RS65983B1 - Postupci i kompozicije za lečenje kancera - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Pronalazak se odnosi na oblast kancera i određenije na polipeptide, kompozicije i njihovu upotrebu u medicini, naročito u prevenciji i/ili lečenju kancera .

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0002] Idealni lek za kancer treba da cilja funkciju koja nije suvišna koja je kontinuirano neophodna za održavanje tumora, ali neobaveznu za održavanje i funkciju bilo kog normalnog tkiva. Prema tome, najčešća logika je da se ciljaju genski proizvodi koji su specifično mutirani u kanceru, na osnovu toga da bi ovi mutantni molekuli bili verovatni "pokretači" kancera i, možda, manje kritični za normalna tkiva. Iz ovih razloga, velika pažnja je usmerena na katalogizaciju ponavljajućih lezija kod specifičnih tipova kancera. Nažalost, ovaj pristup ima nekoliko problema. Prvo, većina solidnih ljudskih karcinoma prolazi kroz epizode genomske nestabilnosti i ispoljava mutacionu buku (noise) koja može prikriti „pokretačke“ mutacije i njihove prateće efektorske puteve. Drugo, karcinomi su krajnji rezultat procesa koji uključuje prelaze kroz višestruka evoluciona uska grla. Svako usko grlo može zahtevati specifičnu vrstu mutacije čija je funkcija posle toga neophodna za održavanje tumora i, shodno tome, nije dobar terapeutski cilj nakon te tačke u evoluciji tumora.

[0003] Myc je osnovni protein heliks-petlja-heliks leucinskog zatvarača (helix-loophelix leucin zipper b-HLH-LZ) uključenog u rast i kontrolu kancera, koji funkcioniše u mreži sa strukturno srodnim proteinima Max, Mad i Mnt. Myc/Max dimeri aktiviraju transkripciju gena i izazivaju ćelijsku proliferaciju ili apoptozu. Mad/Max i Mnt/Max kompleksi deluju kao represori i izazvaju zastoj rasta i diferencijacije ćelija. Svi dimeri prepoznaju isto konsezusno mesto DNK, CACGTG E-boksa.

[0004] Myc je strogo regulisan u normalnim ćelijama, gde su njegovi nivoi veći u ćelijama koje se razmnožavaju, a niži u ćelijama koje se ne razmnožavaju . Neuobičajeno velika i/ili neregulisana aktivnost Myc-a je uzročno uključena u većinu kancera i često je u vezi sa agresivnim, slabo diferenciranim i angiogenim tumorima. Neregulisanost ekspresije Myc-a se javlja usled prekomerne ekspresije preko amplifikacija gena, gubitka transkripcione kontrole, poremećene degradacije ili povećane stabilizacije. Ovo dovodi do aberantne proliferacije, povećanja preživljavanja, promena u metabolizmu, angiogeneze i upale, što sve predstavlja glavne karakteristike kancera. Više ispitivanja je potvrdilo ključnu ulogu Myc-a u upravljanju intracelularnim i ekstracelularnim aspektima tumorigeneze, što sugeriše da bi ciljanje njegove funkcije bilo terapeutski vredno.

[0005] Poznato je da smanjenje Myc-a pomoću inhibitora BET bromodomena dovodi do regresije višestrukih tipova tumora. Iako ovaj pristup pokazuje dobar potencijal, on ima neka ograničenja kao što su toksičnost i brojni efekti van ciljanih. Mnogo malih molekula ometajući Myc/Max interakcije je pokazalo nisku specifičnost in cellulo.

[0006] Inhibitor Myc-a, međutim, tek treba da postane klinički dostupan i njegov plan ima različita objašnjenja da bi se sprečila pogrešna interpretacija: prvo, Myc je transkripcioni faktor jedra, do koga je posledično teže doći nego do membranskih ili citoplazmatskih molekula; drugo, Myc nema enzimsko "aktivno mesto" koje može da se cilja; treće, Myc familija sadrži 3 različita proteina, c-, N i L-Myc, što je u izvesnim uslovima funkcionalno suvišno, tako da svi od njih zahtevaju simultanu inhibiciju. Pored toga, postoji zagrinutost da bi inhibicija Myc-a izazvala ozbiljna sporedna dejstva inhibiranjem proliferacije normalnih tkiva. Zbog svih ovoih razloga, pravi je izazov priprema leka inhibitora Myc-a .

[0007] Omomik je dominantni-negativni mutant MYC-a koji sadrži b-HLH-LZ domen iz Myc-a i sadrži četiri aminokiselinske supstitucije u leucinskom zatvaraču Myc-a (Soucek, L. et al., 1998, Oncogene 17, 2463-2472; Soucek, L. et al. (2002), Cancer Res 62: 3507-3510). Aminokiselinske supstitucije E61T, E68I, R74Q, i R75N daju izmenjenu specifičnost dimerizacije proteina, koja zadržava sposobnost da se veže njegov prirodni Max i da se obrazuju homodimeri sa njim kao i heterodimeri sa divljim tipom c-, N-i L-Myc.

[0008] Zbog ovih osobina, Omomik je takođe u stanju da spreči Myc-zavisne genske transaktivacione funkcije i in vitro i in vivo negirajući sposobnošću Myc-a da vezuje svoje vezujuće mesto za prepoznavanje DNK, E boks. U isto vreme, Omomik jako potencira apoptozu izazvanu pomoću Myc-a na način zavisan od nivoa Myc-a i čime se pojačava aktivnost transrepresije aktivnosti Myc-a. Omomik prema tome sprečava vezivanje Myc-a za promoter E-boksova i transaktivaciju ciljnih gena dok se zadržava Miz-1-zavisno vezivanje za promotere i transrepresiju. U prisustvu Omomika, Myc interaktom se usmerava ka represiji i njegova aktivnost se menja od proonkogene u tumor supresivnu.

[0009] U EP2801370 A1 i WO 2014/180889 A1 je pokazano da sam peptid Omomik je u stanju da efikasno transdukuje kroz ćelijsku membranu i translocira se u jedro, u kome ispoljava svoje tumor supresivno dejstvo

[0010] Međutim, još uvek postoji potreba u stanju tehnike da se razviju novi i poboljšani terapeutski prilazi za lečenje kancera .

KRATKA SUŠTINA PRONALASKA

[0011] U prvom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid koji sadrži polipeptid SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein, ili funkcionalno ekvivalentnu varijantu pomenutog polipeptida koja ima stepen identičnosti u odnosu na SEQ ID NO: 1 veći od 90% i ima treonin na položaju koji odgovara položaju 61 iz SEQ ID NO: 1, izoleucin u položaju koji odgovara položaju 68 iz SEQ ID NO: 1, glutamin u položaju koji odgovara položaju 74 iz SEQ ID NO: 1 i asparagin u položaju koji odgovara položaju 75 iz SEQ ID NO: 1, i gde ostatak X u položaju koji odgovara položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein, gde pomenuta varijanta funkcionalnog ekvivalenta zadržava aktivnost supresije tumora SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein.

[0012] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na konjugat koji sadrži:

a. polipeptid ili varjantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema pronalasku i

b. hemijski deo koji olakšava ćelijsko preuzimanje polipeptida prema pronalasku ili varijantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema pronalasku.

[0013] U trećem aspektu, pronalazak se odnosi na polinukleotid koji kodira polipeptid prema pronalasku ili konjugat prema pronalasku.

[0014] U četvrtom aspektu, pronalazak se odnosi na vektor koji sadrži polinukleotid prema pronalasku.

[0015] U petom aspektu, pronalak se odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži polipeptid prema pronalsku, konjugat prema pronalasku, polinukleotid prema pronalasku ili vektor prema pronalasku.

[0016] U šestom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži farmaceutski efikasnu količinu polipeptida ili varijante funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema pronalasku, konjugata prema pronalasku, polinukleotida prema pronalasku, vektora prema pronalasku ili ćelije domaćina prema pronalasku, i farmaceutski prihvatljivog ekscipijenta.

[0017] U sedmom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid ili varijantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema pronalasku, konjugata prema pronalasku, polinukleotida prema pronalasku, vektora prema pronalasku, ćelije domaćina prema pronalasku ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku za upotrebu u medicini.

[0018] U osmom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid ili varijantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema pronalasku, konjugat prema pronalasku, polinukleotid prema pronalasku, vektor prema pronalasku, ćeliju domaćina prema pronalasku ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kancera.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0019]

Slika 1. Test vijabilnosti ćelija pokazuje da OmoCS (sadrži C89S promenu) inhibira rast U87 malignih ćelija glioma (A panel) i A549 ćelija adenokarcinoma pluća (B panel) efikasnije od Omomika (pri nižoj koncentraciji). Lipofektamin (Lipo) ne deluje. T-test je korišćen da se izračuna statistička značajnost. ** = P < 0.01,*** = P < 0.001

Slika 2. Test gustine ćelija pokazuje da OmoCA (sadrži C98A promeun) inhibira rast A549 ćelija adenokarcinoma pluća efikasno kao OmoCS (sadrži C98S promenu) u nižoj koncentraciji. Lipofektamin (Lipo) ne deluje.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0020] Autori prikazanog pronalaska su pronašli polipeptid SEQ ID NO: 1, u kojoj cisten u položaju 89 je zamenjen sa serinom, nazvan OmoCS, koji je u stanju da ispoljava supresivno dejstvo na tumor efikasnije od Omomika (Primer 1). Ovo supresivno dejsto na tumor je zadržano kada cistein u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 je zamenjen sa drugom aminokiselinom. Primer 2 pokazuje da polipeptid iz SEQ ID NO: 1, gde je cistein u položaju 89 zamenjen sa alaninom, nazvan OmoCA, ima isto supresivno dejstvo na tumor kao OmoCS.

Polipeptid prema pronalasku

[0021] Prema tome, u prvom aspektu pronalazak se odnosi na polipeptid koji sadrži polipeptid iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein, ili varijantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida koja ima stepen identičnosti u odnosu na SEQ ID NO: 1 veći od 90% i ima treonin u položaju koji odgovara položaju 61 iz SEQ ID NO: 1, izoleucin u položaju koji odgovara položaju 68 iz SEQ ID NO: 1, a glutamin u položaju koji odgovara položaju 74 iz SEQ ID NO: 1 i asparagin u položaju koji odgovara položaju 75 iz SEQ ID NO: 1, i gde ostatak X u položaju koji odgovara položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein, gde pomenuta varijanta funkcionalnog ekvivalenta zadržava supresivno dejstvo na tumor iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein.

[0022] SEQ ID NO: 1 odgovara

[0023] Polipeptid sekvence SEQ ID NO: 1 odgovara proteinskoj sekvenci Omomik-a, ali ostatak X u položaju 89 nije cistein. Izraz "Omomik", kako je ovde korišćen, odnosi se na polipeptid koji se sastoji od mutirane verzije bHLHZip domena Myc proteina koji nosi E61T, mutacije E68I, R74Q i R75N (gde je numeracija mutiranih položaja data u odnosu na sekvencu Myc regiona koje odgovaraju aminokiselinama 365-454 polipeptida kako je definisan pod pristupnim brojem NP_002458 u NCBI bazi podataka, izdate March 15, 2015). Sekvenca c-Myc obezbeđena u NCBI bazi podataka pod pristupnim brojem NP_002458 je dole prikazan (SEQ ID NO: 5), gde je region iz kog Omomik potiče prikazan podvučen:

[0024] Izraz "Myc", kako je ovde korišćeno, odnosi se na familiju faktora transkripcije koja uključuje c-Myc, N-Myc i L-Myc. Myc protein aktivira ekspresiju mnogo gena preko vezivanja na konsezusne sekvence CACGTG (Enhancer Box sekvence ili E-boksove) i regrutovanje histon acetil-transferaza ili HATs. Međutim, Myc može takođe delovati kao represor transkipcije. Vezivanjem Miz-1 faktora transkripcije i premeštanjem p300 koaktivatora, inhibira ekspresiju Miz-1 ciljnih gena. Myc takođe ima direktnu ulogu u kontroli replikacije DNK.

[0025] Myc b-HLH-LZ ili Myc osnovni region domena heliks-petlja-heliks leucinskog zatvarača odnosi se na region koji određuje Myc dimerizaciju sa Max proteinom i vezivanje za Myc-ciljane gene. Ovaj region odgovara aminokiselinama 365-454 humanog Myc i karakterisan je sa dva alfa heliksa povezana za petlju (Nair, S. K., & Burley, S. K., 2003, Cell, 112: 193-205).

[0026] U poželjnom izvođenju, polipeptid sadži polipeptid iz SEQ ID NO: 1 obuhvata, sadrži ili sastoji se suštinski od dole prikazane SEQ ID NO: 3.

[0027] U ovom kontekstu, "suštinski se sastoji" označava da specifični molekul ne bi sadržao bio koje dodatne sekvence koji bi menjale aktivnost SEQ ID NO: 3.

[0028] Pronalazak se odnosi na polipeptid koji obuhvata, sadrži ili sastoji se suštinski od SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein. Pomenuti polipeptid može poticati od domena bHLHZip bilo kog Myc proteina poznatog u stanju tehnike, uz uslov da su mutacije koje dovode do dejstva supresije tumora očuvane. Prema tome, polipeptid koji može biti korišćen u prikazanom pronalasku može poticati od bilo koje vrste sisara, uključujući ali bez ograničenja domaće i gajene životinje (krave, konje, svinje, ovce, koze, psa, mačake ili glodare) primata i ljudi. Poželjno, polipeptid prema pronalasku je izveden iz humanog Myc proteina (pristpupni broj NP_002458, objavljen 15. marta 2015).

