RS66228B1 - Postupak za in vitro proizvodnju tkiva hijalinske hrskavice - Google Patents

Postupak za in vitro proizvodnju tkiva hijalinske hrskavice

Info

Publication number
RS66228B1
RS66228B1 RS20241256A RSP20241256A RS66228B1 RS 66228 B1 RS66228 B1 RS 66228B1 RS 20241256 A RS20241256 A RS 20241256A RS P20241256 A RSP20241256 A RS P20241256A RS 66228 B1 RS66228 B1 RS 66228B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
chondrocytes
medium
cartilage
culture medium
cartilage tissue
Prior art date
Application number
RS20241256A
Other languages
English (en)
Inventor
Vannary Tieng
Original Assignee
Vanarix Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=67658935&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS66228(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Vanarix Sa filed Critical Vanarix Sa
Publication of RS66228B1 publication Critical patent/RS66228B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3612—Cartilage, synovial fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/3654—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3817—Cartilage-forming cells, e.g. pre-chondrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A61L27/3852—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na novi postupak za in vitro proizvodnju tkiva hijalinske hrskavice („Cartibeads“), kao i terapijske upotrebe i postupke skrininga korišćenjem tako proizvedenog tkiva hrskavice.
OSNOV PRONALASKA
[0002] Hijalinska hrskavica je sačinjena od specijalizovanih ćelija nazvanih hondrociti, okruženih ekstracelularnim matriksom. Ovaj matriks sintetišu i luče hondrociti i on je uglavnom sačinjen od kolagenih vlakana tipa II, glikozaminoglikana (GAG) i 60-80% vode. Hijalinska hrskavica ima četiri sloja: površinski, srednji, duboki i kalcifikovani sloj na vrhu subhondralne kosti. Biomehanička svojstva zglobne hrskavice u velikoj meri zavise od sastava i integriteta ekstracelularnog matriksa.
[0003] Hrskavica ima veoma ograničen kapacitet samoobnavljanja i nakon povrede često evoluira ka osteoartritisu (OA). Starenje i povrede koje se ponavljaju (npr. koje se javljaju tokom intenzivnog bavljenja sportom) su glavni faktori rizika za degeneraciju hrskavice kolena. OA pogađa veliki broj ljudi i najčešće se javlja kod starijih osoba (prevalencija >10% kod osoba starijih od 60 godina), dok OA uglavnom pogađa mlađe ljude nakon povreda zglobova.
[0004] Hirurški tretmani uključuju zamenu zgloba protezom. Međutim, životni vek proteze je ograničen na 15-20 godina. Dalje, kod većine pacijenata se ne postiže potpuno ublažavanje bola: 20 do 30% pacijenata sa protezom kolena i dalje oseća nelagodnost ili bol. Lečenje je uglavnom palijativno i ciljano ublažavanje bola. Neki biološki agensi kao što su mezenhimske matične ćelije, hijaluronska kiselina ili injekcije plazme bogate trombocitima mogu da odlože propadanje zglobova, ali ne podstiču regeneraciju tkiva.
[0005] U ovom trenutku, strategije koje koriste spoljašnje i sintetičke nosače za popunjavanje defekta nisu zadovoljavajuće i nepotpuno oponašaju biomehanička svojstva zglobne hrskavice. Klasično lečenje uključuje operaciju na bazi mikrofrakture kako bi se stimulisala migracija matičnih ćelija u područje lezije ili direktnu implantaciju hondrocita.
[0006] Procedura mikrofrakture se sastoji u pravljenju sitnih rupa u subhondralnoj kosti sa ciljem da se stimuliše migracija mezenhimskih matičnih ćelija iz koštane srži unutar koaguluma da bi se novi hondrociti formirali i zamenili oštećeno tkivo.
[0007] Kod implantacije autolognih hondrocita (ACI), hondrociti su ekstrahovani iz hrskavice, kultivisani u ograničenom broju pasaža i transplantirani u leziju. Za poboljšanje postupka može da se koristi matriks kao što je svinjski kolagen tipa I/III ili hijaluronska kiselina za kultivaciju hondrocita (Kon E, et al., 2009, The American journal of sports medicine 37(1):33-41; Hettrich CM, Crawford D, & Rodeo SA, 2008, 16(4):230-235). Ovi matriksi se ili primenjuju direktno na leziju nakon procedure mikrofrakture, ili se koriste in vitro za kultivaciju hondrocita pre ponovne implantacije (Ekkers JE, et al. 2013, Osteoarthritis Research Society 21(7):950-956).
[0008] Terapije zasnovane na ćelijama koje koriste transplantaciju autolognih hondrocita (ACI) su indikovane za lezije hrskavice veće od dva kvadratna centimetra (Armoiry X. et al.
2019, Pharmacoeconomics 37, 879-886). Hondrociti predstavljaju logičan izvor ćelija za regeneraciju hrskavice. Zaista, samo ova vrsta ćelija hrskavice je uključena u održavanje matriksa hijalinske hrskavice.
[0009] Glavni izazov je to što hondrociti imaju tendenciju da se dediferenciraju u ćelije slične fibroblastima u kulturi, što rezultuje brzim gubitkom funkcije koji se obično javlja na drugoj ili trećoj ćelijskoj pasaži (Munirah, S. et al. 2010. Tissue & cell 42, 282-292) u sistemima dvodimenzionalnih ćelijskih kultura. Dediferencirani hondrociti se karakterišu gubitkom proizvodnje glikozaminoglikana (GAG) i kolagena tipa II, glavnih komponenti hijalinske hrskavice (Wu, L. et al. 2014. Tissue Eng Part C Methods 20, 160-168; Benya, P. D et al.1978. Cell. 15, 1313-1321) koji se zamenjuju kolagenom tipa I, prisutnim u fibroznoj hrskavici. Zaista, tokom koraka amplifikacije, hondrociti imaju tendenciju da se dediferenciraju gubitkom svog originalnog fenotipa i postaju ćelije slične fibroblastima (izdužene ćelije) sa karakteristikama sličnim matičnim ćelijama u ekspresiji gena (ekspresija markera ćelijske površine kao što su CD73, CD90, CD105 koji se koriste za karakterizaciju mezenhimskih matičnih ćelija (MSC)). Na primer, hondrociti ekstrahovani iz pacijentove zglobne hrskavice brzo gube svoj hondrogeni kapacitet da sintetišu specifični hijalinski matriks hrskavice nakon nekoliko pasaža u in vitro kulturi. Fibrozna hrskavica se biomehanički razlikuje od hijalinske hrskavice i ne smatra se efikasnom za dugotrajno lečenje jer dovodi do disfunkcionalne popravke. Nasuprot tome, poznato je da su hijalinska svojstva hondrocita očuvana u sistemima trodimenzionalnih kultura (Benya, P. D. & Shaffer, J. D.1982. Cell 30, 215-224), koji oponašaju in vivo okruženje. Tay A G et al. otkriva da su hondrociti ljudskog uha, nosa i rebara upoređeni u pogledu njihove podobnosti za generisanje autolognih transplantata hrskavice. Ćelije su ekspandirane kroz dve pasaže u medijumu koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma bez (kontrola) ili sa transformišućim faktorom rasta β1 (TGF-β1), faktorom rasta fibroblasta 2 (FGF-2) i PDGF-bb (TFP). Ekspandirane ćelije su kultivisane kao trodimenzionalne pelete u hondrogenom medijumu bez seruma koji sadrži insulin, deksametazon i TGF-β1. Hondrociti iz sva tri izvora su uspešno izolovani, povećali svoju stopu proliferacije kao odgovor na TFP i podlegli su dediferencijaciji tokom pasažiranja (Tissue Engineering, Larchmont, NY, US, vol. 10. no. 5-6., pages 762-770).
[0010] Gubitak hondrogenog kapaciteta u kulturi posebno je izražen kod starijih pacijenata. Dakle, još jedan izazov za ćelijsku terapiju zasnovanu na hondrocitima je teškoća da se ekspandiraju i diferenciraju ćelije starijih pacijenata, što ograničava njihovu upotrebu u ovoj populaciji. Shodno tome, većina kliničkih ispitivanja ograničava starost pacijenata koji se mogu uključiti na 55 godina.
[0011] Ideja o korišćenju hondrocita za proizvodnju hrskavice ima smisla ako amplifikacija ćelija može da se ostvari zajedno sa održavanjem originalnog fenotipa. Dakle, ostaje potreba da se razvije standardizovani postupak za proizvodnju hrskavice koji rezultuje visokokvalitetnim hrskavičavim tkivom sličnim hijalinskom (okarakterisanim visokim nivoom detekcije GAG), koje oponaša intrinzična svojstva za pacijente svih uzrasta.
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0012] Glavno dostignuće ove studije je postupak koji može da preokrene gubitak fenotipa hondrocita (dediferencijacija hondrocita) tokom ekspanzije. Ovo rešava ključni problem koji se javlja u ćelijskoj terapiji u kojoj se koriste hondrociti kao početni materijal. Sadašnji podaci pokazuju da novi trostepeni postupak može da proizvede visokokvalitetnu hrskavicu sa hijalinskim karakteristikama, bez obzira na starost pacijenta i artritični status zgloba.
[0013] Postupak Cartibead omogućava ekspanziju ćelija iz veoma malog uzorka sakupljene hrskavice (~30 mg u pretkliničkoj studiji koju su podnosioci prijave izveli na mini svinjama), za razliku od 260 mg u proseku u konvencionalnoj ćelijskoj terapiji zasnovanoj na humanim hondrocitima (Brittberg, M. 2018. Injury 39 Suppl 1, S40-49), što smanjuje morbiditet donorskog mesta. Predmetni postupak je pokazao odnos GAG/Cartibead koji je 20 puta veći nego kod prethodno prikazanih mikrotkiva hrskavice, što ukazuje na to da su ova mikrotkiva hrskavice manje hijalinska i da sadrže više fibrozne hrskavice (Bartz, C. et al.2016. J Transl Med 14, 317). U skladu sa ovim rezultatima, pronalazač je u proseku dobio odnos GAG/DNK koji je najmanje tri puta veći od drugog objavljenog postupka (Slika 2B) (Mumme, M. et al.
2016. Lancet 388, 1985-1994; Dang, P. N et al. 2014. Tissue engineering. Part A 20, 3163-3175).
[0014] Do rediferencijacije je došlo usled uklanjanja FGF-2. Međutim, njegovo uklanjanje u 3D kulturi nije bilo dovoljno da indukuje sintezu hijalinskog matriksa u dvostepenom postupku. Rediferencijacija hondrocita najverovatnije zahteva ćelijsku adheziju na bocu obloženu matriksom i indukciju specifičnih ćelijskih signalnih puteva u 2D kulturi.
[0015] Pronalazač je razvio novi postupak za amplifikaciju hondrocita u kulturi i naveo ih da povrate svoj hondrogeni kapacitet nezavisno od starosti pacijenta iz malog komada hrskavice (~ 30 mg). U prvom koraku, ćelije se amplifikuju u dvodimenzionalnoj kulturi na ekstracelularnom matriksu uz podršku FGF-2, a zatim se u drugom koraku prerediferenciraju prema originalnom fenotipu, uklanjanjem FGF-2 koji se koristi za amplifikaciju ćelija. U poslednjem koraku, potpuna rediferencijacija se postiže u trodimenzionalnoj (3D) kulturi sa spontanom agregacijom ćelija da bi se formirala mikrotkiva. Uklanjanjem faktora rasta FGF-2 u drugom koraku, posebno u 2D kulturi, pronalazač je iznenađujuće pokazao da hondrociti počinju da obnavljaju svoju prvobitnu funkciju sintetišući agrekan, protein povezan sa GAG, a održavanjem uklanjanja FGF-2 u trećem koraku u 3D kulturi, kolagen II se sintetiše u kombinaciji GAG, čime se proizvodi hijalinski matriks specifičan za zglobnu hrskavicu. Pronalazač je dalje pokazao da uklanjanje FGF-2 indukuje inaktivaciju signalnog puta Wnt, poželjno signalizacije Wnt7B nakon koraka amplifikacije i na taj način omogućava proizvodnju homogene hijalinske hrskavice koja je veoma reprezentativna za in vivo hrskavicu. Pronalazač je pokazao da se Wnt7B aktivira u medijumu za dediferencijaciju (ME) i da se smanjuje najmanje 10 puta u medijumu za pre-rediferencijaciju (MR) i najmanje 40 puta u medijumu za maturaciju (MI). Transplantacija visokokvalitetnih hijalinskih mikrotkiva, sa karakteristikama što je moguće bližim onima kod nativne hrskavice, ključna je za predviđanje dugoročnog uspeha u lečenju lezija hrskavice (Negoro, T et al. 2018. npj Regenerative Medicine 3, 17; Madeira, C et al.
2015. Trends in biotechnology 33, 35-42).
[0016] Konstruisana hrskavica („Cartibeads“) stoga ima visok potencijal za potpunu integraciju u leziju hrskavice nakon transplantacije.
[0017] Dakle, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za in vitro proizvodnja hijalinskog tkiva hrskavice koji obuhvata prvi korak kultivisanja hondrocita, poželjno hondrocita izolovanih iz subjekta, poželjnije iz tkiva hrskavice čoveka ili konja, u sistemu adherentne kulture u kultivacionom medijumu za dediferencijaciju koji aktivira signalni put Wnt da bi se dobile ćelije slične fibroblastima, poželjno tokom 10 do 15 dana; drugi korak kultivisanja navedenih hondrocita sličnih fibroblastima u sistemu adherentne kulture u kultivacionom medijumu za rediferencijaciju koji inaktivira signalni put Wnt da bi se dobili hondrociti sa punim kapacitetom za resintezu hijalinskog matriksa, poželjno tokom 4 do 8 dana; i treći korak kultivisanja navedenih hondrocita dobijenih u drugom koraku u sistemu trodimenzionalne kulture u kultivacionom medijumu za indukciju/maturaciju koji održava inaktivaciju signalnog puta Wnt, poželjno tokom 10 do 15 dana.
[0018] U poželjnom primeru izvođenja, navedeni kultivacioni medijum za dediferencijaciju sadrži FGF-2, a navedeni kultivacioni medijum za rediferencijaciju i kultivacioni medijum za indukciju/maturaciju su medijumi bez FGF-2. Navedeni kultivacioni medijum za dediferencijaciju može da sadrži najmanje jedan faktor rasta izabran iz grupe koja se sastoji od: PDGF-BB, TGF-β i EGF. Navedeni kultivacioni medijum za rediferencijaciju i navedeni kultivacioni medijum za indukciju/maturaciju mogu da sadrže TGF-β, poželjno TGF-β3, poželjnije TGF-β3 i FGF-7. U drugom primeru izvođenja navedeni kultivacioni medijum za rediferencijaciju može da sadrži lizat trombocita. Konkretno, svi kultivacioni medijumi kao što je gore opisano mogu da sadrže serum. Navedeni kultivacioni medijum za indukciju/maturaciju može da sadrži najmanje jednu komponentu izabranu iz grupe koja se sastoji od: insulina, IGF-1, BMP-2, selena, transferina i etanolamina.
[0019] U posebnom primeru izvođenja, navedeni hondrociti se kultivišu u trećem koraku u hipoksičnoj atmosferi koja sadrži manje od 10% O2(zapr./zapr.). U jednom primeru izvođenja, navedeni hondrociti se kultivišu u koraku i) tokom 10 do 15 dana, u koraku ii) tokom 4 do 8 dana, i/ili u koraku iii) tokom 10 do 15 dana. U jednom primeru izvođenja, navedeni hondrociti iz koraka i) su hondrociti izolovani iz subjekta, poželjno iz tkiva hrskavice čoveka ili konja.
[0020] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na konstruisano tkivo hrskavice u obliku sferoida (Cartibeads) sa sadržajem glikozaminoglikana (GAG) po sferoidu između 10 i 100 μg/sferoidu koje može da se dobije postupkom kao što je gore opisano. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži pomenuto konstruisano tkivo hrskavice i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.
[0021] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na konstruisano tkivo hrskavice kao što je gore opisano ili na farmaceutsku kompoziciju kao što je gore opisano za upotrebu u lečenju defekata hrskavice i degenerativne bolesti hrskavice kod subjekta kome je to potrebno. U jednom primeru izvođenja, pomenuto konstruisano tkivo hrskavice ili farmaceutska kompozicija je za upotrebu u autolognoj transplantaciji kod subjekta kome je to potrebno. U drugom primeru izvođenja, pomenuto konstruisano tkivo hrskavice ili farmaceutska kompozicija je za upotrebu u alogenoj transplantaciji kod subjekta kome je to potrebno.
