RS66162B1 - 4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-l-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-l-il)-3-fluorobenzonitril kao antiproliferativno jedinjenje - Google Patents

Description

Opis

1. POLJE PRIMENE

[0001] Ovde je predviđen 4-(4-(4- (((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril, ili enantiomer, smeša takvih Jedinjenja za upotrebu u obliku enantiomera, tautomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, kao i takva jedinjenja za upotrebu u metodama lečenja, prevencije ili upravljanja multiplim mijelomom. Takođe su predviđeni farmaceutski sastavi koji sadrže jedinjenja, kao i primene ovih sastava, uključujući kombinovane tretmane.

2. POZADINA PRONALASKA

[0002] Multipli mijelom (MM) je karcinom plazma ćelija u koštanoj srži. U normalnim okolnostima, ćelije plazme proizvode antitela i igraju ključnu ulogu u imunološkoj funkciji. Međutim, nekontrolisani rast ovih ćelija dovodi do bolova u kostima i fraktura, anemije, infekcija i drugih komplikacija. Multipli mijelom je drugi najčešći hematološki malignitet, iako tačni uzroci multiplog mijeloma ostaju nepoznati. Multipli mijelom uzrokuje visok nivo proteina u krvi, urinu i organima, uključujući, bez ograničenja, M-protein i druge imunoglobuline (antitela), albumin i beta-2-mikroglobulin, osim kod nekih pacijenata (prema procenama od 1% do 5%) čije ćelije mijeloma ne luče ove proteine (nazvane ne-sekretorni mijelom). M-protein, skraćeno od monoklonalni protein, takođe poznat kao paraprotein, predstavlja posebno abnormalan protein koji proizvode ćelije plazme mijeloma i koji se može naći u krvi ili urinu gotovo svih pacijenata obolelih od multiplog mijeloma, osim pacijenata obolelih od ne-sekretornog mijeloma ili čije ćelije mijeloma proizvode imunoglobuline lakog lanca sa teškim lancem.

[0003] Skeletni simptomi, uključujući bol u kostima, predstavljaju klinički najznačajnije simptome multiplog mijeloma. Maligne ćelije plazme oslobađaju faktore koji stimulišu osteoklaste (uključujući IL-1, IL-6 i TNF) koji dovode do izlučivanja kalcijuma iz kostiju uzrokujući litičke lezije; hiperkalcemija je još jedan simptom. Faktori koji stimulišu osteoklaste, koji se nazivaju i citokini, mogu sprečiti apoptozu ili smrt ćelija mijeloma. Pedeset procenata pacijenata ima radiološki detektabilne skeletne lezije povezane sa mijelomom prilikom dijagnoze. Drugi uobičajeni klinički simptomi multiplog mijeloma uključuju polineuropatiju, anemiju, hiperviskoznost, infekcije i bubrežnu insuficijenciju.

[0004] Trenutna terapija multiplog mijeloma može uključivati jednu ili više operacija, transplantaciju matičnih ćelija, hemoterapiju, imunološku terapiju i/ili tretman zračenjem kako bi se iskorenile ćelije multiplog mijeloma kod pacijenta. Svi trenutni terapijski pristupi odlikuju se značajnim lošim stranama kada je u pitanju pacijent.

[0005] Tokom poslednje decenije, novi terapijski agensi, posebno imunomodulatorni lekovi kao što su lenalidomid i pomalidomid, u značajnoj meri su povećali stopu odgovora i produžili preživljavanje bez progresije (PFS) i ukupno preživljavanje (OS) kod pacijenata sa multiplim mijelomom. Međutim, perzistentni nivoi rezidualne bolesti koji su ispod osetljivosti morfologije koštane srži (BM), proteinske elektroforeze sa imunofiksacijom i kvantitacije lakog lanca postoje kod mnogih pacijenata sa multiplim mijelomom, čak i nakon što ovi pacijenti postignu potpuni odgovor (CR), i u ultimativnom ishodu uzrokuju recidiv bolesti. Minimalna rezidualna bolest (MRD) kod mijeloma je nezavisan prediktor preživljavanja bez progresije (PFS) i razmatra se kao surogatni parametar praćenja ispitivanja kako bi se poboljšala identifikacija efikasnih tretmana, posebno za ispitivanja na prvoj liniji, koja trenutno zahtevaju 5 do 10 godina praćenja kako bi se identifikovale razlike u preživljavanju. Praćenje minimalne rezidualne bolesti (MRD) kod pacijenata sa multiplim mijelomom stoga pruža prognostičku vrednost u predviđanju PFS-a i OS-a i donošenju odluka o lečenju. Detekcija minimalne rezidualne bolesti (MRD) kod mijeloma može koristiti prag od 0,01% (10<-4>) nakon tretmana, odnosno 10<-4>ili manje ćelija multiplog mijeloma u udelu ukupnih mononuklearnih ćelija koštane srži smatra se MRD negativnim rezultatom, a 10<-4>ćelija ili više MRD pozitivnim rezultatom. Prag od 10<-4>MRD je prvobitno bio zasnovan na tehničkim mogućnostima, ali kvantitativna detekcija MRD je sada moguća na nivou 10<-5>uz pomoć protočne citometrije i 10<-6>uz pomoć sekvenciranja visoke propusnosti. (Rawstron et al., Blood 2015; 125(12): 1932-1935). Metode za merenje MRD uključuju DNK sekvenciranje VDJ, lančanu reakciju polimeraze (PCR) (uključujući alel specifičnu PCR, ASO PCR) i multiparametarsku protočnu citometriju (MPF). Testovi za MRD, npr. zasnovani na merenju profila klonotipa takođe su opisani u Patentu SAD br.8,628,927, Faham et al.

[0006] Matyskiela et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2018, Vol. 61, strane 535-542, opisuje cereblon modulator CC-220 u degradaciji proteina Ikaros i Aiolos.

[0007] WO 2014/025960 se odnosi na 3-(4-((4-(morfolinometil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)piperidin-2,6-dion i njegovu upotrebu u lečenju, prevenciji i/ili upravljanju karcinomima.

[0008] Postoji značajna potreba za sigurnim i efikasnim jedinjenjima i metodama za lečenje, prevenciju i upravljanje multiplim mijelomom, uključujući kod pacijenata kod kojih je multipli mijelom novodijagnostikovan ili refraktoran na standardne tretmane, uz istovremeno smanjenje ili izbegavanje toksičnosti i/ili neželjenih efekata koji se dovode u vezu sa konvencionalnim terapijama.

[0009] Citat ili navođenje bilo kakve reference u 2. odeljku ovog patentnog zahteva ne treba tumačiti kao priznanje da referenca predstavlja prethodnu upotrebu u odnosu na ovaj patentni zahtev.

3. REZIME

[0010] Ovde su navedena jedinjenja pronalaska, farmaceutski sastavi koji sadrže jedinjenja i jedinjenja za upotrebu u metodama lečenja multiplog mijeloma. Jedinjenje za upotrebu u sastavima i metodama u ovom dokumentu je 4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril (Jedinjenje 1):

ili enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0011] U jednom drugom otelotvorenju, Jedinjenje koje se koristi u ovde navedenim sastavima i metodama je (S)-4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril (Jedinjenje 2):

ili tautomer, izotopolog ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0012] U još jednom otelotvorenju, Jedinjenje koje se koristi u ovde navedenim sastavima i metodama je (R)-4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril (Jedinjenje 3):

ili tautomer, izotopolog ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0013] Takođe su predviđeni farmaceutski sastavi formulisani za primenu odgovarajućim putem i sredstvima, koji sadrže efikasne koncentracije ovde navedenih jedinjenja, na primer Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili enantiomer, smešu enantiomera, tautomer, izotopolog, ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so, i opciono sadrže najmanje jedan farmaceutski nosač.

[0014] U jednom otelotvorenju, farmaceutski sastavi isporučuju količine efikasne za lečenje multiplog mijeloma. U jednom otelotvorenju, farmaceutski sastavi isporučuju količine efikasne za prevenciju multiplog mijeloma. U jednom otelotvorenju, farmaceutski sastavi isporučuju količine efikasne za ublažavanje multiplog mijeloma.

[0015] Ovde su navedena i jedinjenja ili sastavi pronalaska za primenu u metodama kombinovane terapije, ili enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so istih, pri čemu se kombinovana terapija sastoji od primene jedinjenja ili sastava pronalaska u kombinaciji sa terapijom, npr. drugim farmaceutskim agensom sa aktivnošću protiv multiplog mijeloma ili njegovih simptoma. Primeri terapija u okviru metoda uključuju, bez ograničenja, hirurgiju, hemoterapiju, radioterapiju, biološku terapiju, transplantaciju matičnih ćelija, ćelijsku terapiju i njihove kombinacije.

[0016] Ovde navedena jedinjenja ili sastavi, ili njihovi farmaceutski prihvatljivi derivati, mogu se primenjivati istovremeno, pre ili posle zajedničke primene jedne ili više gorenavedenih terapija. Takođe su predstavljeni farmaceutski sastavi koji sadrže jedinjenje predviđeno ovim dokumentom i jednu ili više gore navedenih terapija.

[0017] U jednom otelotvorenju, efikasne količine jedinjenja ili sastava koji sadrže terapijski efikasne koncentracije jedinjenja daju se pojedincu koji pokazuje simptome multiplog mijeloma koji zahtevaju lečenje. Količine su efikasne za ublažavanje ili eliminisanje jednog ili više simptoma multiplog mijeloma. U praktikovanju metoda lečenja, efikasne količine jedinjenja ili sastava koji sadrže terapijski efikasne koncentracije jedinjenja primenjuju se na pacijentu sa multiplim mijelomom kome je to potrebno.

[0018] U nastavku je predviđeno farmaceutsko pakovanje ili komplet koji se sastoji od jedne ili više posuda napunjenih sa jednim ili više sastojaka farmaceutskih sastava. Opciono povezano sa takvom posudom(posudama) može biti obaveštenje u obliku propisanom od strane vladine agencije koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda, koje obaveštenje odražava odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za primenu kod ljudi. Paket ili komplet mogu biti obeleženi informacijama o načinu primene, redosledu primene leka (npr. odvojeno, sekvencijalno ili istovremeno) ili slično.

[0019] Ovi i drugi aspekti ovde opisanog pronalaska postaće očigledni nakon pozivanja na sledeći detaljan opis.

4. DETALJAN OPIS PRONALASKA

A. Definicije

[0020] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što se obično podrazumeva od strane stručnjaka u oblasti. U slučaju većeg broja definicija za određeni termin iz ovog odeljka, ovde navedene definicije će prevladati, osim ako nije drugačije navedeno.

[0021] se odnosi na količinu, koncentraciju ili dozu određenog testnog jedinjenja koje postiže 50% inhibiciju maksimalnog odgovora, kao što su vezivanje receptora, aktivnost receptora, rast ćelija ili proliferacija, mereno bilo kojim od ovde opisanih in vitro ili ćelijskih analiza.

[0022] Farmaceutski prihvatljive soli uključuju, bez ograničenja, soli amina, kao što su, bez ograničenja, N,N'-dibenziletilendiamin, hloroprokain, holin, amonijak, dietanolamin i drugi hidroksialkilamini, etilendiamin, N-metilglukamin, prokain, N-benzilfenetilamin, 1-parahlorobenzil-2-pirolidin-1'-ilmetil-benzimidazol, dietilamin i drugi alkilamini, piperazin i tris(hidroksimetil)aminometan; soli alkalnih metala, kao što su, bez ograničenja, litijum, kalijum i natrijum; soli zemnoalkalnih metala, kao što su, bez ograničenja, barijum, kalcijum i magnezijum; soli prelaznih metala, kao što je, bez ograničenja, cink; i druge soli metala, kao što su, bez ograničenja, natrijum hidrogen fosfat i dinatrijum fosfat; i takođe uključujući, bez ograničenja, soli mineralnih kiselina, kao što su, bez ograničenja, hidrohloridi i sulfati; i soli organskih kiselina, kao što su, bez ograničenja, acetati, laktati, malati, tartrati, citrati, askorbati, sukcinati, butirati, valerati, fumarati i organski sulfonati.

[0023] Osim ako nije izričito navedeno drugačije, u situacijama u kojima jedinjenje može da preuzme alternativne tautomerne, regioizomerne i/ili stereoizomerne oblike, svi alternativni izomeri smatraju se obuhvaćeni obimom pronalaska za koji se podnosi patentna prijava. Na primer, u situacijama u kojima jedinjenje može imati jedan od dva tautomerna oblika, oba tautomera će biti obuhvaćena ovim zahtevom.

[0024] Dakle, ovde navedena jedinjenja mogu biti enantiomerno čista, ili stereoizomerne ili dijastereomerne smeše. Kao što se ovde koristi i ako nije drugačije naznačeno, termin „stereoizomerno čist“ označava sastav koji se sastoji od jednog stereoizomera jedinjenja i u suštini je bez drugih stereoizomera tog jedinjenja. Na primer, stereoizomerno čist sastav jedinjenja koje ima jedan hiralni centar biće u suštini bez suprotnog enantiomera jedinjenja. Stereoizomerno čist sastav jedinjenja koje ima dva hiralna centra biće u suštini bez drugih dijastereomera jedinjenja. Tipično stereoizomerno čisto jedinjenje se sastoji od više od oko 80% težinskih procenata jednog stereoizomera jedinjenja i manje od oko 20% težinskih procenata drugih stereoizomera jedinjenja, poželjnije više od oko 90% težinskih procenata jednog stereoizomera jedinjenja i manje od oko 10% težinskih procenata drugih stereoizomera jedinjenja, još poželjnije više od oko 95% težinskih procenata jednog stereoizomera jedinjenja i manje od oko 5% težinskih procenata drugih stereoizomera jedinjenja, i najpoželjnije više od oko 97% težinskih procenata jednog stereoizomera jedinjenja i manje od oko 3% težinskih procenata drugih stereoizomera jedinjenja. Stereoizomerno čisto jedinjenje kako se ovde koristi sadrži više od oko 80% težinskih procenata jednog stereoizomera jedinjenja, poželjnije više od oko 90% težinskih procenata jednog stereoizomera jedinjenja, još poželjnije više od oko 95% težinskih procenata jednog stereoizomera jedinjenja, i najpoželjnije više od oko 97% težinskih procenata jednog stereoizomera jedinjenja. Kao što se ovde koristi i ako nije drugačije naznačeno, termin „stereoizomerno obogaćen“ označava sastav koji se sastoji od više od oko 60% po težini jednog stereoizomera jedinjenja, poželjno više od oko 70% po težini, poželjnije više od oko 80% po težini jednog stereoizomera jedinjenja. Kao što se ovde koristi i ako nije drugačije naznačeno, termin „enantiomerno čist“ označava stereoizomerno čist sastav jedinjenja koje ima jedan hiralni centar. Slično tome, termin „stereoizomerno obogaćen“ označava stereoizomerno obogaćeni sastav jedinjenja koje ima jedan hiralni centar. Na način na koji se koristi ovde, termini „stereoizomerne“ ili „dijastereomerne smeše“ označavaju sastav koji sadrži više od jednog stereoizomera jedinjenja. Tipična stereoizomerna smeša jedinjenja sadrži oko 50% težinskih procenata jednog stereoizomera jedinjenja i oko 50% težinskih procenata drugih stereoizomera jedinjenja, ili sadrži više od oko 50% težinskih procenata jednog stereoizomera jedinjenja i manje od oko 50% težinskih procenata drugih stereoizomera jedinjenja, ili sadrži više od oko 45% težinskih procenata jednog stereoizomera jedinjenja i manje od oko 55% težinskih procenata drugih stereoizomera jedinjenja, ili sadrži više od oko 40% težinskih procenata jednog stereoizomera jedinjenja i manje od oko 60% težinskih procenata drugih stereoizomera jedinjenja, ili sadrži više od oko 35% težinskih procenata jednog stereoizomera jedinjenja i manje od oko 65% težinskih procenata drugih stereoizomera jedinjenja.

[0025] Podrazumeva se da ovde navedena jedinjenja mogu sadržati hiralne centre. Takvi hiralni centri mogu biti ili (R) ili (S) konfiguracije, ili mogu biti njihova mešavina. Podrazumeva se da hiralni centri jedinjenja predviđenih u ovom dokumentu mogu biti podvrgnuti epimerizaciji in vivo. Kao takav, stručnjak će prepoznati da je primena jedinjenja u njegovom (R) obliku ekvivalentna, za jedinjenja koja se podvrgavaju epimerizaciji in vivo,primeni jedinjenja u njegovom (S) obliku.

[0026] Optički aktivni (+) i (-), (R)- i (S)-, ili (D)- i (L)-izomeri mogu biti pripremljeni korišćenjem hiralnih sintona ili hiralnih reagenasa, ili razdvojeni korišćenjem konvencionalnih tehnika, kao što je hromatografija na hiralnoj stacionarnoj fazi.

[0027] Na način na koji se koristi ovde, „izotopolog“ je izotopski obogaćeno jedinjenje. Termin „izotopski obogaćen“ se odnosi na atom koji ima izotopski sastav različit od prirodnog izotopskog sastava tog atoma. Termin „izotopski obogaćen“ se takođe može odnositi na jedinjenje koje sadrži najmanje jedan atom koji ima izotopski sastav različit od prirodnog izotopskog sastava tog atoma. Termin „izotopski sastav“ se odnosi na količinu svakog izotopa prisutnog za dati atom. Radioaktivno obeležena i izotopski obogaćena jedinjenja su korisna kao terapijski agensi, npr. terapijski agensi za multipli mijelom, reagensi za istraživanje, npr. reagensi za test vezivanja, i dijagnostički agensi, npr. in vivo agensi za dijagnostičko snimanje. Sve izotopske varijacije jedinjenja koje su ovde opisane, bilo da su radioaktivne ili ne, predviđene su da budu obuhvaćene obimom otelotvorenja datih ovde. U nekim otelotvorenjima, dati su izotopolozi jedinjenja, na primer, izotopolozi Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 su deuterijum, ugljenik-13 ili jedinjenja obogaćena azotom-15. U nekim otelotvorenjima, ovde navedeni izotopolozi su jedinjenja obogaćena deuterijumom. U nekim otelotvorenjima, ovde navedeni izotopolozi su jedinjenja obogaćena deuterijumom, gde se obogaćivanje deuterijumom odvija na hiralnom centru.

[0028] U opisu datom ovde, ako postoji bilo kakva neusklađenost između hemijskog imena i hemijske strukture, struktura će imati primat u tumačenju.

[0029] Kao što se ovde koristi, termin „multipli mijelom“ se odnosi na hematološka stanja koja karakterišu maligne plazma ćelije i obuhvata sledeće poremećaje: monoklonsku gamopatiju neodređenog značaja (MGUS); multipli mijelom niskog, srednjeg i visokog rizika; novodijagnostikovani multipli mijelom (uključujući novodijagnostikovani multipli mijelom niskog, srednjeg i visokog rizika); multipli mijelom pogodan za transplantaciju i multipli mijelom nepogodan za transplantaciju; tinjajući (indolentni) multipli mijelom (uključujući tinjajući multipli mijelom niskog, srednjeg i visokog rizika); aktivni multipli mijelom; solitarni plazmacitom; ekstramedularni plazmacitom; leukemiju plazma ćelija; multipli mijelom centralnog nervnog sistema; mijelom lakog lanca; ne-sekretorni mijelom; imunoglobulin D mijelom; i imunoglobulin E mijelom; i multipli mijelom koji karakterišu genetske abnormalnosti, kao što su Ciklin D translokacije (na primer, t(11;14)(q13;q32); t(6;14)(p21;32); t(12;14)(p13;q32); or t(6;20);); MMSET translokacije (na primer,t(4;14)(p16;q32)); MAP translokacije (na primer, t(14;16)(q32;q32); t(20;22); t(16; 22)(q11;q13); or t(14;20)(q32;q11)); ili drugi faktori hromozoma (na primer, delecija 17p13 ili hromozoma 13; del(17/17p), non-hiperdiploidija i višak(1q)).

[0030] Na način na koji se koristi ovde i ako nije drugačije naznačeno, termini „lečenje“, „lečiti“, „tretman“ i „tretirati“ odnose se na ublažavanje ili redukciju težine simptoma povezanog sa bolešću ili stanjem koje se leči, na primer, sa multiplim mijelomom.

[0031] Termin „prevencija“ uključuje inhibiciju simptoma određene bolesti ili poremećaja, na primer multiplog mijeloma. U nekim otelotvorenjima, pacijenti sa porodičnom istorijom multiplog mijeloma su kandidati za preventivne režime. Generalno, termin „prevencija“ se odnosi na primenu leka pre pojave simptoma, posebno kod pacijenata pod rizikom od multiplog mijeloma.

[0032] Na način na koji se koristi ovde i ako nije drugačije naznačeno, termin „upravljanje“ obuhvata sprečavanje ponavljanja određene bolesti ili poremećaja, kao što je multipli mijelom, kod pacijenta koji je patio od njega, produžavajući vreme tokom kog pacijent koji je patio od bolesti ili poremećaja ostaje u remisiji, smanjujući stope smrtnosti pacijenata

1

i/ili održavajući smanjenje težine ili izbegavanje simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem kojim se upravlja.

[0033] Na način na koji se koristi ovde, „subjekt“ ili „pacijent“ je životinja, obično sisar, uključujući i čoveka, kao što je ljudski pacijent.

[0034] Termin „relaps“ se odnosi na situaciju u kojoj pacijenti, koji su imali remisiju multiplog mijeloma nakon terapije, ponovo imaju prisustvo ćelija mijeloma i/ili smanjen broj normalnih ćelija u koštanoj srži.

[0035] Termin „refraktorni ili rezistentni“ odnosi se na okolnosti u kojima pacijenti, čak i nakon intenzivnog tretmana, imaju rezidualne ćelije mijeloma i/ili smanjen broj normalnih ćelija u koštanoj srži.

[0036] Na način na koji se koristi ovde, termin „indukciona terapija“ odnosi se na prvi tretman koji se primenjuje za lečenje bolesti, ili prvi tretman koji se daje sa namerom da izazove potpunu remisiju bolesti, kao što je karcinom. Kada se koristi samostalno, indukciona terapija je ona koja je prihvaćena kao najbolji dostupni tretman. Ukoliko se detektuje rezidualni karcinom, pacijenti se leče drugom terapijom, koja se naziva reindukcijom. Ako je pacijent u potpunoj remisiji nakon indukcione terapije, daje se dodatna konsolidacija i/ili terapija održavanja kako bi se produžila remisija ili potencijalno izlečio pacijent.

[0037] Na način na koji se koristi ovde, „konsolidaciona terapija“ se odnosi na tretman koji se daje za bolest nakon što se pre toga postigne remisija. Na primer, konsolidaciona terapija za karcinom je tretman koji se daje nakon što je karcinom nestao nakon početne terapije. Konsolidaciona terapija može uključivati terapiju zračenjem, transplantaciju matičnih ćelija ili lečenje medikamentima protiv karcinoma. Konsolidaciona terapija se takođe naziva intenzifikaciona terapija i post-remisiona terapija.

[0038] Na način na koji se koristi „terapija održavanja“ se odnosi na tretman koji se primenjuje za bolest nakon remisije ili postizanja najboljeg odgovora, kako bi se sprečio ili odložio recidiv. Terapija održavanja može uključivati hemoterapiju, hormonsku terapiju ili ciljanu terapiju.

[0039] Kao što se ovde koristi, termin „remisija“ je smanjenje ili nestanak znakova i simptoma karcinoma, na primer, multiplog mijeloma. U delimičnoj remisiji neki, ali ne svi, znaci i simptomi karcinoma su nestali. U potpunoj remisiji, svi znaci i simptomi karcinoma su nestali, iako karcinom još uvek može biti u telu.

[0040] Kao što se ovde koristi, termin „transplantacija“ se odnosi na terapiju visokim dozama sa spašavanjem matičnih ćelija. Hematopoetske (krvne) ili matične ćelije koštane srži se ne koriste kao tretman, već za spašavanje pacijenta nakon terapije visokim dozama, na primer hemoterapija visokim dozama i/ili zračenje. Transplantacija uključuje „autolognu“ transplantaciju matičnih ćelija (ASCT), koja se odnosi na upotrebu sopstvenih matičnih ćelija pacijenata koje se sakupljaju i koriste kao zamenske ćelije. U nekim otelotvorenjima, transplantacija takođe uključuje tandem transplantaciju ili višestruke transplantacije.

[0041] Na način na koji se koristi ovde, i ako nije drugačije definisano, termini „terapijski efikasna količina“ i „efikasna količina“ jedinjenja odnose se na količinu dovoljnu da pruži terapijsku korist u lečenju, prevenciji i/ili upravljanju bolešću, na primer multiplim mijelomom, ili da odloži ili minimizira jedan ili više simptoma povezanih sa bolešću ili poremećajem koji se leči. Termini „terapijski efikasna količina“ i „efikasna količina“ mogu obuhvatiti količinu koja poboljšava dejstvo ukupne terapije, smanjuje ili izbegava simptome ili uzroke bolesti ili poremećaja, ili povećava terapijsku efikasnost drugog terapijskog agensa.

[0042] Termini „istovremena primena“ i „u kombinaciji sa“ uključuju primenu jednog ili više terapijskih agenasa (na primer, jedinjenje koje je ovde predviđeno i drugi agens protiv multiplog mijeloma, agens protiv karcinoma ili agens za potpornu terapiju) ili istovremeno, zajedno ili sekvencijalno bez određenih vremenskih ograničenja. U jednom otelotvorenju, agensi su istovremeno prisutni u ćeliji ili u telu pacijenta ili istovremeno vrše svoj biološki ili terapijski efekat. U jednom otelotvorenju, terapijski agensi su u istom sastavu ili obliku jedinične doze. U drugom otelotvorenju, terapijski agensi su u odvojenim sastavima ili jediničnim doznim oblicima.

[0043] Termin „agens za potpornu terapiju“ odnosi se na bilo koju supstancu kojom se leče, sprečavaju ili kojom se upravlja neželjenim efektima tretmana sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili enantiomerom ili smešom enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljivih soli ovih jedinjenja.

[0044] Termin „biološka terapija“ odnosi se na primenu bioloških terapija kao što su krv iz pupčane vrpce, matične ćelije, faktori rasta i slično.

[0045] U kontekstu karcinoma, kao što je multipli mijelom, inhibicija se može proceniti inhibicijom progresije bolesti, inhibicijom rasta tumora, smanjenjem primarnog tumora, olakšanjem simptoma povezanih sa tumorom, inhibicijom faktora izlučenih iz tumora, odloženim pojavljivanjem primarnih ili sekundarnih tumora, usporenim razvojem primarnih ili sekundarnih tumora, smanjenom pojavom primarnih ili sekundarnih tumora, usporenim sekundarnim efektima bolesti ili njihovom smanjenom ozbiljnošću, zaustavljenim rastom tumora i regresijom tumora, povećanim vremenom do progresije (TTP), povećanim preživljavanjem bez progresije (PFS), povećanim ukupnim preživljavanjem (OS), između ostalog. Skraćenica „OS“ na način na koji se koristi ovde označava vreme od početka lečenja do smrti iz bilo kog uzroka. Skraćenica „TTP“ na način na koji se koristi ovde označava vreme od početka lečenja do progresije tumora; TTP ne uključuje smrtne slučajeve. U jednom otelotvorenju, skraćenica „PFS“ označava vreme od početka lečenja do progresije tumora ili smrti. U jednom otelotvorenju, skraćenica „PFS“ označava vreme od prve doze jedinjenja do prve pojave progresije bolesti ili smrti iz bilo kog uzroka. U jednom otelotvorenju, stope PFS će biti izračunate korišćenjem Kaplan-Meier procena. Preživljavanje bez događaja (EFS) označava vreme od početka lečenja do bilo kakvog neuspeha lečenja, uključujući progresiju bolesti, prekid lečenja iz bilo kog razloga ili smrt. U jednom otelotvorenju, ukupna stopa odgovora (ORR) označava procenat pacijenata koji postignu odgovor. U jednom otelotvorenju, skraćenica „ORR“ označava zbir procenata pacijenata koji postižu potpune i delimične odgovore. U jednom otelotvorenju, skraćenica „ORR“ označava procenat pacijenata čiji je najbolji odgovor ≥ delimični odgovor (PR), prema Jedinstvenim kriterijuma odgovora IMWG. U jednom otelotvorenju, trajanje odgovora (DoR) označava vreme od postizanja odgovora do recidiva ili progresije bolesti. U jednom otelotvorenju, skraćenica „DoR“ označava vreme od postizanja odgovora ≥ delimičnog odgovora (PR) do recidiva ili progresije bolesti. U jednom otelotvorenju, skraćenica „DoR“ označava vreme od prve dokumentacije odgovora do prve dokumentacije progresivne bolesti ili smrti. U jednom otelotvorenju, skraćenica „DoR“ označava vreme od prve dokumentacije odgovora ≥ delimičnog odgovora (PR) do prve dokumentacije progresivne bolesti ili smrti. U jednom otelotvorenju, vreme do odgovora

1

(TTR) označava vreme od prve doze jedinjenja do prve dokumentacije odgovora. U jednom otelotvorenju, skraćenica „TTR“ označava vreme od prve doze jedinjenja do prve dokumentacije odgovora ≥ delimičnog odgovora (PR). U krajnosti, potpuna inhibicija se ovde naziva prevencijom ili hemoprevencijom. U ovom kontekstu, termin „prevencija“ uključuje ili sprečavanje pojave klinički očiglednog karcinoma u potpunosti ili sprečavanje pojave pretklinički očigledne faze karcinoma. Takođe, ova definicija obuhvata i prevenciju transformacije u maligne ćelije ili zaustavljanje ili preokretanje progresije premalignih ćelija u maligne ćelije. To uključuje profilaktičko lečenje osoba koje su izložene riziku od razvoja karcinoma.

[0046] U određenim otelotvorenjima, lečenje multiplog mijeloma može se proceniti na osnovu Međunarodnih jedinstvenih kriterijuma odgovora za multipli mijelom (IURC) (IURC) (videti Durie BGM, Harousseau J-L, Miguel JS, et al. International uniform response criteria for multiple myeloma. Leukemia, 2006; (10) 10: 1-7), koristeći definicije odgovora i parametre praćenja prikazane u nastavku:

1

[0047] Na način na koji se koristi ovde, ECOG status se odnosi na status učinka Istočne kooperativne onkološke grupe (ECOG) (Oken M, et al Toxicity and response criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group. Am J Clin Oncol 1982;5(6):649-655), kao što je prikazano u nastavku:

1

[0048] Termin „oko“, kako se ovde koristi, osim ako nije drugačije naznačeno, odnosi se na vrednost koja nije više od 10% iznad ili ispod vrednosti koja se menja terminom. Na primer, termin „oko 10 mg/m<2>“ označava raspon od 9 mg/m<2>do 11 mg/m<2>.

B. Kratak opis slika

[0049]

Slika 1. (A) Promena indukcije apoptoze, merena površinom ispod krive trostruke indukcije kaspaze (poznato i kao indeks apoptoze) tokom vremena u ćelijama H929-1051 rezistentnim na lenalidomid. Apscisa: log nM (jedinjenje), ordinata: indeks

1

apoptoze. Linije najboljeg uklapanja predstavljaju logističku jednačinu od 3 parametra izračunatu u programu GraphPad Prism. (B) Površina ispod krive koncentracijaodgovor za Jedinjenje 1 i Jedinjenje A u H929-1051 ćelijama korišćena je za poređenje sposobnosti jedinjenja da izazovu apoptozu nakon izlaganja od 6 sati, a zatim razblaživanja, što je rezultiralo približno 20-strukim smanjenjem koncentracije jedinjenja.

Slika 2. Poređenje antiproliferativne aktivnosti kombinovanog tretmana pomalidomiddeksametazon i pojedinačnog agensa Jedinjenja 2 (A), i kombinovanog tretmana sa Jedinjenjem 2-deksametazon (B) u MM ćelijama rezistentnim na lenalidomid H929-1051. Proliferacija je procenjena pomoću testa određivanja ATP (CellTiter-Glo) nakon tretmana od 120 sati. Kontrola procenta je izračunata oduzimanjem pozadine i normalizacijom na DMSO kontrolu (100% kontrole). Svaka tačka podataka predstavlja srednju vrednost najmanje tri nezavisna eksperimenta u duplikatu.

Slika 3. (A) Antiproliferativni efekti na nestimulisane PBMC i (B) THLE-2, tretirane Jedinjenjem 2 tokom 72 sata, procenjeni su pomoću testa određivanja ATP (CellTiter-Glo). Kontrola procenta je izračunata oduzimanjem pozadine i normalizacijom na DMSO kontrolu (100% kontrole).

Slika 4. Antitumorska aktivnost Jedinjenja 2 sa kontinuiranim doziranjem u modelu ksenografta H929-1051 rezistentnog na lenalidomid. Ženke SCID miševa su inokulisane sa10 × 106 H929-1051 tumorskih ćelija u desni bok. Miševi su randomizovani u terapijske grupe (n = 10/grupa) u vreme početka tretmana. Tretman testnim proizvodom počeo je na dan 14 kada su tumori iznosili približno 120mm<3>.

Slika 5: Antiproliferativna aktivnost Jedinjenja 2 u ćelijskim linijama multiplog mijeloma grupisanim prema hromozomskim translokacijama. Grafikon predstavlja površinu ispod krive (AUC) krivulja rasta koncentracija-odgovor merenjem broja živih ćelija pomoću protočne citometrije za 15 MM ćelijske linije koje sadrže uobičajene translokacije pronađene u MM. Prijavljena AUC vrednost odgovara oblasti ispod krive odgovora na dozu u kojoj vrednosti 0 odgovaraju potpunom smanjenju proliferacije/vijabilnosti pri svim dozama, a vrednosti od 10000 odgovaraju odsustvu

1

smanjenja proliferacije/vijabilnosti. Ćelijske linije su grupisane prvo prema pronađenoj hromozomskoj translokaciji a zatim prema tome da li je translokacija poznata kao visokorizična ili ne.

Slika 6: Antiproliferativna aktivnost Jedinjenja 2 i pomalidomida u ćelijskim linijama multiplog mijeloma rezistentnim na lenalidomid i pomalidomid. IC50= koncentracija Jedinjenja 2 i pomalidomida koja rezultira 50% inhibicijom rasta ćelija u poređenju sa kontrolom. Grafikon koji prikazuje poređenje vrednosti antiproliferativnog IC50za Jedinjenje 2 i pomalidomid (prikazano stubovima) određen je korišćenjem CellTiter-Glo analize u matičnim (DF15, NCI-H929 i OPM2) MM ćelijskim linijama, rezistentnim na lenalidomid (NCI-H929-1051) ili rezistentnim na pomalidomid (NCI-H929-P01, OPM2-P01, OPM2-P1, OPM2-P10 i DF15R) prikazanim u tabeli 11.

Slika 7: Gejting strategija za mijeloidne subpopulacije.

Slika 8: Poslednje faze diferencijacije in vitro neutrofilnih progenitora - efekti kratkog dnevnog izlaganja jedinjenju 2 do tri dana. CD34<+>ćelije dobijene iz zdrave koštane srži donora bile su izložene jedinjenju 2 u koncentracijama od 1, 10 i 100 nM svakog od 1, 2 ili 3 uzastopna dana. U analizu su uključene samo žive ćelije. Podaci su srednja vrednost rezultata za donore 1 i 2 i predstavljaju primer procenta ćelija stadijuma III i IV definisanih kao CD34-/CD33<+>/CD11b<+>i CD34-/CD33-/ CD11b<+>, respektivno, nakon 6 sati izlaganja.

Slika 9: Kasna faza sazrevanja neutrofilnih progenitora nakon 6-satnog izlaganja jedinjenju 2 tokom 3 uzastopna dana. CD34<+>ćelije dobijene iz zdrave koštane srži donora bile su izložene jedinjenju 2 u koncentracijama od 1, 10 ili 100 nM tokom 6 sati svakog od svakog od 3 uzastopna dana počevši od dana 10. Podaci predstavljaju srednji procenat ćelija stadijuma III definisanih kao CD34-/CD33<+>/CD11b<+>i procenat ćelija stadijuma IV definisanih kao CD34-/CD33-/CD11b<+>od donora br. 1 i br. 2. Stubovi grešaka su prikazani kao standardna devijacija.

Slika 10: Kasna faza sazrevanja neutrofilnih progenitora nakon 6-satnog izlaganja jedinjenju 2 tokom 5 uzastopna dana. CD34<+>ćelije dobijene iz zdrave koštane srži

1

donora bile su izložene jedinjenju 2 u koncentracijama od 1, 10 ili 100 nM tokom 6 sati svakog od svakog od 5 uzastopna dana počevši od dana 10. Podaci predstavljaju srednji procenat ćelija stadijuma III definisanih kao CD34-/CD33<+>/CD11b<+>i procenat ćelija stadijuma IV definisanih kao CD34-/CD33-/CD11b<+>od donora br. 1 i br. 2. Stubovi grešaka su prikazani kao standardna devijacija.

Slika 11: Dijagrami rasporeda tretmana za deksametazon kao jedini agens.

Slika 12: Procenat zrelih neutrofila tokom mijeloidne diferencijacije nakon jednog izlaganja deksametazonu ili jedinjenju 2 samostalno ili u kombinaciji u različitim koncentracijama. CD34<+>ćelije dobijene iz zdrave donorske koštane srži bile su izložene jedinjenju 2 (tokom 6 sati) i deksametazonu (tokom 30 sati) samostalno (gornji red), ili u kombinaciji (donji red), u koncentracijama od 1, 10 ili 100 nM na dan 13. U svakom od donjih panela, koncentracija Jedinjenja 2 je varirala a koncentracija deksametazona je bila konstantna na 1 nM (levo), 10 nM (sredina) ili 100 nM (desno). Za kombinacije, kulture su istovremeno izložene oba agensa tokom 6 sati. Ćelije su zatim isprane i i ponovo inkubirane deksametazonom narednih 24 sata. Zatim su ćelije isprane i ponovo inkubirane bez Jedinjenja 2 ili deksametazona do kraja studije. Podaci predstavljaju procenat ćelija stadijuma IV definisanih kao CD34-/CD33<+>/CD11b<+>od donora 3, 4 i 5. Crvena linija predstavlja 50% nivoa ćelija IV faze u DMSO kontroli.

Slika 13: Efekat tretmana deksametazonom pojedinačno ili u kombinaciji sa Jedinjenjem 2, lenalidomidom i pomalidomidom, na apoptozu u ćelijskoj liniji multiplog mijeloma rezistentnoj na lenalidomid. Y-osa prikazuje fold promenu za kaspazu-3 u odnosu na DMSO, dok je x-osa log koncentracija deksametazona.

Slika 14: Jedinjenje 2 direktno aktivira humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) da liziraju ćelije K562 eritromijelocitne leukemije na način koji zavisi od koncentracije. (Levo) Reprezentativni grafici protoka ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS) za K562 ćelije koje su ko-kultivisane sa humanim PBMC koji su prethodno inkubirani sa Jedinjenjem 2, lenalidomidom, pomalidomidom ili DMSO. (Desno) Sirovi podaci o procentu PI-Annexin V- K562 ćelija koji pokazuju koncentraciono-zavisno smanjenje životnih K562 ćelija u ko-kulturi. Podaci su

2

predstavljeni kao prosek sa greškama koje predstavljaju standardnu grešku srednje vrednosti.

Slika 15: Imune ćelije su direktno aktivirane Jedinjenjem 2 da liziraju ćelijske linije multiplog mijeloma osetljive na lenalidomid i rezistentne na lenalidomid. Donorske mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) (efektorske ćelije) su prethodno tretirane navedenim testnim proizvodima ili Jedinjenjem 2 tokom 2 sata pre nego što su kultivisane na pločama obloženim anti-CD3 antitelima tokom 72 sata. Pre ko-kulture sa netretiranim CFSE označenim ćelijskim linijama multiplog mijeloma, PBMC su isprane i stavljene u medijum bez prisustva jedinjenja, a zatim su ko-kultivisane sa ćelijskim linijama multiplog mijeloma (ciljne ćelije) tokom 24 sata. Povećanje ubijanja ćelija multiplog mijeloma posredovanog imunim ćelijama bilo je evidentno u kokulturiranim PBMC tretiranim Jedinjenjem 2 (odnos ciljne i efektorske ćelije od 1:5) sa (A) NCI-H929 ćelijama ili (B) H929-1051 ćelijama.

