RS66246B1 - Derivati para-hidrohinona kao vegf, tnf i/ili il inhibitori za lečenje neuroinflamtornih bolesti - Google Patents

Derivati para-hidrohinona kao vegf, tnf i/ili il inhibitori za lečenje neuroinflamtornih bolesti

Info

Publication number
RS66246B1
RS66246B1 RS20241332A RSP20241332A RS66246B1 RS 66246 B1 RS66246 B1 RS 66246B1 RS 20241332 A RS20241332 A RS 20241332A RS P20241332 A RSP20241332 A RS P20241332A RS 66246 B1 RS66246 B1 RS 66246B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
acid
dihydroxy
dihydroxybenzamido
carboxy
ethyl
Prior art date
Application number
RS20241332A
Other languages
English (en)
Inventor
Jacques Bauer
Olivier Martin
Original Assignee
Om Pharma Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Om Pharma Sa filed Critical Om Pharma Sa
Publication of RS66246B1 publication Critical patent/RS66246B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D251/00—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings
    • C07D251/02—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings
    • C07D251/12—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D251/14—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hydrogen or carbon atoms directly attached to at least one ring carbon atom
    • C07D251/16—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hydrogen or carbon atoms directly attached to at least one ring carbon atom to only one ring carbon atom
    • C07D251/20—Heterocyclic compounds containing 1,3,5-triazine rings not condensed with other rings having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hydrogen or carbon atoms directly attached to at least one ring carbon atom to only one ring carbon atom with no nitrogen atoms directly attached to a ring carbon atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/196—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino group being directly attached to a ring, e.g. anthranilic acid, mefenamic acid, diclofenac, chlorambucil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/38—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms and carboxyl groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/45—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/46—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/47—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/45—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/46—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/51—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to an acyclic carbon atom of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/64—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C233/81—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/42—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/44—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with carbon atoms of carboxamide groups and singly-bound oxygen atoms bound to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring
    • C07C235/58—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with carbon atoms of carboxamide groups and singly-bound oxygen atoms bound to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring with carbon atoms of carboxamide groups and singly-bound oxygen atoms, bound in ortho-position to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring
    • C07C235/64—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with carbon atoms of carboxamide groups and singly-bound oxygen atoms bound to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring with carbon atoms of carboxamide groups and singly-bound oxygen atoms, bound in ortho-position to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C275/00—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C275/28—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton
    • C07C275/42—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C309/00—Sulfonic acids; Halides, esters, or anhydrides thereof
    • C07C309/01—Sulfonic acids
    • C07C309/28—Sulfonic acids having sulfo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton
    • C07C309/45—Sulfonic acids having sulfo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton containing nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the carbon skeleton
    • C07C309/51—Sulfonic acids having sulfo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton containing nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the carbon skeleton at least one of the nitrogen atoms being part of any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C317/00—Sulfones; Sulfoxides
    • C07C317/44—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C317/46—Sulfones; Sulfoxides having sulfone or sulfoxide groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/56—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/79—Acids; Esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D235/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings
    • C07D235/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, condensed with other rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D235/04—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles
    • C07D235/18—Benzimidazoles; Hydrogenated benzimidazoles with aryl radicals directly attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D257/00—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D257/02—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D257/04—Five-membered rings
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E60/00—Enabling technologies; Technologies with a potential or indirect contribution to GHG emissions mitigation
    • Y02E60/30—Hydrogen technology
    • Y02E60/50—Fuel cells

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
Ovaj pronalazak se uopšteno odnosi na nove derivate hidrohinona, njihovu pripremu i upotrebu ovih jedinjenja u postupcima lečenja poremećaja davanjem ovih jedinjenja toplokrvnim životinjama kojima je to potrebno. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na jedinjenja koja su korisna u prevenciji i/ili lečenju autoimunih, imunoloških, reumatoloških, vaskularnih poremećaja, oftalmoloških poremećaja, fibroznih poremećaja, metaboličkih i gastrointestinalnih poremećaja, neuroinflamatornih i neurodegenerativnih bolesti, neoplazmi i poremećaja povezanih sa kancerom, hormonskih bolesti i imunoloških poremećaja koji su posledica virusnih i bakterijskih zaraznih bolesti i njihove komplikacije.
Osnovne informacije o pronalasku
Neki derivati na bazi hidrohinona, kao što su, na primer, derivati 2,5-dihidroksibenzensulfonske kiseline i posebno kalcijum dobezilat, etazilat i persilat su poznati u predmetnoj oblasti kao aktivna sredstva za lečenje muške seksualne disfunkcije i drugih vaskularnih poremećaja endotelnog porekla, kako sami tako i u kombinaciji sa drugim sredstvima. Na primer, američki patent br.6,147,112 opisuje postupak za upotrebu derivata 2,5-dihidroksibenzensulfonske kiseline, poželjno kalcijum dobesilata, etamzilata i persilata. Kalcijum dobesilat ili hidrohinon kalcijum sulfonat, sa hemijskim nazivom kalcijumova so 2,5-dihidroksibenzensulfonske kiseline, prodaje se kao Dekium (Delalande) i Doxium (Carrion), a proces za njegovu pripremu je opisan u američkom patentu br.
3,509,207.
Postoji mnogo lekova koji sadrže fenol ili katehol grupe koje pate od preranog metabolizma hidroksi grupe tokom apsorpcije nakon oralne primene. Prethodni napori da se zaštite hidroksi grupe su generalno bili neuspešni jer su korišćene zaštitne grupe ili previše labilne (O=COR ili O=CR) ili previše stabilne (CH3). Stoga je cilj predmetnog pronalaska da obezbedi nove derivate hidrohinona, njihove farmaceutski prihvatljive soli i formulacije. Ovi novi derivati hidrohinona imaju posebno snažna antifibrotička, antiinflamatorna i antiangiogena svojstva.
Međunarodna publikacija VO2018160618A1 otkriva određene supstituisane hidrohinone, 1,4-hinone, katehole, 1,2-hinone, antrahinone i antrahidrokinone za upotrebu kao redoks medijatore u novim tehnologijama, kao što su u medijatorskim gorivnim ćelijama ili organskim posrednicima.
Richter i sar., u Sinthesis, 1976, 1976(3), 192-194 otkrivaju bis-N-arilkarbamate i 2,5-dihidroksi-3,6-bis[N-arilkarboksamido]-1,4-benzohinone i njihovu pripremu iz 2,5-dihidroksi-1,4-benzohinona i aril izocijanata.
Japanska publikacija JP 51026839A otkriva da benzanilidi I (R = H, OH) poseduju antituberkularnu, analgetičku, antiinflamatornu i aktivnost izlučivanja mokraćne kiseline:
Benzanilidi I
Američki patent US 3,973,038 takođe otkriva jedinjenja benzoilanilina koja imaju opštu formulu:
pri čemu (R1 = OH, aciloksi; R2 = H, OH, niži alkil, halo, aciloksi; R3 = Cl, Br, niži alkil; R4 = OH, NH2, niži alkoksi, aciloksi; R5 = H, halo, CO2H, niži alkil, aciloksi) koji ima in vivo svojstva inhibicije enzima, posebno histamin deacetilaze i ksantin oksidaze.
Američka patentna prijava 2008/139632A1 otkriva postupak za modulaciju preranog prekida translacije ili raspada mRNA posredovanog nonsensom u ćeliji sa efikasnom količinom hidroksilovanih jedinjenja 1,2,4-oksadiazol benzojeve kiseline formule:
pri čemu (2 je supstituisani ili nesupstituisani aril, heteroaril, cikloalkil, alkil, alkenil, heterocikl, arilalkil ili ariloksialkil; i X1, X2, X3 i X4 su nezavisno H ili OH, a najmanje jedan od X1, X2, X3 ili X4 je OH)
Američka patentna prijava 2013/172333A1 otkriva hsp90 inhibitorna jedinjenja, koja uključuju hidroksilovana jedinjenja 2,4,5-triazol benzoeve kiseline.
Međunarodna publikacija WO2010/142766A1 otkriva derivate pirimidina kao inhibitore zap-70 za lečenje ili profilaksu imunoloških, inflamatornih, autoimunih, alergijskih poremećaja i imunološki posredovanih bolesti.
Američka patentna prijava 2013/121919A1 otkriva postupke za lečenje neurodegenerativnih poremećaja, stanja povezanih sa akumuliranim depozitima amiloid-beta peptida, nivoima Tau proteina i/ili akumulacijama alfa-sinukleina, kao i kancera kod subjekta primenom jedinjenja koje aktivira HAT formula:
pri čemu (R1 je H, ili CF3; R2 je H, Cl ili CN; R3 je H, O-metil, O-etil, S-etil, O-ciklopentil, OCH2CH2N(CH3)2 ili CH2CH2CH2N(CH3)2; R4 je H;
C(=O)NH-fenil, pri čemu je fenil supstituisan sa jednim ili više halo ili CF3; R5 je H, C1-CS-alkil, OH, OCH3, O-etil, OCH2CH2N(CH3)2, CH2CH2CH2N(CH3)2, SCH2CH2N(CH3)2 ili OCH2C(=O)O-alkil; R6 je H, O-metil, O-etil, OCH2CH2N(CH3)2; i X je CONH, SONH, SO2NH, NHC(=O)NH ili NHCO, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so ili hidrat.
Kineska patentna prijava 109687915A1 otkriva halogenovana jedinjenja benzendiol glukozida formule:
pri čemu X označava F, Cl ili I.
Korejska patentna prijava 20060033817 A otkriva derivate 3-(2-amino-6-piridinil)-4-hidroksifenil ketona formule:
pri čemu A) R1 je aromatičan, heteroaromatičan ili opciono supstituisano aromatičan ili heteroaromatičan; B) R2 je izabran iz grupe koja se sastoji od I) cijano; II) supstituent formule -C(=O) -X1 -X2, pri čemu je X1 direktna veza, kiseonik ili opciono supstituisani amino; X2 je vodonik, pirolidin, piperidin, piperazin, morfolin, niži alkilamin, hidroksi, opciono supstituisani niži alkil, opciono supstituisani aril i heteroaril se bira iz grupe koja se sastoji od; i III) supstituent formule -(CH(-X3)) n NX4X5, pri čemu je X3 vodonik, halogen i opciono supstituisani niži alkil izabran iz grupe koju čine, X4 i X5 su svaki nezavisno vodonik, opciono supstituisani niži alkil, opciono supstituisani sulfon i alkil karbamat, n je ceo broj od 1 do 5; C) R3 i R4 su svaki nezavisno izabrani iz grupe koju čine sledeći supstituenti, I) vodonik; i II) opciono supstituisani ravan lanac, razgranati ili ciklični zasićeni ili nezasićeni alkil.
Međutim, nijedan dokument iz predmetne oblasti ne otkriva novu klasu derivata hidrohinona jedinjenja predmetnog pronalaska, koja su posebno korisna za prevenciju i/ili lečenje raznih bolesti uključujući autoimune, imunološke, reumatološke, vaskularne poremećaje, oftalmološke poremećaje, fibrotične bolesti, metaboličke i gastro-intestinalne poremećaje, neuroinflamatorne i neurodegenerativne bolesti, neoplazme i poremećaje povezane sa kancerom, bolesti povezane sa hormonima i imunološke poremećaje koji su rezultat virusnih i bakterijskih infektivnih bolesti i njihove komplikacije.
Pronalazak se takođe odnosi na lečenje, prevenciju i smanjenje metaboličkih poremećaja, kao što su dijabetes i gojaznost. Kako nivo glukoze u krvi raste nakon obroka, insulin se luči i stimuliše ćelije perifernih tkiva (skeletni mišići i masnoća) da aktivno preuzimaju glukozu iz krvi kao izvor energije. Gubitak homeostaze glukoze kao rezultat pogrešne sekrecije ili delovanja insulina tipično dovodi do metaboličkih poremećaja kao što je dijabetes, koji može biti ko-okidač ili dodatno pogoršan gojaznošću. Pošto su ova stanja često fatalna, potrebne su strategije za obnavljanje adekvatnog klirensa glukoze iz krvotoka. Metabolički poremećaji, posebno poremećaji regulacije glukoze i lipida, postaju sve prisutniji kako stanovništvo u industrijalizovanim zemljama stari i sedentarni način života postaje sve češći. Takvi poremećaji su često međusobno povezani i često su prediktori ili rezultati jedan drugog.
Na primer, dijabetes je uzrokovan kombinacijom insulinske rezistencije i neispravnog lučenja insulina od strane β ćelija pankreasa. Osobe sa insulinskom rezistencijom često imaju abdominalnu gojaznost, dislipidemiju, hipertenziju, intoleranciju na glukozu i protrombično stanje (metabolički sindrom). Shodno tome, gojazni pojedinci u celini imaju veći rizik za dobijanje insulinske rezistencije.
Raspad metaboličkog puta stoga može izazvati bezbroj poremećaja kao što su hiperlipidemija, gojaznost, dijabetes, insulinska rezistencija, intolerancija na glukozu, hiperglikemija, metabolički sindrom i hipertenzija, što zauzvrat može pokrenuti dalju metaboličku disfunkciju što dovodi do sistemskih problema i dovodi pojedince u rizik od dodatnih komplikacije i prevremeni morbiditet. Nivo glukoze i lipida delimično reguliše jetra koja igra ulogu u sintezi, skladištenju, sekreciji, transformaciji i razgradnji glukoze, proteina i lipida. Bolest ili traumatska povreda mogu u velikoj meri smanjiti sposobnost jetre da obavlja ove normalne aktivnosti. Dakle, većina kliničkih manifestacija disfunkcije jetre potiče od oštećenja ćelija i oštećenja normalnih kapaciteta jetre. Disfunkcija jetre može biti rezultat genetskih stanja, upalnih poremećaja, toksina kao što su lekovi i alkohol, imunoloških poremećaja, vaskularnih poremećaja ili metaboličkih stanja. Bez obzira na uzrok, oštećenje jetre može sistemski uticati na funkciju metaboličkih procesa i regulaciju nivoa glukoze u krvi i serumskih lipida, pogoršavajući hronična bolesna stanja i dovodeći do povećanog rizika za dalje oboljenje i morbiditet. I povišeni i smanjeni nivoi glukoze u krvi pokreću hormonske odgovore dizajnirane da obnove homeostazu glukoze. Nizak nivo glukoze u krvi izaziva oslobađanje glukagona iz a-ćelija pankreasa. Visok nivo glukoze u krvi izaziva oslobađanje insulina iz bćelija pankreasa. ACTH i hormoni rasta koji se oslobađaju iz hipofize deluju na povećanje glukoze u krvi inhibiranjem uzimanja u ekstrahepatična tkiva.
Glukokortikoidi takođe deluju na povećanje nivoa glukoze u krvi inhibiranjem uzimanja glukoze. Kortizol, glavni glukokortikoid koji se oslobađa iz korteksa nadbubrežne žlezde, luči se kao odgovor na povećanje cirkulišućeg ACTH.
Hormon nadbubrežne moždine, epinefrin, stimuliše proizvodnju glukoze aktivirajući glikogenolizu kao odgovor na stresne stimulo etaboličke poremećaje koji utiču na metabolizam glukoze i lipida kao što su hiperlipidemija, gojaznost, dijabetes, insulinska rezistencija, hiperglikemija, intolerancija na glukozu, metabolički sindrom i hipertenzija imaju dugoročne zdravstvene posledice koje dovode do hroničnih stanja uključujući kardiovaskularne bolesti i prevremeni morbiditet. Takvi metabolički i kardiovaskularni poremećaji mogu biti međusobno povezani, pogoršavati ili pokretati jedni druge i stvarati povratne mehanizme koje je teško prekinuti. Trenutni farmaceutski tretmani za metaboličke i kardiovaskularne poremećaje uključuju kombinacije lekova za snižavanje lipida, hipoglikemijskih lekova, antihipertenziva, dijete i vežbanja. Međutim, komplikovani terapijski režimi mogu da izazovu probleme polifarmacije zbog povećanih neželjenih efekata, interakcija lekova, neuspeha pridržavanja leka i povećanog broja grešaka u primeni lekova. Stoga postoji ubedljiva, nezadovoljena potreba u predmetnoj oblasti da se identifikuju nova jedinjenja, formulacije i postupci za bezbedno i efikasno lečenje metaboličkih i kardiovaskularnih poremećaja i stanja povezanih sa metaboličkim poremećajima.
Primeri metaboličkih stanja uključuju, ali nisu ograničeni na, bol, zarastanje rana, groznicu, neuroinflamatorna i neurodegenerativna stanja, zapaljenje, proizvodnju toplote, homeotermiju, razgradnju triglicerida, glikolizu, Krebsov ciklus, fermentaciju, fotosintezu, brzinu metabolizma, biotički i abiotički stres, sekrecije, oksidativni stres, stres, neoplastični rast, stanje kože, kardiovaskularna stanja, neuroinflamatorna i neurodegenerativna stanja, mentalni poremećaji i poremećaji ponašanja. Takvi procesi ili stanja mogu se javiti u ćeliji, grupi ćelija ili celom organizmu.
Nedavni napredak u molekularnoj medicini doveo je do određenih poboljšanja u dijagnostici i lečenju neoplastičnih bolesti. Uprkos ovom delimičnom uspehu, ove patologije ostaju značajan izazov. Za određene vrste kancera, trenutna terapija u nekim slučajevima ne uspeva iz nekoliko razloga. S jedne strane, to je inherentna rezistencija tumorskih ćelija, njihova sposobnost stalne mutacije i izbegavanje terapije, a sa druge strane heterogenost tumorskog okruženja. Pokazalo se da se tumori istog tipa veoma razlikuju kod pojedinih ispitanika sa stanovišta njihovog genomskog profila što ukazuje na neophodnost tzv. „personalne“ terapije. Još veći problem predstavlja heterogenost mutacija u istom tumoru, što se nedavno pokazalo i kod tumora bubrega, a ovakva situacija se može očekivati i kod drugih tipova tumora. Iz tog razloga, neophodno je tražiti nove pristupe i nepromenljivu tačku(e) intervencije koja je uobičajena za sve ili većinu malignih ćelija u tumoru i koja po mogućnosti utiče na esencijalne funkcije ćelija kancera. Čini se da bi takva tačka intervencije mogla biti na metaboličkom nivou, na primer, mitohondrija, tj. organele koje su fundamentalne za generisanje energije neophodne za sve fiziološke, kao i patofiziološke procese u ćelijama. Iako tumorske ćelije uglavnom koriste takozvanu aerobnu glikolizu za proizvodnju energije, mitohondrijalno disanje (tj. potrošnja kiseonika povezana sa formiranjem ATP-a) je inherentna većini (ako ne i svim) vrstama tumora. Otuda postoji nezadovoljena i ubedljiva potreba u predmetnoj oblasti da se identifikuju nova jedinjenja, formulacije i postupci za bezbedno i efikasno lečenje takvih neoplastičnih poremećaja.
Sažetak pronalaska
Predmetni pronalazak obezbeđuje nove derivate hidrohinona, novi proces pripreme i nove ključne intermedijere. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske sastave koji sadrže terapeutski efikasnu količinu takvih derivata hidrohinona i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
Pronalazak dalje obezbeđuje upotrebu ovih jedinjenja u postupcima lečenja i/ili prevencije angiogene (vaskularne), inflamatorne i/ili fibrozne patobiologije, pošto ona imaju antifibrotička, antiinflamatorna i antiangiogena dejstva. Predmetni pronalazak tako konačno obezbeđuje upotrebu ovih jedinjenja u postupcima lečenja i/ili prevencije bolesti ili poremećaja uključujući imunološke/reumatološke/vaskularne poremećaje, oftalmološke poremećaje, fibrotične poremećaje, metaboličke i gastrointestinalne poremećaje, neoplazme i poremećaje povezane sa kancerom koji obuhvataju davanje subjektu kome je potrebna terapeutski efikasna doza jedinjenja i/ili farmaceutskih sastava predmetnog pronalaska kao što je gore opisano. Posebno, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja i/ili prevencije bolesti ili poremećaja autoimunih, imunoloških, reumatoloških, vaskularnih poremećaja, oftalmoloških poremećaja, fibroznih poremećaja, metaboličkih i gastrointestinalnih poremećaja, neuroinflamatornih i neurodegenerativnih bolesti, neoplazme i poremećaja povezanih sa kancerom, bolesti povezane sa hormonima i imunološki poremećaji koji su rezultat virusnih i bakterijskih zaraznih bolesti i njihovih komplikacija.
Kratak opis slika
SLIKA 1: (A) Konfokalne imunofluorescentne slike vaskularne permeabilnosti procenjene curenjem Evans plave boje u celim nosačima retine kod reprezentativnog miša iz svake eksperimentalne grupe. Strelice pokazuju lokaciju ekstravazacije. Skala, 30 µm. (B) Kvantifikacija vaskularnog curenja procenom broja ekstravazacija po polju (0,44 mm2). Efekat Ic-007a kapi za oči bio je značajan smanjenjem vaskularnog curenja na isti nivo koji se javlja u kontrolnoj grupi bez dijabetesa. *p < 0,01 u poređenju sa drugim grupama.
SLIKA 2: (A) Schmidt rezultat je procena efikasnosti jedinjenja na osnovu četiri kriterijuma histopatološke procene koji opisuju povredu pankreasa na osnovu sledećih rezultata (broj u zagradi) za četiri parametra. (a) Edem Intersticijalni edem sa ocenama (0) Nema (1) Interlobularni (2) Zahvaćeni lobuli (3) Izolovana ostrva poput acinarnih ćelija. (b) Inflamatorna infiltracija = infiltracija leukocita sa rezultatima (0) Nema, (1) < 20%, (2) 20%-50%, (3) > 50%. (c) Parenhimska nekroza = nekroza acinarnih ćelija sa rezultatima (0) Nema, (1) < 5%, (2) 5%-20%, (3) > 20%. (d) Krvarenje sa rezultatima (0) Nema, (1) 1-2 poena, (2) 3-5 poena, (3) > 5 poena. Najviši Schmidt rezultat = 10 je indukovana karuleinom tretman nosačem, a najniži rezultat = 0 su životinje koje nisu izazvane. Schmidt rezultat je zbir a+b+c+d rezultata i **** znači statistički značajnu razliku sa grupom indukovanom caeruleinom kao što je prikazano na Slici 2. Svi proizvodi pokazuju poboljšani Schmidt rezultat u poređenju sa kontrolnim životinjama sa ceruleinom.
SLIKE 3A-D: Slike 3A-B predstavljaju listu bolesti sa glavnim citokinima uključenim u odabrane bolesti (Akdis M. i sar., J Allergi Clin Immunol 2016;
138:984-1010), a Slika 3C predstavlja deo rezultata pretrage sa citokinima i genima rangiranim po rezultatima i verovatno će biti uključeni u izabranu bolest datu kao primer „dijabetička retinopatija“ nakon pretrage na https://vvv.targetvalidation.org/. Na Slici 3D, pretraga je izvršena korišćenjem VEGFA kao citokina da bi se pronašla lista bolesti gde se VEGFA pominje. Samo deo bolesti kod kojih je VEGFA uključen je predstavljen na Slici 3D. ref: Open Targets Platform: new developments and updates two years on. Denise Carvalho i sar. (Nucleic Acids Research, tom 47, izdanje D1, 8. januar 2019., D1056-D1065, https://doi.org/10.1093/nar/gki1133).
SLIKE 4 (A-D): predstavljaju tabelu koja navodi uslove i prinose jedinjenja tipa Ia-Id kao što je opisano u Primerima 1.1 do 1.4. Ukupan prinos izračunat iz polaznog materijala 2,5-dihidroksitereftalne kiseline.
SLIKA 5 (A-C): predstavljaju tabelu u kojoj su navedeni uslovi i prinosi jedinjenja tipa IIa-IIc kao što je opisano u Primerima 1.5 do 1.7.
SLIKA 6: predstavlja tabelu u kojoj su navedeni uslovi i prinosi jedinjenja tipa IIIa i IIIb kao što je opisano u Primerima 1.8 i 1.9.
SLIKA 7: predstavlja tabelu u kojoj su navedeni uslovi i prinosi jedinjenja tipa IIIc kao što je opisano u Primeru 1.10.
SLIKA 8: je tabela sa spiskom postupaka uklanjanja zaštite kao što je opisano u Primeru 1.12 u odnosu na jedinjenja tipa V.
SLIKA 9: prikazuje nivoe glukoze u krvi bez posta (prosek ± stdev svih životinja) u STZ-indukovanom modelu dijabetesa kod svih životinja svake grupe uzorkovanih posle 0 dana pre doziranja, i nakon 7 i 14 dana dnevnog doziranja intravenskim ili per os putevima.
SLIKA 10: prikazuje ubrzano zarastanje rana u STZ-indukovanom modelu dijabetesa kod 3 životinje po grupi uzorkovane nakon 7 dana dnevnog doziranja intravenskim ili per os putevima.
SLIKA 11: Slika 11A prikazuje reprezentativne slike fibroze pluća 21. dan tretmana; (A1) neindukovano (zdravo); A2, Bleomicin izazvan tretmanom vehikulom; A3, Bleomicin izazvan tretmanom pirfenidonom od 100 mg/kg; A4, Bleomicin izazvan tretmanom IVc-059a. Slika 11B prikazuje Ashcroftov rezultat zdravog, netretiranog izazvanog bleomicinom u odnosu na pirfenidon u odnosu na IVc-059a.
Detaljan opis pronalaska
Ovde su otkrivena nova jedinjenja korisna za lečenje subjekata koji pate od bolesti, poremećaja ili disfunkcije. Primeri takvih bolesti, poremećaja ili disfunkcija uključuju bez ograničenja autoimune, metaboličke, inflamatorne, degenerativne i neoplastične poremećaje, posebno inflamatorne patologije, angiogene bolesti i/ili fibrotične poremećaje kao što su dijabetička retinopatija, dijabetička nefropatija, ankilozantni spondilitis, hronični spondilitis, fibroza, fibroza bubrega, kao i metaboličke bolesti uzrokovane disfunkcijom pankreasa.
U daljem tekstu, osim ako nije drugačije naznačeno, skup bolesti, poremećaja ili disfunkcija koji se mogu lečiti korišćenjem novih jedinjenja koja su ovde otkrivena se zajednički nazivaju „medicinska stanja“. Izraz „subjekat“, kako se ovde koristi, obuhvata bilo koji i sve organizme i uključuje izraz „pacijent“. Subjekat koji se leči u skladu sa postupcima opisanim ovde može biti onaj kome je lekar dijagnostikovao da pati od nekog zdravstvenog stanja. Dijagnoza se može izvesti na bilo koji pogodan način. Stručnjak u predmetnoj oblasti će razumeti da je subjekt koji se leči u skladu sa ovim otkrićem možda bio podvrgnut standardnim testovima za dijagnozu medicinskih stanja. Kao što je poznato prosečnom stručnjaku, kliničke karakteristike medicinskih stanja tipa koji je ovde otkriven variraju u skladu sa patomehanizmima.
Ovde se „lečenje“ odnosi na korišćenje otkrivenih jedinjenja u terapeutske svrhe. Terapijski tretman se može primeniti, na primer, subjektu koji pati od zdravstvenog stanja da bi se poboljšalo ili stabilizovalo stanje subjekta. Prema tome, u ovde opisanim patentnim zahtevima i otelotvorenjima, lečenje se odnosi na subjekta koji se podvrgava u terapijske svrhe, metodologijama koje su ovde otkrivene.
Prolekovi kako se ovde koriste odnose se na bilo koju široku strategiju prolekova. Na primer, strategije prolekova formalno je priznao Adrian Albert 1958. (Albert, A. Chemical aspects of selective toxicity. Nature, 1958, 182, 421422), ali je počelo početkom prošlog veka, kao što su primeri metenamina, fenacetina i prontozila. Prolekovi su generalno molekuli sa malo ili bez farmakološke aktivnosti, ali imaju ugrađenu strukturnu labilnost, bilo slučajno ili po dizajnu, koja dozvoljava biokonverziju in vivo u aktivni lek. Konverzija se može desiti hemijskim ili enzimskim procesom ili kombinacijom ova dva.
Aktivni molekuli su često povezani sa neželjenim fizičko-hemijskim svojstvima koja stvaraju značajne izazove za njihovo dostavljanje do odgovarajuće biološke mete. Prolekovi mogu poboljšati metaboličku nestabilnost koja se obično pripisuje metabolizmu u jetri. Slično, neželjeni crevni metabolizam lekova može se prevazići selektivnim strategijama prolekova. Ova nestabilnost može u velikoj meri smanjiti ukupnu količinu leka koja dospe u sistemsku cirkulaciju i njen cilj. Prolekovi se mogu koristiti za zaštitu aktivnih lekova od ovog efekta prvog prolaza maskiranjem metabolički labilne, ali farmakološki esencijalne funkcionalne grupe, kao što je fenol, kako bi se izbegao brz metabolizam.
Prolekovi dobijeni strukturnim modifikacijama leka su dizajnirani da utiču na inherentna fizičko-hemijska svojstva molekula kako bi omogućili njegovu isporuku. Ovi razvoji nisu uvek integrisani u dizajn novih molekula u fazi otkrića. Često je analogna optimizacija preferirani put napred. Primena rane strategije za prolekove može rezultirati bržim kliničkim razvojem i, na kraju, komercijalizacijom leka.
Mnoge strategije prolekova mogu se primeniti da bi se uticalo na lipofilnost matičnog leka. Lipofilnost lekova je poboljšana maskiranjem njegovih polarnih i jonizovanih funkcionalnosti kratkolančanim ugljovodoničnim supstancama. Hidrofilni hidroksil, karboksil, fosfat ili amin i druge negativno ili pozitivno naelektrisane grupe su uspešno konvertovane u više lipofilne alkil ili aril estre ili N-acil derivate, koji se brzo hidrolizuju nazad u matične lekove u telu pomoću sveprisutnih esteraza ili peptidaza.
Predmetni pronalazak stoga obezbeđuje jedinjenje formule (1):
pri čemu:
Ra, Rb = H, C1-4acil, aril1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil;
R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H ili CONH-R10;
jedan od R2 ili R3 je H, a drugi je R5;
R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R5 = R6, R7 ili R8;
R6 = CONH-R9, CONHCOR9, CONH(CH2)n-R9 ili CONHCH(COOR4)(CH2)kR9, heteroaril-R9 pri čemu je k = 0-4;
R7 = benzoheteroaril supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, azoli [5-člani heterocikli koji sadrže N] ili fluor;
R8 = (CH2)mX(CH2)pR9;
X = O, S, SO2, NH, NAc, ili N(CH2)qR9;
R9 = aril ili heteroaril, supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, azoli [5-člani heterocikli koji sadrže N], fluor, C=O, NHCO-R10;
R10 = aril ili heteroaril, supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, azoli [5-člani heterocikli koji sadrže N], fluor;
pri čemu je aril R9 i R10 aromatična grupa koja sadrži od 6 do 14 atoma ugljenika, izabrana između fenil, naftil, bifenil grupe; i heteroaril R9 i R10 je aromatična grupa koja sadrži 1 do 14 atoma ugljenika i jedan ili više azota; i n, m, p i q su nezavisno 1-4.
Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje jedinjenje formule (I):
pri čemu:
Ra, Rb = H, C1-4acil, aril1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil;
R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H ili CONH-R10;
jedan od R2 ili R3 je H, a drugi je R5;
R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R5 = R6, ili R7,
R6 = CONH-R9, CONHCOR9, CONH(CH2)n-R9, ili CONHCH(COOR4)(CH2)kR9; pri čemu je k = 0-4;
R7 = benzoheteroaril supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, 5-člani heterocikli koji sadrže N ili fluor;
R9 = aril, heteroaril, supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 5-člani heterocikli koji sadrže N, fluor, C=O, ili NHCO-R10;
R10 = aril, heteroaril, supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 5-člani heterocikli koji sadrže N, ili fluor; pri čemu je aril R9 i R10 aromatična grupa koja sadrži od 6 do 14 atoma ugljenika, izabrana između fenila, naftila, bifenila; i heteroaril R9 i R10 je aromatična grupa koja sadrži 1 do 14 atoma ugljenika i jedan ili više azota; i n je nezavisno 1-4.
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje formule (I):
pri čemu:
Ra, Rb = H, C1-4acil, aril1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil;
R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H ili CONH-R10;
jedan od R2 ili R3 je H, a drugi je R5;
R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R5 = R8
R8 = (CH2)mX(CH2)pR9;
X = O, S, SO2, NH, NAc, ili N(CH2)qR9;
R9 = aril, heteroaril, supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 5-člani heterocikli koji sadrže N, fluor, C=O, ili NHCO-R10;
R10 = aril, heteroaril, supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 5-člani heterocikli koji sadrže N, fluor;
pri čemu je aril R9 i R10 aromatična grupa koja sadrži od 6 do 14 atoma ugljenika, izabrana između fenil, naftil, bifenil grupe; pri čemu je heteroaril R9 i R10 aromatična grupa koja sadrži 1 do 14 atoma ugljenika i jedan ili više azota; i n, m, p i q su nezavisno 1-4.
Izraz „alkil“ se odnosi na zasićenu, ravnolančanu ili razgranatu ugljovodoničnu grupu koja sadrži od 1 do 20 atoma ugljenika, poželjno od 1 do 12 atoma ugljenika, posebno od 1 do 6 (npr.1, 2, 3 ili 4) atoma ugljenika, na primer metil, etil, propil, izo-propil, n-butil, izo-butil, sek-butil ili terc-butil. Dalje, izraz „alkil“ se odnosi na grupe u kojima je jedan ili više atoma vodonika zamenjeno atomom halogena (poželjno F ili Cl) kao što je, na primer, 2,2,2-trihloretil ili trifluorometil grupa.
Izraz „acil“ se odnosi na grupe (alkil)-C(O)-, (aril)-C(O)-, (heteroaril)-C(O)-, (heteroalkil)-C(O)- i (heterocikloalkil)-C(O)-, pri čemu je grupa vezana za matičnu strukturu preko karbonilne funkcionalnosti. U nekim otelotvorenjima, to je C1-C4 acil radikal koji se odnosi na ukupan broj atoma lanca ili prstena alkil, aril, heteroaril ili heterocikloalkil dela aciloksi grupe plus karbonil ugljenik acila, tj. tri druga atoma u prstenu ili lancu plus karbonil.
Izraz „aril“ se odnosi na aromatičnu grupu koja sadrži jedan ili više prstenova koji sadrže od 6 do 14 atoma ugljenika u prstenu, poželjno od 6 do 10 (posebno 6) atoma ugljenika u prstenu.
Izraz „aralkil“ ili „aril1-4alkil“ odnosi se na grupe koje sadrže i aril i takođe alkil, alkenil, alkinil i/ili cikloalkil grupe u skladu sa gornjim definicijama, ali nisu ograničene na benzil, 2-feniletil, 3 -fenilpropil i 2-naft-2-iletil. Aralkil grupa poželjno sadrži jedan ili dva sistema aromatičnih prstenova (1 ili 2 prstena) koji sadrže od 6 do 10 atoma ugljenika i jednu ili dve alkil, alkenil i/ili alkinil grupe koje sadrže od 1 ili 2 do 6 atoma ugljenika i/ili cikloalkil grupa koja sadrži 5 ili 6 atoma ugljenika u prstenu.
Izraz „heteroaril“ se odnosi na aromatičnu grupu koja sadrži jedan ili više prstenova koji sadrže od 5 do 14 atoma u prstenu, poželjno od 5 do 10 (posebno 5 ili 6 ili 9 ili 10) atoma u prstenu, i sadrži jedan ili više (poželjno 1, 2, 3 ili 4) atoma kiseonika, azota, fosfora ili sumpora u prstenu (poželjno O, S ili N).
Primeri su piridil (npr.4-piridil), imidazolil (npr.2-imidazolil), fenilpirolil (npr.3-fenilpirolil), tiazolil, izotiazolil, 1,2,3-triazolil, 1,2,4-triazolil, oksadiazolil, tiadiazolil, indolil, indazolil, tetrazolil, pirazinil, pirimidinil, piridazinil, oksazolil, izoksazolil, triazolil, tetrazolil, izoksazolil, indazolil, indolziloksazolil, benzilbenzoksazolil, benzilbenzoksazolil piridazinil, hinolinil, izohinolinil, pirolil, purinil, karbazolil, akridinil, pirimidil, 2,3-bifuril, pirazolil (npr.3-pirazolil) i izohinolinil grupe.
Izraz „benzoheteroaril“ ili „benzoheteroaromatičan“ odnosi se na biciklične prstenove koji sadrže fenil prsten fuzionisan sa monocikličnim heteroaromatičnim prstenom. Primeri benzoheteroarila uključuju benzisoksazolil, benzoksazolil, benzizotiazolil, benzotiazolil, benzimidazolil, benzofuril, benzotienil (uključujući S-oksid i dioksid), hinolil, izohinolil, indazolil, indolil i slično.
Izraz „azol“ se odnosi na petočlanu heteroaril grupu koja ima atom azota u prstenu i između 0 i 3 dodatna heteroatoma u prstenu izabrana između N, O ili S. Imidazol, oksazol, tiazol i tetrazol su reprezentativne azolne grupe.
Izraz „cikloalkil“ se odnosi na zasićenu ili delimično nezasićenu (na primer, cikloalkenil grupa) cikličnu grupu koja sadrži jedan ili više prstenova (poželjno 1 ili 2) i sadrži od 3 do 14 atoma ugljenika u prstenu, poželjno od 3 do 10 (naročito 3, 4, 5, 6 ili 7) atoma ugljenika u prstenu. Specifični primeri cikloalkil grupa su ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil grupa.
Izraz „opciono supstituisan“ odnosi se na grupe u kojima najmanje jedan, ili opciono dva, tri ili više atoma vodonika mogu biti zamenjeni atomima fluora, hlora, broma, joda ili sa OH, =O, SH, =S, NH2, NOH, N3 ili NO2 grupama. Ovaj izraz se dalje odnosi na grupe koje mogu biti supstituisane sa najmanje jednom, dve, tri ili više nesupstituisanih C1-C10 alkil, C2-C10 alkenil, C2-C10 alkinil, heteroalkil, C3-C18 cikloalkil, 2-C17 heterocikloalkil, C4-C20 alkilcikloalkil, C2-C19 heteroalkilcikloalkil, C6-C18 aril, C1-C17 heteroaril, C7-C20 aralkil ili C2-C19 heteroaril grupa. Ovaj izraz se dalje posebno odnosi na grupe koje mogu biti supstituisane sa jednom, dve, tri ili više nesupstituisanih C1-C6 alkil, C2-C6 alkenil, C2-C6 alkinil, C1-C6 heteroalkil, C3-C10 cikloalkil, C2-C9 heterocikloalkil, C7-C12 alkilcikloalkil, C2-C11 heteroalkilcikloalkil, C6-C10 aril, C1-C9 heteroaril, C7-C12 aralkil ili C2-C11 heteroaralkil grupa.
U skladu sa poželjnim otelotvorenjem, sve alkil, alkenil, alkinil, heteroalkil, aril, heteroaril, cikloalkil, heterocikloalkil, alkilcikloalkil, heteroalkilcikloalkil, aralkil i heteroaralkil grupe koje su ovde opisane mogu opciono biti supstituisane.
Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje derivat hidrohinona jedinjenja formule (1), pri čemu:
(A)
Ra, Rb = H, C1-4acil, aril1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil,
R1 = COOR4, R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R2 = H; R3 = R5; i
R5 = R6 = CONH-R9;
ili
(B)
Ra, Rb = H, C1-4acil, aril1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil,
R1 = COOR4, R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R3 = H; R2 = R5; i
R5 = R6 = CONH-R9;
U prvom aspektu, predmetni pronalazak tako uključuje jedinjenja u skladu sa Tabelom 1:
Tabela 1
Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule (1), při čemu:
(A)
Ra, Rb = H;
R1 = SO3H;
R2 = H; R3 = R5; i
R5 = R6 = CONH-R9;
ili
(B)
Ra, Rb = H;
R1 = SO3H;
R3 = H; R2 = R5; i
R5 = R6 = CONH-R9;
U drugom otelotvorenju, predmetni pronalazak uključuje jedinjenja u skladu sa Tabelom 2:
Tabela 2
Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje derivat hidrohinona jedinjenja formule (1), pri čemu:
(A)
Ra, Rb = H;
R1 = (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R2 = H; R3 = R5; i
R5 = R6 = CONH-R9;
ili
(B)
Ra, Rb = H;
R1 = (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R3 = H; R2 = R5; i
R5 = R6 = CONH-R9;
U trećem otelotvorenju, predmetni pronalazak uključuje jedinjenja u skladu sa Tabelom 3:
Tabela 3
Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje derivat hidrohinona jedinjenja formule (1), pri čemu:
(A)
Ra, Rb = H, C1-4acil, aril1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil;
R1 = CONH-R10; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R2 = H; R3 = R5; i
R5 = R6 = CONH-R9;
ili
(B)
Ra, Rb = H, C1-4acil, aril1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil;
R1 = CONH-R10; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R3 = H; R2 = R5; i
R5 = R6 = CONH-R9
U četvrtom otelotvorenju, predmetni pronalazak uključuje jedinjenja u skladu sa Tabelom 4:
Tabela 4
Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje derivat hidrohinona jedinjenja formule (I), pri čemu:
(A)
Ra, Rb = H;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R2 = H; R3 = R5; i
R5 = R6 = CONHCOR9;
ili
(B)
Ra, Rb = H;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R3 = H; R2 = R5; i
R5 = R6 = CONHCOR9.
U petom otelotvorenju, predmetni pronalazak uključuje jedinjenja u skladu sa Tabelom 5:
Tabela 5
Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje derivat hidrohinona jedinjenja formule (1), pri čemu
(A)
Ra, Rb = H;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R2 = H; R3 = R5; i
R5 = R6 = CONH(CH2)n-R9;
ili
(B)
Ra, Rb = H;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R3 = H; R2 = R5; i
R5 = R6 = CONH(CH2)n-R9.
U šestom otelotvorenju, predmetni pronalazak uključuje jedinjenja u skladu sa Tabelom 6:
Tabela 6
Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje derivat hidrohinona jedinjenja formule (1), pri čemu:
Ra, Rb = H;
R1 = SO3H;
R2 = H; R3 = R5; i
R5 = R6 = CONH(CH2)n-R9.
U skladu sa sedmim otelotvorenjem, predmetni pronalazak uključuje jedinjenja u skladu sa Tabelom 7 ispod:
Tabela 7
Poželjno, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje derivata hidrohinona formule (1), pri čemu:
(A)
Ra, Rb = H;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R2 = H; R3 = R5; i
R5 = R6 = CONHCH(COOR4)(CH2)k-R9;
ili
(B)
Ra, Rb = H;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R3 = H; R2 = R5; i
R5 = R6 = CONHCH(COOR4)(CH2)k-R9
U skladu sa osmim otelotvorenjem, predmetni pronalazak uključuje jedinjenja u skladu sa Tabelom 8 ispod:
Tabela 8
U specifičnom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje derivate hidrohinona jedinjenja formule (1), pri čemu
(A)
Ra, Rb = H;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H, ili CONH-R10; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R2 = H; R3 = R5; i
R5 = R6 = heteroaril-R9,
ili
(B)
Ra, Rb = H;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H, ili CONH-R10;
R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R3 = H; R2 = R5; i
R5 = R6 = heteroaril-R9
Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje derivat hidrohinona jedinjenja formule (1), pri čemu:
(A)
Ra, Rb = H;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H, CONH-R10;
R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R2 = H; R3 = R5; i
R5 = R7 = benzoheteroaril supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, azoli [5-člani heterocikli koji sadrže N] ili fluor;
ili
(B)
Ra, Rb = H;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H, ili CONH-R10;
R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R3 = H; R2 = R5; i
R5 = R7 = benzoheteroaril supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, azoli [5-člani heterocikli koji sadrže N] ili fluor;
U skladu sa devetim otelotvorenjem, predmetni pronalazak uključuje jedinjenja u skladu sa Tabelom 9:
Tabela 9:
Poželjno, predmetni pronalazak obezbeđuje derivat hidrohinona jedinjenja formule (I), pri čemu:
(A)
Ra, Rb = H, C1-4acil, aril1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H, ili CONH-R10;
R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R2 = H; R3 = R5; i
R5 = Rs = (CH2)mX(CH2)pR9;
pri čemu X = O, S, SO2, NH, NAc ili N(CH2)qR9;
ili
(B)
Ra, Rb = H, C1-4acil, aril1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H, ili CONH-R10;
R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar);
R3 = H; R2 = R5; i
R5 = R8 = (CH2)mX(CH2)pR9;
pri čemu X = O, S, SO2, NH, NAc ili N(CH2)qR9.
U skladu sa desetim otelotvorenjem, predmetni pronalazak uključuje jedinjenja u skladu sa Tabelom 10:
Tabela 10.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za dobijanje jedinjenja derivata hidrohinona formule (I), koji sadrži:
Korak (a): Kuplovanje karboksilne kiseline izvedene iz hidrohinona, zaštićene na fenolnim funkcijama, sa anilinom koji nosi različite funkcionalne grupe, putem odgovarajućeg acil hlorida ili korišćenjem amidnog sredstva za kuplovanje kao što je TCFH u prisustvu nmI;
Korak (b): Uklanjanje zaštite sa estra obično funkcioniše reakcijom saponifikacije; i
Korak (c): Uklanjanje zaštite fenolnih funkcija tipično katalitičkom hidrogenacijom.
ili, alternativno,
Korak (d): Redukcija karboksilne kiseline izvedene iz hidrohinona, zaštićene fenolnim funkcijama, da bi se dobio benzil alkohol
(e) Aktivacija funkcije benzilnog alkohola i supstitucija sa benzilnim nukleofilom (alkohol, tiol, primarni ili sekundarni amin) koji nosi različite funkcionalne grupe;
(f) Uklanjanje zaštite sa estra funkcioniše tipično reakcijom saponifikacije; i
(g) Uklanjanje zaštite fenolnih funkcija tipično katalitičkom hidrogenacijom.
Proces je šematski predstavljen u nastavku:
eno
Jedinjenja derivata hidrohinona predmetnog pronalaska mogu biti prisutna kao optički aktivni oblici (stereoizomeri), E/Z izomeri, enantiomeri, racemati, njihovi dijastereoizomeri i njihovi hidrati i solvati. Solvati jedinjenja nastaju zbog međusobne privlačnosti između molekula jedinjenja i korišćenog inertnog rastvarača. Solvati, npr. monohidrati, dihidrati ili alkoholati.
Derivati hidrohinona iz predmetnog pronalaska mogu takođe biti prisutni kao farmaceutski prihvatljive soli, pri čemu su osnovni derivati hidrohinona modifikovani pripremanjem njihovih kiselih ili baznih soli.
Primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju, između ostalog, soli mineralnih ili organskih kiselina baznih ostataka, kao što su amini; i alkalne ili organske soli kiselih ostataka, kao što su karboksilne kiseline i slično.
Farmaceutski prihvatljive soli mogu uključivati konvencionalne netoksične soli ili kvaternarne amonijumove soli koje su pogodne za sve puteve primene jedinjenja, na primer, iz netoksičnih organskih ili neorganskih kiselina. Na primer, navedene konvencionalne netoksične soli uključuju one izvedene iz neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, bromovodonična, sumporna, sulfaminska, fosforna, azotna i slično; i soli pripremljene od organskih kiselina kao što su sirćetna, propionska, jantarna, glikolna, stearinska, mlečna, jabučna, vinska, limunska, askorbinska, pamoična, maleinska, hidroksilelna, fenilsirćetna, glutaminska, benzoeva, salicilna, sulfanilna, 2-benzoacetoksa, fumarna, toluen sulfonska, metan sulfonska, etandisulfonska, oksalna, izetionska, trifluorosirćetna i slično.
Farmaceutski prihvatljive soli su opisane za katjone i anjone „Pharmaceutical salts: A summary on doses of salt formers from the Orange Book. Saal C, European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013, 49, 614-623. Kao primere katjona, možemo navesti aluminijum, arginin, benzatin, kalcijum, hloroprokain, holin, dietanolamin, dietilamin, etanolamin, etilendiamin, lizin, magnezijum, histidin, litijum, meglumin, kalijum, prokazin, trikizin, kalijum. kao primere anjona, možemo navesti acetat, aspartat, benzensulfonat, benzoat, bezilat, bikarbonat, bitartrat, bromid, kamzilat, karbonat, hlorid, citrat, dekanoat, edetat, esilat, fumarat, gluceptat, glukonat, glukolat heksanoat, hidroksinaftoat, jodid, izetionat, laktat, laktobionat, malat, maleat, mandelat, mezilat, metilsulfat, mukat, napsilat, nitrat, oktanoat, oleat, pamoat, pantotenat, fosfat, poligalakturonat, propionat, stefatsulfat, salinat tartarat, teolat, tozilat. Alternativno, cviterioni se mogu koristiti kao soli kao što su slobodne aminokiseline arginin ili lizin kao katjonski protivjoni i glutamat ili aspartat kao anjonski kontrajoni. Kratki peptidi (2 do 20 amino kiselina) kao ponovljene jedinice arginina ili lizina i njihove kombinacije sa drugim neutralnim amino kiselinama. Ovi kationski peptidi koji prodiru u ćelije (CPP) mogu se koristiti kao pojačivači za prodiranje leka u ćelije.
Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja korisnih u predmetnom pronalasku mogu se, na primer, sintetizovati iz matičnog jedinjenja koje sadrži bazni ili kiseli deo konvencionalnim hemijskim postupcima. Generalno, navedene soli se mogu dobiti reakcijom slobodne kiseline ili baznih oblika ovih jedinjenja sa stehiometrijskom količinom odgovarajuće baze ili kiseline u vodi ili u organskom rastvaraču, ili u smeši ova dva; Generalno, poželjni su nevodeni medijumi kao što su etar, etil acetat, etanol, izopropanol ili acetonitril. U Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. izdanje, Mack Publishing Compani, Easton, PA, 1985, str.1418, prikazani su spiskovi pogodnih soli.
Pogodne doze prema pronalasku i kao što je ovde opisano u različitim otelotvorenjima mogu da variraju u zavisnosti od stanja, starosti i vrste subjekta, i mogu ih lako odrediti stručnjaci u predmetnoj oblasti. Ukupne dnevne doze koje se koriste i u veterini i u humanoj medicini biće prikladno u rasponu od 0,01-2000 mg/kg telesne težine, poželjno od 0,1-1000 mg/kg telesne težine, poželjno od 1-100 mg/kg i one se mogu davati kao pojedinačne ili podeljene doze, a pored toga, gornja granica takođe može biti prekoračena kada se utvrdi da je to indicirano. Takva doza se može prilagoditi individualnim zahtevima u svakom slučaju uključujući specifična jedinjenja koja se primenjuju, put primene, stanje koje se leči, kao i pacijenta koji se leči. Međutim, jedinjenja se takođe mogu davati kao depo preparati (implantati, formulacije sa sporim oslobađanjem itd.) nedeljno, mesečno ili u čak dužim intervalima. U takvim slučajevima doza može biti mnogo veća od dnevne i može se prilagoditi obliku primene, telesnoj težini i konkretnim indikacijama. Odgovarajuća doza se može odrediti sprovođenjem konvencionalnih testova modela, poželjno životinjskih modela. Generalno, u slučaju oralne ili parenteralne primene odraslim ljudima težine oko 70 kg, dnevna doza od oko 10 mg do oko 10.000 mg, poželjno od oko 200 mg do oko 1000 mg, treba da bude odgovarajuća, iako gornja granica može biti prekoračen kada je to naznačeno. Podrazumeva se da gore navedene terapeutski efikasne doze ne moraju biti rezultat jedne primene i obično su rezultat primene većeg broja jediničnih doza. Te jedinične doze mogu zauzvrat da obuhvataju delove dnevne ili nedeljne doze, i stoga se terapeutski efikasna doza određuje tokom perioda lečenja (kontaktiranja). Na primer, za oralnu primenu, dnevna doza može biti oko 0,04 do oko 1,0 mg/kg telesne težine, poželjnije oko 0,04 do oko 0,20 mg/kg/dan, poželjnije još od oko 0,05 do oko 0,15 mg/kg/ dan, a najpoželjnije oko 0,1 mg/kg telesne težine.
Generalno, količina primenjene aktivne supstance može da varira u relativno širokom opsegu da bi se postigla, a poželjno je i održala, željena koncentracija u plazmi. Jedinični dozni oblici aktivnog sastojka mogu da sadrže oko 0,1 miligrama do oko 15 miligrama istog. Poželjni jedinični dozni oblik sadrži oko 0,1 do oko 1 miligram agensa i može se primeniti 2 do 5 puta dnevno. Međutim, treba napomenuti da se razmatraju i drugi alternativni putevi kao što je kontinuirana infuzija brzinom dizajniranom da održi gore opisanu koncentraciju u plazmi.
Trajanje određenog tretmana takođe može da varira u zavisnosti od težine bolesti, da li je tretman namenjen akutnoj manifestaciji ili u profilaktičke svrhe, i slično. Tipična primena traje u periodu od oko 5 do oko 14 dana, sa uobičajenim kursom od 7 dana.
Kursevi (ciklusi) primene se takođe mogu ponavljati u mesečnim intervalima, ili se parenteralne jedinične doze mogu davati u nedeljnim intervalima. Oralne jedinične doze se mogu davati u intervalima od jednog do nekoliko dana da bi se obezbedila određena terapeutski efikasna doza. Odgovarajuća doza jedinjenja pronalaska zavisiće od vrste bolesti koja se leči, od težine i toka bolesti, od toga da li se sredstvo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, od istorije bolesti pacijenta i od odgovora na jedinjenja i kriterijume odgovornog lekara.
Određivanje odgovarajuće doze ili načina primene je očigledno u mogućnostima trenutnog lekara. Eksperimenti na životinjama pružaju pouzdan vodič za određivanje efektivnih doza za terapiju ljudi. Skaliranje efektivnih doza među vrstama može se izvršiti u skladu sa principima koje su uspostavili Mordenti, J. i Chappell, W. „The use of interspecies scaling in toxicokinetics“, u Tokicokinetics and Nev Drug Development, urednici Yacobi i sar., Pergamon Press, Nev Iork, 1989, str.42-96.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutski sastav koji sadrži (i) terapeutski efikasnu količinu jedinjenja derivata hidrohinona formule (1) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili stereoizomere, i (ii) farmaceutski prihvatljive ekscipijense ili ekscipijente. Farmaceutski ekscipijenti prema predmetnom pronalasku mogu biti izabrani iz grupe koju čine konvencionalni ekscipijenti, kao što su, ali bez ograničenja na, sredstva za rastvaranje, veziva, punioci, dezintegranti, maziva, pH modifikatori, pojačivači propusnosti, modifikatori oslobađanja, konzervansi, sredstva za oblaganje, nosači, sredstva za maskiranje ukusa i njihove kombinacije.
Farmaceutski sastav jedinjenja predmetnog pronalaska sa jednom ili više farmaceutskih komponenti, može se formulisati sa navedenim ekscipijentima kao tečni lekovi, čvrsti ili polučvrsti lekovi i/ili gasoviti lekovi.
Kada su prisutne u čvrstim formulacijama, one mogu uključivati, bez ikakvih ograničenja, granule, pelete, tablete, kapsule, praškove, filmove, pastile, tablete koje se mogu drobiti, rastvorljive tablete, tablete za raspadanje, tablete za disperziju, filmom obložene tablete i kontrolisani, dugotrajni, prošireni ili modifikovani formati izdanja bilo kog od gore navedenih čvrstih formata. Takve formulacije mogu takođe biti u obliku trenutnog oslobađanja, odloženog oslobađanja ili modifikovanog oslobađanja. Dalje, sastavi sa trenutnim oslobađanjem mogu biti konvencionalni, disperzibilni, za žvakanje, rastvaranje u ustima ili brzo topljeni preparati, i sastavi sa modifikovanim oslobađanjem koji mogu sadržati hidrofilne ili hidrofobne, ili kombinacije hidrofilnih i hidrofobnih, supstance koje kontrolišu brzinu oslobađanja da bi formirale matriks ili rezervoar ili kombinaciju matričnih i rezervoarskih sistema.
Sastavi se mogu pripremiti korišćenjem jedne ili više tehnika kao što su direktno mešanje, suva granulacija, vlažna granulacija, homogenizacija, mlevenje, mikronizacija, ekstruzija i sferonizacija. Sastavi mogu biti predstavljeni kao neprevučeni, obloženi filmom, presvučeni šećerom, obloženi prahom, enterički obloženi i premazani sa modifikovanim oslobađanjem. Kada su prisutni u tečnim formulacijama, oni mogu uključivati bez ikakvih ograničenja, bilo koje tečne oblike kao što su rastvori, suspenzije, nanosuspenzije, disperzije, koloidi, emulzije, losioni, kreme, masti, tinkture i sastavi osušeni zamrzavanjem. Kada su prisutni u gasovitim formulacijama, oni mogu uključivati bez ikakvih ograničenja, mleveni prah ili mešavinu, mikronizovani prah ili mešavinu, nanosuspenzije, aerosole, sprejeve, kapljice, magle, raspršene rastvore ili suspenzije i/ili atomizovane pare.
Farmaceutski sastavi prema predmetnom pronalasku mogu dalje da sadrže bilo koje aditive kao što su vehikulum, vezivna sredstva, parfemi, arome, zaslađivači, boje, antiseptici, antioksidansi, stabilizatori i surfaktanti, ako je potrebno.
Farmaceutski sastavi i jedinjenja u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se formulisati za primenu enteralnim putevima, kao što su oralni putevi; parenteralnim putevima putem injekcija kao što su intravenske, subkutane, intraokularne, intramuskularne ili intraperitonealne injekcije; lokalnim putevima, kao što su očni putevi, mukozni i transmukozni putevi, uključujući sublingvalne/bukalne puteve; kao i plućnim, nazalnim, intranazalnim, intrabronhijalnim, intrapulmonalnim putevima. Očni putevi primene uključuju topikalnu okularnu primenu, intraokularnu, intravitrealnu ili retrobulbarnu primenu.
Poželjne formulacije jedinjenja prema predmetnom pronalasku sadrže tečne oralne formulacije, očne formulacije i intravenske i intraperitonealne formulacije.
Tečne oralne formulacije su formati rastvora i suspenzija za oralnu primenu lekova su uobičajeni, pogodni i smatraju se bezbednim. Mogu se koristiti za isporuku relativno velikih količina leka i često se koriste za pedijatrijsku populaciju i za one koji imaju poteškoća pri gutanju tableta ili kapsula. Uvođenje preko gastrointestinalnog trakta obezbeđuje brzo rastvaranje i apsorpciju leka, ali se mora uzeti u obzir podnošljivost i interakcija sa drugim materijalima u traktu. Svojstva aktivnog farmaceutskog sastojka (API) mogu se formulisati u jednostavnim oralnim rastvorima na bazi vode, međutim, kada je API slabo rastvorljiv, formulacije treba da budu dizajnirane oko molekula da bi se poboljšala rastvorljivost i biodostupnost. Uvođenje surfaktanta, rastvarača, pufera i ulja povećava rastvorljivost i smanjuje precipitaciju i/ili degradaciju pri interakciji sa želudačnim tečnostima. Tamo gde su suspenzije potrebne, veličina čestica se često smanjuje i kontroliše kako bi se poboljšala rastvorljivost leka, permeacija i konačno apsorpcija leka. Kako razvoj formulacije napreduje, uvode se konzervansi i arome kako bi se omogućila usaglašenost pacijenata i odgovarajući rok trajanja.
Očne formulacije su oftalmološke formulacije koje se isporučuju direktno u oko i često su tečnosti u obliku rastvora ili suspenzije. Primena u oko izbegava metabolizam u gastrointestinalnom traktu i može se koristiti za lekove koji se slabo apsorbuju kada se daju oralno. Kapi za oči su sterilne i izotonične sa nominalnim pH od 4-8 da bi se izbegla iritacija oka. Ekscipijenti uključujući sredstva za rastvaranje, želatna sredstva, polimere, surfaktante, pojačivače permeacije i ciklodekstrine se dodaju formulaciji da bi se poboljšala stabilnost, modifikovao viskozitet ili povećala rastvorljivost, permeabilnost i biodostupnost slabo rastvorljivih lekova.
Intravenske formulacije omogućavaju brzu apsorpciju nakon parenteralnog davanja leka cele doze koja stigne do sistema pacijenata za trenutni odgovor. Ovim načinom uvođenja izbegava se metabolizam u gastrointestinalnom traktu i može se koristiti za lekove koji se slabo apsorbuju kada se daju oralno. Injekcije su obično sterilni, izotonični rastvori na bazi vode i dizajnirani su tako da ne izazivaju bol prilikom primene. Za slabo rastvorljive lekove, formulacije su modifikovane sa organskim ko-rastvaračima, surfaktantima i puferima da bi se povećala rastvorljivost, a formulacije nano suspenzije su takođe prihvatljive. Za one molekule koji su nestabilni u rastvoru, formulacije se mogu liofilizovati za razblaživanje na mestu upotrebe.
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje komplete, koji sadrže sastav koji sadrži terapeutski efikasnu dozu jednog ili više jedinjenja iz predmetnog pronalaska ili njihovih formulacija, kao i uređaj za isporuku za davanje sastava ili formulacije i koji dalje sadrži uputstvo za upotrebu u pakovanju.
Da bi se pripremili predmetni farmaceutski sastavi, aktivni sastojak prema pronalasku se može mešati sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, adjuvansom i/ili ekscipijensom, u skladu sa konvencionalnim tehnikama farmaceutskog mešanja. Farmaceutski prihvatljivi nosači koji se mogu koristiti u ovim sastavima obuhvataju bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača, kao što je fiziološki rastvor puferovan fosfatom, voda i emulzije, kao što je
emulzija ulje/voda ili voda/ulje, i različite vrste sredstava za vlaženje. Sastavi mogu dodatno da sadrže čvrste farmaceutske ekscipijente kao što su skrob, celuloza, talk, glukoza, laktoza, saharoza, želatin, slad, pirinač, brašno, kreda, silika gel, magnezijum stearat, natrijum stearat, glicerol monostearat, natrijum hlorid, suho mleko i slično. Tečni i polučvrsti ekscipijenti mogu biti izabrani između glicerola, propilen glikola, polietilen glikola, vode, etanola i raznih ulja, uključujući ulja, ulja životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla itd. Tečni nosači, posebno za rastvore za injekcije, uključuju vodu, fiziološki rastvor, vodeni rastvor dekstroza i glikoli. Za primere nosača, stabilizatora i adjuvansa, videti Remington's Pharmaceutical Sciences, urednik E. W. Martin (Mack Publishing Compani, 18. izdanje, 1990).
Sastavi takođe mogu uključivati stabilizatore i konzervanse. Primeri farmaceutski prihvatljivih rastvarača koji se mogu koristiti u ovom sastavu mogu se naći u referentnim knjigama kao što su Handbook of Pharmaceutical Ekcipients (Deveto izdanje, Pharmaceutical Press, London and American Pharmacists Association, Washington, 2020.), Aulton's Pharmaceutics, The Design and Manufacture of Medicines. (Peto izdanje, Urednici: Kevin Taylor i Michael Aulton, Elsevier, 2017.), „Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6. izdanje“ (razni urednici, 1989-1998, Marcel Dekker) i u „Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Deliveri Sistems“ (ANSEL i sar., 1994 i 2011, WILLIAMS & WILKINS).
Neograničavajući primeri farmaceutski prihvatljivih rastvarača koji se mogu koristiti u ovom sastavu uključuju, ali nisu ograničeni na, propilen glikol (takođe poznat kao 1,2-dihidroksipropan, 2-hidroksipropanol, metil etilen glikol, metil glikol ili propan-1,2-diol), etanol, metanol, propanol, izopropanol, butanol, glicerol, polietilen glikol (PEG), glikol, Cremophor EL ili bilo koji oblik polietoksilovanog ricinusovog ulja, dipropilen glikola, dimetil izosorbida, propilen karbonata, N-metilpirolidona, glikoetilne masti tekofurola, estri, i njihove smeše.
Jedinjenja prema pronalasku su pokazala antifibrotičke, antiinflamatorne i antiangiogene efekte. Nekoliko bolesti koje su ovde navedene nakon što su uključivale ne samo jednu već dve ili čak tri mete. Kategorije bolesti koje pokazuju pre-dominantnu angiogenu (vaskularnu), inflamatornu i/ili fibrotičnu patobiologiju.
Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu ovih jedinjenja u postupcima lečenja i/ili prevencije bolesti ili poremećaja autoimunih, imunoloških, reumatoloških, vaskularnih poremećaja, oftalmoloških poremećaja, fibroznih poremećaja, metaboličkih i gastrointestinalnih poremećaja, neuroinflamatornih i neurodegenerativnih bolesti, neoplazme. i poremećaja povezanih sa kancerom, bolesti povezanih sa hormonima i imunološkim poremećajima koji su rezultat virusnih i bakterijskih infektivnih bolesti i njihove komplikacije, koji obuhvata davanje subjektu kome je potrebna terapeutski efikasna doza jedinjenja i/ili farmaceutskih sastava predmetnog pronalaska kao što je gore opisano.
Farmaceutski sastavi u skladu sa predmetnim pronalaskom su posebno pogodni za subjekta koji je čovek ili životinja.
Jedinjenja prema pronalasku mogu da ciljaju bolesti na osnovu njihovih pojedinačnih profila citokina kao što je opisano u BIODATA-u za nekoliko jedinjenja (vidi Slike 3A-D). Sledeća veb lokacija Open Targets Platform (URL: https://www.targetvalidation.org/, Denise Carvalho i sar., Nucleic Acids Research, tom 47, izdanje D1, 8. januar 2019., D1056-D1065, https://doi. org/10.1093/nar/gki1133) daje potpunu sliku zasnovanu na aktuelnim bibliografskim informacijama i može da se pretražuju prema bolesti ili citokinu.
Dva tipična primera: (a) traženje dijabetičke retinopatije specifično za bolest dovodi do sledećih citokina opisanih sa visokom korelacijom sa bolešću (Slika 3C). Tri glavna citokina su kao primer za pretragu dijabetičke retinopatije ukazuju na VEGFA rezultat = 1 (faktor rasta vaskularnog endotela A), HFE rezultat = 1 (homeostatski regulator gvožđa) i TNF rezultat = 0,86 (faktor nekroze tumora) i (b) traženje VEGFA: dovodi do bolesti nervnog sistema, vaskularnih bolesti, bolesti oka, retinopatije i nekoliko drugih bolesti prikazanih na Slici 3D.
Da bi se ilustrovala moć jedinjenja na malu grupu inflamatornih citokina, procenjeni su efekti jedinjenja na ljudsku punu krv (Primer 3.6) i njihove vrednosti IC50 na inhibiciju inflamacije izazvane LPS (Tabela 11, u µm).
Tabela 11:
Imunološki/reumatološki/vaskularni poremećaji mogu uključivati na primer peritonitis, Kavasakijevu bolest (KD), Takaiasu arteritis (TA), mikroskopski poliangiitis (MP), arteritis gigantskih ćelija (GCA), antifosfolipidni sindrom (APS), Behcetovu bolest (BD), granulomatozu sa poliangiitisom (GPA) ili Vegenerovom granulomatozom (VG), eozinofilnom granulomatozom sa poliangiitisom, Churg-Straussovim sindromom (EGPA) i rozaceom (RO).
Reumatološki poremećaji posebno pogađaju tetive zglobova, ligamente i kosti sa bolom, gubitkom pokreta i upalom. Ovo uključuje mnoge vrste artritisa kao što su osteoartritis (OA), reumatoidni artritis (RA), lupus, spondiloartropatije: ankilozantni spondilitis (AS) i psorijatični artritis (PsA), Sjogrenov sindrom, giht, sklerodermija, infektivni artritis, juvenilni idiopatični artritis, reumatska polimijalgija.
Peritonitis je zapaljenje peritoneuma obično uzrokovano bakterijskom ili gljivičnom infekcijom. Postoje dve vrste peritonitisa. Prvi tip je spontani peritonitis koji se može razviti kao komplikacija bolesti jetre, kao što je ciroza, ili bolesti bubrega. Sekundarni peritonitis može biti posledica perforacije abdomena ili kao komplikacija drugih zdravstvenih stanja. Ako se ne leči, peritonitis može dovesti do teške infekcije, potencijalno opasne po život.
Kavasakijeva bolest izaziva upalu u zidovima arterija srednje veličine u celom telu. Pre svega pogađa decu. Upala ima tendenciju da utiče na koronarne arterije, koje snabdevaju krvlju srčani mišić. Kavasakijeva bolest se ponekad naziva i sindrom mukokutanih limfnih čvorova jer takođe utiče na limfne čvorove koji otiču tokom infekcije, kožu i sluzokože u ustima, nosu i grlu.
Takaiasu arteritis je retka vrsta vaskulitisa, grupe poremećaja koji izazivaju upalu krvnih sudova. Kod Takaiasuovog arteritisa, zapaljenje oštećuje aortu i njene glavne grane. Bolest može dovesti do suženih ili začepljenih arterija, ili do aneurizme. Takaiasuov arteritis takođe može dovesti do bolova u ruci ili grudima, visokog krvnog pritiska i na kraju srčane insuficijencije ili moždanog udara. Lekovi su potrebni za kontrolu upale u arterijama i sprečavanje komplikacija.
Granulomatoza sa poliangiitisom je neuobičajen poremećaj koji uzrokuje upalu krvnih sudova u nosu, sinusima, grlu, plućima i bubrezima. Ranije nazvano Vegenerova granulomatoza, ovo stanje spada u grupu poremećaja krvnih sudova koji se nazivaju vaskulitis. Usporava dotok krvi u neke organe. Zahvaćena tkiva mogu razviti oblasti upale koje se nazivaju granulomi, što može uticati na rad ovih organa. Bez lečenja, stanje može biti fatalno.
Arteritis džinovskih ćelija je upala sluznice arterija. Najčešće pogađa arterije u glavi, posebno u slepoočnicama. Iz tog razloga, arteritis džinovskih ćelija se ponekad naziva temporalni arteritis. Arteritis džinovskih ćelija često uzrokuje glavobolje, osetljivost vlasišta, bol u vilici i probleme sa vidom. Ako se ne leči, može dovesti do slepila.
Antifosfolipidni sindrom se javlja kada imuni sistem greškom stvori antitela koja povećavaju verovatnoću zgrušavanja krvi. Ovo može izazvati opasne krvne ugruške u nogama, bubrezima, plućima i mozgu. Kod trudnica, antifosfolipidni sindrom takođe može dovesti do pobačaja i mrtvorođenosti. Ne postoji lek za antifosfolipidni sindrom. Samo dostupni lekovi mogu smanjiti rizik od krvnih ugrušaka. Behcetova bolest, takođe nazvana Behcetov sindrom, je redak poremećaj koji uzrokuje upalu krvnih sudova. Bolest može dovesti do brojnih znakova i simptoma koji u početku mogu izgledati nepovezani. Oni mogu uključivati čireve u ustima, upalu očiju, osip i lezije na koži i rane na genitalnim organima. Trenutni tretman može pomoći u smanjenju simptoma Behcetove bolesti i sprečavanju ozbiljnih komplikacija, kao što je slepilo. Churg-Straussov sindrom je poremećaj obeležen upalom krvnih sudova. Ova upala može ograničiti protok krvi u organe i tkiva, ponekad ih trajno oštetiti. Ovo stanje je takođe poznato kao eozinofilna granulomatoza sa poliangiitisom (EGPA). Astma je najčešći znak Churg-Straussovog sindroma. Poremećaj takođe može izazvati druge probleme, kao što su peludna groznica, osip, gastrointestinalno krvarenje, bol i utrnulost u rukama i stopalima. Churg-Straussov sindrom nema lek. Trenutni lekovi uključuju steroide i druge moćne imunosupresivne lekove koji pomažu u kontroli simptoma.
Rozacea je uobičajeno stanje kože koje uzrokuje crvenilo i vidljive krvne sudove na licu. Takođe može proizvesti male, crvene izbočine pune gnoja. Ovi znaci i simptomi mogu se pojaviti nedeljama do mesecima, a zatim nestati na neko vreme. Rozacea se može zameniti sa aknama, drugim problemima kože ili prirodnom rumenošću. Ne postoji lek za rozaceu, ali lečenje može kontrolisati i smanjiti znake i simptome. Osteoartritis je najčešći oblik artritisa, koji pogađa milione ljudi širom sveta. Nastaje kada se zaštitna hrskavica vremenom istroši. Iako osteoartritis može oštetiti bilo koji zglob, poremećaj najčešće pogađa zglobove ruku, kolena, kuka i kičme. Simptomi osteoartritisa se obično mogu lečiti, iako se oštećenje zglobova ne može vratiti.
Lupus je autoimuna bolest. Ona uzrokuje da imuni sistem proizvodi proteine koji se nazivaju autoantitela koja napadaju sopstvena tkiva i organe, uključujući bubrege. Lupusni nefritis je česta komplikacija kod ljudi koji imaju sistemski eritematozni lupus (poznatiji kao lupus). Lupusni nefritis se javlja kada autoantitela lupusa utiču na strukture bubrega. Ovo uzrokuje upalu bubrega i može dovesti do krvi u urinu, proteina u urinu, visokog krvnog pritiska, oštećene funkcije bubrega ili čak otkazivanja bubrega.
Sklerodermija je grupa retkih bolesti koje uključuju otvrdnjavanje i zatezanje kože i vezivnog tkiva. Postoji mnogo različitih vrsta sklerodermije. Kod nekih ljudi, sklerodermija utiče samo na kožu. Ali kod mnogih ljudi, sklerodermija takođe šteti strukturama izvan kože, kao što su krvni sudovi, unutrašnji organi i digestivni trakt (sistemska sklerodermija). Ne postoji lek za sklerodermiju.
Sjogrenov sindrom je poremećaj imunološkog sistema koji se prepoznaje po dva najčešća simptoma: suvim očima i suvim ustima. Stanje često prati druge poremećaje imunog sistema, kao što su reumatoidni artritis i lupus. Kod Sjogrenovog sindroma obično su prve pogođene sluzokože i žlezde koje luče vlagu očiju i usta - što rezultira smanjenjem suza i pljuvačke. Infektivni ili septički artritis je bolna infekcija u zglobu koja može doći od klica koje putuju krvotokom iz drugog dela tela. Septički artritis se takođe može javiti kada prodorna povreda, kao što je ugriz životinje ili trauma, isporučuje klice direktno u zglob. Ljudi koji imaju veštačke zglobove takođe su u opasnosti od septičkog artritisa. Kolena su najčešće pogođena, ali septički artritis takođe može uticati na kukove, ramena i druge zglobove. Infekcija može brzo i ozbiljno oštetiti hrskavicu i kost unutar zgloba, tako da je brzo lečenje ključno.
Juvenilni idiopatski artritis, ranije poznat kao juvenilni reumatoidni artritis, najčešći je tip artritisa kod dece mlađe od 16 godina. Juvenilni idiopatski artritis može izazvati uporni bol u zglobovima, otok i ukočenost. Neka deca mogu imati simptome samo nekoliko meseci, dok druga imaju simptome mnogo godina. Neke vrste juvenilnog idiopatskog artritisa mogu izazvati ozbiljne komplikacije, kao što su problemi sa rastom, oštećenje zglobova i upala oka.
Reumatske polimijalgija je inflamatorni poremećaj koji uzrokuje bol i ukočenost mišića, posebno u ramenima i kukovima. Znaci i simptomi reumatske polimijalgije obično počinju brzo i pogoršavaju se ujutru. Većina ljudi koji razvijaju reumatsku polimijalgiju su stariji od 65 godina. Ovo stanje je povezano sa drugim inflamatornim stanjem koje se zove arteritis džinovskih ćelija.
Oftalmološki poremećaji mogu uključivati na primer i bez ikakvih ograničenja, starosnu makularnu degeneraciju (AMD ili ARMD, suvi i vlažni oblici), pterigijum (PTE), dijabetičku retinopatiju (DR), dijabetički makularni edem (DME), Stargardovu bolest (SD), proliferativnu vitreoretinopatija (PVR), sindrom suvog oka (DIS), endoftalmitis, centralnu seroznu horioretinopatija (CSC), retinitis pigmentosa (RP), glaukom i komplikacije povezane sa glaukomom i uveitis (UVE).
Vlažna makularna degeneracija je hronični poremećaj oka koji uzrokuje zamagljen vid ili slepu tačku u vidnom polju. Obično je uzrokovana abnormalnim krvnim sudovima koji propuštaju tečnost ili krv u makulu. Makula je u delu mrežnjače koji je odgovoran za centralni vid. Mokra makularna degeneracija je jedan od dva tipa makularne degeneracije povezane sa uzrastom. Mokri tip uvek počinje kao suvi. Suva makularna degeneracija je češća i manje teška. Takođe uzrokuje zamagljen ili smanjen centralni vid, zbog stanjivanja makule. Suva makularna degeneracija može se prvo razviti u jednom ili oba oka, a zatim zahvatiti oba oka. Gubitak vida je tipično centralni, ali se zadržava u perifernom vidu.
Dijabetička retinopatija je komplikacija dijabetesa koja pogađa oči. To je uzrokovano oštećenjem krvnih sudova mrežnjače. U početku, dijabetička retinopatija može izazvati nikakve simptome ili samo blage probleme sa vidom. Na kraju, to može izazvati slepilo. Stanje se može razviti kod svakog ko ima dijabetes tipa 1 ili tipa 2. DME je ozbiljna komplikacija oka koja se javlja kada mikroaneurizme vire iz zidova krvnih sudova, cure ili cure tečnost i krv u mrežnjaču, uzrokujući na taj način edem u makuli. Stargadtova bolest je očna bolest koja uzrokuje gubitak vida kod dece i mladih. To je nasledna bolest i tako se prenosi na decu od roditelja. Stargardtova bolest je oblik makularne degeneracije i često se naziva juvenilna makularna degeneracija.