[0022] Konačno, ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak skrininga molekula koji inhibiraju proces degeneracije hrskavice koji obuhvata dovođenje u kontakt konstruisanog tkiva hrskavice kao što je gore opisano sa jednim ili više molekula-kandidata i odabir molekula koji inhibiraju proces degeneracije hrskavice.
KRATAK OPIS SLIKA
[0023]
Slika 1. Karakterizacija Cartibeads konstruisanih trostepenim postupkom. a, Šema trostepenog postupka za generisanje Cartibeads koji potiču od dediferenciranih hondrocita: korak 1 (ekspanzija), korak 2 (rediferencijacija) izvedeni su u 2D i u atmosferskim uslovima kiseonika (21%), korak 3 (formiranje Cartibead) je izvedeno u 3D kulturi i u hipoksičnim uslovima kiseonika (5%). b, slika pretkliničkih studija: upotreba humanih Cartibeads za procenu njihove bezbednosti na SCID miševima i efikasnosti na mini svinjama. c, Histološka analiza Cartibeads iz fiksiranih uzoraka. Reprezentativne slike bojenja GAG safraninom-O (gornji panel) i jake imunodetekcije kolagena tipa II (DAB bojenje, sredina) koji karakterišu hijalinsku hrskavicu, i slabe detekcije kolagena tipa I (donji panel) Cartibeads dobijenih od 3 nezavisna donora. Razmernik: 200 µm. d, Biohemijska kvantifikacija sadržaja glikozaminoglikana (GAG) u Cartibeads izražena u µg/mg tkiva, određena testom dimetilmetilensko plavog (DMMB), od 15 donora (crne tačke) i iz 3 kontrole nativne hrskavice (kvadrat) e, Biomehanička svojstva Cartibeads određuju se testom sabijanja (Jangov modul) koji meri elastičnost Cartibeads. Predstavljene su krive naprezanjedeformacija za 3 donora i one pokazuju povećanje primene sile kod većih Cartibeads.
Slika 2. Količina GAG u Cartibeads od svih donora. a, Biohemijska kvantifikacija sadržaja GAG po Cartibead pomoću testa DMMB. b, Biohemijska kvantifikacija sadržaja GAG u Cartibead, normalizovanog na sadržaj DNK, izraženog kao odnos GAG/DNK (µg/µg).
Slika 3. Poređenje Cartibeads generisanih na visokom i niskom nivou kiseonika i u trostepenom i dvostepenom postupku. a, Makroskopski prikaz Cartibeads generisanih trostepenim postupkom u uslovima niskog kiseonika za 3 donora. b, Bojenje GAG safraninom O u sekcijama Cartibead generisanim pod četiri različita uslova za 1 donora. Cartibeads su generisani trostepenim i dvostepenim postupkom pod kultivacionim uslovima sa visokim i niskim nivoima kiseonika (21% i 5%). Slike predstavljaju 3 donora. Razmernik: 200µm. c, Procena količine GAG/Cartibead za 3 donora pod 4 različita uslova.
Slika 4. Stabilnost Cartibeads. a, Biohemijska kvantifikacija GAG u Cartibeads nakon završetka trostepenog postupka i u Cartibeads ostavljenim dodatnih 6 dana na 37 °C (inkubator na 5% O2) i na 4 °C i na sobnoj temperaturi (RT) u zatvorenim recipijentima. b, Broj mrtvih ćelija unutar Cartibeads je kvantitativno procenjen bojenjem crvenom fluorescentnom bojom. Pozitivne kontrole za mrtve ćelije bile su Cartibeads tretirani sa 10% tritona pre fluorescentnog bojenja. Razmernik: 100 µm.
Slika 5. Poboljšanje hijalinskih karakteristika Cartibeads konstruisanih trostepenim postupkom u poređenju sa dvostepenim postupkom. a, Šema dvostepenog postupka za generisanje Cartibeads. Hondrociti su ekspandirani u koraku 1 u medijumu E i direktno korišćeni u koraku 2 u medijumu I za generisanje Cartibead b, Funkcionalno anotacijsko klasterovanje analize zastupljenosti genskih grupa zasnovano na trostepenoj ekspresiji u odnosu na dvostepenu. Histogrami pokazuju broj gena za svaku porodicu gena za koju je pronađena značajna zastupljenost. Svetlo sivom bojom su označeni geni sa višim nivoom ekspresije u Cartibeads iz trostepenog postupka, a tamno sivom geni sa nižom ekspresijom. c, Vizuelizacija rezultata sekvenciranja RNK putem vulkanskog dijagrama koji pokazuje statističku značajnost (FDR<0.001) u odnosu na veličinu promene (>2-struka promena). Vulkanski dijagram ističe gene sa faktorima promene koji su statistički značajni, kao npr. ACAN, COL2A1, koji su povećani u trostepenom postupku u poređenju sa dvostepenim postupkom i COL1A1 koji je snižen. ***p<0.001; **p<0.01 d, e, f Podaci analize sekvenciranja RNK kojima se upoređuju nivoi ekspresije iRNK (u RPKM) za gene ACAN (d), COL2A1 (e) i COL1A1 (f) u trostepenom i dvostepenom postupku. NA (nije primenljivo) se odnosi na odsustvo analize zbog odsustva samog koraka g, Bojenje GAG safraninom-O u Cartibeads proizvedenim trostepenim postupkom i dvostepenim postupkom. Razmernik: 100µm
Slika 6. Ekspresija markera MSC. a, Protočna citometrija koja predstavlja CD73, CD90 i CD105 s leva ka desno, redom. b, Studija diferencijacije koja upoređuje potencijal masnih matičnih ćelija (ASC), mezenhimskih matičnih ćelija (MSC) i hondrocita za davanje osteocita, adipocita i hondrocita. Alizarin Red S je boja koja je upotrebljena za bojenje naslaga kalcijuma, koje su indikatori zrelih osteocita (gornji panel), neutralni lipidi obojeni Oil Red O bojom su karakteristični za adipocite (srednji panel) i GAG obojen safraninom-O u hondrocitima (donji panel). Razmernik: 100 µm.
Slika 7. Inhibicija signalizacije WNT podstiče proizvodnju komponenti hijalinskog matriksa, a, Analiza zastupljenosti genskih grupa i funkcionalno grupisanje zasnovano na diferencijalnim nivoima ekspresije medijuma R naspram medijuma E u trostepenom postupku. Grafikon prikazuje zastupljenost za svaku porodicu gena (broj gena koji se diferencijalno eksprimiraju). ***p<0.001; **p<0.01 b, Vulkanski dijagram rezultata sekvenciranja RNK hondrocita u medijumu R naspram medijuma E u trostepenom postupku. c. Podaci iz analize sekvenciranja RNK pokazuju ekspresiju iRNK u RPKM za ki67 (proliferativni marker) (gornji panel), TCF4 (uključen nishodno od wnt/beta kateninskog puta) (srednji panel), SOX9 (transkripcioni faktor uključen u proizvodnju matriksa) (donji panel). d, e, f Podaci iz analize sekvenciranja RNK pokazuju ekspresiju iRNK u RPKM za WNT5A (d), WNT5B (e), i WNT7B (f) u hondrocitima u medijumu E, R i I u trostepenom i dvostepenom postupku. NA (nije primenljivo) se odnosi na odsustvo analize zbog odsustva samog koraka. g, Imunoblotovi prikazuju ekspresiju naznačenih proteina u prisustvu inhibitora WNT signalizacije XAV-939 (10 µM) u hondrocitima. Histogram prikazuje denzitometrijsku analizu β-katenina i aksina u poređenju sa kontrolom. h, i, Ekspresija iRNK za ACAN i COL2A1 određena je qPCR metodom u hondrocitima nakon 4 dana u kulturi u medijumu E, medijumu E+XAV-939 i u Cartibeads (dvostepeni postupak) iz hondrocita kultivisanih u medijumu E i medijumu XAV-839. j, Reprezentativna slika bojenja safraninom-O GAG u Cartibeads generisanim iz hondrocita kultivisanih u medijumu R (trostepeni postupak) i u medijumu E+XAV-939 (dvostepeni postupak). Razmernik: 100 µm. k, Šema rezimira molekularnu osnovu signalnog puta WNT u medijumu E i inhibiciju WNT kada se hondrociti kultivišu u medijumu R ili u medijumu E+XAV939, što omogućava proizvodnju hijalinskog matriksa koji sadrži ACAN i kolagen tipa II.
Slika 8. Izvodljivost implantacije Cartibeads u ljudsko koleno ex vivo. a, Makroskopski prikaz distalne butne kosti nakon totalne artroplastike kolena koji pokazuje ručno kreiranu leziju (levo) hirurškim instrumentom, implantirani Cartibeads 1. dana (u sredini), leziju sa zrnima 1 mesec posle implantacije (desno) nakon kultivacije uz rotaciju u medijumu I. Razmernik: 4 mm b, Bojenje safraninom-O GAG uzorka poprečnog preseka ex vivo uzorka pokazuje da su se Cartibeads međusobno spojili, da su ostali hijalinski i integrisali se u prirodnu hrskavicu, kao što je prikazano pod većim uvećanjem (levi i desni panel). Podaci su reprezentativni za tri nezavisna eksperimenta. Razmernik: 1 mm.
Slika 9. Odsustvo tumorogenosti humanih Cartibeads nakon implantacije kod imunodeficijentnih miševa. a, Reprezentativna slika Cartibead (0.2 × 10<6>hondrocita/cartibead) 2 meseca nakon implantacije (gornji panel) i tumor koji potiče od 5 zrna A549 (0.2 × 10<6>A549 ćelija/zrnu) 6 nedelja nakon implantacije (donji panel) nakon supkutane implantacije na leđa miševa (crne strelice, levi paneli). b, Razvoj tumora nakon supkutane implantacije 1 Cartibead, 1 ili 5 zrna ćelija A549 po SCID mišu (n=10 do 14 miševa za jednog donora Cartibead i 2x n=4 miša po zrnima A549). c, Bojenje safraninom-O GAG u Cartibeads pre (srednji panel) i posle implantacije (desni panel). Razmernik: 200 µm.
Slika 10. Integracija hijalinskih transplantata u koleno mini svinja nakon transplantacije autolognih Cartibeads. a, Šema opisuje primarno mesto biopsije korišćene za generisanje Cartibeads i sekundarne operacije koja kombinuje stvaranje 5 lezija/kolenu i transplantaciju autolognih Cartibeads. b, Biohemijska kvantifikacija GAG (µg/Cartibead) za 6 mini svinja. c-d, Makroskopski prikaz (levi panel) i bojenje safraninom-O GAG isečaka kolena mini svinje (srednji panel), uvećani segmenti pokazuju remodeliranje tkiva 3 i 6 meseci nakon transplantacije. Mesta transplantacije su zaokružena crnom bojom, dok beli krug predstavlja praznu leziju kao kontrolu (desni panel). Prikazano je reprezentativno bojenje transplantirane lezije (srednji panel) i prazne lezije (desni panel) nakon tri meseca (c) i šest meseci (d). Razmernik: 200 µm.
Slika 11. Transplantacija svinjskog Cartibead kod mini svinja generiše hijalinski integrisani transplantat. a, Bojenje safraninom-O GAG u Cartibeads pre transplantacije (gornji panel, razmernik: 200 µm) i makroskopski prikaz kolena (srednji panel) i bojenje safraninom-O GAG u implantiranoj leziji (donji panel, razmernik: 200 µm) za 6 mini svinja korišćenih u ovoj studiji.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0024] Ovaj pronalazak se odnosi na postupak za in vitro proizvodnja tkiva hrskavice koji obuhvata tri koraka kultivacije hondrocita kao što je opisano u nastavku.
[0025] Hondrociti potiču od mezenhimskih ćelija koje imaju karakterističan fenotip zasnovan prvenstveno na tipu ekstracelularnog matriksa koji proizvode. Prekursorske ćelije proizvode kolagen tipa I, ali kada postanu opredeljene za liniju hondrocita, one smanjuju proizvodnju kolagena tipa I i počinju da sintetišu kolagen tipa II, koji čini suštinski protein hijalinskog ekstracelularnog matriksa. Pored toga, opredeljeni hondrociti proizvode proteoglikane koji predstavljaju agrekan povezan sa glikozaminoglikanima koji su visoko sulfatirani.
[0026] Termin „hondrocit“ kako se ovde koristi odnosi se na diferenciranu ćeliju (opredeljeni hondrocit) dobijenu iz hrskavice sa punim kapacitetom za sintezu hijalinskog matriksa.
Termin hondrocit označava primarne kulture (sveže izolovane iz biopsija) kao i ćelije ekspandirane in vitro, uključujući one koje su genetski modifikovane, imortalizovane, selektovane, konzervisane itd.
Izolacija hondrocita subjekta
[0027] Hondrociti se izoluju iz biopsija zrelog tkiva hrskavice prema konvencionalnim postupcima, korišćenjem na primer digestije tkiva enzimima kao što su tripsin, himotripsin, kolagenaza, deoksiribonukleaza, elastaza i hijaluronidaza. Tkivo hrskavice može biti veoma mali komad, poželjno manji od 5 mm u prečniku (ekvivalentno ~30 mg). Tkivo hrskavice je poželjno sisarska, poželjnije hrskavica čoveka ili hrskavica konja. Tkivo hrskavice može biti sakupljeno od zdravog donora ili pacijenta, poželjno iz kolena, skočnog zgloba, kuka, prsta, ramena, poželjnije kolena ili skočnog zgloba pacijenta.
Prvi korak: adherentna kultura u medijumu za dediferencijaciju
[0028] Izolovani hondrociti se prvo uzgajaju u sistemu adherentne kulture u kultivacionom medijumu za dediferencijaciju.
[0029] Sistem adherentne kulture pogodan da se koristi u postupku prema pronalasku može biti sistem adherentne jednoslojne kulture ili sistem kulture na ćelijama hranilicama, poželjno sistem adherentne jednoslojne kulture. Sistem kulture može biti u bilo kom obliku koji je pogodan za postupak prema pronalasku, konkretno u obliku boce, ploče sa više bunarčića ili posude.
[0030] U skladu sa poželjnim primerom izvođenja, sistem adherentne kulture je sistem adherentne jednoslojne kulture. Ovaj sistem sadrži čvrstu podlogu, na primer staklo ili plastiku, obično obloženu matriksom ili supstratom koji podstiče adherenciju ćelija. Supstrat može da bude proteinski supstrat koji se sastoji od faktora vezivanja i podstiče adheziju ćelija na nosač. Ovi faktori vezivanja mogu posebno da se izaberu između poli-L-lizina, kolagena, fibronektina, laminina ili želatina.
[0031] Matriksi koji oponašaju ekstracelularni matriks i pogodni su za upotrebu u postupku prema pronalasku su dobro poznati stručnjacima i mnoge varijante su dostupne komercijalno. Ovi matriksi obuhvataju, na primer, matrikse tipa Matrigel<™>, Geltrex<®>, CELLstart<™>ili druge matrikse koji sadrže jedan ili više proteina za sidrenje kao što su kolagen, laminin, fibronektin, elastin, proteoglikani, aminoglikani ili vitronektin. Mogu se koristiti i trodimenzionalni matriksi tipa hidrogela.
[0032] Prema poželjnom primeru izvođenja, matriks je tipa Matrigel<™>ili supstrat CELLstart<™>.
[0033] Hondrociti se kultivišu u sistemu adherentne kulture u medijumu koji omogućava amplifikaciju i dediferencijaciju ćelija u progenitorsko/nediferencirano stanje, nazvano fibroblastno stanje (morfologija slična fibroblastima). Konkretno, medijum za dediferencijaciju je kultivacioni medijum koji omogućava i proliferaciju i dediferencijaciju hondrocita u ćelije slične fibroblastima, koji se takođe nazivaju hondrociti slični fibroblastima koji su dediferencirani hondrociti sa morfologijom ćelija sličnih fibroblastima i koji ispoljavaju karakteristike matičnih ćelija. Poželjno, medijum za dediferencijaciju omogućava dediferencijaciju hondrocita u ćelije slične fibroblastima koje eksprimiraju površinske markere mezenhimskih matičnih ćelija kao što su CD105, CD90 i/ili CD73. Ćelije slične fibroblastima su dediferencirani hondrociti koji su izgubili sposobnost da sintetišu hijalinski matriks (kolagen 2 i GAG). Medijum za dediferencijaciju je bazalni medijum koji sadrži najmanje jednu ili više komponenti koje omogućavaju hondrocitima da se amplifikuju i dediferenciraju u nediferencirano stanje.
