RS65909B1 - Rpgr genska terapija za pigmentnu retinopatiju - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Pronalazak se odnosi na postupke lečenja humanog subjekta koji ima X-povezanu pigmentnu retinopatiju ili retinitis pigmentozu (XLRP) ili neko drugo oftalmološko stanje usled mutacije gubitka funkcije gena koji kodira retinitis pigmentosa GTPaza regulatorni (RPGR) protein, metodu koja obuhvata primenu kod subjekta nukleinske kiseline koja sadrži adeno-povezani virusni vektor koji sadrži skraćenu humanu RPGR cDNK.

STANJE TEHNIKE

[0002] Retinitis pigmentoza (RP) je glavni oblik naslednog slepila kod ljudi. Od tri opšta načina nasleđivanja (autozomno dominantni, autozomno recesivni i X-povezani), X-povezani RP (XLRP) je povezan sa teškim oblikom bolesti, koji uključuje i fotoreceptore štapića i konusa kao primarne mete (Berson 1993; Sandberg i drugi 2007). Preko 70% X-povezanih RP i 10% - 20% svih slučajeva RP-a je uzrokovano mutacijama u genu koji kodira RPGR (Bader i drugi 2003; Branham i drugi 2012; Churchill i drugi; Pelletier i drugi 2007). S obzirom na to da je trenutno poznato da mutacije u preko 100 gena uzrokuju RP i veću težinu bolesti povezane sa X, RPGR je jedan od najvažnijih gena za RP bolest.

[0003] WO2014011210 opisuje metode za poboljšanje gubitka vida i drugih stanja povezanih sa pigmentnom retinopatijom i retinitis pigmentozom povezanom sa X kod subjekta.

[0004] WO0177380 opisuje metode za dijagnostikovanje bolesti ili predispozicije za bolest genotipizacijom RPGR gena od pojedinca i identifikovanje prisustva jedne ili više bolesti koja uzrokuje mutaciju(e).

[0005] WO0138578 opisuje metode za identifikaciju pasa koji imaju X-povezanu progresivnu retinalnu atrofiju (XLPRA), ispitivanjem biološkog uzorka sa genetskim markerima koji kosegregiraju sa XLPRA genskim lokusom.

[0006] Pawlyk i sar. (2016) opisuju fotoreceptorsko spašavanje od strane skraćenog humanog RPGR gena na mišijem modelu X-povezane pigmentne retinopatije.

[0007] Hong i sar. (2000) opisuju pojedinačnu skraćenu RPGR-ORFI5 varijantu koja rekonstituiše RPGR funkciju in vivo.

[0008] Humani retinitis pigmentoza GTPaza regulatorni gen (RPGR)-ORF15 (SEK ID: 5) je dat u Gensek pristupni br. BCK76671.

[0009] Humani retinitis pigmentoza GTPaza regulatorni (RPGR)-ORF15 protein (SEK: 6) je dat u Gensek, pristupni br. BCK76672.

SUŠTINA PRONALASKA

[0010] Predmetni pronalazak je zasnovan na otkriću skraćenog oblika humanog RPGR-a koji uspešno obezbeđuje funkcionalnu RPGR aktivnost, i stoga uključuje nukleinske kiseline za upotrebu u postupcima za lečenje subjekata koji imaju RP izazvane mutacijama u RPGR-u. Subjekti koji mogu biti tretirani uključuju, one koji imaju gubitak vizuelne funkcije (npr. oštećen odgovor na elektroretinografskom (ERG) testiranju), ali zadržavaju neke fotoreceptorske ćelije kako je utvrđeno optičkom koherentnom tomografijom (OCT).

[0011] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Posebno, pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira skraćeni humani RPGR protein, gde skraćeni humani RPGR protein je bar 95% identičan sa punom dužinom SEK. ID. BR.:2.

[0012] Takođe su obezbeđeni:

virusni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema pronalasku;

izolovana ćelija domaćina koja sadrži virusni vektor prema pronalasku;

nukleinska kiselina, za upotrebu u tretiranju humanog subjekta koji ima X-povezanu pigmentnu retinopatiju (XLRP) ili neko drugo oftalmološko stanje usled mutacije gubitka funkcije gena koji kodira retinitis pigmentosa GTPaza regulatorni (RPGR) protein;

virusni vektor prema pronalasku, za upotrebu u lečenju humanog subjekta koji ima X-povezanu pigmentnu retinopatiju (XLRP) ili neko drugo oftalmološko stanje usled mutacije gubitka funkcije gena koji kodira retinitis pigmentosa GTPaza regulatorni (RPGR) protein; i

adeno-povezani virusni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira skraćeni humani RPGR protein, gde skraćeni humani RPGR protein je bar 95% identičan sa punom dužinom SEK. ID. BR.:2, za upotrebu u lečenju humanog subjekta koji ima X-povezanu pigmentnu retinopatiju (XLRP) ili neko drugo oftalmološko stanje usled mutacije gubitka funkcije gena koji kodira retinitis pigmentosa GTPaza regulatorni (RPGR) protein.

Aspekti opisa

[0013] Takođe su opisani postupci za lečenje humanog subjekta koji ima XLRP ili drugo klinički definisano oftalmološko stanje usled mutacije gubitka funkcije u genu koji kodira retinitis pigmentoza GTPaza regulatorni (RPGR) protein. Postupak uključuje, primenu kod subjekta nukleinske kiseline koja obuhvata adeno-povezani virusni vektor koji sadrži skraćenu humanu RPGR cDNK, pri čemu skraćena humana RPGR cDNK kodira protein koji je najmanje 80% identičan punoj dužini SEK ID BR: 2, opciono sa brisanjem do ukupno 200 dodatnih aminokiselina u regionu koji okružuje obrisani region u SEK ID BR: 2 (tj. između aminokiselina 861 i 862 iz SEK ID BR: 2).

[0014] U nekom aspektu, RPGR cDNK je pod kontrolom promotera humane rodopsin kinaze (hRK), na primer, promotera hRK koji sadrži ili se u osnovi sastoji od SEK ID BR: 5.

[0015] U nekim aspektima, adeno-povezani virusni vektor je AAV-2, serotip-8 (AAV2/8) ili AAV-8.

[0016] U nekim aspektima, RPGR cDNK sadrži ili se u osnovi sastoji od sekvence koja je najmanje 80% identična sa SEK ID BR: 1.

[0017] U nekim aspektima, humana RPGR cDNK kodira protein koji je bar 95% identičan sa punom dužinom SEK. ID. BR.:2.

[0018] U nekom aspektu, postupci uključuju primenjivanje nukleinske kiseline u niskoj dozi od oko 2 x 10<10>vg/ mL, srednjoj dozi od oko 2 x 10<11>vg/mL, ili visokoj dozi od oko 2 x 10<12>vg/mL. U nekom aspektu, nukleinska kiselina je primenjena u subretinalni prostor. U nekom aspektu, mikroinjekciona kanila je ubačena u subretinalni prostor, temporalno optičkom nervu i neposredno iznad glavnih arkadnih sudova, tako da se protok tečnosti može usmeriti ka makuli.

[0019] U drugom aspektu, opisane su nukleinske kiseline koje kodiraju skraćeni humani RPGR, pri čemu skraćena humana RPGR cDNK kodira protein koji je najmanje 80% identičan punoj dužini SEK ID BR: 2, opciono sa delecijom do 200 dodatnih aminokiselina koje okružuju obrisani region iz SEK ID BR: 2.

[0020] U nekom aspektu, RPGR cDNK je pod kontrolom promotera humane rodopsin kinaze (hRK), na primer, promotera hRK koji sadrži ili se u osnovi sastoji od SEK ID BR: 5.

[0021] U nekom aspektu, RPGR cDNK sadrži ili se u osnovi sastoji od sekvence koja je najmanje 80% identična SEK ID BR: 1.

[0022] U nekom aspektu, humana RPGR cDNK kodira protein koji je bar 95% identičan sa punom dužinom SEK. ID. BR.: 2.

[0023] U nekim aspektima, humana RPGR cDNK je najmanje 80% identična punoj dužini SEK ID BR: 1, opciono sa delecijom nukleotida koji kodiraju do 200 dodatnih aminokiselina koje okružuju obrisani region.

[0024] Ovde su takođe obezbeđeni vektori, npr. adeno-povezani virusni vektori, npr. AAV-2, serotip-8 (AAV2/8) ili AAV-8, koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju skraćeni humani RPGR kako je ovde opisano, kao i izolovane ćelije (țj. ćelije koje nisu prisutne u živom čoveku ili životinji domaćinu) koje sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju skraćeni humani RPGR i opciono, izražavaju skraćeni humani RPGR protein.

[0025] Ukoliko nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni izrazi imaju isto značenje kao što je uobičajeno razumljivo prosečnom stručnjaku u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Ovde su opisani postupci i materijali za upotrebu u sadašnjem pronalasku; mogu se koristiti i drugi pogodni postupci i materijali poznati u tehnici. Materijali, metode i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni da budu ograničavajući.

[0026] Ostale karakteristike i prednosti pronalaska biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i slika i iz patentnih zahteva.

OPIS CRTEŽA

[0027]

Slike 1A-B. (A) Mape nativnog humanog RPGR ORF15 kodirajućeg regiona i oba skraćena oblika AAV isporučene humane ORF15cDNK. (B) Imunomrlje za dva rekombinantna oblika humanog RPGR-ORFI5. Isporuka AAV humane cDNK sa malom delecijom (A4V-ORF15-L, "dugačka forma") dovodi do ekspresije humanog proteina RPGR-ORF 15 veličine 160 kD. Isporuka AAV humane cDNK sa velikom delecijom (AAV-ORF15-S, "kratka forma") dovodi do ekspresije proteina veličine -130 kD. Obe forme humanog proteina RPGR-ORFI5 su manje od endogenog humanog RPGR ORF15 koji se nalazi u humanom tkivu mrežnjače (200 kD).

Slike 2A-D. Ekspresija RPGR ORF15 u mrežnjači RPGR<-/->miševa nakon subretinalne isporuke AAV-RPGR ORF15. (A) Fluorescentne slike i kratkog (ORF15-S) i dugog (ORF 15-L) oblika ekspresije humanog RPGR ORF15 proteina, složene na slikama Nomarski radi ilustracije slojeva spoljne mrežnjače. Bojenje nefiksiranih smrznutih delova mrežnjače je izvedeno u 3. nedelji nakon tretmana, u starosti od 1 do 2 meseca. (B) Fluorescentne slike oba oblika humanog RPGR ORF 15, zajedno lokalizovana sa rootletinom. Slično kao kod divljeg tipa, oba oblika humanog RPGR ORF15 su pravilno lokalizovana na fotoreceptoru koji povezuje cilijum koji je distalno od rootletina. RPE, pigmentni epitel mrežnjače; OS, spoljni segment; CC (TZ), povezujući cilijum (prelazna zona); IS, unutrašnji segment; ONL, spoljni nuklearni sloj. (C) Odnos hRPGR fluorescentnih čestica prema fluorescentnim rootletin vlaknima na vezivnom cilijumu za Rpgr<-/->oči (n = 3) tretirane sa ORF15-S, Rpgr<-/->oči (n = 3) tretirane sa ORF15-L, i oči kod divljeg tipa (n = 3). Dobijeni su brojevi i za rootletin unutar unutrašnjeg segmenta i za RPGR koji je distalno od rootletina preko 100 μm dužine srednje periferne mrežnjače. Vrednosti su srednje vrednosti ±1 standardna greška. (D) Šablon ekspresije kratkog i dugog oblika proteina ORF15 u fiksnim plutajućim presecima mrežnjače Rpgr<-/->miševa. Preseci su obojeni za lokalizaciju humanog RPGR ORF 15 proteina, 4-6 nedelja nakon tretmana kod starosti od 2-3 meseca. U mrežnjači divljeg tipa, mišiji protein RPGR ORF 15 je viđen kao diskretni zeleni fluorescentni signal (tačke) koji zauzima područje između unutrašnjeg i spoljašnjeg segmenta fotoreceptora, na nivou prelazne zone ili spajajućeg cilijuma. Suprotno tome, fluorescentni signal za kratki oblik ORF15 (AAV-ORF15-S) nije ograničen na nivo fotoreceptora koji povezuje cilijum, već se takođe vidi kao difuzni signal kroz unutrašnji i spoljašnji segment. Fluorescentni signal za dugački oblik ORF15 pokazuje vrlo malo, ako uopšte ima pogrešne lokalizacije, i uglavnom je ograničen na povezujući region cilijuma slično divljem tipu. OS, spoljni segment; CC (TZ), povezujući cilijum (prelazna zona); IS, unutrašnji segment; ONL, spoljni nuklearni sloj.