PVR je bolest koja se razvija kao komplikacija regmatogenog odvajanja mrežnjače. PVR se javlja kod oko 8-10% pacijenata koji su podvrgnuti primarnoj operaciji odvajanja mrežnjače i sprečava uspešnu hiruršku sanaciju regmatogenog odvajanja mrežnjače. PVR se može lečiti hirurškim zahvatom za ponovno spajanje odvojene mrežnjače, ali je vizuelni ishod operacije veoma loš.
Bolest suvog oka je uobičajeno stanje koje se javlja kada suze nisu u stanju da obezbede adekvatno podmazivanje očiju. Suze mogu biti neadekvatne i nestabilne iz više razloga. Na primer, suve oči se mogu pojaviti ako ne proizvodite dovoljno suza ili ako proizvodite suze lošeg kvaliteta. Ova nestabilnost suza dovodi do upale i oštećenja površine oka.
Endoftalmitis je upala unutrašnjosti oka koja se može javiti nakon injekcije oka ili operacije. Znaci su tipično: zamagljen vid ili druge promene u vidu, bol u oku, crvenilo oka, osetljivost oka na svetlost ili suzenje.
Retinitis pigmentosa (RP) je grupa retkih, genetskih poremećaja koji uključuju raspad i gubitak ćelija u mrežnjači, koja je tkivo osetljivo na svetlost koje oblaže zadnji deo oka. Uobičajeni simptomi uključuju otežano gledanje noću i gubitak bočnog (perifernog) vida.
Glaukom je grupa očnih stanja koja oštećuju optički nerv, čije je zdravlje od vitalnog značaja za dobar vid. Ovo oštećenje je često uzrokovano nenormalno visokim očnim pritiskom. Glaukom je jedan od vodećih uzroka slepila kod ljudi starijih od 60 godina. Može se javiti u bilo kom uzrastu, ali je češći kod starijih osoba. Mnogi oblici glaukoma nemaju znakove upozorenja. Efekat je tako postepen bez promene vida sve dok stanje nije u poodmakloj fazi.
Uveitis je oblik upale oka. Utiče na srednji sloj tkiva u zidu oka ili uvei. Znaci upozorenja na uveitis se često javljaju iznenada i brzo se pogoršavaju. Oni uključuju crvenilo očiju, bol i zamagljen vid. Mogući uzroci uveitisa su infekcija, povreda, autoimuna ili inflamatorna bolest. Uveitis može biti ozbiljan, što dovodi do trajnog gubitka vida.
Jedinjenja i farmaceutski sastavi prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se koriste u postupku lečenja i/ili prevencije neurodegenerativnih bolesti mrežnjače izabranih iz grupe koju čine dijabetička retinopatija, degeneracija makule povezane sa uzrastom, glaukom i pigmentoza retinitisa.
Neurodegenerativne bolesti mrežnjače se odnose na stanja retine koja se karakterišu progresivnim gubitkom neurona. Dijabetička retinopatija, starosna makularna degeneracija, glaukom i retinitis pigmentosa se smatraju bolestima mrežnjače u kojima neurodegeneracija igra suštinsku ulogu.
U skladu sa ovim poželjnim otelotvorenjem, jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu se kombinovati sa drugim aktivnim sredstvima da bi se poboljšala terapeutska efikasnost stanja koje se leči, a posebno sa inhibitorom dipeptidil peptidaze-4 (DPPIV) ili njegovom farmaceutski prihvatljivom soli, za upotreba u topikalnom lečenju očiju i/ili prevenciji neurodegenerativne bolesti mrežnjače. Inhibitor DPPIV može biti izabran iz grupe koju čine sitagliptin, saksagliptin, vildagliptin, linagliptin, anagliptin, teneligliptin, alogliptin, trelagliptin, gemigliptin, omarigliptin, njegove farmaceutski prihvatljive soli i njihove smeše.
Jedinjenja prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se kombinuju sa anti-VEGF tretmanom da bi se smanjio broj intraokularnih injekcija anti-VEGF antitela koje su potrebne pacijentima. Davanje pacijentima koji imaju neurodegenerativne bolesti mrežnjače, kao što je na primer dijabetička retinopatija, makularna degeneracija povezana sa uzrastom, usporava napredovanje ovih bolesti i smanjuje anti-VEGF farmakoterapiju koja je potrebna pacijentima.
Fibrotični poremećaji mogu uključivati na primer i bez ikakvih ograničenja, cističnu fibrozu, retroperitonealnu fibrozu, idiopatsku plućnu fibrozu, kombinovanu plućnu fibrozu i emfizem (CPFE), eozinofilnu angiocentričnu fibrozu, crevnu fibrozu, fibrozu jajnika, fibrozu jajnih ćelija, sistematsku fibrozu nefrotosa, oralnu submukulnu fibrozu (OSMF) i fibroza jetre.
Cistična fibroza (CF) je nasledni poremećaj koji uzrokuje teška oštećenja pluća, digestivnog sistema i drugih organa u telu. Utiče na ćelije koje proizvode sluz, znoj i probavne sokove. Umesto da deluju kao lubrikanti, sekreti začepljuju cevi, kanale i prolaze, posebno u plućima i pankreasu.
Plućna fibroza je bolest pluća koja se javlja kada se plućno tkivo ošteti i ima ožiljke. Ovo zadebljano, ukočeno tkivo otežava pravilan rad pluća. Ožiljci povezani sa plućnom fibrozom mogu biti uzrokovani mnoštvom faktora. Oštećenje pluća uzrokovano plućnom fibrozom ne može se popraviti, ali lekovi i terapije ponekad mogu pomoći u ublažavanju simptoma i poboljšanju kvaliteta života.
Emfizem je stanje pluća koje uzrokuje kratak dah. Alveole su oštećene, a vremenom unutrašnji zidovi alveola slabe i pucaju, stvarajući veće vazdušne prostore umesto mnogo malih. Ovo smanjuje površinu pluća i, zauzvrat, količinu kiseonika koja dospeva u krvotok. Oštećene alveole ne funkcionišu kako treba, što dovodi do zadržavanja starog vazduha i ne ostavlja mesta za ulazak svežeg vazduha bogatog kiseonikom.
Metabolički i gastro-intestinalni poremećaji mogu uključivati, na primer, i bez ikakvih ograničenja, komplikacije izazvane dijabetesom: dijabetička nefropatija (DN), dijabetička retinopatija (DR), dijabetička kardiomiopatija (DCDM) ili dijabetički čir na stopalu (DFU). Bolesti jetre mogu uključivati nealkoholnu masnu bolest jetre (NAFLD), nealkoholnu steatičnu hepatozu (NASH), primarni bilijarni holangitis (PBC), fibrozu ili cirozu jetre (HF), inflamatornu bolest creva (IBD): ulcerozni kolitis, Kronova bolest, crevna fibroza. Pored dijabetičke nefropatije, druge bolesti bubrega mogu uključivati policističnu bolest bubrega (PKD), hroničnu bolest bubrega (CKD), nefrogenu sistemsku fibrozu (NSF) i pankreatitis (akutni i hronični).
Dijabetička nefropatija je ozbiljna komplikacija dijabetesa tipa 1 i dijabetesa tipa 2 povezana sa bubrezima. Takođe se naziva dijabetička bolest bubrega. Oko 25% ljudi sa dijabetesom na kraju razvije bolest bubrega.
Dijabetička nefropatija utiče na sposobnost bubrega da obavljaju svoj uobičajeni posao uklanjanja otpadnih proizvoda i dodatne tečnosti iz tela. Tokom mnogo godina, stanje polako oštećuje delikatni sistem filtriranja bubrega i može napredovati do zatajenja bubrega, što se takođe naziva završnom stadijumom bolesti bubrega. Otkazivanje bubrega je stanje opasno po život.
Nealkoholna masna bolest jetre (NAFLD) je krovni izraz za niz stanja jetre koja pogađaju ljude koji piju malo ili nimalo alkohola. Kao što naziv implicira, glavna karakteristika NAFLD-a je previše masti uskladištene u ćelijama jetre.
Najčešći oblik hronične bolesti jetre. Neki pojedinci sa NAFLD mogu razviti nealkoholni steatohepatitis (NASH), agresivni oblik bolesti masne jetre, koji je obeležen upalom jetre i može napredovati do uznapredovalog ožiljka (ciroze) i otkazivanja jetre. Ova šteta je slična šteti uzrokovanoj teškom upotrebom alkohola.
Primarni bilijarni holangitis je hronična autoimuna bolest u kojoj se žučni kanali u jetri polako uništavaju. Kada su žučni kanali oštećeni, žuč se može vratiti u jetru i ponekad dovesti do ireverzibilne ciroze. Kombinacija genetskih faktora i faktora životne sredine izaziva bolest.
IBD opisuje poremećaje koji uključuju hroničnu upalu digestivnog trakta. Tipovi IBD-a uključuju ulcerozni kolitis koji uključuje čireve duž površne sluznice debelog creva i rektuma, kao i Kronovu bolest koju karakteriše upala sluzokože digestivnog trakta, koja često može zahvatiti dublje slojeve digestivnog trakta.
I ulcerozni kolitis i Kronovu bolest obično karakterišu dijareja, rektalno krvarenje, bol u stomaku, umor, gubitak težine, a ponekad dovode do komplikacija opasnih po život.
Neoplazme i poremećaji povezani sa kancerom mogu uključivati na primer i bez ikakvih ograničenja, kancer pankreasa: uglavnom fibrozni, karcinom bubrežnih ćelija, fibrozu izazvanu zračenjem, primarnu mijelofibrozu, dezmoplaziju, fibrosarkom, hepatocelularni karcinom, retinoblastom, intraokularni i melanomski limfom (konjuktivalni, uvealni).
Pronalazak se takođe odnosi na lečenje, prevenciju i smanjenje virusnih infekcija vezivanjem za virusne proteine na vezivnim mestima heparan sulfata. Jedinjenja prema pronalasku stupaju u interakciju sa heparan sulfatom vezujućim regionom faktora rasta (FGF, VEGF i drugi faktori rasta) i receptora faktora rasta (FGFR, VEGFR i drugi). Poznato je da mnogi virusi stupaju u interakciju sa ćelijama sisara koristeći njihov afinitet prema heparan sulfatnim delovima vezanim za ćelijske membrane. Virusi koji na svojoj površini imaju domene za vezivanje heparan sulfata (HS) koriste ovaj HS afinitet kao jedno od glavnih ulaznih vrata da pristupe i inficiraju ćelije i vezuju se za heparan sulfat vezan za ćelije. Kada su vezani za HS virusi su u stanju da inficiraju ćelije koristeći različite invazivne mehanizme specifične za svaki virus. Snažna interakcija jedinjenja prema pronalasku sa heparan vezujućim domenom proteina i specifično virusnih proteina sprečava virusnu infekciju krvnih zrnaca, endotelnih ćelija koje oblažu krvne sudove i organe, kao i površinskih epitelnih ćelija prisutnih u ustima, nazalne sluzokože, i pluća i takođe u gastrointestinalnom traktu. Poznato je nekoliko vrsta virusa sa visokim afinitetom prema heparan sulfatima, kao što su, ali ne ograničavajući se na respiratorni sincicijalni virus, humani metapneumovirus, gripa (H1N1 i slično), humani rinovirus (HRV), rinosincicijalni virus (RV), chikungunia virus, koronavirus kao npr. CoV, SARS-CoV, MERS-Cov, COVID-19 (SARS-CoV-2 i njihove varijante). HS je neophodan kofaktor za infekciju SARS-CoV-2. HS stupa u interakciju sa domenom koji se vezuje za receptor SARSCoV-2 šiljastog glikoproteina, pored ACE2, pomerajući strukturu šiljaka u otvorenu konformaciju kako bi se olakšalo vezivanje ACE2. Virusne i bakterijske zarazne bolesti takođe mogu uključivati septički šok, upalu oka kao što je endoftalmitis usled operacije ili infekcije.
Primeri
Primer 1: sinteza jedinjenja i intermedijera
Primer 1.1: molekuli tipa ia: monoamidi, 25 primera
Sinteza prekursora
Šema 1. Sintetički intermedijari KI-1 i KI-6
Procedure:
Sinteza KI-1 i KI-6 (koraci [1], [2])
Dietil2,5-bis(benziloksi)tereftalat (KI-0) (Korak [1]). Kalijum karbonat-325 mesh (326,1 g, 2,4 mol) dodat je u porcijama mešanom rastvoru dietil 2,5-dihidroksitereftalata (200,0 g, 0,79 mol) u DMF (800,0 ml) na temperaturi okoline tokom 15 min. Benzil bromid (280,0 ml, 2,4 mol) je zatim dodat u reakcioni balon kap po kap tokom 30 min, i dobijena smeša je zagrevana na 100 °C tokom 2 h, što je rezultiralo formiranjem gustog taloga krem boje. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i tretirana rastvorom zasićenog vodenog rastvora amonijum hlorida (2 l). Dobijena suspenzija je mešana 30 min, a zatim filtrirana. Čvrsti materijal je ispran rastvorom zasićenog vodenog rastvora amonijum hlorida (2 × 200 ml). Čvrsta supstanca je zatim suspendovana u etanolu (400 ml), filtrirana i osušena u vakuum pećnici da bi se dobio željeni proizvod kao bela čvrsta supstanca (341,0 g, 0,785 mol, 99,8%)
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,36 min, nije primećena jonizacija, površina vrha >95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,51-7,44 (m, 6H), 7,44-7,36 (m, 4H), 7,36-7,28 (m, 2H), 5,17 (s, 4H), 4.29 (q, J = 7,1 Hz , 4H), 1,26 (t, J = 7,1 Hz , 6H).
2,5-bis(benziloksi)-4-(etoksikarbonil)benzoeva kiselina (KI-1) i 2,5-bis(benziloksi)tereftalna kiselina (KI-6) (korak [2])
Rastvor kalijum hidroksida (14,2 g, 0,25 mol) u vodi (200,0 ml) je brzo dodat u rastvor dietil 2,5-bis(benziloksi)tereftalata (100 g, 0,23 mol) u 1,4-dioksanu (1 l), i dobijena smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Rastvarač je uklonjen u vakuumu, što je rezultiralo formiranjem bele suspenzije. Sirovi proizvod je suspendovan u EtOH (500 ml) i filtriran, a sakupljena čvrsta supstanca je osušena u vakuum pećnici da bi se dobio čisti dietil 2,5-bis(benziloksi)tereftalat (23,0 g, 0,053 mol, 23%)
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,36 min, nije primećena jonizacija, površina vrha 98%
Etanolni filtrat je koncentrovan da bi se dobilo ulje. Etil acetat (500 ml) je dodat da bi se formirao precipitat koji je filtriran i ispran etil acetatom (200 ml) da bi se dobila 2,5-bis(benziloksi)tereftalna kiselina (KI-6) kao bela čvrsta supstanca (18,9 g, 0,042 mol, 18%).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,22 min, m/z 377,1 [MH]-, površina vrha 95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,52-7,45 (m, 4H), 7,41-7,33 (m, 4H), 7,33-7,26 (m, 4H), 5,13 (s, 4H).
Filtrat je ispran zasićenim rastvorom vodenog rastvora natrijum karbonata (200 ml), 1 M vodenog rastvora hlorovodonične kiseline (500 ml) i slanog rastvora (500 ml), zatim osušen (Na2SO4), filtriran i koncentrovan do suva da bi se dobilo 2 ,5-bis(benziloksi)-4-(etoksikarbonil)benzoeva kiselina (HI-1) kao bela čvrsta supstanca (53 g, 0,130 mol, 57,0%).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,22 min, m/z 405,3 [MH]-, površina vrha 96%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,52-7,27 (m, 13H), 5,17 (s, 4H), 4,28 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 1,26 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
Protokol velikih razmera za sintezu ki-1
Posuda sa omotačem od 10 l napunjena je dietil 2,5-bis(benziloksi)tereftalatom (500,00 g, 1,15 mol), 1,4-dioksanom (2,5 l), kalijum hidroksidom (71,00 g, 1,26 mol) i vodom (500 ml). Reakciona smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. LCMS analiza je pokazala da je reakcija otišla na pola puta do završetka, pokazujući takođe nusproizvod (di-kiselina) i početni materijal (di-estar) u odnosu (diester:mono-kiselina:dijakiselina = 28:58:14).
(dijakiselina: 4,44 rt, monokiselina: 5,08 rt, diester: 5,68 rt). U ovoj fazi rastvarač je uklonjen u vakuumu. Sirovi proizvod je stavljen u 2:1 smešu etanol:voda (3 l), u posudu sa omotačem od 10 l, mešan preko noći i filtriran da bi se dobilo sledeće:
Supstanca: (diester:mono-kiselina:dijakiselina = 86:12:2, 110,00 g, bezbojna čvrsta supstanca)
Filtrati: (diester:mono-kiselina:dijakiselina 3:63:34)
Filtrati su koncentrovani in vacuo da bi se dobilo ulje. Ovo ulje je stavljeno u etil acetat (2,5 l), mešano preko noći u posudi sa omotačem od 10 l i filtrirano da bi se dobila bela čvrsta supstanca (150,00 g). Supstanca:
(diester:mono-acid:diacid = trag: 40:60).
Filtrati su sakupljeni, isprani zasićenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata (100 ml), 1N rastvorom hlorovodonične kiseline (200 ml) i slanim rastvorom (200 ml), osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata i filtrirani.
Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobio željeni proizvod, 2,5-bis(benziloksi)-4-(etoksikarbonil)benzoeva kiselina (HI-1), kao bela čvrsta supstanca, koja je osušena u vakuum pećnici na 50 °C tokom 48 h (225,00 g, 49% prinos) (prinosi variraju između 49-65%).
Šema 2. Sintetički intermedijari KI-1Bn
sadrži 16% KI-0Bn
Procedura:
Sinteza KI-1Bn:
2,5-bis(benziloksi)-4-(benziloksikarbonil)benzoeva kiselina (KI-1Bn). U rastvor 2,5-dihidroksiter-ftalne kiseline (1,97 g, 10 mmol) u DMF (20 ml) na 0 °C dodat je natrijum hidrid (2,0 g, 50 mmol) uz mešanje, zatim benzil bromid (5,95 ml, 50 mmol, 5 ek.) kap po kap tokom 5 min, a rezultujuća smeša je držana na sobnoj temperaturi temp. za 2h. Smeša je zatim zagrevana na 60 °C tokom 18 h. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i pažljivo tretirana sa MeOH (5 ml). Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, a zaostali materijal je uparen sa heptanom (3x). Ostatak je stavljen u DCM (30 ml), organska faza je isprana sa 1M HCl (25 ml), odvojeni vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (3x30 ml) i kombinovane organske faze osušene (MgS04) i koncentrovane. Sirova čvrsta supstanca je rekristalizovana iz EtOH (~30 ml) da bi se dobio čisti KI-0Bn (2,286 g, 41%). Uzorak KI-0Bn (282 mg, 0,5 mmol) je dodat u smešu 1,4-dioksana (10 ml) i litijum hidroksid hidrata (22 mg, 0,52 mmol), i smeša je zagrevana na 80 °C tokom 3 d. Smeša je ohlađena do sobne temperature, uzeta u AcOEt (30 ml) i rastvor je ispran sa 1M HCl (2 ml). Organska faza je osušena i koncentrovana, a ostatak je podvrgnut hromatografiji na koloni da bi se dobio monoestar KI-1Bn kontaminiran sa oko 16% diestra KI-0Bn.
KI-0Bn:<1>H nmR (400 MHz, CDCl3): δ 7,51 (s, 2H), 7,36-7,30 (m, 20H), 5,34 (s, 4H), 5,11 (s, 4H). KI-1Bn:<1>H nmR (250 MHz, CDCl3): δ 7,86 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,41-7,30 (m, 20H), 5,36 (s, 2H), 5,26 (s, 2H), 5,16 (s, 2H).
Sinteza monoamida
Šema 3. Sinteza monoamida Ia
Opšti postupak A za spajanje amida [3A]
➢ Spajanje preko acil hlorida, od KI-1 ili KI-6
Reakcija modela (Ia-013a)
Dimetil 2-(2,5-bis(benziloksi)-4-(etoksikarbonil)benzoilamino)izoftalat. 2,5-bis(benziloksi)-4-(etoksikarbonil)benzoeva kiselina (KI-1, 1,1 g, 2,8 mmol) rastvorena je u tionil hloridu (6 ml), i dobijena smeša je mešana 5 min. Dodato je nekoliko kapi DMF-a i dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 h. Višak tionil hlorida je uklonjen in vacuo i ostatak je kodestilovan sa toluenom (3 × 20 ml) da bi se dobio acil hlorid. Rastvor acil hlorida u DCM (10 ml) je brzo dodat u rastvor amina (dimetil 2-aminoizoftalat, 210 mg, 3,1 mmol) i N,N diizopropiletilamina (0,53 ml, 3,045 mmol) u DCM (10 ml) na sobnoj temperaturi i reakcija je mešana 18 h. Reakcija je razblažena sa DCM (70 ml) i isprana sa 1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (100 ml), vodom (100 ml), osušena (Na2SO4), filtrirana i koncentrovana da bi se dobio sirovi proizvod, koji je bio prečišćen hromatografijom na silika gelu eluiranjem sa gradijentom etil acetata (0 do 25%) u izoheksanu do željenog proizvoda kao bela čvrsta supstanca (1,24 g, 2,075 mmol, 75%). UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,37 min; m/z = 598,2 [M+H]<+>, površina
vrha >95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11,60 (s, 1H), 8,02 (d, J = 7,8 Hz , 2H), 7,69 (s, 1H), 7,59 - 7,23 (m, 12H), 5,49 (s, 2H), 5,19 (s, 2H), 4,28 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 3,71 (s, 6H), 1,26 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
Opšti postupak B za spajanje amida [3B]
➢ Spajanje pomoću sredstva za kondenzaciju, od KI-1 ili KI-6
Reakcija modela (Ia-001a)
Metil 2-(2,5-bis(benziloksi)-4-(etoksikarbonil)benzoilamino)benzoat. 1-metilimidazol (13,0 ml, 163 mmol) je dodat u smešu 2,5-bis(benziloksi)-4-(etoksikarbonil)benzojeve kiseline (KI-1, 12,95 g, 32 mmol) i metil antranilata (5,729 g, 38 mmol, 1,190 ek.) u MeCN (150 ml) na temperaturi okoline. Hloro-N,N,N'N'-tetrametilformamidinijum heksafluorofosfat (TCFH) (10,728 g, 0,038 mol) je dodat u porcijama tokom 30 min, i dobijena smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je tretirana sa 1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (700 ml). Dobijena suspenzija je mešana 10 min, a zatim filtrirana. Čvrsti materijal je ispran vodom (2 × 200 ml). Čvrsta supstanca je zatim suspendovana u etanolu (200 ml), filtrirana, isprana etrom (100 ml) i osušena u vakuum pećnici da bi se dobio željeni proizvod kao bela čvrsta supstanca (14,7 g, 27 mmol, 86%)
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,43 min; m/z = 540,2 [M+H]<+>, površina vrha >99%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,87 (s, 1H), 8,65 (d, J = 8,4 Hz , 1H), 7,98 (dd, J = 8,0, 1,7 Hz , 1H), 7,81 - 7,61 (m, 2H), 7,59 - 7,12 (m, 12H), 5,41 (s, 2H), 5,20 (s, 2H), 4,28 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 3,74 (s, 3H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz , 3H),0
Opšte procedure uklanjanja zaštite [4], [5]
Saponifikacija
Reakcija modela (Ia-013a)
2-(2,5-Bis(benziloksi)-4-karboksibenzoilamino)izoftalna kiselina Rastvor litijum hidroksida (42 mg, 1 mmol) u vodi (4 ml) je dodat u rastvor dimetil 2-(2,5-)bis(benziloksi)-4-(etoksikarbonil)benzoilamino)izoftalat (100 mg,
0,167 mmol) u THF (6 ml) i dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 h. Dodatni LiOH (6 ek.) u vodi (4 ml) je dodat u reakcionu smešu koja je mešana dodatna 23 h. Nakon završetka, u reakciju je dodata voda (50 ml) i smeša je isprana etil acetatom (50 ml). Vodeni sloj je zakiseljen sa 1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline do pH=2 i ekstrahovan etil acetatom (2x 50 ml). Organski slojevi su sakupljeni, osušeni (Na2SO4), filtrirani i koncentrovani da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (82 mg, 0,151 mmol, 91%).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,02 min; m/z = 542,1 [M+H]<+>, površina vrha >95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,18 (s, 2H), 11,74 (s, 1H), 8,00 (d, J = 7,8 Hz , 2H), 7,71 (s, 1H), 7,58 - 7,43 (m, 5H), 7,40 - 7,24 (m, 7H), 5,47 (s, 2H), 5,14 (s, 2H).
Debenzilacija
Reakcija modela (Ia-013a)
2-(2,5-Dihidroksi-4-karboksibenzoilamino)izoftalna kiselina (Ia-013a). Pd/C (94 mg, 10%) je dodat u rastvor 2-(2,5-bis(benziloksi)-4-karboksibenzoilamino)izoftalne kiseline (0,94 g, 1,74 mmol) u 10:30 smeši EtOH i DCM. Smeša je stavljena pod vodonik na atmosferskom pritisku na sobnoj temperaturi i mešana 18 h. Nakon završetka, smeša je filtrirana kroz celit, koji je ispran sa DCM i MeOH. Filtrat i ispiranja su kombinovani i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobio željeni proizvod Ia-013a kao žuta čvrsta supstanca (644 mg, 1.69 mmol, 98%).
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,91 min; m/z =362,0 [M+H]<+>, površina vrha >98%
<1>H nmR (DMSO-d6) δ: 13,11 (s, 2H), 11,70 (s, 1H), 11,13 (s, 1H), 7,97 (d, J = 7,8 Hz , 2H), 7,47 (s, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,38 (t, J = 7,7 Hz , 1H)
Opšti postupak iz KI-1Bn
➢ Spajanje preko acil hlorida
Model reakcija: sinteza Ia-032a
Benzil 4-(2,5-bis(benziloksi)-4-(benziloksikarbonil)benzoilamino)fenilacetat. U rastvor KI-1Bn (233 mg, 84% čistoće) u DCM (10 ml) dodat je SOCl2 (1,8 ml, 60 ek.) i smeša je zagrevana na 50 °C tokom 3 h. Rastvarači su upareni, a ostatak je uparen sa toluenom (3x10 ml), da bi se dobio sirovi acil hlorid (237 mg, 99%). Ovaj materijal je rastvoren u DCM (3 ml) i dodat je diizopropiletilamin (0,08 ml, 1,15 ek.), a zatim rastvor benzil 4-aminofenilacetata (92 mg, 0,95 ek.) u DCM (3 ml). Konačna zapremina reakcije bila je 10 ml. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 sati. Smeša je razblažena sa DCM (15 ml), isprana sa zasićenim vodenim rastvorom amonijum hlorida (12 ml). Odvojena vodena faza je ekstrahovana sa DCM (2x2 ml), organske faze su kombinovane, osušene (MgS04) i koncentrovane. Sirovi proizvod je podvrgnut hromatografiji na koloni (Pet. Et./DCM 1: 1 zatim gradijent do 100% DCM) da bi se dobila prva frakcija čistog KI-0Bn, i druga frakcija koja sadrži čisti željeni proizvod (237 mg, 86%, ispravljeno za čistoću KI-1Bn).
<1>H nmR (400 MHz, CDCl3): δ 10,10 (s, 1H), 8,08 (s, 1H), 7,65 (s, 1H), 7,53-7,30 (m, 20H), 7,22-7,13 (br AB, 4H), 5,39, 5,22, 5,21, 5,12 (4s, 4x 2H), 3,61 (s, 2H).
4-(4-(karboksimetil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina (Ia-032a). U rastvor prethodno pripremljenog prekursora (225 mg, 0,33 mmol) u DCM (20 ml) dodat je 5% Pd na drvenom uglju (72 mg), a zatim EtOH (20 ml). Balon je ispran Ar (3x), zatim napunjen vodonikom (atmosferski pritisak) i smeša je mešana 2 h na sobnoj temperaturi. Katalizator je uklonjen filtracijom preko millipore filtera, filtrat je uparen, a ostatak osušen da bi se dobio proizvod Ia-032a kao svetlo žuta čvrsta supstanca (107 mg, 99%).
<1>H nmR (250 MHz, DMSO-d6): δ 12,28 (br, 1H), 10,92 (s, 1H), 10,44 (s, 1H), 7,65 (br d, 2H), 7,41 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,25 (br d, 2H), 3,55 (s, 2H).
Za primere:
Za uslove i prinose: Vidi Slike 4A-D
1) 4-(2-karboksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-001a UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): sobna temperatura = 0,95 min, m/z = 316 [M-H]-, površina vrha > 97%<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,22 (s, 1H), 10,85 (s, 1H), 8,65 (d, J = 8,4 Hz , 1H), 8,01 (dd, J = 8,0, 1,7 Hz , 1H), 7,71 - 7,56 (m, 1H), 7,41 (d, J = 6,9 Hz , 2H), 7,22 (t, J = 7,6 Hz , 1H). HRMS:
[M+H]<+>, izrač. za C15H12NO7: 318,06083, pronađeno: 318,06080.
Biološki podaci: Ia-001a: FGF-1 IC50 [µM] = 41; FGF-2 IC50 [µM] = 39; VEGF-A1 IC50 [µM] = 7,3;
VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =2,25; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 48;
PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,355; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 44,3; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNγ IC50 [µM] = 30,5; IL-1β IC50 [µM] = 34,4; IL-2 IC50 [µM] = 94,3; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 1,24; IL-9 IC50 [µM] = 5,63; IL-10 IC50 [µM] = >100; IL-12p70 IC50 [µM] = 1,5; IL-13 IC50 [µM] = 26,4; IL-17A IC50 [µM] = 0,1; IL-17F IC50 [µM] = 14,7; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = >100; IL-33 IC50 [µM] = 19,3; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,02; TNFβ IC50 [µM] = 13,2
Dietil estar:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,39 min, m/z = 372,2 [MH]-, površina vrha > 98%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,96 (s, 1H), 11,05 (s, 1H), 9,87 (s, 1H), 8,57 (dd, J = 8,5, 1,2 Hz , 1H), 7,99 (dd, J = 7,9, 1,7 Hz , 1H), 7,65 (ddd, J = 8,7, 7,3, 1,7 Hz , 1H), 7,49 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,25 (td, J = 7,6, 1,2 Hz , 1H), 4,35 (m, 4H), 1,33 (m, 6H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C19H20NO7: 374,12342, pronađeno: 374,12354
Biološki podaci: Ia-001a-E2: FGF-1 IC50 [µM] = 9,2; FGF-2 IC50 [µM] = 200; VEGF-A1 IC50 [µM] = 123; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =1,25; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 51,47; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 2,58; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 50,5
2) 4-(2-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-001aTz:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,17 min; m/z =342,0 [M+H]<+>, površina vrha >96%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,60 (s, 1H), 10,90 (s, 2H), 8,47 (d, J = 8,4 Hz , 1H), 7,93 (d, J = 7,9 Hz , 1H), 7,61 (t, J = 7,9 Hz , 1H), 7,50 - 7,32 (m, 3H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C15H12N5O5: 342,08329, pronađeno: 342,08318
Biološki podaci: Ia-001a-Tz: FGF-1 IC50 [µM] = 6,2; FGF-2 IC50 [µM] = 20; VEGF-A1 IC50 [µM] = 17; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,23; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 54,33; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1,54; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 69,75; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNγ IC50 [µM] = >100; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = 7,99; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 0,75; IL-9 IC50 [µM] = 8,63; IL-10 IC50 [µM] = 26,1; IL-12p70 IC50 [µM] = 32,4; IL-13 IC50 [µM] = 32,1; IL-17A IC50 [µM] = 0,11; IL-17F IC50 [µM] = 46,5; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = >100; IL-33 IC50 [µM] = 23,6; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,63; TNF β IC50 [µM] = 53
Etil estar:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,08 min, m/z = 370,1 [M+H]<+>, površina vrha > 97%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,48 (s, 1H), 9,88 (s, 1H), 8,46 (d, J = 8,4 Hz , 1H), 7,89 (dd, J = 7,8, 1,6 Hz , 1H), 7,62 (ddd, J = 8,6, 7,4, 1,6 Hz , 1H), 7,47 (s, 1H), 7,42 - 7,34 (m, 2H), 4,37 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 1,34 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C17H16N5O5: 370,11460, pronađeno: 370,11458
Biološki podaci: Ia-001a-Tz-El: FGF-1 IC50 [µM] = 200; FGF-2 IC50 [µM] = 200; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =3,8; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 75,97; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 98,88
Etil estar diacetat:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,57 min, m/z = 454,1 [M+H]<+>, površina vrha > 97%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,23 (s, 1H), 8,23 (d, J = 8,6 Hz , 1H), 7,96 (dd, J = 7,9, 1,7 Hz , 1H), 7,84 (s, 1H), 7,73 (s, 1H), 7,64 (t, J = 7,5 Hz , 1H), 7,43 (td, J = 7,6, 1,2 Hz , 1H), 4,32 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 2,34 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 1,32 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C21H20N5O7: 454,13572, pronađeno: 454,13542
Biološki podaci: Ia-001a-Tz-E1-A2: FGF-1 IC50 [µM] = 60; FGF-2 IC50 [µM] = 200; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =ND; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 49,85; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 98,2
3) 2,5-dihidroksi-4-(2-sulfofenilaminokarbonil)benzoeva kiselina, jedinjenje Ia-001c:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,73 min; m/z =352,0 [M-H]-, površina vrha >99%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,54 (s, 1H), 10,99 (s, 1H), 8,34 (d, J = 8,2 Hz , 1H), 7,74 (dd, J = 7,7, 1,7 Hz , 1H), 7,42 - 7,28 (m, 3H), 7,12 (td, J = 7,5, 1,2 Hz , 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C14H12NO8S: 354,02781, pronađeno: 354,02754
Biološki podaci: Ia-001c: FGF-1 IC50 [µM] = 21; FGF-2 IC50 [µM] = 13; VEGF-A1 IC50 [µM] = 100; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =3,31; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 40,36; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 2,4;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 31,33; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNi IC50 [µM] = 0,44; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = 12,8; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 0,95; IL-9 IC50 [µM] = 46,9; IL-10 IC50 [µM] = 1,9; IL-12p70 IC50 [µM] = 0,44; IL-13 IC50 [µM] = 86,1; IL-17A IC50 [µM] = 0,09; IL-17F IC50 [µM] = 89,7; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = >100; IL-33 IC50 [µM] = >100; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,05; TNF β IC50 [µM] = 29,7
4) 4-(3-karboksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-002a:
<1>H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ ~13 (v br, 1H), 10,82 (br s, 1H), 10,60 (br s, 1H), 8,38 (s, 1H).7,92 (d, 1H), 7,71 (d, 1H), 7,49 (t, 1H), 7,39 (s, 2H)
Biološki podaci: 1a-002a: FGF-1 IC50 [µM] = 20; FGF-2 IC50 [µM] = 59; VEGF-A1 IC50 [µM] = 71; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =5,7; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 42,1; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,312;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 27,92
5) 4-(3-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-002aTz:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,13 min; m/z =342,0 [M+H]<+>, površina vrha >99%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,81 (s, 1H), 10,67 (s, 1H), 8,54 (s, 1H), 7,91 - 7,84 (m, 1H), 7,79 (dt, J = 7,8, 1,4 Hz , 1H), 7,60 (t, J = 7,9 Hz , 1H), 7,41 (d, J = 2,2 Hz , 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C15H12N5O5: 342,08329, pronađeno: 342,08317
Biološki podaci: Ia-002a-Tz: FGF-1 IC50 [µM] = 10; FGF-2 IC50 [µM] = 53; VEGF-A1 IC50 [µM] = 57; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 66,61; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1,86;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 38,5
6) 2,5-dihidroksi-4-(3-sulfofenilaminokarbonil)benzoeva kiselina, jedinjenje Ia-002c:
<1>H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 11,04 (s, 1H), 10,53 (s, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,69 (d, 1H), 7,43 (s, 2H) i 7,40-7,28 (m, 2H)
Biološki podaci: Ia-002c: FGF-1 IC50 [µM] = 14; FGF-2 IC50 [µM] = 150; VEGF-A1 IC50 [µM] = 150; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 38,9; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,405; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 1,87
7) 4-(4-karboksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-003a:
<1>H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 12,8 (br, 1H), 10,73 (s, 1H), 10,68 (s, 1H), 7,94 (d od AB, 2H), 7,84 (d of AB, 2H), 7,39 (s, 1H), 7,34 (s, 1H)
HRMS (AX033)
Biološki podaci: Ia-003a: FGF-1 IC50 [µM] = 12; FGF-2 IC50 [µM] = 34; VEGF-A1 IC50 [µM] = 150; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =ND; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 44,4; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,414;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 39,1
8) 4-(4-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-003aTz:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,79 min; m/z =342,0 [M+H]<+>, površina vrha >97%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,77 (s, 1H), 10,70 (s, 1H), 8,04 (d, J = 8,7 Hz , 2H), 7,96 (d, J = 8,5 Hz , 2H), 7,41 (s, 1H), 7,37 (s, 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C15H12N5O5: 342,08329, pronađeno: 342,08326
Biološki podaci: Ia-003a-Tz: FGF-1 IC50 [µM] = 6,7; FGF-2 IC50 [µM] = 45; VEGF-A1 IC50 [µM] = 13; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =6,4; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 62,21; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 2,49;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 30,33; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNi IC50 [µM] = 2,95; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = 43; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 1,41; IL-9 IC50 [µM] = 3,62; IL-10 IC50 [µM] = 6,94; IL-12p70 IC50 [µM] = 1,26; IL-13 IC50 [µM] = 89,6; IL-17A IC50 [µM] = 0,07; IL-17F IC50 [µM] = 83,9; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = 1,49; IL-33 IC50 [µM] = 72,2; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,18; TNF β IC50 [µM] = 55.
