RS66221B1 - Pneumolizinski mutanti i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents

Description

Opis

[0001] Holesterol-zavisni citolizini (CD citolizini) su velika familija toksina koji obrazuju pore, koje proizvodi više od 20 vrsta iz rodova Clostridium, Streptococcus, Listeria, Bacillus i Arcanobacterium. Mehanizam kojim ovi toksini formiraju pore prikazuje dva karakteristična svojstva: apsolutnu zavisnost od prisustva holesterola u membrani i formiranje izuzetno velike pore. Svaki CD citolizin se proizvodi kao solubilni monomerni protein koga, sa izuzetkom jednog člana, sekretuje sekretorni sistem tipa II. Kada se susretnu sa eukariotskom ćelijom, CD citolizini podležu transformaciji iz solubilnog monomernog proteina u supramolekulski kompleks pore umetnut u membranu. Konverzija monomera u oligomerni komples pore, inseriran u membranu, zahteva izvesne izuzetne promene strukture monomera.

[0002] Iako su CD citolizini su dobro poznati kao beta-hemolitički proteini, postaje sve očiglednije da bakterijski patogeni koriste ove proteine na mnogo prefinjenije načine nego kao obične hemolizine ili kao opšta sredstva za liziranje ćelija. Struktura CD citolizina takođe prikazuje plastičnost koja je omogućila evoluciju jedinstvanih svojstava za neke CD citolizine, bez istovremenog ugrožavanja osnovnog mehanizma kojim se pore formiraju. Neka od ovih svojstava se vide kod CD citolizina koji aktiviraju komplement i koji koriste nesterolni receptor koji prikazuje mehanizam formiranja pora osetljiv na pH, ili koji može da funkcioniše kao kanal za translokaciju proteina.

[0003] CD citolizini su proteini bogati β-pločama, sa četiri domena. Veoma konzervativan undekapeptid bogat triptofanom je prisutan u domenu 4, koji učestvuje u vezivanju nekih CD citolizina za membrane bogate holesterolom. Pored toga, pokazano je da se tri druge kratke hidrofobne petlje (petlje L1, L2 i L3) postavljene pored undekapeptida na vrhu domena 4 takođe umeću u površinu membrane i ukotvljuju CD citolizin u membrani u perpendikularnoj orijentaciji. Nakon vezivanja za membranu, monomeri CD citolizina difunduju lateralno kako bi inicirali formiranje membranskog oligomera.

[0004] U trenutku kada kompleks prepore dostigne velike dimenzije, vrlo verovatno kompletnu strukturu prstena, dolazi do njegove tranzicije u kompleks pore. Transmembranska pora se formira kada se dva svežnja α-heliksa u domenu 3 svakog monomera unutar kompleksa prepore konvertuju u dve produžene amfipatične transmembranske β-ukosnice (TM ukosnice). Nakon konverzije prepore u poru, visina strukture prepore kolabira u vertikalnom pravcu za oko 40 angstrema. Kolaps strukture prepore TM ukosnica u domenu 3 u upadljivo rastojanje od površine membrane, i u tom trenutku one započinju usklađeno umetanje u membranu koje dovodi do formiranja velike transmembranske pore u vidu βbačve. CD citolizinska pora je velika: sačinjena je od 35 do 50 monomera i ima prečnik od 250 do 300 angstrema.

[0005] Tokom procesa interakcije CD citolizinskih monomera sa membranom, undekapeptid i tri druge kratke petlje (L1, L2 i L3) na vrhu domena 4 inseriraju se u vidu β-sendviča u membranu nakon što monomeri CD citolizina interaguju sa površinom membrane. Ove petlje ne prodiru duboko u membranu i čini se da ne učestvuju direktno u strukturi transmembranske pore. Izgleda da je jedna funkcija pelji da ukotvi monomere u membrani u uspravnom položaju. Domen 4 egzistira u perpendikularnoj orientaciji u odnosu na membranu i okružen je vodenom sredinom, čak i u oligomernom stanju.

[0006] Domen 4 CD citolizina posreduje u prepoznavanju membrane, bilo da se ono odvija preko holesterola, bilo preko nekog drugog receptor, kao što je to slučaj sa ILY (intermedilizin).

[0007] CD citolizini su takođe u stanju da liziraju niz veoma različitih tipova ćelija sa jedrom in vitro, i ovu sposobnost brojni istraživači koriste za permeabilizaciju različitih tipova eukariotskih ćelija sa CD citolizinima. Uprskos sposobnosti ovih toksina da se ponašaju kao generalizovani agensi za liziranje ćelija in vitro, i dalje nije pokazano da je liziranje ćelija primarna funkcija CD citolizina tokom infekcije. Doprinos CD citolizina infekcijama se proučava, na primer, kod vrsta Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Arcanobacterium pyogenes i Clostridium perfringens. Rezultati nekih od ovih studija ukazuju na to da bakterije koriste CD citolizine na načine koji su sofisticiraniji nego kod generalizovanih citolitičkih agenasa. Takođe izgleda da je struktura CD citolizina prošla kroz neke jedinstvene evolucione transformacije koje omogućavaju patogene mehanizme ovih bakterijskih vrsta.

[0008] Streptococcus pneumoniae je važan uzročnik bolesti kod ljudi, posebno kod novorođenčadi, starijih osoba, osoba sa hroničnim bolestima i imunokompromitovanih osoba. To je bakterija koja se često izoluje kod pacijenata sa invazivnim bolestima kao što su bakteremija/septikemija, pneumonija i meningitis sa visokim morbiditetom i mortalitetom širom sveta. Čak i uz odgovarajuću antibiotsku terapiju, pneumokokne infekcije i dalje dovode do mnogih smrtnih slučajeva. Iako je pojava antimikrobnih lekova smanjila ukupni mortalitet od pneumokokne bolesti, prisustvo rezistentnih sojeva pneumokoka postalo je veliki problem u današnjem svetu i naglašava potrebu za lečenjem i prevencijom pneumokokne infekcije i drugim metodama osim antimikrobnih. Efikasne pneumokokne vakcine mogu da imaju veliki uticaj na morbiditet i mortalitet povezan sa bolešću S. pneumoniae. Takve vakcine bi takođe potencijalno bile korisne za sprečavanje upale srednjeg uha kod novorođenčadi i male dece. Nove imunogene pneumokokne vakcine koje obezbeđuju dugotrajan imunitet su očigledno potrebne, posebno za decu mlađu od 2 godine, jer je incidenca bolesti visoka, a odgovori antitela na antigene polisaharidne vakcine su slabi u ovoj starosnoj grupi.

[0009] Svake godine u Sjedinjenim Državama, pneumokokna bolest je odgovorna za oko 3000 slučajeva meningitisa, 50000 slučajeva bakteremije, 500000 slučajeva pneumonije i 7 miliona slučajeva upale srednjeg uha.

[0010] Teške pneumokokne infekcije su rezultat širenja bakterija u krvotok i centralni nervni sistem. Godine 1997. podaci iz studija u zajednici su pokazali da je ukupna godišnja incidenca pneumokokne bakteremije u Sjedinjenim Državama procenjena na 15-30 slučajeva na 100000; stopa je bila viša za osobe starije od, ili stare, 65 godina (50-83 slučaja na 100000) i za decu mlađu od, ili staru, 2 godine (160 slučajeva na 100000). Kod odraslih, 60%-87% pneumokokne bakterijemije bilo je povezano sa pneumonijom; kod male dece, primarna mesta infekcije često se ne identifikuju.

[0011] U Sjedinjenim Državama, rizik od bakterijemije je manji među belcima nego među osobama u drugim rasnim/etničkim grupama (tj. crncima, starosedeocima Aljaske i američkim Indijancima). Odrasli crnci imaju tri puta do pet puta veću ukupnu incidencu bakterijemije (49-58 slučajeva na 100000) od belaca. Stope invazivne pneumokokne bolesti su izuzetno visoke među starosedeocima Aljaske i američkim Indijancima. Godišnja učestalost invazivne pneumokokne infekcije kod satrosedelaca Aljaske i dece mlađe od 2 godine, prilagođeno uzrastu, utvrđena je prospektivnom studijom nadzora na 74 slučaja i 624 slučaja na 100000, respektivno. Stope meningitisa i bakteremične pneumonije su osam puta do deset puta veće za starosedeoce Aljaske svih uzrasta nego za druge grupe stanovništva u SAD. Najveće stope incidencije za bilo koju populaciju SAD prijavljene su među određenim grupama američkih Indijanaca (npr. Apači). Ukupna godišnja incidenca za takve grupe je 156 slučajeva na 100000; incidenca za decu uzrasta 1-2 godine u ovim grupama je 2396 slučajeva na 100000.

[0012] U Sjedinjenim Državama, procenjena ukupna godišnja incidenca pneumokoknog meningitisa je jedan do dva slučaja na 100000. Incidenca pneumokoknog meningitisa je najveća među decom uzrasta od 6-24 meseca i osobama starijim od, ili starim, 65 godina. Stope za crnce su duplo veće od onih za belce i Hispanoamerikance. Pošto se incidenca meningitisa Haemophilus influenzae tipa b (Hib) kod dece brzo smanjila nakon uvođenja Hib konjugovanih vakcina, S. pneumoniae je postao najčešći uzrok bakterijskog meningitisa u Sjedinjenim Državama (26).

[0013] Sojevi S. pneumoniae rezistentni na lekove (DRSP) postaju sve češći u Sjedinjenim Državama i drugim delovima sveta. U nekim oblastima je prijavljeno da čak 35% izolata pneumokoka ima rezistenciju na penicilin srednjeg nivoa (minimalna inhibitorna koncentracija {MIC} jednaka 0,1-1,0 µg/mL) ili visokog nivoa (MIC veći ili jednak 2 µg/ mL). Mnogi pneumokoki rezistentni na penicilin su takođe rezistentni na druge antimikrobne lekove (na primer, eritromicin, trimetoprim-sulfametoksazol i cefalosporine proširenog spektra). Rezistencija visokog nivoa na penicilin i rezistencija na više lekova često komplikuju regulisanje pneumokokne infekcije i čine sve težim izbor empirijske antimikrobne terapije za slučajeve kada se sumnja na meningitis, pneumoniju i upale srednjeg uha. Lečenje pacijenata inficiranih neosetljivim organizmima može da zahteva upotrebu skupih alternativnih antimikrobnih agenasa i može da dovede do produžene hospitalizacije i povećanih medicinskih troškova. Uticaj antimikrobne rezistencije na mortalitet nije jasno definisan. Nova antimikrobna rezistencija dodatno naglašava potrebu za prevencijom pneumokoknih infekcija vakcinacijom.

[0014] Trenutno dostupne pneumokokalne vakcine, PNEUMOVAX<®>23 (Merck & Co., Inc., Kenilworth, N.J.) i PNU-IMMUNE<®>23 (Lederle-Praxis Biologicals, Pearl River, NY), uključuju 23 prečišćena kapsularna polisaharidna antigena iz S. pneumoniae (serotipovi 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F). Ove vakcine su u Sjedinjenim Državama licencirane 1983. godine i zamenile su prethodnu 14-ovalentnu formulaciju koja je bila licencirana 1977. Jedna doza (0.5 mL) 23-ovalentne vakcine sadrži po 25 µg svakog kapsularnog polisaharidnog antigena, koji su rastvoreni u izotoničnom fiziološkom rastvoru sa fenolom (0,25%) ili timerosalom (0,01%), koji se dodaju kao konzervans, a bez adjuvansa. Od 1997. godine, 23 kapsularna tipa u vakcini su predstavljala najmanje 85%-90% serotipova koji izazivaju invazivne pneumokokalne infekcije kod dece i odraslih u Sjedinjenim Državama. Od 1997. je u 23-ovalentnoj vakcini zastupljeno šest serotipova (6B, 9V, 14, 19A, 19F i 23F) koji su najčešće izazivali invazivne pneumokokalne infekcije otporne na lekove u Sjedinjenim Državama. Kao što se napominje u nastavku teksta, vakcina koja sadrži isključivo kapsularne polisaharide je poželjna u ograničenoj meri.

[0015] Pneumolizin konkretno, predstavlja ključnu komponentu u patogenezi streptokokne pneumonije, koja dovodi do smrti preko milion ljudi godišnje širom sveta. Upotreba pneumolizina kao dela vakcine za infekcije pluća Streptococcus pneumoniae i upale srednjeg uha mogla bi da pruži značajne prednosti, jer vakcine zasnovane na kapsularnom polisaharidu gube efikasnost zbog genetske varijacije i teško ih je generisati, jer postoji više od 90 različitih kapsularni serotipovi Streptococcus pneumoniae. Imunitet na jedan tip kapsule ne štiti od drugog tipa kapsule. Trenutno dostupna pneumokokalna vakcina, koja je razmatrana prethodno u tekstu, a koja sadrži 23 kapsularna polisaharida iz sojeva koji najčešće izazivaju bolest, ima značajne nedostatke u vezi, pre svega sa slabom imunogenošću nekih kapsularnih polisaharida, raznovrsnošću serotipova i razlikama u raspodeli serotipova po vremenu, geografskim oblastima i starosnim grupama. Trenutno se za razvoj vakcine koristi varijanta pneumolizina sa tačkastom mutacijom. Ovaj mutant pneumolizina (označen kao „Pd-B“) sadrži jednu mutaciju na poziciji 433 (gde je nativni triptofanski ostatak izmenjen u fenilalanin). Ova mutacija u pneumolizinu se nalazi u konzervativnom undekapeptidu domena 4, strukturi u holesterol-zavisnim citolizinima (CD citolizinima) za koju se već dugo smatra da posreduje u vezivanju za sisarske membrane.

[0016] Iako se mutant pneumolizina Pd-B konvencionalno koristi za razvoj vakcina, ovaj protein i dalje može da prođe kroz niz strukturnih tranzicija do kojih dolazi nakon vazivanja za membranu sisarskih ćelija. Ove promene dramatično menjaju njegovu strukturu i mogu da smanje njegovu sposobnost da stimuliše efikasan neutrališući imuni odgovor kod pacijenta, prvenstveno zato što će struktura pneumolizina koju imuni sistem pacijenta može da „vidi“ biti struktura terminalnog oligomernog kompleksa vezanog za ćeliju, a ne inicijalna struktura solubilnog monomernog pneumolizina. I još važnije, aktuelni genetski toksoidovani pneumolizin je i dalje ometan neprihvatljivim nivoom toksičnosti. Osnova za ovu toksičnost još nije jasna, ali verovatno proizilazi iz činjenice da se ovaj toksoid i dalje može da se veže i da oligomerizuje na ćelijama sisara. US 8 128 939 otkriva mutantne polipeptide pneumolizina.

[0017] Dakle, holesterol-zavisni mutanti citolizina, kao što je (ali bez ograničenja) pneumolizin, koji imaju smanjenu toksičnost i smanjenu hemolitičku aktivnost, a koji ipak stimulišu imuni odgovor protiv odgovarajućih organizama koji dovode do bolesti, bili bi od velike koristi.

[0018] Nije predviđeno da priloženi crteži ograniče obim pronalaska. Slike nisu nužno u razmeri, a određene karakteristike i određeni pogledi na slikama mogu da budu prikazani preuveličano ili šematski, u interesu jasnoće i sažetosti.

Slike 1A-E sadrže poređenje poravnanja aminokiselina nativnih aminokiselinskih sekvenci različitih holesterol-zavisnih citolizina. Aminokiselinske sekvence svakog ovde identifikovanog proteina odgovaraju sekvencama SEQ ID NO u tabeli 1 u ovom tekstu; na primer, cereolizin na sl.1A-E odgovara SEQ ID NO:2 u tabeli 1, a SEQ ID No:18 (PAF) u tabeli 1 odgovara viridanolizinu na sl.1A-E.

Slika 2 prikazuje kristalnu strukturu ILY (intermedilizin) i poređenje D4 kristalnih struktura ILY i PFO (perfringolisin). Na (a) je prikazana je trakasta reprezentacija kristalne strukture ILY<25>koja označava položaje različitih struktura i ostataka o kojima se govori u ovim studijama. U (b) je prikazano preklapanje trakastog prikaza D4 struktura ILY i PFO na bazi kristalnih struktura oba proteina<23, 24>. Prikazane su relativne lokacije undekapeptida za oba proteina i ostatke L1-L3 petlje ILY i PFO (poslednji u zagradi). Strukturne slike su generisane pomoću VMD<25>.

Slika 3 ilustruje da se ILY undekapeptid inserira u membrane sa smanjenim sadržajem holesterola. ILY ostatak Ala-486 je mutiran u cistein (ILY<A486C>) i derivatizovan sa NBD (jodoacetamido-N,N'-dimetil-N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazolil)etilen-diamin). Emisija fluorescencije NBD je određena kada je ILY<A486C-NBD>inkubiran sam (puna linija), sa humanim crvenim krvnim zrncima (hRBC ćelije-isprekidana linija), ili sa hRBC ćelijama sa snižanom količinom holesterola (isprekidana linija).