[0029] U poželjnom izvođenju, pronalazak se odnosi na polipeptid koji se sastoji od polipeptida SEQ ID NO: 1 u kojoj ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein, ili varijantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida koja ima stepen identičnosti u odnosu na SEQ ID NO: 1 veći od 90% i ima treonin u položaju koji odgovara položaju 61 iz SEQ ID NO: 1, izoleucin u položaju koji odgovara položaju 68 iz SEQ ID NO: 1, glutamin u položaju koji odgovara položaju 74 iz SEQ ID NO: 1 i asparagin u položaju koji odgovara položaju 75 iz SEQ ID NO: 1, i gde ostatak X u položaju koji odgovara položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein, gde pomenuta varijanta funkcionalnog ekvivalenta zadržava supresivno dejstvo na tumor iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein.

[0030] Prema prikazanom pronalasku, ostatak u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 može biti bilo koja aminokiselina osim cisteina,

"Cistein", kako je ovde korišćeno, odnosi se na aminokiselinu formule HO2CCH(NH2)CH2SH. Kodirana je kodonima UGU i UGC. Izraz takođe obuhvata neprirodni cistein

[0031] Cistein može obrazovati disulfidne veze u homodimetnom obliku Omomika, pa će njegova mutacija u bilo koju drugu aminokiselinu dovesti do nemogućnosti obrazovanja disulfidne veze i vodiće do istih svojstava efikasnosti dobijenih sa OmoCS. Prema tome, ostatak u položaju 89 of SEQ ID NO: 1 može biti bilo koja prirodna, neprirodna ili sintetička aminokiselina osim cisteina, i posebno bilo koja aminokiselina koja može biti umrežena sa drugim monomerom polipeptida prema pronalasku da bi se obrazovao homodimer.

[0032] Izraz "aminokiselina " ili "ostatak" odnosi se na prirodne i sintetičke aminokiseline, kao i analoge aminokiselina i aminokiselinske mimetike koji funkcionišu na način sličan prirodnim aminokiselinama. Aminokiseline se ovde mogu pominjati ili njihovim uobičajenim simbolima od tri slova ili simbolima od jednog slova preporučenim od strane IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.

[0033] Izraz aminokiselina uključuje prirodne aminokiseline (Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val), neuobičajene prirodne aminokiseline i neprirodne (sintetičke) aminokiseline. Aminokiseline su poželjno u L Konfiguraciji, ali takođe D konfiguraciji, ili smeše aminokiselina u D i L konfiguracijama su uzete u obrzir.

[0034] Izraz "prirodne aminokiseline" obuhvataju alifatične aminokiseline (glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin), hidroksilovane aminokiseline (serin i treonin), sumporne aminokiseline (metionin), dikarboksilne aminokiseline i njihove amide (asparaginska kiselina, asparagin, glutaminska kiselina i glutamin), aminokiseline koje imaju dve bazne grupe (lizin, arginin i histidin), aromatične aminokiseline (fenilalanin, tirozin i triptofan) i ciklične aminokiseline (prolin). U izvođenju ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 je alifatična aminokiselina. U drugom izvođenju ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 je sumporna aminokiselina. U drugom izvođenju ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 je dikarboksilna aminokiselina i njihovi amidi. U drugom izvođenju ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 je aminokiselina koja ima dve bazne grupe. U drugom izvođenju ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 je aromatična aminokiselina. U drugom izvođenju ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 je ciklična aminokiselina. U poželjnom izvođenju ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 je hidroksilovana aminokiselina, poželjno serin. U poželjnom izvođenju, ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 je aminokiselina izabrana od serina, treonina i alanina, poželjno izabrana od serina i alanina.

[0035] Kako je ovde korišćeno, izraz "neprirodna aminokiselina" odnosi se na karboksilnu kiselinu, ili njen derivat, supstituisan sa amino grupom i koja je strukturno povezana sa prirodnom aminokiselinom. Ilustrativni, neograničavajući primeri modifikovanih ili neuobičajenih aminokiselina uključuju 2-aminoadipinsku kiselinu, 3-aminoadipinsku kiselinu, beta-alanin, 2-aminobuternu kiselinu, 4-aminobuternu kiselinu, 6-aminokapronsku kiselinu, 2-aminoheptansku kiselinu, 2-aminoizobuternu kiselinu, 3-aminoizobuternu kiselinu, 2-aminopimelinsku kiselinu, 2,4-diaminobuternu kiselinu, desmosin, 2,2’-diaminopimelinsku kiselinu, 2,3-diaminopropionsku kiselinu, N-etilglicin, N-etilasparagin, hidroksi lizin, alio hidroksi lizin, 3-hidroksiprolin, 4-hidroksiprolin, izodesmozin, aloizoleucin, N-metilglicin, N-metilizoleucin, 6-N-metillizin, N-metilvalin, norvalin, norleucin, ornitin, itd.

[0036] Ilustrativni, neograničavajući primeri neuobičajenih aminokiselina su Hidroksilizin i hidroksiprolin, Tiroksin, N-metil arginin i n-acetil lizin

[0037] U poželjnom izvođenju, ostatak X u položaju 89 je bilo koja druga aminokiselina koja ne može biti umrežena sa drugim monomerom polipeptida prema pronalasku da obrazuje homodimerni par.

[0038] U poželjnim izvođenju polipeptida prema pronalasku, ostatak u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 je aminokiselina serin.

[0039] "Serin", kako je ovde korišćeno, odnosi se na 2-Amino-3-hidroksipropansku kiselinu kodiranu kod ljudi kodonima UCU, UCC, UCA, UCG, AGU i AGC. Izraz takođe uključuje modifikovane serine kao što su fosforilovani ili sulfonovani serin, kao ilustrativni neograničavajuči primeri N-Benzoil-(2R,3S)-3-fenilizoserin, D-cikloserin, L-izoserin, fenil serin,

[0040] U poželjnom izvođenju, polippetid prema pronalasku sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2.

[0041] U još jednom poželjnom izvođenju, polipeptid prema pronalasku sadrži ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 4.

[0042] U poželjnijim izvođenjima polipeptida prema pronalasku, ostatak u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 je aminokiselinski alanin.

[0043] "Alanin", kako je ovde korišćeno, odnosi se na 2-Aminopropansku kiselinu koja je kodirana u ljudima kodonima GCU, GCC, GCA, i GCG. Izraz takođe obuhvata modifikovane alanine kao što su N-acetil-L-alanin.

[0044] U poželjnom izvođenju, polipeptid prema pronalasku sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 63.

[0045] U još jednom poželjnom izvođenju, polipeptid prema pronalasku sadrži ili se suštinski sastoji od SEQ ID NO: 64.

[0046] Izraz "varijanta funkcionalnog ekvivalenta", kada se odnosi na SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein, odnosi se na bilo koji polipeptid koji je rezultat brisanja, umetanja ili dodavanja jedne ili više aminokiselina u odnosu na polipeptid iz SEQ ID NO: 1 ili koji se dobija hemijskom modifikacijom polipeptida SEQ ID NO: 1 i koji zadržava supresivno dejstvo na tumor iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein, poželjno koji zadržava dejstvo OmoCS supresije na tumor. Stručnjak iz ove oblasti će razumeti da zadržavanje aktivnosti supresije na tumor zahteva da varijanta može dimerizovati sa Myc i/ili njegovim partnerom p21/p22Max i inhibirati aktivnost Myc jednom kada se nađe u jedru, da je sposobna da se translocira preko ćelijske membrane i da je sposobna da se translocira preko omotača (envelop) jedra. U nekim izvođenjima, varijanta funkcionalnog ekvivalenta polipeptida prema pronalasku homodimerizuje manje od Omomika, ili nije uterana u homodimere obrazovanjem disulfidnih mostova. Posebno obrazovanje disulfidnog mosta u obliku homodimera polipeptida prema pronalasku je manje nego u polipeptidu Omomika.

[0047] "Manje homodimerizacije", kako je ovde korišćeno odnosi se na novu sposobnost obrazovanja obaveznih homodimera polipeptida prema pronalasku čak u redukujućim uslovima. U poželjnom izvođenju, sposobnost je bar 5%, bar 10%, bar 15%, bar 20%, bar 25%, bar 30%, bar 35%, bar 40%, bar 45 %, bar 50%, bar 55%, bar 60%, bar 65%, bar 70%, bar 75%, bar 80%, bar 85%, bar 90%, bar 95% manja od sposobnosti obrazovanja homodimera Omomika. Redukujući uslovi, kako je ovde korišćeno odnose se na prisustvo redukcionog sredstva, jedinjenja koji daje elektron drugim hemijskim vrstama u redoks hemijskoj reakciji. Ilustrativni neograničavajući primeri redukujućih sredstava su DTT (ditiotreitol), b-merkaptoetanol ili TCEP (tris(2-karboksietil)fosfin). Moguće je da je količina homodimera ista in vitro, i da razlika između polipeptida prema pronalasku i Omomika je prisutna samo u ćelijama u prisustvu heterodimerizacionih partnera gde odsustvo disulfida omogućava potencijalno veće obrazovanje heterodimera.

[0048] Nekoliko testova može biti korišćeno da se odredi homodimerizacija pepetida, pomoću ilustrativnih neogranićavajućih primera termičkom denaturacijom kontrolisanom cirkularnim dohroizmom, tako da dimerizacija može biti detektovana preko kvantifikacije savijanja i termičke stabilnosti.

[0049] Pogodne varijante funkcionalnih ekvivalenata uključuje polipeptide koji se suštinski sastoje od polipeptida iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein.

[0050] U ovom kontekstu, "suštinski se sastoji" označava da specifični molekul ne bi sadržao bilo koje dodatne sekvence koje bi izmenile aktivnost SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein.

[0051] Pogodne funkcionalne varijante ciljanog peptida su one koje pokazuju stepen identičnosti u odnosu na peptid iz SEQ ID NO: 1 (poželjno OmoCS, SEQ ID NO: 4) veći od 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Stepen idetničnosti između dva polipeptida je određen pomoću kompjuterskih algoritma i postupaka koji su široko piznati osobama iz struke. Identitiet između dve aminokiselinske sekvence je poželjno određen pomoću BLASTP algoritma kako je ranije opisano [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 1990;215: 403-410]. U poželjnom izvođenju, identičnost sekvence je određena preko cele dužine polipeptida iz SEQ ID NO: 1 ili preko cele dužine varijante ili oba.

[0052] Varijante funkcionalnih ekvivalenata polipeptida prema pronalasku mogu takođe uključivati post-translacione modifikacije, kao što su glikozilacija, acetilacija, izoprenilacija, miristoilacija, proteolitička obrada, itd.

[0053] Alternativno, pogodne funkcionalane varijante ciljanih peptida su one u kojima jedan ili više položaja u okviru polipeptida prema pronalasku sadrže aminokiseline koje su konzervativne supstitucije aminokiselina prisutnih u gore pomenutom proteinu. "Konzervativne aminokiselinske supstitucije" su posledica zamene jedne aminokiseline sa drugom koja ima sličnu strukturu i/ili hemijske osobine. Na primer, svaka od sledećih šest grupa sadrži aminokiseline koje su konzervativne supstutucije jedna za drugu: 1) Alanin (A), Serin (S), Treonin (T); 2) Asparaginska kiselina (D), Glutaminska kiselina (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lizin (K); 5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); i 6) Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W). Odabir takvih konzervativnih aminokiselinskih supstitucija je u okviru umešnosti prosečenog stručnjaka iz ove oblasti i opisan je, na primer, od strane Dordo et al., (J. Mol. Biol, 1999, 217;721-739) and Taylor et al., (J. Theor. Biol., 1986, 119:205-218).

[0054] U poželjnom izvođenju, cela sekvenca varijante funkcionalnog ekvivalenta iz SEQ ID NO: 1 ne sadrži aminokiselinu cistein. Razume se da varijante funkcionalnih ekvivalenata iz SEQ ID NO: 1 gde je ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein sadrži mutacije u položajima koji odgovaraju mutacijama E61T, E68I, R74Q i R75N nađenim u Omomiku koji potiče iz humanog c-Myc. Položaj u kome pomenute mutacije su se javile u varijanti funkcionalnog ekvivalenta može biti određen pomoću višestrukog poravnavanja sekvence različitih sekvenci Myc-a i identifikovanja poravnavanjem onih položaja koji odgovaraju položajima 61, 68, 74 i 75 u okviru sekvence Omomika koji potiče iz humanog c-Myc.

[0055] Višestruko poravnanje sekvence je ekstenzija poravnavanja parova da bi se uključile više od dve sekvence istovremeno. Postupci višestrukog poravnavanja poravnavaju sve sekvence u datom ispitivanom skupu. Poželjni program višestrukog poravnavanja sekvence (i njegov algoritam) je ClustalW, Clustal2W ili ClustalW XXL (videti Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res 22:4673-4680). Jednom kada su sekvence c-Myc-a iz različitih organizama i varijante upoređivane (poravnavane) kako je ovde opisano, stručnjak iz ove oblasti može lako identifikovati položaje u okviru svake sekvence koja odgovara položajima E61T, E68I, R74Q i R75N nađene u Omomiku i uvedene u varijantue SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein, mutacije odgovaraju E61T, E68I, R74Q i R75N mutacijama nađenim u Omomiku koji potiče iz humanog c-Myc-a.

[0056] Pogodni testovi za određivanje da li se polipeptid može smatrati kao varijanta funkcionalnog ekvivalenta iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein uključuje, bez ograničenja:

-Testove koji mere kapacitet polipeptida da obrazuje dimerne komplekse sa Max i Myc, kao što su testovi zasnovani na ekspresiji reporter gena kako je opisano u Soucek et al. (Oncogene, 1998, 17: 2463 -2472) kao i u PLA (protein Ligation assay) ili Ko-imunoprecipitaciji.

