrsno blokiran“ i „unakrsno blokiranje“ ovde se koriste naizmenično da označe sposobnost pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina ili polipeptida da ometa vezivanje prirodnog liganda za receptore. Mera u kojoj pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina ili polipeptid iz pronalaska može da ometa vezivanje drugog jedinjenja kao što je prirodni ligand za njegov cilj, te stoga može da se kaže da ga unakrsno blokira prema pronalasku, može da se odredi koristeći testove konkurentskog vezivanja. Jedan posebno pogodan kvantitativni test unakrsnog blokiranja koristi pristup zasnovan na FACS ili ELISA ili Alphascreen za merenje konkurencije između obeleženog (npr. His označenog ili biotinilovanog) pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina ili polipeptida prema pronalasku i drugog vezujućeg agensa u pogledu njihovog vezivanja za cilj. Eksperimentalni deo generalno opisuje odgovarajuće testove zasnovane na premeštanju u FACS, ELISA ili Alphascreen za određivanje da li vezujući molekul unakrsno blokira ili je sposoban da unakrsno blokira pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina ili polipeptid prema pronalasku. Biće jasno da test može da se koristi sa bilo kojim od ovde opisanih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina ili drugih vezujućih agensa. Dakle, uopšteno, unakrsno blokirajuća aminokiselinska sekvenca ili drugi vezujući agens prema pronalasku su, na primer, oni koji će se vezivati za cilj u prethodnom testu unakrsnog blokiranja tako da, tokom testa i u prisustvu druge aminokiselinske sekvence ili drugog vezujućeg agensa iz pronalaska, zabeleženo premeštanje pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina ili polipeptida prema pronalasku iznosi od 60% do 100% (npr. u konkurentskom testu zasnovanom na ELISA/Alphascreen) ili od 80% do 100% (npr. u konkurentskom testu zasnovanom na FACS) maksimalnog teoretskog premeštanja (npr. premeštanja putem hladnog (npr. neobeleženog) pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina ili polipeptida koji treba unakrsno blokirati) putem potencijalnog unakrsno blokirajućeg agensa koji se testira i prisutan je u količini od 0,01 mM ili manje (unakrsno blokirajući agens može biti drugo konvencionalno monoklonsko antitelo kao što su IgG, fragmenti konvencionalnog jednovalentnog antitela (Fab, scFv) i konstruisane varijante (npr. dijatela, trijatela, minitela, VHH, dAb, VH, VL)).

[0211] t) Za aminokiselinsku sekvencu kao što je, npr. pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina ili polipeptid prema pronalasku kaže se da je „pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina tipa VHH1“ ili „sekvenca tipa VHH 1“, ako pomenuti pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina tipa VHH1 ili sekvenca tipa VHH 1 ima 85% identičnosti (koristeći sekvencu konsenzusa VHH1 kao sekvencu za upit i koristeći blast algoritam sa standardnim postavkama, tj. blosom62 matricom za ocenjivanje) sa sekvencom konsenzusa VHH1 (QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSD GSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA) (SEQ ID NO: 361), i obavezno ima cistein na poziciji 50, tj. C50 (koristeći Kabatovu numeraciju).

[0212] u) Za aminokiselinsku sekvencu kao što je, npr. pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina ili polipeptid prema pronalasku kaže se da je „unakrsno reaktivan“ za dva različita antigena ili antigenske determinante (kao što je serumski albumin iz dve različite vrste sisara, kao što je humani serumski albumin i serumski albumin cinomolgus majmuna) ako je specifičan (kao što je ovde opisano) za oba ova različita antigena ili antigenske determinante.

[0213] v) Kao što je dalje opisano u paragrafu q) na stranama 58 i 59 WO 08/020079, aminokiselinski ostaci pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina su numerisani prema opštoj numeraciji za VHdomene koju daju Kabat et al. („Sequence of proteins of immunological interest“, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, publikacija br.91), kao što je primenjeno na VHHdomene kamila u članku autora Riechmann i Muyldermans, 2000 (J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195; vidite, na primer, sliku 2 ove publikacije). Treba napomenuti da – kao što je dobro poznato u struci za VHdomene i za VHH domene – ukupan broj aminokiselinskih ostataka u svakom CDR-u može da varira i možda ne odgovara ukupnom broju aminokiselinskih ostataka koji su naznačeni Kabatovom numeracijom (to jest, jedna ili više pozicija prema Kabatovoj numeraciji možda neće biti zauzeta u stvarnoj sekvenci, ili stvarna sekvenca može da sadrži više aminokiselinskih ostataka od broja dozvoljenog Kabatovom numeracijom). Uopšteno, to znači da numeracija prema Kabatu može i ne mora da odgovara stvarnoj numeraciji aminokiselinskih ostataka u stvarnoj sekvenci. Ukupan broj aminokiselinskih ostataka u VH domenu i VHH domenu će obično biti u rasponu od 110 do 120, često između 112 i 115. Međutim, treba napomenuti da manje i duže sekvence takođe mogu biti pogodne za ovde opisane svrhe.

[0214] Određivanje CDR regiona takođe može da se uradi u skladu sa različitim postupcima. U određivanju CDR prema Kabatu, FR1 pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 1-30, CDR1 pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 31-35, FR2 pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 36-49, CDR2 pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 50-65, FR3 pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 66-94, CDR3 pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 95-102, a FR4 pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 103-113.

[0215] Međutim, u predmetnoj prijavi, osim ako nije drugačije naznačeno, sekvence CDR su utvrđene prema radu autora Kontermann i Dübel (Eds.2010, Antibody Engineering, sveska 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, poglavlje 3, str.33-51). Prema ovom postupku, FR1 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 1-25, CDR1 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 26-35, FR2 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 36-49, CDR2 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 50-58, FR3 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 59-94, CDR3 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 95-102, a FR4 obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 103-113.

[0216] w) Slike, spisak sekvenci i eksperimentalni deo/primeri dati su samo da bi dalje ilustrovali pronalazak i ne treba da se tumače kao ograničavanje obima pronalaska i/ili priloženih zahteva na bilo koji način, osim ako ovde nije izričito naznačeno drugačije.

[0217] x) Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) je mera delotvornosti jedinjenja u inhibiciji biološke ili biohemijske funkcije, npr. farmakološkog dejstva. Ova kvantitativna mera pokazuje koliko je ISV ili nanotela (inhibitora) potrebno da bi se dati biološki proces (ili komponenta procesa, tj. enzim, ćelija, ćelijski receptor, hemotaksa, anaplazija, metastaza, invazivnost, itd.) inhibirao na polovinu. Drugim rečima, to je polovina maksimalne (50%) inhibitorne koncentracije (IC) supstance (50% IC ili IC50). IC50 leka može da se utvrdi konstruisanjem krive odgovora na dozu i ispitivanjem dejstva različitih koncentracija antagonista kao što je ISV ili nanotelo iz pronalaska na preokretanje agonističke aktivnosti. Vrednosti IC50 mogu da se izračunaju za dati antagonist kao što je ISV ili nanotelo iz pronalaska tako što se utvrdi koncentracija potrebna da se inhibira polovina maksimalnog biološkog odgovora agonista.

[0218] Termin polovina maksimalne delotvorne koncentracije (EC50) odnosi se na koncentraciju jedinjenja koja indukuje odgovor na pola puta između početne vrednosti i maksimuma nakon određenog vremena izlaganja. U predmetnom kontekstu ovaj termin se koristi kao mera potentnosti polipeptida, ISV ili nanotela. EC50 stepenaste krive odgovora na dozu predstavlja koncentraciju jedinjenja pri kojoj je uočeno 50% maksimalnog dejstva. Koncentracija je poželjno izražena u molskim jedinicama.

[0219] U biološkim sistemima, male promene koncentracije liganda obično dovode do brzih promena odgovora, u skladu sa sigmoidnom funkcijom. Pregibna tačka u kojoj povećanje odgovora počinje da se usporava sa povećanjem koncentracije liganda je EC50. Ovo matematički može da se odredi izvođenjem najbolje uklopljene linije. Oslanjanje na grafikon za procenu je u većini slučajeva pogodno. U slučaju da je EC50 dat u odeljku primeri, eksperimenti su konstruisani tako da što preciznije odražavaju KD. Drugim rečima, vrednosti EC50 se onda mogu smatrati vrednostima KD. Termin „prosečna vrednost KD“ odnosi se na prosečnu vrednost KD dobijenu najmanje u 1, ali poželjno više od 1, na primer najmanje 2 eksperimenata. Termin „prosečni“ se odnosi na matematički termin „prosek“ (zbir podataka podeljen brojem stavki u podacima).

[0220] On je takođe povezan sa IC50 koji predstavlja meru inhibicije jedinjenja (50% inhibicije). Za testove konkurentskog vezivanja i testove funkcionalnih antagonista, IC50 je najčešća zbirna mera krive odgovora na dozu. Za testove agonista/stimulatora najčešća zbirna mera je EC50.

[0221] y) Treba napomenuti da, kao što se ovde koriste, oblici za jedninu uključuju i množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca na „reagens“ uključuje jedan ili više takvih različitih reagensa, a referenca na „postupak“ uključuje referencu na ekvivalentne korake i postupke poznate osobama sa uobičajenim znanjem u struci koji mogu biti modifikovane ili zamenjene postupcima opisanim ovde.

[0222] Osim ako nije drugačije naznačeno, podrazumeva se da se termin „najmanje“ koji prethodi nizu elemenata odnosi na svaki element u nizu.

[0223] Termin „i/ili“ kad god se koristi u ovom tekstu uključuje značenje reči „i“, „ili“ i „sve i bilo koje druge kombinacije elemenata povezanih pomenutim terminom“.

[0224] Termin „oko“ ili „približno“, kao što se ovde koristi, znači u rasponu od 20%, poželjno u rasponu od 15%, poželjnije u rasponu od 10%, a najpoželjnije u rasponu od 5% od date vrednosti ili raspona.

[0225] U ovoj specifikaciji i zahtevima koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „obuhvatiti“ i varijacije kao što su „obuhvata“ i „koji obuhvata“ treba razumeti tako da podrazumevaju uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka. Kada se ovde koristi, termin „obuhvata“ može se zameniti terminom „sadrži“ ili „uključuje“ ili ponekad, kada se koristi u ovom tekstu, terminom „ima“.

[0226] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid definisan zahtevima koji obuhvata najmanje prvi i najmanje jedan dodatni pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), pri čemu pomenuti najmanje prvi ISV ima visok afinitet prema klasteru diferencijacije 3 (CD3) / vezuje se za njega i pomenuti najmanje jedan dodatni ISV ima visok afinitet prema antigenu na ciljnoj ćeliji / vezuje se za njega.

[0227] Tipično, multispecifični polipeptidi iz pronalaska kombinuju visoko afinitetno prepoznavanje antigena na ciljnoj ćeliji sa aktivacijom T ćelija, što dovodi do aktivacije koja je nezavisna od prirodne specifičnosti T ćelija. Poznat je način delovanja vezujućih molekula koji se vezuju za molekul ćelijske površine na ciljnoj ćeliji kao što je antigen tumora, kao i za koreceptor T ćelija CD3. Dovođenje T ćelije u blizinu ciljne ćelije, tj. aktiviranje pomenute T ćelije dovodi do ubijanja ciljne ćelije od strane T ćelije. U predmetnom pronalasku, ovaj proces se koristi u borbi protiv proliferativnih bolesti, inflamatornih bolesti, infektivnih bolesti i autoimunih bolesti. T ćelije su generalno opremljene granulama koje sadrže smrtonosnu kombinaciju proteina koji formiraju pore, koji se nazivaju perforini, i proteaza koje indukuju ćelijsku smrt, koje se nazivaju granzimi. Poželjno, ovi proteini se isporučuju u ciljne ćelije putem citolitičke sinapse koja se formira ako su T ćelije u neposrednoj blizini ciljne ćelije koju treba ubiti. Obično, neposredna blizina T ćelije i ciljne ćelije se postiže vezivanjem T ćelija za kompleks MHC/peptid koristeći odgovarajući T ćelijski receptor. Polipeptidi iz pronalaska dovode T ćeliju u tako neposrednu blizinu ciljne ćelije u odsustvu interakcije T ćelijskog receptora/MHC.

[0228] U skladu sa tim, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid definisan zahtevima, pri čemu polipeptid usmerava T ćeliju na ciljnu ćeliju.

[0229] Sa jednim krakom (prvi ISV), multispecifični polipeptid ima visok afinitet prema / vezuje se za CD3, proteinsku komponentu kompleksa za transdukciju signala T ćelijskog receptora na T ćelijama. Sa drugim krakom (drugi ISV i/ili treći ISV, itd.), multispecifični polipeptid prepoznaje, ima visok afinitet prema / vezuje se za antigen(e) na ciljnim ćelijama. Poželjno je da se aktivacija T ćelija vidi samo kada se multispecifični polipeptidi prezentuju T ćelijama na površini ciljnih ćelija. Zavisnost rezultata aktivacije ciljnih ćelija od antigena dovodi do povoljnog bezbednosnog profila. U jednom otelotvorenju, multispecifični polipeptidi prolazno vezuju T ćelije i ciljne ćelije kratkim vezama. Poželjno, multispecifični polipeptid može da indukuje da se poliklonske T ćelije u mirovanju, kao što su CD4<+>i/ili CD8<+>T ćelije, aktiviraju, što dovodi do veoma potentne preusmerene lize ciljnih ćelija. Poželjno, T ćelija je usmerena na sledeću ciljnu ćeliju nakon lize prve ciljne ćelije.

[0230] Proteini i polipeptidi koji obuhvataju ili se suštinski sastoje od dva ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina (kao što su najmanje dva pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina iz pronalaska) ovde će biti označeni kao „viševalentni“ proteini ili polipeptidi ili kao „viševalentni konstrukti“. Neki neograničavajući primeri takvih viševalentnih konstrukta će postati jasni na osnovu daljeg opisa u ovom tekstu. Polipeptidi iz pronalaska su „viševalentni“, tj. sastoje se od dva ili više gradivnih blokova ili ISV, od čega su najmanje prvi gradivni blok, ISV ili nanotelo, i drugi gradivni blok, ISV ili nanotelo, različiti i usmereni na različite ciljeve, kao što su antigeni ili antigenske determinante. Polipeptidi iz pronalaska koji obuhvataju najmanje dva gradivna bloka, ISV ili nanotela, pri čemu je najmanje jedan gradivni blok, ISV ili nanotelo usmeren na prvi antigen (tj. na prvi cilj, kao što je, npr. CD3) i najmanje jedan gradivni blok, ISV ili nanotelo je usmeren na drugi antigen (tj. na drugi cilj koji se razlikuje od prvog cilja, kao što je, npr. TAA, npr. CD20 ili HER2), takođe će se nazivati „multispecifični“ polipeptidi iz pronalaska, a za gradivne blokove, ISV ili nanotela prisutne u takvim polipeptidima će se ovde takođe reći da su u „viševalentnom formatu“ ili „multispecifičnom formatu“. Tako je, na primer, „bispecifični“ polipeptid iz pronalaska polipeptid koji obuhvata najmanje jedan gradivni blok, ISV ili nanotelo usmeren na prvi cilj (npr. CD3) i najmanje jedan dodatni gradivni blok, ISV ili nanotelo usmeren na drugi cilj (tj. usmeren na drugi cilj koji se razlikuje od pomenutog prvog cilja, kao što je, npr. TAA, npr. CD20 ili HER2), pri čemu je „trispecifični“ polipeptid iz pronalaska polipeptid koji obuhvata najmanje jedan gradivni blok, ISV ili nanotelo usmeren na prvi cilj (npr. CD3), drugi gradivni blok, ISV ili nanotelo usmeren na drugi cilj koji se razlikuje od pomenutog prvog cilja (npr. TAA, kao što je CD20 ili HER2) i najmanje jedan dodatni gradivni blok, ISV ili nanotelo usmeren na treći antigen (tj. koji se razlikuje od prvog i drugog cilja, kao što je još jedan TAA); itd. Kao što će biti jasno iz opisa, pronalazak nije ograničen na bispecifične polipeptide, u smislu da multispecifični polipeptid iz pronalaska može da obuhvata najmanje prvi gradivni blok, ISV ili nanotelo protiv prvog cilja, drugi gradivni blok, ISV ili nanotelo protiv drugog cilja i bilo koji broj gradivnih blokova, ISV ili nanotela protiv jednog ili više ciljeva, koji mogu biti isti ili se razlikovati od prvog, odnosno drugog cilja. Gradivni blokovi, ISV ili nanotela mogu se opciono povezati preko sekvenci linkera.

[0231] Termini bispecifični polipeptid, bispecifični format, bispecifični konstrukt, bispecifični konstrukt nanotela i bispecifično antitelo koriste se naizmenično u ovom tekstu.

[0232] Kao što će biti jasno iz daljeg opisa iznad i u ovom tekstu, pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina iz pronalaska mogu da se koriste kao „gradivni blokovi“ kako bi se formirali polipeptidi iz pronalaska, npr. njihovim odgovarajućim kombinovanjem sa drugim grupama, ostacima ili vezujućim jedinicama, kako bi se formirala jedinjenja ili konstrukti kao što je ovde opisano (kao što su, bez ograničenja, dvo-/tro-/tetra-/viševalentni i bi-/tri-/tetra-/multispecifični polipeptidi iz pronalaska koji su opisani ovde) koji u jednom molekulu kombinuju jedno ili više željenih svojstava ili bioloških funkcija.

[0233] Biće jasno (kao što je takođe pokazano u odeljku Primeri) da ISV koji vezuje CD3 i ISV koji vezuje antigen na ciljnoj ćeliji mogu biti pozicionirani bilo kojim redosledom u polipeptidu iz pronalaska. Štaviše, u jednom otelotvorenju, ISV koji vezuje CD3 je pozicioniran N-terminalno, a ISV koji vezuje antigen na ciljnoj ćeliji je pozicioniran C-terminalno. U drugom otelotvorenju, ISV koji vezuje antigen na ciljnoj ćeliji je pozicioniran N-terminalno, a ISV koji vezuje CD3 je pozicioniran C-terminalno.

[0234] U poželjnom aspektu, polipeptid iz pronalaska obuhvata najmanje prvi, najmanje drugi i najmanje treći pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), pri čemu pomenuti najmanje prvi ISV ima visok afinitet prema / vezuje se za CD3; pomenuti najmanje drugi ISV ima visok afinitet prema prvom antigenu na ciljnoj ćeliji / vezuje se za njega, a pomenuti najmanje treći ISV ima visok afinitet prema drugom antigenu na ciljnoj ćeliji / vezuje se za njega, pri čemu se pomenuti drugi antigen razlikuje od pomenutog prvog antigena. Pomenuti prvi antigen i pomenuti drugi antigen mogu biti na istoj ili na različitim ciljnim ćelijama.

[0235] Biće jasno (kao što je takođe pokazano u odeljku Primeri) da ISV koji vezuje CD3 i ISV koji vezuju prvi i drugi antigen na ciljnoj ćeliji mogu biti pozicionirani bilo kojim redosledom u polipeptidu iz pronalaska. Konkretnije, u jednom otelotvorenju, ISV koji vezuje CD3 je pozicioniran N-terminalno, ISV koji vezuje prvi antigen na ciljnoj ćeliji pozicioniran je centralno, a ISV koji vezuje drugi antigen na ciljnoj ćeliji pozicioniran je C-terminalno. U drugom otelotvorenju, ISV koji vezuje CD3 je pozicioniran N-terminalno, ISV koji vezuje drugi antigen na ciljnoj ćeliji pozicioniran je centralno, a ISV koji vezuje prvi antigen na ciljnoj ćeliji pozicioniran je C-terminalno. U drugom otelotvorenju, ISV koji vezuje prvi antigen na ciljnoj ćeliji je pozicioniran N-terminalno, ISV koji vezuje drugi antigen na ciljnoj ćeliji pozicioniran je centralno, a ISV koji vezuje CD3 pozicioniran je C-terminalno. U drugom otelotvorenju, ISV koji vezuje prvi antigen na ciljnoj ćeliji je pozicioniran N-terminalno, ISV koji vezuje CD3 pozicioniran je centralno, a ISV koji vezuje drugi antigen na ciljnoj ćeliji pozicioniran je C-terminalno. U drugom otelotvorenju, ISV koji vezuje drugi antigen na ciljnoj ćeliji je pozicioniran N-terminalno, ISV koji vezuje CD3 pozicioniran je centralno, a ISV koji vezuje prvi antigen na ciljnoj ćeliji pozicioniran je C-terminalno. U drugom otelotvorenju, ISV koji vezuje drugi antigen na ciljnoj ćeliji je pozicioniran N-terminalno, ISV koji vezuje prvi antigen na ciljnoj ćeliji pozicioniran je centralno, a ISV koji vezuje CD3 pozicioniran je C-terminalno.

[0236] Pronalazak se dalje odnosi na jedinjenja ili konstrukte, a posebno na proteine ili polipeptide koji obuhvataju jedan ili više ISV ili polipeptida iz pronalaska ili se suštinski sastoje od njih, a opciono dalje obuhvataju jednu ili više drugih grupa, ostataka, funkcionalnih grupa ili vezujućih jedinica. Kao što će stručnjaku biti jasno iz daljeg otkrića u ovom tekstu, takve dodatne grupe, ostaci, funkcionalne grupe, vezujuće jedinice ili aminokiselinske sekvence mogu a ne moraju da obezbede dalju funkcionalnost polipeptidu iz pronalaska (i/ili jedinjenju ili konstruktu u kome je on prisutan) i mogu a ne moraju da izmene osobine polipeptida iz pronalaska.

[0237] Jedinjenja, konstrukti ili polipeptidi iz pronalaska se generalno mogu pripremiti postupkom koji obuhvata najmanje jedan korak pogodnog vezivanja jednog ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina iz pronalaska sa jednom ili više dodatnih grupa, ostataka, funkcionalnih grupa ili vezujućih jedinica, opciono preko jednog ili više odgovarajućih linkera, kako bi se dobilo jedinjenje, konstrukt ili polipeptid iz pronalaska. Polipeptidi iz pronalaska takođe mogu da se pripreme postupkom koji generalno obuhvata barem korake obezbeđivanja nukleinske kiseline koja kodira polipeptid iz pronalaska, ekspresije pomenute nukleinske kiseline na odgovarajući način i izolovanja eksprimiranog polipeptida iz pronalaska. Takvi postupci mogu da se vrše na način koji je već poznat, što će biti jasno stručnjaku, na primer, na osnovu postupaka i tehnika koje su ovde dalje opisane.

[0238] Proces konstruisanja/selekcije i/ili pripreme jedinjenja, konstrukta ili polipeptida iz pronalaska, počevši od aminokiselinske sekvence iz pronalaska, takođe se ovde naziva „formatiranje“ pomenute aminokiselinske sekvence iz pronalaska; a za aminokiselinu iz pronalaska koja je postala deo jedinjenja, konstrukta ili polipeptida iz pronalaska se kaže da je „formatirana“ ili „u formatu“ pomenutog jedinjenja, konstrukta ili polipeptida iz pronalaska. Primeri načina na koje se aminokiselinska sekvenca iz pronalaska može formatirati i primeri takvih formata biće jasni stručnjaku na osnovu ovog otkrića; a takvi formatirani pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina ili polipeptidi čine dalji aspekt pronalaska.

[0239] Na primer, takve dodatne grupe, ostaci, funkcionalne grupe ili vezujuće jedinice mogu biti jedan ili više dodatnih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina, tako da jedinjenje ili konstrukt budu (fuzioni) protein ili (fuzioni) polipeptid. U poželjnom, ali neograničavajućem aspektu, jedna ili više drugih grupa, ostataka, funkcionalnih grupa ili vezujućih jedinica su sekvence imunoglobulina. Još poželjnije, pomenuta jedna ili više drugih grupa, ostataka, funkcionalnih grupa ili vezujućih jedinica je odabrana iz grupe koja se sastoji od domenskih antitela, pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina koji su pogodni za korišćenje kao domensko antitelo, jednodomenskih antitela, pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina (ISV) koji su pogodni za upotrebu kao jednodomensko antitelo, „dAb“, pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina koji su pogodni za korišćenje kao dAb, ili nanotela. Alternativno, takve grupe, ostaci, funkcionalne grupe ili vezujuće jedinice mogu, na primer, biti hemijske grupe, ostaci, funkcionalne grupe, koji mogu a ne moraju biti sami po sebi biološki i/ili farmakološki aktivni. Na primer, i bez ograničenja, takve grupe mogu biti povezane sa jednim ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina ili polipeptida iz pronalaska tako da se dobije „derivat“ ISV ili polipeptida iz pronalaska, kao što je ovde dalje opisano.

[0240] Takođe, u okviru predmetnog pronalaska su jedinjenja ili konstrukti, koji obuhvataju jedan ili više derivata opisanih ovde ili se suštinski sastoje od njih, i opciono dalje obuhvataju jednu ili više drugih grupa, ostataka, funkcionalnih grupa ili vezujućih jedinica, opciono povezanih preko jednog ili više linkera. Poželjno, pomenuta jedna ili više drugih grupa, ostataka, funkcionalnih grupa ili vezujućih jedinica su pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina. U prethodno opisanim jedinjenjima ili konstruktima, jedan ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina iz pronalaska i jedna ili više grupa, ostataka, funkcionalnih grupa ili vezujućih jedinica mogu biti međusobno povezani neposredno i/ili preko jednog ili više odgovarajućih linkera ili spejsera. Na primer, kada su jedna ili više grupa, ostataka, funkcionalnih grupa ili vezujućih jedinica pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina, linkeri takođe mogu biti pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina, tako da dobijeno jedinjenje ili konstrukt bude fuzioni protein ili fuzioni polipeptid.

[0241] U nekim otelotvorenjima, polipeptidi obuhvataju najmanje dva ili više ovde otkrivenih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, polipeptidi se suštinski sastoje od dva ili više ovde otkrivenih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina. Polipeptid koji se „suštinski sastoji od“ dva ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina jeste polipeptid koji pored dva ili više ovde otkrivenih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina nema dodatne pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina. Na primer, polipeptid koji se suštinski sastoji od dva pojedinačna varijabilna domena imunoglobulina ne obuhvata nijedan dodatni pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina. Međutim, treba razumeti da polipeptid koji se suštinski sastoji od dva ili više pojedinačnih domena imunoglobulina može da uključuje dodatne funkcionalnosti, kao što su oznaka, toksin, jedan ili više linkera, vezujuća sekvenca, itd. Te dodatne funkcionalnosti uključuju grupe na bazi aminokiselina kao i grupe koje nisu na bazi aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, polipeptidi se sastoje od jednog ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina koji su ovde otkriveni. Treba razumeti da se termini „polipeptidni konstrukt“ i „polipeptid“ mogu koristiti naizmenično u ovom tekstu (osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije).

[0242] U nekim otelotvorenjima, polipeptidi uključuju viševalentne ili multispecifične konstrukte koji obuhvataju pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina koji su ovde otkriveni. U nekim otelotvorenjima, polipeptidi obuhvataju jedan ili više skeleta na bazi antitela i/ili skeleta koji nisu na bazi antitela koji su ovde otkriveni. U nekim otelotvorenjima, polipeptidi obuhvataju serumski vezujući proteinski ostatak. U nekim otelotvorenjima, serumski vezujući proteinski ostatak je pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina je Nanobody<®>.

