RS66093B1

RS66093B1 - Metode lečenja mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom i anemije

Info

Publication number: RS66093B1
Application number: RS20241154A
Authority: RS
Inventors: Abderrahmane Laadem; Robert Gale
Original assignee: Celgene Corp
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2024-11-29
Also published as: JP2020524139A; JP2024075579A; EP3638243B1; WO2018231905A1; EP3638243A1; JP7496686B2; ES2991738T3; EP4454707A3; US20200101134A1; SMT202400437T1; PT3638243T; HUE068733T2; EP4454707A2; LT3638243T; HRP20241477T1; SI3638243T1; PL3638243T3; DK3638243T3; WO2018231905A8; CN111050770A

Description

Opis

1. POLJE PRIMENE

[0001] Patent se generalno odnosi na metode lečenja anemije kod subjekta koji ima mijelofibrozu povezanu sa mijeloproliferativnom neoplazmom, a koje se sastoje od primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu.

2. POZADINA PRONALASKA

[0002] Anemija je smanjenje broja crvenih krvnih zrnaca ili manje od normalne količine hemoglobina u krvi. Anemija takođe može biti prouzrokovana smanjenom sposobnošću hemoglobina da vezuje kiseonik. Anemija je najčešći poremećaj krvi. Anemija može biti prouzrokovana infektivnom eritropoezom. Infektivna eritropoeza je prisutna ako se odvija aktivna eritropoeza, ali zrela crvena krvna zrnca ne nastaju odgovarajućom brzinom. Progenitorske ćelije prolaze apoptozu pre dostizanja stadijuma zrelih crvenih krvnih zrnaca.

[0003] Mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom- (MPN-) je krovni termin koji se koristi za opisivanje klonalne mijeloidne neoplazme koja može nastati direktno (primarna mijelofibroza (poznata i kao agnogena mijeloidna metaplazija, hronična idiopatska mijelofibroza, mijeloskleroza sa mijeloidnom metaplazijom i idiopatska mijelofibroza)) ili se razviti iz drugih mijeloidnih neoplazmi (policitemija vera i esencijalna trombocitemija), a karakteriše ih disfunkcija koštane srži i fibroza, ekstramedularna hematopoeza i povećana inflamacija. Mijelofibroza povezana sa MPN dovodi do prekomernog formiranja fibroznog tkiva u koštanoj srži, što može dovesti do teške anemije, umora, slabosti i povećane slezine i jetre. Trenutni tretmani za mijelofibrozu povezanu sa MPN uključuju hidroksiureju, splenektomiju i alogenu transplantaciju hematopoetskih matičnih ćelija. Međutim, lečenje hidroksiureom može pogoršati anemiju i postoji zabrinutost zbog njenog mutagenog potencijala pri dugotrajnoj upotrebi, splenektomija ima kratko trajanje odgovora u medijima, može skratiti preživljavanje nakon splenektomije i ima visok postoperativni morbiditet, a alogena transplantacija hematopoetskih matičnih ćelija može dovesti do leukemijske transformacije (Sochacki et al., 2016, Therapeutic approaches in myelofibrosis and myelodysplastic/myeloproliferative overlap syndromes, Onco Targets Ther, 2016(9):2273-286). Dakle, ostaje potreba za terapijama za lečenje mielofibroze povezane sa MPN.

[0004] Dva srodna receptora tipa II, ActRIIA i ActRIIB, identifikovani su kao receptori tipa II za aktivine (Mathews and Vale, 1991, Cell 65:973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). Osim aktivina, ActRIIA i ActRIIB mogu biohemijski da interaguju sa nekoliko drugih proteina iz familije TGF-beta, uključujući BMP7, Nodal, GDF8, i GDF11 (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 130:217-226; Lee i McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311; Yeo i Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev.16:2749-54). ALK4 je primarni receptor tipa I za aktivine, posebno za aktivin A, a ALK-7 takođe može poslužiti kao receptor za aktivine, posebno za aktivin B. Inhibitori signalizacije ActRIIB opisani su za lečenje neefikasne eritropoeze i mijelodisplastičnih sindroma (videti npr. Publikaciju međunarodne patentne prijave br. WO 2013/059347, WO 2011/020045 i WO 2016/090077).

[0005] Keohane C et al.: "Ruxolitinib for myelofibrosis", Clinical Investigation, Future Science, UK, vol.2, no. 10, 30 September 2012 (2012-09-30), strane 1023-1031, usmeren je na upotrebu ruksolitiniba u lečenju mijelofibroze. Anemija i trombocitopenija su identifikovane kao neželjeni efekti lečenja.

[0006] A Agarwal et al.: "Bone marrow fibrosis in primary myelofibrosis: pathogenic mechanisms and the role of TGF-beta", Stem cell investigation, 1 January 2016 (2016-01-01), strane 5-5, ukazuje da se inhibicija TGF-beta puta u kombinaciji sa drugim terapijama može pokazati korisnom u preokretanju fibroze koštane srži kod mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom.

[0007] R. N. V. S. Suragani et al.: "Modified activin receptor IIB ligand trap mitigates ineffective erythropoiesis and disease complications in murine beta-thalassemia", BLOOD, vol. 123, no. 25, 2 May 2014 (2014-05-02), strane 3864-3872, otkriva upotrebu modifikovanog aktivinskog receptora tipa IIB (ActRIIB) zamke liganda (RAP-536) u mišjem modelu beta-talasemije. Lečenje je ublažilo anemiju promovisanjem diferencijacije eritroidnih prekursora u kasnoj fazi i smanjenjem hemolize.

3. REZIME

[0008] Ovde je predviđen inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu u metodi za lečenje anemije kod subjekta koji ima mijelofibrozu povezanu sa mijeloproliferativnom neoplazmom, pri čemu je subjekt prethodno tretiran ruksolitinibom, pri čemu se metoda sastoji od primene na subjektu farmaceutski efikasne količine inhibitora signalizacije ActRIIB, pri čemu je inhibitor signalizacije ActRIIB fuzioni protein koji se sastoji od: (a) fragmenta ekstracelularnog domena ActRIIB, pri čemu fragment sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 9; (b) linkera; i (c) Fc IgG. Dalji aspekti i otelotvorenja pronalaska dati su u priloženim patentnim zahtevima.

[0009] Upućivanje na inhibitor signalizacije ActRIIB u vezi sa ovim pronalaskom treba shvatiti kao upućivanje na inhibitor signalizacije ActRIIB kako je gore definisano.

[0010] Metode lečenja ljudi ili životinja nisu obuhvaćene patentom. Ako se metoda lečenja pomene u kontekstu ovog pronalaska, treba je shvatiti kao inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu u takvoj metodi.

[0011] U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je primarna mijelofibroza. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana JAK2 mutacijom, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna količina je od 0,3 mg/kg do 2,0 mg/kg , npr.0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg. U specifičnim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna količina je 1 mg/kg. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu jednom svakih 21 dan, jednom svakih 28 dana ili jednom svakih 48 dana. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu jednom svakih 21 dan. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu intravenozno ili subkutano. U specifičnim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna količina je 1 mg/kg i inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu supkutano jednom svakih 21 dan. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu supkutano. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je humanizovani fuzioni protein koji se sastoji od ekstracelularnog domena ActRIIB koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:9 i humanog IgG1 Fc domena. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je fuzioni protein koji se sastoji od gorenavedenog ekstracelularnog domena ActRIIB i humanog IgG1 Fc domena. Poznati inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina izabrane iz grupe koja se sastoji od: (a) 90% identične sa SEQ ID NO:4; (b) 95% identične sa SEQ ID NO:4; (c) 98% identične sa SEQ ID NO:4; (d) SEQ ID NO:4; (e) 90% identične sa SEQ ID NO:7; (f) 95% identične sa SEQ ID NO:7; (g) 98% identične sa SEQ ID NO:7; (h) SEQ ID NO:7; (i) 90% identične sa SEQ ID NO:8; (j) 95% identične sa SEQ ID NO:8; (k) 98% identične sa SEQ ID NO:8; (1) SEQ ID NO:8; (m) 90% identične sa SEQ ID NO:11; (n) 95% identične sa SEQ ID NO:11; (o) 98% identične sa SEQ ID NO:11; i (p) SEQ ID NO:11. Poznati inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina izabrane iz grupe koja se sastoji od: (a) 90% identične sa SEQ ID NO:11; (b) 95% identične sa SEQ ID NO:11; (c) 98% identične sa SEQ ID NO:11; i (d) SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je čovek.

[0012] Lečenje u skladu sa ipronalaskom smanjuje ili ublažava jedan ili više simptoma mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom kod navedenog subjekta. U specifičnim otelotvorenjima, simptom je jedan ili više iz grupe koju čine umor, noćno znojenje, svrab, nelagodnost u stomaku, bol ispod rebara na levoj strani, rano zasićenje ili bol u kostima. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je primarna mijelofibroza. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 ddana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna količina inhibitora signalizacije ActRIIB je od 0,3 mg/kg do 2,0 mg/kg, npr. 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg. U specifičnim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna količina je 1 mg/kg. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu jednom svakih 21 dan, jednom svakih 28 dana ili jednom svakih 48 dana. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu jednom svakih 21 dan. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu intravenozno ili subkutano. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu supkutano. U specifičnim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna količina je 1 mg/kg i inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu supkutano jednom svakih 21 dan. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je humanizovani fuzioni protein koji se sastoji od ekstracelularnog domena ActRIIB koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:9 i humanog IgG1 Fc domena. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je fuzioni protein koji se sastoji od gorenavedenog ekstracelularnog domena ActRIIB i humanog IgG1 Fc domena. Poznati inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina izabrane iz grupe koja se sastoji od: (a) 90% identične sa SEQ ID NO:4; (b) 95% identične sa SEQ ID NO:4; (c) 98% identične sa SEQ ID NO:4; (d) SEQ ID NO:4; (e) 90% identične sa SEQ ID NO:7; (f) 95% identične sa SEQ ID NO:7; (g) 98% identične sa SEQ ID NO:7; (h) SEQ ID NO:7; (i) 90% identične sa SEQ ID NO:8; (j) 95% identične sa SEQ ID NO:8; (k) 98% identične sa SEQ ID NO:8; (1) SEQ ID NO:8; (m) 90% identične sa SEQ ID NO:11; (n) 95% identične sa SEQ ID NO:11; (o) 98% identične sa SEQ ID NO:11; i (p) SEQ ID NO:11. Poznati inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina izabrane iz grupe koja se sastoji od: (a) 90% identične sa SEQ ID NO:11; (b) 95% identične sa SEQ ID NO:11; (c) 98% identične sa SEQ ID NO:11; i (d) SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je čovek.

[0013] U jednom otelotvorenju, metoda se sastoji od primene na subjektu doze od 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg polipeptida koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11, pri čemu se polipeptid daje subjektu supkutano jednom svakih 21 dan U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je čovek.

[0014] U jednom otelotvorenju, metoda se sastoji od primene na subjektu doze od 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg polipeptida koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11, pri čemu se polipeptid daje subjektu supkutano jednom svakih 21 dan. U specifičnim otelotvorenjima, doza je 1 mg/kg. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je čovek.

[0015] U jednom otelotvorenju, metoda se sastoji od primene na subjektu doze od 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg polipeptida koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11, pri čemu se polipeptid daje subjektu supkutano jednom svakih 21 dan. U specifičnim otelotvorenjima, doza je 1 mg/kg. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je čovek.

4. TERMINOLOGIJA I SKRAĆENICE

[0016] Kao što se ovde koristi, „ActRII“ se odnosi na receptor aktivina tipa II. Kao što se ovde koristi, „ActRIIA“ se odnosi na receptor aktivina tip IIA. Videti na primer Mathews and Vale, 1991, Cell 65:973-982. GenBank<™>pristupni broj NM_001278579.1 daje primer sekvence nukleinske kiseline humanog ActRIIA. GenBank<™>pristupni broj NP_001265508.1 daje primer sekvence aminokiseline humanog ActRIIA. Kao što se ovde koristi, „ActRIIB“ se odnosi na receptor aktivina tip IIB. Videti na primer Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108. GenBank<™>pristupni broj NM 001106.3 daje primer sekvence nukleinske kiseline humanog ActRIIB. GenBank<™>pristupni broj NP_001097.2 daje primer sekvence aminokiseline humanog ActRIIB.

[0017] Kao što se ovde koriste, „Hb“ i „Hgb“ se odnose na hemoglobin.

[0018] Kao što se ovde koristi, „mg/kg“, u kontekstu doze inhibitora signalizacije ActRIIB, odnosi se na miligrame inhibitora signalizacije ActRIIB po kilogramu težine subjekta kome se inhibitor signalizacije ActRIIB primenjuje.

[0019] Kao što se ovde koristi, „MF“ se odnosi na mijelofibrozu.

[0020] Kao što se ovde koristi, „PMF“ se odnosi na primarnu mijelofibrozu.

[0021] Kao što se ovde koristi, „post-PV MF“ se odnosi na mijelofibrozu nakon policitemije vere.

[0022] Kao što se ovde koristi, „post-ET MF“ se odnosi na mijelofibrozu nakon esencijalne trombocitemije.

[0023] Kao što se ovde koristi, „MPN“ se odnosi na mijeloproliferativnu neoplazmu.

[0024] Kao što se ovde koristi, „RBC“ se odnosi na crvena krvna zrnca.

[0025] Kao što se ovde koristi, „RBC-TI“ se odnosi na transfuziju crvenih krvnih zrnaca nezavisnu od transfuzije.

4.1 KRATAK OPIS CRTEŽA

[0026]

SLIKA 1: Mehanizam delovanja Luspatercepta.

SLIKA 2: Dizajn studije.

5. DETALJAN OPIS

5.1 PREGLED

[0027] Ovde je predviđen inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu u metodi za lečenje anemije kod subjekta koji ima mijelofibrozu povezanu sa mijeloproliferativnom neoplazmom, pri čemu je subjekt prethodno tretiran ruksolitinibom, pri čemu se metoda sastoji od primene na subjektu farmaceutski efikasne količine inhibitora signalizacije ActRIIB, pri čemu je inhibitor signalizacije ActRIIB fuzioni protein koji se sastoji od: (a) fragmenta ekstracelularnog domena ActRIIB, pri čemu fragment sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 9; (b) linkera; i (c) Fc IgG. Dalji aspekti i otelotvorenja pronalaska dati su u priloženim patentnim zahtevima.

[0028] U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je primarna mijelofibroza. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna količina je od 0,3 mg/kg do 2,0 mg/kg, npr.0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu jednom svakih 21 dan, jednom svakih 28 dana ili jednom svakih 48 dana. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu jednom svakih 21 dan. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu intravenozno ili subkutano. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu supkutano. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je humanizovani fuzioni protein koji se sastoji od ekstracelularnog domena ActRIIB koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:9 i humanog IgG1 Fc domena. Poznati inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina izabrane iz grupe koja se sastoji od: (a) 90% identične sa SEQ ID NO:4; (b) 95% identične sa SEQ ID NO:4; (c) 98% identične sa SEQ ID NO:4; (d) SEQ ID NO:4; (e) 90% identične sa SEQ ID NO:7; (f) 95% identične sa SEQ ID NO:7; (g) 98% identične sa SEQ ID NO:7; (h) SEQ ID NO:7; (i) 90% identične sa SEQ ID NO:8; (j) 95% identične sa SEQ ID NO:8; (k) 98% identične sa SEQ ID NO:8; (1) SEQ ID NO:8; (m) 90% identične sa SEQ ID NO:11; (n) 95% identične sa SEQ ID NO:11; (o) 98% identične sa SEQ ID NO:11; i (p) SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina izabrane iz grupe koja se sastoji od: (a) 90% identične sa SEQ ID NO:11; (b) 95% identične sa SEQ ID NO:11; (c) 98% identične sa SEQ ID NO:11; i (d) SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je čovek.

[0029] Lečenje u skladu sa ipronalaskom smanjuje ili ublažava jedan ili više simptoma mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom kod navedenog subjekta. U specifičnim otelotvorenjima, simptom je jedan ili više iz grupe koju čine umor, noćno znojenje, svrab, nelagodnost u stomaku, bol ispod rebara na levoj strani, rano zasićenje ili bol u kostima. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je primarna mijelofibroza. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna količina je od 0,3 mg/kg do 2,0 mg/kg , npr. 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu jednom svakih 21 dan, jednom svakih 28 dana ili jednom svakih 48 dana. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu jednom svakih 21 dan. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu intravenozno ili subkutano. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu supkutano. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je humanizovani fuzioni protein koji se sastoji od ekstracelularnog domena ActRIIB koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:9 i humanog IgG1 Fc domena. Poznati inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina izabrane iz grupe koja se sastoji od: (a) 90% identične sa SEQ ID NO:4; (b) 95% identične sa SEQ ID NO:4; (c) 98% identične sa SEQ ID NO:4, (d) SEQ ID NO:4; (e) 90% identične sa SEQ ID NO:7; (f) 95% identične sa SEQ ID NO:7; (g) 98% identične sa SEQ ID NO:7; (h) SEQ ID NO:7; (i) 90% identične sa SEQ ID NO:8; (j) 95% identične sa SEQ ID NO:8; (k) 98% identične sa SEQ ID NO:8; (1) SEQ ID NO:8; (m) 90% identične sa SEQ ID NO:11; (n) 95% identične sa SEQ ID NO:11; (o) 98% identične sa SEQ ID NO:11; i (p) SEQ ID NO:11. Poznati inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina izabrane iz grupe koja se sastoji od: (a) 90% identične sa SEQ ID NO:11; (b) 95% identične sa SEQ ID NO:11; (c) 98% identične sa SEQ ID NO:11; i (d) SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je čovek.

[0030] U jednom otelotvorenju, metoda se sastoji od primene na subjektu doze od 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg polipeptida koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11, pri čemu se polipeptid daje subjektu supkutano jednom svakih 21 dan. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je čovek.

5.2 METODE LEČENJA

[0031] Ovde obelodanjena metoda je za lečenje mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu se metoda sastoji od primene farmaceutski efikasne količine inhibitora signalizacije ActRIIB kod subjekta. U specifičnim slučajevima mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je primarna mijelofibroza. U specifičnim slučajevima mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim slučajevima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12, ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim slučajevima mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim slučajevima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim slučajevima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim slučajevima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana ili uzrokovana JAK2 mutacijom, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim slučajevima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu.

[0032] U specifičnim slučajevima subjekt je subjekt opisan u Odeljku 5.3. U specifičnim slučajevima subjekt je čovek. U specifičnim slučajevima subjekt ima anemiju. U specifičnim slučajevima subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim slučajevima subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim slučajevima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu.

[0033] U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu kao deo kompozicije. U specifičnim slučajevima kompozicija je kompozicija opisana u Odeljku 5.5.

[0034] U specifičnim slučajevima, farmaceutski efikasna doza je doza opisana u Odeljku 5.6. U specifičnim slučajevima, farmaceutski efikasna količina je od 0,3 mg/kg do 2,0 mg/kg, npr. 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg inhibitora signalizacije ActRIIB. U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacijeActRIIB se daje subjektu sa učestalošću opisanom u Odeljku 5.6. U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacijeActRIIB se daje subjektu jednom u 21 dan, jednom u 28 dana ili jednom u 48 dana. U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu jednom u 21 dan.

[0035] U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu putem primene opisane u Odeljku 5.6. U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacijeActRIIB se daje subjektu intravenozno ili subkutano. U poželjnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu supkutano.

[0036] U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB je inhibitor signalizacije ActRIIB opisan u Odeljku 5.4. U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11. U poželjnom slučaju, inhibitor signalizacije ActRIIB je luspatercept. U specifičnim slučajevima, subjekt je čovek.