Slika 4 ilustruje da se petlje L1, L2 i L3 ILY ne inseriraju u membrane sa sniženim holesterolom. Svaki ostatak petlje D4 za koji se zna da se inserira u membranu zamenjen je cisteinom i modifikovan sa NBD. ILY<A428C-NBD>(a), ILY<A464C-NBD>(b) ili ILY<L518C-NBD>(c) je inkubiran sam (puna linija), sa hRBC (isprekidana linija) ili sa hRBC ćelijama sa sniženim holesterolom (isprekidana linija). Membranski holesterol je zatim obnovljen i određena je insercija petlji L1, L2 i L3. ILY<A428C-NBD>(d), ILY<A464C-NBD>(e) ili ILY<L518C-NBD>(f) je inkubiran sam (puna linija) ili sa membranama sa ponovo dodatim holesterolom (isprekidana linija).

Slika 5 pokazuje da L1-L3 petlje posreduju u vezivanju PFO za lipozome bogate holesterolom, (a) SPR analiza vezivanja nativnog (puna linija) i NEM-modifikovanog PFO (isprekidana linija), (b) SPR analiza vezivanja nativnog PFO (puna linija), PFO<A401D>(isprekidana linija sa dugim crticama), PFO<A437D>(isprekidana linija sa kratkim crticama) i PFO<L491D>(isprekidana linija sa tačkicama).

Slika 6 ilustruje da hemijska modifikacija sulfhidrila u cisteinu undekapeptida u PFO blokira inserciju u membranu triptofana iz undekapeptida i konverziju prepora u pore.

Povećanje intrinzičke fluorescentne emisije triptofana undekapeptida u PFO je korišćeno za merenje njihove insercije u membranu<20, 21>. (a) Povećanje intrinzičke fluorescentne emisije triptofana u nativnom PFO je prikazano kako se on kreće iz svog solubilnog oblika (puna linija) u stanje kada je vezan za membranu (isprekidana linija). (b) Isti eksperiment prikazan u (a) je ponovljen sa nativnim PFO koji je modifikovan na Cys-459 sa NEM.

Slika 7 prikazuje imunogeni odgovor kod miševa imunizovanih mutantnim polipeptidom pneumolizina i pneumolizinom divljeg tipa koji je zatim inokulisan sa S. pneumoniae.

[0019] Osim ako u ovom tekstu nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini imaju značenja koja uobičajeno podrazumevaju stručnjaci u ovoj oblasti. Dalje, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, termini u jednini uključuju množinu, a termini u množini uključuju jedninu. Generalno, nomenklature koje se koriste u vezi sa, i tehnike kulture ćelija i tkiva, molekularne biologije, i hemije proteina i oligo- ili polinukleotida i hibridizacije koje su ovde opisane su tehnike koje su dobro poznate i koje se obično koriste u oblasti. Standardne tehnike se koriste za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida i kulturu tkiva i transformaciju (npr. elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se izvode u skladu sa specifikacijama proizvođača ili kao što je uobičajeno u oblasti ili kako je ovde opisano. Prethodne tehnike i procedure se generalno izvode u skladu sa konvencionalnim metodama dobro poznatim u oblasti i kao što je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje se citiraju i razmatraju u ovoj specifikaciji. Videti npr. Green and Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)) i Coligan et al. (Current Protocols in Immunology, Current Protocols, Wiley Interscience (1994)). Nomenklature koje se koriste u vezi sa analitičkom hemijom, hemijom organske sinteze i medicinskom i farmaceutskom hemijom, kao i njihove laboratorijske procedure i tehnike, koje su ovde opisane, su one koje su dobro poznate i koje se uobičajeno koriste u stanju tehnike. Za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparacije, formulaciju i isporuku, kao i lečenje pacijenata, koriste se tandardne tehnike.

[0020] Svaka referenca u opisu, na postupke lečenja ili in vivo dijagnoze odnosi se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove prema predmetnom pronalasku, za upotrebu u postupku lečenja ljudskog ili životinjskog tela terapijom ili za in vivo dijagnozu.

[0021] Svi patenti, objavljene patentne prijave i ne-patentne publikacije pomenute u predmetnoj specifikaciji ukazuju na nivo sposobnosti stručnjaka u ovoj oblasti.

[0022] Podrazumeva se da sledeći termini, osim ako nije drugačije naznačeno, imaju sledeća značenja:

Upotreba reči u jednini, kada se koriste zajedno sa teminom „koji sadrži“, u patentnim zahtevima i/ili specifikaciji može da znači „jedan“, ali je u skladu i da značenjem „jedan ili više“, „najmanje jedan“ i „ jedan ili više od jednog“. Upotreba temina „ili“ u patentnim zahtevima koristi se da se označi „i/ili“ osim ako eksplicitno nije navedeno da se odnosi samo na alternative ili ako su alternative međusobno isključuju, iako prikaz podržava definiciju koja se odnosi samo na alternative i „i/ili“. Kroz celu ovu prijavu, termin „oko“ se koristi da označi činjenicu da neka vrednost uključuje inherentnu varijaciju greške za uređaj, ako se postupak koristi da se odredi vrednost ili varijacija koja postoji među subjektima u studiji. Na primer, ali ne kao ograničenje, kada se koristi termin „oko“, navedena vrednost može da varira za plus ili minus dvanaest procenata ili jedanaest procenata, ili deset procenata, ili devet procenata, ili osam procenata, ili sedam procenata, ili šest procenata, ili pet procenata, ili četiri procenata, ili tri procenata, ili dva procenata, ili jedan procenat.Smatraće se da upotreba termina "najmanje jedan" uključuje jednu kao i bilo koju količinu veću od jedan, uključujući, ali bez ograničenja na, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 , 100, itd. Termin "najmanje jedan" može da se proširi do 100 ili 1000 ili više, u zavisnosti od termina za koji je vezan; pored toga, količine od 100/1000 ne treba smatrati ograničavajućim, jer više granice takođe mogu dati zadovoljavajuće rezultate. Pored toga, upotreba termina "najmanje jedan od X, Y i Z" podrazumeva da uključuje samo X, samo Y i Z, kao i bilo koju kombinaciju X, Y i Z. Upotreba terminologije rednih brojeva (tj. „prvi“, „drugi“, „treći“, „četvrti“ itd.) je isključivo u svrhu razlikovanja između dve ili više stavki i nema za cilj da implicira bilo kakav niz ili redosled ili važnost jedne stavke u odnosu na drugu ili bilo koji redosled dodavanja, na primer.

[0023] Kako se koristi u ovoj specifikaciji i patentnom zahtevu(ima), reči „koji sadrži“ (i bilo koji oblik obuhvatanja, kao što su „sadrže“ i „sadrži“), „imati“ (i bilo koji oblik posedovanja, kao što su „imaju“ i „ima“), „uključujući“ (i bilo koji oblik uključivanja, kao što su „uključuju“ i „uključuje“) ili „sadrži“ (i bilo koji oblik sadržavanja, kao što su „sadrže“ i „sadrži“) su inkluzivni ili otvoreni i ne isključuje dodatne, nenavedene elemente ili korake postupka.

[0024] Termin "ili njihove kombinacije" kako se ovde koristi odnosi se na sve permutacije i kombinacije navedenih stavki koje prethode tom terminu. Na primer, "A, B, C, ili njihove kombinacije" treba da uključi najmanje jedno od: A, B, C, AB, AC, BC ili ABC, a ako je redosled važan u određenom kontekstu, takođe BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC ili CAB. Nastavljajući sa ovim primerom, izričito su uključene kombinacije koje sadrže ponavljanja jedne ili više stavke ili termina, kao što su BB, AAA, AAB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB i tako dalje. Stručnjak će razumeti da tipično ne postoji ograničenje na broj artikala ili termina u bilo kojoj kombinaciji, osim ako nije drugačije očigledno iz konteksta.

[0025] U celoj specifikaciji i patentnim zahtevima, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, smatraće se da termini "u suštini" i "oko" nisu ograničeni na specifične termine kvalifikovane ovim pridevima/prilozima, već će se smatrati da ukazuju na vrednost koja uključuje inherentnu varijaciju greške za uređaj, metod koji se koristi za određivanje vrednosti i/ili varijacije koja postoji među subjektima istraživanja. Dakle, pomenuti termini dozvoljavaju manje varijacije i/ili odstupanja koja ne rezultiraju značajnim uticajem na njih. Na primer, u određenim slučajevima, termin "oko" se koristi da ukaže na to da vrednost uključuje inherentnu varijaciju greške za uređaj, pri čemu se metod koristi za određivanje vrednosti i/ili varijacije koja postoji među subjektima istraživanja. Slično tome, termin "u suštini" se takođe može odnositi na 80% ili više, kao što je 85% ili više, ili 90% ili više, ili 95% ili više, ili 99% ili više, i slično.

[0026] Termini "prečićeni protein" ili "izolovani protein" kako se ovde koriste znače da je protein ili fragment dovoljno bez zagađivača ili ćelijskih komponenti sa kojima se protein normalno javlja da bi se protein razlikovao od kontaminanata ili ćelijskih komponenti. Ne smatra se da je za „prečišćeni” potreban preparat koji je tehnički potpuno čist (homogen), ali prečišćen kako se ovde koristi znači da je protein ili polipeptidni fragment dovoljno odvojen od zagađivača ili ćelijskih komponenti sa kojima se obično javlja da obezbedi protein u stanje u kome se može koristiti u testu, kao što je imunoprecipitacija ili ELISA. Na primer, prečišćeni protein može da bude u elektroforetskom gelu.

[0027] Termin "mutant" kada se ovde koristi za opisivanje polipeptida odnosi se na polipeptid koji je manje od 100% identičan amino kiselinskoj sekvenci odgovarajućeg divljeg tipa (nativnog) polipeptida, a posebno na sintetički ili rekombinantni polipeptid pri čemu je jedna ili više pozicija aminokiselinskih ostataka polipeptida divljeg tipa supstituisana. Termin "varijanta" može da se koristi naizmenično sa terminom "mutant".

[0028] Mutantni CD citolizini koji je ovde opisan može se kombinovati sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, uključujući nosače, vehikulume i razblaživače, da bi se formirale imunogene kompozicije. Predviđeno je da se termin farmaceutski prihvatljiv ekscipijens odnosi na rastvarače ili druge materijale u kojima se mutantni CD citolizini (npr. mutantni polipeptidi pneumolizina) mogu rasporediti da bi se poboljšala rastvorljivost, isporučivost, disperzija, stabilnost i/ili konformacioni integritet. Primeri takvih farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, fiziološke rastvore (kao što su fiziološki rastvori soli i puferovani slani rastvori na neutralnom pH, kao što je fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS)), etanol, šećeri, dekstroza, glicerol, i/ili polialkoholi (kao što su manitol i sorbitol). Druge vrste nosača uključuju lipozome ili polimere i slično.

[0029] Termin "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na materijal koji nije biološki ili na neki drugi način nepoželjan, tj. materijal se može davati pojedincu zajedno sa odabranim jedinjenjem bez izazivanja bilo kakvih neželjenih bioloških efekata ili interakcije na nepoželjan način sa bilo kojim ostalih komponenti farmaceutske kompozicije u kojoj se nalazi.

[0030] Mutantni CD citolizini ili imunogene kompozicije koje sadrže navedene mutantne CD citolizine mogu dalje da se kombinuju sa adjuvansom kao što je (ali bez ograničenja na) Frojndov nekompletni adjuvans, Frojndov kompletni adjuvans, stipsa, monofosforil lipid A, aluminijum fosfat ili hidroksid, QS-21, soli, tj. AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4)2, silicijum dioksid, kaolin, i/ili ugljenični polinukleotidi (tj. poli IC i poli AU). Neograničavajući primeri adjuvanasa uključuju QuilA, Alhydrogel i slične proizvode. Termin „ajuvans“ se odnosi na supstancu koja je u stanju da pojača, ubrza ili produži imunski odgovor kada se daje sa imunogenom u kompoziciji. Opciono, mutantni CD citolizini mogu da se kombinuju sa imunomodulatorima i imunostimulatorima kao što su, ali bez ograničenja na, interleukini, interferoni i slične supstance. Stručnjacima u oblasti su poznate brojne vakcine i druge farmaceutske formulacije.

[0031] Pod „biološki aktivan“ se podrazumeva sposobnost da se modifikuje fiziološki sistem organizma. Molekul može da bude biološki aktivan kroz sopstvene funkcionalnosti, ili može da bude biološki aktivan na osnovu svoje sposobnosti da aktivira ili inhibira molekule koji imaju sopstvenu biološku aktivnost.

[0032] Termin "imunogeno" kada se ovde koristi ima za cilj da se odnosi na sposobnost supstance da izazove imuni odgovor. Na primer, "imunogena kompozicija" je kompozicija koja sadrži mutantni CD citolizin, kao što je mutantni polipeptid pneumolizina, koji je u stanju da izazove imuni odgovor kod životinje, kao što je proizvodnja antitela, kada joj se daje. Termin "vakcina" se odnosi na imunogenu kompoziciju za davanje subjektu radi izazivanja imunog odgovora protiv određenog antigena. Na primer, vakcina koja sadrži jedan ili više mutantnih polipeptida pneumolizina je vakcina za upotrebu u lečenju bolesti ili stanja uzrokovanih bakterijom Streptococcus pneumoniae.

[0033] Termin "pacijent" ili "subjekt" kako se ovde koristi uključuje ljude i veterinarske subjekte. „Sisar“ u svrhu lečenja odnosi se na bilo koju životinju klasifikovanu kao sisar, uključujući (ali bez ograničenja na) ljude, domaće životinje (kao što su, ali bez ograničenja na, psi i mačke), životinje sa farme (kao što su, ali bez ograničenja na, krave, konji, svinje, koze i ovce), laboratorijske životinje (kao što su, ali bez ograničenja na, miševi, pacovi, zečevi, zamorci i činčile), neljudi primati i bilo koja druga životinja koja ima tkivo dojke.

[0034] "Lečenje" se odnosi i na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere. Oni kojima je potreban tretman uključuju, ali nisu ograničeni na, pojedince koji već imaju određeno stanje ili poremećaj, kao i pojedince koji su u riziku da dobiju određeno stanje ili poremećaj (npr. oni kojima su potrebne profilaktičke/preventivne mere). Termin "lečenje" se odnosi na davanje agensa pacijentu u terapeutske i/ili profilaktičke/preventivne svrhe.

[0035] "Terapeutska kompozicija" ili "farmaceutska kompozicija" se odnosi na agens koji se može primeniti in vivo da bi postigao terapeutski i/ili profilaktički/preventivni efekat.

[0036] Fraza "davanje terapeutski efikasne količine" ili "davanje profilaktički efikasne količine" ima za cilj da obezbedi terapeutsku korist u lečenju, smanjenju pojave, prevenciji ili upravljanju bolesti. Konkretnu količinu koja je terapeutski efikasna može lako da odredi običan lekar i može da varira u zavisnosti od faktora poznatih u tehnici, kao što su tip bolesti/raka, istorija i starost pacijenta, stadijum bolesti i zajednička primena drugih agenasa.

[0037] "Poremećaj" je svako stanje koje bi imalo koristi od tretmana sa polipeptidom. Ovo uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti uključujući ona patološka stanja koja predisponiraju sisara za dotični poremećaj.

[0038] Termin "terapeutski efikasna količina" odnosi se na količinu biološki aktivnog molekula ili konjugata ili njegovog derivata dovoljnu da pokaže željeni terapeutski efekat bez neželjenih neželjenih efekata (kao što su toksičnost, iritacija i alergijski odgovor) srazmerno razumnom odnos korist/rizik kada se koristi na način inventivnih koncepata. Terapeutski efekat može uključivati, na primer, ali ne kao ograničenje, inhibiranje rasta neželjenog tkiva ili malignih ćelija. Efektivna količina za subjekta će zavisiti od tipa subjekta, veličine i zdravlja subjekta, prirode i težine stanja koje se leči, načina primene, trajanja lečenja, prirode istovremene terapije (ako postoji) , specifične formulacije koje se koriste i slično. Dakle, nije moguće unapred odrediti tačan efektivni iznos. Međutim, efikasnu količinu za datu situaciju može odrediti neko od uobičajenih veština u ovoj oblasti koristeći rutinsko eksperimentisanje na osnovu informacija koje su ovde date.