[0034] Brojni bazalni medijumi su komercijalno dostupni i dobro su poznati stručnjacima. Ovaj medijum može da bude minimalni medijum koji konkretno sadrži mineralne soli, aminokiseline, vitamine i izvor ugljenika neophodan za ćelije i puferski sistem za regulisanje pH. Bazalni medijum koji može da se koristi u postupku prema pronalasku uključuje, na primer, ali nije ograničen na, medijum DMEM/F12, medijum DMEM, medijum RPMI, Hamov F12 medijum, medijum IMDM i medijum DMEM KnockOut<™>(Life Technologies).
[0035] U zavisnosti od medijuma koji se koristi, može biti neophodno ili poželjno dodati glutamin, vitamin C, jedan ili više antibiotika kao što su streptomicin, penicilin i/ili antimikotik kao što je fungizon (amfotericin B).
[0036] Prema pronalasku, medijum za dediferencijaciju aktivira signalni put Wnt.
[0037] U aktivnom stanju, Wnt ligand se vezuje za uvijene (engl. frizzled) receptore i njihov ko-receptor, protein vezan za lipoprotein-receptor (LRP) 5/6. Ovo aktivira razbarušeni (engl. dishevelled, DSH) protein koji naknadno inhibira aktivnost GSK3β i fosforilaciju β-katenina. β-katenin se translocira u jedro gde stupa u interakciju sa transkripcionim faktorima TCF/LEF (transkripcioni faktor specifičan za T-ćelije/faktor koji se vezuje za limfoidni pojačivač). U neaktivnom stanju, β-katenin je fosforilisan kinazom glikogen sintaze (GSK) 3β, i fosforilisani β-katenin podleže naknadnoj ubikvitinilaciji i proteazomalnoj degradaciji.
[0038] U poželjnom primeru izvođenja, medijum za dediferencijaciju je bazalni medijum koji sadrži jedno jedinjenje koje aktivira Wnt signalizaciju, poželjno Wnt7B signalizaciju.
[0039] Aktivacija signalnog puta Wnt može se odrediti merenjem u dediferenciranim hondrocitima nivoa ekspresije wnt RNK, posebno wnt7B, wnt5A ili wnt5B, poželjno wnt7B RNK i nishodnih ciljnih gena signalnog puta Wnt, kao što je TCF4. Signalni put Wnt se aktivira u ćelijama kada je nivo ekspresije ciljnog gena najmanje 1.5 puta veći ili 2, 3, 4, 5 puta veći nego u ćelijama kultivisanim bez navedenog jedinjenja.
[0040] Nivo ekspresije iRNK može da se odredi bilo kojim pogodnim metodama poznatim stručnjacima. Obično ove metode obuhvataju merenje količine iRNK. Metode za određivanje količine iRNK su dobro poznate u tehnici. Na primer, nukleinska kiselina sadržana u uzorku se prvo ekstrahuje u skladu sa standardnim metodama, na primer korišćenjem litičkih enzima ili hemijskih rastvora ili se ekstrahuje smolama koje vezuju nukleinske kiseline prema uputstvima proizvođača. Ekstrahovana iRNK se zatim detektuje hibridizacijom (npr. Northern blot analiza), amplifikacijom (npr. RT-PCR) ili sekvenciranjem (RNA-seq).
[0041] Nivo proteina ciljnih gena takođe može da se odredi bilo kojim pogodnim metodama poznatim stručnjacima. Obično, ove metode obuhvataju dovođenje u kontakt uzorka ćelija, poželjno ćelijskog lizata, sa vezujućim partnerom koji je sposoban da selektivno reaguje sa proteinom ciljnog gena koji je prisutan u uzorku. Vezujući partner su uopšteno poliklonska ili monoklonska antitela, poželjno monoklonska. Količina proteina može da se meri, na primer, semi-kvantitativnim Western blotovima, enzimiski obeleženim i posredovanim imunotestovima, kao što su ELISA testovi, testovima tipa biotin/avidin, radioimunoesejem, imunoelektroforezom ili imunoprecipitacijom ili proteinima ili antitelima na čipu.
[0042] Konkretno, jedinjenje sposobno da aktivira signalni put Wnt može da bude protein Wnt koji se vezuje za receptor Wnt ili antagonist GSK-3β malog molekula, poželjno WNT7B, WNT5A ili WNT5B, poželjnije WNT7B.
[0043] Navedeno jedinjenje sposobno da aktivira signalni put Wnt može da se izabere iz grupe koja se sastoji od: litijum hlorida (CAS br.7447-41-8), CHIR99021 (CAS br.252917-06-9), SB-216763 (CAS br. 280744-09-4), BIO (6-bromoindirubin-3'-oksim) (CAS br.
667463-62-9).
[0044] U poželjnom primeru izvođenja, navedeno jedinjenje je FGF2 (faktor rasta fibroblasta-2) takođe poznat kao bFGF ili bazni oblik faktora rasta fibroblasta.
[0045] Aktivacija signalnog puta Wnt omogućava amplifikaciju i dediferencijaciju ćelija hondrocita u ćelije slične fibroblastima. U poželjnom primeru izvođenja, medijum za dediferencijaciju sadrži najmanje 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ng/mL FGF-2. Poželjno, medijum sadrži između 5 do 100 ng/mL FGF-2, poželjno 20 ng/mL FGF-2.
[0046] Prema pronalasku, može se koristiti bilo koji molekul, kao što je polipeptid koji deluje na hondrocite na sličan način kao molekul FGF2 u najmanje jednom aspektu, poželjno za amplifikaciju hondrocita u postupcima pronalaska.
[0047] Dodatne komponente koje pomažu amplifikaciju i dediferenciraju hondrocita u ćelije u nediferenciranom stanju nisu posebno ograničene i mogu se na odgovarajući način odabrati u zavisnosti od svrhe. Primeri komponente uključuju koštane morfogene proteine (BMP), epidermalni faktor rasta (EGF), faktore rasta izvedene iz trombocita (PDGF), transformišući faktor rasta beta (TGF-β), insulinski faktor rasta 1 (IGF-1). Svaka od ostalih gore opisanih komponenti može da se koristi sama, ili više njih može da se koristi u kombinaciji sa jedinjenjem koje može da aktivira signalni put Wnt.
[0048] U posebnom primeru izvođenja, medijum za dediferencijaciju može dalje da sadrži jedan ili više faktora rasta izabranih iz grupe koja se sastoji od: EGF, TGF-β i PDGF-BB i bilo koje njihove kombinacije. U ovom primeru izvođenja, EGF, PDGF-BB i TGF-β su prisutni u koncentracijama u opsegu od 1 do 100 ng/mL, poželjno u opsegu od 5 do 50 ng/mL. U konkretnijem primeru izvođenja, navedeni TGF-β je TGF-β3.
[0049] U posebnom primeru izvođenja, u postupcima prema pronalasku, humani hondrociti se kultivišu u medijumu za dediferencijaciju koji sadrži FGF-2, PDGF-BB i TGF-β3, poželjno između 5 i 100 ng/mL FGF-2, 1 i 100 ng/mL PDGF-BB i 1 i 100 ng/mL TGF-β3, poželjnije 5 i 50 ng/mL FGF-2, 5 i 50 ng/mL PDGF-BB i 5 i 50 ng/mL TGF-β3.
[0050] U drugom posebnom primeru izvođenja, u postupcima prema pronalasku, konjski hondrociti se kultivišu u medijumu za dediferencijaciju koji sadrži FGF-2 i EGF, poželjno između 5 i 100 ng/mL FGF-2 i 1 i 100 ng/mL EGF, poželjnije 5 i 50 ng/mL FGF-2 i 5 i 50 ng/mL EGF.
[0051] U skladu sa poželjnim primerom izvođenja, medijum za dediferencijaciju dalje sadrži serum životinjskog porekla. U poželjnom primeru izvođenja, koristi se autologni serum. Takođe je moguće koristiti ksenogeni ili alogeni serum. Konkretno, za kulturu humanih hondrocita, može se koristiti autologni serum humanog pacijenta ili objedinjeni humani serum. U posebnom primeru izvođenja, za kulturu konjskih hondrocita, može se koristiti fetalni teleći serum. Medijum poželjno sadrži između 2 do 20%, poželjno 5 do 15%, poželjnije 10% seruma.
[0052] U skladu sa posebnim primerom izvođenja, hondrociti su u kontaktu sa medijumom za dediferencijaciju 10 do 20 dana, poželjno 10 do 15 dana.
[0053] Poželjno je da se ćelije redovno subkultivišu kako bi se sprečilo da kultura dostigne konfluentnost, tj. da pokrije celu raspoloživu površinu. Zaista, konfluentnost izaziva prestanak proliferacije i neželjene metaboličke promene. Ćelije mogu da se subkultivišu korišćenjem standardnih tehnika koje su dobro poznate stručnjaku. One konkretno mogu da se odvoje od matriksa ili podloge dejstvom enzima kao što je kolagenaza IV ili mehaničkim pasažiranjem u PBS ili bilo kom drugom rastvoru bez enzima koji sadrži EDTA (npr.: ReleSR, (STEMCELL Technologies)), ili pod dejstvom komercijalnog medijuma za odvajanje ćelija kao što je TrypLE<™>Express (Life Technologies), sakupe centrifugiranjem, mehanički razdvoje i ponovo zaseju u novi sistem za kultivaciju.
Drugi korak: adherentna kultura u medijumu za rediferencijaciju
[0054] Inaktivacijom signalnog puta Wnt korišćenom u medijumu za dediferencijaciju za ćelijsku amplifikaciju u drugom intermedijarnom koraku kultivacije, pronalazač je iznenađujuće pokazao da su nakon kultivacije u trodimenzionalnom sistemu, hondrociti povratili svoj potpuno originalni fenotip i puni kapacitet da sintetišu hijalinski matriks.
[0055] Prema tome, postupak prema pronalasku dalje obuhvata intermedijarni korak kultivisanja ćelija sličnih fibroblastima dobijenih u prvom koraku, u sistemu adherentne kulture kao što je gore opisano sa medijumom za rediferencijaciju koji inaktivira signalni put Wnt, poželjno Wnt7B, Wnt5A ili Wnt5B, poželjno Wnt7B signalni put. Hondrociti su u kontaktu sa ovim medijumom za rediferencijaciju da bi se preokrenuo fibroblastni fenotip i ponovo diferencirale ćelije slične fibroblastima u hondrocite sa punim kapacitetom da sintetišu hijalinski matriks. U ovom drugom koraku, ćelije menjaju svoju morfologiju i postaju manje izdužene, veće, sa granularnim endoplazmatskim retikulumom u citoplazmi vidljivim optičkom mikroskopijom, što ukazuje na visok nivo aktivnosti sinteze proteina. Hondrociti počinju da ponovo eksprimiraju agrekan, proteoglikan povezan sa GAG. Na kraju drugog koraka ne dolazi do ponovnog eksprimiranja kolagena II.
[0056] Poželjno, kontakt se vrši jednostavnom promenom medijuma za kulturu. Alternativno, može se izvesti subkultivacijom u sistem adherentne kulture, kao što je gore opisano, koji sadrži medijum za reverziju.
[0057] Prema jednom primeru izvođenja, sistem adherentne kulture je sistem adherentne jednoslojne kulture kao što je gore opisano. Prema poželjnom primeru izvođenja, matriks je tipa Matrigel<™>ili supstrat CELLstart<™>.
[0058] U prvom primeru izvođenja, medijum za rediferencijaciju može biti medijum za rediferencijaciju koji sadrži bazalni medijum iz koga je uklonjeno jedinjenje koje aktivira signalni put Wnt kao što je prethodno opisano.
[0059] Uklanjanjem jedinjenja, podrazumeva se da navedeni medijum za rediferencijaciju sadrži jedinjenje u koncentraciji koja ne omogućava aktivaciju signalnog puta Wnt.
[0060] U poželjnijem primeru izvođenja, navedeni medijum za rediferencijaciju je medijum za rediferencijaciju bez FGF-2. Navedeni medijum za rediferencijaciju bez FGF-2 sadrži bazalni medijum koji sadrži manje od 0.5 ng/mL FGF-2, poželjno manje od 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 ng/mL FGF-2.
[0061] U drugom primeru izvođenja, navedeni medijum za rediferencijaciju je bazalni medijum koji sadrži inhibitor signalnog puta Wnt.
[0062] Navedeni inhibitor signalnog puta Wnt može da bude mali molekul izabran iz grupe koja se sastoji od: jedinjenja koja ciljno deluju na protein Dvl kao što je NSC668036 (CAS br. 144678-63-7), 3289-8625 (CAS br. 294891-81-9), J01-017a, TMEM88, KY-02061, KY-02327, BMD4702 (CAS br.335206-54-7), niklozamid (CAS br. 50-65-7), DK-520, sulindak (CAS br. 38194-50-2); jedinjenja koja ciljno deluju na kompleks za uništenje β-katenina kao što je pirvinijum (CAS br. 7187-62-4); prirodnih jedinjenja kao što je dericin (CAS br.
34211-25-1), dericidin (CAS br. 38965-74-1), karnozna kiselina (CAS br. 3650-09-7); jedinjenja koja ciljno deluju na reporter transkripcije TCF/LEF kao što su ICG-001 (CAS br.
847591-62-2), PNU-74654 (CAS br. 113906-27-7), vindorfen (CAS br. 19881-70-0); jedinjenja koja ciljno deluju na Pren kao što su IWP-L6 (CAS br. 1427782-89-5), Wnt-C59 (CAS br. 1243243-89-1), LGK974 (CAS br. 1243244-14-5), ETC-159 (CAS br. 1638250-96-0), jedinjenja koja ciljno deluju na TNKS kao što je XAV939 (CAS br. 284028-89-3), E7449 (CAS br. 1140964-99-3), poželjno XAV939.
[0063] U još jednom primeru izvođenja, male inhibitorne RNK (siRNA) se takođe mogu koristiti za smanjenje nivoa genske ekspresije najmanje jednog proteina uključenog u signalni put Wnt. U poželjnom primeru izvođenja, ekspresija gena za navedeni signalni protein Wnt može se smanjiti uvođenjem u ćeliju male dvolančane RNK (dsRNA), ili vektora ili konstrukta koji dovode do proizvodnje male dvolančane RNK, tako da je signalni put Wnt inaktiviran (tj. RNK interferencija ili RNAi). Metode za odabir odgovarajuće dsRNA ili vektora koji kodira dsRNA su dobro poznate u tehnici za gene čija je sekvenca poznata (npr. videti Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002); SAD pat. br. 6,573,099 i 6,506,559; i međunarodne patentne objave br. WO 01/36646, WO 99/32619 i WO 01/68836).
[0064] U još jednom primeru izvođenja, kratka RNK u vidu ukosnice (shRNA) se takođe može koristiti za smanjenje nivoa genske ekspresije Wnt signalnog proteina. Kratka RNK u vidu ukosnice (shRNA) je sekvenca RNK koja pravi uski zaokret u vidu ukosnice koja može da se koristi za utišavanje ekspresije ciljnog gena putem interferencije RNK (RNAi). Ekspresija shRNA u ćelijama se obično postiže isporukom plazmida ili preko virusnih ili bakterijskih vektora. Izbor promotora je od suštinskog značaja za postizanje robusne ekspresije shRNA. U početku su korišćeni promotori polimeraze III kao što su U6 i HI; međutim, ovim promotorima nedostaje prostorna i vremenska kontrola. Zbog toga se prešlo na korišćenje promotora polimeraze II za regulisanje ekspresije shRNA.
[0065] U poželjnom primeru izvođenja, siRNA se koristi za smanjenje nivoa genske ekspresije Wnt5B, Wnt7B, Wnt5A ili β-katenina, poželjno Wnt7B.
