RS66065B1 - Proizvodnja degareliksa - Google Patents

Description

Opis

Tehnička oblast

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na proizvodni proces za pripremu degareliksa.

Pozadina pronalaska

[0002] Karcinom prostate je vodeći uzrok morbiditeta i mortaliteta kod muškaraca u industrijalizovanom svetu. Degareliks, takođe poznat kao FE200486, je antagonist receptora koji oslobađa gonadotropin (GnRH) treće generacije (blokator GnRH) koji je razvijen i odobren za pacijente sa karcinomom prostate kojima je potrebna terapija ablacijom androgena (Doehn et al., Drugs 2006, vol.9, No.8, pp.565-571; WO 09846634). Degareliks deluje neposrednom i konkurentnom blokadom GnRH receptora u hipofizi i, kao i drugi antagonisti GnRH, ne izaziva početnu stimulaciju proizvodnje luteinizirajućeg hormona putem ose hipotalamus-hipofiza-gonada, i stoga ne izaziva porast testosterona ili kliničko pogoršanje (Van Poppel, Cancer Management and Research, 2010:239-52; Van Poppel et al., Urology, 2008, 71(6), 1001-1006); James, E.F. et al., Drugs, 2009, 69(14), 1967-1976).

[0003] Degareliks je sintetički linearni dekapeptid koji sadrži sedam neprirodnih aminokiselina, od kojih su pet D-aminokiseline. Ima deset hiralnih centara u okosnici dekapeptida. Aminokiselinski ostatak na poziciji 5 u sekvenci ima dodatni hiralni centar u supstituciji bočnog lanca, što daje ukupno jedanaest hiralnih centara. Njegov CAS registarski broj je 214766-78-6 (slobodne baze) i komercijalno je dostupan pod zaštitnim znakom Firmagon<™>. Supstanca leka je hemijski označena kao D-alaninamid, N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-alanil-4-hloro-D-fenilalanil-3-(3-piridinil)-D-alanil-L-seril-4-[[[(4S)-heksahidro-2,6-diokso-4-pirimidinil]karbonil]amino]-L-fenilalanil-4- [(aminokarbonil)amino]-D-fenilalanil-L-leucil-N6-(1-metiletil)-L-lizil-L-prolil- i predstavljena je hemijskom strukturom u nastavku (u daljem tekstu takođe nazvanom formula I):

[0004] Struktura degareliksa se takođe može predstaviti kao:

Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2

gde je Ac acetil, 2Nal je 2-naftilalanin, 4Cpa je 4-hlorofenilalanin, 3Pal je 3-piridilalanin, Ser je serin, 4Aph je 4-aminofenilalanin, Hor je hidroorotil, Cbm je karbamoil, Leu je leucin, Lys(iPr) je N6-izopropillizin, Pro je prolin i Ala je alanin.

[0005] Za potrebe opisivanja ovog pronalaska, svakoj aminokiselini u segareliksu će se dati stenografska notacija na sledeći način:

AA1je D-2Nal, AA2je D-4Cpa, AA3je D-3Pal, AA4je Ser, AA5je 4Aph(L-Hor), AA6je D-Aph(Cbm), AA7je Leu, AA8je Lys(iPr), AA9je Pro i AA10je D-Ala.

[0006] Dakle, degareliks se možepredstaviti kao Ac-AA1-AA10-NH2.

[0007] Degareliks je prethodno pripremljen korišćenjem metodologije Boc-čvrste faze sinteze peptida (SPPS) kako je prijavljeno u WO 98/46634 i Jiang et al., J. Med. Chem.

2001, 44, 453-467.

[0008] WO2010/12835 i WO2011/066386 opisuju pripremu degareliksa korišćenjem FMOC strategije. WO2012/055905 i WO2012/055903 opisuju sinteze tečne faze degareliksa. WO2011/004260 opisuje farmaceutske kompozicije za rekonstituciju koje se sastoje od liofilizovanog degareliks acetata.

Sažetak pronalaska

[0009] Fizičko-hemijska karakterizacija degareliksa pokazala je da ovaj dekapeptid ima sposobnost da se sam asocira i na kraju formira gelove u vodenom rastvoru. Samoagregacija čini da ovo jedinjenje stvara depo in situ kada se ubrizgava subkutano ili intramuskularno. Pokazalo se da depo degareliksa obezbeđuje održivo oslobađanje aktivne supstance tokom meseci u zavisnosti od doze. Trenutno se lek primenjuje u dozama od 120 mg (40 mg/ml) za prvu injekciju i od 80 mg (20 mg/ml) za produženo oslobađanje tokom jednog meseca.

[0010] Sadašnji istraživači su iznenađujuće otkrili da se viskoznost, a samim tim i svojstva održivog oslobađanja i bioraspoloživost, rekonstituisanog leka mogu kontrolisati preradom sirovog peptida (npr. dobijenog Fmoc strategijom, sintezom tečne faze ili drugim putem) u supstancu leka. Viskoznost povezana sa supstancom leka iznenađujuće korelira sa viskoznošću povezanom sa proizvodom leka, čak i nakon dalje rekonstitucije i liofilizacije. Viskoznost proizvoda leka mora se kontrolisati u opsegu do 15 mPas, po mogućnosti u opsegu od 2 do 12 mPas, da bi se dobila željena formacija depoa i time održivo oslobađanje. Ovaj pronalazak obezbeđuje procese koji omogućavaju proizvodnju lekova koji pokazuju ovu viskoznost, kako je utvrđeno nakon rekonstitucije sa tečnošću za rekonstituciju u koncentraciji od 20 mg degareliksa po ml tečnosti za rekonstituciju.

[0011] Prema ovom pronalasku, obezbeđena je liofilizovana supstanca leka degareliksa koja se sastoji od degareliksa, 4,5 do 10,0% (m/m) sirćetne kiseline, rezidualne količine vode i nečistoća usled procesa proizvodnje, ako ih ima, što pokazuje, nakon rastvaranja u vodi u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml vode koja sadrži 2,5 mas.% manitola, viskoznost do 3,2 mPas, pri čemu se viskoznost meri pomoću rotirajućeg viskozimetra opremljenog sistemom za merenje konusne ploče sa D=60 mm i 1°, brzina smicanja se povećava sa 0 na 500 s-1 u 20 koraka, koristeći program koraka rotacije sa kontrolisanom brzinom na konstantnoj temperaturi od 20+ -0,2°C.

[0012] Opciono, liofilizovana supstanca leka degareliksa pokazuje nakon rastvaranja u vodi u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml vode koja sadrži 2,5 mas.% manitola, viskoznost od 1,15 do 2,0 mPas, pri čemu se viskoznost meri pomoću rotirajućeg viskozimetra opremljenog sistemom za merenje konusne ploče sa D=60 mm i 1°, pri čemu se brzina smicanja povećava sa 0 na 500 s-1 u 20 koraka, koristeći program koraka rotacije sa kontrolisanom brzinom na konstantnoj temperaturi od 20+ -0,2°C.

[0013] Prema ovom pronalasku, takođe postoji metoda za proizvodnju supstance leka degareliksa u skladu sa jednim ili više patentnih zahteva od 1 do 3, koja obuhvata korake:

a. Pročišćavanje degareliksa dobijenog sintezom peptida tečne ili čvrste faze kako bi se dobio rastvor degareliksa čistoće od najmanje 95%;

b. Uparavanje rastvora da bi se koncentrovao rastvor degareliksa da bi se dobio agregirani degareliks;

c. Deagregacija agregiranog degareliksa sirćetnom kiselinom; i

d. Liofilizacija deagregiranog degareliksa da bi se obezbedila supstanca leka degareliksa.

[0014] Prema ovom pronalasku, takođe postoji metoda koja obuhvata korake:

a. Pročišćavanje degareliksa dobijenog sintezom peptida tečne ili čvrste faze kako bi se dobio rastvor degareliksa čistoće od najmanje 95%;

b. Ubacivanje rastvora degareliksa na hromatografsku kolonu;

c. Eluiranje degareliksa iz kolone sirćetnom kiselinom da bi se obezbedio eluirani degareliks;

d. Liofilizacija eluiranog degareliksa da bi se obezbedila supstanca leka degareliksa.