[0243] Biće jasno da se redosled gradivnih blokova, kao što su npr. prvi gradivni blok, drugi gradivni blok, treći gradivni blok itd., na polipeptidu (orijentacija) može izabrati u skladu sa potrebama stručnjaka za ovu oblast, kao i relativnih afiniteta koji mogu da zavise od lokacije ovih gradivnih blokova u polipeptidu. Da li će polipeptid sadržati linker, zavisi od odabrane konstrukcije. Međutim, neke orijentacije, sa linkerima ili bez njih, mogu da obezbede poželjne karakteristike vezivanja u odnosu na druge orijentacije. Na primer, redosled prvog i drugog gradivnog bloka u polipeptidu iz pronalaska može biti (od N-terminusa ka C-terminusa): (i) prvi gradivni blok (npr. prvi ISV, kao što je prvo nanotelo) - [linker] - drugi gradivni blok (npr. drugi ISV, kao što je drugo nanotelo); ili (ii) drugi gradivni blok (npr. drugi ISV, kao što je drugo nanotelo) - [linker] - prvi gradivni blok (npr. prvi ISV, kao što je prvo nanotelo); (gde je linker opcioni). Sve orijentacije su obuhvaćene pronalaskom. Polipeptidi koji imaju orijentaciju gradivnih blokova koja obezbeđuje željene karakteristike (vezivanja) mogu se lako identifikovati rutinskim skriningom, na primer, kao što je prikazano u eksperimentalnom odeljku.

[0244] Prvi pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV) polipeptida iz pronalaska ima visok afinitet prema/vezuje se za efektorsku ćeliju, poželjno TCR kompleks pomenute efktorske ćelije, a još poželjnije CD3.

[0245] Efektorska ćelija je ćelija koja obuhvata TCR kompleks, poželjno imunska ćelija, kao što je T pomoćna ćelija, monocit, makrofag, ili dendritska ćelija, poželjno CD4<+>T pomoćna ćelija (takođe poznata kao CD4 ćelija, T pomoćna ćelija ili T4 ćelija), poželjnije citotoksična T ćelija (poznata i kao TCćelija, CTL ili CD8<+>T ćelija), T ćelija prirodni ubica (NKT ćelije) ili ćelija prirodni ubica (NK ćelije). U nekim otelotvorenjima, ćelija je prisutna in vivo. U nekim otelotvorenjima, ćelija je prisutna in vitro. Efektorska ćelija iz otkrića posebno se odnosi na ćelije sisara, poželjno na ćelije primata, a još poželjnije na humane ćelije.

[0246] Kao što se ovde koriste, termini „TCR kompleks“ ili „αβ TCR-CD3 kompleks“ odnose se na kompleks T ćelijskog receptora koji je prisutan na površini T ćelija (vidite Kuhns et al.

2006, Immunity 24:133-139). TCR kompleks se sastoji od šest različitih bitopskih transmembranskih proteina tipa I: TCRα i TCRβ lanaca koji formiraju TCR heterodimer odgovoran za prepoznavanje liganda, i nekovalentno povezanih CD3γ, CD3δ, CD3ε i ζ lanaca, koji nose motive citoplazmatskih sekvenci koji se fosforiluju nakon aktivacije receptora i regrutuju veliki broj signalnih komponenata. α i β lanci T ćelijskog receptora sastoje se od konstantnog domena i varijabilnog domena. Sekvence za konstantne domene humanog CD3 i humanog TCRα/β su obezbeđene u tabeli A-10 (SEQ ID NO: 291-296; upor. UniProtKB: CD3 delta: P04234, CD3 gama: P09693, CD3 epsilon: P07766, CD3 ceta: P20963, TCR alfa: P01848 i TCR beta: P01850).

[0247] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti prvi ISV se vezuje za CD3γ (SEQ ID NO: 292), za CD3δ (SEQ ID NO: 291) i/ili CD3ε (SEQ ID NO: 293) TCR kompleksa, ili za njihove polimorfne varijante ili izooblike.

[0248] Alternativno, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti prvi ISV se vezuje za CD3γ (SEQ ID NO: 379), za CD3δ (SEQ ID NO: 291) i/ili CD3ε (SEQ ID NO: 380) TCR kompleksa, ili za njihove polimorfne varijante ili izooblike.

[0249] Izooblici su alternativne proteinske sekvence koje se mogu generisati iz istog gena putem pojedinačnog biološkog događaja ili njihove kombinacije kao što je korišćenje alternativnog promotera, alternativno splajsovanje, alternativna inicijacija i ribozomsko pomeranje okvira, kao što je poznato u struci.

[0250] „Aktivacija T ćelija“, kao što se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više ćelijskih odgovora T ćelije, npr. citotoksične T ćelije, kao što je odgovor izabran od: proliferacije, diferencijacije, lučenja citokina, oslobađanja citotoksičnog efektorskog molekula, ekspresije aktivacionih markera i preusmeravanja lize ciljnih ćelija. Polipeptidi iz pronalaska mogu da indukuju aktivaciju T ćelija. Odgovarajući testovi za merenje aktivacije T ćelija su poznati u struci opisanoj ovde, na primer u WO 99/54440 ili Schlereth et al. 2005 (Cancer Immunol. Immunother. 20: 1-12), ili kao što je opisano u primerima ili u nastavku.

[0251] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid definisan zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid indukuje aktivaciju T ćelija. Poželjno, polipeptid iz pronalaska indukuje aktivaciju T ćelija samo kada je drugi i/ili dodatni ISV vezan za antigen na ciljnoj ćeliji.

[0252] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid definisan zahtevima, pri čemu pomenuta aktivacija T ćelija zavisi od prezentovanja T ćeliji pomenutog polipeptida vezanog za pomenuti prvi antigen na ciljnoj ćeliji.

[0253] Aktivacija T ćelija putem polipeptida iz pronalaska može da se prati pomoću ushodne regulacije CD69, CD25 i različitih ćelijskih adhezionih molekula, de novo ekspresije i/ili oslobađanja citokina (npr. IFN-y, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-4 i IL-10), ushodne regulacije ekspresije granzima i perforina i/ili ćelijske proliferacije, bubrenja membrane, aktivacije prokaspaza 3 i/ili 7, fragmentacije nuklearne DNK i/ili raskidanja supstrata kaspaze poli (ADPriboza) polimeraze. Poželjno, preusmerena liza ciljnih ćelija putem multispecifičnih polipeptida je nezavisna od specifičnosti T ćelijskog receptora, prisustva MHC klase I i/ili β2 mikroglobulina, i/ili bilo kojih kostimulatornih stimulansa.

[0254] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu je pomenuta T ćelijska aktivacija nezavisna od prepoznavanja MHC.

[0255] Polipeptidi iz pronalaska pokazuju preusmerenu lizu in vitro sa prethodno nestimulisanim perifernim poliklonskim CD8<+>- i CD4<+>-pozitivnim T ćelijama. Preusmerena liza ciljnih ćelija putem regrutovanja T ćelija polipeptidima iz pronalaska uključuje formiranje citolitičke sinapse i isporuku perforina i granzima. Ćelijska liza putem T ćelija je opisana, npr. u Atkinson i Bleackley 1995 (Crit. Rev. Immunol 15(3-4):359-384). Poželjno, angažovane T ćelije su sposobne za serijsku lizu ciljne ćelije, i na njih ne utiču mehanizmi za izbegavanje imunskog sistema koji ometaju obradu i prezentaciju peptidnih antigena, ili diferencijaciju klonskih T ćelija (videti, na primer, WO 2007/042261). In vitro, preusmerena liza se može videti pri niskim pikomolarnim koncentracijama, što ukazuje da veoma mali broj polipeptida iz pronalaska treba da bude vezan za ciljne ćelije za aktivaciju T ćelija. Kao što je prikazano u primerima, nizak odnos efektora i cilja može biti pokazatelj serijske lize ciljnih ćelija. Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na potentne polipeptide kao što su definisani zahtevima. Poželjno, polipeptid iz pronalaska posreduje u ubijanju ciljnih ćelija, npr. ćelija kancera, kao što je stimulisanje T ćelija u formiranju pora i isporučivanje proapoptotskih komponenata citotoksičnih T ćelijskih granula.

[0256] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu aktivacija T ćelija izaziva jedan ili više ćelijskih odgovora pomenute T ćelije, pri čemu, pomenuti ćelijski odgovor je odabran iz grupe koja se sastoji od proliferacije, diferencijacije, sekrecije citokina, oslobađanja citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksične aktivnosti, ekspresije aktivacionih markera i preusmerene lize ciljnih ćelija.

[0257] Kao što se ovde koristi, termin „potentnost“ je mera biološke aktivnosti nekog agensa, kao što je polipeptid, ISV ili nanotelo. Potentnost agensa može da se odredi bilo kojim odgovarajućim postupkom poznatim u struci, na primer, kao što je opisano u eksperimentalnom odeljku. Test potentnosti zasnovan na ćelijskoj kulturi je često poželjan format za određivanje biološke aktivnosti, jer meri fiziološki odgovor koji je agens izazvao i može da generiše rezultate u relativno kratkom vremenskom periodu. Mogu se koristiti različite vrste testova na bazi ćelija, na osnovu mehanizma delovanja proizvoda, uključujući, bez ograničenja, testove proliferacije, testove citotoksičnosti, testove ubijanja ćelija, testove sa reporterskim genom, testove vezivanja receptora na ćelijskoj površini, i testove za merenje indukcije/inhibicije funkcionalno esencijalnog proteina ili drugih signalnih molekula (kao što su fosforilovani proteini, enzimi, citokini, cAMP i slično), model iscrpljivanja Ramosovih B ćelija, test ubijanja tumorskih ćelija posredovanog T ćelijama (na primer, kao što je prikazano u odeljku Primeri), koji su svi dobro poznati u struci. Rezultati testova potentnosti na bazi ćelija mogu da se izraze kao „relativna potentnost“ koja je utvrđena poređenjem multispecifičnog polipeptida iz pronalaska sa odgovorom koji je dobijen za odgovarajući referentni jednovalentni ISV, npr. polipeptid koji obuhvata samo jedan ISV ili jedno nanotelo, koji opciono dalje sadrži irelevantno nanotelo (vidite eksperimentalni odeljak).

[0258] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuta aktivacija T ćelija uzrokuje inhibiciju aktivnosti pomenute ciljne ćelije, kao što je odlaganje ili smanjenje širenja ciljne ćelije, inhibicija ili odlaganje rasta i/ili proliferacije ciljne ćelije, i/ili ubijanje ciljne ćelije (npr. što dovodi do povlačenja poremećaja i/ili simptoma) za više od oko 10%, na primer 20%, 30% ili 40% ili čak više od 50%, na primer više od 60%, recimo 70%, 80%, ili čak više od 90%, recimo 100%.

[0259] Prvi gradivni blok, ISV, nanotelo ili VHH iz pronalaska ima visok afinitet prema svom cilju, tj. CD3. Prvi gradivni blok, ISV ili nanotelo iz pronalaska mogu, na primer, biti usmereni na antigensku determinantu, epitop, deo, domen, podjedinicu ili konformaciju (gde je primenljivo) pomenutog prvog cilja. Prvi gradivni blok, npr. prvi ISV, nanotelo ili VHH, poželjno se bira zbog visokog afiniteta prema cilju koji mu je svojstven, bez obzira na uticaj bilo kojih efekata avidnosti.

[0260] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti prvi ISV se vezuje za CD3 sa prosečnom vrednošću KD od 100 nM do 10 pM, kao što je prosečna vrednost KD od 90 nM ili manje, još poželjnije sa prosečnom vrednošću KD od 80 nM ili manjom, kao što je manje od 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM ili čak i manje, kao što je manje od 4, 3, 2 ili 1 nM, kao što je manje od 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 pM ili čak i manje, recimo manje od 10 pM. KD se poželjno određuje putem Kinexa ili SPR, na primer kao što određuje Proteon. Na primer, pomenuti KD se određuje kao što je prikazano u odeljku Primeri.

[0261] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuti prvi ISV ima visok afinitet kada se meri kao jednovalentan. Pomenuti prosečni KD se poželjno meri površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) na rekombinantnom proteinu.

[0262] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid ima konstantu disocijacije (KD) prema pomenutom CD3 (ili za njegovo vezivanje) izabranu iz grupe koja se sastoji od: najviše oko 10<-5>M, najviše oko 10<-6>M, najviše oko 10<-7>M, najviše oko 10<-8>M, najviše oko 10<-9>M, najviše oko 10<-10>M, najviše oko 10<-11>M, i najviše oko 10<-12>M, poželjno kao što je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom.

[0263] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti prvi ISV se vezuje za pomenuti CD3 sa vrednošću EC50 od 100 nM do 1 pM, kao što je prosečna vrednost EC50 od 100 nM ili manja, još poželjnije sa prosečnom vrednošću EC50 od 90 nM ili manjom, kao što je manje od 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM ili čak i manje, kao što je manje od 4, 3, 2 ili 1 nM ili čak i manje, kao što je manje od 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 pM, ili čak i manje, kao što je manje od 4 pM.

[0264] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu je pomenuti prosečni KD određen putem FACS, Biacore, ELISA na jednovalentnom prvom ISV, kao što je nanotelo, ili polipeptidu koji obuhvata jednovalentni prvi ISV, kao što je nanotelo, na primer, pomenuti EC50 se određuje kao što je prikazano u odeljku primeri.

[0265] U primerima je pokazano da KD ima dobru korelaciju sa EC50.

[0266] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid ima konstantu brzine asocijacije (Kon) prema pomenutom CD3 (ili za njegovo vezivanje) izabranu iz grupe koja obuhvata najmanje oko 10<2>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<3>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<4>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<5>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<6>M<-1>s<-1>, 10<7>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<8>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<9>M<-1>s<-1>, i najmanje oko 10<10>M<-1>s<-1>, poželjno kao što je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom ili kao što je izvršeno u odeljku Primeri.

[0267] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan u zahtevima, pri čemu pomenuti polipeptid ima konstantu brzine disocijacije (Koff) prema pomenutom CD3 (ili za njegovo vezivanje) izabranu iz grupe koja obuhvata najviše oko 10<-3>s<-1>, najviše oko 10<-4>s<-1>, najviše oko 10<-5>s<-1>, najviše oko 10<-6>s<-1>, najviše oko 10<-7>s<-1>, najviše oko 10<-8>s<-1>, najviše oko 10<-9>s<-1>, i najviše oko 10<-10>s<-1>, poželjno kao što je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom ili kao što je izvršeno u odeljku Primeri.

[0268] Razmatrane su modifikacije aminokiselinskih sekvenci vezujućih molekula, ISV ili polipeptida koji su ovde opisani. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela ili ISV. Varijante aminokiselinskih sekvenci vezujućih molekula, ISV ili polipeptida se pripremaju uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih izmena u nukleinsku kiselinu vezujućeg molekula, ISV ili polipeptida, ili putem sinteze peptida.

[0269] Takve modifikacije uključuju, na primer, delecije i/ili insercije i/ili supstitucije ostataka u okviru aminokiselinskih sekvenci vezujućih molekula, ISV ili polipeptida. Svaka kombinacija delecije, insercije i supstitucije se pravi da bi se došlo do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt ima željene karakteristike. Aminokiselinske izmene takođe mogu promeniti posttranslacione procese vezujućih molekula, kao što je promena broja ili pozicija mesta glikozilacije. Poželjno, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselina može biti supstituisano u CDR, dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 25 aminokiselina može biti supstituisano u regionima okvira (FR), pod uslovom da, u prvom ISV polipeptida koji obuhvata prvi i drugi ISV u skladu sa zahtevima ili u polipeptidu koji specifično vezuje CD3 u skladu sa zahtevima, CDR1 može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 81, CDR2 može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 101 i/ili CDR3 može imati samo 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123. Supstitucije su poželjno konzervativne supstitucije kao što je ovde opisano. Dodatno ili alternativno, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselina može biti ubačeno u svaki CDR ili izbačeno iz njega (naravno, u zavisnosti njegove dužine), dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 25 aminokiselina može biti ubačeno u svaki FR ili izbačeno iz njega, pod uslovom da, u prvom ISV polipeptida koji obuhvata prvi i drugi ISV u skladu sa zahtevima ili u polipeptidu koji specifično vezuje CD3 u skladu sa zahtevima, CDR1 može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 81, CDR2 može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 101 i/ili CDR3 može imati samo 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123.

[0270] Koristan postupak za identifikaciju određenih ostataka ili regiona vezujućih molekula, ISV ili polipeptida, koji su preferentne lokacije za mutagenezu, naziva se „ciljana mutageneza sa alaninom“, kako je opisano u Cunningham and Wells 1989 (Science 244: 1081-1085). Ovde su ostatak ili grupa ciljnih ostataka u vezujućem molekulu identifikovani (npr. naelektrisani ostaci kao što su Arg, Asp, His, Lys, i Glu) i zamenjeni neutralno ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (najpoželjnije alanin ili polialanin) kako bi se izvršio uticaj na interakciju aminokiselina u epitopu. Te aminokiselinske lokacije koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije se zatim utačnjavaju uvođenjem daljih ili dodatnih varijanti na mesta supstitucije, ili umesto njih. Tako, iako je mesto za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence prethodno određeno, priroda same mutacije ne mora biti prethodno određena. Na primer, za analizu učinka mutacije na datom mestu, mutageneza sa alaninom ili nasumična mutageneza se vrši na ciljnom kodonu ili regionu, a eksprimirane varijante vezujućeg molekula se ispituju na željenu aktivnost.

[0271] Poželjno, insercije za aminokiselinske sekvence uključuju amino- i/ili karboksiterminalne fuzije koje imaju dužinu u rasponu od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ostataka za polipeptide koji sadrže sto ili više ostataka.

[0272] Još jedna vrsta varijante je varijanta aminokiselinske supstitucije. Ove varijante poželjno imaju najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka u vezujućem molekulu, ISV ili polipeptidu koji su zamenjeni različitim ostatkom, pod uslovom da, u prvom ISV polipeptida koji obuhvata prvi i drugi ISV u skladu sa zahtevima ili u polipeptidu koji specifično vezuje CD3 u skladu sa zahtevima, CDR1 može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 81, CDR2 može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 101 i/ili CDR3 može imati samo 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123. Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju CDR, naročito hipervarijabilne regione, ali se razmatraju i izmene FR. Na primer, ako CDR sekvenca obuhvata 6 aminokiselina, predviđeno je da jedna, dve ili tri od tih aminokiselina budu supstituisane. Slično tome, ako CDR sekvenca obuhvata 15 aminokiselina, predviđeno je jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest od tih aminokiselina budu supstituisane, pod uslovom da, u prvom ISV polipeptida koji obuhvata prvi i drugi ISV u skladu sa zahtevima ili u polipeptidu koji specifično vezuje CD3 u skladu sa zahtevima, CDR1 može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 81, CDR2 može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 101 i/ili CDR3 može imati samo 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123.

[0273] Generalno, ako su aminokiseline supstituisane u jednom ili više ili svim CDR, poželjno je da tako dobijena „supstituisana“ sekvenca bude najmanje 60%, poželjnije 65%, još poželjnije 70%, naročito poželjno 75%, konkretnije poželjno 80%, ili čak i više od 90% identična sa „izvornom“ sekvencom CDR, pod uslovom da, u prvom ISV polipeptida koji obuhvata prvi i drugi ISV u skladu sa zahtevima ili u polipeptidu koji specifično vezuje CD3 u skladu sa zahtevima, CDR1 može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 81, CDR2 može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 101 i/ili CDR3 može imati samo 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123. To znači da od dužine CDR zavisi u kojoj meri je identična „supstituisanoj“ sekvenci. Na primer, CDR koji ima 5 aminokiselina je poželjno 80% identičan svojoj supstituisanoj sekvenci kako bi imao najmanje jednu supstituisanu aminokiselinu. U skladu s tim, CDR-i vezujućeg molekula mogu imati različit stepen identičnosti sa svojim supstituisanim sekvencama, npr. CDR1 može imati 80%, dok CDR3 može imati 90%.

[0274] Poželjne supstitucije (ili zamene) su konzervativne supstitucije. Međutim, predviđena je bilo koja supstitucija (uključujući nekonzervativnu supstituciju ili jednu ili više od „primera supstitucija“ navedenih u Tabeli B-1 ispod) sve dok polipeptid zadržava sposobnost da se vezuje za CD3 koji je prisutan na T ćeliji preko prvog ISV i za prvi antigen na ciljnoj ćeliji preko drugog ISV i/ili njegovi CDR imaju identičnost sa tako supstituisanom sekvencom (najmanje 60%, poželjnije 65%, još poželjnije 70%, naročito poželjno 75%, konkretnije poželjno 80% identičnosti sa „izvornom“ sekvencom CDR), pod uslovom da, u prvom ISV polipeptida koji obuhvata prvi i drugi ISV u skladu sa zahtevima ili u polipeptidu koji specifično vezuje CD3 u skladu sa zahtevima, CDR1 može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 81, CDR2 može imati samo 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 101 i/ili CDR3 može imati samo 3, 2 ili 1 aminokiselinu razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123.

[0275] Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli B-1 ispod.

Tabela B-1: Aminokiselinske supstitucije

[0276] Analiza sekvence je takođe otkrila da postoji samo ograničen broj varijacija sekvenci u CDR-ima (videti primer 4.2 i Tabele A-1 do A-6).

[0277] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid definisan zahtevima, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 81-87; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 101-109; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 123-127; i

[0278] Poželjne su sekvence CDR prikazane u Tabeli A-8 i koje spadaju u opseg zahteva. Poželjne su kombinacije CDR navedene u Tabeli A-8 (tj. pomenute u istom redu u Tabeli A-4), sve dok spadaju u opseg zahteva. Stoga je generalno poželjno da, kada je CDR u ISV koji spada u opseg zahteva sekvenca CDR pomenuta u Tabeli A-8 ili pogodno izabrana iz grupe koja sadrži sekvence CDR koje imaju 4, 3, 2 ili samo 1 aminokiselinu razlike u odnosu na sekvencu CDR navedenu u Tabeli A-8, najmanje jedan a poželjno oba druga CDR-a budu pogodno izabrana od sekvenci CDR koje pripadaju istoj kombinaciji u Tabeli A-8 (tj. pomenute su u istom redu u tabeli A-8) ili su pogodno izabrana iz grupe koja sadrži sekvence CDR koje imaju 4, 3, 2 ili samo 1 aminokiselinu razlike u odnosu na sekvence CDR koje pripadaju istoj kombinaciji.

[0279] Analiza sekvenci dobijenih vezivača dodatno je dovela do identifikacije 6 različitih klastera. Obezbeđena su odgovarajući poravnanja (vidite Tabelu A-1, Tabelu A-2, Tabelu A-3, Tabelu A-4, Tabelu A-5 i Tabelu A-6). Grupisanje je zasnovano na sličnostima i razlikama sekvence CDR2 i CDR3. Klaster A je najistaknutiji i obuhvata 50 klonova (SEQ ID NO: 1-50), klaster B kao i klaster D su predstavljeni samo 1 klonom (SEQ ID NO: 51, odnosno SEQ ID NO: 52), klaster C obuhvata 4 klona (SEQ ID NO: 53-65), klaster E obuhvata 9 klonova (SEQ ID NO: 57-56), a klaster F obuhvata 15 klonova (SEQ ID NO: 66-80). Grupisanje je zasnovano na strukturnim sličnostima i razlikama aminokiselinske sekvence koje su prevedene u funkcionalne sličnosti i razlike, kao što je prikazano u primerima. Predstavnici svih klastera su izolovani na osnovu visokoafinitetnog vezivanja za CD3 (primeri 3 i 4) i aktivacije humanih T ćelija (primer 4.2). Generalno, predstavnici klastera A su pokazali najbolje vrednosti EC50. Iako su predstavnici klastera C imali nešto manje povoljne vrednosti EC50 nego predstavnici klastera B, predstavnici klastera C su imali niže vrednosti IC50 u testu ubijanja Ramosovih ćelija posredovanog T ćelijama na bazi protočne citometrije (videti primer 10).

[0280] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid definisan zahtevima, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), pri čemu se CDR1 bira iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 81; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline razlike u odnosu na SEQ ID NO: 81, pri čemu

o na poziciji 1, G je promenjeno u R;

o na poziciji 3, T je promenjeno u A;

o na poziciji 4, Y je promenjeno u F;

o na poziciji 8, S je promenjeno u G; i/ili

o na poziciji 10, G je promenjeno u A.

[0281] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid definisan zahtevima, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), pri čemu je CDR2 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 101; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline razlike u odnosu na SEQ ID NO: 101, pri čemu

o na poziciji 3, V je promenjeno u T ili A;

o na poziciji 5, S je promenjeno u T;

o na poziciji 6, G je promenjeno u D ili E; i/ili

o na poziciji 9, T je promenjeno u S, A ili P.

[0282] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid definisan zahtevima, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), pri čemu je CDR3 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 123; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1, 2 ili 3 aminokiseline razlike u odnosu na SEQ ID NO: 123, pri čemu

o na poziciji 2, I je promenjeno u T;

o na poziciji 9, I je promenjeno u V; i/ili

o na poziciji 10, A je promenjeno u P.

[0283] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid definisan zahtevima, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 81-87; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 101-109; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 123-127; i

[0284] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid definisan zahtevima, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 81, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 101, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 123.

[0285] Nanotela koja pripadaju klasteru B predstavljena su 1 klonom.

[0286] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 88; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 110; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 128; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 1, 2 ili 3 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 128.

[0287] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 88, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 110, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 128.

[0288] Nanotela iz klastera C pokazuju vrlo ograničenu varijabilnost sekvenci u CDR-u.

[0289] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), pri čemu je CDR2 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 112; i

112, pri čemu

o na poziciji 2, V je promenjen u A.

[0290] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 90; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 112-113; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 130; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 1, 2 ili 3 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 130.

[0291] U jednom aspektu, predmetno otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 90, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 112, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 130.

[0292] Nanotela koja pripadaju klasteru D predstavljena su 1 klonom.

[0293] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 89; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 111; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 129; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 1, 2 ili 3 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 129.

[0294] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 89, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 111, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 129.

[0295] Klaster E obuhvata 9 klonova.

[0296] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), pri čemu je CDR1 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 91; i

o na poziciji 6, R je promenjeno u N ili T;

o na poziciji 7, N je promenjeno u H; i/ili

o na poziciji 8, M je promenjeno u T.

[0297] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), pri čemu je CDR2 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 114; i

o na poziciji 1, R je promenjeno u Q;

o na poziciji 3, T je promenjeno u S; i/ili

o na poziciji 7, D je promenjeno u A ili K.

[0298] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), pri čemu je CDR3 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 131; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1 ili 2 aminokiseline razlike u odnosu na SEQ ID NO: 131, pri čemu

o na poziciji 2, S je promenjeno u R; i/ili

o na poziciji 6, S je promenjeno u V.

[0299] U jednom otelotvorenju, ovo otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 91-93; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 114-117; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 131-133; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 131.

[0300] U jednom otelotvorenju, ovo otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 91, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 114, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 131.

[0301] Nanotela koja pripadaju klasteru F predstavljena su sa 15 klonova.

[0302] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), pri čemu je CDR1 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 94; i

o na poziciji 3, S je promenjeno u T, A ili G;

o na poziciji 5, N je promenjeno u S;

o na poziciji 6, M je promenjeno u T ili A; i/ili

o na poziciji 9, L je promenjeno u M.

[0303] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), pri čemu je CDR2 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 118; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline razlike u odnosu na SEQ ID NO: 118, pri čemu

o na poziciji 2, H je promenjeno u V;

o na poziciji 5, S je promenjeno u H ili A;

o na poziciji 8, N je promenjeno u S; i/ili

o na poziciji 10, Y je promenjeno u F.