[0037] Ovde je takođe obelodanjena metoda za lečenje mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu metoda obuhvata primenu farmaceutski efikasne količine inhibitora signalizacije ActRIIB kod subjekta, i pri čemu navedeno lečenje smanjuje ili ublažava jedan ili više simptoma navedene mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom kod navedenog subjekta. U specifičnim slučajevima simptom je jedan ili više iz grupe koju čine umor, noćno znojenje, svrab, nelagodnost u stomaku, bol ispod rebara na levoj strani, rano zasićenje ili bol u kostima. U specifičnim slučajevima mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je primarna mijelofibroza. U specifičnim slučajevima mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim slučajevima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim slučajevima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim slučajevima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim slučajevima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim slučajevima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana JAK2 mutacijom, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim slučajevima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu.

[0038] U specifičnim slučajevima subjekt je subjekt opisan u Odeljku 5.3. U specifičnim slučajevima, subjekt je čovek. U specifičnim slučajevima, subjekt ima anemiju. U specifičnim slučajevima subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim slučajevima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim slučajevima subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim slučajevima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu.

[0039] U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu kao deo kompozicije. U specifičnim slučajevima kompozicija je kompozicija opisana u Odeljku 5.5.

[0040] U specifičnim slučajevima farmaceutski efikasna doza je doza opisana u Odeljku 5.6. U specifičnim slučajevima farmaceutski efikasna količina je od 0,3 mg/kg do 2,0 mg/kg, npr. 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg inhibitora signalizacije ActRIIB. U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacijeActRIIB se daje subjektu at a frequency described in Section 56. U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacijeActRIIB se daje subjektu jednom u 21 dan, jednom u 28 dana ili jednom u 48 dana. U poželjnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu jednom u 21 dan.

[0041] U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacijeActRIIB se daje subjektu putem primene opisane u Odeljku 5.6. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu intravenozno ili subkutano. U poželjnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu supkutano.

[0042] U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB je inhibitor signalizacije ActRIIB opisan u Odeljku 5.4. U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim slučajevima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11. U poželjnom slučaju, inhibitor signalizacije ActRIIB je luspatercept. U specifičnim slučajevima subjekt je čovek.

[0043] Ovde je predviđena metoda za lečenje anemije kod subjekta kome je to potrebno, koja obuhvata davanje subjektu farmaceutski efikasne količine inhibitora signalizacije ActRIIB, pri čemu subjekt ima mijelofibrozu povezanu sa mijeloproliferativnom neoplazmom kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je primarna mijelofibroza. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu.

[0044] U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je subjekt opisan u Odeljku 5.3. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je čovek. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu.

[0045] U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu kao deo kompozicije. U specifičnim otelotvorenjima, kompozicija je kompozicija opisana u Odeljku 5.5.

[0046] U specifičnim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza je doza opisana u Odeljku 5.6. U specifičnim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna količina je od 0,3 mg/kg do 2,0 mg/kg, npr. 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg inhibitora signalizacije ActRIIB. IU specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu sa učestalošću opisanom u Odeljku 5.6. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu jednom svakih 21 dan, jednom svakih 28 dana ili jednom svakih 48 dana. U poželjnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu jednom svakih 21 dan.

[0047] U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu putem primene opisane u Odeljku 5.6. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu intravenozno ili subkutano. U poželjnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu supkutano.

[0048] U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je inhibitor signalizacije ActRIIB opisan u odeljku 5.4. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11. U poželjnom otelotvorenju, inhibitor signalizacije ActRIIB je luspatercept. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je čovek.

[0049] U jednom otelotvorenju, metoda se sastoji od primene na subjektu doze od 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg polipeptida koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11, pri čemu se polipeptid daje subjektu supkutano jednom svakih 21 dan. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je primarna mijelofibroza. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu.

[0050] U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je subjekt opisan u Odeljku 5.3. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu.

[0051] U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu kao deo kompozicije. U specifičnim otelotvorenjima, kompozicija je kompozicija opisana u Odeljku 5.5.

[0052] U jednom otelotvorenju, metoda se sastoji od primene na subjektu doze od 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg polipeptida koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:11, pri čemu se polipeptid daje subjektu supkutano jednom svakih 21 dan. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je primarna mijelofibroza. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu.

[0053] U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je subjekt opisan u Odeljku 5.3. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu.

[0054] U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu kao deo kompozicije. U specifičnim otelotvorenjima, kompozicija je kompozicija opisana u Odeljku 5.5.

[0055] U jednom otelotvorenju, metoda se sastoji od primene na subjektu doze od 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg polipeptida koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11, pri čemu se polipeptid daje subjektu supkutano jednom svakih 21 dan. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je primarna mijelofibroza. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu.

[0056] U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je subjekt opisan u Odeljku 5.3. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu.

[0057] U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu kao deo kompozicije. U specifičnim otelotvorenjima, kompozicija je kompozicija opisana u Odeljku 5.5.

5.3 POPULACIJA PACIJENATA

[0058] Subjekti lečeni u skladu sa ovde opisanim metodama mogu biti bilo koji sisari kao što su glodari i primati, a u poželjnom otelotvorenju, ljudi. U određenim otelotvorenjima, subjekt je čovek. U određenim otelotvorenjima, ovde opisane metode mogu se koristiti za lečenje mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom i/ili anemije kod bilo kojih sisara, kao što su glodari i primati, i u poželjnom otelotvorenju, kod ljudskih subjekata.

[0059] U određenim otelotvorenjima, subjekt lečen u skladu sa ovde opisanim metodama može biti bilo kog uzrasta. U određenim otelotvorenjima,subjekt koji se leči u skladu sa metodama koje su ovde opisane ima manje od 18 godina. U specifičnom otelotvorenju, subjekt koji se leči u skladu sa metodama koje su ovde opisane ima manje od 13 godina. U drugom specifičnom otelotvorenju, subjekt koji se leči u skladu sa metodama koje su ovde opisane ima manje od 12, manje od 11, manje od 10, manje od 9, manje od 8, manje od 7, manje od 6 ili manje od 5 godina. U drugom specifičnom otelotvorenju, subjekt koji se leči u skladu sa metodama koje su ovde opisane ima 1-3 godine, 3-5 godina, 5-7 godina, 7-9 godina, 9-11 godina, 11-13 godina, 13-15 godina, 15-20 godina, 20-25 godina, 25-30 godina, ili više od 30 godina. U drugom specifičnom otelotvorenju, subjekt koji se leči u skladu sa metodama koje su ovde opisane ima 30-35 godina, 35-40 godina, 40-45 godina, 45-50 godina, 50-55 godina, 55-60 godina ili više od 60 godina. U drugom specifičnom otelotvorenju, subjekt koji se leči u skladu sa metodama koje su ovde opisane ima 60-65 godina, 65-70 godina, 70-75 godina, 75-80 godina, ili više od 80 godina.

[0060] Subjekt koji se leči u skladu sa ovde navedenim metodama ima mijelofibrozu povezanu sa mijeloproliferativnom neoplazmom. U određenim otelotvorenjima, mmijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je primarna mijelofibroza. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu.

[0061] Subjekt koji se leči u skladu sa ovde navedenim metodama ima mijelofibrozu povezanu sa mijeloproliferativnom neoplazmom i anemiju. U određenim otelotvorenjima, mmijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je primarna mijelofibroza. U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom JAK2 eksona 12 ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je mijelofibroza nakon policitemije vere. U specifičnijim otelotvorenjima, mijelofibroza nakon policitemije vere je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnim otelotvorenjima, mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom je esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije. U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije je povezana sa ili uzrokovana mutacijom JAK2, npr. mutacijom JAK2 V617F ili mutacijom trombopoetinskog receptora (MPL). U specifičnijim otelotvorenjima, esencijalna trombocitopenija ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije uključuje retikulinsku fibrozu ili trihromsku fibrozu.

[0062] Subjekt lečen u skladu sa ovde navedenim metodama prethodno je lečen ruksolitinibom. U specifičnom otelotvorenju, subjekt lečen u skladu sa ovde navedenim metodama bio je na stabilnoj dozi ruksolitiniba najmanje 112 dana neposredno pre lečenja.

[0063] U određenim otelotvorenjima, subjekt lečen u skladu sa ovde navedenim metodama je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako subjekt nije primio nijednu (0) jedinicu crvenih krvnih zrnaca tokom vremenskog perioda od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre prve primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu.

[0064] U određenim otelotvorenjima, subjekt tretiran u skladu sa ovde navedenim metodama zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. U specifičnim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 dana pre prve primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu.

5.4 INHIBITORI SIGNALIZACIJE ACTRIIB

[0065] Kao što se ovde koristi, termin „ActRIIB“ se odnosi na porodicu proteina receptora aktivina tipa IIB (ActRIIB) iz bilo koje vrste i varijanti izvedenih iz takvih ActRIIB proteina mutagenezom ili drugom modifikacijom. Upućivanje na ActRIIB u ovom tekstu je upućivanje na bilo koji od trenutno identifikovanih oblika receptora. Članovi porodice ActRIIB su uglavnom transmembranski proteini, sastavljeni od ekstracelularnog domena koji vezuje ligand sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskim domenom i citoplazmatskim domenom sa predviđenom aktivnošću serin/treonin kinaze.

[0066] Inhibitori signalizacije ActRIIB uključuju, bez ograničenja, aktivin-vezujuće rastvorljive ActRIIB polipeptide; antitela koja se vezuju za aktivin (posebno podjedinice aktivina A ili B, koje se takođe nazivaju βA ili βB) i ometaju vezivanje ActRIIB; antitela koja se vezuju za ActRIIB i ometaju vezivanje aktivina; proteine koji nisu antitela izabrane za vezivanje aktivina ili ActRIIB; i randomizovane peptide izabrane za vezivanje aktivina ili ActRIIB, koji se mogu konjugovati za Fc domen.

[0067] Dva ili više različitih proteina (ili drugih delova) sa aktivnošću vezivanja aktivina ili ActRIIB, posebno veziva za aktivin koja blokiraju mesta vezivanja tipa I (npr. rastvorljivi receptor aktivina tipa I) i tipa II (npr. rastvorljivi receptor aktivina tipa II), mogu biti povezani kako bi se stvorio bifunkcionalni ili multifunkcionalni molekul vezivanja koji inhibira ActRIIB i stoga se mogu koristiti u ovde opisanim kompozicijama i metodama. Slučajevi antagonista signalne ose aktivin-ActRIIB koji inhibiraju ActRIIB uključuju aptamere nukleinske kiseline, male molekule i druge agense koji se koriste u ovde opisanim kompozicijama i metodama.

5.4.1 Inhibitori signalizacije ActRIIB koji sadrže ActRIIB polipeptide

[0068] Kao što se ovde koristi, termin „ActRIIB polipeptid“ odnosi se na polipeptide koji se sastoje od bilo kog prirodnog polipeptida člana porodice ActRIIB, kao i svih njihovih varijanti (uključujući mutante, fragmente, fuzije i peptidomimetičke oblike) koji zadržavaju korisnu aktivnost. Na primer, ActRIIB polipeptidi uključuju polipeptide izvedene iz sekvence bilo kog poznatog ActRIIB receptora koji ima sekvencu najmanje oko 80% identičnu sekvenci ActRIIB polipeptida, i opciono najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta. Na primer, ActRIIB polipeptid može da se veže za i inhibira funkciju ActRIIB proteina i/ili aktivina. Primer ActRIIB polipeptida uključuje humani ActRIIB prekursorski polipeptid (SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO: 14). Što se tiče ActRIIB prekursorskog polipeptida čija je sekvenca aminokiselina prikazana kao SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO: 14 (tj. humani ActRIIB prekursorski polipeptid), signalni peptid ActRIIB prekursorskog polipeptida nalazi se na aminokiselinama 1 do 18; ekstracelularni domen se nalazi na aminokiselinama 19 do 134, a potencijalna N-vezana mesta glikozilacije se nalaze na aminokiselinskim pozicijama 42 i 65. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira prekursorski polipeptid humanog ActRIIB SEQ ID NO:3 je otkrivena kao SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:6 obezbeđuje alanin na kodonu koji odgovara aminokiselinskoj poziciji 64, ali lako može da se izmeni od strane stručnjaka za oblast koristeći metode koje su poznati u struci da se umesto toga obezbedi arginin na kodonu koji odgovara aminokiselinskoj poziciji 64). Za opis sekvenci, videti tabelu 2. Inhibitor signalizacije ActRIIB pronalaska definisan je u patentnim zahtevima.

[0069] Numeracija aminokiselina za sve ovde opisane polipeptide povezane sa ActRIIB zasniva se na numeraciji aminokiselina za SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO: 14 (koje se razlikuju samo u aminokiselini izraženoj na poziciji 64), osim ako nije drugačije naznačeno). Na primer, ako je ActRIIB polipeptid opisan kao da ima supstituciju/mutaciju na aminokiselinskoj poziciji 79, onda treba shvatiti da se pozicija 79 odnosi na 79. aminokiselinu u SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14, iz koje je izveden ActRIIB polipeptid. Isto tako, ako je ActRIIB polipeptid opisan kao da ima alanin ili arginin na aminokiselinskoj poziciji 64, onda treba shvatiti da se pozicija 64 odnosi na 64. aminokiselinu u SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14, iz koje je izveden ActRIIB polipeptid.

[0070] Inhibitori signalizacije ActRIIB koji se koriste u ovde opisanim kompozicijama i metodama obuhvataju polipeptide koji se sastoje od domena ActRIIB koji se vezuje za aktivin. U nekim slučajevima domeni koji vezuju aktivin ActRIIB obuhvataju vanćelijski domen ActRIIB, ili njegov deo. U određenim slučajevima, vanćelijski domen ili njegov deo ActRIIB je rastvorljiv. Ilustrativni modifikovani oblici polipeptida ActRIIB su otkriveni u U.S. publikacijama patentne prijave br. 20090005308 i 20100068215. Antagonisti A2aR su obelodanjeni u Publikaciji međunarodne patentne prijave br. WO 2008/097541 i WO 2010/019261

[0071] U specifičnim slučajevima, ActRIIB polipeptidi koji se koriste u ovde opisanim kompozicijama i metodama su rastvorljivi ActRIIB polipeptidi. Termin „rastvorljivi ActRIIB polipeptid“ se generalno odnosi na polipeptide koji se sastoje od ekstracelularnog domena ActRIIB proteina, uključujući bilo koji prirodni ekstracelularni domen ActRIIB proteina, kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente i peptidomimetičke oblike). Rastvorljivi ActRIIB polipeptidi mogu da se vezuju za aktivin; međutim, divlji tip ActRIIB proteina ne pokazuje značajnu selektivnost u vezivanju za aktivin naspram GDF8/11. U određenim slučajevima, izmenjeni oblici ActRIIB sa različitim svojstvima vezivanja mogu se koristiti u ovde navedenim metodama. Takvi izmenjeni obrasci su obelodanjeni, npr. u Publikaciji međunarodne patentne prijave br. WO 2006/012627 i WO 2010/019261. Nativnim ili izmenjenim proteinima ActRIIB može se dati dodatna specifičnost za aktivin putem kuplovanja sa drugim vezujućim agensom koji je selektivan za aktivin. Primeri rastvorljivih ActRIIB polipeptida uključuju ekstracelularni domen humanog ActRIIB polipeptida (npr. SEQ ID NO: 4, 5, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 28 i 29).

[0072] Fc fuzioni protein koji ima ActRIIB ekstracelularnu sekvencu koju su obelodanili Hilden et al. (Blood, 1994, 83(8):2163-70), koji ima alanin na poziciji koja odgovara aminokiselini 64 ActRIIB prekursorske sekvence aminokiselina, tj. SEQ ID NO:3 (u daljem tekstu „A64“), dokazan je da poseduje relativno nizak afinitet za aktivin i GDF-11. Nasuprot tome, Fc fuzioni protein sa argininom na poziciji 64 ActRIIB prekursorske sekvence aminokiselina (u daljem tekstu „R64“) ima afinitet za aktivin i GDF-11 u niskom nanomolarnom do visokom pikomolarnom opsegu (videti npr. Publikaciju američke patentne prijave br.20100068215). Videti, takođe, Međunarodnu publikaciju br. WO 2010/019261.

[0073] Prekursorska sekvenca aminokiselina ActRIIB sa argininom na poziciji 64 predstavljena je u SEQ ID NO:14. Kao takvi, u određenim otelotvorenjima, ActRIIB polipeptidi koji se koriste u skladu sa ovde opisanim kompozicijama i metodama mogu da sadrže ili (i) alanin na poziciji koja odgovara aminokiselini 64 prekursorske sekvence aminokiselina ActRIIB, tj. SEQ ID NO:3; ili (ii) arginin na poziciji 64 prekursorske sekvence aminokiselina ActRIIB, tj. SEQ ID NO:14. U drugim otelotvorenjima, ActRIIB polipeptidi koji se koriste u skladu sa ovde opisanim kompozicijama i metodama mogu da sadrže aminokiselinu koja nije alanin ili arginin na poziciji koja odgovara aminokiselini 64 prekursorske sekvence aminokiselina ActRIIB, tj. SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14.

[0074] Prikazano je da brisanje prolinskog čvora na C-terminusu ekstracelularnog domena ActRIIB smanjuje afinitet receptora za aktivin (videti npr. Attisano et al., Cell, 1992, 68(1):97-108). ActRIIB-Fc fuzioni protein koji sadrži aminokiseline 20-119 SEQ ID NO:14 (tj. SEQ ID NO:18), „ActRIIB(20-119)-Fc“ ima smanjeno vezivanje za GDF-11 i aktivin u odnosu na ActRIIB-Fc fuzioni protein koji sadrži aminokiseline 20-134 SEQ ID NO:14 (tj. SEQ ID NO:17), „ActRIIB(20-134)-Fc“, što uključuje region prolinskog čvora i kompletan domen jukstamembrane. Međutim, ActRIIB-Fc fuzioni protein koji sadrži aminokiseline 20-129 SEQ ID NO:14, „ActRIIB(20-129)-Fc“ zadržava sličnu, ali donekle smanjenu aktivnost u odnosu na vanćelijski domen ActRIIB, iako je region prolinskog čvora poremećen. Stoga se očekuje da će svi ActRIIB polipeptidi koji se sastoje od ekstracelularnih domena koji se zaustavljaju na aminokiselinama 134, 133, 132, 131, 130 i 129 SEQ ID NO:14 (ili SEQ ID NO:3) biti aktivni, ali konstrukcije koje se zaustavljaju na aminokiselinama 134 ili 133 mogu biti najaktivnije. Slično tome, ne očekuje se da mutacije na bilo kom od ostataka 129-134 značajno promene afinitet vezivanja liganda, na šta ukazuje činjenica da mutacije P129 i P130 SEQ ID NO:14 ne smanjuju značajno vezivanje liganda. Stoga se ActRIIB polipeptidi koji se koriste u skladu sa ovde opisanim metodama i kompozicijama mogu završiti već kao aminokiselina 109 (tj. konačni cistein) SEQ ID NO: 14 (ili SEQ ID NO:3), međutim, očekuje se da oblici koji se završavaju na ili između aminokiselinskih pozicija 109 i 119 SEQ ID NO:14 (ili SEQ ID NO:3) imaju smanjenu sposobnost vezivanja liganda.

[0075] Aminokiselina 29 SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:14 predstavlja početni cistein u prekursorskoj sekvenci ActRIIB. Očekuje se da će ActRIIB polipeptid koji počinje sa aminokiselinom 29 N-terminusa SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14, ili pre ovih aminokiselinskih pozicija, zadržati aktivnost vezivanja liganda. Mutacija alanina u asparagin na poziciji 24 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 uvodi sekvencu N-vezane glikozilacije bez značajnog uticaja na vezivanje liganda. To potvrđuje da se dobro podnose mutacije u regionu između signalnog peptida za cepanje i unakrsno vezanog regiona cisteina, što odgovara aminokiselinama 20-29 iz SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14. Konkretno, ActRIIB polipeptidi koji počinju na aminokiselinskoj poziciji 20, 21, 22, 23 i 24 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 će zadržati aktivnost, a očekuje se da će ActRIIB polipeptidi koji počinju na aminokiselinskim pozicijama 25, 26, 27, 28 i 29 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 takođe zadržati aktivnost. ActRIIB polipeptid koji počinje na aminokiselinskoj poziciji 22, 23, 24 ili 25 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO: 14 imaće najveću aktivnost.