[0015] Prema ovom pronalasku, takođe postoji metoda za proizvodnju supstance leka degareliksa u skladu sa jednim ili više patentnih zahteva od 1 do 3, koja obuhvata korake:

a. Pročišćavanje degareliksa dobijenog sintezom peptida tečne ili čvrste faze kako bi se dobio rastvor degareliksa čistoće od najmanje 95%;

b. Podešavanje koncentracije sirćetne kiseline prečišćenog rastvora degareliksa na 6 do 40% (m/m), ako je potrebno;

c. Sušenje raspršivanjem rastvora degareliksa kako bi se obezbedila supstanca leka degareliksa.

[0016] Prema jednom aspektu ovog obelodanjivanja, postoji metoda za kontrolu viskoznosti proizvoda degareliksa koja nije veća od 15 mPas, po mogućnosti u opsegu od 2 do 12 mPas, kako je utvrđeno nakon rekonstitucije sa vodom za injekcije u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, koja obuhvata korake:

1. Obezbeđivanje liofilizovane supstance leka degareliksa koja pokazuje viskoznost do 3,2 mPas, kako je utvrđeno nakon rastvaranja u vodi koja sadrži manitol (2,5% m/V) u količini od 20 mg slobodne baze/ml degareliksa

2. Rastvaranje liofilizovane supstance leka degareliksa u vodi koja sadrži manitol kako bi se obezbedila vodena smeša degareliks-manitola;

3. Liofilizacija vodene smeše degareliks-manitola da bi se obezbedio proizvod leka degareliks.

[0017] Prema daljem aspektu ovog obelodanjivanja, obezbeđena je metoda za proizvodnju liofilizovanog proizvoda degareliksa koji pokazuje viskoznost do 15 mPas, po mogućnosti u opsegu od 2 do 12 mPas, kako je utvrđeno nakon rekonstitucije sa vodom za injekcije u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, koja obuhvata korake:

1. Obezbeđivanje liofilizovane supstance leka degareliksa koja pokazuje viskoznost do 3,2 mPas, kako je utvrđeno nakon rastvaranja u vodi koja sadrži manitol (2,5% m/V) u količini od 20 mg slobodne baze/ml degareliksa

2. Rastvaranje liofilizovane supstance leka degareliksa u vodi koja sadrži manitol kako bi se obezbedila vodena smeša degareliks-manitola; i

3. Liofilizacija vodene smeše degareliks-manitola da bi se obezbedio proizvod leka degareliks.

[0018] Prema daljem aspektu ovog obelodanjivanja, obezbeđen je metod za proizvodnju leka degareliksa koji se sastoji od liofilizovanog leka degareliksa i tečnosti za rekonstituciju (tečnost za rekonstituciju) koja, nakon rekonstitucije sa navedenom tečnošću u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, pokazuje viskoznost do 15 mPas, po mogućnosti u opsegu od 2 do 12 mPas, koja obuhvata korake:

1. Rastvaranje liofilizovane supstance leka degareliksa u vodenom rastvoru koji sadrži manitol kako bi se obezbedila smeša degareliks-manitola;

2. Liofilizacija smeše degareliks-manitola kako bi se obezbedio proizvod leka degareliksa,

gde se smeši degareliks-manitola dodaje agens za smanjenje viskoznosti pre liofilizacije.

[0019] Ovaj pronalazak obezbeđuje liofilizovanu supstancu leka degareliksa koja pokazuje, nakon rastvaranja u vodi koja sadrži 2,5 mas.% manitola u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, viskoznost do 3,2 mPas i procese za obezbeđivanje ove liofilizovane supstance leka degareliksa.

[0020] Prema daljem aspektu ovog obelodanjivanja, obezbeđen je proizvod leka degareliksa koji se sastoji od liofilizovanog proizvoda leka degareliksa i tečnosti za rekonstituciju koja, nakon rekonstitucije sa navedenom tečnošću za rekonstituciju u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, pokazuje viskoznost do 15 mPas, po mogućnosti u opsegu od 2 do 12 mPas, i sadrži agens za smanjenje viskoznosti u količini od 0,001 do 5 mg/ml.

Slike

[0021]

Na slici 1 prikazan je odnos između viskoznosti supstance leka i viskoznosti proizvoda leka.

Na slikama 2 i 3 prikazana je veza između dinamičkog viskoziteta suspenzije za doziranje degareliksa (20 mg/ml) i koncentracija degareliksa u plazmi (pacov) 3. dana (slika 2) i 28. dana (slika 3).

Detaljan opis pronalaska

[0022] Metode za proizvodnju liofilizovanog proizvoda degareliksa počinju sa supstancom leka degareliksa koja će biti detaljnije opisana.

Supstanca leka degareliksa

[0023] Dekapeptid degareliks se može pripremiti sintezom peptida čvrste faze, kao što je obelodanjeno u WO98/46634, WO2010/12835 i WO2011/066386, ili sintezom peptida tečne faze, kao što je obelodanjeno u WO2012/055905 ili WO2012/055903. Ova sinteza peptida obezbeđuje sirovi degareliks koji se dalje prečišćava, a zatim liofilizuje kako bi se obezbedio liofilizovani proizvod koji se sastoji od degareliksa, sirćetne kiseline, rezidualne količine vode i manjih količina nečistoća usled procesa proizvodnje, ako ih ima. Ovaj proizvod se u ovom pronalasku naziva supstanca leka degareliksa ili samo supstanca leka. Supstanca leka degareliksa se poželjno sastoji od degareliksa, 4,5 do 10 mas.% sirćetne kiseline (m/m) i do 10 mas.% vode (m/m).

[0024] Proizvodnja supstance leka može se podeliti na prvi korak (A) koji obezbeđuje prečišćeni degareliks u rastvoru i drugi korak (B) koji obezbeđuje supstancu leka degareliks.

Korak (A): Prečišćavanje

[0025] Korak (A) obuhvata prečišćavanje sirovog degareliksa u jednom ili više koraka, po mogućnosti u dva koraka, nakon čega opciono sledi koncentracija kolone i/ili korak razmene soli.

[0026] Sirovi degareliks, dobijen pomoću LPPS ili SPPS, prvo se podvrgava prečišćavanju. Prečišćavanje se po mogućnosti vrši primenom peptidnog rastvora dobijenog pomoću SPPS ili LPPS na kolonu sa materijalom reverzne faze, koja je po mogućnosti prethodno ekvilibrisana puferom. Ovaj prvi korak prečišćavanja po mogućnosti obezbeđuje čistoću od najmanje 95%, kako je utvrđeno putem HPLC.

[0027] Po mogućnosti, hromatografija kolone sa reverznom fazom se ponavlja da bi se dobio proizvod čistoće od najmanje 97,5%, kako je utvrđeno pomoću HPLC.

[0028] Poželjnije , prečišćeni rastvor degareliksa čistoće od najmanje 95%, po mogućnosti najmanje 97,5%, podvrgava se daljem koraku hromatografije kolone da bi se predkoncentrisao rastvor degareliksa i/ili za razmenu soli (posebno ako se sirćetna kiselina koristi za podešavanje pH eluenata u poslednjem koraku prečišćavanja).

[0029] Ovaj korak predkoncentracije i/ili razmene soli takođe se poželjno sprovodi na koloni reverzne faze: Prečišćeni rastvor degareliksa se razblažuje vodom (poželjno 1,5 do 2,5 puta) i nanosi na kolonu, prethodno ekvilibrisanu puferom. Kolonu je poželjno prvo isprati etanolom (niska koncentracija, generalno ispod 20%) i vodenim amonijum acetatom, a zatim etanolom (niska koncentracija, generalno ispod 20%)/sirćetnom kiselinom/vodom. Kolona se zatim eluira, npr. etanolom (visoka koncentracija, generalno 20 do 60 %)/sirćetnom kiselinom/vodom da bi se dobio koncentrovaniji rastvor degareliksa u poređenju sa rastvorima nakon koraka prečišćavanja. Proces nije ograničen na etanol kao organski modifikator u eluentu. Mogu se koristiti i drugi rastvori kao što je acetonitril.

[0030] Korak (A) obezbeđuje prečišćeni degareliks u rastvoru.