[0039] Kako se ovde koristi, termin "istovremena terapija" se koristi naizmenično sa terminima "kombinovana terapija" i "dodatna terapija", i podrazumevaće se da znači da se pacijentu kome je potrebno lečenje leči ili da mu se daje drugi lek za bolesti u kombinaciji sa farmaceutskim kompozicijama. Ova istovremena terapija može da bude sekvencijalna terapija, gde se pacijent leči prvo jednim lekom, a zatim drugim, ili se dva leka daju istovremeno.

[0040] Termini "primena" i "davanje", kako se ovde koriste, podrazumevaju sve puteve primene poznate u tehnici, uključujući, ali bez ograničenja na, oralno, lokalno, transdermalno, parenteralno, subkutano, intranazalno, mukozno, intramuskularno, intraperitonealno , intravitrealni i intravenski putevi, uključujući lokalne i sistemske primene. Pored toga, kompozicije (i/ili metode davanja istih) mogu da budu dizajnirane da obezbede odloženo, kontrolisano ili produženo oslobađanje korišćenjem tehnika formulacije koje su dobro poznate u tehnici.

[0041] Termini "supstitucija", "umetanje", "adicija" i "delecija" se ovde koriste u odnosu na aminokiselinske ili nukleotidne sekvence. "Supstitucija" se odnosi na zamenu jednog ili više nukleotida ili amino kiselina različitim nukleotidima ili aminokiselinama, respektivno. "Ubacivanje" ili "adicija" je ona promena u sekvenci nukleotida ili aminokiselina koja je rezultirala dodavanjem jednog ili više nukleotida ili aminokiselinskih ostataka, respektivno, u poređenju sa sekvencom koja se pojavljuje u prirodi. "Delecija" je definisana kao promena bilo nukleotidne ili aminokiselinske sekvence u kojoj su odsutni jedan ili više nukleotida ili aminokiselinskih ostataka.

[0042] Supstitucije aminokiselina su tipično od pojedinačnih ostataka; insercije će obično biti reda veličine od oko 1 do 20 amino kiselina, iako se mogu tolerisati znatno veće insercije. Delecije se kreću od oko 1 do oko 20 ostataka, iako u nekim slučajevima delecije mogu da budu mnogo veće.

[0043] Supstitucije, delecije, insercije ili bilo koja njihova kombinacija mogu se koristiti da se dođe do konačnog mutiranog polipeptida. Generalno, nekoliko aminokiselina se menja da bi se minimizirala promena molekula. Međutim, veće promene se mogu tolerisati u određenim okolnostima.

[0044] Supstitucije aminokiselina mogu da budu rezultat supstitucije jedne amino kiseline drugom amino kiselinom koja ima slične strukturne i/ili hemijske osobine, kao što je supstitucija izoleucina valinom, tj. konzervativne supstitucije amino kiselina. Insercije ili delecije mogu opciono biti u opsegu od 1 do 5 amino kiselina.

[0045] Supstitucije se mogu izvršiti u skladu sa poznatim "konzervativnim supstitucijama". „Konzervativna supstitucija“ se odnosi na supstituciju aminokiseline u jednoj klasi aminokiselinom u istoj klasi, gde je klasa definisana uobičajenim fizičkohemijskim svojstvima bočnog lanca aminokiselina i visokim frekvencijama supstitucije u homolognim proteinima koji se nalaze u prirodi.

[0046] Nasuprot tome, supstitucije mogu da budu nekonzervativne. "Nekonzervativna supstitucija" se odnosi na supstituciju aminokiseline u jednoj klasi sa amino kiselinom iz druge klase.

[0047] Termin "polipeptid" kako se ovde koristi odnosi se na jedinjenje sačinjeno od jednog lanca aminokiselinskih ostataka povezanih peptidnim vezama. Termin "protein" kako se ovde koristi može da bude sinonim za termin "polipeptid" ili se može odnositi, pored toga, na kompleks od dva ili više polipeptida.

[0048] Termin "molekul nukleinske kiseline" uključuje RNK, DNK i cDNK molekule. Podrazumeva se da, kao rezultat degeneracije genetskog koda, može se proizvesti mnoštvo nukleotidnih sekvenci koje kodiraju dati mutantni CDC protein. Uključena je svaka moguća varijantna sekvenca nukleotida, a sve su moguće s obzirom na degeneraciju genetskog koda.

[0049] Konstrukt ili sekvenca "heterologe" nukleinske kiseline ima svoj deo koji nije prirodan za ćeliju u kojoj je eksprimiran. Termin "heterologan", u odnosu na kontrolnu sekvencu, odnosi se na kontrolnu sekvencu (tj. promotor ili enhenser) koja u prirodi ne funkcioniše da reguliše isti gen čiju ekspresiju trenutno reguliše. Generalno, heterologe sekvence nukleinske kiseline nisu endogene za ćeliju ili nisu deo genoma u kome su prisutne; umesto toga, heterologe sekvence su dodate ćeliji, kao što je infekcija, transfekcija, transformacija, mikroinjekcija, elektroporacija ili slično. Konstrukt "heterologe" nukleinske kiseline može sadržati kombinaciju kontrolne sekvence/kodirajuće sekvence DNK koja je ista ili različita od kombinacije kontrolne sekvence/kodirajuće sekvence DNK koja se nalazi u nativnoj ćeliji.

[0050] Kako se ovde koristi, termin "vektor" se odnosi na konstrukt nukleinske kiseline dizajniran za transfer između različitih ćelija domaćina. "Ekspresioni vektor" se odnosi na vektor koji ima sposobnost da inkorporira i eksprimira heterologe DNK fragmente u stranoj ćeliji. Mnogi prokariotski i eukariotski ekspresioni vektori su komercijalno dostupni. Izbor odgovarajućih ekspresionih vektora je u okviru znanja stručnjaka u oblasti.

[0051] Shodno tome, "ekspresiona kaseta" ili "ekspresioni vektor" je konstrukt nukleinske kiseline generisan rekombinantno ili sintetički, sa nizom specificiranih elemenata nukleinske kiseline koji dozvoljavaju transkripciju određene nukleinske kiseline u ciljnoj ćeliji. Rekombinantna ekspresiona kaseta se može ugraditi u plazmid, hromozom, mitohondrijalnu DNK, DNK plastida, virus ili fragment nukleinske kiseline. Tipično, deo rekombinantne ekspresione kasete ekspresionog vektora uključuje, između ostalih sekvenci, sekvencu nukleinske kiseline koju treba transkribovati i promotor.

[0052] Kako se ovde koristi, termin "plazmid" se odnosi na kružni dvolančani (ds) DNK konstrukt koji se koristi kao vektor za kloniranje i koji formira ekstrahromozomski samoreplicirajući genetski element u mnogim bakterijama i nekim eukariotima.

[0053] Kako se ovde koristi, termin "nukleotidna sekvenca koja kodira marker" odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja je sposobna za ekspresiju u ćelijama i gde ekspresija selektivnog markera daje ćelijama koje sadrže eksprimirani gen sposobnost rasta u prisustvu odgovarajućeg selektivni agens, ili pod odgovarajućim uslovima selektivnog rasta.

[0054] Kako se ovde koristi, termin "promotor" se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja funkcioniše za direktnu transkripciju nizvodnog gena. Promotor će generalno biti odgovarajući za ćeliju domaćina u kojoj se eksprimuje ciljni gen. Promotor, zajedno sa drugim transkripcionim i translacionim regulatornim sekvencama nukleinskih kiselina (koji se takođe nazivaju "kontrolne sekvence"), neophodan je za ekspresiju datog gena. Uopšteno govoreći, transkripcione i translacione regulatorne sekvence uključuju, ali nisu ograničene na, sekvence promotora, mesta vezivanja ribozoma, sekvence početka i zaustavljanja transkripcije, sekvence početka i zaustavljanja translacije i sekvence enhensera ili aktivatora.

[0055] Termini "himerni gen" ili "heterologa konstrukcija nukleinske kiseline", kako se ovde koriste, odnose se na ne-nativni gen (tj. onaj koji je uveden u domaćina) koji može da bude sastavljen od delova različitih gena, uključujući regulatorne elemente. Himerni genski konstrukt za transformaciju ćelije domaćina se obično sastoji od transkripcionog regulatornog regiona (promotora) koji je operativno povezan sa sekvencom koja kodira heterologi protein, ili, u selektivnom marker himernom genu, sa selektivnim markerskim genom koji kodira protein koji daje otpornost na antibiotike na transformisane ćelije. Tipičan himerni gen za transformaciju u ćeliju domaćina uključuje regulatorni region transkripcije koji je konstitutivan ili inducibilan, sekvencu koja kodira protein i sekvencu terminatora. Himerni genski konstrukt može takođe uključiti drugu DNK sekvencu koja kodira signalni peptid ako se želi izlučivanje ciljnog proteina.

[0056] Nukleinska kiselina je "operativno povezana" kada je stavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK koja kodira sekretorni lider je operativno povezana sa DNK za polipeptid ako je eksprimiran kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promotor ili enhenser je operativno vezan za kodirajuću sekvencu ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da olakša translaciju. Generalno, "operabilno povezane" znači da su sekvence DNK koje se povezuju susedne i, u slučaju sekretornog vođe, susedne i u okviru čitanja. Međutim, enhenseri ne moraju biti uzastopni. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim restrikcijskim mestima. Ako takva mesta ne postoje, sintetički oligonukleotidni adapteri, linkeri ili prajmeri za PCR se koriste u skladu sa konvencionalnom praksom.

[0057] Kako se ovde koristi, termin "gen" označava segment DNK koji je uključen u proizvodnju polipeptidnog lanca, koji može, ali ne mora uključivati regione koji prethode i prate kodirajući region, npr. 5' netranslatirane (5' UTR) ili "vodeće" sekvence i 3' UTR ili "repne" sekvence, kao i umetnute sekvence (introni) između pojedinačnih kodirajućih segmenata (egzona).

[0058] Kako se ovde koristi, termin "rekombinantni" uključuje referencu na ćeliju ili vektor koji je modifikovan uvođenjem heterologe sekvence nukleinske kiseline; pored toga, termin "rekombinantni" se takođe može odnositi na ćeliju koja je izvedena iz tako modifikovane ćelije. Tako, na primer, rekombinantne ćelije eksprimiraju gene koji se ne nalaze u identičnom obliku unutar nativnog (nerekombinantnog) oblika ćelije ili eksprimiraju nativne gene koji su inače abnormalno eksprimirani, nedovoljno eksprimirani ili uopšte nisu eksprimirani kao rezultat namerne ljudske intervencije.

[0059] Kako se ovde koristi, termini "transformisana", "stabilno transformisana" ili "transgena", u odnosu na ćeliju, označavaju da ćelija ima ne-nativnu (heterologu) sekvencu nukleinske kiseline integrisanu u svoj genom ili ima epizomalni plazmid koji se održava kroz više generacija.

[0060] Kako se ovde koristi, termin "ekspresija" se odnosi na proces kojim se na osnovu sekvence nukleinske kiseline gena proizvodi polipeptid. Proces uključuje i transkripciju i translaciju.

[0061] Termin "uveden", u kontekstu insercije sekvence nukleinske kiseline u ćeliju, odnosi se na bilo koji metod umetanja sekvence nukleinske kiseline u ćeliju, uključujući, ali bez ograničenja na, postupke "transfekcije", "transformacije" i/ili "transdukcije". Termin "uveden" takođe uključuje referencu na inkorporaciju sekvence nukleinske kiseline u eukariotsku ili prokariotsku ćeliju gde sekvenca nukleinske kiseline može da se inkorporira u genom ćelije (na primer, hromozom, plazmid, plastid ili mitohondrijalnu DNK), konvertuje u autonomni replikon, ili prolazno eksprimira (na primer, transfektovana iRNK).

[0062] Prema prvom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je prečišćeni mutantni pneumolizin, kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.

[0063] U skladu sa primerom za koji se ne traži zaštita, obezbeđen je prečišćeni mutantni pneumolizin koji sadrži: polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 99% identična sa SEQ ID NO: 1, pri čemu aminokiselinska sekvenca sadrži prvu aminokiselinsku supstitucija G293S na poziciji 293 SEQ ID NO: 1 i drugu aminokiselinsku supstituciju L460D na poziciji 460 SEQ ID NO: 1.

[0064] Posmatrano sa sledećeg aspekta, predmetni pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja sadrži prečišćeni mutantni pneumolizin pronalaska smešten u farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0065] Kompozicije mogu da se koriste, na primer, u vakcinama usmerenim protiv odgovarajućih patogena bolesti, ili mogu da se koriste u dijagnostičkim ili skrining metodama ili drugim analitičkim metodama kao što su metode detekcije.

[0066] Posmatrano sa još jednog aspekta, ovaj pronalazak obezbeđuje vakcinu koja sadrži imunogenu kompoziciju prema pronalasku.

[0067] Posmatrano sa još jednog dodatnog aspekta, ovaj pronalazak obezbeđuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prečišćeni mutantni pneumolizin pronalaska.

[0068] Posmatrano sa sledećeg dodatnog aspekta, ovaj pronalazak obezbeđuje ćelijudomaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema pronalasku.

[0069] Organizmi koji proizvode nativne oblike CD citolizina imaju različite patološke efekte, uključujući, ali bez ograničenja na, efekte navedene u nastavku teksta.

[0070] Clostridium perfringens je uzročnik različitih bolesti ljudi i životinja, koje se često karakterišu enterotoksemijom ili infekcijama mekog tkiva kao što je gasna gangrena. Eksperimentalni dokazi ukazuju na ulogu perfringolizina O u slabljenju imunskog odgovora tako što utiče na funkciju neutrofila.

[0071] Bacillus cereus (izvor cereolizina O) je redak uzrok ozbiljnih negastrointestinalnih infekcija, posebno kod zavisnika od droga, imunosupresivnih, novorođenčadi i pacijenata posle operacije, posebno kada se umetnu protetski implantati kao što su ventrikularni šantovi. Očne infekcije su najčešći tipovi teških infekcija, uključujući endoftalmitis, anoftalmitis i keratitis, obično sa karakterističnim formiranjem apscesa rožnjače.

[0072] Bacillus alvei može izazvati endoftalmitis i može izazvati pneumoniju i empiem.

[0073] Pokazalo se da je Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis uključen u brojne različite tipove sindroma ljudskih bolesti.

[0074] Streptococcus canis tipično izaziva bolest kod životinja, prvenstveno pasa. Može da izazove bolesti kod ljudi, najčešće infekcije mekih tkiva, bakteriemiju, urinarne infekcije, infekcije kostiju ili pneumoniju.

[0075] Streptococcus uzrokuje razne bolesti uključujući strep grlo, reumatsku groznicu, infekcije mekih tkiva (tj. bakterije koje jedu meso) i mnoge druge. Pokazalo se da je streptolizin O glavni patogeni faktor mnogih od ovih bolesti.

[0076] Clostridium tetanus, koji je uzročnik tetanusa, proizvodi tetanolizin.

[0077] Listeria ivanovii je infekcija životinja i prvenstveno izaziva abortus kod ovaca.

[0078] Listeria monocitogenes izaziva bolesti koje se prenose hranom kod ljudi; najteža bolest uzrokovana hranom je meningitis. Posebno je problematično za trudnice gde infekcija može da bude subklinička kod majke, ali fatalna za fetus. Listeriolizin je kritični patogeni faktor za ove bolesti, bez njega bakterija je avirulentna.

[0079] Streptococcus suis je uzročnik septikemije, meningitisa, endokarditisa, artritisa i, povremeno, drugih infekcija kod svinja, i sve je veći problem kod ljudi, sve više i više izbijanja su prijavljeni sa simptomima koji uključuju visoku temperaturu, malaksalost, mučninu i povraćanje, praćeno nervnim simptomima, potkožnim krvarenjem, septičkim šokom i komom.

[0080] Otkriveni su netoksični mutanti prirodnog (divljeg tipa) pneumolizina ("PLY;" SEQ ID NO:1) S. pneumoniae (kodirane mutantima SEQ ID NO:20). Ovi PLY mutanti pokazuju nekoliko potencijalnih prednosti u odnosu na mutant pneumolizina (Pd-B) koji je ranije korišćen za razvoj vakcine, posebno po tome što im suštinski nedostaje hemolitička aktivnost u poređenju sa PLY proteinom divljeg tipa. Na primer, mutantni PLY prema predmetnom pronalasku nemaju sposobnost da se vežu za membrane sisara, pa stoga neće biti podvrgnuti bilo kakvoj strukturnoj promeni koja se obično javlja kada se divlji tip PLY toksina veže za membranu (kao što je slučaj sa Pd-B mutantom (Trp433Phe) opisan prethodno u tekstu).