[0304] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), pri čemu je CDR3 odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 134; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje imaju 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline razlike u odnosu na SEQ ID NO: 134, pri čemu

o na poziciji 6, A je promenjeno u S ili D;

o na poziciji 7, F je promenjeno u Y ili A;

o na poziciji 8, R je promenjeno u H;

o na poziciji 9, S je promenjeno u A;

o na poziciji 11, G je promenjeno u D, T, N, S, K ili R; i/ili

o na poziciji 14, V je promenjeno u I.

[0305] U jednom otelotvorenju, ovo otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 94-100; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 118-122; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 134-143; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 134.

[0306] U jednom otelotvorenju, ovo otkriće se odnosi na polipeptid kao što je opisan ovde, pri čemu se pomenuti prvi ISV suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 94, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 118, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 134.

[0307] Drugi pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV) polipeptida iz pronalaska ima visok afinitet prema/vezuje se za antigen na ciljnoj ćeliji, poželjno ćeliji kancera. „Ciljna ćelija“, kao što se ovde koristi, jeste ćelija koja prezentuje određeni antigen na svojoj površini. U poželjnom aspektu, „ciljna ćelija“ je ćelija kancera.

[0308] Membrana (takođe se naziva plazma membrana ili fosfolipidni dvosloj) okružuje citoplazmu ćelije, što predstavlja spoljašnju granicu ćelije, tj. membrana je površina ćelije. Uloga ove membrane je da odvoji i zaštiti ćeliju od njenog okruženja i načinjena je prevashodno od dvostrukog sloja fosfolipida. Unutar ove membrane se nalazi niz molekula proteina, kao što su kanali, pumpe i ćelijski receptori. Pošto je membrana fluidna, molekuli proteina mogu da putuju unutar membrane. Termin „antigen na ciljnoj ćeliji“, kao što se ovde koristi, označava molekul koji je prikazan na površini ćelije. U većini slučajeva, ovaj molekul će se nalaziti u plazma membrani ćelije, ili na njoj, tako da bar deo ovog molekula ostane dostupan izvan ćelije u tercijarnom obliku. Neograničavajući primer za molekul ćelijske površine, koji se nalazi u membrani plazme, jeste transmembranski protein koji u svojoj tercijarnoj konformaciji obuhvata regione hidrofilnosti i hidrofobnosti. Ovde najmanje jedan hidrofobni region omogućava da se molekul ćelijske površine ugradi ili ubaci u hidrofobnu plazma membranu ćelije, dok se hidrofilni regioni protežu sa obe strane plazma membrane u citoplazmu, odnosno ekstracelularni prostor.

[0309] Navedeni antigen može biti bilo koji cilj na ćeliji, npr. tumorski antigen. U poželjnom otelotvorenju, pomenuti antigen je specifičan za pomenutu ciljnu ćeliju, npr. ćeliju kancera, kao što je antigen povezan sa tumorom (TAA) na pomenutoj ćeliji kancera.

[0310] Termin „tumorski antigen“, kao što se ovde koristi, može se razumeti kao antigeni koji su prezentovani na tumorskim ćelijama. Ovi antigeni mogu biti prezentovani na ćelijskoj površini sa ekstracelularnim delom, koji je često kombinovan sa transmembranskim i citoplazmatskim delom molekula. Ovi antigeni ponekad mogu biti prezentovani samo od strane tumorskih ćelija, a nikad od strane normalne ili zdrave ćelije. Tumorski antigeni mogu biti isključivo eksprimirani na tumorskim ćelijama ili mogu predstavljati mutaciju specifičnu za tumor u poređenju sa normalnim ćelijama. U ovom slučaju, oni se nazivaju antigeni specifični za tumor. Međutim, to generalno nije tako. Češći su antigeni koje prezentuju ćelije tumora i normalne ćelije, a oni se nazivaju „antigeni povezani sa tumorom (TAA)“. Ovi antigeni povezani sa tumorom mogu biti prekomerno eksprimirani na tumorskim ćelijama u poređenju sa normalnim ćelijama ili su pristupačniji za vezivanje antitela kod tumorskih ćelija zbog manje kompaktne strukture tumorskog tkiva u poređenju sa normalnim tkivom. TAA su poželjno antigeni koji se eksprimiraju na ćelijama određenih tumora, ali koji se poželjno ne eksprimiraju u normalnim ćelijama. Često, TAA su antigeni koji se obično eksprimiraju u ćelijama samo u određenim tačkama razvoja organizma (na primer, tokom razvoja fetusa) i koji se neadekvatno eksprimiraju u organizmu u sadašnjem trenutku razvoja, ili su antigeni koji nisu eksprimirani u normalnim tkivima ili ćelijama organa koji sada eksprimira antigen.

[0311] U jednom otelotvorenju, pomenuti prvi antigen na ciljnoj ćeliji je tumorski antigen, poželjno antigen povezan sa tumorom (TAA).

[0312] U jednom otelotvorenju, pomenuti drugi antigen na ciljnoj ćeliji je tumorski antigen, poželjno antigen povezan sa tumorom (TAA).

[0313] U jednom otelotvorenju, antigen je prisutan u većoj količini na ćeliji kancera nego na normalnoj ćeliji. Antigen na ciljnoj ćeliji je poželjno antigen povezan sa tumorom (TAA). Poželjni TAA uključuju MART-1, karcinoembrionski antigen („CEA“), gp100, MAGE-1, HER-2, CD20, Luisove<Y>antigene, hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom (MCSP), receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), protein aktivacije fibroblasta (FAP), CD19 i CD33.

[0314] Antigeni ćelijske površine koji su preferentno eksprimirani na AML LSC u poređenju sa normalnim hematopoetskim matičnim ćelijama, i stoga poželjni kao TAA, uključuju CD123, CD44, CLL-1, CD96, CD47, CD32, CXCR4, Tim-3 i CD25.

[0315] Drugi antigeni povezani sa tumorom pogodni kao antigen na ciljnoj ćeliji za vezivanje drugim ISV u okviru polipeptida iz pronalaska uključuju: TAG-72, Ep-CAM, PSMA, PSA, glikolipide poput GD2 i GD3.

[0316] TAA takođe uključuje antigene hematopoetske diferencijacije, tj. glikoproteine koji su obično povezani sa grupisanjem klastera diferencijacije (CD), kao što su CD4, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD45, CD52, CD69 i CD147; receptore faktora rasta, uključujući HER2, ErbB3 i ErbB4; receptore citokina uključujući gama lanac receptora interleukina-2 (CD132 antigen), alfa lanac receptora interleukina-10 (IL-10R-A), beta lanac receptora interleukina-10 (!L-10R-B), beta-1 lanac receptora interleukina-12 (IL-12R-beta1), beta-2 lanac receptora interleukina-12 (IL-12 receptor beta-2), alfa-1 lanac receptora interleukina-13 (IL-13R-alfa-1) (CD213a1 antigen), alfa-2 lanac receptora interleukina-13 (interleukin-13 vezujući protein), receptor interleukina-17 (IL-17 receptor), receptor interleukina-17B (IL-17B receptor), prekursor receptora interleukina 21 (IL-21R), receptor interleukina-1 tip I (IL-1R-1) (CD121a), receptor interleukina-1 tip II (IL-1R-beta) (CDw121b), antagonistički protein receptora interleukina-1 (IL-1ra), alfa lanac receptora interleukina-2 (CD25 antigen), beta lanac receptora interleukina-2 (CD122 antigen), alfa lanac receptora interleukina-3 (IL-3R-alfa) (CD123 antigen); kao i druge, kao što su CD30, IL23R, IGF-1R, IL5R, IgE, CD248 (endosijalin), CD44v6, gpA33, Ron, Trop2, PSCA, klaudin 6, klaudin 18.2, CLEC12A, CD38, ephA2, c-Met, CD56, MUC16, EGFRvIII, AGS-16, CD27L, nektin-4, SLITRK6, mezotelin, receptor folata, faktor tkiva, axl, glipikan-3, CA9, kripto, CD138, CD37, MUC1, CD70, receptor peptida koji oslobađa gastrin, PAP, CEACAM5, CEACAM6, CXCR7, N-kadherin, FXYD2 gama a, CD21, CD133, Na/K-ATPazu, mlgM (IgM vezan za membranu), mlgA (IgA vezan za membranu), Mer, Tyro2, CD120, CD95, CA 195, DR5, DR6, DcR3 i CAlX.

[0317] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu je pomenuti TAA izabran iz grupe koja se sastoji od hondroitin sulfat proteoglikana povezanog sa melanomom (MCSP), receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), proteina aktivacije fibroblasta (FAP), MART-1, karcinoembrionskog antigena (CEA), gp100, MAGE-1, HER-2, Luisovih<Y>antigena, CD123, CD44, CLL-1, CD96, CD47, CD32, CXCR4, Tim-3, CD25, TAG-72, Ep-CAM, PSMA, PSA, GD2, GD3, CD4, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD45, CD52, CD147, receptora faktora rasta uključujući ErbB3 i ErbB4, receptora citokina uključujući gama lanac receptora interleukina-2 (CD132 antigen), alfa lanca receptora interleukina-10 (IL-10R-A), beta lanca receptora interleukina-10 (IL-10R-B), beta-1 lanca receptora interleukina-12 (IL-12R-beta1), beta-2 lanca receptora interleukina-12 (IL-12 receptor beta-2), alfa-1 lanca receptora interleukina-13 (IL-13R-alfa-1) (CD213a1 antigen), alfa-2 lanca receptora interleukina-13 (interleukin-13 vezujući protein), receptora interleukina-17 (IL-17 receptor), receptora interleukina-17B (IL-17B receptor), prekursora receptora interleukina 21 (IL-21R), receptora interleukina-1 tip I (IL-1R-1) (CD121a), receptora interleukina-1 tip II (IL-1R-beta) (CDw121b), antagonističkog proteina receptora interleukina-1 (IL-1ra), alfa lanca receptora interleukina-2 (CD25 antigen), beta lanca receptora interleukina-2 (CD122 antigen), alfa lanca receptora interleukina-3 (IL-3R-alfa) (CD123 antigen), CD30, IL23R, IGF-1R, IL5R, IgE, CD248 (endosijalin), CD44v6, gpA33, Ron, Trop2, PSCA, klaudina 6, klaudina 18.2, CLEC12A, CD38, ephA2, c-Met, CD56, MUC16, EGFRvIII, AGS-16, CD27L, nektina-4, SLITRK6, mezotelina, receptora folata, faktora tkiva, axl, glipikana-3, CA9, kripto, CD138, CD37, MUC1, CD70, receptora peptida koji oslobađa gastrin, PAP, CEACAM5, CEACAM6, CXCR7, N-kadherina, FXYD2 gama a, CD21, CD133, Na/K-ATPaze, mlgM (IgM vezan za membranu), mlgA (IgA vezan za membranu), Mer, Tyro2, CD120, CD95, CA 195, DR5, DR6, DcR3 i CAlX, i povezanih polimorfnih varijanti i izooblika, pri čemu je pomenuti TAA poželjno CD20 (UniProt 11836), HER2 (Uniprot P04626), polimorfne varijante i/ili izooblici prethodnog.

[0318] Drugi gradivni blok, ISV, nanotelo ili VHH iz pronalaska ima visok afinitet prema svom cilju, tj. CD3. Drugi gradivni blok, ISV ili nanotelo iz pronalaska mogu, na primer, biti usmereni na antigensku determinantu, epitop, deo, domen, podjedinicu ili konformaciju (gde je primenljivo) pomenutog antigena na ciljnoj ćeliji.

[0319] Ciljna ćelija se posebno odnosi na ćelije sisara, a poželjno na ćelije primata, a još poželjnije na humane ćelije. Ciljna ćelija je poželjno hiperproliferativna ćelija kao što je npr. ćelija kancera.

[0320] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu se pomenuti drugi ili dalji ISV vezuje za antigen na ciljnoj ćeliji sa prosečnom vrednošću KD od 100 nM do 10 pM, kao što je prosečna vrednost KD od 90 nM ili manje, još poželjnije sa prosečnom vrednošću KD od 80 nM ili manjom, kao što je manje od 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM ili čak i manje, kao što je manje od 4, 3, 2 ili 1 nM, kao što je manje od 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 pM ili čak i manje, recimo manje od 10 pM. KD se poželjno određuje putem KinExA ili SPR, na primer kao što određuje Proteon.

[0321] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuti drugi ili dalji ISV ima visok afinitet prema antigenu kada se meri kao jednovalentan.

[0322] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu se pomenuta prosečna vrednost KD meri putem površinske plazmonske rezonance (SPR) i/ili KinExA ili Proteon, na primer na rekombinantnom proteinu, kao što je opisano u odeljku Primeri.

[0323] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu se pomenuti drugi ili dalji ISV vezuje za antigen na ciljnoj ćeliji sa vrednošću EC50 od 100 nM do 1 pM, kao što je prosečna vrednost EC50 od 100 nM ili manja, još poželjnije sa prosečnom vrednošću EC50 od 90 nM ili manjom, kao što je manje od 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 nM ili čak i manje, kao što je manje od 4, 3, 2 ili 1 nM ili čak i manje, kao što je manje od 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 pM, ili čak i manje, kao što je manje od 4 pM.

[0324] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu se pomenuta prosečna vrednost EC50 određuje putem FACS ili ELISA na jednovalentnom drugom ISV, kao što je nanotelo, ili polipeptidu koji obuhvata jednovalentan drugi ISV, kao što je nanotelo.

[0325] U primerima je pokazano da KD ima dobru korelaciju sa EC50.

[0326] Istovremeno ciljanje više antigena smanjuje verovatnoću generisanja varijanti za bekstvo tumora, zbog čega je terapeutska aktivnost strategije aktiviranja T ćelija poboljšana. Predmetni pronalazak obezbeđuje multispecifične polipeptide koji obuhvataju CD3 ISV u kombinaciji sa pojedinačnim varijabilnim domenima imunoglobulina usmerenim na različite (ciljne) antigene (na ciljnoj ćeliji) (videti primer 19). Ispod su navedene poželjne kombinacije prvog i drugog antigena (biće jasno da ISV koji vezuju pomenute antigene mogu biti pozicionirani bilo kojim redosledom u polipeptidu iz pronalaska):

[0327] Slično tome, istovremno ciljanje više epitopa, antigenskih determinanti, delova, domena, podjedinica ili konformacija proteina ili antigena na ciljnoj ćeliji može smanjiti verovatnoću generisanja varijanti za bekstvo tumora, zbog čega je poboljšana terapeutska aktivnost strategije angažovanja T ćelija (videti primer 20). Predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptide koji obuhvataju anti-CD3 ISV u kombinaciji sa pojedinačnim varijabilnim domenima imunoglobulina usmerenim na različite epitope, antigenske determinante, delove, domene, podjedinice ili konformacije antigena na ciljnoj ćeliji (takođe se nazivaju biparatopski konstrukti). Ispod su navedene poželjne kombinacije prvog i drugog TAA ISV (biće jasno da ISV koji vezuju pomenute antigene mogu biti pozicionirani bilo kojim redosledom u polipeptidu iz pronalaska):

[0328] Polipeptidi i kompozicije iz predmetnog pronalaska mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje bolesti i poremećaja iz predmetnog pronalaska (ovde se takođe nazivaju „bolesti i poremećaji iz predmetnog pronalaska“) koje uključuju, bez ograničenja, kancer. Termin „kancer“ se odnosi na patološko stanje kod sisara koje tipično karakteriše neregulisana ćelijska proliferacija ili opstanak. Primeri za kancer uključuju, bez ograničenja, karcinome, gliome, mezoteliome, melanome, limfome, leukemije, adenokarcinome: kancer dojke, kancer jajnika, kancer grlića materice, glioblastom, multipli mijelom (uključujući monoklonsku gameopatiju neodređenog značaja, asimptomatski i simptomatski mijelom), kancer prostate, Burkitov limfom, kancer glave i vrata, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, nemikrocelularni kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, kancer jednjaka, kancer želuca, kancer pankreasa, hepatobilijarni kancer, kancer žučne kese, kancer tankog creva, kancer rektuma, kancer bubrega, kancer bešike, kancer prostate, kancer penisa, kancer uretre, kancer testisa, vaginalni kancer, kancer materice, kancer štitne žlezde, paratiroidni kancer, adrenalni kancer, endokrini kancer pankreasa, karcinoidni kancer, kancer kostiju, kancer kože, retinoblastom, Hodžkinov limfom, non-Hodžkinov limfom, Kapošijev sarkom, multicentričnu Kastelmanovu bolest ili primarni efuzioni limfom povezan sa sindromom stečene imunodeficijencije, neuroektodermalne tumore, rabdomiosarkom (za dodatne kancere videti, npr. Cancer, Principles and practice (DeVita, et al. eds 1997)); kao i sve metastaze bilo kog od prethodnih kancera.

[0329] Za opšti opis pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina, upućuje se na dalji opis u nastavku, kao i na stručnu literaturu koja je ovde navedena. U tom pogledu, međutim, treba napomenuti da ovaj opis i prethodno stanje tehnike uglavnom opisuju pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina takozvane „VH3 klase“ (tj. pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina sa visokim stepenom homologije sa humanim germinativnim sekvencama VH3 klase kao što je DP-47, DP-51 ili DP-29), što čini poželjni aspekt ovog pronalaska. Međutim, treba napomenuti da pronalazak u svom najširem smislu generalno obuhvata bilo koju vrstu pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina i, na primer, takođe obuhvata pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina koji pripadaju takozvanoj „VH4 klasi“ (tj. pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina sa većim stepenom homologije sekvence sa humanim germinativnim sekvencama VH4 klase kao što je DR-78), kao što je, na primer, opisano u WO 07/118670.

[0330] Uopšteno, pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina (naročito VHHsekvence i sekvence optimizovanih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina) posebno mogu biti okarakterisani prisustvom jednog ili više „svojstvenih ostataka“ (kao što je, na primer, opisano u tabeli B-2) u jednoj ili više sekvenci okvira (ponovo, kao što je ovde detaljnije opisano).

Tabela B-2: Svojstveni ostaci u VHH

(2)Obično kao GLEW na pozicijama 44-47.

(3)Obično kao KERE ili KQRE na pozicijama 43-46, npr. kao KEREL, KEREF, KQREL, KQREF, KEREG, KQREW ili KQREG na pozicijama 43-47. Alternativno, takođe su moguće sekvence kao što su TERE (na primer TEREL), TQRE

(na primer TQREL), KECE (na primer KECEL ili KECER), KQCE (na primer KQCEL), RERE (na primer REREG), RQRE (na primer RQREL, RQREF ili RQREW), QERE (na primer QEREG), QQRE, (na primer QQREW, QQREL ili QQREF), KGRE (na primer KGREG), KDRE (na primer KDREV). Neke druge moguće, ali manje poželjne sekvence uključuju, na primer, DECKL i NVCEL.

(4)Sa GLEW na pozicijama 44-47 i KERE ili KQRE na pozicijama 43-46.

Pozicija Humani VH3 Svojstveni ostaci

(5)Često kao KP ili EP na pozicijama 83-84 prirodnih VHHdomena.

(6)Naročito, ali ne isključivo, u kombinaciji sa GLEW na pozicijama 44-47.

(7)Pod uslovom da, kada su pozicije 44-47 GLEW, pozicija 108 je uvek Q u (nehumanizovanim) VHHsekvencama koje takođe sadrže W na 103.

(8)GLEW grupa takođe sadrži sekvence nalik na GLEW na pozicijama 44-47, kao što su, na primer, GVEW, EPEW, GLER, DQEW, DLEW, GIEW, ELEW, GPEW, EWLP, GPER, GLER i ELEW.

[0331] Imunoglobulini iz pronalaska takođe mogu da sadrže C-terminalnu ekstenziju (X)n (u kojoj je n 1 do 10, poželjno 1 do 5, na primer 1, 2, 3, 4 ili 5 (a poželjno je 1 ili 2, na primer 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, a poželjno nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ili izoleucina (I)), za koju se upućuje na WO 12/175741.

[0332] Opet, takvi pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina mogu biti dobijeni na bilo koji odgovarajući način iz bilo kog odgovarajućeg izvora, i mogu, na primer, biti prirodne VHHsekvence (tj. od pogodne vrste kamelida, npr. lame) ili sintetički ili polusintetički VH ili VL (npr. čoveka). Takvi pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina mogu da uključuju „humanizovane“ ili VHH kojima je na drugi način „optimizovana sekvenca“, „kamelizovane“ sekvence imunoglobulina (a naročito kamelizovane sekvence varijabilnog domena teškog lanca, tj. kamelizovane VH), kao i humane VH, humane VL, VHH kamelida koji su izmenjeni tehnikama kao što je afinitetno sazrevanje (na primer, počevši od sintetičke, nasumične ili prirodne sekvence imunoglobulina), CDR graftovanje, glaziranje, kombinovanje fragmenata dobijenih od različitih sekvenci imunoglobulina, PCR sklapanje koristeći preklapajuće prajmere, i slične tehnike za konstruisanje imunoglobulina koje su dobro poznate stručnjaku; ili bilo koju pogodnu kombinaciju bilo čega od prethodnog kao što je ovde dalje opisano.

[0333] Kao što je ovde pomenuto, posebno poželjna klasa pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina obuhvaćenih u polipeptidu iz pronalaska uključuje pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina sa aminokiselinskom sekvencom koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci prirodnog VHHdomena, ali koja je „humanizovana“, tj. zamenom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci pomenute prirodne sekvence VHH(a naročito u sekvenci okvira) sa jednim ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajućim pozicijama u VHdomenu konvencionalnog 4-lančanog antitela ljudskog bića (npr. kao što je prethodno naznačeno). Ovo se može izvesti na način koji je već poznat, koji će biti jasan stručnjaku, na primer na osnovu daljeg opisa u ovom tekstu i prethodne stručne literature o humanizaciji koja se ovde daje kao referenca. Još jednom, treba napomenuti da se takvi humanizovani pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina obuhvaćeni u polipeptidu iz pronalaska mogu dobiti na bilo koji odgovarajući način koji je već poznat, te tako nisu strogo ograničeni na polipeptide koji su dobijeni koristeći polipeptid koji obuhvata prirodni VHHdomen kao polaznu supstancu. Još jedna posebno poželjna klasa pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina obuhvaćenih u polipeptidu iz pronalaska uključuju pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina sa aminokiselinskom sekvencom koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci prirodnog VHdomena, ali koja je „kamelizovana“, tj. zamenom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci prirodnog VHdomena iz konvencionalnog 4-lančanog antitela sa jednim ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajućim pozicijama u VHHdomenu antitela teškog lanca. Ovo se može izvesti na način koji je već poznat, što će biti jasno stručnjaku, na primer na osnovu opisa u ovom tekstu. Takve „kamelizujuće“ supstitucije su poželjno ubačene na aminokiselinske pozicije koje formiraju VH-VLmeđupovršinu i/ili su prisutne na njoj, i/ili na takozvanim svojstvenim pozicijama kamelida kao što je ovde definisano (vidite takođe, na primer, WO 94/04678 i Davies i Riechmann 1994 (FEBS letters 339: 285-290) i 1996 (Protein Engineering 9: 531-537)). Poželjno, sekvenca VHkoja se koristi kao polazna supstanca ili kao polazna tačka za dobijanje ili konstruisanje kamelizovanih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina je poželjno VHsekvenca sisara, poželjnije VHsekvenca ljudskog bića, kao što je sekvenca VH3. Međutim, treba napomenuti da se takvi kamelizovani pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina iz pronalaska mogu dobiti na bilo koji odgovarajući način koji je već poznat, te tako nisu strogo ograničeni na polipeptide koji su dobijeni koristeći polipeptid koji obuhvata prirodni VHdomen kao polaznu supstancu.

[0334] Na primer, ponovo kao što je ovde dalje opisano, i „humanizacija“ i „kamelizacija“ mogu da se izvedu obezbeđivanjem nukleotidne sekvence koja kodira prirodni VHHdomen, odnosno VHdomen, a zatim zamenom, na način koji je poznat, jednog ili više kodona u pomenutoj nukleotidnoj sekvenci na takav način da nova nukleotidna sekvenca kodira „humanizovani“, odnosno „kamelizovani“ pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina iz pronalaska. Ova nukleinska kiselina zatim može da se eksprimira kao što je već poznato, tako da se dobiju željeni pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina iz pronalaska. Alternativno, na osnovu aminokiselinske sekvence prirodnog VHHdomena, odnosno VHdomena, aminokiselinska sekvenca željenih humanizovanih, odnosno kamelizovanih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina koji su obuhvaćeni u polipeptidu iz pronalaska, može da se konstruiše i zatim sintetiše de novo upotrebom tehnika za sintezu peptida koje su već poznate. Takođe, na osnovu aminokiselinske sekvence ili nukleotidne sekvence prirodnog VHHdomena, odnosno VHdomena, nukleotidna sekvenca koja kodira željene humanizovane, odnosno kamelizovane pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina iz pronalaska, može da se konstruiše i zatim sintetiše de novo upotrebom tehnika za sintezu nukleinskih kiselina koje su već poznate, nakon čega tako dobijena nukleinska kiselina može da se eksprimira na način koji je već poznat, kako bi se obezbedili željeni pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina u polipeptidu iz pronalaska.

[0335] U skladu sa tim, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti ISV je nanotelo, VHH, humanizovani VHH, ili kamelizovani VH.

[0336] Uopšteno, proteini ili polipeptidi koji obuhvataju jedan gradivni blok, pojedinačni varijabilni domen pojedinačnog imunoglobulina ili pojedinačno nanotelo, ili se suštinski od njega sastoje, ovde će se nazivati „jednovalentni“ proteini ili polipeptidi, „jednovalentni konstrukti“, „jednovalentni gradivni blok“, „jednovalentni pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina“, odnosno „jednovalentno nanotelo“.

[0337] U tom smislu, predmetni pronalazak se takođe odnosi na jednovalentne gradivne blokove koji sačinjavaju polipeptide iz pronalaska.

[0338] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na ISV ili polipeptid koji specifično vezuje konstantni domen CD3 i koji obuhvata ili se suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 81-87; ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 101-109; ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 123-127; ili

[0339] Kao što je prethodno pomenuto, izolovani su ISV koji pripadaju različitim klasterima, na osnovu strukturnih sličnosti i razlika CDR2 i CDR3.

[0340] Pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji pripadaju klasteru A predstavljeni su polipeptidima, pri čemu:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 81-87; i

(b) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 81, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR1 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR1 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 101-109; i

(d) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 101, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR2 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR2 bez 4, 3, 2, ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom; i/ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 123-127; i

(f) aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po 4, 3, 2 ili 1 aminokiselini od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 123, pod uslovom da polipeptid koji obuhvata CDR3 sa 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinom razlike vezuje CD3 sa otprilike istim ili većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem polipeptidom koji obuhvata CDR3 bez 4, 3, 2 ili 1 aminokiseline razlike, pri čemu je pomenuti afinitet izmeren površinskom plazmonskom rezonancom.

[0341] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru A, CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 81; i

o na poziciji 1, G je promenjeno u R;

o na poziciji 3, T je promenjeno u A;

o na poziciji 4, Y je promenjeno u F;

o na poziciji 8, S je promenjeno u G; i/ili

o na poziciji 10, G je promenjeno u A.

[0342] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru A, CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 101; i

o na poziciji 3, V je promenjeno u T ili A;

o na poziciji 5, S je promenjeno u T;

o na poziciji 6, G je promenjeno u D ili E; i/ili

o na poziciji 9, T je promenjeno u S, A ili P.

[0343] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru A, CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 123; i

o na poziciji 2, I je promenjeno u T;

o na poziciji 9, I je promenjeno u V; i/ili

o na poziciji 10, A je promenjeno u P.