Korak (B)

[0031] Naknadni tretman prečišćenog degareliksa u rastvoru za dobijanje supstance leka degareliksa može se sprovesti na različite načine. U nastavku su ilustrovana četiri poželjna načina (koraci (B1), (B2), (B3) i (B4)).

Korak (B1): Koncentracija - de-agregacija - liofilizacija

[0032] Prečišćeni degareliks u rastvoru se prvo podvrgava koraku koncentracije u kojem se etanol ili drugi organski modifikator kao što je acetonitril uklanja isparavanjem. Ovaj korak se poželjno izvodi sa rotavap isparivačem. Poželjna maksimalna temperatura tokom isparavanja je 40 °C. Dobijeni visoko koncentrovani, viskozni proizvod degareliksa (agregatni proizvod koji je obično u obliku gela) se zatim tretira sirćetnom kiselinom (korak deagregacije), po mogućnosti filtrira i liofilizuje.

[0033] Korak de-agregacije je važan za kontrolu viskoznosti supstance leka. Stoga se korak de-agregacije poželjno sprovodi sa jednim ili više, najpoželjnije sa svim sledećim uslovima:

● Konačna koncentracija sirćetne kiseline: 6 - 40 %, poželjno 15 - 35 % (m/m)

● Temperatura od 0 do 35 °C, poželjno od 2 do 30 °C, najpoželjnije od 5 do 15 °C

● Koncentracija degareliksa (slobodna baza) 5-35 g/l, po mogućnosti 10-20 g/l

● Vreme 1-15 sati

[0034] U okviru ovih ograničenja, odgovarajuće kombinacije procesnih parametara mogu se pronaći jednostavnim eksperimentisanjem.

[0035] Korak liofilizacije se po mogućnosti sprovodi na debljini leda od 1,2 do 2,4 cm i sekundarnom vremenu sušenja od 1 do 17 sati. Sekundarna temperatura sušenja je obično oko 20 °C (15 do 25 °C).

[0036] Po mogućnosti, korak (B1) tako obezbeđuje liofilizovanu supstancu leka koja pokazuje viskoznost manju od 3,2 mPas, po mogućnosti između 1,15 i 2 mPas (kako je utvrđeno nakon rastvaranja u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa u 1 ml vode, koja sadrži 2,5% (m/V) manitola). Metoda za merenje viskoznosti opisana je u eksperimentalnom delu. Supstanca leka koja ispunjava ovaj zahtev viskoznosti se dalje naziva supstanca leka (1), dok se supstanca leka koja ne ispunjava ovaj zahtev viskoznosti dalje naziva supstanca leka (2). Supstanca leka (2) ima poželjnu viskoznost od 3,2 do 15 mPas, nakon rastvaranja u količini od 20 mg u 1 ml vode. Supstanca leka (2) može biti čak i nalik gelu, u stanju znatno većem od 3,2 mPas, iako se njena viskoznost ne može precizno izmeriti.

1

[0037] S tim u vezi, napominje se da se „nakon rastvaranja u količini od 20 mg u 1 ml vode“ samo odnosi na uslove za merenje viskoznosti i ne znači da je supstanca leka prisutna u rastvoru od 20 mg/ml. Najpoželjnije, supstanca leka je prisutna u liofilizovanom obliku.

[0038] Supstanca leka, posebno supstanca leka (1), poželjno je da se dalje karakteriše sadržajem sirćetne kiseline od 4,5 do 10,0% (m/m) i/ili sadržajem vode od 10% ili manje (m/m). Pored toga, supstanca leka, posebno supstanca leka (1), poželjno pokazuje optičku gustinu od 0,10 AU ili manje (pri koncentraciji od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml u 2,5% manitola (aq)). Metoda merenja optičke gustine opisana je u eksperimentalnom delu.

[0039] Stoga, ovo obelodanjivanje pruža metodu za proizvodnju supstance leka degareliksa (1), koja obuhvata korake:

a. Pročišćavanje degareliksa dobijenog sintezom peptida tečne ili čvrste faze kako bi se dobio rastvor degareliksa čistoće od najmanje 95%;

b. Uparavanje rastvora da bi se koncentrovao rastvor degareliksa da bi se dobio agregirani degareliks;

c. Deagregacija agregiranog degareliksa sirćetnom kiselinom; i

d. Liofilizacija deagregiranog degareliksa da bi se obezbedila supstanca leka degareliksa.

[0040] Obelodanjivanje dalje pruža metodu za modulaciju viskoznosti degareliksa, tako da nakon liofilizacije i rekonstitucije sa vodom, viskoznost rastvora degareliksa od 20 mg/ml u 2,5% m/V manitola nije veća od 15 mPas, koji se sastoji od:

tretiranja agregiranog degareliksa sirćetnom kiselinom; i

liofilizacije smeše degareliksa i sirćetne kiseline.

[0041] Po mogućnosti, uslovi za dodavanje sirćetne kiseline i liofilizaciju su kao što je gore opisano. Konkretno, sadržaj sirćetne kiseline nakon liofilizacije je 4,5 do 10,0% (m/m).

Korak (B2): Koncentracija kolone - liofilizacija

[0042] Rastvor degareliksa dobijen u koraku A (po mogućnosti nakon metode prečišćavanja u jednom ili dva koraka, npr. bez predkoncentracije/razmene soli) učitava se na hromatografsku kolonu, vrši se jonska razmena i kolona se ispire (pere) razblaženom sirćetnom kiselinom (oko 1%). Degareliks se eluira iz kolone korišćenjem vodene sirćetne kiseline u koncentraciji AcOH od 20 do 50 mas.%, poželjno 23 do 37 mas.%, poželjno 23 do 27 mas.%, poželjno 27 do 37 mas.%, poželjno 33 do 37 mas.%, poželjno 35 mas.%, i naknadno opciono razblažen do odgovarajuće koncentracije AcOH, filtriran. Zatim se liofilizuje AcOH/vodeni rastvor degareliksa. Stacionarna faza u koloni može biti različitih tipova. Stacionarna faza može da sadrži funkcionalne grupe kao što su ugljovodonici (alifatski i aromatični), alkoholi, nitrili, grupe sa odgovarajućim kiselinsko/baznim svojstvima i jonozmenjivačke grupe, ali nije ograničena na ovu vrstu grupa. Ovaj proces obezbeđuje supstancu leka, po mogućnosti supstancu leka (1).

[0043] Dakle, pronalazak pruža metodu za proizvodnju supstance leka degareliksa, koja obuhvata korake:

a. Pročišćavanje degareliksa dobijenog sintezom peptida tečne ili čvrste faze kako bi se dobio rastvor degareliksa čistoće od najmanje 95%;

b. Ubacivanje rastvora degareliksa na hromatografsku kolonu;

c. Eluiranje degareliksa iz kolone sirćetnom kiselinom da bi se obezbedio eluirani degareliks;

d. Liofilizacija eluiranog degareliksa da bi se obezbedila supstanca leka degareliksa.

Korak (B3): Izolacija putem liofilizacije-rekonstitucije u AcOH/liofilizaciji vodom

[0044] Prečišćeni degareliks u rastvoru dobijenom nakon koraka A je izolovan liofilizacijom; dobijeni liofilizovani proizvod se rastvara u koncentraciji između 10 i 20 g/l u 2% sirćetnoj kiselini i ponovo liofilizuje da bi se dobila supstanca leka degareliksa (1).

Korak (B4): Sušenje raspršivanjem

[0045] Prečišćeni degareliks u rastvoru (EtOH/voda koja sadrži AcOH ili ACN/voda koja sadrži AcOH dobijen nakon koraka A, ili kao što je opisano u koraku B1, osim za liofilizaciju, ili B2, osim za liofilizaciju) se izoluje sušenjem raspršivanjem da bi se dobila supstanca leka degareliksa (1).

[0046] Poželjno je da se prečišćeni rastvor degareliksa dobijen u koraku A direktno podvrgne postupku sušenja raspršivanjem. Koncentracija AcOH navedenog vodenog rastvora degareliksa podvrgnutog sušenju raspršivanjem podešava se na 6 do 40% (m/m), poželjno 15 do 35% (m/m).