[0076] Zajedno, aktivni delovi (tj. polipeptidi ActRIIB) prekursorskog proteina ActRIIB (tj. SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14) koji će se koristiti u skladu sa ovde opisanim metodama i kompozicijama generalno će se sastojati od aminokiselina 29-109 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14, a takvi polipeptidi ActRIIB mogu, na primer, početi sa ostatkom koji odgovara bilo kojoj od aminokiselina 19-29 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 i završiti na poziciji koja odgovara bilo kojoj od aminokiselina 109-134 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14. Specifični primeri polipeptida ActRIIB koji su ovde obuhvaćeni uključuju one koji počinju na aminokiselinskoj poziciji od 19-29, 20-29 ili 21-29 iz SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 i završavaju se na aminokiselinskoj poziciji od 119-134, 119-133 ili 129-134, 129-133 iz SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14. Specifični primeri ovde obuhvaćenih ActRIIB polipeptida uključuju one koji počinju na aminokiselinskoj poziciji od 20-24 (ili 21-24, ili 22-25) SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO: 14 i završavaju na aminokiselinskoj poziciji od 109-134 (ili 109-133), 119-134 (ili 119-133), ili 129-134 (ili 129-133) SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14. Takođe su razmatrane varijante polipeptida ActRIIB koje spadaju u ove raspone, naročito one koje imaju najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sekvence ili homologije sekvence sa odgovarajućim delom SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14.

[0077] U određenim slučajevima, inhibitori signalizacije ActRIIB koji se koriste u ovde opisanim kompozicijama i metodama čine skraćeni oblik vanćelijskog domena ActRIIB. To skraćenje može biti na karboksi terminusu i/ili na amino terminusu polipeptida ActRIIB. U određenim slučajevima, skraćenje može biti dugačko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 aminokiselina u odnosu na zreli ActRIIB polipeptidni ekstracelularni domen. U određenim slučajevima, skraćenje može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 N-terminalnih aminokiselina zrelog ActRIIB polipeptidnog ekstracelularnog domena. U određenim slučajevima, skraćenje može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 C-terminalnih aminokiselina zrelog ActRIIB polipeptidnog ekstracelularnog domena. Na primer, skraćeni oblici ActRIIB uključuju polipeptide sa aminokiselinama 20-119; 20-128; 20-129; 20-130; 20-131; 20-132; 20-133; 20-134; 20-131; 21-131; 22-131; 23-131; 24-131; i 25-131, pri čemu se aminokiselinske pozicije odnose na aminokiselinske pozicije u SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14.

[0078] Dodatni primeri skraćenih oblika ActRIIB uključuju (i) polipeptide koji počinju na aminokiselinama na bilo kojoj od aminokiselina 21-29 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 (opciono koji počinju na 22-25 SEQ ID NO: 3 ili SEQ ID NO:14) i završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 109-134 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14; (ii) polipeptide koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 20-29 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 (opciono koji počinju na 22-25 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14) i završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 109-133 SEQ ID NO: 3 ili SEQ ID NO:14; (iii) polipeptide koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 20-24 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 (opciono koji počinju na 22-25 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14) i završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 109-133 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14; (iv) polipeptide koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 21-24 SEQ ID NO: 3 ili SEQ ID NO:14 i završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 109-134 SEQ ID NO: 3 ili SEQ ID NO:14; (v) polipeptide koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 20-24 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 i završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 118-133 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14; (vi) polipeptide koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 21-24 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 i završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 118-134 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14; (vii) polipeptide koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 20-24 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 i završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 128-133 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14; (viii) polipeptide koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 20-24 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 i završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 128-133 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14, (ix) polipeptide koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 21-29 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 i završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 118-134 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14; (x) polipeptide koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 20-29 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 i završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 118-133 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14; (xi) polipeptide koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 21-29 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 i završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 128-134 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14; and (xii) polipeptide koji počinju na bilo kojoj od aminokiselina 20-29 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 i završavaju se na bilo kojoj od aminokiselina 128-133 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14. U specifičnom slučaju, ActRIIB polipeptidi se sastoji ili se u suštini sastoji od aminokiselinske sekvence koja počinje na aminokiselinskoj poziciji 25 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 i završava se na aminokiselinskoj poziciji 131 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14. U drugom specifičnom slučaju, ActRIIB polipeptid se sastoji ili se u suštini sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:4, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32 ili 33.

[0079] Bilo koji od ActRIIB polipeptida koji se koriste u ovde opisanim kompozicijama i metodama može se proizvesti kao homodimer. Bilo koji od ActRIIB polipeptida koji se koriste u ovde opisanim kompozicijama i metodama može se formulisati kao fuzioni protein koji ima heterologni deo koji se sastoji od konstantnog regiona iz IgG teškog lanca, kao što je Fc domen. Bilo koji od ActRIIB polipeptida koji se koriste u ovde opisanim kompozicijama i metodama može da sadrži kiselu aminokiselinu na poziciji koja odgovara poziciji 79 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14, opciono u kombinaciji sa jednom ili više dodatnih aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija u odnosu na SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14.

[0080] U specifičnim slučajevima, inhibitori signalizacije ActRIIB koji se koriste u ovde opisanim kompozicijama i metodama obuhvataju vanćelijski domen ActRIIB sa jednom ili više supstitucija/mutacija aminokiselina. Takva supstitucija/mutacija aminokiselina može biti, na primer, razmena iz leucina na poziciji aminokiseline 79 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 u kiselu aminokiselinu, kao što je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina. Na primer, pozicija L79 SEQ ID NO: 3 ili SEQ ID NO:14 može biti izmenjena u ActRIIB polipeptidima ekstracelularnog domena da bi se prenela izmenjena svojstva vezivanja aktivin-miostatina (GDF-11). Mutacije L79A i L79P smanjuju vezivanje GDF-11 u većoj meri nego vezivanje aktivina. Mutacije L79E i L79D zadržavaju vezivanje GDF-11, dok pokazuju značajno smanjeno vezivanje aktivina.

[0081] U određenim slučajevima, inhibitori signalizacije ActRIIB koji se koriste u ovde opisanim kompozicijama i metodama obuhvataju skraćeni oblik ActRIIB ekstracelularnog domena koji takođe nosi supstituciju aminokiselina, npr. razmenu sa leucina na aminokiselinskoj poziciji 79 SEQ ID NO: 3 ili SEQ ID NO:14 na kiselu aminokiselinu, kao što je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina. Prema patentnim zahtevima, skraćeni oblik ekstracelularnog domena ActRIIB polipeptida koji takođe nosi supstituciju aminokiselina koja se koristi u ovde opisanim kompozicijama i metodama je SEQ ID NO:9. Oblici ActRIIB koji su skraćeni i/ili nose jednu ili više supstitucija aminokiselina mogu biti povezani sa Fc domenom antitela kao što je gore pomenuto.

[0082] Funkcionalno aktivni fragmenti ActRIIB polipeptida mogu se dobiti, na primer, skriningom polipeptida rekombinantno proizvedenih iz odgovarajućeg fragmenta nukleinske kiseline koji kodira ActRIIB polipeptid. Pored toga, fragmenti mogu da se sintetišu hemijskim putem koristeći tehnike koje su poznate u struci, kao što je Merifildov postupak u čvrstoj fazi sa f-Moc ili t-Boc. Fragmenti mogu da se proizvedu (rekombinantno ili putem hemijske sinteze) i da se testiraju kako bi se identifikovali oni peptidilni fragmenti koji mogu da funkcionišu kao antagonisti (inhibitori) proteina ActRIIB ili signalizacije posredovane aktivinom.

[0083] Pored toga, funkcionalno aktivne varijante ActRIIB polipeptida mogu se dobiti, na primer, skriningom biblioteka modifikovanih polipeptida rekombinantno proizvedenih iz odgovarajućih mutagenizovanih nukleinskih kiselina koje kodiraju ActRIIB polipeptid. Varijante mogu da se proizvedu i da se testiraju kako bi se identifikovale one koje mogu da funkcionišu kao antagonisti (inhibitori) proteina ActRIIB ili signalizacije posredovane aktivinom. U određenim slučajevima, funkcionalna varijanta ActRIIB polipeptida obuhvata sekvencu aminokiselina koja je najmanje 75% identična sekvenci aminokiselina izabranih iz SEQ ID NO:4, 5, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 28 i 29. U određenim slučajevima, funkcionalna varijanta ima sekvencu aminokiselina od najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu sekvenci aminokiselina izabranih iz SEQ ID NO:4, 5, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 28 i 29.

[0084] Funkcionalne varijante se mogu generisati, na primer, modifikacijom strukture ActRIIB polipeptida u svrhe poboljšanja terapijske efikasnosti ili stabilnosti (npr. rok trajanja ex vivo i otpornost na proteolitičku degradaciju in vivo). Takvi modifikovani polipeptidi ActRIIB, kada se biraju da zadrže vezivanje aktivina, smatraju se funkcionalnim ekvivalentima prirodnih polipeptida ActRIIB. Modifikovani polipeptidi ActRIIB takođe mogu da se proizvedu, na primer, putem aminokiselinske supstitucije, delecije ili adicije. Na primer, razumno je očekivati da izolovana zamena leucina izoleucinom ili valinom, aspartata glutamatom, treonina serinom ili slična zamena aminokiseline strukturno srodnom aminokiselinom (npr. konzervativne mutacije) neće imati veliki uticaj na biološku aktivnost rezultujućeg molekula. Konzervativne zamene su one koje se odvijaju u okviru porodice aminokiselina koje su srodne po bočnim lancima. Da li promena aminokiselinske sekvence polipeptida ActRIIB dovodi do funkcionalnog homologa, lako može da se utvrdi procenom sposobnosti varijante polipeptida ActRIIB da proizvede odgovor u ćelijama na način sličan polipeptidu ActRIIB divljeg tipa.

[0085] ActRIIB polipeptidni mutanti, posebno skupovi kombinatornih mutanata ActRIIB polipeptida, kao i mutanti skraćivanja, grupe kombinatornih mutanata su posebno korisni za identifikaciju funkcionalnih varijanti sekvenci mogu se koristiti u ovde opisanim metodama i kompozicijama. Svrha skrininga takvih kombinatornih biblioteka može biti stvaranje, na primer, varijanti polipeptida ActRIIB koje mogu da deluju kao agonisti ili kao antagonisti, ili koje alternativno imaju potpuno novu aktivnost.

[0086] Dokazano je da je džep za vezivanje liganda ActRIIB definisan ostacima Y31, N33, N35, L38 do T41, E47, E50, Q53 do K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 do N83, Y85, R87, A92 i E94 do F 101 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO: 14. Očekuje se da će konzervativne mutacije na ovim pozicijama biti tolerisane, mada se mutacija K74A dobro podnosi, kao i R40A, K55A, F82A i mutacije na poziciji L79. R40 je K u Ksenopusu, što ukazuje na to da će se osnovne aminokiseline na ovoj poziciji tolerisati. Q53 je R u goveđem ActRIIB i K u ActRIIB ksenopusa, pa će se stoga aminokiseline uključujući R, K, Q, N i H tolerisati na ovoj poziciji. Dakle, opšta formula za ActRIIB polipeptid za upotrebu u ovde opisanim metodama i kompozicijama je ona koja se sastoji od aminokiselina 29-109 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO: 14, ali opciono počinje na poziciji aminokiselina u rasponu od 20-24 ili 22-25 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO: 14 i završava se na poziciji aminokiselina u rasponu od 129-134 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14, i ne sadrži više od 1, 2, 5 ili 15 konzervativnih promena aminokiselina u džepu za vezivanje liganda, i nula, jedne ili više nekonzervativnih promena na pozicijama aminokiselina 40, 53, 55, 74, 79 i/ili 82 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 u džepu za vezivanje liganda. Takav polipeptid ActRIIB može zadržati više od 80%, 90%, 95% ili 99% identičnosti sekvence ili homologije sekvence sa sekvencom aminokiselina 29-109 iz SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14. Mesta izvan žarišta vezivanja, gde varijabilnost može naročito dobro da se podnosi, uključuju amino i karboksi terminuse ekstracelularnog domena ActRIIB, i pozicije 42-46 i 65-73. Asparaginska promena alanina na poziciji 65 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 (N65A) zapravo poboljšava vezivanje liganda u pozadini A64 i stoga se očekuje da neće imati štetan uticaj na vezivanje liganda u pozadini R64. Ova promena verovatno eliminiše glikozilaciju na N65 u pozadini A64, čime se pokazuje da će značajna promena u ovom regionu verovatno biti tolerisana. Dok se promena R64A slabo podnosi, R64K se dobro podnosi, i stoga se drugi osnovni ostatak, kao što je H, može tolerisati na poziciji 64.

[0087] Kao specifičan primer ActRIIB polipeptida sa mutacijom u domenu vezivanja liganda, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak Asp (D80) domena vezivanja liganda ActRIIB može biti mutiran u drugačiji aminokiselinski ostatak tako da se varijanta ActRIIB polipeptida preferencijalno vezuje za GDF8, ali ne i za aktivin. U specifičnom slučaju, ostatak D80 se menja u aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: nenapunjenog aminokiselinskog ostatka, negativnog aminokiselinskog ostatka i hidrofobnog aminokiselinskog ostatka. Kao dalji specifičan primer, hidrofobni ostatak L79 može se izmeniti u kisele aminokiseline asparaginsku kiselinu ili glutaminsku kiselinu kako bi se u velikoj meri smanjilo vezivanje aktivina uz zadržavanje vezivanja GDF11. Kao što će biti jasno stručnjaku za oblast, većina opisanih mutacija, varijanti ili modifikacija može da se načini na nivou nukleinske kiseline, ili, u nekim slučajevima, putem posttranslacione modifikacije ili hemijske sinteze. Takve tehnike su dobro poznate u struci.

[0088] U specifičnim slučajevima, inhibitori signalizacije ActRIIB koji se koriste u ovde opisanim kompozicijama i metodama obuhvataju konjugovani/fuzioni protein koji se sastoji od ekstracelularnog domena (npr. domena vezivanja za aktivin) receptora ActRIIB povezanog sa Fc delom antitela. Takvi konjugovani/fuzioni proteini mogu da sadrže bilo koji od ActRIIB polipeptida otkrivenih u ovom dokumentu (npr. bilo koji od SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33), bilo koji ActRIIB polipeptida poznatih u struci, ili bilo koji ActRIIB polipeptida generisanih korišćenjem metoda poznatih u struci i/ili datih u ovom dokumentu.

[0089] U određenim slučajevima, ekstracelularni domen je povezan sa Fc delom antitela preko linkera, npr. peptidnog linkera. Primeri linkera uključuju kratke polipeptidne sekvence kao što su 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 aminokiselinski ostaci (npr. ostaci glicina), kao što je, na primer, Gly-Gly-Gly linker. U specifičnom slučaju, linker se sastoji od aminokiselinske sekvence Gly-Gly-Gly (GGG). U drugom specifičnom slučaju, linker se sastoji od aminokiselinske sekvence Thr-Gly-Gly-Gly (TGGG). Opciono, Fc domen ima jednu ili više mutacija na ostacima kao što su Asp-265, lizin 322, i Asn-434. U određenim slučajevima, mutantni Fc domen koji ima jednu ili više ovih mutacija (npr. mutacija Asp-265) ima smanjenu sposobnost vezivanja za Fcy receptor u odnosu na Fc domen divljeg tipa. U drugim slučajevima, mutantni Fc domen koji ima jednu ili više ovih mutacija (npr. mutacija Asn-434) ima povećanu sposobnost vezivanja za Fc-receptor (FcRN) povezan sa MHC klasom I u odnosu na Fc domen divljeg tipa. Primeri fuzionih proteina koji se sastoje od rastvorljivog ekstracelularnog domena ActRIIB spojenog sa Fc domenom navedeni su u SEQ ID NO:20, 21, 24, 25 ili 34.

[0090] U specifičnom slučaju, inhibitori signalizacije ActRIIB koji se koriste u ovde opisanim kompozicijama i metodama obuhvataju vanćelijski domen ActRIIB, ili njegov deo, povezan sa Fc delom antitela, pri čemu navedeni inhibitor signalizacije ActRIIB obuhvata sekvencu aminokiselina koja je najmanje 75% identična sekvenci aminokiselina izabranih iz SEQ ID NO:20, 21, 24, 25, 34. U drugom specifičnom slučaju, ActRIIB inhibitori signalizacije koji se koriste u ovde opisanim kompozicijama i metodama obuhvataju ekstracelularni domen ActRIIB, ili njegov deo, povezan sa Fc delom antitela, pri čemu navedeni ActRIIB inhibitor signalizacije obuhvata sekvencu aminokiselina koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci aminokiselina izabranih iz SEQ ID NO:20, 21, 24, 25 i 34.

[0091] U specifičnom slučaju, inhibitor signalizacije ActRIIB koji će se koristiti u ovde opisanim kompozicijama i metodama je fuzioni protein između ekstracelularnog domena humanog ActRIIB receptora i Fc dela IgG1. U drugom specifičnom slučaju, inhibitor signalizacije ActRIIB koji će se koristiti u ovde opisanim kompozicijama i metodama je fuzioni protein između skraćenog vanćelijskog domena humanog ActRIIB receptora i Fc dela IgG1. U drugom specifičnom slučaju, inhibitor signalizacije ActRIIB koji će se koristiti u ovde opisanim kompozicijama i metodama je fuzioni protein između skraćenog vanćelijskog domena humanog ActRIIB receptora i Fc dela IgG1, pri čemu skraćeni vanćelijski domen humanog ActRIIB receptora poseduje aminokiselinsku supstituciju na aminokiselinskoj poziciji koja odgovara aminokiselini 79 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14. U jednom otelotvorenju, supstitucija aminokiselina na aminokiselinskoj poziciji koja odgovara aminokiselini 79 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 je supstitucija leucina za asparaginsku kiselinu (tj. mutacija L79D).

[0092] U specifičnom otelotvorenju, inhibitor signalizacije ActRIIB koji će se koristiti u ovde opisanim kompozicijama i metodama je SEQ ID NO:10 ili 11, koji predstavlja fuzioni protein između ekstracelularnog domena humanog ActRIIB receptora i Fc dela IgG1, pri čemu navedeni ActRIIB ekstracelularni domen sadrži aminokiseline 25-131 SEQ ID NO:14 sa mutacijom L79D. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein ActRIIB-Fc SEQ ID NO:10 data je u SEQ ID NO:31.

[0093] U drugom specifičnom slučaju, inhibitor signalizacije ActRIIB koji će se koristiti u ovde opisanim kompozicijama i metodama je SEQ ID NO:20 ili 21, koji predstavlja fuzioni protein između ekstracelularnog domena humanog ActRIIB receptora i Fc dela IgG1, pri čemu navedeni ActRIIB ekstracelularni domen sadrži aminokiseline 25-131 SEQ ID NO:3 sa mutacijom L79D.