[0344] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na ISV ili polipeptid koji specifično vezuje CD3 i koji obuhvata ili se suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 81; i

− na poziciji 1, G je promenjeno u R;

− na poziciji 3, T je promenjeno u A;

− na poziciji 4, Y je promenjeno u F;

− na poziciji 8, S je promenjeno u G; i/ili

− na poziciji 10, G je promenjeno u A,

i u kome

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 101; i

− na poziciji 3, V je promenjeno u T ili A;

− na poziciji 5, S je promenjeno u T;

− na poziciji 6, G je promenjeno u D ili E; i/ili

− na poziciji 9, T je promenjeno u S, A ili P,

i u kome

(iii) CDR3 se bira iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 123; i

− na poziciji 2, I je promenjeno u T;

− na poziciji 9, I je promenjeno u V; i/ili

− na poziciji 10, Aje promenjeno u P.

[0345] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid kao što je definisan zahtevima, gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 81, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 101, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 123. Poželjno je da polipeptid bude izabran od bilo kog od SEQ ID NO: 1 do 50.

[0346] Pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji pripadaju klasteru B predstavljeni su polipeptidima, pri čemu:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 88; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 110; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 128; i

[0347] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru B, CDR1 je SEQ ID NO: 88.

[0348] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru B, CDR2 je SEQ ID NO: 110.

[0349] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru B, CDR3 je SEQ ID NO: 128.

[0350] U drugom aspektu, otkriće se odnosi na polipeptid u kome: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 88, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 110, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 128. Polipeptid je poželjno SEQ ID NO: 51.

[0351] Pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji pripadaju klasteru C predstavljeni su polipeptidima, pri čemu:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 90; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 112-113; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 130; i

[0352] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru C, CDR1 je SEQ ID NO: 90.

[0353] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru C, CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 112; i

112, pri čemu

o na poziciji 2, V je promenjen u A.

[0354] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru C, CDR3 je SEQ ID NO: 130.

[0355] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na ISV ili polipeptid koji specifično vezuje CD3 i koji obuhvata ili se suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde:

(i) CDR1 je SEQ ID NO: 90; i

i u kome

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 112; i

na poziciji 2, V je promenjeno u A,

i u kome

(iii) CDR3 je SEQ ID NO: 130.

[0356] U drugom aspektu, otkriće se odnosi na polipeptid u kome: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 90, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 112, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 130. Poželjno je da polipeptid bude izabran od bilo kog od SEQ ID NO: 53-56.

[0357] Pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji pripadaju klasteru D predstavljeni su polipeptidima, pri čemu:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 89; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 111; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 129; i

[0358] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru D, CDR1 je SEQ ID NO: 89.

[0359] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru D, CDR2 je SEQ ID NO: 111.

[0360] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru D, CDR3 je SEQ ID NO: 129.

[0361] U drugom aspektu, otkriće se odnosi na polipeptid u kome: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 89, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 111, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 129. Polipeptid je poželjno SEQ ID NO: 52.

[0362] Pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji pripadaju klasteru E predstavljeni su polipeptidima, pri čemu:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 91-93; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 114-117; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 131-133; i

[0363] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru E, CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 91; i

o na poziciji 6, R je promenjeno u N ili T;

o na poziciji 7, N je promenjeno u H; i/ili

o na poziciji 8, M je promenjeno u T.

[0364] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru E, CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 114; i

o na poziciji 1, R je promenjeno u Q;

o na poziciji 3, T je promenjeno u S; i/ili

o na poziciji 7, D je promenjeno u A ili K.

[0365] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru E, CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 131; i

131, pri čemu

o na poziciji 2, S je promenjeno u R; i/ili

o na poziciji 6, S je promenjeno u V.

[0366] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na ISV ili polipeptid koji specifično vezuje CD3 i koji obuhvata ili se suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 91; i

− na poziciji 6, R je promenjeno u N ili T;

− na poziciji 7, N je promenjeno u H; i/ili

− na poziciji 8, M je promenjeno u T,

i u kome

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 114; i

− na poziciji 1, R je promenjeno u Q;

− na poziciji 3, T je promenjeno u S; i/ili

− na poziciji 7, D je promenjeno u A ili K,

i u kome

(iii) CDR3 se bira iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 131; i

− na poziciji 2, S je promenjeno u R; i/ili

− na poziciji 6, S je promenjeno u V.

[0367] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 91, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 114, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 131. Poželjno je da polipeptid bude izabran od bilo kog od SEQ ID NO: 57-65.

[0368] Pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji pripadaju klasteru F predstavljeni su polipeptidima, pri čemu:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 94-100; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 118-122; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 134-143; i

[0369] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru F, CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 94; i

o na poziciji 3, S je promenjeno u T, A ili G;

o na poziciji 5, N je promenjeno u S;

o na poziciji 6, M je promenjeno u T ili A; i/ili

o na poziciji 9, L je promenjeno u M.

[0370] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru F, CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 118; i

o na poziciji 2, H je promenjeno u V;

o na poziciji 5, S je promenjeno u H ili A;

o na poziciji 8, N je promenjeno u S; i/ili

o na poziciji 10, Y je promenjeno u F.

[0371] U drugom aspektu, u polipeptidima koji pripadaju klasteru F, CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 134; i

o na poziciji 6, A je promenjeno u S ili D;

o na poziciji 7, F je promenjeno u Y ili A;

o na poziciji 8, R je promenjeno u H;

o na poziciji 9, S je promenjeno u A;

o na poziciji 11, G je promenjeno u D, T, N, S, K ili R; i/ili

o na poziciji 14, V je promenjeno u I.

[0372] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na ISV ili polipeptid koji specifično vezuje CD3 i koji obuhvata ili se suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), gde:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 94; i

− na poziciji 3, S je promenjeno u T, A ili G;

− na poziciji 5, N je promenjeno u S;

− na poziciji 6, M je promenjeno u T ili A; i/ili

− na poziciji 9, L je promenjeno u M,

i u kome

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 118; i

− na poziciji 2, H je promenjeno u V;

− na poziciji 5, S je promenjeno u H ili A;

− na poziciji 8, N je promenjeno u S; i/ili

− na poziciji 10, Y je promenjeno u F,

i u kome

(iii) CDR3 se bira iz grupe koja se sastoji od

(a) SEQ ID NO: 134; i

− na poziciji 6, A je promenjeno u S ili D;

− na poziciji 7, F je promenjeno u Y ili A;

− na poziciji 8, R je promenjeno u H;

− na poziciji 9, S je promenjeno u A;

− na poziciji 11, G je promenjeno u D, T, N, S, K ili R; i/ili

− na poziciji 14, V je promenjeno u I.

[0373] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje polipeptid kao što je ovde opisan, gde: CDR1 je predstavljen sa SEQ ID NO: 94, CDR2 je predstavljen sa SEQ ID NO: 118, a CDR3 je predstavljen sa SEQ ID NO: 134. Poželjno je da polipeptid bude izabran od bilo kog od SEQ ID NO: 66-80.

[0374] U daljem aspektu, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide koji unakrsno blokiraju vezivanje za CD3 putem najmanje jednog ISV ili polipeptida koji pripadaju klasteru A, B, C, D, E ili F.

[0375] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide koji unakrsno blokiraju vezivanje za CD3 putem najmanje jednog ISV ili polipeptida sa SEQ ID NO: 1-50.

[0376] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide koji unakrsno blokiraju vezivanje za CD3 putem ISV ili polipeptida sa SEQ ID NO: 51.

[0377] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide koji unakrsno blokiraju vezivanje za CD3 putem najmanje jednog ISV ili polipeptida sa SEQ ID NO: 53-56.

[0378] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide koji unakrsno blokiraju vezivanje za CD3 putem ISV ili polipeptida sa SEQ ID NO: 52.

[0379] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide koji unakrsno blokiraju vezivanje za CD3 putem najmanje jednog ISV ili polipeptida sa SEQ ID NO: 57-65.

[0380] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide koji unakrsno blokiraju vezivanje za CD3 putem najmanje jednog ISV ili polipeptida sa SEQ ID NO: 66-80.

[0381] U daljem aspektu, otkriće se odnosi na polipeptide koji su unakrsno blokirani u pogledu vezivanja za CD3 putem najmanje jednog ISV ili polipeptida koji pripadaju klasteru A, B, C, D, E ili F.

[0382] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide koji su unakrsno blokirani u pogledu vezivanja za CD3 putem najmanje jednog ISV ili polipeptida koji pripadaju SEQ ID NO: 1-50.

[0383] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide koji su unakrsno blokirani u pogledu vezivanja za CD3 putem ISV ili polipeptida sa SEQ ID NO: 51.

[0384] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide koji su unakrsno blokirani u pogledu vezivanja za CD3 putem najmanje jednog ISV ili polipeptida koji pripadaju SEQ ID NO: 53-56.

[0385] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide koji su unakrsno blokirani u pogledu vezivanja za CD3 putem ISV ili polipeptida sa SEQ ID NO: 52.

[0386] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide koji su unakrsno blokirani u pogledu vezivanja za CD3 putem najmanje jednog ISV ili polipeptida koji pripadaju SEQ ID NO: 57-65.

[0387] Shodno tome, predmetno otkriće se odnosi na polipeptide koji su unakrsno blokirani u pogledu vezivanja za CD3 putem najmanje jednog ISV ili polipeptida koji pripadaju SEQ ID NO: 66-80.

[0388] Pronalazak se dalje odnosi na jedinjenja ili konstrukte, a posebno na proteine ili polipeptide koji obuhvataju jedan ili više ISV ili polipeptida iz pronalaska ili se suštinski sastoje od njih, a opciono dalje obuhvataju jednu ili više drugih grupa, ostataka, funkcionalnih grupa ili vezujućih jedinica. Kao što će stručnjaku biti jasno iz daljeg otkrića u ovom tekstu, takve dodatne grupe, ostaci, funkcionalne grupe, vezujuće jedinice ili aminokiselinske sekvence mogu a ne moraju da obezbede dalju funkcionalnost polipeptidu iz pronalaska (i/ili jedinjenju ili konstruktu u kome je on prisutan) i mogu a ne moraju da izmene osobine polipeptida iz pronalaska.

[0389] U specifičnom, ali neograničavajućem aspektu pronalaska, koji će biti dalje opisan ovde, ISV i polipeptidi iz pronalaska mogu imati produžen poluživot u serumu (kao što je ovde opisano) u poređenju sa pojedinačnim varijabilnim domenom imunoglobulina ili polipeptidom iz kojih su izvedeni. Na primer, pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina ili polipeptid iz pronalaska može biti povezan (hemijskim ili drugim putem) sa jednom ili više grupa ili ostataka koji produžavaju poluživot (kao što je PEG), kako bi se dobio derivat ISV ili polipeptid iz pronalaska sa produženim poluživotom.

[0390] U specifičnom aspektu pronalaska, jedinjenje ili konstrukt iz pronalaska ili polipeptid iz pronalaska mogu imati produženi poluživot, u poređenju sa odgovarajućim ISV ili polipeptidom iz pronalaska. Neki poželjni, ali neograničavajući primeri za takva jedinjenja, konstrukte i polipeptide biće jasni stručnjaku na osnovu daljeg otkrića u ovom tekstu, i, na primer, obuhvataju pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina ili polipeptide iz pronalaska koji su hemijski modifikovani da bi se njihov poluživot produžio (na primer, putem pegilovanja); pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina ili polipeptide iz pronalaska koji obuhvataju najmanje jedno dodatno mesto vezivanja za vezivanje za serumski protein (kao što je serumski albumin); ili konstrukte ili polipeptide iz pronalaska koji obuhvataju najmanje ISV ili polipeptid iz pronalaska koji je povezan sa najmanje jednim ostatkom (a naročito najmanje jednom aminokiselinskom sekvencom) koji produžava poluživot ISV ili polipeptida iz pronalaska. Primeri za ISV ili polipeptide iz pronalaska koji obuhvataju takve ostatke ili pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina koji produžavaju poluživot biće jasni stručnjaku na osnovu daljeg otkrića u ovom tekstu; i, na primer, uključuju, bez ograničenja, polipeptide u kojima je jedan ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina ili polipeptida iz pronalaska pogodno povezano sa jednim ili više serumskih proteina ili njihovih fragmenata (kao što je (humani) serumski albumin ili njegovi pogodni fragmenti) ili sa jednom ili više vezujućih jedinica koje mogu da se vezuju za serumske proteine (kao što su, na primer, domenska antitela, pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji su pogodni za upotrebu kao domenska antitela, jednodomenska antitela, pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji su pogodni za upotrebu kao jednodomensko antitelo, „dAb“, pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina koji su pogodni za korišćenje kao dAb ili nanotela koji mogu da se vezuju za serumske proteine kao što su serumski albumin (kao što je humani serumski albumin), serumski imunoglobulini kao što je IgG, ili transferin; upućuje se na dalji opis i reference pomenute u ovom tekstu); ISV ili polipeptide gde je ISV ili polipeptid iz pronalaska povezan sa Fc delom (kao što je humani Fc) ili njegovim pogodnim delom ili fragmentom; ili polipeptide u kojima je jedan ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina ili polipeptida iz pronalaska pogodno povezano sa jednim ili više malih proteina ili peptida koji mogu da se vezuju za serumske proteine, kao što su, bez ograničenja, proteini i peptidi opisani u WO 91/01743, WO 01/45746, WO 02/076489, WO 08/068280, WO 09/127691 i WO 11/095545.

[0391] Generalno, jedinjenja, konstrukti ili polipeptidi iz pronalaska sa produženim poluživotom poželjno imaju poluživot koji je najmanje 1,5 puta, poželjnije najmanje 2 puta, kao što je najmanje 5 puta, na primer najmanje 10 puta ili više od 20 puta duži od poluživota odgovarajućeg samog ISV ili polipeptida iz pronalaska. Na primer, jedinjenja, konstrukti ili polipeptidi iz pronalaska sa produženim poluživotom mogu imati poluživot, npr. kod ljudi, koji je produžen za više od 1 sata, poželjno više od 2 sata, poželjnije više od 6 sati, kao što je više od 12 sati, ili čak više od 24, 48 ili 72 sata u poređenju sa odgovarajućim samim ISV ili polipeptidom iz pronalaska.

[0392] U jednom poželjnom, ali neograničavajućem aspektu pronalaska, takva jedinjenja, konstrukti ili polipeptidi iz pronalaska imaju poluživot u serumu, npr. kod ljudi, koji je produžen za više od 1 sata, poželjno više od 2 sata, poželjnije više od 6 sati, kao što je više od 12 sati, ili čak više od 24, 48 ili 72 sata u poređenju sa odgovarajućim samim ISV ili polipeptidom iz pronalaska.

[0393] U drugom poželjnom, ali neograničavajućem aspektu pronalaska, takva jedinjenja, konstrukti ili polipeptidi iz pronalaska pokazuju poluživot u serumu čoveka od najmanje oko 12 sati, poželjno najmanje 24 sata, poželjnije najmanje 48 sati, još poželjnije najmanje 72 sata ili više. Na primer, jedinjenja, konstrukti ili polipeptidi iz pronalaska mogu imati poluživot od najmanje 5 dana (kao što je oko 5 do 10 dana), poželjno najmanje 9 dana (kao što je oko 9 do 14 dana), poželjnije najmanje oko 10 dana (kao što je oko 10 do 15 dana), ili najmanje oko 11 dana (kao što je oko 11 do 16 dana), poželjnije najmanje oko 12 dana (kao što je oko 12 do 18 dana ili više), ili duži od 14 dana (kao što je oko 14 do 19 dana).

[0394] U predmetnom pronalasku je pokazano da uključivanje vezujuće jedinice koja cilja albumin u konstrukt samo po sebi nije imalo značajan uticaj na dobijenu potentnost ili efikasnost. Iako je manji gubitak efikasnosti/potentnosti primećen u prisustvu HSA, CD3 multispecifični polipeptidi sa produženim poluživotom su i dalje bili potentni za ubijanje tumorskih ćelija. Dokazano je da je isporuka leka na bazi albumina korisna za postizanje poboljšane terapije za kancer, najviše usled njegovog pasivnog ciljanja tumora putem povećanje propustljivosti i dejstva retencije i povećane tražnje albumina kao izvora energije i aminokiselina od strane tumorskih ćelija. Međutim, albuminu nedostaje ne samo aktivni mehanizam za prevazilaženje barijere ćelijske membrane, već i sposobnost da prodre u tumorska tkiva (Qianqian Guo et al. Polym. Chem., 2013,4, 4584-4587).

[0395] U posebno poželjnom, ali neograničavajućem aspektu pronalaska, pronalazak obezbeđuje polipeptid iz pronalaska koji obuhvata prvi i drugi pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV); i dalje obuhvata jedan ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina (poželjno jedan) koji vezuju serumski albumin kao što je opisano ovde, npr. pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina koji vezuje serumski albumin koji se naziva Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG (Tabela B-3).

Tabela B-3: Pojedinačni varijabilni domeni imunoglobulina za upotrebu u HLE ISV i polipeptida iz pronalaska

[0396] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, koji dalje obuhvata vezujući ostatak serumskog proteina.

[0397] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuti vezujući ostatak serumskog proteina vezuje serumski albumin.

[0398] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuti vezujući ostatak serumskog proteina predstavlja pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina koji vezuje serumski albumin.

[0399] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu, pomenuti ISV koji vezuje serumski albumin suštinski se sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), pri čemu, CDR1 je SFGMS (SEQ ID NO: 373), CDR2 je SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 374), i pri čemu, CDR3 je GGSLSR (SEQ ID NO: 375), CDR određen prema Kabatovoj definiciji; i/ili pri čemu, CDR1 je GFTFSSFGMS (SEQ ID NO: 376) ili GFTFRSFGMS (SEQ ID NO: 377), CDR2 je SISGSGSDTL (SEQ ID NO: 378) i CDR3 je GGSLSR (SEQ ID NO: 375), CDR određen prema Kontermanu 2010.

[0400] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je definisan zahtevima, pri čemu pomenuti ISV koji vezuje serumski albumin obuhvata Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG (Tabela B-3).

[0401] U polipeptidima iz pronalaska, dva ili više gradivnih blokova, ISV ili nanotela i opciono jedan ili više polipeptida, jedna ili više drugih grupa, lekova, agensa, ostataka ili vezujućih jedinica mogu biti međusobno povezani neposredno (kao što je, na primer, opisano u WO 99/23221) i/ili mogu biti međusobno povezani preko jednog ili više odgovarajućih spejsera ili linkera, ili bilo koje njihove kombinacije.

[0402] Odgovarajući spejseri ili linkeri za upotrebu u viševalentnim i multispecifičnim polipeptidima biće poznati stručnjaku, i generalno mogu biti bilo koji linker ili spejser koji se u struci koristi za vezivanje aminokiselinskih sekvenci. Poželjno, pomenuti linker ili spejser je pogodan za upotrebu u konstruisanju proteina ili polipeptida koji su namenjeni za farmaceutsku primenu.

[0403] Neki posebno poželjni spejseri uključuju spejsere i linkere koji se koriste u struci za povezivanje fragmenata antitela ili domena antitela. Oni uključuju linkere koji su pomenuti u opštoj tehničkoj literaturi koja je prethodno navedena, kao i, na primer, linkere koji se u struci koriste za konstruisanje dijatela ili ScFv fragmenata (u ovom pogledu, međutim, treba napomenuti da, dok u dijatelima i ScFv fragmentima, sekvenca linkera koja se koristi treba da ima dužinu, stepen fleksibilnosti i druga svojstva koja omogućavaju da se relevantni VHi VLdomeni spoje kako bi se formiralo kompletno antigen vezujuće mesto, ne postoje posebna ograničenja dužine ili fleksibilnosti linkera koji se koristi u polipeptidu iz pronalaska, pošto svaki ISV ili nanotelo sami čine kompletno antigen vezujuće mesto).

[0404] Na primer, linker može biti odgovarajuća aminokiselinska sekvenca, a naročito aminokiselinske sekvence sa 1 do 50, poželjno od 1 do 30, recimo od 1 do 10 aminokiselina. Neki poželjni primeri za takve aminokiselinske sekvence uključuju gly-ser linkere, na primer tipa (glyxsery)z, kao što je (na primer (gly4ser)3ili (gly3ser2)3, kao što je opisano u WO 99/42077 i GS30, GS15, GS9 i GS7 linkere opisane u prijavama Ablynx koje su ovde pomenute (vidite, na primer, WO 06/040153 i WO 06/122825), kao i regione nalik regionu šarke, kao što su regioni šarke prirodnih antitela teškog lanca ili sličnih sekvenci (kao što je opisano u WO 94/04678). Poželjni linkeri su prikazani u Tabeli B-4.

Tabela 8-4: Linkeri

[0405] Drugi posebno poželjni linkeri su polialanin (kao što je AAA), kao i linkeri GS30 (SEQ ID NO: 85 u WO 06/122825) i GS9 (SEQ ID NO: 84 u WO 06/122825).

[0406] Drugi pogodni linkeri obično obuhvataju organska jedinjenja ili polimere, posebno one pogodne za upotrebu u proteinima za farmaceutsku primenu. Na primer, ostaci poli(etilenglikola) su korišćeni za povezivanje domena antitela, videti, na primer, WO 04/081026.

[0407] Opsegom ovog pronalaska je obuhvaćeno da dužina, stepen fleksibilnosti i/ili druga svojstva linkera koji se koriste (mada nisu kritična, što je obično slučaj za linkere koji se koriste u ScFv fragmentima) mogu imati određeni uticaj na svojstva finalnog polipeptida iz pronalaska, uključujući, bez ograničenja, afinitet, specifičnost ili avidnost prema CD3, ili prema jednom ili više drugih antigena. Na osnovu ovog otkrića, stručnjak će moći da odredi optimalne linkere za upotrebu u specifičnom polipeptidu iz pronalaska, opciono nakon ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0408] Na primer, u viševalentnim polipeptidima iz pronalaska koji obuhvataju gradivne blokove, ISV ili nanotela usmerene na prvi i drugi cilj, dužina i fleksibilnost linkera su poželjno takvi da omogućavaju da se svaki gradivni blok, ISV ili nanotelo iz pronalaska prisutno u polipeptidu vezuje za svoj srodni cilj, npr. antigensku determinantu na svakom cilju. Ponovo, na osnovu ovog otkrića, stručnjak će moći da odredi optimalne linkere za upotrebu u specifičnom polipeptidu iz pronalaska, opciono nakon ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0409] Takođe je u okviru pronalaska da linkeri koji se koriste daju jedno ili više drugih pogodnih svojstava ili funkcija polipeptidima iz pronalaska, i/ili obezbeđuju jedno ili više mesta za nastanak derivata i/ili vezivanje funkcionalnih grupa (npr. kao što je ovde opisano za derivate ISV, nanotela ili polipeptide iz pronalaska). Na primer, linkeri koji obuhvataju jedan ili više naelektrisanih aminokiselinskih ostataka mogu da pruže poboljšana hidrofilna svojstva, dok linkeri koji formiraju male epitope ili oznake ili ih obuhvataju mogu da se koriste u svrhu detekcije, identifikacije i/ili prečišćavanja. Ponovo, na osnovu ovog otkrića, stručnjak će moći da odredi optimalne linkere za upotrebu u specifičnom polipeptidu iz pronalaska, opciono nakon ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0410] Konačno, kada se dva ili više linkera koristi u polipeptidima iz pronalaska, ti linkeri mogu biti isti ili različiti. Ponovo, na osnovu ovog otkrića, stručnjak će moći da odredi optimalne linkere za upotrebu u specifičnom polipeptidu iz pronalaska, opciono nakon ograničenih rutinskih eksperimenata.

[0411] Polipeptid iz pronalaska će obično biti linearni polipeptid radi lakše ekspresije i proizvodnje. Međutim, pronalazak u svom najširem smislu nije ograničen na njih. Na primer, kada polipeptid iz pronalaska obuhvata tri ili više gradivnih blokova, ISV ili nanotela, moguće ih je povezati upotrebom linkera sa tri ili više „kraka“, gde je svaki „krak“ povezan sa gradivnim blokom, ISV ili nanotelom, tako da se dobije konstrukt „u obliku zvezde“. Takođe je moguće, mada je obično manje poželjno, koristiti kružne konstrukte.

[0412] Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je ovde opisan, pri čemu su pomenuti prvi ISV i pomenuti drugi ISV, a moguće i pomenuti treći ISV odnosno pomenuti ISV koji vezuje serumski albumin neposredno međusobno povezani ili su povezani preko linkera.

[0413] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je ovde opisan, gde je navedeni linker izabran iz grupe koja se sastoji od linkera 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS i 35GS. Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid kao što je ovde opisan, pri čemu, pomenuti vezujući ostatak serumskog proteina je polipetid koji nije zasnovan na antitelu (npr. PEG).

[0414] Pronalazak se takođe odnosi na postupke za pripremu ISV, polipeptida i konstrukta kao što su definisani zahtevima. ISV, polipeptidi i konstrukti iz pronalaska mogu da se pripreme na način koji je već poznat, kao što će biti jasno stručnjaku na osnovu daljeg opisa u ovom tekstu. Na primer, ISV, polipeptidi i konstrukti iz pronalaska mogu da se pripreme na bilo koji način koji je već poznat za pripremu antitela, a naročito za pripremu fragmenata antitela (uključujući, bez ograničenja, (jedno)domenska antitela i ScFv fragmente). Neki poželjni, ali neograničavajući postupci za pripremu polipeptida i konstrukta uključuju postupke i tehnike opisane u ovom tekstu.

[0415] Postupak za proizvodnju ISV, polipeptida ili proteinskog konstrukta iz pronalaska može da sadrži sledeće korake:

• ekspresiju, u odgovarajućoj ćeliji domaćinu ili organizmu domaćinu (ovde se takođe naziva „domaćin pronalaska“) ili u drugom odgovarajućem ekspresionom sistemu nukleinske kiseline koji kodira pomenuti ISV, polipeptid ili proteinski konstrukt iz pronalaska,

nakon čega opciono sledi:

• izolovanje i/ili prečišćavanje ISV, polipeptida ili proteinskog konstrukta iz pronalaska koji je tako dobijen.

[0416] Konkretno, takav postupak može da obuhvata korake:

• uzgajanja, odnosno održavanja domaćina pronalaska u takvim uslovima da pomenuti domaćin pronalaska eksprimira i/ili proizvodi najmanje jedan ISV, polipeptid ili proteinski konstrukt iz pronalaska;

nakon čega opciono sledi:

[0417] Shodno tome, predmetni pronalazak se takođe odnosi na nukleinsku kiselinu ili nukleotidnu sekvencu koja kodira ISV, polipeptid ili proteinski konstrukt iz pronalaska (kao što je definisano zahtevima, takođe se naziva „nukleinska kiselina iz pronalaska“ ili „nukleotidna sekvenca iz pronalaska“). Nukleinska kiselina iz pronalaska može biti u obliku jednolančane ili dvolančane DNK ili RNK, a poželjno je u obliku dvolančane DNK. Na primer, nukleotidne sekvence iz pronalaska mogu biti genomska DNK, cDNK ili sintetička DNK (kao što je DNK sa upotrebom kodona koji je posebno prilagođen za ekspresiju u predviđenoj ćeliji domaćinu ili organizmu domaćinu).

[0418] Prema jednom otelotvorenju pronalaska, nukleinska kiselina iz pronalaska je u suštinski izolovanom obliku, kao što je ovde definisano. Nukleinska kiselina iz pronalaska takođe može biti u obliku vektora, odnosno biti u njemu prisutna i/ili činiti deo vektora, kao što je na primer plazmid, kozmid ili YAC, koji takođe može biti u suštinski izolovanom obliku.