Slika 3. Imunohistohemijske (žuto u originalu) analize štapićastih i konusnih fotoreceptora na tretiranim (kratki i dugi oblik ORF 15) i kontrolnim mrežnjačama RPGR miševa starosti 13 meseci (6 meseci nakon injekcije). U retini RPGR miša tretiranoj kratkim oblikom ORF 15 (AAV8-ORF15-s), rodopsin i konusni opsin (mešoviti S&M čepići u donjoj retini), oblici bojenja pogrešne lokalizacije se gotovo ne mogu razlikovati od onih viđenih u kontrolnoj mrežnjači. Napomena za pogrešnu lokalizaciju opsina u konusu u unutrašnjim segmentima i sinaptički sloj u obe ove mrežnjače miša. Slično tome, spoljni segmenti štapića i konusa se skraćuju i dezorganizuju sa smanjenim spoljnim nuklearnim slojem u poređenju sa starosno odgovarajućom mrežnjačom divljeg tipa. Suprotno tome, u mrežnjači RPGR -/- miša tretiranoj sa dugim oblikom ORF15 (AAV8-ORF15-1) rodopsin pokazuje particioniranje spoljašnjeg segmenta slično mrežnjači miša divljeg tipa. Takođe, u štapićima retine tretiranim dugačkim oblikom ORF 15 spoljni segmenti su duži i dobro organizovani, a ONL je deblji u poređenju sa kontrolnom mrežnjačom. Bojenje opsina konusa pokazuje mnogobrojnije fotoreceptore čepića sa izduženim i dobro organizovanim spoljnim segmentima u ORF 15 dugačkom obliku tretirane mrežnjače RPGR -/- miša u poređenju sa kontrolom.

Slike 4A-B. Spašavanje ćelija fotoreceptora nakon tretmana sa RPGR ORF 15-1 kod RPGR miševa. (A) Prikazani su složeni trakasti grafikoni za debljinu ONL-a (gore) i dužinu IS/OS (dole) za tretirane (crveno u originalu) i kontrolne (plavo u originalu) oči 3 miša starosti 18 meseci. (B) Reprezentativne svetlosne mikrografije miša divljeg tipa i tretiranog ORF15-1 i kontrolnog oka RPGR miša starosti 18 meseci. Slike su snimljene od središnje periferije duž vertikalnog meridijana u gornjoj mrežnjači.

Slike 5A-C. (A) Amplitude a-talasa štapića, b-talasa štapića i b-talasa konusa od 16 RPGR miševa, starosti 11-14 meseci. Kontrolne oči (OD) su pokazale nesrazmeran gubitak amplitude b-talasa čepića u odnosu na amplitudu b-talasa štapića u poređenju sa donjim granicama za miševe divljeg tipa. Osim u jednom slučaju, sve tretirane oči (OS) su imale veće reakcije od ostalih kontrolnih očiju. Posebno, treba imati na umu da je više od polovine tretiranih očiju u ovom uzrastu imalo ERG amplitude b-talasa štapića koje su bile na ili iznad donje granice divljeg tipa. Srednje vrednosti za sva tri merenja su se značajno razlikovale među očima (P <0,01). (B) Dijagrami rasejanja ERG amplitude za 22 RPGR miša starosti između 9 i 18 meseci na log skali za b-talas prilagođen na tamu (štapić)(gornji grafikon) i b-talas prilagođen na svetlost (konus) (donji grafikon). Tačke podataka su pomerene malo horizontalno za svaku starosnu grupu da bi se smanjilo preklapanje podataka. Regresione linije za tretirane i kontrolne oči su postavljene ponovljenim merenjima uzdužne regresije koristeći PROC MIXED od SAS-a na osnovu svih raspoloživih podataka. (C) Reprezentativni ERG talasni oblici prilagođeni na tamu (DA) i prilagođeni svetlu (LA) iz para tretiranih ORF15-1 i kolegijalnih kontrolnih RPGR očiju u uzrastu od 18 meseci. WT (starosno prilagođeni) ERG talasni oblici prikazani su za poređenje. Kontrolno oko je u ovom uzrastu ozbiljno smanjilo ili skoro ugasilo ERG-ove štapića i konusa. Međutim, tretirano oko još uvek ima značajnu funkciju štapića i konusa u ovoj vremenskoj tački, što je približno 70%, odnosno 35% vrednosti WT, respektivno.

Slika 6. ERG-ovi u celom polju do 0,5 Hz bliceva bele svetlosti i do 30 Hz bliceva iste bele svetlosti od 5 pacijenata sa XLRP usled RPGR ORF 15 mutacija. Tri ili više tragova je postavljeno radi ilustracije ponovljivosti. Tačke iznad tragova označavaju početak bljeska normale (350 μV), odzivi na bliceve od 30 Hz nisu bili otkriveni kako je prikazano (tj. bez opsega filtriranja i proseka signala).

DETALJAN OPIS

[0028] Somatska genska terapija posredovana virusnim vektorima se pokazala obećavajućom u lečenju životinjskih modela degenerativne bolesti humane mrežnjače. Do danas je izvedeno više uspešnih studija koje su koristile isporuku gena posredstvom adeno-povezanog virusa (AAV) za sprečavanje degeneracije fotoreceptora na modelima malih životinja (Ali i drugi 2000; Pang i drugi 2012; Pawlyk i drugi 2010; Pawlyk i drugi 2005; Tan i drugi 2009) i modelima velikih životinja (Acland i drugi 2001; Aleksandar i drugi 2007; Beltran i drugi 2012; Komaromy i drugi 2010; Lheriteau i drugi 2009). U ovim slučajevima, retinalni pigmentni epitel (RPE) ili fotoreceptori su bili primarni ciljevi za ekspresiju transgena. Pored toga, klinička ispitivanja faze I koja uključuju gensku terapiju za pacijente sa Leberovom urođenom amaurozom (LCA) koja cilja RPE (Bainbridge i drugi 2008; Cideciyan i drugi 2008; Maguire i drugi 2008) i nedavno horoideremijom (Maclaren i drugi 2014), su već naišle na određen uspeh. Trenutno nema kliničkih ispitivanja koja koriste AAV posredovanu gensku terapiju za lečenje pacijenata sa X-povezanom RP.

[0029] Sadašnji pronalazači su prethodno pokazali funkcionalno i morfološko spašavanje fotoreceptorskih štapičastih i kupastih ćelija kod miševa kojima nedostaje RPGR, koristeći skraćenu mišju izoformu RPGR ORF15 kojoj nedostaje oko 600 bp na karboksilnom završetku bogatom purinom, koristeći transgeni pristup (Hong i drugi 2005). Neke varijacije u dužini ponavljajućeg regiona se često nalaze kod normalnih pojedinaca (Bader i drugi 2003; Jacobi i drugi 2005; Karra i drugi 2006). Međutim, funkcija skraćenog humanog RPGR-a nije bila opisana.

[0030] U ovoj studiji, skraćeni humani RPGR ORF15 gen za zamenu, vođen prethodno opisanim promoterom rodopsin kinaze (R) (Khani i drugi 2007; Sun i drugi 2010) i isporučen u brzo delujućem AAV8 vektoru (Allocca i drugi 2007; Natkunarajah i drugi 2008), uspeo je da izbavi fenotip degeneracije fotoreceptora u mišijem modelu RPGR nokaut. Ponavljajući region ORF 15 egzona bogat purinom je potreban za pravilnu subćelijsku lokalizaciju i funkciju RPGR-a, ali čini se da skraćivanje njegove dužine do jedne trećine ne narušava njegovu funkciju. Ovaj skraćeni gen za zamenu RPGR-a nudi održivu alternativu prema do sada izbegavajućem RPGR ORF 15 „pune dužine“ u budućim ispitivanjima genske terapije.

RPGR

[0031] RPGR je izražen u složenom modelu sa obe opisane varijante, osnovnom i ORF 15 (Vervoort i drugi 2000). Podrazumevani ili konstitutivni oblik RPGR-a obuhvata egzone 1-19 i ORF 15 se završava velikim alternativnim egzonom označenim ORF 15 pre početka egzona 16-19. Egzon ORF15 je jedinstven po tome što sadrži dugačak niz ponavljajuće sekvence bogate purinom koji se pokazao teškim za kloniranje u cDNK i nestabilnim u mnogim postupcima rekombinantne DNK manipulacije. Iako je manji podrazumevani oblik RPGR-a preovlađujući oblik u tkivima sa pokretnim cilijama (Hong i sar., 2003) i mnogim vrstama primarnih cilija (naši neobjavljeni podaci), izoforma ORF 15 RPGR-a je neophodna za normalnu funkciju štapičastih i kupastih ćelija retine (Vervoort i drugi 2000; Vervoort i Wright 2002) i izražena je prvenstveno u fotoreceptorima (Hong i drugi 2003). ORF 15 je takođe uobičajeno mesto mutacija u RPGR-u, sa mutacijama identifikovanim kod 22-60% pacijenata sa X-vezanim RP (Breuer i drugi 2002; Vervoort i drugi 2000).

[0032] Sadašnji pronalazači su doprineli razvoju prvog mišijeg modela RP povezanog sa X koji je nosio nultu mutaciju u RPGR-u bez otkrivenih nivoa bilo kakvih izoformi RPGR-a (Hong i drugi 2000). RPGR nulti miševi ispoljavaju lagano progresivnu retinalnu degeneraciju koja je karakterisana ranom pogrešnom lokalizacijom konusnog opsina u ćelijskim telima i sinapsama i smanjenim nivoima rodopsina u štapićima. Kao rezultat, ovi miševi imaju kupastoštapičastu degeneraciju. Do 12. meseca starosti postaju vidljivi značajni gubici fotoreceptorskih ćelija i pad funkcije čepića i štapića, mereno elektroretinogramima (ERG). U mrežnjači, RPGR je vezan za fotoreceptor koji povezuje cilijum lokalizovan između unutrašnjih i spoljašnjih segmenata putem proteina koji stupa u interakciju sa RPGR-om (RPGRIP1) (videti, na primer, Boylan i Wright 2000; Hong i drugi 2001; Roepman i drugi 2000). Povezujući cilijum je analogan prelaznoj zoni pokretnih ili primarnih cilija koje mogu poslužiti kao prolaz ka spoljnom segmentu. Ovaj šablon subćelijske lokalizacije i fenotip mutantnog miša sugerišu da RPGR može imati ulogu u transportu proteina između unutrašnjeg i spoljašnjeg segmenta i štapića i čepića (Hong i Li 2002; Hong i drugi 2000; Hong i drugi 2001). U pokušajima da se razvije model RPGR mutiranog miša sa bržim tokom degeneracije, nedavno je razvijeno nekoliko drugih linija RPGR miša (Brunner i sar, 2010; Huang i sar, 2012). Takođe je nedavno objavljen izveštaj o modelu koji se prirodno javlja (rd9) X- povezani RPGR (Thompson i drugi 2012). U svim ovim slučajevima, uključujući RPGR nulte miševe prikazan je lagano progresivni gubitak fotoreceptora, ali sa različitim stepenom zahvaćenosti štapića i konusa, što delimično može biti posledica razlika u soju i / ili pigmentaciji. Ovi nalazi ukazuju na to da je lagana stopa degeneracije u nokaut modelu posledica razlika u vrstama pre nego nepotpune ablacije, i potvrđuju primenjivost ovog mišijeg modela u terapijskim studijama nultih RPGR mutacija kod pacijenata.

[0033] Dve varijante (A i C) ljudskog RPGR-a u punoj dužini (takođe, poznat kao CRD; RP3; COD 1; PCDX; RP15; XLRP3; orfl5; i CORDX1) su opisane su u GenBank; Izoforma A je pri pristupnom broju NM_000328.2 (nukleinska kiselina) i NP_000319.1 (protein); Isoforma C je pri pristupnom broju NM_001034853.1 (nukleinska kiselina) i NP_001030025.1 (protein). Varijanta (A) koristi alternativno mesto spajanja i sadrži više alternativnih egzona u 3' kodirajućem regionu, u poređenju sa varijantom C, i kodira izoformu A (takođe poznata kao izoforma 1) koja je kraća i ima različiti C-završetak, u poređenju sa izoformom C. Sekvenca korišćena u primerima ovde opisanih kompozicija navedena je niže kao SEK ID BR: 1. Sekvence humanog RPGR korisne u ovde opisanim kompozicijama i postupcima mogu biti najmanje 80%, npr. 85%, 90%, 95% ili 100% identične punoj dužini SEK ID BR: 1, sa do dodatnih 50, 100, 150 ili 200 aminokiselina izbrisanih iz uklonjenog regiona, označenih crtama u sekvenci ispod.

Skraćeni oblik humane RPGRORF15 sekvence sa izbrisanim 378bp i izbrisanim regionom prikazanim crticama (“-“ broj crtica nije u korelaciji sa veličinom brisanja

[0034]

Proteinska sekvenca za skraćeni oblik humanog RPGRORF15 sa izbrisanim regionom prikazanim crticama ("-"; broj crtica nije u korelaciji sa veličinom brisanja)

[0035]

1

Humana RPGRORF15 cDNK sekvenca pune dužine; 378bp obrisanih u skraćenom obliku su boldirani i podvučeni u sekvenci niže

[0036]

1

Aminokiselinska sekvenca humanog RPGRORF15 pune dužine; aminokiseline izbrisane u skraćenom obliku su boldirane i podvučene u sekvenci ispod

[0037]

�

�

[0038] Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se izvršiti korišćenjem matematičkog algoritma. Na primer, procenat identičnosti između dve sekvence aminokiselina, može biti određen korišćenjem Needleman-a i Wunsch-a ((1970) J. Mol. Biol.48: 444-453) algoritma koji je inkorporiran u program GAP u softverskom paketu GCG (dostupan na svetskoj web mreži na gcg.com), koristeći zadate parametre, npr. Matricu bodovanja Blossum 62 sa kaznom praznine od 12, kaznom produžetka praznine od 4, i kaznom za prazninu pomeranja okvira od 5.