[0047] Nakon što smo opisali proizvodnju supstance leka, sada ćemo opisati proizvodnju leka degareliksa. Liofilizovani proizvod leka degareliksa sadrži supstancu leka degareliksa i manitol, tj. sadrži (i poželjno se sastoji od) degareliks, sirćetnu kiselinu, manitol, rezidualnu količinu vode i manje količine nečistoća usled proizvodnog procesa, ako ih ima.

Proizvodni proces A proizvoda leka degareliksa

[0048] Proizvodni proces A je aspekt gore pomenutog obelodanjivanja, tj. metoda za proizvodnju leka degareliksa koji, nakon rekonstitucije sa vodom za injekcije u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, pokazuje viskoznost do 15 mPas, po mogućnosti u opsegu od 2 do 12 mPas, koji obuhvata korake:

a. Obezbeđivanje liofilizovane supstance leka degareliksa, po mogućnosti supstance leka degareliksa (1);

b. Rastvaranje liofilizovane supstance leka degareliksa u vodi koja sadrži manitol kako bi se obezbedila vodena smeša degareliks-manitola;

c. Liofilizaciju vodene smeše degareliks-manitola da bi se obezbedio proizvod leka degareliks.

1

[0049] U ovom obelodanjivanju, „nakon rekonstitucije sa vodom za injekcije u količini od 20 mg/ml“ odnosi se na uslove za merenje viskoznosti i ne znači da je lek prisutan u rastvoru od 20 mg/ml. Najpoželjnije, lek je prisutan u liofilizovanom obliku, opciono u kombinaciji sa tečnošću za rekonstituciju. Poželjne količine po bočici su u opsegu od 60 do 300 mg (kao što su 120 mg, 80 mg i 240 mg). Alternativno, može se obezbediti kao rekonstituisani lek, sa poželjnim koncentracijama u opsegu od 2 do 100 mg/ml, poželjno 10 do 70 mg/ml (kao što su 40 mg/ml, 20 mg/ml i 60 mg/ml).

[0050] Korak b se takođe može nazvati korakom mešanja. Poželjno je da se filtracija i punjenje bočica sprovode nakon mešanja i pre sušenja zamrzavanjem tako da ceo željeni proizvodni proces A obuhvata korake:

● Mešanje za obezbeđivanje nefiltriranog proizvoda leka u velikoj zapremini

● Filtraciju (sterilnu)

● Punjenje bočica

● Sušenje zamrzavanjem/liofilizaciju

Mešanje za obezbeđivanje proizvoda leka u velikoj zapremini

[0051] Supstanca leka se podvrgava koraku mešanja, koji se generalno sprovodi na sledeći način:

Za proizvodnju nefiltriranog leka u velikoj zapremini, supstanca leka i manitol se rastvaraju u vodi (čista voda; generalno Milli-Q voda) u količinama od 10 - 60 g, na 1000 g veličine šarže. Tipične količine su 20 do 50 g supstance leka (kao sadržaj slobodne baze degareliksa) određeno pomoću HPLC i 10 do 50 g manitola na 1000 g. Stvarna količina zavisi od konačne koncentracije degareliksa u proizvodu leka i zapremine tečnosti za rekonstituciju (poželjno je dodati manitol tako da se nakon rekonstitucije dobije izotonični rastvor osmolalnosti 300 mOsm /-30 mOsm).

[0052] Za proizvodnju, voda (obično oko 80% ukupne količine vode) se dodaje u posudu za mešanje. Manitol se dodaje i rastvara mešanjem. Zatim se supstanca leka dodaje u mešani rastvor manitola i formulisana zapremina (šarža) se dovodi do konačne težine dodavanjem preostale vode. Ovo mešanje se vrši na način da se izbegne značajno povećanje viskoznosti. Viskoznost proizvoda u velikoj zapremini stoga poželjno ostaje ispod 5 mPas, poželjno ispod 3,2 mPas tokom koraka mešanja (viskoznost određena nakon filtracije nakon rastvaranja u količini od 20 mg u 1 ml 2,5% (m/V) vodenog rastvora manitola). To se može postići vlaženjem peptida velikom brzinom mešanja u relativno kratkom vremenskom periodu (do 30 minuta), a zatim rastvaranjem peptida smanjenom brzinom mešanja kako bi se izbeglo penjenje i agregacija (obično 30 do 90 minuta). Temperatura se obično održava u opsegu od 6 - 15 °C. Mešalica je poželjno ona koja obezbeđuje turbulentno mešanje bez vorteksa.

Filtracija

[0053] Proizvod leka u velikoj zapremini se zatim poželjno sterilno filtrira, npr. kroz dva filtera za sterilizaciju smeštena u šaržu, pritiskom na formulisanu zapreminu azotom.

Punjenje

[0054] Sterilisane bočice se pune filtriranim proizvodom leka u velikoj zapremini i poluzačepljuju (položaj za sušenje zamrzavanjem) u aseptičnim uslovima.

Sušenje zamrzavanjem

[0055] Poželjno je da se sušač zamrzavanjem steriliše parom pre upotrebe. Bočice se stavljaju na police za sušenje zamrzavanjem. Sledeći proces sušenja zamrzavanjem po mogućnosti obuhvata korake zamrzavanja, glavnog sušenja (sublimacije) i sekundarnog sušenja. Poželjni uslovi su sledeći:

Proces sušenja zamrzavanjem po mogućnosti obuhvata, ili se čak sastoji od, tri glavna koraka, tj. zamrzavanje, glavno sušenje (sublimaciju) i sekundarno sušenje.

1

• Zamrzavanje

[0056] Bočice se stavljaju na police u frižideru koje se održavaju na 2 do 10 °C, kao što je 5 °C.

[0057] Police se hlade od npr. 5 °C do -30 °C do -40 °C, kao što je -35 °C. Temperatura police se održava na npr. -35 °C najmanje dva sata kako bi se osiguralo potpuno zamrzavanje cele šarže pre početka primarnog sušenja.

• Glavno sušenje (sublimacija)

[0058] Glavno sušenje se vrši snižavanjem pritiska u komori (po mogućnosti na 0,100 mBar ili manje) i povećanjem temperature police (po mogućnosti na 10 do 20 °C, kao što je 17 °C).

[0059] Vreme glavnog sušenja traje najmanje 15 sati.

• Sekundarno sušenje

[0060] Nakon završetka primarnog procesa bojenja, pritisak u komori se smanjuje (po mogućnosti na 0,01 mBar ili manje) i temperatura police se povećava (po mogućnosti na 20 do 30°C, kao što je 25°C). Sekundarno sušenje se obično završava u roku od 7 sati.

[0061] Liofilizovani lek se zatim obeležava i pakuje i kombinuje sa odgovarajućom količinom tečnosti za rekonstituciju.

[0062] Tečnost za rekonstituciju se bira u zavisnosti od viskoznosti supstance leka. Ako se supstanca leka (1) koristi kao polazni materijal za proizvodni proces A, tj. liofilizovana supstanca leka koja pokazuje viskoznost manju od 3,2 mPas, poželjno između 1,15 i 2 mPas (nakon rastvaranja u količini od 20 mg u 1 ml 2,5 (m/V)% vodenog rastvora manitola), dobijeni liofilizovani proizvod leka se poželjno kombinuje sa vodom za injekcije (WFI) kao tečnost za rekonstituciju. Ako se liofilizovani lek rekonstituiše sa WFI, viskoznost je generalno u opsegu od 2 do 15 mPas (mereno nakon rastvaranja 20 mg degareliksa (slobodna baza) u 1 ml WFI). Utvrđeno je da proizvod leka sa viskoznošću unutar ovog opsega obezbeđuje dovoljno oslobađanje degareliksa iz depoa in vivo.

1

Proizvodni proces B leka degareliksa

[0063] Proizvodni proces B je metoda za proizvodnju leka degareliksa koja se sastoji od liofilizovanog leka degareliksa i tečnosti za rekonstituciju (tečnost za rekonstituciju) koja, nakon rekonstitucije sa navedenom tečnošću u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml, pokazuje viskoznost do 15 mPas, po mogućnosti u opsegu od 2 do 12 mPas, koja obuhvata korake:

a. Rastvaranje liofilizovane supstance degareliksa u vodenom rastvoru koji sadrži manitol kako bi se obezbedila smeša degareliks-manitola;

b. Liofilizaciju smeše degareliks-manitola kako bi se obezbedio proizvod leka degareliksa,

gde se smeši degareliks-manitola dodaje agens za smanjenje viskoznosti pre liofilizacije.