Slika 16: Imune ćelije aktivirane jedinjenjem pokazuju poboljšano ubijanje tumorskih ćelija kada su ćelije multiplog mijeloma prethodno tretirane lenalidomidom, pomalidomidom ili jedinjenjem 2 pre ko-kulture. Mononuklearne ćelije periferne krvi su predinkubirane lenalidomidom, pomalidomidom ili Jedinjenjem 2 tokom 2 sata pre nego što su kultivisane na pločama obloženim anti-CD3 antitelima tokom 72 sata. Istovremeno, 4 linije ćelija multiplog mijeloma (MM) su kultivisane u medijumu koji sadrži testne proizvode. Nakon 72 sata, ćelije su ko-kultivisane tokom 24 sata (odnos ciljne i efektorske ćelije [T:E] od 1:5). Povećanje ubijanja MM posredovanog imunim ćelijama bilo je evidentno u ko-kulturama (grafikoni sa desne strane u svakom redu) u poređenju sa MM pojedinačnim kulturama (grafikoni sa leve strane u svakom redu) u svim testiranim ćelijskim tipovima (A) NCI-H929, (B) H929-1051, (C) OPM2 i (D) OPM2 P10 ćelijskih linija. Jedinjenja su imala mali uticaj na održivost PBMC (prikazano u srednjim grafikonima u svakom redu).

Slika 17: Jedinjenje 2 pojačava ekspresiju CD38 u MM ćelijskim linijama. Ekspresija CD38 na površini ćelije je procenjena u MM ćelijama prethodno tretiranim Jedinjenjem 2 ili pomalidomidom tokom 72 sata. Efekti odgovora na dozu prikazani su za OPM-2 i OPM-2.P10 ćelijske linije.

Slika 18: Jedinjenje 2 povećava ADCC MM ćelija posredovan daratumamabom. Sedam MM ćelijskih linija tretirano je subletalnim koncentracijama Jedinjenja 2 ili pomalidomida tokom 72 sata pre ko-kultivisanja sa NK ćelijama na efektoru da bi se postigao odnos [E:T] od 10:1 za ADCC test. Grafikoni ilustruju reprezentativne podatke dobijene za 7 MM ćelijskih linija. Testovi su obavljeni dva puta sa NK ćelijama dva različita donora. Kontrola DMSO je početna aktivnost NK ćelija sa netretiranim tumorskim ćelijama; Izotip i Dara su aktivnost NK ćelija u prisustvu kontrole izotipa i daratumamab, respektivno, sa netretiranim tumorskim ćelijama; Izotip Jedinjenje i Dara Jedinjenje su aktivnost NK ćelija u prisustvu kontrole izotipa i daratumamab, respektivno, sa tretiranim tumorskim ćelijama.

Slika 19: Jedinjenje 2 poboljšava ADCP MM ćelija posredovan daratumamabom. Testovi fagocitoze su urađeni sa efektorom u odnosu na ciljni odnos [E:T] od 2: 1. Šest MM ćelijskih linija /- Jedinjenje 2 ili prethodni tretman pomalidomidom podvrgnuti su ADCP posredovanom daratumamabom. A) Reprezentativne slike ADCP sa OPM2 ćelijskom linijom. Makrofagi su crvene boje, a OPM2 ćelije zelene boje. B) Kvantifikacija fagocitoze protočnom citometrijom. Kontrola DMSO je početna aktivnost NK ćelija sa netretiranim tumorskim ćelijama; Izotip i Dara su aktivnost NK ćelija u prisustvu kontrole izotipa i daratumamab, respektivno, sa netretiranim tumorskim ćelijama; Izotip Jedinjenje i Dara Jedinjenje su aktivnost NK ćelija u prisustvu kontrole izotipa i daratumamab, respektivno, sa tretiranim tumorskim ćelijama.

Slika 20: Kombinacija Jedinjenja 2 sa inhibitorom proteasoma rezultira povećanom apoptozom u MM modelima ćelija. MM ćelijske linije su tretirane pulsom bortezomiba ili DMSO tokom 1 sata, nakon čega je usledilo ispiranje. Prethodno tretirane ćelije su inkubirane različitim koncentracijama Jedinjenja 2 tokom 72 sata, nakon čega je usledilo bojenje uzoraka rastvorom 7-AAD i Annexin-V i analiza protočnom citometrijom. A) Procenat živih ćelija Jedinjenja 2 pojedinačno ili sa prethodnim tretmanom bortezomibom. B) Raspršeni grafikoni OPM2-P10 ćelija pri različitim uslovima tretmana.

Slika 21: Kombinacija Jedinjenja 2 sa bortezomibom ili karfilzomibom u MM ćelijama. Četiri MM ćelijske linije su tretirane pulsom bortezomiba ili DMSO tokom 1 sata, nakon čega je usledilo ispiranje. Prethodno tretirane ćelije su inkubirane različitim koncentracijama Jedinjenja 2 tokom 72 sata, nakon čega je usledilo bojenje uzoraka rastvorom 7-AAD i Annexin-V i analiza protočnom citometrijom. A) Antiproliferativni efekat Jedinjenja 2 pojedinačno ili sa prethodnim tretmanom bortezomibom. B) Antiproliferativni efekat Jedinjenja 2 pojedinačno ili sa prethodnim tretmanom karfilzomibom. DRC = riva doza-odgovor

Slika 22. Prikazan je tretman MM ćelija Jedinjenjem 2 u kombinaciji sa inhibitorima histonske deacetilaze, hemoterapijskim agensima, Bcl-2 inhibitorima, Mcl-1 inhibitorima, BET inhibitorima ili LSD-1 inhibitorima. Proračuni sinergije su izvršeni za lečenje Jedinjenjem 2 u kombinaciji sa 13 inhibitora malih molekula preko panela MM ćelijskih linija. Plave boje u okvirima ilustruju procenat bunara koji su sinergistički kada su kombinovani sa Jedinjenjem 2. Oznaka * predstavlja značaj razlike površinskog odziva u odnosu na nulti model.

Slika 23: Efekat tretmana Jedinjenjem 2 (0,1 mg/kg, qd) i deksametazonom (0,5 mg/kg, qd) kao jedinim agensima i u kombinaciji u modelu ksenografta H929-1051 rezistentnog na lenalidomid.

Slika 24: Antitumorska aktivnost Jedinjenja 2 pojedinačno i u kombinaciji sa bortezomibom u NCI-H929 (H929-1051) multiplom mijelomu/ksenograftu plazmocitoma rezistentnom na lenalidomid. Dani doziranja su označeni strelicama na X osi.

C. Jedinjenja

[0050] Ovde je predviđeno Jedinjenje 4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril, koje se naziva „Jedinjenje 1“:

2

ili njegov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so.

[0051] U određenim otelotvorenjima, jedinjenje za upotrebu u ovde navedenim sastavima i metodama je Jedinjenje 1, ili njegov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so.

[0052] Takođe je predviđeno Jedinjenje (S)-4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril, koje se naziva „Jedinjenje 2“:

ili tautomer, izotopolog ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0053] U određenim otelotvorenjima, jedinjenje za upotrebu u ovde navedenim sastavima i metodama je Jedinjenje 2, ili njegov tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so.

[0054] Takođe je predviđeno jedinjenje (S)-4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril, koje se naziva „Jedinjenje 3“:

ili tautomer, izotopolog ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0055] U određenim otelotvorenjima, jedinjenje za upotrebu u ovde navedenim sastavima i metodama je Jedinjenje 3, ili njegov tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so.

[0056] Ovde je predviđeno Jedinjenje 1. Ovde je predviđen tautomer Jedinjenja 1. Ovde je predviđen enantiomer Jedinjenja 1. Ovde je predviđena smeša enantiomera Jedinjenja 1. Ovde je predviđena farmaceutski prihvatljiva so Jedinjenja 1.

[0057] Ovde je predviđeno Jedinjenje 2. Ovde je predviđen tautomer Jedinjenja 2. Ovde je predviđena farmaceutski prihvatljiva so Jedinjenja 2.

[0058] Ovde je predviđeno Jedinjenje 3. Ovde je predviđen tautomer Jedinjenja 3. Ovde je predviđena farmaceutski prihvatljiva so Jedinjenja 3.

[0059] Ovde su takođe navedeni izotopski obogaćeni analozi jedinjenja koja su ovde obezbeđena. Izotopsko obogaćivanje (na primer, deuteracija ili obogaćivanje deuterijumom) farmaceutskih proizvoda za poboljšanje farmakokinetike („PK“), farmakodinamike („PD“) i profila toksičnosti, prethodno je pokazano kod nekih klasa lekova. Videti, na primer, Lijinsky et. al., Food Cosmet. Toxicol., 20: 393 (1982); Lijinsky et. al., J. Nat. Cancer Inst., 69: 1127 (1982); Mangold et. al., Mutation Res. 308: 33 (1994); Gordon et. al., Drug Metab. Dispos., 15: 589 (1987); Zello et. al., Metabolism, 43: 487 (1994); Gately et. al., J. Nucl. Med., 27: 388 (1986); Wade D, Chem. Biol. Interact. 117: 191 (1999). Bez ograničavanja bilo kojom određenom teorijom, izotopsko obogaćivanje jedinjenja može se koristiti, na primer, za (1) smanjenje ili eliminaciju neželjenih metabolita, (2) povećanje poluraspada matičnog leka, (3) smanjenje broja doza potrebnih za postizanje željenog efekta, (4) smanjenje količine doze neophodne za postizanje željenog efekta, (5) povećanje formiranja aktivnih metabolita, ako se

2

formiraju, i/ili (6) smanjenje proizvodnje štetnih metabolita u određenim tkivima i/ili stvaranje efikasnijeg leka i/ili bezbednijeg leka za kombinovanu terapiju, bez obzira da li je kombinovana terapija namerna ili ne. Zamena atoma za jedan od njegovih izotopa često će rezultirati promenom brzine reakcije hemijske reakcije. Ovaj fenomen je poznat kao kinetički izotopski efekat (Kinetic Isotope Effect, KIE). Na primer, ako se veza C-H prekine tokom koraka određivanja brzine u hemijskoj reakciji (tj. koraka sa najvišom energijom prelaznog stanja), zamena deuterijuma za vodonik će izazvati smanjenje brzine reakcije i proces će se usporiti. Ovaj fenomen je poznat kao deuterijumski efekat kinetičkog izotopa (Deuterium Kinetic Isotope Effect, DKIE). (Videti, npr. Foster et al., Adv. Drug Res., vol. 14, pp. 1-36 (1985); Kushner et al., Can. J. Physiol. Pharmacol., vol. 77, pp. 79-88 (1999)). Magnituda DKIE se može izraziti kao odnos između brzina date reakcije u kojoj je C-H veza prekinuta i iste reakcije u kojoj je deuterijum zamenjen vodonikom. DKIE može biti u rasponu od oko 1 (bez izotopskog efekta) do veoma velikih brojeva, kao što je 50 ili više, što znači da reakcija može biti pedeset, ili više, puta sporija kada se deuterijum zameni vodonikom. Bez ograničavanja određenom teorijom, visoke vrednosti DKIE mogu biti delimično posledica fenomena poznatog kao tunelovanje, što je posledica principa nesigurnosti. Tunelovanje se pripisuje maloj masi atoma vodonika, a javlja se jer se prelazna stanja koja uključuju proton ponekad mogu formirati u odsustvu potrebne energije aktivacije. Pošto deuterijum ima veću masu od vodonika, statistički ima mnogo manju verovatnoću da učestvuje u ovoj pojavi.

[0060] Tricijum („T“) je radioaktivni izotop vodonika koji se koristi u istraživanjima, fuzionim reaktorima, neutronskim generatorima i radiofarmaceuticima. Tricijum je atom vodonika koji ima 2 neutrona u jezgru i ima atomsku težinu blizu 3. Pojavljuje se prirodno u životnoj sredini u veoma niskim koncentracijama, najčešće u obliku T2O. Tricijum se sporo raspada (vreme poluraspada = 12,3 godine) i emituje niskoenergetsku beta česticu koja ne može da prodre u spoljašnji sloj ljudske kože. Unutrašnja izloženost je glavna opasnost povezana sa ovim izotopom, ali je potrebno da on bude unet u organizam u velikim količinama kako bi predstavljao značajan rizik po zdravlje. U poređenju sa deuterijumom, konzumira se manja količina tricijuma pre nego što dostigne opasan nivo. Supstitucija tricijuma („T“) za vodonik rezultira još jačom vezom od deuterijuma i daje numerički veće izotopske efekte.

[0061] Slično tome, zamena izotopa za druge elemente, uključujući, bez ograničenja,<13>C ili<14>C za ugljenik,<33>S,<34>S, ili<36>S za sumpor,<15>N za azot, i<17>O ili<18>O za kiseonik, obezbediće slične kinetičke izotopske efekte.

2

[0062] Životinjsko telo izražava različite enzime u svrhu eliminacije stranih supstanci, kao što su terapeutski agensi, iz svog cirkulacionog sistema. Primeri takvih enzima uključuju enzime citokroma P450 („CYP“), esteraze, proteaze, reduktaze, dehidrogenaze i monoaminooksidaze, za reagovanje i pretvaranje ovih stranih supstanci u polarne intermedijere ili metabolite za izlučivanje putem bubrega. Neke od najčešćih metaboličkih reakcija farmaceutskih jedinjenja uključuju oksidaciju veze ugljenika i vodonika (C-H) na pi-vezu ugljenika i kiseonika (C-O) ili ugljenika i ugljenika (C-C). Rezultirajući metaboliti mogu biti stabilni ili nestabilni u fiziološkim uslovima i mogu imati značajno različite farmakokinetičke, farmakodinamičke i akutne i dugoročne profile toksičnosti u odnosu na osnovna jedinjenja. Za mnoge lekove takva oksidacija je brza. Kao rezultat toga, ovi lekovi često zahtevaju primenu višestrukih ili visokih dnevnih doza.

[0063] Izotopsko obogaćivanje na određenim pozicijama jedinjenja navedenog u ovom dokumentu može proizvesti detektabilni KIE koji utiče na farmakokinetičke, farmakološke i/ili toksikološke profile Jedinjenja navedenog u ovom dokumentu u poređenju sa sličnim jedinjenjem koje ima prirodni izotopski sastav. U jednom otelotvorenju, obogaćivanje deuterijumom se vrši na mestu cepanja C-H veze tokom metabolizma.

[0064] U jednom otelotvorenju, ovde je predviđen izotopolog Jedinjenja 1, ili njegov enantiomer ili smeša enantiomera, tautomer ili farmaceutski prihvatljiva so. U nekim otelotvorenjima, izotopolog Jedinjenja 1 je Jedinjenje 1 obogaćeno deuterijumom, ili njegov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so. U nekim otelotvorenjima, izotopolog Jedinjenja 1 je Jedinjenje 1 obogaćeno deuterijumom, ili njegov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, gde se obogaćivanje deuterijumom javlja na hiralnom centru. U drugom otelotvorenju, ovde je predviđen izotopolog Jedinjenja 2, ili tautomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. U nekim otelotvorenjima, izotopolog Jedinjenja 2 ije Jedinjenje 2 obogaćeno deuterijumom, ili tautomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. U nekim otelotvorenjima, izotopolog Jedinjenja 2 ije Jedinjenje 2 obogaćeno deuterijumom, ili tautomer, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde se obogaćivanje deuterijumom javlja na hiralnom centru.

[0065] U određenim otelotvorenjima, ovde su predviđeni izotopolozi 4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il) oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila, ili enantiomeri ili smeše enantiomera, tautomer ili farmaceutski prihvatljive

2

soli istih, u kojima je jedna ili više atomskih pozicija molekula 4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila izotopski obogaćena, na primer deuterijumom. Određena otelotvorenja ovde obezbeđuju jedinjenja sledeće formule:

u kojoj su jedan ili više Y atoma (npr. Y<1>, Y<2>, Y<3>, Y<4>, Y<5>, Y<6>, Y<7>, Y<8>, Y<9>, Y<10>, Y<11>, Y<12>, Y<13>, Y<14>, Y<15>, Y<16>, Y<17>, Y<18>, Y<19>, Y<20>, Y<21>, Y<22>, Y<23>, Y<24>, Y<25>, Y<26>, Y<27>, Y<28>, Y<29>i Y<30>) izotopski obogaćeni vodonikom, a svaki preostali Y atomi su neobogaćeni atomi vodonika.

[0066] U jednom otelotvorenju, jedinjenje ima sledeću formulu:

[0067] U jednom otelotvorenju, jedinjenje ima sledeću formulu:

2

[0068] U određenim otelotvorenjima, jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest, dvadeset, dvadeset jedan, dvadeset dva, dvadeset tri, dvadeset četiri, dvadeset pet, dvadeset šest, dvadeset sedam, dvadeset osam, dvadeset devet ili svi navedeni Y atomi su izotopski obogaćeni deuterijumom, a svi preostali Y atomi su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, jedan od naznačenih Y atoma je izotopski obogaćen deuterijumom, a svi preostali Y atomi su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<5>je obogaćen deuterijumom.

[0069] U određenim otelotvorenjima, jedan ili više atoma Y na glutarimidnom delu jedinjenja (Y<1>, Y<2>, Y<3>, Y<4>, Y<5>i Y<27>) su obogaćeni deuterijumom. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više Y atoma na izoindolinonskom delu jedinjenja (Y<6>, Y<7>, Y<8>, Y<9>i Y<10>) su obogaćeni deuterijumom. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više Y atoma na fenil alkilnom delu jedinjenja (Y<11>, Y<12>, Y<13>, Y<14>, Y<15>, Y<16>, Y<17>i Y<18>) su obogaćeni deuterijumom. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više Y atoma na piperazinskom delu jedinjenja (Y<19>, Y<20>, Y<21>, Y<22>, Y<23>, Y<24>, Y<25>i Y<26>) su obogaćeni deuterijumom. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više Y atoma na udaljenom fenil prstenastom delu jedinjenja (Y<28>, Y<29>i Y<30>) su obogaćeni deuterijumom. Ovde navedeno jedinjenje može biti bilo koja kombinacija obogaćivanja deuterijumom kao što je ovde obelodanjeno. Drugim rečima, ovde je obuhvaćena svaka kombinacija deuterijumom obogaćenog glutarimidnog dela, deuterijumom obogaćenog izoindolinskog dela, deuterijumom obogaćenog fenil alkilnog dela, deuterijumom obogaćenog piperazinskog dela i deuterijumom obogaćenog udaljenog fenil prstenastog dela.

2

[0070] U jednom otelotvorenju, Y<1>i Y<2>su obogaćeni deuterijumom, a svi preostali atomi Y su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<3>i Y<4>su obogaćeni deuterijumom, a svi preostali atomi Y su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<5>je obogaćen deuterijumom, a svi preostali Y atomi su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<1>do Y<5>su obogaćeni deuterijumom, a svi preostali atomi Y su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<3>do Y<5>su obogaćeni deuterijumom, a svi preostali atomi Y su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<6>i Y<7>su obogaćeni deuterijumom, a svi preostali atomi Y su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<8>do Y<10>su obogaćeni deuterijumom, a svi preostali atomi Y su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<11>i Y<12>su obogaćeni deuterijumom, a svi preostali atomi Y su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<13>do Y<16>su obogaćeni deuterijumom, a svi preostali atomi Y su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<17>i Y<18>su obogaćeni deuterijumom, a svi preostali atomi Y su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<11>do Y<18>su obogaćeni deuterijumom, a svi preostali atomi Y su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<19>do Y<26>su obogaćeni deuterijumom, a svi preostali atomi Y su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<27>je obogaćen deuterijumom, a svi preostali Y atomi su neobogaćeni vodonici. U jednom otelotvorenju, Y<28>do Y<30>su obogaćeni deuterijumom, a svi preostali atomi Y su neobogaćeni vodonici.

[0071] U jednom otelotvorenju, izotopolog Jedinjenja 1 je Jedinjenje 1-D:

[0072] U drugom otelotvorenju, izotopolog Jedinjenja 1 je smeša

[0073] U još jednom otelotvorenju, izotopolog Jedinjenja 2 je Jedinjenje 2-D

[0074] U još jednom otelotvorenju, izotopolog Jedinjenja 3 je Jedinjenje 3-D

[0075] U određenim otelotvorenjima, bilo koja od pozicija obogaćenih deuterijumom nezavisno ima prisustvo deuterijuma od najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili oko 100%. U jednom otelotvorenju, Y<5>je obogaćen deuterijumom i ima prisustvo deuterijuma od najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili oko 100%.

1

[0076] U jednom otelotvorenju, D (u hiralnom centru) u jedinjenju 1-D ima prisustvo deuterijuma od najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili oko 100%. U jednom otelotvorenju, D ima prisustvo deuterijuma od najmanje 90%.

[0077] U jednom otelotvorenju, D (u hiralnom centru) u jedinjenju 2-D ima prisustvo deuterijuma od najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili oko 100%. U jednom otelotvorenju, D ima prisustvo deuterijuma od najmanje 90%.

[0078] U jednom otelotvorenju, D (u hiralnom centru) u jedinjenju 3-D ima prisustvo deuterijuma od najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili oko 100%. U jednom otelotvorenju, D ima prisustvo deuterijuma od najmanje 90%.

[0079] U određenim otelotvorenjima, jedinjenje obogaćeno deuterijumom koje je ovde navedeno ima enantiomerni višak od najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99%. Dodatni primeri stereoizomerne čistoće uključuju enantiomerni višak od najmanje 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ili 99%.

[0080] U jednom otelotvorenju, Jedinjenje 2-D ima enantiomerni višak od najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99%. U jednom otelotvorenju, Jedinjenje 2-D ima enantiomerni višak od najmanje 90%.

[0081] U jednom otelotvorenju, Jedinjenje 3-D ima enantiomerni višak od najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%,

2

najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99%. U jednom otelotvorenju, Jedinjenje 3-D ima enantiomerni višak od najmanje 90%.

[0082] Ovde data jedinjenja obogaćena deuterijumom mogu se pripremiti u skladu sa sintetičkom šemom i primerima navedenim u ovom dokumentu, ali korišćenjem odgovarajućih polaznih materijala obogaćenih deuterijumom. Jedinjenja obogaćena deuterijumom koja su ovde navedena takođe se mogu pripremiti u skladu sa opštom hemijom poznatom stručnjacima u predmetnoj oblasti za pripremu jedinjenja izoindolinona i glutarimida obogaćenih deuterijumom, uključujući, ali ne ograničavajući se na ona opisana u WO 2014/039421 i WO 2014/116573

D. Priprema Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 i Jedinjenja 3

[0083] Metode za pripremu jedinjenja pronalaska su obelodanjene, ali nisu predmet patentih zahteva. Otelotvorenja ovih metoda pripreme obelodanjena u odeljku „D. Priprema Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 i Jedinjenja 3“ nisu otelotvorenja patentnih zahteva pronalaska. Jedinjenja navedena u ovom dokumentu mogu se pripremiti metodama poznatim stručnjacima u predmetnoj oblasti, i prateći postupke slične onima opisanim u odeljku Primeri i rutinskim modifikacijama istih. Primer šeme reakcije za pripremu jedinjenja prikazan je ispod u Šemi 1 za Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 i Jedinjenje 3, i u Šemi 2 za Jedinjenje 2.

[0084] Kao što je prikazano u Šemi 1, zaštita 3-hidroksi-2-metilbenzojeve kiseline (na primer, formiranjem metil estra i terc-butil(dimetil)sililetra) praćena je brominacijom, na primer korišćenjem N-bromosukcinimida i azobisizobutironitrila. Reakcija sa metil-4,5-diamino-5-okso-pentanoatom (koji se takođe naziva H-D, L-Glu(OMe)-NH2), u prisustvu baze (kao što je DIEA), rezultirala je derivatizovanim formiranjem izoindolina, nakon čega je usledila deprotekcija TBS korišćenjem baze, kao što je kalijum karbonat. Reakcija derivatizovanog izoindolina sa 1,4-bis(bromometil)benzenom u prisustvu baze (kao što je kalijum karbonat), praćena je formiranjem glutarimida u prisustvu kalijum terc-butoksida. Konačno, reakcija sa 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrilom dala je ciljno Jedinjenje 1. Hiralna separacija daje Jedinjenje 2 i Jedinjenje 3.

[0085] Alternativno, kao što je prikazano u šemi 2, reakcija metil 2-(bromometil)-3-[tercbutil(dimetil)silil]oksi-benzoat intermedijera sa hiralnim terc-butil (4S)-4,5-diamino-5-oksopentanoatom (koji se takođe naziva H-L-Glu (OtBu)-NH2; reakcija sa H-D-Glu(OtBu)-NH2obezbeđuje suprotan enantiomer), u prisustvu baze (kao što je DIEA), rezultirala je derivatizovanim formiranjem izoindolina, nakon čega je usledila deprotekcija TBS korišćenjem tetrabutilamonijum fluorida. Reakcija derivatizovanog izoindolina sa 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrilom, ili njegovom soli, u prisustvu baze (kao što je kalijum karbonat), praćena deprotekcijom i formiranjem glutarimida dala je ciljno Jedinjenje 2.

4

[0086] Stručnjak u oblasti bi znao kako da modifikuje postupke navedene u ilustrativnim šemama i primerima kako bi dobio željene proizvode.

[0087] U jednom aspektu, ovde su date metode za pripremu Jedinjenja 1,

ili njegovog enantiomera ili smeše enantiomera, tautomera ili izotopologa, pri čemu metoda obuhvata kontaktiranje Jedinjenja 1a

ili njegovog enantiomera ili smeše enantiomera, tautomera ili izotopologa, sa 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrilom, u organskom rastvaraču u prisustvu baze, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 1; pri čemu je X odlazeća grupa.

[0088] U jednom otelotvorenju,metoda je metoda za pripremu enantiomera Jedinjenja 1, na primer, Jedinjenja 2,

pri čemu metoda obuhvata kontaktiranje enantiomera Jedinjenja 1a, na primer Jedinjenja 2a

sa 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrilom, u organskom rastvaraču u prisustvu baze, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 2; pri čemu je X odlazeća grupa.

[0089] U jednom otelotvorenju, X je halogen, na primer Br ili Cl. U drugom otelotvorenju, X je metansulfonat (koji se takođe naziva -OM). U jednom otelotvorenju, rastvarač je acetonitril, THF ili DMSO. U drugom, baza je DIEA ili TEA. U nekim otelotvorenjima, kontakt se vrši na povišenoj temperaturi, na primer, na oko 35°C do oko 50°C.

[0090] U nekim otelotvorenjima, metode dalje obuhvataju pripremu Jedinjenja 1a,

ili njegovog enantiomera ili smeše enantiomera, tautomera ili izotopologa, pri čemu metoda obuhvata kontaktiranje Jedinjenja 1b

ili njegovog enantiomera ili smeša enantiomera, tautomera ili

izotopologa, sa kalijum terc-butoksidom, u organskom rastvaraču, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 1a.

[0091] U jednom otelotvorenju, metoda je metoda za pripremu enantiomera Jedinjenja 1a, na primer, Jedinjenja 2a,

pri čemu metoda obuhvata kontaktiranje enantiomera Jedinjenja 1b, na primer Jedinjenja 2b

sa kalijum terc-butoksidom, u organskom rastvaraču, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 2a.

[0092] U jednom otelotvorenju, X je Br. U jednom otelotvorenju, rastvarač je THF. U nekim otelotvorenjima, kontakt se vrši na sniženoj temperaturi, na primer, na oko -70°C do oko -80°C.

[0093] U nekim otelotvorenjima, metode dalje obuhvataju pripremu Jedinjenja 1b,

ili njegovog enantiomera ili smeše enantiomera, tautomera ili izotopologa, pri čemu metoda obuhvata kontaktiranje Jedinjenja 1c

ili njegovog enantiomera ili smeše enantiomera, tautomera ili izotopologa, sa

u organskom rastvaraču, u prisustvu baze, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 1b.

[0094] U jednom otelotvorenju, metoda je metoda za pripremu enantiomera Jedinjenja 1b, na primer, Jedinjenja 2b,

pri čemu metoda obuhvata kontaktiranje enantiomera Jedinjenja 1c, na primer Jedinjenja 2c

sa

u organskom rastvaraču, u prisustvu baze, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 1b.

[0095] U jednom otelotvorenju, X je Br. U jednom otelotvorenju, rastvarač je acetonitril. U nekim otelotvorenjima, baza je kalijum karbonat. U nekim otelotvorenjima, kontakt se vrši na povišenoj temperaturi, na primer, na oko 50°C do oko 70°C.

[0096] U nekim otelotvorenjima, metode dalje obuhvataju pripremu Jedinjenja 1c,

ili njegovog enantiomera ili smeše enantiomera, tautomera ili izotopologa, pri čemu metoda obuhvata kontaktiranje Jedinjenja 1d

ili njegovog enantiomera ili smeše enantiomera, tautomera ili izotopologa, sa bazom u rastvaraču, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 1c.

[0097] U jednom otelotvorenju, metoda je metoda za pripremu enantiomera Jedinjenja 1c, na primer, Jedinjenja 2c,

pri čemu metoda obuhvata kontaktiranje enantiomera Jedinjenja 1d, na primer Jedinjenja 2d

4

sa bazom u rastvaraču, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 2c. U jednom otelotvorenju, rastvarač je voda. U nekim otelotvorenjima, baza je kalijum karbonat.

[0098] U nekim otelotvorenjima, metode dalje obuhvataju pripremu Jedinjenja 1d,

ili njegovog enantiomera ili smeše enantiomera, tautomera ili izotopologa, pri čemu metoda obuhvata kontaktiranje Jedinjenja 1e

ili njegovog enantiomera ili smeše enantiomera, tautomera ili izotopologa, sa metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-benzoatom u rastvaraču, u prisustvu baze, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 1d.

[0099] U jednom otelotvorenju, metoda je metoda za pripremu enantiomera Jedinjenja 1d, na primer, Jedinjenja 2d,

pri čemu metoda obuhvata kontaktiranje enantiomera Jedinjenja 1e, na primer Jedinjenja 2e

sa metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-benzoatom u rastvaraču, u prisustvu baze, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 2d.

[0100] U jednom otelotvorenju, rastvarač je acetonitril. U nekim otelotvorenjima, baza je DIEA. U nekim drugim otelotvorenjima, kontakt se vrši na povišenoj temperaturi, na primer, na oko 50°C do oko 70°C.

[0101] U drugom aspektu, ovde su date metode za pripremu Jedinjenja 1,

ili njegovog enantiomera ili smeše enantiomera, tautomera ili izotopologa, pri čemu metode obuhvataju kontaktiranje Jedinjenja 1f

ili njegovog enantiomera ili smeše enantiomera, tautomera ili izotopologa, sa kiselinom, u organskom rastvaraču, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 1.

[0102] U jednom otelotvorenju,metoda je metoda za pripremu enantiomera Jedinjenja 1, na primer, Jedinjenja 2,

pri čemu metoda obuhvata kontaktiranje enantiomera Jedinjenja 1f, na primer Jedinjenja 2f

sa kiselinom, u organskom rastvaraču, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 2.

[0103] U jednom otelotvorenju, rastvarač je acetonitril. U drugom, kiselina je benzen sulfonska kiselina. U nekim otelotvorenjima, kontakt se vrši na povišenoj temperaturi, na primer, na oko 75°C do oko 95°C.

[0104] U nekim otelotvorenjima, metode dalje obuhvataju pripremu Jedinjenja 1f,

4

ili njegovog enantiomera ili smeše enantiomera, tautomera ili izotopologa, pri čemu metode obuhvataju kontaktiranje Jedinjenja 1g

ili njegovog enantiomera ili smeše enantiomera, tautomera ili izotopologa, sa 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrilom, ili njegovom soli, u rastvaraču, u prisustvu baze, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 1f.

[0105] U jednom otelotvorenju, metoda je metoda za pripremu enantiomera Jedinjenja 1f, na primer, Jedinjenja 2f,

pri čemu metoda obuhvata kontaktiranje enantiomera Jedinjenja 1g, na primer Jedinjenja 2g

sa 4-(4-(4-(hlorometil)benzil) piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrilom, ili njegovom soli, u rastvaraču, u prisustvu baze, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje Jedinjenja 2f.

[0106] U jednom otelotvorenju, rastvarač je DMF. U jednom otelotvorenju, rastvarač je DMSO. U drugom, baza je kalijum karbonat. U nekim otelotvorenjima, kontakt se vrši na povišenoj temperaturi, na primer, na oko 35°C do oko 55°C.

[0107] U nekim otelotvorenjima, metode za pripremu Jedinjenja 1f dalje obuhvataju metodu prečišćavanja, metodu prečišćavanja koja se sastoji od (i) kontakta Jedinjenja 1f (slobodna baza) sa kiselinom u prvom rastvaraču; (ii) filtriranja da bi se obezbedila kisela so Jedinjenja 1f; i (iii) ispiranja kisele soli Jedinjenja 1f u drugom rastvaraču sa bazom da bi se obezbedilo Jedinjenje 1f (slobodna baza). U jednom otelotvorenju, kiselina je vinska kiselina (npr. L-vinska kiselina). U jednom otelotvorenju, prvi rastvarač je metanol. U jednom otelotvorenju, kisela so Jedinjenja 1f je tartratna so (npr. so L-vinske kiseline) sedinjenja 1f. U jednom otelotvorenju, drugi rastvarač je 2-metiltetrahidrofuran. U jednom otelotvorenju, baza je kalijum karbonat.

[0108] U nekim otelotvorenjima, metode za pripremu enantiomera Jedinjenja 1f, na primer, Jedinjenja 2f, dalje obuhvataju metodu prečišćavanja koja se sastoji od (i) kontakta Jedinjenja 2f (slobodna baza) sa kiselinom u prvom rastvaraču; (ii) filtriranja da bi se obezbedila kisela so Jedinjenja 2f; i (iii) ispiranja kisele soli Jedinjenja 2f u drugom rastvaraču sa bazom da bi se obezbedilo Jedinjenje 2f (slobodna baza). U jednom otelotvorenju, kiselina je vinska kiselina (npr. L-vinska kiselina). U jednom otelotvorenju, prvi rastvarač je metanol. U jednom otelotvorenju, kisela so Jedinjenja 2f je tartratna so (npr. so L-vinske kiseline) sedinjenja 2f. U jednom otelotvorenju, drugi rastvarač je 2-metiltetrahidrofuran. U jednom otelotvorenju, baza je kalijum karbonat.

[0109] U nekim otelotvorenjima, metode dalje obuhvataju pripremu 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila, ili njegove soli, pri čemu metode podrazumevaju kontaktiranje 4-(hlorometil)benzaldehida sa 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrilom, u rastvaraču, u prisustvu redukujućeg agensa, pod uslovima pogodnim za obezbeđivanje 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila.

4

[0110] U jednom otelotvorenju, redukujući agens je natrijum triacetoksiborohidrid (NaBH(OAc)4) U jednom otelotvorenju, rastvarač je toluen. U jednom otelotvorenju, kontakt se vrši u prisustvu kiseline. U jednom otelotvorenju, kiselina je sirćetna kiselina.

[0111] U jednom otelotvorenju, 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril, ili njegova so, pripremljen i korišćen u ovde navedenim metodama je HCl so 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila. U jednom otelotvorenju, HCl so se priprema kontaktom slobodne baze 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila sa hlorovodoničnom kiselinom u izopropanolu.

E. Upotreba u metodama lečenja i prevencije

[0112] Iznenađujuće je utvrđeno da su Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 i Jedinjenje 3 veoma moćna jedinjenja protiv mijeloma koja imaju prepoznatljive karakteristike, kao što je poboljšani bezbednosni profil, uključujući selektivno ubijanje ćelija multiplog mijeloma u poređenju sa normalnim ćelijama, smanjenu aktivnost na vanciljanim receptorimat i smanjenu inhibiciju CYP enzima, smanjujući potencijal za neželjene interakcije sa lekovima.

[0113] U jednom otelotvorenju, metoda je lečenje multiplog mijeloma, koja se sastoji od primene na pacijentu Jedinjenja 1, ili njegovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli. U jednom otelotvorenju, ovde je predviđeno Jedinjenje 1, ili njegov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u metodi lečenja multiplog mijeloma, pri čemu se metoda sastoji od primene navedenog jedinjenja na pacijentu.

[0114] U jednom otelotvorenju, metoda je lečenje multiplog mijeloma, koja se sastoji od primene na pacijentu Jedinjenja 2, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli. U jednom otelotvorenju, ovde je predviđeno Jedinjenje 2, ili njegov tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u metodi lečenja multiplog mijeloma, pri čemu se metoda sastoji od primene navedenog jedinjenja na pacijentu.

[0115] U jednom otelotvorenju, metoda je lečenje multiplog mijeloma, koja se sastoji od primene na pacijentu Jedinjenja 3, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski

4

prihvatljive soli. U jednom otelotvorenju, ovde je predviđeno Jedinjenje 3, ili njegov tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u metodi lečenja multiplog mijeloma, pri čemu se metoda sastoji od primene navedenog jedinjenja na pacijentu.

[0116] U jednom otelotvorenju, metoda je sprečavanje multiplog mijeloma, koja se sastoji od primene na pacijentu jedinjenja datog u ovom dokumentu, npr. Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli. U jednom otelotvorenju, ovde je predviđeno jedinjenje dato u ovom dokumentu, npr. Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3, ili njegov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u metodi sprečavanja multiplog mijeloma, pri čemu se metoda sastoji od navedenog jedinjenja za pacijenta.

[0117] U drugom otelotvorenju,metoda je upravljanje multiplim mijelomom, koja se sastoji od primene na pacijentu jedinjenja datog u ovom dokumentu , npr. Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli. U jednom otelotvorenju, ovde je predviđeno jedinjenje dato u ovom dokumentu, npr. Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3, ili njegov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u metodi upravljanja multiplim mijelomom, pri čemu se metoda sastoji od primene navedenog jedinjenja na pacijentu.

[0118] U jednom otelotvorenju, metoda je namenjena izazivanju terapijskog odgovora, procenjenog prema Međunarodnim jedinstvenim kriterijumima odgovora za multipli mijelom (IURC) (videti Durie BGM, Harousseau J-L, Miguel JS, et al. International uniform response criteria for multiple myeloma. Leukemia, 2006; (10) 10: 1-7) kod pacijenta, koja obuhvata primenu efikasne količine Jedinjenja opisanog u ovom dokumentu, npr. Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, na pacijentu koji ima multipli mijelom. U drugom otelotvorenju, metoda je predviđena za postizanje strogog potpunog odgovora, potpunog odgovora ili veoma dobrog delimičnog odgovora, kako je utvrđeno Međunarodnim jedinstvenim kriterijumima odgovora za multipli mijelom (IURC) kod pacijenta, koja obuhvata primenu efikasne količine jedinjenja opisanog u ovom dokumentu, npr. Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive

4

soli, na pacijentu koji ima multipli mijelom. U drugom otelotvorenju, metoda je predviđena za postizanje povećanja ukupnog preživljavanja, preživljavanja bez progresije, preživljavanja bez događaja, vremena do progresije ili preživljavanja bez bolesti kod pacijenta, koja obuhvata primenu efikasne količine jedinjenja opisanog u ovom dokumentu, npr. Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, na pacijentu koji ima multipli mijelom. U drugom otelotvorenju, metoda je za postizanje povećanja ukupnog preživljavanja kod pacijenta, koja obuhvata primenu efikasne količine jedinjenja opisanog u ovom dokumentu, npr. Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, na pacijentu koji ima multipli mijelom. U drugom otelotvorenju, metoda je za postizanje povećanja preživljavanja bez progresije kod pacijenta, koja obuhvata primenu efikasne količine jedinjenja opisanog u ovom dokumentu, npr. Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, na pacijentu koji ima multipli mijelom. U drugom otelotvorenju, metoda je za postizanje povećanja preživljavanja bez događaja kod pacijenta, koja obuhvata primenu efikasne količine jedinjenja opisanog u ovom dokumentu, npr. Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, na pacijentu koji ima multipli mijelom. U drugom otelotvorenju, metoda je za postizanje povećanja vremena do progresije kod pacijenta, koja obuhvata primenu efikasne količine jedinjenja opisanog u ovom dokumentu, npr. Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, na pacijentu koji ima multipli mijelom. U drugom otelotvorenju, metoda je za postizanje povećanja preživljavanja bez bolesti kod pacijenta, koja obuhvata primenu efikasne količine jedinjenja opisanog u ovom dokumentu, npr. Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, na pacijentu koji ima multipli mijelom.