RK Promoter

[0039]U nekim realizacijama ovde opisanih metoda, koristi se zamenski genski konstrukt u kome je skraćena humana RPGR cDNK, kako je ovde opisano, smeštena pod kontrolom promotera humane rodopsin kinaze (hRK). U nekim realizacijama, RK promoter je dužine oko 200 bp (kratki promoter izveden iz gena rodopsin kinaze (RK), za koji se pokazalo da pokreće ćelijski specifičnu ekspresiju u štapićima i čepićima (Khani i sar., 2007; Sun i sar., 2010; Young i sar., 2003)). Primer hRK promoterske sekvence je -112 / 87 (Khani i sar., 2007):

Virusni vektor za isporuku

[0040] Skraćena humana RPGR cDNK, kako je gore opisano, upakovana je u vektoru za isporuku, npr., AAV8 ili AAV2/8 vektoru.

[0041] Geni za zamenu (cDNK), mogu biti primenjivani u bilo kom efikasnom nosaču, na primer, u bilo kojoj formulaciji ili sastavu koji je u stanju da efikasno isporučuje komponentni

1

gen u ćelije in vivo. Pristupi uključuju, umetanje gena u ne-patogene, ne-replikujuće virusne vektore, uključujući rekombinantne retroviruse, adenovirus, adeno-povezani virus, lentivirus i herpes simplex virus-1, di rekombinantne bakterijske ili eukariotske plazmide. Virusni vektori direktno transficiraju ćelije; plazmidska DNK može biti isporučena gola ili uz pomoć, na primer, katjonskih liposoma (lipofektamina) di derivatizovanih (npr. konjugovanih antitela), konjugata polilizina, gramacidina S, veštačkih virusnih omotača ili drugih takvih unutarćelijskih nosača, kao i direktnom injekcijom genskog konstrukta ili precipitacijom CaPO4 izvedenom in vivo.

[0042] Poželjni pristup za in vivo uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju je korišćenjem virusnog vektora koji sadrži nukleinske kiselinu, na primer, cDNK. Prednost infekcije ćelija virusnim vektorom je u tome što veliki deo ciljanih ćelija može da primi nukleinsku kiselinu. Pored toga, molekuli kodirani unutar virusnog vektora, na primer, pomoću cDNK sadržane u virusnom vektoru, efikasno su eksprimirani u ćelijama koje su preuzele nukleinske kiselinu virusnog vektora.

[0043] Retrovirusni vektori i adeno-povezani virusni vektori, mogu biti korišćeni kao rekombinantni sistem genske isporuke za transfer egzogenih gena in vivo, naročito u ljude. Ovi vektori omogućavaju efikasnu isporuku gena u ćelije, a prenesene nukleinske kiseline su stabilno integrisane u hromozomsku DNK domaćina. Razvoj specijalizovanih ćelijskih linija (nazvanih "ćelije za pakovanje") koje proizvode samo retroviruse sa oštećenom replikacijom je povećao korisnost retrovirusa za gensku terapiju, a oštećeni retrovirusi su okarakterisani za upotrebu u transferu gena u svrhu genske terapije (za pregled pogledati Miller, Blood 76: 271 (1990). Retrovirus sa oštećenom replikacijom može biti spakovan u virione, koji se mogu koristiti za infekciju ciljne ćelije, upotrebom pomoćnog virusa standardnim tehnikama. Protokoli za proizvodnju rekombinantnih retrovirusa i za inficiranje ćelija in vitro di in vivo sa takvim virusima mogu se naći u Ausubel, i sar, ur., Aktuelni protokoli u Molekularnoj Biologiji, Greene Publishing Associates, (1989), Odeljci 9.10-9.14 i drugim standardnim laboratorijskim priručnicima. Primeri pogodnih retrovirusa uključuju pLJ, pZIP, pWE i pEM koji su poznati stručnjacima u tehnici. Primeri pogodnih linija pakovanja virusa za pripremu i ekotropnih i amfotropnih retrovirusnih sistema uključuju ΨCrip, ΨCre, ' Ψ2 i ' ΨAm. Retrovirusi su korišćeni za uvođenje različitih gena u mnoge različite tipove ćelija, uključujući epitelne ćelije, in vitro i / ili in vivo (videti, na primer, Eglitis, i sar. (1985) Science 230: 1395-1398; Danos i Mulligan (1988) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460-6464; Wilson i sar. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3014- 3018; Armentano i sar. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6141-6145; Huber i sar. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039-8043; Ferry i sar. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8377-8381; Chowdhury i sar. (1991) Science 254: 1802-1805; van Beusechem i sar. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7640-7644; Kay i sar. (1992) Humana genska terapija 3: 641-647; Dai i sar. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895; Hwu i sar. (1993) J. Immunol. 150:4104- 4115; Američki patent br.4,868,116; Američki patent br.

4,980,286; PCT prijava WO 89/07136; PCT prijava WO 89/02468; PCT prijava WO 89/05345; i PCT prijava WO 92/07573).

[0044] Drugi sistem za isporuku virusnog gena koristan u sadašnjim metodama koristi vektore izvedene od adenovirusa. Genomom adenovirusa se može manipulisati tako da on kodira i

1

izražava genski proizvod od interesa, ali je inaktiviran u pogledu njegove sposobnosti da se replikuje u normalnom litičkom virusnom životnom ciklusu. Videti, na primer, Berkner i sar., BioTechniques 6: 616 (1988); Rosenfeld i sar., Science 252: 431-434 (1991); i Rosenfeld i sar., Cell 68: 143-155 (1992). Pogodni adenovirusni vektori izvedeni iz adenovirusnog soja Ad tip 5 dl324 ili drugih sojeva adenovirusa (npr. Ad2, Ad3 ili Ad7 itd.) su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Rekombinantni adenovirusi mogu imati prednosti u određenim okolnostima, u tome da nisu sposobni da inficiraju ćelije koje se ne dele i mogu biti korišćeni za infekciju širokog spektra ćelijskih tipova, uključujući epitelne ćelije (Rosenfeld i sar., (1992) supra). Dalje, čestice virusa su relativno stabilne i podložne prečišćavanju i koncentrisanju, i kao gore, mogu biti modifikovane tako da utiču na spektar infektivnosti. Pored toga, uvedena adenovirusna DNK (i strana DNK koja se u njoj nalazi) nije integrisana u genom ćelije domaćina, ali ostaje epizomalna, čime se izbegavaju potencijalni problemi koji mogu nastati kao rezultat insercijske mutageneze in situ, gde uvedena DNK postaje integrisana u genom domaćina (npr. retrovirusna DNK). Štaviše, nosivost adenovirusnog genoma za stranu DNK je veliki (do 8 kilobaza) u odnosu na druge vektore za isporuku gena (Berkner i sar., gore; Haj-Ahmand i Graham, J. Virol.57:267 (1986).

[0045] Još jedan sistem virusnih vektora koristan za isporuku nukleinskih kiselina je adenopovezani virus (AAV). Adeno-povezani virus je prirodno defektan virus kome je potreban drugi virus, kao što je adenovirus ili herpes virus, kao pomoćni virus za efikasnu replikaciju i produktivni životni ciklus. (Za pregled videti Muzyczka i sar, Curr. Topics in Micro. and Immunol. 158: 97- 129 (1992). Takođe je jedan od retkih virusa koji može integrisati svoju DNK u ćelije koje se ne dele i pokazuje visoku učestalost stabilne integracije (videti na primer Flotte i sar., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356 (1992); Samulski i sar., J. Virol. 63: 3822-3828 (1989); i McLaughlin i sar., J. Virol. 62: 1963-1973 (1989). Vektori koji sadrže najmanje 300 osnovnih parova AAV mogu se spakovati i integrisati. Prostor za egzogenu DNK je ograničen na oko 4,5 kb. AAV vektor kakav je opisan od strane Tratschin i sar, Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260 (1985), može biti korišćen za uvođenje DNK u ćelije. Razne nukleinske kiseline su uvedene u različite tipove ćelija koristeći AAV vektore (videti na primer Hermonat i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6466-6470 (1984); Tratschin i sar., Mol. Cell. Biol.

4:2072-2081 (1985); Wondisford i sar., Mol. Endocrinol. 2:32-39 (1988); Tratschin i sar., J. Virol. 51: 611-619 (1984); i Flotte i sar., J. Biol. Chem.268:3781-3790 (1993).

[0046] U poželjnim realizacijama, vektor za isporuku virusa je rekombinantni AAV2/8 virus.

[0047] Pre primene, finalni proizvod će biti podvrgnut seriji koraka ultraprečišćavanja da bi se zadovoljili kriterijumi kliničke ocene.

Odabir subjekata

[0048] Subjekti koji su kandidati za sadašnje metode lečenja uključuju one koji imaju dijagnozu RP izazvanu mutacijama gena koji kodira RPGR. Subjekti koji pate od drugih oftalmoloških klinički definisanih stanja uzrokovanih mutacijama gena koji kodira RPGR, npr. X-povezana konusna-štapićasta distrofija, takođe, mogu biti lečeni korišćenjem ovde opisanih postupaka. Dijagnoza XLRP ili drugog oftalmološkog stanja izazvanog mutacijama gena koji kodira RPGR može se izvršiti korišćenjem metoda poznatih u struci.

1

[0049] Ovde opisane metode mogu da uključuju identifikaciju subjekta, npr. deteta, adolescenta ili mladog odraslog subjekta, koji ima XLRP ili neko drugo oftalmološko stanje izazvano mutacijama gena koji kodira RPGR, ili za koga se sumnja da ima XLRP ili neko drugo oftalmološko stanje uzrokovano mutacijama u genu koji kodira RPGR (npr. na osnovu prisustva simptoma stanja i bez drugog očiglednog uzroka), i dobijanjem uzorka koji sadrži genomsku DNK od subjekta, otkrivanjem prisustva mutacije u RPGR-u korišćenjem poznatih molekularno- bioloških metoda i odabirom pacijenta koji ima mutaciju RPGR-a koja uzrokuje XLRP ili drugo stanje. Otkrivanje mutacije u RPGR-u može uključivati otkrivanje mutacije u ORF15, na primer, kao što je opisano od strane Sandberg i sar., (2007). Invest Ophthalmol Vis Sci 48, 1298-304; Dror i sar., Am J Hum Genet. Nov 2003; 73 (5): 1131-1146.

[0050] Mutacije u RPGR ORF15 uključuju vanfazne mutacije, besmislene mutacije, mutacije mesta spajanja i mutacije sa pogrešnim kodirajućim značenjem. Primerne mutacije uključuju, ORF15Glu446 (1-bp-del), ORF15Glu447 (2-bp-del) i ORF15GL ys52l (1-bp-ins).

[0051] Otkrivanje mutacije u RPGR-u takođe, može da uključuje sekvencioniranje celog ili dela (npr., regiona ORF 15) RPGR gena kod subjekta i upoređivanje sekvence sa referentnom sekvencom (npr., GenBank pristupni broj NG_009553.1), radi otkrivanja mutacija. Mutacije pomeranja okvira, mutacije skraćenja, mutacije koje menjaju konzerviranu aminokiselinu ili mutacije koje utiču na regulatorni (npr. promoter) region mogu se smatrati mutacijama koje mogu prouzrokovati XLRP ili neko drugo oftalmološko stanje kako je ovde opisano; promena funkcije može biti potvrđena ekspresijom mutanta in vitro (npr., u kultivisanim ćelijama) ili in vivo (npr., kod transgenih životinja), i ispitivanjem, na primer, funkcije ili subćelijske lokalizacije.

[0052] Pacijenti sa XLRP ili drugim oftalmološkim stanjem usled RPGR mutacija koje se mogu lečiti ovde opisanom metodom, poželjno zadržavaju neke fotoreceptore i vizuelnu funkciju, na primer, mereno standardnom vizuelnom funkcijom ili terenskim testovima i / ili optičkom koherentnom tomografijom (OCT, npr. Spektralni domen-OCT (SD-OCT)); videti, na primer, Sandberg i sar., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007;48: 1298- 1304. Ovde opisane metode mogu da uključuju, identifikovanje subjekata kojima je dijagnostikovano XLRP ili neko drugo oftalmološko stanje usled RPGR mutacija, koji imaju potvrđenu mutaciju u RPGR koja uzrokuje njihovo stanje, i ispitivanje njihove vizuelne sposobnosti i otkrivanje prisustva rezidualnih centralnih fotoreceptora. Subjekti, npr., dete, adolescent, mlada odrasla osoba ili odrasli subjekti, koji se mogu lečiti pomoću sadašnjih metoda, poželjno će imati oštrinu vida najmanje 20/200 (postupci za određivanje vidne oštrine su dobro poznati u tehnici; videti, npr. Johnson, Poremećaji gluvoće i vida: Anatomija i fiziologija, postupci procene, okularne anomalije i obrazovne implikacije, izdavač Charles C. Thomas; 1999) Carlson, N; Kurtz, D.; Heath, D.; Hines, C. Klinički postupci za oči pregled. Appleton & Lange; Norwalk, CT.1990) i prepoznatljivi spoljni nuklearni sloj u centralnoj jami (npr. najmanje 75%, 80%, 90%, 95% ili 99% normalne debljine).

PRIMERI

[0053] Pronalazak je dalje opisan u sledećim primerima, koji ne ograničavaju obim pronalaska opisan u patentnim zahtevima.

2

Materijali i metode

[0054] Sledeći materijali i metode su korišćeni u dole navedenim primerima.

Životinje

[0055] Generisanje i analiza RPGR<-/->miševa je bila prethodno opisana (Hong i sar.2000).RPGR miševi korišćeni u ovoj studiji su uzgajani parenjem braće i sestara među nulizigotnim RPGR mužjacima i homozigotnim hRPGR’ ) ženkama održavanim u našem institucionalnom objektu za životinje. Miševi divljeg tipa korišćeni u studiji su bili C57BL iz Charles River Laboratorije (Wilmington, MA). Miševi su održavani pod ciklusom osvetljenja 12 sati svetlo/ 12 sati tama. Studije su rađene u skladu sa ARVO izjavom za korišćenje životinja u oftalmološkim i vizuelnim istraživanjima, a odobrene od strane IACUC Masačusetske očne i ušne bolnice.