9) 2,5-dihidroksi-4-(4-sulfofenilaminokarbonil)benzoeva kiselina, jedinjenje Ia-003c:
<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,90 (s, 1H), 10,51 (s, 1H), 7,66 (d od AB, 2H), 7,58 (d od AB, 2H), 7,40 (s, 1H), 7,39 (S, 1H)
Biološki podaci: Ia-003c: FGF-1 IC50 [µM] = 35; FGF-2 IC50 [µM] = 150; VEGF-A1 IC50 [µM] = 150; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,4; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = ND; PMN ROS inhibicija IC50 [µM]-;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = ND
10) 4-(3-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-004a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 6,5 min): rt = 1,40 min; m/z =332,0 [M-H]-, površina vrha >96%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,94 (s, 1H), 10,37 (s, 1H), 8,20 (d, J = 2,7 Hz , 1H), 7,74 (dd, J = 8,9, 2,8 Hz , 1H), 7,39 (s, 1H), 7,34 (s, 1H), 6,93 (d, J = 8,9 Hz , 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C15H12NO8: 334,05574, pronađeno: 334,05572
Biološki podaci: Ia-004a: FGF-1 IC50 [µM] = 32; FGF-2 IC50 [µM] = 15; VEGF-A1 IC50 [µM] = 28; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =7,7; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 64,61; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 28,38
Etil metil estar:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,16 min, m/z = 376,1 [M+H]<+>, površina vrha > 95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,90 (s, 1H), 10,50 (s, 1H), 10,36 (s, 1H), 9,91 (s, 1H), 8,26 (d, J = 2,7 Hz , 1H), 7,76 (dd, J = 8,9, 2,8 Hz , 1H), 7,43 (s, 1H), 7,36 (s, 1H), 7,01 (d, J = 8,9 Hz , 1H), 4,37 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 3,91 (s, 3H), 1,34 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C18H18NO8: 376,10269, pronađeno: 376,10259
Biološki podaci: Ia-004a-E2: FGF-1 IC50 [µM] = 35; FGF-2 IC50 [µM] = 36; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =6,1; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 85,34; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 97,65
11) 4-(2-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-006a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,81 min; m/z =334,0 [M+H]<+>, površina vrha >96%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,33 (s, 1H), 11,86 (s, 1H), 10,90 (s, 1H), 9,66 (s, 1H), 8,39 (d, J = 9,0 Hz , 1H), 7,40 (d, J = 6,8 Hz , 2H), 7,03 (dd, J = 9,0, 3,0 Hz , 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C15H12NO8: 334,05574, pronađeno: 334,05562
Biološki podaci: Ia-006a: FGF-1 IC50 [µM] = 89; FGF-2 IC50 [µM] = 224; VEGF-A1 IC50 [µM] = 100; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =11,8; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 60,56; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1,2; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 25,33
12) 3-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)ftalna kiselina, jedinjenje Ia-011a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,69 min; m/z = 360,1 [M-H]-, površina vrha >89%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,46 (s, 2H), 11,37 (s, 1H), 10,97 (s, 1H), 8,33 (dd, J = 8,2, 1,3 Hz , 1H), 7,63 (dd, J = 7,7, 1,3 Hz , 1H), 7,57 (t, J = 7,9 Hz , 1H), 7,52 (s, 1H), 7,44 (s, 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H12NO9: 362,05065, pronađeno: 362,05036
Biološki podaci: Ia-011a: FGF-1 IC50 [µM] = 35; FGF-2 IC50 [µM] = 110; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 57,71; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 42,32
13) 2-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)tereftalna kiselina, jedinjenje Ia-012a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,12 min; m/z = 362,1 [M+H]<+>, površina vrha >96%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,41 (brs, 2H), 12,29 (s, 1H), 10,94 (s, 1H), 9,26 (d, J = 1,7 Hz , 1H), 8,09 (d, J = 8,2 Hz , 1H), 7,73 (dd, J = 8,2, 1,7 Hz , 1H), 7,42 (s, 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H12NO9: 362,05065, pronađeno: 362,05046
Biološki podaci: Ia-012a: FGF-1 IC50 [µM] = 38; FGF-2 IC50 [µM] = 36; VEGF-A1 IC50 [µM] = 30; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 59,52; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1,85;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 28,5
14) 2-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalna kiselina, jedinjenje Ia-013a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,91 min; m/z = 362,0 [M+H]<+>, površina vrha >98%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,11 (s, 2H), 11,70 (s, 1H), 11,13 (s, 1H), 7,97 (d, J = 7,8 Hz , 2H), 7,47 (s, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,38 (t, J = 7,7 Hz , 1H)
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H12NO9: 362,05065, pronađeno: 362,05041
Biološki podaci: Ia-013a: FGF-1 IC50 [µM] = 29; FGF-2 IC50 [µM] = 18; VEGF-A1 IC50 [µM] = 17; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 38,52; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 2,38;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 27,67
15) 4-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)ftalna kiselina, jedinjenje Ia-014a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,98 min; m/z = 362,1 [M+H]<+>, površina vrha >94%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,76 (s, 1H), 10,70 (s, 1H), 8,14 (s, 1H), 7,94 - 7,84 (m, 2H), 7,38 (s, 1H), 7,30 (s, 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H12NO9: 362,05065, pronađeno: 362,05047
Biološki podaci: Ia-014a: FGF-1 IC50 [µM] = 20; FGF-2 IC50 [µM] = 20; VEGF-A1 IC50 [µM] = 88; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 61,3; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 9,667
16) 5-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalna kiselina, jedinjenje Ia-015a:
<1>H nmR (250 MHz, DMSO-d6) δ 10,74 (s, 1H), 8,56 (usko d, 2H), 8,22 (usko t, 1H), 7,41 (s, 1H) i 7,37 (s, 1H)
Biološki podaci: Ia-015a: FGF-1 IC50 [µM] = 20; FGF-2 IC50 [µM] = 9,3; VEGF-A1 IC50 [µM] = 19; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,15; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 43,8; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,387;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 17,38; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = 2,76; IFNγ IC50 [µM] = >100; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = 7,08; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 0,77; IL-9 IC50 [µM] = 1,47; IL-10 IC50 [µM] = 5,27; IL-12p70 IC50 [µM] = 0,12; IL-13 IC50 [µM] = 0,15; IL-17A IC50 [µM] = 0,05; IL-17F IC50 [µM] = 0,15; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = 57,2; IL-33 IC50 [µM] = 0,24; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,17; TNF β IC50 [µM] = 0,3.
17) 3-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)izonikotinska kiselina, jedinjenje Ia-023a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,63 min; m/z = 319,1 [M+H]<+>, površina vrha >93%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,17 (s, 1H), 11,03 (s, 1H), 9,78 (s, 1H), 8,46 (d, J = 5,0 Hz , 1H), 7,82 (d, J = 5,0 Hz , 1H), 7,45 (s, 1H), 7,43 (s, 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C14H11N2O7: 319,05608, pronađeno: 319,05610
Biološki podaci: Ia-023a: FGF-1 IC50 [µM] =N.D.; FGF-2 IC50 [µM] = 63; VEGF-A1 IC50 [µM] = 143; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 61,95; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 13,37
Dietil estar:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,87 min, m/z = 375,1 [M+H]<+>, površina vrha > 98%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,79 (s, 1H), 11,23 (s, 1H), 9,87 (s, 1H), 9,68 (s, 1H), 8,50 (d, J = 5,0 Hz , 1H), 7,81 (dd, J = 5,1, 0,7 Hz , 1H), 7,53 (s, 1H), 7,41 (s, 1H), 4,46 - 4,27 (m, 4H), 1,41 - 1,25 (m, 6H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C18H19N2O7: 375,11867, pronađeno: 375,11867
Biološki podaci: Ia-023a-E2: FGF-1 IC50 [µM] =N.D.; FGF-2 IC50 [µM] = 76; VEGF-A1 IC50 [µM] = 141; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =6,6; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 69,47; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 34
18) 4-(4-(karboksimetil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-032a:
<1>H nmR (250 MHz, DMSO-d6): δ 12,28 (br, 1H), 10,92 (s, 1H), 10,44 (s, 1H), 7,65 (br d, 2H), 7,41 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,25 (br d, 2H), 3,55 (s, 2H).
Biološki podaci: Ia-032a: FGF-1 IC50 [µM] =N.D.; FGF-2IC50 [µM] = 91; VEGF-A1 IC50 [µM] =N.D.; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = ND; PMN ROS inhibicija IC50 [µM]-;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = ND
19) 4-(3-(karboksimetil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-033a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 6,5 min): rt = 1,71 min; m/z = 332,1 [M+H]<+>, površina vrha >99%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,89 (s, 1H), 10,46 (s, 1H), 7,65 (s, 1H), 7,59 (d, J = 8,1 Hz , 1H), 7,40 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,03 (d, J = 7,6 Hz , 1H), 3,57 (s, 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H14NO7: 332,07647, pronađeno: 332,07644
Biološki podaci: Ia-033a: FGF-1 IC50 [µM] = 60; FGF-2 IC50 [µM] = 165; VEGF-A1 IC50 [µM] = 281; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 57,73; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1,32; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 38
20) 4-(2-(karboksimetil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-034a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,82 min; m/z = 332,1 [M+H]<+>, površina vrha >98%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,78 (d, J = 8,1 Hz , 1H), 7,31 (d, J = 3,0 Hz , 2H), 7,28 (d, J = 7,6 Hz , 2H), 7,15 (t, J = 7,4 Hz , 1H), 3,63 (s, 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H14NO7: 332,07648, pronađeno: 332,07641 Biološki podaci: Ia-034a: FGF-1 IC50 [µM] = 79; FGF-2 IC50 [µM] = 14; VEGF-A1 IC50 [µM] = 102; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 49,07; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 2,28; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 15
21) 4-(3,4-dihidroksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-035a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,02 min; m/z = 320,1 [M+H]<+>, površina vrha >91%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO- d6) δ 11,56 (s, 1H), 9,21 (t, J = 5,9 Hz , 1H), 8,91 (s, 1H), 8,79 (s, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,28 (s, 1H), 6,72 (d, J = 2,1 Hz , 1H), 6,67 (d, J = 8,0 Hz , 1H), 6,57 (dd, J = 8,0, 2,1 Hz , 1H), 4,32 (d, J = 5,8 Hz , 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C15H14NO7: 320,07648, pronađeno: 320,07650
Biološki podaci: Ia-035a: FGF-1 IC50 [µM] = 20; FGF-2 IC50 [µM] = 71; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =36; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 75,13; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,41; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 27
22) 4-(2-(3,4-dihidroksifenil)etilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-035a-2:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,77 min; m/z = 332,0 [M-H]-, površina vrha >99%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,50 (s, 1H), 8,85 (t, J = 5,6 Hz , 1H), 8,76 (s, 1H), 8,66 (s, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,28 (s, 1H), 6,67 - 6,60 (m, 2H), 6,48 (dd, J = 8,0, 2,1 Hz , 1H), 3,44 (q, J = 6,8 Hz , 2H), 2,67 (dd, J = 8,6, 6,0 Hz , 2H),δ 11,56 (s, 1H), 9,21 (t, J = 5,9 Hz , 1H), 8,91 (s, 1H), 8,79 (s, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,28 (s, 1H), 6,72 (d, J = 2,1 Hz , 1H), 6,67 (d, J = 8,0 Hz , 1H), 6,57 (dd, J = 8,0, 2,1 Hz , 1H), 4,32 (d, J = 5,8 Hz , 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H16NO7: 334,09213, pronađeno: 334,09242 Biološki podaci: Ia-035a-2: FGF-1 IC50 [µM] = 10; FGF-2 IC50 [µM] = 65; VEGF-A1 IC50 [µM] = 109; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =10; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 58,81; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1,1;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 21,5
23) 4-(1-karboksi-2-(3,4-dihidroksifenil)etilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-035a-3:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,70 min; m/z = 376,0 [M-H]-, površina vrha >99%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,90 (s, 1H), 11,11 (s, 1H), 8,98 (d, J = 7,4 Hz , 1H), 8,73 (d, J = 13,1 Hz , 2H), 7,45 (s, 1H), 7,31 (s, 1H), 6,61 (dd, J = 5,1, 2,9 Hz , 2H), 6,47 (dd, J = 8,1, 2,1 Hz , 1H), 3,01 (dd, J = 13,9, 4,9 Hz , 1H), 2,96 - 2,84 (m, 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C17H16NO9: 378,08196, pronađeno: 378,08195
Biološki podaci: Ia-035a-3: FGF-1 IC50 [µM] = 34; FGF-2 IC50 [µM] = 207; VEGF-A1 IC50 [µM] = 198; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =10; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 79,62; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,66; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 22
24) 4-(karboksi(3,4-dihidroksifenil)metilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-036a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,62 min; m/z = 362,1 [M-H]-, površina vrha >92%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,00 (s, 1H), 9,32 (d, J = 6,7 Hz , 1H), 9,05 (s, 1H), 8,97 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,34 (s, 1H), 6,81 (d, J = 2,1 Hz , 1H), 6,75 - 6,64 (m, 2H), 5,29 (d, J = 6,6 Hz , 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H14NO9: 364,06630, pronađeno: 364,06615
Biološki podaci: Ia-036a: FGF-1 IC50 [µM] = N.D.; FGF-2 IC50 [µM] = 37; VEGF-A1 IC50 [µM] = 123; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =1,6; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 87,17; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 30,77
25) 4-(2-karboksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-053a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,08 min; m/z = 332,0 [M+H]<+>, površina vrha >97%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,09 (s, 1H), 11,19 (s, 1H), 9,34 - 9,27 (m, 1H), 7,91 (dd, J = 7,8, 1,4 Hz , 1H), 7,55 (dd, J = 7,5, 1,5 Hz , 1H), 7,46 (d, J = 7,9 Hz , 2H), 7,39 (td, J = 7,5, 1,4 Hz , 1H), 7,32 (s, 1H), 4,82 (d, J = 5,9 Hz , 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H14NO7: 332,07648, pronađeno: 332,07622
Biološki podaci: Ia-053a: FGF-1 IC50 [µM] = 150; FGF-2 IC50 [µM] = 124; VEGF-A1 IC50 [µM] = 210; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 52,92; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 2,5; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 18,67
Šema 4b. Sinteza etil 4-amino-2,5-dibenziloksibenzoata (anilin A)
Anilin A
Protokol: sinteza anilina A
Etil 4-amino-2,5-dibenziloksibenzoat (Anilin A). U ohlađeni rastvor (ledeno kupatilo) 2,5-bis(benziloksi)-4-(etoksikarbonil)benzojeve kiseline (KI-1) (2,0 g, 4,9 mmol) i Et3N (1,6 ml, 11,3 mmol) u THF (25 ml) u inertnoj atmosferi (N2), polako je dodavan DPPA (1,1 ml, 5,2 mmol). Smeša je polako zagrejana do sobne temperature i mešana na ovoj temperaturi 3 h. Zatim je dodata voda (8 ml) i reakciona smeša je zagrevana do 70 °C tokom 2 h. Reakciona smeša je sipana u zasićeni rastvor natrijum hidrogenkarbonata (250 ml) i mešana 5 min pre nego što je ekstrahovana sa EtOAc (3 x 100 ml). Kombinovani organski slojevi su sušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobilo bezbojno ulje. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (izoheksan/EtOAc 1:0, a zatim gradijent do 30% EtOAc) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova Anilin A (1,0 g, 53%) kao sivo-bela čvrsta supstanca.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,26 min; m/z = 378,2 [M+H]<+>, površina vrha 94%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,54 - 7,46 (m, 4H), 7,44 - 7,36 (m, 4H), 7,35 - 7,25 (m, 3H), 6,46 (s, 1H), 5,65 (s, NH2), 5,06 (s, 2H), 5,02 (s, 2H), 4,16 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 1,22 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
26) 4-(4-karboksi-2,5-dihidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ia-056a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,90 min; m/z = 348,0 [MH]-, površina vrha 97%
1H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,28 (brs, 1H), 11,26 (s, 1H), 9,97 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,26 (s, 1H).
Dietil estar:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,86 min; m/z = 404,2 [M-H]-, površina vrha 92%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,48 (brs, 1H), 11,32 (brs, 1H), 10,28 (s, 1H), 10,07 (brs, 1H), 9,88 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 7,58 (s, 1H), 7,39 (s, 1H), 7,28 (s, 1H), 4,46 - 4,27 (m, 4H), 1,46 - 1,12 (m, 6H).
Primer 1.2 – molekuli tipa Ib: Diamidi iz diamina, 1 primer
Šema 5. Sinteza diamida tipa Ib
Sintetičke procedure: pogledajte opšte procedure, korake [3], [4], [5] Primer:
Za uslove i prinose: Vidi Slike 4A-D
27) 3,5-bis(2,5-dihidroksi-4-karboksibenzoilamino)benzoeva kiselina, jedinjenje Ib-010a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,98 min; m/z = 511,0 [M-H]-, površina vrha >93%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,81 (s, 2H), 10,65 (s, 2H), 8,38 (d, J = 2,0 Hz , 1H), 8,12 (d, J = 2,0 Hz , 2H), 7,39 (d, J = 2,3 Hz , 4H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C23H17N2O12: 513,07760, pronađeno: 513,07736
Biološki podaci: Ib-010a: FGF-1 IC50 [µM] = 14; FGF-2 IC50 [µM] = 3,8; VEGF-A1 IC50 [µM] = 15; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =1,6; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 71,84; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1,06;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 1,5; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNi IC50 [µM] = 2,22; IL-1β IC50 [µM] = 33,3; IL-2 IC50 [µM] = 2,74; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 1,02; IL-9 IC50 [µM] = 11,58; IL-10 IC50 [µM] = >100; IL-12p70 IC50 [µM] = 0,27; IL-13 IC50 [µM] = >100; IL-17A IC50 [µM] = 0,42; IL-17F IC50 [µM] = >100; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = 67,8; IL-33 IC50 [µM] = 31,3; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,31; TNF β IC50 [uM] = 49,3
Trietil estar:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,29 min, m/z = 597,1 [M+H]<+>, površina vrha > 96%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,80 (s, 2H), 10,68 (s, 2H), 9,95 (s, 2H), 8,40 (t, J = 2,0 Hz , 1H), 8,15 (d, J = 2,0 Hz , 2H), 7,42 (s, 2H), 7,39 (s, 2H), 4,42 - 4,33 (m, 6H), 1,38 - 1,33 (m, 9H). HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C29H29N2O12: 597,17150, pronađeno: 597,17131
Biološki podaci: Ib-010a-E3: FGF-1 IC50 [µM] = 26; FGF-2 IC50 [µM] = 226; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,09; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 36,41; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 6,52; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 79,5; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNi IC50 [µM] = 2,79; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = 36,2; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 0,24; IL-9 IC50 [µM] = 26,8; IL-10 IC50 [µM] = >100; IL-12p70 IC50 [µM] = 0,84; IL-13 IC50 [µM] = 33; IL-17A IC50 [µM] = 0,52; IL-17F IC50 [µM] = 34,2; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = >100; IL-33 IC50 [µM] = 20; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,98; TNF β IC50 [µM] = 38,2.
Trietil estar tetraacetat:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,19 min, m/z = 782,1 [M+NH4]<+>, površina vrha 91%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,84 (s, 2H), 8,40 (m, 1H), 8,08 (d, J = 2,0 Hz , 2H), 7,80 (s, 2H), 7,63 (s, 2H), 4,45 - 4,22 (m, 6H), 2,32 (s, 6H), 2,23 (s, 6H), 1,38 - 1,27 (m, 9H).
Biološki podaci: Ib-010a-E3-A4: FGF-1 IC50 [µM] = 200; FGF-2 IC50 [µM] = 200; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,54; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 54,86; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1,49; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 96
Primer 1.3. - molekuli tipa Ic: Diamidi iz dikiselina, 4 primera
Šema 6. Sinteza amida tipa Ic sa R = R’
Procedure: videti opšte procedure iz KI-6 [3], [4], [5]
Primeri:
Za uslove i prinose: Vidi Slike 4A-D
28) N1,N4-bis(2-(1H-tetrazol-5-il)fenil)-2,5-dihidroksitereftalamid, jedinjenje Ic-001aTz2:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,97 min; m/z = 485,1 [M+H]<+>, površina vrha >97%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,53 (s, 1H), 10,98 (s, 1H), 8,49 (dd, J = 8,4, 1,2 Hz , 1H), 7,90 (dd, J = 7,8, 1,6 Hz , 1H), 7,62 (ddd, J = 8,7, 7,4, 1,6 Hz , 1H), 7,58 (s, 1H), 7,37 (td, J = 7,6, 1,2 Hz , 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C22H17N10O4: 485,14287, pronađeno: 485,17274
Biološki podaci: Ic-001aTz2: FGF-1 IC50 [µM] = 200; FGF-2 IC50 [µM] = 70; VEGF-A1 IC50 [µM] = 45; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =2,2; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 60,64; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 97,15; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNi IC50 [µM] = 1,38; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = 9,45; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 0,52; IL-9 IC50 [µM] = 9,13; IL-10 IC50 [µM] = >100; IL-12p70 IC50 [µM] = 29,1; IL-13 IC50 [µM] = 0,12; IL-17A IC50 [µM] = 0,31; IL-17F IC50 [µM] = 0,15; IL-18 IC50 [µM] = 33,9; IL-21 IC50 [µM] = 32; IL-33 IC50 [µM] = 0,23; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,1; TNF β IC50 [µM] = 0,41.
29) 5-(4-(3-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ic-007a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,80 min; m/z = 469,1 [M+H]<+>, površina vrha >91%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,08 (s, 2H), 7,65 (s, 2H), 7,59 (s, 2H), 7,30 - 6,89 (m, 5H), 6,79 (d, J = 8,8 Hz , 2H).
<13>C nmR (100 MHz, DMSO-d6) δ 172,1, 165,2, 158,3, 150,1, 130,2, 129,2 (CH), 122,8, 122,6 (CH), 117,7 (CH), 117,3 (CH), 113,3.
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C22H17N2O10: 469,08777, pronađeno: 469,08739
Biološki podaci: Ic-007a: FGF-1 IC50 [µM] = 13; FGF-2 IC50 [µM] = 5,4; VEGF-A1 IC50 [µM] = 3,2; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,09; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 57,99; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 2,7; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 57,5; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNi IC50 [µM] = 1,44; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = >100; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 0,09; IL-9 IC50 [µM] = 27,1; IL-10 IC50 [µM] = 12,5; IL-12p70 IC50 [µM] = 0,49; IL-13 IC50 [µM] = 30,1; IL-17A IC50 [µM] = 0,04; IL-17F IC50 [µM] = 22,9; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = 1,9; IL-33 IC50 [µM] = 18,4; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,27; TNF β IC50 [µM] = 6,52
Dimetil estar:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,13 min, m/z = 497,0 [M+H]<+>, površina vrha > 95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,08 (s, 2H), 10,48 (s, 2H), 10,38 (s, 2H), 8,27 (d, J = 2,8 Hz , 2H), 7,89 - 7,74 (m, 2H), 7,56 (s, 2H), 7,03 (d, J = 8,9 Hz , 2H), 3,93 (s, 6H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C24H21N2O10: 497,11907, pronađeno: 497,11874
Biološki podaci: Ic-007a-E2: FGF-1 IC50 [µM] = 23; FGF-2 IC50 [µM] = 49; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,25; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 21,33; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 7,9; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 2
Alternativa, velika sinteza Ic-007a
a) metil estar 5-(4-(3-metoksikarbonil-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dibenziloksibenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline
Balon od 5 l je napunjen sa 2,5-bis(benziloksi)tereftalnom kiselinom (KI-6, 141,00 g, 0,373 mol), benziltrietilamonijum hloridom (850 mg, 3,73 mmol, 0,01 ek.) i hloroformom (2,5 l). Zatim je opremljen ulazom za azot, termometrom, levkom za ispuštanje pritiska za izjednačavanje pritiska, izlazom u praznu Dreschel bocu i mehurićem natrijum hidroksida. Mešani rastvor je zagrejan do 55 °C i tionil hlorid (59 ml, 0,802 mol, 2,15 ek.) je dodat u kapima tokom perioda od 40 min. Rastvor je držan na 55 °C tokom 6 h, a zatim ostavljen da se ohladi na sobnu temperaturu preko noći. Alikvot je obrađen ultrazvukom u etanolu 5 minuta, a zatim analiziran LCMS analizom, koja je pokazala samo dietilestar. Smeša je prebačena u dve tikvice sa okruglim dnom i isparljive materije su uklonjene u vakuumu; hlorid kiseline je azeotropovan toluenom (800 ml u svakoj posudi). Posuda od 10 l sa omotačem je napunjena metil 5-amino-2-hidroksibenzoatom (137,00 g, 0,819 mol, 2,2 ek.) i dihlorometanom (2,5 l, 18 vol.); rastvor je ohlađen na 15 °C. Kiseli hlorid je stavljen u dihlorometan (2,5 l, 18 vol.) i dodat je mešanoj reakciji. Reakcija odmah formira velike količine čvrste supstance i mešanje postaje teško; takođe reakcija egzotermna do 30 °C. Međutim, pri dužem mešanju smeša postaje roze/ljubičasta fina suspenzija. Smeša je mešana na 25 °C tokom 72h. Suspenzija je filtrirana, isprana dihlorometanom (2 l, 14 vol.) i dobijena čvrsta supstanca osušena u vakuum pećnici da bi se dobilo 240,00 g proizvoda (94% prinos).
b) 5-(4-(3-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksi benzoeva kiselina, Ic-007a
Saponifikacija: Balon sa okruglim dnom od 5 l sa 3 grla je napunjen svežom mlevenom metil estar 5-(4-(3-metoksikarbonil-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dibenziloksibenzamido)-2-hidroksibenzoevom kiselinom (150,00 g, 0,22 mol) i isopropanolom (1,5 l, 10 vol.). Smeša je zagrejana do 50 °C i dodati su tetrabutilamonijum hidroksid (444 ml, 0,67 mol., 3 ek.) i voda (1,1 l, 7 vol.). Posle 1 h ostalo je nešto čvrste materije, pa je dodato još 60 ml rastvora tetrabutilamonijum hidroksida zajedno sa vodom (120 ml), smeša je mešana na 50 °C tokom 6 h, a zatim ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu preko noći. Dodat je još tetrabutilamonijum hidroksida (80 ml) i smeša je dalje mešana na 60 °C tokom 1 h sve dok nije ostala čvrsta supstanca. Hidrogenolisa: Reakcija je degazirana (3 ciklusa sa N2), zatim je dodat katalizator (30,00 g, 10% Pd na C) kao suspenzija u vodi (100 ml). Reakcija je dalje degazirana (3 ciklusa sa N2, 2 sa H2) i stavljena pod H2 (pritisak balona) na 50 °C preko noći. Reakcija je ponovo napunjena vodonikom i držana na 50 °C još 4 h nakon čega je LCMS analiza pokazala potpunu reakciju. Reakciona smeša je degazirana (3 ciklusa sa N2), filtrirana kroz sloj celita i isprana toplom vodom/izopropanolom (1 l, 1:1, 60 °C). Zapremina je smanjena na ~1,2 l u vakuumu. Smeša je prebačena u balon sa prirubnicom od 5 l sa vodom (∼3 l). Balon je opremljen gornjom mešalicom (veliki sidreni tip) i zakiseljen hlorovodoničnom kiselinom (35%). Tokom dodavanja formirao se težak talog. Smeša je zagrevana na 55 °C tokom 6h, a zatim ostavljena da se ohladi do sobne temperature tokom 72h. Smeša je filtrirana i čvrsta supstanca je suspendovana u 1M vodenoj HCl (3 l) i zagrevana na 50 °C tokom 3h, pre nego što je ostavljena da se ohladi do sobne temperature preko noći. Smeša je filtrirana, isprana sa 1M vodenom HCl (2 l), vodom (1,5 l) i acetonom (1 l). Čvrsta supstanca je osušena u vakuum pećnici da bi se dobilo 100.00 g proizvoda još uvek kontaminiranog sa ~5 mol.% tetrabutilamonijum soli (NMR). Ova čvrsta supstanca je mešana u 1M vodenom rastvoru hlorovodonične kiseline (3 l) na 70 °C tokom 8 h, zatim ostavljena da se ohladi do sobne temperature preko noći. Čvrsta supstanca je filtrirana, isprana vodom i osušena u vakuum pećnici. Količina tetrabutilamonijuma je smanjena na ∼0,62 mol.%. (85,90 g, prinos 82%) (braon prah).
30) 2-(2,5-dihidroksi-4-(4-hidroksi-2-karboksifenilaminokarbonil)benzamido)-5-hidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ic-009a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,85 min; m/z = 469,0 [M+H]<+>, površina vrha >98%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,31 (s, 2H), 11,93 (s, 2H), 10,85 (s, 2H), 9,64 (s, 2H), 8,41 (d, J = 9,0 Hz , 2H), 7,55 (s, 2H), 7,39 (d, J = 3,0 Hz , 2H), 7,03 (dd, J = 9,0, 3,0 Hz , 2H).
HRMS: izrač. za C22H17N2O10: 469,08777, pronađeno: 469,08755
Biološki podaci: Ic-009a: FGF-1 IC50 [µM] = 32; FGF-2 IC50 [µM] = 202; VEGF-A1 IC50 [µM] = 208; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =ND; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 72,85; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 72,21
Dimetil estar:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,03 min, m/z = 497,1 [M+H]<+>, površina vrha > 92%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,69 (s, 2H), 11,01 (s, 2H), 9,75 (s, 2H), 8,36 (d, J = 9,0 Hz , 2H), 7,62 (s, 2H), 7,37 (d, J = 3,0 Hz , 2H), 7,07 (dd, J = 9,0, 3,0 Hz , 2H), 3,87 (s, 6H).
HRMS: izrač. za C24H21N2O10: 497,11907, pronađeno: 497,11913
Biološki podaci: Ic-009a-E2: FGF-1 IC50 [µM] = 23; FGF-2 IC50 [µM] = 30; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,02; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 24,12; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 41,05
Šema 7. Sinteza amida tipa Ic sa R = R’
Sintetičke procedure: Videti opštu proceduru iz KI-1.
Primer:
Za uslove i prinose: Vidi Slike 4A-D
31) 5-(4-(2-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje Ic-001aTz/004a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,40 min; m/z = 477,2 [M-H]-, površina vrha >99%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,92 (s, 1H), 10,42 (s, 1H), 8,47 (dd, J = 8,4, 1,2 Hz , 1H), 8,25 (d, J = 2,7 Hz , 1H), 7,98 - 7,88 (m, 1H), 7,76 (dd, J = 8,9, 2,8 Hz , 1H), 7,63 - 7,56 (m, 2H), 7,51 (s, 1H), 7,37 (td, J = 7,6, 1,2 Hz , 1H), 6,97 (d, J = 8,9 Hz , 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C22H17N6O7: 477,11532, pronađeno: 477,11475
Biološki podaci: Ic-001a-Tz/004a: FGF-1 IC50 [µM] = 19; FGF-2 IC50 [µM] = 87; VEGF-A1 IC50 [µM] = 25; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =2,6; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 82,83; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 96,99; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = 3,4; IFNγ IC50 [µM] = 0,61; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = 4,91; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 3,04; IL-9 IC50 [µM] = 8,48; IL-10 IC50 [µM] = 19,5; IL-12p70 IC50 [µM] = 12,2; IL-13 IC50 [µM] = 1,5; IL-17A IC50 [µM] = 0,02; IL-17F IC50 [µM] = 2,4; IL-18 IC50 [µM] = 46,6; IL-21 IC50 [µM] = 0,3; IL-33 IC50 [µM] = 1,67; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,002; TNF β IC50 [µM] = 3,02
Metil estar:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,06 min, m/z = 491,1 [M+H]<+>, površina vrha > 89%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,55 (s, 1H), 10,90 (s, 1H), 10,45 (s, 1H), 10,37 (s, 1H), 8,47 (dd, J = 8,4, 1,2 Hz , 1H), 8,30 (d, J = 2,7 Hz , 1H), 7,91 (dd, J = 7,8, 1,6 Hz , 1H), 7,76 (dd, J = 8,9, 2,7 Hz , 1H), 7,63 (ddd, J = 8,7, 7,4, 1,6 Hz , 1H), 7,58 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 7,38 (td, J = 7,6, 1,2 Hz , 1H), 7,02 (d, J = 8,8 Hz , 1H), 3,93 (s, 4H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C23H19N6O7: 491,13097, pronađeno:
491,13071
Biološki podaci: Ic-001a-Tz/004a-E1: FGF-1 IC50 [µM] = 104; FGF-2 IC50 [µM] = 200; VEGF-A1 IC50 [µM] = 35; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,1; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 73,97; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 97,56
Primer 1.4. molekuli tipa Id: Benzimidazol povezan, 1 primer
Šema 8. Sinteza jedinjenja tipa Id
Sintetički postupak: videti opštu proceduru iz KI-1 [3], [4], [5]
Korak ciklizacije: videti Slike 4A-D
Primer:
32) 2-(4-karboksi-2,5-dihidroksifenil)-1H-benzo[d]imidazol-4-karboksilna kiselina, jedinjenje Id-030a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,99 min; m/z = 313,1 [M-H]-, površina vrha >97%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,10 (d, J = 8,2 Hz , 1H), 8,05 (d, J = 7,7 Hz , 1H), 7,80 (s, 1H), 7,68 (t, J = 8,0 Hz , 1H), 7,62 (s, 1H)
Biopodaci - nestabilni u DMSO
Etil metil estar:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 2,09 min, m/z = 357,1 [M+H]<+>, površina vrha > 89%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6+D2O 10%) δ 7,97 (d, J = 8,0 Hz , 1H), 7,90 - 7,83 (m, 2H), 7,44 - 7,36 (m, 2H), 4,35 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 3,94 (s, 3H), 1,33 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C18H17N2O6: 357,10811, pronađeno: 357,10827
Biološki podaci: Id-030a-E2: FGF-1 IC50 [µM] = 115; FGF-2 IC50 [µM] = 200; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,33; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 0; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 43
Primer 1.5: molekuli tipa Ila: Monoamidi, 16 primera
Sinteza prekurzora
Šema 9a. Sinteza intermedijara KI-2 i KI-7
Procedure:
Sinteza KI-2 i KI-7
2,6-Di(etoksikarbonil)cikloheksan-1,4-dion [Korak 1][Ref: Rodriguez i sar. Synth. Comm.28 (1998) 2259-69]: 1,3-dihloroaceton (12,5 g, 0,1 mol) u THF (500 ml) je dodat u kapima, tokom perioda od 30 minuta, u suspenziju dietil 1,3-acetonedikarboksilata (18 ml, 0,1 mol) i kalijum karbonata- 325 mesh (21,5 g, 0,15 mol) u THF (1 l) na temperaturi refluksa. Posle 2 h, reakcija je završena i smeša je ohlađena do sobne temperature, a zatim filtrirana kroz celitⓒ; čvrsti ostatak je ispran sa THF (200 ml), rastvarač je zatim uklonjen pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (Heksan/EtOAc 0 do 20%) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (9,3 g, 37% prinos).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,01 min; m/z = 257,1 [M+H]-, površina vrha >74%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) Kompleksna smeša enola i cis/trans izomera δ 12,10 (s), 4,23 (q, J = 7,1 Hz ), 4,11 (m), 3,85 - 3,77 (m), 3,70 (s), 3,10 -2,89 (m), 2,89 - 2,80 (m), 2,62 - 2,58 (m), 1,25 (t, J = 7,1 Hz ), 1,22 - 1,15 (m, 9H).
Dietil 2,5-dihidroksiizoftalat [Korak 2]: [Protokol preuzet od Zhong i sar.: Chem Eur. J.25 (2019) 8177-8169]: U mešani rastvor 2,6-di(etoksikarbonil)-cikloheksan-1,4-diona (5,0 g, 20 mmol) u AcOH (17 ml) na sobnoj temperaturi dodat je NBS (3,5 g, 20 mmol) u porcijama preko 30 min. Posle dodatnih 20 minuta, reakcija je ugašena dodatkom vode (100 ml). Željeni proizvod se izdvaja kao čvrsta supstanca. Posle filtracije i sušenja, jedinjenje iz naslova je izolovano kao bela čvrsta supstanca (4,6 g, 93% prinos).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,00 min; m/z = 253,1 [M-H]-, površina vrha >90%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,85 (s, 1H), 9,57 (s, 1H), 7,39 (s, 2H), 4,32 (q, J = 7,1 Hz , 4H), 1,31 (t, J = 7,1 Hz , 6H).
Dietil 2,5-bis(benziloksi)izoftalat [Korak 3]: U suspenziju dietil 2,5-dihidroksiizoftalata (19,0 g, 75 mmol) i kalijum karbonata-325 mesh (82,6 g, 598 mmol) u DMF (83 ml) dodat je u kapima benzil bromid (43,0 ml, 362 mmol) preko 10 min. Reakciona smeša je zagrevana na 100 °C tokom 2 h. Posle hlađenja do sobne temperature, rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Zatim je u ostatak dodata voda (500 ml). Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (3 × 250 ml), sakupljeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (300 ml), osušeni preko Na2SO4, filtrirani i zatim koncentrovani pod sniženim pritiskom. Sirovi materijal je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (Heksan/EtOAc 0 do 15%) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (29,4 g, 90% prinos).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,38 min; m/z = 435,2 [M+H]<+>, površina vrha >90%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,50 (s, 2H), 7,49 - 7,45 (m, 2H), 7,44 -7,37 (m, 5H), 7,37 - 7,29 (m, 3H), 5,17 (s, 2H), 4,95 (s, 2H), 4,26 (q, J = 7,1 Hz , 4H), 1,22 (t, J = 7,1 Hz , 6H).
2,5-bis(benziloksi)-3-(etoksikarbonil)benzoeva kiselina (KI-2) [Korak 4]: Rastvor kalijum hidroksida (4,4 g, 79 mmol) u vodi (66 ml) je brzo dodat u rastvor dietil 2,5-bis(benziloksi)izoftalata (31,3 g, 72 mmol) u 1,4-dioksanu (430 ml). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1,5 h.1,4-dioksan je uklonjen pod sniženim pritiskom, zatim je dodat zasićeni vodeni rastvor Na2CO3 (1 l), vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (3x 500 ml), osušen iznad Na2SO4, filtriran i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Ostatak je prečišćen filtracijom preko silika jastučića korišćenjem heksana/EtOAc (1/1), zatim EtOAc (1% vol./vol. AcOH) kao eluenta da bi se dobile dve različite frakcije:
Početni materijal: Dietil 2,5-bis(benziloksi)izoftalat (20,4 g, 65% prinos).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,38 min; m/z = 435,2 [M+H]<+>, površina vrha >78%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,50 (s, 2H), 7,49 - 7,45 (m, 2H), 7,44 -7,37 (m, 5H), 7,37 - 7,29 (m, 3H), 5,17 (s, 2H), 4,95 (s, 2H), 4,26 (q, J = 7,1 Hz , 4H), 1,22 (t, J = 7,1 Hz , 6H).
Željeni proizvod, 2,5-bis(benziloksi)-3-(etoksikarbonil)benzoeva kiselina kao bela pahuljasta čvrsta supstanca, (KI-2) (3,5 g, 12% prinos).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,22 min; m/z = 405,1 [M-H]-, površina vrha >90%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,30 (s, 1H), 7,48 (t, J = 3,0 Hz , 2H), 7,46 - 7,42 (m, 5H), 7,39 (m, 3H), 7,37 - 7,31 (m, 2H), 5,17 (s, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,25 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 1,22 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
Originalni zasićeni vodeni rastvor Na2CO3 je zatim zakiseljen do pH~7 korišćenjem koncentrovane hlorovodonične kiseline. Zatim ekstrahovan sa EtOAc (2 × 500 ml), osušen preko natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobila smeša KI-2 i KI-7 (3,0 g, 11% prinos).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,00 min; m/z = 377,1 [M-H]-, površina vrha 25%, rt = 1,22 min; m/z = 405,1 [M-H]-, površina vrha 56%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,23 (s, 2H), 7,52 - 7,29 (m, 12H), 5,17 (s, 2H), 4,97 (s, 2H).