[0066] Bazalni kultivacioni medijum može da bude minimalni medijum koji naročito sadrži mineralne soli, aminokiseline, vitamine i izvor ugljenika neophodan za ćelije i puferski sistem za regulisanje pH. Bazalni medijum koji može da se koristi u postupku prema pronalasku uključuje, na primer, ali nije ograničen na, medijum DMEM/F12, medijum DMEM, medijum RPMI, Hamov F12 medijum, medijum IMDM i medijum DMEM KnockOut<™>(Life Technologies).
[0067] U posebnom primeru izvođenja, medijum za rediferencijaciju je medijum za rediferencijaciju bez FGF-2 koji obuhvata bazalni medijum koji sadrži manje od 0.5 ng/mL FGF-2 i sadrži najmanje jednu ili više komponenti koje podstiču ćelije slične fibroblastima da se ponovo diferenciraju u hondrocite.
[0068] U posebnom primeru izvođenja, medijum za rediferencijaciju sadrži transformacioni faktor rasta β (TGFβ), poželjnije TGF-β3. Poželjno, medijum za rediferencijaciju sadrži između 1 i 100 ng/mL TGF-β3, poželjnije između 5 i 50 ng/mL TGF-β3.
[0069] U konkretnijem primeru izvođenja, medijum za rediferencijaciju dalje sadrži FGF-7, takođe poznat kao faktor rasta keratinocita. FGF-7 učestvuje u proliferaciji ćelija i u ćelijskoj diferencijaciji. Poželjno, medijum za rediferencijaciju sadrži između 1 i 100 ng/mL FGF-7, poželjnije između 5 i 50 ng/mL FGF-7.
[0070] U skladu sa posebnim primerom izvođenja, korišćeni medijum za rediferencijaciju dalje sadrži serum životinjskog porekla kao što je gore opisano.
[0071] U poželjnom primeru izvođenja, navedeni TGF-β, FGF-7 i/ili serum su zamenjeni lizatom trombocita. Lizat trombocita je dodatak ćelijskoj kulturi bogat faktorom rasta koji se dobija iz krvnih pločica nakon ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Ciklus zamrzavanja/odmrzavanja uzrokuje lizu trombocita, oslobađajući veliku količinu faktora rasta neophodnih za ekspanziju ćelija. U poželjnom primeru izvođenja, medijum za rediferencijaciju sadrži između 5 do 20%, poželjno 10% lizata trombocita. U poželjnom primeru izvođenja, navedeni lizat trombocita je zbirni lizat humanih trombocita.
[0072] Komponente koje mogu da utiču na diferencijaciju hondrocita nisu posebno ograničene i mogu se na odgovarajući način odabrati u zavisnosti od svrhe. Primeri komponente uključuju insulin, faktore rasta slične insulinu (IGF-1), transformacioni faktor rasta β, koštane morfogene proteine (BMP), selen, transferin, etanolamin, faktore rasta koji potiču od trombocita. Svaka od ostalih gore opisanih komponenti može da se koristi sama, ili više njih može da se koristi u kombinaciji.
[0073] U skladu sa posebnim primerom izvođenja, hondrociti su u kontaktu sa medijumom za rediferencijaciju tokom 2 do 10 dana, poželjno 3 do 7 dana, poželjnije 7 dana.
[0074] Ćelije mogu redovno da se subkultivišu kako bi se sprečilo da kultura postane konfluentna, tj. da pokrije celu raspoloživu površinu. Zaista, konfluentnost izaziva prestanak proliferacije i neželjene metaboličke promene. Ćelije mogu da se subkultivišu korišćenjem standardnih tehnika koje su dobro poznate stručnjaku kao što je gore opisano.
Treći korak: Sistem 3D kulture u medijumu za indukciju/maturaciju
[0075] Da bi se omogućilo formiranje tkiva hrskavice, hondrociti dobijeni u drugom koraku se zatim kultivišu u sistemu trodimenzionalne kulture u medijumu za maturaciju koji se takođe naziva indukcioni medijum. U ovom koraku, hondrociti proizvode sopstveni ekstracelularni matriks da bi formirali hrskavičavo tkivo, konkretno počinju da sintetišu kolagen tipa II. Dobijeno tkivo hrskavice je trodimenzionalno tkivo različite veličine, koje se može nazvati sferoidom. Navedeni sferoid je sačinjen od ćelija sadržanih u sferoidu i od hijalinskog matriksa koji su formirale ove ćelije.
[0076] Medijum za maturaciju je bazalni medijum koji sadrži najmanje jednu ili više komponenti koje omogućavaju hondrocitima da proizvode hijalinski matriks i formiraju tkivo hrskavice.
[0077] Konkretno, medijum za maturaciju inaktivira signalni put Wnt. U jednom primeru izvođenja, medijum za maturaciju sadrži bazalni medijum iz koga je jedinjenje koje aktivira signalni put Wnt uklonjeno kao što je prethodno opisano. U drugom primeru izvođenja, navedeni medijum za maturaciju je bazalni medijum koji sadrži inhibitor signalnog puta Wnt kao što je prethodno opisano.
[0078] U poželjnom primeru izvođenja, navedeni medijum za maturaciju je bazalni medijum iz koga je faktor rasta FGF-2 uklonjen. Drugim rečima, medijum za maturaciju je bazalni medijum koji sadrži manje od 0.5 ng/mL FGF-2, poželjno manje od 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 ng/mL FGF-2.
[0079] Komponente koje mogu da utiču na maturaciju hondrocita nisu posebno ograničene i mogu se na odgovarajući način odabrati u zavisnosti od svrhe. Primeri komponenti uključuju faktore rasta TGF-β, insulin, faktore rasta slične insulinu (IGF-1), transformacioni faktor rasta β, koštane morfogene proteine (BMP), selen, transferin, etanolamin, epidermalni faktor rasta, faktore rasta koji potiču od trombocita. Svaka od ostalih gore opisanih komponenti može da se koristi sama, ili više njih može da se koristi u kombinaciji.
[0080] U skladu sa posebnim primerom izvođenja, medijum za maturaciju je bazalni kultivacioni medijum kao što je gore opisano, koji dalje sadrži TGF-β, poželjno TGF-β3.
[0081] Poželjno, medijum za maturaciju sadrži između 1 i 100 ng/mL TGF-β3, poželjnije između 5 do 50 ng/mL TGF-β3.
[0082] Prema jednom primeru izvođenja, medijum za maturaciju hondrocita je bazalni kultivacioni medijum koji sadrži TGF-β3, IGF-1, BMP-2 i insulin. Poželjno, medijum za maturaciju hondrocita sadrži TGF-β3, insulin, IGF-1, BMP-2, selen, transferin i etanolamin, poželjnije TGF-β3, insulin, selen, transferin i etanolamin.
[0083] Poželjno, medijum za maturaciju sadrži između 1 i 100 ng/mL TGF-β3, poželjno 5 i 50 ng/mL TGF-β3, između 1 i 100 ng/mL IGF-1, poželjno 5 i 50 ng/mL IGF-1, i/ili između 1 i 100 ng/mL poželjno 5 i 50 ng/mL BMP-2.
[0084] U skladu sa posebnim primerom izvođenja, hondrociti se kultivišu u sistemu trodimenzionalne kulture u medijumu za maturaciju tokom 10 do 20 dana, poželjno 10 do 15 dana.
[0085] 3D kultura omogućava ćelijama da se međusobno povežu kako bi se favorizovala sinteza ekstracelularnog matriksa od strane hondrocita. Sistem 3D kulture može da bude statički ili dinamički. Statički postupak podrazumeva da se ćelijama obezbedi modalitet da formiraju agregate zahvaljujući statičkim fizičkim silama. Statički postupci uključuju, ali se ne ograničavaju na postupak viseće kapi, kulturu u tečnosti na neadherentnoj podlozi kao što je tanak sloj agara ili agaroze, kulturu na pločama sa nisko-adherentnom površinom. Dinamički postupci podrazumevaju nametnutu ćelijsku agregaciju. Dinamički postupci obuhvataju, ali nisu ograničeni na kulturu u spiner-boci, rotirajuće sudove i kulturu peleta. U poželjnom primeru izvođenja, sistem 3D kulture je kultura peleta. U kulturi peleta, hondrociti se raspodeljuju u ploče i centrifugiraju da bi ćelije agregirale i formirale pelete.
[0086] U poželjnom primeru izvođenja, 3D kultura u medijumu za maturaciju se održava u hipoksičnoj atmosferi da bi se poboljšalo formiranje hrskavice. U poželjnom primeru izvođenja, hondrociti se kultivišu u sistemu 3D kulture u medijumu za maturaciju u atmosferi sa manje od 10% (zapr./zapr.) O2, poželjnije manje od 7% O2, poželjnije sa 5% O2.
[0087] Ćelije se održavaju u medijumu za maturaciju hondrocita do dobijanja tkiva hrskavice. Kako se ovde koristi, hrskavica se odnosi na hijalinsku hrskavicu. Tokom ovog perioda, i na uobičajen način, kultivacioni medijum može redovno da se menja, poželjno na svaka 2 ili 3 dana.
[0088] Kvalitet dobijenog tkiva hrskavice može da se ispita merenjem sadržaja glikozaminoglikana (GAG) i kolagena II u konstruisanom tkivu hrskavice. Kvalitet i kvantitet tkiva hrskavice takođe može da se odredi merenjem količine GAG/mikrotkivu ili odnosom GAG/dvolančana DNK. Prisustvo GAG, kolagena ili dvolančane DNK može da se proceni bilo kojim metodama poznatim u tehnici. Na primer, GAG može da se prikaže bojenjem safraninom-O ili da se odredi kvantitativno utvrđivanjem količine GAG putem testa sa dimetilmetilen plavim (DMMB). Kolagen II može da se proceni imuno-bojenjem ili testom koji je u većoj meri kvantitativan, kao što je ELISA.
[0089] Stoga, opciono, postupak prema pronalasku može da sadrži dodatni korak koji se sastoji od merenja ili procene prisustva GAG i/ili kolagena II u konstruisanom tkivu hrskavice.
Konstruisano tkivo hrskavice (Cartibeads)
[0090] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na konstruisano tkivo hrskavice koje može da se dobije postupkom prema pronalasku. Prema pronalasku, pomenuto konstruisano tkivo hrskavice je u obliku sferoida koji ima sadržaj glikozaminoglikana (GAG) po sferoidu između 10 i 100 μg/sferoidu.
[0091] Ovaj pronalazak se odnosi na konstruisano tkivo hrskavice u obliku sferoida gde navedeni sferoid ima sadržaj GAG po sferoidu od najmanje 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 µg/sferoidu, između 10 i 100 µg/sferoidu, poželjnije između 15 i 60 µg/sferoidu.
[0092] Ovaj pronalazak se odnosi na konstruisano tkivo hrskavice u obliku sferoida pri čemu navedeni sferoid ima odnos GAG/dvolančana DNK od najmanje 10, 15 ili 20, poželjno između 10 do 100, poželjnije između 10 do 80.
[0093] Navedeni sferoid tkiva hrskavice ima prečnik od 1 do 2 mm i sadrži između 50 000 do 250 000 ćelija, prvenstveno 200 000 ćelija.
Farmaceutska kompozicija
[0094] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konstruisano tkivo hrskavice prema pronalasku i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.
[0095] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi moraju da budu kompatibilni sa ćelijama i mogu da budu, na primer, kultivacioni medijum, puferski rastvor ili fiziološki rastvor.
[0096] U poželjnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je pogodna za parenteralnu primenu, poželjno supkutanim putem, posebno za primenu direktno u hrskavičavo ili koštano tkivo. Farmaceutska kompozicija može da bude formulisana u skladu sa standardnim farmaceutskim praksama poznatim stručnjacima.
[0097] U posebnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži tkivo hrskavice prema pronalasku, inkapsulirano u biokompatibilni matriks.
[0098] Farmaceutska kompozicija može takođe da sadrži jedno ili više dodatnih aktivnih jedinjenja, na primer jedinjenja za koja se zna da poboljšavaju preživljavanje ili proliferaciju ćelija ili sprečavaju kontaminaciju.
Terapijska primena
[0099] Prema još jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na konstruisano tkivo hrskavice prema pronalasku ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži pomenuto konstruisano tkivo hrskavice za terapijsku upotrebu, posebno za lečenje defekata hrskavice i degenerativnih bolesti hrskavice kod subjekta kome je to potrebno.
[0100] Ovaj pronalazak se stoga odnosi na konstruisano tkivo hrskavice prema pronalasku za upotrebu u lečenju defekata hrskavice i degenerativne bolesti hrskavice kod subjekta kome je to potrebno. Takođe se odnosi na farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku za upotrebu u lečenju defekata hrskavice i degenerativne bolesti hrskavice kod subjekta kome je to potrebno.
[0101] Ovaj pronalazak je posebno pogodan za autolognu transplantaciju tkiva hrskavice kod subjekta kome je to potrebno. Kod transplantacije autolognog konstruisanog tkiva hrskavice prema pronalasku, hondrociti se prvo izoluju iz navedenog subjekta, poželjno iz biopsije zrelog tkiva hrskavice navedenog subjekta. Hondrociti se zatim kultivišu u skladu sa postupkom pronalaska da bi se dobilo autologno konstruisano tkivo hrskavice i koriste za lečenje defekata hrskavice i degenerativnih bolesti hrskavice kod navedenog pacijenta.
[0102] Prema tome, u poželjnom primeru izvođenja, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu autolognog konstruisanog tkiva hrskavice prema pronalasku ili farmaceutske kompozicije koja sadrži pomenuto autologno konstruisano tkivo hrskavice za lečenje defekata hrskavice i degenerativnih bolesti hrskavice kod subjekta kome je to potrebno.
[0103] U drugom primeru izvođenja, kod subjekta kome je to potrebno može da se koristi alogena transplantacija.
[0104] Kako se ovde koriste, termini „defekti hrskavice i degenerativna bolest hrskavice“ uključuju, ali nisu ograničeni na lezije hrskavice, artrozu, reumatizam ili osteoartritis.
[0105] U posebnom primeru izvođenja, konstruisano tkivo hrskavice prema pronalasku ili njegova farmaceutska kompozicija je indikovana za pacijente pogođene fokalnom lezijom zglobne hrskavice ili ranim osteoartritisom, kako bi se odložila ili izbegla potpuna zamena kolena koja se obično ne predlaže za pacijente mlađe od 60 godina zbog ograničenog veka trajanja proteze. Prema tome, u poželjnom primeru izvođenja, defekti hrskavice i degenerativna bolest hrskavice su fokalna lezija zglobne hrskavice ili rani osteoartritis.
[0106] Termin „lečenje“ kako se koristi u ovom dokumentu odnosi se na poboljšanje ili nestanak simptoma, kao što su bol i smanjenje pokretljivosti, usporavanje progresije bolesti, prestanak evolucije bolesti ili nestanak bolesti. Ovaj termin takođe uključuje i preventivno i kurativno lečenje.
[0107] Kako se ovde koristi, termin „subjekt“ ili „pacijent“ koristi se da označi sisare. Vrste sisara koje mogu imati koristi od otkrivenih postupaka lečenja uključuju, ali nisu ograničene na, ljude, primate izuzev ljudi kao što su bezrepi majmuni, šimpanze, majmuni i orangutani, pripitomljene životinje, uključujući pse i mačke, kao i stoku kao što su konji, goveda, svinje, ovce i koze, ili druge vrste sisara uključujući, bez ograničenja, kamile, miševe, pacove, zamorce, zečeve, hrčke i slično. U posebnom primeru izvođenja, navedeni subjekt je čovek ili konj.
[0108] Termin „terapijski efikasna količina“ kako se ovde koristi odnosi se na dovoljnu količinu za smanjenje simptoma bola ili povećanje pokretljivosti subjekta koji ima defekte hrskavice i/ili degenerativne bolesti hrskavice.
[0109] U poželjnom primeru izvođenja, 10 do 50 sferoida tkiva hrskavice prečnika približno 1 do 2 mm treba da se primeni po cm<2>lezije da je potpuno pokrije.
[0110] Sferoidi imaju sposobnost adherencije na subhondralnu kost i unutrašnju ivicu oštećenja hrskavice.
[0111] Konstruisano tkivo hrskavice ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku mogu da se primene direktnom implantacijom navedene hrskavice na površinu hrskavice ili potpornog matriksa ili u lokalno okruženje hrskavice ili potpornog matriksa subjekta.
[0112] Konstruisano tkivo hrskavice ili farmaceutska kompozicija pronalaska mogu da se primene kod subjekta hirurškom procedurom na otvorenom zglobu ili putem artroskopije, poželjno putem artroskopije da bi se omogućio brži oporavak pacijenata.