[0094] Mesta prepoznavanja glikozilacije povezane sa asparaginom generalno obuhvataju tripeptidnu sekvencu, asparagin-X-treonin (ili asparagin-X-serin) (gde je „X“ bilo koja aminokiselina) koja je posebno prepoznata odgovarajućim ćelijskim enzimima glikozilacije. Alteracija se takođe može izvršiti dodavanjem ili zamenom sa jednim ili više serinskih ili treoninskih ostataka u sekvencu divljeg tipa ActRIIB polipeptida (za O-vezana mesta glikozilacije). Različite aminokiselinske supstitucije ili delecije na jednoj ili obe od prvih ili trećih pozicija aminokiselina na mestu prepoznavanja glikozilacije (i/ili delecija aminokiselina na drugoj poziciji) rezultiraju neglikozilacijom na modifikovanoj tripeptidnoj sekvenci. Drugi način za povećanje broja ugljovodoničnih ostataka na polipeptidu ActRIIB je putem hemijskog ili enzimskog kuplovanja glikozida sa polipeptidom ActRIIB. U zavisnosti od korišćenog režima spajanja, šećer(i) mogu biti vezani za (a) arginin i histidin; (b) slobodne karboksilne grupe; (c) slobodne sulfhidrilne grupe kao što su one cisteina; (d) slobodne hidroksilne grupe kao što su one serina, treonina ili hidroksiprolina; (e) aromatične ostatke kao što su oni fenilalanina, tirozina ili triptofana, ili (f) amidnu grupu glutamina. Ove metode su opisane u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 87/05330, objavljenoj 11. septembra 1987. godine i u Aplin i Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., str. 259-306. Uklanjanje jednog ili više ugljovodoničnih ostataka koji su prisutni na polipeptidu ActRIIB može da se ostvari hemijskim i/ili enzimskim putem. Hemijska deglikozilacija može uključivati, na primer, izlaganje ActRIIB polipeptida jedinjenju trifluorometansulfonskoj kiselini ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovo tretiranje dovodi do cepanja većine ili svih šećera osim vezujućeg šećera (N-acetil glukozamin ili N-acetil galaktozamin), pri čemu aminokiselinska sekvenca ostaje netaknuta. Hemijsku deglikozilaciju su dalje opisali Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys.259:52 i Edge et al. (1981) Anal. Biochem.118:131. Enzimsko cepanje ugljovodoničnih ostataka na polipeptidima ActRIIB može da se postigne upotrebom različitih endo- i egzo-glikozidaza, kao što su opisali Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. Sekvenca ActRIIB polipeptida može biti naknadna, po potrebi, u zavisnosti od tipa korišćenog sistema ekspresije, jer ćelije sisara, kvasca, insekata i biljaka mogu uvesti različite obrasce glikozilacije na koje može uticati aminokiselinska sekvenca peptida. Uopšteno, proteini ActRIIB za upotrebu kod ljudi biće eksprimirani u ćelijskoj liniji sisara koja obezbeđuje odgovarajuću glikozilaciju, kao što su HEK293 ili CHO ćelijske linije, mada se očekuje da će biti korisni i drugi ekspresioni sistemi, kao što su druge ekspresione ćelijske linije sisara, ćelijske linije kvasaca sa konstruisanim enzimima za glikozilaciju i ćelije insekata.

[0095] U specifičnim slučajevima, mutirani ActRIIB polipeptidi koji se sastoje od dodavanja dodatnog N-vezanog mesta glikozilacije (N-X-S/T) koje povećava poluvreme eliminacije seruma ActRIIB-Fc fuzionog proteina, u odnosu na ActRIIB(R64)-Fc oblik, mogu se koristiti u ovde opisanim metodama i kompozicijama. U specifičnom slučaju, uvođenje asparagina na poziciji 24 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14 (A24N) rezultira stvaranjem NXT sekvence koja daje duže poluvreme eliminacije. Ostale NX(T/S) sekvence se mogu naći na 42-44 (NQS) i 65-67 (NSS), iako potonje možda neće biti efikasno glikozilirane sa R na poziciji 64 (tj. u R64 polipeptidima). N-X-S/T sekvence se generalno mogu uvesti na pozicijama izvan džepa za vezivanje liganda ActRIIB, što je gore opisano. Posebno pogodna mesta za uvođenje neendogenih N-X-S/T sekvenci uključuju aminokiseline 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 ili 129-134 SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO: 14. Sekvence N-X-S/T takođe mogu da se uvedu u linker između sekvence ActRIIB i Fc ili druge fuzione komponente. Takvo mesto se može uvesti sa minimalnim naporom uvođenjem N u ispravnu poziciju odnosu na već postojeći S ili T, ili uvođenjem S ili T na poziciju koja odgovara već postojećem N. Dakle, poželjne izmene koje bi stvorile mesto glikozilacije vezano za N su: A24N, R64N, S67N (moguće u kombinaciji sa izmenom N65A), E106N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S i R112T (sa svim pozicijama aminokiselina koje odgovaraju pozicijama koje se mogu naći u SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:14). Svaki S za koji je predviđeno da bude glikozilovan može da se izmeni u T bez nastanka imunogenog mesta, zahvaljujući zaštiti koju daje glikozilacija. Slično tome, svaki T za koji je predviđeno da bude glikozilovan može da se izmeni u S. Tako, ovde su obuhvaćene izmene S67T i S44T. Slično tome, u varijanti A24N, može da se koristi izmena S26T. Shodno tome, polipeptid ActRIIB može da uključuje jednu ili više dodatnih, neendogenih sekvenci konsenzusa N-vezane glikozilacije.

[0096] Za procenu ActRIIB polipeptidnih varijanti mogu se koristiti različiti skrining testovi. Na primer, ActRIIB polipeptidna varijanta može biti pregledana na sposobnost vezivanja za ActRIIB ligand, kako bi se sprečilo vezivanje ActRIIB liganda za ActRIIB polipeptid ili ometala signalizacija izazvana ActRIIB ligandom. Aktivnost ActRIIB polipeptida ili njegovih varijanti takođe se može testirati u testu na bazi ćelija ili in vivo.

[0097] Mogu se generisati kombinovano izvedene varijante koje imaju selektivnu ili generalno povećanu potenciju u odnosu na prirodni ActRIIB polipeptid. Isto tako, mutageneza može dovesti do varijanti koje imaju unutarćelijsko poluvreme eliminacije koje se dramatično razlikuje od odgovarajućeg divljeg tipa ActRIIB polipeptida. Na primer, izmenjeni protein može biti stabilniji ili manje stabilan na proteolitičku razgradnju ili druge ćelijske procese koji rezultiraju uništavanjem ili na drugi način inaktivacijom nativnog ActRIIB polipeptida. Takve varijante, i geni koji ih kodiraju, mogu da se koriste da se nivo polipeptida ActRIIB izmeni modulacijom poluvremena eliminacije polipeptida ActRIIB. Na primer, kratko poluvreme eliminacije može dovesti do prolaznijeg biološkog dejstva i može da omogući bolju kontrolu nivoa rekombinantnog polipeptida ActRIIB kod subjekta. U Fc fuzionom proteinu, mogu se napraviti mutacije u linkeru (ako postoji) i/ili Fc delu da bi se promenilo poluvreme eliminacije proteina.

[0098] Kombinatorna biblioteka može biti proizvedena putem degenerisane biblioteke gena koja kodira biblioteku polipeptida od kojih svaka uključuje najmanje deo potencijalnih ActRIIB polipeptidnih sekvenci. Na primer, smeša sintetičkih oligonukleotida može se enzimski ligirati u genske sekvence tako da se degenerisani skup potencijalnih ActRIIB polipeptidnih nukleotidnih sekvenci može izraziti kao pojedinačni polipeptidi, ili alternativno, kao skup većih fuzionih proteina (npr. za prikaz faga).

[0099] Postoji mnogo načina na koje se biblioteka potencijalnih homologa može generisati iz degenerisane oligonukleotidne sekvence. Hemijska sinteza degenerisane sekvence gena može se sprovesti u automatskom DNK sintetizatoru, a sintetički geni se zatim ligiraju u odgovarajući vektor za ekspresiju. Sinteza degenerisanih oligonukleotida je dobro poznata u struci (videti na primer, Narang, S A (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier str. 273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Takve tehnike su korišćene u usmerenoj evoluciji drugih proteina (videti na primer, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; kao i U.S. pat. br. 5,223,409, 5,198,346, i 5,096,815).

[0100] Alternativno, drugi oblici mutageneze mogu se koristiti za generisanje kombinatorne biblioteke. Na primer, ActRIIB polipeptidne varijante mogu se generisati i izolovati iz biblioteke skriningom koristeći, na primer, mutagenezu skeniranjem alanina i slično (Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem.218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem.268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; and Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), mutagenezom skeniranja linkera (Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol.12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); mutagenezom zasićenja (Meyers et al., (1986) Science 232:613); PCR mutagenezom (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); ili nasumičnom mutagenezom, uključujući hemijsku mutagenezu, itd. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; and Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). Mutageneza skeniranja linkera, posebno u kombinatorskom okruženju, atraktivna je metoda za identifikaciju skraćenih (bioaktivnih) oblika ActRIIB polipeptida.

[0101] U struci je poznat širok spektar tehnika za skrining genskih proizvoda kombinatornih biblioteka napravljenih tačkastim mutacijama i skraćenjima, i, u tom smislu, za skrining cDNK biblioteka za genske proizvode koji imaju određeno svojstvo. Takve tehnike će generalno moći da se prilagode za brzi skrining biblioteka gena koje su dobijene kombinatornom mutagenezom polipeptida ActRIIB. Najzastupljenije korišćene tehnike za skrining velikih biblioteka gena obično obuhvataju kloniranje biblioteke gena u replikabilne ekspresione vektore, transformaciju odgovarajućih ćelija u dobijenoj biblioteci vektora, i ekspresiju kombinatornih gena u uslovima u kojima detekcija željene aktivnosti omogućava relativno lako izolovanje vektora koji kodira gen čiji proizvod je detektovan. Poželjni testovi uključuju testove vezivanja aktivina i testove ćelijske signalizacije posredovane aktivinom.

[0102] U određenim otelotvorenjima, ActRIIB polipeptidi koji se koriste u ovde opisanim metodama i kompozicijama mogu dalje da sadrže posttranslacione modifikacije pored bilo kojih koje su prirodno prisutne u ActRIIB polipeptidima. Takve modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, acetilaciju, karboksilaciju, glikozilaciju, fosforilaciju, lipidaciju i acilaciju. Kao rezultat toga, modifikovani ActRIIB polipeptidi mogu da sadrže elemente koji nisu aminokiseline, kao što su polietilen glikoli, lipidi, poli- ili mono-saharidi i fosfati. Efekti takvih ne-aminokiselinskih elemenata na funkcionalnost ActRIIB polipeptida mogu se ispitati bilo kojom metodom poznatom kvalifikovanom stručnjaku. Kada se polipeptid ActRIIB proizvodi u ćelijama putem cepanja nastajućeg oblika polipeptida ActRIIB, posttranslaciona obrada takođe može biti značajna za pravilno savijanje i/ili funkcionisanje proteina. Različite ćelije (kao što su CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 ili HEK293) imaju specifičnu ćelijsku mašineriju i karakteristične mehanizme za takve posttranslacione aktivnosti i mogu biti izabrane da obezbede ispravnu modifikaciju i obradu ActRIIB polipeptida.

[0103] U određenim aspektima, funkcionalne varijante ili modifikovani oblici ActRIIB polipeptida uključuju fuzione proteine koji imaju najmanje deo ActRIIB polipeptida i jedan ili više fuzionih domena. Dobro poznati primeri takvih fuzionih domena uključuju, ali nisu ograničeni na, polihistidin, Glu-Glu, glutation S transferazu (GST), tioredoksin, protein A, protein G, konstantni region teškog lanca imunoglobulina (Fc), protein koji vezuje maltozu (MBP), ili humani serumski albumin. Fuzioni domen može biti izabran tako da daje željenu osobinu. Na primer, neki fuzioni domeni su posebno korisni za izolovanje fuzionih proteina pomoću afinitetne hromatografije. U svrhu afinitetnog prečišćavanja, koriste se relevantne matrice za afinitetnu hromatografiju, kao što su glutation-, amilaza- i nikl- ili kobaltkonjugovane smole. Brojne takve matrice su dostupne u obliku „kompleta“, kao što je sistem za prečišćavanje Pharmacia GST i sistem QIAexpressTM (Qiagen) koji su korisni sa (HIS6) fuzionim partnerima. Kao drugi primer, može se izabrati domen fuzije kako bi se olakšalo detekciju ActRIIB polipeptida. Primeri takvih domena detekcije uključuju različite fluorescentne proteine (npr. GFP), kao i „epitopske oznake“, koje su obično kratke peptidne sekvence za koje je dostupno specifično antitelo. Dobro poznate oznake epitopa za koje su specifična monoklonska antitela lako dostupna uključuju OZNAKU FLAG, hemaglutinin (HA) virusa gripa i c-myc oznake. U nekim slučajevima, domeni fuzije imaju mesto cepanja proteaze, kao što je za faktor Xa ili trombin, što omogućava relevantnoj proteazi da delimično svari fuzione proteine i time oslobodi tamošnje rekombinantne proteine. Oslobođeni proteini zatim mogu da se izoluju iz fuzionog domena pomoću daljeg hromatografskog razdvajanja. U određenim poželjnim slučajevima, ActRIIB polipeptid je spojen sa domenom koji stabilizuje ActRIIB polipeptid in vivo (domen „stabilizatora“). Pod „stabilizacijom“ se podrazumeva sve što povećava poluvreme eliminacije seruma, bez obzira da li je to zbog smanjenog uništenja, smanjenog klirensa bubrega ili drugog farmakokinetičkog efekta. Poznato je da fuzije sa Fc delom imunoglobulina daju željene farmakokinetičke osobine širokom rasponu proteina. Slično tome, fuzija sa albuminom humanog seruma može dati željene osobine. Druge vrste fuzionih domena koje mogu da se izaberu uključuju multimerizujuće (npr. dimerizujuće, tetramerizujuće) domene i funkcionalne domene (koji daju dodatnu biološku funkciju, kao što je dodatna stimulacija rasta kostiju ili rasta mišića, po želji).

[0104] Podrazumeva se da različiti elementi fuzionih proteina mogu biti raspoređeni na bilo koji način koji je u skladu sa željenom funkcionalnošću. Na primer, polipeptid ActRIIB može da se postavi C-terminalno u odnosu na heterologni domen, ili, alternativno, heterologni domen može da se postavi Cterminalno u odnosu na polipeptid ActRIIB. Domen polipeptida ActRIIB i heterologni domen ne moraju biti susedni u fuzionom proteinu, i dodatni domeni ili aminokiseline mogu biti ubačeni C- ili N-terminalno u odnosu na bilo koji domen ili između domena.

[0105] U određenim slučajevima, ActRIIB polipeptidi koji se koriste u ovde opisanim metodama i kompozicijama sadrže jednu ili više modifikacija koje su sposobne da stabilizuju ActRIIB polipeptide. Na primer, takve modifikacije poboljšavaju poluvreme eliminacije ActRIIB polipeptida in vitro, poboljšavaju poluvreme eliminacije cirkulacije ActRIIB polipeptida ili smanjuju proteolitičku degradaciju ActRIIB polipeptida. Takve stabilizujuće modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, fuzione proteine (uključujući, na primer, fuzione proteine koji se sastoje od ActRIIB polipeptida i domena stabilizatora), modifikacije mesta glikozilacije (uključujući, na primer, dodavanje mesta glikozilacije na ActRIIB polipeptid) i modifikacije dela ugljenih hidrata (uključujući, na primer, uklanjanje delova ugljenih hidrata iz ActRIIB polipeptida). U slučaju fuzionih proteina, polipeptid ActRIIB je fuzionisan sa stabilizujućim domenom kao što je molekul IgG (npr. Fc domen). Kao što se ovde koristi, termin „domen stabilizatora“ se ne odnosi samo na fuzioni domen (npr. Fc) kao u slučaju fuzionih proteina, već uključuje i neproteinske modifikacije kao što je ugljeni hidratni deo ili neproteinski polimer, kao što je polietilen glikol.

[0106] U određenim slučajevima, ovde opisane metode i kompozicije koriste izolovane ili prečišćene ActRIIB polipeptide, tj. ActRIIB polipeptide koji su izolovani od, ili na drugi način suštinski slobodni od, drugih proteina, mogu se koristiti sa ovde opisanim metodama i kompozicijama. Polipeptidi ActRIIB će se obično proizvoditi ekspresijom iz rekombinantnih nukleinskih kiselina.

[0107] U određenim aspektima, ActRIIB polipeptidi koji se koriste u ovde opisanim metodama i kompozicijama kodirani su izolovanim i/ili rekombinantnim nukleinskim kiselinama, uključujući fragmente, funkcionalne varijante i fuzione proteine otkrivene ovde. Na primer, SEQ ID NO:6 kodira prirodni prekursorski polipeptid humanog ActRIIB. Predmetne nukleinske kiseline mogu biti jednolančane ili dvolančane. Takve nukleinske kiseline mogu biti molekuli DNK ili RNK. Ove nukleinske kiseline se mogu koristiti, na primer, u metodama za pravljenje ActRIIB polipeptida ili kao direktni terapijski agensi (npr. u pristupu genskoj terapiji).

[0108] U određenim aspektima, nukleinske kiseline koje se mogu koristiti za proizvodnju ActRIIB polipeptida pogodnih za upotrebu u ovde opisanim metodama i kompozicijama dalje se razumeju tako da uključuju nukleinske kiseline koje su varijante SEQ ID NO:6, kao i varijante onih sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju rastvorljive ActRIIB polipeptide (npr. nukleinske kiseline koje kodiraju SEQ ID NO: 4, 5, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 28 i 29). Varijante nukleotidnih sekvenci uključuju sekvence koje se razlikuju po jednoj ili više nukleotidnih supstitucija, adicija ili delecija, kao što su alelne varijante.

[0109] U određenim slučajevima, izolovane ili rekombinantne sekvence nukleinskih kiselina koje se mogu koristiti za proizvodnju ActRIIB polipeptida pogodnih za upotrebu u ovde opisanim metodama i kompozicijama su najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO:6 ili one sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju rastvorljive ActRIIB polipeptide (npr. nukleinske kiseline koje kodiraju SEQ ID NO: 4, 5, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 28 i 29). Stručnjak u predmetnoj oblasti će ceniti da se sekvence nukleinskih kiselina komplementarne sa SEQ ID NO:6 ili one sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju rastvorljive ActRIIB polipeptide (npr. nukleinske kiseline koje kodiraju SEQ ID NO: 4, 5, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 28 i 29), i varijante SEQ ID NO:6 ili one sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju rastvorljive ActRIIB polipeptide (npr. nukleinske kiseline koje kodiraju SEQ ID NO: 4, 5, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 28, i 29) mogu se koristiti sa ovde opisanim metodama i kompozicijama. U daljim otelotvorenjima, sekvence nukleinske kiseline mogu biti izolovane, rekombinantne i/ili spojene sa heterolognom nukleotidnom sekvencom ili u DNK biblioteci.

[0110] U drugim slučajevima, nukleinske kiseline koje se mogu koristiti za proizvodnju ActRIIB polipeptida pogodnih za upotrebu u ovde opisanim metodama i kompozicijama uključuju nukleotidne sekvence koje se pod veoma strogim uslovima hibridizuju sa nukleotidnom sekvencom označenom u SEQ ID NO:6 ili one sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju rastvorljive ActRIIB polipeptide (npr. nukleinske kiseline koje kodiraju SEQ ID NO: 4, 5, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 28 i 29), komplementarnu sekvencu SEQ ID NO:6 ili one sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju rastvorljive ActRIIB polipeptide (npr. nukleinske kiseline koje kodiraju SEQ ID NO: 4, 5, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 28, i 29), ili njihove fragmente. Osobi sa uobičajenim znanjem i veštinama u oblasti će biti jasno da odgovarajući striktni uslovi koji promovišu hibridizaciju DNK mogu da se razlikuju. Na primer, može se izvršiti hibridizacija na 6,0 puta natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC) na oko 45° Celzijusa, nakon čega sledi pranje 2,0 puta SSC na 50° Celzijusa. Na primer, koncentracija soli u koraku pranja može se izabrati od niske strogosti od oko 2,0 puta SSC na 50° Celzijusa do visoke strogosti od oko 0,2 puta SSC na 50° Celzijusa. Pored toga, temperatura u koraku pranja može se povećati od uslova niske strogosti na sobnoj temperaturi, oko 22° Celzijusa, do uslova visoke strogosti na oko 65° Celzijusa. I temperatura i so mogu biti promenjeni, ili temperatura ili koncentracija soli mogu biti konstantni dok se druga promenljiva menja. U jednom otelotvorenju, nukleinske kiseline koje se hibridizuju pod uslovima niske strogosti od 6 puta SSC na sobnoj temperaturi, nakon čega sledi ispiranje na 2 puta SSC na sobnoj temperaturi, mogu se koristiti sa ovde opisanim metodama i kompozicijama.