[0419] Nukleinske kiseline iz pronalaska mogu da se pripreme ili dobiju na način koji je već poznat, na osnovu informacija o polipeptidima ili proteinskim konstruktima iz pronalaska koje su ovde date, odnosno mogu biti izolovane iz odgovarajućeg prirodnog izvora. Takođe, kao što će biti jasno stručnjaku, za pripremu nukleinske kiseline iz pronalaska, takođe nekoliko nukleotidnih sekvenci, kao što je najmanje jedna nukleotidna sekvenca koja kodira pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina iz pronalaska i, na primer, nukleinske kiseline koje kodiraju jedan ili više linkera, mogu biti povezane na odgovarajući način.

[0420] Tehnike za generisanje nukleinskih kiselina iz pronalaska biće jasne stručnjaku i, na primer, mogu da uključuju, bez ograničenja, automatizovanu sintezu DNK; mutagenezu usmerenu na mesto; kombinovanje dve ili više prirodnih, odnosno sintetičkih sekvenci (ili dva ili više njihovih delova), uvođenje mutacija koje dovode do ekspresije skraćenog proizvoda ekspresije; uvođenje jednog ili više restrikcionih mesta (npr. kako bi se kreirale kasete i/ili regioni koji mogu biti lako digestovani, odnosno ligirani koristeći odgovarajuće restrikcione enzime) i/ili uvođenje mutacija putem PCR reakcije koristeći jedan ili više „pogrešno sparenih“ prajmera. Ove i druge tehnike će biti jasne stručnjaku, a ponovo se poziva na standardne priručnike, kao što je Sambrook et al. i Ausubel et al., koji su ovde pomenuti, kao i na primere u nastavku.

[0421] Nukleinska kiselina iz pronalaska takođe može biti u obliku genetskog konstrukta, biti prisutna u njemu, odnosno činiti njegov deo, kao što će biti jasno stručnjaku za oblast. Takvi genetski konstrukti obično sadrže najmanje jednu nukleinsku kiselinu iz pronalaska koja je opciono povezana sa jednim ili više elemenata genetskih konstrukta koji su sami po sebi poznati, kao što su, na primer, jedan ili više odgovarajućih regulatornih elemenata (kao što su odgovarajući promoteri, pojačivači, terminatori, itd.). i drugi elementi genetskih konstrukta koji su ovde pomenuti. Takvi genetski konstrukti koji obuhvataju najmanje jednu nukleinsku kiselinu iz pronalaska ovde će se takođe nazivati „genetski konstrukti iz pronalaska“.

[0422] Genetski konstrukti iz pronalaska mogu biti DNK ili RNK, a poželjno su dvolančana DNK. Genetski konstrukti iz pronalaska takođe mogu biti u obliku koji je pogodan za transformaciju predviđene ćelije domaćina ili organizma domaćina u oblik koji je pogodan za integrisanje u genomsku DNK predviđene ćelije domaćina ili u oblik koji je pogodan za nezavisnu replikaciju, održavanje i/ili nasleđivanje u predviđenom organizmu domaćinu. Na primer, genetski konstrukti iz pronalaska mogu biti u obliku vektora, kao što je, na primer, plazmid, kozmid, YAC, virusni vektor ili transpozon. Konkretno, vektor može biti ekspresioni vektor, tj. vektor koji može da obezbedi ekspresiju in vitro i/ili in vivo (npr. u odgovarajućoj ćeliji domaćinu, organizmu domaćinu i/ili ekspresionom sistemu).

[0423] U poželjnom, ali neograničavajućem otelotvorenju, genetski konstrukt iz pronalaska obuhvata

a) najmanje jednu nukleinsku kiselinu iz pronalaska; operativno povezanu sa

b) jednim ili više regulatornih elemenata, kao što su promoter i opciono odgovarajući terminator;

i opciono takođe

c) jedan ili više daljih elemenata genetskih konstrukta koji su sami po sebi poznati;

gde termini „regulatorni element“, „promoter“, „terminator“ i „operativno povezano“ imaju

uobičajeno značenje u struci (kao što je ovde dalje opisano); i gde „dalji elementi“ prisutni u genetskim konstruktima mogu, na primer, biti 3'- ili 5'-UTR sekvence, vodeće sekvence, selekcioni markeri, ekspresioni markeri / reporterski geni, odnosno elementi koji mogu da olakšaju ili povećaju transformaciju ili integraciju (njihovu efikasnost). Ovi i drugi pogodni elementi za takve genetske konstrukte biće jasni stručnjaku i mogu, na primer, zavisiti od vrste konstrukta koji se koristi; predviđene ćelije domaćina ili organizma domaćina; načina na koji će se eksprimirati nukleotidne sekvence iz pronalaska (npr. putem konstitutivne, tranzijentne ili inducibilne ekspresije); i/ili tehnike transformacije koja se koristi. Na primer, regulatorne sekvence, promoteri i terminatori koji su već poznati za ekspresiju i proizvodnju antitela i fragmenata antitela (uključujući, bez ograničenja, (jedno)domenska antitela i ScFv fragmente) mogu da se koriste na suštinski isti način.

[0424] Poželjno, u genetskim konstruktima iz pronalaska, pomenuta najmanje jedna nukleinska kiselina iz pronalaska i pomenuti regulatorni elementi, i opciono pomenuti jedan ili više daljih elemenata, međusobno su „operativno povezani“, pod čime se uopšteno misli da su u međusobnoj funkcionalnoj vezi. Na primer, smatra se da je promoter „operativno povezan“ sa kodirajućom sekvencom ako pomenuti promoter može da inicira ili na drugi način kontroliše/reguliše transkripciju, odnosno ekspresiju kodirajuće sekvence (gde treba shvatiti da je pomenuta kodirajuća sekvenca „pod kontrolom“ pomenutog promotera). Generalno, kada su dve nukleotidne sekvence operativno povezane, one će biti u istoj orijentaciji i obično u istom okviru za čitanje. One će obično biti suštinski uzastopne, mada to ne mora biti neophodno.

[0425] Nukleinske kiseline iz pronalaska, odnosno genetski konstrukti iz pronalaska mogu da se koriste za transformaciju ćelije domaćina ili organizma domaćina, tj. za ekspresiju i/ili proizvodnju polipeptida ili proteinskog konstrukta iz pronalaska. Domaćin je poželjno nehumani domaćin. Odgovarajući domaćini ili ćelije domaćini će biti poznati stručnjaku, i mogu, na primer, biti bilo koja odgovarajuća gljivična, prokariotska ili eukariotska ćelija ili ćelijska linija ili bilo koji odgovarajući gljivični, prokariotski ili eukariotski organizam, na primer:

• soj bakterija, uključujući, bez ograničenja, gram-negativne sojeve kao što su sojevi Escherichia coli; Proteus, na primer Proteus mirabilis; Pseudomonas, na primer Pseudomonas fluorescens; i gram-pozitivne sojeve kao što su sojevi Bacillus, na primer Bacillus subtilis ili Bacillus brevis; Streptomyces, na primer Streptomyces lividans; Staphylococcus, na primer Staphylococcus carnosus; i Lactococcus, na primer Lactococcus lactis;

• ćelija gljiva, uključujući, bez ograničenja, ćelije vrste Trichoderma, na primer Trichoderma reesei; Neurospora, na primer Neurospora crassa; Sordaria, na primer Sordaria macrospora; Aspergillus, na primer Aspergillus niger ili Aspergillus sojae; ili drugih filamentoznih gljiva;

• ćelija kvasca, uključujući, bez ograničenja, ćelije vrste Saccharomyces, na primer Saccharomyces cerevisiae; Schizosaccharomyces, na primer Schizosaccharomyces pombe; Pichia, na primer Pichia pastoris ili Pichia methanolica; Hansenula, na primer Hansenula polymorpha; Kluyveromyces, na primer Kluyveromyces lactis; Arxula, na primer Arxula adeninivorans; Yarrowia, na primer Yarrowia lipolytica;

• ćelija ili ćelijska linija vodozemaca, kao što je Xenopus oocytes;

• ćelija ili ćelijska linija dobijena od insekata, kao što su ćelije/ćelijske linije dobijene od leptira, uključujući, bez ograničenja SF9 i Sf21 ćelije Spodoptera ili ćelije/ćelijske linije dobijene od Drosophila, kao što su Šnajderove i Kc ćelije;

• biljka ili biljna ćelija, na primer u duvanu; i/ili

• ćelija ili ćelijska linija sisara, na primer ćelija ili ćelijska linija dobijena od čoveka, ćelija ili ćelijska linija sisara, uključujući, bez ograničenja, CHO-ćelije, BHK-ćelije (na primer BHK-21 ćelije) i humane ćelije ili ćelijske linije kao što su HeLa, COS (na primer COS-7) i PER.C6 ćelije;

kao si svi drugi domaćini ili ćelije domaćini već poznati za ekspresiju i proizvodnju antitela i fragmenata antitela (uključujući, bez ograničenja, (jedno)domenska antitela i ScFv fragmente), što će biti jasno stručnjaku. Takođe se poziva na opštu stručnu literaturu koja je prethodno navedena u ovom tekstu, kao i, na primer, na WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al. 1998 (Res. Immunol. 149: 589-99); Riechmann i Muyldermans 1999 (J. Immunol. Met. 231: 25-38); van der Linden 2000 (J. Biotechnol. 80: 261-70); Joosten et al.

2003 (Microb. Cell Fact.2: 1); Joosten et al.2005 (Appl. Microbiol. Biotechnol.66: 384-92); i dalje reference navedene u ovom tekstu.

[0426] Za ekspresiju ISV, polipeptida ili konstrukta u ćeliji, oni mogu biti eksprimirani kao takozvana „intratela“, na primer, kao što je opisano u WO 94/02610, WO 95/22618 i US 7004940; WO 03/014960; u Cattaneo i Biocca 1997 (Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes i Springer-Verlag); i u Kontermann 2004 (Methods 34: 163-170).

[0427] Prema poželjnom, ali neograničavajućem otelotvorenju pronalaska, ISV, polipeptid ili proteinski konstrukt iz pronalaska se proizvodi u bakterijskoj ćeliji, naročito bakterijskoj ćeliji koja je pogodna za farmaceutsku proizvodnju velikog obima, kao što su ćelije prethodno pomenutih sojeva.

[0428] Prema drugom poželjnom, ali neograničavajućem otelotvorenju pronalaska, ISV, polipeptid ili proteinski konstrukt iz pronalaska se proizvodi u ćeliji kvasca, naročito ćeliji kvasca koja je pogodna za farmaceutsku proizvodnju velikog obima, kao što su ćelije prethodno pomenutih vrsta.

[0429] Prema još jednom poželjnom, ali neograničavajućem otelotvorenju pronalaska, ISV, polipeptid ili konstrukt iz pronalaska se proizvodi u ćeliji sisara, naročito humanoj ćeliji ili u ćeliji humane ćelijske linije, a naročito u humanoj ćeliji ili u ćeliji humane ćelijske linije koja je pogodna za farmaceutsku proizvodnju velikog obima, kao što su ćelijske linije prethodno pomenute u ovom tekstu.

[0430] Odgovarajuće tehnike za transformaciju domaćina ili ćelije domaćina iz pronalaska biće jasne stručnjaku i mogu zavisiti od predviđene ćelije domaćina/organizma domaćina i genetskog konstrukta koji se koristi. Ponovo se poziva na prethodno pomenute priručnike i patentne prijave.

[0431] Nakon transformacije, može se izvesti korak za otkrivanje i odabir ćelija domaćina ili organizama domaćina koji su uspešno transformisani nukleotidnom sekvencom/genetskim konstruktom iz pronalaska. To, na primer, može biti korak odabira na osnovu selektabilnog markera koji je prisutan u genetskom konstruktu iz pronalaska ili korak koji obuhvata detekciju polipeptida iz pronalaska, npr. koristeći specifična antitela.

[0432] Transformisana ćelija domaćin (koja može biti u obliku stabilne ćelijske linije) ili organizmi domaćini (koji mogu biti u obliku stabilne mutantske linije ili soja) formiraju dalje aspekte predmetnog pronalaska.

[0433] Poželjno, ove ćelije domaćini ili organizmi domaćini su takvi da eksprimiraju, ili su (u najmanju ruku) sposobni da eksprimiraju (npr. u odgovarajućim uslovima), ISV, polipeptid ili proteinski konstrukt iz pronalaska (a u slučaju organizma domaćina: u najmanje jednoj njegovoj ćeliji, tkivu ili organu). Pronalazak takođe uključuje i naredne generacije, potomstvo, odnosno izdanke ćelije domaćina ili organizma domaćina iz pronalaska, na primer, dobijene putem ćelijske deobe ili seksualnog ili aseksualnog razmnožavanja.

[0434] Shodno tome, u još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na domaćina ili ćeliju domaćina koji eksprimira (ili je u odgovarajućim okolnostima sposoban da eksprimira) ISV, polipeptid ili proteinski konstrukt iz pronalaska; odnosno koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja ga kodira. Neki poželjni, neograničavajući primeri za takve domaćine ili ćelije domaćine mogu biti kao što je generalno opisano u WO 04/041867, WO 04/041865 ili WO 09/068627. Na primer, ISV, polipeptidi i proteinski konstrukti iz pronalaska mogu pogodno biti eksprimirani ili proizvedeni u soju kvasca, kao što je soj Pichia pastoris. Takođe se poziva na WO 04/25591, WO 10/125187, WO 11/003622, i WO 12/056000 koji takođe opisuju ekspresiju/proizvodnju u Pichia i drugim domaćinima/ćelijama domaćinima pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina i polipeptida koji ih obuhvataju.

[0435] Da bi se proizvela/postigla ekspresija ISV, polipeptida ili proteinskih konstrukta iz pronalaska, transformisana ćelija domaćin ili transformisani organizam domaćin mogu se generalno čuvati, održavati, odnosno uzgajati u uslovima tako da (željeni) ISV, polipeptid ili proteinski konstrukt iz pronalaska bude eksprimiran/proizveden. Odgovarajući uslovi će biti jasni stručnjaku za ovu oblast i obično će zavisiti od ćelije domaćina/organizma domaćina koji se koristi, kao i od regulatornih elemenata koji kontrolišu ekspresiju (relevantne) nukleotidne sekvence iz pronalaska. Ponovo, poziva se na priručnike i patentne prijave koje su prethodno pomenute u paragrafima o genetskim konstruktima iz pronalaska.

[0436] Generalno, pogodni uslovi mogu da uključuju upotrebu odgovarajućeg medijuma, prisustvo odgovarajućeg izvora hrane i/ili odgovarajućih hranljivih supstanci, upotrebu odgovarajuće temperature, i opciono prisustvo odgovarajućeg indukujućeg faktora ili jedinjenja (npr. kada su nukleotidne sekvence iz pronalaska pod kontrolom inducibilnog promotera); pri čemu sve od prethodnog stručnjak može izabrati. Ponovo, u takvim uslovima, ISV, polipeptidi ili proteinski konstrukti iz pronalaska mogu biti eksprimirani na konstitutivni način, na tranzijentni način, ali samo kada su odgovarajuće indukovani.

[0437] Stručnjaku će takođe biti jasno da ISV, polipeptid ili proteinski konstrukt iz pronalaska može (prvo) biti generisan u nezrelom obliku (kao što je prethodno pomenuto), koji se zatim može podvrgnuti posttranslacionim modifikacijama, u zavisnosti od ćelije domaćina/organizma domaćina koji se koristi. Takođe, ISV, polipeptidni ili proteinski konstrukt iz pronalaska može biti glikozilovan, ponovo u zavisnosti od ćelije domaćina/organizma domaćina koji se koristi.

[0438] ISV, polipeptid ili proteinski konstrukt iz pronalaska može se zatim izolovati iz ćelije domaćina/organizma domaćina, odnosno iz medijuma u kome su pomenuta ćelija domaćin ili organizam domaćin uzgajani, koristeći tehnike izolovanja proteina, odnosno prečišćavanja koje su već poznate, kao što su (preparativna) hromatografija, odnosno tehnike elektroforeze, tehnike diferencijalnog taloženja, afinitetne tehnike (npr. koristeći specifične, raskidive aminokiselinske sekvence fuzionisane sa polipeptidom ili konstruktom iz pronalaska), odnosno preparativne imunološke tehnike (tj. koristeći antitela usmerena na aminokiselinsku sekvencu koju treba izolovati).

[0439] Konstruktori iz pronalaska generalno mogu da se pripreme postupkom koji obuhvata najmanje korak odgovarajućeg vezivanja ISV ili polipeptida iz pronalaska sa jednom ili više daljih grupa, ostataka, funkcionalnih grupa ili vezujućih jedinica, opciono preko jednog ili više odgovarajućih linkera, tako da se dobiju konstrukti iz pronalaska. ISV, polipeptidi i konstrukti iz pronalaska se zatim mogu dalje modifikovati, a naročito putem hemijskih, odnosno bioloških (npr. enzimskih) modifikacija, jednog ili više aminokiselinskih ostataka koji grade polipeptide ili konstrukte iz pronalaska, kako bi se dobili derivati polipeptida ili konstrukta iz pronalaska.

[0440] Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata ISV, polipeptid, jedinjenje ili konstrukt iz pronalaska.

[0441] U gore navedenim metodama, aminokiselinske sekvence, ISV, nanotela, polipeptidi, jedinjenja ili konstrukti iz pronalaska i/ili kompozicije koje ih obuhvataju, mogu da se primene na bilo koji odgovarajući način, u zavisnosti od konkretne farmaceutske formulacije ili kompozicije koja se koristi. Tako aminokiselinske sekvence, ISV, nanotela, polipeptidi, jedinjenja ili konstrukti iz pronalaska i/ili kompozicije koje ih obuhvataju, mogu, na primer, da se primene oralno, intraperitonealno (npr. intravenski, supkutano, intramuskularno ili bilo kojim drugim putem primene koji zaobilazi gastrointestinalni trakt), intranazalno, transdermalno, topikalno, putem supozitorije, putem udisanja, ponovo u zavisnosti od konkretne farmaceutske formulacije ili kompozicije koja se koristi. Klinički lekar će moći da odabere odgovarajući način primene i odgovarajuću farmaceutsku formulaciju ili kompoziciju koja se koristi za takvu primenu, u zavisnosti od bolesti ili poremećaja koji se sprečavaju ili leče i od drugih faktora koji su dobro poznati kliničkom lekaru.

[0442] Kao što se ovde koristi, termin „terapeutski agens“ se odnosi na bilo koji agens koji se može koristiti u lečenju, odnosno kontrolisanju hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja, npr. kancera, ili jednog ili više njegovih simptoma. U određenim otelotvorenjima, termin „terapeutski agens“ se odnosi na multispecifični polipeptid iz pronalaska. Poželjno, terapeutski agens je agens za koji je poznato da je koristan, ili je prethodno korišćen ili se trenutno koristi za lečenje, prevenciju i/ili kontrolisanje hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja, npr. kancera, ili jednog ili više njegovih simptoma.

[0443] Kao što se ovde koristi, „terapeutski delotvorna količina“ u kontekstu kancera se odnosi na količinu terapije koja samostalno, ili u kombinaciji sa drugim terapijama, pruža terapeutsku korist u lečenju i/ili kontrolisanju kancera. U jednom aspektu, terapeutski delotvorna količina se odnosi na količinu terapije koja je dovoljna da uništi, izmeni, suzbije ili ukloni primarno, regionalno ili metastatsko kancerozno tkivo. U drugom aspektu, terapeutski delotvorna količina se odnosi na količinu terapije koja je dovoljna da se simptomi kancera smanje. U drugom aspektu, terapeutski delotvorna količina se odnosi na količinu terapije koja je dovoljna da se širenje kancera odloži ili smanji. U konkretnom otelotvorenju, terapeutski delotvorna količina terapije je količina terapije koja je dovoljna da inhibira rast ili proliferaciju ćelija kancera, ubije postojeće ćelije kancera (npr. dovede do povlačenja kancera), odnosno spreči širenje ćelija kancera na druga tkiva ili oblasti (npr. spreči metastazu). U drugom specifičnom otelotvorenju, terapeutski delotvorna količina terapije je količina terapije koja je dovoljna da inhibira rast tumora za najmanje 5%, poželjno najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 100% na osnovu merenja standardnim postupkom koji je poznat u struci. Kada se koristi zajedno sa količinom multispecifičnog polipeptida iz pronalaska, termin može da obuhvata količinu koja unapređuje ukupnu terapiju, smanjuje ili izbegava neželjena dejstva, ili povećava terapeutsku efikasnost ili sinergiju sa drugom terapijom. U jednom otelotvorenju, terapeutski delotvorna količina terapije smanjuje ili izbegava neželjena dejstva, ili povećava terapeutsku efikasnost ili sinergiju sa drugom terapijom za najmanje 5%, poželjno najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 100% u odnosu na kontrolu (npr. negativnu kontrolu, kao što je fiziološki rastvor puferovan fosfatom) na testu koji je poznat u struci ili je opisan ovde.

[0444] Kao što se ovde koristi, „terapeutski delotvorna količina“ u kontekstu hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja koji nije kancer odnosi se na količinu terapije koja samostalno, ili u kombinaciji sa drugim terapijama, pruža terapeutsku korist u lečenju, odnosno kontrolisanju pomenutog poremećaja. U jednom aspektu, terapeutski delotvorna količina se odnosi na količinu terapije koja je dovoljna da uništi, izmeni, suzbije ili ukloni ćelije zahvaćene hiperproliferativnim ćelijskim poremećajem koji nije kancer. U drugom aspektu, terapeutski delotvorna količina se odnosi na količinu terapije koja je dovoljna da se simptomi hiperproliferativnog poremećaja koji nije kancer smanje. U drugom aspektu, terapeutski delotvorna količina se odnosi na količinu terapije koja je dovoljna da se širenje hiperproliferativnog poremećaja koji nije kancer odloži ili smanji. U specifičnom otelotvorenju, terapeutski delotvorna količina terapije je količina terapije koja je dovoljna da inhibira rast ili proliferaciju hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja koji nije kancer, ubije postojeće nekancerozne hiperproliferativne ćelije (npr. dovede do povlačenja poremećaja). U drugom specifičnom otelotvorenju, terapeutski delotvorna količina terapije je količina koja je dovoljna da inhibira rast nekanceroznih hiperproliferativnih ćelija za najmanje 5%, poželjno najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 100% na osnovu merenja standardnim postupkom koji je poznat u struci. Kada se koristi zajedno sa količinom multispecifičnog polipeptida iz pronalaska, termin može da obuhvata količinu koja unapređuje ukupnu terapiju, smanjuje ili izbegava neželjena dejstva, ili povećava terapeutsku efikasnost ili sinergiju sa drugom terapijom. U jednom otelotvorenju, terapeutski delotvorna količina terapije smanjuje ili izbegava neželjena dejstva, ili povećava terapeutsku efikasnost ili sinergiju sa drugom terapijom za najmanje 5%, poželjno najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 100% u odnosu na kontrolu (npr. negativnu kontrolu, kao što je fiziološki rastvor puferovan fosfatom) na testu koji je poznat u struci.

[0445] Kao što se ovde koristi, termin „terapija“ se odnosi na bilo koji protokol, postupak i/ili agens koji može da se koristi u lečenju, prevenciji i/ili kontrolisanju hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja, npr. kancera. U određenim otelotvorenjima, termini „terapije“ i „terapija“ se odnose na biološku terapiju, palijativnu terapiju, odnosno druge terapije koje su korisne za lečenje, prevenciju, odnosno kontrolisanje hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja, npr. kancera, ili jednog ili više njegovih simptoma koji su poznati stručnjaku za oblast kao što su zdravstveni radnici.

[0446] Kao što se ovde koriste, termini „lečiti“, „tretman“ i „lečenje“, u kontekstu primene terapija na ispitaniku, odnose se na smanjenje ili ublažavanje progresije, ozbiljnosti, odnosno trajanja poremećaja povezanog sa hiperproliferativnim ćelijskim poremećajem, npr. kancerom, odnosno na ublažavanje jednog ili više njegovih simptoma usled primene jedne ili više terapija (uključujući, bez ograničenja, primenu jednog ili više profilaktičkih ili terapeutskih agensa). U specifičnim otelotvorenjima, termini „lečiti“, „tretman“ i „lečenje“, u kontekstu primene terapija na ispitaniku, odnose se na smanjenje ili ublažavanje progresije, ozbiljnosti, odnosno trajanja hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja, npr. kancera, i odnose se na smanjenje ćelija kancera za najmanje 5%, poželjno najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 100% u odnosu na kontrolu (npr. negativnu kontrolu, kao što je fiziološki rastvor puferovan fosfatom). U drugim otelotvorenjima, termini „lečiti“, „tretman“ i „lečenje“, u kontekstu primene terapija na ispitaniku, odnose se na smanjenje ili ublažavanje progresije, ozbiljnosti, odnosno trajanja hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja, npr. kancera, i odnose se na promenu broja ćelija kancera, kraće vreme hospitalizacije, manji mortalitet, ili duže preživljavanje ispitanika sa kancerom.

[0447] Aminokiselinske sekvence, ISV, nanotela, polipeptidi, jedinjenja, odnosno konstrukti iz pronalaska, odnosno kompozicije koje ih obuhvataju, primenjuju se u skladu sa režimom lečenja koji je pogodan za prevenciju, odnosno lečenje hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja, npr. kancera, koji treba sprečiti ili lečiti. Klinički lekar će generalno moći da odredi odgovarajući režim lečenja, u zavisnosti od faktora kao što su stadijum hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja, npr. kancera, koji se leči, težina hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja, npr. kancera, koji se leči, odnosno težina njegovih simptoma, konkretna aminokiselinska sekvenca, ISV, nanotelo, polipeptid, jedinjenje, odnosno konstrukt iz pronalaska koji se koriste, konkretan način primene i farmaceutska formulacija ili kompozicija koji se koriste, starost, pol, težina, ishrana, opšte stanje pacijenta, i slični faktori koji su dobro poznati kliničkom lekaru.

[0448] Generalno, režim lečenja će obuhvatati primenu jedne ili više aminokiselinskih sekvenci, ISV, nanotela, polipeptida, jedinjenja, odnosno konstrukta iz pronalaska, ili jedne ili više kompozicija koje ih obuhvataju, u jednoj ili više farmaceutski delotvornih količina ili doza. Klinički lekar može da odredi konkretne količine ili doze koje se primenjuju, ponovo na osnovu prethodno navedenih faktora.

[0449] Generalno, za prevenciju i/ili lečenje hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja, npr. kancera, koji je ovde pomenut i u zavisnosti od vrste hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja, npr. kancera, i stadijuma bolesti koja se leči, potentnosti konkretne aminokiselinske sekvence, ISV, nanotela, polipeptida, jedinjenja ili konstrukta iz pronalaska koji se koriste, konkretnog načina primene i konkretne farmaceutske formulacije ili kompozicije koja se koristi, aminokiselinske sekvence, ISV, nanotela, polipeptidi, jedinjenja ili konstrukti iz pronalaska će se generalno primenjivati u količini od 1 grama do 0,01 miligrama po kg telesne težine na dan, poželjno od 0,1 gram do 0,01 miligram po kg telesne težine na dan, recimo oko 0,1, 1, 10, 100 ili 1000 miligrama po kg telesne težine na dan, npr. od 0,1 mg po kg do 25 mg po kg ispitanikove telesne težine; bilo kontinualno (npr. putem infuzije), u vidu jedne dnevne doze ili kao više podeljenih doza tokom dana. Klinički lekar će generalno moći da odredi odgovarajuću dnevnu dozu, u zavisnosti od faktora koji su ovde navedeni. Takođe će biti jasno da u određenim slučajevima klinički lekar može da izabere da odstupi od ovih količina, na primer, na osnovu gore navedenih faktora i njegove stručne procene. Generalno, neke smernice o količinama koje treba primeniti mogu se dobiti na osnovu količina koje se obično primenjuju za uporediva konvencionalna antitela ili fragmente antitela protiv istog cilja kada se primenjuju na suštinski isti način, međutim, uzimajući u obzir razlike u afinitetu/avidnosti, delotvornosti, biodistribuciji, poluživotu i sličnim faktorima koji su dobro poznati stručnjaku.