[0081] Mutanti pneumolizina eliminišu bilo kakvu toksičnu aktivnost toksina, pošto se ne mogu vezati za ćelije sisara. Iako je mutant Pd-B pneumolizina oko 21.000 puta manje toksičan od prirodnog pneumolizina, on i dalje pokazuje dovoljnu toksičnost da bude problematičan u razvoju bilo koje vakcine koje ga uključuje. Čini se da je savremeni razvoj vakcine protiv S. pneumoniae usredsređen na korišćenje pneumolizina sa drugim proteinima koji potiču od S. pneumoniae; stoga se čini da će, bez obzira na druge proteine koji se koriste u vakcini, pneumolizin biti uključen u sve efikasne vakcine protiv S. pneumoniae zbog njegovog značaja za uspostavljanje i napredovanje bolesti.

[0082] Kao što je opisano u nastavku, pokazano je u perfringolizinu, toksinu povezanom sa pneumolizinom, da undekapeptid proteina ne posreduje u vezivanju ovih toksina za ćeliju sisara, suprotno konvencionalnoj mudrosti. Strukture koje posreduju u vezivanju su tri kratke hidrofobne petlje koje su poredane sa undekapeptidom. U skladu sa pronalaskom, sada je poznato da ako se negativno naelektrisani aspartat ili glutamatni ostatak (na primer) stavi unutar bilo koje hidrofobne petlje (u položaju koji već ne sadrži aspartat ili glutamat), vezivanje pneumolizina za membranu je blokiran. Dakle, ova mutacija u jednoj tački eliminiše vezivanje pneumolizina za membrane sisara. Na primer, jedan ostatak asparata ili glutamata zamenjen leucinom 460 pneumolizina praktično potpuno poništava njegovu hemolitičku aktivnost. Pošto je poznato u drugim sistemima (opisanim u nastavku) da ova mutacija blokira vezivanje za membranu ćelija, ona suštinski eliminiše bilo kakvu toksičnu aktivnost (što je čini najmanje 200 puta manje toksičnom od mutanta Pd-B, na primer), ali takođe eliminiše sve moguće nuspojave koje bi mogle biti uzrokovane njegovim vezivanjem za površinu membrana sisara.

[0083] Mutantni pneumolizini ovog pronalaska nemaju hemolitičku aktivnost i sposobnost formiranja pora koja je prisutna u prirodnom proteinu pneumolizina S. pneumoniae. Generalno, polipeptidna komponenta pokazuje manje od oko 30%, manje od oko 20%, manje od oko 10%, manje od oko 5%, manje od oko 1%, manje od oko 0,1%, manje od oko 0,001% ili manje hemolitičke aktivnosti prirodnog proteina pneumolizina S. pneumoniae.

[0084] Mutantni pneumolizini mogu imati supstitucije u jednom ili više od tri ostatka koji se nalaze na obe strane položaja 293, 370, 406 ili 460, uključujući pozicije 290, 291, 292, 294, 295, 296, 367, 367, 36. , 372, 373, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 457, 458, 459, 461, 462 i 463.

[0085] Na primer, ovi ostaci mogu da budu zamenjeni negativno naelektrisanom amino kiselinom, glutamatom ili aspartatom (osim na poziciji 403, koja već sadrži aspartat), ili pozitivno naelektrisanom amino kiselinom lizinom, argininom ili histidinom (osim u pozicije 367 i 407, koje već sadrže ostatke histidina). Alternativno, ovi ostaci mogu da budu zamenjeni bilo kojom drugom prirodnom amino kiselinom (uključujući gli, ala, leu, ile, val, pro, trp, asn, gln, phe, tir, met, cis, thr ili ser) koja poništava vezivanje aktivnost, formiranje pora i/ili hemolitička aktivnost mutanta.

[0086] Kao što je prethodno u tekstu navedeno, sekvenca aminokiselina za divlji tip pneumolizina je SEQ ID NO:1, a reverzni komplement cDNK koji kodira pneumolizin SEQ ID NO:1 je prikazan kao SEQ ID NO:20. cDNK mutantnih pneumolizina (i njihovih reverznih komplemenata) su supstituisane po potrebi da se kodiraju supstituisani proteini (mutanti) opisani ili na drugi način omogućeni ovde, i mogu zauzvrat da obuhvataju bilo koju konzervativnu supstituciju baze (nukleotida) da bi se napravile cDNK koje kodiraju takve mutante.

[0087] Biće cenjeno da polinukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptide mogu da budu izmenjene sa degenerisanim kodonima, ali i dalje kodiraju mutantne polipeptide ovog pronalaska. Shodno tome, polinukleotidi koji se hibridizuju sa polinukleotidnim sekvencama opisanim ovde (ili njihovim komplementarnim sekvencama) mogu imati najmanje 90% identičnosti između sekvenci, ili najmanje 95% identičnosti, ili najmanje 99% identičnosti.

[0088] Slike 1A do 1E pokazuju poravnanje aminokiselinskih sekvenci nativnih verzija CD citolizina identifikovanih ovde. Sekvence su poređane duž tri hidrofobne petlje koje odgovaraju pozicijama 367-373 (druga petlja, L2), 403-409 (treća petlja, L3) i 457-463 (prva petlja, L1) pneumolizina, predstavljenih na Sl. E kao pozicije 586-592 (druga petlja, L2), 622-628 (treća petlja, L3) i 676-682 (prva petlja, L1). Kao što je prethodno u tekstu pomenuto, određeni konkretni (ali neograničavajući) primeri mogu sadržati supstitucije na jednoj ili više ovih pozicija negativno naelektrisanim amino kiselinama, glutaminskom kiselinom ili asparaginskom kiselinom (osim gde pozicija već ima asparaginsku kiselinu), ili pozitivno naelektrisanim amino kiselinama histidinom, lizinom ili argininom (osim histidina gde pozicija već ima histidin, lizinom gde pozicija već ima lizin, ili argininom gde pozicija već ima arginin) ili bilo kojom od ostalih 15 prirodnih aminokiselina navedenih prethodno u tekstu.

[0089] Mutanti mogu dalje da sadrže više od jedne od ovde opisanih supstitucija tako da mutant ima 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 supstituisanih ostataka u jednoj petlji (L1, L2, L3), ili mutant može imati jedan ili više (1 do 7) supstituisanih ostataka u dve petlje (npr. L1 i L2, L1 i L3, L2 i L3), ili jedan ili više supstituisanih ostataka (1 do 7) u svakoj od tri petlje (L1, L2 i L3), pri čemu su supstitucije izabrane od onih koje su ovde navedene; na primer, mutant može imati 1 do 7 supstitucija u prvoj petlji (L1), i/ili 1 do 7 supstitucija u drugoj petlji (L2), i/ili 1 do 7 supstitucija u trećoj petlji (L3). Na primer, gde je prirodni ostatak pozitivno naelektrisan, supstituisani ostatak može da bude negativno naelektrisan, a gde je prirodni ostatak negativno naelektrisan, supstituisani ostatak može da bude pozitivno naelektrisan. Alternativno, aspartat može da bude zamenjen glutamatom, histidinom, argininom ili lizinom, ili glutamat može da bude zamenjen aspartatom, lizinom, histidinom ili asparaginom, ili arginin može da bude zamenjen drugom pozitivno naelektrisanom amino kiselinom.

[0090] Položaji aminokiselina petlje 1, petlje 2 i petlje 3 svakog CDC opisanog ovde su navedeni u tabeli 1.

Tabela 1: Aminokiselinke pozicije koje odgovaraju petljama domena 4

[0091] Mutanti ili njihovi antigeni fragmenti mogu se koristiti u analitičkim metodama za detekciju prisustva alternativnih oblika proteina u biološkim uzorcima korišćenjem tehnika poznatih u tehnici, na primer ELISA.

[0092] Nukleinske kiseline koje kodiraju alelne varijante proteinskih mutanata, pri čemu se alelne varijante mutanata proteina razlikuju od proteinskih mutanata za manje od 15% identiteta svojih aminokiselina, na primer, najmanje 85% amino kiselina alelne varijante je identično mutantnom proteinu, a 100% aminokiselina u prvoj, drugoj, i trećoj petlji (L1, L2 i L3) su identične onima u mutantnom proteinu. Na primer, alelne varijante mogu da se razlikuju od proteinskih mutanata za manje od 12% identiteta svojih aminokiselina, za manje od 10% identiteta svojih aminokiselina, za manje od 8% identiteta svojih aminokiselina, za manje od 6% identiteta svojih aminokiselina, za manje od 4% njihovog identiteta, za manje od 2% identiteta svojih aminokiselina, ili za manje od 1% identiteta svojih aminokiselina, od ovde opisanih proteinskih mutanata.

[0093] Poravnavanje izabranih sekvenci da bi se odredio "% identičnosti" između dve ili više sekvenci, može se izvršiti korišćenjem, na primer, programa CLUSTAL-W u MacVector verziji 6.5, koji radi sa podrazumevanim parametrima, uključujući kaznu otvorene praznine od 10,0, kaznu produžene praznine od 0,1, i BLOSUM 30 matricu sličnosti.

[0094] Termin "identičnost sekvence" kako se ovde koristi znači da se sekvence porede na sledeći način. Sekvence su poravnate pomoću verzije 9 programa GAP (program globalnog poravnanja) grupe Genetic Computing Group, koristeći podrazumevanu (BLOSUM62) matricu (vrednosti od -4 do 11) sa kaznom otvorene praznine od -12 (za prvu nulu praznine) i kaznu produžene praznine od -4 (po svakoj dodatnoj uzastopnoj nuli u praznini). Nakon poravnanja, procenat identičnosti se izračunava izražavanjem broja podudaranja kao procenta od broja aminokiselina u traženoj sekvenci.

[0095] Imunogene kompozicije mogu da uključuju formulacije vakcine koje mogu da se koriste u količini efikasnoj za izazivanje (stimulaciju) protektivnog imunskog odgovora kod životinje. Na primer, generisanje protektivnog imunskog odgovora može da se meri razvojem antitela. Količine mutantnih pneumolizina koje mogu da formiraju protektivni imunski odgovor obično su u jediničnom doznom obliku od oko 0,001 µg do 100 mg po kg telesne težine, kao što je, ali ne ograničeno na, oko 0,01 µg do 1 mg/kg telesne težine, ili oko 0,1 µg do oko 10 µg/kg telesne težine, na primer, u intervalu od oko 1 do 6 nedelja između imunizacija.

[0096] Bilo koja od imunogenih kompozicija može da se primenjuje kod pacijenta koji je inficiran organizmom koji izaziva bolest ili predisponiran na infekciju organizmom koji izaziva bolest. Imunogena kompozicija je suštinski netoksična (ili suštinski netoksična u poređenju sa prirodnim PLY proteinom), ne vezuje se suštinski za ćelijske membrane, suštinski je nehemolitična i/ili je stabilna kao, ili značajno stabilnija, od PLY proteina.

[0097] Bilo koja od imunogenih kompozicija može da se primenjuje kod inficiranog pacijentu ili pacijenta predisponiranog na infekciju. Imunogena kompozicija je suštinski netoksična (ili suštinski netoksična u poređenju sa prirodnim PLY proteinom), ne vezuje se suštinski za ćelijske membrane, suštinski je nehemolitična i/ili je stabilna kao, ili značajno stabilnija od, nativnog PLY proteina. Mutantni polipeptidi pneumolizina mogu da imaju oko 100000 puta manju hemolitičku aktivnost od polipeptida pneumolizina divljeg tipa. Mutantni polipeptidi pneumolizina mogu da imaju oko 150000 puta manju hemolitičku aktivnost od polipeptida pneumolizina divljeg tipa. Mutantni polipeptidi pneumolizina mogu imati oko 200.000 puta manju hemolitičku aktivnost od polipeptida pneumolizina divljeg tipa. Mutantni polipeptidi pneumolizina imaju oko 250000 puta manju hemolitičku aktivnost od polipeptida pneumolizina divljeg tipa. Prečišćeni mutantni polipeptidi pneumolizina imaju povećan prinos nakon prečišćavanja u odnosu na mutantni polipeptid pneumolizina koji ima supstituciju samo na jednoj od pozicija aminokiselina 293, 294, 458, 459 i 460. Povećani prinos rekombinanta može da bude, na primer, najmanje oko 10X , najmanje oko 15X, najmanje oko 17X ili najmanje oko 20X.

[0098] Imunogene kompozicije mogu da se primenjuju kod životinja koje su inficirane ili mogu da postanu inficirane organizmima koji izazivaju bolest, a koji su ovde opisani, uključujući, ali bez ograničenja na, pse, mačke, zečeve, glodare, konje, stoku (npr. goveda, ovce, koze, i svinje), životinje u zoološkim vrtovima, kopitare, primate i ljude.

[0099] Kao što je prethodno u tekstu napomenuto, imunogena kompozicija (kao što je, ali bez ograničenja na, vakcina) može da se primeni kod subjekta u cilju stimulacije imunogenog odgovora kod subjekta. Imunogena kompozicija/vakcina može da sadrži druge proteine ili proteinske subjedinice iz S. pneumoniae, ili može da sadrži kapsularni polisaharidni materijal kombinovan sa, ili konjugovan sa, pneumolizinskim mutantima ili drugim proteinima u imunogenoj kompoziciji/vakcini. Na primer, kapsularni materijal može da bude izveden iz bilo kog, ili više, od serotipova S. pneumoniae 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 27, 33F ili 34, ili drugih serotipova pozbatih u stanju tehnike. Kao što je napomenuto, imunogena kompozicija/vakcina može da sadrži pomoćno sredstvo i/ili druge farmaceutski prihvatljive ekscipijense. Polisaharidi mogu da se konjuguju sa mutantom, na primer, preko monomerne veze (samo jedan kraj polisaharida je vezan za polipeptid), veze preko petlje (jedan polipeptid je vezan za polisaharide sa petljom) ili unakrsnog povezivanja (više polisaharida povezanih za više polipeptida).

[0100] Imunogene kompozicije ili vakcine koje sadrže mutantne pneumolizine iz predmetnog pronalaska ili njihove fragmente, mogu da se koriste za lečenje bolesti i stanja povezanih sa Streptococcus pneumoniae, kao što su, ali bez ograničenja, pneumonija, meningitis, bakteremija i upala srednjeg uha.

[0101] U nekim primerima izvođenja, mutantni pneumolizini su korisni za izazivanje stimulacije proliferacije T-ćelija ili generisanjeantitela stimulacijom B ćelija.

[0102] Kao što je prethodno u tekstu napomenuto, imunogena kompozicija prema predmetnom pronalasku može da se formira kombinovanjem mutantnih pneumolizina sa farmaceutski (fiziološki) prihvatljivim ekscipijensom, kao što je (ali bez ograničenja na) fiziološki rastvor ili puferovani slani rastvori na neutralnom pH (kao što je kao fiziološki rastvor puferovan fosfatom).

[0103] Na primer, za kompozicije vakcina, fragmenti su dovoljno veliki da stimulišu protektivni imunski odgovor. Polipeptidna komponenta mora da bude dužine koja je dovoljna da izazove takav pojačani imuni odgovor. Za fragmente CD citolizinskog proteina koji se javlja u prirodi, dužinafragmenata iznosi najmanje oko 8, najmanje oko 10, najmanje oko 25, najmanje oko 50, najmanje oko 75, najmanje oko 100, najmanje oko 125, najmanje oko 150, najmanje oko 175, najmanje oko 200, najmanje oko 250, najmanje oko 300, najmanje oko 350, najmanje oko 400, najmanje oko 425, najmanje oko 450, najmanje oko 460, najmanje oko 465, ili više, aminokiselina.

[0104] Fragmenti mogu da sadrže delove peptida sa različitih lokacija mutanata koji su međusobno spojeni. Fragmenti mogu da uključuju jednu ili više od tri petlje koje su ovde razmatrane.

[0105] Mutirani pneumolizini su takođe korisni za generisanje neutrališućih antitela koja mogu da se koriste kao pasivni imuni serum za lečenje ili ublažavanje simptoma kod pacijenata. Imunogena kompozicija kao što je prethodno u tekstu opisana može da se primenjuje kod životinje (kao što je konj ili čovek) sve dok se ne generiše neutrališući odgovor antitela. Ova neutrališuća antitela zatim mogu da se sakupe, prečiste i koriste za lečenje pacijenata koji prikazuju simptome.