[0111] Izolovane nukleinske kiseline koje se razlikuju od nukleinskih kiselina kako je navedeno u SEQ ID NO:6 ili onih sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju rastvorljive ActRIIB polipeptide (npr. nukleinske kiseline koje kodiraju SEQ ID NO: 4, 5, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 28 i 29) zbog degeneracije u genetskom kodu mogu se koristiti i za proizvodnju ActRIIB polipeptida pogodnih za upotrebu u ovde opisanim metodama i kompozicijama. Na primer, više aminokiselina je označeno sa više od jednog tripleta. Kodoni koji određuju istu aminokiselinu, ili sinonimi (na primer, CAU i CAC su sinonimi za histidin) mogu rezultirati „tihim“ mutacijama koje ne utiču na sekvencu aminokiselina proteina. Međutim, očekivano je da će među ćelijama sisara postojati polimorfizmi sekvence DNK koji dovode do promena aminokiselinskih sekvenci predmetnih proteina. Stručnjaku će biti jasno da ove varijacije u jednom ili više nukleotida (do oko 3-5% nukleotida) nukleinskih kiselina koje kodiraju konkretni protein mogu postojati kod pojedinaca određene vrste usled prirode alelnih varijacija. Sve takve varijacije nukleotida i nastali polimorfizmi aminokiselina mogu da se koriste sa metodama i kompozicijama koje su ovde opisane.

[0112] U određenim slučajevima, rekombinantne nukleinske kiseline koje se mogu koristiti za proizvodnju ActRIIB polipeptida pogodnih za upotrebu u ovde opisanim metodama i kompozicijama mogu biti operativno povezane sa jednom ili više regulatornih nukleotidnih sekvenci u ekspresijskom konstruktu. Regulatorne nukleotidne sekvence će obično biti odgovarajuće za ćeliju domaćina koja se koristi za ekspresiju. U struci su poznate brojne vrste odgovarajućih ekspresionih vektora i pogodnih regulatornih sekvenci za različite ćelije domaćine. Tipično, navedena jedna ili više regulatornih nukleotidnih sekvenci mogu uključivati, ali nisu ograničene na, sekvence promotera, sekvence lidera ili signala, mesta ribozomskog vezivanja, transkripcione startne i terminacione sekvence, translacione startne i terminacione sekvence i sekvence pojačivača ili aktivatora. Konstitutivni ili inducibilni promoteri koji su poznati u struci mogu da se koriste sa pmetodama i kompozicijama koje su ovde opisane. Promoteri mogu biti prirodni promoteri, ili hibridni promoteri koji kombinuju elemente više od jednog promotera. Ekspresioni konstrukt u ćeliji može biti prisutan na epizomu, kao što je plazmid, ili ekspresioni konstrukt može biti ubačen u hromozom. U poželjnom otelotvorenju, ekspresioni vektor sadrži selektabilni marker gen koji omogućava selekciju transformisanih ćelija domaćina. Geni markera koji se mogu odabrati dobro su poznati u struci i variraće u zavisnosti od ćelije domaćina koja se koristi.

[0113] U određenim aspektima, nukleinske kiseline koje se mogu koristiti za proizvodnju ActRIIB polipeptida pogodnih za upotrebu u ovde opisanim metodama i kompozicijama date su u ekspresijskom vektoru koji se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira ActRIIB polipeptid i operativno je povezana sa najmanje jednom regulatornom sekvencom. Regulatorne sekvence su poznate u struci i biraju se da usmere ekspresiju polipeptida ActRIIB. Shodno tome, termin regulatorna sekvenca obuhvata promotere, pojačavače i druge elemente ekspresione kontrole. Primeri za regulatorne sekvence su opisani u Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Na primer, bilo koja iz širokog raspona sekvenci za kontrolu ekspresije koje kontrolišu ekspresiju sekvence DNK kada su operativno vezane sa njom može da se koristi u ovim vektorima za ekspresiju sekvenci DNK koje kodiraju polipeptid ActRIIB. Takve korisne sekvence kontrole ekspresije, uključuju, na primer, rane i kasne promotore SV40, tet promotor, adenovirus ili citomegalovirusni neposredni rani promotor, RSV promotore, lac sistem, trp sistem, TAC ili TRC sistem, T7 promotor čiju ekspresiju usmerava T7 RNK polimeraza, glavne operatore i promotorske regione faga lambda, kontrolne regione za protein FD kaputa, promotor za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, promotore kisele fosfataze, npr. Pho5, promotore alfa kvasca. - faktori parenja, promotor poliedra sistema bakulovirusa i druge sekvence za koje se zna da kontrolišu ekspresiju gena prokariotskih ili eukariotskih ćelija ili njihovih virusa, i različite njihove kombinacije. Treba razumeti da dizajn ekspresijskog vektora može zavisiti od faktora kao što su izbor ćelije domaćina koja će se transformisati i/ili tip proteina koji se želi izraziti. Štaviše, treba uzeti u obzir i broj kopije vektora, sposobnost kontrole tog broja kopije i ekspresiju bilo kog drugog proteina kodiranog od strane vektora, kao što su markeri antibiotika.

[0114] Rekombinantna nukleinska kiselina se može proizvesti ligacijom kloniranog gena, ili njegovog dela, u vektor pogodan za ekspresiju u prokariotskim ćelijama, eukariotskim ćelijama (kvasac, ptica, insekt ili sisar), ili oboje. Ekspresioni vehikulumi za proizvodnju rekombinantnog polipeptida ActRIIB uključuju plazmide i druge vektore. Na primer, pogodni vektori uključuju plazmide tipa: plazmida dobijenih pomoću pBR322, plazmida dobijenih pomoću pEMBL, plazmida dobijenih pomoću pEX, plazmida dobijenih pomoću pBTac i plazmida dobijenih pomoću pUC za ekspresiju u prokariotskim ćelijama, poput E. coli.

[0115] Neki vektori ekspresije kod sisara sadrže i prokariotske sekvence za olakšavanje širenja vektora kod bakterija i jednu ili više eukariotskih transkripcionih jedinica koje su izražene u eukariotskim ćelijama. Vektori pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo i pHyg izvedeni su primeri vektora ekspresije kod sisara pogodnih za transfekciju eukariotskih ćelija. Neki od tih vektora su modifikovani sekvencama bakterijskih plazmida, kao što je pBR322, kako bi se olakšala replikacija i selekcija otpornosti na lek kod prokariotskih i eukariotskih ćelija. Alternativno, derivati virusa kao što su goveđi papiloma virus (BPV-1) ili Epštajn-Barov virus (pHEBo, dobijen od pREP i p205) mogu da se koriste za prolaznu ekspresiju proteina u eukariotskim ćelijama. Primeri za druge virusne (uključujući retrovirusne) ekspresione sisteme mogu se naći ispod u opisu sistema za isporuku genske terapije. Različite metode koje se koriste u pripremi plazmida i u transformaciji organizama domaćina dobro su poznate u struci. Za druge pogodne sisteme ekspresije i za prokariotske i za eukariotske ćelije, kao i za opšte rekombinantne procedure, videti Laboratorijski priručnik za molekularno kloniranje, 3. izdanje, izdanje Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). U nekim slučajevima, može biti poželjno da se rekombinantni polipeptidi eksprimiraju koristeći ekspresioni sistem bakulovirusa. Primeri takvih sistema ekspresije bakulovirusa uključuju vektore izvedene iz pVL (kao što su pVL1392, pVL 1393 i pVL941), vektore izvedene iz pAcUW (kao što je pAcUW1) i vektore izvedene iz pBlueBac (kao što je .beta.-gal koji sadrži pBlueBac III).

[0116] U jednom otelotvorenju, vektor može biti dizajniran za proizvodnju ActRIIB polipeptida koji se koriste u ovde opisanim metodama i kompozicijama u CHO ćelijama, kao što su Pcmv-Script vektor (Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 vektori (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) i pCI-neo vektori (Promega, Madison, Wis.). Kao što će biti očigledno, konstrukti predmetnog gena mogu se koristiti za izazivanje ekspresije predmetnih ActRIIB polipeptida u ćelijama koje se razmnožavaju u kulturi, npr. za proizvodnju proteina, uključujući fuzione proteine ili varijantne proteine, za prečišćavanje.

[0117] Ćelije domaćina transfektovane rekombinantnim genom uključujući sekvencu kodiranja (npr. SEQ ID NO:6 ili one sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju rastvorljive ActRIIB polipeptide (npr.

nukleinske kiseline koje kodiraju SEQ ID NO: 4, 5, 9, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 28 i 29)) za jedan ili više predmetnih ActRIIB polipeptida mogu se koristiti za proizvodnju ActRIIB polipeptida pogodnih za upotrebu u ovde opisanim metodama i kompozicijama. Ćelija domaćin može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija. Na primer, ActRIIB polipeptid može biti izražen u bakterijskim ćelijama kao što je E. coli, ćelijama insekata (npr. korišćenjem sistema ekspresije bakulovirusa), ćelijama kvasca ili ćelijama sisara. Stručnjacima za oblast su poznate i druge pogodne ćelije domaćini.

[0118] Shodno tome, ovde su date metode proizvodnje ActRIIB polipeptida koji se koriste u ovde opisanim metodama i kompozicijama. Na primer, ćelija domaćin koja je transficirana ekspresionim vektorom koji kodira polipeptid ActRIIB može da se uzgaja u odgovarajućim uslovima koji omogućavaju da dođe do ekspresije polipeptida ActRIIB. Polipeptid ActRIIB može da se izluči i izoluje iz smeše ćelija i medijuma koji sadrže polipeptid ActRIIB. Alternativno, ActRIIB polipeptid se može zadržati citoplazmatski ili u membranskoj frakciji i prikupljene ćelije, lizati i protein izolovati. Ćelijska kultura sadrži ćelije domaćine, medijume i druge nusproizvode. Pogodni medijumi za ćelijsku kulturu su dobro poznati u struci. Predmetni ActRIIB polipeptidi mogu se izolovati iz medija ćelijske kulture, ćelija domaćina ili oba, koristeći tehnike poznate u struci za prečišćavanje proteina, uključujući jonsko-izmenjivačku hromatografiju, gel filtracionu hromatografiju, ultrafiltraciju, elektroforezu, prečišćavanje imunoafiniteta antitelima specifičnim za određene epitope ActRIIB polipeptida i prečišćavanje afiniteta agensom koji se vezuje za domen spojen sa ActRIIB polipeptidom (npr. kolona proteina A može se koristiti za prečišćavanje ActRIIB-Fc fuzije). U poželjnom slučaju, ActRIIB polipeptid je fuzioni protein koji sadrži domen koji olakšava njegovo prečišćavanje. U poželjnom slučaju, prečišćavanje se postiže nizom koraka hromatografije kolone, uključujući, na primer, tri ili više sledećih, bilo kojim redosledom: hromatografiju proteina A, Q sefaroznu hromatografiju, fenilsefaroznu hromatografiju, hromatografiju isključivanja veličine i hromatografiju katjonske razmene. Prečišćavanje može da se obavi virusnom filtracijom i razmenom pufera. Kao što je ovde prikazano, protein ActRIIB-hFc je prečišćen do čistoće >98% na osnovu hromatografije na molekulskim sitima i >95% na osnovu SDS PAGE. Ovaj nivo čistoće je bio dovoljan da se ostvari željeno dejstvo na kosti miševa i prihvatljiv bezbednosni profil kod miševa, pacova i nehumanih primata.

[0119] U drugom slučaju, fuzioni gen koji kodira sekvencu lidera prečišćavanja, kao što je sekvenca mesta cepanja poli-(His)/enterokinaze na N-terminusu željenog dela rekombinantnog ActRIIB polipeptida, može omogućiti prečišćavanje izraženog fuzionog proteina afinitetnom hromatografijom korišćenjem Ni2+ metalne smole. Sekvenca lidera prečišćavanja se zatim može ukloniti tretmanom enterokinazom kako bi se obezbedio prečišćeni ActRIIB polipeptid (npr. videti Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177; and Janknecht et al., PNAS USA 88:8972).

[0120] Tehnike za pravljenje fuzionih gena su dobro poznate. U suštini, spajanje različitih fragmenata DNK koji kodiraju za različite polipeptidne sekvence vrši se u skladu sa konvencionalnim tehnikama, primenom tupih ili smaknutih termina za ligaciju, varenje restriktivnih enzima kako bi se obezbedili odgovarajući termini, popunjavanje kohezivnih krajeva po potrebi, tretman alkalnom fosfatazom kako bi se izbeglo neželjeno spajanje i enzimska ligacija. U drugom otelotvorenju, fuzioni gen se može sintetizovati konvencionalnim tehnikama, uključujući automatizovane DNK sintetizere. Alternativno, PCR amplifikacija fragmenata gena može se sprovesti korišćenjem ankernih prajmera koji dovode do komplementarnih prepusta između dva uzastopna fragmenta gena koji kasnije mogu žarenjem generisati himernu sekvencu gena (videti na primer Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).

[0121] ActRIIB -Fc fuzioni protein se može izraziti u stabilno transficiranim CHO-DUKX Bl 1 ćelijama iz pAID4 vektora (SV40 ori/pojačivač, CMV promoter), koristeći sekvencu tkiva plazminogena lidera SEQ ID NO:2. Fc deo može da sadrži humanu IgGl Fc sekvencu, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1. U određenim slučajevima, nakon ekspresije, sadržani protein ima, u proseku, između oko 1,5 i 2,5 mola sijalinske kiseline po molekulu ActRIIB-Fc fuzionog proteina.

[0122] U određenim slučajevima, dugo poluvreme eliminacije fuzije ActRIIB-Fc u serumu može biti 25-32 dana kod ljudi. Pored toga, materijal koji je eksprimiran u CHO ćelijama može imati veći afinitet prema aktivin B ligandu nego što je objavljeno za fuzioni protein ActRIIB-hFc koji je eksprimiran u humanim 293 ćelijama (del Re et al., J Biol Chem.2004 Dec 17;279(51):53126-35). Pored toga, bez vezivanja za teoriju, upotreba sekvence TPA lidera obezbedila je veću proizvodnju od drugih sekvenci lidera i, za razliku od ActRIIB-Fc izraženih sa izvornim liderom, može pružiti visoko čistu N-terminalnu sekvencu. Upotreba nativne vodeće sekvence može dovesti do dve velike vrste ActRIIB-Fc, obe sa različitom N-terminalnom sekvencom.

[0123] U poželjnom otelotvorenju, inhibitor signalizacije ActRIIB je luspatercept (videti International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances (INN), WHO Drug Information, Vol. 27, No. 4, 2013, Proposed INN: List 110-458, 422).

5.5 KOMPOZICIJE

[0124] U određenim otelotvorenjima, inhibitori signalizacije ActRIIB formulisani su farmaceutski prihvatljivim nosačem za upotrebu sa ovde opisanim metodama. Na primer, inhibitor signalizacije ActRIIB može se primenjivati sam ili kao komponenta farmaceutske formulacije (terapijska kompozicija). Predmetna jedinjenja mogu da se formulišu za primenu na bilo koji način koji je pogodan za ljudsku ili veterinarsku medicinu.

[0125] U poželjnom otelotvorenju, inhibitor signalizacije ActRIIB je formulisan za supkutanu primenu.

[0126] U drugom poželjnom otelotvorenju, inhibitor signalizacije ActRIIB je upakovan u posudu kao sterilni liofilizovani prah ili kolač bez konzervansa. U određenim otelotvorenjima, posuda se sastoji od 25 mg inhibitora signalizacije ActRIIB. U određenim otelotvorenjima, posuda koja se sastoji od 25 mg inhibitora signalizacije ActRIIB sadrži ukupno 37,5 mg proteina. U određenim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB u posudi koja se sastoji od 25 mg inhibitora signalizacije ActRIIB se rekonstituiše sa 0,68 ml vode za injekcije. U određenim otelotvorenjima, posuda se sastoji od 75 mg inhibitora signalizacije ActRIIB. U određenim otelotvorenjima, posuda koja se sastoji od 75 mg inhibitora signalizacije ActRIIB sadrži ukupno 87,5 mg proteina. U određenim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB u posudi koja se sastoji od 75 mg inhibitora signalizacije ActRIIB se rekonstituiše sa 1,6 ml vode za injekcije. U određenim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB u posudi se rekonstituiše sa zapreminom vode za injekcije, tako da je konačna koncentracija rekonstituisanog inhibitora signalizacije ActRIIB u vodi za injekcije 50 mg/ml sa pH od približno 6,5. U određenim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje subjektu u roku od 10 sati od rekonstitucije. U određenim otelotvorenjima, posuda sadrži inhibitor signalizacije ActRIIB u koncentraciji od 50 mg/ml u rastvoru na bazi citratnog pufera od 10 mM, pri čemu rastvor na bazi citratnog pufera od 10 mM sadrži 10 mM citrata, pH 6,5, 9% saharoze i 0,02% polisorbata 80. U određenim otelotvorenjima, posuda se skladišti na između 2°C i 8°C. U određenim otelotvorenjima, posuda se skladišti na temperaturi između 2°C i 8°C tokom 18 meseci. U određenim otelotvorenjima, posuda je staklena bočica od 3 ml sa sivim čepom obloženim butilom. U određenim otelotvorenjima, posuda je staklena bočica od 3 ml sa sivim gumenim čepom. U određenim otelotvorenjima, gumeni čep je pričvršćen na mestu preklopnom aluminijumskom kapicom sa plastičnim dugmetom u boji. U određenim otelotvorenjima, staklena bočica od 3 ml sadrži 25 mg inhibitora signalizacije ActRIIB i obojeno plastično dugme je crveno. U određenim otelotvorenjima, staklena bočica od 3 ml sadrži 75 mg inhibitora signalizacije ActRIIB i obojeno plastično dugme je belo. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11.

[0127] U specifičnom otelotvorenju, inhibitor signalizacije ActRIIB je upakovan u posudu kao sterilni liofilizovani prah ili kolač bez konzervansa. U specifičnom otelotvorenju, posuda se sastoji od 50 mg/ml inhibitora signalizacije ActRIIB u 10 mM citratnog pufera pH 6,5. U specifičnom otelotvorenju, posuda se sastoji od 56 mg inhibitora signalizacije ActRIIB, 0 19 mg limunske kiseline monohidrata, 3,03 mg trinatrijum citrat dehidrata, 0,24 mg polisorbata 80 i 100,80 mg saharoze. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11.

[0128] U određenim otelotvorenjima, terapijske metode navedene u ovom dokumentu uključuju sistemsku ili lokalnu primenu kompozicije (koja se sastoji od inhibitora signalizacije ActRIIB) kao implantata ili uređaja. Kada se primenjuje, terapijska kompozicija za primene predviđene u ovom dokumentu je u fiziološki prihvatljivom obliku bez pirogena. Terapijski korisni agensi osim ActRIIB inhibitora signalizacije koji se takođe mogu opciono uključiti u kompoziciju kao što je gore opisano, mogu se primenjivati istovremeno ili sekvencijalno sa predmetnim jedinjenjima (npr. ActRII polipeptidi, kao što su ActRIIA i / ili ActRIIB polipeptidi).