[0450] U prethodnom postupku će se obično koristiti jedna aminokiselinska sekvenca, ISV, nanotelo, polipeptid, jedinjenje ili konstrukt iz pronalaska. Međutim, u okvir otkrića spada korišćenje kombinacije dve ili više aminokiselinskih sekvenci, ISV, nanotela, polipeptida, jedinjenja, odnosno konstrukta iz pronalaska.

[0451] ISV, nanotela, aminokiselinske sekvence, polipeptidi, jedinjenja, odnosno konstrukti iz pronalaska takođe se mogu koristiti u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih farmaceutski aktivnih jedinjenja ili principa, tj. kao što je režim kombinovane terapije, što može, i ne mora, dovesti do sinergijskog dejstva. Opet, klinički lekar će moći da izabere takva dodatna jedinjenja ili principe, kao i odgovarajući režim kombinovanog lečenja, na osnovu gore navedenih faktora i njegovog stručnog mišljenja.

[0452] Konkretno, aminokiselinske sekvence, ISV, nanotela, polipeptidi, jedinjenja, odnosno konstrukti iz pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim jedinjenjima ili principima koji se koriste ili se mogu koristiti za prevenciju, odnosno lečenje hiperproliferativnog ćelijskog poremećaja, npr. kancera, bolesti, odnosno poremećaja navedenog ovde, usled čega može, ali ne mora doći do sinergijskog dejstva. Primeri za takva jedinjenja i principe, kao i načini, postupci i farmaceutske formulacije ili kompozicije za njihovu primenu biće jasni kliničkom lekaru.

[0453] Kada dve ili više supstanci ili principa treba koristiti u okviru režima kombinovane terapije, one se mogu primenjivati istim putem primene ili različitim putevima primene, suštinski istovremeno ili u različito vreme (npr. suštinski istovremeno, redno, ili u skladu sa naizmeničnim režimom). Kada se supstance ili principi primenjuju istovremeno istim putem primene, oni se mogu primenjivati kao različite farmaceutske formulacije ili kompozicije ili u okviru kombinovane farmaceutske formulacije ili kompozicije, što će biti jasno stručnjaku.

[0454] U jednom aspektu, otkriće obezbeđuje postupke za primenu pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina i njihovih polipeptidnih konstrukta koji obuhvataju jedan ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina, polipeptida, jedinjenja, odnosno konstrukta. U nekim otelotvorenjima, pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina, polipeptid, jedinjenje, odnosno konstrukt primenjuju se kao farmaceutska kompozicija. Farmaceutska kompozicija, pored pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina i njihovih polipeptidnih konstrukta obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0455] Kao što je detaljno opisano, farmaceutske kompozicije iz otkrića mogu biti posebno formulisane za primenu u čvrstom ili tečnom obliku, uključujući oblike koji su prilagođeni za sledeće: oralnu primenu, na primer, tečnosti (vodeni ili nevodeni rastvori ili suspenzije), tablete, npr. one koje su namenjene za bukalnu, sublingvalnu, i sistemsku apsorpciju, boluse, praškove, granule, paste za nanošenje na jezik; parenteralnu primenu, na primer, putem supkutane, intramuskularne, intravenske ili epiduralne injekcije u vidu, na primer, sterilnog rastvora ili suspenzije, ili formulacije sa produženim oslobađanjem; topikalnu primenu, na primer, kao krema, melem ili flaster sa kontrolisanim oslobađanjem ili sprej koji se primenjuje na kožu, pluća ili usnu duplju; intravaginalnu ili intratekalnu primenu, na primer, kao pesar, krema ili pena; sublingvalnu primenu; okularnu primenu; transdermalnu primenu; ili nazalnu primenu, plućnu primenu i primenu na druge mukozne površine.

[0456] Fraza „farmaceutski prihvatljivo“ ovde se koristi da se označe jedinjenja, supstance, kompozicije, odnosno dozni oblici koji su, u skladu sa zdravim medicinskim rasuđivanjem, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudskih bića i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskih odgovora ili drugih problema ili komplikacija, u skladu sa odgovarajućim odnosom rizika i koristi.

[0457] Fraza „farmaceutski prihvatljiv nosač“, kao što se ovde koristi, odnosi se na farmaceutski prihvatljivu supstancu, kompoziciju ili vehikulum, kao što je tečni ili čvrsti punilac, razblaživač, ekscipijens ili supstanca koja enkapsulira rastvarač, koja učestvuje u prenosu ili transportu datog jedinjenja iz jednog organa, ili dela tela, u drugi organ, ili deo tela. Svaki nosač mora biti „prihvatljiv“ u smislu da je kompatibilan sa ostalim sastojcima formulacije i da nije štetan po pacijenta. Neki primeri za supstance koje mogu da služe kao farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju: šećere, kao što je laktoza, glukoza i saharoza; skrobove, kao što je kukuruzni skrob i krompirov skrob; celulozu i njene derivate, kao što je natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celulozni acetat; tragakant u prahu; slad; želatin; talk; ekscipijense, kao što su kakao puter i supozitorijski voskovi; ulja, kao što je kikirikijevo ulje, ulje semena pamuka, suncokretovo ulje, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje; glikole, kao što je propilen glikol; poliole, kao što je glicerin, sorbitol, manitol i polietilen glikol; estre, kao što je etil oleat i etil laurat; agar; puferujuće agense, kao što je magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; algininsku kiselinu; vodu bez pirogena; izotonični fiziološki rastvor; Ringerov rastvor; etil alkohol; pH puferovane rastvore; poliestre, polikarbonate, odnosno polianhidride; i druge netoksične kompatibilne supstance koje se koriste u farmaceutskim formulacijama.

[0458] Formulacije iz otkrića uključuju one koje su pogodne za oralnu, nazalnu, topikalnu (uključujući bukalnu i sublingvalnu), rektalnu, vaginalnu, odnosno parenteralnu primenu. Formulacije se mogu zgodno predstaviti u obliku jediničnih doza i mogu se pripremati bilo kojim postupcima dobro poznatim u oblasti farmacije. Količina aktivnog sastojka (npr. pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina ili njegovih polipeptidnih konstrukta) koja može da se kombinuje sa supstancom nosača kako bi se dobio jedan dozni oblik će se razlikovati u zavisnosti od domaćina koji se leči i konkretnog režima primene. Količina aktivnog sastojka koji se može kombinovati sa supstancom nosača da bi se dobio jedan dozni oblik obično će biti količina jedinjenja koja proizvodi terapeutsko dejstvo. Generalno, ova količina će biti u rasponu od oko 1% do oko 99% aktivnog sastojka, poželjno od oko 5% do oko 70%, najpoželjnije od oko 10% do oko 30%.

[0459] U određenim otelotvorenjima, formulacija obuhvata ekscipijens izabran iz grupe koja se sastoji od ciklodekstrina, lipozoma, agensa koji formiraju micele, npr. žučnih kiselina, i polimernih nosača, npr. poliestara i polianhidrida. U određenim otelotvorenjima, gorepomenuta formulacija čini pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina ili polipeptidni konstrukt oralno bioraspoloživim.

[0460] Postupci za pripremu ovih formulacija ili kompozicija uključuju korak dovođenja u vezu pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina ili polipeptidnog konstrukta sa nosačem i, opciono, jednim ili više pomoćnih sastojaka. Uopšteno, formulacije se pripremaju uniformnim i bliskim povezivanjem pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina ili polipeptidnog konstrukta sa tečnim nosačima, ili fino podeljenim čvrstim nosačima, ili sa oba, a zatim, po potrebi, oblikovanjem proizvoda.

[0461] Formulacije pogodne za oralnu primenu mogu biti u obliku kapsula, skrobnih kapsula, pilula, tableta, lozengi (koje koriste bazu sa ukusom, obično saharozu, akaciju ili tragakant), praškova, granula ili rastvora ili suspenzije u vodenoj ili nevodenoj tečnosti, ili u obliku emulzije ulje u vodi ili voda u ulju, ili u obliku eliksira ili sirupa, ili u obliku pastila (koje koriste inertnu bazu, kao što je želatin i glicerin, ili saharoza i akacija), odnosno u obliku tečnosti za ispiranje usta i slično, svaki od čega sadrži prethodno utvrđenu količinu pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina ili polipeptidnog konstrukta kao aktivni sastojak. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina ili polipeptidni konstrukt iz pronalaska takođe mogu da se primenjuju kao bolus, elektuar ili pasta.

[0462] U čvrstim doznim oblicima za oralnu primenu (kapsule, tablete, pilule, dražeje, praškovi, granule i slično), aktivni sastojak je pomešan sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, kao što je natrijum citrat ili dikalcijum fosfat, odnosno sa bilo čime od sledećeg: puniocima ili ekstenderima, kao što su skrobovi, laktoza, saharoza, glukoza, manitol, odnosno silicijumova kiselina; vezivačima, kao što su, na primer, karboksimetil celuloza, alginati, želatin, polivinil pirolidon, saharoza, odnosno akacija; humektansima, kao što je glicerol; dezintegransima, kao što je agar-agar, kalcijum karbonat, krompirov ili tapioka skrob, algininska kiselina, određeni silikati i natrijum karbonat; agensima za usporavanje rastvaranja, kao što je parafin; akceleratorima apsorpcije, kao što su jedinjenja kvarternernog amonijaka; kvašljivcima, kao što su, na primer, cetil alkohol, glicerol monostearat i nejonski surfaktansi; apsorbensima, kao što su kaolin i bentonit glina; lubrikansima, kao što su talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat i njihove smeše; i bojama. U slučaju kapsula, tableta i pilula, farmaceutske kompozicije takođe mogu da obuhvataju puferujuće agense. Čvrste kompozicije slične vrste takođe mogu da se koriste kao punioci u želatinskim kapsulama sa mekim i čvrstim omotačem koje koriste ekscipijense poput laktoze ili mlečnog šećera, kao i polietilen glikole velike molekulske mase, i slično.

[0463] Tableta može da se napravi komprimovanjem ili oblikovanjem, opciono sa jednim ili više pomoćnih sastojaka. Komprimovane tablete mogu da se pripreme koristeći vezivač (na primer, želatin ili hidroksi-propilmetil celulozu), lubrikans, inertni razblaživač, konzervans, dezintegrans (na primer, natrijum skrob glikolat ili unakrsno vezana natrijum karboksimetil celuloza), površinski aktivni agens ili agens za disperziju. Oblikovane tablete mogu da se naprave u odgovarajućoj mašini u kojoj se smeša jedinjenja u prahu kvasi inertnim tečnim razblaživačem.

[0464] Tablete i drugi čvrsti dozni oblici farmaceutskih kompozicija kao što su dražeje, kapsule, pilule i granule, mogu biti opciono sa zarezom ili pripremljene sa oblogama i omotačima, kao što su enterična obloga i druge obloge koje su dobro poznate u oblasti farmaceutske formulacije. Takođe se mogu formulisati tako da obezbede sporo ili kontrolisano oslobađanje aktivnog sastojka koji se u njima nalazi koristeći, na primer, hidroksipropil metil celulozu u različitim udelima da se obezbedi željeni profil oslobađanja, druge polimerne matrice, lipozome, odnosno mikrosfere. Oni mogu biti formulisani za brzo oslobađanje, npr. liofilizovani. Oni mogu biti sterilisani, na primer, filtracijom kroz filter koji zadržava bakterije, ili ubacivanjem sredstava za sterilizaciju u vidu sterilnih čvrstih kompozicija koje se mogu rastvoriti u sterilnoj vodi ili u nekom drugom sterilnom injektabilnom medijumu pre upotrebe. Ove kompozicije takođe opciono mogu da sadrže agense za zamućenje i mogu imati takav sastav da oslobađaju aktivne sastojke samo, ili poželjno, u određenom delu gastrointestinalnog trakta, opciono uz određeno odlaganje. Primeri za kompozicije za ukalupljivanje koje mogu da se koriste uključuju polimerne supstance i voskove. Aktivni sastojak takođe može biti u mikroenkapsuliranom obliku, ako je potrebno, sa jednim ili više goreopisanih ekscipijenasa.

[0465] Tečni dozni oblici za oralnu primenu uključuju farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe i eliksire. Pored aktivnog sastojka, tečni dozni oblici mogu da obuhvataju inertne razblaživače koje se uobičajeno koriste u struci, kao što su, na primer, voda i drugi rastvarači, solubilizatori i emulgatori, kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, ulja (naročito, ulje semena pamuka, kikirikija, kukuruza, pšeničnih klica, masline, ricinusa i susama), glicerol, tetrahidrofuril alkohol, polietilen glikole i estre masnih kiselina sorbitana, i njihove smeše.

[0466] Pored inertnih razblaživača, oralne kompozicije takođe mogu da uključuju adjuvanse kao što su kvašljivci, agensi za emulgovanje i suspendovanje, zaslađivači, arome, boje, mirisi i konzervansi.

[0467] Pored aktivnih jedinjenja, suspenzije mogu da obuhvataju agense za suspendovanje, kao što su, na primer, etoksilovani izostearil alkoholi, polioksietilen sorbitol i sorbitan estri, mikrokristalnu celulozu, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar i tragakant, i njihove smeše.

[0468] Formulacije farmaceutskih kompozicija za rektalnu ili vaginalnu primenu mogu biti u obliku supozitorije, koja može da se pripremi mešanjem pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina ili polipeptidnog konstrukta sa jednim ili više odgovarajućih ekscipijenasa ili nosača koji ne izazivaju iritaciju, uključujući, na primer, kakao puter, polietilen glikol, supozitorijski vosak ili salicilat, i koji su čvrsti na sobnoj temperaturi, ali tečni na temperaturi tela, te se stoga tope u rektumu ili vaginalnoj šupljini i oslobađaju aktivno jedinjenje.

[0469] Formulacije pogodne za vaginalnu primenu takođe obuhvataju i pesare, tampone, kreme, gelove, paste, pene ili sprej formulacije koje obuhvataju takve nosače za koje je u struci poznato da su odgovarajući.

[0470] Dozni oblici za topikalnu ili transdermalnu primenu pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina ili polipeptidnog konstrukta uključuju praškove, sprejeve, meleme, paste, kreme, losione, gelove, rastvore, flastere i inhalanse. Aktivno jedinjenje se može pomešati u sterilnim uslovima sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i sa bilo kojim konzervansima, puferima ili propelantima koji mogu biti potrebni.

[0471] Melemi, paste, kreme i gelovi mogu da sadrže ekscipijense, kao što su životinjske i biljne masti, ulja, voskovi, parafini, skrobovi, tragakant, derivati celuloze, polietilen glikoli, silikoni, bentoniti, silicijumova kiselina, talk i cink oksid, ili njihove smeše.

[0472] Praškovi i sprejevi mogu da sadrže ekcipijense kao što su laktoza, talk, silicijumova kiselina, aluminijum hidroksid, kalcijum silikati i poliamidni prašak, ili smeše ovih supstanci. Sprejevi takođe mogu da sadrže uobičajene propelante, kao što su hlorfluor ugljovodonici i isparljivi nesupstituisani ugljovodonici, kao što su butan i propan.

[0473] Transdermalni flasteri imaju dodatnu prednost što omogućavaju kontrolisanu isporuku pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina ili polipeptidnog konstrukta u organizam. Rastvaranje ili disperzija jedinjenja u odgovarajućem medijumu može dati takve dozne oblike. Pojačavači apsorpcije se takođe mogu koristiti za povećanje protoka jedinjenja kroz kožu. Obezbeđivanje membrane koja kontroliše brzinu ili dispergovanje jedinejnja u polimernoj matrici ili gelu može da kontroliše brzinu tog protoka.

[0474] Takođe se smatra da su oftalmičke formulacije, melemi za oči, praškovi, rastvori i slično obuhvaćene ovim otkrićem.

[0475] Farmaceutske kompozicije pogodne za parenteralnu primenu obuhvataju jedan ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina ili polipeptidnih konstrukta u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih izotoničnih vodenih ili nevodenih rastvora, disperzija, suspenzija ili emulzija, ili sterilne praškova koji mogu biti rekonstituisani u sterilne injektabilne rastvore ili disperzije neposredno pre upotrebe, koji mogu da obuhvataju šećere, alkohole, antioksidanse, pufere, bakteriostatske agense, rastvorke koji čine formulaciju izotoničnom sa krvlju predviđenog primaoca ili agensima za suspenziju ili zgušnjavanje.

[0476] Primeri za odgovarajuće vodene i nevodene nosače, koji mogu da se koriste u farmaceutskoj kompoziciji uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično) i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i injektabilne organske estre, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost može da se održava, na primer, korišćenjem supstanci za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija, i korišćenjem surfaktanata.

[0477] Ove kompozicije takođe mogu da sadrže adjuvanse kao što su konzervansi, kvašljivci, emulgatori i agensi za dispergovanje. Prevencija dejstva mikroorganizama na predmetna jedinjenja može da se osigura uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agensa, na primer, parabena, hlorbutanola, fenol sorbinske kiseline i slično. Takođe može biti poželjno uključiti izotonične agense, kao što su šećeri, natrijum hlorid i slično u kompozicije. Pored toga, produžena apsorpcija farmaceutskog oblika za ubrizgavanje može se postići uključivanjem agenasa koji odlažu apsorpciju kao što su aluminijum monostearat i želatin.

[0478] U nekim slučajevima, da bi se produžilo dejstvo leka, poželjno je da se uspori apsorpcija leka iz supkutane ili intramuskularne injekcije. To može da se postigne korišćenjem tečne suspenzije kristalne ili amorfne supstance koja ima lošu rastvorljivost u vodi. Stopa apsorpcije leka onda zavisi od njegove brzine rastvaranja, koja zauzvrat može zavisiti od veličine kristala i oblika kristala. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenog oblika leka se postiže rastvaranjem ili suspendovanjem leka u uljanom vehikulumu.

[0479] Injektabilni depo oblici se proizvode formiranjem mikroenkapsuliranih matrica predmetnih jedinjenja u biorazgradivim polimerima kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa leka i polimera, i prirode konkretnog polimera koji se koristi, stopa oslobađanja leka može da se kontroliše. Primeri za druge biorazgradive polimere uključuju poli(ortoestre) i poli(anhidride). Depo injektabilne formulacije se takođe pripremaju hvatanjem leka u lipozome ili mikroemulzije, koje su kompatibilne sa telesnim tkivom.

[0480] Pronalazak će sada biti dalje opisan pomoću sledećih neograničavajućih poželjnih aspekata, primera i slika.

PRIMERI

Primer 1 Ćelijske linije TCR αβ / CD3

[0481] Generisane su tranzijentne i stabilne CHO-K1 (ATCC: CCL-61), HEK293H (Life technologies 11631-017), Llana (ćelije fibroblasta od ćelija pupčane vrpce lame) ćelijske linije sa rekombinantnom prekomernom ekspresijom svih 6 lanaca potpuno humanog kompleksa T-ćelijskog receptora. U tu svrhu, kodirajuće sekvence TCR alfa (α) i TCR beta (β) lanca su klonirane u vektor dobijen od pcDNA3.1, nishodno od CMV promotera i sekvenca virusnog peptida nalik na 2A je umetnuta između oba lanca kako bi se indukovalo ribozomsko preskakanje tokom translacije poliproteina. U istom vektoru, kodirajuće sekvence epsilon, delta, gama i zeta lanaca CD3 kompleksa su klonirane nishodno od dodatnog CMV promotora, takođe koristeći sekvence virusnog peptida nalik na 2A između odgovarajućih lanaca. Pored toga, stabilan HEK293H klon sa rekombinantnom prekomernom ekspresijom 4 lanca humanog CD3 je generisan kao što je prethodno opisano koristeći jedan genski vektor.

[0482] Sekvence konstantnih domena humanog CD3 i humanog TCRα/β su dobijene iz UniProtKB (CD3 delta: P04234, CD3 gama: P09693, CD3 epsilon: P07766, CD3 ceta: P20963, TCRα: P01848 i TCRβ: P01850). Sekvence varijabilnih domena humanog TCRα/β su dobijene iz kristalne strukture. (PDB kodovi: 2IAN, 2XN9 i 3TOE).

[0483] Ćelijska površinska ekspresija kompleksa humanog T ćelijskog receptora je potvrđena korišćenjem funkcionalnog mišjeg IgG2b anti-humanog TCRα/β antitela, klona BW242/412 (Miltenyi 130-098-219) i funkcionalnog mišjeg IgG2a anti-CD3 PE obeleženog antitela, klona OKT-3 (eBioscience 12-0037). (Slika 1)

Primer 2 Immunizacija lama sa TCR/CD3, kloniranje repertoara fragmenata antitela samo sa teškim lancem i priprema faga

2.1 Imunizacija

[0484] Posle odobrenja od strane etičkog komiteta (Fakultet za veterinarsku medicinu Univerziteta u Gentu, Belgija- EC2004/044 en EC2005/053), lame (llama glama) su imunizovane limfocitima humane periferne krvi (PBMC) koji su izolovani gradijentnim centrifugiranjem sa fikolom iz jedne frakcije leukocita i trombocita, ili mišjim ili humanim T-i NK ćelijama koje su obogaćene iz PBMC putem magnetne separacije ćelija koristeći antitela konjugovana biotinom. Nijedna od ovih strategija imunizacije nije dala specifičan imunski odgovor.

[0485] Nakon odobrenja od strane etičkog komiteta (CRIA, LA1400575, Belgija- EC2012 br.

1), 3 dodatne lame su imunizovane pVAX1-humanim TCR(2IAN)/CD3 (opisan u primeru 1) plazmidnim vektorom (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) i pVAX1-humanim TCR(2XN9)/CD3 (opisan u primeru 1) plazmidnim vektorom (Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) prema standardnom protokolu. Dve lame su dodatno primile 1 supkutanu injekciju primarnih humanih T ćelija. Humane T ćelije su prikupljene iz frakcije leukocita i trombocita krvi zdravih dobrovoljaca (Blood bank Gent) koristeći RosetteSep (StemCell Technologies, br. 15061), nakon čega je usledilo obogaćivanje na Ficoll-PaqueTM PLUS (GE Healthcare br. 17-144003) prema uputstvu proizvođača i čuvane su u tečnom azotu. Nakon odmrzavanja, ćelije su isprane, i ponovo suspendovane u D-PBS kompanije Gibco i držane na ledu pre injekcije.

2.2 Kloniranje repertoara fragmenata antitela samo sa teškim lancem i priprema faga.

[0486] Uzorci krvi su po životinji prikupljani nakon injekcije jedne vrste antigena za imunizaciju. Iz ovih uzoraka krvi, PBMC su pripremljene koristeći Ficoll-Hypaque prema uputstvu proizvođača (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, SAD). Za svaku imunizovanu lamu, biblioteke su konstruisane objedinjavanjem ukupne RNK koja je izolovana iz uzoraka koji potiču od određenog podskupa iz rasporeda imunizacije, tj. nakon jedne vrste antigena za imunizaciju.

[0487] Ukratko, PCR-amplifikovani repertoar VHH je preko specifičnih restrikcionih mesta kloniran u vektor koji je konstruisan da omogući displej faga biblioteke VHH. Vektor je dobijen iz pUC119. U okviru sa VHH kodirajućom sekvencom, vektor kodira C-terminalni 3xFLAG i His6 oznaku. Fagi su pripremljeni u skladu sa standardnim protokolima (vidite, na primer, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858 i drugu tehničku literaturu i patentne prijave koje je podnela kompanija Ablynx N.V. navedene ovde).

Primer 3 Odabir VHH specifičnih za TCR/CD3 putem displeja faga

[0488] Repertoari VHH dobijeni od svih lama i klonirani kao biblioteka faga korišćeni su u različitim strategijama odabira, uz primenu više uslova za odabir. Promenljive su uključivale: i) oblik prezentacije humanog TCR α/β /CD3 (na različitim ćelijskim pozadinama ili na prečišćenim primarnim T ćelijama (izolovano kao što je opisano u primeru 2.1, ii) koncentraciju antigena, iii) broj krugova odabira. Ukratko, ćelije su inkubirane tokom 2 h sa bibliotekama faga nakon čega su temeljno isprane; vezani fagi su eluirani tripsinom (1 mg/ml) tokom 15 minuta. Kada je tripsin korišćen za eluiranje faga, aktivnost proteaze je odmah neutralisana primenom 0,8 mM inhibitora proteaze ABSF. Kao kontrola, paralelno je obavljen odabir sa matičnom ćelijskom linijom ili bez antigena.

[0489] Dobijeni fagi su korišćeni za inficiranje E. coli radi analize pojedinačnih klonova VHH. Periplazmatski ekstrakti su pripremljeni u skladu sa standardnim protokolima (vidite, na primer, WO 03/035694, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551 i drugu tehničku literaturu i patentne prijave koje je podnela kompanija Ablynx N.V. navedene ovde).

Primer 4 Skrining

4.1 Skrining za nanotela koja vezuju TCR/CD3 na testu protočnom citometrijom

[0490] Periplazmatski ekstrakti su skrinovani na ćelije koje eksprimiraju vezivanje TCR/CD3 koristeći humane TCR/CD3 transficirane CHO-K1 ili HEK293H ćelije i odgovarajuće CHO-K1 ili HEK293H referentne ćelijske linije u postavci sa mešovitim ćelijskim linijama. U tom cilju, velika količina referentnih linija ćelija je označena sa 8 µM PKH26 i zamrznuta.5×10<4>PKH obeleženih referentnih ćelija je pomešano sa 5×10<4>ciljnih ćelija i inkubirano sa periplazmatskim ekstraktima tokom 30 min na 4 °C, i isprano 3 puta. Ćelije su zatim inkubirane sa 1 µg/ml monoklonskog ANTI-FLAG<®>M2 antitela (Sigma-Aldrich, kat. br. F1804) tokom 30 min na 4 °C, ponovo isprane, i inkubirane tokom 30 min na 4 °C sa kozjim anti-mišjim APC obeleženim antitelom (Jackson Immunoresearch 115-135-164, 1:100). Uzorci su isprani, suspendovani u FACS puferu (D-PBS kompanije Gibco, sa 10% FBS kompanije Sigma i 0,05% natrijum azidom kompanije Merck) i zatim analizirani na BD FACSArray. Prva P1 populacija koja predstavlja više od 80% ukupne ćelijske populacije izabrana je na osnovu raspodele FSC-SSC. U ovom izdvajanju, izbrojano je 20.000 ćelija tokom akvizicije. Na osnovu raspodele PKH26-SSC, izabrana je matična populacija označena sa PKH i neobeležena ciljna populacija humanog TCR/CD3. Izračunata je prosečna vrednost APC za ove 2 populacije.

4.2 Skrining za nanotela koja vezuju TCR/CD3 na testu aktivacije humanih T ćelija

[0491] Nakon nekoliko pokušaja, ispostavilo se da aktivacija prečišćenih humanih T ćelija putem antitela ili nanotela u skladu sa standardnim protokolima, tj. kada su nanete na ploču sa 96 bunarčića, nije bila dovoljno osetljiva (podaci nisu prikazani).