[0119] Ovde su navedena i jedinjenja ili sastavi pronalaska za primenu u metodama lečenja pacijenata koji su prethodno lečeni od multiplog mijeloma, ali ne reaguju na standardne terapije, kao i onih koji prethodno nisu lečeni. Dalje su obuhvaćena jedinjenja ili sastavi pronalaska za upotrebu u metodama lečenja pacijenata koji su bili podvrgnuti operaciji u pokušaju lečenja multiplog mijeloma, kao i onih koji nisu. Ovde su navedena i jedinjenja ili sastavi pronalaska za upotrebu u metodama lečenja pacijenata koji su prethodno bili podvrgnuti transplantacionoj terapiji, kao i onih koji nisu.

4

[0120] Metode uključuju lečenje multiplog mijeloma koji je relapsirajući, refraktoran ili rezistentan. Metode uključuju prevenciju multiplog mijeloma koji je relapsirajući, refraktoran ili rezistentan. Metode uključuju upravljanje multiplim mijelomom koji je relapsirajući, refraktoran ili rezistentan. U nekim takvim otelotvorenjima, mijelom je primarni, sekundarni, tercijarni, četvorostruko ili petostruko relapsirajućii multipli mijelom. U jednom otelotvorenju, metode redukuju, održavaju ili eliminišu minimalnu rezidualnu bolest (MRD). U jednom otelotvorenju, metode obuhvataju lečenje, prevenciju ili upravljanje različitim tipovima multiplog mijeloma, kao što su monoklonska gamopatija neodređenog značaja (MGUS), multipli mijelom niskog, srednjeg i visokog rizika, novodijagnostikovani multipli mijelom (uključujući novodijagnostikovani multipli mijelom iskog, srednjeg i visokog rizika), multipli mijelom koji je pogodan i multipli mijelom koji je nepogodan za transplantaciju, tinjajući (indolentni) multipli mijelom (uključujući tinjajući multipli mijelom niskog, srednjeg i visokog rizika), aktivni multipli mijelom, usamljeni plazmacitom, ekstramedularni plazmacitom, leukemiju plazma ćelija, multipli mijelom centralnog nervnog sistema, mijelom lakog lanca, ne-sekretorni mijelom, imunoglobulin D mijelom i imunoglobulin E mijelom, primenom terapijski efikasne količine ovde opisanog jedinjenja. U drugom otelotvorenju, metode obuhvataju lečenje, prevenciju ili upravljanje multiplim mijelomom koji se karakteriše gentskim abnormalnostima, kao što su Ciklin D translokacije (na primer, t(11;14)(q13;q32); t(6;14)(p21;32); t(12;14)(p13;q32) ili t(6;20);); MMSET translokacije (na primer, t(4;14)(p16;q32)); MAF translokacije (na primer, t(14;16)(q32;q32); t(20;22); t(16; 22)(q11;q13) ili t(14;20)(q32;q11)); ili drugi hromozomski faktori (na primer, delecija 17p13, ili hromozoma 13; del(17/17p), nehiperdiploidija i dobitak(1q)), primenom terapijski efikasne količine ovde opisanog jedinjenja.

[0121] U jednom otelotvorenju, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, ili njegovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli. U drugom otelotvorenju, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 2, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli. U drugom otelotvorenju, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 3, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli.

[0122] U nekim otelotvorenjima, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, ili njegovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, kao indukcione terapije. U drugom otelotvorenju, metode se

4

sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 2, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, kao indukcione terapije. U drugom otelotvorenju, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 3, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, kao indukcione terapije. U nekim otelotvorenjima, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, ili njegovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, kao konsolidacione terapije. U drugom otelotvorenju, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 2, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, kao konsolidacione terapije. U drugom otelotvorenju, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 3, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, kao konsolidacione terapije. U nekim otelotvorenjima, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, ili njegovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, kao terapije održavanja. U drugom otelotvorenju, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 2, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, kao terapije održavanja. U drugom otelotvorenju, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 3, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, kao terapije održavanja.

[0123] U jednom određenom otelotvorenju ovde opisanih metoda, multipli mijelom je leukemija plazma ćelija.

[0124] U jednom otelotvorenju ovde opisanih metoda, multipli mijelom je multipli mijelom visokog rizika. Kod nekih takvih otelotvorenja, multipli mijelom visokog rizika je relapsan ili refraktoran. U jednom otelotvorenju, multipli mijelom visokog rizika je multipli mijelom sa relapsom u roku od 12 meseci od prvog tretmana. U još jednom otelotvorenju, multipli mijelom visokog rizika je multipli mijelom koji se karakteriše genetskim abnormalnostima, na primer, jedan ili više del(17/17p) i t(14;16)(q32;q32). Kod nekih takvih otelotvorenja, multipli mijelom visokog rizika je relapsan ili refraktoran na jednu, dve ili tri prethodne terapije.

[0125] U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše mutacija p53. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je Q331 mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je R273H mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je K132 mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je K132N mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je R337 mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je R337L mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je W146 mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je S261 mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je S261T mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je E286 mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je E286K mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je R175 mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je R175H mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je E258 mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je E258K mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je A161 mutacija. U jednom otelotvorenju, p53 mutacija je A161T mutacija.

[0126] U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše homozigotna delecija p53. U jednom otelotvorenju, multipli mijelom se karakteriše homozigotnom delecijom divljeg tipa p53.

[0127] U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše divlji tip p53.

[0128] U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše aktivacija jednog ili više onkogenih pokretača. U jednom otelotvorenju, jedan ili više onkogenih pokretača su izabrani iz grupe koja se sastoji od C-MAF, MAFB, FGFR3, MMset, Ciklina D1 i Ciklina D. U jednom otelotvorenju, multipli mijelom se karakteriše aktivacijom C-MAF. U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše aktivacija MAFB. U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše aktivacija FGFR3 i MMset. U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše aktivacija C-MAF, FGFR3 i MMset. U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše aktivacija Ciklina D1. U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše aktivacija MAFB i Ciklina D1. U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše aktivacija Ciklina D.

[0129] U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše jedna ili više hromozomskih translokacija. U jednom otelotvorenju, hromozomska translokacija je t(14;16). U jednom otelotvorenju, hromozomska translokacija je t(14;20). U jednom otelotvorenju, hromozomska translokacija je t(4;14). U jednom otelotvorenju, hromozomske translokacije su t(4;14) i t(14;16). U jednom otelotvorenju, hromozomska translokacija je t(11;14). U jednom otelotvorenju, hromozomska translokacija je t(6;20). U jednom otelotvorenju, hromozomska translokacija je t(20;22). U jednom otelotvorenju, hromozomske translokacije su t(6;20) i t(20;22). U jednom otelotvorenju, hromozomska translokacija je t(16;22). U jednom

1

otelotvorenju, hromozomske translokacije su t(14;16) i t(16;22). U jednom otelotvorenju, hromozomske translokacije su t(14;20) i t(11;14).

[0130] U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše mutacija Q331 p53, aktivacija C-MAF i hromozomska translokacija na t(14;16). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše homozigotna delecija p53, aktivacija C-MAF i hromozomska translokacija na t(14;16). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše K132N p53 mutacija aktivacija MAFB i hromozomska translokacija na t(14;20). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše divlji tip p53, aktivacija FGFR3 i MMset i hromozomska translokacija na t(4;14). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše divlji tip p53, aktivacija C-MAF i hromozomska translokacija na t(14;16). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše homozigotna delecija p53, aktivacija FGFR3, MMset i C-MAF i hromozomska translokacija na t(4; 14) i t(14;16). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše homozigotna delecija p53, aktivacija Ciklina D1 i hromozomska translokacija na t(11;14). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše mutacija R337L p53, aktivacija Ciklina D1 i hromozomska translokacija na t(11;14). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše mutacija W146 p53, aktivacija FGFR3 i MMset i hromozomska translokacija na t(4; 14). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše mutacija S261T p53, aktivacija MAFB i hromozomska translokacija na t(6;20) i t(20;22). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše mutacija E286K p53, aktivacija FGFR3 i MMset i hromozomska translokacija na t(4; 14). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše mutacija R175H p53, aktivacija FGFR3 i MMset i hromozomska translokacija na t(4; 14). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše mutacija E258K p53, aktivacija C-MAF i hromozomska translokacija na t(14; 16) i t(16;22). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše divlji tip p53, aktivacija MAFB i Ciklina D1 i hromozomske translokacije na t(14;20) i t(11;14). U jednom otelotvorenju, multipli mijelom karakteriše mutacija A161T p53, aktivacija Ciklina D i hromozomska translokacija na t(11;14).

[0131] U nekim otelotvorenjima, multipli mijelom je novodijagnostikovani multipli mijelom pogodan za transplantaciju. U drugom otelotvorenju, multipli mijelom je transplantacijski neprihvatljiv novodijagnostikovani multipli mijelom.

[0132] U drugim otelotvorenjima, multipli mijelom se karakteriše ranom progresijom (na primer manje od 12 meseci) nakon inicijalnog lečenja. U drugim otelotvorenjima, multipli

2

mijelom se karakteriše ranom progresijom (na primer, manje od 12 meseci) nakon autologne transplantacije matičnih ćelija. U drugom otelotvorenju, multipli mijelom je refraktoran na lenalidomid. U drugom otelotvorenju, multipli mijelom je refraktoran na pomalidomid. U nekim takvim otelotvorenjima, predviđa se da će multipli mijelom biti refraktoran na pomalidomid (na primer, molekularnom karakterizacijom). U drugom otelotvorenju, multipli mijelom je relapsan ili refraktoran na 3 ili više tretmana i bio je izložen inhibitoru proteasoma (na primer, bortezomib, karfilzomib, iksazomib, oprozomib ili marizomib) i imunomodulatornom jedinjenju (na primer talidomid, lenalidomid, pomalidomid, iberdomid ili avadomid), ili dvostruko refraktoran na inhibitor proteasoma i imunomodulatorno jedinjenje. U drugim otelotvorenjima, multipli mijelom je relapsiran ili refraktoran na 3 ili više prethodnih terapija, uključujući na primer CD38 monoklonsko antitelo (CD38 mAb, na primer, daratumumab ili izatuksimab), inhibitor proteasoma (na primer, bortezomib, karfilzomib, iksazomib ili marizomib) i imunomodulatorno jedinjenje (na primer talidomid, lenalidomid, pomalidomid, iberdomid ili avadomid) ili dvostruko refraktoran na inhibitor proteasoma ili imunomodulatorno jedinjenje i CD38 mAb. U drugim otelotvorenjima, multipli mijelom je trostruko refraktoran, na primer, multipli mijelom je refraktoran na inhibitor proteasoma (na primer, bortezomib, karfilzomib, iksazomib, oprozomib ili marizomib), imunomodulatorno jedinjenje (na primer talidomid, lenalidomid, pomalidomid, iberdomid ili avadomid) i još jedan aktivni agens, kao što je ovde opisano.

[0133] U nekim takvim otelotvorenjima, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, ili njegovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, kao indukcione terapije. U drugom otelotvorenju, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 2, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, kao indukcione terapije. U drugom otelotvorenju, metode se sastoje od primene terapijski efikasne količine Jedinjenja 3, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, kao indukcione terapije.

[0134] U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, uključujući relapsni/refraktorni multipli mijelom kod pacijenata sa oštećenom funkcijom bubrega ili simptomom istog, koje obuhvataju primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli kod pacijenta sa relapsnim/refraktornim multiplim mijelomom sa oštećenom funkcijom bubrega.

[0135] U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, uključujući relapsni ili refraktorni multipli mijelom kod slabih pacijenata ili simptome istog, koje obuhvataju primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli kod slabih pacijenata koji imaju multipli mijelom. U nekim takvim otelotvorenjima, pacijenta oslabljenog stanja karakteriše nepodobnost za indukcionu terapiju ili netolerancija na lečenje deksametazonom. U nekim takvim otelotvorenjima, pacijent oslabljenog stanja je stariji, na primer, stariji od 65 godina.

[0136] U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 1, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu je multipli mijelom četvrta linija recidivirajućeg/refraktornog multiplog mijeloma. U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 2, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu je multipli mijelom četvrta linija recidivirajućeg/refraktornog multiplog mijeloma. U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 3, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu je multipli mijelom četvrta linija recidivirajućeg/refraktornog multiplog mijeloma.

[0137] U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 1, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli kao indukcione terapije, pri čemu je multipli mijelom novodijagnostikovani multipli mijelom pogodan za transplantaciju. U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 2, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli kao indukcione terapije, pri čemu je multipli mijelom novodijagnostikovani multipli mijelom pogodan za transplantaciju. U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 3, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli kao indukcione terapije, pri čemu je multipli mijelom novodijagnostikovani multipli mijelom pogodan za transplantaciju.

4

[0138] U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 1, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli kao terapije održavanja nakon druge terapije ili transplantacije, pri čemu je multipli mijelom novodijagnostikovani multipli mijelom pogodan za transplantaciju pre druge terapije ili transplantacije. U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 2, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli kao terapije održavanja nakon druge terapije ili transplantacije, pri čemu je multipli mijelom novodijagnostikovani multipli mijelom pogodan za transplantaciju pre druge terapije ili transplantacije. U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 3, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli kao terapije održavanja nakon druge terapije ili transplantacije, pri čemu je multipli mijelom novodijagnostikovani multipli mijelom pogodan za transplantaciju pre druge terapije ili transplantacije.

[0139] U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 1, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli kao terapije održavanja nakon druge terapije ili transplantacije. U nekim otelotvorenjima, multipli mijelom je novodijagnostikovan, multipli mijelom pogodan za transplantaciju pre druge terapije i/ili transplantacije. U nekim otelotvorenjima, druga terapija pre transplantacije je lečenje hemoterapijom ili Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3. U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 2, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli kao terapije održavanja nakon druge terapije ili transplantacije. U nekim otelotvorenjima, multipli mijelom je novodijagnostikovan, multipli mijelom pogodan za transplantaciju pre druge terapije i/ili transplantacije. U nekim otelotvorenjima, druga terapija pre transplantacije je lečenje hemoterapijom ili Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3. U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 3, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli kao terapije održavanja nakon druge terapije ili transplantacije. U nekim otelotvorenjima, multipli mijelom je novodijagnostikovan, multipli mijelom pogodan za transplantaciju pre druge terapije i/ili transplantacije. U nekim otelotvorenjima, druga terapija pre transplantacije je lečenje hemoterapijom ili Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3.

[0140] U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 1, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu je multipli mijelom visokorizični multipli mijelom, koji je relapsiran ili refraktoran na jedan, dva ili tri prethodna tretmana. U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 2, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu je multipli mijelom visokorizični multipli mijelom, koji je relapsiran ili refraktoran na jedan, dva ili tri prethodna tretmana. U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 3, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu je multipli mijelom visokorizični multipli mijelom, koji je relapsiran ili refraktoran na jedan, dva ili tri prethodna tretmana.

[0141] U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 1, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu je multipli mijelom novodijagnostikovani multipli mijelom nepodoban za transplantaciju. U određenim otelotvorenjima,

metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 2, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu je multipli mijelom novodijagnostikovani multipli mijelom nepodoban za transplantaciju. U određenim otelotvorenjima, metode su lečenje, prevencija i/ili upravljanje multiplim mijelomom, koje obuhvataju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine Jedinjenja 3, ili njegovog tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu je multipli mijelom novodijagnostikovani multipli mijelom nepodoban za transplantaciju.

[0142] U određenim otelotvorenjima, terapijski ili profilaktički efikasna količina jedinjenja je od oko 0,01 do oko 25 mg dnevno, od oko 0,01 do oko 10 mg dnevno, od oko 0,01 do oko 5 mg dnevno, od oko 0,01 do oko 2 mg dnevno, od oko 0,01 do oko 1 mg dnevno, od oko 0,01 do oko 0,5 mg dnevno, od oko 0,01 do oko 0,25 mg dnevno, od oko 0,1 do oko 25 mg dnevno, od oko 0,1 do oko 10 mg dnevno, od oko 0,1 do oko 5 mg dnevno, od oko 0,1 do oko 2 mg dnevno, od oko 0,1 do oko 1 mg dnevno, od oko 0,1 do oko 0,5 mg dnevno, od oko 0,1 do oko 0,25 mg dnevno, od oko 0,5 do oko 25 mg dnevno, od oko 0,5 do oko 10 mg dnevno, od oko 0,5 do oko 5 mg dnevno, od oko 0,5 do oko 2 mg dnevno, od oko 0,5 do oko 1 mg dnevno, od oko 1 do oko 25 mg dnevno, od oko 1 do oko 10 mg dnevno, od oko 1 do oko 5 mg dnevno, od oko 1 do oko 2,5 mg dnevno ili od oko 1 do oko 2 mg dnevno. U jednom otelotvorenju, terapijski ili profilaktički efikasna količina Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 je od oko 0,1 mg dnevno do oko 0,4 mg dnevno.

[0143] U određenim otelotvorenjima, terapijski ili profilaktički efikasna količina je oko 0,1, oko 0,2, oko 0,3, oko 0,4, oko 0,5, oko 0,6, oko 0,7, oko 0,8, oko 0,9, oko 1, oko 2, oko 3, oko 4, oko 5, oko 6, oko 7, oko 8, oko 9, oko 10, oko 15, oko 20 ili oko 25 mg dnevno. U nekim takvim otelotvorenjima, terapijski ili profilaktički efikasna količina je oko 0,1, oko 0,2, oko 0,3, oko 0,4, oko 0,5, oko 0,6 ili oko 0,7 mg dnevno.

[0144] U jednom otelotvorenju, preporučeni dnevni opseg doze Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, za ovde opisane uslove leži u opsegu od oko 0,1 mg do oko 25 mg dnevno, poželjno datih kao jedna doza jednom dnevno, ili u podeljenim dozama tokom dana. U drugim otelotvorenjima, doza se kreće od oko 0,1 do oko 10 mg dnevno. Posebne dnevne doze uključuju 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24 ili 25 mg dnevno. Konkretnije izdeljene dnevne doze uključuju 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 ili 0,5 mg dnevno.

[0145] U konkretnom otelotvorenju, preporučena početna doza može biti 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 10; 15; 20 ili 25 mg dnevno. U drugom otelotvorenju, preporučena početna doza može biti 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 ili 0,5 mg dnevno. Doza se može povećati na 1, 2, 3, 4 ili 5 mg dnevno.

[0146] U određenim otelotvorenjima, terapijski ili profilaktički efikasna količina je od oko 0,001 do oko 5 mg/kg/dan, od oko 0,001 do oko 4 mg/kg/dan, od oko 0,001 do oko 3 mg/kg/dan, od oko 0,001 do oko 2 mg/kg/dan, od oko 0,001 do oko 1 mg/kg/dan, od oko 0,001 do oko 0,05 mg/kg/dan, od oko 0,001 do oko 0,04 mg/kg/dan, od oko 0,001 do oko 0,03 mg/kg/dan, od oko 0,001 do oko 0,02 mg/kg/dan, od oko 0,001 do oko 0,01 mg/kg/dan, ili od oko 0,001 do oko 0,005 mg/kg/dan.

[0147] Primenjena doza se takođe može izraziti u jedinicama koje nisu mg/kg/dan. Na primer, doze za parenteralnu primenu mogu se izraziti kao mg/m<2>/dan. Stručnjak u oblasti trebalo bi da može sa lakoćom da konvertuje doze od mg/kg/dan u mg/m<2>/dan na osnovu visine ili težine subjekta ili oboje (videti www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm). Na primer, doza od 1 mg/kg/dan za čoveka teškog 65 kg je otprilike jednaka dozi od 38 mg/m<2>/dan.

[0148] U određenim otelotvorenjima, pacijent koji treba da se leči jednom od metoda nije prethodno bio podvrgnut terapiji za multipli mijelom pre primene Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 koja su ovde data, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli. U određenim otelotvorenjima, pacijent koji treba da se leči jednom od metoda je prethodno bio podvrgnut terapiji za multipli mijelom pre primene Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 koja su ovde data, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli. U određenim otelotvorenjima, pacijent koji treba da se leči jednom od metoda je razvio rezistentnost na lekove tokom terapije protiv multiplog mijeloma. U nekim takvim otelotvorenjima, pacijent je razvio rezistenciju na jednu, dve ili tri terapije protiv multiplog mijeloma, pri čemu su terapije izabrane između CD38 monoklonskog antitela (CD38 mAb, na primer, daratumumab ili izatuksimab), inhibitora proteasoma (na primer, bortezomib, karfilzomib, iksazomib ili marizomib) i imunomodulatornog jedinjenja (na primer talidomid, lenalidomid, pomalidomid, iberdomid ili avadomid)

[0149] Metode obuhvataju lečenje pacijenta bez obzira na starost. U nekim otelotvorenjima, pacijent ima 18 godina ili više. U drugim otelotvorenjima, pacijent je stariji od 18, 25, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ili 70 godina. U drugim otelotvorenjima, pacijent je mlađi od 65 godina. U drugim otelotvorenjima, pacijent je stariji od 65 godina. U jednom otelotvorenju, pacijent je starija osoba obolela od multiplog mijeloma, na primer, pacijent stariji od 65 godina. U jednom otelotvorenju, pacijent je starija osoba obolela od multiplog mijeloma, na primer, pacijent stariji od 75 godina.

[0150] U zavisnosti od stanja bolesti koja se leči i stanja subjekta, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 predviđeno ovim dokumentom, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, može se primenjivati oralnim, parenteralnim (npr. intramuskularnom, intraperitonealnom, intravenskom, CIV, intracisternom injekcijom ili infuzijom, supkutanom injekcijom ili implantom), inhalacijom, nazalno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno (npr. transdermalno ili lokalno. Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 koje je ovde predviđeno, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, mogu se formulisati, pojedinačno ili zajedno, u odgovarajućoj jedinici doziranja sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima, nosačima, adjuvansima i vehikulumima, pogodnim za svaki put primene.

[0151] U jednom otelotvorenju, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 predviđeno ovde, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, primenjuje se oralno. U drugom otelotvorenju, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 predviđeno ovde, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, primenjuje se parenteralno. U drugom otelotvorenju, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 predviđeno ovde, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, primenjuje se intravenski.

[0152] Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 koje je ovde predviđeno, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, mogu se isporučiti u jednoj dozi kao što je npr. jedna bolusna injekcija ili oralne tablete ili pilule; ili tokom vremena, kao što je npr. kontinuirana infuzija tokom vremena ili podeljene bolusne doze tokom vremena. Jedinjenja koja su ovde opisana mogu se davati više puta ako je potrebno, na primer, sve dok pacijent ne postigne stanje stabilne bolesti ili regresije, ili dok pacijent ne postigne progresiju bolesti ili neprihvatljive nivoe toksičnosti. Stabilna bolest ili njen izostanak određuje se metodama koje su poznate u struci kao što su procena simptoma pacijenta, fizički pregled, vizuelizacija tumora koji je snimljen rendgenskim snimkom, CAT, PET ili MRI skeniranjem i drugim uobičajenim modalitetima procene.

[0153] Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 koje je ovde predviđeno, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, mogu se primenjivati jednom dnevno (QD ili qd), ili podeliti u više dnevnih doza kao što su dva puta dnevno (BID ili bid), tri puta dnevno (TID ili tid) i četiri puta dnevno (QID ili qid). Pored toga, primena može biti kontinuirana (tj. svakodnevno tokom uzastopnih dana ili svakog dana), povremena, npr. u ciklusima (tj. uključujući dane, nedelje ili mesece perioda bez leka). Kao što se ovde koristi, termin „dnevno“ ima za cilj da znači da se terapijsko jedinjenje, kao što je Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 dato ovde, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, primenjuje jednom ili više puta dnevno, na primer, tokom određenog vremenskog perioda. Termin „kontinuirano“ treba da znači da se terapijsko jedinjenje, kao što je Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 dato ovde, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, primenjuje svakodnevno tokom neprekidnog perioda od najmanje 7 dana do 52 nedelje. Termin „sa prekidima“ ili „intermitentno“, na način na koji se koristi ovde, ima za cilj da označi započinjanje i obustavljanje primene u redovnim ili neredovnim intervalima. Na primer, isprekidana primena Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 datog ovde, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa, ili farmaceutski prihvatljive soli, je primena jedan do šest dana nedeljno, primena u ciklusima (npr. dnevna primena dve do osam uzastopnih nedelja, zatim period bez primene do jedne nedelje), ili primena naizmenično. Termin „cikliranje“ kako se ovde koristi ima za cilj da označi da se primenjuje terapijsko jedinjenje, kao što je Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3, ili njegov enantiomer, smeša enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljiva so, dnevno ili kontinuirano ali sa periodom bez primene leka. U nekim takvim otelotvorenjima, jedinjenje se primenjuje jednom dnevno u trajanju od dva do šest dana, nakon čega sledi period pauze u primeni jedinjenja u trajanju od pet do sedam dana.

[0154] U nekim otelotvorenjima, učestalost primene je u opsegu od oko dnevne doze do oko mesečne doze. U određenim otelotvorenjima, jedinjenje se primenjuje jednom dnevno, dva puta dnevno, tri puta dnevno, četiri puta dnevno, jednom svakog drugog dana, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, ili jednom svake četiri nedelje. U jednom otelotvorenju, ovde dato Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljiva so, primenjuje se jednom dnevno. U drugom otelotvorenju, ovde dato Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljiva so, primenjuje se dva puta dnevno. U drugom otelotvorenju, ovde dato Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljiva so, primenjuje se tri puta dnevno. U drugom otelotvorenju, ovde dato Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljiva so, primenjuje se četiri puta dnevno.

[0155] U jednom otelotvorenju, terapijski efikasna količina Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 primenjuje se u ciklusu tretmana koji podrazumeva period primene do 20 dana nakon čega sledi period pauze. U jednom otelotvorenju, terapijski efikasna količina Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 primenjuje se u ciklusu tretmana koji podrazumeva period primene do 15 dana nakon čega sledi period pauze. U jednom otelotvorenju, terapijski efikasna količina Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 primenjuje se u ciklusu tretmana koji podrazumeva period primene do 10 dana nakon čega sledi period pauze. U jednom otelotvorenju, terapijski efikasna količina Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 primenjuje se u ciklusu tretmana koji podrazumeva period primene do 7 dana nakon čega sledi period pauze. U jednom otelotvorenju, terapijski efikasna količina Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 primenjuje se u ciklusu tretmana koji podrazumeva period primene do 5 dana nakon čega sledi period pauze. U jednom otelotvorenju, terapijski efikasna količina Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 primenjuje se u ciklusu tretmana koji podrazumeva period primene do 4 dana nakon čega sledi period pauze. U jednom otelotvorenju, terapijski efikasna količina Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 primenjuje se u ciklusu tretmana koji podrazumeva period primene do 3 dana nakon čega sledi period pauze.

[0156] U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 14 dana nakon čega sledi period pauze. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 10 dana nakon čega sledi period pauze. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 7 dana nakon čega sledi period pauze. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 5 dana nakon čega sledi period pauze. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 4 dana nakon čega sledi period pauze. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 3 dana nakon čega sledi period pauze.

1

[0157] U jednom otelotvorenju, period pauze traje oko 2 dana do oko 11 dana. U jednom otelotvorenju, period pauze traje oko 2 dana do oko 10 dana. U jednom otelotvorenju, period pauze traje oko 2 dana. U jednom otelotvorenju, period pauze traje oko 3 dana. U jednom otelotvorenju, period pauze traje oko 4 dana. U jednom otelotvorenju, period pauze traje oko 5 dana. U jednom otelotvorenju, period pauze traje oko 6 dana. U drugom otelotvorenju, period pauze traje oko 7 dana. U drugom otelotvorenju, period pauze traje oko 8 dana. U drugom otelotvorenju, period pauze traje oko 9 dana. U drugom otelotvorenju, period pauze traje oko 10 dana. U drugom otelotvorenju, period pauze traje oko 11 dana.

[0158] U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 15 dana nakon čega sledi period pauze od oko 2 dana do oko 10 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 10 dana nakon čega sledi period pauze od oko 2 dana do oko 10 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 7 dana nakon čega sledi period pauze od oko 2 dana do oko 10 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 5 dana nakon čega sledi period pauze od oko 2 dana do oko 10 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 3 dana nakon čega sledi period pauze od oko 10 dana do oko 15 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 3 dana nakon čega sledi period pauze od oko 3 dana do oko 15 dana.

[0159] U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 15 dana nakon čega sledi period pauze od 7 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 10 dana nakon čega sledi period pauze od 5 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 10 dana nakon čega sledi period pauze od 4 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 10 dana nakon čega sledi period pauze od 3 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 10 dana nakon čega sledi period pauze od 2 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 7 dana nakon čega sledi period pauze od 7 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 5 dana nakon čega sledi period pauze od 5 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 3 dana nakon čega sledi period pauze od 11 dana. U drugom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 5 dana nakon čega sledi period pauze od 9 dana. U drugom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 5

2

dana nakon čega sledi period pauze od 2 dana. U drugom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva period primene do 3 dana nakon čega sledi period pauze od 4 dana.

[0160] U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 5. dana ciklusa od 28 dana. U drugom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 10. dana ciklusa od 28 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 21. dana ciklusa od 28 dana. U drugom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 5. dana ciklusa od 7 dana. U drugom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 7. dana ciklusa od 7 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 10. dana i od 15. do 24. dana ciklusa od 28 dana (u daljem tekstu: ciklus doziranja 20/28). U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 3. dana i od 15. do 18. dana ciklusa od 28 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 7. dana i od 15. do 21. dana ciklusa od 28 dana (u daljem tekstu: ciklus doziranja 14/28). U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 5. dana i od 15. do 19. dana ciklusa od 28 dana (u daljem tekstu: ciklus doziranja 10/28). U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 3. dana i od 15. do 17. dana ciklusa od 28 dana (u daljem tekstu: ciklus doziranja 6/28).

[0161] U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 14. dana ciklusa od 21 dana. U drugom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 4. dana i od 8. do 11. dana ciklusa od 21 dana. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 5. dana i od 8. do 12. dana ciklusa od 21 dana. U drugom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 5. dana i od 11. do 15. dana ciklusa od 21 dana. U drugom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 5. dana, od 8. do 12. dana i od 15. do 19. dana ciklusa od 21 dana. U drugom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 4. dana, od 8. do 11. dana i od 15. do 18. dana ciklusa od 21 dana. U drugom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 4. dana, od 8. do 10. dana i od 15. do 17. dana ciklusa od 21 dana. U drugom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 3. dana i od 8. do 11. dana ciklusa od 21 dana. U drugom otelotvorenju, ciklus tretmana podrazumeva primenu terapijski efikasne količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, od 1. do 3. dana i od 11. do 13. dana ciklusa od 21 dana.

[0162] Bilo koji ciklus lečenja opisan ovde može se ponoviti u najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više ciklusa. U određenim slučajevima, ciklus tretmana opisan ovde uključuje od 1 do oko 24 ciklusa, od oko 2 do oko 16 ciklusa, ili od oko 2 do oko 4 ciklusa. U određenim slučajevima ciklus tretmana opisan ovde uključuje od 1 do oko 4 ciklusa. U određenim otelotvorenjima, ciklusi 1 do 4 su svi ciklusi od 28 dana. U nekim otelotvorenjima, terapijski efikasna količina Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 se primenjuje tokom 1 do 13 ciklusa od 28 dana (npr. oko 1 godine). U određenim slučajevima, ciklusna terapija nije ograničena na broj ciklusa i terapija se nastavlja do progresije bolesti. Ciklusi mogu u određenim slučajevima da uključuju variranje trajanja perioda primene i/ili perioda pauza koji su ovde opisani.

[0163] U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana uključuje primenu Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 u dozi od oko 0,1 mg/dan, 0,2 mg/dan, 0,3 mg/dan, 0,4 mg/dan, 0,5 mg/dan, 0,6 mg/ dan, 0,7 mg/dan, 0,8 mg/dan, 0,9 mg/dan, 1,0 mg/dan, 5,0 mg/dan ili 10 mg/dan, primenjeno jednom dnevno. U jednom otelotvorenju, ciklus tretmana uključuje primenu Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 u dozi od oko 0,1 mg/dan, 0,2 mg/dan, 0,3 mg/dan, 0,4 mg/dan, 0,5 mg/dan, 0,6 mg/ dnevno, 0,7 mg/dan ili 0,8 mg/dan, primenjeno jednom dnevno. U nekim takvim otelotvorenjima, ciklus tretmana uključuje primenu Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 jednom dnevno u dozi od oko 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg ili 0,5 mg od 1. do 10. dana ciklusa od 28 dana. U nekim takvim otelotvorenima, ciklus tretmana uključuje primenu Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 jednom dnevno u dozi od oko 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg ili 0,5 mg od 1. do 10. i od 15. do 24. dana ciklusa od 28 dana. U nekim takvim otelotvorenjima, ciklus tretmana uključuje primenu Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 jednom dnevno u dozi od oko 0,1 mg od 1. do 10. dana i od 15. do 24. dana ciklusa

4

od 28 dana. U drugim otelotvorenjima, ciklus tretmana uključuje primenu Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 dva puta dnevno u dozi od oko 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg ili 0,5 mg od 1. do 3. dana ciklusa od 28 dana. U drugim otelotvorenjima, ciklus tretmana uključuje primenu Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 dva puta dnevno u dozi od oko 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg ili 0,5 mg od 1. do 3. dana i od 15. do 19. dana ciklusa od 28 dana. U drugim otelotvorenjima, ciklus tretmana uključuje primenu Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 dva puta dnevno u dozi od oko 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg ili 0,5 mg od 1. do 3. dana i od 15. do 17. dana ciklusa od 28 dana. U drugim otelotvorenjima, ciklus tretmana uključuje primenu Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3 dva puta dnevno u dozi od oko 0,2 mg od 1. do 3. dana i od 15. do 17. dana ciklusa od 28 dana. U jednom takvom otelotvorenju, Jedinjenje se daje od 1. do 3. dana (ujutru i uveče), 14. dana (samo uveče), 15. i 16. dana (ujutru i uveče) i 17. dana (samo ujutru) ciklusa od 28 dana, na primer u 1. ciklusu.

F. Kombinovana terapija sa drugim aktivnim agensom

[0164] Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 koje je ovde dato, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, takođe se mogu kombinovati ili koristiti u kombinaciji sa (npr.pre, tokom ili nakon) konvencionalnom terapijom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hirurgiju, biološku terapiju (uključujući imunoterapiju, na primer sa inhibitorima kontrolnih tačaka), terapiju zračenjem, hemoterapiju, transplantaciju matičnih ćelija, ćelijsku terapiju ili drugu terapiju koja nije zasnovana na lekovima koja se trenutno koristi za lečenje, sprečavanje ili upravljanje multiplim mijelomom. Kombinovana primena jedinjenja koje je navedeno ovde i konvencionalne terapije može dati jedinstveni režim tretmana koji je neočekivano efikasan kod određenih pacijenata. Bez ograničenja teorijom, veruje se da Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 mogu pružiti aditivne ili sinergijske efekte kada se daju istovremeno sa konvencionalnom terapijom.

[0165] Kao što je ovde objašnjeno, ovde je obuhvaćeno jedinjenje ili sastav pronalaska za upotrebu u metodi smanjenja, lečenja i/ili sprečavanja neželjenih efekata povezanih sa konvencionalnom terapijom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hirurgiju, hemoterapiju, radioterapiju, biološku terapiju i imunoterapiju. Ovde navedeno jedinjenje, npr. Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, i drugi aktivni sastojak mogu se dati pacijentu pre, tokom ili nakon pojave neželjenog efekta povezanog sa konvencionalnom terapijom.

[0166] Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 predviđeno ovde, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, takođe se mogu kombinovati ili koristiti u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima korisnim u lečenju i/ili prevenciji multiplog mijeloma opisanog ovde.

[0167] U jednom otelotvorenju, metoda je lečenje, prevencija ili upravljanje multiplim mijelomom, koji se sastoji od primene na pacijentu Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, u kombinaciji sa jednim ili više drugih aktivnih agenasa, i opciono u kombinaciji sa terapijom zračenjem, transfuzijama krvi ili operacijom.

[0168] Na način na koji se koristi ovde, termin „u kombinaciji“ uključuje primenu više od jedne terapije (npr. jednog ili više profilaktičkih i/ili terapijskih agenasa). Međutim, upotreba termina „u kombinaciji“ ne ograničava redosled kojim se terapije (npr. profilaktički i/ili terapijski agensi) daju pacijentu sa određenom bolešću ili poremećajem. Prva terapija (npr. profilaktički ili terapijski agens kao što je ovde navedeno jedinjenje, npr. Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog, ili farmaceutski prihvatljiva so) može se primeniti pre (npr.5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata, 96 sati, 1 nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 8 nedelja, ili 12 nedelja ranije), istovremeno sa, ili nakon (npr.5 minuta, 15 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata, 96 sati, 1 nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 8 nedelja, ili 12 nedelja nakon) primene druge terapije (npr. profilaktički ili terapijski agens) na subjketu. Ovde se takođe razmatra trostruka terapija, kao i četvorostruka terapija. U jednom otelotvorenju, druga terapija je deksametazon.

[0169] Primena Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, i jednog ili više drugih aktivnih agenasa kod pacijenta može se javiti istovremeno ili sekvencijalno istim ili različitim putevima primene. Pogodnost određenog načina primene koji se koristi za određeno aktivno sredstvo zavisiće od samog aktivnog sredstva (npr. da li se može primeniti oralno bez raspadanja pre ulaska u krvotok).

[0170] Put primene Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, nezavisan je od puta primene druge terapije. U jednom otelotvorenju, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, primenjuju se oralnim putem. U drugom otelotvorenju, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 se primenjuje intravenski. Dakle, u skladu sa ovim otelotvorenjima, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, primenjuje se oralno ili intravenski, a druga terapija se može primeniti oralno, parenteralno, intraperitonealno, intravenski, intraarterijski, transdermalno, sublingvalno, intramuskularno, rektalno, transbukalno, intranazalno, liposomalno, inhalacijom, vaginalno, intraokularno, putem lokalne isporuke kateterom ili stentom, subkutano, intraadipozno, intraartikularno, intratekalno ili u obliku doziranja sa sporim oslobađanjem. U jednom otelotvorenju, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili farmaceutski prihvatljiva so, i druga terapija se primenjuju istim načinom primene, oralno ili putem IV. U drugom otelotvorenju, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog, ili farmaceutski prihvatljiva so, primenjuje se jednim načinom primene, npr. putem IV, dok se drugi agens (agens protiv multiplog mijeloma) primenjuje drugim načinom primene, npr. oralno.

[0171] U jednom otelotvorenju, drugi aktivni agens se daje intravenski ili supkutano i jednom ili dva puta dnevno u količini od oko 1 do oko 1000 mg, od oko 5 do oko 500 mg, od oko 10 do oko 350 mg, ili od oko 50 do oko 200 mg. Specifična količina drugog aktivnog agensa zavisiće od specifičnog agensa koji se koristi, vrste multiplog mijeloma koji se leči ili kojim se upravlja, težine i stadijuma bolesti i količine Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovog enantiomera, smeše enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljive soli, koja je ovde navedena i svih opcionih dodatnih aktivnih agenasa koji se istovremeno primenjuju kod pacijenta.

[0172] Jedan ili više drugih aktivnih sastojaka ili agenasa mogu se koristiti zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3 u ovde navedenim metodama i sastavima. Drugi aktivni agensi mogu biti veliki molekuli (npr. proteini), mali molekuli (npr. sintetički neorganski, organometalni ili organski molekuli) ili ćelijske terapije (npr. CAR ćelije).