[0113] Kada su transplantirani in vivo, hondrociti unutar tkiva hrskavice reaguju na mehanička opterećenja nastavljajući da proizvode matriks kako bi popunili punu debljinu defekta do površine oštećenog tkiva i imaju potencijal da se potpuno spoje in vivo kako bi se formiralo homogeno hrskavičavo tkivo.
Komplet
[0114] Takođe je otkriven komplet za in vitro proizvodnja tkiva hrskavice. Ovaj komplet sadrži:
- prvi kontejner koji sadrži jedno ili više jedinjenja prisutnih u medijumu za dediferencijaciju kao što je gore opisano, poželjno FGF-2, poželjnije FGF-2 i faktor rasta izabran iz grupe koja se sastoji od EGF, TGF-β3 i PDGF-BB i bilo koje njihove kombinacije,
- drugi kontejner koji sadrži jedno ili više jedinjenja prisutnih u medijumu za rediferencijaciju kao što je gore opisano, poželjno TGFβ3, poželjnije TGFβ3 i FGF-7, navedeni TGF-β3 i/ili FGF-7 mogu biti zamenjeni lizatom trombocita, i
- treći kontejner koji sadrži jedno ili više jedinjenja prisutnih u medijumu za maturaciju kao što je gore opisano, poželjno TGF-β3, poželjnije TGF-β3 i jedno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od: IGF-1, BMP-2, insulina, selena, transferina i etanolamina i bilo koje njihove kombinacije, još poželjnije TGF-β3 i insulin, selen, transferin i etanolamin.
[0115] Poželjno, komplet sadrži kontejnere od kojih svaki sadrži jedno ili više jedinjenja u koncentraciji ili u količini koja olakšava rekonstituciju i/ili upotrebu medijuma za diferencijaciju i/ili maturaciju i sprovođenje postupka prema pronalasku. Komplet takođe može da sadrži kontejner koji sadrži bazalni medijum kao što je gore opisano.
[0116] Komplet takođe može da sadrži sistem adherentne kulture, posebno u obliku boce, ploče sa više bunarčića ili posude.
[0117] Komplet takođe može da sadrži uputstva koja ukazuju na postupke za pripremu i/ili korišćenje medijuma za diferencijaciju ili maturaciju za in vitro proizvodnju tkiva hrskavice prema postupku pronalaska.
[0118] Takođe je otkrivena upotreba kompleta prema pronalasku za in vitro proizvodnju hondrocita prema postupcima pronalaska.
Postupak za skrining molekula od terapijskog interesa.
[0119] Takođe je otkrivena upotreba tkiva hrskavice prema pronalasku za skrining molekula od terapijskog interesa.
[0120] Molekuli od terapijskog interesa mogu biti posebno molekuli koji inhibiraju degenerativni proces u degenerativnoj bolesti hrskavice. Ovi molekuli mogu biti posebno upotrebljivi u lečenju ili prevenciji defekata hrskavice ili degenerativnih bolesti hrskavice kao što je gore opisano.
[0121] Takođe je otkriven postupak za skrining molekula od interesa koji sadrži
i) dovođenje u kontakt tkiva hrskavice prema pronalasku sa molekulima-kandidatima, i
ii) odabir molekula koji imaju željenu aktivnost.
[0122] Ovaj pronalazak se posebno odnosi na postupak za skrining molekula koji inhibiraju proces degeneracije hrskavice koji sadrži:
i) dovođenje u kontakt hrskavice prema pronalasku sa jednim ili više molekulakandidata, i
ii) odabir molekula koji inhibiraju proces degeneracije hrskavice.
[0123] Proizvodnja tkiva hrskavice može da se proceni tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima, kao što su, na primer, metode koje obuhvataju merenje GAG ili kolagena II.
[0124] U zavisnosti od prirode traženih molekula, hondrociti koji se koriste za proizvodnju tkiva hrskavice mogu se dobiti od zdravog subjekta ili subjekta koji ima defekt hrskavice ili degenerativnu bolest hrskavice kao što je gore definisano.
[0125] Ostale karakteristike i prednosti pronalaska će postati očiglednije čitanjem sledećih primera datih kao neograničavajuća ilustracija.
PRIMERI
MATERIJAL I METODE
Hemikalije
[0126] XAV939 je nabavljen od kompanije Sigma i korišćen u koncentraciji od 10 µM tokom 4 dana u 2D kulturi u medijumu E.
Proizvodnja Cartibeads
[0127] Sledeći medijumi opisani u tabeli 1 su korišćeni u primerima.
Tabela 1: Kompozicija medijuma korišćenih u primerima.
Sakupljanje uzoraka
[0128] Uzorci humane hrskavice su dobijeni od donora koji su dali informisani pristanak za žive donore (starosti od 18 do 80 godina), nakon ortopedskih procedura za različite indikacije (Tabela 2).
Tabela 2: Karakteristike donora uključujući pol, starost i patologiju.
[0129] Sakupljena hrskavica je prebačena u laboratoriju u sterilnoj posudi u normalnom fiziološkom rastvoru (NaCl 0.9%) na sobnoj temperaturi. Sakupljanje uzoraka humane hrskavice odobrio je Švajcarski etički komitet (BASEC, 2016-00656).
[0130] Hrskavice mini svinja su dobijene iz lateralnog trohlearnog oslonca, (~30 mg), sakupljene iz desnog kolena mini svinja.
[0131] Hrskavica (~ 30 mg) je isečena na male komade (1 mm) da bi se olakšala ekstrakcija hondrocita enzimskom digestijom, zatim je stavljena na 37 °C preko noći uz rotaciju, sa kolagenazom tipa II (400 U/ml, ThermoFisher) u medijumu E koji sadrži antibiotik (gentamicin, 50 ug/ml) i antifungalno sredstvo (amfotericin B ili fungizone<®>, 0.250 ug/ml).
Ćelijska kultura i proizvodnja Cartibeads
[0132] Ćelije su isprane i zasejane (p0) u boce T25 cm<2>prethodno obložene ekstracelularnim matriksom (MaxGel<™>, Sigma), zatim kultivisane 12 do 16 dana u medijumu E sa gentamicinom i fungizone<®>koji su uklonjeni nakon 5 dana ekspanzije ćelija. Sve 2D ćelijske kulture su gajene u bocama obloženim ekstracelularnim matriksom. Po dostizanju konfluentnosti, ćelije su pasažirane u 1 bocu T75 (p1) i kasnije podeljene na 2x T75 (p2) do dostizanja konfluentnosti. U ovoj fazi ćelije mogu da se zamrznu kao rezerva (p3). Nakon ekspanzije ćelija u medijumu E (korak 1), ćelije su kultivisane 7 dana u medijumu R, u koraku 2, gde je primećeno smanjenje njihovog rasta pre prelaska na 3D kulturu u koraku 3. U koraku 3, hondrociti su sakupljeni i agregirani u medijumu I da se dobije 0.2 x 10<6>ćelija/bunarčiću u pločama sa 96 konusnih bunarčića (~20 x 10<6>ćelija/ploči). Ploče sa 96 bunarčića su centrifugirane 5 minuta na 300 g da bi se omogućila agregacija ćelija i formiranje Cartibeads nakon 15 dana u 3D kulturi. Cartibeads su dobijene iz hondrocita do pasaže 8. Ova zrna su uklonjena iz ploča sa 96 bunarčića i spojena zajedno i ona mogu da se održavaju u medijumu I na 4 do 23 °C (sobna temperatura) do 6 dana sa visokom stabilnošću.
Kvantifikacija GAG
[0133] Sadržaj glikozaminoglikana (GAG) je procenjen testom dimetilmetilen plavog (DMMB) (Sigma, 341088). Hondroitin sulfat A (Sigma, C9819) je korišćen za pravljenje 6 standarda, sa koncentracijama u rasponu od 0 do 50 µg/mL. Hondroitin sulfat C (Sigma, C4384) je korišćen za pravljenje interne kontrole kvaliteta (IQC) niske i visoke koncentracije, sa koncentracijama od 15, odnosno 35 µg/mL. Cartibeads su digestirana proteinazom K (1 mg/ml) (Promega, V3021) u Tris-HCl, 50 mM, pH 8 (Sigma), tokom 15±2 sata na 56 °C. Enzimska digestija je zaustavljena inkubacijom na 97 °C tokom 15 minuta. Dobijeni uzorak je zatim razblažen (1/5-1/10) u Tris-HCl, 50 mM, pH 8 za test. Nakon 5 minuta reakcije sa 1 mL rastvora DMMB, 100 µL standarda, ICQ i uzoraka je očitano spektrofotometrom u triplikatu (λ = 525 nm). Zatim je sadržaj GAG normalizovan na količinu DNK, koja je merena PicoGreen-Qubit testom. Standardi i ICQ su pripremljeni od DNK timusa teleta u dva odvojena preparata. Standardi i ICQI su pripremljeni u 200 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, pH 7.5, (TE) puferu; uzorci su oni iz digestije proteinazom K, zatim razblaženi 1 /15 u TE puferu. Za ovaj test je uzeto po 100 µL standarda, IQC, zatim uzorka, i podeljeno u triplikate. Zatim je dodato 100 µL 1/200 razblaženog PicoGreen Quant-It<®>(ThermoFisher, P11496). Uzorak je zatim inkubiran 5 minuta, tokom kog vremena interkalant stvara kompleks sa DNK. Konačno, očitavanje je obavljeno u Qubit 4 fluorometru (ThermoFisher, Q33238), sa ekscitacionim pikom na 485 nm.
Vijabilnost ćelija u Cartibeads
[0134] Uzorci su testirani na vijabilnost testom u kome se koristi crvena fluorescentna boja, Zombie Aqua<™>(Biolegend, 423101) koja je amin-reaktivna fluorescentna boja koja ne prodire u žive ćelije, ali prodire u ćelije sa oštećenim membranama, što omogućava procenu živih naspram mrtvih ćelija. Trodimenzionalni uzorci su sakupljeni do kraja koraka 3, zatim isprani sa PBS, a zatim je dodata Zombie boja razblažena u PBS (1 : 100) tokom 20 minuta, uzorci su držani u mraku. Uzorci su zatim isečeni pomoću kriostatskog mikrotoma na 3 µm debljine i postavljeni na superfrost plus predmetna stakla. Nakon toga su fiksirani sa formolom 4% i zatim tretirani agensom Hoechst (Molecular probe, H3570Thermofisher) razblaženim u PBS (1 : 2000) tokom 10 minuta. Kontrola testa je izvršena dodavanjem Triton<™>(Sigma, X100-100ML) u koncentraciji od 10% u PBS, 1 sat na sobnoj temperaturi (RT) pre početka koraka bojenja bojom Zombie.
Imunohistohemijsko bojenje
[0135] Za imunohistohemijsko bojenje tkiva hrskavice i Cartibeads fiksiranih formalinom i obloženih parafinom, parafinski blokovi koji sadrže uzorke su isečeni mikrotomom na 5 µm. Predmetna stakla su sušena preko noći na 47 °C. Sa predmetnih stakala je ksilolom uklonjen parafin i ona su rehidrirana u kupatilima sa nizom rastvora alkohola (koncentracije 100%, 95% i 70%). Korišćene su dve tehnike demaskiranja. Za nativnu hrskavicu koja potiče od mini svinja, pronalazači su koristili 20 mg/mL rastvora hijaluronidaze u 0.1 M fosfatnom puferu, nanetog na predmetna stakla tokom 1 sata na 37 °C. Predmetna stakla su ispirana u PBS dva puta po 5 minuta da bi se uklonila hijaluronidaza. Uzorci Cartibeads su uronjeni u kupatilo sa 0.01 M citratnog pufera na pH=6, zagrevani 3 puta, svaki put po 5 minuta u mikrotalasnoj pećnici na 620w, a zatim hlađeni u ledenom kupatilu 20 minuta. Predmetna stakla su zatim ispirana u PBS 5 minuta. Zatim su korišćena primarna antitela (Collagen I Abcam, ab6308; Collagen II Abcam ab85266 i ThermoFisher MAS-12789). Treba napomenuti da su dva korišćena antitela na kolagen tipa II pokazala slične rezultate. Antitela su naneta na različite uzorke, razblažena 1 : 100 u 0.3% smeše triton : PBS tokom 1 sata. Nakon ispiranja u trajanju od 5 minuta sa PBS, korišćeno je sekundarno antitelo, biotinkonjugovano anti-mišje antitelo (Vector lab, BA-2000), anti-zečje IgG antitelo (Vector lab BA-1000) i sistem za detekciju avidin-biotin peroksidaze sa 3,3'-diaminobenzidinom kao supstratom (Vector Labs). Uzorci su kontrastno obojeni hematoksilinom. Dehidratacija je postignuta snažnom dehidratacijom protresanjem stalka 10-20 puta u alkoholnim kupatilima (koncentracija 95% i 100%), nakon čega je usledilo kupatilo sa ksilolom do sklapanja predmetnih stakala smolom Eukitt (serija A1113, KiNDO1500). Za snimanje su korišćeni Nikon Eclipse C1 konfokalni mikroskop, kao i Nikon Eclipse TE2000-E.
Bojenje safraninom-O
[0136] Sprovedeno je bojenje safraninom-O uzoraka sfera hrskavice i nativne hrskavice fiksiranih formalinom i obloženih parafinom, da bi se otkrili glikozaminoglikani (GAG) na parafinskim isečcima od 5 µm. Sa predmetnih stakala je ksilolom uklonjen parafin i ona su rehidrirana u kupatilima sa nizom rastvora alkohola (koncentracije 100%, 95% i 70%) sa poslednjim kupatilom sa destilovanim vodenim tokom 5 minuta. Zatim je korišćeno bojenje hematoksilinom za kontrastno bojenje jedra, nakon čega je usledilo 5-minutno ispiranje tekućom toplom vodom. Fast Green (Sigma F7252) je korišćen za bojenje citoplazme, a zatim ispran sirćetnom kiselinom. Predmetna stakla su odmah isprana destilovanom vodom. Za bojenje GAG je dodat 0.1% safranin-O u vodenom kupatilu (Sigma S2255) tokom dva i po minuta, a zatim više puta ispran destilovanom vodom. Dehidratacija je postignuta energičnim protresanjem stalka 10-20 puta u alkoholnim kupatilima (koncentracija 95% i 100%), nakon čega je usledilo ksilolno kupatilo do sklapanja predmetnih stakala smolom Eukitt (serija A1113, KiNDO1500).
Procena multipotentnosti
[0137] Humani MSC/ASC/hondrociti ekspandirani u jednom sloju su diferencirani u hondrogenom, adipogenom i osteogenom pravcu da bi se procenila njihova multipotentnost. Osteogena diferencijacija je procenjena korišćenjem bojenja Alizarin Red S (Merck, TMS-008-C). Adipogena diferencijacija je procenjena korišćenjem bojenja pomoću Oil Red O (Sigma, 01391), a hondrogena diferencijacija je procenjena bojenjem pomoću safranin-O (Sigma, S2255) /Fast Green (Sigma F7252).
Biomehanička merenja
[0138] Testovi sabijanja se izvode pomoću aparata za istezanje-sabijanje MTS criterion (model 42) opremljenog meračem opterećenja od 1N na zrnima hrskavice prečnika u rasponu od 0.68 mm do 1.54 mm i na prirodnoj hrskavici. Brzina sabijanja je podešena na 0.01 mm.s<-1>sa maksimalnim opterećenjem sabijanja postavljenim na 0.2N; maksimalno deset zrna je korišćeno po testu kako bi se povećala površina ispitivane oblasti. Originalni sistem za držanje je napravljen po meri da bi se izbeglo klizanje zrna i obezbedilo izotropno sabijanje tokom testa. Neobrađeni podaci su predstavljali merenja sile sabijanja u funkciji pomeranja. Zatim je izračunata kriva naprezanje-deformacija da bi se procenio Jangov modul za hrskavicu, uzimajući u obzir nagib skupa podataka u linearnom režimu, podeljen sa površinom uzorka i brojem zrna u svrhu normalizacije. Proračun Jangovog modula je napravljen na sledeći način:
gde je σ naprezanje na sabijanje (kPa), E je Jangov modul (kPa) i ε deformacija (bez jedinice) koja odgovara normalizovanom izduženju.