[0106] Ova neutrališuća antitela se primenjuju kod pacijenata koji prikazuju simptome bolesti, u količini efikasnoj za neutralizaciju efekta patogena. Neutrališuća antitela mogu da se primenjuju intravenski, intramuskularno, intradermalno, subkutano i slično. Konkretna ruta je intravenska, ili za lokalizovanu infekciju, topikalna, na mestu oštećenja tkiva, uz debridman. Neutrališuće antitelo takođe može da se primenjuje u kombinaciji sa antibiotskom terapijom. Neutrališuće antitelo može da se primenjuje sve dok se ne postigne smanjenje šoka ili oštećenja tkiva u jednoj ili više doza. Količina neutrališućih antitela koja se tipično primenjuje je oko 1 mg do oko 1000 mg antitela po kg telesne težine, kao što je, ali bez ograničenja na, oko 50 mg do oko 200 mg antitela po kg telesne težine.

[0107] Imunogene kompozicije mogu da se pripremaju kao farmaceutske kompozicije koje sadrže imunoprotektivnu, netoksičnu količinu najmanje jednog od mutantnih pneumolizina u netoksičnom i sterilnom farmaceutski prihvatljivom ekscipijensu.

[0108] Imunogene kompozicije se mogu davati odgovarajućem subjektu na bilo koji pogodan način poznat u tehnici, uključujući (ali bez ograničenja) oralno intramuskularno, intravenozno, sublingvalno mukoznu, intraarterijsko, intratekalno, intradermalno, intraperitonealno, intranazalno, intrapulmonarno , intravaginalno, intrarektalno i/ili subkutano. Oni se mogu uneti u gastrointestinalni trakt ili respiratorni trakt, na primer, inhalacijom rastvora ili praha koji sadrži imunogeni sastav. Parenteralna primena, ako se koristi, generalno se karakteriše injekcijom. Injekcioni preparati se mogu pripremiti u konvencionalnim oblicima, bilo kao tečni rastvori ili suspenzije, čvrsti oblici pogodni za rastvor ili suspenziju u tečnosti pre injekcije, ili kao emulzije.

[0109] Imunogena kompozicija (npr. vakcina) se primenjuje u količini dovoljnoj da izazove proizvodnju antitela kao deo imunogenog odgovora. Doziranje za bilo kog datog pacijenta zavisi od mnogih faktora, uključujući veličinu pacijenta, opšte zdravlje, pol, površinu tela, starost, određeno jedinjenje koje se primenjuje, vreme i put primene i druge lekove koji se primenjuju istovremeno. Određivanje optimalne doze je u okviru sposobnosti farmakologa uobičajene veštine. Neograničavajući opseg efektivnih količina mutantnog pneumolizina koje se mogu davati subjektu je, na primer, oko 10 ng proteina do 100 mg po kg telesne težine, kao što je oko 0,1 µg proteina do oko 1 mg po kg telesne težine. U najmanje jednoj neograničavajućoj varijanti, doza koja je data je u opsegu od oko 0,25 µg do oko 25 µg proteina, sa ili bez pomoćnih sredstava.

[0110] Kada se imunogeni preparat primenjuje parenteralno, preko intramuskularnog ili dubokog subkutanog puta, mutantni pneumolizin može (u određenim posebnim ali neograničavajućim primerima izvođenja) da se pomeša ili apsorbuje sa bilo kojim konvencionalnim adjuvansom da bi privukao ili poboljšao imuni odgovor. Takvi adjuvansi uključuju, ali nisu ograničeni na aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat, muramil dipeptid, bakterijske lipopolisaharide i derivate i prečišćene saponine iz QuilA. Protein se takođe može predstaviti imunskom sistemu unutar mikročestica kao što su lipozomi ili imunostimulišući kompleksi (ISCOM). Kao što je napomenuto, formulacija koja sadrži fragmente mutantnog proteina/peptida može da bude dizajnirana za oralnu ili intranazalnu ingestiju.

[0111] Terapeutski efikasnu i netoksičnu dozu imunogenih kompozicija može odrediti osoba sa uobičajenim iskustvom u ovoj oblasti. Na primer, specifična doza za bilo kog subjekta može zavisiti od niza faktora uključujući (ali bez ograničenja na) starost, opšte zdravlje, ishranu pacijenta, vreme i način primene, sinergističke efekte sa drugim lekovima koji se primenjuju i da li imunogeni sastav se primenjuje više puta. Ako je potrebno, imunogena kompozicija će se primenjivati više puta u intervalima od jednog do tri meseca između svake doze i sa opcionom dodatnom dozom kasnije u vremenu. Stvarni postupci za pripremu odgovarajućih doznih oblika su poznati ili će biti očigledni stručnjacima u ovoj oblasti; pogledajte, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, najnovije izdanje.

[0112] Polinukleotidi koji kodiraju mutantne polipeptide i aktivne fragmente mogu da budu u obliku RNK ili u obliku DNK (uključujući, ali bez ograničenja na, cDNK, genomsku DNK i sintetičku DNK). DNK može da bude dvolančana ili jednolančana, a ako je jednolančana, može da bude kodirajuća ili nekodirajuća (anti-sense) lanac.

[0113] U tabeli 2 su prikazane DNK sekvence (i odgovarajuće aminokiselinske sekvence) koje direktno kodiraju (ili kodiraju preko reverznog komplementa) nativne sekvence CD citolizina i na taj način takođe mogu da budu mutirane da formiraju mutantne oblike.

Tabela 2: Sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina nativnih oblika CD citolizina

[0114] Ćelije-domaćini su genetski modifikovane (transdukovane, transformisane i/ili transfektovane) vektorima koji sadrže polinukleotid koji kodira mutantni polipeptid prema predmetnom pronalasku. Vektor može da bude, na primer, u obliku plazmida, virusne čestice, faga, itd. Konstruisane ćelije-domaćini mogu da se gaje u konvencionalnim hranljivim medijumima koji mogu da se modifikuju na odgovarajući način u cilju aktiviranja promotora, selekcije transformanata ili amplifikacije polinukleotida koji kodiraju ove polipeptide. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su isti kao oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom-domaćinom koja je odabrana u cilju ekspresije, i biće očigledni prosečnom stručnjaku u oblasti. Vektori uključuju hromozomske, nehromozomske i sintetičke DNK sekvence, npr. derivate SV40; bakterijske plazmide; DNK faga; bakulovirus; plazmide kvasca; vektore dobijene iz kombinacija plazmida i DNK faga, DNK virusa kao što je vakcinija, adenovirus, virus boginja živine i pseudorabies. Međutim, bilo koji drugi vektor može da se koristi pod uslovom da može da se replicira i da je vijabilan u domaćinu.

[0115] Odgovarajuća DNK sekvenca može da se inserira u vektor različitim postupcima. U principu, sekvenca DNK se inserira u odgovarajuće mesto(a) restrikcione endonukleaze postupcima poznatim u satnju tehnike. Smatra se da takvi i drugi postupci spadaju u delokrug stručnjaka.

[0116] DNK sekvenca u ekspresionom vektoru je operativno vezana za odgovarajuću(e) kontrolnu(e) sekvencu(e) ekspresije (promotor) za usmeravanje sinteze iRNK. Kao reprezentativni primeri takvih promotora, mogu se navesti: LTR ili SV40 promotor, E. coli lac ili trp, fag lambda PL promotor i drugi promotori za koje se zna da kontrolišu ekspresiju gena u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama ili njihovim virusima. Ekspresioni vektor takođe sadrži mesto vezivanja ribozoma za iniciranje translacije i terminator transkripcije. Vektor takođe može uključiti odgovarajuće sekvence za pojačavanje ekspresije.

[0117] Pored toga, ekspresioni vektori mogu sadržati jedan ili više selektivnih markerskih gena da obezbede fenotipsku osobinu za selekciju transformisanih ćelija domaćina, kao što je rezistencija na dihidrofolat reduktazu ili neomicin za eukariotsku ćelijsku kulturu, ili kao što je otpornost na tetraciklin ili ampicilin u E. coli.

[0118] Vektor koji sadrži pogone DNK sekvence koje su prethodno opisane u tekstu, kao i pogodan promotor ili kontrolnu sekvencu, mogu da se primene za transformaciju pogodnog domaćina koja bi omogućila da domaćin eksprimira proteine.

[0119] Kao reprezentativni (ali neograničavajući) primeri pogodnih domaćina, mogu da se pomenu: bakterijske ćelije, kao što su E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; ćelije gljiva kao što su kvasti, ćelije insekata kao što su Drosophila S2 i Spodoptera Sf9; ćelije životinja, kao što su CHO, COS ili Baues melanoma; adenovirusi; ćelije biljaka, itd. Smatra se da je odabir pogodne ćelije-domaćina u obimu sposobnosti stručnjaka u oblasti, na osnovu ovde datih uputstava.

[0120] Rekombinantni konstrukti mogu da sadrže jednu ili više sekvenci kako je ovde opisano i omogućeno. Konstrukti sadrže vektor, kao što je plazmid ili virusni vektor, u koji je inserirana polinukleotidna sekvenca u direktnoj ili reverznoj orijentaciji. Konstrukt može dalje da sadrži regulatorne sekvence, uključujući, na primer, promotor koji je operativno vezan sa sekvencom. Stručnjacima je poznat veliki broj pogodnih vektora i promotora koji su komercijalno dostupni. Sledeći vektori su dati kao neograničavajući primer. Bakterijski: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen, Inc., Hilden, Germany), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pBS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene, San Diego, CA); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia, Stockholm, Švedska). Eukariotski: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene, San Diego, CA) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia, Stockholm, Švedska). Međutim, bilo koji drugi plazmid ili vektor može da se koristi pod uslovom da može da se replicira i da je vijabilan u domaćinu.

[0121] Promotorski regioni mogu da se izaberu iz bilo kog željenog gena korišćenjem CAT (hloramfenikol transferaza) vektora ili drugih vektora sa selektivnim markerima. Dva odgovarajuća vektora su pKK232-8 i pCM7. Konkretni imenovani bakterijski promotori uključuju lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PLi TRP. Eukariotski promotori uključuju CMV intermedijerni rani, HSV timidin kinazu, rani i kasni SV40, LTR ponovke iz retrovirusa, mišiji metalotionein-I. Odabir pogodnog vektora i promotora je sasvim na nivou sposobnosti prosečnog stručnjaka u oblasti.

[0122] Ćelije-domaćini koje sadrže prethodno opisane konstrukte mogu da budu ćelija viših eukariota, kao što je (ali bez ograničenja na) ćelija sisara; ćelija nižih eukariota, kao što je (ali bez ograničenja na) ćelija kvasca; ili prokariotska ćelija, kao što je (ali bez ograničenja na) bakterijska ćelija. Uvođenje konstrukta u ćeliju-domaćina može da se izvrši transfekcijom pomoću kalcijum fosfata, transfekcijom posredovanom DEAE-dekstranom, elektroporacijom (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York, NY), ili bilo kojom drugom pogodnom tehnikom.

[0123] Konstrukti u ćelijama-domaćinima mogu da se koriste na konvencionalan način za proizvodnju genskog proizvoda kodiranog rekombinantnom sekvencom. Alternativno, polipeptidi mogu da se proizvode sintetički pomoću konvencionalnih peptidnih sintetizera.

[0124] Zreli proteini mogu da se eksprimiraju u ćelijama sisara, kvasca, bakterija ili drugim ćelijama, pod kontrolom odgovarajućih promotora. Translacioni sistemi bez ćelija takođe mogu da se koriste za proizvodnju ovih proteina koristeći RNK koje su dobijene od DNK konstrukata. Odgovarajuće vektore za kloniranje i ekspresiju, za upotrebu sa prokariotskim i eukariotskim domaćinima, opisali su Green i Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (2012)).

[0125] Transkripcija DNK koja kodira mutantne polipeptide od strane viših eukariota može se povećati umetanjem enhenserske sekvence u vektor. Enhenseri su cis-delujući elementi DNK, obično oko 10 do 300 bp koji deluju na promotor da bi povećali njegovu transkripciju. Primeri uključuju enhenser SV40 na drugoj strani oridžina replikacije bp 100 do 270, enhenser ranog promotora citomegalovirusa, enhenser polioma na drugoj strani oridžina replikacije i adenovirusni enhenser.

[0126] Generalno, rekombinantni ekspresioni vektori će uključivati poreklo replikacije i selektivne markere koji dozvoljavaju transformaciju ćelije domaćina, npr. gen otpornosti na ampicilin E. coli i S. cerevisiae TRP1 gena, i promotor izveden iz visoko eksprimiranog gena za direktnu transkripciju nizvodne strukturne sekvence. Takvi promotori mogu biti izvedeni iz operona koji kodiraju glikolitičke enzime kao što su 3-fosfoglicerat kinaza (PGK), α-faktor, kisela fosfataza ili proteini toplotnog šoka, između ostalog. Heterologa strukturna sekvenca se sklapa u odgovarajuću fazu sa sekvencama inicijacije i terminacije translacije. Opciono, heterologa sekvenca može da kodira fuzioni protein uključujući peptid za identifikaciju N-terminusa koji daje željene karakteristike, npr. stabilizaciju ili pojednostavljeno prečišćavanje eksprimovanog rekombinantnog proizvoda.

[0127] Korisni ekspresioni vektori za bakterijsku upotrebu su konstruisani umetanjem strukturne DNK sekvence koja kodira željeni protein zajedno sa odgovarajućim inicijacijskim i terminacionim signalima translacije u operativnoj fazi čitanja sa funkcionalnim promotorom. Vektor će sadržati jedan ili više fenotipskih selektabilnih markera i poreklo replikacije kako bi se obezbedilo održavanje vektora i, ako je poželjno, obezbedila amplifikacija unutar domaćina.

[0128] Kao reprezentativan, ali neograničavajući primer, korisni ekspresioni vektori za bakterijsku upotrebu mogu da sadrže selektabilni marker i bakterijsko poreklo replikacije izvedeno iz komercijalno dostupnih plazmida koji sadrže genetske elemente dobro poznatog vektora za kloniranje pBR322 (ATCC 37017). Takvi komercijalni vektori uključuju, na primer, pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscatavai, N.J., SAD) i pGEM1 (Promega, Madison, Vis., SAD). Ovi pBR322 delovi "kičme" su kombinovani sa odgovarajućim promotorom i strukturnom sekvencom koja se eksprimira.

[0129] Posle transformacije odgovarajućeg soja domaćina i rasta soja domaćina do odgovarajuće gustine ćelija, odabrani promotor se indukuje odgovarajućim sredstvima (npr. promena temperature ili hemijska indukcija), a ćelije se kultivišu u dodatnom periodu.

[0130] Ćelije se obično sakupljaju centrifugiranjem, razbijaju se fizičkim ili hemijskim sredstvima, a dobijeni sirovi ekstrakt se zadržava za dalje prečišćavanje.

[0131] Mikrobne ćelije koje se koriste u ekspresiji proteina mogu biti poremećene bilo kojim pogodnim metodom, uključujući ciklus zamrzavanja-odmrzavanja, sonikaciju, francusku štampu, mehaničko ometanje ili upotrebu agenasa za lizu ćelija, takvi postupci su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Međutim, može biti poželjno (ali neograničavajući) da se koriste ćelije-domaćini koje luče polipeptide i dozvoljavaju oporavak polipeptida iz medijuma za gajenje.

[0132] Za ekspresiju rekombinantnog proteina mogu se koristiti i različiti sistemi kultura ćelija sisara. Primeri ekspresionih sistema kod sisara uključuju COS-7 linije fibroblasta bubrega majmuna, koje je opisao Gluzman (Cell (1981) 23:175), i druge ćelijske linije sposobne da eksprimiraju kompatibilni vektor, na primer, C127, 3T3, CHO, HeLa i BHK ćelijske linije. Ekspresioni vektori sisara će sadržati početak replikacije, pogodan promotor i enhenser, kao i sva neophodna mesta vezivanja ribozoma, mesto poliadenilacije, donorska i akceptorska mesta splajsovanja, sekvence terminacije transkripcije i 5' bočne netranskribovane sekvence. DNK sekvence izvedene iz mesta splajsovanja SV40 i poliadenilacije mogu da se koriste za obezbeđivanje potrebnih netranskribovanih genetskih elemenata.

[0133] Polipeptidi mogu da se izdvoje i/ili prečiste iz rekombinantnih ćelijskih kultura dobro poznatim metodama za izdvajanje i prečišćavanja proteina. Takva metodologija može da uključuje precipitaciju amonijum sulfatom ili etanolom, ekstrakciju kiseline, anjonsku ili katjonsku izmenjivačku hromatografiju, fosfoceluloznu hromatografiju, hromatografiju hidrofobnih interakcija, afinitetnu hromatografiju, hromatografiju na hidroksilapatitu i lektinsku hromatografiju. Koraci ponovnog savijanja proteina mogu da se koriste, po potrebi, kako bi se kompletirala konfiguracija zrelog proteina. U tom smislu, u takvom postupku ponovnog savijanja mogu da se koriste šaperoni. Na kraju, tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) može da se koristi za završne korake prečišćavanja.