[0129] Tipično, ActRIIB inhibitori signalizacije će se primenjivati parenteralno. U poželjnom otelotvorenju, inhibitor signalizacije ActRIIB će se primenjivati supkutano. Farmaceutske kompozicije pogodne za parenteralnu primenu mogu sadržati jedan ili više ActRIIB polipeptida u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih sterilnih izotoničnih vodenih ili nevodenih rastvora, disperzija, suspenzija ili emulzija, ili sterilnih prašaka koji se mogu rekonstituisati u sterilne injekcione rastvore ili disperzije neposredno pre upotrebe, koji mogu sadržati antioksidante, pufere, bakteriostate, rastvore koji čine formulaciju izotoničnom sa krvlju predviđenog primaoca ili agensima za suspenziju ili zgušnjavanje. Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama za upotrebu u ovde opisanim metodama uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično) i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i organske estre za ubrizgavanje, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost može da se održi, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, putem održavanja odgovarajuće veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom surfaktanata.

[0130] Ovde opisane kompozicije takođe mogu da sadrže adjuvanse, kao što su konzervansi, agensi za vlaženje, emulgatori i agensi za dispergovanje. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može da se osigura uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agensa, na primer, parabena, hlorbutanola, fenol sorbinske kiseline, i slično. Takođe može biti poželjno da se u kompozicije uključe izotonični agensi, kao što su šećeri, natrijum hlorid, i slično. Pored toga, produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika može da se postigne uključivanjem agensa koji odlažu apsorpciju, kao što je aluminijum monostearat i želatin.

[0131] U određenim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je suštinski čist u farmaceutskoj kompoziciji. Konkretno, najviše 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,1% ili najviše 0,05% jedinjenja u farmaceutskoj kompoziciji su jedinjenja koja nisu inhibitor signalizacije ActRIIB i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0132] U određenim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se daje na sobnoj temperaturi pacijentu u skladu sa metodom koja je ovde navedena.

5.6 DOZE I PUTEVI PRIMENE

[0133] Ovde su takođe date doze ActRIIB inhibitora signalizacije za primenu na subjektu u vezi sa ovde opisanom metodom lečenja (videti, npr. Odeljak 5.2). U određenim otelotvorenjima, doza je farmaceutski efikasna doza.

[0134] U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRII je doza dovoljna za smanjenje ili ublažavanje jednog ili više simptoma mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRII je doza dovoljna da spreči pogoršanje najmanje jednog simptoma mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom. Neograničavajući primeri mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom uključuju umor, noćno znojenje, svrab, nelagodnost u stomaku, bol ispod rebara na levoj strani, rano zasićenje ili bol u kostima.

[0135] U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRII je doza dovoljna za smanjenje ili ublažavanje jednog ili više simptoma anemije izazvane mijelofibrozom povezanom sa mijeloproliferativnom neoplazmom ili u vezi sa njom. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRII je doza koja je dovoljna da spreči pogoršanje najmanje jednog simptoma anemije. Neograničavajući primeri za simptome anemije uključuju umor, gubitak energije, ubrzan rad srca, otežano disanje, glavobolju, teškoće s koncentracijom, vrtoglavicu, bledilo, grčeve u nogama i nesanicu.

[0136] U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRII je doza dovoljna za smanjenje ili ublažavanje jednog ili više simptoma anemije i jednog ili više simptoma mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRII je doza dovoljna da spreči pogoršanje najmanje jednog simptoma anemije i pogoršanje najmanje jednog simptoma mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom. Neograničavajući primeri za simptome anemije uključuju umor, gubitak energije, ubrzan rad srca, otežano disanje, glavobolju, teškoće s koncentracijom, vrtoglavicu, bledilo, grčeve u nogama i nesanicu. Neograničavajući primeri mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom uključuju umor, noćno znojenje, svrab, nelagodnost u stomaku, bol ispod rebara na levoj strani, rano zasićenje ili bol u kostima.

[0137] U određenim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB se dozira u intervalima i količinama dovoljnim da se postignu koncentracije u serumu od 0,2 mg/kg ili veće, na primer, nivoi u serumu od 1 mg/kg ili 2 mg/kg ili veći. Režimi doziranja mogu biti dizajnirani tako da dostignu koncentracije u serumu između 0,2 i 15 mg/kg, a opciono između 1 i 5 mg/kg. Kod ljudi, nivoi seruma od 0,2 mg/kg mogu se postići jednom dozom od 0,1 mg/kg ili većom, a nivoi seruma od 1 mg/kg mogu se postići jednom dozom od 0,3 mg/kg ili većom. Uočeno poluvreme eliminacije molekula u serumu je od 20 do 30 dana, što je suštinski duže nego kod većine Fc fuzionih proteina, te se tako produženi efikasni nivo u serumu može postići, na primer, doziranjem 0,2-0,4 mg/kg na nedeljnom ili dvonedeljnom nivou, ili mogu da se koriste veće doze sa dužim intervalima između doziranja. Na primer, doze od 1-3 mg/kg mogu da se koriste na mesečnom ili dvomesečnom nivou, a dejstvo na kosti može biti u toj meri dugotrajno da je doziranje potrebno samo jednom na svakih 3, 4, 5, 6, 9, 12 ili više meseci. Nivoi seruma inhibitora signalizacije ActRIIB mogu se izmeriti na bilo koji način poznat kvalifikovanom stručnjaku. Na primer, antitela protiv inhibitora signalizacije ActRIIB mogu se koristiti za određivanje nivoa inhibitora signalizacije ActRIIB u serumu koristeći, npr. ELISA test. U specifičnom otelotvorenju, metoda koja je ovde obezbeđena takođe ima značajno dejstvo na gustinu i čvrstinu kostiju.

[0138] U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je oko 0,1 mg/kg, oko 0,3 mg/kg, oko 0,45 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 0,6 mg/kg, 0,75 mg/kg, oko 0,8 mg/kg, oko 1,0 mg/kg, oko 1,25 mg/kg, oko 1,33 mg/kg, oko 1,5 mg/kg, oko 1,75 mg/kg, oko 2,0 mg/kg ili oko 2,25 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,1 mg/kg i 2,25 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,1 mg/kg i 1 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,3 mg/kg i 1,25 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,5 mg/kg i 1,5 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,1 mg/kg i 2,0 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,33 mg/kg i 2,0 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,75 mg/kg i 1,0 mg/kg, između 1,0 mg/kg i 1,25 mg/kg, između 1,25 mg/kg i 1,5 mg/kg, između 1,5 mg/kg i 1,75 mg/kg ili između 1,75 mg/kg i 2,0 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je farmaceutski efikasna doza. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,33 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,45 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,6 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,8 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,0 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,33 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,75 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 2,00 mg/kg. Kada se koristi zajedno sa ovde navedenom dozom (npr. dozom inhibitora signalizacije ActRIIB ili dozom drugog aktivnog agensa), reč „oko“ se odnosi na bilo koji broj unutar 1, 5 ili 10% referentnog broja.

[0139] U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je farmaceutski efikasna doza. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRIIB je oko 0,1 mg/kg, oko 0,3 mg/kg, oko 0,45 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 0,6 mg/kg, 0,75 mg/kg, oko 0,8 mg/kg, oko 1,0 mg/kg, oko 1,25 mg/kg, oko 1,33 mg/kg, oko 1,5 mg/kg, oko 1,75 mg/kg, oko 2,0 mg/kg ili oko 2,25 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,1 mg/kg i 2,25 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,1 mg/kg i 1 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,3 mg/kg i 1,25 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,5 mg/kg i 1,5 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,1 mg/kg i 2,0 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,33 mg/kg i 2,0 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski efikasna doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,75 mg/kg i 1,0 mg/kg, između 1,0 mg/kg and 1,25 mg/kg, između 1,25 mg/kg i 1,5 mg/kg, između 1,5 mg/kg i 1,75 mg/kg ili između 1,75 mg/kg i 2,0 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,33 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,45 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,6 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,8 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,0 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,33 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,75 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 2,00 mg/kg.

[0140] U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je za povećanje nivoa hemoglobina kod subjekta u poređenju sa nivoom hemoglobina kod subjekta u početnom stanju. U kontekstu procene povećanja nivoa hemoglobina kod subjekta, „početno stanje“ se odnosi na vreme neposredno pre prve primene inhibitora signalizacije ActRIIB kod subjekta. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je za povećanje nivoa hemoglobina kod subjekta za najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 100% tokom bilo kog uzastopnog perioda od 84 dana nakon što je subjektu data prva doza inhibitora signalizacije ActRIIB, pri čemu je subjektu transfuzovano 0 jedinica crvenih krvnih zrnaca tokom uzastopnog perioda od 84 dana, u poređenju sa nivoom hemoglobina kod subjekta u početnom stanju. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je za povećanje nivoa hemoglobina kod subjekta za najviše 5%, najviše 10%, najviše 15%, najviše 20%, najviše 25%, najviše 30%, najviše 35%, najviše 40%, najviše 45%, najviše 50%, najviše 55%, najviše 60%, najviše 65%, najviše 70%, najviše 75%, najviše 80%, najviše 85%, najviše 90%, najviše 95% ili najviše 100% tokom bilo kog uzastopnog perioda od 84 dana nakon što je subjektu data prva doza inhibitora signalizacije ActRIIB, pri čemu je subjektu transfuzovano 0 jedinica crvenih krvnih zrnaca tokom uzastopnog perioda od 84 dana, u poređenju sa nivoom hemoglobina kod subjekta u početnom stanju. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB primenjena na subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je za povećanje nivoa hemoglobina za najmanje 1,5 g/dl, najmanje 1,8 g/dl, najmanje 2,0 g/dl, najmanje 2,2 g/dl, najmanje 2,4 g/dl, najmanje 2,6 g/dl, najmanje 2,8 g/dl, najmanje 3,0 g/dl, najmanje 3,2 g/dl, najmanje 3,4 g/dl, najmanje 3,6 g/dl, najmanje 3,8 g/dl, najmanje 4,0 g/dl, najmanje 5,0 g/dl, ili najmanje 6,0 g/dl tokom bilo kog uzastopnog perioda od 84 dana nakon što je subjektu data prva doza inhibitora signalizacije ActRIIB, pri čemu je subjektu transfuzovano 0 jedinica crvenih krvnih zrnaca tokom uzastopnog perioda od 84 dana, u poređenju sa nivoom hemoglobina kod subjekta u početnom stanju. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB primenjena kod subjekta u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je za povećanje nivoa hemoglobina za najviše 1,5 g/dl, najviše 1,8 g/dl, najviše 2,0 g/dl, najviše 2,2 g/dl, najviše 2,4 g/dl, najviše 2,6 g/dl, najviše 2,8 g/dl, najviše 3,0 g/dl, najviše 3,2 g/dl, najviše 3,4 g/dl, najviše 3,6 g/dl, najviše 3,8 g/dl, najviše 4,0 g/dl, najviše 5,0 g/dl, ili najviše 6,0 g/dl tokom bilo kog uzastopnog perioda od 84 dana nakon što je subjektu data prva doza ActRIIB inhibitora signalizacije, pri čemu je subjektu transfuzovano 0 jedinica crvenih krvnih zrnaca tokom uzastopnog perioda od 84 dana, u poređenju sa nivoom hemoglobina kod subjekta u početnom stanju. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je da dovede do povećanja nivoa hemoglobina kod subjekta tokom najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 12, najmanje 18, najmanje 24 ili najmanje 48 meseci nakon primene inhibitora signalizacije ActRIIB. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je da dovede do povećanja nivoa hemoglobina kod subjekta na neodređeno vreme nakon primene inhibitora signalizacije ActRIIB. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,33 mg/kg i 2,0 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,33 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,45 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,6 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,8 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,0 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,33 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,75 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 2,00 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je inhibitor signalizacije ActRIIB dopisan u Odeljku 5.4. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11. U poželjnom otelotvorenju, inhibitor signalizacije ActRIIB je luspatercept.

[0141] U određenim otelotvorenjima u kojima je subjekt zavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je da dovede do nezavisnosti transfuzije crvenih krvnih zrnaca kod subjekta tokom bilo kog uzastopnog perioda od 84 dana nakon što je subjektu data prva doza inhibitora signalizacije ActRIIB. U određenim otelotvorenjima, subjekt je nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je primio 0 jedinica crvenih krvnih zrnaca tokom bilo kog uzastopnog 60-dnevnog, 61-dnevnog, 62-dnevnog, 63-dnevnog, 64-dnevnog, 65-dnevnog, 66-dnevnog, 67-dnevnog, 68-dnevnog, 69-dnevnog, 70-dnevnog, 71-dnevnog, 72-dnevnog, 73-dnevnog, 74-dnevnog, 75-dnevnog, 76-dnevnog, 77-dnevnog, 78-dnevnog, 79-dnevnog, 80-dnevnog, 81-dnevnog, 82-dnevnog, 83-dnevnog, 84-dnevnog, 85-dnevnog, 86-dnevnog, 87-dnevnog, 88-dnevnog, 89-dnevnog ili 90-dnevnog perioda. U određenim otelotvorenjima, subjekt zavisi od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ili 90 ddana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je da dovede do nezavisnosti transfuzije crvenih krvnih zrnaca kod subjekta tokom najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 12, najmanje 18, najmanje 24 ili najmanje 48 meseci nakon primene inhibitora signalizacije ActRIIB. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je da dovede do nezavisnosti transfuzije crvenih krvnih zrnaca kod subjekta na neodređeno vreme nakon primene inhibitora signalizacije ActRIIB. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,33 mg/kg i 2,0 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,33 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,45 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,6 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,8 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,0 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,33 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,75 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 2,00 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je inhibitor signalizacije ActRIIB dopisan u Odeljku 5.4. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11. U poželjnom otelotvorenju, inhibitor signalizacije ActRIIB je luspatercept.

[0142] U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je da smanji učestalost transfuzije crvenih krvnih zrnaca kod subjekta u poređenju sa učestalošću transfuzije crvenih krvnih zrnaca kod subjekta u početnom stanju U kontekstu procene smanjenja učestalosti transfuzije crvenih krvnih zrnaca kod subjekta, „početno stanje“ se odnosi na vreme neposredno pre prve primene inhibitora signalizacije ActRIIB kod subjekta. Da bi se procenilo smanjenje učestalosti transfuzije crvenih krvnih zrnaca kod subjekta u poređenju sa učestalošću transfuzije crvenih krvnih zrnaca kod subjekta u početnom stanju, srednji broj jedinica crvenih krvnih zrnaca transfuzije kod subjekta u periodu od četiri nedelje nakon što je subjektu data prva doza inhibitora signalizacije ActRIIB upoređuje se sa srednjim brojem jedinica crvenih krvnih zrnaca transfuzije kod subjekta u periodu od četiri nedelje u početnom stanju. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu lečenom u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je da smanji srednji broj jedinica crvenih krvnih zrnaca transfuzije kod subjekta tokom perioda od četiri nedelje nakon što je subjektu data prva doza inhibitora signalizacije ActRIIB za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili za najmanje 100% u poređenju sa srednjim brojem jedinica crvenih krvnih zrnaca transfuzije kod subjekta tokom perioda od četiri nedelje u početnom stanju. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu lečenom u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je da smanji srednji broj jedinica crvenih krvnih zrnaca transfuzije kod subjekta tokom perioda od četiri nedelje nakon što je subjektu data prva doza inhibitora signalizacije ActRIIB za najviše 10%, najviše 20%, najviše 30%, najviše 40%, najviše 50%, najviše 60%, najviše 70%, najviše 80%, najviše 90%, ili najviše 100% u poređenju sa srednjim brojem jedinica crvenih krvnih zrnaca transfuzije kod subjekta tokom perioda od četiri nedelje u početnom stanju. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu lečenom u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je da smanji srednji broj jedinica crvenih krvnih zrnaca transfuzije kod subjektua tokom perioda od četiri nedelje nakon što je subjektu data prva doza inhibitora signalizacije ActRIIB za najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7 ili najmanje 8 jedinica u poređenju sa srednjim brojem jedinica crvenih krvnih zrnaca transfuzije kod subjekta tokom perioda od četiri nedelje u početnom stanju. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu lečenom u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je da smanji srednji broj jedinica crvenih krvnih zrnaca transfuzije kod subjekta tokom perioda od četiri nedelje nakon što je subjektu data prva doza inhibitora signalizacije ActRIIB za najviše 1, najviše 2, najviše 3, najviše 4, najviše 5, najviše 6, najviše 7, ili najviše 8 jedinica u poređenju sa srednjim brojem jedinica crvenih krvnih zrnaca transfuzije kod subjekta tokom perioda od četiri nedelje u početnom stanju. U određenim otelotvorenjima, jedna jedinica RBC se odnosi na oko 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 100-200 ml, 150-250 ml, 200-300 ml, 250-300 ml ili 250-350 ml RBC. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,33 mg/kg i 2,0 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,33 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,45 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,6 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,8 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,0 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,33 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,75 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 2,00 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je inhibitor signalizacije ActRIIB dopisan u Odeljku 5.4. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11. U poželjnom otelotvorenju, inhibitor signalizacije ActRIIB je luspatercept.

[0143] U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je za smanjenje opterećenja transfuzijom kod subjekta za najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 100% u bilo kom vremenskom periodu nakon što je subjektu data prva doza inhibitora signalizacije ActRIIB u poređenju sa opterećenjem transfuzijom kod subjekta u početnom stanju. U kontekstu procene smanjenja opterećenja transfuzijom kod subjekta, „početno stanje“ se odnosi na vreme neposredno pre prve primene inhibitora signalizacije ActRIIB kod subjekta. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je za smanjenje opterećenja transfuzijom kod subjekta za najviše 5%, najviše 10%, najviše 15%, najviše 20%, najviše 25%, najviše 30%, najviše 35%, najviše 40%, najviše 45%, najviše 50%, najviše 55%, najviše 60%, najviše 65%, najviše 70%, najviše 75%, najviše 80%, najviše 85%, najviše 90%, najviše 95% ili najviše 100% u bilo kom vremenskom periodu nakon što je subjektu data prva doza ActRIIB inhibitora signalizacije u poređenju sa opterećenjem transfuzije kod subjekta u početnom stanju. U određenim otelotvorenjima, vremenski period tokom kojeg se smanjuje opterećenje transfuzijom kod subjekta je najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 11 ili najmanje 12 nedelja. U određenim otelotvorenjima, vremenski period tokom kojeg se smanjuje opterećenje transfuzijom kod subjekta je 12 nedelja (tj. 84 dana). U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je za smanjenje opterećenja transfuzijom kod subjekta za najmanje 50% tokom bilo kog uzastopnog perioda od 84 dana nakon što je subjektu data prva doza inhibitora signalizacije ActRIIB u poređenju sa opterećenjem transfuzijom kod subjekta u početnom stanju. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je za smanjenje opterećenja transfuzijom kod subjekta za najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 12, najmanje 18, najmanje 24 ili najmanje 48 meseci nakon primene inhibitora signalizacije ActRIIB. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB koja se daje subjektu u skladu sa ovde navedenim metodama dovoljna je za smanjenje opterećenja transfuzijom kod isubjekta na neodređeno vreme nakon primene inhibitora signalizacije ActRIIB. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je između 0,33 mg/kg i 2,0 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,33 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,45 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,6 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 0,8 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,0 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,33 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 1,75 mg/kg. U specifičnom otelotvorenju, doza inhibitora signalizacije ActRIIB je 2,00 mg/kg. U određenim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je inhibitor signalizacije ActRIIB dopisan u Odeljku 5.4. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11. U poželjnom otelotvorenju, inhibitor signalizacije ActRIIB je luspatercept.