-Testovi koji mere kapacitet polipeptida da veže mesto prepoznavanja Myc/Max u okviru DNK (CACGTG mesto), kao što je test pomaka elekroforetske mobilnosti (EMSA) opisan kod Soucek et al. (supra.).

-Testovi koji mere kapacitet potiskivanja Myc-izazvane transaktivacije, kao što je test zasnovan na ekspresiji reporter gena pod kontrolom vezujućih mesta DNK specifičnih za Myc/Max kako je opisano kod Soucek et al. (supra.).

-Testovi zasnovani na kapacitetu genskog proizvoda ili polipeptida da inhibira rast ćelija koje eksprimuju myc onkogen, kako je opisano kod Soucek et al. (supra.).

-Testovi koji mere sposobnost polipeptida da pospeše myc-indukovanu apoptozu, kao što su testovi opisani kod Soucek et al. (Oncogene, 1998: 17, 2463 -2472). Povrh toga, može biti korišćen bilo koji test opšte poznat u stanju tehnike za procenu apoptoze u ćeliji, kao što je Hoechst-ovo bojenje, Propidijum Jodid (PI) ili bojenje Aneksinom V, tripan plavo, DNK lestvice/fragmentacija i TUNEL.

[0057] U poželjnom izvođenju, varijanta funkcionalnog ekvivalenta iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein uključuje one sekvence koje imaju jednu ili više, poželjno dve sledeće karakteristike: sposobnost da se dimerizuju sa Myc i inhibirajući njegovu aktivnost, translokaciju duž ćelijkse membrane, translokaciju u jedro, nesposobnost da se obrazuju homodimeri ili smanji kapacitet da se obrazuju homodimeri u poređenju sa Omomikom, ćelijsku vijabilnost u in vitro testu kako je izvedeno u primeru 1 nižu od Omomika u količini od 12.5 nM iRNK koja kodira polipeptid prema pronalasku. U poželjnom izvođenju, varijanta funkcionalnog ekvivalenta pronalaska koja odgovara sekvenci koja posreduje u ćelijskoj vijabilnosti u in vitro testu kako je izvedeno u primeru 1 nižoj od Omomika u količini od 12.5 nM iRNK koja kodira polipeptid prema pronalasku.

[0058] U poželjnom izvođenju, polipeptid se smatra varijantom funkcionalnog ekvivalenta iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein ukoliko pokazuje aktivnost u jednom ili više gornjih testova koji je bar 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% aktivnosti SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein (poželjno aktivnosti OmoCS).

[0059] Dodatno, varijante funkcionalnih ekvivalenta iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein, su takođe u stanju da transdukuju ćelije pošto je varijanta u kontaktu sa pomenutim ćelijama.

[0060] U poželjnom izvođenju, polipeptid se smatra kao varijanta funkcionalnog ekvivalenta iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein ukoliko je u stanju da transdukuje ciljnu ćeliju bar 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% tako efikasno kao SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein (poželjno kao OmoCS, SEQ ID NO: 4).

[0061] Dodatno, varijantne funkcionalnih ekvivalenata iz SEQ ID NO: 1 u kojima ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein, su takođe u stanju da translociraju u jedro ciljne ćelije tumora.

[0062] U poželjnom izvođenju, polipeptid se smatra kao varijanta funkcionalnog ekvivalenta iz SEQ ID NO: 1 u kojoj ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein ukoliko je u stanju da translocira u jedro ciljih ćelija tumora bar 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili100% efikasno kao SEQ ID NO: gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein (poželjno kao OmoCS, SEQ ID NO: 4).

[0063] Pogodni testovi za određivanje da li polipeptid je varijanta funkcionalnog ekvivalenta iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein u smislu njegove sposobnosti da translocira preko ćelijske membrane i u jedro uključuje dvostruko obeležavanja ćelija sa reagensom specifičnim za polipeptid i sa bojom koja specifično obeležava jedro ćelije (kao što je DAPI ili Hoechst-ova boja). U poželjnom izvođenju, detekcija polipeptida prema pronalasku je izvedena pomoću konfokalnog mikroskopa ili pomoću fluorescentne mikroskopije.

[0064] Polipeptid prema pronalasku iz SEQ ID NO: 1 takođe sadrži M2 domen iz c-Myc-a, koji ima sekvencu RQRRNELKRSF (SEQ ID NO: 55) (videti Dang and Lee, Mol. Cell. Biol., 1988, 8:4048-4054), i koji odgovara signalu lokalizacije jedra.

[0065] U drugom poželjnom izvođenju, varijanta funkcionalnog ekvivalenta iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein sadrži sekvencu SEQ ID NO: 55.

[0066] Izraz "signal lokalizacije jedra", kako je ovde korišćen, odnosi se na aminokiselinsku sekvencu dužine oko 4-20 aminokiselinskih ostataka, koja služi da usmeri protein u jedro. Tipično, sekvenca lokalizacije jedra je bogata u aminokiselinama i sekvence date kao primer su dobro poznate u oblasti tehnike (Gorlich D. (1998) EMBO 5.17:2721-7).

[0067] U nekim izvođenjima, NLS jeizabran iz grupe koju čine SV40 veliki T Antigen NLS (PKKKRKV, SEQ ID NO: 6); Nukleoplasmin NLS (KRPAATKKAGQAKKKK, SEQ ID NO: 7); CBP80 NLS (RRRHSDENDGGQPHKRRK, SEQ ID NO: 8); HIV-I Rev protein NLS (RQARRNRRRWE, SEQ ID NO: 9); HTLVI Rex (MPKTRRRPRRSQRKRPPT, SEQ ID NO: 10); hnRNP A NLS (NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFKPRNQGGY, SEQ ID NO: 11); rpL23a NLS (VHSHKKKKIRTSPTFTTPKTLRLRRQPKYPRKSAPRRNKLDHY, SEQ ID NO: 12). U jednom izvođenju pronalaska, signal lokalizacije jedra sadrži motiv K (K/ R) X (K/ R) (SEQ ID NO: 13).

[0068] Dodatno varijantni funkcionalni ekvivalenti iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein su takođe u stanju da dosegnu jedro transdukovanih ćelija pošto je varijanta bila u kontaktu sa pomenutom ćelijom. Razume se da varijante funkcionalnih ekvivalenta iz SEQ ID NO: 1 u kojima ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein koji sadrži NLS nađen u SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein ili drugi funkcionalnu NLS. U drugom izvođenju polipeptid prema pronalasku ne sadrži prirodni NLS nađen u SEQ ID NO: 1 i sadrži dugi funkcionalni NLS koji zamenjuje pomenuti NLS nađen u SEQ ID NO: 1 ili u bio kom drugom delu polipeptida prema pronalasku.

Konjugat prema pronalasku

[0069] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na konjugat koji sadrži :

a) polipeptid ili varijantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema pronalasku i

b) hemijski deo koji olakšava preuzimanje od strane ćelije polipeptida prema pronalasku ili varijante funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema pronalasku.

[0070] Izraz "konjugat", kako je ovde korišćeno, odnosi se na dva ili više jedinjenja koja su kovalentno zajedno povezana tako da funkcija svakog jedinjenja je zadržana u konjugatu.

[0071] U poželjnim izvođenjima, konjugati prema pronalasku sadrže bar 1, bar 2, bar 3, bar 4, bar 5, bar 6, bar 7, bar 8, bar 9, bar 10 ili više hemijskih delova koji olakšavaju preuzimanje od strane ćelije polipeptida ili varijante funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida.

[0072] U jednom izvođenju, hemijski deo koji olakšava preuzimanje od strane ćelije polipeptida je lipid ili masna kiselina.

[0073] Masna kiselina je generalno molekul koji sadrži lanac ugljenika sa kiselim delom (npr., karboksilna kiselina) na kraju lanca. Lanac ugljenika masne kiseline može biti bilo koje dužine, međutim, poželjno je da dužina lanca ugljovodonika bude bar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više ugljenikovih atoma, i bilo koji opseg koji se može iz njega izvesti. U izvesnim izvođenjima, dužina ugljenikovog lanca je od 4 do 18 ugljenikovih atoma u delu lanca masne kiseline. U izvesnim izvođenjima lanac ugljenika masne kiseline može sadržati neparan broj ugljenikovih atoma, međutim, paran broj ugljenikovih atoma u lancu može biti poželjan u izvesnim izvođenjima. Masna kiselina koja sadrži samo jednogube veze u njenom ugljeničnom lancu naziva se zasićena, dok masna kiselina koja sadrži bar jednu dvostuku vezu u njenom lancu se naziva nezasićena. Masna kiselina može biti razgranata, mada u poželjnim izvođenjima prikazanog pronalaska je nerazgranata. Specifične masne kiseline uključuju, ali nisu ograničene samo na njih, linolnu kiselinu, oleinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, linolensku kiselinu, stearinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, arašidnu kiselinu, palmitoleinsku kiselinu, arahidonsku kiselinu.

[0074] U poželjnom izvođenju, hemijski deo koji olakšava preuzimanje od strane ćelije polipeptida je peptidna sekvenca koja prodire u ćeliju, u kom slučaju, konjugat je fuzioni protein koji sadrži polipeptid prema pronalasku ili varijantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida i peptidnu sekvencu koja prodire u ćeliju .

[0075] Izraz "fuzioni protein" odnosi se na proteine koji su dobijeni genskom tehnologijom koja se sastoji od dva ili više funkcionalnih domena koji potiču iz različitih proteina. Fuzioni protein može biti dobijen konvencionalni sredstvima, npr., pomoću genske ekspresije nukleotidne sekvence koja kodira pomenuti fuzioni peptid u pogodonoj ćeliji. Razume se da peptid koji prodire u ćeliju se odnosi na peptid koji prodire u ćeliju koji je različit od peptida koji prodire u ćeliju koji obrazuje deo polipeptida iz SEQ ID NO: 1 ili varijante funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida.

[0076] Izraz "peptidna sekvenca koja prodire u ćeliju" je korišćenu u prikazanom opisu zamenjivo sa "CPP", "domen transdukcije proteina" ili "PTD". Odnosi se na peptidni lanac promenjive dužine koji se odnosi na transport proteina unutar ćelije. Postupak dostavljanja u ćeliju se uobičajeno dešava endocitozom ali peptid može takođe biti unet u ćeliju pomoću direktne memebranske translokacije. CPPs tipično ima aminokiselinsku kompoziciju koja ili sadrži visoku relativnu rasprostranjenost pozitivno naelektrisanih aminokiselina kao što su lizin ili arginin ili ima sekvencu koja sadrži promenjivi uzorak polarnih/naelektrisanih aminokiselina i nepolarnih, hidrofobnih aminokiselina. Primeri CPPs koji mogu biti korišćeni u prikazanom pronalasku, uključuju, bez ograničenja, CPP nađen u proteinu Drosophila antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK; SEQ ID NO:14) , CPP nađen u virusu herpes simpleksa 1 (HSV-1) VP22 DNK-vezujućem proteinu (DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE; SEQ ID NO: 15), CPP iz Bac-7 (RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPG; SEQ ID NO: 16), CPPs iz HIV-1 TAT proteina koji se sastoji od aminokiselina 49-57 (RKKRRQRRR; SEQ ID NO: 17), aminokiselina 48-60 (GRKKRRQRRRTPQ; SEQ ID NO: 18), aminokiselina 47-57 (YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO: 19), CPP iz S413-PV peptida (ALWKTLLKKVLKAPKKKRKV; SEQ ID NO: 20), CPP iz penetratina (RQIKWFQNRRMKWKK; SEQ ID NO: 21), CPP iz SynB 1 (RGGRLSYSRRRFSTSTGR; SEQ ID NO: 22), CPP iz SynB3 (RRLSYSRRRF; SEQ ID NO:23), CPP iz PTD-4 (PIRRRKKLRRLK; SEQ ID NO: 24), CPP iz PTD-5 (RRQRRTSKLMKR; SEQ ID NO: 25), CPP iz FHV Coat-(35-49) (RRRRNRTRRNRRRVR; SEQ ID NO: 26), CPP iz BMV Gag-(7-25) (KMTRAQRRAAARRNRWTAR; SEQ ID NO: 27), CPP iz HTLV-II Rex-(4-16) (TRRQRTRRARRNR; SEQ ID NO:28), CPP iz D-Tat (GRKKRRQRRRPPQ; SEQ ID NO:29), CPP R9-Tat (GRRRRRRRRRPPQ; SEQ ID NO: 30), CPP iz MAP (KLALKLALKLALALKLA; SEQ ID NO: 31), CPP iz SBP (MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV; SEQ ID NO: 32), CPP iz FBP (GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; SEQ ID NO: 33), CPP iz MPG (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya; SEQ ID NO: 34), CPP iz MPG(ENLS) (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya; SEQ ID NO: 35), CPP iz Pep-1 (ac-KET-WWETWWTEWSQPKKKRKV-cya; SEQ ID NO: 36), CPP iz Pep-2 (ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya; SEQ ID NO: 37), poliargininska sekvenca koja ima strukturu RN (gde N je između 4 i 17), GRKKRRQRRR sekvenca (SEQ ID NO: 38), RRRRRRLR sekvenca (SEQ ID NO: 39), RRQRRTSKLMKR sekvenca (SEQ ID NO: 40); Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 41); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEQ ID NO: 42); RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 43), YGRKKRRQRRR sekvenca (SEQ ID NO: 44); RKKRRQRR sekvenca (SEQ ID NO: 45); YARAAARQARA sekvenca (SEQ ID NO: 46); THRLPRRRRRR sekvenca (SEQ ID NO: 47); GGRRARRRRRR sekvenca (SEQ ID NO: 48).