[0173] Primeri drugih aktivnih agenasa koji se mogu koristiti u metodama i sastavima opisanima ovde uključuju jedan ili više sledećih: melfalan, vinkristin, ciklofosfamid, etopozid, doksorubicin, bendamustin, obinutuzumab, inhibitor proteazoma (na primer, bortezomib, karfilzomib, iksazomib, oprozomib ili marizomib), inhibitor histon deacetilaze (na primer, panobinostat, ACY241), BET inhibitor (na primer, GSK525762A, OTX015, BMS-986158, TEN-010, CPI-0610, INCB54329, BAY1238097, FT-1101, ABBV-075, BI 894999, GS-5829, GSK1210151A (I-BET-151), CPI-203, RVX-208, XD46, MS436, PFI-1, RVX2135, ZEN3365, XD14, ARV-771, MZ-1, PLX5117, 4-[2-(ciklopropilmetoksi)-5-(metansulfonil)fenil]-2-metilizohinolin-1(2H)-on, EP11313 i EP11336), BCL2 inhibitor (na primer, venetoklaks ili navitoklaks), MCL-1 inhibitor (na primer, AZD5991, AMG176, MIK665, S64315 ili S63845), LSD-1 inhibitor (na primer, ORY-1001, ORY-2001, INCB-59872, IMG-7289, TAK-418, GSK-2879552, 4-[2-(4-amino-piperidin-1-il)-5-(3-fluoro-4-metoksi-fenil)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-il]-2-fluoro-benzonitril ili njegova so), kortikosteroid (na primer, prednizon), deksametazon; antitelo (na primer, CS1 antitelo, kao što je elotuzumab; CD38 antitelo, kao što je daratumumab ili isatuksimab; ili BCMA antitelo ili konjugat antitela, kao što su GSK2857916 ili BI 836909), inhibitor kontrolne tačke (kako je ovde opisano) ili CAR ćelije (kako je ovde opisano).

[0174] U jednom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je deksametazon.

[0175] U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 4 mg 1. i 8. dana ciklusa od 21 dana. U nekim drugim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 4 mg 1, 4, 8. i 11. dana ciklusa od 21 dana. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 4 mg 1, 8. i 15. dana ciklusa od 28 dana. U nekim drugim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 4 mg 1, 4, 8, 11, 15 i 18 dana ciklusa od 28 dana. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 4 mg 1, 8, 15. i 22. dana ciklusa od 28 dana. U jednom takvom otelotvorenju, deksametazon se primenjuje u dozi od 4 mg 1, 10, 15. i 22. dana 1. ciklusa. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 4 mg 1, 3, 15. i 17. dana ciklusa od 28 dana. U jednom takvom otelotvorenju, deksametazon se primenjuje u dozi od 4 mg 1, 3, 14. i 17. dana 1. ciklusa.

[0176] U nekim drugim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 8 mg 1. i 8. dana ciklusa od 21 dana. U nekim drugim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 8 mg 1, 4, 8. i 11. dana ciklusa od 21 dana. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 8 mg 1, 8. i 15. dana ciklusa od 28 dana. U nekim drugim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 8 mg 1, 4, 8, 11, 15. i 18. dana ciklusa od 28 dana. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 8 mg 1, 8, 15. i 22. dana ciklusa od 28 dana. U jednom takvom otelotvorenju, deksametazon se primenjuje u dozi od 8 mg 1, 10, 15. i 22. dana 1. ciklusa. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 8 mg 1, 3, 15. i 17. dana ciklusa od 28 dana. U jednom takvom otelotvorenju, deksametazon se primenjuje u dozi od 8 mg 1, 3, 14. i 17. dana 1. ciklusa.

[0177] U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 10 mg 1. i 8. dana ciklusa od 21 dana. U nekim drugim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 10 mg 1, 4, 8. i 11. dana ciklusa od 21 dana. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 10 mg 1, 8. i 15. dana ciklusa od 28 dana. U nekim drugim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 10 mg 1, 4, 8, 11, 15 i 18 dana ciklusa od 28 dana. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 10 mg 1, 8, 15. i 22. dana ciklusa od 28 dana. U jednom takvom otelotvorenju, deksametazon se primenjuje u dozi od 10 mg 1, 10, 15. i 22. dana 1. ciklusa. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 10 mg 1, 3, 15. i 17. dana ciklusa od 28 dana. U jednom takvom otelotvorenju, deksametazon se primenjuje u dozi od 10 mg 1, 3, 14. i 17. dana 1. ciklusa.

[0178] U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 20 mg 1. i 8. dana ciklusa od 21 dana. U nekim drugim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 20 mg 1, 4, 8. i 11. dana ciklusa od 21 dana. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 20 mg 1, 8. i 15. dana ciklusa od 28 dana. U nekim drugim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 20 mg 1, 4, 8, 11, 15 i 18 dana ciklusa od 28 dana. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 20 mg 1, 8, 15. i 22. dana ciklusa od 28 dana. U jednom takvom otelotvorenju, deksametazon se primenjuje u dozi od 20 mg 1, 10, 15. i 22. dana 1. ciklusa. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 20 mg 1, 3, 15. i 17. dana ciklusa od 28 dana. U jednom takvom otelotvorenju, deksametazon se primenjuje u dozi od 20 mg 1, 3, 14. i 17. dana 1. ciklusa.

[0179] U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 40 mg 1. i 8. dana ciklusa od 21 dana. U nekim drugim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 40 mg 1, 4, 8. i 11. dana ciklusa od 21 dana. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 40 mg 1, 8. i 15. dana ciklusa od 28 dana. U jednom takvom otelotvorenju, deksametazon se primenjuje u dozi od 40 mg 1, 10, 15. i 22. dana 1. ciklusa. U nekim drugim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 40 mg 1, 4, 8, 11, 15 i 18 dana ciklusa od 28 dana. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 40 mg 1, 8, 15. i 22. dana ciklusa od 28 dana. U nekim otelotvorenjima, deksametazon se primenjuje u dozi od 40 mg 1, 3, 15. i 17. dana ciklusa od 28 dana. U jednom takvom otelotvorenju, deksametazon se primenjuje u dozi od 40 mg 1, 3, 14. i 17. dana 1. ciklusa.

[0180] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je bortezomib. U još jednom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom, ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je daratumumab. U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona. U nekim otelotvorenjima, metode obuhvataju primenu Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 ili Jedinjenja 3, ili njihovih enantiomera, mešavine enantiomera, tautomera, izotopologa, ili farmaceutski prihvatljive soli, sa inhibitorom proteasoma kao što je opisano u ovom dokumentu, inhibitorom CD38 kao što je opisano u ovom dokumentu i kortikosteroidom kao što je opisano u ovom dokumentu.

[0181] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je panobinostat. U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona.

[0182] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je ACY241. U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona.

[0183] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je vinkristin. U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona.

[0184] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je ciklofosfamid. U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona.

[0185] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je etopozid. U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona.

[0186] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je doksorubicin. U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona.

[0187] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je venetoklaks. U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona.

1

[0188] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je AMG176. U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona.

[0189] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je MIK665. U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona.

[0190] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je GSK525762A. U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona.

[0191] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je OTX015. U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona.

[0192] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i sastavima je 4-[2-(ciklopropilmetoksi)-5-(metansulfonil)fenil]-2-metilizohinolin-1(2H)-on. U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona.

[0193] U drugom otelotvorenju, drugi aktivni agens koji se koristi zajedno sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u ovde opisanim metodama i

2

sastavima je 4-[2-(4-amino-piperidin-1-il)-5-(3-fluoro-4-metoksifenil)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-il]-2-fluoro-benzonitril, ili njegova so (na primer, besilatna so). U nekim takvim otelotvorenjima, metode dodatno obuhvataju primenu deksametazona.

[0194] U određenim otelotvorenjima, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3, ili njihov enantiomer, smeša enantiomera, tautomera, izotopologa ili farmaceutski prihvatljiva so, primenjuje se u kombinaciji sa inhibitorima kontrolnih tačaka. U jednom otelotvorenju, jedan inhibitor kontrolne tačke se koristi u kombinaciji sa Jedinjenjem 1, ili njegovim tautomerom, izotopologom, ili farmaceutski prihvatljivom soli, u vezi sa ovde navedenim metodama. U drugom otelotvorenju, dva inhibitora kontrolne tačke se koriste u kombinaciji sa Jedinjenjem 1, ili njegovim tautomerom, izotopologom, ili farmaceutski prihvatljivom soli, u vezi sa ovde navedenim metodama. U još jednom otelotvorenju, tri ili više inhibitora kontrolne tačke se koriste u kombinaciji sa Jedinjenjem 1, Jedinjenjem 2 ili Jedinjenjem 3, ili njihovim enantiomerom, smešom enantiomera, tautomerom, izotopologom ili farmaceutski prihvatljivom soli, u vezi sa ovde navedenim metodama.

[0195] Na način na koji se koristi ovde, termin „inhibitor imunološke kontrolne tačke“ ili „inhibitor kontrolne tačke“ odnosi se na molekule koji potpuno ili delimično smanjuju, inhibiraju, ometaju ili moduliraju jedan ili više proteina kontrolne tačke. Bez ograničenja određenom teorijom, proteini kontrolne tačke regulišu aktivaciju ili funkciju T-ćelija. Poznati su brojni proteini kontrolne tačke, kao što su CTLA-4 i njegovi ligandi CD80 i CD86; i PD-1 sa svojim ligandima PD-L1 i PD-L2 (Pardoll, Nature Reviews Cancer, 2012, 12, 252-264). Ovi proteini su odgovorni za ko-stimulacione ili inhibitorne interakcije odgovora T-ćelija. Čini se da proteini imunološke kontrolne tačke regulišu i održavaju samo-toleranciju i trajanje i amplitudu fizioloških imunoloških odgovora. Imunološki inhibitori kontrolne tačke uključuju antitela ili su izvedeni iz antitela.

[0196] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je CTLA-4 inhibitor. U jednom otelotvorenju, inhibitor CTLA-4 je anti-CTLA-4 antitelo. Primeri anti-CTLA-4 antitela uključuju, bez ograničenja, one opisane u američkim patentima br. 5,811,097; 5,811,097; 5,855,887; 6,051,227; 6,207,157; 6,682,736; 6,984,720; i 7,605,238. U jednom otelotvorenju, anti-CTLA-4 antitelo je tremelimumab (takođe poznat kao ticilimumab ili CP-675,206). U drugom otelotvorenju, anti-CTLA-4 antitelo je ipilimumab (takođe poznat kao MDX-010 ili MDX-101). Ipilimumab je potpuno humano monoklonsko IgG antitelo koje se vezuje za CTLA-4. Ipilimumab se prodaje pod trgovačkim imenom Yervoy<™>.

[0197] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je PD-1/PD-L1 inhibitor. Primeri PD-1/PD-L1 inhibitora uključuju, bez ograničenja, one opisane u američkim patentima br.

7,488,802; 7,943,743; 8,008,449; 8,168,757; 8,217,149, i PCT publikacijama patentnih prijava br. WO2003042402, WO2008156712, WO2010089411, WO2010036959, WO2011066342, WO2011159877, WO2011082400, and WO2011161699.

[0198] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je PD-1 inhibitor. U jednom otelotvorenju, PD-1 inhibitor je anti-PD-1 antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-PD-1 antitelo je BGB-A317, nivolumab (takođe poznat kao ONO-4538, BMS-936558 ili MDX1106) ili pembrolizumab (takođe poznat kao MK-3475, SCH 900475 ili lambrolizumab). U jednom otelotvorenju, anti-PD-1 antitelo je nivolumab. Nivolumab je humani IgG4 anti-PD-1 monoklonsko antitelo i prodaje se pod trgovačkim imenom Opdivo<™>. U drugom otelotvorenju, anti-PD-1 antitelo je pembrolizumab. Pembrolizumab je humanizovano monoklonsko IgG4 antitelo i prodaje se pod trgovačkim imenom Keytruda<™>. U još jednom otelotvorenju, anti-PD-1 antitelo je CT-011, humanizovano antitelo. CT-011, kada se primenjuj samostalno, nije pokazao odgovor u lečenju akutne mijeloične leukemije (AML) pri relapsu. U još jednom otelotvorenju, anti-PD-1 antitelo je AMP-224, fuzijski protein. U drugom otelotvorenju, PD-1 antitelo je BGB-A317. BGB-A317 je monoklonsko antitelo u kojem je sposobnost vezivanja Fc gama receptora I posebno izbačena projektovanjem, i koji ima jedinstveni vezni potpis za PD-1 sa visokim afinitetom i superiornom specifičnošću cilja.

[0199] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je PD-L1 inhibitor. U jednom otelotvorenju, PD-L1 inhibitor je anti-PD-L1 antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-PD-L1 antitelo je MEDI4736 (durvalumab). U drugom otelotvorenju, anti-PD-L1 antitelo je BMS-936559 (takođe poznato kao MDX-1105-01). U još jednom otelotvorenju, PD-L1 inhibitor je atezolizumab (takođe poznat kao MPDL3280A i Tecentriq<®>).

[0200] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je PD-L2 inhibitor. U jednom otelotvorenju, PD-L2 inhibitor je anti-PD-L2 antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-PD-L2 antitelo je rHIgM12B7A.

4

[0201] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je inhibitor limfocitnog aktivacionog gena 3 (LAG-3). U jednom otelotvorenju, LAG-3 inhibitor je IMP321, rastvorljivi Ig fuzijski protein (Brignone et al., J. Immunol., 2007, 179, 4202-4211). U drugom otelotvorenju, LAG-3 inhibitor je BMS-986016.

[0202] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je inhibitor B7. U jednom otelotvorenju, B7 inhibitor je B7-H3 inhibitor ili B7-H4 inhibitor. U jednom otelotvorenju, inhibitor B7-H3 je MGA271, anti-B7-H3 antitelo (Loo et al., Clin. Cancer Res., 2012, 3834).

[0203] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je inhibitor TIM3 (domen imunoglobulina T-ćelije i domen mucina 3) (Fourcade et al., J. Exp. Med., 2010, 207, 2175-86; Sakuishi et al., J. Exp. Med., 2010, 207, 2187-94).

[0204] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je agonist OX40 (CD134). U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je anti-OX40 antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-OX40 antitelo je anti-OX-40. U drugom otelotvorenju, anti-OX40 antitelo je MEDI6469.

[0205] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je GITR agonist. U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je anti-GITR antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-GITR antitelo je TRX518.

[0206] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je agonist CD137. U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je anti-CD137 antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-CD137 antitelo je urelumab. U drugom otelotvorenju, anti-CD137 antitelo je PF-05082566.

[0207] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je agonist CD40. U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je anti-CD40 antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-CD40 antitelo je CF-870,893.

[0208] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je rekombinantni humani interleukin-15 (rhIL-15).

[0209] U jednom otelotvorenju, inhibitor kontrolne tačke je IDO inhibitor. U jednom otelotvorenju, IDO inhibitor je INCB024360. U drugom otelotvorenju, IDO inhibitor je indoksimod.

[0210] U određenim otelotvorenjima, kombinovane terapije uključuju dva ili više ovde opisanih inhibitora kontrolne tačke (uključujući inhibitore kontrolne tačke iste ili različite klase). Štaviše, kombinovane terapije opisane u ovom dokumentu mogu se koristiti u kombinaciji sa jednim ili više drugih aktivnih sredstava kao što je opisano u ovom dokumentu, gde je to prikladno za lečenje bolesti opisanih u ovom dokumentu prihvaćeno u struci.

[0211] U određenim otelotvorenjima, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 mogu se koristiti u kombinaciji sa jednom ili više imunoloških ćelija koje izražavaju jedan ili više himernih antigenskih receptora (CAR) na svojoj površini (npr. modifikovana imunološka ćelija). Generalno, CAR se sastoji od ekstracelularnog domena iz prvog proteina (npr. antigenvezujućeg proteina), transmembranskog domena i intracelularnog signalnog domena. U određenim otelotvorenjima, kada se ekstracelularni domen veže za ciljni protein kao što je antigen povezan sa tumorom (TAA) ili tumor-specifični antigen (TSA), signal se generiše preko intracelularnog signalnog domena koji aktivira imunološku ćeliju, npr. ciljaju i ubijaju ćeliju koja eksprimira ciljni protein.

[0212] Ekstracelularni domeni: Ekstracelularni domeni CAR receptora se vezuju za antigen od interesa. U određenim otelotvorenjima, ekstracelularni domen CAR sadrži receptor, ili deo receptora, koji se vezuje za pomenuti antigen. U određenim otelotvorenjima, ekstracelularni domen sadrži, ili jeste, antitelo ili njegov deo koji se vezuje za antigen. U specifičnim otelotvorenjima, ekstracelularni domen obuhvata, ili jeste, jednolančani Fv (scFv) domen. Jednolančani Fv domen može da sadrži, na primer, Vz, povezan sa VHfleksibilnim linkerom, pri čemu su navedeni VLi VHiz antitela koje vezuje navedeni antigen.

[0213] U određenim otelotvorenjima, antigen prepoznat preko ekstracelularnog domena polipeptida koji je ovde opisan je antigen povezan sa tumorom (TAA) ili tumor-specifičan antigen (TSA). U različitim konkretnim otelotvorenjima, antigen povezan sa tumorom ili tumor-specifični antigen je, bez ograničenja, Her2, antigen matičnih ćelija prostate (PSCA), alfa-fetoprotein (AFP), karcinoembrionalni antigen (CEA), antigen karcinoma-125 (CA- 125), CA19-9, kalretinin, MUC-1, antigen sazrevanja B ćelija (BCMA), protein epitelne membrane (EMA), antigen epitelnog tumora (ETA), tirozinaza, antigen povezan sa melanomom-24 (MAGE), CD19, CD22, CD27, CD30, CD34, CD45, CD70, CD99, CD117, EGFRvIII (epidermalni faktor rasta varijanta III), mezotelin, PAP (prostatična kisela fosfataza), prostein, TARP (protein alternativnog okvira za čitanje T ćelija receptora), Trp-p8, STEAPI (šesttransmembranski epitelni antigen prostate 1), hromogranin, citokeratin, desmin, glijski vlaknasti kiseli protein (GFAP), grubi protein tečnosti cistične bolesti (GCDFP-15), HMB-45 antigen, protein melan-A (antigen melanoma koji prepoznaju T limfociti; MART-I), mio-D1, aktin specifičan za mišiće (MSA), neurofilament, enolaza specifična za neurone (NSE), placentalna alkalna fosfataza, sinaptofiza, tireoglobulin, faktor transkripcije štitne žlezde-1, dimerni oblik izoenzima piruvat kinaze tipa M2 (tumor M2-PK), abnormalni ras protein ili abnormalni protein p53. U nekim drugim otelotvorenjima, TAA ili TSA koje prepoznaje ekstracelularni domen CAR je integrin αvβ3 (CD61), galaktin ili Ral-B.

[0214] U određenim otelotvorenjima, TAA ili TSA koje prepoznaje ekstracelularni domen CAR je antigen karcinoma/testisa (CT), npr. BAGE, CAGE, CTAGE, FATE, GAGE, HCA661, HOM-TES-85, MAGEA, MAGEB, MAGEC, NA88, NY-ES0-1, NY-SAR-35, OY-TES-1, SPANXBI, SPA17, SSX, SYCPI ili TPTE.

[0215] U određenim drugim otelotvorenjima, TAA ili TSA prepoznata od strane ekstracelularnog domena CAR je ugljeni hidrat ili gangliozid, npr. fuc-GMI, GM2 (onkofetalni antigen-imunogeni-1; OFA-I-1); GD2 (OFA-I-2), GM3, GD3 i slično.

[0216] U određenim drugim otelotvorenjima, TAA ili TSA koje prepoznaje vanćelijski domen CAR su alfa-aktinin-4, Bage-1, BCR-ABL, Bcr-Abl fuzioni protein, beta-katenin, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, Casp-8, cdc27, cdk4, cdkn2a, CEA, coa-1, dek-can fuzioni protein, EBNA, EF2, antigeni Epstein-Barr virusa, ETV6-AML1 fuzioni protein, HLA-A2, HLA-All, hsp70-2, KIAA0205, Mart2, Mum-1, 2 i 3, neo-PAP, miozin klase I, OS-9, pm1-RARα fuzioni protein, PTPRK, K-ras, N-ras, triozofosfat izomeraza, Gage 3,4,5,6,7, GnTV, Herv-K-mel, Lage-1, NA-88, NY-Eso-1/Lage-2, SP17, SSX-2, TRP2-Int2, gp100 (Pmel17), tirozinaza, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, RAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15(58), RAGE, SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, HRas, HER-2/neu, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antigeni humanog papiloma virusa (HPV) E6 i E7, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 13-katenin, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, CT7, telomeraza, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 13HCG, BCA225, BTAA, CD68\KP1, C0-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB\70K, NY-C0-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90, TAAL6, TAG72, TLP ili TPS.

[0217] U različitim specifičnim otelotvorenjima, antigen povezan sa tumorom ili antigen specifičan za tumor je tumorski antigen povezan sa AML, kao što je opisano kod S. Anguille et al., Leukemia (2012), 26, 2186-2196.

[0218] Drugi antigeni povezani sa tumorom i tumor-specifični antigeni su poznati stručnjacima u oblasti.

[0219] Receptori, antitela i scFvs koji se vezuju za TSA i TAA, korisni u izgradnji himernih antigenskih receptora, poznati su u struci, a isti je slučaj i sa nukleotidnim sekvencama koje ih kodiraju.

[0220] U određenim konkretnim otelotvorenjima, antigen prepoznat od strane ekstracelularnog domena himernog receptora antigena je antigen koji se generalno ne smatra TSA ili TAA, ali koji je ipak povezan sa tumorskim ćelijama ili oštećenjem uzrokovanim tumorom. U određenim otelotvorenjima, na primer, antigen je, npr. faktor rasta, citokin ili interleukin, npr. faktor rasta, citokin ili interleukin povezan sa angiogenezom ili vaskulogenezom. Takvi faktori rasta, citokini ili interleukini mogu uključivati, npr. vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), osnovni faktor rasta fibroblasta (bFGF), faktor rasta izveden iz trombocita (PDGF), faktor rasta hepatocita (HGF), faktor rasta sličan insulinu (IGF) ili interleukin-8 (IL-8). Tumori takođe mogu stvoriti hipoksično okruženje lokalno u odnosu na tumor. Kao takav, u drugim konkretnim otelotvorenjima, antigen je faktor povezan sa hipoksijom, npr. HIF-1α, HIF-1β, HIF-2α, HIF-2β, HIF-3α ili HIF-3β. Tumori takođe mogu izazvati lokalizovano oštećenje normalnog tkiva, izazivajući oslobađanje molekula poznatih kao molekuli molekulskog uzorka povezanih sa oštećenjem (DAMP; takođe poznati kao alarmini). Prema tome, u određenim drugim konkretnim otelotvorenjima, antigen je DAMP, na primer, protein toplotnog šoka, protein povezan sa hromatinom 1 grupe visoke mobilnosti (HMGB 1), S100A8 (MRP8, kalgranulin A), S100A9 (MRP14, kalgranulin B), serumski amiloid A (SAA), ili može biti dezoksiribonukleinska kiselina, adenozin trifosfat, mokraćna kiselina ili heparin sulfat.

[0221] Transmembranski domen: U određenim otelotvorenjima, ekstracelularni domen CAR je spojen sa transmembranskim domenom polipeptida pomoću sekvence linkera, spejsera ili zglobnog polipeptida, npr. sekvence iz CD28 ili sekvence iz CTLA4. Transmembranski domen se može dobiti ili izvesti iz transmembranskog domena bilo kog transmembranskog proteina, i može uključivati ceo ili deo takvog transmembranskog domena. U konkretnim otelotvorenjima, transmembranski domen se može dobiti ili izvesti iz, npr. CD8, CD16, citokinskog receptora i interleukinskog receptora, ili receptora faktora rasta, ili slično.

[0222] Intracelularni signalni domeni: U određenim otelotvorenjima, intracelularni domen CAR jeste ili podrazumeva intracelularni domen ili motiv proteina koji je eksprimiran na površini T ćelija i pokreće aktivaciju i/ili proliferaciju navedenih T ćelija. Takav domen ili motiv je u stanju da transmituje primarni signal vezivanja antigena koji je neophodan za aktivaciju T limfocita u odgovoru na vezivanje antigena za vanćelijski (ekstracelularni) deo CAR. Uobičajeno, ovaj domen ili motiv sadrži, ili jeste, ITAM (motiv aktivacije imunoreceptora na bazi tirozina). Polipeptidi koji sadrže ITAM pogodni za CAR uključuju, na primer, zeta CD3 lanac (CD3ζ) ili njegove delove koji sadrže ITAM. U određenom otelotvorenju, intracelularni domen je CD3ζ intracelularni signalni domen. U drugim konkretnim otelotvorenjima, intracelularni domen je iz lanca receptora limfocita, proteina kompleksa TCR/CD3, podjedinice Fe receptora ili podjedinice IL-2 receptora. U određenim otelotvorenjima, CAR dodatno sadrži jedan ili više ko-stimulativnih domena ili motiva, na primer, kao deo intracelularnog domena polipeptida. Jedan ili više kostimulativnih domena ili motiva mogu biti, ili mogu sadržati, jedan ili više kostimulativnih CD27 polipeptidnih sekvenci, kostimulativnih CD28 polipeptidnih sekvenci, kostimulativnih OX40 (CD134) polipeptidnih sekvenci, kostimulativnu 4-1BB (CD137) polipeptidnu sekvencu, ili inducibilnu kostimulativnu polipeptidnu sekvencu T-ćelija (ICOS), ili drugi kostimulativni domen ili motiv, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0223] CAR može takođe sadržati motiv preživljavanja T ćelija. Motiv preživljavanja T ćelija može biti bilo koja polipeptidna sekvenca ili motiv koji olakšava preživljavanje T limfocita nakon stimulacije antigenom. U određenim otelotvorenjima, motiv preživljavanja T ćelija jeste, ili je izveden iz CD3, CD28, intracelularnog signalnog domena receptora IL-7 (IL-7R), intracelularnog signalnog domena receptora IL-12, intracelularnog signalnog domena receptora IL-15, intracelularnog signalnog domena receptora IL-21 ili intracelularnog signalnog domena transformišućeg faktora rasta receptora β (TGFβ).

[0224] Modifikovane imunološke ćelije koje eksprimiraju CAR mogu biti, npr. T limfociti (T ćelije, npr. CD4+ T ćelije ili CD8+ T ćelije), citotoksični limfociti (CTL) ili prirodne ćelije ubice (NK). T limfociti koji se koriste u ovde navedenim sastavima i metodama mogu biti naivni T limfociti ili T limfociti ograničeni MHC-om. U određenim otelotvorenjima, T limfociti su tumorski infiltrirajući limfociti (TIL). U određenim otelotvorenjima, T limfociti su izolovani iz biopsije tumora, ili su eskpandirani iz T limfocita izolovanih iz biopsije tumora. U određenim drugim otelotvorenjima, T ćelije su izolovane ili su ekspandirane iz T limfocita izolovanih iz periferne krvi, krvi pupčane vrpce ili limfe. Imunološke ćelije koje će se koristiti za generisanje modifikovanih imunoloških ćelija koje eksprimiraju CAR mogu se izolovati korišćenjem metoda koje su uobičajene u praksi, rutinskih metoda, npr. prikupljanje krvi praćeno aferezom i opciono izolacijom ili sortiranjem ćelija posredovanim antitelima.

[0225] Modifikovane imunološke ćelije su poželjno autologne pojedincu kome će biti administrirane. U određenim drugim otelotvorenjima, modifikovane imunološke ćelije su alogene za pojedinca kome će biti administrirane. Tamo gde se alogeni T limfociti ili NK ćelije koriste za pripremu modifikovanih T limfocita, poželjno je odabrati T limfocite ili NK ćelije koje će smanjiti mogućnost bolesti grafta protiv domaćina (GVHD) kod pojedinca. Na primer, u određenim otelotvorenjima, T limfociti specifični za virus biraju se za pripremu modifikovanih T limfocita; od takvih limfocita će se očekivati da imaju znatno smanjenu prirodnu sposobnost vezivanja za bilo koji antigen primaoca i stoga i aktivaciju njime. U određenim otelotvorenjima, odbijanje alogenih T limfocita posredovano od strane primaoca može se smanjiti istovremenom primenom jednog ili više imunosupresivnih agenasa, npr. ciklosporina, takrolimusa, sirolimusa, ciklofosfamida ili slično.

[0226] T limfociti, npr. nemodifikovani T limfociti ili T limfociti koji eksprimiraju CD3 i CD28, ili koji sadrže polipeptid koji se sastoji od domena signalizacije CD3ζ i kostimulacionog domena CD28, mogu se proširiti pomoću antitela na CD3 i CD28, npr. antitela vezana za perle; videti, npr. SAD Patent br. 5,948,893; 6,534,055; 6,352,694; 6,692,964; 6,887,466; i 6,905,681.

[0227] Modifikovane imunološke ćelije, npr. modifikovani T limfociti, mogu opciono da sadrže „samoubilački gen“ ili „sigurnosni prekidač“ koji omogućava ubijanje suštinski svih modifikovanih imunoloških ćelija po želji. Na primer, modifikovani T limfociti, u određenim otelotvorenjima, mogu da sadrže gen HSV timidin kinaze (HSV-TK), koji uzrokuje smrt modifikovanih T limfocita prilikom kontakta sa ganciklovirom. U drugom otelotvorenju, modifikovani T limfociti sadrže induktivnu kaspazu, npr. induktivnu kaspazu 9 (icaspase9), odnosno fuzijski protein između kaspaze 9 i humanog vezivnog proteina FK506 koji omogućava dimerizaciju pomoću specifičnog farmaceutskog sredstva malog molekula. Videti Straathof et al., Blood 105(11):4247-4254 (2005).

[0228] U određenim otelotvorenjima, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 ili Jedinjenje 3 kako je ovde predviđeno primenjuje se kod pacijenata sa različitim tipovima ili stadijumima multiplog mijeloma u kombinaciji sa T-ćelijama himernih antigenskih receptora (CAR). U određenim otelotvorenjima, CAR T ćelija u kombinaciji cilja antigen sazrevanja B ćelija (BCMA), a u specifičnijim otelotvorenjima, CAR T ćelija je bb2121 ili bb21217. U nekim otelotvorenjima, CAR T ćelija je JCARH125.

G. Farmaceutski sastavi

[0229] Ovde navedeni farmaceutski sastavi sadrže terapijski efikasne količine jednog ili više ovde navedenih jedinjenja i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

[0230] Jedinjenja se mogu formulisati u odgovarajuće farmaceutske preparate kao što su rastvori, suspenzije, tablete, disperzibilne tablete, pilule, kapsule, praškovi, formulacije sa produženim oslobađanjem ili eliksiri, za oralnu primenu ili u sterilnim rastvorima ili suspenzijama za oftalmološku ili parenteralnu primenu, kao i za pripremu transdermalnih flastera i inhalatora suvog praha. Uobičajeno, gore opisana jedinjenja su formulisana u farmaceutske sastave koristeći tehnike i procedure dobro poznate u struci (videti, npr. Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Seventh Edition 1999).

[0231] U sastavima, efikasne koncentracije jednog ili više jedinjenja ili farmaceutski prihvatljivih soli se mešaju sa odgovarajućim farmaceutskim nosačem ili vehikulumom. U određenim otelotvorenjima, koncentracije jedinjenja u sastavima su efikasne za isporuku odgovarajuće količine koja tretira, sprečava ili ublažava jedan ili više simptoma i/ili progresiju multiplog mijeloma.

1

[0232] Sastavi su uobičajeno formulisani za jednokratnu dozu. Da bi se formulisao sastav, maseni udeo jedinjenja se rastvara, suspenduje, disperguje ili na drugi način meša u izabranom vehikulumu u efikasnoj koncentraciji kako bi bilo moguće ublažavanje ili olakšavanje lečenog stanja. Farmaceutski nosači ili vehikulumi pogodni za primenu jedinjenja predviđenih ovim dokumentom uključuju sve takve nosače koji su poznati u struci kao pogodni za određeni metod primene.

[0233] Pored toga, jedinjenja se mogu formulisati kao jedini farmaceutski aktivni sastojak u sastavu ili se mogu kombinovati sa drugim aktivnim sastojcima. Lipozomske suspenzije, uključujući lipozome ciljane na tkivo, kao što su tumorski ciljani lipozomi, takođe mogu biti pogodne kao farmaceutski prihvatljivi nosači. Oni se mogu pripremiti u skladu sa metodama koje su dobro poznate u struci. Na primer, lipozomske formulacije se mogu pripremiti na način koji je poznat u struci. Ukratko, lipozomi kao što su multilamelarne vezikule (MLV) mogu se formirati sušenjem jajnog fosfatidil holina i moždanog fosfatidil serina (molarni odnos 7:3) na unutrašnjoj strani bočice. Dodaje se rastvor ovde navedenog jedinjenja u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom bez dvovalentnih katjona (PBS) i balon se mućka dok se lipidni film ne disperguje. Dobijeni vezikuli se ispiraju da bi se uklonilo nekapsulirano jedinjenje, peletiraju centrifugiranjem, a zatim resuspenduju u PBS.

[0234] Aktivno jedinjenje je uključeno u farmaceutski prihvatljiv nosač u količini koja je dovoljna da bi se ostvario terapijski koristan efekat u odsustvu neželjenih nuspojava kod lečenog pacijenta. Terapijski efikasna koncentracija može se odrediti empirijski testiranjem jedinjenja u in vitro i in vivo sistemima opisanim u ovom dokumentu, a zatim ekstrapolacijom u doze koje su odgovarajuće za ljude.

[0235] Koncentracija aktivnog jedinjenja u farmaceutskom sastavu zavisiće od apsorpcije, distribucije tkiva, inaktivacije, metabolizma i brzine izlučivanja aktivnog Jedinjenja, fizičkohemijskih karakteristika Jedinjenja, rasporeda doziranja i primenjene količine, kao i drugih faktora koji su dobro poznati u struci. Na primer, količina koja se isporučuje dovoljna je za ublažavanje jednog ili više simptoma karcinoma, uključujući solidne tumore i tumore koji se prenose krvlju.

2

[0236] Rastvori ili suspenzije koji se koriste za parenteralnu, intradermalnu, supkutanu ili topikalnu primenu mogu uključivati bilo koju od sledećih komponenti: sterilni razblaživač, kao što je voda za injekcije, fiziološki rastvor, fiksno ulje, polietilen glikol, glicerin, propilen glikol, dimetil acetamid ili drugi sintetički rastvarač; antimikrobna sredstva, kao što su benzil alkohol i metil parabeni; antioksidansi, kao što su askorbinska kiselina i natrijum bisulfit; helatna sredstva, kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA); puferi, kao što su acetati, citrati i fosfati; i sredstva za prilagođavanje toniciteta kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. Parenteralni preparati mogu biti u ampulama, olovkama, špricevima za jednokratnu upotrebu ili jednokratnim ili višestrukim doznim bočicama od stakla, plastike ili drugog odgovarajućeg materijala.

[0237] U slučajevima kada jedinjenja pokazuju nedovoljnu rastvorljivost, mogu se koristiti metode za rastvaranje jedinjenja. Takvi postupci su poznati stručnjacima u ovoj oblasti i uključuju, bez ograničenja, korišćenje korastvarača, kao što je dimetilsulfoksid (DMSO), korišćenje surfaktanata, kao što je TWEEN<®>, ili rastvaranje u vodenom rastvoru natrijum bikarbonata.

[0238] Nakon mešanja ili dodavanja jednog ili više jedinjenja, dobijena smeša može biti rastvor, suspenzija, emulzija ili slično. Oblik dobijene smeše zavisi od niza faktora, uključujući predviđeni način primene i rastvorljivost jedinjenja u izabranom nosaču ili vehikulumu. Efikasna koncentracija je dovoljna za ublažavanje simptoma bolesti, poremećaja ili stanja koji se leče i može se empirijski odrediti.

[0239] Farmaceutski sastavi su predviđeni za primenu kod ljudi i životinja u jediničnim doznim oblicima, kao što su tablete, kapsule, pilule, praškovi, granule, sterilni parenteralni rastvori ili suspenzije, oralni rastvori ili suspenzije i emulzije ulja i vode koje sadrže odgovarajuće količine jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. Farmaceutski terapijski aktivna jedinjenja i njihove soli se formulišu i primenjuju u jediničnim doznim oblicima ili višestrukim doznim oblicima. Jedinični dozni oblici, na način na koji se koriste ovde, odnose se na fizički diskretne jedinice pogodne za primenu kod ljudi i životinja, pojedinačno upakovane na način koji je uobičajen u struci. Svaka jedinična doza sadrži unapred određenu količinu terapijski aktivnog jedinjenja dovoljnu da proizvede željeni terapijski efekat, zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem, vehikulumom ili razblaživačem. Primeri jediničnih doznih oblika uključuju ampule i špriceve i pojedinačno upakovane tablete ili kapsule. Jedinični dozni oblici mogu se primenjivati u frakcijama ili u većem broju. Višestruki dozni oblik je mnoštvo identičnih jediničnih doznih oblika upakovanih u jedno pakovanje i primenjuje se u izdvojenom obliku jedinične doze. Primeri višestrukih doznih oblika uključuju bočice, bočice sa tabletama ili kapsulama ili bočice sa tečnošću. Stoga, višestruki dozni oblik predstavlja višestruke jedinične doze koje nisu odvojene u pakovanju.

[0240] Mogu se pripremiti oblici doziranja ili sastavi koji sadrže aktivni sastojak u rasponu od 0,005% do 100% uravnoteženim pomoću neotrovnog nosača. Za oralnu primenu, farmaceutski prihvatljiv neotrovni sastav se formira ugradnjom bilo kog od uobičajeno korišćenih ekscipijenasa, kao što su, na primer, manitol, laktoza, skrob, magnezijum stearat, talk, derivati celuloze, natrijum kroskarmeloza, glukoza, saharoza, magnezijum karbonat ili natrijum saharin. Takvi sastavi uključuju rastvore, suspenzije, tablete, kapsule, praškove i formulacije sa produženim oslobađanjem, kao što su, bez ograničenja, implantati i mikroenkapsulirani sistemi isporuke, i biorazgradive, biokompatibilne polimere, kao što su kolagen, etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, poliortoestri, polilaktična kiselina i drugi. Metode za pripremu ovih sastava su poznate u struci.

[0241] Aktivna jedinjenja ili njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu se pripremiti sa nosačima koji štite jedinjenje od brze eliminacije iz tela, kao što su formulacije ili premazi sa produženim oslobađanjem

[0242] Sastavi mogu uključivati druga aktivna jedinjenja kako bi se dobile željene kombinacije svojstava. Ovde navedena jedinjenja ili njihove farmaceutski prihvatljive soli takođe se mogu primenjivati u terapijske ili profilaktičke svrhe zajedno sa drugim farmakološkim agensom za koji je poznato da ima vrednost u lečenju jedne ili više ovde navedenih bolesti ili medicinskih stanja, kao što su oboljenja povezana sa oksidativnim stresom. Podrazumeva se da takva kombinovana terapija predstavlja dalji aspekt ovde navedenih sastava i tretmana.

H. Procena aktivnosti i svojstava jedinjenja

[0243] Standardne fiziološke, farmakološke i biohemijske procedure su dostupne za testiranje jedinjenja kako bi se identifikovala jedinjenja koja poseduju željena svojstva, uključujući proliferativnu aktivnost protiv multiplog mijeloma i adekvatan bezbednosni profil. Takvi

4

testovi uključuju, na primer, biohemijske testove kao što su testovi vezivanja, testovi inkorporacije radioaktivnosti, kao i razne testove na ćelijama.

[0244] Derivati izoindolinona i njihova terapijska upotreba opisani su u, na primer, američkom patentu br. 8.518.972. Iznenađujuće, Jedinjenje 1, Jedinjenje 2 i Jedinjenje 3 pokazuju neočekivana i korisna svojstva, kao što je prikazano u odeljku Primeri. Ova korisna svojstva uključuju značajno povećanu potenciju protiv multiplog mijeloma, povećane nivoe apoptoze i snažniji i efikasniji kombinovani odgovor sa deksametazonom, i iznenađujuće poboljšan bezbednosni profil, što pokazuje smanjena funkcionalna aktivnost na α1 adrenergičkim i D2 dopaminskim receptorima (in vitro, kao i in vivo), poboljšana selektivnost ubijanja ćelija (što se pokazuje smanjenim ubijanjem nemijelomskih ćelija) i smanjena inhibicija CYP3A4.