[0492] Da bi se procenila aktivnost, razvijen je drugačiji test, zasnovan na aktivaciji T ćelija koje su kuplovane na perlicama. Ukratko, kozje anti-mišje IgG dynabeads (Life technologies br. 11033) obložene su mišjim anti-flag IgG antitelima (Sigma F1804), (15 µg/1E7 perlica). Nakon perioda inkubacije od 2 h na 4 °C, perlice su isprane i inkubirane sa 80 µl periplazmatskog ekstrakta tokom 20 min na 4 °C uz tresenje. Nevezana nanotela su uklonjena ispiranjem pre dodavanja kompleksa perlica zajedno sa rastvorljivim mišjim anti-CD28 antitelom (Pelicluster CD28 - Sanquin br. M1650) u prečišćene primarne humane T ćelije (izolovane kao što je opisano u primeru 2.1). Kao kontrolni uslov, korišćene su nestimulisane humane T ćelije. Ukratko, kozje anti-mišje IgG dynabead perlice vezane sa mišjim anti-flag IgG su inkubirane u 80 µl periplazmatskog ekstrakta koji sadrži irelevantna nanotela. Nakon uklanjanja nevezanih nanotela tokom koraka ispiranja, kompleks irelevantnih nanotela i perlica je dodat u prečišćene primarne humane T ćelije.

[0493] Nakon 24 h inkubacije na 37 °C i 5% CO2, status aktivacije humanih T ćelija je određen merenjem nivoa ekspresije CD69 u protočnoj citometriji pomoću monoklonskog mišjeg antihumanog CD69PE (BD br.557050).

[0494] Nanotela koja su imala pozitivnu ocenu na testu vezivanja protočnom citometrijom i testu T ćelijske aktivacije su sekvencirana.

[0495] Analiza sekvence je dovela do identifikacije 6 različitih klastera. Obezbeđena su odgovarajući poravnanja (Tabela A-1, Tabela A-2, Tabela A-3, Tabela A-4, Tabela A-5, Tabela A-6). Grupisanje je zasnovano na sličnostima i razlikama sekvence CDR2 i CDR3. Klaster A je najistaknutiji i obuhvata 50 klonova (SEQ ID NO: 1-50), klaster B kao i klaster D su predstavljeni samo 1 klonom (SEQ ID NO: 51, odnosno SEQ ID NO: 52), klaster C obuhvata 4 klona (SEQ ID NO: 53-65), klaster E obuhvata 9 klonova (SEQ ID NO: 57-56), a klaster F obuhvata 15 klonova (SEQ ID NO: 66-80).

[0496] Varijabilnost sekvence CDR je određena za različite klastere. Za klaster A, aminokiselinska sekvenca CDR klona 117G03 je korišćena kao referenca, sa kojom su upoređeni CDR-i svih drugih klonova iz klastera A. Varijabilnost sekvence u odnosu na 117G03 prikazana je u tabelama ispod.

[0497] Za klaster B, aminokiselinska sekvenca CDR klona 60E11 je prikazana u tabelama ispod.

[0498] Za klaster C, aminokiselinska sekvenca CDR klona 33G03 je korišćena kao referenca, sa kojom su upoređeni CDR-i svih drugih klonova iz klastera C. Varijabilnost sekvence u odnosu na 33G03 prikazana je u tabelama ispod.

[0499] Za klaster D, aminokiselinska sekvenca CDR klona 11A10 je prikazana u tabelama ispod.

[0500] Za klaster E, aminokiselinska sekvenca CDR klona 52G04 je korišćena kao referenca, sa kojom su upoređeni CDR svih drugih klonova iz klastera E. Varijabilnost sekvence u odnosu na 52G04 prikazana je u tabelama ispod.

[0501] Za klaster F, aminokiselinska sekvenca CDR klona 50A11 je korišćena kao referenca, sa kojom su upoređeni CDR svih drugih klonova iz klastera F. Varijabilnost sekvence u odnosu na 50A11 prikazana je u tabelama ispod.

[0502] Grupisanje na osnovu sekvence transmutirane u funkcionalne razlike (pogledajte ispod).

4.3 Prečišćavanje jednovalentnih nanotela

[0503] Pošto nije moguće opisati sve klonove identifikovane u primeru 4.2, reprezentativna nanotela su izabrana i eksprimirana u E. coli TG1 kao trostruki Flaf, His6-označeni proteini.

Ekspresija je indukovana dodatkom 1 mM IPTG i pušteno je da traje tokom 4 sata na 37 °C. Nakon centrifugiranja ćelijskih kultura, periplazmatski ekstrakti su pripremljeni zamrzavanjem i odmrzavanjem peleta. Ovi ekstrakti su korišćeni kao polazna supstanca, a nanotela su prečišćena putem IMAC i hromatografije na molekulskim sitima (SEC).

[0504] Nanotela su prečišćena do 95% čistoće, što je procenjeno putem SDS-PAGE (podaci nisu prikazani).

Primer 5 Vezivanje CD3 nanotela za humani TCR/CD3 eksprimiran na CHO-K1 ćelijama i za prečišćene primarne humane T ćelije

[0505] Vezivanje prečišćenih jednovalentnih CD3 nanotela za humani TCR(2XN9)/CD3 eksprimiran na CHO-K1 ćelijama i za prečišćene primarne humane T ćelije procenjeno je protočnom citometrijom kao što je opisano u primeru 4.1. Na ćelijama su primenjene serije razblaženja CD3 nanotela 117G03 (klaster A), 60E11 (klaster B), 33G03 (klaster C), 11A10 (klaster D), 52G04 (klaster E) i 50A11 (klaster F) počevši od 1 µM.

[0506] Rezultati su prikazani na Slici 2.

[0507] Nanotela su se jasno vezivala za humani TCR/CD3 eksprimiran na CHO-K1 ćelijama. Predstavnik klastera A pokazao je najbolji afinitet, a zatim predstavnici klastera B, C, F, D i E.

[0508] Nanotela su se vezivala za prečišćene primarne humane T ćelije, iako sa nešto manjom potentnošću u poređenju sa CHO-K1 humanim TCR(2XN9)/CD3 ćelijama. Predstavnik klastera A pokazao je najbolji afinitet prema humanim primarnim T ćelijama, u skladu sa podacima za CHO-K1 (2XN9)/CD3. Vrednosti EC50dobijene sa krive odgovora na dozu predstavljene su u Tabeli 1.

Tabela 1: EC50 (M) anti-CD3 jednovalentnih nanotela za CHO-K1 humane TCR(2XN9)/CD3 ćelije i za prečišćene primarne T ćelije, kao što je određeno u protočnoj citometriji.

Primer 6 Određivanje vezujućeg epitopa

[0509] Vezivanje za humani TCR(2IAN)/CD3 eksprimiran na HEK293H ćelijama procenjeno je i upoređeno sa vezivanjem za HEK293H humane CD3 ćelije u protočnoj citometriji, kao što je opisano u primeru 5. Na ćelije su primenjene serije razblaženja CD3 nanotela počevši od 1 µM. Matična HEK293H ćelijska linija je uključena kao TCR/CD3 negativna ćelijska linija.

[0510] Rezultati su prikazani na Slici 3.

[0511] Vezivanje za HEK293H transficirane sa humanim CD3 je uočeno za sva nanotela. Pored toga, neka Nb su pokazala vezivanje za HEK293H transficirane sa humanim TCR/CD3. Nije uočeno vezivanje za HEK293H matične ćelijske linije. Vrednosti EC50dobijene iz krive odgovora na dozu prikazane su u Tabeli 2.

Tabela 2: EC50 (M) anti-CD3 jednovalentnih nanotela za humani TCR(2IAN)/CD3 ili humani CD3 eksprimiran na HEK293H kao što je određeno u protočnoj citometriji.

Primer 7 Kapacitet prečišćenih CD3 reaktivnih nanotela za aktivaciju primarnih humanih T ćelija

[0512] Funkcionalnost prečišćenih jednovalentnih CD3 nanotela procenjena je na testu aktivacije humanih T ćelija. Kozje anti-mišje IgG dynabead perlice (Life technologies br.

11033) obložene su mišjim anti-flag IgG antitelima (Sigma F1804), (15 µg/1E7 perlica). Nakon perioda inkubacije od 2 h na 4 °C, perlice su isprane i inkubirane fiksnom (1 µg) koncentracijom prečišćenog flag označenog nanotela tokom 20 min na 4 °C uz tresenje.

Nevezana nanotela su uklonjena ispiranjem pre dodavanja kompleksa perlica zajedno sa rastvorljivim mišjim anti-CD28 antitelom (Pelicluster CD28 - Sanquin br. M1650) u prečišćene primarne humane T ćelije (izolovane kao što je opisano u primeru 2.1) od različitih zdravih donora.

[0513] Pored toga, dejstvo vezivanja jednovalentnog CD3 putem nanotela je procenjeno putem inkubacije nanotela sa prečišćenim primarnim humanim T ćelijama koje su izolovane od različitih zdravih donora, bez prethodnog hvatanja na perlicama, u prisustvu anti-CD28 antitela.

[0514] Status aktivacije prečišćenih primarnih humanih T ćelija je praćen merenjem ekspresije CD69 protočnom citometrijom koristeći monoklonski mišji anti-humani CD69PE (BD br.

557050) nakon 24 h inkubacije na 37 °C i 5% CO2 kao što je opisano u primeru 4.2.

[0515] Da zaključimo, CD3 nanotela su pokazala jasnu ushodnu regulaciju CD69 nakon hvatanja na anti-mišje IgG dynabead perlice (slika 4A). Nijedno od CD3 reaktivnih nanotela, kada se primenjuje u rastvoru, nije moglo da aktivira prečišćene primarne humane T ćelije kao što je određeno na osnovu povišene ekspresije CD69 (slika 4B).

Primer 8 Vezivanje bispecifičnih CD3 polipeptida za kompleks receptora humanih T ćelija eksprimiran na ćelijama

[0516] Da bi se pokazalo da je moguće preusmeravanje angažovanih T ćelija na tumorske ćelije putem nanotela, CD20 antigen je izabran kao reprezentativni tumorski cilj.

[0517] Različiti CD3 gradivni blokovi (tj. nanotela) formatirani su u bispecifične konstrukte sa nanotelom koje cilja humani CD20 (vidite Tabelu 3). Efektorska i tumorska nanotela su genetski povezana sa 35GS linkerom i zatim eksprimirana u kvascu Pichia u skladu sa standardnim protokolom (bispecifični polipeptidi).

[0518] Irelevantni konstrukti su generisani zamenom efektorskog ili tumorskog nanotela irelevantnim nanotelom antijajčanog lizozima (cablys) (Tabela 3).

Tabela 3: ID uzorka i opis bispecifičnih konstrukta

[0519] Vezivanje bispecifičnih konstrukta za humani TCR/CD3 eksprimiran na CHO-K1 ćelijama, prečišćene primarne humane T ćelije i humane CD20 pozitivne Ramosove ćelije (ATCC: CRL-1596) procenjeno je protočnom citometrijom kao što je opisano u primeru 5 i prikazano na Slici 5.

[0520] Vrednosti EC50dobijene iz krive odgovora na dozu prikazane su u Tabeli 4.

Tabela 4: EC50 (M) anti-CD3 jednovalentnih nanotela za CHO-K1 humani TCR(2XN9)/CD3, primarne humane T ćelije i Ramosove ćelije na osnovu protočne citometrije.

[0521] Podaci ukazuju na slično vezivanje CD3xCD20 bispecifičnog nanotela (isprekidana linija) u poređenju sa jednovalentnim parnjacima, ali na smanjeno vezivanje CD20XCD3 bispecifičnog nanotela (puna linije) u poređenju sa jednovalentnim parnjacima za CHO-K1 humane TCR(2XN9)/CD3 ćelije i za primarne humane T ćelije. Na humanim CD20 Ramosovim ćelijama, bispecifična CD3 nanotela sa CD20 na C terminusu pokazala su smanjeno vezivanje.

Primer 9 Funkcionalna karakterizacija bispecifičnih CD20×CD3 polipeptida na testu ubijanja na bazi protočne citometrije

[0522] Da bi se procenilo da li su bispecifični polipeptidi bili u stanju da ubiju ćelije tumora, obavljeni su testovi citotoksičnosti sa izolovanim humanim T ćelijama kao efektorskim ćelijama.

[0523] Humane T ćelije su izolovane kao što je opisano u primeru 2.1. Kvalitet i čistoća prečišćenih humanih T ćelija su provereni sa anti-CD3 (eBioscience br.12-0037-73); anti-CD8 (BD Bioscience br. 345775); anti-CD4 (BD Bioscience br. 345771); anti-CD45RO (BD Bioscience br. 555493); anti-CD45RA (BD Bioscience br. 550855) i anti-CD19 (BD Bioscience br.555413), anti-CD25 (BD Pharmigen br.557138), anti-CD69 (BD Pharmigen br.

557050) fluorescentno obeleženim antitelima na testu protočne citometrije. Ramosove ćelije koje eksprimiraju humani CD20 i Radžijeve ćelije koje eksprimiraju CD20 (ECACC: 85011429), obeležene PKH-26 membranskom bojom kao što je prethodno opisano, korišćene su kao ciljne ćelije.2,5×10<5>efektorskih i 2,5×10<4>ciljnih ćelija je zajedno inkubirano u pločama sa 96 bunarčića sa dnom u obliku slova V sa odnosom efektora prema cilju od 10:1. Za merenje ćelijske lize zavisne od koncentracije, serijska razblaženja bispecifičnih polipeptida (Tabela 3) dodata su u uzorke i inkubirana tokom 18 h u atmosferi od 5% CO2 na 37 °C. Nakon inkubacije, ćelije su peletirane centrifugiranjem i isprane FACS puferom. Ćelije su zatim ponovo suspendovane u FACS puferu sa dodatkom 5 nM TOPRO3 (Molecular Probes kat. br. T3605) kako bi se napravila razlika između živih i mrtvih ćelija. Ćelije su analizirane pomoću FACS Array protočnog citometra (BD Biosciences). Pribavljena je ukupna zapremina od 80 µl po uzorku. Gejtovanje je podešeno na PKH26 pozitivne ćelije, i TOPRO3 pozitivne ćelije su određene unutar ove populacije.

[0524] CD3 bispecifični polipeptidi su pokazali ubijanje Ramosovih ćelija zavisno od doze (Slika 6A). T017000045 (klaster C, T0170033G03-35GS-20CD019C07-FLAG3-HIS6) pokazao je ubijanje zavisno od doze Ramosovih (Slika 6A) kao i Radžijevih (Slika 6B) ćelija, što potvrđuje da uočeno citotoksično dejstvo nije ograničeno na jednu ćelijsku liniju tumora. Nivo ekspresije tumorskog antigena , CD20, određen je za obe ćelijske linije (Slika 7).

[0525] Vrednosti IC50i % lize dobijene iz krive odgovora na dozu prikazane su u Tabeli 5 (% lize = % mrtvih ćelija pri 500 nM nanotela minus % mrtvih ćelija bez kontrole nanotela).

[0526] Ovi rezultati pokazuju da CD3 bispecifičnih polipeptidi mogu da indukuju T ćelijski posredovano ubijanja ćelijskih linija pozitivnih na tumorski cilj. Kada je ciljno nanotelo ili efektorsko nanotelo zamenjeno irelevantnim nanotelom, nije bilo moguće uočiti dejstvo na vijabilnost Ramosovih ćelija. Nije bilo jasnih preferenci u pogledu orijentacije između pojedinačnih gradivnih blokova u bispecifičnom polipeptidu.

Primer 10 Funkcionalna karakterizacija bispecifičnih CD20×CD3 polipeptida u testu ubijanja na bazi xCELLigence

[0527] CD3 multispecifični polipeptidi (Tabela 3) takođe su testirani na ćelijsku toksičnost za humane CD20 transficirane prianjajuće ciljne ćelije u prisustvu humanih efektorskih T ćelija koristeći tehniku na bazi električne impedanse u realnom vremenu. Ovde su izmerene fluktuacije impedanse izazvane prianjanjem ćelija na površini elektrode. T ćelije nisu prianjale i stoga nisu uticale na merenja impedanse.

[0528] Ukratko, stanica xCELLigence je postavljena u inkubator sa 37 °C i 5% CO2. 50 µl testiranog medijuma je dodato u svaki bunarčić E-ploče 96 (ACEA Biosciences; kat. br.05232 368 001) i slepo očitavanje na sistemu xCELLigence je obavljeno kako bi se izmerila pozadinska impedansa u odsustvu ćelija. Nakon toga, humane CD20 transficirane CHO-K1 ili CHO-K1 matične ćelije (1×10<4>) zasejane su na E-ploče 96, i dodato je 50 µl serijskog razblaženja nanotela. Nakon 30 min na RT, dodato je 50 µl humanih T ćelija po bunarčiću (3×10<5>) da bi se dobio odnos efektora prema cilju od 30:1. Ploča je postavljena na stanicu xCELLigence, i impedansa je merena na svakih 15 minuta tokom 3 dana. Podaci su analizirani 44 h nakon početka testa.

[0529] Vrednosti IC50su prikazane u Tabeli 6.

[0530] Multispecifični polipeptidi su pokazali ubijanje zavisno od tumorskog antigena, indukovali su T ćelijski posredovano ubijanje humanih CD20 transficiranih CHO-K1 ćelija zavisno od doze (Slika 8), ali konstrukti nisu mogli da indukuju T ćelijski posredovano ubijanje CHO-K1 matičnih ćelija (Slika 9).

Tabela 6: Prosečna vrednost IC50 (M) multispecifičnih konstrukta u testu ubijanja CHO-K1 CD20 posredovanog humanim T ćelijama na bazi xCELLigence koristeći odnos efektora prema cilju od 30 prema 1, analizirana 44 h nakon zasejavanja.

Klaster ID ID uzorka n IC50 ID uzorka n IC50

[0531] Ovi rezultati potvrđuju rezultat dobijen u testu ubijanje na bazi protočne citometrije iz primera 9. Pored toga, T ćelijski posredovano ubijanje je uočeno samo kada je prisutan ciljni antigen tumora, što pokazuje da su bispecifični polipeptidi kritično zavisni od svog cilja za indukciju citotoksičnosti.

Primer 11 Procena dužine linkera bispecifičnih polipeptida

[0532] Da bi se procenio uticaj dužine linkera koji se koristi u CD20/CD3 bispecifičnim polipeptidima na citotoksični kapacitet, efektorska i tumorska nanotela su genetski povezana sa 5GS, 9GS ili 35GS linkerom i zatim eksprimirana u Pichia u skladu sa standardnim protokolima (vidite Tabelu 7).

Tabela 7: ID uzorka i opis bispecifičnih konstrukta za procenu uticaja dužine linkera

[0533] Uticaj dužine linkera koji se koristi u CD20/CD3 bispecifičnim polipeptidima na ćelijsku citotoksičnost indukovanu humanim primarnim efektorskim T ćelijama na prianjajućem CHO-K1 humanom CD20 cilju je procenjen koristeći tehniku na bazi električne impedanse u realnom vremenu kao što je opisano u primeru 9.

[0534] Rezultati su rezimirani na Slici 10.

[0535] Svi bispecifični polipeptidi, tj. sve dužine linkera, pokazuju specifično ćelijsko ubijanje. Mala razlika u potentnosti je primećena između različitih linkera 9GS i 35GS za ove bispecifične polipeptide.

Primer 12 Procena odnosa efektora prema cilju za CD3 bispecifične polipeptide

[0536] Da bi se procenilo dejstvo različitih odnosa efektora prema cilju (E:T) na svojstva ubijanja nanotela, CD20xCD3 bispecifični polipeptidi su inkubirani sa 2,5×10<4>PKH obeleženih Ramosovih ćelija u prisustvu 2,5×10<5>(E:T=10:1), 1,25×10<5>(E:T=5:1), 5×10<4>(E:T=2:1), odnosno 2,5×10<4>(E:T=1:1) humanih T ćelija kao što je opisano u primeru 2.

[0537] Reprezentativni rezultati su prikazani na Slici 11. Vrednosti IC50su prikazane u Tabeli 8.

Tabela 8: Vrednost IC50 (M) bispecifičnih konstrukta u testu ubijanja Ramosovih ćelija posredovanog T ćelijama na bazi protočne citometrije koristeći različite odnose efektora prema cilju.

Klaster ID ID uzorka E:T n IC50 95% 95% % lize

[0538] Bispecifični konstrukt je indukovao ubijanje humanih CD20 ciljnih ćelija pri različitim odnosima E:T, čak i pri odnosu 1:1, nakon inkubacije od 18 h uz male razlike u potentnosti. Iako postoji uticaj odnosa E:T na % lize, to takođe može biti povezano sa trajanjem inkubacije (videti ispod).

Primer 13 Vremenski zavisna citolitička aktivnost CD20/CD3 bispecifičnih konstrukta na testu posredovanom prečišćenim primarnim humanim T ćelijama u xCELLigence

[0539] Da bi se procenio uticaj vremena inkubacije na osobine ubijanja CD20×CD3 bispecifičnih konstrukta, specifična liza ciljnih ćelija je izračunata za različite termine u xCELLigence. Ukratko, stanica xCELLigence je postavljena u inkubator sa 37 °C i 5% CO2.

50 µl testiranog medijuma je dodato u svaki bunarčić E-ploče 96 (ACEA Biosciences; kat. br.

05 232 368 001) i slepo očitavanje na sistemu xCELLigence je obavljeno kako bi se izmerila pozadinska impedansa u odsustvu ćelija. Nakon toga, humane CD20 transficirane CHO-K1 ili CHO-K1 matične ćelije (1×10<4>) zasejane su na E-ploče 96. Nakon 20 h, dodate su prečišćene primarne humane T ćelije (opisane iznad) i 100 nM, odnosno 1,5 nM bispecifični konstrukti. Ćelijski indeks (CI) meren je na svakih 15 min tokom 5 dana. Korišćenjem normalizovanog CI (normalizovani ćelijski indeks – NCI, izračunava se deljenjem vrednosti ćelijskog indeksa u određenom terminu sa vrednošću ćelijskog indeksa datog termina kada su dodate primarne humane T ćelije) izračunata je specifična liza u različitim terminima u uslovima sa konstruktima u odnosu na uslove kada nema konstrukta. (% specifične lize = ((NCIbezkonstrukta- NCIsa konstruktom)/NCIbez konstrukta))×100.

[0540] Rezultati su prikazani na Slici 12.

[0541] Već sat vremena nakon dodavanja humanih primarnih T ćelija i multispecifičnog konstrukta, može se uočiti povećanje ćelijskog indeksa koji se jasno povećao nakon dužeg vremena inkubacije. Maksimalno dejstvo je očito zavisilo od vremena inkubacije, ali dobijena vrednost IC50 se nije promenila sa povećanim vremenom inkubacije. Irelevantni konstrukt nije pokazao nikakvo ubijanje humanih CD20 CHO-K1 ćelija.

Primer 14 Ispitivanje produžetka poluživota

[0542] Hipoteza je bila da bi HLE preko vezivanja albumina mogao biti pogodan za usklađivanje sa različitim zahtevima, uključujući (i) produžetak poluživota (HLE) funkcionalne grupe; i (ii) delotvornost multispecifičnog konstrukta. Poželjno, funkcija HLE ne umanjuje prodiranje u tumore i tkiva.

[0543] Alb11, nanotelo koje se vezuje za humani serumski albumin (HSA) povezano je sa multispecifičnim CD20xCD3 polipeptidima kako bi se produžio in vivo poluživot formatiranih molekula (WO 06/122787). Određeni broj formata je generisan na osnovu gradivnog bloka koji cilja CD20 na N-terminusu, gradivnih blokova koji regrutuju CD3 u sredini i sa nanotelom koje cilja albumin na C-terminusu koristeći 35GS linker i eksprimirani su kao što je gore naznačeno. Pregled ispitanih formata je prikazan u Tabeli 9.

Tabela 9: ID uzorka i opis HLE konstrukta

[0544] Pošto vezivanje HSA za Alb11 nanotelo može imati uticaj na afinitet ili potentnost HLE konstrukta, nanotela sa produženim poluživotom su okarakterisana na vezivanje za CHO-K1 koje prekomerno eksprimiraju CD3 i za primarne humane T ćelije. Pored toga, potentnost na testu ubijanja Ramosovih B ćelija zavisnom od funkcionalnih T ćelija procenjena je u prisustvu i odsustvu HSA (opisano u 14.1 i 14.2 u nastavku).

14.1 Uticaj humanog serumskog albumina na svojstva vezivanja

[0545] Analogno eksperimentima koji su opisani u primeru 5, vezivanje anti-CD3 multispecifičnih konstrukta sa produženim poluživotom za CHO-K1 humane TCR(2XN9)/CD3 ćelije, primarne humane T ćelije i Ramosove ćelije ispitano je protočnom citometrijom.

[0546] Rezultati su dati na Slici 13. Vrednosti EC50dobijene u ovom testu su navedene u Tabeli 10.

Tabela 10: Tabela sa vrednostima EC50 za vezivanje na bazi ćelija za CHO-K1 humane

[0547] Poređenje CD20-35GS-CD3 HLE konstrukta sa konstruktima bez HLE pokazalo je slično vezivanje za sve tri testirane ćelijske linije. Prikazani podaci pokazuju da kuplovanje gradivnog bloka Alb11 nije uticalo na svojstva vezivanja.

14.2 Uticaj humanog serumskog albumina na potentnost na testu ubijanja B ćelija posredovanog humanim T ćelijama

[0548] Funkcionalnost anti-CD3 nanotela sa produženim poluživotom (Tabela 9) ispitana je na testu ubijanja Ramosovih ćelija posredovanog humanim T ćelijama, kao što je opisano u primeru 10, u prisustvu i odsustvu 30 µM HSA i u poređenju sa funkcionalnošću bispecifičnih konstrukta bez HLE.

[0549] Rezultati su prikazani na Slici 14. Vrednosti IC50dobijene u ovom testu su navedene u Tabeli 11.

Tabela 11: Tabela sa vrednošću IC50 i % lize za CD20×CD3 nanotela na testu ubijanja B-ćelija (Ramos) zavisnom od T ćelija za procenu dejstva HLE

[0550] Rezultati pokazuju da uključivanje Nb koje cilja albumin u konstruktu samo po sebi nije imalo značajan uticaj na dobijenu potentnost ili efikasnost. Iako je manji gubitak efikasnosti/potentnosti primećen u prisustvu HSA, CD3 bispecifični polipeptidi sa produženim poluživotom su i dalje bili potentni za ubijanje tumorskih ćelija.

Primer 15 Funkcionalna karakterizacija multispecifičnih polipeptida na testu ubijanja HER2 pozitivnog tumora posredovanog humanim T ćelijama na bazi xCELLigence

[0551] Da bi se procenila opšta primenljivost CD3 gradivnih blokova u usmeravanju T ćelija na ćelije tumora, CD3 gradivni blokovi su kombinovani sa različitim TAA, u ovom slučaju nanotelom koje se vezuje za HER2.

[0552] Anti-CD3 gradivni blok je kombinovanom sa nanotelom protiv HER2 antigena čvrstog tumora sa dve orijentacije (Tabela 12) i okarakterisan na testu ubijanja HER2 pozitivnog tumora posredovanog humanim T ćelijama na bazi xCELLigence, kao što je opisano u primeru 10, koristeći dve ćelijske linije koje eksprimiraju HER2: SK-BR-3 (ATCC: HTB-30), MCF-7 (ATCC: HTB-22) i HER2 negativnu referentnu ćelijsku liniju, MDA-MB-468 (ATCC HTB-132) kao populaciju ciljnih ćelija. Nivoi ekspresije humanog HER2 su potvrđeni koristeći jednovalentno anti-HER2 nanotelo HER2005F07 u protočnoj citometriji, kao što je opisano u primeru 9, koristeći 100 nM anti-HER2 nanotela i prikazani su na Slici 15.