[0064] Korak a se takođe može nazvati korakom mešanja. U poželjnom otelotvorenju, filtracija i punjenje bočica se sprovode nakon mešanja i pre liofilizacije tako da ceo poželjan proizvodni proces B obuhvata korake:

● Mešanje za obezbeđivanje nefiltriranog proizvoda leka u velikoj zapremini

● Filtraciju (sterilnu)

● Punjenje bočica

● Sušenje zamrzavanjem/liofilizaciju

[0065] Proizvodni proces B je identičan proizvodnom procesu A, sa izuzetkom da se u koraku mešanja dodaje agens za smanjenje viskoznosti, po mogućnosti nejonski surfaktant pre liofilizacije. Nejonski surfaktant se poželjno dodaje u količini od 0,0003 do 1,5 mg/ml u rastvor velike zapremine, što odgovara količini od 0,001 do 5 mg/ml, poželjnije 0,1 do 1 mg/ml, u rekonstituisanom leku (npr. kada se rekonstituiše do koncentracije degareliksa od 60

1

mg slobodne baze degareliksa/ml). Poželjni nejonski surfaktanti su oni sa linearnim alkilnim lancem koji imaju najmanje 8 atoma ugljenika (po mogućnosti bez dvostrukih veza) i ugljenohidratni deo. Posebno su poželjni oni koje su odobreni za supkutane injekcije, kao što je Tween 20 (polisorbat 20). Ostali pogodni nejonski surfaktanti uključuju tokoferilpolietilen-glikol-1000-sukcinat (TPGS) i druge Tweens.

[0066] Kao polazni materijal za proizvodni proces B, poželjno je koristiti supstancu leka (2), tj. liofilizovanu supstancu leka koja pokazuje viskoznost od najmanje 3,2 mPas (nakon rastvaranja u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa u 1 ml 2,5 mas.% vodenog rastvora manitola). Dobijeni liofilizovani lek se obično kombinuje sa WFI kao tečnost za rekonstituciju. Ako se liofilizovani lek rekonstituiše sa WFI, viskoznost je generalno u opsegu od 2 do 15 mPas (mereno nakon rastvaranja 20 mg slobodne baze degareliksa u 1 ml WFI). Utvrđeno je da proizvod leka sa viskoznošću unutar ovog opsega obezbeđuje dovoljnu formaciju depoa za odloženo oslobađanje degareliksa in vivo.

[0067] Proizvodni proces B je posebno poželjan za proizvode degareliksa koji imaju relativno visoku koncentraciju degareliksa nakon rekonstitucije, kao što je 50 mg slobodne baze degareliksa/ml ili više, npr. 60 mg slobodne baze degareliksa/ml (240 mg proizvoda leka).

Novi proizvod leka degareliksa

[0068] Obelodanjivanje koje se odnosi na proizvodni proces B pruža novi proizvod leka degareliksa koji se razlikuje od poznatih proizvoda leka po tome što rekonstituisani proizvod leka sadrži agens za smanjenje viskoznosti. Agens za smanjenje viskoznosti je ono koje se koristi u koraku B, po mogućnosti nejonski surfaktant.

[0069] Ovo obelodanjivanje stoga obezbeđuje proizvod leka degareliksa koji se sastoji od liofilizovanog proizvoda leka degareliksa i tečnosti za rekonstituciju koja, nakon rekonstitucije sa navedenom tečnošću u količini od 20 mg slobodne baze /ml degareliksa, pokazuje viskoznost do 15 mPas, po mogućnosti u opsegu od 2 do 12 mPas, i sadrži agens za smanjenje viskoznosti u količini od 0,001 do 5 mg/ml, po mogućnosti 0,1 do 1 mg/ml.

1

Eksperimentalni deo

Primer 1: Prečišćavanje, deagregacija i liofilizacija

[0070] Sirovi degareliks je sintetizovan kao što je opisano u WO2012/055905 A1, do koraka 12 u primeru 5. Korak 13, kako je obelodanjeno u WO2012/055905 A1, zamenjen je sledećim koracima. Ukratko, proces prečišćavanja sirove supstance leka degareliksa, dobijene nakon poslednjeg koraka deprotekcije, sastoji se od tri pripremna koraka reverzne fazne hromatografije (RPC), pri čemu je treći korak RPC prvenstveno korak desalinizacije.

Korak 13 (korak prečišćavanja):

[0071] Sirovi rastvor degareliksa iz koraka 12 u WO2012/055905A1 primenjen je na kolonu napunjenu materijalom reverzne faze, prethodno uravnotežen puferom (90% od 0,12% TFA i 10% EtOH). Opterećenje: ≤30 g/l zapremine kolone. Kolona je isprana i eluirana sa gradijentom: pufer (EtOH 29% do 50 i 0,12% TFA (aq) 71% do 50%). Dobijene frakcije su analizirane i kombinovane na način da je čistoća glavnog skupa ispunila kriterijum prihvatljivosti za kontrolu procesa.

[0072] Kada je eluacija proverena HPLC metodom, čistoća je ≥95%.

Korak 14 (korak prečišćavanja):

[0073] Glavni skup dobijen u koraku 13 razblažen je dva puta vodom i nanet na kolonu napunjenu materijalom reverzne faze, prethodno uravnotežen puferom (90% 1% AcOH i 10% EtOH). Opterećenje: ≤ 25 g/l zapremine kolone. Kolona je prvo isprana prvim puferom (10% EtOH i 90% 0,5 mol/l AcONH4), a zatim drugim puferom (90% 1% AcOH i 10% EtOH).

[0074] Kolona je zatim eluirana smešom pufera i etanola (76% 1% AcOH i 24% EtOH). Dobijene frakcije su analizirane i kombinovane na način da čistoća u glavnom skupu ispunjava kriterijume prihvatljivosti za kontrolu procesa.

[0075] Kada je eluacija proverena „HPLC metodom“, čistoća je ≥ 975%.

1

Korak 15 (predkoncentracija/razmena soli):

[0076] Glavni skup dobijen u koraku 14 razblažen je dva puta vodom i nanet na kolonu napunjenu materijalom reverzne faze, prethodno uravnotežen puferom (90% 1% AcOH i 10% EtOH). Opterećenje: ≤ 18 g/l zapremine kolone. Kolona je prvo isprana prvim puferom (10% EtOH i 90% 0,5 mol/l AcONH4), a zatim drugim puferom (90% 1% AcOH i 10% EtOH). Kolona je zatim eluirana smešom pufera i etanola (50% 1% AcOH i 50% EtOH).

[0077] Kao alternativa, degareliks se može eluirati rastvorom AcOH/MeCN/vode, kao što je 12% AcOH i 22% MeCN u vodi.

Korak 16 (koncentracija-de-agregacija-liofilizacija):

[0078] Pre liofilizacije, skup čistih rastvora degareliksa iz koraka 15 bio je koncentrovan ispod 40°C. U koncentrovani rastvor dodata je vodena sirćetna kiselina i voda, da bi se dobila koncentracija ispod 15 g/L, a koncentracija sirćetne kiseline 30%. Ovaj rastvor je zatim filtriran i liofilizovan da bi se dobila supstanca leka degareliksa.

Rezultati

[0079] Viskoznost supstance leka dobijena nizom koraka bila je ispod 2,5 mPas, kako je utvrđeno u koncentraciji od 20 mg/ml u 2,5 (m/V) % rastvoru manitola.

Primer 2: Metoda za merenje viskoznosti supstance leka i proizvoda leka

2

[0080] Određivanje viskoznosti supstance leka i rastvora proizvoda leka zasniva se na aktuelnom izdanju Ph. Eur. i USP postupak pomoću rotirajućeg viskozimetra opremljenog sistemom za merenje konusne ploče sa D = 60 mm i 1°. Brzina smicanja se povećava sa 0 na 500 s-1 u 20 koraka, koristeći program koraka rotacije sa kontrolisanom brzinom (CR) na konstantnoj temperaturi od 20 ± 0,2 °C, vodeći računa da sistem dostigne ravnotežu pre nego što se viskoznost zabeleži pri brzini smicanja od 500s-1.