[0144] U određenim otelotvorenjima, meri se odgovor anemije. U nekim otelotvorenjima, odgovor anemije se meri jer se odnosi na povećanje hemoglobina (Hgb), npr. udeo subjekata koji postižu povećanje hemoglobina od ≥ 1,5 g/dl u odnosu na početno stanje tokom bilo kog uzastopnog perioda od 84 dana bez transfuzije RBC (npr. kod subjekata koji primaju luspatercept). U nekim otelotvorenjima, odgovor na anemiju se meri jer se odnosi na povećanu nezavisnost od transfuzije crvenih krvnih zrnaca (RBC), npr. udeo subjekata koji su postali nezavisni od transfuzije RBC tokom bilo kog uzastopnog perioda od 84 dana (npr. kod subjekata koji primaju luspatercept). U nekim otelotvorenjima, odgovor na anemiju se meri jer se odnosi na vreme odgovora na anemiju, npr. vreme od prve doze luspatercepta do prvog početka odgovora na anemiju (npr. kod subjekata koji primaju luspatercept). U nekim otelotvorenjima, odgovor na anemiju se meri jer se odnosi na trajanje odgovora na anemiju, npr. maksimalno trajanje odgovora na anemiju kod subjekata (npr. kod subjekata koji primaju luspatercept). U nekim otelotvorenjima, odgovor na anemiju se meri jer se odnosi na učestalost transfuzija RBC, npr. srednji broj transfuzija RBC po subjektu tokom četiri nedelje (npr. kod subjekata koji primaju luspatercept). U nekim otelotvorenjima, odgovor na anemiju se meri jer se odnosi na učestalost zavisnosti od transfuzije RBC, npr. udeo subjekata zavisnih od transfuzije RBC koji smanjuju opterećenje transfuzijom za ≥ 50% od početnog stanja tokom bilo kog uzastopnog perioda od 84 dana (npr. kod subjekata koji primaju luspatercept). U nekim otelotvorenjima, odgovor na anemiju se meri jer se odnosi na udeo subjekata koji postižu smanjenje simptoma umora kako je zabeleženo i procenjeno putem modifikovanog obrasca za procenu simptoma mijeloproliferativne neoplazme (MPN-SAF), (videti Emanual et "Myeloproliferative Neoplasm (MPN) Symptom Assessment Form Total Symptom Score: Prospective International Assessment of an Abbreviated Symptom Burden Scoring System Among Patients With MPNs," J. Clin. Oncol. 30(33):4098-4103 (2012)), npr. merenje umora, noćnog znojenja, svraba, nelagodnosti u stomaku, bola ispod rebara sa leve strane, rane zasićenosti i bola u kostima (npr. kod subjekata koji primaju luspatercept); npr. kod subjekata koji postižu ≥ 50% smanjenje simptoma umora mereno MPN-SAF. U nekim otelotvorenjima, odgovor na anemiju se meri jer se odnosi na udeo subjekata koji postižu smanjenje od ≥ 50% u ukupnom rezultatu simptoma (TSS), kako je zabeleženo i procenjeno putem modifikovanog obrasca za procenu simptoma mijeloproliferativne neoplazme (MPN-SAF), (videti Emanual et αl., "Myeloproliferative Neoplasm (MPN) Symptom Assessment Form Total Symptom Score: Prospective International Assessment of an Abbreviated Symptom Burden Scoring System Among Patients With MPNs," J. Clin. Oncol. 30(33):4098-4103 (2012), npr. merenje umora, noćnog znojenja, svraba, nelagodnosti u stomaku, bola ispod rebara sa leve strane, rane zasićenosti i bola u kostima (npr. kod subjekata koji primaju luspatercept). U nekim otelotvorenjima, odgovor na anemiju se meri jer se odnosi na mere kvaliteta života povezane sa zdravljem (HRQoL), npr. meri srednje promene u rezultatima u domenu HRQoL upitnika u poređenju sa početnim rezultatima (npr. kod subjekata koji primaju luspatercept). In some embodiments anemia response is measured as it relates to EQ-5D-5L questionnaires scores (EuroQol, Rotterdam, The Netherlands), e.g., measuring mean changes in EQ-5D-5L questionnaire domain scores compared to baseline scores (npr. kod subjekata koji primaju luspatercept). U nekim otelotvorenjima, odgovor na anemiju se meri jer se odnosi na neželjene događaje (AE), npr. vrstu, učestalost i težinu neželjenih događaja (npr. kod subjekata koji primaju luspatercept). U nekim otelotvorenjima, anemijski odgovor se meri korišćenjem antitela na lek (ADA) (npr. učestalost antitela na lek i efekti na efikasnost, bezbednost ili farmakokinetiku kod subjekata koji primaju luspatercept). U nekim otelotvorenjima, anemijski odgovor se meri korišćenjem farmakokinetičkih parametara, npr. krive plazma koncentracija-vreme, površine ispod krive (AUC), Cmax (npr. za subjekte koji primaju luspatercept).

[0145] U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB se primenjuje injekcijom. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB se primenjuje supkutano. U određenim otelotvorenjima, doza inhibitora signalizacije ActRIIB se primenjuje jednom u 3 nedelje. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina koja odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:11. U specifičnim otelotvorenjima, inhibitor signalizacije ActRIIB je polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11. U poželjnom otelotvorenju, inhibitor signalizacije ActRIIB je luspatercept. Testovi

[0146] Različite ActRIIB polipeptidne varijante, ili rastvorljive ActRIIB polipeptidne varijante, mogu se testirati na njihovu sposobnost da inhibiraju signalizaciju ActRIIB. Pored toga, jedinjenja se mogu testirati na njihovu sposobnost da inhibiraju signalizaciju ActRIIB. Kada se potvrdi aktivnost inhibitora signalizacije ActRIIB, ova jedinjenja se mogu koristiti sa ovde navedenim metodama. Testovi u nastavku su opisani za ActRIIA, ali analogno mogu da se koriste za ActRIIB.

[0147] Na primer, može se proceniti efekat polipeptidne varijante ActRIIA na ekspresiju gena uključenih u proizvodnju kostiju ili razaranje kostiju. Ovo se, po potrebi, može izvršiti u prisustvu jednog ili više rekombinantnih ActRIIA ligand proteina (npr. aktivina), a ćelije se mogu transficirati tako da proizvode ActRIIA polipeptid i/ili njegove varijante, i opciono ActRIIA ligand. Slično tome, polipeptid ActRIIA može da se primeni na mišu ili na drugoj životinji, i može da se testira jedna ili više osobina kostiju, kao što su gustina ili zapremina. Takođe može da se ispita brzina zarastanja preloma kostiju. Dvoenergetska rendgenska apsorpciometrija (DEXA) je dobro uspostavljena, neinvazivna, kvantitativna tehnika za procenu gustine kostiju kod životinje. Kod ljudi, centralni DEXA sistemi mogu da se koriste za procenu gustine kostiju u kičmi i karlici. To su najbolji pokazatelji sveukupne gustine kostiju. Periferni DEXA sistemi mogu da se koriste za procenu gustine kostiju u perifernim kostima, uključujući, na primer, kosti šake, ručnog zgloba, članka i stopala. Tradicionalni sistemi za rendgensko snimanje, uključujući CAT skenere, mogu da se koriste za procenu rasta kostiju i zarastanje preloma. Pored toga, gustina kostiju može da se izmeri koristeći kvantitativnu kompjuterizovanu tomografiju (qCT). Takođe može da se proceni mehanička snaga kostiju.

[0148] U određenim aspektima, ovde je predviđena upotreba ActRIIA polipeptida (npr. rastvorljivih ActRIIA polipeptida) i aktivnih polipeptida za identifikaciju jedinjenja (agenasa) koja su agonisti ili antagonisti aktivin-ActRIIA signalnog puta. Jedinjenja koja su identifikovana skriningom mogu da se testiraju kako bi se procenila njihova sposobnost da modulišu rast kostiju ili mineralizaciju in vitro. Opciono, ova jedinjenja dalje mogu da se testiraju na životinjskim modelima kako bi se procenila njihova sposobnost da modulišu rast tkiva in vivo.

[0149] Postoje brojni pristupi skriningu za terapeutske agense za modulaciju rasta tkiva ciljanjem na aktivin i ActRIIA polipeptide. U određenim otelotvorenjima, može se izvršiti skrining jedinjenja visoke propusnosti kako bi se identifikovali agensi koji ometaju delovanje aktivina ili ActRIIA posredovane efekte na kost. U određenim otelotvorenjima, test se sprovodi radi probira i identifikacije jedinjenja koja specifično inhibiraju ili smanjuju vezivanje ActRIIA polipeptida za aktivin. Alternativno, test može da se koristi za identifikaciju jedinjenja koja poboljšavaju vezivanje polipeptida ActRIIA za aktivin. U daljem otelotvorenju, jedinjenja se mogu identifikovati po svojoj sposobnosti da interaguju sa aktivinom ili ActRIIA polipeptidom.

[0150] Različiti formati testova će biti dovoljni i, u svetlu ovog otkrića, oni koji nisu izričito ovde opisani će ipak biti shvaćeni od strane prosečnog stručnjaka u ovoj oblasti. Kao što je ovde opisano, testirana jedinjenja (agensi) koja se ovde koriste mogu da se kreiraju bilo kojim kombinatornom hemijskom metodom. Alternativno, predmetna jedinjenja mogu biti prirodni molekuli koji su sintetisani in vivo ili in vitro. Jedinjenja (agensi) koja se testiraju na njihovu sposobnost da deluju kao modulatori rasta tkiva mogu se proizvesti, na primer, bakterijama, kvascem, biljkama ili drugim organizmima (npr. prirodnim proizvodima), hemijski (npr. malim molekulima, uključujući peptidomimetike) ili rekombinantno. Test jedinjenja koja se ovde razmatraju uključuju nepeptidilne organske molekule, peptide, polipeptide, peptidomimetike, šećere, hormone i molekule nukleinskih kiselina. U jednom specifičnom otelotvorenju, testirani agens je mali organski molekul koji ima molekulsku masu manju od oko 2000 daltona.

[0151] Test jedinjenja mogu biti obezbeđena kao pojedinačni, diskretni entiteti ili obezbeđena u bibliotekama veće složenosti, kao što je napravljeno kombinatornom hemijom. Ove biblioteke mogu da obuhvataju, na primer, alkohole, alkil halogenide, amine, amide, estre, aldehide, etre i druge klase organskih jedinjenja. Uvođenje testiranih jedinjenja u test sistem može biti u izolovanom obliku ili u vidu smeše jedinjenja, naročito u inicijalnim koracima skrininga. Opciono, jedinjenja mogu da se derivatizuju sa drugim jedinjenjima i imaju derivatizujuće grupe koja omogućavaju izolovanje jedinjenja. Neograničavajući primeri derivatizacionih grupa uključuju biotin, fluorescein, digoksigenin, zeleni fluorescentni protein, izotope, polihistidin, magnetne perle, glutation S transferazu (GST), fotoaktivne unakrsne veze ili bilo koje njihove kombinacije.

[0152] U mnogim programima skrininga lekova koji testiraju biblioteke jedinjenja i prirodnih ekstrakata, poželjni su testovi visoke propusnosti kako bi se maksimizirao broj anketiranih jedinjenja u datom vremenskom periodu. Testovi koji se izvode u sistemima bez ćelija, kao što se mogu izvesti sa prečišćenim ili polupročišćenim proteinima, često se preferiraju kao „primarni“ skrining testovi jer se mogu generisati kako bi se omogućio brz razvoj i relativno lako otkrivanje promene u molekularnoj meti koja je posredovana test jedinjenjem. Štaviše, dejstvo ćelijske toksičnosti ili bioraspoloživosti testiranog jedinjenja generalno može da se zanemari u in vitro sistemu, i test se umesto toga primarno fokusira na dejstvo leka na molekulski cilj, što može da se manifestuje kao izmena afiniteta vezivanja između polipeptida ActRIIA i aktivina.

[0153] Samo u svrhu ilustracije, u primeru skrining testa, jedinjenje od interesa se kontaktira sa izolovanim i prečišćenim ActRIIA polipeptidom koji je obično sposoban da se veže za aktivin. U smešu jedinjenja i polipeptida ActRIIA zatim je dodata kompozicija koja sadrži ligand ActRIIA. Detekcija i kvantifikacija kompleksa ActRIIA/aktivin obezbeđuje sredstvo za određivanje efikasnosti jedinjenja u inhibiciji (ili potenciranju) formiranja kompleksa između polipeptida ActRIIA i aktivina. Efikasnost jedinjenja se može proceniti generisanjem krive odgovora na dozu iz podataka dobijenih korišćenjem različitih koncentracija test jedinjenja. Štaviše, takođe može da se obavi kontrolni test kako bi se dobila početna vrednost za poređenje. Na primer, u kontrolnom testu, izolovani i prečišćeni aktivin je dodat u kompoziciju koja sadrži polipeptid ActRIIA, i nastanak kompleksa ActRIIA/aktivin je kvantifikovan u odsustvu testiranog jedinjenja. Podrazumeva se da se, generalno, redosled kojim se reaktanti mogu mešati može menjati i mogu se mešati istovremeno. Štaviše, umesto prečišćenih proteina, mogu se koristiti ćelijski ekstrakti i lizati za izradu odgovarajućeg sistema testiranja bez ćelija.

[0154] Formiranje kompleksa između ActRIIA polipeptida i aktivina može se detektovati različitim tehnikama. Na primer, modulacija formiranja kompleksa može se kvantifikovati korišćenjem, na primer, detektabilno označenih proteina kao što su radioaktivno označeni (npr. 32P, 35S, 14C ili 3H), fluorescentno označeni (npr. FITC) ili enzimski označeni ActRIIA polipeptid ili aktivin, imunološkim testom ili hromatografskom detekcijom.

[0155] U određenim slučajevima, ovde se razmatra upotreba testova fluorescentne polarizacije i testova fluorescentne rezonance prenosa energije (FRET) u merenju, bilo direktno ili indirektno, stepena interakcije između ActRIIA polipeptida i njegovog vezujućeg proteina. Nadalje, drugi vidovi detekcije, kao što su oni koji se zasnivaju na optičkim talasovodima (PCT publikacija WO 96/26432 i američki patent br. 5,677,196), površinska plazmonska rezonanca (SPR), senzori površinskog naboja i senzori površinske sile kompatibilni su sa mnogim ovde opisanim otelotvorenjima.

[0156] Štaviše, test interakcione zamke, poznat i kao „dva hibridna testa“, može se koristiti za identifikaciju agenasa koji ometaju ili potenciraju interakciju između ActRIIA polipeptida i njegovog vezujućeg proteina. Videti na primer američki patent br.5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; i Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). U specifičnom otelotvorenju, ovde se razmatra upotreba obrnuta dva hibridna sistema za identifikaciju jedinjenja (npr. malih molekula ili peptida) koja disociraju interakcije između ActRIIA polipeptida i njegovog vezujućeg proteina. Videti na primer Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; i američki patent br.5,525,490; 5,955,280; i 5,965,368.

[0157] U određenim slučajevima, predmetna jedinjenja se identifikuju po svojoj sposobnosti interakcije sa ActRIIA ili aktivnim polipeptidom. Interakcija između jedinjenja i polipeptida ActRIIA ili aktivina može biti kovalentna ili nekovalentna. Na primer, takva interakcija se može identifikovati na nivou proteina korišćenjem in vitro biohemijskih metoda, uključujući foto unakrsno povezivanje, vezivanje radioaktivno označenog liganda i afinitetnu hromatografiju (Jakoby W B et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). U specifičnim slučajevima, jedinjenja mogu da se ispitaju u testu na bazi mehanizma, kao što je test za detekciju jedinjenja koja se vezuju za polipeptid aktivina ili ActRIIA. To može da uključuje događaj vezivanja u čvrstoj fazi ili u tečnoj fazi. Alternativno, gen koji kodira aktivin ili ActRIIA polipeptid može se transfektovati reporterskim sistemom (npr. β-galaktozidazom, luciferazom ili zelenim fluorescentnim proteinom) u ćeliju i pregledati prema biblioteci po mogućnosti skriningom visoke propusnosti ili sa pojedinačnim članovima biblioteke. Mogu da se koriste i drugi testovi vezivanja na bazi mehanizma, na primer, testovi vezivanja koji mogu da detektuju promene slobodne energije. Testovi vezivanja mogu da se obave sa ciljem fiksiranim u bunarčiću, perlici ili čipu ili uhvaćenim putem imobilisanog antitela ili resolvatisanim putem kapilarne elektroforeze. Vezano jedinjenje obično može da se detektuje koristeći kolorimetriju ili fluorescenciju ili površinsku plazmonsku rezonancu.

6. PRIMERI

6.1 PRIMER 1: MULTICENTRIČNA, OTVORENA STUDIJA FAZE 2 ZA PROCENU EFIKASNOSTI I BEZBEDNOSTI LUSPATERCEPTA KOD SUBJEKATA SA MIJELOFIBROZOM POVEZANOM SA MIJELOPROLIFERATIVNOM NEOPLAZMOM I ANEMIJOM SA I BEZ ZAVISNOSTI OD TRANSFUZIJE CRVENIH KRVNIH ZRNACA

[0158] vaj primer se odnosi na multicentričnu, otvorenu studiju faze 2 za procenu luspatercepta, inhibitora ActRIIB signalizacije, kod subjekata sa mijelofibrozom povezanom sa mijeloproliferativnom neoplazmom koji imaju anemiju sa i bez zavisnosti od transfuzije crvenih krvnih zrnaca. Studija je podeljena na period skrininga, period lečenja (koji se sastoji od primarne faze, procene odgovora na bolest 169. dana i faze produžetka), nakon čega sledi period praćenja nakon lečenja. Svrha ove studije faze 2 je da proceni da li postoji signal efikasnosti sa luspaterceptom kod pacijenata sa MF povezanom sa MPN koji su anemični i mogu ili ne moraju biti zavisni od transfuzije RBC korekcijom neefikasne eritropoeze i time smanjenjem anemije, stanja koje se razvija kod skoro svih pacijenata sa MF povezanom sa MPN (od kojih je umor simptom).

[0159] Subjekti koji ispunjavaju kriterijume podobnosti raspoređeni su u 1 od sledećih kohorti (koje se paralelno upisuju) na osnovu njihove podobnosti: (1) Kohorta 1: sadrži do 20 subjekata samo sa anemijom koji trenutno ne primaju transfuzije RBC (ovi subjekti se nazivaju „samo anemija“ tokom ovog primera, definisano kao da su primili 0 jedinica RBC/84 dana odmah do datuma 1. ciklusa, 1. dan (C1D1)); (II) Kohorta 2: sadrži do 20 subjekata koji su zavisni od RBC transfuzije (ovi subjekti se nazivaju „zavisni od transfuzije RBC“ tokom celog primera, definisanog kao da su primili prosečnu učestalost transfuzije RBC od 2 do 4 jedinice RBC/28 dana tokom najmanje 84 dana neposredno do datuma C1D1); (iii) Kohorta 3A: sadrži ≥ 10 subjekata (Kohorta 3 sadrži ukupno 30 subjekata) koji ispunjavaju kriterijume podobnosti za Kohortu 1 (samo anemija) dok su na stabilnoj dozi ruksolitiniba najmanje 112 dana neposredno pre datuma uključivanja; i (iv) Kohorta 3B: sadrži ≥ 10 subjekata (Kohorta 3 sadrži ukupno 30 subjekata) koji ispunjavaju kriterijume podobnosti za Kohortu 2 (zavisno od RBC transfuzije) dok su na stabilnoj dozi ruksolitiniba najmanje 112 dana neposredno pre datuma uključivanja. Sve u svemu, studija će uključiti oko 70 subjekata širom sveta.