6. PRIMERI

[0245] Određena otelotvorenja pronalaska ilustrovana su sledećim primerima, bez ograničenja.

Skraćenice:

[0246]

AcN/ACN

Acetonitril

AIBN

Azobisizobutironitril

Boc

terc-butiloksikarbonil

BoczO

di-terc-butil dikarbonat tBuOK

Kalijum terc-butoksid DIEA

Diizopropiletilamin DMF

N,N'-dimetilformamid DMSO

Dimetilsulfoksid EtOAc

Etil acetat

IPA

Izopropanol ili 2-propanol MeOH

Metanol

MM

Multipli mijelom NBS

N-bromosukcinimid,

NMR

Nuklearna magnetna rezonanca

PBMC

Humana mononuklearna ćelija periferne krvi i-PrOAc

Izopropil acetat

TBS

terc-butil dimetilsilil

TBSC1

terc-butil dimetilsililhlorid

THF

Tetrahidrofuran

TLC

Tankoslojna hromatografija

TMSC1

Trimetilsilil hlorid

Primer 1: Sinteza 4-(4-(4-((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila (Jedinjenje 1).

[0247]

[0248] 2-amino-5-metoksi-5-oksopentanska kiselina. U suspenziju 2-aminopentandiojeve kiseline (250 g; 1,70 mol) u suvom metanolu (2,5 l) pod azotom dodavan je trimetilsilil hlorid (277 g; 2,55 mol) tokom 30 minuta. Rezultujući bistri rastvor je mešan na sobnoj temperaturi (20°C) tokom 30 minuta.<1>H NMR je pokazao da je polazni materijal u potpunosti potrošen. Reakciona smeša je korišćena u sledećem koraku bez dalje obrade.<1>H NMR: 400 MHz CD3OD δ: 4.17-4.15 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 2.70-2.60 (m, 2H), 2.33-2.25 (m, 2H).

[0249] 2-((terc-butoksikarbonil)amino)-5-metoksi-5-oksopentanska kiselina. Gore navedenom rastvoru je dodat trietilamin (275 g; 2,72 mol) i di-terc-butil dikarbonat (447,35 g; 2,05 mol). Reakciona smeša je mešana na 25°C 2 sata. Rastvor je koncentrovan do suvoće, zatim je dodata voda (2,5 l) da bi se rastvorio ostatak. Dobijena vodeni rastvor je ispran etil acetatom (200 ml), zatim zakiseljen na pH = 3 pomoću HCl (1 N) i ekstrahovan etil acetatom (1 l × 3). Kombinovani organski slojevi su isprani slanom vodom (800 ml), osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani tako da se dobije 2-(terc-butoksikarbonilamino)-5-metoksi-5-okso-pentanska kiselina (250 g; 56% prinosa; dva koraka) u vidu čvrste supstance bele boje.<1>H NMR: 400 MHz CD3OD δ: 4.18-4.11 (m, 1H), 3.69 (s, 3H), 2.48-2.43 (m, 2H), 2.21-2.15 (m, 1H), 1.95-1.91 (m, 1H), 1.46 (s, 9H).

[0250] Metil 5-amino-4-(terc-butoksikarbonil amino)-5-okso-pentanoat. U rastvor 2-(tercbutoksikarbonilamino)-5-metoksi-5-okso-pentanske kiseline (200 g; 765 mmol) u 1,4-dioksanu (1,5 l) dodati su di-terc-butil dikarbonat (267 g; 1,22 mol) i piridin (121 g; 1,53 mol).

Nakon mešanja reakcione smeše na 25°C u trajanju od 30 min, u smešu je dodat amonijum karbonat (182 g; 2,30 mol) i mešano je dodatnih 16 h na 25°C. Organski rastvarač je uklonjen rotacionim isparavanjem, ostatak je zakiseljen pomoću HCl (6 M) do pH = 3, a zatim ekstrahovan etil acetatom (800 ml × 3). Kombinovana organska faza je isprana slanom vodom (800 ml), osušena preko natrijum sulfata i filtrirana. Isparljive organske materije su uklonjene pod smanjenim pritiskom da bi se dobio metil 5-amino-4-(terc-butoksikarbonil amino)-5-oksopentanoat (180 g; 90% prinosa) u vidu čvrste supstance bele boje.<1>H NMR: 400 MHz CDCl3δ: 6.51 (s, 1H), 5.94 (s, 1H), 5.43 (s, 1H), 4.21 (s, 1H), 3.63 (s, 3H), 2.59-2.40 (m, 2H), 2.15-2.11 (m, 1H), 1.94-1.90 (m, 1H), 1.42 (s, 9H).

[0251] Metil 4,5-diamino-5-okso-pentanoat hidrohlorid. Smeša metil 5-amino-4-(tercbutoksikarbonilamino)-5-okso-pentanoata (180 g; 692 mmol) i HCl/etil acetata (300 ml; 4 M) je mešana na 25°C tokom 12 sati. Istaložena čvrsta supstanca je sakupljena vakuumskom filtracijom i isprana etil acetatom (500 ml) da bi se dobio metil 4,5-diamino-5-okso-pentanoat hidrohlorid (130 g; 95% prinosa) u vidu čvrste supstance bele boje.<1>H NMR: 400 MHz CD3OD δ: 4.00-3.96 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 2.59-2.52 (m, 2H), 2.22-2.13 (m, 2H).

[0252] Metil 3-hidroksi-2-metil-benzoat. Paralelno su sprovedene četiri serije (po 200 g). U rastvor 3-hidroksi-2-metil-benzojske kiseline (200 g; 1,31 mol) u metanolu (4,0 l) dodata je koncentrovana sumporna kiselina (47,7 g; 486 mmol). Reakciona smeša je mešana na 60°C tokom 17 sati i koncentrovana na 800 ml. Rezultujuća smeša je ohlađena na 20°C i polako sipana u vodu (400 ml) tokom 30 minuta. Voda (1200 ml) je dodata na 20°C tokom 3 sata i dobijena smeša je mešana na 20°C tokom 1 sata. Istaložena čvrsta materija je sakupljena vakuum filtracijom (četiri serije zajedno) i isprana je tri puta vodom/metanolom (1000 ml, 9:1) do pH > 3. Čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom na 45°C kako bi se dobilo metil 3-hidroksi-2-metilbenzoat (700 g; prinos 80,4%) u vidu čvrste supstance sive boje.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6δ: 9.70 (s, 1H), 7.18 (t, J= 6.8 Hz, 1H), 7.09 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 7.00 (t, J= 6.8 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 2.29 (s, 3H).

[0253] Metil 3-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-2-metil-benzoat. Paralelno su izvršene dve serije (240 g svaka). Rastvoru metil 3-hidroksi-2-metilbenzoata (240 g; 1,44 mol) u DMF (1,40 l) dodat je imidazol (246 g; 3,61 mol) i terc-butil dimetilsilil hlorid (238 g; 1,58 mol) na 5°C. Nakon dodavanja, smeša je zagrejana na 20°C i mešana 6 sati. Dodat je izopropil acetat (1700 ml), a zatim je polako dodata voda (2000 ml) dok je temperatura održavana na temperaturi ispod 30 °C. Dobijena smeša je mešana i organska faza je razdvojena. Kombinovane organske faze (dve kombinovane serije) su isprane vodom (1700 ml × 3) i koncentrovane na -1500 ml (KF<0,05%). Proizvod je skladišten kao izopropil acetatni rastvor koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

[0254] Metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-benzoat. Paralelno su izvršene dve serije (~375 g svaka). U izopropil acetatni rastvor metil 3-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-2-metil-benzoata (-375 g; 1,34 mol) dodat je N-bromosukcinimid (274 g; 1,54 mol) i azobisizobutironitril (4,40 g; 26,8 mmol). Reakciona smeša je zagrevana na 70°C tokom najmanje 1 sata i mešana na 70°C tokom 4 sata. Reakciona smeša je ohlađena na 20°C i održavana na 20°C najmanje 1 sat. Dve serije čvrstog (sukcinimida) su uklonjene filtracijom i isprane izopropil acetatom (700 ml). Filtrat je ispran rastvorom natrijum sulfita (700 g) u vodi (6000 ml), praćeno vodom (1500 ml). Organski sloj je destilovan pod vakuumom na 45°C do suvoće kako bi se dobio metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-benzoat (920 g; prinos 95,5%) u vidu ulja tamno narandžaste boje.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6δ: 7.45 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.13 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.95 (s, 2H), 1.02 (s, 9H), 0.29 (s, 6H).

[0255] Metil 5-amino-4-[4-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-1-okso-izoindolin-2-il]-5-oksopentanoat. Mešanom rastvoru metil 4,5-diamino-5-okso-pentanoat hidrohlorida (74,5 g; 379 mmol) u acetonitrilu (2,50 l) dodat je metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil(dimetil)silil] oksibenzoat (125 g; 348 mmol). Suspenziji je dodat diizopropiletilamin (89,9 g; 696 mmol) kroz adicioni levak tokom 10 minuta, a zatim je smeša mešana na 60°C tokom 16 sati. Reakciona smeša je razblažena sa etil acetatom (1,0 l), isprana sa HCl (1N; 1,0 l), natrijum bikarbonatom (zasić.1,0 l) i slanom vodom (1,0 l), sukcesivno. Organski sloj je koncentrovan tako da je dobijen sirovi metil 5-amino-4-[4-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-1-okso-izoindolin-2-il]-5-oksopentanoat (108 g; sirovi) u vidu čvrste supstance svetlo žute boje. LCMS: m/z 407.3 [M+1]<+>.

[0256] Metil 5-amino-4-(4-hidroksi-1-okso-izoindolin-2-il)-5-okso-pentanoat. U mešani hladni rastvor metil 5-amino-4-[4-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-1-okso-izoindolin-2-il]-5-oksopentanoata (108 g; 266 mmol) u N,N-dimetilformamidu (350 ml) dodat je kalijum karbonat (14,7 g; 106 mmol) u vodi (40 ml) u porcijama tokom 5 minuta. Rezultirajuća reakciona smeša je mešana na 15°C tokom 15 sati. Reakciona smeša je ohlađena u ledenom kupatilu i HCl (12 M; 15 ml) je dodavan polako na 0-5°C. U smešu je dodat acetonitril (200 ml) i formiran je talog. Suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi 10 minuta i filtrirana. Filtarski kolač je ispran etil acetatom (200 ml × 5) da bi se dobio proizvod (55 g). Filtrat je koncentrovan pod visokim vakuumom da bi se dobio sirovi proizvod (100 g) koji je rastvoren u dihlormetanu (1,0 l) i ostavljen da stoji na 15°C tokom 16 sati. Formirana je bela čvrsta materija koja je filtrirana da bi se dobilo 5 g proizvoda. Čvrste materije su kombinovane tako da daju metil 5-amino-4-(4-hidroksi-1-okso-izoindolin-2-il)-5-okso-pentanoat (60 g; 77% prinosa) u vidu čvrste supstance bele boje.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6δ: 7.58 (s, 1H), 7.31 (t, J= 8.0 Hz, 1H), 7.19-7.14 (m, 2H), 7.01 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.75-4.71 (m, 1H), 4.50 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 3.51 (s, 3H), 2.29-2.18 (m, 3H), 2.09-1.99 (m, 1H).

[0257] Metil 5-amino-4-[4-[[4-(bromometil)fenil]metoksi]-1-oksoizoindolin-2-il]-5-oksopentanoat. Paralelno su izvedene dve reakcije (25 g; 85,5 mmol). Smeša 1,4-bis(bromometil)benzena (67,7g; 257 mmol), kalijum karbonata (11,8g; 85,5 mmol) i metil 5-amino-4-(4-hidroksi-1-okso-izoindolin-2-il)-5-oksopentanoata (25g; 85,5 mmol) u acetonitrilu (1 l) mešana je na 60°C tokom 16 sati. Dve serije su kombinovane i smeša je ohlađena na 15°C i filtrirana. Filtrat je koncentrovan i prečišćen hromatografijom na koloni silikagela (eluiran sa 50% naftnog etra u etil acetatu do 100% etil acetata) kako bi se dobio metil 5-amino-4-[4-[[4-(bromometil)fenil]metoksi]-1-okso-izoindolin-2-il]-5-okso-pentanoat (52 g; 63% prinos) u vidu čvrste supstance bele boje.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6δ: 7.59 (s, 1H), 7.50-7.44 (m, 5H), 7.32-7.28 (m, 2H), 7.19 (s, 1H), 5.26 (s, 2H), 4.79-4.71 (m, 3H), 4.55 (d, J= 17.6 Hz, 1H), 4.43 (d, J= 17.6 Hz, 1H), 3.52 (s, 3H), 2.30-2.19 (m, 3H), 2.10-2.08 (m, 1H).

[0258] 3-[4-[[4-(bromometil)fenil]metoksi]-1-okso-izoindolin-2-il]piperidin-2,6-dion.

Paralelno su izvedene dve reakcije (28,5 g; 60,0 mmol). Metil 5-amino-4-[4-[[4-(bromometil)fenil]metoksi]-1-okso-izoindolin-2-il]-5-oksopentanoat (28,5; 60,0 mmol) je rastvoren u tetrahidrofuranu (720 ml) i rastvor je ohlađen u suvom ledu/acetonskom kupatilu na -70°C. Dok je mešan, kalijum terc-butoksid (7,4 g; 66,0 mmol) je dodavan u jednoj porciji u bistri rastvor. Reakciona smeša je promenila boju u bledo žutu i mešanje je nastavljeno tokom dodatna 2 sata na -70°C. Ohlađeni rastvor HCl (1N; 260 ml) je brzo prebačen u reakcionu smešu uz održavanje temperature na -70°C. Smeša je odmah postala mlečno bela i uklonjeno je suvo ledeno/acetonsko kupatilo. Smeša je koncentrovana da bi se uklonio najveći deo tetrahidrofurana. Nakon koncentrovanja reakcione smeše, istaložena je čvrsta materija bele boje. Bela kaša je razblažena vodom (500 ml) i zatim filtrirana. Filterski kolač je ispran vodom (500 ml) i osušen u vakuumskoj peći na 40°C tokom 12 sati, a zatim ispran etil acetatom (500

1

ml). Serije su kombinovane da bi dale 3-[4-[[4-(bromometil)fenil]metoksi]-1-okso-izoindolin-2-il] piperidin-2,6-dion (49,85 g; 93%) u vidu čvrste supstance svetlo žute boje.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6δ: 10.95 (s, 1H), 7.51-7.41 (m., 5H), 7.35-7.28 (m, 2H), 5.23 (s, 2H), 5.12-5.07 (m, 1H), 4.70 (s, 2H), 4.41 (d, J= 17.6 Hz, 1H), 4.25 (d, J= 17.6 Hz, 1H), 2.90-2.84 (m, 1H), 2.58-2.53 (m, 1H), 2.44-2.41 (m, 1H), 1.98-1.95 (m, 1H).

[0259] 4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril. 3-(4-((4-(bromometil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)piperidin-2,6-dion (5,0 g; 11,28 mmol) je stavljen u bocu sa 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrilom (2,315 g; 11,28 mmol), diizopropiletilaminom (5,91 ml; 33,8 mmol) i acetonitrilom (100 ml). Reakciona smeša je mešana na 40°C tokom 18 sati. Isparljive organske materije su uklonjene pod smanjenim pritiskom i prečišćavanje standardnim metodama dalo je 4-(4-(4-(((2-(2,6-diokopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.97 (s, 1H), 7.68 (dd, J=1.96, 13.45 Hz, 1H), 7.56 (dd, J=1.77, 8.38 Hz, 1H), 7.43-7.52 (m, 3H), 7.30-7.38 (m, 4H), 7.11 (t, J=8.80 Hz, 1H), 5.24 (s, 2H), 5.11 (dd, J=5.14, 13.33 Hz, 1H), 4.37-4.46 (m, 1H), 4.22-4.30 (m, 1H), 3.54 (s, 2H), 3.12-3.23 (m, 4H), 2.84-2.98 (m, 1H), 2.52-2.62 (m, 5H), 2.36-2.48 (m, 1H), 1.92-2.04 (m, 1H). MS (ESI) m/z 568.2 [M+1]<+>. Anal. Izračunato za C32H30FN5O4: C, 67.71; H, 5.33; N, 12.34. Pronađeno: C, 67.50; H, 5.44; N 12.34.

Primer 2: Sinteza (S)-4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila (Jedinjenje 2)

[0260]

[0261] terc-butil (4S)-5-amino-4-(benziloksikarbonilamino)-5-oksopentanoat. U rastvor (2S)-2-(benziloksikarbonilamino)-5-terc-butoksi-5-okso-pentanske kiseline (150 g; 445

2

mmol) u 1,4-dioksanu (1,50 l) dodat je di-terc-butil dikarbonat (155 g; 711 mmol), piridin (70,3 g; 889 mmol) i amonijum bikarbonat (105 g; 1,33 mol). Reakciona smeša je mešana na 18°C tokom 16 sati, a zatim koncentrovana. Ostatak je rastvoren u etil acetatu (5,0 l) i vodi (5,0 l), organski sloj je odvojen i ispran sa HCl (3,0 ml; 1 N), zasićenim natrijum bikarbonatom (3,0 l), slanom vodom (3,0 l), osušen preko bezvodnog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan tako da se dobije sirovi terc-butil (4S)-5-amino-4-(benziloksikarbonilamino)-5-oksopentanoat (450 g; sirovi) u vidu čvrste supstance bele boje, koja je korišćena u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR 400 MHz DMSO-d6δ: 7.35-7.30 (m, 5H), 7.02 (s, 1H), 5.01 (d, J= 3.2 Hz, 1H), 3.93-3.90 (m, 1H), 2.20 (t, J= 8.0 Hz, 2H), 1.88-1.84 (m, 1H), 1.72-1.69 (m, 1H), 1.35 (s, 9H).

[0262] terc-butil (4S) -4,5-diamino-5-okso-pentanoat. U rastvor terc-butil (4S)-5-amino-4-(benziloksikarbonilamino)-5-okso-pentanoata (112 g; 333 mmol) u metanolu (1,0 l) dodato je 10 % paladijuma na ugljeniku (15 g) pod azotom. Suspenzija je otplinjavana pod vakuumom i nekoliko puta pročišćena vodonikom. Smeša je mešana pod vodoničnim gasom (40 psi) na 30°C tokom 16 sati. Reakciona smeša je filtrirana i filtrat je koncentrovan da bi se dobio sirovi terc-butil (4S)-4,5-diamino-5-okso-pentanoat u vidu bezbojnog ulja.<1>H NMR 400 MHz DMSO-d6δ: 7.30 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 3.10-3.07 (m, 1H), 2.27-2.23 (m, 2H), 1.69-1.78 (m, 1H), 1.59-1.55 (m, 1H), 1.38 (s, 9H).

[0263] Metil 3-hidroksi-2-metil-benzoat. Paralelno su sprovedene četiri serije (po 200 g). U rastvor 3-hidroksi-2-metil-benzojske kiseline (200 g; 1,31 mol) u metanolu (4,0 l) dodata je koncentrovana sumporna kiselina (47,7 g; 486 mmol). Reakciona smeša je mešana na 60°C tokom 17 sati. Reakciona smeša je koncentrovana na 800 ml. Rezultujuća smeša je ohlađena na 20°C i polako sipana u vodu (400 ml) tokom 30 minuta. Voda (1200 ml) je dodata na 20°C tokom 3 sata i dobijena smeša je mešana na 20°C tokom 1 sata. Taložena čvrsta supstanca je sakupljena vakuum filtracijom (četiri serije zajedno) i isprana je tri puta vodom/metanolom (1000 ml; 9:1) ili dok filtrat nije imao pH > 3. Čvrsta supstanca je osušena pod vakuumom na 45°C da bi se dobio metil 3-hidroksi-2-metil-benzoat (700 g; prinos 80,4%) u vidu čvrste supstance sive boje.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6δ: 9.70 (s, 1H), 7.18 (t, J= 6.8 Hz, 1H), 7.09 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 7.00 (t, J= 6.8 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 2.29 (s, 3H).

[0264] Metil 3-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-2-metil-benzoat. Paralelno su izvršene dve serije (240 g svaka). U rastvor metil 3-hidroksi-2-metilbenzoata (240 g; 1,44 mol) u N,Ndimetilformamid (1,40 l) dodati su imidazol (246 g; 3,61 mol) i terc-butil dimetilsilil hlorid (238 g; 1,58 mol) na 5°C. Nakon dodavanja, smeša je zagrevana do 20°C i mešana 6 sati. Dodat je izopropil acetat (1700 ml), a zatim je polako dodavana voda (2000 ml) dok je temperatura održavana ispod 30°C. Rezultujuća smeša je promešana nakon čega je usledilo odvajanje organske faze. Kombinovane organske materije (dve kombinovane serije) su isprane vodom (1700 ml × 3) i koncentrovane na -1500 ml (KF<0,05%). Proizvod je skladišten kao izopropil acetatni rastvor koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

[0265] Metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-benzoat. Paralelno su izvršene dve serije (~375 g svaka). U izopropil acetatni rastvor metil 3-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-2-metil-benzoata (-375 g; 1,34 mol) dodat je N-bromosukcinimid (274 g; 1,54 mol) i azobisizobutironitril (4,40 g; 26,8 mmol). Reakciona smeša je zagrevana na 70°C tokom najmanje 1 sata i mešana na 70°C tokom 4 sata. Reakciona smeša je ohlađena na 20°C i održavana na 20°C najmanje 1 sat. Dve serije čvrstog (sukcinimida) su uklonjene filtracijom i isprane izopropil acetatom (700 ml). Filtrat je ispran rastvorom natrijum sulfita (700 g) u vodi (6000 ml), praćeno vodom (1500 ml). Organski sloj je destilovan pod vakuumom na 45°C do suvoće kako bi se dobilo metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-benzoat (920 g; prinos 95,5%) kao tamno narandžasto ulje.<1>H NMR: 400 MHz DMSO-d6δ: 7.45 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.13 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.95 (s, 2H), 1.02 (s, 9H), 0.29 (s, 6H).

[0266] terc-butil (4S)-5-amino-4-[4-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-1-okso-izoindolin-2-il]-5-okso-pentanoat. U rastvor terc-butil (4S)-4,5-diamino-5-oksopentanoata (130 g; 643 mmol) u acetonitrilu (4,0 l) dodat je metil 2-(bromometil)-3-[terc-butil(dimetil)silil]oksi-benzoat (210 g; 584 mmol) i diizopropiletilamin (113 g; 877 mmol). Reakciona smeša je mešana na 50°C tokom 16 sati. Reakciona smeša je koncentrovana da bi se uklonio veći deo acetonitrila, ostatak je rastvoren u metil terc-butil etru (2,0 l) i vodi (1,5 l), organski sloj je ispran zasićenim monokalijum fosfatom (1,0 l × 2), slanom vodom (1,0 l), osušen preko bezvodnog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan da bi se dobio sirovi terc-butil (4S)-5-amino-4-[4-[tercbutil(dimetil)silil]oksi-1-okso-izoindolin-2-il]-5-okso-pentanoat (524 g), koji je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

[0267] terc-butil (4S)-5-amino-4-(4-hidroksi-1-okso-izoindolin-2-il)-5-oksopentanoat.

Rastvoru terc-butil (4S) -5-amino-4-[4-[terc-butil(dimetil)silil] oksi-1-okso-izoindolin -2-il]-

4

5-okso-pentanoata (275 g; 613 mmol) u metanolu (2,0 l) dodat je tetrabutilamonijum fluorid trihidrat (38,7 g; 123 mmol). Smeša je mešana na 18 °C tokom 16 sati. Reakciona smeša je koncentrovana da bi se uklonio najveći deo metanola, ostatak je rastvoren u dihlorometanu/vodi (3 l/2 l), organski sloj je ispran slanom vodom (1,0 l), osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan da bi se dobio sirovi proizvod koji je prečišćen kolonom od silikagela da bi se dobio proizvod (260 g). Proizvod je dodat u acetonitril (750 ml) i smeša je mešana na 60 °C tokom 2 sata, ohlađena na 18 °C i mešana još 2 sata. Čvrsta supstanca je filtrirana i kolač je osušen da bi se dobio terc-butil (4S)-5-amino-4-(4-hidroksi-1-okso-izoindolin-2-il)-5-okso-pentanoat (248 g, prinos 60,5%) u vidu čvrste supstance sive boje.<1>H NMR 400 MHz DMSO-d6δ: 10.00 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.29 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 7.14 (d, J= 4.8 Hz, 2H), 4.72-4.68 (m, 1H), 4.49-4.28 (m, 2H), 2.17-1.97 (m, 4H), 1.31 (s, 9H).

[0268] 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril. 1,4-bis(hlorometil)benzen (51,2 g; 292 mmol) je stavljen u tikvicu sa acetonitrilom (195 ml) i N,N-dimetilformamidom (195 ml). Reakciona smeša je mešana na temperaturi okoline dok se sve čvrste materije nisu rastvorile. Zatim je dodat diizopropilamin (51,1 ml; 292 mmol) zajedno sa 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrilom (20 g; 97 mmol). Reakcija je zagrevana na 60 °C tokom 1 sata. Acetonitril je uklonjen pod smanjenim pritiskom. Preostala smeša je podeljena između etil acetata (1,0 l), vode (700 ml) i slane vode (300 ml). Organski sloj je izdvojen i vodeni sloj je ekstrahovan sa etil acetatom dva puta. Isparljive organske materije su kombinovane i uklonjene pod sniženim pritiskom. Čvrsta supstanca je rastvorena u minimalnoj količini dihlormetana i prečišćena na koloni silikagela (0-100% etil acetata u heksanima preko 3 l). Kombinovane su frakcije koje sadrže željeni proizvod i uklonjeni su isparljivi organski proizvodi pod smanjenim pritiskom. Ostatak je rastvoren u minimalnoj količini dihlormetana i drugi put prečišćen na koloni silikagela (10% izokratičnog etil acetata u heksanima preko 800 ml praćeno sa 20-80% etil acetata u heksanima preko 4 l). Frakcije koje sadrže željeni proizvod su kombinovane i isparljivi organski proizvodi su uklonjeni pod smanjenim pritiskom kako bi se dobio 4-(4-(4-(hlorometil)benzil) piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril (22,7 g; 66,0 mmol; 67,7% prinosa) u vidu čvrste supstance sivkasto bele boje.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.33 - 7.39 (m, 5 H) 7.29 (d, J=1.96 Hz, 1 H) 7.25 (d, J=1.96 Hz, 1 H) 6.91 (t, J=8.56 Hz, 1 H) 4.60 (s, 2 H) 3.58 (s, 2 H) 3.19 - 3.27 (m, 4 H) 2.58 - 2.66 (m, 4 H). MS (ESI) m/z 344.2 [M+1]<+>.

[0269] (S)-terc-butil 5-amino-4-(4-((4-((4-(4-cijano-2-fluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)-5-oksopentanoat. (S)-terc-butil 5-amino-4-(4-hidroksi-1-oksoizoindolin-2-il)-5-oksopentanoat (22,05 g; 65,9 mmol) je stavljen u tikvicu sa 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrilom (22,67 g; 65,9 mmol), kalijum karbonatom (18,23 g; 132 mmol) i N, N-dimetilformamidom (330 ml). Reakciona smeša je zagrevana na 45°C tokom 16 sati. Reakcija je razblažena etil acetatom (50 ml) i filtrirana. Filtrat je podeljen sa etil acetatom (900 ml) i vodom (600 ml) i slanom vodom (200 ml). Organski sloj je izolovan i ispran vodom (600 ml). Organski sloj je osušen preko natrijum sulfata, a isparljive materije su uklonjene pod smanjenim pritiskom. Ostatak je tretiran sa 20% etil acetata u heksanima, a isparljive materije su uklonjene pod smanjenim pritiskom da bi se dobio (S)-terc-butil 5-amino-4-(4-((4-((4-(4-cijano-2-fluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)-5-oksopentanoat (44,02 g; 68,6 mmol; 104% prinos) u vidu čvrste supstance sivkasto bele boje. Prinos je bio nešto veći od kvantitativnog jer je ostalo nešto DMF.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.43 - 7.49 (m, 2 H) 7.40 (s, 4 H) 7.36 (dd, J=8.38, 1.28 Hz, 1 H) 7.29 (d, J=1.96 Hz, 1 H) 7.26 (d, J=1.83 Hz, 1 H) 7.11 (dd, J=7.64, 1.16 Hz, 1 H) 6.92 (t, J=8.50 Hz, 1 H) 6.23 (br s, 1 H) 5.24 - 5.32 (m, 1 H) 5.15 (s, 2 H) 4.86 - 4.94 (m, 1 H) 4.38 - 4.55 (m, 2 H) 3.61 (s, 2 H) 3.18 - 3.32 (m, 4 H) 2.58 - 2.70 (m, 4 H) 2.09 - 2.47 (m, 4 H) 1.43 (s, 8 H). MS (ESI) m/z 642.4 [M+1]<+>.

[0270] (S)-4-(4-(4-((2-(2,6-diokopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril. (S)-terc-butil 5-amino-4-(4-((4-((4-(4-cijano-2-fluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin- 2-il)-5-okspentanoat (12,1 g; 18,86 mmol) je stavljen u bočicu sa acetonitrilom (189 ml) i benzensulfonskom kiselinom (3,96 g; 24,51 mmol). Reakciona smeša je stavljena pod vakuum i pročišćena azotom. Ovo je ponovljeno još jednom i smeša je zatim zagrejana na 85°C preko noći u atmosferi azota. Topla reakciona smeša je sipana direktno u 2 separatorna levka koji sadrže dihlorometan (1000 ml) i etil acetat (300 ml). Ovoj smeši je dodat zasićeni rastvor natrijum bikarbonata (900 ml), vode (100 ml) i slane vode (450 ml). Organski sloj je izolovan i vodeni sloj je ekstrahovan sa dihlormetanom (800 ml) i etil acetatom (200 ml). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko bezvodnog magnezijum sulfata i koncentrovani. Prečišćavanje standardnim metodama obezbedilo je naslovno jedinjenje.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.96 (s, 1 H) 7.68 (dd, J=13.45, 1.83 Hz, 1 H) 7.56 (dd, J=8.44, 1.83 Hz, 1 H) 7.43 - 7.52 (m, 3 H) 7.29 - 7.39 (m, 4 H) 7.11 (t, J=8.80 Hz, 1 H) 5.24 (s, 2 H) 5.11 (dd, J=13.20, 5.14 Hz, 1 H) 4.22 - 4.46 (m, 2 H) 3.54 (s, 2 H) 3.12 - 3.22 (m, 4 H) 2.85 - 2.97 (m, 1 H) 2.53 - 2.62 (m, 2 H) 2.38 - 2.48 (m, 2 H) 1.93 - 2.03 (m, 1 H). MS (ESI) m/z 568.2 [M+1]<+>.

Primer 3: Sinteza (S)-4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila (Jedinjenje 2)

[0271]

[0272] 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril hidrohlorid. U rastvor 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrila (100 g) u toluenu (1400 ml) dodata je sirćetna kiselina (28 ml) na 25°C i reakciona smeša je ostavljena da reaguje 30 min. 4-(hlorometil)benzaldehid (79 g) je dodat na 25°C i smeša je ostavljena da reaguje 2 sata. Natrijum triacetoksiborohidrid (52 g svaki) je dodavan na 25°C svakih 30 min tri puta. Smeša je mešana na 25°C oko 10 sati. Voda (600 ml) je dodavana tokom 1 sata uz održavanje temperature serije ispod 30 °C. Odvojen je veći deo donjeg sloja. Smeša je filtrirana i donji sloj je odvojen. Organski sloj je ispran vodom (200 ml). U organski sloj je dodat IPA (75 ml), zatim 5-6 N HCl u IPA (8 ml), a potom suspenzija semena 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril hidrohlorida (2 g) u toluenu (20 ml). U smešu je dodato 5-6 N HCl u IPA (115 ml) na temperaturi od 25 °C tokom 2 sata. Smeša je ostavljena da reaguje oko 10 sati, a zatim je filtrirana kako bi se dobila sirova čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca je isprana toluenom (400 ml) i osušena u vakuumskoj peći da bi se dobio 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il) -3-fluorobenzonitril hlorid u vidu bledo žute čvrste supstance (152 g; 82% prinosa).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.82 (s, 1H), 7.50-7.79 (m, 6H), 7.18-7.24 (m, 1H), 4.80 (s, 2H), 4.38-4.39 (m, 2H), 3.44-3.70 (m, 2H), 3.14-3.44 (m, 6H).

[0273] terc-butil 5-amino-4-(4-((4-(4-(4-cijano-2-fluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)-5-oksopentanoat. U smešu 4-(4-(4(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril hidrohlorida (100 g) i terc-butil (S)-5-amino-4-(4-hidroksi-1-oksuizoindolin-2-il)-5-okso-pentanoata (97 g) u DMF (600 ml) dodat je kalijum karbonat (K2CO3) (75 g) na temperaturi od 35 °C, a reakciona smeša je ostavljena da reaguje 24 sata. U smešu je zatim dodat trietilamin (11 ml) i smeša je mešanja na 45 °C oko 2 sata. Nakon toga, u smešu je dodat EtOAc (1 l) i rastvor kalijum karbonata u vodi (5%; 500 ml). Organski sloj je ispran vodenim rastvorom natrijum hlorida (5%; 500 ml). U smešu je dodat Ecosorb C948 E-pak (30 g) i smeša je ostavljena da reaguje 2 sata. Zatim je smeša filtrirana. U smešu je dodat rastvor L-tartarske kiseline (47 g) u metanolu (850 ml) na temperaturi od 45 °C, a smeša je ostavljena da reaguje 2 sata. Nakon toga, smeša je ohlađena na 25 °C. Čvrstie supstance su filtrirane kako bi se dobila tartratna so terc-butil (S)-5-amino-4-(4-((4-(4-(4-ciano-2-fluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oksij)-1-oksuizoindolin-2-il)-5-okso-pentanoata. (145 g; 70% prinosa).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.31 (s, 9H), 1.87 - 2.27 (m, 4H), 2.55 (br s, 4H), 3.18 (br s, 4H), 4.29 (s, 2H), 4.36 - 4.62 (m, 2H), 4.71 (dd, J = 4.2, 10.0 Hz, 1H), 5.22 (s, 2H), 7.10 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 7.18 (s, 1H), 7.29 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.33 - 7.40 (m, 2H), 7.40 - 7.51 (m, 3H), 7.51 - 7.63 (m, 2H).

[0274] (S)-4-(4-(4-((2-(2,6-diokopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril. Rastvor tartratne soli terc-butila (S)-5-amino-4-(4-((4-((4-(4-cijano-2-fluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)-5-oksopentanoata (100 g) u 2-metiltetrahidrofuranu (1 l) ispran je vodenim rastvorom kalijum karbonata (10%; 85 ml). Donji sloj je odvojen. Rastvarač 2-metiltetrahidrofuran je zamenjen acetonitrilom da bi se dobio rastvor. Rastvoru je dodata benzensulfonska kiselina (60 g) u acetonitrilu (200 ml) na 70°C tokom 2 sata. Prečišćavanje standardnim metodama dalo je naslovno jedinjenje.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.96 (s, 1 H) 7.68 (dd, J=13.45, 1.83 Hz, 1 H) 7.56 (dd, J=8.44, 1.83 Hz, 1 H) 7.43 - 7.52 (m, 3 H) 7.29 - 7.39 (m, 4 H) 7.11 (t, J=8.80 Hz, 1 H) 5.24 (s, 2 H) 5.11 (dd, J=13.20, 5.14 Hz, 1 H) 4.22 - 4.46 (m, 2 H) 3.54 (s, 2 H) 3.12 - 3.22 (m, 4 H) 2.85 - 2.97 (m, 1 H) 2.53 - 2.62 (m, 2 H) 2.38 - 2.48 (m, 2 H) 1.93 - 2.03 (m, 1 H). MS (ESI) m/z 568.2 [M+1]<+>.

Primer 4: Sinteza (S)-4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitrila (Jedinjenje 2)

[0275]

[0276] 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril hidrohlorid. U rastvor 3-fluoro-4-(piperazin-1-il)benzonitrila (100 g) u toluenu (1400 ml) dodata je sirćetno kiselina (28 ml) na temperaturi od 25 °C, i reakciona smeša je ostavljena 30 minuta. 4-(hlorometil)benzaldehid (79 g) je zatim dodat na temperaturi od 25 °C, a smeša je ostavljena da reaguje 2 sata. Natrijum triacetoksiboro-hidrid (52 g svaki put) je dodavan na temperaturi od 25 °C svake 30 minuta tri puta. Smeša je mešana na 25°C oko 10 sati. Voda (600 ml) je dodavana tokom 1 sata uz održavanje temperature serije ispod 30 °C. Odvojen je veći deo donjeg sloja. Smeša je filtrirana i donji sloj je odvojen. Organski sloj je ispran vodom (200 ml). U organski sloj je dodat IPA (75 ml), zatim 5-6 N HCl u IPA (8 ml), a potom suspenzija semena 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril hidrohlorida (2 g) u toluenu (20 ml). U smešu je zatim dodat 5-6 N HCl u IPA (115 ml) na temperaturi od 25 °C tokom 2 sata. Smeša je ostavljena da reaguje oko 10 sati, a zatim je filtrirana kako bi se dobila sirova čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca je isprana toluenom (400 ml) i osušena u vakuumskoj peći, čime je dobijen 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril hidrohlorid kao bela čvrsta supstanca (152 g; 82% prinosa).<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 11.82 (s, 1H), 7.50-7.79 (m, 6H), 7.18-7.24 (m, 1H), 4.80 (s, 2H), 4.38-4.39 (m, 2H), 3.44-3.70 (m, 2H), 3.14-3.44 (m, 6H).

[0277] terc-butil 5-amino-4-(4-((4-(4-(4-cijano-2-fluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il)-5-oksopentanoat. U smešu 4-(4-(4-(hlorometil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril hidrohlorida (100 g) i terc-butil (S)-5-amino-4-(4-hidroksi-1-oksuizoindolin-2-il)-5-okso-pentanoata (88 g) u dimetil sulfoksidu (DMSO) (700 mll) dodat je kalijum karbonat (K2CO3) (73 g) na temperaturi od 35 °C, a smeša je ostavljena da reaguje 24 sata. U smešu je zatim dodat EtOAc (1,2 l) i voda (1,1 l). Organski sloj je ispran rastvorom natrijum hlorida u vodi (5%; 1 l). U smešu je dodat n-heptan (200 ml). Smeša je isprana rastvorom sirćetne kiseline u vodi (3%, 1 l), vodom (1 l), rastvorom K3PO4 u vodi (20%, 10 L), i vodom (10 l). Rastvarač je destilovan na oko 1,2 l. Smeša je kristalizovana sa n-heptanom kako bi se dobio terc-butil (S)-5-amino-4-(4-((4-(4-(4-ciano-2fluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oksi)-1-oksuizoindolin-2-il)-5-okso-pentanoat (143 g; 85% prinosa).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 7.43 - 7.49 (m, 2 H) 7.40 (s, 4 H) 7.36 (dd, J=8.38, 1.28 Hz, 1 H) 7.29 (d, J=1.96 Hz, 1 H) 7.26 (d, J=1.83 Hz, 1 H) 7.11 (dd, J=7.64, 1.16 Hz, 1 H) 6.92 (t, J=8.50 Hz, 1 H) 6.23 (br s, 1 H) 5.24 - 5.32 (m, 1 H) 5.15 (s, 2 H) 4.86 - 4.94 (m, 1 H) 4.38 - 4.55 (m, 2 H) 3.61 (s, 2 H) 3.18 - 3.32 (m, 4 H) 2.58 - 2.70 (m, 4 H) 2.09 - 2.47 (m, 4 H) 1.43 (s, 8 H).