Tabela 12: ID uzorka i opis HER2/CD3 konstrukta

[0553] Ukratko, SKBR3 (4×10<4>ćelija/bunarčiću), MDA-MB-468 (4×10<4>ćelija /bunarčiću) ili MCF-7 (2×10<4>ćelija/bunarčiću) zasejane su u E-pločama sa 96 bunarčića i inkubirane sa 6×10<5>ćelija i 3×10<5>ćelija humanih primarnih T ćelija (odnos efektora prema cilju 15 prema 1) u prisustvu ili odsustvu multispecifičnih konstrukta i praćene tokom vremena. Podaci su analizirani 18 h od početka eksperimenta i prikazani na Slici 16.

[0554] Vrednosti IC50dobijene u ovom testu su navedene u Tabeli 13.

[0555] Podaci ukazuju na specifično ubijanje HER2 pozitivnih ćelijskih linija tumora putem usmeravanja humanih primarnih T ćelija na tumorske ćelije putem CD3 nanotela. Dakle, CD3 gradivni blokovi su široko primenljivi za usmeravanje CTL na tumore. Uprkos velikoj razlici u gustini tumorskog antigena na SKBR3 i MCF-7 ćelijama, i jedne i druge se delotvorno ubijaju dodavanjem multispecifičnih konstrukta nanotela.

Primer 16 Dejstvo CD20/CD3 polipeptida na oslobađanje IFN-γ od strane humanih T ćelija na xCELLigence testu ubijanja

[0556] CD20×CD3 polipeptidi su ispitani na sposobnost da indukuju sekreciju citokina na testu ubijanja CHO_K1 humanih CD20 ćelija posredovanog T ćelijama na bazi xCELLigence, kao što je opisano u primeru 10. Oslobađanje citokina IFN-γ je mereno putem ELISA. Ukratko, CHO-K1 humane CD20 ćelije su zasejane na E ploču sa 96 bunarčića i, nakon 20 h, u E ploče su dodate prečišćene humane primarne T ćelije sa bispecifičnim CD20XCD3/irelevantnim konstruktima ili bez njih, kao što je opisano u primeru 13. 72 h nakon dodavanja humanih primarnih T ćelija/konstrukta na E-ploče, izmerena je proizvodnja IFN-γ od strane humanih primarnih T ćelija. Maxisorp ELISA ploče sa 96 bunarčića (Nunc) obložene su anti-humanim IFN-γ antitelom (BD Bioscence br.551221). Nakon inkubacije tokom noći, ploče su isprane i blokirane sa PBS 2% BSA tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim inkubirane sa 100 µl supernatanta (2-struko razblaženi) i 1 µg/ml biotinilovanog anti-humanog IFN-γ antitela (BD Bioscience, br.554550) tokom 2 h 30 min, uz tresenje, ponovo su isprane i inkubirane sa streptavidinom-HRP (Dakocytomation br. P0397). Nakon 30 minuta dodat je TMB One Solution (Promega br. G7431). Reakcija je zaustavljena sa 2 M H2SO4 i proizvodnja IFN-γ zavisna od doze nanotela određena je merenjem OD pri 405 nm koristeći Tecan sunrise 4.

[0557] Rezultati su prikazani na Slici 17. Vrednosti EC50dobijene u ovom testu su navedene u Tabeli 14.

Tabela 14: Vrednost EC50 (M) za sekreciju IFN-γ zavisnu od CD20/CD3 od strane humanih T ćelija na testu ubijanja posredovanog T ćelijama na bazi xCELLigence.

ID jednovalentnog Nb ID konstrukta (CD20×CD3) n EC50 (M) 95% LCI 95% UCI

[0558] Bispecifični CD20/CD3 polipeptid je pokazao proizvodnju IFN-γ zavisnu od doze. Inkubacija sa irelevantnim konstruktom ili u uslovima bez bispecifičnog konstrukta nije indukovala proizvodnju IFN-y.

Primer 17 In vivo dokaz koncepta na modelu iscrpljivanja PBMC B ćelija

[0559] Na ovom modelu iscrpljivanja B ćelija, humane PBMC su intraperitonealno injektovane NOG miševima. Ispitano je ubijanje B ćelija izvedenih iz PBMC putem polipeptidom posredovanog regrutovanja T ćelija koje su prisutne u populaciji PBMC, koje odražava potencijal multispecifičnih polipeptida da aktiviraju T ćelije neposrednim vezivanjem T ćelija putem CD3 za ciljne B ćelije putem CD20, što dovodi do ubijanja ciljnih ćelija.

[0560] In vivo efikasnost CD3/CD20 multispecifičnih polipeptida (T017000084, vezivanje CD20xCD3, klaster A) za iscrpljivanje B ćelija na PBMC NOG mišjem modelu je procenjena i upoređena sa irelevantnim polipeptidom T017000088. Studija je pokazala jasan efekat na iscrpljivanje B ćelija izvedenih iz PBMC u slezini.

[0561] Detaljno, iscrpljivanje B ćelija je procenjeno na miševima kojima je intraperitonalno ubrizgano 3×10<7>PBMC u 500 µl PBS 3. dana (D3) nakon ozračivanja celog tela miševa γizvorom (1,44 Gy, 60Co) 0. dana (D0) i randomizovanja miševa u grupe od po 12 životinja. Lečenje je počelo dana D3 jedan sat nakon injekcije PBMC i ponavljano je tokom 5 uzastopnih dana, ukupno do 7. dana (D7) (slika 18). Testiran je jedan dozni nivo CD3/CD20 vezujućeg NB (24 mg/kg).

[0562] Miševi su žrtvovani 18. dana (D18) i slezine su sakupljene za FACS analizu (mCD45, hCD45, hCD19, hCD20) kako bi se analiziralo i kvantifikovalo prisustvo humanih B ćelija izvedenih iz PBMC (hCD19+ hCD20+ hCD45+ mCD45-).

[0563] Rezultati za iscrpljivanje B ćelija izvedenih iz PBMC su predstavljeni na slici 19. Broj B ćelija u slezini u grupi koja je tretirana sa T017000084 jasno se razlikovao od grupe tretirane irelevantnim polipeptidom pri testiranom doznom nivou. Procenjeno je da je doza na nivou maksimalnog dejstva.

[0564] Da zaključimo, ovi rezultati pokazuju da su CD3/CD20 vezujući multispecifični polipeptidi jasno mogli da smanje broj B ćelija izvedenih iz PNMC u slezini na ovom modelu. Ovo je potvrdilo aktivaciju T ćelija indukovanu polipeptidom putem unakrsnog vezivanja T ćelija za ciljne B ćelije i ubijanje potonjih.

Primer 18: In vivo dokaz koncepta na modelu iscrpljivanja Ramosovih B ćelija

[0565] U ovom modelu iscrpljivanja B ćelija, Ramosove ćelije (ćelijska linija Burkitovog limfoma) i humane PBMC su injektovane intravenski, odnosno intraperitonealno u NOG miševe. Ispitano je ubijanje Ramosovih B ćelija i B ćelija izvedenih iz PBMC putem polipeptidom posredovanog regrutovanja T ćelija koje su prisutne u populaciji PBMC, koje odražava potencijal multispecifičnih polipeptida da aktiviraju T ćelije neposrednim vezivanjem T ćelija putem CD3 za ciljne B ćelije putem CD20, što dovodi do ubijanja ciljnih ćelija.

[0566] In vivo efikasnost multispecifičnog polipeptida T017000084 (CD20xCD3 vezivanje) za iscrpljivanje B ćelija na Ramos NOG mišjem modelu je procenjena i upoređena sa irelevantnim polipeptidom T017000088 (irelevantno nanotelo CD3 vezujuće nanotelo). Studija je pokazala statistički značajan efekat u koštanoj srži i slezini na iscrpljivanje Ramosovih B ćelija i B ćelija izvedenih iz PBMC u slezini.

[0567] Detaljno je procenjeno iscrpljivanje B ćelija kod miševa kojima je intravenski injektovano 10<6>Ramosovih ćelija u 200 µl medijuma Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 prvog dana (D1). Ova injekcija se odigrala 24 sati nakon ozračivanja celog tela miševa γ-izvorom (1,44 Gy, 60Co) (D0).10<7>PBMC (500 µl u PBS) injektovano je dana D3 (tj. dva dana nakon injekcije tumorskih ćelija) nakon randomizacije miševa u grupe od po 12 životinja. Lečenje je počelo dana D3 jedan sat nakon injekcije PBMC i ponavljano je tokom 5 uzastopnih dana, ukupno do D7 (slika 20). Testiran je jedan dozni nivo CD3/CD20 vezujućeg polipeptida (24 mg/kg).

[0568] Na D20. ili D21. miševi su žrtvovani i slezina i koštana srž (butna kost) prikupljeni su za FACS analizu (mCD45, hCD45, hCD19, hCD20, hCD10) za analizu i kvantifikaciju prisustva Ramosovih B ćelija (hCD19+ hCD20+ hCD45+ mCD45 -hCD10+) i B ćelija izvedenih iz PBMC (hCD19+ hCD20+ hCD45+ mCD45- hCD10-).

[0569] Rezultati za iscrpljivanje Ramosovih B ćelija su predstavljeni na slici 21. Miševi tretirani irelevantnim bispecifičnim polipeptidom su posmatrani kao kontrolna grupa za analize. Obavljena je statistička analiza F-testovima iz ANOVA analize sa mešovitim dejstvima. Za koštanu srž i slezinu, broj B ćelija u grupi koja je tretirana sa T017000084 se statistički značajno razlikovao od grupe tretirane irelevantnim polipeptidom pri testiranom doznom nivou. U slezini, procenjeno je da je doza na nivou maksimalnog dejstva ili je blizu njega.

[0570] Rezultati za iscrpljivanje B ćelija izvedenih iz PBMC su predstavljeni na slici 22. U koštanoj srži kao i slezini uočena je statistički značajna razlika u broju humanih B ćelija za T017000084 u odnosu na irelevantni polipeptid pri testiranom doznom nivou. Procenjeno je da je doza na nivou maksimalnog dejstva.

[0571] Dakle, ovi rezultati pokazuju da su CD3/CD20 bispecifični polipeptidi mogli značajno da smanje broj Ramosovih B ćelija i B ćelija izvedenih iz PBMC u slezini i koštanoj srži na ovom modelu. Ovo potvrđuje aktivaciju T ćelija indukovanu nanotelom putem unakrsnog vezivanja T ćelija za ciljne B ćelije i ubijanje potonjih.

Primer 19 Ciljanje tumorskih ćelija multispecifičnim polipeptidima koji angažuju T ćelije

[0572] Terapeutska aktivnost strategije angažovanja T ćelija može da se poboljša istovremenim ciljanjem više antigena povezanih sa tumorom. Tumorske ćelije često stvaraju mehanizam za bekstvo putem nishodne regulacije ciljanih antigena u terapiji. Očekivano je da će istovremeno vezivanje više antigena smanjiti verovatnoću generisanja varijanti za bekstvo tumora. Pojedinačni afinitet odgovarajućih nanotela koja ciljaju tumor može da se menja tako da se postigne poželjno vezivanje za pojedinačni marker ili istovremeno vezivanje za oba tumorska markera. Antigeni prisutni na različitim ćelijskim populacijama mogu da se kombinuju ili čak i rastvorljivi proteini mogu da se ciljaju u kombinaciji sa antigenom povezanim sa tumorom.

[0573] Kako je platforma nanotela idealna za kombinovanje različitih specifičnosti u multispecifičnom formatu, CD3 nanotela iz pronalaska se kombinuju u formate koji ilustruju ove koncepte, tj. sa nanotelima koja vezuju različite tumorske antigene u multispecifičnom polipeptidu.

[0574] Za koncept ciljanja dvostrukog tumorskog antigena, nanotelo reaktivno na prvi tumorski antigen (TA1, npr. CEA) povezano je sa drugim nanotelom različite specifičnosti (TA2, npr. EGFR), koja se razlikuje od TA1, u kombinaciji sa CD3 reaktivnim nanotelom. Konkretan redosled gradivnih blokova se menja u okviru formata, kao i dužina primenjenih linkera između različitih gradivnih blokova. Kombinacije TA1 i TA2 koje su testirane prikazane su u Tabeli 15.

Tabela 15: Kombinacija CD3, TA1, TA2 i Alb vezujućih gradivnih blokova u multispecifičnim polipeptidima.

T-ćelijski ISV TA1 ISV TA2 ISV ALB-ISV

[0575] Da bi se testirao produžetak poluživota, nanotelo koje vezuje albumin je takođe uključeno u polipeptide kao što je prikazano u Tabeli 15.

[0576] Da bi se pokazalo specifično ubijanje, koristi se sistem za testiranje mešovite ćelijske kulture gde su TA1 pojedinačno pozitivne (npr. MC38-huCEA ili MKN45) i TA2 pojedinačno pozitivne tumorske ćelije (npr. Heka ili Her14) inkubirane zajedno. Nivo ekspresije odgovarajućih tumorskih antigena je određen u različitim ćelijskim linijama i predstavljen je na slici 23. Nakon dodavanja polipeptida iz pronalaska, primarnih humanih T ćelija i po potrebi albumina, T ćelijski posredovana citotoksičnost se prati na osnovu citometrijskog očitavanja. Poređenje se vrši u pogledu dvostruko negativnih ćelija ili formata koji sadrže jedno ili više irelevantnih nanotela.

[0577] Da bi se potvrdilo specifično ubijanje, indukovano ubijanje dvostruko pozitivnih tumorskih) ćelija (na TA1 i TA2, npr. LS174T ili LoVo poredi se sa indukovanim ubijanjem pojedinačno pozitivnih tumorskih ćelija. Za to se koristi test T ćelijski posredovane citotoksičnosti kao što je prethodno opisano, sa jednim tipom tumorskih ćelija koje su pozitivne na oba markera (vidite primer 17).

Primer 20 Ciljanje tumorskih ćelija multispecifičnim polipeptidima koji angažuju T ćelije

[0578] Kao što je već pomenuto, terapeutska aktivnost strategije angažovanja T ćelija može da se poboljša istovremenim ciljanjem više antigena povezanih sa tumorom. Ne samo da tumorske ćelije stvaraju mehanizam za bekstvo putem nishodne regulacije ciljanih antigena u terapiji, već i putem uvođenja (tačkastih) mutacija. Takođe, u ovom slučaju, očekivano je da će istovremeno vezivanje više epitopa na antigenu smanjiti verovatnoću generisanja varijanti za bekstvo tumora. Štaviše, ciljanje više epitopa na jednom antigenu može povećati afinitet vezivanja (efekat avidnosti).

[0579] Kako je platforma nanotela idealna za kombinovanje različitih specifičnosti u viševalentni format, anti-CD3 nanotela iz pronalaska se kombinuju u formate koji ilustruju ove koncepte, tj. sa nanotelima koja vezuju različite tumorske antigene u multispecifičnom polipeptidu.

[0580] Za koncept viševalentnog ciljanja tumorskog antigena, dva nanotela reaktivna na antigen su povezana (TA1, odnosno TA2), a zatim je dodato CD3 reaktivno nanotelo. Konkretan redosled gradivnih blokova se menja u okviru formata, kao i dužina primenjenih linkera između različitih gradivnih blokova. Kombinacije TA1 i TA2 koje su testirane prikazane su u Tabeli 16.

Tabela 16: Kombinacija CD3, TA1, TA2 i Alb vezujućih gradivnih blokova u multispecifičnim polipeptidima.

[0581] Da bi se testirao produžetak poluživota, Alb nanotelo je takođe uključeno u polipeptide kao što je prikazano u Tabeli 16.

[0582] Potentnost i efikasnost ovih viševalentnih formata se procenjuju i upoređuju sa odgovarajućim bispecifičnim formatima u in vitro testu ubijanja tumorskih ćelija koji je uporediv sa testom opisanim u primeru 10, ali sa relevantnim ćelijskim linijama (npr. Hela, Her14, Ls174T, SKBR3, MCF7). Pored toga, odnos efektora i cilja se menja tako da se načini procena da li viševalentni/multispecifični polipeptid ima veću efikasnost sa manjim odnosom efektora prema cilju.

TABELE

[0583]

Tabela A-1: Poravnavanje sekvenci CD3 vezivača iz klastera A

T0170P EVQLVESGGGPVQAGGSLRLSCAASGRTYRGYSMGWFRQAPGKEREFVA MP117 AIVWSGGNTYYEDSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMTSLKPEDSATYYCAA G03 : KIRPYIFKIAGQYDYWGQGTQVTVSS

T0170P .......................N........G.A....S...........T..E..A....F...............L.....N.....T.L......................

T0170P ...P.........T........V...........A....P...........T..E.......F...............L...........T.L..............P..........

T0170P ...........A..............................R...........D...............................................................L.....

T0170P ...............D.......................V.............TD...................T...........................................L.....

MP126

Tabela A-3: Poravnavanje sekvenci CD3 vezivača iz klastera C

T0170P ..........V...................THT........E...EM..Q.S...K...I.......T..........F.R..D...D..............V...

Tabela A-6: Poravnavanje sekvenci CD3 vezivača iz klastera F

T0170 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFNMNPLGWFRQSPGKEREFVAA PMP05 HRWSDGNTYYVDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCAAG 0A11 : RPWSAFRSPGEYVYWGQGTQVTVSS

T0170 ...........................T.ST..M........N.................A.......A.......K..........................SY...D......

T0170 ...........................G.ST..M..................................A..........H.......................DY.A.S..I....

Tabela A-7: Aminokiselinske sekvence jednovalentnih anti-CD3 antitela („ID“ se odnosi na SEQ ID NO kao što se koristi ovde)

Naziv ID Aminokiselinska sekvenca Naziv ID Aminokiselinska sekvenca Naziv ID Aminokiselinska sekvenca

Naziv ID Aminokiselinska sekvenca Naziv ID Aminokiselinska sekvenca Naziv ID Aminokiselinska sekvenca Naziv ID Aminokiselinska sekvenca

Tabela A-8: Sekvence za CDR i okvire, kao i poželjne kombinacije kao što je navedeno u formuli I, naime FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. „ID“ se odnosi na dati SEQ ID NO. Prva kolona se odnosi na SEQ ID NO kompletnog ISV, tj. FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. CDR1, CDR2 i CDR3 su određeni prema Kontermann, 2010.

ID Nazi ID FR1 ID CDR ID FR2 ID CDR ID FR3 ID CDR ID FR4

ID Nazi ID FR1 ID CDR ID FR2 ID CDR ID FR3 ID CDR ID FR4 ID Nazi ID FR1 ID CDR ID FR2 ID CDR ID FR3 ID CDR ID FR4

ID Nazi ID FR1 ID CDR ID FR2 ID CDR ID FR3 ID CDR ID FR4

Tabela A-9: Sekvence multispecifičnih polipeptida (sa oznakama i bez njih). „ID“ se odnosi na SEQ ID NO kao što se koristi ovde.

ID Naziv Opis Aminokiselinska sekvenca ID Naziv Opis Aminokiselinska sekvenca

00018 35GS-cAbLys3

ID Naziv Opis Aminokiselinska sekvenca

ID Naziv Opis Aminokiselinska sekvenca ID Naziv Opis Aminokiselinska sekvenca ID Naziv Opis Aminokiselinska sekvenca ID Naziv Opis Aminokiselinska sekvenca

00018 35GS-cAbLys3

ID Naziv Opis Aminokiselinska sekvenca ID Naziv Opis Aminokiselinska sekvenca ID Naziv Opis Aminokiselinska sekvenca ID Naziv Opis Aminokiselinska sekvenca ID Naziv Opis Aminokiselinska sekvenca ID Naziv Opis Aminokiselinska sekvenca

Tabela A-10: Sekvence komponenata TCR kompleksa. „ID“ se odnosi na SEQ ID NO kao što se koristi ovde

ID Naziv Aminokiselinska sekvenca

Tabela A-11: Sekvence TAA gradivnih blokova. „ID“ se odnosi na SEQ ID NO kao što se koristi ovde

ID Naziv Aminokiselinska sekvenca

Claims

Patentni zahtevi

1. Polipeptid koji obuhvata prvi i drugi pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina (ISV), pri čemu

- pomenuti prvi ISV ima visok afinitet prema klasteru diferencijacije 3 (CD3) prisutnom na T ćeliji / vezuje se za njega;

- pomenuti drugi ISV ima visok afinitet prema prvom antigenu na ciljnoj ćeliji / vezuje se za njega;

pri čemu, pomenuti prvi antigen se razlikuje od pomenutog CD3;

pri čemu, pomenuta ciljna ćelija se razlikuje od pomenute T ćelije; i

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 81-87; i

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 101-109; i

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 123-127; i

2. Polipeptid prema zahtevu 1, pri čemu, pomenuti prvi antigen na ciljnoj ćeliji je tumorski antigen, poželjno antigen povezan sa tumorom (TAA).

3. Polipeptid prema zahtevu 1 ili 2, koji dalje obuhvata treći ISV, koji ima visok afinitet prema drugom antigenu na ciljnoj ćeliji / vezuje se za njega, pri čemu, pomenuti drugi antigen se razlikuje od pomenutog prvog antigena.

4. Polipeptid prema zahtevu 3, pri čemu, pomenuti drugi antigen na ciljnoj ćeliji je tumorski antigen, poželjno antigen povezan sa tumorom (TAA).

5. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 2 do 4, pri čemu, pomenuti TAA su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od hondroitin sulfat proteoglikana povezanog sa melanomom (MCSP), receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), proteina aktivacije fibroblasta (FAP), MART-1, karcinoembrionskog antigena (CEA), gp100, MAGE-1, HER-2, Luisovih Y antigena, CD123, CD44, CLL-1, CD96, CD47, CD32, CXCR4, Tim-3, CD25, TAG-72, Ep-CAM, PSMA, PSA, GD2, GD3, CD4, CD5, CD19, CD20, CD22, CD33, CD36, CD45, CD52, i CD147, receptora faktora rasta uključujući ErbB3 i ErbB4, i receptora citokina uključujući gama lanac receptora interleukina-2 (CD132 antigen), alfa lanca receptora interleukina-10 (IL-10R-A), beta lanca receptora interleukina-10 (IL-10R-B), beta-1 lanca receptora interleukina-12 (IL-12R-beta1), beta-2 lanca receptora interleukina-12 (IL-12 receptor beta-2), alfa-1 lanca receptora interleukina-13 (IL-13R-alfa-1) (CD213a1 antigen), alfa-2 lanca receptora interleukina-13 (interleukin-13 vezujući protein), receptora interleukina-17 (IL-17 receptor), receptora interleukina-17B (IL-17B receptor), prekursora receptora interleukina 21 (IL-21R), receptora interleukina-1 tip I (IL-1R-1) (CD121a), receptora interleukina-1 tip II (IL-1R-beta) (CDw121b), antagonističkog proteina receptora interleukina-1 (IL-1ra), alfa lanca receptora interleukina-2 (CD25 antigen), beta lanca receptora interleukina-2 (CD122 antigen), alfa lanca receptora interleukina-3 (IL-3R-alfa) (CD123 antigen), CD30, IL23R, IGF-1R, IL5R, IgE, CD248 (endosijalin), CD44v6, gpA33, Ron, Trop2, PSCA, klaudina 6, klaudina 18.2, CLEC12A, CD38, ephA2, c-Met, CD56, MUC16, EGFRvIII, AGS-16, CD27L, nektina-4, SLITRK6, mezotelina, receptora folata, faktora tkiva, axl, glipikana-3, CA9, kripto, CD138, CD37, MUC1, CD70, receptora peptida koji oslobađa gastrin, PAP, CEACAM5, CEACAM6, CXCR7, N-kadherina, FXYD2 gama a, CD21, CD133, Na/K-ATPaze, mlgM (IgM vezan za membranu), mlgA (IgA vezan za membranu), Mer, Tyro2, CD120, CD95, CA 195, DR5, DR6, DcR3 i CAlX.

6. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 2 do 5, pri čemu, pomenuti prvi antigen i pomenuti drugi antigen su izabrani iz grupe koja se sastoji od:

- EGFR kao prvog antigena i CEA kao drugog antigena;

- CD19 kao prvog antigena i CD20 kao drugog antigena;

- CD19 kao prvog antigena i CD22 kao drugog antigena;

- CD123 kao prvog antigena i Tim-3 kao drugog antigena; i

- CD123 kao prvog antigena i CD69 kao drugog antigena.

7. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 6, koji dalje obuhvata vezujući ostatak serumskog proteina.

8. Polipeptid prema zahtevu 7, pri čemu, pomenuti vezujući ostatak serumskog proteina je ISV koji vezuje serumski albumin.

9. Polipeptid koji se specifično vezuje za CD3 i koji obuhvata ili se suštinski sastoji od 4 regiona okvira (FR1 do FR4, datim redosledom) i 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, datim redosledom), u kome:

(i) CDR1 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(a) SEQ ID NO: 81-87; ili

(ii) CDR2 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(c) SEQ ID NO: 101-109; ili

(iii) CDR3 je odabran iz grupe koja se sastoji od:

(e) SEQ ID NO: 123-127; ili

10. Polipeptid prema zahtevu 9, koji dalje obuhvata vezujući ostatak serumskog proteina.

11. Polipeptid prema zahtevu 9, pri čemu je pomenuti vezujući ostatak serumskog proteina ISV koji vezuje serumski albumin.

12. Nukleinska kiselina ili sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid kao što je definisan u bilo kom od zahteva 1 do 11, ili vektor koji obuhvata pomenutu nukleinsku kiselinu ili sekvencu nukleinske kiseline.

13. Ćelija domaćin koja je transformisana ili transficirana nukleinskom kiselinom ili sekvencom nukleinske kiseline ili vektorom kao što je definisano u zahtevu 12.

14. Proces proizvodnje polipeptida prema bilo kom od zahteva 1 do 11, pri čemu pomenuti proces obuhvata uzgajanje ćelije domaćina kao što je definisano u zahtevu 13 u uslovima koji omogućavaju ekspresiju polipeptida kao što je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 11 i izolovanje proizvedenog polipeptida iz kulture.

15. Farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 11.

16. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 11, za upotrebu u lečenju ispitanika kome je to potrebno.

17. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 11 za upotrebu u prevenciji, lečenju ili poboljšanju bolesti izabrane iz grupe koja obuhvata proliferativnu bolest, inflamatornu bolest, infektivnu bolest i autoimunsku bolest.

18. Polipeptid za upotrebu prema zahtevu 17, pri čemu, pomenuta proliferativna bolest je kancer.

19. Polipeptid za upotrebu prema zahtevu 18, pri čemu, pomenuti kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od karcinoma, glioma, mezotelioma, melanoma, limfoma, leukemija, adenokarcinoma: kancera dojke, kancera jajnika, kancera grlića materice, glioblastoma, multiplog mijeloma (uključujući monoklonsku gameopatiju neodređenog značaja, asimptomatski i simptomatski mijelom), kancera prostate, Burkitovog limfoma, kancera glave i vrata, kancera debelog creva, kolorektalnog kancera, nemikrocelularnog kancera pluća, mikrocelularnog kancera pluća, kancera jednjaka, kancera želuca, kancera pankreasa, hepatobilijarnog kancera, kancera žučne kese, kancera tankog creva, kancera rektuma, kancera bubrega, kancera bešike, kancera prostate, kancera penisa, kancera uretre, kancera testisa, vaginalnog kancera, kancera materice, kancera štitne žlezde, paratiroidnog kancera, adrenalnog kancera, endokrinog kancera pankreasa, karcinoidnog kancera, kancera kostiju, kancera kože, retinoblastoma, Hodžkinovog limfoma, non-Hodžkinovog limfoma, Kapošijevog sarkoma, multicentrične Kastelmanove bolesti ili primarnog efuzionog limfoma povezanog sa sindromom stečene imunodeficijencije, neuroektodermalnih tumora, rabdomiosarkoma, kao i bilo kojih metastaza bilo kog od prethodnih kancera.