[0077] U poželjnom izvođenju, pomenuti peptid koji prodire u ćeliju nije endogeno sadržan u SEQ ID NO: 1.

[0078] U poželjnom izvođenju CPP je CPP iz HIV-1 TAT proteina koji se sastoji od aminokiselina 49-57 (RKKRRQRRR, SEQ ID NO: 49). U drugom poželjnom izvođenju CPP je GRKKRRQRRR sekvenca (SEQ ID NO: 50) ili RRRRRRRR (SEQ ID NO: 51).

[0079] U jednom izvođenju, peptidna sekvenca koja prodirire u ćeliju je spojena na N-kraju polipeptida prema pronalasku ili varijanti funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida. U drugom izvođenju, peptid koji prodire u ćeliju je spojen na C-kraju polipeptida prema pronalasku ili varijante funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida.

[0080] U poželjnim izvođenjima, konjugati ili fuzioni proteini prema pronalsku sadrže, pored svog pepetida koji prodire u ćeliju koji se nalazi u polipeptidu iz SEQ ID NO: 1 ili varijanti funkcionalnog ekvivalenta pomenutog peptida, bar 1, bar 2, bar 3, bar 4, bar 5, bar 6, bar 7, bar 8, bar 9, bar 10 ili više dodatnih peptida koji prodiru u ćeliju .

[0081] Pogodni fuzioni peptidi prema pronalasku uključuju polipeptide OmoCS*TAT i OmoCS*LZArg kako je dole definisano:

[0082] U drugom poželjnom izvođenju, konjugati ili fuzioni proteini prema pronalasku sadrže polipeptid prema pronalasku ili njegovu varijantu funkcionalnog ekvivalenta i dalje sadrže N-kraj ili C-kraj signala loklizacije jedra.

[0083] Stručnjak iz ove oblasti će znati da može biti poželjno da difuzioni protein dalje sadrži jedan ili više fleksibilnih peptida koji povezuju polipeptid prema pronalasku ili varijantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida, peptidnu sekvencu prodiranja u ćeliju i/ili NLS. Prema tome, u posebnom izvođenju polipeptid prema pronalasku je direktno povezan za peptidnu sekvencu koja prodire u ćeliju. U drugom posebnom izvođenju, polipeptid prema pronalasku je povezan za peptidnu sekvencu koja prodire u ćeliju preko fleksibilnog peptida. U izvođenju polipeptid prema pronalasku je direktno povezan za NLS. U drugom izvođenju polipeptid prema pronalasku je povezan za NLS preko fleksibilnog peptida.

[0084] U posebnom izvođenju polipeptid prema pronalasku je direktno povezan za peptidnu sekvencu koja prodire u ćeliju i NLS.

[0085] U jednom izvođenju, NLS je jedan od NLS koji se javlja endogeno u Myc sekvenci, kao što je M1 peptid (PAAKRVKLD, SEQ ID NO: 54) ili M2 peptid (RQRRNELKRSF, SEQ ID NO: 55).

[0086] U drugom izvođenju dodatni NLS odnosi se na NLS koji je različit od endogenog NLS nađenog u polipeptidu iz SEQ ID NO: 1 ili u varijanti funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida.

[0087] U poželjnim izvođenjima, konjugati ili fuzioni proteini prema pronalasku sadrže, pored endogenog NLS nađenog u polipeptidu prema pronalasku ili u njegovoj varijanti funkcionalnog ekvivalenta , bar 1, bar 2, bar 3, bar 4, bar 5, bar 6, bar 7, bar 8, bar 9, bar 10 NLS.

[0088] U drugom posebnom izvođenju, polipeptid prema pronalasku je povezan za peptidnu sekvencu koja prodire u ćeliju preko prvog fleksibilnog peptidnog linkera i za NLS preko drugog fleksibilnog peptidnog linkera.

[0089] Kako je ovde korišćeno, izraz "fleksibilni peptid", "spejser peptid" ili "linker peptid" odnosi se na peptid koji kovalentno vezuje dva proteina ili dela ali koji nije deo bilo polipeptida, dozvoljavajući pokretanje jednog u odnosu na drugi, bez izazivanja suštitnskog štetnog efekata na funkciji ili bilo koji protein ili deo. Prema tome, fleksibilni linker ne utiče na dejstvo supresije tumora polipeptidne sekvence, aktivnost prodiranja u ćeliju peptida koji prodire u ćeliju ili kapacitet lokalizacije jedra NLS.

[0090] Fleksibilni peptid sadrži bar jednu aminokiselinu, bar dve aminokiseline, bar tri aminokiseline, bar četiri aminokiseline, bar pet aminokiselina, bar šest aminokiselina, bar sedam aminokiselina, bar osam aminokiselina, bar devet aminokiselina, bar 10 aminokiselina, bar 12 aminokiselina, bar 14 aminokiselina, bar 16 aminokiselina, bar 18 aminokiselina, bar 20 aminokiselina, bar 25 aminokiselina, bar 30 aminokiselina, bar 35 aminokiselina, bar 40 aminokiselina, bar 45 aminokiselina, bar 50 aminokiselina, bar 60 aminokiselina, bar 70 aminokiselina, bar 80 aminokiselina, bar 90 aminokiselina, ili oko 100 aminokiselina. U nekim izvođenjuma fleksibilni peptid će dozvoliti kretanje jednog proteina u odnosu na drugi u cilju povećanja rastvorljivosti proteina i/ili da se poboljša njegova. Pogodni regioni linkera uključuju poli-glicin region, GPRRRR sekvencu (SEQ ID NO: 56) kombinacije ostataka glicina, prolina i alanina.

[0091] U nekim izvođenjima fuzioni protein prema pronalasku može sadržati dodatni hemijski deo koji uključuje, između ostalog, fluorescentne grupe, biotin, polietilen glikol (PEG), aminokiselinske analoge, neprirodne aminokiseline, fosfatne grupe, glikozilne grupe, radioizotopne obeleživače, i farmaceutske molekule. U drugim izvođenjima, heterologni polipeptid može sadržati jednu ili više hemijski reaktivnih grupa uključujući, između ostalih keton, aldehid, Cys ostatke i Lys ostatke.

[0092] U posebnom izvođenju, konjugati ili fuzioni proteini prema pronalasku sadrže oznaku (tag) vezanu za konjugat ili za domen C-terminala ili N-terminala pomenutog fuzionog proteina ili variante pomenutog polipeptida. Pomenuta oznaka je generalno peptidna ili aminokiselinska sekvenca koja može biti korišćena u izolaciji ili prečišćavanju pomenutog fuzionog proteina. Prema tome, pomenuta oznaka je u stanju da se veže za jedan ili više liganada, na primer, jedan ili više liganada afinitetne matrice kao što je hromatografski nosač ili sloj sa visokim afinitetom. Primer pomenute oznake je histidinska oznaka (His-tag ili HT), kao što je oznaka koja sadrži 6 ostataka histidina (His6 ili H6), koja se može vezati za kolonu od nikla (Ni2+) ili kobalta (Co2+) sa visokim afinitetom. His-tag ima poželjnu karakteristiku da može vezati svoje ligande pod uslovima koji su denaturišući za većinu proteina i koji remete protein-protein interakcije. Prema tome, može biti korišćen da ukloni protein mamac označen sa H6 nakon prekida protein-protein interakcija sa kojim je mamac učestvovao.

[0093] Dodatni ilustrativni, neograničavajući, primeri oznaka korisnih za izolovanje ili prečišćavanje fuzionog proteina uključuju Arg-tag, FLAG-tag (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 57), Strep-tag (WSHPQFEK; SEQ ID NO: 58), epitop koji je u stanju da bude prepoznat pomoću antitela, kao što je c-myc-tag (prepoznat pomoću anti-c-myc antitela), HA tag (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 59), V5 tag (GKPIPNPLLGLDST; SEQ ID NO: 60), SBP-tag, S-tag, peptid koji vezuje kalmodulin, domen koji vezuje celulozu, domen koji vezuje hitin, glutation S-transferazni-tag, protein koji vezuje maltozu, NusA, TrxA, DsbA, Avitag, etc. (Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 60:523-525), aminokiselinska sekvenca kao što je AHGHRP (SEQ ID NO: 61) ili PIHDHDHPHLVIHSGMTCXXC (SEQ ID NO: 62), β-galaktozidaza.

[0094] Oznaka može biti korišćena, ukoliko je potrebno, za izolaciju ili prečišćavanje pomenutog fuzionog proteina.

Polinukleotid, vektor i ćelija domaćina prema pronalasku

[0095] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na polinukleotidno kodiranje polipeptida prema pronalasku ili konjugat prema pronalasku.

[0096] Izrazi "polinukleotid", "nukleinska kiselina" i "molekul nukleinske kiseline" su sinonimi i odnose se na polimerne oblike nukleotida bilo koje dužine. Polinukleotidi mogu sadržati deoksiribonukleotide, ribonukleotide, i/ili njihove analoge. Nukleotidi mogu imati bilo koju trodimenzionalnu strukturu, i mogu imati bilo koju funkciju, poznatu i nepoznatu. Izraz "polinukleotid" uključuje, na primer, jednostruke, dvostruke i trostruke helikoidne molekule, gen ili genski fragment, egzone, introne, iRNK, tRNK, rRNK, ribozime, cDNK, rekombinantne polinukleotide, razgranate polinukleotide, plazmide, vektore, izolovane DNK bilo koje sekvence, izolovane RNK bilo koje sekvence, nukleinsko kiselinske sonde, i prajmere. Pored prirodnih molekula nukleinske kiseline, molekul nukleinske kiseline prema prikazanom pronalasku može sadžati modifikovane molekule nukleinske kiseline. Kako je ovde korišćeno, iRNK odnosi se na RNK koja se može prevesti u ćeliju.

[0097] U poželjnom izvođenju, polinukleotid prema pronalasku je iRNK. iRNK može biti hemijski sintetizovan, može biti dobijen pomoću in vitro transkripcije ili može biti sintetizovan in vivo u ciljnoj ćeliji. Nukleotidne sekvence koje obrazuju polinukleotid koji kodira konjugat ili fuzioni protein prema pronalasku su u isto vreme ispravni okvir čitanja za njihovu ekspresiju.

[0098] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na vektor koji sadrži polinukleotid prema pronalasku.

[0099] Izraz "vektor", kako je ovde korišćen, odnosi se na sekvencu nukleinskih kiselina koja sadrži neophodne sekvence tako da posle traskripcije i translacije pomenutih sekvenci u ćeliji stvoren je polipeptid kodiran polinukleotidom prema pronalasku. Pomenuta sekvenca je operativno vezana za dodatne segmente koji obezbeđuju njihovu autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina od interesa. Poželjno, vektor je ekspresioni vektor, koji je definisan kao vektor koji, pored regiona autonomnih replikacija u ćeliji domaćina, sadrži regione operativno vezane za nukleinsku kiselinu prema pronalasku i koji su u stanju da pospeše ekspresiju proizvoda nukleinske kiseline prema pronalasku. Vektori prema pronalsku mogu biti dobijeni pomoću široko poznatih tehnika u ovoj oblasti.

[0100] Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore, gole DNK ili RNK ekspresione vektore, plazmid, kozmid ili vektore faga, DNK ili RNK ekspresione vektore u vezi sa katjonskim kondenzacionim sredstvima, DNK ili RNK ekspresione vektore inkapsulirane u lipozome, i izvesne eukarotske ćelije, kao što su ćelije proizvođači. Pogodni vektori koji sadrže polinukleotid prema pronalasku su vektori koji potiču od ekspersionih vektora u prokariotama kao što su pUC18, pUC19, pBluescript i njihovi derivati, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCRl, RP4, fagi i "transfer" vektori pSA3 i pAT28, ekspresioni vektori u kvascu kao što su vektori tipa plazmidna 2-mikrona, integracionih plazmida, YEP vektora, centromernih plazmida i slično, ekspresioni vektori u ćelijama insekata kao što su vektori pAC serija i pVL serija, ekspresioni vektori u biljkama kao što su vektori serije pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE i slični i ekspresioni vektori u superiornim ćelijama eukariota zasnovanim na virusnim vektorima (adenovirus, virus povezan za adenovirus kao i retrovirus i, posebno, lentivirus) kao i nevirusni vektori kao što su pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL, pKSV10, pBPV-1, pML2d i pTDT1. U poželjnom izvođenju, polinukleotid prema pronalasku se nalazi u vektoru koji je izabran iz grupe koju čine pEGFP ili pBabe retrovirusni vektori i pTRIPZ ili pSLIK lentivirusni vektori.

[0101] Vektor prema pronalasku može biti korišćen da transformiše, transfektuje ili inficira ćelije koje mogu biti transformisane, transfektovane ili inficirane pomenutim vektorom. Pomenute ćelije mogu biti prokariotske ili eukariotske.

[0102] Vektor poželjno sadrži polinukleotid prema pronalasku operativno vezan za sekvence koje regulišu ekspresiju polinukleotida prema pronalasku. Regulatorne sekvence za korišćenje u prikazanom pronalasku mogu biti nuklearni promoteri ili alternativno, pospešivačke sekvence i/ili druge regulatorne sekvence koje povećavaju ekspresiju heterologne nuklensko kiselinske sekvence. U principu, bilo koji promoter može biti korišćen u prikazanom pronalasku uz uslov da je pomenuti promoter kompatibilan sa ćelijama u kojima polinukleotid treba da se eksprimuje. Prema tome, promoteri pogodni za realizovanje prikazanog pronalaska uključuju, ali nisu neophodno ograničeni na, konstitutivne promotere kao što su derivati eukariotskih virusnig genoma kao što su virus polioma, adenovirus, SV40, CMV, virus sarkoma ptica, hepatitis B virus, promotor gena metalotioneina, promotor gena timidin kinaze virusa herpes simpleksa, LTR regioni retrovirusa, promotor gena imunoglobulina, promotor gena aktina, promotor EF-1alfa gena kao i inducibilni promotori u kojima ekspresija proteina zavisi od adicije molekulskog ili egzogenog signala, kao što su tetraciklinski sistemi, NFκB/UV laki sistem, Cre/Lox sistem i promotori gena toplotnog šoka, regulisani promotori RNK polimeraze II opisani u WO/2006/135436 i promotori specifični za tkiva.