Primer 3: Metoda za merenje optičke gustine supstance leka i proizvoda leka

Oprema i materijali

[0081]

● UV spektrofotometar

● Kivete koje prenose UV svetlost, putanja 10 mm.

● Poklopci od kivete

● Voda za injekcije (koristi se za rekonstituciju leka degareliksa i u referentnoj ćeliji)

Sprovođenje analize

[0082] Između rekonstitucije i merenja, rekonstituisani uzorci moraju se čuvati na 22°C ± 1°C.

[0083] Bočica supstance leka se rekonstituiše 2,5% vodenog rastvora manitola u vodi (m/V). Bočica proizvoda leka se rekonstituiše vodom za injekcije. Dozirajte rastvor u bočicu i vrtite bočicu dok se rekonstitucija ne završi ili koristite vorteks nekoliko sekundi. Tečnost treba da izgleda bistro i da se ne vidi nerastvoren prah ili čestice. Držite bočicu u uspravnom položaju i ne tresite. Uzorak se meri na 350 nm, 120 minuta nakon dodavanja rastvora.

[0084] Četiri minuta pre merenja, uzorak mora biti homogenizovan nežnim okretanjem kivete pet puta napred-nazad za približno 180 stepeni. Četvorominutno kašnjenje omogućava da se svi mehurići vazduha rasprše pre očitavanja.

[0085] Apsorpcija izazvana kivetom i vodom za injekcije mora se oduzeti od očitavanja uzorka.

Primer 4: Sušenje raspršivanjem

Priprema smeše

[0086] Prilikom pripreme smeše, izmerena količina degareliksa, prikazana u tabeli ispod, je rastvorena uz pomoć magnetne mešalice Različiti rastvori smeše W-VI i AI-IV pripremljeni su dodavanjem Milli-Q vode, ili čiste ledene sirćetne kiseline (99,9%) na sledeći način:

a. Šarža W-IV: odgovarajuća zapremina vode je dodata izmerenoj količini degareliksa

b. Šarža A-I do A-III: za svaki eksperiment, rastvori sirćetne kiseline su pripremljeni razblaživanjem 99,0% glacijalne sirćetne kiseline sa Milli-Q vodom, što je rezultiralo rastvorima od 30, 5, 2%, kojima je dodata izmerena količina degareliksa

[0087] Pre svih sušenja raspršivanjem, rekonstituisani peptid je filtriran u mernu tikvicu kroz filter Sartoriuos Ministar od 0,20 µm pre sušenja raspršivanjem.

Sušenje raspršivanjem

[0088] Pre raspršivanja, ulazna temperatura i brzina doziranja smeše su podešene. Crevo pumpe je postavljeno u rastvor smeše, i proces sušenja je započet. Kada je sušenje završeno, dozvoljen je pad ulazne temperature na 700°C pre nego što je ciklon i sabirna posuda demontirana radi sakupljanja praha. Prah je prikupljen četkicama u Petri posude, koje su bile izmerene pre i posle sakupljanja kako bi se odredio prinos.

Pregled podešavanja primenjenog za sušenje raspršivanjem

[0089]

[0090] Viskoznost rekonstituisanog degareliksa osušenog raspršivanjem iz rastvora sirćetne kiseline četiri različite koncentracije (A-I do A-III) u poređenju sa jednom šaržom degareliksa osušenog raspršivanjem iz vode (W-IV)

Primer 5: Koncentracija kolone - liofilizacija

[0091] Skup iz koraka 14, primera 1 je razblažen vodom i nanet na kolonu napunjenu materijalom reverzne faze. Nakon ispiranja kolone sa 1% AcOH u vodi, degareliks je eluiran sa 35% AcOH u vodi. Frakcije su podešene tako da sadrže 35 g degareliksa/I, 27% AcOH (uzorak 1) i 15 g degareliksa/I, 30% AcOH (uzorak 2). Podešene frakcije su liofilizovane i analizirane. Rezultati: videti tabelu u nastavku:

2

Primer 6: Proizvodnja supstance leka degareliksa i studije deagregacije

□ Materijali

Studije de-agregacije prečišćene, sirove supstance leka

[0092]

● Sirovi, prečišćeni degareliks je isporučen u koncentraciji od 57,4 mg/ml ● Sirćetnu kiselinu 100% je isporučio Merck

● Oprema za de-agregaciju:

o Posuda za mešanje: staklena posuda sa dvostrukim zidom od 300 ml o Bočice sa plavim čepom, 50 ili 100 ml

o Magnet

o Magnetna mešalica

● Primarno pakovanje:

o Bezbojne staklene bočice od 20R. Bočice su oprane i osušene u toplotnoj komori.

Čepovi za sušenje zamrzavanjem prečnika 20 mm tip I u skladu sa Ph. Eur / USP, Flip-Off čepovi prečnika 20 mm.

Proizvodnja proizvoda leka korišćenjem de-agregiranih supstanci leka

[0093]

● Korišćene su dve eksperimentalne supstance leka. Kao kontrolna grupa se koristi komercijalna supstanca leka.

● Manitol: D (-) manitol (PF-05-0232)

● Primarno pakovanje:

o Bezbojne 10R staklene bočice (prema DIN ISO 8362). Bočice su oprane i osušene u toplotnoj komori.

Čepovi za sušenje zamrzavanjem prečnika 20 mm tip I u skladu sa Ph. Eur / USP (tip 1319, gumeni W4416/50/sivi, The West Company)

o 20 mm Flip-Off čepovi (The West Company)

□ Metode

Eksperimenti de-agregacije korišćenjem osnovnog rastvora supstance leka

[0094] Temperatura tokom eksperimenata:

Tokom studija deagregacije temperatura je podešena na 5, 20, 25 ili 35°C

2

[0095] Koncentracija supstance leka degareliksa u zalihama rastvora tokom eksperimenata: Koncentracija supstance leka degareliksa bila je 5, 15, 25 ili 35 mg/ml.

[0096] Koncentracija sirćetne kiseline tokom eksperimenata:

Koncentracija sirćetne kiseline je 13, 15, 18, 20, 22, 26, 30, 35 ili 40%.

[0097] Analiza sprovedena tokom eksperimenata:

Viskoznost: Uzeti približno 1,2 ml na T = 1, 60, 120 i 240 minuta.

[0098] Ako se bolje uklapa u raspored uzimanja uzorka u drugoj vremenskoj tački, onda se to može uraditi pod uslovom da se tačno vreme upiše u zapisnik formulacije. Međutim, tačka uzorkovanja na T=1 min treba biti zadržana.

[0099] Optička gustina (OD): Na kraju svakog eksperimenta treba uzeti uzorak (~1 ml) za merenje konačne optičke gustine.

[0100] Protokol eksperimenta de-agregacije, ukupna zapremina 20 ili 69 ml:

1. Izmeriti potrebnu količinu osnovnog rastvora u čaši. Izjednačiti na željenu temperaturu

2. Izmeriti potrebnu količinu sirćetne kiseline (100%) u čaši

3. Sirćetnu kiselinu (100%) pomešati sa 3 ili 10 ml Mili-Q vode i izbalansirati na željenu temperaturu

4. Izmešati osnovni rastvor degareliksa sa rastvorom sirćetne kiseline/Mili-Q vode

5. Dodati milli-Q vodu do 20 ili 69 ml.

6. Dobro promešati

2

7. Uzeti uzorke za viskoznost i optičku gustinu kao što je gore opisano. Obratiti pažnju na izgled rastvora tokom eksperimenta

[0101] Podešavanja za de-agregaciju dva osnovna rastvora degareliksa od 69 ml:

Konc. leka Degarelix 25 mg/ml u oba eksperimenta

Sirćetna kiselina: 10% ili 13%

Temperatura: 5°C

[0102] Punjenje dve test de-agregirane supstance leka (69 ml) u bočice i sušenje zamrzavanjem: De-agregirani rastvori su odmah napunjeni u 20R bočice. U svaku bočicu je napunjeno 5 ml. Bočice i zapremina treba da budu hladni tokom punjenja (po mogućnosti između 5-10°C). Čim su bočice bile napunjene, stavljene su u liofilizator i program je pokrenut.