Šema 9b. Alternativna sinteza KI-7
Mravlja kiselina
[Korak 3]
Pinnick oksidacija
[Korak 5]
2,6-dimetil-1,4-fenilen diacetat [Korak 1]: U mešani rastvor 2,6-dimetilhidrokinona (5,0 g, 36 mmol) u piridinu (10 ml) brzo je dodat anhidrid sirćetne kiseline (10 ml). Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 18 h. Rastvarač je zatim uklonjen pod sniženim pritiskom, a ostatak je rastvoren sa EtOAc (250 ml) i zatim ispran vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (1 M, 250 ml), zasićenim vodenim rastvorom NaHCOs (250 ml) i vodom ( 250 ml), osušen preko Na2SO4, filtriran i rastvarač je uklonjen in vacuo, da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (7,4 g, 92%) u vidu bele čvrste supstance.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,07 min; m/z = 240,2 [M+NH4]<+>, površina vrha >90%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6,88 (HAr, 2H), 2,37 - 2,30 (m, 3H), 2,27 - 2,21 (m, 3H), 2,12 - 2,02 (m, 6H).
2,6-bis(dibromometil)-1,4-fenilen diacetat [Korak 2]: U mešani rastvor 2,6-dimetil-1,4-fenilen diacetata (6,34 g, 29 mmol) u 1,2-dihloroetanu (130 ml) je uzastopno dodat 2,2'-Azobis(2-metilpropionitril) (AIBN) (0,93 g,
6 mmol) i N-bromosukcinimid (NBS) (25,39 g, 143 mmol). Rastvor je mešan pod refluksom 24 h. Dodati su 2,2'-Azobis(2-metilpropionitril) (AIBN) (0,93 g, 6 mmol) i N-bromosukcinimid (NBS) (5,08 g, 28,6 mmol) i reakciona smeša je mešana pod refluksom još 24 h. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i zaostala čvrsta supstanca je uklonjena filtracijom i isprana sa DCM (250 ml). Filtrat je ispran zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata (250 ml), vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (1 M, 250 ml) i slanim rastvorom (250 ml).
Organski sloj je zatim osušen sa natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (9,38 g, 61%) kao narandžasto ulje.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,23 min; m/z = 553,1 [M+NH4]<+>, površina vrha >88%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,69 (s, 2H), 7,31 (s, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,32 (s, 3H).
2,5-dihidroksiizoftalaldehid [Korak 3]: U mešanu suspenziju 2,6-bis(dibromometil)-1,4-fenilen diacetata (3,89 g, 7,23 mmol) u mravljoj kiselini (50 ml) dodata je voda (5 ml). Smeša je mešana pod refluksom 18 h. Reakciona smeša je zatim polako sipana u zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata (300 ml). Formirani precipitat je zatim izolovan filtracijom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (0,94 g, 78%) kao braon čvrsta supstanca.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,74 min; m/z = 165,0 [M-H]-, površina vrha >98%
2,5-bis(benziloksi)izoftalaldehid [Korak 4]: Kalijum karbonat-325 mesh (2,34 g, 17,0 mmol) je dodat mešanom rastvoru 2,5-dihidroksiizoftalaldehida (0,94 g, 5,7 mmol) u DMF (6 ml) na temperaturi okoline. Benzil bromid (2,0 ml, 17,0 mmol) je zatim dodat u reakcioni balon, a rezultujuća smeša je zagrevana na 100 °C tokom 18 h. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i tretirana rastvorom zasićenog vodenog rastvora amonijum hlorida (100 ml). Dobijena suspenzija je mešana 30 min, a zatim filtrirana. Čvrsti materijal je ispran rastvorom zasićenog vodenog rastvora amonijum hlorida (2 × 50 ml). Čvrsta supstanca je zatim triturirana sa etanolom (5 ml), osušena usisavanjem da bi se dobio željeni proizvod kao braon čvrsta supstanca (1,58 g, 68%)
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,28 min, nije primećena jonizacija, površina vrha 78%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,14 (s, 2H), 7,63 (s, 2H), 7,53 - 7,28 (m, 10H), 5,23 (s, 2H), 5,21 (s, 2H).
2,5-bis(benziloksi)izoftalna kiselina (KI-7) [Korak 5]: 2,5-bis(benziloksi)izoftalaldehid (1,58 g, 4,5 mmol) je rastvoren u rastvoru 2-metil-2-butena u THF (2,0 M, 25 ml). Zatim je dodat rastvor natrijum hlorita (5,1 g, 45,0 mmol) i kalijum dihidrogen fosfata (4,6 g, 33,8 mmol) u vodi (25 ml) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 h. Reakciona smeša je zatim sipana u zasićeni vodeni rastvor NaHCO3 (400 ml). Vodeni sloj je ispran sa EtOAc (3 × 100 ml) nakon čega je usledilo zakiseljavanje sa konc. hlorovodonična kiselina (pH-1). Vodeni sloj je zatim ekstrahovan sa DCM (2 × 150 ml) i Et2O (2 × 200 ml), prikupljeni organski sloj je osušen natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je zatim triturisan sa n-pentanom (3 × 50 ml) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova KI-7 kao bela čvrsta supstanca (0,98 g, 58%).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,03 min, m/z = 379,1 [M+H]<+>, površina vrha >96%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,23 (s, 2H), 7,57 - 7,28 (m, 12H), 5,17 (s, 2H), 4,97 (s, 2H).
Šema 9c. Sinteza KI-2Ac2
Metil 2,5-diacetoksi-3-metilbenzoat.3-metilsalicilna kiselina je oksidovana persulfatom kako su opisali Nudenberg i sar. (J. Org. Chem.1943, 8, 500-508). 3-metilsalicilna kiselina (15,0 g, 98,6 mmol) je rastvorena u rastvoru natrijum hidroksida (15,0 g, 375 mmol, 3,8 ek.) u vodi (37,5 ml). Svetlosmeđi rastvor je ohlađen na 20 °C i tretiran, uz mešanje, sa 7,75 ml porcijama 40% natrijum hidroksida i 33,8 ml porcijama 10% rastvora kalijum persulfata, počevši od hidroksida, takvom brzinom da je temperatura od 30-35 °C održana i sve dok se ne doda deset porcija svake. Nakon što je dodavanje završeno, mešanje je nastavljeno tokom 1 h, smeša je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi 16-20 h, a zatim je dodata konusna HCl do plave boje u Kongo. Nereagovana 3-metilsalicilna kiselina je odvojena na ovom mestu kao čvrsta supstanca i uklonjena filtracijom. Filtrat je ekstrahovan etrom nekoliko puta (5x50 ml) da bi se dobio ostatak 3-metilsalicilne kiseline. Vodeni rastvor je zatim tretiran konusnom HCl (100 ml) i zatim refluksovan 2 h da bi se razgradio intermedijer monosulfata. Topli rastvor je ostavljen da se ohladi do sobne temperature i skoro crna kristalna čvrsta supstanca koja se istaložila je filtrirana, isprana vodom i osušena. Ekstrakcija vodenog filtrata etrom dala je dodatnu šaržu 2,5-dihidroksi-3-metilbenzoeve kiseline kao braon čvrstu supstancu (ukupno: 7,71 g, 47%). Mp 212-214 °C;<1>H nmR (250 MHz, DMSO): δ 10,94 (br, s,, 1H), 7,00 (dd, J = 3,0 i 0,75,<1>Har), 6,86 (dd, J = 3,0 i 0,75,<1>Har), 2,12 (s, 3H).
Esterifikacija. Koncentrovana sumporna kiselina (0,7 ml) je pažljivo dodata na 0 °C i pod azotom u rastvor 2,5-dihidroksi-3-metilbenzojeve kiseline (2,05 g, 12,2 mmol) u MeOH (7 ml). Reakciona smeša je zatim mešana 6 h na 100 °C. Posle hlađenja do sobne temperature, rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Dobijeni sirovi proizvod je rastvoren u etil acetatu (50 ml) i rastvor je ispran vodom (20 ml), 10% vod. NaHCOs (20 ml), 5% vod. HCl (20 ml) i slanim rastvorom (20 ml), a zatim je osušen (MgSO4). Posle filtriranja, organski sloj je koncentrovan in vacuo da bi se dobio ostatak koji je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (petroleum etar/etil acetat = 9/1) da bi se dobio metil 2,5-dihidroksi-3-metilbenzoat kao bela čvrsta supstanca (370 mg, 75%). Mp 101-103 °C;<1>H nmR (250 MHz, CDCl3): δ 10,56 (d, J = 0,50 Hz , 1H), 7,12 (dd, J = 3,25 i 0,50 Hz ,<1>Har), 6,90 (dt, J = 3,00 i 0,50 Hz ,<1>Har), 4,45 (s, 3H),, 2,24 (s, 3H); HRMS (ESI<+>): m/ z izračunato za C9H11O4 [M+H]<+>: 183,0652; pronađeno 183,0651.
Acetilacija. Višak anhidrida sirćetne kiseline (10 ml) je dodat u rastvor metil 2,5-dihidroksi-3-metil-benzoata (4,43 g, 24,3 mmol) u piridinu (10 ml) pod argonom. Posle 12 h mešanja na sobnoj temperaturi, piridin i anhidrid sirćetne kiseline su eliminisani ko-evaporacijom sa toluenom (25 ml) pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je zatim rastvoren u etil acetatu (15 ml) i rastvor je uzastopno ispran sa 2% vodenim rastvorom HCl (5 ml), zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3 (5 ml) i rastvorom soli (5 ml). Organska faza je osušena (MgSO4) i rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom. Dobijeno bezbojno ulje je prečišćeno fleš hromatografijom na silika gelu (petrol etar/etil acetat = 8/2) da bi se dobio acetilovani naslovni proizvod (2,5-acetoksi-3-metil-benzoat) u obliku bele čvrste supstance (6,25 g, 97%). Mp 69-71 °C;<1>H nmR (250 MHz, CDCl3): δ 7,58 (dd, J = 3,00 i 0,50 Hz ,<1>Har), 7,18 (dd, J = 3,00 i 0,75 Hz , 1Har), 3,85 (s, 3H), 2,37 (s, 3H), 2,30 (s, 3H), 2,22 (s, 3H); HRMS (ESI<+>): m/z izračunato za C13H18NO6 [M+NH4]<+>: 284,1129; pronađeno 284,1128.
Metil 2,5-diacetoksi-3-dibromometilbenzoat. Rastvor metil 2,5-acetoksi-3-metilbenzoata (2,15 g, 8,08 mmol), N-bromosukcinimida (2,87 mg, 16,2 mmol, 2,0 ek.) i azobisisobutironitrila (AIBN, 27,0 mg, 0,162 mmol, 0,02 ek.) u ugljeniku tetrahlorid (45 ml) je refluksovan oko 12 h dok bela čvrsta supstanca nije plutala na površini. Reakciona smeša je filtrirana, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeno bezbojno ulje je prečišćeno fleš hromatografijom na silika gelu (petrol etar/etil acetat = 9/1) da bi se dobio dibromovani proizvod u vidu bele čvrste supstance (3,29 g, 84%). Mp 117-119 °C;<1>H nmR (250 MHz, CDCl3): δ 7,86 (d, J = 2,75 Hz ,<1>Har), 7,78 (d, J = 2,75 Hz ,<1>Har), 6,81 (s, 1H), 3,86 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,33 (s, 3H); HRMS (ESI<+>): m /z izračunato za C13H12Br2NaO6 [M+Na]<+>: 444,8893; pronađeno 444,8896.
Metil 2,5-diacetoksi-3-formilbenzoat. Rastvor metil 2,5-diacetoksi-3-dibromometilbenzoata (2,30 g, 5,42 mmol) i srebro nitrata (2,29 g, 13,5 mmol, 2,5 ek.) u smeši aceton - H2O(4,7: 1, 40 ml) je mešan na sobnoj temperaturi i u mraku tokom 12 h. Smeša je zatim filtrirana, a filtrat je ekstrahovan etil acetatom (2 × 20 ml). Kombinovani organski sloj je ispran rastvorom (5 ml), osušen (MgSO4) i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Tako dobijeno bezbojno ulje je prečišćeno fleš hromatografijom na silika gelu (petroleum etar/etil acetat = 9/1) da bi se dobio aldehid kao žuta čvrsta supstanca (1,14 g, 75%). Mp 102-104 °C; 1H nmR (250 MHz, CDCl3): □ 10,17 (s, 1H), 8,00 (d, J = 3,00 Hz , 1Har), 7,82 (d, J = 3,00 Hz , 1Har), 3,90 (s, 3H), 2,44 (s, 3H), 2,34 (s, 3H).
Monometil estar 2,5-diacetoksiizoftalne kiseline (KI-2Ac2). Rastvor natrijum hidrogen fosfata (1,35 g, 9,81 mmol, 2,5 ek.) u vodi (3,5 ml) je dodat u kapima u rastvor metil 2,5-diacetoksi-3-formilbenzoata (1,10 g, 3,93 mmol) u DMSO (14 ml). Smeša je zatim ohlađena na 0 °C i polako je dodat rastvor natrijum hlorita (1,06 g, 9,34 mmol, 2,4 ek.) u vodi (3,5 ml). Posle 72 h mešanja na sobnoj temperaturi, smeša je ugašena zasićenim vodenim rastvorom NaHCOs (10 ml) i ekstrahovana etil acetatom (2 × 30 ml). Vodena faza je zatim zakiseljena sa 1M HCl do pH = 1 i ekstrahovana etil acetatom (2 × 30 ml).
Kombinovani organski sloj je ispran rastvorom (5 ml), osušen (MgSO4) i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeno narandžasto ulje je korišćeno u sledećem koraku bez ikakvog prečišćavanja.
Sinteza monoamida
Šema 10. Sinteza monoamida IIa
Protokoli: Sinteza monoamida
Procedure spajanja i uklanjanja zaštite amida
Pogledajte Opšte procedure iz KI-1 i KI-6 koraka [3], [4], [5], iste procedure iz KI-2, KI-2Ac2 i KI-7
Primeri
Za uslove i prinose: Pogledajte tabelu 2 (Slike 5A-C)
33) 3-(2-karboksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IIa-001a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,86 min; m/z = 318,0 [M+H]<+>, površina vrha >92%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,49 (s, 1H), 12,16 (s, 1H), 9,54 (s, 1H), 8,70 (dd, J = 8,5, 1,2 Hz , 1H), 7,99 (dd, J = 7,9, 1,7 Hz , 1H), 7,70 - 7,51 (m, 2H), 7,42 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 7,20 (td, J = 7,6, 1,2 Hz , 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C15H12NO7: 318,06083, pronađeno: 318,06082
Biološki podaci: IIa-001a: FGF-1 IC50 [µM] = 8,6; FGF-2 IC50 [µM] = 11; VEGF-A1 IC50 [µM] = 150; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 30,5; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,408; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 36,24
34) 3-(2-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IIa-001aTz:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,71 min; m/z = 342,1 [M+H]<+>, površina vrha >99%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,40 (s, 1H), 9,49 (s, 1H), 8,51 (d, J = 8,3 Hz , 1H), 7,87 (d, J = 7,7 Hz , 1H), 7,72 - 7,51 (m, 2H), 7,51 - 7,26 (m, 2H)
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C15H12N5O5: 342,08329, pronađeno: 342,08317
Biološki podaci: IIa-001a-Tz: FGF-1 IC50 [µM] = N.D.; FGF-2 IC50 [µM] = 9,8; VEGF-A1 IC50 [µM] = 187; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =ND; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 74,15; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 24,18
Etil estar
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,46 min; m/z = 370,1 [M+H]<+>, površina vrha >92%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,51 (s, 1H), 11,37 (s, 1H), 9,63 (s, 1H), 8,47 (d, J = 8,3 Hz , 1H), 7,92 (dd, J = 7,8, 1,6 Hz , 1H), 7,66 - 7,57 (m, 2H), 7,43 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 7,38 (td, J = 7,6, 1,2 Hz , 1H), 4,40 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 1,36 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C17H16N5O5: 370,11460, pronađeno: 370,11444
Biološki podaci: IIa-001aTz-E1: FGF-1 IC50 [µM] = 200; FGF-2 IC50 [µM] = 42; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 68,86; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 81,94
35) 2,5-Dihidroksi-3-(2-sulfofenilaminokarbonil)benzoeva kiselina, jedinjenje IIa-001c:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,63 min; m/z = 354,0 [M+H]<+>, površina vrha >80%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,18 (s, 1H), 9,48 (s, 1H), 8,34 - 8,27 (m, 1H), 7,72 (dd, J = 7,7, 1,7 Hz , 1H), 7,52 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 7,41 - 7,31 (m, 2H), 7,08 (td, J = 7,5, 1,2 Hz , 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C14H12NO8S: 354,02781, pronađeno: 354,02781
Biološki podaci: IIa-001c: FGF-1 IC50 [µM] = N.D.; FGF-2 IC50 [µM] = 71; VEGF-A1 IC50 [µM] =283; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =ND; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 72,62; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 43,53
36) 3-(3-karboksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IIa-002a:
<1>H nmR (250 MHz, CD3OD): δ 8,37 (t, 1H), 7,93 (br d, 1H), 7,81 (br d, 1), 7,76 (d, 1H), 7,52 (d, 1H), 7,48 (t, 1H).
HRMS (ESI-): [MH]-, izrač. za C15H10NO7: 316,0461, pronađeno:
318,0463
Biološki podaci: IIa-002a: FGF-1 IC50 [µM] = 19; FGF-2 IC50 [µM] = 131; VEGF-A1 IC50 [µM] = 150; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =ND; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 43,3; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,299; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 17,39
37) 3-(4-karboksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina)amid, jedinjenje IIa-003a:
<1>H nmR (250 MHz, CD3OD): □8,06 (BB' od AA'BB', 2H), 7,85 (AA' od AA'BB', 2H), 7,75 (d, 1H), 7,58 (d, 1H)
HRMS (ESI-): izračunato za C15H10NO7 [MH]-: 316,0461; pronađeno 316,0462
Biološki podaci: IIa-003a: FGF-1 IC50 [µM] = 22; FGF-2 IC50 [µM] = 13; VEGF-A1 IC50 [µM] = 150; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =2,5; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 59,3; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 35,27
38) 3-(3-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IIa-004a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,76 min; m/z = 334,0 [M+H]<+>, površina vrha >99%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 14,02 (brs, 1H), 11,07 (brs, 1H), 10,32 (s, 1H), 9,47 (brs, 1H), 8,27 (d, J = 2,7 Hz , 1H), 7,76 (dd, J = 8,9, 2,7 Hz , 1H), 7,42 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 7,36 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 6,96 (d, J = 8,9 Hz , 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C15H12NO8: 334,05574, pronađeno: 334,05571
Biološki podaci: IIa-004a: FGF-1 IC50 [µM] = 47; FGF-2 IC50 [µM] = 33; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 63,5; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1,002;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 36
39) 3-(2-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IIa-006a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,65 min; m/z = 334,0 [M+H]<+>, površina vrha >99%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,36 (s, 1H), 11,83 (s, 1H), 9,62 (s, 1H), 9,47 (s, 1H), 8,47 (d, J = 9,1 Hz , 1H), 7,64 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 7,41 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 7,37 (d, J = 3,0 Hz , 1H), 7,03 (dd, J = 9,1, 3,0 Hz , 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C15H12NO8: 334,05574, pronađeno: 334,05548
Biološki podaci: IIa-006a: FGF-1 IC50 [µM] =N.D.; FGF-2 IC50 [µM] = 43; VEGF-A1 IC50 [µM] = 121; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =2,9; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 84,29; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 20,29
40) 3-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)ftalna kiselina, jedinjenje IIa-011a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,72 min; m/z = 360,1 [M-H]-, površina vrha >77%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,83 (s, 1H), 9,55 (s, 1H), 8,43 (dd, J = 7,9, 1,5 Hz , 1H), 7,73 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 7,63 - 7,53 (m, 2H), 7,46 (d, J = 3,3 Hz , 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H12NO9: 362,05066, pronađeno: 362,05045,
Biološki podaci: IIa-011a: FGF-1 IC50 [µM] = 141; FGF-2 IC50 [µM] = 123; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 58,1; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1,18; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 26
41) 2-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)tereftalna kiselina, jedinjenje IIa-012a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,73 min; m/z = 362,0 [M+H], površina vrha >97%
<1>H nmR (DMSO-d6) δ: 13,81 (s, 1H), 13,34 (s, 1H), 12,23 (s, 1H), 9,50 (s, 1H), 9,30 (d, J = 1,6 Hz , 1H), 8,06 (d, J = 8,2 Hz , 1H), 7,71 (dd, J = 8,2, 1,7 Hz , 1H), 7,64 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 7,43 (d, J = 3,3 Hz , 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H12NO9: 362,05066, pronađeno: 362,05046,
Biološki podaci: IIa-012a: FGF-1 IC50 [µM] = 150; FGF-2 IC50 [µM] = 150; VEGF-A1 IC50 [µM] = 32; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =3,31; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 44,8; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,313; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 7,5
42) 2-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalna kiselina, jedinjenje IIa-013a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,68 min; m/z = 362,0 [M+H]<+>, površina vrha >96%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,12 (brs, 3H), 11,71 (s, 1H), 9,47 (s, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,66 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 7,44 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 7,35 (t, J = 7,8 Hz , 1H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H12NO9: 362,05066, pronađeno: 362,05047
Biološki podaci: IIa-013a: FGF-1 IC50 [µM] = 137; FGF-2 IC50 [µM] = 12; VEGF-A1 IC50 [µM] = 34; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 57,68; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 2,54;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 15,75
43) 4-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)ftalna kiselina, jedinjenje IIa-014a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,63 min; m/z = 362,1 [M+H]<+>, površina vrha >88%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,80 (s, 1H), 9,45 (s, 1H), 8,01 (d, J = 2,2 Hz , 1H), 7,86 (dd, J = 8,5, 2,2 Hz , 1H), 7,74 (d, J = 8,5 Hz , 1H), 7,45 -7,33 (m, 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H12NO9: 362,05066, pronađeno: 362,05048
Biološki podaci: IIa-014a: FGF-1 IC50 [µM] = 40; FGF-2 IC50 [µM] = 61; VEGF-A1 IC50 [µM] = 91; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =17,6; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 73,94; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 21,5
44) 5-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalna kiselina, jedinjenje IIa-015a:
<1>H nmR (250 MHz, CD3OD): δ 8,60 (d, J = 1,5 Hz , 2H), 8,44 (t, J = 1,5 Hz , 1H), 7,75 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 7,56 (d, J = 3,2 Hz , 1)
HRMS (ESI+): m/z izračunato za C16H12NO9 [M+H]+: 362,0507; pronađeno 362,0505 [LM-163]
Biološki podaci: IIa-015a: FGF-1 IC50 [µM] = N.D.; FGF-2 IC50 [µM] = 125; VEGF-A1 IC50 [µM] = N.D.; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =ND; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = ND; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = ND
45) (3-(3-(karboksimetil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IIa-033a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,78 min; m/z = 330,1 [M-H]-, površina vrha >98%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,40 (s, 1H), 9,45 (s, 1H), 7,66 (t, J = 1,9 Hz , 1H), 7,63 - 7,57 (m, 1H), 7,45 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 7,38 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 7,29 (t, J = 7,8 Hz , 1H), 7,05 - 6,95 (m, 1H), 3,56 (s, 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H14NO7: 332,07648, pronađeno: 332,07644,
Biološki podaci: IIa-033a: FGF-1 IC50 [µM] = 35; FGF-2 IC50 [µM] = 32; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =4,9; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 50,64; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,914; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 11,75
46) 3-(2-(karboksimetil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IIa-034a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,74 min; m/z = 332,0 [M+H]<+>, površina vrha >95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,48 (s, 1H), 10,65 (s, 1H), 9,30 (s, 1H), 7,97 (d, J = 8,3 Hz , 1H), 7,64 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 7,40 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 7,33 - 7,26 (m, 2H), 7,13 (td, J = 7,5, 1,3 Hz , 1H), 3,70 (s, 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H14NO7: 332,07648, pronađeno: 332,07653 Biološki podaci: IIa-034a: FGF-1 IC50 [µM] = 22; FGF-2 IC50 [µM] = 5,7; VEGF-A1 IC50 [µM] = 86; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =100; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 69,2; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 26,58
Dietil estar
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,12 min; m/z = 388,1 [M+H]<+>, površina vrha >99%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,81 (s, 1H), 9,58 (s, 1H), 7,77 (t, J = 8,5 Hz , 1H), 7,65 (d, J = 3,4 Hz , 1H), 7,42 (d, J = 3,4 Hz , 1H), 7,36 - 7,31 (m, 2H), 7,20 (t, J = 7,4 Hz , 1H), 4,39 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 4,05 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 3,77 (s, 2H), 1,36 (t, J = 7,1 Hz , 3H), 1,13 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C20H22N07: 388,13907, pronađeno: 388,13887
Biološki podaci: IIa-034a-E2: FGF-1 IC50 [µM] =N.D.; FGF-2 IC50 [µM] = 164; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =ND; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 68,73; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 11,86
47) 3-(3,4-dihidroksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IIa-035a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,69 min; m/z = 318,0 [M-H]-, površina vrha >99%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,38 (s, 1H), 8,84 (s, 1H), 8,75 (s, 1H), 7,55 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 7,34 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 6,74 (d, J = 2,1 Hz , 1H), 6,67 (d, J = 8,0 Hz , 1H), 6,58 (dd, J = 8,1, 2,1 Hz , 1H), 4,34 (d, J = 5,7 Hz , 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C15H14NO7: 320,07647, pronađeno: 320,07625.
Biološki podaci: IIa-035a: FGF-1 IC50 [µM] = 16; FGF-2 IC50 [µM] = 61; VEGF-A1 IC50 [µM] = 45; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,52; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 76,99; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 36,67
48) 3-(2-karboksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IIa-053a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,08 min; m/z = 332,0 [M+H]<+>, površina vrha >97%
<1>H nmR (DMSO-d6) δ: 13,13 (brs, 1H), 12,73 (brs, 1H), 9,40 (s, 1H), 9,05 (s, 1H), 7,91 (dd, J = 7,8, 1,4 Hz , 1H), 7,65 - 7,29 (m, 5H), 4,80 (d, J = 6,1 Hz , 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H14NO7: 332,07648, pronađeno: 332,07626
Biološki podaci: IIa-053a: FGF-1 IC50 [µM] = 84; FGF-2 IC50 [µM] = 18; VEGF-A1 IC50 [µM] = 37; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,27; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 63,13; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,62;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 20; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNi IC50 [µM] = 1,04; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = 1,67; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 2,2; IL-9 IC50 [µM] = 1,41; IL-10 IC50 [µM] = >100; IL-12p70 IC50 [µM] = 0,27; IL-13 IC50 [µM] = 29,9; IL-17A IC50 [µM] = >100; IL-17F IC50 [µM] = 28,8; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = >100; IL-33 IC50 [µM] = 12,1; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,02; TNF β IC50 [µM] = 91,5.
Primer 1.6. molekuli tipa IIb: Diamidi iz diamina, 1 primer
Šema 11. Sinteza diamida tipa IIb
Procedura: videti opštu proceduru iz KI-1 [3], [4], [5]
Na primer:
Za uslove i prinose: Pogledajte tabelu 2 (Slike 5A-C)
49) 3,5-bis(2,5-dihidroksi-3-karboksibenzoilamino)benzoeva kiselina, jedinjenje IIb-010a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,98 min; m/z = 511,1 [M-H]-, površina vrha >93%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,81 (s, 2H), 10,65 (s, 2H), 8,38 (m, 1H), 8,12 (d, J = 2,0 Hz , 2H), 7,39 (d, J = 2,3 Hz , 4H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C23H17N2O12: 513,07760, pronađeno:
513,07774
Biološki podaci: IIb-010a: FGF-1 IC50 [µM] = 200; FGF-2 IC50 [µM] = 102; VEGF-A1 IC50 [µM] = 28; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =ND; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 81,87; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 59,84
Primer 1.7. molekuli tipa IIc: Diamidi iz dikiselina, 2 primera
Šema 12. Sinteza amida tipa IIc sa R = R'
Procedura: videti opštu proceduru iz KI-6 [3], [4], [5]
Za primere
Za uslove i prinose: Pogledajte tabelu 2 (Slike 5A-C)
50) 5-(3-(3-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IIc-007a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,20 min; m/z = 469,1 [M+H]<+>, površina vrha >91%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,41 (s, 2H), 9,51 (s, 1H), 8,22 (d, J = 2,7 Hz , 2H), 7,79 (dd, J = 9,0, 2,7 Hz , 2H), 7,58 (s, 2H), 6,98 (d, J = 8,9 Hz , 2H).
<13>C nmR (100 MHz, DMSO-d6) δ 172,1, 166,1, 158,3, 152,0, 149,4, 130,2, 129,5 (CH), 122,8 (CH), 120,3, 119,8 (CH), 117,7 (CH).113,0.
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C22H17N2O10: 469,08777, pronađeno: 469,08803
Biološki podaci: IIc-007a: FGF-1 IC50 [µM] = 11; FGF-2 IC50 [µM] = 91; VEGF-A1 IC50 [µM] = 8,2; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,44; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 93,04; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] =ND;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 64,61; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = 26; IFNγ IC50 [µM] = 0,11; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = 12,8; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 0,05; IL-9 IC50 [µM] = 2,14; IL-10 IC50 [µM] = 17,9; IL-12p70 IC50 [µM] = 3,37; IL-13 IC50 [µM] = 0,25; IL-17A IC50 [µM] = 0,01; IL-17F IC50 [µM] = 0,26; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = 9,41; IL-33 IC50 [µM] = 0,18; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,03; TNF β IC50 [µM] = 0,29
Alternativna sinteza velikih razmera IIc-007a
2,5-dibenziloksiizoftalna kiselina (KI-7)
U posudu sa omotačem od 5 l sipa se 2,5-dibenziloksiizoftalaldehid (šema 9b) (300 g, 866 mmol), resorcinol (286 g, 2,60 mol), KH2PO4 (354 g, 2,60 mol), aceton (1,5 ml) i voda (516 ml). Suspenzija je mešana na 15-25 °C. Rastvor 80% NaClOz (294 g, 2,60 mol) u vodi (1 l) je napunjen na 15-30 °C tokom 90 minuta (egzotermno). Nakon što je dodavanje završeno, reakcija je mešana na 15-25 °C tokom 1 sata. Rastvor 85% H3PO4(85 ml, 1,24 mol) u vodi (1175 ml) [~1M] je napunjen tokom 10 minuta na T<30 °C (egzotermno) dajući precipitat. Šarža je ohlađena na 0-5 °C i filtrirana. Čvrste materije su isprane vodom (3x12 l) i osušene u pećnici (50 °C) da bi se dobilo 325,6 g dikiseline KI-7. HPLC:
98,9%; nmR >95%. Korigovani prinos (90,6%).
5-(3-(3-Metoksikarbonil-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dibenziloksibenzamido)-2-hidroksibenzoeva kiselina metil estar. U posudu sa omotačem od 2 l sipana je dijakiselina KI-7 (80 g, 211 mmol), HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum heksafluorofosfat) (176,8 g, 466 mmol) i THF (560 ml). Šarža je mešana na 15-25 °C i dodat je N-metilimidazol (50,6 ml, 635 mmol). Posle 30 minuta, stavljen je metil 5-amino-2-hidroksibenzoat (77,8 g, 466 mmol) i reakcija je mešana na 25 °C preko noći. Dodata je voda (1,2 l) i šarža je mešana na 20 °C tokom 30 minuta. Šarža je filtrirana, isprana vodom
(2x480 ml), zatim MeCN (320 ml). Dobijena čvrsta supstanca (236 g) je napunjena nazad u posudu zajedno sa MeCN (800 ml). Suspenzija je zagrevana na 50 °C tokom 40 minuta, a zatim ohlađena na 20 °C. Šarža je filtrirana i isprana sa MeCN (320 ml). nmR analiza čvrste supstance (156 g) je pokazala da nema TMU, HOBt, nmI ili HBTU. Materijal je sušen na 50 °C preko noći da bi se dobilo 125 g dijamida. HPLC: 98,2%. nmR: >97%. Prinos: 88%.
5-(3-(3-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dibenziloksibenzamido)-2-hidroksibenzoeva kiselina. U posudu sa omotačem od 2 l napunjen je prethodni diamid (110 g, 163 mmol), THF (550 ml) i voda (1100 ml). Šarža je mešana na 15-25 °C i napunjen 85% KOH (32,2 g, 488 mmol) (mala egzotermna). Rastvor je zagrevan na 50 °C tokom 4h, zatim ohlađen na 20 °C i mešan preko noći.6M vod. AcOH (550 ml, 3,3 mol) je zatim napunjen tokom 30 minuta na 15-25 °C. Nakon što je dodavanje završeno, šarža je mešana 30 minuta i zatim filtrirana. Čvrste materije su isprane vodom (3x550 ml), a zatim osušene u pećnici na 50 °C. Ovo je dalo 102 g besplatne dijakiseline. HPLC:
98,9% (0,3% mono-amid, 0,19% monokiselina). nmR: >97%. Prinos: 97%.
5-(3-(3-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeva kiselina IIc-007a. U posudu od 2 l sa omotačem pod N2 sipano je 10% Pd/C (10 g, 50% vlažno, tip 87L), a zatim prethodna dijakiselina (100 g, 154 mmol), AcOH (5 ml, 88 mmol) i THF (1200 ml). Šarža je mešana, a zatim prskana sa H2 i zagrevana na 40 °C tokom 2 sata.
Šarža je prskana sa N2 i zatim filtrirana (GF/F). Posuda je isprana sa THF (300 ml) i ispiranje je korišćeno za pranje katalizatora na filteru. Filtrat je napunjen u posudu i zapremina je podešena na 2 l sa THF (400 ml). Rastvor je zagrejan na 30 °C, napunjen je SPM32 (10 g), a šarža je mešana na 30 °C preko noći. SPM32 je filtriran i ispran sa THF (200 ml). Rastvarač je uklonjen in vacuo da bi se dobila svetlo žuta čvrsta supstanca (110 g). nmR analiza je pokazala 28% THF. Materijal je suspendovan u EtOH (1 l) na 20 °C tokom 2 sata i zatim filtriran. Čvrste materije su isprane sa EtOH (400 ml) i sušene u pećnici na 60 °C preko noći. nmR je pokazao 8,7% EtOH, bez THF. Materijal je dalje sušen na 80 °C tokom 4 noći da bi se dobilo 66,5 g IIc-007a kao prljavo bele čvrste supstance u prinosu od 92%. HPLC: 99,5% (0,31% monoamid). nmR: 4,6% EtOH, bez THF. Pd od ICP-OES: <2 ppm.
IIc-007a-THF solvat: Koncentrovanje THF filtrata daje žutu čvrstu supstancu, tipično koja sadrži 25-30% THF prema nmR, koja se ne može ukloniti sušenjem, što ukazuje na nestehiometrijski solvat. Mali uzorak THF solvata (1,45 g) je zagrevan na 50 °C u THF (10 ml) tokom 1 sata, ohlađen na sobnu temperaturu i izolovan, ispran sa 3 ml THF. Ovo je dalo 1,13 g IIc-007a-THF. nmR: 27% THF. HPLC: 99,6% (0,1% monoamid). Izolovanje THF solvata filtracijom dovodi do povećanja čistoće i efikasnog čišćenja glavne nečistoće (monoamid, IIa-004a) sa 0,7% na 0,1%. Prinos oporavka: 78%. Rastvorljivost THF solvata u THF izračunata kao ~25 mg/ml na 20 °C.
Probe desolvatacije su izvedene na materijalu u acetonu, EtOH i EtOAc. Svaka serija je zagrevana 1 sat na 50 °C u 20 vol. rastvarača, zatim izolovana na sobnoj temperaturi i osušena u pećnici (60 °C). Etanol je izabran kao rastvarač za desolvataciju zbog niskog nivoa EtOH ugrađenog u proizvod nakon sušenja i odličnog čišćenja THF iz sistema. Korak desolvatacije je izveden na 12,1 g proizvoda (25% THF). U materijal je napunjen EtOH (20 vol.) i šarža je mešana na ST preko noći. Uzorak je filtriran i to je ukazivalo na uspešnu desolvataciju na sobnoj temperaturi. Ukupan prinos: 8,67 g. HPLC: 99,4%. nmR: >97% (0,8% EtOH). XRPD je pokazao visok stepen kristalnosti izolovanog proizvoda.
Proizvod IIc-007a takođe formira DMSO solvate (DMSO:proizvod u odnosu 3:2).
51) 2-(3-(2-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-5-hidroksilbenzoeva kiselina, jedinjenje IIc-009a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,79 min; m/z = 469,1 [M+H]<+>, površina vrha >95%
<1>H nmR (400 MHz, DMF-d7) δ 10,11 (s,1H), 10,01 (s,2H), 8,71 (d, J = 9,0 Hz , 2H), 8,01 (s, 2H), 7,82 (d, J = 3,0 Hz , 2H), 7,46 (d, J = 8,9 Hz , 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C22H17N2O10: 469,08777, pronađeno: 469,08714
Biološki podaci: IIc-009a: FGF-1 IC50 [µM] = 30; FGF-2 IC50 [µM] =N.D.; VEGF-A1 IC50 [µM] = 182; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =1,7; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 75,31; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] =ND; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 53,15; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNγ IC50 [µM] = 0,54; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = 19,6; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 0,27; IL-9 IC50 [µM] = 18,9; IL-10 IC50 [µM] = 11,31; IL-12p70 IC50 [µM] = >100; IL-13 IC50 [µM] = 0,13; IL-17A IC50 [µM] = 0,001; IL-17F IC50 [µM] = 0,13; IL-18 IC50 [µM] = 2,95; IL-21 IC50 [µM] = 8,01; IL-33 IC50 [µM] = 0,29; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,11; TNF β IC50 [µM] = 6,94.
Primer 1.8: molekuli tipa Illa: Monoamidi, 4 primera
Sinteza prekursora)
Šema 13. Sintetički intermedijari: KI-8 i KI-9 iz KI-1
Sintetički protokoli
Intermedijari KI-8 i KI-9 (preko KI-10 i KI-11)
Etil 2,5-bis(benziloksi)-4-(hidroksimetil)benzoat (KI-10) [Korak 1]: U ohlađeni rastvor na -20 °C HI-1 (62,3 g, 153 mmol) u THF (700 ml) pod pozitivnim protokom inertnog gasa (N2) polako je dodat prethodno ohlađen rastvor BH3.THF (615,0 ml, 615 mmol) (na -10 °C). Dodavanje je obavljeno na način da unutrašnja temperatura reakcije nikada nije prelazila -15 °C. Reakcija je blago zagrejana, unutrašnja temperatura nije dozvoljena da pređe -7 °C. Smeša je održavana na ovoj temperaturi 2,5 h. Reakciona smeša je zatim sipana u led/vodu (8 l). Dobijene mutne bele smeše su ostavljene da se mešaju na sobnoj temperaturi tokom 2 h, a zaostala bela suspenzija je filtrirana kroz levak (Poroznost 3). Ovako dobijena bela čvrsta supstanca je dalje osušena u vakuum pećnici na 40 °C preko noći, da bi se dobio etil 2,5-bis(benziloksi)-4-(hidroksimetil)benzoat (HI-10) (60,5 g, 97% prinos) kao bela čvrsta materija.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,25 min; m/z = 391,2 [M-H]-, površina vrha >68%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,54 - 7,48 (m, 2H), 7,48 - 7,43 (m, 2H), 7,43 - 7,35 (m, 4H), 7,35 - 7,27 (m, 4H), 5,28 (t, J = 5,4 Hz , 1H), 5,13 (s, 2H), 5,11 (s, 2H), 4,58 (d, J = 5,4 Hz , 2H), 4,25 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 1,26 (t, J =
7,1 Hz , 3H).