[0278] (S)-4-(4-(4-((2-(2,6-diokopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il)-3-fluorobenzonitril. Rastvor terc-butil (S)-5-amino-4-(4-((4-(4-(4-ciano-2-fluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oksi)-1-oksuizoindolin-2-il)-5-okso-pentanoata (100 g) u acetonitrilu (1 l) održavan je na temperaturi od 70 °C. U rastvor je dodat benzensulfonska kiselina (74 g) u acetonitrilu (200 ml) na 70 °C tokom 2 sata. Prečišćavanje standardnim metodama obezbedilo je dobijanje traženog jedinjenja.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10.96 (s, 1 H) 7.68 (dd, J=13.45, 1.83 Hz, 1 H) 7.56 (dd, J=8.44, 1.83 Hz, 1 H) 7.43 - 7.52 (m, 3 H) 7.29 - 7.39 (m, 4 H) 7.11 (t, J=8.80 Hz, 1 H) 5.24 (s, 2 H) 5.11 (dd, J=13.20, 5.14 Hz, 1 H) 4.22 - 4.46 (m, 2 H) 3.54 (s, 2 H) 3.12 - 3.22 (m, 4 H) 2.85 -2.97 (m, 1 H) 2.53 - 2.62 (m, 2 H) 2.38 - 2.48 (m, 2 H) 1.93 - 2.03 (m, 1 H). MS (ESI) m/z 568.2 [M+1]<+>.

Primer 5: 4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il-2,2,3,3,5,5,6,6-d<8>)-3-fluorobenzonitril

[0279]

[0280] 3-fluoro-4-(piperazin-1-il-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)benzonitril. Rastvor 3,4-difluorobenzonitrila (278 mg; 2,00 mmol) i piperazina-2,2,3,3,5,5,6,6-d<8>(942 mg; 10,0 mmol) u suvoj DMA (6 ml) mešan je na 110 °C tokom 16 sati. Smeša je ohlađena na sobnu temperaturu i polako dodata u H2O (60 ml) uz mešanje. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (3 puta), a organski delovi su kombinovani, oprani zasićenim NaCl (3 puta), osušeni preko MgSO4,

1

filtrirani i koncentrisani. Preostala bezbojna sirupasta supstanca je sušena pod vakuumom da bi se dobio sirovi proizvod kao bela čvrsta supstanca (599 mg). Čvrsta supstanca je rastvorena u EtOAc, a rastvor je ispran sa H2O (3 puta), zasićenim rastvorom NaCl u vodi (3 puta) i osušen preko MgSO4. Osušeni rastvor je filtriran, koncentrisan, a ostatak je osušen pod vakuumom da bi se dobilo traženo jedinjenje (447 mg; 105%) kao bela čvrsta supstanca. LCMS (ESI) m/z 214.2 [M+H]<+>.

[0281] 4-(4-(4-(((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-4-il)oksi)metil)benzil)piperazin-1-il-2,2,3,3,5,5,6,6-d<8>)-3-fluorobenzonitril. U rastvor 3-[4-[[4-(bromometil)fenil]metoksi]-1-okso-izoindolin-2-il]piperidin-2,6-dion (736 mg; 1,66 mmol) i 3-fluoro-4-(piperazin-1-il-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)benzonitrila (425 mg; 1,99 mmol) u suvoj DMF (5,0 mL) dodat je DIEA (0,870 ml; 4,99 mmol), a smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. Smeša je filtrirana (najlon membrana od 0,45 µm), a rastvor je pročišćen standardnim metodama da bi se dobio traženi proizvod (532 mg; 56%). LCMS (ESI) m/z 576.4 [M+H]<+>.

Primer 6: Antiproliferativni i proapoptotični efekti na multipli mijelom.

[0282] Materijali ćelijske kulture: Ćelijske linije humanog multiplog mijeloma kupljene su od dobavljača i kultivisane na 37 °C sa 5%CO2u medijumu kao što je navedeno u tabeli 1. Ćelijske linije rezistentne na lenalidomid i pomalidomid dobijene su metodama koje su prethodno generalno opisane (Lopez-Girona et al Leukemia 2012; 26(11): 2335). Sve ćelijske linije su održavane u logaritamskoj fazi, a gustina i vijabilnost ćelija su praćene isključenjem tripan plave boje pomoću analizatora Vi-ćelijske XR vijabilnosti ćelija (Beckman Coulter, Brea, CA).

Tabela 1: Testirane ćelijske linije multiplog mijeloma

1 1

[0283] Priprema rastvora test stavke: Jedinjenja su stavljena u crne ploče sa 384 bunarčića (Corning Inc.) do konačne zapremine DMSO od 0,1% uz pretpostavku maksimalne zapremine od 50 µl. Odziv doze u 10 tačaka počev od 10 µM sa razblaživanjem 1:3 odštampan je u duplikatu akustičnim izdavanjem koristeći EDC ATS-100 platformu. Alternativno, korišćen je odgovor doze u 10 tačaka počevši od 10 µM sa razblaženjem 1: 10, ili počevši od 100 nM sa razblaženjem 1:3.

[0284] Testovi proliferacije ćelija: Uticaj jedinjenja na proliferaciju/održivost hematoloških ćelijskih linija (tabela 1), procenjen je nakon 120 sati inkubacije koristeći CTG (Promega), u skladu sa uputstvima proizvođača. Hematološke ćelijske linije su izdate u ploče jedinjenja pomoću Multidrop kombinovanog dozatora reagensa (Thermo Scientific, Waltham, MA) u koncentraciji od 0,1 x 10<6>ćelija po ml u ukupnoj zapremini od 50 µL. U 120 sati, 25 µL po bunarčiću CTG-a je izdato Multidrop kombinovanim dozatorom reagensa, a oslobađanje adenozin trifosfata (ATP) od strane vijabilnih ćelija je izmereno kao relativna jedinica luminiscencije nakon 30 minuta koristeći Envision platformu.

[0285] Testovi apoptoze ćelija: Sposobnost jedinjenja da indukuju apoptozu procenjena je u odabranim MM ćelijskim linijama u navedenim vremenskim tačkama i koncentracijama jedinjenja. Kao marker apoptoze, nivo aktivnosti kaspaze-3 meren je u MM ćelijama pomoću snimaka živih ćelija. Da bi se snimile suspenzivne ćelije, ploče sa 96 bunarčića su obložene

1 2

fibronektinom kako bi ćelije prianjale i ležale ravno na dnu posude. Ćelije su dodate u ploče sa 96 bunarčića korišćenjem Multidrop kombinovanog dozatora reagensa (Thermo Scientific, Waltham, MA) noć pre dodavanja jedinjenja. Jedinjenja su naneta na vrh ćelija u odgovarajući bunarčić ploče sa 96 bunarčića korišćenjem Hewlett-Packard D300 digitalnog dispenzera (Tecan, Mannedorf, Švajcarska). MM ćelijske linije su tretirane jedinjenjima, a nakon 6 sati medijum je zamenjen kako bi se oponašalo obnavljanje jedinjenja in vivo, što je rezultiralo približno 20 puta razređivanjem koncentracije jedinjenja. Ćelije su uzgajane u prisustvu NucView 488 Caspase-3 enzimskog supstrata (Biotium) i inkubirane u IncuCyte ZOOM sistemu za analizu živih ćelija (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI) smeštenim u standardnom inkubatoru. Cepanje supstrata enzima kaspaze-3 i ćelijska konfluencija u svakom bunarčiću detektovani su snimanjem pri 10x na IncuCite ZOOM sistemu svakih 4-6 sati tokom 5 dana. Svaki bunarčić/uslov je ponovljen na istoj ploči i svaki uslov je imao prosek od 410x slike snimljene u svakoj vremenskoj tački.

[0286] Rezultati. Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2 pokazuju antiproliferativnu aktivnost protiv MM ćelijskih linija. MM ćelijske linije izabrane za ovu studiju bile su linije osetljive i rezistentne na lenalidomid i/ili pomalidomid (tabela 1), dva sredstva koja se koriste u klinici za lečenje pacijenata sa mijelomom. Proliferacija je procenjena pomoću CellTitre-Glo<®>testa. Rezultati za kulture inkubirane sa jedinjenjima normalizovani su na rezultate za kontrolne kulture za svaku ćelijsku liniju. IC50za inhibiciju rasta ćelija jedinjenjima određen je za svaku ćelijsku liniju pomoću softvera ActivityBase. Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2 su snažno inhibirali proliferaciju ćelija u četiri ćelijske linije, što je utvrđeno kvantitativnom procenom nivoa ATP prisutnih u medijumu nakon 120 sati. Antiproliferativne vrednosti IC50Jedinjenja 1 i Jedinjenja 2 kretale su se između 0,07 nM i 19 nM (tabela 2). Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2 pokazali su veoma snažnu antiproliferativnu aktivnost multiplog mijeloma čak i na ćelijskim linijama koje su bile rezistentne na lenalidomid i/ili pomalidomid.

Tabela 2: Inhibicija rasta ćelija Jedinjenjem 1 i Jedinjenjem 2 u MM ćelijskim linijama u tečnoj kulturi

1

[0287] Indukovana apoptoza Jedinjenja 1 u linijama ćelija multiplog mijeloma. Ispitivani su efekti jedinjenja na apoptozu u MM ćelijskim linijama. Kako bi se odredila sposobnost jedinjenja da indukuju apoptozu i kinetički karakterizovao početak ovog procesa, indukcija kaspaze-3 merena je tokom vremena u H929-1051 ćelijama rezistentnim na lenalidomid (slika 1). H929-1051 ćelije su inkubirane sa jedinjenjima u koncentracijama od 1 nM, 10 nM, 100 nM i 1000 nM i apoptoza je procenjena tokom vremena. Rezultati su pokazali da su za ćelije H929-1051 sve koncentracije Jedinjenja 1 izazvale apoptozu počevši od oko 48 sati i dostižući blizu maksimalne indukcije u ~72 sata inkubacije. Zatim je površina ispod krive (AUC) izračunata za svaku koncentraciju i korišćena za generisanje krive koncentracija-odgovor za svako jedinjenje. Ovo je pružilo kvantitativne dokaze o sposobnosti Jedinjenja 1 da izazove apoptozu u H929-1051. Iznenađujuće, indukcija apoptoze koju je izazvalo Jedinjenje 1 bila je značajno veća od indukcije apoptoze koja je zabeležena za prethodno prijavljeno jedinjenje 3-(4-((4-((4-(2,4-difluorofenil)piperazin-1-il)metil)benzil)oksi)-1-oksoizoindolin-2-il) piperidin-2,6-dion (Primer 5.285 u SAD patentu br. 8,518,972) (Jedinjenje A). Kao što je prikazano na slici 1B, apoptotička indukcija (merena ukupnim AUC) koju je izazvalo Jedinjenje 1 je povećana za skoro 30% (126%) u poređenju sa apoptotičkom indukcijom koju je izazvalo Jedinjenje A.

[0288] Kombinacija sa deksametazonom. Aktivnost pomalidomida sa onom Jedinjenja 2 pojedinačno ili u kombinaciji sa deksametazonom procenjena je preko panela MM ćelijskih linija. Slika 2 je reprezentativan skup kriva doza-odgovor u ćelijskoj liniji H929-1051 rezistentnoj na lenalidomid, što pokazuje da je Jedinjenje 2 kao jedini agens 10 puta jače od kombinacije pomalidomid-deksametazona i skoro jednako efikasno (slika 2, panel A). Iznenađujuće, kada se Jedinjenje 2 kombinuje sa deksametazonom, ono ne samo da stvara snažniji odgovor, već se i efikasnost dramatično poboljšava (slika 2, panel B); postiže se skoro

1 4

potpuno ubijanje ćelija. Tabela 3 rezimira potenciju (IC50) studija jedinog agensa i kombinacije sa deksametazonom sprovedenih u ćelijskoj liniji H929-1051. Navedene su IC50Svrednosti jedinog agensa pomalidomida ili Jedinjenja 2, kao i kombinacije sa 1, 0,1 ili 0,01 µM deksametazona (Dex) u ćelijama rezistentnim na lenalidomid (H929-1051). Svaka IC50vrednost je prosek iz najmanje 3 nezavisna eksperimenta. Proliferacija je praćena 5. dana korišćenjem Cell Titer-Glo. Dosledno, Jedinjenje 2 u kombinaciji sa deksametazonom bilo je dramatično aktivnije od pomalidomida u kombinaciji sa deksametazonom, a ova povećana aktivnost postignuta je pri 10-100 puta nižim koncentracijama deksametazona. Zajedno, ovi podaci ukazuju na potencijal za povećanu bezbednost kombinovanog tretmana Jedinjenjem 2 i deksametazonom, omogućavajući upotrebu nižih doza deksametazona uz održavanje efikasnosti i sinergije.

Tabela 3: Poređenje antiproliferativnih vrednosti IC50za Jedinjenje 2 i Pomalidomid kao pojedinačne agense ili u kombinaciji sa deksametazonom u ćelijskoj liniji H929-1051 rezistentnoj na lenalidomid

[0289] In Vitro procena bezbednosti prema proceni antiproliferativne selektivnosti u odnosu na normalne ćelije. Da bi se pokazalo da Jedinjenje 2 generalno nije citotoksično, sprovedeno je kontra testiranje protiv besmrtne (ali netumorogene) ćelijske linije izvedene iz humanih hepatocita THLE-2 (Pfeifer et al, Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90(11):5123-7) i protiv primarnih, zdravih humanih PBMC (slika 3). Jedinjenje 2 je imalo mali antiproliferativni efekat na THLE-2 ćelije (IC50> 10 µM) ili na nestimulirane primarne humane PBMC (IC50> 10 µM) u poređenju sa MM ćelijskim linijama prikazanim gore.

1

[0290] Antitumorska aktivnost Jedinjenja 2 u modelu ksenografta multiplog mijeloma rezistentnog na lenalidomid. Svrha studije je bila da se testira antitumorska aktivnost jedinjenja 2 u modelu ksenografta H929-1051 sa doziranjem jednom dnevno (QD) od 1, 3, 10 i 30 mg/kg. Značajna (p < 0,0001) antitumorska aktivnost je primećena na svim nivoima doze sa smanjenjem zapremine tumora od 75%, 86%, 84% i 85% pri 1, 3, 10 i 30 mg/kg, respektivno (slika 4).

[0291] Zaključak: ovi podaci zajedno pokazuju da Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2 pokazuju veoma snažnu aktivnost protiv multiplog mijeloma i iznenađujuće pokazuju značajno povećane nivoe apoptoze u poređenju sa prethodno prijavljenim jedinjenjima, Jedinjenjem A i pomalidomidom. Pored toga, Jedinjenje 2 u kombinaciji sa deksametazonom ne samo da stvara snažniji odgovor, već se i efikasnost dramatično poboljšava. Dodatno, pokazano je selektivno ubijanje ćelija multiplog mijeloma u odnosu na normalne ćelije.

Primer 7: Vanciljni efekti Jedinjenja 1/Jedinjenja 2 i implikacije.

[0292] α1 Adrenergički i dopaminski D2 receptori. Metode: Ispitivanja vezivanja i funkcionalnosti za α1 adrenergičke i dopaminske D2 receptore sprovedena su od strane Eurofins Cerep prema njihovim metodama.

[0293] α1 Adrenergički receptor. Vezivanje na 10 µM. Testom vezivanja procenjen je afinitet testnog proizvoda za neselektivni α1 adrenergički receptor u cerebralnom korteksu pacova. Membranski homogenati cerebralnog korteksa su inkubirani u duplikatu 60 minuta na sobnoj temperaturi sa 0,25 nM [<3>H]prazosina u odsustvu ili prisustvu test stavki na 10 µM. Nakon perioda inkubacije, uzorci su filtrirani kroz filtere od staklenih vlakana, filteri su osušeni, a zatim izbrojani na radioaktivnost pomoću brojača scintilacije. Rezultati su izraženi kao srednji procenat inhibicije vezivanja kontrolnog radioliganda.

[0294] Vezivni IC50. Da bi se odredio vezivni IC50za neselektivni α1 adrenergički receptor, različite koncentracije test stavke su inkubirane u duplikatu sa 0,25 nM [<3>H] prazosina. Jedinjenje A je testirano na 0,01-30 µM. Jedinjenje B, S-enantiomer Jedinjenja A, testirano je na 0,0003-10 µM. Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2, S-enantiomer Jedinjenja 1, ispitivani su na 0,03-

1

100 µM. Radioaktivnost je izmerena kao što je gore opisano. IC50je definisan kao koncentracija koja uzrokuje polumaksimalnu inhibiciju vezivanja specifičnog za kontrolu.

[0295] Antagonistička aktivnost. Antagonistički efekti testnih jedinjenja na α1Ai α1Badrenergičke receptore mereni su pomoću ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) transficiranih humanim receptorima. Aktivnost antagonista je određena merenjem efekta jedinjenja na mobilizaciju kalcijuma indukovanu agonistima (epinefrinom) u testu receptora α1Aili nivoima cAMP u testu receptora α1B. U ovim eksperimentima, CHO ćelije su inkubirane u duplikatu na sobnoj temperaturi sa test stavkom i epinefrinom na 3 nM u testovima α1Areceptora ili na 3000 nM u testu α1Breceptora. Jedinjenje A je testirano u testu receptoraα1Ana 0,01-30 µM. Jedinjenje B je testirano u testovima receptora α1Ai α1Bna 0,0003-30 µM. Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2 su testirani na 0,03 do 30 µM u testu receptora α1Ai 0,03 do 100 µM u testu receptora α1B. U testu receptora α1A, nivoi citosolnog kalcijuma mereni su fluorometrijski pomoću fluorescentne sonde, Fluo4 Direct. Nivoi intracelularnog cAMP-a u testu α1Badrenergičkog receptora mereni su homogenom vremenski rešenom fluorescencijom (HTRF). Antagonizam IC50je definisan kao koncentracija koja uzrokuje polumaksimalnu inhibiciju odgovora kontrolnog agonista.

[0296] Dopaminski D2 receptor. Vezivanje na 10 µM. Testom vezivanja procenjen je afinitet test stavki za dopaminski D2 receptor u transficiranim ćelijama humanog embrionskog bubrega (HEK)-293. Za određivanje vezivanja u testu D2Sreceptora, test stavka je inkubirana sa 0,3 nM [<3>H] metilspiperonom ili 1 nM [<3>H] 7-hidroksi-2-N,N-dipropilaminotetralinom (7-OH-DPAT).

[<3>H] Metilspiperon na 0,3 nM je takođe korišćen kao kontrolni ligand u testu vezivanja D2L. Homogenati ćelijske membrane su inkubirani u duplikatu na sobnoj temperaturi 60 minuta sa ligandom u odsustvu ili prisustvu test stavki na 10 µM. Nakon perioda inkubacije, uzorci su filtrirani kroz filtere od staklenih vlakana, filteri su osušeni, a zatim izbrojani na radioaktivnost pomoću brojača scintilacije. Rezultati su izraženi kao srednji procenat inhibicije vezivanja kontrolnog radioliganda.

[0297] Vezivni IC50. Da bi se odredio vezivni IC50u testovima D2 receptora, HEK-293 je testiran kao što je gore opisano, ali sa različitim koncentracijama test stavke. Jedinjenje A je testirano na 0,01-30 µM u testu vezivanja D2Sradioliganda. Jedinjenje B je testirano na 0,0003-10 µM i u D2Si D2Ltestovima vezivanja. Jedinjenje 1 je testirano na 0,03-100 µM i u D2Si D2Ltestovima, dok je Jedinjenje 2 testirano na 0,03-100 µM u D2Stestu i na 0,01-100 µM u D2L

1

testovima. IC50je definisan kao koncentracija koja uzrokuje polumaksimalnu inhibiciju vezivanja specifičnog za kontrolu.

[0298] Agonistička aktivnost. Agonizam test jedinjenja na dopaminskom D2Sreceptoru procenjen je pomoću ćelija HEK-293 transficiranih humanim receptorima. Agonistička aktivnost je određena merenjem efekta jedinjenja na impedansnu modulaciju. U ovim eksperimentima, HEK-293 ćelije su inkubirane u duplikatu na 28 °C sa test stavkom. Jedinjenje A je testirano na 0,01-30 µM. Jedinjenje B je testirano na 0,0003-10 µM, dok su Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2 testirani na 0,01-10 µM. Kao agonistička kontrola korišćen je dopamin (3 µM). Merenja impedanse su praćena 10 minuta nakon dodavanja liganda pomoću ćelijske dielektrične spektroskopije. EC50je definisan kao koncentracija koja izaziva polumaksimalni odgovor, u poređenju sa odgovorom kontrolnog agonista (dopamina).

[0299] Rezultati. Vezivanje na 10 µM na α1 adrenergičkim i dopaminskim D2 receptorima je procenjeno za Jedinjenje 1, Jedinjenje 2, Jedinjenje A, Jedinjenje B i niz jedinjenja prikazanih u SAD patentu br. 8,518,972 (tabela 4). Dok su prethodno otkrivena jedinjenja potpuno inhibirala vezivanje liganda na oba receptora, iznenađujuće, Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2 pokazali su značajno smanjenu sposobnost inhibicije vezivanja liganda, pokazujući samo 67/62% (α1 adrenergički receptor) odnosno 55/52% (dopamin D2S) inhibiciju vezivanja liganda. Stoga je dalje analiziran diferencirani efekat Jedinjenja 1 i Jedinjenja 2, u poređenju sa Jedinjenjem A i Jedinjenjem B na α1 adrenergičkim i dopaminskim D2 receptorima.

Tabela 4. Efekti Jedinjenja A, Jedinjenja B, Jedinjenja 1 i Jedinjenja 2 i prethodno prijavljenih jedinjenja na α1 adrenergički i dopaminski D2 receptor

1

[0300] Detaljni efekti Jedinjenja A, Jedinjenja B, Jedinjenja 1 i Jedinjenja 2 na adrenergički receptor α1 sažeti su u tabeli 5. Jedinjenje A je inhibiralo vezivanje liganda za α1 adrenergički receptor za 102%. Vezivanje IC50za Jedinjenje A na receptor bilo je 0,064 µM. Pokazalo se da je jedinjenje A jak antagonist α1Aadrenergičkog receptora, sa IC50od 0,014 µM. Slično tome, Jedinjenje B je inhibiralo vezivanje liganda za α1 adrenergički receptor za 98-100% na

1

10 µM i imalo je vezivanje IC50od 0,024 µM. Snažan antagonizam α1 adrenergičkog receptora je primećen sa Jedinjenjem B, sa IC50vrednostima od 0,0064 i 0,078 µM na α1Ai α1Breceptorima, respektivno. Iznenađujuće, za razliku od toga, pokazalo se da i Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2 imaju slabu aktivnost na adrenergičkom receptoru α1. IC50vrednosti za antagonizam receptora Jedinjenjem 1 bile su 0,98 µM i 6,9 µM za α1Ai α1Breceptore, respektivno. Uporedivi rezultati su primećeni za Jedinjenje 2.

Tabela 5. Efekti Jedinjenja A, Jedinjenja B, Jedinjenja 1 i Jedinjenja 2 na adrenergički receptor α1

11

[0301] Dopaminski D2 receptor. Efekti Jedinjenja A, Jedinjenja B, Jedinjenja 1 i Jedinjenja 2 na dopaminski D2 receptor sumirani su u tabeli 6. Jedinjenje A je inhibiralo vezivanje liganda za dopaminski D2Sreceptor za 99%. IC50vrednost vezivanja za Jedinjenje A na D2Sreceptoru iznosila je 0,15 µM. Pokazalo se da je jedinjenje A delimični agonist dopaminskog D2Sreceptora, sa EC50od 0,016 µM. Slično tome, Jedinjenje B je inhibiralo D2Sreceptor za 99% na 10 µM i imalo je IC50vrednost vezivanja od 0,084 i 0,016-0,047 µM na D2Li D2Sreceptorima, respektivno. Iznenađujuće, za razliku od toga, pokazalo se da Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2 imaju slabu aktivnost na dopaminskom D2 receptoru, sa inhibicijom na 10 µM od ≤ 55% i IC50vrednostima vezivanja IC50 ≥ 2 µM. Funkcionalni agonizam (EC50) Jedinjenja B na dopaminskom D2S receptoru u tri nezavisne studije bio je >10, 2,7 i 1,9 µM. Iako je stepen agonizma Jedinjenja B na D2Sreceptoru bio manji od onog koji je primećen za Jedinjenje A, postojala je tendencija ka većem agonizmu Jedinjenja B u poređenju sa Jedinjenjem 1 i Jedinjenjem 2. Sveukupno, podaci o % inhibicije vezivanja na 10 µM, IC50vrednosti vezivanja i IC50agonizma, pokazali su jaču aktivnost Jedinjenja A i Jedinjenja B na dopaminskom D2 receptoru u poređenju sa Jedinjenjem 1 i Jedinjenjem 2. Ovo zapažanje je u skladu sa dokazima agonizma dopamina D2 (tj. smanjenog pokretljivosti/pražnjenja želuca) kod pacova sa Jedinjenjem A, ali ne i sa Jedinjenjem 1 (kao što je objašnjeno u nastavku).

Tabela 6. Efekti Jedinjenja A, Jedinjenja B, Jedinjenja 1 i Jedinjenja 2 na dopaminski D2 receptor

[0302] 7-dnevne eksplorativne toksikološke studije kod mužjaka pacova Metode. Mužjaci CD-IGS pacova (n=5/grupa za toksikološku procenu; n=4/grupa za toksikokinetičku procenu) dozirani su jednom dnevno oralnom gavažom (10 ml/kg) sa vehikulumom (0,5% HPMC/0,25% Tween-80 u 50 mM citrata, pH 2,6-2,8) ili testnim proizvodima (Jedinjenje A ili Jedinjenje 1) u dozi od 100, 300 ili 1000 mg/kg/dan tokom 7 uzastopnih dana. Uzorci krvi za toksikokinetiku su prikupljeni 1. i 7. dana. Svi pacovi su posmatrani zbog kliničkih znakova toksičnosti pre doziranja, otprilike 1 sat nakon doziranja od 1. do 7. dana i pre nekropsije 8. dana. Telesna težina je zabeležena prilikom randomizacije, pre doziranja od 1. do 7. dana i pre nekropsije. Uzorci za hematologiju i analize hemije seruma prikupljeni su 8. dana, približno 24 sata nakon poslednje doze. Pacovi su 8. dana eutanazirani zbog nekropsije. Anatomska patološka procena sastojala se od bruto opservacije, težine organa i histopatološkog pregleda odabranih tkiva.

[0303] Rezultati. Nakon dnevne oralne primene Jedinjenja A tokom 7 uzastopnih dana, sistemska izloženost (AUC0-t) se povećala u zavisnosti od doze sa 100 na 1000 mg/kg. Izloženost 7. dana bila je približno 3 do 7 puta veća od 1. dana. AUC 7. dana iznosili su 441, 1230 i 1760 µM h pri 100, 300 i 1000 mg/kg, respektivno. Klinički znaci toksičnosti (pogrbljeno držanje, piloerekcija i smanjena aktivnost) i smanjena telesna težina primećeni su pri ≥ 300 mg/kg. Pri dozi od 100 mg/kg nije uočeno povećanje telesne težine. Abnormalan sadržaj želuca (suv, hranljivi materijal) primećen je grubo pri ≥ 100 mg/kg, bez mikroskopskog korelata. Ovo otkriće sugeriše smanjenu gastrointestinalnu motilitet/pražnjenje i u skladu je sa agonističkom aktivnošću na dopaminskom D2receptoru Mikroskopski nalazi vezani za testni proizvod bili su ograničeni na minimalnu multifokalnu nekrozu miokarda i mešovitu infiltraciju ćelija u srcima pacova pri svim nivoima doze. Iako tačan uzrok ove srčane lezije ostaje da se utvrdi, nalaz je u skladu sa agonizmom dopaminskog D2receptora i/ili antagonizmom α1-adrenergičkog receptora. Promene ovih receptora mogu dovesti do vazodilatacije, što dovodi do smanjenog protoka krvi, hipotenzije i refleksne tahikardije. Lokacija srčanih lezija (vrh, endokardijalna površina komora) dodatno podržava mehanizam ishemije. Za Jedinjenje 1, izloženost (AUC0-t) se takođe povećala u zavisnosti od doze sa 100 na 1000 mg/kg, a izloženost 7. dana je bila približno 2 do 6 puta veća nego 1. dana. 7. dana, SUC pri 100, 300 i 1000 mg/kg iznosili su 143, 514 i 1220 µM h, respektivno. Nije bilo kliničkih opservacija vezanih za testni proizvod. Minimalno smanjenje povećanja telesne težine primećeno je pri ≥ 300 mg/kg. Iznenađujuće, nasuprot Jedinjenju A, nisu primećeni efekti na želudac ili srce kod pacova koji su primali Jedinjenje 1, što je u skladu sa smanjenim aktivnostima na α1 adrenergičkim i dopaminskim D2receptorima koje je zabeležio Eurofins Cerep, kao što je ranije opisano.

[0304] In vitro evaluacija Jedinjenja 2 i Jedinjenja B kao inhibitora enzima humanog citokroma p450. Cilj je bio da se proceni potencijal Jedinjenja B i Jedinjenja 2 da deluju kao direktni ili vremenski zavisni inhibitor aktivnosti citokroma P450 (CYP) u grupisanim mikrozomima ljudske jetre. U ovoj studiji ispitivana je inhibicija devet enzima humanog citokroma P450, odnosno CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 i CYP3A4/5 (korišćenjem dva supstrata).

[0305] Metode. Da bi se ispitao potencijal jedinjenja da deluju kao direktni inhibitor CYP enzima, grupisani mikrozomi ljudske jetre su inkubirani sa probnim supstratima, u koncentracijama približno jednakim njihovom prividnom Km, u odsustvu ili prisustvu Jedinjenja B (0,03 do 30 µM) ili Jedinjenja 2 (0,03 do 30 µM) i NADPH (1 mM). Pored toga, procenjen je potencijal jedinjenja da deluju kao inhibitori koji zavise od vremena u istim gorenavedenim koncentracijama. Prilikom procene vremenski zavisne inhibicije, jedinjenja su predinkubirana mikrozomima ljudske jetre i NADPH (1 mM) 30 minuta pre dodavanja probnog supstrata. Pored odgovarajućih kontrola vehikuluma, kao pozitivne kontrole uključeni su poznati direktni inhibitori i vremenski zavisni inhibitori CYP izoforma. Nakon inkubacije,

11

koncentracije metabolita probnog supstrata su kvantifikovane korišćenjem utvrđenih LC/MS/MS metoda. Obim inhibicije izražen je kao procenat kontrolne aktivnosti.

[0306] Rezultati. Jedinjenje B. U eksperimentalnim uslovima koji se koriste za ispitivanje direktne inhibicije, Jedinjenje B (do 30 µM) je imalo mali (≤ 30%) ili nikakav inhibitorni efekat na CYP1A2, CYP2A6, CYP2C8, CYP2D6, CYP2E1 i CYP3A4/5 (midazolam). Pri 30 µM, Jedinjenje B je inhibiralo aktivnost CYP2B6, CYP2C9 i CYP2C19 za 59, 38 i 45%, respektivno. Jedinjenje B inhibiralo je CYP3A4/5 (testosteron) sa IC50vrednošću od 2,92 µM. U uslovima koji se koriste za testiranje vremenski zavisne inhibicije, Jedinjenje B (do 30 µM) pokazalo je malu ili nikakvu vremenski zavisnu inhibiciju CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 i CYP2E1 nakon 30-minutne predinkubacije sa ili bez NADPH. Jedinjenje B je inhibiralo CYP3A4/5 na vremenski zavisan način. Pomerana IC50vrednost (sa NADPH) bila je 2,23 i 1,93 µM za midazolam i testosteron kao supstrate, respektivno.

[0307] Jedinjenje 2. U eksperimentalnim uslovima koji se koriste za ispitivanje direktne inhibicije, Jedinjenje 2 (do 30 µM) je imalo mali (≤ 30%) ili nikakav inhibitorni efekat na CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1 i CYP3A4/5 (midazolam). Pri 30 µM, Jedinjenje 2 je inhibiralo aktivnost CYP2C19 i CYP3A4/5 (testosteron) za 41 odnosno 46%. U uslovima koji se koriste za testiranje vremenski zavisne inhibicije, Jedinjenje 2 (do 30 µM) pokazalo je malu ili nikakvu vremenski zavisnu inhibiciju CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 i CYP3A4/5 (midazolam) nakon 30-minutne predinkubacije sa ili bez NADPH. Jedinjenje 2 (pri 30 µM) inhibiralo je aktivnost CYP3A4/5 (testosterona) za 59% (sa NADPH) i 23% (bez NADPH), što je ukazivalo na to da je Jedinjenje 2 slab vremenski zavisan inhibitor CYP3A4/5.

[0308] Zaključak. Ukratko, Jedinjenje B (do 30 µM) je imalo malo (≤ 30%) do nikakvog direktnog inhibitornog efekta na CYP1A2, CYP2A6, CYP2C8, CYP2D6, CYP2E1 i CYP3A4/5 (midazolam). Jedinjenje B inhibiralo je CYP3A4/5 (testosteron) sa IC50vrednošću od 2,92 µM. Jedinjenje B je inhibiralo aktivnost CYP2B6, CYP2C9 i CYP2C19 za 59, 38 i 45% respektivno na 30 µM. Jedinjenje B (do 30 µM) nije vremenski zavisni inhibitor CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 i CYP2E1, ali je vremenski zavisni inhibitor CYP3A4/5.

[0309] Iznenađujuće, za razliku od Jedinjenja 2 (do 30 µM), ono je imalo malo (≤ 30%) do nikakvog inhibitornog efekta na bilo koji od testiranih CYP enzima, a pri 30 µM, Jedinjenje 2 je inhibiralo aktivnost CYP2C19 i CYP3A4/5 (testosteron) samo za 41, odnosno 46% (tj. IC50> 30 µM). Jedinjenje 2 (do 30 µM) je takođe samo slab vremenski zavisan inhibitor CYP3A4/5. Smanjena inhibitorna aktivnost za CYP2C19 i CYP3A4/5 rezultira smanjenim dejstvom na metabolizam, uključujući druge lekove, a samim tim i smanjenim potencijalom za neželjene interakcije lekova.

[0310] Rezime: Kombinacija snažne aktivnosti protiv multiplog mijeloma uz poštovanje normalnih ćelija, značajno povećanih nivoa apoptoze i snažnijeg i efikasnijeg kombinovanog odgovora sa deksametazonom, ukazuje da će Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2 biti korisni u lečenju multiplog mijeloma. Pored toga, iznenađujuće poboljšani in vitro i in vivo rezultati vanciljnog i CYP profila, u kombinaciji sa potencijalom za korišćenje nižih doza deksametazona, ukazuju na to da Jedinjenje 1 i Jedinjenje 2 treba da imaju poboljšane bezbednosne profile u odnosu na prethodno prijavljena jedinjenja.

Primer 8: Apoptoza izazvana jedinjenjem 2 u ćelijskim linijama multiplog mijeloma, koju karakterišu onkogeni pokretači, hromozomske translokacije i p53 mutacije.

[0311] Metode. Efekat jedinjenja na proliferaciju i indukciju apoptoze reprezentativnih MM ćelijskih linija koje poseduju zajedničke onkogene mutacije i hromozomske translokacije, uključujući one za koje se smatra da su visokorizične translokacije ili mutacije pronađene kod MM pacijenata, procenjen je korišćenjem testa protočne citometrije sa 96 bunarčića nakon 120 sati inkubacije sa jedinjenjima. Dvadeset MM ćelijskih linija (tabela 7 i 8) (uključujući ćelijske linije plazma ćelijske leukemije (PCL) L363, JJN-3, ARH-77 i SKMM-2) tretirane su u duplikatu sa eskalirajućim koncentracijama Jedinjenja 2 ili pomalidomida, u rasponu od 0,015 do 100 nM. Koristeći 5 mM rastvore, jedinjenja su prethodno postavljena u odgovarajuće bunarčiće ploča sa 96 bunarčića pomoću Hewlett-Packard D300 digitalnog dispenzera. Ćelije su dodate u ploče sa 96 bunarčića pomoću Multidrop kombinovanog dozatora reagensa. Nakon pet dana tretmana, analiza protočnom citometrijom korišćena je za utvrđivanje broja živih, mrtvih i apoptotskih ćelija. Posle pet dana tretmana, ćelije su inkubirane aneksinom V za bojenje izloženog fosfatidilserina, markera apoptotske površine ćelije, i vitalnom bojom 7-AAD, koja ne prodire u ćelije sa očuvanim ćelijskim membranama, a zatim su analizirane protočnom citometrijom (Attune<®>, Thermo Fisher). Zatim je sprovedena analiza za utvrđivanje

11

broja živih ćelija (ćelije koje su dvostruko negativne na aneksin V i 7-AAD) i izračunavanje procenta apoptotskih ćelija (ćelije pozitivne na aneksin V) za svaku uslovnu grupu u poređenju sa kontrolom tretiranom sa DMSO. Sve opisane vrednosti normalizovane su prema ćelijama tretiranim samo sa DMSO. Sve krive za proliferaciju i indukciju apoptoze obrađene su i prikazane kao procentualna vrednost kontrole korišćenjem XI,Fit (IDBS, Alameda, CA) i GraphPad Prism 7.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Broj živih ćelija za svaku koncentraciju normalizovan je prema kontroli sa DMSO (koja se smatra kao 100%) koristeći Microsoft Excel za generisanje krivih proliferacije. Vrednosti IC50(koncentracija jedinjenja koja postiže 50% inhibicije) izračunate su primenom log(inhibitora) naspram normalizovanog odgovora - analiza promenljive kosine, a vrednosti površine ispod krive (AUC) izračunate su primenom analize površine ispod krive u programu GraphPad Prism 7.03. Slično tome, za analizu apoptoze, procenat apoptoze izazvane lekom izračunat je za sve doze kombinovanjem „rane“ (pozitivne na aneksin V i negativne na 7-AAD) i „kasne“ apoptoze (pozitivne na aneksin V i 7-AAD) i oduzimanjem osnovnih vrednosti (ćelije tretirane DMSO kontrolom). AUC vrednosti za krive apoptoze izračunate su primenom analize površine ispod krive u programu GraphPad Prism 7.03. Površina ispod krive doza-odgovor (AUC) izračunata je jer integriše potentnost i efikasnost lekova u jedan parametar koji predstavlja apoptozu. Vrednosti IC50za jedinjenje 2 i pomalidomid u analizama protočne citometrije prikazane su u tabeli 9. U tabeli 10 prikazana je površina ispod krivih doza-odgovor (AUC) koja upoređuje aktivnost jedinjenja 2 i pomalidomida korišćenjem analize protočne citometrije u panelu ćelijskih linija multiplog mijeloma (MM).

Tabela 7: Ćelijske linije multiplog mijeloma

11

11

11

Tabela 8: Onkogeni pokretači, hromozomske translokacije i p53 mutacije pronađene u panelu višestrukih ćelijskih linija mijeloma

11

12

[0312] Rezultati. Antiproliferativna aktivnost Jedinjenja 2 procenjena je preko panela reprezentativnih MM ćelijskih linija koje poseduju zajedničke onkogene mutacije i hromozomske translokacije (tabela 8), uključujući one koje se smatraju visokorizičnim translokacijama ili mutacijama pronađenim kod MM pacijenata (Johnson, et al. Int JHematol. (2011);94:321-333; Zhou, et al. Leukemia (2009);23:1941-1956; Terpos, et al. Leuk Lymphoma (2006);47:803-814; Tonon, Hematol Oncol Clin North Am. (2007);21:985-1006). Krive koncentracija-odgovor dobijene su korišćenjem protočne citometrije za merenje broja živih ćelija kako bi se pokazala antiproliferativna aktivnost Jedinjenja 2 u poređenju sa pomalidomidom. IC50vrednosti za Jedinjenje 2 i pomalidomid prikazane su u Tabeli 9.

Tabela 9: Antiproliferativna aktivnost Jedinjenja 2 u ćelijskim linijama multiplog mijeloma

[0313] Indukcioni efekat apoptoze Jedinjenja 2 procenjen je korišćenjem protočne citometrije nakon 120 sati lečenja i upoređen sa tretmanom pomalidomidom. Procenat kontrole je izračunat normalizacijom na DMSO kontrolu (100% kontrole) kako bi se generisale krive odgovora na dozu i izračunala površina ispod tih krivih (AUC). Prijavljena AUC vrednost odgovara površini ispod krive odgovora na dozu, pri čemu vrednosti od 10000 odgovaraju potpunoj indukciji apoptoze pri svim dozama, a vrednosti od 0 odgovaraju odsustvu indukcije apoptoze. Svaka tačka podataka predstavlja 2 nezavisna eksperimenta sa najmanje dva uzorka u svakom eksperimentu. (tabela 10).