Imunobloting
[0139] Ćelije su lizirane 30 minuta na ledu u ledeno hladnom puferu RIPA (Life Technologies), dopunjenom inhibitorima fosfataze i proteaze (Complete anti-protease cocktail; Roche). Protein (10 µg) je odvojen pomoću SDS-PAGE (BioRad) i prebačen na PVDF membrane (Amersham). Blotovi su hibridizovani sa anti-fosfo-β-kateninom (Cell Signaling; 5651T), TCF-4 (Cell Signaling; 2569), Axin1 (Cell Signaling; 2087), β-aktinom HRP (Sigma-Aldrich) i GADPH (Cell Signaling; 2118) (1 : 1000), a zatim sa HRP-konjugovanim zečjim ili mišjim antitelima (1 : 5000).
Protočna citometrija
[0140] 100 000 ćelija je fiksirano sa 4% PFA, a zatim obojeno na CD73-CFS, CD90-APC i CD105-PerCP (Cell Sigma) tokom 1 sata na RT u puferu FACs (BSA-Azide-PBS). Minimum 10 000 živih ćelija je dobijeno pomoću Gallios protočnog citometra, a analiza je urađena korišćenjem softvera FlowJo. Rezultati predstavljaju prosek tri nezavisna eksperimenta za CD73 i CD90. Izvedena su dva nezavisna eksperimenta za CD105. Za „gejting“ strategiju, žive ćelije su prvo selektovane, a zatim su identifikovane pojedinačne ćelije na osnovu FSC-W i FSC-A da bi se uklonili dubleti. Pozitivno bojenje je definisano na osnovu negativne kontrole IgG-CFS, IgG-APC i IgG-PerCP za CD73-CFS, CD90-APC i CD105-PerCP, redom.
Sekvenciranje RNK
[0141] Kao što je prethodno opisano, korišćene su biblioteke SR100 - TruSeqHT stranded -Illumina HiSeq 4000, a kontrola kvaliteta sekvenciranja je izvršena pomoću FastQC v.0.11.5 (Cosset, E. et al. 2016. Biomaterials 107, 74-87). Raspodela kvaliteta tokom očitavanja je procenjena i validirana za sve uzorke. UCSC humana hg38 referenca je korišćena za mapiranje očitavanja sa STAR poravnanjem v.2.5.3a na referentni genom. Prosečna stopa mapiranja bila je 93.54%. Metrika transkriptoma je procenjena pomoću alata Picard v.1.141, a analiza diferencijalne ekspresije je izvršena pomoću statističke analize R/Bioconductor package edgeR v. 3.18.1 (Gentleman, R. C. et al. 2004. Genome Biol 5, R80, Huber, W. et al. 2015. Nat Methods 12, 115-121). Ukratko, pogoci su normalizovani prema veličini biblioteke i filtrirani. Geni koji imaju broj pogodaka iznad 1 pogotka na milion očitavanja (cpm) u najmanje 3 uzorka su zadržani za analizu. Neobrađeni broj gena u setu bio je 26485. Geni koji se slabo ili nimalo ne eksprimiraju su otfiltrirani. Konačni skup podataka sastojao se od 13 884 gena. Testovi diferencijalno eksprimiranih gena su urađeni egzaktnim testom upotrebom negativne binomne raspodele. P-vrednosti za diferencijalno eksprimirane gene su korigovane za grešku višestrukog testiranja sa 5% FDR (stopa lažno pozitivnih rezultata). Korišćena korekcija je Benjamini-Hochberg (BH). Testovi za diferencijalno eksprimirane gene su urađeni sa edgeR primenom negativne binomne raspodele. P-vrednost diferencijalno eksprimiranih gena je korigovana za grešku višestrukog testiranja korišćenjem Benjamini-Hochberg (BH) stope lažno pozitivnih rezultata (FDR).
[0142] Panter analiza je korišćena za određivanje zastupljenosti za svaku porodicu gena (broj entiteta) (Mi, H. et al. 2017. Nucleic Acids Res 45, D183-D189).
Ekstrakcija RNK i RT-PCR
[0143] Izolacija ukupne RNK je izvršena korišćenjem kompleta RNeasy kompanije Qiagen prema uputstvima proizvođača i merena je spektrometrom. 500 ng ukupne RNK je korišćeno za sintezu cDNK korišćenjem kompleta PrimeScript RT Reagent Kit (Takara) prema protokolu proizvođača.
[0144] PCR u realnom vremenu je izveden sa PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) korišćenjem QuantStudio 12K Flex PCR sistema u realnom vremenu (Thermo Fisher Scientific) u istraživačkom centru Genomic platform (Univerzitet u Ženevi). Prvo, izvršeni su testovi efikasnosti za sve prajmere za validaciju pre upotrebe. Relativni nivo svakog uzorka je normalizovan, najmanje, na 2 konstitutivna gena (ALAS1). RT-PCR reakcije su sprovedene, najmanje, u tehničkim i biološkim triplikatima, i određene su prosečne vrednosti praga ciklusa (CT).
Transplantacija humanih Cartibeads u miševe SCID/NOD za ispitivanje bezbednosti [0145] Pedeset šest mužjaka miševa SCID/NOD je korišćeno za testiranje bezbednosti predmetnih standardizovanih Cartibeads. Četrdeset četiri miša su primila humane Cartibeads supkutanom implantacijom. Korišćena je jedna kontrolna grupa, gde je 8 životinja dobilo agregirane ćelije adenokarcinoma A549, nazvane zrnima (broj miševa po grupi je sumiran u tabeli 3).
Tabela 3. Spisak donora Cartibeads transplantiranih u SCID miševe. Cartibeads različitih donora i ćelijskih pasaža (od 3 do 6) su ubrizgani supkutano u miševe SCID/NOD (n=8 do 14 miševa po grupi). Ćelijska linija adenokarcinoma A549 je korišćena kao pozitivna kontrola i proizvela je 100% tumora. Nakon eutanazije životinja nakon 6 meseci, nijedan od miševa nije pokazao gubitak težine zbog transplantacije Cartibead, abnormalnosti pri palpaciji ili bilo kakve znake opšte uznemirenosti. Pored toga, u plućima, srcu, jetri, bubrezima i slezini nije primećena nikakva abnormalnost ili dokaz prisustva tumora.
[0146] Svi implantirani humani Cartibeads kultivisani su prema standardizovanom trostepenom postupku i transplantirani na isti način. Opšta anestezija je postignuta sa 4% izoflurana, a zatim sa 2% izoflurana ispod maske sa 5% kiseonika. Lokalna dezinfekcija kože nakon brijanja leđa sa 70% alkohola. Urađen je rez u koži od 0.5 cm kaudalno od potiljačnog stuba. Proizvedena tkiva (Cartibeads i zrna adenokarcinoma) od po 200 000 ćelija su implantirana supkutano sterilnom pipetom (1 zrno/životinji). Koža je zatim zatvorena hirurškim lepkom (Histoacryl, B. Braun Surgical S.A.). Da bi locirali mesto i orijentaciju uzorka na koži, pronalazači su tetovirali 4 kardinalne tačke sterilnom iglom od 26 gejdža i zelenim mastilom za tetovažu. Miševi u kontrolnim grupama su eutanazirani nakon 4 do 6 nedelja, dok su miševi u grupi Cartibeads praćeni do 6 meseci. Kožu i organe su sakupila i pregledala dva člana studije u svakoj fazi. Svi uzorci su konzervirani, 1/3 u formolu 4%, a 2/3 kao suvi na -20 °C. Procedure sa životinjama je odobrila Švajcarska savezna kancelarija za veterinarstvo (GE/12/18)
Uporedna genomska hibridizacija na čipu
[0147] Genomska stabilnost je takođe određena upoređivanjem normalnih humanih dermalnih fibroblasta tretiranih sa FBS 10% ili PRP 10% tokom 6 dana korišćenjem uporedne genomske hibridizacije (CGH) na čipu. DNK je ekstrahovana korišćenjem kompleta QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden) prema protokolu proizvođača. CGH na čipu je izvedena korišćenjem kompleta Agilent SurePrint G3 Human CGH Microarray kit 4_44K (ID dizajna 014950) sa ukupnim srednjim razdvajanjem proba od 43 Kb (Agilent Technologies). Praktična rezolucija je bila približno 200 kb. DNK pacijenata i DNK kontrole koja odgovara po polu (1 µg svake) su obeležene sa Cy3-dUTP, odnosno Cy5dUTP (Sure Tag labeling kit, Agilent Technologies). Obeleženi proizvodi su prečišćeni pomoću Amicon Ultra 30 K filtera (Millipore). Hibridizacija je izvedena prema protokolu koji je obezbedio Agilent. DNK pacijenta i kontrole su objedinjene i hibridizovane sa 2 mg humane Cot-I DNK na 65 °C uz rotiranje tokom 24 sata. Čipovi su analizirani korišćenjem skenera Agilent SureScan Microarray i softvera Agilent Feature Extraction (v11.5), a rezultati su predstavljeni pomoću Agilent Genomic Workbench (v.7.0).
Transplantacija autolognih Cartibeads u mini svinje za ispitivanje efikasnosti [0148] U studiji je korišćeno šest odraslih ženki mini svinja (37-48 kg). Životinje su anestezirane sevofluranom i dat im je profilaktički antibiotik intravenski (Cefazolin: 2 g/kg) 30 minuta pre pravljenja reza. Operisane su pod potpunom narkozom i ekstubirane su 5 minuta nakon zatvaranja kože. Dezinfekcija kože je ponovljena tri puta i izvedeno je aseptično prekrivanje jednokratnim hirurškim zastorima.
Korak 1 hirurške intervencije
[0149] Za prvu operaciju izabran je super-lateralni para-patelarni pristup. Sakupljanje hrskavice je obavljeno na superolateralnoj granici lateralne trohlearne fasete da bi se sprečilo potencijalno ometanje kasnijih lezija hrskavice tokom drugog hirurškog koraka. Biopsije hrskavice su stavljene u kultivacioni medijum E za dalju obradu. Izvršeno je stepenasto zatvaranje. Zavoj nije stavljen.
Korak 2 hirurške intervencije
[0150] Pet do 6 nedelja nakon sakupljanja hrskavice, mini svinje su podvrgnute drugoj operaciji putem pristupa medijalne para-patelarne tetive (Bonadio, M. B. et al. 2017. J Exp Orthop 4, 11). Ovim pristupom stvorene su po dve lezije na medijalnoj i lateralnoj femoralnoj trohleji kod svih mini svinja osim jedne zbog obima donorskog mesta. Veličina lezija je bila 6 mm u prečniku i napravljene su malom kiretom, a zatim potpuno ispunjene jednim slojem od 4-5 Cartibeads. Za brže pričvršćivanje, na svaki defekt nanet je tanak sloj Tisseel (Baxter). Zatim je stvorena peta lezija na medijalnom femoralnom kondilu i ispunjena sa Cartibeads na identičan način. Kod svake životinje 1 lezija je ostavljena prazna na različitoj lokaciji kao negativna kontrolna lezija. Izvršeno je stepenasto zatvaranje. Zavoj nije stavljen.
Rehabilitacija
[0151] Puno opterećenje težinom je bilo dozvoljeno čim se narkoza završila bez ograničenja bilo kakve aktivnosti.
Eutanazija
[0152] Tri mini svinje su eutanazirane 3 meseca nakon druge operacije, a ostale tri su eutanazirane nakon 6 meseci. Operisano koleno je amputirano, a distalna butna kost je stavljena u rastvor formil aldehida za dalju analizu.
[0153] Procedure na životinjama je odobrila Švajcarska savezna kancelarija za veterinarstvo (GE/60/18)
REZULTATI
Konstruisanje i karakterizacija Cartibeads
[0154] U ovoj studiji, pronalazači su stvorili mikrotkiva hrskavice, nazvana Cartibeads, sa poboljšanim karakteristikama hijalinske hrskavice, što je definisano sadržajem GAG i ekspresijom kolagena II. Cartibeads postupak je inovativni trostepeni protokol (Slika 1A), koji se sastoji od (korak 1) ekspanzije hondrocita u dvodimenzionalnoj kulturi (2D) koju karakteriše dediferencijacija ćelija praćena (korak 2) rediferencijacijom ćelija u 2D, definisana kao hondrogeno opredeljenje, i konačno (korak 3) trodimenzionalnom kulturom (3D) koja omogućava formiranje Cartibeads agregacijom hondrocita. Dakle, humani hondrociti su enzimski ekstrahovani iz hirurškog otpadnog materijala i kultivisani u 2D u uslovima atmosferskog kiseonika (21%) u koraku 1 i 2, što je praćeno 3D kulturom na niskom nivou kiseonika (5%).
[0155] Hondrociti postaju „fibroblastični“ sa karakteristikama matičnih ćelija u ekspresiji gena i eksprimiraju površinske markere mezenhimskih matičnih ćelija (CD105, CD90, CD73) (Slika 6). Za tri nedelje moguće je od 100000 ekstrahovanih ćelija dobiti 60 do 100 miliona ćelija posle kultivacije u medijumu 1 (medijum E).
[0156] Drugi korak odgovara „reverziji“ fibroblastnog fenotipa ka fenotipu hondrocita nakon koraka masovne amplifikacije ćelija. Ćelije se postavljaju u rediferencijaciju (medijum 2) tokom 3 do 7 dana. Nultog dana, 2 miliona ćelija se zasejava u bocu T75 cm2 da dostignu konfluentnost i ćelije se održavaju konfluentnim do između 4. dana i 8. dana pre nego što se odvoje od podloge za 3D kulturu. Iz boce T75 cm2 dobija se 6 do 10 miliona ćelija u koraku 2. Za poređenje, u prvom koraku u medijumu za dediferencijaciju, u T75 se dobija 12 do 16 miliona ćelija kada dostignu konfluentnost. Uklanjanje faktora rasta FGF-2 u medijumu za rediferencijaciju (medijum R) smanjuje rast ćelija i omogućava reverziju fenotipa i rediferencijaciju ka potpunoj diferencijaciji hondrocita. Ćelije menjaju svoju morfologiju u drugom koraku kulture i postaju manje izdužene, veće, sa izraženim granularnim endoplazmatskim retikulumom u citoplazmi uočljivim pod optičkim mikroskopom, što ukazuje na visok nivo aktivnosti sinteze proteina. Hondrociti počinju da ponovo eksprimiraju agrekan, proteoglikan povezan sa GAG (podaci iz analize RNAseq). U ovom drugom koraku u 2D kulturi, kolagen II još nije počeo da se ponovo eksprimira.
[0157] U trećem koraku, ćelije se odvajaju od kulture u medijumu 2 (medijum R) i zasejavaju u 3D kulturu. 100 000 do 200 000 ćelija se raspoređuje u polipropilenske ploče sa 96 konusnih bunarčića u kultivacionom medijumu za rediferencijaciju (medijum 3, takođe nazvan medijum I). Ploče sa 96 bunarčića se centrifugiraju 5 min, na 300 g da bi se ćelije agregirale i formirale pelete. Ploče sa 96 bunarčića su napravljene od polipropilenskog materijala kako bi se izbeglo da se ćelije zalepe za površinu bunarčića. Kultura se inkubira u hipoksičnoj atmosferi (5% O2) da bi se povećala proizvodnja hijalinske hrskavice tokom 15 dana pre upotrebe mikrotkiva.
[0158] Cartibeads napravljene od hondrocita imaju potencijal za lečenje lezija hrskavice kao ATMP. Stoga, za procenu njihove bezbednosti i efikasnosti, pronalazači su koristili životinjske modele (SCID miševi i mini svinje) (Slika 1B). Za bolju karakterizaciju Cartibeads urađene su histološke kvalitativne analize. Pokazano je prisustvo hijalinskih karakteristika sa homogenom raspodelom GAG obojenog safraninom-O, koje je u korelaciji je sa jakom imunodetekcijom kolagena tipa II, dok je kolagen tipa I bio slabo izražen. (Slika 1C).
[0159] Pronalazači su bili u mogućnosti da konstruišu tkiva hrskavice (nazvana cartibeads) sličnog kvaliteta od donora do 80 godina starosti, uključujući pacijente sa osteoartritisom (OA). Kvantitativna analiza Cartibeads otkrila je visok sadržaj GAG, koji je bio nezavisan od starosti pacijenta i osteoartritičnog statusa zgloba (Slika 1D, Tabela 2). Pronalazači su izmerili u proseku 40 µg GAG/cartibead i prosečnu vrednost GAG/DNK od 50 (10;140) (Slika 2).