Alternativno, intermedijer KI-10 se može dobiti iz KI-1 putem mešanog anhidrida (tretman KI-1 sa izobutilhloroformatom u THF u prisustvu trietilamina) nakon čega sledi redukcija mešanog anhidrida sa natrijum borohidridom u THF (prinosi 85-90%, 150 g-skala).
Etil 2,5-bis(benziloksi)-4-(hlorometil)benzoat (KI-11) [Korak 2]: Tozil hlorid (17,0 g, 70 mmol) je polako dodat u ohlađeni rastvor (ledeno kupatilo) KI-10 (25,0 g, 64 mmol), DIPEA (12,2 ml, 70 mmol) i DMAP (0,778 g, 6 mmol) u DCM (260 ml). Reakciona smeša je mešana na 60 °C tokom 30 h, nakon čega je ocenjeno da je reakcija završena. Dodat je DCM (100 ml) i organski sloj je odvojen, ispran zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogenkarbonata (4 × 50 ml), vodom (2 × 50 ml) i slanim rastvorom (50 ml), osušen preko natrijum sulfata i koncentrovan. Sirovi proizvod je podvrgnut hromatografiji na koloni (Heksan/EtOAc 0-20%) da bi se dobio etil 2,5-bis(benziloksi)-4-(hlorometil)benzoat (KI-11) (23,5 g, 75%).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,39 min; m/z = bez jona, površina vrha >84%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,54 - 7,44 (m, 4H), 7,43 - 7,36 (m, 6H), 7,36 - 7,28 (m, 2H), 5,18 (s, 2H), 5,13 (s, 2H), 4,76 (s, 2H), 4,26 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 1,25 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
Alternativno, intermedijer KI-11 se može dobiti tretiranjem KI-10 sa tionil hloridom (1,14 ek.) u dihlorometanu na -10 °C, zatim isparavanjem rastvarača i precipitacijom iz heptana (prinos 90%, skala od 300 g)
Etil 2,5-bis(benziloksi)-4-(cijanometil)benzoat [Korak 3]: Suspenzija KI-11 (7,5 g, 18,2 mmol) u smeši EtOH (90 ml) i H2O(45 ml) je tretirana sa kalijum cijanidom (1,8 g, 27,4 mmol). Reakciona smeša je zagrejana do 75 °C i mešana na ovoj temperaturi 16 h. Reakciona smeša je razblažena vodom (500 ml) i ekstrahovana sa EtOAc (2 × 200 ml), kombinovane organske faze su zatim isprane slanim rastvorom (200 ml), osušene preko natrijum sulfata, filtrirane i koncentrovane u vakuumu. Sirovi proizvod je izolovan kao smeša etil 2,5-bis(benziloksi)-4-(cijanometil)benzoata i 2,5-bis(benziloksi)-4-(cijanometil)benzojeve kiseline (7,1 g), proizvod se koristi se u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,30 min; m/z = 402,2 [M+H]<+>, površina vrha >65% i rt = 1,15 min; m/z = 374,1 [M+H]<+>, površina vrha >8%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,56 - 7,27 (m, 12H), 5,19 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 4,26 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 3,95 (s, 2H), 1,25 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
2,5-bis(benziloksi)-4-(karboksimetil)benzoeva kiselina (KI-9) [Korak 4]: U suspenziju etil 2,5-bis(benziloksi)-4-(cijanometil)benzoata (7,1 g, 13,2 mmol) u EtOH (20 ml) dodat je rastvor natrijum hidroksida (8,5 g, 212,5 mmol) u vodi ( 50 ml) i reakciona smeša je mešana pod refluksom 18 h. Reakciona smeša je razblažena vodom (100 ml) i dobijeni rastvor je ispran sa EtOAc (2 × 100 ml), tako dobijeni organski sloj je ekstrahovan vodom (100 ml) i svi vodeni slojevi su sakupljeni. Zatim je vodeni sloj zakiseljen do pH ∼ 3 sa zasićenim vodenim rastvorom limunske kiseline, formirani talog je filtriran i osušen pod sniženim pritiskom. Čvrsta supstanca je dalje osušena u vakuum peći na 40 °C preko noći da bi se dobila 2,5-bis(benziloksi)-4-(karboksimetil)benzoeva kiselina (KI-9) (6,4 g, 92% prinos) kao žućkasta čvrsta supstanca.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,07 min; m/z = 393,2 [M+H]<+>, površina vrha >74%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,46 (s, 2H), 7,55 - 7,27 (m, 11H), 7,19 (s, 1H), 5,11 (s, 2H), 5,09 (s, 2H), 3,61 (s, 2H).
2,5-bis(benziloksi)-4-(2-etoksikarbonilmetil)benzoeva kiselina (KI-8) [Korak 5]: KI-9 (5,5 g, 14,0 mmol) je suspendovan u EtOH (30 ml) i suspenzija je tretirana sa tionil hloridom (0,52 ml, 7,1 mmol) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 24 h. Zatim je reakciona smeša sipana u zasićeni rastvor natrijum bikarbonata (1 l), što je dovelo do bele suspenzije. Čvrsta supstanca je izolovana filtracijom i dalje triturirana sa Et2O (2 × 20 ml). Čvrsta supstanca je dalje osušena u vakuum peći preko noći da bi se dobila 2,5-bis(benziloksi)-4-(2-etoksikarbonilmetil)benzoeva kiselina (KI-8) (4,2 g, 64%) kao bela čvrsta supstanca.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,23 min; m/z = 419,3 [M-H]-, površina vrha >79%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,68 (brs, 1H), 7,58 - 7,27 (m, 11H), 7,19 (s, 1H), 5,11 (s, 2H), 5,08 (s, 2H), 4,01 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 3,66 (s, 2H), 1,11 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
Sinteza monoamida
Šema 14. Sinteza monoamida IIIa
Sintetički protokoli
Postupci spajanja amida i uklanjanja zaštite:
Pogledajte opšte procedure iz koraka KI-1 i KI-6 [3], [4], [5]
Primeri
Za uslove i prinose: Pogledajte tabelu 3 (Slika 6)
52) 2-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)benzoeva kiselina, jedinjenje IIIa-001a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,89 min; m/z = 332,1 [M+H]<+>, površina vrha >98%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,38 (s, 1H), 12,17 (s, 1H), 10,67 (s, 1H), 9,23 (s, 1H), 8,64 (dd, J = 8,5, 1,2 Hz , 1H), 8,00 (dd, J = 7,9, 1,7 Hz , 1H), 7,62 (ddd, J = 8,7, 7,3, 1,7 Hz , 1H), 7,33 (s, 1H), 7,19 (td, J = 7,6, 1,2 Hz , 1H), 6,80 (s, 1H), 3,49 (s, 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H14NO7: 332,07648, pronađeno: 332,07666 Biološki podaci: IIIa-001a: FGF-1 IC50 [µM] = 62; FGF-2 IC50 [µM] = 10; VEGF-A1 IC50 [µM] = 32; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =ND; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 74,79; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 30,4
Etil metil estar
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,14 min; m/z = 374,2 [M+H]<+>, površina vrha >96%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,91 (s, 1H), 10,78 (s, 1H), 9,25 (s, 1H), 8,60 (dd, J = 8,5, 1,2 Hz , 1H), 7,97 (dd, J = 8,0, 1,7 Hz , 1H), 7,64 (ddd, J = 8,7, 7,3, 1,7 Hz , 1H), 7,38 (s, 1H), 7,26 - 7,18 (m, 1H), 6,81 (s, 1H), 4,08 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 3,88 (s, 3H), 3,56 (s, 2H), 1,19 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C19H20NO7: 374,12342, pronađeno: 374,12333
Biološki podaci: IIIa-001a-E2: FGF-1 IC50 [µM] = 200; FGF-2 IC50 [µM] = 33; VEGF-A1 IC50 [µM] = 43; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =ND; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 69,66; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 44,46
53) (2-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetna kiselina, jedinjenje IIIa-001aTz:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,87 min; m/z = 356,1 [M+H], površina vrha >95%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,22 (s, 1H), 11,43 (s, 1H), 10,74 (s, 1H), 9,21 (s, 1H), 8,46 (dd, J = 8,5, 1,2 Hz , 1H), 7,87 (d, J = 8,1 Hz , 1H), 7,60 (td, J = 8,6, 7,9, 1,6 Hz , 1H), 7,39 - 7,30 (m, 2H), 6,80 (s, 1H), 3,48 (s, 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H14N5O5: 356,09894, pronađeno: 356,09889
Biološki podaci: IIIa-001aTz: FGF-1 IC50 [µM] = 51; FGF-2 IC50 [µM] = 14; VEGF-A1 IC50 [µM] = 12; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,71; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 69,35; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 39,74; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNγIC50 [µM] = 18,9; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = >100; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 1,98; IL-9 IC50 [µM] = 3,01; IL-10 IC50 [µM] = 7,78; IL-12p70 IC50 [µM] = 0,48; IL-13 IC50 [µM] = 0,15; IL-17A IC50 [µM] = 0,17; IL-17F IC50 [µM] = 0,16; IL-18 IC50 [µM] = 27,7; IL-21 IC50 [µM] = 3; IL-33 IC50 [µM] = 0,14; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,31; TNF β IC50 [µM] = 0,23.
Etil estar:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,56 min; m/z = 384,2 [M+H]<+>, površina vrha >95%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,34 (s, 1H), 10,73 (s, 1H), 9,25 (s, 1H), 8,45 (dd, J = 8,5, 1,2 Hz , 1H), 7,85 (dd, J = 7,8, 1,6 Hz , 1H), 7,61 (ddd, J = 8,7, 7,4, 1,6 Hz , 1H), 7,39 - 7,30 (m, 2H), 6,80 (s, 1H), 4,08 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 3,56 (s, 2H), 1,19 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C18H18N5O5: 384,13024, pronađeno: 384,12999
Biološki podaci: IIIa-001aTz-E1: FGF-1 IC50 [µM] = 200; FGF-2 IC50 [µM] = 200; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,32; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 70,03; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 91,76
54) 2-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalna kiselina, jedinjenje IIIa-013a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,82 min; m/z = 376.0 [M+H]<+>, površina vrha >89%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,67 - 11,48 (m, 3H), 10,82 (s, 1H), 9,19 (s, 1H), 7,95 (d, J = 7,8 Hz , 2H), 7,36 (s, 1H), 7,33 (t, J = 7,8 Hz , 1H), 6,79 (s, 1H), 3,48 (s, 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C17H14NO9: 376,06630, pronađeno: 376,06638 Biološki podaci: IIIa-013a: FGF-1 IC50 [µM] = 17; FGF-2 IC50 [µM] = 31; VEGF-A1 IC50 [µM] = 43; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =1,3; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 76,55; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 30,667; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = 27,8; IFNγ IC50 [µM] = 0,15; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = 57,1; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 3,55; IL-9 IC50 [µM] = 11,9; IL-10 IC50 [µM] = 37,3; IL-12p70 IC50 [µM] = 0,5; IL-13 IC50 [µM] = 0,37; IL-17A IC50 [µM] = 0,15; IL-17F IC50 [µM] = 0,41; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = 1,63; IL-33 IC50 [µM] = 1,11; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,51; TNF β IC50 [µM] = 0,89.
55) 5-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalna kiselina, jedinjenje IIIa-015a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,93 min; m/z = 376,0 [M+H]<+>, površina vrha >96%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6+10% D2O) δ 8,34 (s, 2H), 8,18 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 6,71 (s, 1H), 3,39 (s, 2H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C17H14NO9: 376,06630, pronađeno: 376,06665
Biološki podaci: IIIa-015a: FGF-1 IC50 [µM] = 16; FGF-2 IC50 [µM] = 114; VEGF-A1 IC50 [µM] = 202; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =0,89; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 78,76; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 12,13
Etil dimetil estar
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,69 min; m/z = 432,1 [M+H]<+>, površina vrha >97%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,23 (s, 1H), 8,58 (s, 1H), 8,58 (s, 1H), 8,23 - 8,21 (m, 1H), 7,31 (s, 1H), 6,81 (s, 1H), 4,08 (q, J = 7,0 Hz , 2H), 3,91 (s, 6H), 3,58 (s, 2H), 1,19 (t, J = 7,1 Hz , 3H), HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C21H22NO9: 432,12891, pronađeno: 432,02903
Biološki podaci: IIIa-015a-E3: FGF-1 IC50 [µM] =N.D.; FGF-2 IC50 [µM] = 191; VEGF-A1 IC50 [µM] = 87; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =7,2; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 91,37; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 61,22
Primer 1.9. molekuli tipa IIIb: Diamidi iz diamina, 1 primer
Šema 15. Sinteza diamida tipa IIIb
Procedura: pogledajte opštu proceduru iz KI-1 koraka [3], [4], [5]
Na primer:
Za uslove i prinose: Pogledajte tabelu 3 (Slika 6)
56) 3,5-bis(2,5-dihidroksi-4-karboksimetilbenzoilamino)benzoeva kiselina, jedinjenje IIIb-010a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,08 min; m/z = 539.2.1 [MH]-, površina vrha 80%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,85 (brs, 2H), 10,57 (brs, 2H), 9,20 (s, 2H), 8,26 (m, 1H), 8,09 (d, J = 2,0 Hz , 2H), 7,36 (s, 2H), 6,82 (s, 2H), 3,50 (s, 4H).
HRMS: [M+H]+, izrač. za C23H17N2O12: 513,07760, pronađeno:
513,07774
Trietil estar
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,81 min; m/z = 623,3 [M-H]-, površina vrha 94%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,87 (s, 2H), 10,65 (s, 2H), 9,23 (s, 2H), 8,31 - 8,28 (m, 1H), 8,10 (d, J = 2,0 Hz , 2H), 7,35 (s, 2H), 6,81 (s, 2H), 4,35 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 4,08 (q, J = 7,1 Hz , 4H), 3,58 (s, 4H), 1,35 (t, J = 7,1 Hz , 3H), 1,19 (t, J = 7,1 Hz , 6H).
Biološki podaci: IIIb-010a-E3: FGF-1 IC50 [µM] = 200; FGF-2 IC50 [µM] = 200; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,65; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = ND; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 0
Primer 1.10: molEKULI TIPA IIIc. Dimeri, 6 primera
Sintetičke šeme i procedure
Šema 16. X=O
Opšte sintetičke procedure:
Formiranje etarske veze iz KI-10 i KI-11
Etil 2,5-dibenziloksi-4-[(2,5-dibenziloksi-4-etoksikarbonifenil)metoksimetil]benzoat [Korak 1]: U rastvor HI-11 (340 mg, 0,83 mmol) i KI-10 (250 mg, 0,64 mmol) u DMF (6 ml), ohlađenom u ledenom kupatilu, dodat je u porcijama natrijum hidrid (76 mg, 1,9 mmol). Posle 1 h, reakciona smeša je sipana u zasićeni vodeni rastvor amonijum hlorida (50 ml) i materijal je ekstrahovan sa EtOAc (3 × 30 ml), organska faza je dalje isprana vodom (2 × 50 ml) i rastvorom soli (50 ml), osušenim natrijum sulfatom i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (Heksan/EtOAc 0 do 20%) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (161 mg, 33% prinos) kao braon čvrsta supstanca.
Procedure uklanjanja zaštite:
Videti Opšte procedure [4], [5]
Za primere
Za uslove i prinose: Pogledajte tabelu 4 (ukidanje zaštite) (Slika 7)
57) 4-((2,5-dihidroksi-4-karboksifenil)metoksimetil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IIIc-060a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,94 min; m/z = 349,1 [M-H]-, površina vrha >90%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,20 (s, 2H), 6,92 (s, 2H), 4,56 (s, 4H),
Biološki podaci: IIIc-060a: FGF-1 IC50 [µM] = 200; FGF-2 IC50 [µM] = 51; VEGF-A1 IC50 [µM] = 114; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =1,3; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 86,84; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 41,38
Opšte sintetičke procedure:
Formiranje aminske veze iz KI-12 i KI-13 preko KI-10 i KI-11
Etil 2,5-bis(benziloksi)-4-formilbenzoat (KI-12): U rastvor KI-10 (3,4 g, 8,6 mmol) u dihlorometanu (50 ml) dodat je mangan dioksid (4,5 g, 51,9 mmol). Dobijena suspenzija je mešana pod refluksom 4 h. Reakcija je filtrirana kroz jastučić Celite<®>i čvrsta supstanca je isprana dihlorometanom (300 ml), rastvarač je zatim uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (3,2 g, 94% prinos) kao žućkasta čvrsta supstanca.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,33 min; m/z = bez jona, površina vrha >93%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,39 (s, 1H), 7,56 (s, 1H), 7,54 - 7,26 (m, 11H), 5,28 (s, 2H), 5,20 (s, 2H), 4,30 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
Etil 4-(azidometil)-2,5-bis(benziloksi)benzoat: U suspenziju KI-10 (3,0 g, 7,6 mmol) i 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-ena (DBU) (1,5 ml, 9,9 mmol) u toluenu (30 ml) je dodat difenil fosforil azid (DPPA) (2 ml, 9,1 mmol). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 h. Dodan je vodeni rastvor 1M hlorovodonika (200 ml) i proizvod je ekstrahovan sa EtOAc (3 × 100 ml), kombinovani organski slojevi su isprani vodom (2 × 50 ml), osušeni preko natrijum sulfata i koncentrovani pod smanjenim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (Heksan/EtOAc 0 do 20%) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (3,1 g, 98%) kao bezbojno ulje koje je vremenom postalo bela
čvrsta supstanca.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,37 min; m/z = 390,2, [M+HN2]<+>, površina vrha >93%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,53 - 7,46 (m, 4H), 7,44 - 7,26 (m, 8H), 5,16 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 4,48 (s, 2H), 4,26 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 1,25 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
Etil 4-(aminometil)-2,5-bis(benziloksi)benzoat (KI-13): U rastvor etil 4-(azidometil)-2,5-bis(benziloksi)benzoata (2,8 g, 6,7 mmol) u THF (60 ml) i vodi (6 ml) dodat je polimerom vezan trifenilfosfin (4,7 g, ~3 mmol/g punjenja) i dobijena smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi 18 h. Smola je uklonjena filtracijom i isprana vodom (100 ml) i EtOAc (2 × 100 ml). Faze su razdvojene, a vodeni sloj je dalje ekstrahovan sa EtOAc (100 ml), sakupljeni organski slojevi su isprani slanim rastvorom (200 ml), osušeni preko natrijum sulfata i koncentrovani da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (KI-13) (1,8 g, 70% prinos) kao bela čvrsta supstanca.
UPLC-MS (osnovni postupak, 2 min): rt = 1,20 min; m/z = 392,2, [M+H]<+>, površina vrha >93%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,60 - 7,22 (m, 12H), 5,14 (s, 2H), 5,10 (s, 2H), 4,24 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 3,75 (s, 2H), 1,25 (t, J= 7,1 Hz , 3H).
Etil 2,5-dibenziloksi-4-[(2,5-dibenziloksi-4-etoksikarbonilfenil)metilaminometil] benzoat: KI-12 (500 mg, 1,3 mmol) i KI-13 (641 mg, 1,6 mmol) rastvoreni su u DCM (35 ml) nakon čega je usledilo dodavanje aktiviranih molekularnih sita (10 kuglica). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 5 h. Zatim je dodat natrijum triacetoksiborohidrid (654 mg, 3,1 mmol) i dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 h. Dodat je DCM (25 ml), reakciona smeša je dekantirana u levak za odvajanje i isprana vodom (50 ml), osušena natrijum sulfatom i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni ((Heksan/EtOAc 0 do 50%) da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje (631 mg, 64% prinos) kao bezbojno ulje koje je vremenom postalo čvrsto.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,37 min; m/z = 766,3, [M+H]<+>, površina vrha >92%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,47 - 7,42 (m, 4H), 7,38 - 7,25 (m, 20H), 5,08 (s, 4H), 5,04 (s, 4H), 4,25 (q, J = 7,1 Hz , 4H), 3,76 (s, 4H), 1,25 (t, J = 7,1 Hz , 6H).
Procedure uklanjanja zaštite: Videti Opšte procedure [4], [5]
Za uslove i prinose: Videti Sliku 7.
Za primere
58) Bis(4-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)amin, jedinjenje IIIc-056a:
OPUPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,57 min; m/z = 350,0 [M+H]<+>, površina vrha >96%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,97 (s, 2H), 9,08 (s, 2H), 7,31 (s, 2H), 7,02 (s, 2H), 4,11 (s, 4H). HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H16NO8: 350,08704, pronađeno: 350,08706
Biološki podaci: IIIc-056a: FGF-1 IC50 [µM] = 200; FGF-2 IC50 [µM] = 35; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =ND; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 90,07; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 35
Šema 18. X = NAc
Opšte sintetičke procedure:
N,N-bis-[2,5-dibenziloksi-4-etoksikarbonilfenilmetil]acetamid: U rastvor N,N-bis-[2,5-dibenziloksi-4-etoksikarbonilfenilmetil]amina (300 mg, 0,39 mmol) i piridina (0,2 ml, 2,4 mmol) u DCM (6 ml), u atmosferi azota, je dodat anhidrid sirćetne kiseline (0,2 ml, 2,1 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1 h i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (Heksan/EtOAc, 0 do 50 %) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (316 mg, 92% prinos) kao bezbojno ulje.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,44 min; m/z = 808,2 [M+H]<+>, površina vrha >95%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,49 - 7,17 (m, 22H), 6,92 (s, 1H), 6,72 (s, 1H), 5,03 (s, 2H), 5,00 (s, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,94 (s, 2H), 4,46 (s, 4H), 4,31 -4,16 (m, 4H), 1,96 (s, 3H), 1,28 - 1,20 (m, 6H).
Procedure uklanjanja zaštite:
Videti Opšte procedure [4], [5]
Za primere
Za uslove i prinose: Pogledajte sliku 7 (ukidanje zaštite)
59) N,N-Bis(4-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)acetamid, jedinjenje IIIc-057a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,84 min; m/z = 392,1 [M+H]<+>, površina vrha >99%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,50 (s, 1H), 9,34 (s, 1H), 7,22 (s, 1H), 7,17 (s, 1H), 6,63 (s, 1H), 6,53 (s, 1H), 4,48 (s, 2H), 4,39 (s, 2H), 2,11 (s, 3H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C18H18NO9: 392,09761, pronađeno: 392,09766
Biološki podaci: IIIc-057a: FGF-1 IC50 [µM] = 87; FGF-2 IC50 [µM] = 77; VEGF-A1 IC50 [µM] = 38; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,2; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 90,34; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 40,04; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNγ IC50 [µM] = 0,9; IL-1β IC50 [µM] = 16,2; IL-2 IC50 [µM] = 24,2; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 0,19; IL-9 IC50 [µM] = 11,1; IL-10 IC50 [µM] = >100; IL-12p70 IC50 [µM] = 0,73; IL-13 IC50 [µM] = 4,73; IL-17A IC50 [µM] = 1,32; IL-17F IC50 [µM] = 5,06; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = 1,56; IL-33 IC50 [µM] = 2,93; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,15; TNF β IC50 [µM] = 1,58.
Opšte sintetičke procedure:
Formiranje tercijarnog amina iz KI-11 i NH3
Tris(4-etoksikarboni-2,5-dibenziloksifenilmetil)amin: Zapečaćena epruveta je napunjena sa KI-11 (32,5 g, 79 mmol), natrijum jodidom (0,79 g, 5 mmol), rastvorom amonijaka u MeOH (7 N) (38 ml, 264 mmol) i EtOAc (80 ml). Epruveta je zatim zatvorena i reakciona smeša je zagrevana na 60 °C tokom 24 h. Posle 24 h, početni materijal (KI-11) je potrošen i reakciona smeša je sadržala željeni proizvod ali i monomerne i dimerne strukture. Dodata je voda (100 ml) i dobijena smeša je ekstrahovana sa EtOAc (3 × 100 ml), prikupljeni organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je rastvoren u EtOAc (165 ml) i dodani su KI-11 (2,5 g, 6 mmol), natrijum jodid (0,79 g, 5 mmol), DIPEA (10 ml, 58 mmol) i dobijeni rastvor je zagrevan na 60 °C. Posle 18 h, dodata je voda (100 ml) i dobijena smeša je ekstrahovana sa EtOAc (3 × 100 ml), prikupljeni organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen rekristalizacijom korišćenjem EtOH/EtOAc 95/5 (20 ml) kao rastvarača da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (15,0 g, 50%) u vidu belih kristala.
UPLC-MS (osnovni postupak, 2 min): rt = 1,71 min; m/z = 1140,3 [M+H]<+>, površina vrha >99%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 6,56 - 6,49 (m, 12H), 6,48 - 6,38 (m, 24H), 4,22 (s, 6H), 4,04 (s, 6H), 3,42 (q, J = 7,1 Hz , 6H), 3,00 (s, 6H), 0,42 (t, J = 7,1 Hz , 9H).
Alternativno, proizvod se može prečistiti fleš hromatografijom na silika gel koloni: razmera, do 270 g; Instrument: Combiflash Torrent; kertridž: RediSep kolona, silika 3 kg; tip učitavanja: Sirov rastvor rastvoren u 1 l heptana:toluena (1:1). Eluiranje sa etil acetatom/heptanom. Otkrivanje: UV - 240 nm
Procedure uklanjanja zaštite: Videti Opšte procedure [4], [5]
Za uslove i prinose: Pogledajte sliku 7 (ukidanje zaštite)
Alternativni postupci uklanjanja zaštite velikih razmera:
Saponifikacija. Tris(4-etoksikarboni-2,5-dibenziloksifenilmetil)amin (95,00 g, 0,083 mol), natrijum hidroksid (40,00 g, 0,99 mol), voda (570 ml) i tetrahidrofuran (1,9 l) dodati su u balon sa okruglim dnom od 5 l. Reakciona smeša je zagrevana, korišćenjem temperaturnog bloka, na 80 °C (temperatura refluksa je bila 65 °C) tokom 48h, a zatim je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24h. Rastvarači su zatim uklonjeni u vakuumu. Sirovi materijal je sakupljen i dalje razblažen vodom (2,85 l). U drugom balonu od 10 l, mešavina sirćetne kiseline (180 ml) i vode (950 ml) je mešana na sobnoj temperaturi. Smeša sirovog proizvoda u vodi je dodata u smešu sirćetne kiseline tokom perioda od 30 min. uz mešanje gornjom mešalicom i istaloži se kremasta čvrsta supstanca. Reakciona smeša je mešana još 1 h i čvrsta supstanca je izolovana posle filtracije; pH matične tečnosti je bio 4,2. Izolovana čvrsta supstanca je mešana sa vodom (1425 ml) tokom 1 h, a zatim filtrirana. pH matične tečnosti je bio 4,5. Dobijena čvrsta supstanca je mešana sa još vode (1425 ml) tokom 1 h, a zatim filtrirana; pH matične tečnosti je bio 4,5. Gornja čvrsta supstanca je mešana sa acetonom (950 ml) tokom 1 h i filtrirana. Supstanca krem boje je sušena u vakuum pećnici na 50 °C tokom 48 h pre analize (82,00 g, 93% prinos) (prinosi variraju između 90-95%).
Napomena: pH je kritičan parametar tokom pranja kako bi se proizvod održao u obliku slobodne kiseline i uklonio višak sirćetne kiseline iz proizvoda.
Idealan pH: 4,2 do 4,5 (konačni sadržaj natrijuma varira između 2ppm-20ppm).
Hidrogenoliza i izolacija. Tris(4-karboksi-2,5-dibenziloksifenilmetil)amin (58,00 g, 54,00 mmol, lek) i tetrahidrofuran (1160 ml) su stavljeni u balon sa okruglim dnom od 2 l. Smeša je degazirana azotom, zatim isprana ciklusom vodonik/vakum 4-5 puta. Paladijum na ugljeniku (JM 10% 424 Pd/C, 70 g, 15% punjenje) je dodat u reakcionu smešu i mešan na 25 °C tokom 5-6h. Reakcija je zatim degazirana i katalizator je uklonjen filtracijom kroz sloj celita, koji je ispran tetrahidrofuranom (3×1160 ml). Na kraju, filtrati su koncentrovani pod sniženim pritiskom. Sirova čvrsta supstanca je sakupljena, mešana sa heptanom (1160 ml) i filtrirana da bi se dobila siva čvrsta supstanca, koja je osušena u vakuum pećnici na 50 °C preko noći (32,50 g, >100 % prinos na sirovoj bazi). Sakupljeni sirovi materijal je rastvoren u etanolu (325 ml) i zagrejan do 60 °C (bistar rastvor). Zatim je polako dodavana voda (325 ml) na 60 °C (održavajući temperaturu najmanje na 50 °C tokom dodavanja) tokom perioda od 15-20 min. U ovoj fazi primećena je mutna tečnost. Zamućena reakciona smeša je mešana na temperaturi refluksa 30 min.
Posle ovog vremena, reakciona smeša je ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu još 30 min. Precipitirana čvrsta supstanca je izolovana nakon filtracije i isprana 1:1 smešom etanol:voda (66 ml). Čvrsta supstanca je sušena u vakuum pećnici na 50 °C najmanje 72 h pre analize, da bi se dobio željeni proizvod IIIc-061a (22,00 g, 76% prinos) (prinos varira između 65-75%).
LCMS: >95%, nmR: >95% čistoće.
Tris(4-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)amin, jedinjenje IIIc-061a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,74 min; m/z = 516,0 [M+H]<+>, površina vrha >86%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,27 (s, 3H), 6,83 (s, 3H), 4,33 (s, 6H).
<13>C nmR (100 MHz, DMSO-d6) δ 172,0, 154,3, 148,3, 134, 117,8 (CH), 114,9 (CH), 112,4, 53,6 (CH2). HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C24H22NO12: 516,11365, pronađeno: 516,11389
Biološki podaci: IIIc-061a: FGF-1 IC50 [µM] = 9; FGF-2 IC50 [µM] = 7,6; VEGF-A1 IC50 [µM] = 21; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =4,3; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 92,5; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] =ND;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 58,69; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = 31,2; IFNγ IC50 [µM] = 2,48; IL-1β IC50 [µM] = >100; IL-2 IC50 [µM] = >100; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 0,18; IL-9 IC50 [µM] = 8,85; IL-10 IC50 [µM] = 17,9; IL-12p70 IC50 [uM] = 37,2; IL-13 IC50 [µM] = 0,31; IL-17A IC50 [µM] = 0,04; IL-17F IC50 [µM] = 0,32; IL-18 IC50 [µM] = 32,4; IL-21 IC50 [µM] = 6,38; IL-33 IC50 [µM] = 0,31; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,03; TNF β IC50 [µM] = 0,81
Trietil estar
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,05 min; m/z = 600,2 [M+H]<+>, površina vrha >82%.
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,02 (s, 3H), 9,54 (s, 3H), 7,17 (s, 3H), 7,00 (s, 3H), 4,33 (q, J = 7,1 Hz , 6H), 3,59 (s, 6H), 1,31 (t, J = 7,1 Hz , 9H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C30H34NO12: 600,20755, pronađeno: 600,20790
Biološki podaci: IIIc-061a-E3: FGF-1 IC50 [µM] = 200; FGF-2 IC50 [µM] = 200; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,34; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = ND; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = N.D.; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 10,4
Opšte sintetičke procedure:
Formiranje tioetarske veze iz KI-11
Videti šemu 21. Isti uslovi za stvaranje tioetarske veze.
Procedure uklanjanja zaštite: videti Opšte procedure [4], [5] Za primere
Za uslove i prinose: Pogledajte sliku 7 (ukidanje zaštite) 60) 4-((2,5-dihidroksi-4-karboksifenil)metiltiometil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IIIc-058a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,84 min; m/z = 365,1 [M-H]-, površina vrha >79%
<1>H nmR (400 MHz, Methanol-d4) δ 7,25 (s, 2H), 6,83 (s, 2H), 3,69 (s, 4H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H15O8S: 367,04822, pronađeno: 367,04768
Biološki podaci: IIIc-058a: FGF-1 IC50 [µM] = 12; FGF-2 IC50 [µM] = 12; VEGF-A1 IC50 [µM] = 124; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,29; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 61,22; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1,17; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 23
Opšte sintetičke procedure:
Oksidacija tioetarske veze
Videti pripremu IVc-059a: isti uslovi oksidacije.
Procedure uklanjanja zaštite: videti Opšte procedure [4], [5]
Za primere
Za uslove i prinose: Pogledajte sliku 7 (ukidanje zaštite)
61) 4-((2,5-dihidroksi-4-karboksifenil)metilsulfonilmetil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IIIc-059a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,72 min; m/z = 397,1 [M-H]-, površina vrha >97%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,94 (brs, 2H), 10,63 (brs, 2H), 9,71 (s, 2H), 7,27 (s, 2H), 6,91 (s, 2H), 4,44 (s, 4H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H15O10S: 399,03804, pronađeno:
399,03768
Biološki podaci: IIIc-059a: FGF-1 IC50 [µM] = 47; FGF-2 IC50 [µM] = 50; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =3,61; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 66,39; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 1; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 14,67
Primer 1.11: Jedinjenja tipa IVc
Šema 22:
Sinteza preko dimetil etra
Opšte sintetičke procedure:
Sinteza iz 5-O-metil gentizinske kiseline
3-formil-2-hidroksi-5-metoksibenzoeva kiselina.
Heksametilentetramin (40,019 g, 0,285 mol) je dodat u smešu 2-hidroksi-5-metoksibenzojeve kiseline (24,0 g, 0,143 mol) u trifluorosirćetnoj kiselini (190,0 ml). Reakcija je refluksovana 18 h. Po završetku, reakcija je ohlađena do sobne temperature i u smešu je dodat rastvor 2M hlorovodonične kiseline (700 ml) koja je mešana na sobnoj temperaturi 24 h. Talog je filtriran, ispran vodom (500 ml) i osušen u vakuum pećnici da bi se dobila 3-formil-2-hidroksi-5-metoksibenzoeva kiselina kao bledo žuta čvrsta supstanca (21,30 g, 0,11 mol, 77,0%)
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,69 min; m/z = 195,1 [M-H]-, površina vrha >98%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,36 (s, 1H), 7,62 (d, J = 3,4 Hz , 1H), 7,44 (d, J = 3,4 Hz , 1H), 3,78 (s, 3H).
Metil 3-formil-2,5-dimetoksibenzoat. Metil jodid (6,7 ml, 0,107 mol) je dodat u smešu 3-formil-2-hidroksi-5-metoksibenzoeve kiseline (10,0 g, 0,05 mol) i kalijum karbonata-325 mesh (28,18 g, 0,20 mol) u DMF ( 100,0 ml). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 h. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i tretirana hladnom vodom (400 ml) što je rezultiralo formiranjem taloga. Dobijena suspenzija je mešana 10 min, zatim filtrirana i osušena u vakuum pećnici da bi se dobio metil 3-formil-2,5-dimetoksibenzoat kao žuta čvrsta supstanca (8,90 g, 0,04 mol, 78,0%).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,95 min; m/z = 225,1 [M+H]<+>, površina vrha >98%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,27 (s, 1H), 7,55 (d, J = 3,4 Hz , 1H), 7,41 (d, J = 3,4 Hz , 1H), 3,88 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,83 (s, 3H).
Metil 3-(hidroksimetil)-2,5-dimetoksibenzoat. Natrijum borohidrid (16,198 g, 0,428 mol) je polako dodat u rastvor metil 3-formil-2,5-dimetoksibenzoata (48,0 g, 0,214 mol) u MeOH (900 ml) na 0 °C i dobijena smeša je mešana na temperatura okoline 15 min. Rastvarač je uklonjen in vacuo i ostatak je rastvoren u DCM (200 ml), a zatim ispran vodom (200 ml). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan do suva da bi se dobio metil 3-(hidroksimetil)-2,5-dimetoksibenzoat kao bela čvrsta supstanca (45,6 g, 0,20 mol, 95,0%)
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,84 min; bez jonizacije, površina vrha >98%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,20 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 7,08 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 5,24 (t, J = 5,7 Hz , 1H), 4,54 (d, J = 5,6 Hz , 2H), 3,83 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,68 (s, 3H).
Metil 3-(hlorometil)-2,5-dimetoksibenzoat. Tionil hlorid (17,2 ml, 0,235 mol) je dodat u kapima u rastvor metil 3-(hidroksimetil)-2,5-dimetoksibenzoata (45,60 g, 0,20 mol) tokom 30 minuta na temperaturi okoline. Dobijena smeša je mešana 18 h na sobnoj temperaturi. Nakon završetka, reakciona smeša je isprana zasićenim rastvorom natrijum karbonata (3 × 500 ml) i slanim rastvorom (500 ml). Organski sloj je osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan do suva da bi se dobio metil 3-(hlorometil)-2,5-dimetoksibenzoat kao braon čvrsta supstanca (49,1 g, 0,18 mol, 90%).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,10 min; bez jonizacije, površina vrha >92%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,29 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 7,22 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 4,74 (s, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,77 (s, 3H), 3,76 (s, 3H).
Metil 3-(acetiltiometil)-2,5-dimetoksibenzoat. Kalijum tioacetat (15,54 g, 0,136 mol) je dodat u rastvor metil 3-(hlorometil)-2,5-dimetoksibenzoata (22,20 g, 0,091 mol) u THF (500,0 ml) na temperaturi okoline. Reakciona smeša je mešana na 75 °C tokom 18 h. Nakon završetka, rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom da bi se dobio crveni uljasti ostatak koji je tretiran zasićenim rastvorom soli (500 ml), zatim ekstrahovan dietil etrom (2 × 250 ml). Organske faze su kombinovane, osušene preko Na2SO4, filtrirane i koncentrovane do suva da bi se dobio metil 3-(acetiltiometil)-2,5-dimetoksibenzoat kao braon čvrsta supstanca (25,50 g, 0,09 mol, 99%).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,10 min; bez jonizacije, površina vrha >92%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,12 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 7,10 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 4,10 (s, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,74 (s, 3H), 3,70 (s, 3H), 2,35 (s, 3H).
Metil 3-(merkaptometil)-2,5-dimetoksibenzoat. U rastvor metil 3-(acetiltiometil)-2,5-dimetoksibenzoata (25,5 g, 89,68 mmol) u suvom metanolu (800 ml) dodat je u kapima na 0 °C rastvor natrijum metanolata (5,81 g, 107,62 mmol) u atmosferi azota. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi 45 min pre nego što je ugašena sa Dowex X8(H<+>) jonoizmenjivačkom smolom i mešana 15 min. Posle filtracije, rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi proizvod kao smeđe ulje (koje je sadržalo željeni proizvod i odgovarajuće disulfidno jedinjenje u odnosu 2:1). Ostatak je rastvoren u DMF (400,0 ml) i tretiran sa ditiotreitolom (DTT) (33,95 g, 0,26 mol) u atmosferi azota. Reakciona smeša je mešana na 75 °C tokom 18 h. Nakon završetka konverzije disulfida u tiol, rastvarač je uparen. Dobijeni ostatak je rastvoren u DCM (1 l), ispran slanim rastvorom (7 × 500 ml), osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan do suva da bi se dobio homogeni metil 3-(merkaptometil)-2,5-dimetoksibenzoat kao smeđe ulje (21,40 g, 88,32 mmol, 99%)
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,05 min; m/z = 243,1 [M+H]<+>, površina vrha >95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,19 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 7,09 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 3,83 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,73 (s, 3H), 3,71 (d, J = 8,0 Hz , 2H), 2,93 (t, J = 8,0 Hz , 1H).