12

Tabela 10: Apoptoza izazvana Jedinjenjem 2 u ćelijskim linijama multiplog mijeloma

[0314] Zaključak. Jedinjenje 2 je bilo široko aktivno u većini MM ćelijskih linija i razlikovalo se od pomalidomida pokazujući snažnu aktivnost u ćelijskim linijama koje imaju srednju osetljivost na pomalidomid i u ćelijskim linijama koje su rezistentne na pomalidomid. Jedinjenje 2 je bilo široko aktivno u ovom opsegu MM ćelijskih linija sa različitim statusom p53, onkogenim pokretačima ili hromozomskim translokacijama. Na primer, OPM2, LP-1, EJM, U266 i RPMI-8226 ćelije imaju mutirani p53 i bile su osetljive na Jedinjenje 2. Pored toga, NCI-H929, KMS-11, KMS 34, OPM2 i LP-1 ćelijske linije sadrže t(4;14) „visokorizičnu” MM hromozomsku translokaciju i bile su osetljive na Jedinjenje 2 SK-MM-2 i EJM ćelije su takođe bile osetljive na Jedinjenje 2 i sadrže još jednu „visokorizičnu” MM hromozomsku translokaciju, t(14;20). (Slika 5) Sposobnost Jedinjenja 2 da izazove apoptozu nakon kratkog, definisanog izlaganja može omogućiti postizanje kontrole bolesti korišćenjem intenzivnih, isprekidanih rasporeda. Takvi rasporedi bi mogli poboljšati terapijski indeks smanjenjem

12

potencijala Jedinjenja 2 za izazivanje citopenija koje se javljaju kod kontinuiranijih režima doziranja trenutnih jedinjenja za lečenje MM.

Primer 9: Jedinjenje 2 ima aktivnost u više ćelijskih linija mijeloma koje su stekle rezistentnost na lenalidomid ili pomalidomid

[0315] Aktivnost Jedinjenja 2 je testirana u ćelijama koje su stekle rezistentnost na lenalidomid ili pomalidomid zbog kontinuirane izloženosti bilo kom jedinjenju i, u tom procesu, stekle su smanjene nivoe cereblona (tabela 11). Ćelije su tretirane 5 dana, a zatim procenjene pomoću testa za određivanja ATP (CellTiter-Glo). Procenat kontrole je izračunat oduzimanjem pozadine i normalizacijom na DMSO kontrolu (100% kontrole). Relativni procenat cereblona u ćelijskim linijama sa stečenom rezistencijom na lenalidomid ili pomalidomid određen je metodom Western blot i prikazan je, sa količinom u matičnim ćelijskim linijama koja je označena kao 100%.

[0316] Rezultati. Slika 6 prikazuje IC50s krivih odgovora na koncentraciju upoređujući aktivnost Jedinjenja 2 i pomalidomida, za merenje proliferacije u matičnim linijama (DF15, NCI-H929 i OPM2), ćelijskoj liniji rezistentnoj na lenalidomid (NCI-H929-1051) ili pet ćelijskih linija rezistentnih na pomalidomid (NCI-H929-P01, OPM2-P01, OPM2-P1, OPM2-P10 i DF15R)

Tabela 11: Jedinjenje i koncentracija jedinjenja koje se koristi za razvoj rezistencije na lekove u ćelijskim linijama multiplog mijeloma i sticanje promena u ekspresiji cereblonskih proteina

12

[0317] Zaključak: Najupečatljiviji efekat Jedinjenja 2 bila je široka i snažna antiproliferativna aktivnost preko MM ćelijskih linija, ali ne i na netumorske ćelije. Jedinjenje 2 ima snažnu antiproliferativnu aktivnost u MM ćelijskim linijama koje sadrže translokacije visokog rizika, kao što su t(4; 14), t(14;16) i druge. U poređenju sa lenalidomidom i pomalidomidom, Jedinjenje 2 je značajno potentnije u ubijanju većine MM ćelijskih linija. Štaviše, Jedinjenje 2 je izazvalo apoptozu, merenu indukcijom aktivnosti kaspaze-3, u MM ćelijskim linijama koje su stekle rezistentnost na lenalidomid i pomalidomid.

Primer 10: Ex Vivo efekat Jedinjenja 2 na sazrevanje mijeloidnih progenitora na odrasle neutrofile

12

[0318] Metode: Za istraživanje sazrevanja ex vivo specifičnog za neutrofile korišćene su ex vivo kulture CD34<+>ćelija koštane srži (BM) zdravih donora (HD). In vitro diferencijacija neutrofilnih progenitora indukovana je dodavanjem faktora matičnih ćelija (SCF), liganda tirozin kinaze 3 povezanog sa FMS (Flt3-L) i faktora stimulacije kolonije granulocita (G-CSF) u medijum kulture. Diferencijacija ćelija je procenjena protočnom citometrijom kao procenat ćelija u 5 subpopulacija: hematopoetske matične ćelije (HSC, CD34<+>/CD33<->/CD11b-) i stadijum I (CD34<+>/CD33<+>/CD11b-), stadijum II (CD34-/CD33<+>/CD11b-), stadijum III (CD34-/CD33<+>/ CD11b<+>) i stadijum IV (CD34-/CD33-/CD11b<+>) (od nezrelosti do zrelosti), kao što je prikazano na slici 7. Procenjeni su efekti Jedinjenja 2 na sazrevanje neutrofilnih progenitora i procenjeni su različiti rasporedi doziranja kako bi se dobio uvid u zavisnost ovih događaja od rasporeda.

[0319] Rezultati. Kratke dnevne izloženosti Jedinjenja 2. Efekti različitih perioda izlaganja (2, 4 i 6 sati) na 1, 10 i 100 nM Jedinjenja 2 tokom najviše 3 uzastopna dana na sazrevanje neutrofilnih progenitora procenjeni su u unapred određenim vremenskim tačkama korišćenjem protočne citometrije. Rezultati su pokazali da je sazrevanje neutrofilnih progenitora u kasnoj fazi blokirano Jedinjenjem 2, pri čemu je broj zrelih ćelija značajno smanjen pri višim koncentracijama nakon jednog ili više dana izlaganja. Čini se da se zastoj sazrevanja javlja prvenstveno u stadijumu III razvoja neutrofilnih progenitora, što dokazuje akumulacija ćelija sa ćelijskim površinskim imunofenotipom stadijuma III i smanjenje populacije ćelija sa ćelijskim površinskim imunofenotipom stadijuma IV (zreli neutrofili). Kao što je prikazano na slici 8, u primeru 6-satne inkubacije, ovaj efekat sazrevanja zavisio je od koncentracije i povećavao se sa brojem dana izlaganja, ali nije bio promenjen trajanjem (2, 4 ili 6 sati) pojedinačnih izlaganja. Važno je da nije bilo uticaja na vijabilnost neutrofilnih progenitora i zrelih neutrofila izloženih Jedinjenju 2, što je dokazano odsustvom bilo kakvog detektabilnog povećanja udela ćelija pozitivnih na aneksin V ili 7-aminoaktinomicin D, koji se akumulira u mrtvim ćelijama.

[0320] Oporavak zrelih neutrofila nakon izlaganja Jedinjenju 2 takođe je procenjen u sistemu. Oporavak zrelih nivoa neutrofila na najmanje 50% netretiranog kontrolnog nivoa u sistemu analize koji se koristi u ovoj studiji u korelaciji je sa odsustvom indukcije ili oporavka od klinički značajne neutropenije. Zaista, nakon perioda od jedne nedelje bez Jedinjenja 2, udeo ćelija stadijuma IV oporavio se za najmanje 50% od najniže vrednosti (slika 8, donji paneli), sa tendencijom ka bržem i potpunijem oporavku pri nižim koncentracijama.

12

[0321] Zaključak: Rezultati ukazuju na to da uspešno lečenje neutropenije kod pacijenata sa MM tretiranih Jedinjenjem 2 može biti moguće uz upotrebu odgovarajućih rasporeda doziranja.

[0322] Duže dnevne izloženosti Jedinjenju 2. Da bi se dodatno okarakterisali potencijalni uticaji različitih rasporeda na zaustavljanje sazrevanja progenitora neutrofila i naknadnog oporavka, promene u relativnim proporcijama svake od gore pomenutih faza sazrevanja progenitora mijeloida na odrasle neutrofile procenjene su protočnom citometrijom nakon 3 ili 5 uzastopnih dana izlaganja Jedinjenju 2 od 1, 10 ili 100 nM tokom 6 ili 24 sata svakog dana. CD34<+>BM ćelije dobijene od zdravih donora bile su izložene Jedinjenju 23 ili 5 uzastopnih dana počev od 10. dana tokom 6 sati (donori br.1 i 2) ili 24 sata (donori br.3 i 4) svakog dana. Nakon završetka konačnog izlaganja, ćelije su isprane i ponovo inkubirane u odsustvu Jedinjenja 2 do 22. dana. I 6- i 24-satno izlaganje Jedinjenju 2 tokom 3 ili 5 uzastopnih dana rezultiralo je nakupljanjem populacije neutrofila stadijuma III sa odgovarajućim smanjenjem populacije stadijuma IV, u skladu sa blokom sazrevanja od stadijuma III do stadijuma IV. Kao što je prikazano na slici 9 i slici 10, u primerima za 6-satno izlaganje tokom 3 i 5 dana, tempo oporavka od zastoja u sazrevanju bio je zavisan od koncentracije i pod uticajem broja dnevnih izlaganja, produžen je pri višim koncentracijama Jedinjenja 2 i nakon 5 naspram 3 dana izlaganja, ali promena trajanja (6 naspram 24 sata) dnevnih izlaganja imala je mali uticaj na očigledan tempo oporavka.

[0323] Nakon izlaganja Jedinjenju 2 tokom 3 uzastopna dana, primećen je 50% ili veći oporavak normalnog sazrevanja nakon perioda bez leka od 8 do 10 dana, u svim ispitivanim uslovima (slika 10, desni panel). Nasuprot tome, nakon izlaganja Jedinjenju 2 tokom 5 uzastopnih dana, primećen je 50% ili veći oporavak normalnog sazrevanja nakon perioda bez leka od 8 do 10 dana, ali samo za koncentracije od 1 i 10 nM. Sa najvećom koncentracijom Jedinjenja 2 (100 nM), može biti potreban duži period bez lekova za oporavak sazrevanja neutrofilnih progenitora. Međutim, uprkos ovom nepotpunom oporavku sazrevanja, nije primećen gubitak održivosti ni u jednom od testiranih uslova, uključujući kontinuirano (24-satno) izlaganje do 5 dana. Ovo zapažanje je u suprotnosti sa indukcijom apoptoze u ćelijama mijeloma, koja je optimizovana kontinuiranim izlaganjem Jedinjenju 2 duže od 6 sati.

[0324] Tokom 6 do 8 dana nakon poslednjeg izlaganja u 5-dnevnom rasporedu, primećene su početne faze oporavka stadijuma IV (zreli neutrofili) nakon izlaganja Jedinjenju 2 samo pri koncentraciji od 10 nM, dok u ovom vremenskom okviru nije primećen oporavak u kulturama

12

izloženim Jedinjenju 2 od 100 nM tokom 5 dana. Ovi podaci ukazuju na to da izlaganje višim koncentracijama Jedinjenja 2 tokom sve većeg broja uzastopnih dana nagoveštava dugotrajnije sazrevanje prekursora neutrofila (i neutropenije) i da je tempo oporavka nezavisan od trajanja (6 naspram 24 sata) dnevnih izlaganja.

[0325] Zaključak: Uzeto zajedno, podaci ukazuju na to da intenzivnije doziranje Jedinjenja 2 (višestruke doze dnevno) ne može negativno uticati na indukciju i oporavak od neutropenije kod pacijenata u poređenju sa doziranjem jednom dnevno.

Primer 11: Efekat deksametazona na in vitro sazrevanje neutrofilnih progenitora kao jedinog agensa i u kombinaciji sa Jedinjenjem 2

[0326] Metode. Da bi se razumeli efekti deksametazona na neutropeniju, in vitro kulture BM CD34<+>ćelija zdravih donora korišćene su za procenu neutropenijskih događaja posredovanih deksametazonom kao jedinim agensom i u kombinaciji sa Jedinjenjem 2. Da bi se definisali efekti monoterapije deksametazonom u ovom modelu, izloženost deksametazonu od 1, 10 ili 100 nM održavala se 30 sati upoređujući 7 različitih rasporeda doziranja (slika 11). Za kombinovane studije, Jedinjenje 2 sa jednokratnom izloženošću (1, 10 ili 100 nM) i deksametazon su održavani 6 odnosno 30 sati, počev od 13. dana kulture.

[0327] Rezultati. Rezultati su pokazali da izlaganje deksametazonu kao jedinom agensu po bilo kom testiranom rasporedu nije uticalo na sazrevanje neutrofilnih progenitora, dok je sazrevanje prekursora neutrofila u kasnoj fazi blokirano Jedinjenjem 2 (slika 12), pri čemu je broj zrelih ćelija smanjen pri svim testiranim koncentracijama nakon jednog izlaganja. Ovaj zastoj sazrevanja je takođe primećen kada je Jedinjenje 2 kombinovano sa deksametazonom. Blok sazrevanja je zavisio od koncentracije Jedinjenja 2, ali nije promenjen promenom koncentracije deksametazona. Deksametazon ili Jedinjenje 2, pojedinačno ili u kombinaciji, nisu uticali na održivost nezrelih i zrelih neutrofila. Nakon ispiranja leka, primećen je potpuni oporavak normalnog sazrevanja u svim ispitivanim uslovima nakon jednonedeljnog perioda bez leka.

1

[0328] Zaključak. Ovi podaci ukazuju na to da neutropenija izazvana Jedinjenjem 2 može biti podložna upravljanju modifikovanjem rasporeda doziranja, ali se predviđa da neće biti ublažena niti pogoršana istovremenim lečenjem deksametazonom.

Primer 12: Efekat Jedinjenja 2 samog i u kombinaciji sa deksametazonom na multipli mijelom rezistentan na lenalidomid.

[0329] Metode: Deksametazon je procenjen zbog svoje sposobnosti da izazove apoptozu kao jedini agens ili u kombinaciji sa Jedinjenjem 2, pomalidomidom ili lenalidomidom. Indukcija apoptoze merena je korišćenjem Caspase-Glo u ćelijama multiplog mijeloma rezistentnim na lenalidomid (H929-1051). Deksametazon je doziran u 20 koncentracija, pomoću akustičnog dozatora. Testni proizvodi su dodati kao pojedinačne koncentracije u bunarčiće deksametazona pomoću digitalnog dozatora Hewlett-Packard D300. Konačne koncentracije jedinjenja za test bile su: deksametazon (0,8 µM do 0,00002 µM), lenalidomid (1 µM), pomalidomid (0,1 µM) i Jedinjenje 2 (0,001, 0,01 ili 0,1 µM). Ćelije su raspoređene u test ploče pomoću Multidrop dozatora i napravljene su duplikati ploča za test. Procenat apoptoze meren je 72 sata nakon tretmana jedinjenjem korišćenjem Caspase-Glo 3/7 i CellTiter-Glo testova. Caspase-Glo 3/7 luminiscencija je normalizovana na CellTiter-Glo luminiscenciju kako bi se uzele u obzir razlike u broju ćelija. Fold promena tretiranog uzorka izračunata je na sledeći način: normalizovana kaspaza tretiranog uzorka/prosek normalizovane DMSO kontrole.

[0330] Rezultati: Aktivnost apoptoze deksametazona pojedinačno ili u kombinaciji sa lenalidomidom, pomalidomidom ili Jedinjenjem 2 merena je indukcijom kaspaze-3. Jedinjenje 2 je sinergovano sa deksametazonom kako bi se smanjila vijabilnost ćelija i potencirala apoptotička sposobnost deksametazona na način koji zavisi od koncentracije. Početak aktivnosti deksametazona je pomeren za 1 log u prisustvu Jedinjenja 2.

[0331] Zaključak: Jedinjenje 2 potencira apoptotičku aktivnost deksametazona ukazujući na potencijal za smanjenje doze deksametazona kada se koristi u kombinaciji sa Jedinjenjem 2 u klinici.

[0332] Kao što je prikazano na slici 13, dramatična dvosmerna sinergija se primećuje nakon tretmana Jedinjenjem 2 u kombinaciji sa deksametazonom. Čak i 10 nM deksametazona

1 1

poboljšava sposobnost ubijanja ćelija Jedinjenja 2, dok niske do subnanomolarne koncentracije Jedinjenja 2 pojačavaju apoptotske efekte deksametazona.

Primer 13: Jedinjenje 2 poboljšava antitumorsku aktivnost imunih ćelija zdravih ljudskih donora

[0333] Eksperimenti kokulture sa mononuklearnim ćelijama periferne krvi i K562 ćelijama. Metode: Priprema mononuklearnih ćelija ljudske periferne krvi (PBMC): PBMC izolovani od zdravih donora kultivisani su u RPMI 1640 medijumu sa 10% FBS pri gustini od 1 × 10<6>ćelija/ml.

[0334] Ćelijska kultura: K562 ćelije su održavane u log fazi, a gustina i vijabilnost ćelija su praćene isključenjem tripan plavog korišćenjem Vi-CELL<®>XR analizatora vijabilnosti ćelija (Beckman Coulter, Brea, CA).

[0335] Test procedure: Sveže izolovani ljudski PBMC kultivisani su rekombinantnim IL-2 u koncentraciji od 20 jedinica/ml tokom 72 sata. Mononuklearne ćelije periferne krvi su zatim centrifugirane i ponovo suspendovane u svežem RPMI kompletnom medijumu na 2×10<6>ćelija/ml. Ćelije su zatim tretirane sa DMSO ili jedinjenjima u naznačenim koncentracijama i inkubirane dodatna 72 sata. PBMC su zatim dva puta isprani u svežem RPMI kompletnom medijumu pre kokulture. K562 ćelije su ponovo suspendovane na gustinu ćelija od 1 × 10<6>//ml i označene sa 1 µM CellTrace CFSE u skladu sa uputstvima proizvođača. Označene ćelije K562 su zatim zasejane u ploču sa okruglim dnom sa 96 bunarčića na 1 × 10<5>ćelija/bunarčić. Mononuklearne ćelije periferne krvi su zatim prebačene u istu ploču sa 96 bunarčića u odnosu 1:15, u tri primerka i inkubirane na 37°C tokom 4 sata. Specifična liza ciljnih ćelija od strane PBMC ćelija merena je korišćenjem aneksin V-fluorescein izotiocijanata (FITC) i propidijum jodida (PI) prema uputstvima proizvođača, a uzorci su sprovedeni na FACS Array skeniranju. Neoznačene K562 ćelije, CellTrace CFSE označene K562 ćelije i aneksin V-FITC- i PI označene neobrađene K562 ćelije uključene su u svaki test kao kontrole.

[0336] Testovi kokulture sa mononuklearnim ćelijama ljudske periferne krvi tretiranim jedinjenjem i netretiranim linijama ćelija mijeloma. Metode: Ćelijska kultura. Sve ćelijske

1 2

linije mijeloma su održavane u log fazi, a gustina i vijabilnost ćelija su praćene isključenjem pomoću Vi-CELL XR analizatora vijabilnosti ćelija.

[0337] Test procedura PBMC tretmana. Posude sa devedeset šest bunarčića je prethodno obloženo anti-CD3 antitelima (OKT3, 3 µg/ml) i inkubirano na 4 °C preko noći pre početka eksperimenta. Smrznute ćelije donora PBMC su odmrzavane na 37°C tokom 2 minuta u RPMI medijumu sa 10% FBS, a broj ćelija i održivost su izmereni na Vi-CELL<®>analizatoru (Beckman Coulter). Mononuklearne ćelije periferne krvi su isprane i razblažene do 1 × 10<6>ćelija/ml i raspoređene na ploče tretirane jedinjenjem u ukupnoj zapremini od 200 µL. Ćelije su inkubirane jedinjenjima 2 sata pre nego što su prebačene na ploče obložene anti-CD3 i inkubirane dodatnih 72 sata na 37°C. Nakon 72 h, PBMC su centrifugirani, a ćelije su isprane dva puta u RPMI medijumu 10% FBS. Netretirane MM ćelijske linije (H929 i H929-1051) označene su CellTrace CFSE prema uputstvima proizvođača i ponovo suspendovane u ukupnoj koncentraciji od 0,1×10<6>ćelija/ml u ploču sa U dnom sa 96 bunarčića u ukupnoj zapremini od 100 µL. Mononuklearne ćelije periferne krvi su prebrojane i dodate MM ćelijama u odnosu cilj:efektor (T:E) od 1:5. Nakon 24 sata kokulture, specifična liza ciljnih ćelija od strane PBMC merena je korišćenjem aneksina V-AF647 i 7-AAD prema uputstvima proizvođača, a uzorci su analizirani na Attune NxT citometru (Thermo Fisher).

[0338] Test procedura tretmana PBMC i MM ćelija. Posude sa devedeset šest bunarčića je prethodno obloženo anti-CD3 antitelima (OKT3, 3 µg/ml) i inkubirano na 4 °C preko noći pre početka eksperimenta. Smrznute ćelije donora PBMC odmrzavane su na 37°C tokom 2 minuta u RPMI medijumu sa 10% FBS, a broj ćelija i vijabilnost mereni su na Vi-CELL analizatoru. Mononuklearne ćelije periferne krvi su isprane i razblažene do 1×10<6>ćelija/ml i raspoređene na ploče tretirane jedinjenjem u ukupnoj zapremini od 200 µL. Ćelije su inkubirane jedinjenjima 2 sata pre nego što su prebačene na ploče obložene anti-CD3 i inkubirane dodatnih 72 sata. Istovremeno, MM ćelijske linije (NCI-H929, H929-1051, OPM2, OPM2-P10) su razblažene do konačne koncentracije od 0,1 × 10<6>ćelija/ml i označene sa CellTrace CFSE prema uputstvima proizvođača. Ćelijske linije multiplog mijeloma su zatim raspoređene u ploče tretirane jedinjenjem u ukupnoj zapremini od 200 µL i inkubirane 72 sata. Nakon 72 sata, PBMC i MM ćelije su prebrojane i prebačene u ploču sa U dnom sa 96 bunarčića pri konačnom odnosu T:E od 1:5 Nakon 24 sata kokulture, specifična liza ciljnih ćelija od strane PBMC ćelija merena je korišćenjem aneksina V-AF647 i 7-AAD prema uputstvima proizvođača, a uzorci su analizirani na Attune NxT citometru.

1

[0339] Rezultati. Model kokulture je korišćen za određivanje direktnih efekata Jedinjenja 2 na antitumorsku aktivnost PBMC uzetih od zdravih donora. Tretman Jedinjenjem 2 IL-2 aktiviranih PBMC izazvao je ubijanje netretiranih K562 ćelija na način zavistan od koncentracije (slika 14, desni panel). PBMC tretirani jedinjenjem 2 (IC50= 5,9 pM) bili su ~600 puta jači od PBMC tretiranih pomalidomidom (POM; IC50= 0,004 µM) i -2600 puta jači od PBMC tretiranih lenalidomidom (LEN; IC50= 0,02 µM) u postizanju 50% direktnog ubijanja ćelija K562. Iako je Jedinjenje 2 bilo potentnije od lenalidomida i pomalidomida, jačina odgovora bila je slična među jedinjenjima (slika 14, desni panel).

[0340] Efekti Jedinjenja 2 na anti-MM ćelijsku aktivnost PBMC inkubiranih sa Jedinjenjem 2 dalje su ispitani u ćelijskim linijama koje pokazuju fenotip rezistencije u cilju upoređivanja sa odgovorom u osetljivim ćelijama. U drugom modelu ko-kulture, PBMC donorske ćelije su prethodno tretirane Jedinjenjem 2, lenalidomidom ili pomalidomidom tokom 2 sata pre nego što su kultivisane na pločama obloženim anti-CD3 antitelima tokom 72 sata. PBMC aktivirani anti-CD3 antitelima tretirani Jedinjenjem 2 pokazali su povećanje zavisno od koncentracije u lizi tumorskih ćelija netretiranih MM ćelijskih linija osetljivih na lenalidomid (NCI-H929; IC50 = 0,005 µM) i rezistentnih na lenalidomid (H929-1051; IC50= 0,0002 µM) u sličnom stepenu (slika 15). Jedinjenje 2 je bilo potentnije od lenalidomida i pomalidomida u pogledu smanjenja procenta održivih MM ćelija. Sličan nivo ubijanja tumorskih ćelija od strane PBMC uočen je protiv tumorskih ćelija osetljivih na lenalidomid i rezistentnih na lenalidomid, što pokazuje da su PBMC pripremljeni za ubijanje tumorskih ćelija nezavisno od njihovog fenotipa rezistentnosti.

[0341] Pošto je predinkubacija imunih ćelija Jedinjenjem 2 poboljšala ciljanje i liziranje MM ćelija, takođe je istražen efekat predinkubacije MM ćelija Jedinjenjem 2 na njihovu podložnost imunološki posredovanom ubijanju (slika 16, tabela 12). Četiri MM ćelijske linije i PBMC aktivirani anti-CD3 antitelima odvojeno su predinkubirani Jedinjenjem 2, lenalidomidom ili pomalidomidom tokom 72 sata. Kada su PBMC aktivirani anti-CD3 antitelima i MM linije prethodno tretirani Jedinjenjem 2, lenalidomidom ili pomalidomidom, nakon čega je usledila ko-kultura, efekti na lizu MM ćelija indukovanu PBMC pojačani su kako u poteniciji tako i u obimu odgovora na ubijanje. Upoređujući vrednosti IC50iz pojedinačnih MM ćelijskih kultura u odnosu na imunološke i tumorske ćelijske ko-kulture, Jedinjenje 2 je poboljšalo ubijanje NCI-H929 ćelija za -7000 puta i poboljšalo je ubijanje H929-1051 ćelija za -6000 puta. Za

1 4

ćelijsku liniju OPM2-P10 rezistentnu na pomalidomid, tretman MM ćelija Jedinjenjem 2 poboljšao je imunološki posredovano ubijanje za -3000 puta (tabela 12).

Tabela 12: IImunološki posredovano ubijanje ćelija u višestrukim linijama ćelija mijeloma u pojedinačnim kulturama naspram ko-kultura

1

[0342] Zaključak: PBMC tretirani Jedinjenjem 2 izazvali su lizu tumora netretiranih K562 i MM ćelijskih linija u istoj meri kao što je viđeno sa lenalidomidom i pomalidomidom, iako sa mnogo većom potentnošću. Štaviše, ubijanje tumorskih ćelija je u velikoj meri poboljšano ako su i PBMC i MM ćelijske linije prethodno tretirane Jedinjenjem 2, što ukazuje na to da pored svojih snažnih ćelijskih autonomnih efekata, Jedinjenje 2 takođe može poboljšati imunogenost MM ćelijskih linija. Kombinacija snažnih ćelijskih-autonomnih i imunogenih efekata na MM ćelije, pored svojih imunomodulatornih svojstava, čini Jedinjenje 2 potencijalnim kandidatom za kliniku.

Primer 14: Efekat jedinjenja 2 u kombinaciji sa daratumumabom na multipli mijelom

[0343] Daratumumab, anti-CD38 antitelo odobreno za lečenje multiplog mijeloma, vrši svoju aktivnost protiv mijeloma putem ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), ćelijske fagocitoze zavisne od antitela (ADCP) i citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC). Efekat Jedinjenja 2 ili pomalidomida u kombinaciji sa daratumumabom procenjen je u MM ćelijskim linijama.

[0344] ADCC test: Efekat Jedinjenja 2 ili pomalidomida na ADCC posredovan daratumumabom procenjen je in vitro protočnom citometrijom u panelu MM ćelijskih linija. NK ćelije su kultivisane preko noći u NK medijumu kulture koji sadrži 10 U/ml rekombinantnog humanog IL-2 pre početka testa. NK ćelije su isprane i ponovo suspendovane u NK ćelijski medijum na 3,75 × 10<6>ćelija/ml. MM ćelije su prethodno tretirane subletalnim

1

koncentracijama Jedinjenja 2 ili pomalidomida tokom 72 sata pre upotrebe u ADCC testu. MM ćelije su isprane i označene Tag-it Violet<™>bojom za proliferaciju i praćenje ćelija u skladu sa uputstvima proizvođača, nakon čega je usledila ponovna suspenzija u medijum NK kulture u koncentraciji od 0,75 × 10<6>ćelija/ml. ADCC test je izveden u tri ponavljanja sa odnosom efektora i tumora od 10:1 na ploči sa 96 bunarčića. MM ćelije (10 µL) su pomešane sa 10 µL 2x koncentracije daratumumaba u bunarčićima pre dodavanja 20 µL NK ćelija. Kokulture su inkubirane na 37°C tokom 3 sata, nakon čega je dodato 50 µL rastvora 7-AAD na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. Analiza je urađena na protočnom citometru BD Celesta.

[0345] ADCP test: Efekat Jedinjenja 2 ili pomalidomida na ADCP posredovan daratumumabom utvrđen je u panelu MM ćelijskih linija. Monociti su postavljeni u ploču sa 96 bunarčića sa 40.000 ćelija po bunarčiću u zapremini od 100 µL kompletnog AIM-V medija koji sadrži 50 ng/ml M-CSF. Ćelije su ostavljene da se talože na ploči 15 minuta na sobnoj temperaturi pre nego što su stavljene u inkubator od 37 °C, 5% CO2na 9 dana kako bi se omogućila diferencijacija u makrofage. Medijumi za kulturu su dopunjavani svežim kompletnim medijima svaka 3-4 dana. Na jutro ADCP testa, makrofagi su izgladnjivani u serumu 2-4 sata na 37°C, 5% CO2pre ko-kultivacije sa MM ćelijama. MM ćelije su prethodno tretirane subletalnim koncentracijama Jedinjenja 2 ili pomalidomida tokom 72 sata. Na dan testa, MM ćelije su isprane sa PBS i označene sa CSFE tokom 15 minuta. Reakcija je zaustavljena sa jednakom zapreminom od 20% FBS. Ćelije su isprane dva puta sa PBS i ponovo suspendovane u AIM-V medijumu na 1,6 × 10<6>ćelija/ml. Zatim je 50 µL MM ćelija pomešano sa 50 µL 2 µg/ml daratumumaba tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi pre dodavanja izgladnelim makrofagima u serum. Svako stanje je testirano u tri ponavljanja. Konačna zapremina testa bila je 200 µL koja sadrži 10% ljudskog seruma sa efektorom u odnosu na ciljni odnos 2:1. Ploča je centrifugirana na 500 o/min tokom 1 minuta, a zatim inkubirana na 37 °C, 5% CO2tokom 3 sata. Na kraju inkubacije, ploča je isprana sa 100 µL PBS, a preostale ćelije su označene anti-CD14 i anti-CD138 antitelima kako bi se identifikovali makrofagi i ćelije multiplog mijeloma, respektivno. Ploča je isprana i bunarčići napunjeni sa 100 µL PBS. Makrofagi su odvojeni od dna bunarčića sa dodatkom 50 µL 0,25% tripsina. Uzorci su neutralizovani sa dodatkom 50 µL kompletnog AIM-V medija. Uzorci su analizirani na protočnom citometru. Procenat fagocitoze određen je dvostruko pozitivnim ćelijama CSFE/CD14 podeljenim sa ukupnim brojem CD14+ ćelija puta 100.

1

[0346] Rezultati: Tretman MM ćelija Jedinjenjem 2 i pomalidomidom rezultiralo je povećanjem ekspresije CD38 u zavisnosti od doze (slika 17). Obim ekspresije CD38 bio je veći kod Jedinjenja 2 i javljao se pri nižim koncentracijama u poređenju sa pomalidomidom. MM cells /- Jedinjenje 2 ili prethodni tretman pomalidomidom procenjeni su u ADCC testovima sa daratumumabom. MM ćelije tretirane Jedinjenjem 2 pokazale su veći stepen lize tumora sa daratumumabom u poređenju sa netretiranim ćelijama (slika 18). Ćelije tretirane Jedinjenjem 2 takođe su bile osetljivije na ADCC posredovan daratumumabom u poređenju sa ćelijama tretiranim pomalidomidom. Testirana je i sposobnost Jedinjenja 2 i pomalidomida da moduliraju ADCP posredovan daratumumabom. MM ćelije tretirane Jedinjenjem 2 bile su osetljivije na ADCP posredovan daratumumabom u poređenju sa netretiranim ćelijama i ćelijama tretiranim pomalidomidom (slika 19). Samo jedna testirana ćelijska linija, ARH-77, nije pokazala poboljšani ADCP sa Jedinjenjem 2 ili pomalidomidom, ali je pokazala poboljšani ADCC sa Jedinjenjem 2.

[0347] Zaključak: Jedinjenje 2 pojačava ekspresiju CD38 u MM ćelijama, što rezultira povećanim ADCC i ADCP posredovanim daratumumabom u poređenju sa pomalidomidom ili netretiranim ćelijama Ovi podaci ukazuju na to da kombinovanje daratumumaba sa Jedinjenjem 2 može biti efikasnije u lečenju MM u poređenju sa kombinacijom samo pomalidomida ili daratumumaba.

Primer 15: Efekat Jedinjenja 2 u kombinaciji sa inhibitorima proteasoma na multipli mijelom

[0348] Dvadeset četiri sata pre tretmana inhibitorom proteasoma i testnim jedinjenjem, odgovarajući broj ćelija je podeljen na koncentraciju od 0,2×10<6>/ml u svežem medijumu kako bi se omogućio eksponencijalni rast. Na dan tretmana, jedinjenja su sveže rastvorena u DMSO. Inhibitori proteasoma bortezomib ili karfilzomib su razblaženi i dodati u prethodno zagrejane podloge za kulturu u konačnim radnim koncentracijama od 150 nM ili 300 nM za bortezomib i 300 nM ili 550 nM za karfilzomib. Koncentracije inhibitora proteasoma određene su na osnovu kliničkih koncentracija Cmax, kao i prethodnih studija u svakoj ćelijskoj liniji koje su odredile trajanje i koncentraciju PI potrebnih za inhibiciju određene količine aktivnosti β5 proteasoma. Ćelije su prebrojane i odgovarajući broj je stavljen u medijum koji sadrži inhibitor proteasoma i temeljno pomešan. Nakon inkubacije u trajanju od 1 sata na 37°C, 5% CO2, ćelije su isprane dva puta sa 40 ml kompletnog medija da bi se uklonio inhibitor proteasoma. Alikvoti

1

svakog tretmana proteasomom su testirani kako bi se potvrdio obim inhibicije β5, β2 i β1 podjedinice. Ćelije su ponovo suspendovane na 0,1×10<6>/ml i postavljene na 100 µL/bunarčić u sveže posuđe za kulturu koje sadrži trostruke titracije Jedinjenja 2 ili pomalidomida. Zasađene ćelije su kultivisane na 37 °C, 5% CO2, tokom ostatka eksperimenta, do 72 sata. Svakih 24 sata, inhibicija proteasoma je praćena uz pomoć testa Proteasome-Glo na bazi ćelija. Proliferacija i apoptoza su merene na 72 h protočnom citometrijom. Ćelije su obojene sa APC aneksin-V i 7-AAD da bi se naveo broj živih ćelija preostalih u kulturi.

[0349] Rezultati. Uspostavljen je in vitro ćelijski test kako bi se imitirala klinička farmakokinetika (PK) i farmakodinamika (PD) izloženosti inhibitorima proteasoma bortezomibu i karfilzomibu. Model koristi kratko izlaganje inhibitoru proteasoma praćeno temeljnim ispiranjem jedinjenja kako bi se dozirale ćelije sa klinički relevantnim koncentracijama inhibitora proteasoma, uz postizanje brzog klirensa uočenog in vivo. Štaviše, uporediv nivo inhibicije β5 proteasoma može se postići u svim ćelijskim linijama. Ovaj model je korišćen za procenu kombinovanih efekata Jedinjenja 2 u kombinaciji sa bortezomibom ili karfilzomibom u panelu ćelijskih linija multiplog mijeloma i leukemije plazma ćelija (OPM2.P10, RPMI.8226 rezistentne na pomalidomid, i linije leukemije plazma ćelija L363 i JJN-3).

[0350] Bortezomib i Jedinjenje 2 pokazali su kombinovani efekat u obe testirane MM linije, OPM2.P10 i RPMI.8226, kao i u jednoj od ćelijskih linija leukemije plazma ćelija, JJN-3. Efekti kombinacije u ćelijskoj liniji L363 nisu mogli biti procenjeni, jer bortezomib nije imao aktivnost pojedinačnog agensa na vijabilnost ćelija u uslovima ovog in vitro testa (slika 20 i slika 21A).

[0351] Iako su tretmani karfilzomibom između eksperimenata bili promenljivi u procentu ubijanja ćelija koje su postigli tokom 1 h tretmana, kombinovani efekti sa Jedinjenjem 2 su prikazani u sve 4 ćelijske linije (slika 21B).

[0352] Zaključak: Iznenađujuće, Jedinjenje 2 održava svoju sposobnost za ubijanje ćelija na klinički relevantnim nivoima inhibicije proteasoma. Kombinacija Jedinjenja 2 sa bortezomibom ili karfilzomibom pokazala je povećanje apoptoze i antiproliferativne aktivnosti protiv MM ćelija.

1

Primer 16: Efekat Jedinjenja 2 u kombinaciji sa inhibitorima histonske deacetilaze, agensima za hemoterapiju, Bcl-2 inhibitorima, Mcl-1 inhibitorima, BET inhibitorima ili LSD-1 inhibitorima.

[0353] Efekat kombinovanja tretmana sa Jedinjenjem 2 i inhibitorima malih molekula sa različitim mehanizmima procenjen je u panelu MM ćelijskih linija. Trinaest inhibitora malih molekula je izabrano za studije kombinacije sa Jedinjenjem 2 na osnovu njihove pretkliničke i/ili aktivnosti protiv MM. Ćelijske linije H929-1051, KMS11, KMS-12PE, L363, OPM-P10 i RPMI8226 izabrane su za ovu studiju da predstavljaju različite grupe genetskog grupisanja preko MM ćelijskih linija. Koncentracije jedinjenja za kombinovane tretmane izabrane su u opsegu od 1 log iznad i 2 loga ispod IC50pojedinačnog agensa. Kombinovani agensi su dozirani u krivoj doza-odgovor od 6 tačaka (DRC) u razblaženju 1:3, Jedinjenje 2 je dozirano u DRC od 10 tačaka, takođe u razblaženju 1:3. Kombinovani eksperimenti su sprovedeni dva puta, svaki put sa ponovljenim podacima na odvojenim pločama. Jedinjenja su prethodno uočena u odgovarajuće bunarčiće ploče sa 384 bunarčića pomoću akustičnog raspršivača. Sve MM ćelijske linije su kultivisane u inkubatoru na 37°C sa 5% CO2koristeći naznačenu ćelijsku kulturu koja sadrži 1x penicilin-streptomicin. Ćelije su dodate jedinjenju koje sadrži ploče sa 384 bunarčića pomoću Multidrop kombinovanog dozatora reagensa i ostavljene da se inkubiraju 3 dana na 37°C sa 5% CO2. Nakon 3 dana, ćelije su procenjene za njihov nivo ATP sadržaja putem Cell Titer-Glo mereno na detektoru luminiscencije (PerkinElmer Envision).