[0134] Mutantni polipeptidi koji su korisni kao imunogeni upredmetnom pronalasku mogu da budu proizvodi postupaka hemijske sinteze ili proizvodi rekombinantnih tehnika iz prokariotskog ili eukariotskog domaćina (na primer, bakterija, kvasca, viših biljaka, insekata i sisarskih ćelija u kulturi ), kao što je prethodno objašnjeno. U zavisnosti od domaćina koji se koristi u postupku rekombinantne proizvodnje, mutantni polipeptidi mogu da budu glikozilovani ili ne-glikozilovani.

[0135] Individualno eksprimirani polipeptidi mogu da se izoluju metodama rekombinantne ekspresije/izolacije koje su dobro poznate u tehnici. Tipični primeri za ove metode izolacije mogu da koriste antitelo na kozervativni region proteina ili na His oznaku ili odvojivu vodeću sekvencu ili rep koji je eksprimiran kao deo strukture proteina.

[0136] Fragment je varijanta polipeptida koja ima aminokiselinsku sekvencu koja je potpuno ista kao deo, ali ne i celina, aminokiselinske sekvence nativnih ili mutantnih polipeptida. Fragmenti mogu da budu "samostojeći" ili sadržani u okviru većeg polipeptida čiji deo ili region fragment formira, recimo (ali bez ograničenja) u vidu jednog kontinuiranog regiona. Posebni neograničavajuči fragmenti su biološki aktivni fragmenti, a to su oni fragmenti koji posreduju u aktivnostima polipeptida uključujući polipeptide sa sličnom aktivnošću ili poboljšanom aktivnošću ili sa smanjenom aktivnošću. Takođe su uključeni oni fragmenti koji su antigeni ili imunogeni kod životinje, posebno kod čoveka. Fragmenti mutantnog CD citolizina mogu da budu na primer (ali bez ograničenja) dužine najmanje oko 20-100 aminokiselina ili oko 100-200 aminokiselina.

[0137] Nukleinske kiseline koje kodiraju mutante CD citolizina mogu da hibridizuju sa odgovarajućom prirodnom sekvencom pod strogim uslovima hibridizacije. Primer veoma strogih uslova uključuje hibridizaciju na oko 42°C u 50% formamidu, 5 X SSC, 5 X Denhartovom rastvoru, 0,5% SDS i 100 µg/ml denaturisane DNK nosača, nakon čega sledi dva puta ispiranje u 2 X SSC i 0,5% SDS na sobnoj temperaturi i dva dodatna puta u 0,1 X SSC i 0,5% SDS na 42°C.

Konstrukti nukleinskih kiselina/Ekspresioni vektori

[0138] Kao što je napomenuto, nukleinske kiseline mogu da se inkorporiraju u heterologe konstrukte ili vektore nukleinskih kiselina koji su sposobni za uvođenje i replikaciju u ćelijidomaćinu. Bilo koji vektor može da se koristi pod uslovom da može da se replicira i da je vijabilan u ćelijama u koje je uveden. Veliki broj pogodnih vektora i promotora je poznat stručnjacima i komericijalno dostupan. Odgovarajuća DNK sekvenca može da se inserira u plazmid ili vektor (koji se ovde zajednički nazivaju "vektori") različitim procedurama. U principu, DNK sekvenca se inserira u odgovarajuće mesto(a) restrikcione endonukleaze standardnim procedurama. Smatra se da su takvi postupci i srodni postupci subkloniranja unutar obima znanja stručnjaka u ovoj oblasti.

[0139] Heterologi konstrukti nukleinske kiseline mogu uključivati kodirajuću sekvencu za mutantne pneumolizine ili njihove fragmente: (i) izolovano; (ii) u kombinaciji sa dodatnim kodirajućim sekvencama, kao što su (ali bez ograničenja) sekvence koje kodiraju fuzioni protein ili signalni peptid, gde je mutantna kodirajuća sekvenca CDC dominantna kodirajuća sekvenca; (iii) u kombinaciji sa nekodirajućim sekvencama, kao što su (ali bez ograničenja na) introni i kontrolni elementi, kao što su elementi promotora i terminatora ili 5' i/ili 3' netranslatirani regioni, efikasni za ekspresiju kodirajuće sekvence u pogodnom domaćinu; i/ili (iv) u vektoru ili okruženju domaćina u kome je mutantna sekvenca koja kodira CDC heterologi gen.

[0140] Odgovarajući vektori su tipično opremljeni sekvencom nukleinske kiseline koja kodira marker koji može da selektuje, mestima umetanja i odgovarajućim kontrolnim elementima, kao što su sekvence promotora i terminacije. Vektor može da sadrži regulatorne sekvence, uključujući, na primer, nekodirajuće sekvence kao što su introni i kontrolni elementi, tj. elementi promotora i terminatora ili 5' i/ili 3' netranslatirani regioni, efikasni za ekspresiju kodirajuće sekvence u ćelijama domaćina (i/ili u vektoru ili okruženju ćelije domaćina u kome modifikovana rastvorljiva proteinska kodirajuća sekvenca antigena nije normalno eksprimirana), operativno vezana za kodirajuću sekvencu. Stručnjacima je poznat veliki broj odgovarajućih vektora i promotora, od kojih su mnogi komercijalno dostupni.

[0141] Primeri promotora uključuju i konstitutivne promotore i inducibilne promotore, čiji primeri uključuju CMV promotor, SV40 rani promotor, RSV promotor, EF-1α promotor, promotor koji sadrži tet-responsivni element (TRE) u sistemu sa uključenim tet i isključenim tet, promotor beta aktina i metalotioneinski promotor koji može da se aktivira dodatkom određenih metalnih soli. Promotorska sekvenca je DNK sekvenca koju prepoznaje ćelijadomaćin u svrhu ekspresije. Operativno je vezan za DNK sekvencu koja kodira mutantni polipeptid.

[0142] Osim ako nije drugačije naznačeno, primena kompozicija i metoda koristi konvencionalne tehnike molekularne biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK i imunologije, koje su u okviru veštine prosečnog stručnjaka u ovoj oblasti.

PRIMERI

[0143] Primeri su dati u nastavku teksta. Međutim, primeri izvođenja prema predmetnom pronalasku nisu ograničeni u primeni na specifične eksperimente, rezultate i laboratorijske procedure koje su ovde opisane. Predviđeno je da se primeri i posmatraju samo kao primeri, a ne kao sveobuhvatni.

[0144] Primer 1 nije prema pronalasku.

[0145] Citolizini zavisni od holesterola (CD citolizini) su velika porodica polipeptidnih toksina koji formiraju pore koje proizvodi više od 20 različitih vrsta Gram-pozitivnih bakterija1. U početku, bakterije luče ove toksine kao stabilne monomere rastvorljive u vodi. Monomer se vezuje za membrane i prolazi kroz specifičan niz strukturnih promena, što promoviše oligomerizaciju i formiranje pora. Kao što ime kaže, mehanizam formiranja pora CD citolizina apsolutno zavisi od membranskog holesterola za njegov mehanizam stvaranja pora. Već nekoliko decenija postoji dogma da je holesterol receptor za ove toksine i da je očuvani undekapeptid, koji se nalazi u domenu 4 (D4) CD citolizina (sl. 2), važan za interakciju CD citolizina sa holesterolom<2-4>. Međutim, druge studije su sugerisale da undekapeptid ne posreduje u inicijalnomvezivanju ovih CD citolizina za membrane bogate holesterolom<5,6>. Stoga su strukturne komponente ovih CD citolizina koje posreduju u njihovom vezivanju za holesterol bile nejasne pre ovog rada.

[0146] Osetljivost mehanizma CD citolizina na oksidaciju poznata je više od 80 godina<7>, a ova osobina je odgovorna za naziv „citolizini aktivirani tiolom“ koji je prvobitno dat ovim toksinima (pregled dat u referenci 8). Oksidacija ove tiolne grupe dovodi do značajnog gubitka citolitičke aktivnosti, često >99%<2>. Kasnije je analizom sekvenci velikog broja CD citolizina pokazano da se cistein koji ima osetljivu tiol grupu nalazi u konzervativnom undekapeptidu (ECTGLAWEWWR-SEQ ID NO:39), pošto je to jedini cistein prisutan u većini sekvenciranih CD citolizina. Pretpostavlja se da je gubitak citolitičke aktivnosti povezan sa oksidacijom ove tiolne grupe rezultat promena u vezivanju za membrane bogate holesterolom<2>, čime se uspostavlja pretpostavljena veza između vezivanja za membranu i undekapeptida. Visoko konzervisana priroda undekapeptida takođe ukazuje na visoko očuvanu funkciju, možda koja posreduje u direktnoj interakciji sa membranskim holesterolom.

[0147] Dogma da je holesterol receptor za CD citolizini bila je zakomplikovana otkrićem intermedilizina (ILY), CD citolizina koga sekretuje Streptococcus intermedius. Za razliku od drugih CD citolizina, ILY je specifičan za ljudske ćelije<9,10>, što je karakteristika koja se objašnjava njegovom sposobnošću da se specifično veže za humani CD59, specifični inhibitor kompleksa komplementa za napad na membrane<11,12>, a ne na membrane bogate holesterolom<13>. Prema tome, sada postoje najmanje dve klase CD citolizina, ILY koji se vezuje za specifični nesterolni receptor i PFO-slični CD citolizini koji se direktno vezuju za membrane bogate holesterolom. Ipak, citolitički mehanizmi oba tipa CD citolizina su osetljivi na membranski holesterol i nijedan nije aktivan na membranama u kojima je količina holesterola uznačajno smanjena<14>. Ove studije su, dakle, predstavljale enigmu; da li holesterol doprinosi ILY mehanizmu na značajno drugačiji način nego PFO-slični CD citolizini, ili postoji zajednička molekularna osnova za doprinos holesterola obema klasama CD citolizina?

[0148] Gidings et al.<14>su pokazali da smanjenje holesterola u hRBC membranama blokira konverziju prepora u pore za sve CD citolizine, ali takođe utiče na vezivanje CD citolizina sličnog PFO za membranu. Soltani i sar.<15>su pokazali da ometanje insercije L1-L3 D4 petlji u membranu (sl. 2) ILY takođe blokira konverziju prepora u pore. Stoga, dva različita fenomena blokiraju konverziju prepora u pore u ILY, smanjenje membranskog holesterola<14>i poremećaj umetanja L1-L3 petlji u membrane<15>.

[0149] Na osnovu ovih zapažanja, izvršeno je detaljno ispitivanje interakcije D4 petlji i undekapeptida ILY i PFO sa membranama. Rezultati ovih studija pokazuju da su L1-L3 petlje u bazi domena 4 primarne strukture koje prepoznaju membrane bogate holesterolom, a ne undekapeptid. Interakcija ovih petlji sa membranama bogatim holesterolom posreduje u interakciji PFO sa membranama bogatim holesterolom, dok je njihova insercija u membranu takođe neophodna za konverziju prepora u pore i kod PFO i kod ILY. Dakle, ovi rezultati sada obezbeđuju strukturnu osnovu za osetljivost CD citolizina na holesterol i obezbeđuju objedinjujuće objašnjenje za efekat holesterola i na ILY i na PFO-slične CD citolizine, koji koriste različite membranske receptore.

Materijali i metode u primeru 1

Bakterijski sojevi, plazmidi i hemikalije

[0150] Geni za ILY i PFO su klonirani u pTrcHisA (Invitrogen) kao što je prethodno opisano<14,16>. Sve mutacije su napravljene na pozadini nativnog ILY (prirodno bez cisteina) ili PFO bez cisteina (PFO<C459A>). Nativni PFO sadrži cistein na ostatku 459 koji je promenjen u alanin da bi se dobio PFO derivat bez cisteina, PFO<C459A>. I PFO i PFO<C459A>pokazuju slične citolitičke aktivnosti<16>. Sve hemikalije i enzimi su dobijeni od kompanija Sigma, VWR i Research Organics. Sve fluorescentne probe su dobijene od firme Molecular Probes (Invitrogen).

Generisanje i prečišćavanje ILY i njegovih derivata

[0151] Korišćenjem PCR QuikChange mutageneze (Stratagene), napravljene su različite aminokiselinske supstitucije u prirodnom ILY ili PFO<C459A>. DNK sekvence mutantnih verzija ILY gena su analizirane u laboratorijama Oklahoma Medical Research Foundation Core DNA Sequencing Facility. Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnog ILY i njegovih derivata iz Escherichia coli izvedeni su kao što je opisano<15,16>. Eluirani protein je dijaliziran u puferu (300 mM NaCl, 10 mm MES, 1 mM EDTA, pH 6,5) preko noći na 4°C. Protein je zatim uskladišten u 5mM DTT i 10% (zap./zap.) sterilnom glicerolu na -80°C.

Hemijska modifikacija ILY i PFO i njihovih derivata sa sulfhidril-specifičnim reagensima.

[0152] Cisteinski derivati ILY su modifikovani ekološki osetljivom probom jodoacetamido-N,N'-dimetil-N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazolil)etilen-diamina (NBD) preko sulfhidrilnih grupa. Reakcija je izvedena kao što je prethodno opisano<14>. Modifikovani protein je uskladišten u 10% (zap./zap.) sterilnom glicerolu, brzo zamrznut u tečnom azotu i čuvan na -80°C. Proteini su markirani sa efikasnošću od 75% ili više.

Merenja fluorescencije

[0153] Sva merenja intenziteta fluorescencije su izvedena pomoću spektrofluorimetra za brojanje fotona SLM-8100 kao što je prethodno opisano<16>. Za NBD merenja korišćena je talasna dužina ekscitacije od 460-480 nm i talasna dužina emisije od 540 nm sa propusnim opsegom od 4 nm. Emisiona skeniranja od 500-600 nm za svaki uzorak su sprovedena pri rezoluciji od 1 nm sa vremenom integracije od 1 s. Uzorci koji sadrže 10 µg ukupnog toksina su inkubirani sa praznim membranama (ekvivalentno sa 303,25 µg membranskih proteina) ljudskih crvenih krvnih zrnaca (hRBC) u PBS [10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 3 mM KCl (pH 7,5)] na 37°C, 5-10 minuta pre merenja spektra.

Priprema lipozoma

[0154] Lipozomi koji sadrže 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (POPC; Avanti Polar Lipids) i holesterol u odnosu 45:55 mol % su pripremljeni kao što je opisano<16>.

Priprema praznih membrana HRB ćelija

[0155] Prazneme mbrane HRB ćelija su pripremljene kao što je prethodno opisano. Sadržaj membranskih proteina je kvantifikovan korišćenjem Bradfordove metode (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Inc.) koja je takođe prethodno opisana<14,16>.

Uklanjanje i ponovno dodavanje holesterola

[0156] Ekstrakcija holesterola je izvedena sa metil-β-ciklodekstrinom (MβCD) kao što je prethodno opisano<14>. Ukratko, humane huRBC prazne membrane su inkubirane sa finalnom koncentracijom od 20 mM - 40 mM MβCD (pravljeno sveže za svaku upotrebu) na 37 °C tokom 2 sata. Membrane su isprane tri puta ponovljenim centrifugiranjem (14000 rpm tokom 20 minuta na 4 °C) i resuspendovane u PBS da bi se uklonio višak MβCD. Prazne membrane su na kraju suspendovane u PBS. Sadržaj holesterola je meren korišćenjem kompleta Cholesterol/Cholesteryl Ester Quantitation Kit (Calbiochem, Billerica, MA). Ovim postupkom se sadržaj holesterola u membranama tipino smanjuje >90%.

[0157] Ponovno dodavanje holesterola je izvedeno korišćenjem MβCD sa dodatim holesterolom. Ovaj postupak je ranije opisan<14>. Ukratko, sveže napravljen MβCD je dodat u pufer A (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 10 mM HEPES, 5 mM glukoza, pH 6,5) do finalne koncentracije od 5 mM. 100 mM zaliha holesterola je napravljena u 1:2 (zap./zap.) smeši hloroform:metanol. Pufer A MβCD su zagrejani na 80°C u staklenoj posudi. Kada se zagreje na 80°C, dodat je suspendovani holesterol do finalne koncentracije od 4 mM. Rastvor je homogenizovan ultrazvukom (4 X 20 s). Zatim je rastvor filtriran korišćenjem filtera od 0,22 µm. MβCD sa dodatim holesterolom dodat je peletiranim praznim membranama sa smanjenim holesterolom i inkubiran 2 sata na 37°C. Membrane su isprane ponovljenim centrifugiranjem kao i ranije i na kraju resuspendovane u PBS.