Konstrukcija plazmida i proizvodnja rekombinantnog AAV8

[0056] Humane RPGR ORF 15 cDNK su amplifikovane iz humane retinalne cDNK pomoću PCR koristeći prajmere dizajnirane da obuhvate celokupni RPGR ORF 15 izoformni region kodiranja. Nijedna ORF 15 cDNK u punoj dužini nije dobijena uprkos ponovljenim pokušajima primenom različitih metoda, u skladu sa iskustvom drugih istraživača i našim iskustvom (Hong i drugi 2005). Umesto toga, dobili smo skraćenu cDNK ORF 15 koja sadrži veliku deleciju 314 kodona (942 bp) u okviru u ORF 15 egzonu (preostalo 2.517 bp) sa uklonjenom glavninom regiona koji se ponavlja bogatog purinima (kodoni 696-1010del, "kratka forma“) (sl.1A). Druga ORF15 cDNK je konstruisana rekombinantnom DNK manipulacijom koja je sadržala deleciju 126-kodona (378 bp) unutar okvira unutar visoko ponavljajućeg regiona iz egzona 15 (sa 3.081-bp preostalog u ORF 15 egzonu) (kodoni 862-988del, „dugačka forma“). Ove ORF15 cDNK su sekvencirane da bi se verifikovala vernost. Da bi se konstruisali AAV vektori, RPGR cDNK su umetnute u mesto višestrukog kloniranja roditeljskog pAAV-RK-zsGreen vektora. Dobijeni vektori pAAV-RK-mRPGR i pAAV-RK-hRPGR su upakovani u AAV. Pseudotipovani vektor AAV2/8 je generisan tripartitnom transfekcijom: (1) AAV vektorski plazmid koji kodira gen od interesa, (2) AAV pomoćni plazmid pLT-RC03 koji kodira AAV Rep proteine iz serotipa 2 i Cap proteine iz serotipa 8, i (3) adenovirusni pomoćni miniplazmid pHGTI-Adenol) u ćelije 293A. Transfekcija je izvršena korišćenjem protokola koji su razvili Xiao i saradnici (Xiao, i sar., 1998). Dva dana nakon transfekcije, ćelije su lizirane ponovljenim ciklusima zamrzavanja i odmrzavanja. Nakon početnog čišćenja ćelijskih ostataka, komponenta nukleinske kiseline ćelija proizvođača virusa je uklonjena tretiranjem benzonazom. Rekombinantne AAV vektorske čestice su prečišćene gradijentom gustine jodiksanola. Prečišćene vektorske čestice su intenzivno dijalizovane nasuprot PBS-u i titrovane tačkastom blot hibridizacijom.

Subretinalne injekcije

[0057] Miševi su dovedeni u opštu anesteziju intraperitonealnom injekcijom ketamina (90 mg / kg) / ksilazina (9 mg / kg). 0,5% rastvor proparakaina je nanesen na rožnjaču kao lokalni anestetik. Zenice su proširene lokalnom primenom ciklopentolata i fenilefrin hidrohlorida. Pod oftalmološkim hirurškim mikroskopom napravljen je mali rez kroz rožnjaču pored limbusa pomoću igle kalibra 18. Tupa igla kalibra 33, postavljena na Hamiltonov špric, ubačena je kroz rez iza sočiva i gurnuta kroz mrežnjaču. Sve injekcije su izvršene subretinalno na mestu unutar nazalnog kvadranta mrežnjače. Injekcije su davane subretinalno u nosni kvadrant mrežnjače. Svako oko je primilo ili 2 x 109 vektorski genom (AAV- ORF15-L) ili 5 x 109 vektorski genom (AA V-ORF15- ) u zapremini od 1 μl. RPGR-ORFI5 vektori su primenjeni u levo oko (OS, oculus sinister), a kontrolni vektori (AAV8-RK-EGFP) su primenjeni u desno oko (OD, oculus dexter). Oni se u ovom tekstu nazivaju „tretiranim“, ili „kontrolnim“, respektivno. Vizualizacija tokom injekcije je potpomognuta dodavanjem fluoresceina (100 mg/ml AK-FLUOR, Alcon, Inc.) u suspenzije vektora u količini od 0,1%. Pregledom fundusa nakon injekcije utvrđeno je da se u većini slučajeva odvojilo > 30% mrežnjače, što potvrđuje uspešnu subretinalnu isporuku. Kohorte miševa (n = 50 ukupno) su injektovane pri 1 mesecu starosti za studije ekspresije proteina i sa 3 do 7 meseci starosti (pošto su ERG-ovi ostali normalni tokom ovog starosnog perioda) za funkcionalne (ERG) i histološke studije, pre glavnog gubitka fotoreceptora.

Histologija i imunofluorescencija

[0058] Za obe, svetlosnu mikroskopiju i transmisionu elektronsku mikroskopiju, enukleirane oči su fiksirane tokom 10 minuta u 1% formaldehidu, 2,5% glutaraldehidu u 0,1 M kakodilatnom puferu (pH 7,5). Nakon uklanjanja prednjih segmenata i sočiva, okulari su ostavljeni u istom fiksatoru na 4 ° C preko noći. Okulari su isprani puferom, post-fiksirani u osmijum-tetroksidu, dehidrirani preko stepenovanih alkoholnih serija i ugrađeni u Epon. Polutanki preseci (1 μm) su isečeni za posmatranje svetlosnom mikroskopijom. Za EM, ultratanki preseci su obojeni uranilacetatom i olovnim citratom pre posmatranja na JEOL 100CX elektronskom mikroskopu.

[0059] Za imunofluorescentno bojenje cilijarnih proteina, oči su enukleirane, zamrznute šokom i presečene pri 10 μm debljine u kriostat. Nefiksirani smrznuti delovi su zatim sakupljeni na staklu i obojeni. Za imunobojenje svih ostalih proteina prikupljeni su i obojeni plutajući delovi mrežnjače. Za ovaj postupak oči su postavljene u fiksatoru (2% formaldehida, 0,25% glutaraldehida / PBS) i uklonjeni su im prednji segmenti i sočiva. Trajanje fiksacije je obično bilo 20 minuta. Fiksirana tkiva su natopljena u 30% saharoze / PBS najmanje 2 sata, smrznuta i presečena slično kao nefiksirana tkiva. Zatim su sekcije sakupljene u PBS puferu i ostale su slobodno plutajuće tokom procesa imunobojenja. Obojeni preseci su pregledani i fotografisani na laserskom skenirajućem konfokalnom mikroskopu (model TCS SP2; Leica). Korišćena antitela su bila mišiji RPGR (SI), humani RPGR C100, anti-rootletin, 1D4 (anti-rodopsin), mešani plavo / zeleni konusni anti-opsin i Hoechst 33342, mrlja nuklearne boje.

Imunobloting analiza

[0060] Retinalna tkiva su homogenizovana u RIPA puferu, kuvana u Laemmli puferu i napunjena pri 15 μg/traci na 5% SDS-PAGE gelovima. Nakon odvajanja gela, proteini su preneti na PVDF membranu elektrotransferom. Membrane su blokirane sa 5% nemasnog mleka i inkubirane sa primarnim antitelima preko noći na sobnoj temperaturi. Nakon pranja, membrane su inkubirane sekundamim antitelima konjugovanim sa peroksidazom. Za detekciju je korišćena SuperSignal West Pico hemiluminescentna podloga (Pierce). Za normalizaciju, uzorci proteina su odvojeni na standardnom SDS-PAGE i sondirani sa transducin α antitelom (poklon dr. Heidi Hamm, Univerzitet Vanderbilt).

ERG snimanje

[0061] Miševi su prilagođeni na mrak tokom noći i anestezirani sa natrijum pentobarbitalom injektovanim intraperitonealno pre testiranja. Obe zenice svake životinje su lokalno proširene sa fenilefrin hidrohloridom i ciklopentolat hidrohloridom, a miševi su zatim postavljeni na zagrejanu platformu. Odgovori kojima su dominirali štapići su pobuđeni u mraku sa 10- μs bliceva bele svetlosti (1,37 x 10’ cd/m<2>) predstavljenim u intervalima od 1 minuta u kupoli Ganzfelda. Svetlosno prilagođeni konusni odgovori izazvani su u prisustvu 41 cd/m<2>štapićadesenzibilizirajuće bele pozadine sa istim blicevima (1,37 x 10’ cd/m<2>) predstavljenim u intervalima od 1 Hz. ERG-ovi su nadgledani istovremeno iz oba oka, elektrodom petlje u obliku srebrne žice u kontaktu sa svakom rožnjačom, lokalno anesteziranom proparakain hidrohloridom i navlaženom Goniozolom, sa subdermalnom elektrodom na vratu kao referencom; električno zaštićena komora je služila kao tlo.

[0062] Svi odgovori su različito amplifikovani pri dobitku od 1,000 (-3db na 2 Hz i 300 Hz; AM502, Tektronix Instruments, Beaverton, OR), digitalizovani na 16-bitnoj rezuluciji sa podesivom ulaznom amplitudom od vrha do vrha (PCI-6251, National Instruments, Austin, TX), i prikazani na ličnom računaru pomoću prilagođenog softvera (Labview, version 8.2, National Instruments). Nezavisno za svako oko, odgovori čepića su kondicionirani pojasno nepropusnim filterom od 60 Hz i podesivim prozorom za odbacivanje artefakta, sumirani (n=4-20), i zatim podešeni na kubnu funkciju uglavka sa varjabilnom nefleksibilnošću radi poboljšanja signala: buke bez uticaja na njihove temporalne karakteristike; na taj način bismo mogli da rešimo odgovore b-talasa konusa veličine 2 μV.

Statistička analiza

[0063] JMP, verzija 6 (SAS Institute, Cary, NC) je korišćena za poređenje poprečnih preseka ERG amplituda i implicitnih vremena. Analize ponovljenih merenja sa PROC MIXED OF SAS, verzija 9.3 (SAS Institute) je korišćena za histološka poređenja i za upoređivanje longitudinalnih ERG podataka lečenih nasuprot nelečenih očiju.

Pacijenti

[0064] Pregledani su elektroretinografski (ERG) podaci u punom polju, dobijeni iz skupa podataka koji su opisali Sharon, i saradnici (2003), za 111 pacijenata sa XLRP usled ORF15 RPGR mutacija radi poređenja amplituda b-talasa sa belom svetlošću od 0,5 Hz, koje reflektuju preostala štapićasta+ konusna funkcija i bliceva do 30 Hz iste bele svetlosti, koji odražavaju samo preostalu funkciju konusa. Da bismo utvrdili da li su imali bolest štapića-konusa ili čepića-štapića, izračunali smo odnos njihove amplitude prema blicevima od 0,5 Hz podeljen njihovom amplitudom prema bljeskovima od 30 Hz za OD i za OS; isti odnos za donju granicu normale u našem sistemu je 350 μV / 50 μV = 7. Radi preciznijeg kvantifikovanja amplituda

2

odgovora na bliceve od 0,5 Hz i minimalizovanja mogućih efekata usled primarne degeneracije fotoreceptora, fokusirali smo se na one pacijente (n = 14) sa amplitudama prema blicevima od 0,5 Hz > 50 μV koji su odražavali raniju ili blažu bolest.

ERG-ovi pacijenata sa mutacijama ORF15

[0065] Za 14 pacijenata sa najsnažnijim odgovorima na bele bliceve od 0,5 Hz, odražavajući preostalu funkciju štapića čepića, amplitude tog stanja su se kretale od 53 μV do 329 μV OD i od 59 μV do 282 μV OS. Njihove amplitude prema blicevima od 30 Hz iste bele svetlosti, koje reflektuju samo funkciju konusa i praćene su propusnim filtriranjem i prosekom signala za amplitude < 10 μV, kretale su se od 0,98 μV do 23,5 μV OD i od 0,95 μV do 20 μV OS. Odnos amplitude odgovora prema blicevima od 0,5 Hz podeljen amplitudom odgovora na bliceve od 30 Hz imao je srednju standardnu grešku od 47,0 12,7 OD i 48,7 13,0 OS. Ove srednje vrednosti su se značajno razlikovale od vrednosti 7,0, vrednosti za odnos zasnovan na donjim granicama normale (neparametarski test sa oznakom ranga, p = 0,0004 OD i p = 0,001 OS). Drugim rečima, ovi pacijenti sa mutacijama ORF15 su imali izrazito nesrazmeran gubitak funkcije konusa. Primeri ovih ERG-ova prikazani su na slici 6.

Primer 1. AAV posredovano izražavanje ljudskog RPGR ORF15

[0066] Konstruisali smo dva humana gena za zamenu RPGR ORF15, jedan sa delecijom u okviru od 126 kodona (dugačka forma, ORF15-L), a drugi sa delecijom u okviru od 314 kodona (kratka forma, ORF15-S). Oba su ubačena u vektor AAV8 pod kontrolom promotera humane rodopsin kinaze (sl. 1A) (Khani i drugi 2007; Sun i drugi 2010). Subretinalna isporuka dva ljudska gena za zamenu RPGR ORF15 (leve oči) je dovela do proizvodnje rekombinantnih RPGR proteina. Western blot analizom, dve nedelje nakon primene AAV vektora, dugi oblik ORF 15 je proizveo približno 160 kD proteina, dok je kratki oblik ORF 15 proizveo približno 125 kD proteina. Oba proteinska proizvoda su bila manja od nativnog ORF15 viđenog u ljudskom tkivu mrežnjače (približno 200 kD) (Sl.1B, C). Oba oblika zamene ORF15 pojavila su se kao pojedinačna traka kada su ispitana antitelom protiv C-završetka humanog RPGR. U našim eksperimentalnim uslovima i datim dozama, nivoi ekspresije ORF15-S i ORF 15-L su bili uporedivi. Kontrolne oči (desne oči) su primile AAV-GFP.