[0103] Nakon sušenja zamrzavanjem i zatvaranja bočica, bočice su čuvane u liofilizatoru na 5°C do pražnjenja.

[0104] Dve liofilizovane supstance leka podvrgnute su sledećim analizama:

Viskoznost je merena na uzorcima od 20 mg/ml slobodne baze

Optička gustina je merena na uzorcima od 20 mg/ml

Sadržaj degareliksa

Sadržaj acetata

□ Rezultati

[0105]

2

Primer 7: Proizvodnja leka bez agensa za smanjenje viskoznosti

Mešanje šarži proizvoda leka u laboratorijskim razmerama korišćenjem dve de-agregirane supstance leka

[0106] Ekscipijensi navedeni u tabeli 1 koriste se u svim eksperimentima mešanja.

2

[0107] Oprema za mešanje:

Posuda za m staklena posuda sa dvostrukim zidom od 300 ml

Bočice sa plavim čepom, 100 ml

Magnet

Magnetna mešalica

[0108] Primarno pakovanje:

● Bezbojne staklene bočice od 10R. Bočice su oprane i osušene u toplotnoj komori.

● Čepovi za sušenje zamrzavanjem prečnika 20 mm, tip I

● Flip-Off čepovi prečnika 20 mm

Opis studije

[0109] Degareliks rastvori velike zapremine koji sadrže 20 mg/g degareliksa i 25 mg/g manitola se mešaju korišćenjem različitih šarži supstance leka i različitih podešavanja temperature.

[0110] Viskoznosti rastvora velike zapremine se mere tokom/nakon mešanja u dva navrata (nakon rastvaranja i na t = 120 minuta).

Kompozicija velike zapremine:

[0111] Veličina šarže i kompozicija dva rastvora velike zapremine prikazani su u tabeli 2.

2

Tabela 1: Veličina šarže i kompozicija rastvora velike zapremine

Eksperimentalni dizajn:

[0112] Parametri mešanja su dati u nastavku u tabeli 2.

Tabela 2: Parametri mešanja

Mešanje:

[0113] Mešanje se vrši sa mešalicom postavljenom u centru. Pre početka eksperimenata treba fiksirati centralni položaj.

1. Izmeriti potrebne sastojke

o 40g Milli-Q vode u posudi za mešanje.

o 1,25 g manitola u odgovarajućoj posudi.

o Izmeriti tačnu količinu supstance leka degareliks (videti tabelu 2) u odgovarajućoj posudi.

o Izmeriti preostalu količinu vode Milli-Q u odgovarajućoj posudi.

ovezati dvostruko obloženu posudu za mešanje koja sadrži Milli-Q vodu sa cirkulatorom za hlađenje. Povezati drugu dvostruko obloženu posudu u nizu. Posuda koja sadrži ostatak vode postavljena je u drugu dvostruko obloženu posudu kako bi se izjednačila na odgovarajuću temperaturu pre nego što se doda u zapreminu (korak 9).

ažljivo postaviti magnet za mešanje u posudu za mešanje. Podesiti brzinu mešanja na 50 o/min pomoću tahometra.

odesiti hladnjak na odgovarajuću temperaturu, započeti mešanje i dodati manitol u posudu za mešanje. Mešati dok se manitol ne rastopi.

ustiti da se sistem izjednači sa podešenom temperaturom.

meriti temperaturu u rastvoru manitola.

kloniti mešalicu. Pokrenuti tajmer i odmah dodati supstancu leka. Zatim ponovo umetnuti mešalicu.

t = 5 minuta dodati ostatak Milli-Q vode, ravnomerno preko površine supstance leka pomoću staklene Pasterove pipete.

ada ostane samo nekoliko grudvica, isprati supstancu leka sa strana posude sredstvom za rastvaranje.

Kada se supstanca leka potpuno rastvori, zabeležiti vreme i izmeriti temperaturu. Izvaditi uzorak za merenje viskoznosti zapremine.

Nastaviti eksperiment do t = 120 minuta. Izvaditi uzorak za merenje viskoznosti zapremine.

1

Filtriranje

[0114] Zapremine neće biti filtrirane jer se očekuje da će najmanje jedna od šarži biti visoko agregirana i stoga veoma teška za filtriranje. Takođe, šarže se neće koristiti u svrhe u kojima je potrebna sterilnost.

Punjenje

[0115] Napuniti 6,40 g zapremine u bočice od 10R. Bočice i zapremina treba da budu hladni tokom punjenja (po mogućnosti između 5-10°C). Čim se bočice napune, treba ih staviti u zamrzivač i pokrenuti program. Svaka zapremina treba da rezultira sa oko 6-7 bočica.

□ Rezultati

[0116] 18 različitih šarži supstance leka, sa različitim viskozitetom kao što je navedeno u tabeli ispod, obrađeno je kao što je gore opisano. Viskoznost odgovarajućih proizvoda leka određena je na sledeći način:

2

[0117] Ovi rezultati su grafički prikazani na slici 1. Na slici 1 prikazana je korelacija između viskoznosti supstance leka i viskoznosti proizvoda leka.

Primer 8: Proizvodnja leka sa agensom za smanjenje viskoznosti

Eksperiment 1: Testirani surfaktantni (rekonstitucija korišćenjem rastvora WFI/surfaktanta)

Procedura:

[0118]

● Šarža degareliksa je rekonstituisana korišćenjem WFI (kao kontrolne grupe) i korišćenjem WFI koja sadrži surfakante. Bočice su rekonstituisane do 60 mg/ml degareliksa. Zapremina proizvoda leka koja se koristi za ove eksperimente imala je zapreminsku viskoznost od oko 3,8 mPas.

● TPGS i Tween 20 su pripremljeni u rastvorima koji sadrže 1 mg/ml (0,1% rastvora)

● OD (apsorbancija) je izmerena na 350 nm

● Apsorbancija je registrovana nakon 30 min, 60 min, 120 min i 24 sata

Rezultat:

[0119] I TPCG i Tween 20 su smanjili optičku gustinu na nivo ispod kontrolne grupe.

Eksperiment 2: Rekonstitucija bočica degareliksa sa [WFI Tween 20] ne menja in vitro profil oslobađanja (IVD test) od 40 mg/ml degareliksa

[0120] Testirane koncentracije Tween 20:

1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml;

Kontrolna grupa: WFI

Rezultati: In vitro profili oslobađanja se ne menjaju dodavanjem Tween-20.

Primer 9: Viskoznost i bioraspoloživost proizvoda leka

Sažetak

[0121] Multivarijantna analiza podataka sprovedena je sa skupom podataka iz n=38 šarži proizvoda lekova koji sadrže degareliks, uključujući farmakokinetičke podatke in vivo (model pacova).

[0122] Uspostavljena je veza između fizičko-hemijskih karakteristika i farmakokinetike in vivo u modelu pacova. Studija je otkrila da se čini da je viskoznost rekonstituisanog proizvoda degareliksa istaknuti i jedini parametar sa izvesnom sposobnošću predviđanja performansi depoa in vivo.

□ Uvod

[0123] Proizvod leka degareliks se proizvodi kao liofilizovani proizvod koji sadrži manitol. Proizvodi se koriste kao istraživački lekovi u kliničkim studijama. Proizvedeno je nekoliko formulacija, koje sadrže različite količine degareliksa po bočici, naime 10 mg, 20 mg, 40 mg,

4

88 mg, 128 mg, 120 mg (40 mg/ml), 180 mg (60 mg/ml) i 240 mg (60 mg/ml) i različite odnose degareliksa/manitola.

□ Materijali

[0124] Približno 40 različitih šarži degareliksa je proizvedeno sa različitim šaržama supstance i formulacija degareliksa. Standardna koncentracija degareliksa u zapremini je 20 g/l, osim ako nije drugačije navedeno.

□ Metode

▪ Fizičko-hemijske metode

[0125] Različite metode za karakterizaciju agregacije izabrane su iz multivarijantne analize podataka. Prikupljeni su podaci iz n=38 šarži. Međutim, manje populacije su korišćene za neke metode koje su primenjene samo sa nekim formulacijama (npr. merenja pri 40 mg/ml nisu izvršena sa formulacijom od 20 mg).