6.1.1 Primarne mere ishoda

[0160] Sledeće su primarne mere ishoda za ispitivanje faze 2: (i) odgovor na anemiju koji se odnosi na povećanje hemoglobina (Hgb) (udeo subjekata iz kohorti 1 i 3A koji su postigli povećanje hemoglobina od ≥ 1,5 g/dL u odnosu na početnu vrednost tokom bilo kog uzastopnog perioda od 84 dana bez transfuzije RBC; vremenski okvir merenja je približno do dana 168); (ii) odgovor na anemiju koji se odnosi na povećanje nezavisnosti od transfuzije crvenih krvnih zrnaca (RBC) (udeo subjekata iz kohorti 2 i 3B koji su postali nezavisni od transfuzije RBC tokom bilo kog uzastopnog perioda od 84 dana period; vremenski okvir merenja je približno do dana 168); (iii) vreme do odgovora na anemiju (vreme od prve doze luspatercepta do prvog početka odgovora na anemiju u svakoj od kohorti; vremenski okvir merenja je približno do 2 godine); (iv) trajanje odgovora na anemiju (maksimalno trajanje odgovora na anemiju u svakoj od kohorti; vremenski okvir merenja je približno do 2 godine); (v) učestalost transfuzija RBC (srednji broj transfuzija RBC po subjektu tokom četiri nedelje; vremenski okvir merenja je približno do 2 godine); (vii) učestalost zavisnosti od transfuzije RBC (udeo subjekata zavisnih od transfuzije RBC koji smanjuju opterećenje transfuzijom za ≥ 50% od početnog stanja tokom bilo kog uzastopnog perioda od 84 dana; vremenski okvir merenja je približno do 2 godine); (vii) udeo subjekata koji postižu smanjenje simptoma umora za ≥ 50%, što je čest simptom kod pacijenata sa mijelofibrozom povezanom sa mijeloproliferativnom neoplazmom koji imaju anemiju, kako je zabeleženo i procenjeno putem modifikovanog obrasca za procenu simptoma mijeloproliferativne neoplazme (MPN-SAF), (videti Emanual et al., "Myeloproliferative Neoplasm (MPN) Symptom Assessment Form Total Symptom Score: Prospective International Assessment of an Abbreviated Symptom Burden Scoring System Among Patients With MPNs," J. Clin. Oncol.30(33):4098-4103 (2012); vremenski okvir merenja je približno do 2 godine); (viii) udeo subjekata koji postižu smanjenje od ≥ 50% u ukupnom rezultatu simptoma (TSS). Simptomi pu vezi sa mijelofibrozom povezanom sa mijeloproliferativnom neoplazmom (MPN) (umor, noćno znojenje, svrab, nelagodnost u stomaku, bol ispod rebara na levoj strani, rana zasićenost i bol u kostima) zabeleženi i procenjeni putem modifikovanog obrasca za procenu simptoma mijeloproliferativne neoplazme (MPN-SAF), (videti Emanual et al., "Myeloproliferative Neoplasm (MPN) Symptom Assessment Form Total Symptom Score: Prospective International Assessment of an Abbreviated Symptom Burden Scoring System Among Patients With MPNs," J. Clin. Oncol. 30(33):4098-4103 (2012); (ix) Health-related quality of life (HRQoL): merenje srednjih promena u rezultatima domena upitnika HRQoL tokom studije upoređuje se sa početnim rezultatima (vremenski okvir merenja je približno do 2 godine); (x) EQ-5D-5L upitnici (EuroQol, Roterdam, Holandija): merenje srednjih promena u rezultatima domena upitnika EQ-5D-5L tokom studije upoređuje se sa početnim rezultatima (vremenski okvir merenja je približno do 2 godine); (xi) procenjuju se neželjeni događaji (uključujući vrstu, učestalost i težinu); vremenski okvir merenja je približno do 2 godine ); (xiii) antitela na lek (ADA) (učestalost antitela na lek i uticaji na efikasnost, bezbednost ili farmakokinetiku; vremenski okvir merenja je približno do 2 godine); (xiii) farmakokinetika (površina ispod krive (auc) i Cmax; vremenski okvir merenja je približno do 2 godine); i (xiv) Funkcionalna procena terapije karcinoma - anemije (FACT-An): merenje srednjih promena rezultata u domenu upitnika FACT-An tokom studije upoređuju se sa početnim rezultatima (vremenski okvir merenja je približno do 2 godine).

6.1.2 Kriterijumi inkluzije

[0161] Subjekti moraju da zadovolje kriterijume iz ovog odeljka da bi bili uključeni u studiju (sa datumom upisa definisanim kao datum kada je subjektu dodeljena kohorta u tehnologiji integrisanog odgovora [IRT]) i da prime svoju prvu dozu luspatercepta.

[0162] Subjekt mora imati ≥18 godina u trenutku potpisivanja obrasca informisanog pristanka (ICF).

[0163] Subjekt ima mijelofibrozu povezanu sa MPN (PMF, post-PV MF i/ili post-ET MF) kao što je potvrđeno iz lokalnog patološkog izveštaja.

[0164] Subjekt ima anemiju definisanu kao: (I) kohorte 1 i 3A: (a) subjekt ima ≥ 3 nivoa Hgb od ≤ 9,5 g/dl zabeležena ≥ 3 različita dana, uključujući dan doziranja, u periodu od 84 dana neposredno do datuma C1D1; nisu uključeni subjekti sa intervalom od ≥ 42 dana između merenja hemoglobina; i (b) ne sme postojati transfuzija RBC u periodu od 84 dana neposredno do datuma C1D1; i (11) kohorte 2 i 3B: (a) subjekt ima prosečnu učestalost transfuzije RBC od 2 do 4 jedinice RBC/28 dana tokom najmanje 84 dana neposredno do datuma C1D1; ne sme postojati interval > 42 dana bez ≥ 1 transfuzije RBC; (b) isubjekti moraju imati vrednost Hgb ≤ 13 g/dl na C1D1 pre primene luspatercepta; (c) samo transfuzije RBC date kada je Hgb ≤ 9,5 g/dl se boduju u određivanju podobnosti; i (d) transfuzije RBC date zbog krvarenja, infekcije ili anemije izazvane hemoterapijom se ne boduju u utvrđivanju ispunjenosti uslova.

[0165] Subjekt ima rezultat učinka Istočne kooperativne onkološke grupe (ECOG) ≤ 2. Videti npr. Oken et al. (1982). "Toxicity and response criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group". Am. J. Clin.

Oncol.5 (6): 649-55, u vezi sa ECOG rezultatom učinka. Subjekt koji ima ECOG rezultat performansi 0 je asimptomatski (tj. potpuno aktivan, sposoban da obavlja sve aktivnosti pre bolesti bez ograničenja). Subjekt koji ima ECOG rezultat performansi 1 je simptomatičan, ali potpuno pokretan (tj. ograničen u fizički napornoj aktivnosti, ali pokretan i sposoban da obavlja poslove lake ili sedentarne prirode, na primer, lake kućne poslove, kancelarijske poslove). Subjekt koji ima ECOG rezultat performansi 2 je simptomatičan, <50% u krevetu tokom dana (tj. pokretan i sposoban za svu brigu o sebi, ali nesposoban za obavljanje bilo kakvih radnih aktivnosti; do i oko 50% budnih sati). Subjekt koji ima ECOG rezultat performansi 3 je simptomatičan, >50% u krevetu, ali nije vezan za krevet (tj. sposoban je samo za ograničenu brigu o sebi, ograničen na krevet ili stolicu 50% ili više sati budnosti). Subjekt koji ima ECOG rezultat performansi 4 je vezan za krevet (tj. potpuno je onesposobljen; ne može da nastavi sa samopomoći; potpuno je ograničen na krevet ili stolicu). Subjekt koji ima ECOG rezultat učinka 5 je mrtav.

[0166] Ne očekuje se da će subjekt tokom 6 meseci od datuma C1D1 primiti transplantaciju hematopoetskih ćelija.

[0167] Ženski subjekt reproduktivnog potencijala (FCBP) za ovu studiju definisan je kao žena koja: (1) je postigla menarhu u nekom trenutku; i (2) nije prošla histerektomiju ili bilateralnu terapiju (ne isključuje reproduktivni potencijal) najmanje 24 uzastopna meseca (tj. imala je menstruaciju u bilo kom trenutku u prethodna 24 uzastopna meseca). FCBP koja učestvuje u studiji mora: (a) (a) imati 2 negativna testa na trudnoću verifikovana od strane istraživača pre početka studijske terapije; mora pristati na kontinuirano testiranje na trudnoću tokom studije, a nakon završetka studijske terapije, što se primenjuje čak i ako subjekt praktikuje istinsku apstinenciju od heteroseksualnog kontakta; i (b) ili se obavezati na istinsku apstinenciju od heteroseksualnog kontakta (koji se mora pregledati na mesečnom nivou i dokumentovati izvor) ili pristati na upotrebu efikasne kontracepcije bez prekida, 28 dana pre početka ispitivanog leka, tokom studijske terapije (uključujući prekide doziranja), i tokom 12 nedelja (približno 5 puta srednji terminalni poluživot luspatercepta na osnovu podataka o farmakokinetici višestrukih doza [PK]) nakon prekida studijske terapije.

[0168] Muški subjekti moraju: (a) da praktikuju istinsku apstinenciju (koja se mora preispitivati na mesečnom nivou) ili da pristanu da koriste kondom tokom seksualnog kontakta sa trudnicom ili ženom reproduktivne dobi tokom učešća u studiji, tokom prekida doziranja i najmanje 12 nedelja (približno 5 puta srednji terminalni poluživot luspatercepta na osnovu podataka o farmakokinetici višestrukih doza) nakon prekida ispitivanog proizvoda, čak i ako je podvrgnut uspešnoj vazektomiji.

[0169] Subjekt mora da razume i dobrovoljno potpiše obrazac informisanog pristanka pre sprovođenja bilo kakvih procena/procedura u vezi sa studijom.

[0170] Subjekt je voljan i sposoban da se pridržava rasporeda studijske posete i drugih zahteva protokola.

6.1.3 Metoda lečenja

[0171] Doza luspatercepta je 1,75 mg/kg.

[0172] Luspatercept se daje subjektu supkutano jednom u 21 dan do 2 godine.

6.2 PRIMER 2

6.2.1 Pozadina

[0173] Mijelofibroza (MF) povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom (MPN) je klonska mijeloidna neoplazma koju karakterišu fibroza koštane srži, defektna funkcija koštane srži, ekstramedularna hematopoeza, sklonost transformaciji u blastnu fazu i upala (Mesa RA, et al. Leuk Res. 2011;35(1):12-13). Anemija i zavisnost od transfuzije crvenih krvnih zrnaca (RBC) (TD) su nezavisne nepovoljne prognostičke i prediktivne varijable za preživljavanje među ovim pacijentima (Passamonti F, et al. Blood.

2010;115(9): 1703-1708; Elena C, et al. Haematologica.2011;96(1): 167-170).

[0174] Luspatercept je rekombinantni fuzioni protein koji se sastoji od modifikovanog receptora aktivina tipa IIB povezanog sa Fc domenom humanog imunoglobulina G1 (IgG1) (slika 1) (Attie KM, et al. Am J Hematol. 2014;89(7):766-770; Suragani RN, et al. Nat Med. 2014;20(4):408-414). Luspatercept deluje kao agens eritroidnog sazrevanja vezivanjem specifičnih transformacionih faktora rasta-β (TGF-β) superfamilijskih liganda kao što je faktor diferencijacije rasta-11 (GDF11), blokirajući njihov inhibitorni efekat i dovodeći do povećane proizvodnje RBC (Suragani RN, et al. Nat Med. 2014;20(4):408-414). U nedavnoj studiji faze 2, luspatercept se pokazao efikasnim i dobro se podnosi za lečenje anemije kod pacijenata sa mijelodisplastičnim sindromima nižeg rizika (Platzbecker U, et al. Lancet Oncol.

2017;18(10):1338-1347).

[0175] Cilj ovog kliničkog ispitivanja je procena efikasnosti i bezbednosti luspatercepta za lečenje anemije kod pacijenata sa MF povezanom sa MPN sa ili bez RBC-TD.

6.2.2 Detalji studije

[0176] Ovaj primer se odnosi na tekuću, multicentričnu, otvorenu studiju faze 2.

6.2.3 Studijska populacija

[0177] Kriterijumi za uključivanje u ovu studiju su: (i) starost ≥ 18 godina; (ii) MF povezana sa MPN (primarna MF, postpolimitemija vera MF ili mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije MF); (iii) anemija, definisana kao: (a) kohorte 1 i 3a: ≥ 3 nivoa hemoglobina (Hb) ≤ 9,5 g/dl tokom ≥ 3 dana (uključujući dan doziranja), bez transfuzija RBC u 84 dana pre 1. dana ciklusa (C1D1); ≥ 42 dana između merenja će biti isključena; (b) kohorte 2 i 3b: prosečna učestalost transfuzije RBC od 2-4 jedinice RBC/28 dana tokom ≥ 84 dana pre C1D1, bez intervala > 42 dana bez ≥ 1 transfuzije RBC; Hb < 13 g/dl na C1D1 pre primene luspatercepta; i (iv) status performansi Istočne kooperativne onkološke grupe 2 ≤.

6.2.4 Dizajn studije i lečenje:

[0178] Studija se sastoji od 3 perioda (slika 2): (i) perioda skrininga; (ii) perioda lečenja (primarna faza, procena odgovora na bolest 169. dana i faza produžetka); i (iii) perioda praćenja nakon lečenja.

(a) Period skrininga

[0179] Sve procedure skrininga se sprovode ≤ 28 dana pre uuključivanja.

(b) Period lečenja

[0180] Svi pacijenti će primati luspatercept 1 mg/kg supkutano 1. dana svakog 21. dana ciklusa. Pacijenti će biti uključeni u kohorte u skladu sa zahtevima za transfuziju RBC: (i) kohorte 1 i 3a (samo anemija); i (ii) kohorte 2 i 3b (RBC-TD). Najbolja suportivna nega se može koristiti u kombinaciji sa studijskom terapijom. Procena odgovora na bolest treba da se završi 169. dana nakon prve doze studijske terapije. Pacijenti sa odgovorom mogu nastaviti lečenje do dodatnih 1,5 godina. Pacijenti koji ne daju odgovor će prekinuti lečenje.

(c) Period praćenja nakon lečenja

[0181] Nakon prekida lečenja, podaci o bezbednosti praćenja biće prikupljeni do 42 dana nakon poslednje doze studijske terapije. Podaci o bezbednosti će se zatim prikupljati svaka 3 meseca do 3 godine nakon poslednje doze studijske terapije ili do smrti, povlačenja saglasnosti ili gubitka kontrole.

6.2.5 Krajnje tačke

[0182] Primarne i sekundarne krajnje tačke su navedene u tabeli 1 (u nastavku). Eksplorativni ishodi uključuju izloženost lečenju-odgovor, biomarkere i mutacione analize. Sve analize efikasnosti će se vršiti prvenstveno na populaciji planiranoj za lečenje, definisanoj kao svi uključeni pacijenti. Potvrdne analize efikasnosti će biti sprovedene na populaciji koja procenjuje efikasnost, definisanoj kao svi pacijenti koji su: (i) primili ≥ 3 ciklusa terapije ispitivanja i ostali u ispitivanju ≥ 21 dan nakon treće doze ispitivanja; ili (ii) postigli Hb > 13 g/dl u < 3 ciklusa. Bezbednosne analize će se vršiti na svim pacijentima koji primaju ≥ 1 dozu studijske terapije. Neželjeni događaji i laboratorijske abnormalnosti se klasifikuju prema NCI-CTCAE verziji 4.03. Farmakokinetičke analize će se zasnivati na svim pacijentima koji imaju procenjive podatke o koncentraciji za određivanje farmakokinetičkih parametara.

6.2.6 Statističke analize

[0183] Pre svega će se koristiti deskriptivne statističke analize. Kaplan-Mejerova metoda se može koristiti za procenu trajanja odgovora na anemiju. Neće se vršiti inferencijalna poređenja između kohorti.

6.2.7 Status studije

[0184] Prijava je počela u novembru 2017. godine. Cilj prijave je 70 pacijenata sa MF povezanom sa MPN i anemijom, sa ili bez RBC-TD. Od 9. aprila 2018. godine na 24 klinička mesta, 12 pacijenata je uključeno u studiju.

Tabela 1. Krajnje tačke studije

[0185] Tabela 2.

Claims

Patentni zahtevi

1. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu u metodi za lečenje anemije kod subjekta koji ima mijelofibrozu povezanu sa mijeloproliferativnom neoplazmom, pri čemu je subjekt prethodno lečen ruksolitinibom, pri čemu se metoda sastoji od primene na subjektu farmaceutski efikasne količine inhibitora signalizacije ActRIIB, pri čemu je inhibitor signalizacije ActRIIB fuzioni protein koji se sastoji od: (a) fragmenta ekstracelularnog domena ActRIIB, pri čemu fragment sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 9; (b) linkera; i (c) Fc IgG.

2. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu lečenje smanjuje ili ublažava jedan ili više simptoma mijelofibroze povezane sa mijeloproliferativnom neoplazmom kod subjekta.

3. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, pri čemu je simptom jedan ili više iz grupe koju čine umor, noćno znojenje, svrab, nelagodnost u stomaku, bol ispod rebara na levoj strani, rano zasićenje ili bol u kostima.

4. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu je subjekt bio na stabilnoj dozi ruksolitiniba najmanje 112 dana neposredno pre primene inhibitora signalizacijeActRIIB na subjektu.

5. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu je mijelofibroza povezana sa mijeloproliferativnom neoplazmom

(i) primarna mijelofibroza;

(ii) mijelofibroza nakon policitemije vere; ili

(iii) mijelofibroza nakon esencijalne trombocitemije.

6. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu je subjekt:

(i) nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca; ili

(ii) zavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca.

7. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je:

(i) subjekt nezavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je primio 0 jedinica crvenih krvnih zrnaca u periodu od 84 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu; ili

(ii) subjekt zavisan od transfuzije crvenih krvnih zrnaca ako je subjekt primio prosečnu frekvenciju transfuzije crvenih krvnih zrnaca od 2 do 4 jedinice crvenih krvnih zrnaca u 28 dana tokom perioda od najmanje 84 dana pre primene inhibitora signalizacije ActRIIB na subjektu.

8. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, pri čemu je farmaceutski efikasna količina 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg, opciono pri čemu je farmaceutski efikasna količina 1,0 mg/kg.

9. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, pri čemu se inhibitor signalizacije ActRIIB daje subjektu:

(i) jednom u 21 dan, jednom u 28 dana ili jednom u 48 dana;

(ii) intravenozno ili subkutano; ili

(iii) supkutano jednom u 21 dan.

10. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu je IgG IgG1.

11. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, pri čemu je inhibitor signalizacije ActRIIB

(i) polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11;

(ii) polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEQ ID NO:11; ili

(iii) polipeptid koji se sastoji od sekvence aminokiselina navedene u SEQ ID NO:11.

12. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, pri čemu je subjekt čovek.

13. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, pri čemu metoda obuhvata davanje subjektu doze od 0,33 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,75 mg/kg ili 2,0 mg/kg inhibitora signalizacije ActRIIB, pri čemu se inhibitor signalizacije ActRIIB daje subjektu supkutano jednom svakih 21 dan i pri čemu inhibitor signalizacije ActRIIB:

(i) obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:11;

(ii) obuhvata sekvencu aminokiselina koja se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11; ili (iii) sastoji se od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:11.

14. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13, pri čemu je inhibitor signalizacije ActRIIB formulisan sa farmaceutski prihvatljivim nosačem kao farmaceutskom kompozicijom.

15. Inhibitor signalizacije ActRIIB za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 14, pri čemu se fragment sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 9.