[0160] Da bi okarakterisali biomehanička svojstva Cartibeads, pronalazači su koristili aparat sa kalupom prilagođenim po meri da kvantifikuju elastičnost Cartibeads pomoću testa sabijanja. Jangov modul je izračunat deljenjem naprezanja na sabijanje deformacijom u elastičnom delu krive (normalizovano izduženje) (Lee, J. K. et al. 2017, Nature Materials, 16:864-873). Ova metoda se obično koristi za ispitivanje elastičnosti hrskavice i odražava njen sastav ekstracelularnog matriksa (ECM). Pronalazači su primetili povećanje otpornosti na primenu sile kod Cartibeads koji sadrže više GAG, što ukazuje na korisnost povećanja količine GAG (Slika 1E), u skladu sa drugim objavljenim studijama (Omelyanenko, N. P. et al. 2018, Cartilage, 1947603518798890).
[0161] Pošto je poznato da faktor 1-alfa (HIF-1α) koji se može indukovati hipoksijom indukuje sastojke ECM (Madeira et al. 2015, Trends in Biotechnology, 33:35-42), pronalazači su ocenili efekat niskih nivoa kiseonika tokom 3D kulture (5% kiseonika) na kvalitet Cartibeads u poređenju sa atmosferskim uslovima. Kao što se očekivalo, rezultati su pokazali poboljšanje hijalinskog kvaliteta zrna hrskavice u uslovima niskog kiseonika (Slika 3A-C). Treba napomenuti da standardni uslovi kulture u atmosferskim uslovima u stvari odgovaraju hiperoksiji pošto je nivo kiseonika zabeležen u nativnom tkivu hrskavice između 0.5-5%, u zavisnosti od dubine (Lafont, J. E.2010, Int. J. exp. Pathol. 91(2):99-106).
[0162] U ćelijskoj terapiji je od suštinskog značaja stabilnost ćelijskih komponenti materijala koji se transplantira. Stoga su pronalazači ocenili stabilnost Cartibeads u različitim uslovima, kao i proporciju vijabilnih ćelija. Pronalazači su uporedili količinu GAG u Cartibeads 0. dana nakon završetka koraka maturacije, sa Cartibeads držanim na 4 °C i 23 °C dodatnih 6 dana (Slika 4A). Rezultati su pokazali da je koncentracija GAG ostala nepromenjena, u proseku 55 µg/cartibead, tokom vremena i indiferentne varijacije temperature, što ukazuje na stabilnost. Otkriven je samo mali broj mrtvih ćelija (13%) u ovim uslovima, što ukazuje na dobro preživljavanje hondrocita u Cartibeads (Slika 4B).
Analize transkriptoma trostepenog Cartibead postupka identifikovale su nizak nivo ekspresije WNT gena kao ključni put uključen u kvalitet hijalinskog matriksa.
[0163] U pokušaju da se identifikuju molekularni putevi uključeni u povećanu proizvodnju hijalinske hrskavice, trostepeni Cartibead postupak je upoređen sa dvostepenim postupkom, koji se uobičajeno koristi u tkivnom inženjerstvu (Slika 5A). Što se tiče morfologije, trostepeni postupak je rezultovao većim, belo obojenim Cartibeads (prečnik 1-2 mm) od dvostepenog postupka (prečnik 0.5-1 mm) i većom količinom GAG/zrnu (Slika 2A-C). Poboljšanje hijalinskog kvaliteta Cartibeads u trostepenom postupku je uglavnom posledica uvođenja dodatnog koraka nakon ekstenzivne ekspanzije ćelija sa FGF-2. Ovaj korak, koji odgovara koraku gladovanja, koristio je medijum „R“, koji ne sadrži FGF-2, i na taj način olakšao rediferencijaciju hondrocita i proizvodnju hijalinskog matriksa. U oba postupka, poslednji korak se sastoji u 3D kulturama tokom 2 nedelje u medijumu za maturaciju I koji sadrži dodatak TGF-β3 (Slika 5A).
[0164] Da bi razumeli molekularne mehanizme koji omogućavaju proizvodnju Cartibead, pronalazači su izvršili analizu sekvenciranja RNK (RNAseq) koristeći uzorke 3 donora u svakom kritičnom koraku oba postupka. RNK je ekstrahovana u različitim vremenskim tačkama za trostepeni Cartibead postupak: (i) kraj koraka 1 (amplifikovani hondrociti, medijum E), (ii) kraj koraka 2 u medijumu R i (iii) posle 15 dana koraka 3 (zrna, medijum I). Za dvostepeni postupak odabrane su 2 vremenske tačke: korak 1 (amplifikovani hondrociti, medijum E) i kraj koraka 2 (zrna, medijum I). Pronalazači su prvo uporedili mikrotkiva hrskavice dobijena u oba postupka u medijumu I (Slika 5B i C).
[0165] Zapazili su značajno više nivoe gena uključenih u degradaciju / formiranje kolagena i ECM zajedno sa organizacijom ECM u Cartibeads (COL1A1, COL2A1, COL4A1, MMP1, MMP13, MNIP11). Analiza diferencijalne ekspresije gena je pokazala da je trostepeni postupak indukovao mnogo više nivoe kolagena tipa II (COL2A1) i agrekana (ACAN) u Cartibeads, dok je nivo kolagena tipa I (COL1A1), specifičnog za fibroznu hrskavicu bio viši u dvostepenom postupku (Slika 5C-F). Povećani nivoi GAG potvrdili su poboljšanu diferencijaciju hrskavice u trostepenom Cartibead postupku. (Slika 5G; Slika 2A-C). U trostepenom postupku (M1+M2+M3) SOX9 (transkripcioni faktor uključen u proizvodnju matriksa) je takođe povećan (Slika 7C).
[0166] Ovi podaci su potvrdili dediferencijaciju hondrocita u medijumu E (koji sadrži FGF-2) uz detekciju ekspresije COL1A1 i odsustva markera hijalinske hrskavice kao što je tip COL2A1, i ACAN, protein povezan sa GAG (Slika 5D-F). Pronalazači su potvrdili obogaćivanje dediferenciranim ćelijama u medijumu E pomoću protočne citometrije, što ukazuje da je udeo ćelija koje eksprimiraju markere mezenhimskih matičnih ćelija CD73, CD90 i CD 105, kako je definisano predlogom Međunarodnog društva za ćelijsku terapiju (ISCT), na kraju faze ekspanzije iznosio više od 90% ukupne ćelijske populacije (Slika 6A; Tabela 4).
Tabela 4: Analiza dediferenciranih hondrocita protočnom citometrijom. Tabela predstavlja analizu protočnom citometrijom dediferenciranih hondrocita 3 donora na CD73, CD90 i CD 105.
[0167] Osim toga, karakteristike multipotentnosti ove populacije dediferenciranih hondrocita potvrđene su činjenicom da ona ima kapacitet da se diferencira prema drugim ćelijama koje potiču od mezenhimskih matičnih ćelija (MSC) (osteociti, adipociti i hondrociti), čak i ako je ovaj potencijal ostao niži u odnosu na MSC (Slika 6B).
[0168] Kada su pronalazači uporedili ekspresiju gena ćelija kultivisanih u medijumu R (korak rediferencijacije) sa medijumom E (korak ekspanzije), otkrili su više nivoe ekspresije gena uključenih u inflamatorne procese (signalizacija interleukina i citokina zajedno sa signalizacijom interferona) tokom rediferencijacije. Paralelno, pronalazači su pronašli niže nivoe ekspresije gena uključenih u ćelijski ciklus (MI67, CDK, CCNB1), što ukazuje da proizvodnja hijalinskog matriksa zahteva dinamičku ravnotežu između ćelijske inflamacije i remodeliranja tkiva povezanu sa izlaskom iz ćelijskog ciklusa (Slika 7A).
[0169] Upoređujući fazu ekspanzije sa fazom rediferencijacije, pronalazači su primetili visoke nivoe ekspresije gena WNT5A, WNT5B i WNT7B tokom faze ekspanzije (korak 1, medijum E, oba postupka) (Slika 7B, D-F). Ovi geni su bili snažno nishodno regulisani tokom koraka rediferencijacije (medijum R, trostepeni postupak) i tokom 3D kulture (medijum I, oba postupka) osim WNT5B, koji je pokazao intermedijarnu ekspresiju u 3D kulturi (korak 3, medijum I) (Slika 7E).
[0170] Ekspresija KI67 (proliferativni marker) i TCF4 (uključen nishodno od wnt/beta kateninskog puta) je takođe smanjena tokom koraka rediferencijacije (Slika 7C). Što je najvažnije, nakon faza dediferencijacije i rediferencijacije (M1+M2), KI67 i WNT7B/WNT5B se smanjuju pre formiranja sfera u fazi maturacije (M3). Kada se ćelije koriste za formiranje sferoida direktno iz faze dediferencijacije (M1), one i dalje visoko eksprimiraju KI67 i WNT7B/WNT5B i rezultuju manjom proizvodnjom hijalinskog matriksa.
[0171] Ovi rezultati su u skladu sa prethodnim studijama koje izveštavaju o ushodnoj regulaciji WNT nakon tretmana sa FGF-2 (Buchtova, M. et al. 2015. Biochim Biophys Acta 1852, 839-850; Deng, Y. et al.2019. Biomaterials 192, 569-578). Zaista, WNT signalizacija je uključena u fenotip sličan matičnom (Buchtova, M. et al. 2015. Biochim Biophys Acta 1852, 839-850). Shodno tome, uklanjanje FGF-2 u medijumu R dovelo je do nishodne regulacije WNT signalizacije tokom faze rediferencijacije. Pronalazači su otkrili niže nivoe ekspresije COL2A1 i ACAN u dvostepenom postupku u poređenju sa trostepenim postupkom (Slika 5C-E). Međutim, primetili su uporedivo snižavanje gena WNT5A, WNT5B i WNT7B u dvostepenom postupku tokom faze 3D diferencijacije u medijumu I (Slika 7B).
[0172] Da bi se potvrdila uloga nishodne regulacije WNT puta tokom faze rediferencijacije (medijum R) (Slika 1A), pronalazači su zamenili medijum R medijumom E sa dodatkom 10 µM XAV-939, inhibitora WNT puta tokom 4 dana (Slika 7G). Nakon tretmana sa XAV-939, pronalazači su primetili povećanje nivoa fosfo-β-katenina i aksina (Slika 7G), poznatih pokazatelja blokade WNT signalizacije (Huang, S. M. et al. 2009. Nature 461, 614-620).
Shodno tome, slično kao u medijumu R, farmakološka inhibicija WNT je izazvala povećanje ekspresije ACAN i COL2A1 u dvostepenom postupku nakon 2D i 3D kulture, (Slika 7H, I). Kao rezultat toga, farmakološka inhibicija WNT je rezultovala prisustvom hijalinskih karakteristika zrna dobijenih dvostepenim postupkom u prisustvu XAV-939, što je potvrđeno bojenjem GAG safraninom-O (Slika 7J).
[0173] U celini, analiza transkriptoma je identifikovala učešće signalnog puta WNT i njegovu modulaciju dediferencijacije i rediferencijacije hondrocita, zajedno sa WNT5A, WNT5B i WNT7B koji deluju kao potencijalni glavni posrednici ovog odgovora (Slika 7D-F). Medijum E dopunjen sa XAV-939 oponaša efekat medijuma R (Slika 7K), ali trostepeni postupak je prirodno indukovao nishodnu regulaciju WNT gena za 7 dana, bez upotrebe skupog farmakološkog molekula.
Ex vivo studija izvodljivosti kod defekta humane hrskavice
[0174] U kontekstu kliničke primene Cartibeads, pronalazači su procenili kapacitet Cartibeads da se međusobno spoje i integrišu u leziju nastalu u ex vivo zglobu kolena čoveka. Lezija je napravljena hirurškom biopsijom ubodom od 8 mm i ispunjena sa 20 do 50 Cartibeads u suvom stanju. Cartibeads su držani 20 minuta u tom stanju, da bi se olakšala adhezija Cartibeads na mesto lezije i jedne na drugu (Slika 8A, levi i srednji panel), nakon čega je dodat medijum I. Zatim je ceo uzorak sa lezijom ispunjenom Cartibeads kultivisan 1 mesec u rotaciji da bi se olakšao visok prenos mase hranljivih materija. Mesec dana nakon implantacije, pronalazači su analizirali koštano-hrskavičavo tkivo (Slika 8A, desni panel) i izveli bojenje safraninom-O na nivou ispunjene lezije (Slika 8B). Pronalazači su primetili održavanje hijalinskih karakteristika unutar lezije i određeni nivo integracije Cartibeads u prirodno okolno tkivo i međusobno spajanje Cartibeads (Slika 8B).
Pretkliničke studije bezbednosti Cartibeads in vitro i in vivo
[0175] Transplantacija ćelija koje su ekspandirane in vitro postavlja problem potencijalne nekontrolisane proliferacije. Bezbednost Cartibeads je procenjena kroz pretkliničke studije. Analiza CGH (uporedna genomska hibridizacija) na čipu pokazala je genetsku stabilnost hondrocita tokom amplifikacije ćelija do pasaže 11 (Tabela 5).
Tabela 5: Lista donora Cartibeads analiziranih putem CGH na čipu. Genetska stabilnost hondrocita je procenjena nakon ekstenzivne ekspanzije u medijumu E uz prisustvo FGF-2, izvođenjem analize uporedne genomske hibridizacije (CGH) na čipu na uzorcima deset donora kultivisanim od pasaže 3 do 11.
[0176] U skladu sa prethodnim studijama, gubitak hromozoma Y je uobičajena stečena mutacija u normalnom starenju muškaraca i primećena je kod dela (43%) starijih donora (Thompson, D. J. et al. 2019. Nature 575, 652-657; Stumm, M. et al. 2012. Osteoarthritis and cartilage 20, 1039-1045).
[0177] U in vivo studiji, pronalazači su procenili potencijalni tumorogeni efekat transplantiranih humanih Cartibeads kod SCID miševa. Cartibeads se nisu proširili i uglavnom nisu mogli da se detektuju 6 meseci nakon implantacije kod SCID miševa, čime se potvrđuje odsustvo potencijalne tumorogenosti tokom 6-mesečnog praćenja (Slika 9A-C, Tabela 5).
Pretklinička studija efikasnosti in vivo
[0178] U cilju približavanja kliničkoj primeni, pronalazači su izvršili pretkliničku studiju efikasnosti kod odraslih getingenskih mini svinja, izabranih zbog zrelosti njihove hrskavice i anatomije kolena koja liči na ljudsku (Christensen, B. B. et al.2015. Journal of experimental orthopaedics 2, 13; Pfeifer, C. G. et al. 2017. Tissue engineering. Part C, Methods 23, 745-753). U studiji je korišćeno šest ženki. Prva operacija je urađena da bi se uzela biopsija hrskavice (~30 mg) iz kolena za proizvodnju autolognih Cartibeads mini svinja. Druga operacija je izvedena da bi se indukovalo 4 do 5 lezija po životinji/desnom kolenu i da bi se transplantirali autologni Cartibeads. Mini svinje su praćene između 3 i 6 meseci (Slika 10A; Slika 11). Pre transplantacije, količina GAG u Cartibeads mini svinja je kvantifikovana i kretala se u proseku između 40 do 50 µg/zrnu (Slika 10B). Posle 3 meseca od transplantacije, pronalazači su potvrdili hijalinske karakteristike lezija u koje su implantirani Cartibeads mini svinja bojenjem safraninom-O (Slika 10C). Slični rezultati su dobijeni iz lezija sa implantatima 6 meseci nakon transplantacije (Slika 10D). Potpuno međusobno spajanje Cartibeads i njihova integracija u okolnu nativnu hrskavicu i subhondralnu kost primećena je kod svih mini svinja u periodu praćenja od 3 i 6 meseci (Slika 10C-D). Zbirno, autologni Cartibeads dokazali su svoju efikasnost u smislu uspešnosti implantacije u lezije, uz očuvanje njihovog hijalinskog kvaliteta. Takođe su se pokazale bezbednim jer ni degeneracija zgloba (Slika 11, srednji panel), niti formiranje ektopičnog ili hipertrofičnog tkiva nisu zabeleženi pri makro pregledu od strane dva nezavisna operatora (podaci nisu prikazani).