▪ Biološki test pacova

[0126] Korišćen je standardizovani test na pacove koji se sastojao od praćenja farmakokinetičkog profila degareliksa tokom 28 dana. Da bi se izbegla lokalna neželjena dejstva, pacovima je dat degareliks u obliku suspenzije od 20 mg/ml sa zapreminom injekcije od 100 µl. Korišćene su grupe od n=8 pacova, svi tretirani rekonstituisanom suspenzijom koja potiče iz jedne bočice. Koncentracije u plazmi su inicijalno izmerene 2 sata, 1 dan, 7 dana i 28 dana, a parcijalni AUC je izračunat kao AUC 0-7 dana i AUC 7-28 dana. Dizajn je zatim promenjen tako što je merenje koncentracije u plazmi (Cp)-2 sata preskočeno i zamenjeno sa Cp-3 dana. Isto tako, AUC 0-7 dana je zamenjen sa AUC 1-7 dana. Ovo objašnjava diskontinuitete u veličinama populacije nekih in vivo varijabli.

▪ Multivarijantna analiza podataka

[0127] S obzirom na veličinu skupa podataka, implementiran je pristup multivarijantnom analizom podataka (PCA i PLS) sa softverom Simca-P, verzija 10 (Umetrics AB, SE-Umeå).

Podaci su obrađeni kao i ranije, uključujući meko blok skaliranje (1/4 korena), skaliranje do jedinične varijanse (UV) i centriranje. Podaci o zamućenosti su transformisani kako bi se poboljšala distribucija podataka. In vivo Cp podaci su takođe transformisani da bi se stabilizovala varijansa.

Odnos između fizičko-hemijskih i in vivo performansi proizvoda leka u modelu pacova

▪ Odnos između fizičko-hemijskih i in vivo performansi

[0128] Prvi model je izračunat na osnovu 2 komponente. Kvalitet prilagođavanja (R2=0,58) bio je relativno nizak s obzirom na veliku varijabilnost bioloških podataka (20-30%), ali je kvalitet predvidivosti (Q2=0,35) bio zadovoljavajući (R2-Q2 treba da bude u opsegu od 0,2 do 0,3). Iz grafikona rasipanja opterećenja (nije prikazano) moglo se videti da varijable kao što su zamućenost izmerena pri 20 mg/ml i sadržaj acetata nisu bile uticajne.

[0129] Stoga je generisan novi model isključujući ove 3 varijable (2 varijable zamućenosti merene pri 20 mg/ml i acetat), na osnovu 2 značajne komponente i dajući sličan opis podataka (R2=0,53), ali poboljšanu predvidivost (Q2=0,42). Najbolje objašnjene i predviđene varijable pacova bile su koncentracije u plazmi nakon 3 dana i 28 dana (Cp-3d, Cp-28d) i površina ispod krive između 1. i 7. dana (AUC 1-7d).

[0130] Grafikon pregleda koeficijenata pokazao je da su podaci o viskoznosti imali veće uticaje pri 20 mg/ml, a zatim pri 40 mg/ml, što je sve značajno na nivou pouzdanosti od 0,95 za svaku biološku varijablu. Specifična površina i zamućenost su očigledno imali manji uticaj i nisu bili značajni, čak i na nivou pouzdanosti od 0,90.

[0131] Odnos između dinamičke viskoznosti izmerene pri 20 mg/ml i najbolje prilagođenih bioloških varijabli prikazan je na slikama 2 i 3.

• Zaključak

[0132] Uspostavljena je čvrsta povezanost (R2=0,53) između viskoznosti konstituisanog proizvoda i in vivo performansi kako je istraženo u modelu pacova. U oba slučaja, veća viskoznost je dovela do smanjenog oslobađanja iz depoa. Ostale fizičko-hemijske varijable nisu bile relevantne sa izuzetkom sadržaja acetata za in vitro rastvaranje. Stoga se čini da je viskoznost konstituisanog proizvoda degareliksa istaknuti parametar sa određenom sposobnošću predviđanja in vitro oslobađanja i in vivo performansi depoa.

Claims (11)

Patentni zahtevi

1. Liofilizovana supstanca degareliksa koja se sastoji od degareliksa, 4,5 do 10,0% (m/m) sirćetne kiseline, rezidualne količine vode i nečistoća usled proizvodnog procesa, ako ih ima, koja pokazuje, nakon rastvaranja u vodi u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml vode koja sadrži 2,5 mas.% manitola, viskoznost do 3,2 mPas, pri čemu se viskoznost meri pomoću rotirajućeg viskozimetra opremljenog sistemom za merenje konusne ploče sa D=60 mm i 1°, brzina smicanja se povećava sa 0 na 500 s-1 u 20 koraka, koristeći program koraka rotacije sa kontrolisanom brzinom na konstantnoj temperaturi od 20+ -0,2°C.

2. Liofilizovana supstanca degareliksa prema patentnom zahtevu 1, koja nakon rastvaranja u vodi u količini od 20 mg slobodne baze degareliksa/ml vode koja sadrži 2,5 mas.% manitola, pokazuje viskoznost od 1,15 do 2,0 mPas, pri čemu se viskoznost meri pomoću rotirajućeg viskozimetra opremljenog sistemom za merenje konusne ploče sa D=60 mm i 1°, pri čemu se brzina smicanja povećava sa 0 na 500 s-1 u 20 koraka, koristeći program koraka rotacije sa kontrolisanom brzinom na konstantnoj temperaturi od 20+ -0,2°C.

3. Liofilizovana supstanca degareliksa prema jednom ili više patentnih zahteva 1 i 2, sa sadržajem vode od 10% ili manje (m/m).

4. Metoda za proizvodnju supstance leka degareliksa prema jednom ili više patentnih zahteva 1 do 3, koja obuhvata korake:

a. Pročišćavanje degareliksa dobijenog sintezom peptida tečne ili čvrste faze kako bi se dobio rastvor degareliksa čistoće od najmanje 95%;

b. Uparavanje rastvora da bi se koncentrovao rastvor degareliksa da bi se dobio agregirani degareliks;

c. Deagregacija agregiranog degareliksa sirćetnom kiselinom; i

d. Liofilizacija deagregiranog degareliksa da bi se obezbedila supstanca leka degareliksa.

5. Metoda prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je koncentracija sirćetne kiseline na kraju koraka c u opsegu od 15 do 35% (m/m).

6. Metoda prema patentnom zahtevu 4 ili 5, pri čemu je temperatura u koraku c u opsegu od -5 do 30 °C.

7. Metoda prema jednom ili više patentnih zahteva 4 do 6, pri čemu je koncentracija degareliksa (slobodna baza) u opsegu od 10 do 35 g/l.

8. Metoda za proizvodnju supstance leka degareliksa prema jednom ili više patentnih zahteva 1 do 3, koja obuhvata korake:

a. Pročišćavanje degareliksa dobijenog sintezom peptida tečne ili čvrste faze kako bi se dobio rastvor degareliksa čistoće od najmanje 95%;

b. Ubacivanje rastvora degareliksa na hromatografsku kolonu;

c. Eluiranje degareliksa iz kolone sirćetnom kiselinom da bi se obezbedio eluirani degareliks;

d. Liofilizacija eluiranog degareliksa da bi se obezbedila supstanca leka degareliksa.

9. Metoda prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je koncentracija sirćetne kiseline u koraku c u opsegu od 27 do 37 mas.%.

10. Metoda prema jednom ili više patentnih zahteva 8 do 9, pri čemu se eluirani degareliks filtrira pre liofilizacije.

11. Metoda za proizvodnju supstance leka degareliksa prema jednom ili više patentnih zahteva 1 do 3, koja obuhvata korake:

a. Pročišćavanje degareliksa dobijenog sintezom peptida tečne ili čvrste faze kako bi se dobio rastvor degareliksa čistoće od najmanje 95%;

b. Podešavanje koncentracije sirćetne kiseline prečišćenog rastvora degareliksa na 6 do 40% (m/m), ako je potrebno;

c. Sušenje raspršivanjem rastvora degareliksa kako bi se obezbedila supstanca leka degareliksa.