[0103] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži polipeptid prema pronalasku, konjugat prema pronalasku, polinukleotid prema pronalasku ili vektor prema pronalasku.

[0104] Ćelije pogodne za prikazani pronalazak uključuju, ali nisu ograničene na, ćelije sisara, biljaka, insekata, gljiva i bakterija. Bakterijske ćelije uključuju, ali bez ograničenja samo na njih, ćelije iz Gram-pozitivne bakterije kao što su vrste iz roda Bacillus, Streptomyces i Staphylococcus i ćelija iz Gram-negativne bakterije kao što su ćelije iz roda Escherichia i Pseudomonas. Ćelije gljiva poželjno uključuju ćelije kvasca kao što su Saccharomyces, Pichia pastoris i Hansenula polymorpha. Ćelije insekata uključuju, ali nisu ograničene na ćelije Drozofile i ćelije Sf9. Biljne ćelije uključuju, između ostaih, biljne ćelije useva kao što su žitarice, lekovitih ili ukrasnih biljki ili iz lukovice. Ćelije sisara pogodne za prikazani pronalazak uključuju epitelne ćelijske linije (svinjske, itd.), ćelijske linije osteosarkoma (humane, itd.), ćelijske linije neuroblastoma (humane, itd.), epitelijalnih karcinoma (humane, itd.), glijalne ćelije (mišje, etc.), ćelijske linije jetre (iz majmuna, itd.), CHO (Chinese Hamster Ovaryjajnika kiseskog hrčka) ćelije, COS ćelije, BHK ćelije, HeLa, 911, AT1080, A549, 293 ili PER.C6 ćelije, humane NTERA-2 ECC ćelije, D3 ćelije iz mESC linije, nehumane embrionske matične ćelije, NIH3T3, 293T, REH i MCF-7 ćelije i hMSC ćelije.

[0105] Svi izrazi i izvođenja prethodono opisana su jednako primenjiva na ovaj aspekt pronalaska.

Farmaceutska kompozicija prema pronalasku

[0106] U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži farmaceutski efikasnu količinu polipeptida ili varijantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema pronalasku, konjugat prema pronalasku, polinukleotid prema pronalasku, vektor prema pronalasku ili ćeliju domaćina prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.

[0107] Kako je korišćeno u prikazanom pronalasku, izraz "farmaceutska kompozicija" odnosi se na formulaciju koja je bila prilagođena za davanje prethodno određenje doze jednog ili nekoliko terapeutski korisnih sredstava u ćeliju, grupu ćelija, organ, tkivo ili životinju u kojoj je ćelijsko deljenje nekontrolisano, kao što je kancer.

[0108] Izraz "farmaceutski efikasna količina", kako je ovde korišćen, se smatra količinom koja je u stanju da obezbedi terapeutski efekat, i koja može biti određena od strane osobe iz struke pomoću uobičajenih sredstava. Količina polipeptida prema pronalasku ili njegove varijante funkcionalnog ekvivalenta, konjugata, polinukleotida, vektora ili ćelije domaćina prema pronalasku ili jedinjenja protiv tumora koja može biti kombinovana u farmaceutskim kompozicijama prema pronalasku će zavisiti od subjekta i posebno od načina davanja. Stručnjaci iz ove oblasti će znati da doze mogu takođe biti određene smernicama iz Goodman and Goldman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition (1996), Appendix II, pp. 1707-1711 and from Goodman and Goldman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition (2001), Appendix II, pp.475-493.

[0109] Odgovarajuća doza aktivnog principa ili aktivnih principa u okviru farmaceutske kompozicije će zavisiti od tipa kancera koji se leči, ozbiljnosti i toka bolesti, da li je kompozicija davana u preventivne ili terapeutske svrhe, ranije terapije, pacijentove kliničke istorije i reagovanja na peptid ili polipeptide, i diskrecionog prava nadležnog lekara. Količina polipeptida prema pronalasku ili njegove varijante funkcionalnog ekvivalenta, konjugata, polinukleotida, vektora ili ćelije domaćina prema pronalasku je pogodno davana pacijentu jednom ili tokom serije lečenja. U zavisnosti od tipa i ozbiljnosti bolesti, odgovarajući dozni nivo će generalno biti oko 0.01 do 500 mg po kg tela pacijenta po danu koji moće biti davan kao jedna ili više doza. Poželjno, dozni nivo će biti oko 0.1 do oko 250 mg/kg po danu; poželjnije oko 0.5 do oko 100 mg/kg po danu. Pogodni dozni nivo može biti oko 0.01 do 250 mg/kg po danu, oko 0.05 do 100 mg/kg po danu, ili oko 0.1 do 50 mg/kg po danu. U okviru ovog opsega doza može biti 0.05 do 0.5, 0.5 do 5 ili 5 do 50 mg/kg po danu. Za oralno davanje, kompozicije su poželjno obezbeđene u obliku tableta koje sadrže 1.0 do 1000 miligrama aktivnog sastojka, naročito 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0, i 1000.0 miligrama aktivnog sredstva za simptomatsko podešavanje doze za pacijenta koji se leči. Jedinjenja mogu biti davana u režimu 1 do 4 dana po danu, poželjno jednom ili dva puta dnevno.

[0110] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku takođe sadrže jedan ili nekoliko dodatnih farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata. "Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens" se podrazumeva da je terapeutski neaktivna supstanca za koju se kaže da se koristi za ugradnju aktivnog sastojka i koja je prihvatljiva za pacijenta sa farmakološke/toksikološke tačke gledišta i za farmaceutskog hemičara koji ih proizvodi sa fizičko-hemijske tačke gledišta u odnosu na sastav, formulaciju, stabilnost, prihvatanje pacijenta i biodostupnost. Ekscipijent ili nosač takođe uključuje bilo koju supstancu koja služi za poboljšanje isporuke i efikasnosti aktivnog principa unutar farmaceutske kompozicije. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju jedan ili više od vode, fiziološkog rastvora, fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom, dekstroze, glicerola i etanola, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid u kompoziciju. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu dalje da sadrže manje količine pomoćnih supstanci kao što su sredstva za vlaženje ili emulgatori, konzervansi ili puferi, koji povećavaju rok trajanja ili efikasnost fuzionog proteina ili kompozicija koje čine deo farmaceutskih kompozicija. Primeri odgovarajućih nosača su dobro poznati u literaturi (videti na primer Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). Primeri nosača bez ograničenja su serije saharida kao što su laktoza, dekstroza, saharoza, sorbitol, manitol, ksilitol, eritritol i maltitol; serija skroba kao što je kukuruzni skrob, pšenični skrob, pirinčani skrob i krompirov skrob; serija celuloze kao što je celuloza, metil celuloza, natrijum karboksi metil celuloza i hidroksil propilmetil celuloza; i niz punila kao što su želatin i polivinil pirolidon. U nekim slučajevima može se dodati sredstvo za raspadanje kao natrijum alginat.

[0111] Broj i priroda farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata zavise od željenog doznog oblika. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti su poznati stručnjacima iz ove oblasti (Fauli y Trillo C. (1993) "Tratado de Farmacia Galénica", Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid). Pomenute kompozicije mogu biti pripremljene pomoću konvencionalnih postupala poznatih u stanju tehnike ("Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition (2003) Genaro A.R., ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, US).

[0112] Za farmaceutske kompozicije koje sadrže agens koji je molekul nukleinske kiseline, molekul nukleinske kiseline može biti prisutan u bilo kom od različitih sistema za isporuku poznatih stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući nukleinsku kiselinu i ekspresione sisteme bakterija, virusa i sisara kao što su, na primer, rekombinantni ekspresioni konstrukti kao što je ovde dato. Tehnike za inkorporiranje DNK u takav ekspresioni sistem su dobro poznate stručnjaku iz ove oblasti. DNK može takođe biti "gola," kako je opisano, na primer, u Ulmer et al., Science 259:1745-49, 1993 i u pregledu Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. Preuzimanje „gole“ DNK može biti povećano oblaganjem DNK na biorazgradiva zrna, koja se efikasno transportuju u ćelije.

[0113] Molekuli nukleinske kiseline mogu biti dostavljeni u ćeliju prema bilo kom od nekoliko postupaka opisanih u tehnici (videti, npr., Akhtar et al., Trends Cell Bio.2:139 (1992); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., Mol. Membr. Biol. 16:129-40 (1999); Hofland and Huang, Handb. Exp. Pharmacol. 137:165-92 (1999); Lee et al., ACS Symp. Ser. 752:184-92 (2000); U.S. Pat. br. 6,395,713; Objava međunarodne patentne prijave br. WO 94/02595); Selbo et al., Int. J. Cancer 87:853-59 (2000); Selbo et al., Tumour Biol. 23:103-12 (2002); U.S. objave patentne priajve br.2001/0007666, i 2003/077829). Takvi postupci dostavljanja poznati stručnjacim iz ove oblasti tehnike, uključuju, ali nisu ograničeni na, inkapsulaciju u lipozome, jonotoforezom, ili inkorporacijom u druga sredstva za dostavljanje, kao što su biodegradabilni polimeri; hidrogelovi; ciklodekstrini (videti, npr., Gonzalez et al., Bioconjug. Chem. 10: 1068-74 (1999); Wang et al., International Application Publication Nos. WO 03/47518 i WO 03/46185); poli(mlečna-koglikolna)kiselina (PLGA) i PLCA mikrosfere (takođe korisne za dostavljanje peptida i polipeptida i drugih supstanci) (videti npr., U.S. Pat. No. 6,447,796; objava U.S. patentne prijave br. 2002/130430); biodegradabilne nanokapsule; i bioadhezivne mikrosfere, ili proteinskim vektorima (objava međunarodne prijave br. WO 00/53722). U drugom izvođenju, molekuli nukleinske kiseline za upotrebu i menjanju (suzbijanju i pospešivanju) imunog odgovora u imunoj ćeliji i za lečenje imunološke bolesti ili poremećaja mogu takođe biti formulisani ili kompleksirani sa polietileniminom i njegovim derivatima, kao što su polietilenimin-polietilenglikol-N-acetilgalaktozamin (PEI-PEG-GAL) ili polietilenimin-polietilenglikol-tri-N-acetilgalaktozamin (PEI-PEGtriGAL) derivati (videti takođe, npr, objava U.S. patentne prijave br.

2003/0077829).

[0114] U poželjnom izvođenju, farmaceutska kompozicija ili farmaceutska kombinacija prema pronalasku dalje obuhvata zajedno ili odvojeno antitumorsko sredstvo.

[0115] Kako je ovde korišćeno, "sredstvo protiv tumora" se smatra kao pomenuti biološko ili hemijsko jedinjenje koje leči tumore ili sprečava njihovo obrazovanje. U poželjnom izvođenju pomenuto sredstvo protiv tumora je izabrano iz grupe koju čine citotoksično sredstvo, antiangiogeno sredstvo, antimetastatičko sredstvo i antiproliferativno sredstvo.

[0116] Kako je korišćen u sadašnjem pronalasku, izraz "citotoksično sredstvo" odnosi se na sredstvo koje je u stanju da pospešuje ćelijsku smrt i koje ima svojstvo da smanjuje rast, zaustavlja rast ili uništava ćelije, a naročito ćelije koje se brzo dele i još određenije ćelije tumora. Ćelijska smrt može biti izazvana bilo kojim mehanizmom, kao što je na primer apoptoza, mada nije ograničena na ovaj uzrok, inhibicijom metabolizma, mešanjem u organizaciju citoskeleta ili hemijskom modifikacijom DNK. Izraz citotoksično sredstvo sadrži bilo koje hemoterapeutsko sredstvo uključujući male organske molekule, peptide, oligonukleotide; toksine; enzime; citokine; radioizotope ili radioterapijska sredstva.

[0117] "Antiangiogeno sredstvo" se podrazumeva kao hemijska ili biološka supstanca koja inhibira ili smanjuje obrazovanje novih krvnih sudova, tj., angiogeneze.

[0118] Antiangiogena sredstva koja mogu biti korišćena sa polipeptidom prema prvom aspeku pronalaska ili sa fuzionim proteinom prema drugom aspektu pronalaska uključuju, bez ograničenja, antiangiogeno sredstvo izabrano iz grupe koju čine paclitaksel, 2-metoksiestradiol, prinomastat, batimastat, BAY 12-9566, karboksiamidotriazol, CC-1088, dekstrometorfan sirćetna kiselina, dimetilksantenon sirćetna kiselina, endostatin, IM-862, marimastat, penicilamin, PTK787/ZK 222584, RPI.4610, skvalamin laktat, SU5416, talidomid, kombretastatin, tamoksifen, COL3, neovastat, BMS-275291, SU6668, anti-VEGF antitela, Medi-522 (Vitaksin II), CAI, interleukin 12, IM862, amilorid, angiostatin, Kl-3 angiostatin, Kl-5 angiostatin, kaptopril, DL-alfadifluorometilornitin, DL-alfa-difluorometilornitin HCl, endostatin, fumagillin, herbimicin A, 4-hidroksifenilretinamid, juglon, laminin, laminin heksapeptid, laminin pentapeptid, lavendustin A, medroksiprogesteron, minociklin, inhibitor placenta ribonukleaze, suramin, trombospondin, antitela usmerena protiv proangiogenih faktora (na primer, Avastin, Erbitux, Vectibiks, Herceptin); inhibitori tirozin kinase niske molekulske mase proangiogenih faktora rasta (na primer Tarceva, Neksavar, Sutent, Iresa); inhibitori mTOR (na primer Torisel); interferon alfa, beta i gama, IL-12, inhibitori metaloproteinaza matriksa (na primer, COL3, marimastat, batimastat); ZD6474, SUl1248, vitaksin; inhibitori PDGFR (na primer Gleevec); NM3 i 2-ME2; ciklopeptidi kao što je cilengitid.