Imobilizacija lipozoma na L1 SPR senzorskom čipu

[0158] Površinska plazmonska rezonancija (SPR) je merena sa BIAcore 3000 sistemom korišćenjem L1 senzorskog čipa (BIAcore, Uppsala, Švedska). L1 senzorski čip sadrži matricu dekstrana za koju se kovalentno vezuju hidrofobni ostaci i rutinski se koristi za imobilizaciju lipozoma. U pripremi L1 čipa za lipozome, 10 µl 20 mM CHAPS deterdženta je ubrizgano pri brzini protoka od 10 µl/min. Lipozomi (0,5 mM finalna koncentracija lipida) su zatim ubrizgavani istom brzinom protoka tokom 10 min. Nakon ubrizgavanja lipozoma, 50 mM NaOH je ubrizgavano 3 min kako bi se uklonili višestruki slojevi lipida. Nakon toga je usledilo ubrizgavanje 0,1 mg/ml BSA da bi se obložila nespecifična mesta vezivanja. Sva ubrizgavanja su izvedena na 25 °C. L1 čip je regenerisan i očišćen od lipozoma ponovljenim ubrizgavanjem 20 mM CHAPS deterdženta i 50 mM NaOH dok nije postignuto originalno očitavanje u RU. Procedura regeneracije nije dovela do gubitka kapaciteta za vezivanje senzorskog čipa.

SPR analiza

[0159] Sve analize interakcija između lipozoma i PFO derivata su izvedene u HBS na 25 °C. PFO divljeg tipa (50 ng/µl) i aspartatni mutanti PFO (50 ng/µl) su ubrizgani preko čipa obloženog lipozomima pri brzini protoka od 30 µl/min tokom 4 minuta.

Rezultati za primer 1

[0160] Eksperimentalna strategija. Vezivanje ILY za nativne membrane ne zavisi od membranskog holesterola, ali njegov mehanizam je i dalje osetljiv na holesterol. Za razliku od PFO-sličnih CD citolizina koji se ne vezuju za membrane kojima nedostaje holesterol, vezivanje receptora i oligomerizacija ILY se i dalje dešava u membranama sa sniženim sadržajem holesterola<14>. Zbog toga je ILY iskorišćen da se prvo identifikuju strukture koje su odgovorne za njegovu zavisnost od holesterola. Kada su identifikovane strukture ILY koje su osetljive na membranski holesterol, ispitivan je efekat narušavanja ovih struktura u PFO, na njegovu sposobnost da se veže za membrane lipozoma bogate holesterolom. Na ovaj način se moglo utvrditi da li su iste strukture u ILY i PFO odgovorne za njihovu zavisnost od holesterola.

[0161] Holesterol nije potreban za inserciju ILY undekapeptida u membranu. Prethodne studije sa ILY su pokazale da undekapeptid mora da se inserira u membranu da bi se formirala prepora<15>. Zbog toga je utvrđeno da li je njegova insercija osetljiva na membranski holesterol ili nije. Cisteinski ostatak je zamenjen za Ala-486, koji se nalazi unutar undekapeptida, i markiran sa NBD preko njegove sulfhidrilne grupe. Pokazalo se da se ovaj ostatak inserira u membranu u prirodnom ILY<15>. Intenzitet fluorescencije NBD u ILY<A486C-NBD>meren je u odsustvu i prisustvu membrana koje sadrže holesterol ili membrana sa sniženim sadržajem holesterola. Kao što je prikazano na sl.3, u prisustvu praznih hRBC membrana, undekapeptid se inserira u membranu kao što pokazuje povećanje intenziteta emisije fluorescencije u poređenju sa emisijom uočenom za ILY kad je u solubilnom stanju. Kada je sadržaj holesterola u membrani snižen, uočava se isto povećanje emisije fluorescencije. Ovi rezultati pokazuju da je insercija undekapeptidnog regiona u blizini Ala-486 u membranu, nezavisna od sadržaja holesterola u membrani.

[0162] Holesterol je potreban za inserciju petlji L1, L2 i L3. Insercija tri kratke hidrofobne petlje na vrhu D4 (sl. 2) u membranu se odvija koordinisano i potrebna je kako bi se monomeri CD citolizina usidrili i pravilno orijentisali na membrani<15,17>. Njihova insercija, zajedno sa insercijom undekapeptida, neophodna je za naknadnu inserciju D3 transmembranskih β-ukosnica (TM ukosnice) u membranu, što dovodi do formiranja transmembranskih pora u obliku β-bačve<15>. Holesterol je takođe potreban za inserciju TMH i formiranje kompleksa pora<14>. Dakle, i membranski holesterol i insercija L1-L3 petlji u membranu su preduslovi za konverziju prepora u pore<14,15>. Pošto insercija L1-L3 petlji u membranu prethodi inserciji D3 TM ukosnica, izgledalo je razumno pretpostaviti da smanjenje količine holesterola u membrani može da blokira inserciju L1-L3 petlji što bi, zatim, sprečilo inserciju D3 TM ukosnica i blokiralo prelaz prepora u porr. Zbog toga je postavljena hipoteza da je holesterol potreban za inserciju L1-L3 petlji u membranu.

[0163] Da bi se testirala ova hipoteza, pojedinačno je mereno insercija L1-L3 petlji membrane, u nativne i huRBC prazne membrane sa sniženim holesterolom. Nedavno je pokazano da se ILY ostaci Leu-518, Ala-424 i Ala-464, koji se nalaze unutar petlji L1, L2, odnosno L3, inseriraju u membranu<17>. Da bi se izmerila insercija svake petlje, po jedan ostatak u svakoj petlji je mutiran u cistein (ILY<A428C>, ILY<A464C>, ILY<L518C>)<15>, a sulfhidril grupa derivatizovana sa NBD. Kako NBD koji se nalazi na ovim mestima ulazi u membranu, njegov intenzitet emisije fluorescencije značajno raste<15,17>. Intenzitet emisije NBD upoređen je za solubilni monomerni toksin, toksin vezan za prazne huRBC membrane i toksin vezan za prazne membrane sa sniženim holesterolom.

[0164] Za razliku od povećanja intenziteta emisije fluorescencije koje se vidi kada se svaka petlja ubaci u nativnu praznu hRBC membranu, uklanjanje približno 90% holesterola iz membrane poništava inserciju sve tri petlje u membranu (sl. 4, paneli a-c). Vraćanje holesterola u membrane sa sniženim holesterolom vraća sposobnost petlji da se inseriraju u membranu (sl. 4, paneli d-f)). Dakle, membranski holesterol je neophodan za inserciju L1-L3 petlji, i, kao što je ranije prikazano, ovo umetanje je neophodno za konverziju prepora u pore<14,15>.

[0165] Supstitucija aspartata u ostatke u petljama L1-L3 u PFO sprečava njegovo vezivanje za membrane bogate holesterolom. Umetanje membrane L1-L3 petlji ILY-a bilo je osetljivo na smanjenje holesterola u prirodnim membranama, što sugeriše da bi u PFO ove iste petlje mogle posredovati u njegovom vezivanju direktno za membrane bogate holesterolom. Međutim, ovom problemu se u PFO nije moglo pristupiti na sličan način kao kod ILY, pošto smanjenje holesterola smanjuje vezivanje PFO za membranu. Stoga je određen efekat mutacije ovih istih petlji na vezivanje PFO za lipozome bogate holesterolom. Ovo je postignuto uvođenjem aspartata u petlje L1-L3 PFO, prethodno prikazane u ILY-u, da bi se sprečilo njihovo umetanje u membranu15. Insercija petlji L1-L3 je spregnuto u ILY, a uvođenje asparata za bilo koji ostatak petlje, Ala-428 (L2), Ala-464 (L3) ili Leu518 (L1), blokiralo je njihovo umetanje u membranu. Stoga je predviđeno da ako se aspartat zameni bilo kojim od analognih ostataka u PFO, Ala-401, Ala-437 ili Leu-491, to bi poremetilo vezivanje PFO za lipozome bogate holesterolom.

[0166] Pojedinačna supstitucija analognih ostataka u PFO, Ala-401 (L2), Ala-437 (L3) i Leu-491 (L1), rezultirala je gubitkom više od 99,7% hemolitičke aktivnosti za svaki mutant ( podaci nisu prikazani). Vezivanje PFO mutanata za holesterol-PC lipozome je mereno površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Kao što je prikazano na slici 5a, ove mutacije su značajno smanjile vezivanje za holesterol-PC lipozome kada su ispitane SPR. Supstitucija aspartata za Ala-401 (L2) ili Leu-491 (L1) potpuno je poništila vezivanje PFO za membrane liposoma, a vezivanje aspartatom zamenjenim Ala-437 (L3) bilo je manje od 7% od divljeg tipa (sl. 5b). Ovaj rezultat ukazuje da su petlje D4 L1-L3 kritične za interakciju PFO-sličnog CD citolizina sa membranama bogatim holesterolom.

[0167] Modifikacija Cys-459 u PFO blokira inserciju triptofanskih ostataka undekapeptida u membranu, ali ne i vezivanje PFO za membranu. Dugo se smatralo da konzervativni undekapeptid CD citolizina sličnog PFO učestvuje u njihovom vezivanju za membrane bogate holesterolom, prvenstveno zato što je objavljeno da hemijska modifikacija sulfhidrilne grupe prirodnog cisteina (Cys-459) undekapeptida značajno utiče na PFO vezivanje za nizak broj ćelija eritrocita ovaca, ali ne i za veliki broj ćelija<2>. Drugi autori su, međutim, pokazali da izgleda da njegova modifikacija ne utiče na vezivanje drugih CD citolizina za ćelije<5,6>. Stoga su upoređene sposobnosti prirodnog PFO i PFO modifikovanog preko sulfhidril grupe Cys-459 undekapeptida da se vežu za holesterol-PC lipozome preko SPR.

[0168] Modifikacija Cys-459 tiola u PFO undekapeptidu sulfhidril-specifičnim reagensom N-etilmaleimidom (NEM), smanjila je hemolitičku aktivnost za 99% (podaci nisu prikazani), slično drugim izveštajima po kojima su cistein sulfhidril u PFO i SLO bili hemijski modifikovani<2,18>. Međutim, brzina i obim vezivanja NEM-modifikovanog toksina su povećani u odnosu na nativni toksin, što je utvrđeno SPR analizom (sl. 6A-B). Dakle, hemijska modifikacija Cys-459 ne remeti vezivanje PFO za membranu.

[0169] Ako modifikacija Cys-459 ne utiče na vezivanje, postavlja se pitanje šta to ova modifikacija menja u PFO, što efikasno blokira njegovu aktivnost. Od otkrića CD citolizina pre skoro 90 godina, poznato je da je njihov citolitički mehanizam osetljiv na oksidaciju. Ostatak osetljiv na oksidaciju je na kraju bio povezan sa visoko konzervativnim cisteinskim ostatkom undekapeptida<1>. Strukturni efekti modifikacije cisteina na PFO su dalje ispitani da bi se utvrdilo da li je njegova modifikacija sprečila strukturnu promenu u PFO koja bi mogla da utiče na njegovu aktivnost. Insercija u membranu undekapeptidnih triptofana 464, 466 i 467 je konformaciono povezano sa insercijom D3 TMH. Prethodne studije su pokazale da mutacije u ostacima D3 TMH1 koje povećavaju njihovu stopu insercije takođe povećavaju stopu insercije membranu undekapeptidnih ostataka triptofana<19>. Pošto je Cys-459 postavljen nasuprot ostacima triptofana, ispitano je da li je hemijska modifikacija tiol grupe cisteina blokira inserciju ostataka triptofana u membranu.

[0170] Insercija ostataka undekapeptida triptofana u membranu može da se prati preko povećanja njihovog intrinzičkog intenziteta fluorescencije kako se kreću u nepolarno okruženje membrane<20,21>. Insercija ovih triptofana je merena u NEM-modifikovanom i nativnom PFO (sl. 6a i 6b). Modifikacija Cys-459 blokirala je inserciju triptofana undekapeptida, ali nije sprečila formiranje oligomera otpornog na SDS, sličnog nativnom PFO (podaci nisu prikazani). Dakle, ovi podaci pokazuju da konformaciona promena u strukturi PFO koja se odražava gubitkom insercije triptofanskih ostataka undekapeptida utiče na naknadnu konverziju oligomera prepora u kompleks pora.

Imunizacija sa pneumolizinskim mutantom Leu 460Asp

[0171] CBA/CAHN-XID miševi su imunizovani supkutano sa 5 µg pneumolizina ili mutanta pneumolizina, koristeći stipsu (aluminijum hidroksid) kao pomoćno sredstvo, 0. i 14. dana.

21. dana, miševi su imunizovani proteinima u samom razblaživaču (bez pomoćnog sredstva). Sve injekcije su date u zapremini od 0,2 ml. 35. dana miševi su izloženi soju EF3030 kapsularnog tipa 19F. Sedam dana kasnije, miševi su eutanazirani gasovitim ugljendioksidom. Pluća su homogenizovana, a broj jedinica koje formiraju kolonije (CFU) u plućima svakog miša određen je tako što je homogenizovano tkivo zasejano na ploče sa krvnim agarom. Miševima je takođe uzeta krv. U krvi nisu uočene pneumokoke, čime je pokazano da je ovo model pneumonije, a ne pneumonije i sepse. Rezultati pokazuju da su i pneumolizin divljeg tipa i mutantni pneumolizin, bili u stanju da zaštite od pneumonije u modelu fokalne pneumonije kod miševa (sl.7).

[0172] Dva dugotrajna obeležja CD citolizina su zavisnost njihovog mehanizma za formiranje pora od prisustva membranskog holesterola i reverzibilna inaktivacija najvećeg broja CD citolizina oksidacijom undekapeptidnog cisteina. Ove studije rešavaju molekularnu osnovu za oba fenomena. Bez želje da se ograničimo teorijom, izgleda da je umetanje L1-L3 petlji koje se nalaze na bazi domena 4, u membranu, primarni događaj koji je osetljiv na prisustvo membranskog holesterola za ILY. Nakon smanjenja sadržaja holesterola, ove petlje se ne inseriraju u membranu, i, kao što je ranije prikazano, ekstrakcija holesterola iz hRBC membrana<15>sprečava konverziju ILY iz prepora u pore. Ovi rezultati ukazuju na to da su oba efekta takođe rezultat nemogućnosti ovih petlji da se inseriraju u membrane sa smanjenim sadržajem holesterola. Ovi podaci dalje ukazuju na to da oksidacija konzervativnog cisteina u PFO, i verovatno u drugim PFO sličnim CD citolizinima, blokira inserciju u membranu triptofanskih ostataka koji zarobljava PFO u stanju prepora, ali ne utiče na vezivanje za lipozome bogate holesterolom.

[0173] Otkriće ILY, toksina specifičnog za ljudske ćelije, predstavlja zagonetku o tome kako ILY može razlikovati ljudske i životinjske ćelije ako je holesterol njegov receptor. Specifičnost ILY ljudskih ćelija objašnjena je otkrićem da je humani CD59, kasni stadijum, inhibitor komplementa specifičan za vrstu, njegov receptor<13>. Iako holesterol nije ILY receptor, njegov mehanizam za formiranje pora ostao je osetljiv na membranski holesterol<14>, i pokazao je da je holesterol potreban za mnogo kasniju fazu mehanizma za formiranje pora u ILY; značajno smanjenje membranskog holesterola blokira konverziju prepora u pore. Zanimljivo je da je ovo takođe primećeno za SLO i PFO<14>, dva CD citolizina koji se mogu direktno vezati za membrane bogate holesterolom. Iako je smanjenje membranskog holesterola iz hRBC blokiralo konverziju PFO prepora u pore, takođe je smanjilo vezivanje PFO. Zbog toga je holesterol neophodan za konverziju prepora u pore za sva tri CD citolizina, a pored toga doprinosi i vezivanju membrane od strane PFO sličnog CD citolizina.

[0174] Nedavno su Soltani et al.<15>pokazali da je insercija u membranu L1-L3 D4 petlji ILY neophodna za konverziju prepora u pore. Dakle, i holesterol i insercija L1-L3 petlji u membranu neophodni su za konverziju ILY iz prepora u pore. Bez želje da budemo ograničeni teorijom, podaci predstavljeni ovde ukazuju na to da je objedinjujuće objašnjenje za ova zapažanja da se insercija ovih petlji u membrane dešava samo u membranama bogatim holesterolom, a ova insercija je neophodna za konverziju prepora u pore i za ILY i za PFO-slične CD citolizine. Pored toga, sposobnost ovih petlji da se inseriraju u membrane bogate holesterolom takođe posreduje u početnom vezivanju PFO, a verovatno i PFO-sličnih CD citolizina, za površine membrana bogatih holesterolom. Stoga, ovi podaci ukazuju na to da i kod ILY i kod PFO-sličnih CD citolizina, L1-L3 petlje moraju da se inseriraju u membranu da bi se uspešno formirao kompleks pore. U slučaju ILY, vezivanje je prvo posredovano sa huCD59, nakon čega sledi insercija L1-L3 petlji u membrane bogate holesterolom, dok su ova dva događaja, vezivanje i insercija, jedno te isto u PFO i posredovano su prvenstveno putem L1-L3 petlje.