Dimetil 3,3'-(tiobis(metilen))bis(2,5-dimetoksibenzoat). Trietilamin (19,0 ml, 136,61 mmol) je dodat u rastvor metil 3-(merkaptometil)-2,5-dimetoksibenzoata (21,40 g, 88,32 mmol) i metil 3-(hlorometil)-2,5-dimetoksi69benzoata (22,92,74 mmol) u atmosferi azota. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 18 h. Nakon završetka, rastvarač je uklonjen pod vakuumom da bi se dobio smeđi ostatak ulja koji je tretiran vodom (1 l), zatim ekstrahovan dietil etrom (3 × 500 ml). Organske faze su kombinovane, isprane slanim rastvorom (5 × 250 ml), osušene preko Na2SO,, filtrirane i koncentrovane do suva da bi se dobio sirovi proizvod u vidu braon ulja, koje je prečišćeno hromatografijom na silika gelu: eluiranje je napravljeno sa gradijent etil acetata (0 do 20%) u izoheksanu da bi se dobio dimetil 3,3'-(tiobis(metilen))bis(2,5-dimetoksibenzoat) kao braon čvrsta supstanca (29,9 g, 66,37 mmol, 76%)
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,22 min; m/z = 451,2 [M+H]<+>, površina vrha >92%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,12 - 7,08 (m, 4H), 3,83 (s, 6H), 3,76 (s, 4H), 3,73 (s, 6H), 3,67 (s, 6H).
3,3'-(tiobis(metilen))bis(2,5-dimetoksibenzoeva kiselina). Rastvor litijum hidroksida monohidrata (1,0 g, 23,83 mmol) u vodi (30,0 ml) je dodat u rastvor dimetil 3,3'-(tiobis(metilen))bis(2,5-dimetoksibenzoata) (2,0 g, 4,44 mmol) u THF (100,0 ml). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 48 h. Nakon završetka, u reakciju je dodata voda (100 ml) i smeša je isprana etil acetatom (100 ml).
Vodeni sloj je zakiseljen sa 1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline do pH=2 i ekstrahovan etil acetatom (3 × 100 ml). Organski slojevi su sakupljeni, osušeni (Na2SO4), filtrirani i koncentrovani da bi se dobila 3,3'-(tiobis(metilen))bis(2,5-dimetoksibenzoeva kiselina) kao braon čvrsta supstanca (1,91 g, 4,11 mmol, 93%)
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,93 min; m/z = 421,1 [M-H]-, površina vrha >95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,96 (s, 2H), 7,10 (d, J = 3,3 Hz , 2H), 7,08 (d, J = 3,2 Hz , 2H), 3,76 (s, 4H), 3,73 (s, 6H), 3,69 (s, 6H).
3-[(2,5-Dihidroksi-3-karboksifenil)metiltiometil]-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina. U rastvor prethodnog tioetra (5,0 g, 0,01 mol) u DCM (200,0 ml) polako je dodat 1M rastvor tribromoborana u DCM (100,7 ml, 0,101 mol) na 0 °C i reakciona smeša je refluksovana 48 h. Posle ovog vremena, čvrsta supstanca je filtrirana, isprana sa DCM (500 ml) i zatim suspendovana u rastvoru 1M hlorovodonične kiseline (50 ml). Dobijena smeša je refluksovana 2 h. Dobijena smeđa suspenzija je filtrirana i osušena da bi se dobio sirovi proizvod, koji je prečišćen hromatografijom na koloni reverzne faze (25 g, MeCN:H2O 5% do 95% na 12 CV) da bi se dobila 2,5-dihidroksi-3-[(2,5-dihidroksi-3-karboksifenil)metiltiometil]benzoeva kiselina kao bela čvrsta supstanca (1,1 g, 0,003 mol, 26%).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,70 min; m/z = 365,1 [M-H]-, površina vrha >95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,86 (s, 2H), 11,09 (s, 2H), 9,14 (s, 2H), 7,08 (d, J = 3,1 Hz , 2H), 7,02 (d, J = 3,1 Hz , 2H), 3,65 (s, 4H).
Primer:
62) 3-((2,5-dihidroksi-3-karboksifenil)metiltiometil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IVc-058a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,70 min; m/z = 365,1 [M-H]-, površina vrha >95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,86 (s, 2H), 11,09 (s, 2H), 9,14 (s, 2H), 7,08 (d, J = 3,1 Hz , 2H), 7,02 (d, J = 3,1 Hz , 2H), 3,65 (s, 4H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H15O8S: 367,04822, pronađeno: 367,04734 Biološki podaci: IVc-058a: FGF-1 IC50 [µM] = 36; FGF-2 IC50 [µM] = 4,9; VEGF-A1 IC50 [µM] = 83; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] = 0,53; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 77,04; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,29; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 43,5; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNγ IC50 [µM] = 10,6; IL-1β IC50 [µM] = 27,5; IL-2 IC50 [µM] = 3,82; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 0,21; IL-9 IC50 [µM] = 31,1; IL-10 IC50 [µM] = 16,4; IL-12p70 IC50 [µM] = 4,23; IL-13 IC50 [µM] = 55,9; IL-17A IC50 [µM] = 0,1; IL-17F IC50 [µM] = 86,8; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = 3,2; IL-33 IC50 [µM] = 33,9; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,18; TNF β IC50 [µM] = 59,3.
Sinteza iz jedinjenja IVc-058a
3-((2,5-Dihidroksi-3-karboksifenil)metilsulfonilmetil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina. U rastvor tioetra IVc-058a (4,25 g, 9,28 mmol) u DMF (20,0 ml) polako je dodat rastvor 3-hlorobenzen-1-karboperoksi kiseline (mCPBA stepen čistoće ≤77%, 5,80 g, 25,88 mmol) DMF (20,0 ml). Reakciona smeša je mešana 18 h na sobnoj temperaturi. Sirovi proizvod je podvrgnut HPLC prečišćavanju (videti opšte uslove) da bi se dobila bela čvrsta supstanca (3,20 g) koja je triturisana sa 1M HCl (50 ml) da bi se dobio željeni proizvod u vidu bele čvrste supstance (2,55 g, 6,40 mmol, 56%)
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,68 min; m/z = 397,1 [M-H]-, površina vrha >95%
63) 3-((2,5-dihidroksi-3-karboksifenil)metilsulfonilmetil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, jedinjenje IVc-059a:
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,68 min; m/z = 397,1 [M-H]-, površina vrha >95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,24 (s, 1H), 9,32 (s, 1H), 7,21 (d, J = 3,1 Hz , 1H), 7,09 (d, J = 3,1 Hz , 1H), 4,44 (s, 2H).
<13>C nmR (100 MHz, DMSO-d6) δ 172,4, 153,4, 149,2, 117,4, 116,1 (CH), 113,3 (CH), 53,6 (CH2). HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C16H15O10S: 399,03804, pronađeno: 399,03775
Biološki podaci: IVc-059a: FGF-1 IC50 [µM] = 6,7; FGF-2 IC50 [µM] = 2,7; VEGF-A1 IC50 [µM] = 12; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =4,8; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 74; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 0,147;
Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 10; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = >100; IFNγ IC50 [µM] = 4,34; IL-1β IC50 [µM] = 38,6; IL-2 IC50 [µM] = 21,2; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 0,11; IL-9 IC50 [µM] = 0,4; IL-10 IC50 [µM] = 1,31; IL-12p70 IC50 [µM] = 42; IL-13 IC50 [µM] = >100; IL-17A IC50 [µM] = 0,16; IL-17F IC50 [µM] = >100; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = 1,87; IL-33 IC50 [µM] = 27,5; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNF a IC50 [µM] = 0,16; TNF β IC50 [µM] = 0,33
Dimetil estar
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,94 min; m/z = 427,1 [M+H]<+>, površina vrha >95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,28 (s, 2H), 9,43 (s, 2H), 7,21 (d, J = 3,1 Hz , 2H), 7,13 (d, J = 3,1 Hz , 2H), 4,47 (s, 4H), 3,91 (s, 6H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C18H19O10S: 427,06934, pronađeno: 427,06942
Biološki podaci: IVc-059a-E2: FGF-1 IC50 [µM] = 78; FGF-2 IC50 [µM] = 94; VEGF-A1 IC50 [µM] = 200; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =2,7; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 45,67; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 2,64; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 50,5
Dimetil estar tetraacetat
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,05 min; m/z = 593,1 [M-H]-, površina vrha >95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,75 (d, J = 2,8 Hz , 2H), 7,53 (d, J = 2,9 Hz , 2H), 4,65 (s, 4H), 3,81 (s, 6H), 2,31 (s, 6H), 2,23 (s, 6H).
HRMS: [M+H]<+>, izrač. za C26H27O14S: 595,11160, pronađeno: 595,11149
Biološki podaci: IVc-059a-E2-A4: FGF-1 IC50 [µM] = 54; FGF-2 IC50 [µM] = 200; VEGF-A1 IC50 [µM] = 25; VEGFR-inhibicija fosforilacije IC50 [µM] =ND; PMN ROS [inhibicija na 0,3 µm [%] = 29,17; PMN ROS inhibicija IC50 [µM] = 4,13; Inhibicija adhezije neutrofila [%] = 87,5; Puna krv: GM-CSF IC50 [µM] = 1,83; IFNγ IC50 [µM] = 3,5; IL-1β IC50 [µM] = 14,1; IL-2 IC50 [µM] = 10,4; IL-4 IC50 [µM] = >100; IL-5 IC50 [µM] = >100; IL-6 IC50 [µM] = 0,99; IL-9 IC50 [µM] = 2,9; IL-10 IC50 [µM] = 16,8; IL-12p70 IC50 [µM] = 51,4; IL-13 IC50 [µM] = 18,7; IL-17A IC50 [µM] = 0,02; IL-17F IC50 [uM] = 25,8; IL-18 IC50 [µM] = >100; IL-21 IC50 [µM] = >100; IL-33 IC50 [µM] = 23,2; TGFβ IC50 [µM] = >100; TNFa IC50 [µM] = 0,3; TNF β IC50 [µM] = 19,4
Alternativna, skalabilna sinteza IVc-059a
Šema 24: sinteza IVc-059a iz 2,5-dibenziloksiftalaldehida
2,5-bis(benziloksi)-3-(hidroksimetil)benzaldehid [Korak 1]: 2,5-bis(benziloksi)-izoftalaldehid (25,0 g, 72,1 mmol) (videti šemu 9b) je rastvoren u THF (150 ml) i dodat je EtOH (15 ml). Braon rastvor je držan pod pozitivnim protokom azota i mešan na sobnoj temperaturi 10 minuta, a zatim je dodavan čvrsti NaBH4 (695 mg, 18,37 mmol) u porcijama tokom 20 minuta, unutrašnja temperatura reakcije nije smela da pređe 25 °C (koristi se vodeno kupatilo).
Reakciona smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi 30 minuta, a zatim je svakih 15 minuta dodavana dodatna količina NaBH4 do potpune konverzije početnog materijala (ukupno: 107 mg, u dve porcije). Reakciona smeša je zatim sipana u vodu (1,2 l) i mešana 20 min. Ovako formirani braon talog je izolovan filtracijom i dobijena čvrsta supstanca je dalje osušena u vakuum pećnici na 40 °C do konstantne mase da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (22,9 g, 76% korigovani prinos) u obliku smeđeg ulja. nmR profil je pokazao 83% željenog proizvoda, 15% prekomerno redukovanog diola, 2% početnog materijala, materijal je prenet u sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,19 min, 86%, m/z = 347,2 [MH]-
1H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,11 (s, 1H), 7,52 - 7,28 (m, 11H), 7,19 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 5,34 (t, J = 5,6 Hz , 1H), 5,15 (s, 2H) 4,99 (s, 2H), 4,60 (d, J = 5,6 Hz , 2H).
2,5-bis(benziloksi)-3-(hidroksimetil)benzoeva kiselina [Korak 2]: 2,5-Bis(benziloksi)-3-(hidroksimetil)benzaldehid (44,3 g, 103 mmol, 81% čistoće) i KH2PO4 (25,9 g, 190 mmol) rastvoreni su u acetonu (440 ml) i vodi (130 ml).
Dodat je resorcinol (21,0 g, 191 mmol) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 10 min. Rastvor natrijum hlorita (21,5 g, 191 mmol) u vodi (60 ml) je dodavan polako tokom 30 min, ne dozvoljavajući da unutrašnja temperatura pređe 25 °C. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 3 h i dodat je 2 M vodeni rastvor H3PO4 (95 ml). Smeša je mešana 20 min i ohlađena na 6 °C u ledenom kupatilu pre nego što je filtrirana. Čvrsta supstanca je dalje isprana vodom sve dok pH filtrata nije bio ~6. Dobijena čvrsta supstanca je suspendovana u vodi (ca.300 ml) i dodat je prethodno ohlađen (5 - 10 °C) rastvor NaOH (17 g, 412 mmol) u vodi (200 ml). Suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi 30 min pre nego što je filtrirana na levku za sinterovanje. Izolovana čvrsta supstanca je dalje isprana sa 1 M vodenim rastvorom NaOH (2 × 50 ml) i vodom (50 ml).
Alkalna tečnost je zatim zakiseljena korišćenjem 6N vodenog rastvora HCl prethodno ohlađenog (5 - 10 °C) do pH ~1. Dobijena suspenzija je magnetno mešana 20 min pre filtriranja, dobijena čvrsta supstanca je dalje sušena u vakuum pećnici na 40 °C do konstantne mase da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao svetlo bež čvrsta supstanca (34,8 g, 88%).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,06 min, 99%, m/z = 363,2 [MH]-.
1H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,02 (s, 1H), 7,51 - 7,31 (m, 10H), 7,28 (d, J = 3,2 Hz , 1H), 7,22 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 5,21 (s, 1H), 5,12 (s, 2H), 4,88 (s, 2H), 4,53 (s, 2H).
Etil 2,5-bis(benziloksi)-3-(hidroksimetil)benzoat [Korak 3]: 2,5-Bis(benziloksi)-3-(hidroksimetil)benzoeva kiselina (32,5 g, 89,3 mmol) i Cs2CO3 (32,3 g, 99,2 mmol) su suspendovani u DMF (200 ml ) i etil jodidu (9,0 ml, 112 mmol) je dodato u reakcionu smešu. Posle mešanja na sobnoj temperaturi tokom 3 h, reakciona smeša je sipana u zasićeni vodeni rastvor NH4Cl (1 l) i dodat je čvrsti NaCl (~30 g). Posle mešanja od 10 min, materijal je ekstrahovan sa EtOAc (2 × 500 ml). Sakupljeni organski sloj je ispran slanim rastvorom (2 × 500 ml), osušen natrijum sulfatom, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio smeđi ostatak ulja (42,0 g, sirov, 89,3 mmol). Sirovi materijal je prenet u sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,24 min, 93%, m/z = slaba jonizacija.
1H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,51 - 7,32 (m, 10H), 7,31 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 7,22 (d, J = 3,3 Hz , 1H), 5,24 (t, J = 5,6 Hz , 1H), 5,13 (s, 2H), 4,87 (s, 2H), 4,54 (d, J = 5,6 Hz , 2H), 4,26 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 1,24 (t, J = 7,1 Hz , 3H)
Etil 2,5-bis(benziloksi)-3-(hlorometil)benzoat (HI-14) [Korak 4]: Etil 2,5-bis(benziloksi)-3-(hidroksimetil)benzoat (42 g sirovog materijala iz prethodnog koraka, 89,3 mmol) je rastvoren u DCM (200 ml) u inertnoj atmosferi (N2), zatim SOCl2 (9,8 ml, 133,9 mmol) je dodato na 0 °C (ledeno kupatilo) i reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature. Posle 2 h isparljive supstance su uklonjene pod sniženim pritiskom, a zatim azeotropna destilacija korišćenjem toluena (3 × 100 ml) što je dovelo do polučvrstog smeđeg ulja (38,0 g, sirovo, 89,3 mmol).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,40 min, 91%, m/z = slaba jonizacija.
1H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,54 - 7,26 (m, 12H), 5,14 (s, 2H), 4,95 (s, 2H), 4,71 (s, 2H), 4,28 (q, J = 7,1 Hz , 2H), 1,28 - 1,22 (t, J = 7,1 Hz , 3H).
Bis(2,5-dibenziloksi-3-etoksikarbonilfenilmetil)sulfid [korak 5]: U rastvor KI-14 (38,0 g, sirovi materijal, 89,3 mmol) u DMF (420 ml) dodat je tioacetamid (8,4 g, 111,8 mmol) nakon čega sledi dodavanje K2CO3 - 325 Mesh (16,7 g, 120,8 mmol). Reakcija je zagrevana na 45 °C tokom 48 h. Reakcija je ohlađena do sobne temperature, nakon čega je usledilo dodavanje tioacetamida (2,5 g, 33,3 mmol) i K2CO3 - 325 mesh (5,0 g, 36,1 mmol) i dalje mešanje na 45 °C tokom 18 h da bi se reakcija završila. Reakciona smeša je sipana u vodu (4 l). Reakciona smeša je mešana 20 min pre dodavanja EtOAc (2 l), a zatim čvrstog NaCl (~60 g). Faze su razdvojene nakon čega je usledila dodatna ekstrakcija korišćenjem EtOAc (1,5 l). Sakupljeni organski sloj je ispran slanim rastvorom (1,5 l), osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobilo sirovo jedinjenje iz naslova (39,8 g, 44,6 mmol) kao smeđe ulje koje je korišćeno u sledećem koraku bez očišćenja.
UPLCMS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,57 min, m/z = 800,5 [M+NH4]+, površina vrha 77%.
1H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,46 - 7,17 (m, 24H), 5,05 (s, 4H), 4,83 (s, 4H), 4,23 (q, J = 7,1 Hz , 4H), 3,73 (s, 4H), 1,20 (t, J = 7,1 Hz , 6H).
Bis(2,5-dibenziloksi-3-etoksikarbonilfenilmetil)sulfon [Korak 6]: U rastvor bis(2,5-dibenziloksi-3-etoksikarbonilfenilmetil)sulfida (39,8 g sirovog, 44,6 mmol) u sirćetnoj kiselini (850 ml) je polako dodato 30 tež.% rastvor vodonik peroksida (50 ml, 490 mmol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi 18 h.
Reakciona smeša je sipana u led/vodu (5 l) i mešana na sobnoj temperaturi 30 min, a zatim je dodato EtOAc (2 l) i čvrsti NaCl (~40 g). Posle razdvajanja faza, vodeni sloj je ekstrahovan još jednom sa EtOAc (1 l). Sakupljeni organski sloj je ispran slanim rastvorom (1,5 l), osušen preko Na2SO4, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobila smeđa čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca je suspendovana u MTBE (250 ml) i magnetno mešana tokom 30 min, a zatim je usledila filtracija i dalje trituracija sa MTBE (150 ml) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (23,56 g, 28,9 mmol, 64% prinos u 4. koraka).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,48 min; m/z = 832,5 [M+NH4]+, površina vrha 96%
1H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,50 - 7,24 (m, 24H), 5,08 (s, 4H), 4,85 (s, 4H), 4,50 (s, 4H), 4,26 (q, J = 7,1 Hz , 4H), 1,25 - 1,17 (m, 6H).
Bis(2,5-dibenziloksi-3-karboksifenilmetil)sulfon [Korak 7]: Rastvor litijum hidroksida (9,7 g, 233 mmol) u vodi (100 ml) je dodat u rastvor bis(2,5-dibenziloksi-3-etoksikarbonilfenilmetil)sulfona (33,3 g, 38,8 mmol) u THF (350 ml) i dobijena smeša je mešana na refluksu 18 h. Posle ovog vremena, većina THF je uklonjena pod sniženim pritiskom što je dovelo do bele suspenzije. Nakon dodavanja vode (3 l) i vodenog rastvora natrijum hidroksida (1 M, 1 l) smeša ostaje suspenzija. Suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi 18 h i vodeni sloj je zakiseljen do pH-1 dodavanjem 6 M vodenog rastvora hlorovodonične kiseline i dobijena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom i isprana vodom, sve dok tečnosti nisu bile neutralne, tako dobijen bela čvrsta supstanca je dalje sušena u vakuum pećnici na 40 °C do konstantne mase da bi se dobilo jedinjenje iz naslova kao bela čvrsta supstanca (29,4 g, 38,7 mmol, 99%).
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,39 min; m/z = 757,1 [MH]-, površina vrha 100%
1H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,23 (s, 2H), 7,47 - 7,25 (m, 24H), 5,08 (s, 4H), 4,88 (s, 4H), 4,48 (s, 4H).
Bis(2,5-dihidroksi-3-karboksifenilmetil)sulfon [Korak 8], IVc-059a: U suspenziju bis(2,5-dibenziloksi-3-karboksifenilmetil)sulfona (10,08 g, 13,28 mmol) u EtOH (140 ml) i THF (140 ml) dodat je paladijum na drvenom uglju (20 tež.%, 2 g) kao suspenzija u vodi (20 ml). Posle nekoliko ciklusa vakuum/vodonik smeša je održavana u atmosferi H2 na 25 °C i mešana 20 h. Nakon završetka, smeša je filtrirana kroz Celite<®>koristeći THF. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobila beličasta čvrsta supstanca. Ostatak je zatim suspendovan u acetonitrilu (100 ml) i zagrevan do refluksa uz magnetno mešanje, smeša je zatim ohlađena na -5 °C pre nego što je filtrirana i dalje isprana hladnim acetonitrilom. Proizvod je dalje osušen u vakuum pećnici na 40 °C do konstantne mase da bi se dobio željeni proizvod u vidu bele čvrste supstance (5,35 g, 12,78 mmol, 96%).
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,67 min; m/z = 397,1 [MH]-, površina vrha 100%
NMR podaci: videti gore.
Primer 1.12 – molekuli tipa V: Referentna jedinjenja
Diamidi izvedeni iz 5-hidroksiizoftalne kiseline
2 primera
Sintetičke šeme i procedure
Šema 25: sinteza V-001a
Formiranje amidne veze
Videti Opšti postupak B za spajanje amida [3B] korišćenjem anilina A (2 mola) ili metil 5-aminosalicilata
Procedure uklanjanja zaštite: Videti Opšte procedure [4], [5]
Za detalje pogledajte Sliku 8
Za primere
64) bis-N-(4-karboksi-2,5-dihidroksifenil)amid 5-hidroksiizoftalne kiseline (V-001a)
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 0,72 min; m/z = 483,0 [M+H]<+>, površina vrha >95%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,28 (s, 1H), 9,83 (s, 2H), 9,48 (s, 2H), 7,92 (s, 1H), 7,68 (s, 2H), 7,52 (d, J = 1,5 Hz , 2H), 7,30 (s, 2H).
Dietil estar
UPLC-MS (kiseli postupak, 2 min): rt = 1,09 min; m/z = 539,2 [M-H]-, površina vrha 94%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,23 (s, 2H), 9,92 (s, 2H), 9,49 (s, 2H), 7,91 (s, 1H), 7,73 (s, 2H), 7,51 (d, J = 1,5 Hz , 2H), 7,32 (s, 2H), 4,35 (q, J = 7,1 Hz , 4H), 1,34 (t, J = 7,1 Hz , 6H).
65) bis-N-(3-karboksi-4-hidroksifenil)amid 5-hidroksiizoftalne kiseline (V-002a)
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,00 min; m/z = 451,1 [M-H]-, površina vrha 97%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,31 (s, 2H), 10,11 (s, 1H), 8,28 (d, J = 2,7 Hz , 2H), 7,98 (m, 1H), 7,89 (dd, J = 9,0, 2,7 Hz , 2H), 7,50 (d, J = 1,5 Hz , 2H), 6,97 (d, J = 9,0 Hz , 2H).
Jedinice gentizične kiseline povezane sa ureom 1 primer
Sintetička šema i procedure
Šema 26: sinteza V-003a
Formiranje veze uree
Procedura iz KI-1:
N,N'-Bis(2,5-dibenziloksi-4-etoksikarbonilfenil)urea. U ohlađeni rastvor (ledeno kupatilo) 2,5-bis(benziloksi)-4-(etoksikarbonil)benzojeve kiseline (HI-1) (2,0 g, 4,9 mmol) i Et3N (1,6 ml, 11,3 mmol) u THF (25 ml) u inertnoj atmosferi (N2), polako je dodavan DPPA (1,1 ml, 5,2 mmol). Smeša je polako zagrejana do sobne temperature i mešana na ovoj temperaturi 3 h. Zatim je dodat tBuOH (8 ml) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 h. Profil reakcije pokazao je većinu proizvoda vezivanja uree umesto željenog Boc-anilina. Smeša je sipana u zasićeni rastvor natrijum hidrogenkarbonata (250 ml) i mešana 5 min pre nego što je ekstrahovana sa EtOAc (3 × 50 ml). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, filtrirani i koncentrovani pod sniženim pritiskom da bi se dobilo bezbojno ulje. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (izo-heksan/EtOAc 1:0, a zatim gradijent do 30% EtOAc) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1,1 g, 56%) u vidu sivobele čvrste supstance.
UPLC-MS (osnovni postupak, 2 min): rt = 1,50 min; m/z = 781,2 [M+H]<+>, površina vrha 85%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,49 (s, 2H), 8,18 (s, 2H), 7,58 - 7,45 (m, 8H), 7,43 - 7,35 (m, 8H), 7,35 - 7,28 (m, 6H), 5,27 (s, 4H), 5,11 (s, 4H), 4,22 (q, J = 7,1 Hz , 4H), 1,24 (t, J = 7,1 Hz , 6H).
Procedure uklanjanja zaštite: Videti Opšte procedure [4], [5]
Za detalje pogledajte Sliku 8
Na primer
66) N,N'-Bis(2,5-dihidroksi-4-karboksifenil)urea (V-003a)
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 0,90 min; m/z = 363,1 [M-H]-, površina vrha 93%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,36 (s, 2H), 10,86 (s, 2H), 9,64 (s, 2H), 9,48 (s, 2H), 7,77 (s, 2H), 7,17 (s, 2H).
Dietil estar
UPLC-MS (kiseli postupak, 4 min): rt = 1,79 min; m/z = 419,2 [M-H]-, površina vrha 97%
<1>H nmR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,26 (s, 2H), 9,74 (s, 2H), 9,53 (s, 2H), 7,81 (s, 2H), 7,20 (s, 2H), 4,32 (q, J = 7,1 Hz , 4H), 1,33 (t, J = 7,1 Hz , 6H).
Primer 1.13: Formiranje soli
a) Supstance.
Opšti protokol: soli su dobijene kao čvrste materije dodavanjem odgovarajućeg broja ekvivalenta baze u rastvore ili suspenzije željenih jedinjenja u vodi, sonikacijom do potpunog rastvaranja, podešavanjem pH po potrebi na vrednosti između 7,0 i 7,4 dodavanjem vodenog rastvora HCl ili višak baze, zatim liofilizacija rastvora. Aterativno određene soli mogu se dobiti rastvaranjem u DMSO praćenom precipitacijom sa EtOH (IIc-007a). Supstance su dobijene od sledećih baza: natrijum hidroksid, dietilamin (DEA), lizin (Lis), meglumin (Meg), trietanolamin (TEA).
Za primere:
Natrijumove i dietilamonijumove (DEA) soli Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a kao čvrste materije su dobijene u skladu sa opštim protokolom bez podešavanja pH.
− Približne rastvorljivosti u vodi:
Ic-007a-DEA2: < 10 mg/ml
Ic-007a-DEA3: > 20 mg/ml
IIc-007a-DFA1: > 10 mg/ml
IIc-007a-DEA2: > 20 mg/ml
IIIc-061a-DEA3: > 25 mg/ml
− Stabilnost slobodnih kiselina i soli kao supstance:
Slobodne kiseline Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a i sledeće soli Ic-007a-DEA2, IIc-007a-DEA2, IIIc-061a-DEA3 bile su stabilne kao čvrsta supstanca do 56d na temperaturama od 4 °C, 20 °C i 40 °C; so Ic-007a-DEA3 je bila stabilna na istim temperaturama do 36 d.
b) Rešenja
Opšti protokol: soli su dobijene kao rastvori dodavanjem odgovarajućeg broja ekvivalenta baze u rastvore ili suspenzije željenih jedinjenja u vodi, sonikacijom do potpunog rastvaranja, podešavanjem pH po potrebi na vrednosti između 7,0 i 7,4 dodavanjem vodenog rastvora HCl ili višak baze. Ispitivane su sledeće baze: etilamin, trietilamin, etilendiamin, dietanolamin, trietanolamin, holin, meglumin, lizin i arginin.
Za primere:
Soli Ic-007a:
Rastvorljive soli su dobijene sa megluminom, lizinom i dietanolaminom nakon mešanja smeše tokom 2 dana na 40 °C. Čvrsti oblik soli Ic-007a-Lis2 je dobijen iz DMSO precipitacijom sa etanolom.
Sol je bila stabilna kao rastvor u vodi najmanje 7 dana na sobnoj temperaturi.
Soli IIc-007a:
DEAL-sol: u malom obimu, mono-dietilamonijum so je dobijena opštom procedurom bez podešavanja pH. Rastvorljivost: 17,4 mg/ml naspram 1,8 mg/ml za matičnu dikiselinu
Proces velikog obima i karakterizacija:
IIc-007a (20 g, 42,7 mmol) je napunjen EtOH (200 ml). Reakcija je mešana na ST da bi se dobila suspenzija. DEA (4,4 ml, 42,7 mmol) je napunjena i reakcija je zagrevana na 50 °C tokom 2h. Šarža je ohlađena na sobnu temperaturu i čvrsta materija je filtrirana. Filterski kolač je ispran sa EtOH (50 ml) i osušen u pećnici na 40 °C da bi se dobilo 21,5 g mono-DEA soli kao žute čvrste supstance sa prinosom od 98%. nmR: 1,6% EtOH, 1,04 ek. DEA. HPLC: 99,6%.
Podaci o čvrstom stanju za mono-DEA so IIc-007a pokazali su jasan kristalni obrazac u XRPD analizi. Trag TGA je pokazao gubitak manje količine EtOH <120 °C što ukazuje da se EtOH može osušiti na 60-80 °C. Zatim je primećen gubitak DEA (teorija 13,5 tež.% za 1: 1 so) povezana sa endotermom rastapanja u DSC (vrh na 273,8 °C), nakon čega sledi topljenje oblika slobodne kiseline. DEA2-sol, pH podešeno: dobijeno opštom procedurom sa podešavanjem pH (0,51 dodatnih ek. Et2NH potrebno je da se postigne pH=7,25). So u rastvoru pokazuje jasnu degradaciju posle 21 dan na 40 °C i ekstenzivnu degradaciju posle 24 h na 80 °C.
DEA2-sol, pH nije podešen: dobijen opštim postupkom bez podešavanja pH. pH rastvora = 5,87. Sol u rastvoru nije pokazala degradaciju posle 21 dan na 4 °C, 20 °C i 40 °C.
Lis2-sol, pH nije podešen: dobijen opštim postupkom korišćenjem 2 ek. L-lizina. pH rastvora = 5,74.
NAPOMENA: po analogiji sa bis (N-metil)amidom 2-hidroksiizoftalne kiseline (pKa fenola = 6,81), 2-OH grupa izoftalnog bis-amida jezgra IIc-007a je izuzetno kisela i njena jonizacija dovodi do degradacija molekula. Ovaj efekat nije primećen za Ic-007a (očekivani pKa fenolnih funkcija u opsegu od 9,8-10,0). Zbog toga je važno ne podešavati pH rastvora didikacionih soli IIc-007a.
Soli IIIc-061a:
DEA3-sol, pH podešeno: dobijeno opštom procedurom korišćenjem 3 ek. Et2NH sa podešavanjem pH (0,8 dodatnih ek. HCl (0,5 M) potrebno je da se postigne konačni pH=7,22). Sol u rastvoru nije pokazala degradaciju posle 21 dana na 4 °C, 20 °C i blagu degradaciju na 40 °C posle 33 dana.
Meg3-sol, pH podešeno: dobijeno opštim postupkom korišćenjem 3 ek. meglumina sa podešavanjem pH da bi se postigao konačni pH=7,22 (HCl 0,5M). So u rastvoru nije pokazala degradaciju posle 21 dana na 4 °C, 20 °C i 40 °C posle 14 dana.
Soli IVc-059a,
DEA2-sol, pH podešeno: dobijeno opštim postupkom sa podešavanjem pH (0,32 dodatnih ek. Et2NH potrebno je da se postigne pH=7,3). Sol u rastvoru pokazuje stabilnost nakon 26 dana na 4 °C, 20 °C i 40 °C.
Primer 1.14: Prolekovi
Prolekovi Ic-007a
1) 2-Morfolinoetil 5-[[2,5-dihidroksi-4-[[4-hidroksi-3-(2-morfolinoetoksikarbonil) fenil]karbamoil]benzoil]amino]-2-hidroksi-benzoat (Ic-007a-mpe2)
Esterifikacija. Suspenzija 5-[[2,5-dibenziloksi-4-[(3-karboksi-4-hidroksifenil)karbamoil]-benzoil]amino]-2-hidroksi-benzojeve kiseline (130 mg, 0,2 mmol) u N,N -dimetilformamid (4 ml) je mešana na sobnoj temperaturi. Dodati su N,N-dimetilpiridin-4-amin (49 mg, 0,4 mmol) i rastvor 2-morfolinoetanola
(53 mg, 0,4 mmol) u N,N-dimetilformamidu (0,5 ml). Dodat je 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid (115 mg, 0,6 mmol) i reakciona smeša je zagrevana u mikrotalasnom reaktoru na 60 °C tokom 1,5 sati. Reakciona smeša je filtrirana, filtrat je razblažen tetrahidrofuranom i rastvarač je uparen. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu eluiranjem sa 0-40% metanola u dihlorometanu da bi se dobio proizvod iz naslova kao bela čvrsta supstanca (80 mg, 45%). LCMS (m/z) [M+H] 875,1.
Hidrogenolisa: Pripremljen je rastvor gore dobijenog diestera (80 mg, 0,092 mmol) u tetrahidrofuranu (12 ml) i vodi (4 ml) i dodat je 10% paladijum na ugljeniku (50 mg, 10% pasta). Reakciona smeša je mešana u vodoničkoj atmosferi 17 sati. Katalizator je uklonjen filtracijom i rastvarač je uparen. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC reverzne faze na C18 koloni koristeći gradijent od 10-97% (acetonitril 0,1% mravlja kiselina): (voda 0,1% mravlja kiselina).
Ostatak je triturisan dietil etrom i osušen pod vakuumom da bi se dobio proizvod iz naslova Ic-007a-mpe2 kao žuta čvrsta supstanca (22 mg, 35%).
<1>H nmR (d6-DMSO ppm) δ 11,16-11,00 (br s, 1H), 10,46 (s, 1H), 10,45-10,15 (br s, 1H), 8,25 (d, J=2,7 Hz , 1H), 7,77 (dd, J=9,0, 2,7Hz, 1H), 7,53 (s, 1H), 7,01 (d, J=9,0 Hz , 1H), 4,46 (t, J=5,4 Hz , 2H), 3,62-3,56 (m, 4H), 2,77-2,69 (m, 2H), 2,56-2,50 (m, 4H, delimično prikriveno DMSO vrhom). LCMS (m/z) [M+H] 695,0.
2) 5-[[2,5-Dihidroksi-4-[[4-hidroksi-3-(2-morfolinoetoksikarbonil)fenil]karbamoil] benzoil] amino]-2-hidroksi-benzoeva kiselina (Ic-007a-mpe1)
Esterifikacija. Rastvor 5-[[2,5-dibenziloksi-4-[(3-karboksi-4-hidroksifenil)-karbamoil]benzoil]amino]-2-hidroksi-benzojeve kiseline (324 mg, 0,5 mmol) i trietilamina (101 mg, 0,15 ml, 1 mmol) u N,N-dimetilformamidu (7 ml) je mešan na sobnoj temperaturi. Dodat je rastvor 2-morfolinoetanola (66 mg, 0,5 mmol) u N,N-dimetilformamidu (1 ml) i N,N-dimetilpiridin-4-aminu (122 mg, 1 mmol). Dodat je 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid (115 mg, 0,6 mmol) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 2 sata, a zatim zagrevana u mikrotalasnoj pećnici na 60 °C tokom 4 sata. Reakcija je ponovljena na sličnoj skali i reakcione smeše su kombinovane. Rastvarač je uparen, a ostatak je triturisan sa dietil etrom da bi se dobila smeša mono i diestera (230 mg). LCMS (m/z) [M+H] 762,0 (mono estar).
Hidrogenoliza. Gore dobijena smeša mono i diestera (230 mg) rastvorena je u sirćetnoj kiselini (10 ml), tetrahidrofuranu (15 ml) i vodi (5 ml) i dodat je 10% paladijum na ugljeniku (150 mg, 10% pasta). Reakciona smeša je mešana u vodoničkoj atmosferi 16 sati. Katalizator je uklonjen filtracijom i rastvarač je uparen da bi se dobila žuta guma (140 mg). Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC reverzne faze na C18 koloni koristeći gradijent od 10-70% (acetonitril 0,1% mravlja kiselina): (voda 0,1% mravlja kiselina). Ostatak je triturisan dietil etrom i osušen pod vakuumom da bi se dobio naslovni monoestar Ic-007a-mpe1 kao žuta čvrsta supstanca (11 mg).
<1>H nmR (d6-DMSO ppm) δ 11,33-11,29 (br s, 1H), 11,13-10,08 (br s, 1H), 10,50-10,44 (br s, 2H), 10,36-10,30 (br s, 1H), 8,25 (d, J=2,4 Hz , 1H), 8,06-8,02 (m, 1H), 7,78 (dd, J=9,0, 2,4Hz, 1H), 7,69-7,60 (m, 2H), 7,52 (s, 1H), 7,01 (d, J=9,0 Hz , 1H), 6,75 (d, J=8,7 Hz , 1H), 4,50-4,45 (m, 2H), 3,65-3,55 (m, 4H), 2,81-2,71 (m, 2H), 2,60-2,50 (m, 4H, delimično prikriveno DMSO vrhom). LCMS (m/z) [M+H] 582,0.