Diskusija i zaključci
[0179] Glavno dostignuće ove studije je postupak koji može da preokrene gubitak fenotipa hondrocita (dediferencijacija hondrocita) tokom ekspanzije. Ovo rešava ključni problem koji se javlja u ćelijskoj terapiji u kojoj se koriste hondrociti kao početni materijal. Sadašnji podaci pokazuju da novi trostepeni postupak može da proizvede visokokvalitetnu hrskavicu sa hijalinskim karakteristikama, bez obzira na starost pacijenta i artritični status zgloba.
[0180] Postupak Cartibead omogućava ekspanziju ćelija iz veoma malog uzorka uzete hrskavice (~30 mg u pretkliničkoj studiji koju su podnosioci prijave izveli na mini svinjama), za razliku od 260 mg u proseku u konvencionalnoj ćelijskoj terapiji zasnovanoj na humanim hondrocitima (Brittberg, M. 2008. Injury 39 Suppl 1, S40-49), što smanjuje morbiditet donorskog mesta. Predmetni postupak je pokazao odnos GAG/Cartibead koji je 20 puta veći nego kod prethodno prikazanih mikrotkiva hrskavice, što ukazuje na to da su ova mikrotkiva hrskavice manje hijalinska i da sadrže više fibrozne hrskavice (Bartz, C. et al.2016. J Transl Med 14, 317). U skladu sa tim rezultatima, pronalazači su u proseku dobili odnos GAG/DNK najmanje tri puta veći nego kod drugog objavljenog postupka (Slika 2B) (Mumme, M. et al.
2016. Lancet 388, 1985-1994; Dang, P. N., Solorio, L. D. & Alsberg, E. 2014. Tissue engineering. Part A 20, 3163-3175).
[0181] Do rediferencijacije je došlo usled uklanjanja FGF-2. Međutim, njegovo uklanjanje u 3D kulturi nije bilo dovoljno da indukuje sintezu hijalinskog matriksa u dvostepenom postupku. Rediferencijacija hondrocita najverovatnije zahteva ćelijsku adheziju na bocu obloženu matriksom i indukciju specifičnih ćelijskih signalnih puteva u 2D kulturi. Uskraćivanje FGF-2 isključuje gene uključene u multipotentnost i matičnost, uključujući nekoliko gena signalnog puta WNT. WNT signalizacija je uključena i u inhibiciju i u stimulaciju hondrogene diferencijacije adultnih progenitorskih ćelija (Day, T. F. et al. 2005. Developmental cell 8, 739-750; Hill, T. P., et al. 2005. Developmental cell 8, 727-738; Hu, H. et al. 2005. Development, 132, 49-60). Kao što je pokazano na embrionima, visoki nivoi signalizacije WNT/β-katenin inhibiraju hondrogenu diferencijaciju matičnih ćelija, dok nishodna regulacija ovog puta indukuje hondrogenezu (Hartmann, C. 2007. Molecules and cells 24, 177-184; Johnson, M. L. & Rajamannan, N. 2006. Reviews in endocrine & metabolic disorders 7, 41-49; Westendorf, J. J., Kahler, R. A. & Schroeder, T. M.2004. Gene 341, 19-39).
[0182] U ovoj studiji, pronalazači su identifikovani WNT5A, WNT5B i WNT7B kao verovatne izoforme WNT uključene u ovaj mehanizam. Paralelno sa nishodnom regulacijom WNT puta, pronalazači su primetili povećanje ekspresije gena uključenih u inflamatorni put (interleukini, citokini). U zarastanju rana i popravci tkiva, dinamička ravnoteža između proi antiinflamatornih faktora je od suštinskog značaja za efikasno zarastanje (Gerhard T. Laschober et al. 2011. Rejuvenation Research 14, 119-131; Bosurgi, L. et al. 2017. Science 356, 1072-1076). Shodno tome, sadašnji podaci sugerišu da je zapaljenje preduslov za regeneraciju tkiva povezanu sa biosintezom hijalinskog matriksa (Karin, M. & Clevers, H.2016. Nature 529, 307-315).
[0183] Humani Cartibeads nisu proliferisali kada su implantirani u SCID miševe i čak su nestali nakon 6 meseci, što je u skladu sa sličnim studijama (Zscharnack, M. et al. 2015. J Transl Med 13, 160). Osim toga, autologna transplantacija Cartibeads kod mini svinja je pokazala stabilnu integraciju u lezije, održavala visoke nivoe GAG i uspešno popravila oštećenje hrskavice 6 meseci nakon transplantacije. Ukratko, pronalazači su pokazali izvodljivost primena transplantata Cartibead koji sadrži visok nivo GAG u velikom životinjskom modelu, što podržava njegov potencijal za dugoročnu popravku hrskavice. Shodno tome, Cartibeads predstavljaju napredak u oblasti popravke hrskavice i sada mogu ući u fazu kliničkog ispitivanja I (prvo ispitivanje na ljudima) za autologne transplantacije hrskavice kod pacijenata sa oštećenjem hrskavice.

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Postupak za in vitro proizvodnju hijalinskog tkiva hrskavice koji sadrži:
i) kultivisanje hondrocita u sistemu adherentne kulture u kultivacionom medijumu za dediferencijaciju koji aktivira signalni put Wnt za dobijanje hondrocita sa morfologijom ćelija sličnih fibroblastima;
ii) kultivisanje navedenih hondrocita sličnih fibroblastima u sistemu adherentne kulture u kultivacionom medijumu za rediferencijaciju koji inaktivira signalni put Wnt da bi se dobili hondrociti sa punim kapacitetom za resintezu hijalinskog matriksa; iii) kultivisanje navedenih hondrocita dobijenih u koraku ii) u sistemu trodimenzionalne kulture u kultivacionom medijumu za indukciju/maturaciju koji održava inaktivaciju signalnog puta Wnt.
2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu navedeni kultivacioni medijum za dediferencijaciju sadrži FGF-2, a navedeni kultivacioni medijum za rediferencijaciju i kultivacioni medijum za indukciju/maturaciju su medijumi bez FGF-2.
3. Postupak prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu navedeni kultivacioni medijum za dediferencijaciju sadrži najmanje jedan faktor rasta izabran iz grupe koja se sastoji od: FGF-2, PDGF-BB, TGF-β i EGF, poželjno navedeni kultivacioni medijum za dediferencijaciju sadrži FGF-2.
4. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu navedeni kultivacioni medijum za rediferencijaciju i navedeni kultivacioni medijum za indukciju/maturaciju sadrže TGF-β, poželjno TGF-β3, poželjnije TGF-β3 i FGF-7.
5. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu navedeni kultivacioni medijum za rediferencijaciju sadrži lizat trombocita.
6. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu navedeni kultivacioni medijum za dediferencijaciju, kultivacioni medijum za rediferencijaciju i/ili kultivacioni medijum za indukciju/maturaciju sadrži/sadrže serum.
7. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu navedeni kultivacioni medijum za indukciju/maturaciju sadrži najmanje jednu komponentu izabranu iz grupe koja se sastoji od: insulina, IGF-1, BMP-2, selena, transferina i etanolamina.
8. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu se navedeni hondrociti kultivišu u koraku iii) u hipoksičnoj atmosferi koja sadrži manje od 10% O2(zapr./zapr.).
9. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu se navedeni hondrociti kultivišu u koraku i) tokom 10 do 15 dana, u koraku ii) tokom 4 do 8 dana i/ili u koraku iii) tokom 10 do 15 dana.
10. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu su navedeni hondrociti iz koraka i) hondrociti izolovani iz subjekta, poželjno iz tkiva hrskavice subjekta čoveka ili konja.
11. Konstruisano tkivo hrskavice u obliku sferoida sa sadržajem glikozaminoglikana (GAG) po sferoidu između 10 i 100 µg/sferoidu koje može da se dobije postupkom prema bilo kom od zahteva 1 do 10.
12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konstruisano tkivo hrskavice prema zahtevu 11 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.
13. Konstruisano tkivo hrskavice prema zahtevu 11 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 12 za upotrebu u lečenju defekata hrskavice i degenerativne bolesti hrskavice kod subjekta kome je to potrebno.
14. Konstruisano tkivo hrskavice ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 13, pri čemu je navedeno konstruisano tkivo hrskavice ili farmaceutska kompozicija za upotrebu u autolognoj transplantaciji kod subjekta kome je to potrebno.
15. Konstruisano tkivo hrskavice ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 13, pri čemu je navedeno konstruisano tkivo hrskavice ili farmaceutska kompozicija za upotrebu u alogenoj transplantaciji kod subjekta kome je to potrebno.
16. Postupak skrininga molekula koji inhibiraju proces degeneracije hrskavice koji sadrži:
i) dovođenje u kontakt konstruisanog tkiva hrskavice prema zahtevu 11 sa jednim ili više molekula-kandidata, i
ii) odabir molekula koji inhibiraju proces degeneracije hrskavice.
RS20241256A 2019-08-14 2020-08-07 Postupak za in vitro proizvodnju tkiva hijalinske hrskavice RS66228B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19191756 2019-08-14
PCT/EP2020/072237 WO2021028335A1 (en) 2019-08-14 2020-08-07 Method for in vitro production of hyaline cartilage tissue
EP20750291.5A EP4013466B1 (en) 2019-08-14 2020-08-07 Method for in vitro production of hyaline cartilage tissue

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66228B1 true RS66228B1 (sr) 2024-12-31

Family

ID=67658935

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241256A RS66228B1 (sr) 2019-08-14 2020-08-07 Postupak za in vitro proizvodnju tkiva hijalinske hrskavice

Country Status (18)

Country Link
US (1) US20220315897A1 (sr)
EP (1) EP4013466B1 (sr)
JP (1) JP7645553B2 (sr)
KR (1) KR20220047811A (sr)
CN (1) CN114555783B (sr)
AU (1) AU2020329525B2 (sr)
BR (1) BR112022002564A2 (sr)
CA (1) CA3149691A1 (sr)
ES (1) ES2995166T3 (sr)
HR (1) HRP20241538T1 (sr)
HU (1) HUE069065T2 (sr)
IL (1) IL290332A (sr)
MX (1) MX2022001888A (sr)
PL (1) PL4013466T3 (sr)
RS (1) RS66228B1 (sr)
SM (1) SMT202400473T1 (sr)
WO (1) WO2021028335A1 (sr)
ZA (1) ZA202201894B (sr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118109397B (zh) * 2022-11-30 2025-03-21 北赛泓升(北京)生物科技有限公司 人多能干细胞分化来源的软骨微组织的制备方法及用途
CN117126801B (zh) * 2023-08-30 2025-01-21 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 一种高再生传代的纤维软骨细胞制备方法、产品及应用
CN120366202B (zh) * 2025-06-27 2025-09-16 山东第一医科大学(山东省医学科学院) 一种3d软骨组织及其制备方法和应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
WO2001068836A2 (en) 2000-03-16 2001-09-20 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
EP1160315A1 (en) * 2000-05-29 2001-12-05 Kantonsspital Basel Use of biochemical factors for tissue engineering
CN101014699B (zh) * 2004-08-24 2010-05-26 富士软件株式会社 去分化型软骨细胞向软骨细胞的再分化用培养基
CN102688524A (zh) * 2005-10-31 2012-09-26 株式会社现代组织工学 包含获得自肋软骨的软骨细胞的人工软骨及其制备方法
WO2008086147A1 (en) * 2007-01-05 2008-07-17 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods for the repair and regeneration of cartilage and/or bone
US20130122589A1 (en) * 2010-07-26 2013-05-16 The University Of Manchester Targeted differentiation of stem cells
EP2977448B1 (en) * 2013-03-21 2019-07-10 Public University Corporation Yokohama City University Method for preparing chondrocytes
US9993504B2 (en) * 2013-04-05 2018-06-12 University Health Network Methods and compositions for generating chondrocyte lineage cells and/or cartilage like tissue
US20170197011A1 (en) * 2014-06-06 2017-07-13 Vivoscript, Inc. Methods for repairing cartilage damage
AU2016205311B2 (en) * 2015-01-08 2022-02-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Factors and cells that provide for induction of bone, bone marrow, and cartilage
JP2020524515A (ja) * 2017-06-21 2020-08-20 モグリファイ リミテッド 軟骨細胞を産生するための細胞リプログラミング法
EP3417888A1 (de) * 2017-06-25 2018-12-26 co.don AG Verfahren zum herstellen von transplantierbarem knorpelgewebe
US11696929B2 (en) 2017-09-20 2023-07-11 The Regents Of The University Of California Methods and systems for conserving highly expanded cells

Also Published As

Publication number Publication date
EP4013466A1 (en) 2022-06-22
CN114555783A (zh) 2022-05-27
JP7645553B2 (ja) 2025-03-14
AU2020329525A1 (en) 2022-03-03
AU2020329525B2 (en) 2026-05-07
ZA202201894B (en) 2025-05-28
SMT202400473T1 (it) 2025-01-14
US20220315897A1 (en) 2022-10-06
CA3149691A1 (en) 2021-02-18
HRP20241538T1 (hr) 2025-01-31
ES2995166T3 (en) 2025-02-07
IL290332A (en) 2022-04-01
EP4013466C0 (en) 2024-10-16
PL4013466T3 (pl) 2025-01-13
WO2021028335A1 (en) 2021-02-18
JP2022545376A (ja) 2022-10-27
MX2022001888A (es) 2022-05-30
CN114555783B (zh) 2026-05-05
EP4013466B1 (en) 2024-10-16
KR20220047811A (ko) 2022-04-19
HUE069065T2 (hu) 2025-02-28
BR112022002564A2 (pt) 2022-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Thorp et al. Fabrication of hyaline-like cartilage constructs using mesenchymal stem cell sheets
Williams et al. Identification and clonal characterisation of a progenitor cell sub-population in normal human articular cartilage
Zhang et al. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes
US12065673B2 (en) Method for obtaining human brown/beige adipocytes
Raabe et al. Hydrolyzed fish collagen induced chondrogenic differentiation of equine adipose tissue-derived stromal cells
Acharya et al. Enhanced chondrocyte proliferation and mesenchymal stromal cells chondrogenesis in coculture pellets mediate improved cartilage formation
Yang et al. Coculture-driven mesenchymal stem cell-differentiated articular chondrocyte-like cells support neocartilage development
WO2011122601A1 (ja) 椎間板髄核幹／前駆細胞、その培養方法および用途
EP4013466B1 (en) Method for in vitro production of hyaline cartilage tissue
Rosenzweig et al. Comparative analysis in continuous expansion of bovine and human primary nucleus pulposus cells for tissue repair applications
Whelan et al. A microphysiological model of bone development and regeneration
Fox et al. Effects of growth factors on equine synovial fibroblasts seeded on synthetic scaffolds for avascular meniscal tissue engineering
Xiong et al. Recapitulation of endochondral ossification by hPSC-derived SOX9+ sclerotomal progenitors
Mahajan et al. Converse modulation of Wnt/β-catenin signaling during expansion and differentiation phases of Infrapatellar fat pad-derived MSCs for improved engineering of hyaline cartilage
Hashemibeni et al. Investigation and comparison of the effect of TGF-β3, kartogenin and avocado/soybean unsaponifiables on the in-vitro and in-vivo chondrogenesis of human adipose-derived stem cells on fibrin scaffold
Pereira et al. In vitro chondrogenic commitment of human Wharton's jelly stem cells by co‐culture with human articular chondrocytes
EP4170019A1 (en) Method and composition for inducing chondrogenesis or tenogenesis in mesenchymal stem cells
WO2018127554A1 (en) Methods of preparing bioengineered or bioprinted organ or tissue, and uses thereof
KR100990436B1 (ko) 중간엽 줄기세포를 ＤＫＫ-1 또는 ｓＦＲＰ-1을 이용하여 연골세포로 분화시키는 방법
KR20240041985A (ko) 관절증 치료제, 및 관절증 치료제의 제조 방법
CN105797154B (zh) 软骨干细胞的分离及其应用
RU2843977C2 (ru) Способ in vitro получения хрящевой ткани, сконструированная хрящевая ткань, способ скрининга
Gadomski et al. Time-and cell-specific activation of BMP signaling restrains chondrocyte hypertrophy
HK40076963B (en) Method for in vitro production of hyaline cartilage tissue
HK40076963A (en) Method for in vitro production of hyaline cartilage tissue