[0067] Oba oblika ORF 15 su mogla biti viđena u mrežnjači RPGR<-/->miševa pomoću imunofluorescentnog bojenja nefiksiranih kriosekcija (3 nedelje nakon subretinalnih injekcija) i pravilno lokalizovana u sloju između unutrašnjeg i spoljašnjeg segmenta gde su smeštene spojne cilije. Međutim, kratki oblik (AAV8-ORF15- s) je davao mnogo slabije signale (Sl.2A) od dugog oblika (AAV8-ORF15-l). U dobro transdukovanim područjima mrežnjače, izgleda da se signal iz mrežnjača tretiranih dugim oblikom ne razlikuje od signala divljeg tipa (Sl.2A, B). Dvostruko obeležavanje antitelom za cilijarne korenčiće, koji potiču iz proksimalnih krajeva bazalnih tela i protežu se prema unutrašnjosti ćelije i stoga, služe kao odličan marker za ciliarni region (Hong i drugi 2003; Yang i drugi 2002), potvrdilo je tačnu subćelijsku lokalizacija rekombinantnog RPGR- a za spajajuće cilije (Sl.2B). Suprotno sličnosti u nivou proteinske ekspresije utvrđenoj Western blot-om, izgleda da samo dugi oblik ORF 15 ima robustan signal u svakom CC koji odgovara broju korenčića, dok u mrežnjačama tretiranim kratkim oblikom, mnogi korenčići nisu imali RPGR signal na njihovim distalnim krajevima.

Slika 2C prikazuje grafikon barova koji predstavlja broj RPGR oznaka u odnosu na broj cilijarnih korenskih vlakana u mrežnjačama Rpgr miševa tretiranim ili dugim ili kratkim oblikom humanog ORF 15, kao i kod netretiranih mrežnjača miša divljeg tipa. Nije bilo razlike u srednjim odnosima (broj RPGR signala podeljen brojem vlakana Rootletina) za dugu formu ORF 15 nasuprot divljem tipu (Dunnettova metoda, p = ,24), ali je značajno niži srednji odnos za kratku formu ORF 15 nasuprot divljem tipu (p = ,0019).

[0068] S obzirom na sličan nivo ekspresije imunoblotiranjem, ovaj nesklad u lokalizaciji proteina na povezujućem cilijumu sugeriše da je možda neka frakcija kratkog oblika ORF 15 pogrešno lokalizovana negde drugde u fotoreceptorima. Dalja analiza imunobojenjem fiksiranih delova mrežnjače, koja je omogućila bolje očuvanje tkiva na račun snage signala, otkrila je model pogrešno lokalizovanog ORF 15 u unutrašnjim i spoljašnjim segmentima fotoreceptora za kratki oblik ORF 15 (Sl.2D). Nije primećena pogrešna lokalizacija kod dugog oblika ORF15 koji je imao sliku bojenja sličnu divljem tipu. Stoga, nedostatak bojenja za kratki oblik RPGR na CC je usled smanjene sposobnosti lokalizacije ili ograničavanja u ovom podćelijskom odeljku, pre nego niži nivo ekspresije u celini.

Primer 2. Ekspresija humanog ORF15-1 (dugačka forma) kod RPGR nultih miševa promoviše preživljavanje štapića i čepića

[0069] Da bismo istražili terapijsku efikasnost dva zamenjena gena, procenili smo fotoreceptore RPGR miša pomoću imunobojenja kako bismo tražili znakove poboljšanja morfologije štapića i čepića. Do starosti od 13 meseci (6 meseci nakon tretmana) nije bilo očigledne razlike u morfologiji štapića ili čepića primećene kod kratkog oblika humanog ORF15 (Slika 3); i kontrolne i oči tretirane ORF15 kratkom formom su imale tipičan degenerativni izgled za ovo doba. Spoljni segmenti štapića i konusa su skraćeni i dezorganizovani u poređenju sa očima divljeg tipa sa pogrešnom lokalizacijom rodopsina posmatranom kroz spoljni nuklearni sloj i pogrešnom lokalizacijom opsina konusa dodatno u sinaptičkom sloju. Spoljni nuklearni sloj, u kontrolnim i tretiranim očima sa ORF 15 kratkim oblikom, takođe je srazmerno smanjen u debljini.

[0070] Suprotno tome, oči tretirane dugim oblikom humanog ORF 15 su imale ekspresiju rodopsina u štapićima koja je bila pravilno raspodeljena do spoljnih segmenata bez očiglednih znakova pogrešne lokalizacije. Slično tome, pogrešna lokalizacija opsina u konusu bila je retka kod ovih očiju lečenih dužim ORF 15 konstruktom. Pored toga, utvrđeno je da oči tretirane ORF 15-1 imaju više štapičastih i kupastih ćelija (sa spoljnim segmentima koji se gotovo normalno pojavljuju) od kontrolnih ili ORF15-s tretiranih očiju.

[0071] Na osnovu ovih otkrića izvedene su longitudinalne studije na miševima lečenim dugim oblikom ORF 15. Da bismo kvantifikovali obim spašavanja u očima tretiranim ORF 15-1 u odnosu na kontrolne oči, izmerili smo debljinu spoljnog nuklearnog sloja (ONL) i dužinu unutrašnjih / spoljašnjih segmenata fotoreceptora u kolegijalnim očima 3 Rpgr<-/->miševa. Oni su izmereni u 3 regiona gornje hemisfere i u 3 regiona donje hemisfere, svaki region odvojen pomoću 600 μm i započinje 600 μm sa obe strane glave optičkog nerva duž vertikalnog meridijana; Ponovljena merenja pune faktorske regresije u starosti od 11 meseci i 18 meseci je korišćena za identifikovanje razlika u očima, hemisferom i regionom kao glavnim efektima,

2

kao i njihovih unakrsnih proizvoda da bi se utvrdilo da li se efekat lečenja razlikuje geografski. U starosti od 11 meseca, debljina ONL-a je bila normalno distribuirana, ali dužina unutrašnjeg segmenta / spoljnog segmenta nije (Shapiro-Wilk W test dobrog prilagođavanja, p = 0,016); sa 18 meseci starosti, ni debljina ONL-a niti dužina unutrašnjeg segmenta / spoljnog segmenta nisu normalno raspoređene (p = ,0011 i p =,0002, respektivno). U starosti od 11 meseci srednja debljina ONL je bila značajno veća za tretirane oči (48,0 μm) nego za kontrolne oči (38,0 μm, p = ,0015); srednja dužina unutrašnjeg segmenta / spoljnog segmenta je takođe bila značajno veća za tretirane oči (45,1 μm) nego za kontrolne oči (29,5 μm, p < ,0001, p < ,0001 za normalizovane rangove). Prednosti lečenja u odnosu na debljinu ONL-a i dužinu IS / OS bile su uporedive za donju i gornju hemisferu u ovom dobu. U starosti od 18 meseci razlike u morfologiji mrežnjače među ostalim očima bile su još izraženije: srednja debljina ONL-a je bila 22,8 μm za tretirane oči i 13,7 μm za kontrolne oči (p < ,0001, p < ,0001 za normalizovane rangove), dok su srednje vrednosti dužine unutrašnjeg segmenta / spoljnog segmenta bile 19,8 μm za tretirane oči i 7,3 μm za kontrolne oči (p < ,0001, p < ,0001 za normalizovane rangove). U ovom uzrastu smo u početku primetili da je korist od lečenja za dužinu IS / OS bila značajno veća u superiornoj mrežnjači nego u inferiornoj mrežnjači sa 18 meseci (p =,0036), ali se to nije održalo nakon pretvaranja dužine u normalizovane redove (p = ,17). Slika 4A ilustruje debljinu ONL-a i dužinu IS / OS od strane regiona za lečene i kontrolne oči kod tri miša starosti od 18 meseci.

[0072] Slika 4B prikazuje reprezentativne svetlosne mikrografije snimljene sa reprezentativnog ORF 15-L tretiranog i kolegijalnog kontrolnog oka starosti od 18 meseci. U kontrolnoj mrežnjači, najbolje očuvano područje ima samo oko 2-3 reda labavo raspoređenih nukleusa fotoreceptora sa skraćenim i neorganizovanim unutrašnjim/spoljnim segmentima fotoreceptora. Treba napomenuti da se margine unutrašnjih i spoljašnjih segmenata više ne razlikuju. Lečena mrežnjača, s druge strane, ima oko 5-6 redova fotoreceptorskih ćelija, sa dužim, bolje organizovanim i različitim unutrašnjim i spoljnim segmentima.

Primer 3. Ekspresija humanog RPGR ORF15 dugog oblika poboljšava štapičastu i konusnu funkciju

[0073] Funkcija mrežnjače praćena ERG-ovima štapića i čepića u celom polju je procenjena u kohorti (n = 22) RPGR miševa starosti od 9 meseci do 18 meseci. Miševi su dobili tretman između 3 i 7 meseci starosti, a ERG-ovi za praćenje su snimljeni ne pre nego što je prošlo 6 meseci nakon injekcije. Slika SA prikazuje ERG amplitude štapića i čepića od strane oka za 16 miševa koji su testirani između 11 i 14 meseci starosti. Kontrolne oči (OD) su pokazale nesrazmeran gubitak amplitude b-talasa konusa u odnosu na amplitudu b-talasa štapića u poređenju sa donjim granicama za miševe divljeg tipa, kao što je prethodno primećeno u ovom mišijem modelu RPGR miševa i dokaz za konusnu-štapičastu degeneraciju. U svakom slučaju, osim u jednom, lečeno oko (OS) je imalo veću ERG amplitudu a-talasa i b-talasa u poređenju sa drugim kontrolnim okom (OD), demonstrirajući poboljšanje funkcije fotoreceptora štapića i konusa. U stvari, više od polovine tretiranih očiju (9/16) je imalo amplitude b-talasa štapića koje su bile na ili iznad donje granice starosnih vrednosti WT (isprekidana linija). Geometrijske srednje vrednosti za štapičasta ERG amplitudu a-talasa i b-talasa su bile 121 μV OS i 65 μV

2

OD za a-talas i 482 μV OS i 267 μV OD za b-talas. Srednje konusne ERG amplitude b-talasa su bile 22 μV OS i 11 μV OD. Ovi podaci pokazuju 81-86% poboljšanja štapičaste funkcije i 100% poboljšanja konusne funkcije sa tretmanom AAV-ORF15 za ovaj starosni opseg.

[0074] U punoj kohorti od 22 miša, koristili smo ponovljena merenja longitudinalne regresije da bismo uporedili stope promene amplituda b-talasa štapića i konusa (Slika.5B). Procenjene srednje stope promene su bile -8,6%/mesečno za amplitudu b-talasa štapića kontrolnih očiju i -3,8% / mesečno za amplitudu b-talasa štapića tretiranih očiju; razlika između ove dve srednje vrednosti je bila značajna (p = 0,0001). Procenjene srednje stope promene su bile -5,8%/mesečno za amplitudu b-talasa konusa kontrolnih očiju i -0,8% / mesec za amplitudu btalasa konusa tretiranih očiju; razlika između ove dve srednje vrednosti je takođe bila značajna (p<0,0001). Pored toga, utvrđeno je da se pad amplitude b-talasa konusa za tretirane oči ne razlikuje značajno od nule (p = 0,54), što ukazuje na stabilnost funkcije konusa bez vidljive progresije.

[0075] Reprezentativni ERG-ovi štapića i čepića su prikazani na Sl. 5C za ilustraciju talasnih oblika u lečenim i kontrolnim očima, uključujući WT, sa 18 meseci starosti (poslednja vremenska tačka). Funkcija štapića u kontrolnim očima u ovom uzrastu je ozbiljno smanjena (u proseku za 75%), dok je funkcija konusa minimalna i u nekim slučajevima praktično nije detektabilna. Suprotno tome, tretirane oči u ovoj vremenskoj tački i dalje imaju značajnu štapičastu i konusnu funkciju, iako ispod onih koje se vide u očima divljeg tipa.

REFERENCE

[0076] ACLAND GM, AGUIRRE GD, RAY J, ZHANG Q, et al. (2001). Gene therapy restores vision in a canine model of childhood blindness. Nat Genet 28, 92-5.

[0077] ALEXANDER JJ, UMINO Y, EVERHART D, CHANG B, et al. (2007). Restoration of cone vision in a mouse model of achromatopsia. Nat Med 13, 685-7.

[0078] ALI RR, SARRA GM, STEPHENS C, ALWIS MD, et al. (2000). Restoration of photoreceptor ultrastructure and function in retinal degeneration slow mice by gene therapy. Nat Genet 25, 306-10.

[0079] ALLOCCA M, MUSSOLINO C, GARCIA-HOYOS M, SANGES D, et al. (2007). Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol 81, 11372-80.

[0080] BADER I, BRANDAU O, ACHATZ H, APFELSTEDT-SYLLA E, et al. (2003). X-linked retinitis pigmentosa: RPGR mutations in most families with definite X linkage and clustering of mutations in a short sequence stretch of exon ORF 15. Invest Ophthalmol Vis Sci 44, 1458-63.