[0354] Metoda najvišeg pojedinačnog agensa (HAS) je korišćena za otkrivanje sinergije u podacima krive odgovora na dozu. Kombinacije su analizirane iz perspektive površine odgovora. Statistički okvir (Van Der Borght, K., et al., BIGL: Biochemically Intuitive Generalized Loewe null model for prediction of the expected combined effect compatible with partial agonism and antagonism; Scientific Reports, 7 (1), 17935-1-17935-9 (2017)) je ugrađen u analizu na vrhu HAS nultog modela sa dva statistička testa: 1) Kompletna površina odgovora se razlikuje od nultog modela, 2) Pojedinačni bunarčić se razlikuje od nultog modela

[0355] Rezultati: Efekat lečenja Jedinjenjem 2 u kombinaciji sa inhibitorima malih molekula procenjen je u panelu ćelijskih linija multiplog mijeloma. Jedinjenje 2 je pregledano u kombinaciji sa 14 jedinjenja i sinergija je izračunata u svim bunarčićima za 6 ćelijskih linija. Deksametazon i etopozid su pokazali značajnu sinergiju u kombinaciji sa Jedinjenjem 2 u pet od šest testiranih ćelijskih linija (slika 22). Kombinacija Jedinjenja 2 sa BET inhibitorima (4-

14

[2-(ciklopropilmetoksi)-5-(metansulfonil)fenil]-2-metilizokinolin-1(2H)-on (Jedinjenje D), birabresib i GSK525762A) takođe je pokazala sinergističku aktivnost u MM ćelijama, sa različitim stepenima sinergije između tri inhibitora. Kombinacija Jedinjenja 2 sa AMG176 (inhibitor MCL-1) pokazala je sinergističku aktivnost u tri ćelijske linije (KMS11, KMS12-PE, L363), dok je kombinacija Jedinjenja 2 sa ACY241 i panobinostatom (inhibitori histonske deacetilaze) bila sinergistička u L363/OPM2-P10 i L363/H929-1051, respektivno. Jedinjenje 2 u kombinaciji sa 4-[2-(4-amino-piperidin-1-il)-5-(3-fluoro-4-metoksi-fenil)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-il]-2-fluoro-benzonitrilom (Jedinjenje E) bilo je sinergističko u ćelijama L363 i KMS12-PE. MIK665, inhibitor MCL-1, bio je jedino jedinjenje koje nije pokazalo značajnu sinergiju u testiranim ćelijskim linijama od 6 MM.

[0356] Zaključci: Tretman Jedinjenjem 2 u kombinaciji sa 12 od 14 malih molekula pokazao je sinergističku aktivnost u najmanje jednoj ili više testiranih MM ćelijskih linija. Kombinacija sa šest jedinjenja pokazala je sinergiju u najmanje 3 testirane MM ćelijske linije (slika 22). Ovi podaci sugerišu da kombinovano lečenje Jedinjenjem 2 sa testiranim inhibitorima malih molekula predstavlja potencijalnu paradigmu lečenja MM, uključujući neke sa sinergističkom aktivnošću.

Primer 17: In Vivo antitumorska aktivnost Jedinjenja 2 samo i u kombinaciji sa deksametazonom.

[0357] Metode: Studija ksenografta je sprovedena sa ženkama SCID miševa koje imaju NCI-H929 (H929-1051) multipli mijelom/plazmacitom tumore rezistentne na lenalidomid. Ženke SCID miševa su inokulisane potkožno ćelijama H929-1051 u predelu bokova iznad desne zadnje noge. Nakon inokulacije životinja, tumorima je dozvoljeno da narastu do približno 100 mm<3>pre randomizacije. 13. dana nakon inokulacije tumorskih ćelija, miševi koji nose H929-1051 tumore u rasponu od 79 do 157 mm<3>su objedinjeni i randomizovani u različite terapijske grupe. Jedinjenje 2 je formulisano u 2% HPMC u vodi (kao suspenzija). Deksametazon je formulisan u 0,5% CMC/0,25% Tween 80 u deionizovanoj vodi. Jedinjenje 2 (0,1 mg/kg) i deksametazon (0,5 mg/kg) su primenjeni oralno jednom dnevno tokom trajanja studije počev od 13. dana nakon inokulacije tumorskih ćelija. U grupi sa kombinacijom, životinje su primale Jedinjenje 2 (0,1 mg/kg/dan) i deksametazon (0,5 mg/kg/dan) istovremeno tokom trajanja studije počevši od 13. dana nakon inokulacije tumorskih ćelija. Tumori su mereni dva puta nedeljno koristeći kalipere, a zapremine tumora su izračunate pomoću formule W<2>× L / 2.

Statistička analiza je izvršena korišćenjem jednosmerne ili dvosmerne analize varijanse (ANOVA). Proračuni sinergije izvršeni su metodom frakcionog proizvoda.

[0358] Rezultati: Tretman Jedinjenjem 2 kao jedinim agensom značajno (p<0,01) inhibiralo (-34%) rast tumora H929-1051 multiplog mijeloma. Tretman deksametazonom kao jedinim agensom marginalno inhibiralo (-20%) rast H929-1051 ksenografta tumora. Tretman Jedinjenjem 2 u dozi od 0,1 mg/kg primenjenim u kombinaciji sa deksametazonom u dozi od 0,5 mg/kg dalo je značajno (p < 0,0001) smanjenje zapremine tumora u poređenju sa kontrolom vehikuluma, pokazujući smanjenje zapremine tumora od 84%. U dvosmernoj ANOVA sa Bonferonijevim post-testom, ova kombinovana antitumorska aktivnost bila je značajno bolja od samog Jedinjenja 2 (84% naspram 34% TVR; p < 0,0001) ili samog deksametazona (84% naspram 20% TVR; p < 0,0001). Koristeći metodu frakcionog proizvoda, utvrđeno je da je kombinovana antitumorska aktivnost Jedinjenja 2 pri 0,1 mg/kg i deksametazona pri 0,5 mg/kg sinergistička u smanjenju zapremine tumora. (Slika 23)

[0359] Zaključak: Jedinjenje 2 u kombinaciji sa deksametazonom pokazalo je sinergizam u smanjenju zapremine tumora u NCI-H929 modelu tumora multiplog mijeloma/plazmacitoma, što ukazuje na to da je kombinovani tretman Jedinjenja 2 i deksametazona pokazao sinergističku antitumorsku aktivnost u MM modelu rezistentnom na lenalidomid. Jedinjenje 2 potencira apoptotičku aktivnost deksametazona ukazujući na potencijal za smanjenje doze deksametazona kada se koristi u kombinaciji sa Jedinjenjem 2 u klinici.

Primer 18: In Vivo antitumorska aktivnost Jedinjenja 2 samo i u kombinaciji sa bortezomibom.

[0360] Metode: Studija ksenografta je sprovedena sa ženkama SCID miševa koje imaju NCI-H929 (H929-1051) multipli mijelom/plazmacitom tumore rezistentne na lenalidomid. Ženke SCID miševa su inokulisane potkožno ćelijama H929-1051 u predelu bokova iznad desne zadnje noge. Nakon inokulacije životinja, tumorima je dozvoljeno da narastu do približno 500 mm<3>pre randomizacije. 31. dana nakon inokulacije tumorskih ćelija, miševi koji nose H929-1051 tumore u rasponu od 366 do 535 mm<3>su objedinjeni i randomizovani u različite terapijske grupe. Jedinjenje 2 je formulisano u 2% HPMC u vodi (kao suspenzija). Bortezomib je formulisan u 1% DMSO u fiziološkom rastvoru (kao rastvor). Jedinjenje 2 (1 mg/kg) je primenjeno oralno jednom dnevno tokom 3 uzastopna dana počev od 31. dana nakon inokulacije tumorskih ćelija. Bortezomib (1 mg/kg) je primenjen kao pojedinačna doza intravenski 31. dana nakon inokulacije tumorskih ćelija. U kombinovanoj grupi, životinje su primale Jedinjenje 2 (1 mg/kg/dan) oralno 31-33. dana, a bortezomib je primenjen intravenski kao pojedinačna doza 31. dana. 31. dana, bortezomib je primenjen 1 sat pre prve doze Jedinjenja 2. Tumori su mereni dva puta nedeljno koristeći kalipere, a zapremine tumora su izračunate pomoću formule W<2>× L / 2. Životinje su eutanazovane kada su zapremine tumora dostigle unapred određenu krajnju tačku od približno 2000 mm<3>. Statistička analiza je sprovedena do 50. dana korišćenjem jednosmerne ili dvosmerne analize varijanse (ANOVA). Proračuni sinergije izvršeni su metodom frakcionog proizvoda.

[0361] Rezultati: Tretman Jedinjenjem 2 kao jedinim agensom kada se primenjuje jednom dnevno tokom 3 uzastopna dana (qdx3) 31-33. dana nakon inokulacije tumorskih ćelija, značajno (p<0,0001) inhibiralo (-44%) rast H929-1051 tumora multiplog mijeloma 50. dana. Tokom vremena, tumori životinja tretirani Jedinjenjem 2 (1 mg/kg) porasli su i dostigli približno 2000 mm<3>do 58. dana. Tretman bortezomibom u monoterapiji kada se primenjuje u jednoj dozi 31. dana, značajno (p<0,0001) inhibiralo (-60%) rast H929-1051 ksenografta 50. dana. Tokom vremena, tumori životinja tretirani bortezomibom (1 mg/kg) porasli su i dostigli približno 2000 mm<3>do 66. dana. Tretman Jedinjenjem 2 u dozi od 1 mg/kg (qdx3) kada se primenjuje u kombinaciji sa bortezomibom u dozi od 1 mg/kg (pojedinačna doza) dalo je značajno (p < 0,0001) smanjenje zapremine tumora u poređenju sa kontrolom vehikuluma, pokazujući smanjenje zapremine tumora od 98% do 50. dana. U dvosmernoj ANOVA sa Bonferonijevim post-testom, ova kombinovana antitumorska aktivnost bila je značajno bolja od samog Jedinjenja 2 (98% naspram 44% TVR; p < 0,0001) ili samog bortezomiba (98% naspram 60% TVR; p < 0,0001). Koristeći metodu frakcionog proizvoda, utvrđeno je da je kombinovana antitumorska aktivnost Jedinjenja 2 pri 1 mg/kg i deksametazona pri 1 mg/kg sinergistička u smanjenju zapremine tumora. Iznenađujuće, do 53. dana inokulacije tumorskih ćelija, 7 od 9 životinja tretiranih kombinacijom Jedinjenja 2 i bortezomiba postalo je slobodno od tumora i ostalo je slobodno od tumora. (Slika 24)

[0362] Zaključak: Jedinjenje 2 u kombinaciji sa bortezomibom pokazalo je sinergizam u smanjenju zapremine tumora u modelu tumora NCI-H929 rezistentnog na lenalidomid i iznenađujuće dovelo do pojave životinja bez tumora.

14

Primer 19: Klinička studija faze 1 - Relapsni i refraktorni multipli mijelom

[0363] Multicentrična, otvorena studijae faze 1 se sprovodi radi procene bezbednosti, farmakokinetike i preliminarne efikasnosti Jedinjenja 2 u kombinaciji sa deksametazonom kod subjekata sa relapsnim i refraktornim multiplim mijelomom (RRMM).

[0364] Ciljevi: Primarni cilj studije je procena farmakokinetike (PK), bezbednosti/podnošljivosti i definisanje maksimalne tolerisane doze (MTD)/preporučene doze iz Dela 2 (RP2D) Jedinjenja 2 u kombinaciji sa deksametazonom u kombinaciji sa najmanje dva rasporeda doziranja Jedinjenja 2. Sekundarni cilj je procena preliminarne efikasnosti Jedinjenja 2 u kombinaciji sa deksametazonom.

[0365] Dizajn studije: Ovo je otvorena, multicentrična, međunarodna studija faze 1 za procenu bezbednosti, PK/PD i preliminarne efikasnosti Jedinjenja 2 u kombinaciji sa deksametazonom kod subjekata sa RRMM. Svi subjekti koji ispunjavaju uslove moraju biti oni koji su doživeli neuspeh, imaju intoleranciju na dostupne terapije ili nisu kandidati za terapije koje su poznate po tome što donose kliničku korist u RRMM.

[0366] Studija se sprovodi u dva dela: Deo 1 procenjuje PK/PD i bezbednost rastućih doza Jedinjenja 2 sa istovremenom, standardnom dozom deksametazona i određuje MTD/RP2D za kombinaciju kada se primenjuje u skladu sa najmanje dva različita rasporeda doziranja. Deo 2 se sastoji od jedne ekspanzione kohorte Jedinjenja 2 na RP2D plus deksametazon za oba rasporeda doziranja. Pored procena bezbednosti, PK i PD, svi subjekti prolaze mesečne procene odgovora prema Jedinstvenim kriterijumima odgovora Međunarodne radne grupe za mijelom (IMWG) (Rajkumar et al., Consensus recommendations for the uniform reporting of clinical trials: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 1. Blood, 2011, 117(18):4691-5; Kumar et al., International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma, Lancet Oncology, 2016, 17:e328-46) i mogu nastaviti studijsku terapiju do progresije bolesti, nepodnošljive toksičnosti ili odluke lekara ili subjekta da prekine studijsku terapiju.

[0367] Studija se sprovodi u skladu sa tehničkim zahtevima Međunarodnog saveta za harmonizaciju (ICH) za registraciju lekova za ljudsku upotrebu/dobru kliničku praksu (GCP) i važećim regulatornim zahtevima.

[0368] Deo 1 (eskalacija doze): Kohorte subjekata sa RRMM primaju eskalirajuće doze Jedinjenja 2 plus fiksnu dozu deksametazona (40 mg/doza; 20 mg/doza kod subjekata ≥ 75 godina) u cilju procene njegove bezbednosti, MTD/RP2D i PK/PD profila. U Delu 1 procenjuju se najmanje dva različita rasporeda doziranja, od kojih se prvi sastoji od 10 uzastopnih dana doziranja jednom dnevno (QD), nakon čega slede 4 dana bez tretmana × 2 svakog 28-dnevnog ciklusa (u daljem tekstu: raspored 20/28). Drugi raspored se sastoji od doziranja dva puta dnevno (BID) tokom 3 uzastopna dana, nakon čega sledi 11 dana bez studijske terapije × 2 svakog ciklusa (u daljem tekstu: raspored 6/28). Kohorte početne doze primaju 0,1 mg/dan Jedinjenja 2 QD u rasporedu 20/28 i 0,2 mg BID u rasporedu 6/28. Raspodela subjekata se vrši od strane sponzora u zavisnosti od dostupnosti mesta za subjekte za jedan ili oba režima. Prebacivanje između rasporeda doziranja nije dozvoljeno. Dodatni rasporedi doziranja (npr.5 dana doziranja Jedinjenja 2 nakon čega sledi 9 dana bez tretmana × 2 ili 7 dana doziranja nakon čega sledi 7 dana bez tretmana × 2 po 28-dnevnom ciklusu) mogu se istražiti pod uslovima izmene protokola do ishoda početne bezbednosti i rezultata PK/PD u vezi sa rasporedima 20/28 i 6/28.

[0369] Za sve rasporede doziranja, ciklus 1, dani 1-28 predstavljaju period procene toksičnosti koja ograničava dozu (DLT) za potrebe određivanja MTD. Subjekti se mogu proceniti za DLT ako prime propisanu dozu Jedinjenja 2 najmanje 16 od 20 dana doziranja po rasporedu 20/28 i najmanje 5 od 6 dana doziranja (10 doza) po rasporedu 6/28 u 1. ciklusu ili dožive DLT. Subjekti koji se ne mogu proceniti za DLT se zamenjuju.

[0370] U svakom rasporedu, kohorte od tri ili više subjekata primaju Jedinjenje 2 u dozama koje se povećavaju u koracima od 100% u uzastopnim kohortama do pojave dva neželjena događaja koji su nastali tokom tretmana stadijuma 2 i koji se ne mogu jasno i neosporno pripisati stranim uzrocima. Nakon toga, povećanja doze ne smeju biti veća od 50% do pojave prvog DLT. Bajesova metodologija povećanja doze korišćenjem logističke regresije koristi se nakon pojave prvog DLT u bilo kom rasporedu doziranja, sa dodeljenom dozom Jedinjenja 2, brojem doza dnevno (QD u odnosu na BID) i brojem uzastopnih dana doziranja za svaki

14

raspored (3 u odnosu na 10) kao kovarijantama. Ciljna stopa toksičnosti za kombinaciju Jedinjenja 2 i deksametazona je 20% za sve rasporede.

[0371] Unutar-subjektna eskalacija doze nije dozvoljena tokom perioda procene DLT, međutim, u ciklusu 2 i dalje, subjekti bez dokaza o progresiji bolesti koji tolerišu dodeljenu dozu Jedinjenja 2 mogu (po nahođenju istraživača i u konsultaciji sa medicinskim nadzorom studije) eskalirati do najvišeg nivoa doze za koji se pokazalo da ga adekvatno toleriše najmanje jedna kohorta subjekata u dodeljenom rasporedu doziranja.

[0372] Deo 2 (proširenje kohorte): Po završetku Dela 1, ispitivanje proširenja Jedinjenja 2 plus deksametazona sa jednom grupom sprovodi se na 20 subjekata po rasporedu doziranja kako bi se dodatno procenila njegova bezbednost, PD i efikasnost na RP2D i rasporedu.

[0373] Nakon određivanja RP2D za Jedinjenje 2 plus deksametazon, procena bezbednosti/podnošljivosti, PK i preliminarne efikasnosti Jedinjenja 2/deksametazona u kombinaciji sa drugim agensima protiv mijeloma od interesa, npr. anti-CD38 u jednoj ili više kohorti subjekata sa različitim prethodnim istorijama lečenja i/ili prognostičkim karakteristikama, takođe se može započeti paralelno kao deo ovog protokola.

[0374] Populacija studije: Subjekti koji imaju ≥ 18 godina sa MM koji su refraktorni na svoju poslednju liniju lečenja, koji su doživeli neuspeh ili imaju intoleranciju na dostupne terapije za koje je poznato da donose kliničku korist subjekatima sa recidivirajućom i refraktornom bolešću, imaju status performansi Istočne kooperativne onkološke grupe (ECOG PS) 0-2, merljivu bolest i adekvatnu funkciju koštane srži, bubrega i srca, mogu se prijaviti za studiju. Subjekti sa istorijom alogene transplantacije, ne- ili oligosekretornim MM, leukemijom plazma ćelija ili primarnim refraktornim MM (tj. bez istorije barem manjeg odgovora na prethodni režim lečenja) su isključeni.

[0375] Kriterijumi za uključenje: Subjekti moraju da zadovolje sledeće kriterijume da bi bili uključeni u studiju:

1. Subjekt ima ≥ 18 godina u trenutku potpisivanja obrasca informisanog pristanka (ICF).

14

ubjekt mora da razume i dobrovoljno potpiše ICF pre sprovođenja bilo kakvih procena/procedura u vezi sa studijom.

ubjekt je voljan i sposoban da se pridržava rasporeda studijske posete i drugih zahteva protokola.

cena stanja performansi Istočne kooperativne onkološke grupe (ECOG) od 0, 1 ili 2.

ubjekti moraju imati dokumentovanu dijagnozu MM i merljive bolesti prilikom prijave. Merljiva bolest se definiše kao:

a. Količine M-proteina ≥ 0.5 g/dL prema sPEP ili

b. ≥ 200 mg/24 h sakupljanje urina prema uPEP ili

c. Nivoi FLC u serumu > 100 mg/l (miligrama/l) uključuju laki lanac i abnormalan odnos kapa/lambda (κ/λ) kod subjekata bez detektabilnog M-proteina u serumu ili urinu ili

d. Za subjekte sa imunoglobulinom klase A (IgA), mijelomom čija se bolest može pouzdano izmeriti samo kvantitativnim merenjem imunoglobulina, nivo IgA u serumu ≥ 0,50 g/dl.

vi subjekti moraju:

a. imati dokumentovanu progresiju bolesti na dan ili u roku od 60 dana od poslednje doze poslednje terapije za mijelom i,

b. imati neuspeh u lečenju, biti intolerantni ili ne biti inače kandidati za dostupne terapije za koje je poznato da donose kliničku korist subjekatima sa RRMM.

14

Napomena: Prethodne linije terapije moraju uključivati (najmanje) inhibitor proteasoma i cereblonski modulirajući agens koji se primenjuje pojedinačno (bilo kojim redosledom) ili zajedno.

ubjekti moraju imati sledeće laboratorijske vrednosti:

o Apsolutni broj neutrofila (ANC) ≥ 1,25 × 10<9>/l bez podrške faktora rasta tokom ≥ 7 dana ( ≥ 14 dana za pegfilgrastim).

o Hemoglobin (Hgb) ≥ 8 g/dl.

o Trombociti (plt) ≥ 75 × 10<9>/l bez transfuzije tokom ≥ 7 dana (≥ 50 × 10<9>/l za subjekte sa > 50% plazma ćelija u koštanoj srži).

o Korigovani kalcijum u serumu ≤ 13,5 mg/dl ( ≤ 3,4 mmol/l).

o 24-satni klirens kreatinina (CrCl) ≥ 45 ml/min.

o AST/SGOT i ALT/SGPT ≤ 3,0 × gornja granica normale (ULN).

o Bilirubin u serumu ≤ 1,5 × ULN.

o Mokraćna kiselina ≤ 7,5 mg/dL (446 µmol/l).

o PT/INR < 1,5 × ULN i parcijalno tromboplastinsko vreme (PTT) < 1,5 × ULN, (za subjekte koji ne primaju terapijsku antikoagulaciju).

Napomena: Subjekti koji primaju terapiju za tromboembolijski događaj koji se dogodio >3 meseca pre uključivanja su podobni sve dok su na stabilnom režimu antikoagulacije sa varfarinom, heparinom niske molekularne težine ili drugim odobrenim terapijskim antikoagulacionim režimom.

ene reproduktivne dobi (FCBP) moraju:

14

a. Imati dva negativna testa na trudnoću koje je verifikovao istraživač pre početka studijske terapije. SMora da pristane na kontinuirano testiranje na trudnoću tokom studije i nakon prekida primene Jedinjenja 2. Ovo važi čak i ako subjekt praktikuje istinsku apstinenciju* od heteroseksualnog kontakta.

b. Ili se obavezati na istinsku apstinenciju* od heteroseksualnog kontakta (koji se mora pregledati na mesečnom nivou i dokumentovati iz izvora) ili pristati na upotrebu, i biti u stanju da se pridržava, dva pouzdana oblika kontracepcije bez prekida, 28 dana pre početka primene Jedinjenja 2, tokom studijske terapije (uključujući i tokom prekida doziranja), i 28 dana nakon prekida studijske terapije.

Napomena: Žena reproduktivne dobi (FCBP) je žena koja: 1) je postigla menarhu u nekom trenutku i, 2) nije prošla histerektomiju ili bilateralnu ooforektomiju, ili 3) nije bila prirodno u postmenopauzi (amenoreja nakon terapije karcinomom ne isključuje reproduktivni potencijal) najmanje 24 uzastopna meseca (tj. imala je menstruaciju u bilo kom trenutku u prethodna 24 uzastopna meseca).

uški subjekti moraju:

a. Praktikovati istinsku apstinenciju* (koja se mora preispitivati na mesečnom nivou) ili pristati na upotrebu kondoma tokom seksualnog kontakta sa trudnicom ili ženom u reproduktivnoj dobi tokom učešća u studiji (čak i tokom prekida doziranja) i najmanje 3 meseca nakon prekida primene Jedinjenja 2, čak i ako je podvrgnut uspešnoj vazektomiji.

* Istinska apstinencija je prihvatljiva kada je to u skladu sa poželjnim i uobičajenim načinom života subjekta. Periodična apstinencija (npr. kalendar, ovulacija, simptotermalne, post-ovulacione metode) i prekid koitusa (izvlačenje) nisu prihvatljive metode kontracepcije.

Muškarci moraju pristati da se uzdrže od doniranja sperme dok su na Jedinjenju 2 i 90 dana nakon njegovog prekida.

14

11. Svi subjekti moraju pristati da se uzdrže od davanja krvi dok su na Jedinjenju 2 i 28 dana nakon njegovog prekida.

[0376] Kriterijumi za isključenje: Prisustvo bilo čega od sledećeg isključuje subjekt iz uključenja:

1. Subjekt ima značajno zdravstveno stanje, laboratorijsku abnormalnost ili psihijatrijsku bolest koja bi sprečila subjekt da učestvuje u studiji.

2. Subjekt ima bilo kakvo stanje, uključujući prisustvo laboratorijskih abnormalnosti, što dovodi subjekt u neprihvatljiv rizik ako bi učestvovao u studiji.

3. Subjekt ima bilo koje stanje koje zbunjuje sposobnost tumačenja podataka iz studije.

4. Subjekt ima ne- ili oligosekretorni multipli mijelom.

5. Subjekt ima leukemiju plazma ćelija ili aktivnu leptomeningealnu mijelomatozu.

6. Subjekt ima dokumentovanu sistemsku amiloidozu lakog lanca ili polineuropatiju, organomegaliju, endokrinopatiju, monoklonsku gamopatiju i sindrom kožnih promena (POEMS).

7. Subjekt ima mijelom imunoglobulinske klase M (IgM).

8. Subjekt ima istoriju alogene transplantacije koštane srži.

9. Subjekt je na dijalizi.

10. Subjekti sa perifernom neuropatijom ≥ 2. stepena.

11. Subjekti sa gastrointestinalnom bolešću koja može značajno promeniti apsorpciju Jedinjenja 2.

1

Subjekt ima oštećenu srčanu funkciju ili klinički značajnu srčanu bolest, uključujući bilo šta od sledećeg:

o LVEF < 45% kako je utvrđeno Echo ili MUGA skeniranjem na skriningu.

o Kompletna leva grana snopa, bifascikularni blok ili drugi klinički značajan abnormalni elektrokardiografski (EKG) nalaz na skriningu.

o Produženje QT intervala na EKG skriningu kako je definisano ponovljenom demonstracijom QTc intervala >480 milisekundi (ms) korišćenjem Fredericijine formule za korekciju QT intervala; istorija ili trenutni faktori rizika za Torsades de Pointe (npr. srčana insuficijencija, hipokalemija ili porodična istorija sindroma dugog QT intervala); i istovremena primena lekova koji produžavaju QT/QTc interval.

o Kongestivna srčana insuficijencija (klasa III ili IV Njujorške asocijacije za srce).

o Infarkt miokarda ≤6 meseci pre početka primene Jedinjenja 2.

o Nestabilna ili slabo kontrolisana angina pektoris, uključujući Prinzmetal varijantu angine pektoris.

Istovremena primena jakih modulatora CYP3A.

Subjekt je prethodno imao sistemsko lečenje mijeloma (odobreno ili ispitivano) ≤ 5 poluraspada ili 4 nedelje pre početka primene Jedinjenja 2, šta god je kraće.

Subjekt je imao ozbiljnu operaciju ≤ 2 nedelje pre početka Jedinjenja 2. Napomena:

Subjekti su se morali oporaviti od bilo kakvih klinički značajnih efekata nedavne operacije.

Žena subjekt je trudna ili dojilja ili namerava da zatrudni tokom učešća u studiji.

1 1

Subjekt ima poznatu infekciju virusom humane imunodeficijencije (HIV).

Subjekt ima poznatu aktivnu hroničnu infekciju virusom hepatitisa B ili C (HBV/HCV).

Subjekt ima istoriju istovremenog drugog karcinoma koji zahteva tekuće sistemsko lečenje.

Subjekt ima istoriju prethodne maligne bolesti koja nije MM, osim ako subjekt nije bio slobodan od bolesti ≥3 godine, osim sledećih neinvazivnih malignih bolesti lečenih sa kurativnom namerom:

o Karcinom bazalnih ili skvamoznih ćelija kože.

o Karcinom in situ grlića materice ili dojke.

o Karcinom mokraćne bešike stadijuma 1.

o Slučajni histološki nalazi lokalizovanog karcinoma prostate kao što je stadijum tumora 1a ili 1b (T1a ili T1b) prema klasifikaciji tumora/čvorova/metastaza (TNM) malignih tumora ili karcinoma prostate koji je lečen sa kurativnom namerom.

Subjekt ima istoriju anafilaksije na talidomid, lenalidomid, pomalidomid ili deksametazon.

Subjekt ima poznatu ili sumnjivu preosetljivost na ekscipijene sadržane u formulaciji Jedinjenja 2 ili deksametazona.

Subjekt se podvrgao bilo čemu od sledećeg u roku od 14 dana od početka primene Jedinjenja 2:

o Plazmafereza.

1 2

o Radioterapija koja nije lokalna terapija za simptomatsko ublažavanje lezija kostiju povezanih sa MM.

24. Subjekt je primio imunosupresivne lekove u roku od 14 dana pre prve doze Jedinjenja 2. Izuzeci od ovog kriterijuma su:

o Intranazalne, inhalacione, topikalne ili lokalne injekcije kortikosteroida (npr.

intraartikularna injekcija).

o Sistemski kortikosteroidi u dozama koje ne prelaze 10 mg/dan prednizona ili ekvivalenta.

o Steroidi kao premedikacija za reakcije preosetljivosti (npr. kompjuterizovana tomografija (CT) kao premedikacija).

25. Subjekt nije u mogućnosti ili ne želi da se podvrgne profilaksi potrebne venske tromboembolije (VTE).

[0377] Dužina studije: Očekuje se da će prosečno trajanje studije po subjektu biti približno 6 meseci. Očekuje se da će potpuno uključivanje trajati otprilike 21 mesec (18 meseci za Deo 1 i 3 meseca za Deo 2). Očekuje se da će završetak aktivnog tretmana i praćenje nakon tretmana trajati dodatnih 6 do 12 meseci. Očekuje se da će celokupna studija trajati približno 33 meseca.

[0378] Kraj ispitivanja je definisan ili kao datum poslednje posete poslednjeg subjekta za završetak praćenja nakon tretmana, ili kao datum prijema poslednje tačke podataka od poslednjeg subjekta koja je potrebna za primarnu, sekundarnu i/ili istraživačku analizu, kako je unapred navedeno u protokolu, u zavisnosti od toga šta nastupi na kasniji datum.

[0379] Studijski tretmani: Jedinjenje 2 se primenjuje oralno ili jednom dnevno za subjekte uključene u raspored 20/28 ili dva puta dnevno za subjekte uključene u raspored 6/28. Za subjekte uključene u raspored doziranja od 20/28, Jedinjenje 2 se primenjuje ujutru sa najmanje 240 ml vode nakon noćnog posta u trajanju od najmanje 6 sati. Subjekti se moraju uzdržati od unosa hrane ili drugih lekova najmanje 2 sata nakon svake jutarnje doze. Subjekti uključeni u

1

raspored 6/28 slede gorenavedena uputstva kao što je navedeno za raspored 20/28 za prvu dozu svakog dana doziranja. Druga doza se daje 12 ± 2 sata nakon jutarnje doze, najmanje 4 sata nakon i 2 sata pre unosa hrane. Na primer, subjekti uključeni u raspored doziranja 6/28 mogli bi da prime svoju početnu dozu Jedinjenja 2 u 7:00 časova, nakon čega sledi doručak u 9:00 časova, ručak u podne, svoju drugu dozu Jedinjenja 2 već u 17:00 časova sa večernjim obrokom uzetim 2 sata kasnije (tj. ne ranije od 19:00 časova). Imajte na umu da se samo u 1. ciklusu Jedinjenje 2 primenjuje od 1. do 3. dana (ujutru i uveče), 14. dana (samo uveče), 15. i 16. dana (ujutru i uveče) i 17. dana (samo ujutru).

[0380] Za oba rasporeda doziranja, deksametazon se primenjuje sa Jedinjenjem 2 natašte ili najmanje 2 sata nakon Jedinjenja 2 sa hranom (osim u danima procene PK kada se oba moraju dati istovremeno). Deksametazon dat 1., 8. dana (10. dan samo u 1. ciklusu), 15. i 22. dana ili 1, 3. i 15. dana (14. dan samo u 1. ciklusu) i 17. dana svakog ciklusa u rasporedu doziranja od 20/28 odnosno 6/28, može se primenjivati natašte istovremeno sa Jedinjenjem 2. Alternativno (kod subjekata sa istorijom iritacije želuca izazvane deksametazonom), može se primenjivati sa hranom najmanje 2 sata nakon Jedinjenja 2, osim u danima procene PK kada oba treba primenjivati istovremeno kod svih subjekata. Za sve subjekte, svaka doza deksametazona je 40 mg za subjekte koji imaju < 75 godina starosti i 20 mg za one koji imaju ≥ 75 godina starosti.

[0381] Pregled ključnih procena efikasnosti: Primarna varijabla efikasnosti je najbolja ukupna stopa odgovora (ORR) definisana kao procenat subjekata čiji je najbolji odgovor ≥ PR prema IMWG Jedinstvenim kriterijumima odgovora (Rajkumar et al Blood 2011; 117(18):4691-5). Subjekti se mesečno podvrgavaju proceni odgovora. Odgovor mijeloma određuje istraživač na mestu održavanja studije na osnovu laboratorijskih ispitivanja (elektroforeza proteina u serumu (sPEP), elektroforeza proteina u urinu (uPEP), imunofiksaciona elektroforeza (IFE), nivoi slobodnog lakog lanca u serumu (sFLC), kvantitativni imunoglobulin A (IgA), koštana srž za kvantifikaciju plazma ćelija, po potrebi) procenjenih u centralnoj referentnoj laboratoriji i/ili lokalno (tj. korigovani serumski kalcijum, pozitronska emisiona tomografija/kompjuterizovano skeniranje (pet/CT) ili magnetna rezonanca (MRI) za procenu plazmacitoma i/ili CT ili skeletno ispitivanje za procenu lezija kostiju). Dodatne varijable efikasnosti uključuju vreme do odgovora (vreme od prve doze Jedinjenja 2 do prve dokumentacije o odgovoru ≥ PR), trajanje odgovora (vreme od prve dokumentacije o odgovoru ( ≥ PR) do prve dokumentacije o PD ili smrti) i preživljavanje bez

1 4

progresije (vreme od prve doze Jedinjenja 2 do prve pojave progresije bolesti ili smrti iz bilo kog razloga).

[0382] Svi bezbedni subjekti sa važećom početnom vrednošću i najmanje jednom procenom odgovora nakon početka uključeni su u analize efikasnosti. Ako se tretman prekine iz razloga koji nisu progresija bolesti, od subjekata se traži da nastave sa procenama odgovora prema navedenom rasporedu procene do progresije, povlačenja saglasnosti, smrti ili početka nove sistemske terapije protiv mijeloma, u zavisnosti od toga šta nastupi ranije.

[0383] Pregled ključnih procena bezbednosti: Bezbednosne varijable za ovu studiju uključuju neželjene događaje koji nastaju tokom tretmana (TEAE) i promene u odnosu na početne fizičke nalaze/vitalne znakove, odabrane laboratorijske analize i 12-kanalne elektrokardiograme (EKG). Dodatne metrike bezbednosti uključuju stepen izloženosti studijskoj terapiji (i Jedinjenje 2 i deksametazon), procene istovremene upotrebe lekova i testiranje na trudnoću za žene reproduktivne dobi (FCBP).

[0384] Pregled farmakokinetičkih procena: PK profili (početna doza i stabilno stanje) se procenjuju za Jedinjenje 2, njegov R-enantiomer (Jedinjenje 3) i deksametazon. Analize izloženost-odgovor mogu se sprovesti, po potrebi, kako bi se pomoglo u identifikaciji Jedinjenja 2 RP2D.

[0385] Ostvarenja opisana iznad imaju za cilj da budu samo primeri, a stručnjaci iz ove oblasti će prepoznati, ili će moći da utvrde koristeći samo rutinsko eksperimentisanje, brojne ekvivalente specifičnih jedinjenja, materijala i procedura.

1

Claims (19)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje, pri čemu je jedinjenje Jedinjenje 1 formule
2. ili enantiomer, smeša enantiomera, tautomer, izotopolog ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 2. Jedinjenje iz patentnog zahteva 1, pri čemu je jedinjenje Jedinjenje 1 formule
3. 3. Jedinjenje iz patentnog zahteva 1, pri čemu je jedinjenje farmaceutski prihvatljiva so Jedinjenja 1.
4. 4. Jedinjenje, pri čemu je jedinjenje Jedinjenje 2 formule

   ili tautomer, izotopolog ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
5. 5. Jedinjenje iz patentnog zahteva 4, pri čemu je jedinjenje Jedinjenje 2 formule
6. 6. Jedinjenje iz patentnog zahteva 4, pri čemu je jedinjenje farmaceutski prihvatljiva so Jedinjenja 2.
7. 7. Farmaceutski sastav, koji se sastoji od jedinjenja iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 6.
8. 8. Jedinjenje iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 6 ili farmaceutski sastav iz patentnog zahteva 7 za upotrebu u metodi lečenja multiplog mijeloma, pri čemu metoda obuhvata davanje terapijski efikasne količine jedinjenja pacijentu kome je to potrebno.
9. 9. Jedinjenje ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je multipli mijelom relapsan, refraktoran ili rezistentan.
10. 10. Jedinjenje ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 8 ili 9, pri čemu je multipli mijelom: (i) refraktoran ili rezistentan na lenalidomid ili pomalidomid; ili (ii) multipli mijelom visokog rizika koji je relapsan ili refraktoran na jednu, dve ili tri prethodne terapije; ili (iii) rezistentan na jednu, dve ili tri terapije protiv multiplog mijeloma, pri čemu se terapije biraju između CD38 monoklonskog antitela, inhibitora proteasoma i imunomodulatornog jedinjenja; ili 1 (iv) okarakterisan p53 mutacijom, homozigotnom delecijom p53, aktivacijom jednog ili više onkogenih pokretača ili jednom ili više hromozomskih translokacija.
11. 11. Jedinjenje ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 10(iv), pri čemu je mutacija p53 mutacija Q331, R273H, K132N, R337L, W146, S261T, E286K, R175H, E258K ili A161T; ili pri čemu su jedan ili više onkogenih pokretača izabrani iz grupe koja se sastoji od C-MAF, MAFB, FGFR3, MMset, Cyclin D1 i Cyclin D; ili pri čemu je hromozomska translokacija t(14; 16), t(14;20), t(4; 14), t(11;14), t(6;20), t(20;22) ili t(16;22).
12. 12. Jedinjenje ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je multipli mijelom novodijagnostikovani multipli mijelom.
13. 13. Jedinjenje ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, pri čemu je novodijagnostikovani multipli mijelom novodijagnostikovan, multipli mijelom pogodan za transplantaciju.
14. 14. Jedinjenje ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 13, pri čemu se jedinjenje primenjuje: (i) kao indukciona terapija, konsolidaciona terapija ili terapija održavanja; (ii) u količini od oko 0,1 do oko 2 mg dnevno; ili (iii) od 1. do 10. dana i od 15. do 24. dana ciklusa od 28 dana, od 1. do 3. dana i od 15. do 18. dana ciklusa od 28 dana, od 1. do 7. dana i od 15. do 21. dana ciklusa od 28 dana, od 1. do 14. dana ciklusa od 21 dana, ili od 1. do 21. dana ciklusa od 28 dana.
15. 15. Jedinjenje ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 14(ii), pri čemu se jedinjenje primenjuje u količini od oko 1 mg dnevno. 1
16. 16. Jedinjenje ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 15, pri čemu metoda dalje obuhvata primenu drugog aktivnog agensa.
17. 17. Jedinjenje ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, pri čemu je drugi aktivni agens deksametazon, daratumumab, inhibitor proteasoma, inhibitori histonske deacetilaze, agens za hemoterapiju, inhibitor Bcl-2, inhibitor Mcl-1, inhibitor BET, ili inhibitor LSD-1, ili njihova kombinacija; ili pri čemu je drugi aktivni agens ACY241, AMG176, OTX015, 4-[2-(ciklopropilmetoksi)-5-(metansulfonil)fenil]-2-metilizokinolin-1(2H)-on, 4-[2-(4-amino-piperidin-1-il)-5-(3-fluoro-4-metoksi-fenil)-1-metil-6-okso-1,6-dihidropirimidin-4-il]-2-fluorobenzonitril, ciklofosfamid, deksametazon, doksorubicin, etopozid, GSK525762A, MIK665, panobinostat, venetoklaks ili vinkristin.
18. 18. Jedinjenje ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, pri čemu je drugi aktivni agens deksametazon, bortezomib, karfilzomib, daratumumab, kombinacija deksametazona i bortezomiba, kombinacija deksametazona i daratumumaba, ili kombinacija deksametazona i karfilzomiba.
19. 19. Jedinjenje ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, pri čemu se drugi aktivni agens bira između jednog ili više deksametazona, bortezomiba, karfilzomiba i daratumumaba. 1