[0175] Tradicionalno je prihvaćeno da je undekapeptid CD citolizina sličnog PFO doprineo ili direktno posredovao u prepoznavanju membrana bogatih holesterolom<2,3,21>. Studije pokazuju da su L1-L3 petlje primarne strukture koje posreduju u interakciji između CD citolizina i membrana bogatih holesterolom. Iako hemijska modifikacija PFO undekapeptidnog cisteina sa NEM smanjuje njegovu hemolitičku aktivnost za više od 99%, njegovo vezivanje za holesterol-PC lipozome je uglavnom neoštećeno. Stoga, za razliku od postojeće dogme, interakcija PFO i drugih PFO-sličnih CD citolizina, prvenstveno je posredovana petljama L1-L3, a ne undekapeptidom. Mutacije unutar undekapeptida mogu da utiču na interakciju L1-L3 sa membranama bogatim holesterolom. Pokazalo se da mutacija undekapeptida Trp-491 ILY blokira umetanje L1-L3<15>, a izmenjena struktura nativnog ILY undekapeptida očigledno sprečava direktnu interakciju L1-L3 sa membranama bogatim holesterolom, omogućavajući mu da prvo veže se za huCD59. Ova poslednja ideja je pojačana činjenicom da je, kada je konsenzusna undekapeptidna struktura uvedena u ILY, omogućila da se veže za ne-humane ćelije<22>.

[0176] Zanimljivo pitanje je zašto L1-L3 petlje ILY ne posreduju u vezivanju za membrane bogate holesterolom slično kao PFO. Kao što je prethodno u tekstu navedeno, čini se da je glavna razlika u domenu 4 primarna struktura visoko konzervativnog undekapeptida. Jasno je da je ILY izgubio sposobnost da se direktno vezuje za membrane bogate holesterolom; inače, ne bi pokazivao specifičnost ljudske ćelije posredovanu preko huCD59. Kristalne strukture D4 ILY i PFO mogu pružiti objašnjenje za ovu razliku u L1-L3 petljama za posredovanje direktnog vezivanja ova dva CD citolizina za membrane bogate holesterolom. Lokacija i orijentacija L1-L3 ostataka (Leu-518, Ala-428 i Ala-464) ILY su skoro identični analognim ostacima u PFO (Leu-491, Ala-401 i Ala-437) (sl. 4b). U stvari, većina D4 strukture dva CD citolizina je skoro identična (rms devijacija manje od 0,6 Å, referenca 23), sa izuzetkom undekapeptidne petlje i strukture β-jezika na vrhu domena 4. Undekapeptidna petlja ILY proteže se nadole od baze D4, 4-5Å dalje od PFO undekapeptida. Dakle, ILY undekapeptid može sterički da ometa interakciju L1-L3 petlji ILY sa površinom bogatom holesterolom. Možda se tek nakon vezivanja za receptor ILY undekapeptidna struktura menja na takav način da dozvoljava umetanje L1-L3 petlji.

[0177] Predmetni prikaz otkriva strukturnu osnovu za ozbiljan efekat na aktivnost koji oksidacija undekapeptida cisteina pokazuje na citolitički mehanizam PFO, i verovatno drugih PFO-sličnih CD citolizina. Prvobitno su CD citolizini nazvani citolizini aktivirani tiolom zbog ove karakteristike, ali molekularna osnova za ovaj efekat nije bila poznata. Rane studije su sugerisale da je uticalo na vezivanje za eritrocite, ali u isto vreme na vezivanje za holesterol nije uticalo, a nelitički oligomeri su i dalje primećeni na površini ćelija<2>. Kao što je ovde prikazano, ova modifikacija sprečava umetanje undekapeptida triptofana i dovodi do oligomerne strukture zarobljene u preporama. Iako precizna strukturna osnova za ovaj efekat nije poznata, prethodne studije su pokazale da je insercija domena 3 u membranu, koji formira transmembranske pore u vidu â-bačve, konformaciono povezano sa membranskim insercijom triptofanskih ostataka domena 4 u undekapeptidu<19>. Dakle, sprečavanje insercije ovih triptofana u membranu može da spreči inserciju TM ukosnica domena 3, čime se PFO zarobljava u stanju prepora.

Primer 2

[0178] PLYdivljeg tipai PLY mutanti (PLYL460Di PLYL460D/G293S) su prečišćeni korišćenjem afinitetne kolone. Prosečan prinos proteina bio je PLYdivljeg tipa: 1 mg/ml, PLYL460D: 1 mg/ml i PLYL460D/G293S: 4 mg/ml. Hemolitička aktivnost prečišćenih proteina je testirana inkubacijom serijski titriranih toksina sa ljudskim crvenim krvnim zrncima (RBC ćelije). EC50(efikasna koncentracija potrebna za lizu 50% RBC ćelija) za svaki protein je izračunata iz nelinearne sigmoidne krive doza-odgovor. Koliko puta se vrednost promenila u odnosu na divlji tip PLY je određeno za svaki mutant (promena vrednosti = EC50divlji tip/EC50mutant). Zabeleženo je da su rezultati za dva PLY mutanta više nego određeni broj puta manje aktivni od PLY divljeg tipa, pošto pri najvišim proteinskim koncentracijama ovih derivata 100%, liza RBC ćelija, potrebna za tačnu krivu doza-odgovor, nije mogla da se postigne. Smanjenje hemolitičke aktivnosti mutanta u poređenju sa proteinom divljeg tipa (koliko puta je manje aktivan od PLYdivljeg tipa) za PLYL460Dje bilo > 10000 puta, a za PLYL460D/G293S> 260000 puta.

[0179] Relativna stabilnost proteina se izvodi iz izračunavanja temperature topljenja (TMCelzijusa), što je temperatura na kojoj se 50% proteina odvija. Krive topljenja proteina su generisane pomoću kompleta Protein Thermal Shift Assay Dye Kit (Applied Biosystems). Kako se temperatura povećava, protein se odvija i boja je u stanju da se veže za izložene hidrofobne regione i da fluorescira. Tmza PLYdivljeg tipa, PLYL460Di PLYL460D/G293Ssu bile 47,50 ± 0,2, 47,69 ± 0,2, 47,97 ± 0,2, redom. Beznačajne razlike u TMzabeležene za ova tri PLY proteina ukazuju na to da uvođenje naznačenih mutacija u PLYdivljeg tipanema uticaja na stabilnost proteina.

[0180] Kao što je prethodno navedeno u tekstu, pneumolizin je dvostruki mutant označen kao PLY-L460D/G293S (PLYL460D/G293S) pri čemu je L na poziciji 460 supstituisan sa D, a G na poziciji 293 sa S. Supstitucija G293S, sama po sebi, smanjuje hemolitičku aktivnost PLY mutanta samo za oko 50 puta. Supstitucija L460D, sama po sebi, smanjuje aktivnost PLY mutanta za oko 5000-10000 puta. Ali kod PLY mutanta sa obe supstitucije, smanjenje aktivnosti iznosi više od 260000 puta u odnosu na nativni PLY toksin. Ovo je geometrijsko smanjenje, a ne samo „aditivno“ smanjenje aktivnosti.

[0181] Bez želje da se igraničavamo teorijom, ovo naglo smanjenje aktivnosti je posledica blokiranja dve suštinske funkcije PLY. Prvo, supstitucija L460D blokira vezivanje za holesterol i drugo, supstitucija G293S zaustavlja PLY u stanju prepore u kome pora u vidu βbačve ne može da se inserira (prepore se definiše kao monomeri koji su vezani za membranu, koji su oligomerizovali u strukturu sličnu prstenu, ali ne mogu da inseriraju poru u vidu βbačve). Otuda je inhibitorni efekat geometrijski: 50 X 5000-10000 >250000 puta manje toksičan (manje hemolitički), što je u skladu sa merenjima koja pokazuju da je >260000 puta manje toksičan od nativnog PLY. Supstitucija G293S takođe stabilizuje strukturu monomera u L460D mutantnom proteinu i povećava prinos prilikom prečišćavanja. Na primer, prilikom prečišćavanja iz 1,0 litra kulture E. coli, prinos PLY-L460D/G293S mutanta je bio približno 52 mg, nasuprot 3 mg za PLY-L460D mutanta (oko 17X više).

[0182] Mutantni pneumolizinski polipeptid prema pronalasku ima smanjenu hemolitičku aktivnost i smanjenu aktivnost formiranja pora u poređenju sa pneumolizinskim polipeptidom divljeg tipa. Aminokiselinska sekvenca prečišćenog mutantnog pneumolizina obuhvata SEQ ID NO:40. Mutantni pneumolizinski polipeptid ima povećan prinos u odnosu na pneumolizin divljeg tipa ili u odnosu na mutantni pneumolizinski polipeptid koji ima supstituciju samo na jednoj od aminokiselinskih pozicija 293, 294, 458, 459 i 460. Mutantni pneumolizinski polipeptid može da ima 250000 puta manju hemolitičku aktivnost nego pneumolizinski polipeptid divljeg tipa.

[0183] U drugim aspektima pronalaska, mutantni pneumolizin prema patentnom zahtevu 1, raspoređen u farmaceutski prihvatljivom ekscipijensu kako bi formirao imunogenu kompoziciju. Vakcina uključuje imunogenu kompoziciju i opciono sadrži adjuvans. Sekvenca nukleinske kiseline kodira bilo koji od mutantnih polipeptida pneumolizina prema patentnom zahtevu 1. Ćelija-domaćin uključuje navedenu sekvencu nukleinske kiseline.

LITERATURA

[0184] Sledeće reference su primeri procedura ili drugim detaljima dopunjuju reference koje su ovde izložene.

1. Alouf, J.E., Billington, S.J. & Jost, B.H. Repertoire and general features of the cholesterol-dependent cytolysins in Bacterial Toxins: A Comprehensive Sourcebook (eds. Alouf, J.E. & Popoff, M.R.) 643-658 (Academic Press, London, 2005).

2. Iwamoto, M., Ohno-Iwashita, Y. & Ando, S. Role of the essential thiol group in the thiol-activated cytolysin from Clostridium perfringens. Eur J Biochem 167, 425-430 (1987).

3. Sekino-Suzuki, N., Nakamura, M., Mitsui, K.I. & Ohno-Iwashita, Y. Contribution of individual tryptophan residues to the structure and activity of theta-toxin (perfringolysin o), a cholesterol-binding cytolysin. Eur J Biochem 241, 941-947 (1996).

4. Jacobs, T. et al. The conserved undecapeptide shared by thiol-activated cytolysins is involved in membrane binding. FEBS Lett. 459, 463-466 (1999).

5. Vazquez-Boland, J.A., Dominguez, L., Rodriguez-Ferri, E.F., Fernandez-Garayzabal, J.F. & Suarez, G. Preliminary evidence that different domains are involved in cytolytic activity and receptor (cholesterol) binding in listeriolysin O, the Listeria monocytogenes thiol-activated toxin. FEMS Microbiol Lett 53, 95-9 (1989).

6. Saunders, F.K., Mitchell, T.J., Walker, J.A., Andrew, P.W. & Boulnois, G.J. Pneumolysin, the thiol-activated toxin of Streptococcus pneumoniae, does not require a thiol group for in vitro activity. Infect. Immun. 57, 2547-2552 (1989).

7. Neill, J.M. & Fleming, W.L. Studies on the oxidation and reduction of immunological substances: II The hematoxin of the Welch bacillus. J. Exp. Med. 44, 215-226 (1926). 8. Alouf, J.E. & Geoffrey, C. Structure activity relationships in the sulfhydryl-activated toxins. in Bacterial Protein Toxins (eds. Alouf, J.E., Fehrenbach, F.J., Freer, J.H. & Jeljaszewicz, J.) 165-171 (Academic Press, London, 1984).

9. Nagamune, H. et al. Intermedilysin. A cytolytic toxin specific for human cells of a Streptococcus intermedius isolated from human liver abscess. Adv Exp Med Biol 418, 773-775 (1997).

10. Nagamune, H. et al. Intermedilysin, a novel cytotoxin specific for human cells secreted by Streptococcus intermedius UNS46 isolated from a human liver abscess. Infect Immun 64, 3093-3100 (1996).

11. Rollins, S.A., Zhao, J., Ninomiya, H. & Sims, P.J. Inhibition of homologous complement by CD59 is mediated by a species-selective recognition conferred through binding to C8 within C5b-8 or C9 within C5b-9. J Immunol 146, 2345-51 (1991).

12. Rollins, S.A. & Sims, P.J. The complement-inhibitory activity of CD59 resides in its capacity to block incorporation of C9 into membrane C5b-9. J Immunol 144, 3478-83 (1990).

13. Giddings, K.S., Zhao, J., Sims, P.J. & Tweten, R.K. Human CD59 is a receptor for the cholesterol-dependent cytolysin intermedilysin. Nat Struct Mol Biol 12, 1173-1178 (2004).

14. Giddings, K.S., Johnson, A.E. & Tweten, R.K. Redefining cholesterol's role in the mechanism of the cholesterol-dependent cytolysins. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 11315-11320 (2003).

15. Soltani, C.E., Hotze, E.M., Johnson, A.E. & Tweten, R.K. Specific protein-membrane contacts are required for prepore and pore assembly by a cholesterol-dependent cytolysin. J. Biol. Chem . Paper is press 282 (21), 15709-15716, April 5, 2007.

16. Shepard, L.A. et al. Identification of a membrane-spanning domain of the thiolactivated pore-forming toxin Clostridium perfringens perfringolysin O: an á-helical to âsheet transition identified by fluorescence spectroscopy. Biochemistry 37, 14563-14574 (1998).

17. Ramachandran, R., Heuck, A.P., Tweten, R.K. & Johnson, A.E. Structural insights into the membrane-anchoring mechanism of a cholesterol-dependent cytolysin. Nat Struct Biol 9, 823-7 (2002).

18. Harris, J.R., Adrian, M., Bhakdi, S. & Palmer, M. Cholesterol-Streptolysin O Interaction: An EM Study of Wild-Type and Mutant Streptolysin O. J Struct Biol 121, 343-55 (1998).

19. Heuck, A.P., Hotze, E., Tweten, R.K. & Johnson, A.E. Mechanism of membrane insertion of a multimeric b-barrel protein: Perfringolizin O creates a pore using ordered and coupled conformational changes. Molec. Cell 6, 1233-1242 (2000).

20. Heuck, A.P., Tweten, R.K. & Johnson, A.E. Assembly and topography of the prepore complex in cholesterol-dependent cytolysins. J Biol Chem 278, 31218-31225 (2003).

21. Nakamura, M., Sekino, N., Iwamoto, M. & Ohno-Iwashita, Y. Interaction of thetatoxin (perfringolysin O), a cholesterol-binding cytolysin, with liposomal membranes: change in the aromatic side chains upon binding and insertion. Biochemistry 34, 6513-6520 (1995).

22. Nagamune, H. et al. The human-specific action of intermedilysin, a homolog of streptolysin o, is dictated by domain 4 of the protein. Microbiol Immunol 48, 677-92 (2004).

23. Polekhina, G., Giddings, K.S., Tweten, R.K. & Parker, M.W. Insights into the action of the superfamily of cholesterol-dependent cytolysins from studies of intermedilysin. Proc Natl Acad Sci 102, 600-605 (2005).

24. Rossjohn, J., Feil, S.C., McKinstry, W.J., Tweten, R.K. & Parker, M.W. Structure of a cholesterol-binding thiol-activated cytolysin and a model of its membrane form. Cell 89, 685-692 (1997).

25. Humphrey, W., Dalke, A. & Schulten, K. VMD: visual molecular dynamics. J Mol Graph 14, 33-8, 27-8 (1996).

26. Anonymous: Prevention of Pneumococcol Disease: Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). Morbidity and Mortality Weekly Report-Recommendations and Reports: 46:1-24 (April 4, 1997).

Claims (6)

Patentni zahtevi

1. Prečišćeni mutantni pneumolizin koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40.

2. Imunogena kompozicija koja sadrži:

prečišćeni mutantni pneumolizin prema patentnom zahtevu 1; i

farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

3. Vakcina koja sadrži imunogenu kompoziciju prema patentnom zahtevu 2.

4. Vakcina prema patentnom zahtevu 3, koja dodatno sadrži adjuvans.

5. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira prečišćeni mutantni pneumolizin prema patentnom zahtevu 1.

6. Ćelija-domaćin koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 5.