[0119] "Antimetastatsko sredstvo" se smatra da je hemijska ili biološka supstanca koja inhibira ili smanjuje metastaze, tj., dalje napredovanje, u osnovi limfom ili krvotokom, ćelija koje izazivaju kancer, i rast novih tumora na određenim mestima pomenutih metastaza.

[0120] "Antiproliferativno sredstvo" se smatra da je hemijska ili biološka supstanca koja je u stanju da spreči ili inhibira obrazovanje ili rast tumora . Antiproliferativna sredstva uključuju ,ali nisu ograničena samo na (i) antimetabolite kao što su antimetaboliti folne kiseline (aminopterin, denopterin, metotreksat, edatreksat, trimetreksat, nolatreksed, lometreksol, pemetreksed, raltitreksed, piritreksim, pteropterin, leukovorin, 10-propargil-5,8-dideazafolat (PDDF, CB3717)), purinski analozi (kladribin, klofarabin, fludarabin, merkaptopurin, pentostatin, tioguanin) i analoga pirimidina (kapecitabin, citarabin ili ara-C, decitabin, fluorouracil, 5-fluorouracil, doksifluridin, floksuridin i gemcitabin) (ii) prirodni proizvodi, kao što su antitumorski antibiotici i mitotički inhibitori kao što su vinka alkaloidi kao što su vindesin, vinkristin, vinblastin, vinorelbin; taksani kao što su paclitaksel (Taxol<™>), docetaksel (Taxotere<™>); kolhicin (NSC 757), tiokolhicin (NSC 361792), derivati kolhicina (npr., NSC 33410), i alokolhicin (NSC 406042); halihondrin B (NSC 609395); dolastatin 10 (NSC 376128); maitansin (NSC 153858); rhizoksin (NSC 332598); epotilon A, epotilon B; diskodermolid; estramustin; nokodazol; (iii) hormoni i njihovi antagonisti kao što su tamoksifen, toremifen, anastrozol, arzoksifen, lazofoksifen, raloksifen, nafoksidin, fulvestrant, aminoglutetimid, testolakton, atamestan, eksemestan, fadrozol, formestan, letrozol, goserelin, leuprorelin ili leuprolid, buserelin, histrelin, megestrol i fluoksimesteron; (iv) biološka sredstva, kao što su virusni vektori, interferon alfa i interleukini; (v) jedinjenja na bazi platine kao što su karboplatin, cisplatin [cisdiamindihloroplatinum, (CDDP)], oksaliplatin, iproplatin, nedaplatin, triplatin tetranitrat, tetraplatin, satraplatin (JM216), JM118 [cis amin dihloro (II)], JM149 [cis amin dihloro (cikloheksilamin) trans dihidrokso platinum (IV)], JM335 [trans amin dihloro dihidrokso platina (IV)], transplatin, ZD0473, cis, trans, cis-Pt(NH3)(C6H11NH2)(OOCC3H7)2Cl, malanat-l,2-diaminocikloheksanoplatin(II), 5-sulfosalicilat-trans-(l,2-diaminocikloheksan)platin (II) (SSP), poli-[(trans-l,2-diaminocikloheksan)platin]-karboksiamiloza (POLY-PLAT) i 4-hidroksisulfonilfenilacetat (trans-1,2-diaminocikloheksan) platinum (II) (SAP) i (vi) DNK-alkilirajući lekovi kao što su azotni iperiti, nitrozouree, etileniminski derivativi, alkil sulfonati i triazeni, uključujući, ali bez ograničenja na, ciklofosfamid (Cytoxan<™>), busulfan, improsulfan, piposulfan, pipobroman, melfalan (L-sarkolizin), hlorambucil, mehloretamin ili mustin, uramustin ili uracil mustard, novembihin, fenesterin, trofosfamid, ifosfamid, karmustin (BCNU), lomustin (CCNU), hlorozotocin, fotemustin, nimustin, ranimnustin, semustin (metil-CCNU), streptozocin, tiotepa, trietilenmelamin, trietilentiofosforamin, prokarbazin, altretamin, dakarbazin, mitozolomid i temozolomid.

[0121] U slučaju farmaceutskih kompozicija ili kombinacija prema pronalasku koje sadrže sredstvo protiv tumora, kompozicije mogu biti predstavljene kao pojedinačna formulacija (na primer, kao tableta ili kapsula koja sadrži fiksnu količinu svake od komponenti) ili mogu, sa druge strane, biti prikazane kao odvojene formulacije koje se kasnije kombinuju za zajedničko, sekvencionalno ili odvojeno davanje. Kompozicije ili kombinacije prema pronalsku takođe uključuju formulaciju kao kit iz delova u kome su komponente formulisane odvojeno ali su spakovane u isti sud. Osobe iz struke će znati da formulacija različitih jedinjenja u slučaju druge farmaceutske kompozicije prema pronalsku može biti slična, drugim rečima, slično formulisana (u tablete ili pilule), što omogućava njihovo davanje na isti način. U slučaju kada su različite komponente pronalaska formulisane odvojeno, dve komponente mogu se nalaziti u blisteru. Svaki blister sadrži lekove koji se moraju konzumirati tokom dana. Ako se lekovi moraju davati nekoliko puta dnevno, lekovi koji odgovaraju svakoj primeni mogu se staviti u različite delove blistera, po mogućstvu beležeći u svakom delu blistera doba dana kada ih treba primeniti. Alternativno, komponente kompozicije pronalaska mogu biti drugačije formulisane tako da se različite komponente različito primenjuju. Stoga je moguće da je prva komponenta formulisana kao tableta ili kapsula za oralnu primenu, a druga komponenta je formulisana za intravensku primenu ili obrnuto. Odnos između komponenti koje su deo kompozicija koje se koriste u drugoj farmaceutskoj kompoziciji prema pronalasku može da podesi stručnjak u zavisnosti od antitumorskog sredstva koje se koristi u svakom konkretnom slučaju, kao i od željene indikacije. Dakle, pronalazak predviđa kompozicije u kojima odnos količina dve komponente može da se kreće od 50:1 do 1:50, posebno od 20:1 do 1:20, od 1:10 do 10:1, ili od 5 :1 do 1:5.

[0122] Farmaceutske kompozicije ili kombinacije prema pronalasku mogu biti davane na bilo koji način, kao što je oralno davanje, lokalno davanje, inhalacijom ili parenteralno davanje tako da farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti neophodni za formulaciju željenog doznog oblika mogu biti uključeni. Poželjan način davanja pomenutih farmaceutskih kompozicija je endovensko davanje.

[0123] "Oralno davanje" podrazumeva da se farmaceutska kompozicija unosi u organizam nakon gutanja. U posebnom izvođenju, farmaceutska kompozicija pronalaska može biti u doznom obliku pogodnom za oralnu primenu, bilo da je čvrsta ili tečna. Dozni oblici pogodni za njihovu primenu oralnim putem mogu biti tablete, kapsule, sirupi ili rastvori, i mogu sadržati bilo koji konvencionalni ekscipijent poznat u tehnici, kao što su vezivna sredstva, na primer sirup, akacija, želatin, sorbitol ili polivinilpirolidon; sredstva za punjenje, na primer laktoza, šećer, kukuruzni skrob, kalcijum fosfat, sorbitol ili glicin; lubrikansi za kompresiju, na primer, magnezijum stearat; sredstva za dezintegraciju, na primer skrob, polivinilpirolidon, natrijum glikolat skroba ili mikrokristalna celuloza; ili farmaceutski prihvatljiva sredstva za vlaženje kao što je natrijum lauril sulfat. Čvrste oralne kompozicije se mogu pripremiti pomoću konvencionalnih procesa mešanja, punjenja ili komprimovanja. Ponavljajuće operacije mešanja mogu se koristiti za potpunu distribuciju aktivnog sredstva u onim kompozicijama koje koriste velike količine sredstava za punjenje. Navedene operacije su konvencionalne u tehnici. Tablete se mogu pripremiti, na primer, vlažnom ili suvom granulacijom, i opciono premazivanjem prema postupcima poznatim u uobičajenoj farmaceutskoj praksi, posebno sa enteričkom oblogom.

[0124] S druge strane, "lokalno davnje" se podrazumeva kao primena nesistemskim putem, i uključuje primenu farmaceutske kompozicije pronalaska spolja na epidermu, u usnoj duplji i ukapavanje pomenutog preparata u uši, oči i nos , i kod kojih ne ulazi značajno u krvotok. "Sistemski put" se podrazumeva kao oralno, intravensko, intraperitonealno i intramuskularno davanje. Pod "inhalacijom" se podrazumeva davanje intranazalno i oralnom inhalacijom. Dozni oblici pogodni za pomenutu primenu, kao što je formulacija u aerosolu ili inhalator sa meračom doze, mogu se pripremiti pomoću konvencionalnih tehnika. U jednom rešenju, način primene je intranazalni put.

[0125] Kako se ovde koristi, termin "parenteralno" uključuje primenu intravensku, intraperitonealnu, intramuskularnu ili subkutanu. Subkutani, intramuskularni i intravenski oblici doziranja za parenteralnu primenu su generalno poželjni.

[0126] U jednom izvođenju, farmaceutske kompozicije pronalaska mogu biti prilagođene za njihovu parenteralnu primenu, kao što su sterilni rastvori, suspenzije ili liofilizovani proizvodi u odgovarajućem obliku jedinične doze. Farmaceutske kompozicije pogodne za injekcionu upotrebu obuhvataju sterilne vodene rastvore (kada su rastvorljivi u vodi), ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporanu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Za njegovu primenu intravenskim putem, neki pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor puferovan sa fosfatom (PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora biti sterilna, i mora biti tečna do te mere da postoji mogućnost lakog ubrizgavanja. Mora biti stabilna u uslovima pripreme i skladištenja i mora biti zaštićena od kontaminacije mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, farmaceutski prihvatljiv poliol kao što je glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, korišćenjem prevlake kao što je lecitin, održavanjem veličine čestica koja je potrebna u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Prevencija delovanja mikroorganizama može se postići uz pomoć različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava, na primer, parabena, hlorobutanola, fenola, askorbinske kiseline, tiomersala. U većini slučajeva biće poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere; polialkohole kao što su manitol, sorbitol; ili natrijum hlorid u kompoziciju. Produžena apsorpcija kompozicija za injektiranje može biti uzrokovana uključivanjem agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum i želatin monostearat.

[0127] Sterilni rastvori za injekcije se mogu pripremiti ugrađivanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u pogodan rastvarač sa jednim ili kombinacijom prethodno navedenih sastojaka, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija filtracijom kroz sterilne membrane. Generalno, disperzije se pripremaju ugrađivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i ostatak potrebnih sastojaka između onih koji su prethodno navedeni. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, poželjni procesi pripreme su sušenje u vakuumu i liofilizacija koji daju prah sa aktivnim sastojkom plus bilo koji željeni dodatni sastojak iz prethodno filtriranog sterilnog rastvora istog.

[0128] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu biti pogodno davane pomoću pulsne infuzije, na primer, smanjenjem doza kompozicije. Poželjno, doza je davana injekcijama, poželjnije intravenskim ili subkutanim injekcijama, delimično u zavisnosti od toga da li je primena akutna ili hronična .

[0129] U jednom izvođenju, prve ili druge farmaceutske kompozicije pronalaska su pripremljene sa nosačima koji će zaštititi navedeni polipeptid od brze eliminacije iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate i mikrokapsulirane sisteme za davanje. Mogu se koristiti biorazgradivi biokompatibilni polimeri kao što su etilen vinilacetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Postupci za pripremu navedenih formulacija biće jasni za osobe sa iskustvom u ovoj oblasti. Materijali mogu takođe biti komercijalno dobijeni u Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.

[0130] Kompozicije sa produženim oslobađanjem takođe uključuju preparate kristala antitela suspendovanih u pogodnim formulacijama koje mogu da održavaju kristale u suspenziji. Ovi preparati, kada se ubrizgavaju subkutano ili intraperitonealno, mogu proizvesti efekat odloženog oslobađanja. Druge kompozicije takođe uključuju antitela zarobljena u lipozomima. Lipozomi koji sadrže takva antitela se pripremaju pomoću poznatih metoda kao što su Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949.

[0131] Uprkos činjenici da polipeptid prema pronalasku i konjugati i fuzioni proteini koji sadrže polipeptid prema pronalasku mogu da se translociraju kroz biološke membrane, stručnjak će razumeti da takođe može biti pogodno formulisati konjugate ili fuzione proteine koji sadrže polipeptide pronalaska u nanočestice.

[0132] Kako se ovde koristi, izraz "nanočestica" se odnosi na bilo koji materijal koji ima dimenzije u opsegu od 1-1,000 nm. U nekim izvođenjima, nanočestice imaju dimenzije u opsegu 2-200 nm, poželjno u opsegu 2-150 nm, a još poželjnije u opsegu 2-100 nm.