[0081] BAINBRIDGE JW, SMITH AJ, BARKER SS, ROBBIE S, et al. (2008). Effect of gene therapy on visual function in Leber’s congenital amaurosis. N Engl J Med 358, 2231-9.

2

[0082] BELTRAN WA, CIDECIYAN AV, LEWIN AS, IWABE S, et al. (2012). Gene therapy rescues photoreceptor blindness in dogs and paves the way for treating human X-linked retinitis pigmentosa. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 2132-7.

[0083] BERSON EL. (1993). Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci 34, 1659-76.

[0084] BOYLAN JP, WRIGHT AF. (2000). Identification of a novel protein interacting with RPGR. Hum Mol Genet 9, 2085-2093.

[0085] BRANHAM K, OTHMAN M, BRUMM M, KAROUKIS AJ, et al. (2012). Mutations in RPGR and RP2 Account for 15% of Males with Simplex Retinal Degenerative Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci 53, 8232-7.

[0086] BREUER DK, YASHAR BM, FILIPPOVA E, HIRIYANNA S, et al. (2002). A comprehensive mutation analysis of RP2 and RPGR in a North American cohort of families with X-linked retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet 70, 1545-54. [0087] CHURCHILL JD, BOWNE SJ, SULLIVAN LS, LEWIS RA, et al. (2013). Mutations in the X-linked retinitis pigmentosa genes RPGR and RP2 found in 8.5% of families with a provisional diagnosis of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci 54, 1411-6.

[0088] CIDECIYAN AV, ALEMAN TS, BOYE SL, SCHWARTZ SB, et al. (2008). Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of vision but with slow rod kinetics. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 15112-7. [0089] HONG DH, LI T. (2002). Complex expression pattern of RPGR reveals a role for purine-rich exonic splicing enhancers. Invest Ophthalmol Vis Sci 43, 3373-82.

[0090] HONG DH, PAWLYK B, SOKOLOV M, STRISSEL KJ, et al. (2003). RPGR isoforms in photoreceptor connecting cilia and the transitional zone of motile cilia. Invest Ophthalmol Vis Sci 44, 2413-21.

[0091] HONG DH, PAWLYK BS, ADAMIAN M, SANDBERG MA, et al. (2005). A single, abbreviated RPGR-ORF15 variant reconstitutes RPGR function in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci 46, 435-41.

[0092] HONG DH, PAWLYK BS, SHANG J, SANDBERG MA, et al. (2000). A retinitis pigmentosa GTPase regulator (RPGR)-deficient mouse model for X-linked retinitis pigmentosa (RP3). Proc Natl Acad Sci USA 97, 3649-54.

[0093] HONG DH, YUE G, ADAMIAN M, LI T. (2001). Retinitis pigmentosa GTPase regulator (RPGR)-interacting protein is stably associated with the photoreceptor ciliary axoneme and anchors RPGR to the connecting cilium. J Biol Chem 276, 12091-12099.

[0094] JACOBI FK, KARRA D, BROGHAMMER M, BLIN N, et al. (2005). Mutational risk in highly repetitive exon ORF15 of the RPGR multi disease gene is not associated with haplotype background. Int J Mol Med 16, 1175-8.

2

[0095] KARRA D, JACOBI FK, BROGHAMMER M, BLIN N, et al. (2006). Population haplotypes of exon ORF 15 of the retinitis pigmentosa GTPase regulator gene in Germany : implications for screening for inherited retinal disorders. Mol Diagn Ther 10, 115-23.

[0096] KHANI SC, PAWLYK BS, BULGAKOV OV, KASPEREK E, et al. (2007). AAV-Mediated Expression Targeting of Rod and Cone Photoreceptors with a Human Rhodopsin Kinase Promoter. Invest Ophthalmol Vis Sci 48, 3954-61.

[0097] KOMAROMY AM, ALEXANDER JJ, ROWLAN JS, GARCIA MM, et al. (2010). Gene therapy rescues cone function in congenital achromatopsia. Hum Mol Genet 19, 2581-93.

[0098] LHERITEAU E, LIBEAU L, STIEGER K, DESCHAMPS JY, et al. (2009). The RPGRIP1-deficient dog, a prom- ising canine model for gene therapy. Mol Vis 15, 349-61.

[0099] MACLAREN RE, GROPPE M, BARNARD AR, COTTRIALL CL, et al. (2014). Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet.

[0100] MAGUIRE AM, SIMONELLI F, PIERCE EA, PUGH EN, JR., et al. (2008). Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital amaurosis. N Engl J Med 358, 2240-8.

[0101] NATKUNARAJAH M, TRITTIBACH P, MCINTOSH J, DURAN Y, et al. (2008). Assessment of ocular transduc- tion using single-stranded and self-complementary recombinant adeno-associated virus serotype 2/8. Gene Ther 15, 463-7.

[0102] PANG JJ, LEI L, DAI X, SHI W, et al. (2012). AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr Mol Med 12, 316-30.

[0103] PAWLYK BS et al. (2016) Photoreceptor rescue by an abbreviated human RPGR gene in a murine model of X-linked retinitis pigmentosa. Gene Therapy, vol.23, no.2, pages 196 -204.

[0104] PAWLYK BS, BULGAKOV OV, LIU X, XU X, et al. (2010). Replacement gene therapy with a human RPGRIP1 sequence slows photoreceptor degeneration in a murine model of Leber congenital amaurosis. Hum Gene Ther 21, 993-1004.

[0105] PAWLYK BS, SMITH AJ, BUCH PK, ADAMIAN M, et al. (2005). Gene replacement therapy rescues photore- ceptor degeneration in a murine model of Leber congenital amaurosis lacking RPGRIP. Invest Ophthalmol Vis Sci 46, 3039-45.

[0106] PELLETIER V, JAMBOU M, DELPHIN N, ZINOVIEVA E, et al. (2007). Comprehensive survey of mutations in RP2 and RPGR in patients affected with distinct retinal dystrophies: genotype-phenotype correlations and impact on genetic counseling. Hum Mutat 28, 81-91.

[0107] ROEPMAN R, BERNOUD-HUBAC N, SCHICK DE, MAUGERI A, et al. (2000). The retinitis pigmentosa GTPase regulator (RPGR) interacts with novel transport-like proteins in the outer segments of rod photoreceptors. Hum Mol Genet 9, 2095-2105.

2

[0108] SANDBERG MA, ROSNER B, WEIGEL-DIFRANCO C, DRYJA TP, et al. (2007). Disease course of patients with X-linked retinitis pigmentosa due to RPGR gene mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci 48, 1298-304.

[0109] SUN X, PAWLYK B, XU X, LIU X, et al. (2010). Gene therapy with a promoter targeting both rods and cones rescues retinal degeneration caused by AIPL1 mutations. Gene Ther 17, 117-131.

[0110] TAN MH, SMITH AJ, PAWLYK B, XU X, et al. (2009). Gene therapy for retinitis pigmentosa and Leber congenital amaurosis caused by defects in AIPL1: effective rescue of mouse models of partial and complete Aipl1 deficiency using AAV2/2 and AAV2/8 vectors. Hum Mol Genet.

[0111] THOMPSON DA, KHAN NW, OTHMAN MI, CHANG B, et al. (2012). Rd9 is a naturally occurring mouse model of a common form of retinitis pigmentosa caused by mutations in RPGR-ORF15. PLoS One 7, e35865.

[0112] VERVOORT R, LENNON A, BIRD AC, TULLOCH B, et al. (2000). Mutational hot spot within a new RPGR exon in X-linked retinitis pigmentosa. Nature Genetics 25, 462-466.

[0113] VERVOORT R, WRIGHT AF. (2002). Mutations of RPGR in X-linked retinitis pigmentosa (RP3). Hum Mutat 19, 486-500.

[0114] YANG J, LIU X, YUE G, ADAMIAN M, et al. (2002). Rootletin, a novel coiled-coil protein, is a structural component of the ciliary rootlet. J Cell Biol 159, 431-440.

SEQUENCE LISTING

<110> Massachusetts Eye and Ear Infirmary

<120> RPGR GENE THERAPY FOR RETINITIS

PIGMENTOSA

<130> 00633-0182WO1

<150> US 62/028,638

<151> 2014-07-24

<160> 5

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 3081

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human RPGRORF15 sequence with 378bp deleted

<400> 1

atgagggagc cggaagagct gatgcccgat tcgggtgctg tgtttacatt tgggaaaagt 60 aaatttgctg aaaataatcc cggtaaattc tggtttaaaa atgatgtccc tgtacatctt 120 tcatgtggag atgaacattc tgctgttgtt accggaaata ataaacttta catgtttggc 180 agtaacaact ggggtcagtt aggattagga tcaaagtcag ccatcagcaa gccaacatgt 240 gtcaaagctc taaaacctga aaaagtgaaa ttagctgcct gtggaaggaa ccacaccctg 300 gtgtcaacag aaggaggcaa tgtatatgca actggtggaa ataatgaagg acagttgggg 360 cttggtgaca ccgaagaaag aaacactttt catgtaatta gcttttttac atccgagcat 420 aagattaagc agctgtctgc tggatctaat acttcagctg ccctaactga ggatggaaga 480 ctttttatgt ggggtgacaa ttccgaaggg caaattggtt taaaaaatgt aagtaatgtc 540 tgtgtccctc agcaagtgac cattgggaaa cctgtctcct ggatctcttg tggatattac 600 cattcagctt ttgtaacaac agatggtgag ctatatgtgt ttggagaacc tgagaatggg 660 aagttaggtc ttcccaatca gctcctgggc aatcacagaa caccccagct ggtgtctgaa 720 attccggaga aggtgatcca agtagcctgt ggtggagagc atactgtggt tctcacggag 780 aatgctgtgt atacctttgg gctgggacaa tttggtcagc tgggtcttgg cacttttctt 840 tttgaaactt cagaacccaa agtcattgag aatattaggg atcaaacaat aagttatatt 900 tcttgtggag aaaatcacac agctttgata acagatatcg gccttatgta tacttttgga 960 gatggtcgcc acggaaaatt aggacttgga ctggagaatt ttaccaatca cttcattcct 1020 actttgtgct ctaatttttt gaggtttata gttaaattgg ttgcttgtgg tggatgtcac 1080 atggtagttt ttgctgctcc tcatcgtggt gtggcaaaag aaattgaatt cgatgaaata 1140 aatgatactt gcttatctgt ggcgactttt ctgccgtata gcagtttaac ctcaggaaat 1200 gtactgcaga ggactctatc agcacgtatg cggcgaagag agagggagag gtctccagat 1260 tctttttcaa tgaggagaac actacctcca atagaaggga ctcttggcct ttctgcttgt 1320 tttctcccca attcagtctt tccacgatgt tctgagagaa acctccaaga gagtgtctta 1380 tctgaacagg acctcatgca gccagaggaa ccagattatt tgctagatga aatgaccaaa 1440 gaagcagaga tagataattc ttcaactgta gaaagccttg gagaaactac tgatatctta 1500 aacatgacac acatcatgag cctgaattcc aatgaaaagt cattaaaatt atcaccagtt 1560 cagaaacaaa agaaacaaca aacaattggg gaactgacgc aggatacagc tcttactgaa 1620 aacgatgata gtgatgaata tgaagaaatg tcagaaatga aagaagggaa agcatgtaaa 1680 caacatgtgt cacaagggat tttcatgacg cagccagcta cgactatcga agcattttca 1740 gatgaggaag tagagatccc agaggagaag gaaggagcag aggattcaaa aggaaatgga 1800 atagaggagc aagaggtaga agcaaatgag gaaaatgtga aggtgcatgg aggaagaaag 1860 gagaaaacag agatcctatc agatgacctt acagacaaag cagaggtgag tgaaggcaag 1920 gcaaaatcag tgggagaagc agaggatggg cctgaaggta gaggggatgg aacctgtgag 1980 gaaggtagtt caggagcaga acactggcaa gatgaggaga gggagaaggg ggagaaagac 2040 aagggtagag gagaaatgga gaggccagga gagggagaga aggaactagc agagaaggaa 2100 gaatggaaga agagggatgg ggaagagcag gagcaaaagg agagggagca gggccatcag 2160 aaggaaagaa accaagagat ggaggaggga ggggaggagg agcatggaga aggagaagaa 2220 gaggagggag acagagaaga ggaagaagag aaggagggag aagggaaaga ggaaggagaa 2280 ggggaagaag tggagggaga acgtgaaaag gaggaaggag agaggaaaaa ggaggaaaga 2340 gcggggaagg aggagaaagg agaggaagaa ggagaccaag gagaggggga agaggaggaa 2400 acagagggga gaggggagga aaaagaggag ggaggggaag tagagggagg ggaagtagag 2460 gaggggaaag gagagaggga agaggaagag gaggagggtg agggggaaga ggaggaaggg 2520 gagggggaag aggaggaagg ggagggggaa gaggaggaag gagaagggaa aggggaggaa 2580 gaaggggagg gggaagagga ggaaggggaa gaagaagggg aggaagaagg agagggagag 2640 gaagaagggg agggagaagg ggaggaagaa gaggaagggg aagtggaagg ggaggtggaa 2700 ggggaggaag gagaggggga aggagaggaa gaggaaggag aggaggaagg agaagaaagg 2760 gaaaaggagg gggaaggaga agaaaacagg aggaacagag aagaggagga ggaagaagag 2820 gggaagtatc aggagacagg cgaagaagag aatgaaaggc aggatggaga ggagtacaaa 2880 aaagtgagca aaataaaagg atctgtgaaa tatggcaaac ataaaacata tcaaaaaaag 2940 tcagttacta acacacaggg aaatgggaaa gagcagaggt ccaaaatgcc agtccagtca 3000 aaacgacttt taaaaaatgg gccatcaggt tccaaaaagt tctggaataa tatattacca 3060 cattacttgg aattgaagta a 3081