[0133] Nanočestice mogu doprineti očuvanju integriteta polipeptida u biološkim tečnostima dok ne dospe do ciljnog organa. Štaviše, u slučaju kompozicija koje sadrže antitumorski agens, inkapsulacija kompozicije može smanjiti sekundarne efekte izazvane antitumorskim agensom. Na kraju, nanočestice se takođe mogu modifikovati tako da uključuju delove koji omogućavaju ciljanje nanočestice na organ od interesa.

[0134] Prema tome, u drugom izvođenju, farmaceutske kompozicije prema pronalasku sadrže konjugate, fuzione proteine i kompozicije prema pronalsku koje obrazuju deo nanočestice.

[0135] Pogodne nanočestice koje se mogu koristiti u kontekstu ovog pronalaska uključuju materijale nanorazmera kao što su nanočestice zasnovane na lipidima, superparamagnetna nanočestica, nanoljuske, poluprovodnički nanokristal, kvantna tačka, nanočestica na bazi polimera, nanočestica na bazi silikona, nanočestica na bazi silicijum-dioksida, nanočestica na bazi metala, fuleren i nanocev.

[0136] Ciljana isporuka se može postići dodavanjem liganada bez ugrožavanja sposobnosti nanočestica da isporuče svoje polipeptidno opterećenje. Pretpostavlja se da će to omogućiti isporuku specifičnim ćelijama, tkivima i organima. Specifičnost ciljanja sistema za isporuku zasnovanu na ligandu zasniva se na distribuciji receptora liganda na različitim tipovovima ćelija. Ciljni ligand može biti ili nekovalentno ili kovalentno povezan sa nanočesticom, i može se konjugovati sa nanočesticama različitim metodama kako je ovde diskutovano.

[0137] Primeri proteina ili peptida koji mogu biti korišćeni za ciljane nanočestice uključuju transferin, laktoferrin, TGFβ, nervni faktor rasta, albumin, HIV Tat peptid, RGD peptid, i insulin, kao i druge.

[0138] Podrazumeva se da formulacija proizvoda pronalaska u nanočestici nije namenjena ili nije namenjena isključivo da olakša pristup proizvoda unutrašnjosti ćelije, već da zaštiti proizvod od degradacije i/ili da olakša ciljanje nanočestice u organ od interesa.

[0139] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku su pogodne za davanje bilo kojoj vrsti sisara, poželjno čoveku.

[0140] Svi prethodno opisani izrazi i izvođenja su podjednako primenjivi na ovaj aspakt pronalaska.

Medicinske upotrebe

[0141] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid ili varijantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema pronalasku, konjugat prema pronalasku, polinukleotid prema pronalasku, vektor prema pronalasku, ćeliju domaćina prema pronalasku ili farmaceutski preparat prema pronalasku za upotrebu u medicini.

[0142] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid ili varijantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema pronalasku, konjugat prema pronalasku, polinukleotid prema pronalasku, vektor prema pronalasku, ćeliju domaćina prema pronalasku ili farmaceutski preparat prema pronalasku za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kancera.

[0143] "Prevencija" se podrazumeva kao davanje jedinjenja u inicijalnoj ili ranoj fazi bolesti, ili takođe da spečii početak.

[0144] Izraz "lečenje" je korišćen da da odredi davanje jedinjenja za kontrolu progresije bolesti pre ili posle pojave kliničkih znakova. Kontrola progresije bolesti se podrazumeva kao korisni ili željeni klinički rezultati koji uključuju, ali nisu ograničeni na smanjenje simptoma, smanjenje trajanja bolesti, stabilizaciju patoloških stanja (posebno izbegavanje dodatnog oštećenja), odlaganje progresije bolesti, poboljšanje patološkog stanja i remisiju (delimična i potpuna). Kontrola progresije bolesti podrazumeva i produženje preživljavanja u odnosu na očekivano preživljavanje ako se lečenje ne primenjuje.

[0145] "Subjekat", kako se ovde koristi, uključuje bilo koju životinju koja ima kancer ili pokazuje simptom ili kancer, ili je izložena riziku da ima kancer ili pokazuje simptome kancera. Pogodni subjekti (pacijenti) uključuju laboratorijske životinje (kao što su miš, pacov, zec ili zamorac), životinje sa farme i domaće životinje ili kućni ljubimci (kao što su mačka ili pas). Uključeni su nehumani primati i, poželjno, ljudi.

[0146] Termin "kancer" se odnosi na bolest koju karakteriše nekontrolisana deoba ćelija (ili povećanje preživljavanja ili otpornost na apoptozu), sposobnost navedenih ćelija da napadnu druga susedna tkiva (invazija) ili širenje na druga područja telo gde se ćelije normalno ne nalaze (metastaze) kroz limfne i krvne sudove. U zavisnosti od toga da li se tumori mogu širiti invazijom i metastazama ili ne, oni se klasifikuju kao benigni ili maligni: benigni tumori su tumori koji se ne mogu širiti invazijom ili metastazama, tj. rastu samo lokalno; dok su maligni tumori tumori koji se mogu širiti invazijom i metastazama. Polipeptidi prema ovom pronalasku su korisni za lečenje lokalnih i malignih tumora. Kako se ovde koristi, termin kancer uključuje, ali nije ograničen na, sledeće tipove kancera: kancer dojke; kancer bilijarnog trakta; kancer bešike; kancera mozga uključujući glioblastome i meduloblastome; kancer grlića materice; horiokarcinom; kancer debelog creva; kancer endometrijuma; kancer jednjaka; kancer želuca; hematološke neoplazme uključujući akutnu limfocitnu i mijelogenu leukemiju; T-ćelijska akutna limfoblastna leukemija/limfom; leukemija dlakastih ćelija; hronična mijelogena leukemija, multipli mijelom; leukemije povezane sa AIDS-om i T-ćelijsku leukemiju/limfom kod odraslih; intraepitelne neoplazme uključujući Bovenovu bolest i Pagetovu bolest; kancer jetre; kancer pluća; limfomi uključujući Hodžkinovu bolest i limfocitne limfome; neuroblastome; oralni karcinom uključujući karcinom skvamoznih ćelija; karcinom jajnika uključujući one koji nastaju iz epitelnih ćelija, stromalnih ćelija, polnih ćelija i mezenhimalnih ćelija; kancer pankreasa; kancer prostate; kancer rektuma; sarkomi uključujući leiomiosarkom, rabdomiosarkom, liposarkom, fibrosarkom i osteosarkom; kancer kože uključujući melanom, karcinom Merkelovih ćelija, Kaposijev sarkom, karcinom bazalnih ćelija i karcinom skvamoznih ćelija; kancer testisa uključujući germinalne tumore kao što su seminom, neseminom (teratomi, horiokarcinomi), stromalni tumori i tumori polnih ćelija; karcinom štitne žlezde uključujući adenokarcinom štitne žlezde i medularni karcinom; i kancer bubrega uključujući adenokarcinom i Vilmsov tumor. Drugi kanceri će biti poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. U poželjnom izvođenju, kancer koji se leči je kancer pluća, poželjno adenokarcinom pluća, poželjnije adenokarcinom pluća vođen Kras-om.

[0147] U poželjnom izvođenju kancer je solidni tumor.

[0148] Sve kombinacije jedinjenja prema pronalasku i tipovi kancera su uključeni u prikazanu prijavu.

[0149] U poželjnom izvođenju, kancer je izabran iz grupe koju čine glioblastom i kancer nemalih ćelija pluća.

[0150] "Glioblastom", takođe poznat kao glioblastom i astrocitom stepena IV, je najčešći i najagresivnih kancer koji počinje u mozgu.

[0151] Izraz "NSCLC" ili "kancer nemalih ćelija pluća", kako je ovde korišćen, odnosi se na grupu heterogenih bolesti zajedno grupisanih jer njihova prognoza i kontrola je gotovo identična prema histološkoj klasifikaciji Svetske zdravstvene organizacije /Međunarodnog udruženja za ispitivanje kancera pluća (Travis WD et al. Histological typing of lung and pleural tumours.3rd ed. Berlin: Springer-Verlag, 1999):

1. karcinom skvamoznih ćelija (SCC), čini od 30% do 40% NSCLC, počinje u većim disajnim kanalima ali raste sporije što znači da veličina ovih tumora varira od dijagnoze.

2. adenokarcinom je najuobičajeniji podtip NSCLC, koji čini od 50% do 60% NSCLC, koji počinje blizu površine za izmenu gasova pluća i koji uključuje podtip bronhioalveolarnog karcinoma, koji može imati različite odgovore na lečenje.

3. karcinom velikih ćelija je oblik koji brzo raste blizu površine pluća. To je prvenstveno dijagnoza isključenja i kada se uradi više istraživanja, obično se reklasisifikuje u karcinom skvamoznih ćelija i adenokarcinom

4. adenoskvamozni karcinom je tip kancera koji sadrži dva tipa ćelija: skvamoznih ćelija (tankih, ravnih ćelija koje oblažu izvesne organe) i ćelija sličnih žlezdi.

5. karcinomi sa pleomorfnim, sarkomatoidnim ili sarkomatoznim elementima. Ovo je grupa retkih tumora koji odražavaju kontinuitet u histološkoj heterogenosti, kao i epitelnu i mezenhimsku diferencijaciju.

6. karcinoidni tumor je sporo rastući neuroendokrini tumor pluća i počinje u ćelijama koje su sposobne da oslobađaju hormon kao odgovor na stimulus koji pruža nervni sistem.

7. karcinomi tipa pljuvačne žlezde počinju u ćelijama pljuvačne žlezde koje se nalaze unutar velikih disajnih puteva pluća.

8. neklasifikovani karcinomi uključuju kancere koji se ne uklapaju u bilo koje gore pomenute kategorije kancera pluća.

[0152] Svi prethodno opisani termini i izvođenja su podjednako primenjivi na ovaj aspekt pronalaska.

[0153] Dole je pronalazak detaljno opisan pomoću sledećih primera koji služe samo za ilustraciju i nije namera da ograniče obim pronalaska.

PRIMERI

Materijali i Postupaci

Transfekcija ćelija sa Omomikom i OmoCS iRNK

[0154] iRNK iz Omomika i OmoCS mutanta je nabavljena kod Trilink Biotechnologies u koncentracijama od 0.782 mg/mL i 0.876 mg/mL tim redom (ARCA kapiran i potpuno supstituisan sa 5-metil-C i modifikovanim pseudo-U).

[0155] Ili Omomik ili OmoCS DNK sekvenca je uvedena u vektor nishodno od promotera T7 RNK polimeraze i poli(T) repa lociranog na 3p kraju. 5-Metilcitidin-5"-trifosfat i pseudouridin-5’-trifosfat modifiikovana-RNK je proizvedena preko in vitro transkripcije pomoću T7 RNK polimeraze. RNK je takođe kapirana pomoću [3’-0-Mem7G(5’)ppp(5’)G] RNK analoga strukture kape. Šablon DNK vektora je degradiran pomoću DNKaze i zaostali trifosfat je uklonjen tretiranjem fosfatazom. RNK proizvod je zatim prečišćen i integritet i količina su procenjeni elektroforezom na agaroznom gelu Nanodrop-om tim redom. RNK je. Čuvan na -80°C. Lipofektaminski Messenger MAX transfekcioni reagens je nabavljen od Thermo Fisher Scientific. A549 i U87 ćelijske linije su zasejane na 500 i 1000 ćelija po bunarčiću, tim redom, na ploče od 96 bunarčića. Ćelije su gajene u Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) obogaćenom sa 10% govešeg seruma fetusa (FBS) i 1% L-glutamina (potpun medijum). Posle 24 sata, ćelije su bile transfektovane sa lipofektamin-iRNK kompleksima. 3 μg RNK za svaka 2 μL lipofektamina su odvojeno razblaženi u medijumu bez seruma i inkubirani u toku 10 minuta. iRNK i lipofektaminska razblaženja su zatim pomešana i inkubirana u toku 5 minuta da bi se omogućilo obrazovanje kompleksa. Bunarčići su isprani sa medijumom bez seruma dva puta. Ćelije su serijski razblažene polazeći od 1 μg do 0.0625 μg iRNK po bunarčiću u 100 μL ukupnog medijum bez seruma. Za svaku koncentraciju, kontrolne ćelije su tretirane samo sa lipofektaminom i triplikati su korišćeni za svako stanje. Posle 4 sata transfekcije, medijum bez seruma i iRNK-lipofektamin kompleksi su uklonjeni iz bunarčiča i zasmenjeni sa kompletnim medijumom. Ćelije su inkubirane u toku 3 dana. Zatim, vijabilnost je proceđena korišćenjem CellTiter-Blue iz Promege. Apsorbanca u odnosu na netretirane bunarčiće je izračunavana za svako stanje. Statistička značajnost je izračunata pomoću t-testa.

Transfekcija ćelija sa OmoCS i OmoCA iRNK

[0156] iRNK za OmoCS i OmoCA mutant je nabavljen od Trilink Biotechnologies (ARCA kapiran i potpuno supstituisan sa 5-metil-C i pseudo-U modifikovanim). iRNK koncentracije za OmoCS i OmoCA su određeni na 0.845mg/mL i 0.832mg/mL retrospektivno korišćenjem Nanodropa. Lipofektamin MessengerMAX transfekcioni Reagens je nabavljen iz Thermo Fisher Scientific. A549 ćelije su zasejane 500 ćelija po ploči sa 96 bunarčića. Ćelije su gajene u Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medijumu obogaćenom sa 10% goveđeg životinjskog seruma (FBS) i 1% L-glutamina (kompletan medijum). Posle 24 sata ćelije su transfektovane sa lipofektamin-iRNK kompleksima. 2 μg iRNK za svakog 1.5 μL lipofektamina su odvojeno razblaženi u medijumu koji je bez seruma i inkubirani u toku 10 minuta. iRNK i lipofektaminska razblaženja su zatim promešana i inkubirana u toku 5 minuta da se dozvoli obrazovanje kompleksa. Bunarčići su isprani sa medijumom bez seruma dva puta. Ćelije su tretirane sa serijskim 1:2 razblaženjima polazeći od 1 μg iRNK po bunarčiću u 50 μL ukupnog medijuma bez seruma (200nM). Za svaku koncentraciju, ćelije su ili netretirane (nisu tretirane) ili tretirane sa samo lipofektaminom (Lipo samo) kao kontrolni bunarčići. Triplikati su prethodno obrazovani za svaki uslov. Posle 4 sata transfekcije, medijumi bez seruma i iRNK-lipofektaminski kompleksi su uklonjeni iz bunarčića i supstituisani sa kompletnim RPMI medijumom. Ćelije su inkubirane u toku 3 dana. U toj tački, procenjivana je gustina ćelije pomoću bojenja kristalno ljubičastim. Absorbanca u odnosu na netretirane bunarčiće je izračunata za svaku koncentraciju.

Primer 1

[0157] Izneneđujuće, OmoCS mutant pokazuje veću inhibiciju ćelijskog rasta u odnosu na originalnu Omomik sekvencu u niskoj koncentraciji (Slika 1). Ovo poboljšava efikasnost u poređenju sa originalnom Omomik sekvencom što može biti bar parcijalno objašnjeno hipotezom da oksidovani interfacijalni cistein Omomik homodimera će sprečiti heterodimerizaciju Omomika sa Myc ili sa Max, ograničavanjem aktivnosti Omomika na puku kompeticiju za vezivanje E-boksa. Umesto toga, OmoCS mutant će favorizovati druge biološke aktivnosti Omomika pospešivanjem obrazovanja heterodimernih populacija.

Primer 2

[0158] Iznenađujuće, OmoCA mutant ponaša se baš kao OmoCS u istom testu proliferacije (Slika 2).

Hebron

FUNDACI PRIVADA INSTITUCI CATALANA DE RECERCA I ESTUDIS AVAN ATS

<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER <130> P13088PC00

<150> EP 16382339

<151> 2016-07-15

<160> 64

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 90

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polypeptide

<220>

<221> VARIANT

<222> (89)..(89)

<223> Xaa may be any amino acid except Cysteine

<400> 1

Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln

1 5 10 15

Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile

20 25 30

Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu

50 55 60

Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His

65 70 75 80

33

Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Xaa Ala

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polypeptide

<400> 2

Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln 1 5 10 15

Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile 20 25 30

Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys 35 40 45

Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu 50 55 60

Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His 65 70 75 80

Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Ala

85 90

<210> 3

<211> 91

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polypeptide

<220>

<221> VARIANT

<222> (90)..(90)

<223> X may be any amino acid except Cysteine

<400> 3

Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Va 3l4 Leu Glu Arg 1 5 10 15

Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45

Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60

Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80

His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Xaa Ala

85 90

<210> 4

<211> 91

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polypeptide

<400> 4

Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15

Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30

Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45

Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60

Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80

His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Ala

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Met Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met 1 5 10 15

Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp 20 25 30

Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln 35 40 45

Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile 50 55 60

Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg 65 70 75 80

Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser 85 90 95

Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp 100 105 110

Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln 115 120 125

Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile 130 135 140

Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val 145 150 155 160

Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser 165 170 175

Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr 180 185 190 36

Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala 210 215 220

Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser 225 230 235 240

Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His 245 250 255

Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu 260 265 270

Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro 275 280 285

Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys 290 295 300

Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His 305 310 315 320

Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala 325 330 335

Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser 340 345 350

Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn 355 360 365

Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu 370 375 380

Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu 385 390 395 400

Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys 37 Ala Thr Ala 405 410 415

Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln 435 440 445

Leu Arg Asn Ser Cys Ala

450

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SV40 large T Antigen NLS

<400> 6

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nucleoplasmin NLS

<400> 7

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CBP80 NLS

<400> 8

Arg Arg Arg His Ser Asp Glu Asn Asp Gly Gly Gln Pro His Lys Arg 1 5 10 15 38

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HIV-I Rev protein NLS

<400> 9

Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Trp Glu

1 5 10

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HTLV-I Rex

<400> 10

Met Pro Lys Thr Arg Arg Arg Pro Arg Arg Ser Gln Arg Lys Arg Pro 1 5 10 15

Pro Thr

<210> 11

<211> 37

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hnRNP A NLS

<400> 11

Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly 1 5 10 15

Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Lys Pro Arg 20 25 30

<211> 43

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> rpL23a NLS

<400> 12

Val His Ser His Lys Lys Lys Lys Ile Arg Thr Ser Pro Thr Phe Thr 1 5 10 15

Thr Pro Lys Thr Leu Arg Leu Arg Arg Gln Pro Lys Tyr Pro Arg Lys 20 25 30

Ser Ala Pro Arg Arg Asn Lys Leu Asp His Tyr

35 40

<210> 13

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NLS sequence

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(2)

<223> replace="R or K"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)..(4)

<223> replace="R or K"

<400> 13

Leu Xaa Xaa Xaa

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP found in Drosophila antennapedia protein <400> 14

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15

<210> 15

<400> 15

000

<210> 16

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of Bac-7

<400> 16

Arg Arg Ile Arg Pro Arg Pro Pro Arg Leu Pro Arg Pro Arg Pro Arg 1 5 10 15

Pro Leu Pro Phe Pro Arg Pro Gly

20

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of the HIV-1 TAT protein

<400> 17

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5

<210> 18

<211> 13 41 <212> PRT

<223> CPP of the HIV-1 TAT protein

<400> 18

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Thr Pro Gln

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of the HIV-1 TAT protein

<400> 19

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of S413-PV peptide

<400> 20

Ala Leu Trp Lys Thr Leu Leu Lys Lys Val Leu Lys Ala Pro Lys Lys 1 5 10 15

Lys Arg Lys Val

20

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of penetratin

<400> 21

Arg Gln Ile Lys Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp 42 Lys Lys 1 5 10 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of SynB1

<400> 22

Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15

Gly Arg

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of SynB3

<400> 23

Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe

1 5 10

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of PTD-4

<400> 24

Pro Ile Arg Arg Arg Lys Lys Leu Arg Arg Leu Lys

1 5 10

<210> 25

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220> 43

<223> CPP of PTD-5

Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg

1 5 10

<210> 26

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of the FHV Coat-(35-49)

<400> 26

Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg 1 5 10 15

<210> 27

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of BMV Gag-(7-25)

<400> 27

Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp 1 5 10 15

Thr Ala Arg

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of HTLV-II Rex-(4-16)

<400> 28

Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg

1 5 10

<210> 29 44 <211> 13

<223> CPP of D-Tat

<400> 29

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1 5 10

<210> 30

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP R9-Tat

<400> 30

Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1 5 10

<210> 31

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of MAP

<400> 31

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu Lys Leu 1 5 10 15

Ala

<210> 32

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of SBP

<400> 32

45

Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

20 25

<210> 33

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of FBP

<400> 33

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

20 25

<210> 34

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of MPG

<400> 34

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

20 25

<210> 35

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of MPG(ENLS)

<400> 35

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Se 46r Thr Met Gly 1 5 10 15

<210> 36

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of Pep-1

<400> 36

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val

20

<210> 37

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of Pep-2

<400> 37

Lys Glu Thr Trp Phe Glu Thr Trp Phe Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15

Lys Lys Arg Lys Val

20

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP

<400> 38

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP

<400> 39

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Arg

1 5

<210> 40

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP

<400> 40

Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg

1 5 10

<210> 41

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP

<400> 41

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

20 25

<210> 42

<211> 33

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP 48

Leu Ala Lys His Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Cys Glu 20 25 30

Ala

<210> 43

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP

<400> 43

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP

<400> 44

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP

<400> 45

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP

<400> 46

Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala

1 5 10

<210> 47

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP

<400> 47

Thr His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 48

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP

<400> 48

Gly Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 49

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HIV-1 TAT protein

<400> 49

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 50 1 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP

<400> 50

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP

<400> 51

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 52

<211> 101

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> OmoCS*TAT

<400> 52

Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15

Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30

Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45

Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 51

His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Ala Gly Arg Lys Lys Arg 85 90 95

Arg Gln Arg Arg Arg

100

<210> 53

<211> 99

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> OmoCS*LZArg

<400> 53

Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15

Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30

Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45

Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60

Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80

His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ser Ala Arg Arg Arg Arg Arg 85 90 95

Arg Arg Arg

<210> 54

<211> 9

<212> PRT 52

<213> Artificial Sequence

Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp

1 5

<210> 55

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> M2 peptide

<400> 55

Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe

1 5 10

<210> 56

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> poly-glycine region

<400> 56

Gly Pro Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 57

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FLAG-tag

<400> 57

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 58

<211> 8 53 <212> PRT

<223> Strep-tag

<400> 58

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HA tag

<400> 59

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 60

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> V5 tag

<400> 60

Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10

<210> 61

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Tag sequence

<400> 61

Ala His Gly His Arg Pro

1 5

<210> 62 54 <211> 21

<223> tag sequence

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)..(20)

<223> Xaa can be any natural occurring amino acid

<400> 62

Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val Ile His Ser Gly Met 1 5 10 15

Thr Cys Xaa Xaa Cys

20

<210> 63

<211> 90

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Polypeptide

<400> 63

Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln 1 5 10 15

Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile 20 25 30

Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys 35 40 45

Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu 50 55 60

Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His 65 70 75 80

Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ala Ala

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> OmoCA

<400> 64

Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15

Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30

Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45

Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60

Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80

His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Ala Ala

85 90

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Polipeptid koji sadrži polipeptid SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein, ili varijantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida koja ima stepen identičnosti u odnosu na SEQ ID NO: 1 veći od 90% i ima treonin u položaju koji odgovara položaju 61 SEQ ID NO: 1, izoleucin u položaju koji odgovara položaju 68 iz SEQ ID NO: 1, a glutamin u položaju koji odgovara položaju 74 iz SEQ ID NO: 1 i asparagin u položaju koji odgovara položaju 75 iz SEQ ID NO: 1, i gde ostatak X u položaju koji odgovara položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein, gde pomenuta varijanta funkcionalnog ekvivalenta zadržava supresivno dejstvo na tumor iz SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein.

2. Polipeptid prema zahtevu 1, gde varijanta funkcionalnog ekvivalenta može dimerizovati sa Myc i/ili njegovim obaveznim partnerom p21/p22Max i inhibira Myc aktivnost onda kada se nađe u jedru, koji je u stanju da translocira preko ćelijske membrane i preko omotača jedra.

3. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, gde je pomenuti polipeptid izabran iz grupe koju čine:

a) polipeptid koji se sastoji od polipeptida SEQ ID NO: 1 gde ostatak X u položaju 89 iz SEQ ID NO: 1 nije cistein ili se sastoji od varijante funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema zahtevu 1; i

b) polipeptid koji se sastoji od polipeptida iz SEQ ID NO: 3 gde ostatak X u položaju 90 iz SEQ ID NO: 3 nije cistein.

4. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde ostatak X je serin ili alanin.

5. Polipeptid prema zahtevu 4 koji se sastoji od SEQ ID NO: 4.

6. Konjugat koji sadrži:

a. polipeptid ili varijantu funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema bilo kom od zahteva 1-5 i

b. hemijski deo koji olakšava ćelijsko preuzimanje polipeptida prema bilo kom od zahteva 1-5 ili varijante funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5.

7. Konjugat prema zahtevu 6, gde hemijski deo koji olakšava ćelijsko preuzimanje polipeptida ili varijante funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida je peptidna sekvenca koja prodire u ćeliju i gde pomenuta peptidna sekvenca koja prodire u ćeliju i pomenuti peptid ili varijanta funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida obrazuju fuzioni protein, poželjno peptidna sekvenca koja prodire u ćeliju je izabrana iz grupe koju čine GRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 38) i RRRRRRLR (SEQ ID NO: 39).

8. Konjugat prema bilo kom od zahteva 6 ili 7 dalje obuhvata signal lokalizacije jedra, naročito signal lokalizacije jedra je izabran iz grupe koju čine PKKKRKV (SEQ ID NO: 6), PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 54) i KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 7).

9. Polinukleotid koji kodira polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 5 ili konjugat prema bilo kom od zahteva 6 do 8.

10. Vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 9.

11. Ćelija domaćina koja sadrži polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 5, konjugat prema bilo kom od zahteva 6 do 8, polinukleotid prema zahtevu 9 ili vektor prema zahtevu 10.

12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži farmaceutski efikasnu količinu polipeptida ili varijante funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema bilo kom od zahteva 1 do 5, konjugat prema bilo kom od zahteva 6 do 8, polinukleotid prema zahtevu 9, vektor prema zahtevu 10 ili ćeliju domaćina prema zahtevu 11, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.

13. Polipeptid ili varijanta funkcionalnog ekvivalenta pomenutog polipeptida prema bilo kom od zahteva 1 do 5, konjugat prema bilo kom od zahteva 6 do 8, polinukleotid prema zahtevu 9, vektor prema zahtevu 10, ćelija domaćina prema zahtevu 11 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 12 za upotrebu u medicini.

14. Polipeptid ili varijanta njegovog funkcionalnog ekvivalenta prema bilo kom od zahteva 1 do 5, konjugat prema bilo kom od zahteva 6 do 8, polinukleotid prema zahtevu 9, vektor prema zahtevu 10, ćelija domaćina prema zahtevu 11 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 12 za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kancera.

15. Polipeptid ili varijanta njegovog funkcionalnog ekvivalenta, konjugat, polinukleotid, vektor, ćelija domaćina ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 14, gde kancer je izabran iz grupe koju čine glioblastom i kancer nemalih ćelija pluća.