<210> 2

<211> 1026

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human RPGRORF15 sequence with 126 amino acids

deleted

<400> 2

Met Arg Glu Pro Glu Glu Leu Met Pro Asp Ser Gly Ala Val Phe Thr

1 5 10 15

Phe Gly Lys Ser Lys Phe Ala Glu Asn Asn Pro Gly Lys Phe Trp Phe

20 25 30

Lys Asn Asp Val Pro Val His Leu Ser Cys Gly Asp Glu His Ser Ala

35 40 45

Val Val Thr Gly Asn Asn Lys Leu Tyr Met Phe Gly Ser Asn Asn Trp

50 55 60

Gly Gln Leu Gly Leu Gly Ser Lys Ser Ala Ile Ser Lys Pro Thr Cys

65 70 75 80

Val Lys Ala Leu Lys Pro Glu Lys Val Lys Leu Ala Ala Cys Gly Arg

85 90 95

Asn His Thr Leu Val Ser Thr Glu Gly Gly Asn Val Tyr Ala Thr Gly

100 105 110

Gly Asn Asn Glu Gly Gln Leu Gly Leu Gly Asp Thr Glu Glu Arg Asn

115 120 125

Thr Phe His Val Ile Ser Phe Phe Thr Ser Glu His Lys Ile Lys Gln

130 135 140

Leu Ser Ala Gly Ser Asn Thr Ser Ala Ala Leu Thr Glu Asp Gly Arg

145 150 155 160

Leu Phe Met Trp Gly Asp Asn Ser Glu Gly Gln Ile Gly Leu Lys Asn

Val Ser Asn Val Cys Val Pro Gln Gln Val Thr Ile Gly Lys Pro Val 180 185 190

Ser Trp Ile Ser Cys Gly Tyr Tyr His Ser Ala Phe Val Thr Thr Asp 195 200 205

Gly Glu Leu Tyr Val Phe Gly Glu Pro Glu Asn Gly Lys Leu Gly Leu 210 215 220

Pro Asn Gln Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Pro Gln Leu Val Ser Glu 225 230 235 240

Ile Pro Glu Lys Val Ile Gln Val Ala Cys Gly Gly Glu His Thr Val 245 250 255

Val Leu Thr Glu Asn Ala Val Tyr Thr Phe Gly Leu Gly Gln Phe Gly 260 265 270

Gln Leu Gly Leu Gly Thr Phe Leu Phe Glu Thr Ser Glu Pro Lys Val 275 280 285

Ile Glu Asn Ile Arg Asp Gln Thr Ile Ser Tyr Ile Ser Cys Gly Glu 290 295 300

Asn His Thr Ala Leu Ile Thr Asp Ile Gly Leu Met Tyr Thr Phe Gly 305 310 315 320

Asp Gly Arg His Gly Lys Leu Gly Leu Gly Leu Glu Asn Phe Thr Asn 325 330 335

His Phe Ile Pro Thr Leu Cys Ser Asn Phe Leu Arg Phe Ile Val Lys 340 345 350

Leu Val Ala Cys Gly Gly Cys His Met Val Val Phe Ala Ala Pro His 355 360 365

Arg Gly Val Ala Lys Glu Ile Glu Phe Asp Glu Ile Asn Asp Thr Cys 370 375 380

Leu Ser Val Ala Thr Phe Leu Pro Tyr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asn 385 390 395 400

Val Leu Gln Arg Thr Leu Ser Ala Arg Met Arg Arg Arg Glu Arg Glu 405 410 415

Arg Ser Pro Asp Ser Phe Ser Met Arg Arg Thr Leu Pro Pro Ile Glu 420 425 430

Gly Thr Leu Gly Leu Ser Ala Cys Phe Leu Pro Asn Ser Val Phe Pro 435 440 445

Arg Cys Ser Glu Arg Asn Leu Gln Glu Ser Val Leu Ser Glu Gln Asp 450 455 460

Leu Met Gln Pro Glu Glu Pro Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Met Thr Lys 465 470 475 480

Glu Ala Glu Ile Asp Asn Ser Ser Thr Val Glu Ser Leu Gly Glu Thr 485 490 495

Thr Asp Ile Leu Asn Met Thr His Ile Met Ser Leu Asn Ser Asn Glu 500 505 510

Lys Ser Leu Lys Leu Ser Pro Val Gln Lys Gln Lys Lys Gln Gln Thr 515 520 525

Ile Gly Glu Leu Thr Gln Asp Thr Ala Leu Thr Glu Asn Asp Asp Ser 530 535 540

Asp Glu Tyr Glu Glu Met Ser Glu Met Lys Glu Gly Lys Ala Cys Lys 545 550 555 560

Gln His Val Ser Gln Gly Ile Phe Met Thr Gln Pro Ala Thr Thr Ile 565 570 575

Glu Ala Phe Ser Asp Glu Glu Val Glu Ile Pro Glu Glu Lys Glu Gly 580 585 590

Ala Glu Asp Ser Lys Gly Asn Gly Ile Glu Glu Gln Glu Val Glu Ala 595 600 605

Asn Glu Glu Asn Val Lys Val His Gly Gly Arg Lys Glu Lys Thr Glu 610 615 620

Ile Leu Ser Asp Asp Leu Thr Asp Lys Ala Glu Val Ser Glu Gly Lys 625 630 635 640

Ala Lys Ser Val Gly Glu Ala Glu Asp Gly Pro Glu Gly Arg Gly Asp 645 650 655

Gly Thr Cys Glu Glu Gly Ser Ser Gly Ala Glu His Trp Gln Asp Glu 660 665 670

Glu Arg Glu Lys Gly Glu Lys Asp Lys Gly Arg Gly Glu Met Glu Arg 675 680 685

Pro Gly Glu Gly Glu Lys Glu Leu Ala Glu Lys Glu Glu Trp Lys Lys 690 695 700

Arg Asp Gly Glu Glu Gln Glu Gln Lys Glu Arg Glu Gln Gly His Gln 705 710 715 720

Lys Glu Arg Asn Gln Glu Met Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu His Gly 725 730 735

Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Asp Arg Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu 740 745 750

Gly Glu Gly Lys Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Val Glu Gly Glu Arg 755 760 765

Glu Lys Glu Glu Gly Glu Arg Lys Lys Glu Glu Arg Ala Gly Lys Glu 770 775 780

Glu Lys Gly Glu Glu Glu Gly Asp Gln Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu 785 790 795 800

Thr Glu Gly Arg Gly Glu Glu Lys Glu Glu Gly Gly Glu Val Glu Gly 805 810 815

Gly Glu Val Glu Glu Gly Lys Gly Glu Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu 820 825 830

Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu 835 840 845

Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly 850 855 860

Glu Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu 865 870 875 880

Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Val Glu 885 890 895

Gly Glu Val Glu Gly Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu 900 905 910

Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Arg Glu Lys Glu Gly Glu Gly Glu Glu 915 920 925

Asn Arg Arg Asn Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Lys Tyr Gln 930 935 940

Glu Thr Gly Glu Glu Glu Asn Glu Arg Gln Asp Gly Glu Glu Tyr Lys 945 950 955 960

Lys Val Ser Lys Ile Lys Gly Ser Val Lys Tyr Gly Lys His Lys Thr 965 970 975

Tyr Gln Lys Lys Ser Val Thr Asn Thr Gln Gly Asn Gly Lys Glu Gln 980 985 990

Arg Ser Lys Met Pro Val Gln Ser Lys Arg Leu Leu Lys Asn Gly Pro 995 1000 1005

Ser Gly Ser Lys Lys Phe Trp Asn Asn Ile Leu Pro His Tyr Leu Glu 1010 1015 1020

Leu Lys

1025

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

atgagggagc cggaagagct gatgcccgat tcgggtgctg tgtttacatt tgggaaaagt 60 aaatttgctg aaaataatcc cggtaaattc tggtttaaaa atgatgtccc tgtacatctt 120 tcatgtggag atgaacattc tgctgttgtt accggaaata ataaacttta catgtttggc 180 agtaacaact ggggtcagtt aggattagga tcaaagtcag ccatcagcaa gccaacatgt 240 gtcaaagctc taaaacctga aaaagtgaaa ttagctgcct gtggaaggaa ccacaccctg 300 gtgtcaacag aaggaggcaa tgtatatgca actggtggaa ataatgaagg acagttgggg 360 cttggtgaca ccgaagaaag aaacactttt catgtaatta gcttttttac atccgagcat 420 aagattaagc agctgtctgc tggatctaat acttcagctg ccctaactga ggatggaaga 480 ctttttatgt ggggtgacaa ttccgaaggg caaattggtt taaaaaatgt aagtaatgtc 540 tgtgtccctc agcaagtgac cattgggaaa cctgtctcct ggatctcttg tggatattac 600 cattcagctt ttgtaacaac agatggtgag ctatatgtgt ttggagaacc tgagaatggg 660 aagttaggtc ttcccaatca gctcctgggc aatcacagaa caccccagct ggtgtctgaa 720 attccggaga aggtgatcca agtagcctgt ggtggagagc atactgtggt tctcacggag 780 aatgctgtgt atacctttgg gctgggacaa tttggtcagc tgggtcttgg cacttttctt 840

tttgaaactt cagaacccaa agtcattgag aatattaggg atcaaacaat aagttatatt 900 tcttgtggag aaaatcacac agctttgata acagatatcg gccttatgta tacttttgga 960 gatggtcgcc acggaaaatt aggacttgga ctggagaatt ttaccaatca cttcattcct 1020 actttgtgct ctaatttttt gaggtttata gttaaattgg ttgcttgtgg tggatgtcac 1080

atggtagttt ttgctgctcc tcatcgtggt gtggcaaaag aaattgaatt cgatgaaata 1140 aatgatactt gcttatctgt ggcgactttt ctgccgtata gcagtttaac ctcaggaaat 1200 gtactgcaga ggactctatc agcacgtatg cggcgaagag agagggagag gtctccagat 1260 tctttttcaa tgaggagaac actacctcca atagaaggga ctcttggcct ttctgcttgt 1320 tttctcccca attcagtctt tccacgatgt tctgagagaa acctccaaga gagtgtctta 1380 tctgaacagg acctcatgca gccagaggaa ccagattatt tgctagatga aatgaccaaa 1440 gaagcagaga tagataattc ttcaactgta gaaagccttg gagaaactac tgatatctta 1500 aacatgacac acatcatgag cctgaattcc aatgaaaagt cattaaaatt atcaccagtt 1560 cagaaacaaa agaaacaaca aacaattggg gaactgacgc aggatacagc tcttactgaa 1620 aacgatgata gtgatgaata tgaagaaatg tcagaaatga aagaagggaa agcatgtaaa 1680 caacatgtgt cacaagggat tttcatgacg cagccagcta cgactatcga agcattttca 1740 gatgaggaag tagagatccc agaggagaag gaaggagcag aggattcaaa aggaaatgga 1800 atagaggagc aagaggtaga agcaaatgag gaaaatgtga aggtgcatgg aggaagaaag 1860 gagaaaacag agatcctatc agatgacctt acagacaaag cagaggtgag tgaaggcaag 1920 gcaaaatcag tgggagaagc agaggatggg cctgaaggta gaggggatgg aacctgtgag 1980 gaaggtagtt caggagcaga acactggcaa gatgaggaga gggagaaggg ggagaaagac 2040 aagggtagag gagaaatgga gaggccagga gagggagaga aggaactagc agagaaggaa 2100 gaatggaaga agagggatgg ggaagagcag gagcaaaagg agagggagca gggccatcag 2160 aaggaaagaa accaagagat ggaggaggga ggggaggagg agcatggaga aggagaagaa 2220 gaggagggag acagagaaga ggaagaagag aaggagggag aagggaaaga ggaaggagaa 2280 ggggaagaag tggagggaga acgtgaaaag gaggaaggag agaggaaaaa ggaggaaaga 2340 gcggggaagg aggagaaagg agaggaagaa ggagaccaag gagaggggga agaggaggaa 2400 acagagggga gaggggagga aaaagaggag ggaggggaag tagagggagg ggaagtagag 2460 gaggggaaag gagagaggga agaggaagag gaggagggtg agggggaaga ggaggaaggg 2520 gagggggaag aggaggaagg ggagggggaa gaggaggaag gagaagggaa aggggaggaa 2580 gaaggggaag aaggagaagg ggaggaagaa ggggaggaag gagaagggga gggggaagag 2640 gaggaaggag aaggggaggg agaagaggaa ggagaagggg agggagaaga ggaggaagga 2700 gaaggggagg gagaagagga aggagaaggg gagggagaag aggaggaagg agaagggaaa 2760 ggggaggagg aaggagagga aggagaaggg gagggggaag aggaggaagg agaaggggaa 2820 ggggaggatg gagaagggga gggggaagag gaggaaggag aatgggaggg ggaagaggag 2880 gaaggagaag gggaggggga agaggaagga gaaggggaag gggaggaagg agaaggggag ggggaagagg aggaaggaga aggggagggg gaagaggagg aaggggaaga agaaggggag 3000 gaagaaggag agggagagga agaaggggag ggagaagggg aggaagaaga ggaaggggaa 3060 gtggaagggg aggtggaagg ggaggaagga gagggggaag gagaggaaga ggaaggagag 3120 gaggaaggag aagaaaggga aaaggagggg gaaggagaag aaaacaggag gaacagagaa 3180 gaggaggagg aagaagaggg gaagtatcag gagacaggcg aagaagagaa tgaaaggcag 3240 gatggagagg agtacaaaaa agtgagcaaa ataaaaggat ctgtgaaata tggcaaacat 3300 aaaacatatc aaaaaaagtc agttactaac acacagggaa atgggaaaga gcagaggtcc 3360 aaaatgccag tccagtcaaa acgactttta aaaaatgggc catcaggttc caaaaagttc 3420 tggaataata tattaccaca ttacttggaa ttgaagtaa 3459

<210> 4

<211> 1152

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Arg Glu Pro Glu Glu Leu Met Pro Asp Ser Gly Ala Val Phe Thr

1 5 10 15

Phe Gly Lys Ser Lys Phe Ala Glu Asn Asn Pro Gly Lys Phe Trp Phe

20 25 30

Lys Asn Asp Val Pro Val His Leu Ser Cys Gly Asp Glu His Ser Ala

35 40 45

Val Val Thr Gly Asn Asn Lys Leu Tyr Met Phe Gly Ser Asn Asn Trp

50 55 60

Gly Gln Leu Gly Leu Gly Ser Lys Ser Ala Ile Ser Lys Pro Thr Cys

65 70 75 80

Val Lys Ala Leu Lys Pro Glu Lys Val Lys Leu Ala Ala Cys Gly Arg

85 90 95

Asn His Thr Leu Val Ser Thr Glu Gly Gly Asn Val Tyr Ala Thr Gly

100 105 110

Gly Asn Asn Glu Gly Gln Leu Gly Leu Gly Asp Thr Glu Glu Arg Asn

115 120 125

Thr Phe His Val Ile Ser Phe Phe Thr Ser Glu His Lys Ile Lys Gln

130 135 140

Leu Ser Ala Gly Ser Asn Thr Ser Ala Ala Leu Thr Glu Asp Gly Arg

145 150 155 160

Leu Phe Met Trp Gly Asp Asn Ser Glu Gly Gln Ile Gly Leu Lys Asn

165 170 175

Val Ser Asn Val Cys Val Pro Gln Gln Val Thr Ile Gly Lys Pro Val

180 185 190

Ser Trp Ile Ser Cys Gly Tyr Tyr His Ser Ala Phe Val Thr Thr Asp

195 200 205

Gly Glu Leu Tyr Val Phe Gly Glu Pro Glu Asn Gly Lys Leu Gly Leu

210 215 220

Pro Asn Gln Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Pro Gln Leu Val Ser Glu

225 230 235 240

Ile Pro Glu Lys Val Ile Gln Val Ala Cys Gly Gly Glu His Thr Val

245 250 255

Val Leu Thr Glu Asn Ala Val Tyr Thr Phe Gly Leu Gly Gln Phe Gly

260 265 270

Gln Leu Gly Leu Gly Thr Phe Leu Phe Glu Thr Ser Glu Pro Lys Val

275 280 285

Ile Glu Asn Ile Arg Asp Gln Thr Ile Ser Tyr Ile Ser Cys Gly Glu

290 295 300

Asn His Thr Ala Leu Ile Thr Asp Ile Gly Leu Met Tyr Thr Phe Gly 305 310 315 320

Asp Gly Arg His Gly Lys Leu Gly Leu Gly Leu Glu Asn Phe Thr Asn 325 330 335

His Phe Ile Pro Thr Leu Cys Ser Asn Phe Leu Arg Phe Ile Val Lys 340 345 350

Leu Val Ala Cys Gly Gly Cys His Met Val Val Phe Ala Ala Pro His 355 360 365

Arg Gly Val Ala Lys Glu Ile Glu Phe Asp Glu Ile Asn Asp Thr Cys 370 375 380

Leu Ser Val Ala Thr Phe Leu Pro Tyr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asn 385 390 395 400

Val Leu Gln Arg Thr Leu Ser Ala Arg Met Arg Arg Arg Glu Arg Glu 405 410 415

Arg Ser Pro Asp Ser Phe Ser Met Arg Arg Thr Leu Pro Pro Ile Glu 420 425 430

Gly Thr Leu Gly Leu Ser Ala Cys Phe Leu Pro Asn Ser Val Phe Pro 435 440 445

Arg Cys Ser Glu Arg Asn Leu Gln Glu Ser Val Leu Ser Glu Gln Asp 450 455 460

Leu Met Gln Pro Glu Glu Pro Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Met Thr Lys 465 470 475 480

Glu Ala Glu Ile Asp Asn Ser Ser Thr Val Glu Ser Leu Gly Glu Thr 485 490 495

Thr Asp Ile Leu Asn Met Thr His Ile Met Ser Leu Asn Ser Asn Glu 500 505 510

Lys Ser Leu Lys Leu Ser Pro Val Gln Lys Gln Lys Lys Gln Gln Thr 515 520 525

Ile Gly Glu Leu Thr Gln Asp Thr Ala Leu Thr Glu Asn Asp Asp Ser 530 535 540

Asp Glu Tyr Glu Glu Met Ser Glu Met Lys Glu Gly Lys Ala Cys Lys 545 550 555 560

Gln His Val Ser Gln Gly Ile Phe Met Thr Gln Pro Ala Thr Thr Ile 565 570 575

Glu Ala Phe Ser Asp Glu Glu Val Glu Ile Pro Glu Glu Lys Glu Gly 580 585 590

Ala Glu Asp Ser Lys Gly Asn Gly Ile Glu Glu Gln Glu Val Glu Ala 595 600 605

Asn Glu Glu Asn Val Lys Val His Gly Gly Arg Lys Glu Lys Thr Glu 610 615 620

Ile Leu Ser Asp Asp Leu Thr Asp Lys Ala Glu Val Ser Glu Gly Lys 625 630 635 640

Ala Lys Ser Val Gly Glu Ala Glu Asp Gly Pro Glu Gly Arg Gly Asp 645 650 655

Gly Thr Cys Glu Glu Gly Ser Ser Gly Ala Glu His Trp Gln Asp Glu 660 665 670

Glu Arg Glu Lys Gly Glu Lys Asp Lys Gly Arg Gly Glu Met Glu Arg 675 680 685

Pro Gly Glu Gly Glu Lys Glu Leu Ala Glu Lys Glu Glu Trp Lys Lys 690 695 700

Arg Asp Gly Glu Glu Gln Glu Gln Lys Glu Arg Glu Gln Gly His Gln 705 710 715 720

Lys Glu Arg Asn Gln Glu Met Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu His Gly 725 730 735

Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Asp Arg Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu Gly Glu Gly Lys Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Val Glu Gly Glu Arg 755 760 765

Glu Lys Glu Glu Gly Glu Arg Lys Lys Glu Glu Arg Ala Gly Lys Glu 770 775 780

Glu Lys Gly Glu Glu Glu Gly Asp Gln Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu 785 790 795 800

Thr Glu Gly Arg Gly Glu Glu Lys Glu Glu Gly Gly Glu Val Glu Gly 805 810 815

Gly Glu Val Glu Glu Gly Lys Gly Glu Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu 820 825 830

Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu 835 840 845

Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu 850 855 860

Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu 865 870 875 880

Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu 885 890 895

Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly 900 905 910

Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Gly 915 920 925

Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Asp Gly 930 935 940

Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Trp Glu Gly Glu Glu Glu 945 950 955 960

Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu 965 970 975

Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu 980 985 990

Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu 995 1000 1005

Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Val Glu Gly Glu 1010 1015 1020

Val Glu Gly Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu 1025 1030 1035 1040

Glu Glu Gly Glu Glu Arg Glu Lys Glu Gly Glu Gly Glu Glu Asn Arg 1045 1050 1055

Arg Asn Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Lys Tyr Gln Glu Thr 1060 1065 1070

Gly Glu Glu Glu Asn Glu Arg Gln Asp Gly Glu Glu Tyr Lys Lys Val 1075 1080 1085

Ser Lys Ile Lys Gly Ser Val Lys Tyr Gly Lys His Lys Thr Tyr Gln 1090 1095 1100

Lys Lys Ser Val Thr Asn Thr Gln Gly Asn Gly Lys Glu Gln Arg Ser 1105 1110 1115 1120

Lys Met Pro Val Gln Ser Lys Arg Leu Leu Lys Asn Gly Pro Ser Gly 1125 1130 1135

Ser Lys Lys Phe Trp Asn Asn Ile Leu Pro His Tyr Leu Glu Leu Lys 1140 1145 1150

<210> 5

<211> 199

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60 gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120 ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180 gtgctgtgtc agccccggt 199

Claims (20)

Patentni zahtevi

1. Nukleinska kiselina koja kodira skraćeni humani RPGR protein, gde je skraćeni humani RPGR protein bar 95% identičan sa punom dužinom SEK. ID. BR.:2.

2. Nukleinska kiselina prema zahtevu 1, gde:

nukleinska kiselina koja kodira skraćeni humani RPGR protein je pod kontrolom promotera humane rodopsin kinaze (hRK); gde

(a) hRK promoter sadrži SEK. ID. BR.:5; ili

(b) hRK promoter se suštinski sastoji od SEK. ID. BR.:5.

3. Nukleinska kiselina prema zahtevu 1 ili 2, što nukleinska kiselina kodira skraćeni humani RPGR protein koji sadrži SEK. ID. BR.:2.

4. Nukleinska kiselina prema bilo kom od zahteva 1 do 3, što nukleinska kiselina kodira skraćeni humani RPGR protein koji se sastoji od SEK. ID. BR.:2.

5. Nukleinska kiselina prema bilo kom od zahteva 1 do 4, što je nukleinska kiselina koja kodira skraćeni humani RPGR protein bar 95% identična sa punom dužinom SEK. ID. BR.:1.

6. Nukleinska kiselina prema bilo kom od zahteva 1 do 5, za upotrebu u tretiranju humanog subjekta koji ima X-povezanu pigmentnu retinopatiju (XLRP) ili neko drugo oftalmološko stanje usled mutacije gubitka funkcije gena koji kodira retinitis pigmentosa GTPaza regulatorni (RPGR) protein.

7. Virusni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema bilo kom od zahteva 1 do 5.

8. Virusni vektor prema zahtevu 7, koji je adeno-povezani virusni vektor, opciono gde je adeno-povezani virusni vektor AAV2 ili AAV8.

9. Virusni vektor prema zahtevu 8, gde je adeno-povezani virusni vektor AAV2/8.

10. Virusni vektor prema bilo kom od zahteva 7-9, za upotrebu u lečenju humanog subjekta koji ima X-povezanu pigmentnu retinopatiju (XLRP) ili neko drugo oftalmološko stanje usled mutacije gubitka funkcije gena koji kodira retinitis pigmentosa GTPaza regulatorni (RPGR) protein.

11. Izolovana ćelija domaćina koja sadrži virusni vektor prema zahtevima 7 do 9 ili nukleinsku kiselinu prema bilo kom od zahteva 1 do 5.

12. Izolovana ćelija domaćina prema zahtevu 11, gde ćelija eksprimuje skraćeni humani RPGR protein.

4

13. Adeno-povezani virusni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira skraćeni humani RPGR protein, gde je skraćeni humani RPGR protein bar 95% identičan sa punom dužinom SEK. ID. BR.:2, za upotrebu u lečenju humanog subjekta koji ima X-povezanu pigmentnu retinopatiju (XLRP) ili neko drugo oftalmološko stanje usled mutacije gubitka funkcije gena koji kodira retinitis pigmentosa GTPaza regulatorni (RPGR) protein.

14. Virusni vektor za upotrebu prema zahtevu 13, gde je nukleinska kiselina koja kodira skraćeni humani RPGR protein pod kontrolom promotera humane rhodopsin kinaze (hRK).

15. Virusni vektor za upotrebu prema zahtevu 13 ili 14, gde:

(a) hRK promoter sadrži ili sastoji se suštinski od SEK. ID. BR.:5; i/ili

(b) nukleinske kiseline koja kodira skraćeni humani RPGR protein koji sadrži ili se sastoji suštinski od sekvence koja je bar 95% identična sa SEK. ID. BR.: 1.

16. Virusni vektor za upotrebu prema bilo kom od zahteva 13-15, gde je adeno-povezani virusni vektor AAV2 ili AAV8.

17. Virusni vektor za upotrebu prema bilo kom od zahteva 13-15, gde je adeno-povezani virusni vektor AAV2/8

18. Virusni vektor za upotrebu prema bilo kom od zahteva 13 do 17, gde skraćeni humani RPGR protein sadrži SEK. ID. BR.:2.

19. Virusni vektor za upotrebu prema bilo kom od zahteva 13 do 18, gde skraćeni humani RPGR protein se sastoji od SEK. ID. BR.: 2.

20. Virusni vektor za upotrebu prema bilo kom od zahteva 13 do 19;

(a) gde upotreba obuhvata davanje nukleinske kiseline u niskoj dozi od oko 2 x 1010 vg/mL, srednjoj dozi od oko 2 x 1011 vg/mL, ili visokoj dozi od oko 2 x 1012 vg/mL; and/or

(b) gde je nukleinska kiselina davana u subretinalni prostor ;

opciono gde je mikroinjekciona kanila umetnuta u subretinalni prostor, temporalno optičkom nervu i baš iznad glavnog arkadnog suda, tako da protok tečnosti može biti usmeren ka makuli.