3) 1-(2,2-dimetilpropanoiloksi)etil 5-[[4-[[3-[1-(2,2-dimetilpropanoiloksi)etoksikarbonil]-4-hidroksi-fenil]karbamoil]-2,5-dihidroksibenzoil]amino]-2-hidroksi-benzoat (Ic-007a-pive2) i
4) 5-[[4-[[3-[1-(2,2-dimetilpropanoiloksi)etoksikarbonil]-4-hidroksifenil]karbamoil]-2,5-dihidroksi-benzoil]amino]-2-hidroksi-benzoeva kiselina (Ic-007a-pive1)
(smeša mono- i di-estara)
Esterifikacija. Rastvor 5-[[2,5-dibenziloksi-4-[(3-karboksi-4-hidroksifenil)karbamoil] benzoil]amino]-2-hidroksi-benzojeve kiseline (324 mg, 0,5 mmol) i trietilamina (152 mg 0,21 mmol) u N,N-dimetilformamidu (10 mj) je mešan na 0 °C i dodat je 1-jodoetil 2,2-dimetilpropanoat (572 mg, 2 mmol). Reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i mešana na sobnoj temperaturi 24 sata. Dimetilformamid je uparen i ostatak je podeljen između dihlorometana i vodenog rastvora natrijum metabisulfita. Organska faza je osušena preko anhidrovanog magnezijum sulfata i uparena da bi se dobila 1:1 smeša mono i diestra (187 mg). Reakcija je ponovljena i mešavine estara 1:1 su kombinovane. LCMS (m/z) [M+H] 777,0 (mono estar) i 905,1 (diestar).
(smeša mono- i di-estara) (smeša mono- i di-estara)
Hidrogenoliza
Smeša mono i diestera (320 mg) dobijena iznad je rastvorena u tetrahidrofuranu (50 ml) i vodi (5 ml) i dodat je 10% paladijum na ugljeniku (300 mg, 10% pasta). Reakciona smeša je mešana u vodoničkoj atmosferi 20 sati. Katalizator je uklonjen filtracijom i rastvarač je uparen. LCMS je pokazao da je postignuta samo delimična deprotekcija. Ostatak je rastvoren u tetrahidrofuranu (36 ml) i dodata je voda (6 ml) i 10% paladijum na ugljeniku (600 mg, 10% pasta). Reakciona smeša je mešana u vodoničkoj atmosferi 22 sati. Katalizator je uklonjen filtracijom i rastvarač je uparen. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC reverznom fazom na C18 koloni, koristeći gradijent od 40-97% (acetonitril 0,1% mravlja kiselina): (voda 0,1% mravlja kiselina). Ostaci su triturisani dietil etrom i osušeni pod vakuumom da bi se dobili proizvodi iz naslova:
Diester (Ic-007a-pive2): žuta čvrsta supstanca (60 mg).<1>H nmR (d6-DMSO ppm) δ 11,05 (s, 1H), 10,46 (s, 1H), 10,18 (s, 1H), 8,18 (br s, 1H), 7,83-7,77 (m, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,05-6,96 (m, 2H), 1,58 (d, J=5,5 Hz , 3H), 1,17 (s, 9H). LCMS (m/z) [M+H] 724,9.
Biološki podaci: T1/2 (mišja plazma): 62,2 min (estar cepljen; 65% preostalo nakon 1h); T1/2 (ljudska plazma): > 180 min.
Monoestar (Ic-007a-pive1): žuta čvrsta supstanca (35 mg).<1>H nmR (d6-DMSO ppm) δ 11,13 (s, 1H), 11,06 (s, 1H), 10,46 (s, 1H), 10,42 (s, 1H), 10,18 (s, 1H), 8,21-8,18 (m, 2H), 8,78-8,72 (m, 2H), 7,55 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,03-6,92 (m, 3H), 1,58 (d, J=5,5 Hz , 3H), 1,17 (s, 9H). LCMS (m/z) [M+H] 596,9
Biološki podaci: T1/2 (mišja plazma): 44,6 min (estar cepljen; 49% preostalo nakon 1h); T1/2 (ljudska plazma): > 180 min.
Prolekovi IIc-007a
1) 2,2-dimetilpropanoiloksimetil 5-[[3-[[3-(2,2-dimetilpropanoiloksimetoksikarbonil)-4-hidroksi-fenil]karbamoil]-2,5-dihidroksibenzoil]amino]-2-hidroksi-benzoat (IIc-007a-pivm2)
Esterifikacija. Rastvor 5-[[2,5-dibenziloksi-3-[(3-karboksi-4-hidroksifenil)karbamoil]benzoil]amino]-2-hidroksi-benzojeve kiseline (280 mg, 0,432 mmol) je pripremljen N-dimetil formamidu i dodat je hlorometil 2,2-dimetilpropanoat (137 µl, 0,95 mmol), a zatim trietilamin (167µl, 1,2 mmol)) i natrijum jodid (143 mg, 0,95 mmol). Mešani rastvor je zagrevan na 50 °C tokom 18 sati. Rastvor je zatim ohlađen i podeljen između zasićenog rastvora amonijum hlorida i etil acetata. Organski sloj je osušen iznad natrijum sulfata, filtriran i uparen. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silicijum dioksida koristeći gradijent od 100% izo-heksana do 50% etil acetata, 50% izo-heksana da bi se dobio diestar kao bezbojna guma (192 mg, 51%). LCMS (m/z) [M+H] 876,9.
Hidrogenolisa: Rastvor gore dobijenog diestra (192 mg, 0,219 mmol) u tetrahidrofuranu (4,5 ml) je pripremljen i dodat je mešanoj suspenziji 10% paladijuma na ugljeniku (40 mg, 0,04 mmol) u vodi (1,5 ml). Mešana reakciona smeša je stavljena u atmosferu vodonika tokom 18 sati. Reakcija je filtrirana da bi se uklonio katalizator i rastvor je uparen da bi se dobila kremasta čvrsta supstanca (142 mg). Čvrsta supstanca je prečišćena pomoću HPLC na C18 koloni koristeći gradijent od 60% acetonitrila, 40% vode do 100% acetonitrila (0,1% mravlja kiselina) da bi se dobio naslovni diestar IIc-007a-pivm2 kao bela čvrsta supstanca (75 mg, 49 %).<1>H nmR (DMSO-D6 ppm) δ 13,03 (br s, 1H), 10,43 (br s, 2H), 10,16 (s, 2H), 9,52 (br s, 1H), 8,17 (d, J=2,7Hz, 2H), 7,82 (dd, J=8,9Hz, 2,7Hz, 2H), 7,55 (s, 2H), 7,02 (d, J=8,9Hz, 2H), 5,98 (s, 4H), 1,17 (s, 18H). LCMS (m/z) [MH] 694,9.
2) 5-[[3-[[3-[1-(2,2-dimetilpropanoiloksi)etoksikarbonil]-4-hidroksifenil]karbamoil]-2,5-dihidroksi-benzoil]amino]-2-hidroksi-benzoeva kiselina (IIc-007a-pive1)
Esterifikacija. Rastvor 5-[[2,5-dibenziloksi-3-[(3-karboksi-4-hidroksifenil)karbamoil]benzoil]amino]-2-hidroksi-benzoeve kiseline (324 mg, 0,5 mmol) i trietilamina ( 101 mg, 0,14 ml, 1,0 mmol) u N,N-dimetilformamidu (10 ml) je mešan na 0°C. Dodan je 1-jodoetil 2,2-dimetilpropanoat (154 mg, 0,6 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 21 sat. Dodato je još trietilamina (0,14 ml, 1,0 mmol) i 1-jodoetil 2,2-dimetilpropanoata (154 mg, 0,6 mmol) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat. Rastvarač je uparen. Ostatak je podeljen između dihlorometana i rastvora natrijum metabisulfita. Organski ekstrakti su kombinovani, isprani slanim rastvorom i osušeni propuštanjem rastvora kroz hidrofobnu fritu. Filtrat je uparen da bi se dobila smeša mono i diestera. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silika gelu eluiranjem sa 5-100% etil acetata u izoheksanima, a zatim sa 10% metanolom u dihlorometanu da bi se dobio mono estar kao žuta čvrsta supstanca (121 mg). LCMS (m/z) [M+H] 777.
Hidrogenoliza. Rastvor gore dobijenog monoestra (121 mg, 0,15 mmol) u tetrahidrofuranu (16 ml) i vodi (4 ml) koji sadrži 10% paladijum na ugljeniku (250 mg, 10% pasta) mešan je u atmosferi vodonika 18 sati. Katalizator je uklonjen filtracijom i rastvarač je uparen. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC reverznom fazom koristeći gradijent od 40-97% (acetonitril 0,1% mravlja kiselina): (voda 0,1% mravlja kiselina) da bi se dobio monoestar IIc-007a-pive1 kao žuta čvrsta supstanca (34 mg ).<1>H nmR (DMSO-D6" ppm) δ 13,15 (br s, 1H), 10,47 (br s, 2H), 10,18 (s, 1H), 9,47 (br s, 1H), 8,21 (d, J=3 Hz 1H), 8,17 (d, J=3 Hz 1H), 7,82 (dd, J=9, 3 Hz 1H), 7,78 (dd, J=9, 3 Hz 1H), 7,59-7,55 (m, 2H), 7,03 (d, J=9 Hz 1H), 6,99 (q, J=5,4 Hz 1H), 7,96 (d, J=9 Hz 1H), 1,58 (d, J=5,4 Hz , 3H), 1,17 (s, 9H). LCMS (m/z) [MH] 595,1.
Prolekovi IVc-059a
1) 2,5-dihidroksi-3-[[2,5-hidroksi-3-(2-morfolinoetoksikarbonil)fenil] metilsulfonil-metil]benzoeva kiselina (IVc-059a-mpe1)
Esterifikacija. Rastvor 2,5-dibenziloksi-3-[(2,5-dibenziloksi-3-karboksifenil) metilsulfonilmetil]benzoeve kiseline (300 mg, 0,40 mmol) i 2-morfolinoetanola (53 mg, 0,40 mmol) je pripremljen u N,N-dimetilformamidu (93 ml) i dodati su 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (EDC, 93 mg, 0,48 mmol) i N,N-dimetilpiridin-4-amin (10 mg, 0,08 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 sati. Dobijeni rastvor je uparen do suva, a ostatak je prečišćen pomoću HPLC na C18 koloni koristeći gradijent od 30% acetonitrila, 70% vode do 100% acetonitrila (0,1% mravlja kiselina) da bi se dobio morfolinoetil estar kao bezbojna guma (111 mg, 32%). LCMS (m/z) [M+H] 872,1.
Hidrogenoliza. Rastvor gornjeg monoestra (111 mg, 0,127 mmol) u tetrahidrofuranu (3 ml) je dodat u mešanu suspenziju 10% paladijuma na ugljeniku (20 mg, 0,019 mmol) u vodi (1 ml). Mešana reakciona smeša je stavljena u atmosferu vodonika tokom 18 sati.
Reakcija je filtrirana da bi se uklonio katalizator i rastvor je uparen da bi se dobila smeđa čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca je prečišćena pomoću HPLC na C18 koloni koristeći gradijent od 10% acetonitrila, 90% vode do 60% acetonitrila, 40% vode (0,1% mravlja kiselina) da bi se dobila bela čvrsta supstanca (20,5 mg). Čvrsta supstanca je razmućena dietil etrom i osušena pod vakuumom da bi se dobio proizvod iz naslova IVc-059a-mpe1 kao bela čvrsta supstanca (5 mg, 8%).
<1>H nmR (DMSO-d6 ppm) δ 10,33 (br s, 1H), 9,30 (s, 1H) 8,92 (s, 1H), 7,08-7,15 (m, 3H), 6,91 (d, J=3,1Hz, 1H), 4,40 (t, J=5,0Hz, 2H), 4,36 (s, 2H), 3,65-3,72 (m, 4H), 3,05 (t, J=5,0Hz, 2H), 2,78-2,87 (m, 4H). LCMS (m/z) [M+H] 511,9.
Biopodaci: stabilno do 60 min u plazmi miša
2) 2,5-Dihidroksi-3-[[2,5-hidroksi-3-(2-morfolinoetoksikarbonil)fenil] metilsulfonil-metil]benzoeva kiselina 2-morfolinoetil estar (IVc-059a-mpe2)
Rastvor 2,5-dibenziloksi-3-[(2,5-dibenziloksi-3-karboksifenil)metilsulfonilmetil]benzoeve kiseline (69 mg, 0,091 mmol) i 2-morfolinoetanola (25 mg, 0,19 mmol) je pripremljen u N,Ndimetilformamidu (1 ml) i dodati su 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid (42 mg, 0,48 mmol) i N,Ndimetilpiridin-4-amin (5 mg, 0,04 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 sati. Dobijeni rastvor je uparen do suva, a ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silicijum dioksida korišćenjem 10% metanola, 90% dihlorometana da bi se dobio naslovni proizvod u obliku bezbojne gume (58 mg, 65%). LCMS (m/z) [M+H] 985,0.
Rastvor gore dobijenog diestera (58 mg, 0,059 mmol) u tetrahidrofuranu (1,5 ml) je pripremljen i dodat je mešanoj suspenziji 10% paladijuma na ugljeniku (5 mg, 0,005 mmol) u vodi (0,5 ml). Mešana reakciona smeša je stavljena u atmosferu vodonika tokom 18 sati. Reakcija je filtrirana da bi se uklonio katalizator i rastvor je uparen da bi se dobila smeđa čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca je prečišćena pomoću HPLC na C18 koloni koristeći gradijent od 10% acetonitrila, 90% vode do 60% acetonitrila, 40% vode (0,1% mravlja kiselina) da bi se dobila bela čvrsta supstanca (13,7 mg).
Čvrsta supstanca je razmućena dietil etrom i osušena pod vakuumom da bi se dobio naslovni proizvod IVc-059a-mpe2 kao bela čvrsta supstanca (9,1 mg, 25%).
<1>HNMR (CD3OD ppm) δ 8,34 (brs, 2H), 7,32 (d, J=3,1Hz, 2H), 7,16 (d, J=3,1Hz, 2H), 4,52 (t, J=5,5Hz, 4H), 4,45 (s, 4H), 3,68-3,73 (m, 8H), 2,83 (t, J=5,5Hz, 4H), 2,58-2,65 (m, 8H). LCMS (m/z) [M+H] 625,0.
Biopodaci: stabilno do 60 min u plazmi miša; T1/2 (ljudska
plazma): > 180 min.
3) 3-[[3-[1-(2,2-dimetilpropanoiloksi)etoksikarbonil]-2,5-dihidroksifenil]metil-sulfonilmetil]-2,5-dihidroksi-benzoeva kiselina 1-(2,2-dimetilpropanoiloksi) )etil estar (IVc-059a-pive2)
Esterifikacija. Rastvor 2,5-dibenziloksi-3-[(2,5-dibenziloksi-3-karboksifenil)metil-sulfonilmetil]benzoeve kiseline (200 mg, 0,263 mmol) u anhidrovanom N,N-dimetilformamidu (5 ml) je pripremljen i trietilamin (88 µl, 0,63 mmol), natrijum jodid (8 mg, 0,053 mmol) i sirovi 1-jodoetil 2,2-dimetilpropanoat (ca.4,2 mmol) su dodati. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 sati. Dobijeni rastvor je uparen do male zapremine i ostatak je podeljen između dihlorometana i rastvora natrijum tiosulfata. Organski sloj je filtriran kroz hidrofobnu fritu i uparen. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa gradijentom od 100% izo-heksana do 50:50 etil acetat/izo-heksana da bi se dobio di-estar kao bezbojna guma (110 mg, 41%). LCMS (m/z) [M+Na] 1037,0
Monoestar je takođe izolovan iz iste kolone kao bezbojna guma (90 mg, 40%). LCMS (m/z) [M+Na] 909,6.
Hidrogenolisa:
Rastvor gore izolovanog diestera (110 mg, 0,108 mmol) u tetrahidrofuranu (3 ml) je dodat u mešanu suspenziju 10% paladijuma na ugljeniku (20 mg, 0,02 mmol) u vodi (1 ml). Mešana reakciona smeša je stavljena u atmosferu vodonika tokom 48 sati. Reakciona smeša je filtrirana da bi se uklonio katalizator, rastvor je uparen, a ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silicijum dioksida eluiranjem sa gradijentom od 100% dihlorometana do 10% metanola, 90% dihlorometana da bi se dobio naslovni proizvod IVc-059a- pive2 kao čvrsta supstanca (55 mg, 78%).
<1>H nmR (CDCl3 ppm) δ 10,55 (s, 2H), 7,24-7,28 (m, 2H), 7,14-7,18 (m, 2H), 7,05 (q, J=5,4Hz, 2H), 6,18 (br s, 2H), 4,30-4,50 (m, 4H), 1,60 (d, J=5,4Hz, 6H), 1,21 (s, 18H). LCMS (m/z) [MH] 653,9.
Biopodaci: brzo se hidrolizuju u plazmi miševa i ljudi
4) 3-[[3-[1-(2,2-dimetilpropanoiloksi)etoksikarbonil]-2,5-dihidroksifenil]metilsulfonil-metil]-2,5-dihidroksi-benzoeva kiselina (IVc-059a-pive1)
Hidrogenolisa:
Rastvor gore izolovanog monoestra (90 mg, 0,104 mmol) u tetrahidrofuranu (3 ml) je dodat u mešanu suspenziju 10% paladijuma na ugljeniku (20 mg, 0,02 mmol) u vodi (1 ml). Mešana reakciona smeša je stavljena u atmosferu vodonika tokom 48 sati. Reakcija je filtrirana da bi se uklonio katalizator, rastvor je uparen i ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silicijum dioksida eluiranjem sa gradijentom od 100% dihlorometana do 20% metanola, 80% dihlorometana da bi se dobio naslovni proizvod IVc-059a-pive1 kao čvrsta supstanca (22,5 mg, 43%).
1H nmR (CD3OD ppm) δ 7,39 (d, , J=3,1Hz, 1H), 7,25 (d, J=3,1Hz, 1H), 7,18 (d, J=3,1Hz, 1H), 7,05 (q, J=5,4Hz, 1H), 6,96 (d, J=3,1Hz, 1H), 4,40-4,45 (m, 4H), 1,61 (d, J=5,4Hz, 3H), 1,21 (s, 9H). LCMS (m/z) [MH] 524,9.
Biopodaci: brzo se hidrolizuju u plazmi miša
5) 2,2-dimetilpropanoiloksimetil 2,5-dihidroksi-3-[[2,5-dihidroksi-3-(2,2-dimetil-propanoiloksimetoksikarbonil)fenil]metilsulfonilmetil] benzoat (IVc-059a-pivm2)
Esterifikacija. Rastvor 2,5-dibenziloksi-3-[(2,5-dibenziloksi-3-karboksifenil) metilsulfonil-metil]benzoeve kiseline (100 mg, 0,131 mmol) u anhidrovanom N,N-dimetilformamidu (1 ml) je pripremljen i dodat je hlorometil 2,2-dimetilpropanoat (91 µl, 0,631 mmol), a zatim trietilamin (110 µl, 0,789 mmol) i natrijum jodid (87 mg, 0,579 mmol). Reakciona smeša je zagrevana na 50 °C tokom 6,5 sati. Dobijeni rastvor je uparen, a ostatak je podeljen između etil acetata i vode. Organski sloj je osušen iznad natrijum sulfata, filtriran i uparen. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa gradijentom od 100% izo-heksana do 50% etil acetata, 50% izo-heksana da bi se dobio diestarski proizvod kao bezbojna guma (85 mg, 66%). LCMS (m/z) [M+Na] 1010,0.
Hidrogenolisa: Rastvor gore dobijenog diestera (85 mg, 0,086 mmol) u tetrahidrofuranu (3 ml) je dodat mešanoj suspenziji 10% paladijuma na ugljeniku (20 mg, 0,02 mmol) u vodi (1 ml). Mešana reakciona smeša je stavljena u atmosferu vodonika tokom 18 sati. Reakcija je filtrirana da bi se uklonio katalizator, rastvor je uparen i ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela eluiranjem sa gradijentom od 100% izoheksana do 60% etil acetata, 40% izoheksana da bi se dobio diestar IVc-059a-pivm2 kao bela čvrsta supstanca (31 mg, 57%).
<1>H nmR (CDCl3 ppm) δ 7,29 (d, J=2,9Hz, 2H), 7,19 (d, J=2,9Hz, 2H), 5,97 (s, 4H), 4,42 (s, 4H), 1,22 (s, 18H). LCMS (m/z) [MH] 624,8.
Biopodaci: brzo hidrolizovan u plazmi miša, T1/2 = 14,1 min; T1/2 (ljudska plazma): > 180 min.
6) 2,5-dihidroksi-3-[[2,5-dihidroksi-3-(2,2-dimetilpropanoiloksimetoksikarbonil)fenil] metil-sulfonilmetil] benzoeva kiselina (IVc-059a-pivm1)
Esterifikacija: Pripremljen je rastvor 2,5-dibenziloksi-3-[(2,5-dibenziloksi-3-karboksifenil)metilsulfonil metil]benzojeve kiseline (300 mg, 0,395 mmol) u anhidrovanom N,N-dimetilformamidu (3 ml) i dodat je hlorometil 2,2-dimetilpropanoat (57 µl, 0,395 mmol), a zatim trietilamin (68 µl, 0,489 mmol) i natrijum jodid (129 mg, 0,870 mmol). Reakciona smeša je zagrevana na 50 °C tokom 4 sata. Dobijeni rastvor je ohlađen, a zatim uparen. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni silicijum dioksida eluiranjem sa gradijentom od 20% etil acetata, 80% izoheksana do 80% etil acetata, 20% izoheksana da bi se dobio monoestarski proizvod kao bela čvrsta supstanca (121 mg, 35). %). LCMS (m/z) [MH] 871,0.
Hidrogenolisa: Rastvor gore dobijenog monoestra (121 mg, 0,138 mmol) u tetrahidrofuranu (3 ml) je dodat u mešanu suspenziju 10% paladijuma na ugljeniku (20 mg, 0,02 mmol) u vodi (1 ml). Mešana reakciona smeša je stavljena u atmosferu vodonika tokom 48 sati. Reakcija je filtrirana da bi se uklonio katalizator, rastvor je uparen i ostatak je prečišćen pomoću HPLC na C18 koloni eluiranjem sa gradijentom od 30% acetonitrila, 70% vode do 100% acetonitrila (0,1% mravlja kiselina) da bi se dobio monoestar IVc-059a-pivm1 kao bela čvrsta supstanca (30 mg, 42%).
<1>H nmR (CD3OD ppm) δ 7,34 (d, J=3,0Hz, 1H), 7,27 (d, J=3,1Hz, 1H), 7,20 (d, J=3,1Hz, 1H), 7,08 (d, J=3,0Hz, 1H), 6,01 (s, 2H), 4,45 (s, 4H), 1,22 (s, 9H). LCMS (m/z) [MH] 510,9.
Biopodaci: brzo hidrolizovan u plazmi miša, T1/2 = 6,7 min; T1/2 (ljudska plazma): > 180 min.
PRIMER 2: Opšti eksperimentalni postupci
NMR spektroskopija
<1>H nmR spektri su snimljeni na 400 MHz na Bruker Advance III nmR spektrometru. Uzorci su pripremljeni u deuterisanom hloroformu (CDCl3) ili dimetilsulfoksidu (DMSO-d6) i sirovi podaci su obrađeni korišćenjem Mnova nmR softvera. Maseni spektri visoke rezolucije su snimljeni MaXis ESI qTOF masenim spektrometrom ultra visoke rezolucije
UPLC-MS analiza
UPLC-MS analiza je sprovedena na Waters Acquity UPLC sistemu koji se sastoji od Acquity I-Class Sample Manager-FL, Acquity I-Class Binary Solvent Manager i Acquity I-Class UPLC Column Manage UV detekcija je postignuta korišćenjem Acquity I-Class UPLC PDA detektora (skeniranje od 210 - 400 nm), dok je detekcija mase postignuta korišćenjem Acquity QDa detektora (skeniranje mase od 100 - 1250 Da; pozitivni i negativni modusi istovremeno). Kolona Waters Acquity UPLC BEH C18 (2,1 × 50 mm, 1,7 mm) je korišćena da bi se postiglo razdvajanje analita.
Uzorci su pripremljeni rastvaranjem (sa ili bez ultrazvučne obrade) u 1 ml 1:1 (vol./vol.) mešavine MeCN u H2O. Dobijeni rastvori su filtrirani kroz filter šprica od 0,45 µm pre nego što su predati na analizu. Svi korišćeni rastvarači (uključujući mravlju kiselinu i 36% rastvor amonijaka) su korišćeni kao HPLC kvaliteta.
Za ovaj rad korišćene su četiri različite analitičke metode, čiji su detalji predstavljeni u nastavku. Trčanje kiselinom (2 min): 0,1% vol./vol. Mravlja kiselina u vodi [Eluent A]; 0,1% vol./vol. Mravlja kiselina u MeCN [Eluent B]; Brzina protoka 0,8 ml/min; zapremina injekcije 2 µl i vreme ravnoteže između uzoraka 1,5 min.
Tabela 14:
Trčanje kiselinom (4 min): 0,1% vol./vol. Mravlja kiselina u vodi [Eluent A]; 0,1% vol./vol. Mravlja kiselina u MeCN [Eluent B]; Brzina protoka 0,8 ml/min; zapremina injekcije 2 µl i vreme ravnoteže između uzoraka 1,5 min.
Tabela 15:
Trčanje kiselinom (6,5 min): 10 mm amonijum formata 0,1% vol./vol. mravlje kiseline [Eluent A]; 0,1% vol./vol. Mravlja kiselina u MeCN [Eluent B]; Brzina protoka 0,6 ml/min; Zapremina ubrizgavanja 2 µl.
Tabela 16:
Osnovno trčanje (2 min): 0,1% amonijaka u vodi [Eluent A]; 0,1% amonijaka u MeCN [Eluent B]; Brzina protoka 0,8 ml/min; zapremina injekcije 2 µl i vreme ravnoteže između uzoraka 1,5 min.
Tabela 17:
Osnovno trčanje (4 min): 0,1% amonijaka u vodi [Eluent A]; 0,1% amonijaka u MeCN [Eluent B]; Brzina protoka 0,8 ml/min; zapremina injekcije 2 µl i vreme ravnoteže između uzoraka 1,5 min.
Tabela 18:
Osnovno trčanje (6,5 min): 10 mm amonijum bikarbonata 0,1% vol./vol. 35% rastvor amonijaka [Eluent A]; 0,1% vol./vol. Mravlja kiselina u MeCN [Eluent B]; Brzina protoka 0,6 ml/min; Zapremina ubrizgavanja 2 µl.
Tabela 19:
Preparativno HPLC prečišćavanje
Preparativna HPLC je izvedena korišćenjem Waters sistema za autoprečišćavanje sa XBridge Prep C18 kolonom (19 × 150 mm). Waters sistem se sastojao od Waters 2545 Binary Prep pumpe, Waters 2767 Sample Manager, Waters SFO Column Organiser, Waters 2998 DAD, Waters 515 Make up pumpe i Acquity QDa masenog spektrometra
Sistem za prečišćavanje je kontrolisan softverom MassLynx (verzija 4.2) sa Open Access Login modulom.
Mobilne faze su se sastojale od (A) 10 mm amonijum formata (+ 0,1% vol./vol. mravlje kiseline) i (B) acetonitrila (+ 0,1% vol./vol. mravlje kiseline).
Uzorci su pripremljeni rastvaranjem u 10% vol./vol. vode u DMSO da bi se dobila koncentracija od ~150 mg/ml. Zapremina od 320 ml pripremljenog uzorka je stavljena na kolonu i prečišćena korišćenjem gradijentnog eluiranja na sobnoj temperaturi sa brzinom protoka od 25 ml/min. Između injekcija postoji ravnoteža od 1,5 minuta.
Tabela 20: Gradijent:
PRIMER 3: Metode in vitro skrininga
Primer 3.1: In vitro metoda inhibicije HUVEC ćelija FGF1, FGF2 i VEGF-A
Cilj ove in vitro metode je da proceni efekte jedinjenja na FGF-2, FGF-1 ili VEGF-A indukovano klijanje endotelnih ćelija humane umbilikalne vene (HUVEC) u testu ćelijske angiogeneze na bazi sferoida. Pre dodavanja faktora rasta ćelijama, one su prethodno inkubirane sa jedinjenjem. Sunitinib je testiran kao kontrola (bez predinkubacije).
Kontrola sunitiniba je inhibirala klijanje HUVEC izazvanog FGF-2, FGF-1 i VEGF-A kao što se očekivalo. IC50 vrednosti određene za testirana jedinjenja su izražene u mikroM [µM], a vrednosti za inhibiciju rasta (klijanja) izazvanog FGF-1, FGF2 i VEGF-A su navedene posle svakog jedinjenja u primerima nakon hemijske karakterizacije.
Test klijanja je izveden na jedinjenjima rastvorenim u DMSO da bi se postigla 100-struko koncentrovana matična rastvora i rastvorena u medijumu za kulturu. Sunitinib kao referentno jedinjenje obezbedila je ProQinase GmbH. Faktori rasta su kupljeni od rhFGF-basic (FGF-2), Peprotech, New Jersey, USA, #100-18C, Lot # 0415571; rhFGF-kiseli (FGF-1), Peprotech, New Jersey, USA, # 100-17A, Lot # 031207; hVEGF-A165 (ProQinase GmbH, Freiburg, Nemačka;
05.02.2010) korišćeni su za stimulaciju rasta HUVEC ćelija.
Test sistem: Endotelne ćelije iz humane pupčane vene (HUVEC) prikupljenih donora su uskladištene zamrznute sa 70% medijuma, 20% FCS, 10% DMSO na oko 1 × 10<6>ćelija/ampuli. HUVEC ćelije, primarne ljudske endotelne ćelije pupčane vene (PromoCell, Heidelberg, Nemačka), korišćene su nakon prolaza 3 do 4. Morfologija ćelija je adherentna, raste kao monosloj nalik na kaldrmu i uzgajane su u endotelnim ćelijama za rast i bazalnom medijumu (ECGM/ECBM, PromoCell). Potkultura je podeljena 1:3; svakih 3-5 dana, seme na ca. 1 × 10<4>ćelija/cm<2>i inkubirano na 37 °C sa 5% CO2 sa vremenom udvostručavanja 24-48 sati
Razblaživanje test jedinjenja: 100x koncentrovani rastvori (u vezi sa konačnim koncentracijama testa) svakog testiranog jedinjenja su pripremljeni sa odgovarajućim rastvaračem (u DMSO ili u vodi). Ovi 100x rastvori jedinjenja su dalje razblaženi u rastu endotelnih ćelija i bazalnom medijumu (ECBM) 1:7,5 da bi se dobio 13,33x koncentrovani rastvor.75 µl 13,33x rastvora je zatim pomešano sa 25 µl 40x koncentrovanog stimulusa (rastvorenog u ECBM), što je rezultiralo 10x koncentrovanom mešavinom stimulusa/jedinjenja. Ova smeša (100 µl) je inkubirana 30 min na 37 °C, a zatim dodata u 900 µl gela, koji sadrži HUVEC sferoide (što je rezultiralo konačnom koncentracijom testa).
Postupak testiranja: eksperimenti su sprovedeni u modifikaciji prvobitno objavljenog protokola (Korff i Augustin: J Cell Sci 112: 3249-58, 1999). Ukratko, sferoidi su pripremljeni kako je opisano (Korff i Augustin: J Cell Biol 143: 1341-52, 1998) pipetiranjem 400 HUVEC u visećoj kapi na plastičnim posudama da bi se omogućilo agregiranje sferoida preko noći.50 HUVEC sferoida je zatim zasejano u 0,9 ml kolagen gela i pipetirano u pojedinačne jažice ploče sa 24 bunara da bi se omogućila polimerizacija. Test jedinjenja su prethodno inkubirana sa faktorima rasta (FGF-1, FGF-2 ili VEGF-A konačna koncentracija 25 ng/ml) u 10-struko koncentrovanom rastvoru, a zatim je 100 µl ovog rastvora dodato na polimerizovani rastvor gel. Sva jedinjenja su razblažena u rastvaraču (DMSO ili voda) kao prvo 100x zaliha (što znači da je 100x zaliha svake konačne koncentracije za analizu pripremljeno u rastvaraču). Nakon toga, ove zalihe su dalje razblažene u medijumu (što je rezultiralo sa 13,33x zaliha svake konačne koncentracije testa) sa testiranim konačnim koncentracijama: 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13 i 1,56 × 10<-6>M). Ploče su inkubirane na 37 °C tokom 24 sata i fiksirane dodavanjem 4% PFA (Roth, Karlsruhe, Nemačka).
Kvantifikacija inhibicije faktora rasta: intenzitet klijanja HUVEC sferoida tretiranih faktorom rasta i inhibitorima je kvantifikovan pomoću sistema za analizu slike koji određuje kumulativnu dužinu klica po sferoidu (CSL). Slike pojedinačnih sferoida su snimljene pomoću invertovanog mikroskopa i softvera za digitalno snimanje NIS-Elements BR 3.0 (Nikon). Nakon toga, sferoidne slike su postavljene na početnu stranicu kompanije Wimasis za analizu slika. Kumulativna dužina klica svakog sferoida određena je korišćenjem alata za analizu slike WimSprout.
Srednja vrednost kumulativne dužine klice od 10 nasumično odabranih sferoida je analizirana kao pojedinačna tačka podataka. Za određivanje IC50, neobrađeni podaci su konvertovani u procenat HUVEC klijanja u odnosu na kontrolu rastvarača (koja sadrži stimulus), koja je postavljena na 100% i bazalnu kontrolu (bez stimulacije), koja je postavljena na 0%. Vrednosti IC50 su određene korišćenjem softvera GraphPad Prism 5 sa ograničenjem od dna do 0 i od vrha do 100 korišćenjem krive nelinearne regresije sa promenljivim nagibom brda.
Rezultati: Odnos doze odgovora na klijanje endotelnih ćelija izazvano faktorom rasta je procenjen za sva jedinjenja. Vrednosti IC50 su određene korišćenjem standardnih parametara na osnovu signala kontrole rastvarača kao gornjeg ograničenja (100% HUVEC klijanja) i signala bazalne kontrole kao donjeg ograničenja (0%). Odgovarajuće vrednosti IC50 za svako jedinjenje na FGF1, FGF2 i VEGFA su sumirane ispod svakog jedinjenja ispod njihove hemijske karakterizacije u paragrafu BIODATA.
Primer 3.2: In vitro adhezija neutrofila u statičkim uslovima, metoda
Ljudski neutrofili dobijeni iz puhastih omotača zdravih donora suspendovani su pri 3 × 10<6>/ml u puferu za adheziju (PBS koji sadrži 1 mm CaCl2/MgCl2 i 10% FCS, pH 7,2). Neutrofili su prethodno inkubirani 30 min na 37 °C sa 40 µm i 80 µm jedinjenja.
Testovi adhezije su izvedeni na staklenim predmetima sa 18 bunarčića obloženim 18 h na 4 °C humanim fibrinogenom (20 µg/bažiriću u PBS-u bez endotoksina); 20 µl ćelijske suspenzije je dodato u svaki bunar i stimulisano 1 min na 37 °C sa 5 µl finalne koncentracije fMLP 1nM. Nakon ispiranja, adherentne ćelije su fiksirane u glutaraldehidu 1,5% u PBS-u i prebrojane kompjuterski potpomognute numeracijom. Statistička analiza je izvršena izračunavanjem srednje vrednosti i standardne devijacije (SD); značajnost je izračunata neuparenim t-testom. Sve statističke analize su obavljene korišćenjem GraphPad Prism 6 (GraphPad softver).
Odgovarajuća inhibicija adhezije neutrofila izražena u [%] za svako jedinjenje je sažeta ispod svakog jedinjenja ispod njihove hemijske karakterizacije u paragrafu BIOPODACI.
Primer 3.3: In vitro testiranje inhibicije proizvodnje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) u ljudskim neutrofilima
NADPH oksidaza, smeštena u plazma membrani i u membranama specifičnih granula, proizvodi superoksidne anjone iz kojih su ostali ROS, kao što su vodonik peroksid, singletni kiseonik, hipohlorit i aktivni hidroksilni radikali. ROS se oslobađaju u okolni medijum ili u subćelijsku organelu zatvorenu membranom. Jedna brza i osetljiva metoda za merenje stvaranja ovih metabolita je hemiluminiscencija (CL). Izoluminol pojačana CL tehnika je veoma osetljiva i široko se koristi za proučavanje respiratornog pucanja (uglavnom ekstracelularne proizvodnje ROS) indukovanog u neutrofilima.
Ljudski neutrofili su izolovani iz puzastih kaputa dobijenih od zdravih donora. Izolovani neutrofili (3 × 10<6>/ml) su suspendovani u Hanksovom balansiranom rastvoru soli (HBSS) sa kalcijumom i magnezijumom. Neutrofili su prethodno inkubirani sa jedinjenjima u različitim koncentracijama (0,1, 0,3, 1, 3 i 10 µm) tokom 30 minuta na 37 °C. Crne ploče za kulturu ćelija sa 96 jažica su obložene humanim fibrinogenom (0,25 mg/ml u PBS) i inkubirane preko noći na 4 °C ili 2 sata na 37 °C. Zatim su ploče isprane PBS-om bez endotoksina.
Neutrofili su inkubirani (priming) sa TNF-α (20 ng/ml) 10 minuta na 37 °C. Zatim je u svaki bunar dodato 75 ul suspenzije ćelija i 75 ul (izoluminol HRP rastvor). Hemiluminiscencija je zabeležena (svakih 25 sekundi tokom 250 sekundi) nakon fMLP (1 µm) aktivacije korišćenjem Multilabel Reader victor3 (Perkin Elmer, SAD). Pozadinske vrednosti, definisane kao srednje hemiluminiscentne vrednosti izoluminola razblaženog u HBSS, oduzete su od svih očitavanja (CPS, broj u sekundi). Testovi su rađeni u duplikatu ili tri primerka.
Rezultati dobijeni izoluminolom pojačanog CL testa su otkrili da jedinjenja snažno smanjuju nivo ROS na način zavisan od koncentracije u fMLP TNF-α stimulisanom PMN.
Inhibicija PMN ROS-a na 0,3 µm izražena u [%] i IC50 [µM] su sumirana ispod svakog jedinjenja ispod njihove hemijske karakterizacije u paragrafu BIOPODACI.
Primer 3.4: In vitro proizvodnja humanih neutrofila i humanih monocita inflamatornih citokina, postupak
Neutrofili i monociti su izolovani iz puhastih kaputa zdravih donora, u uslovima bez endotoksina. Ukratko, penasti premazi su stratifikovani na gradijentu Ficoll-Paque PLUS, a zatim centrifugirani na 400 × g tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Neutrofili su zatim sakupljeni i podvrgnuti sedimentaciji dekstrana nakon čega je usledila hipotonična liza da bi se uklonili eritrociti. Umesto toga, monociti su izolovani iz PBMC, nakon centrifugiranja preko Percoll gradijenta. Humani neutrofili i monociti su suspendovani pri 5×106/ml i 2,5×106/ml, respektivno, u medijumu RPMI 1640 sa dodatkom 10% FBS sa niskim endotoksinom (<0,5 EU/ml; iz BioWhittaker-Lonza, Basel, Švajcarska) i zatim stavljeni u ploče za kulturu tkiva sa 24 bunarčića na 37 °C, 5% CO2 atmosfere, u prisustvu ili odsustvu različitih koncentracija (20-40 µm) jedinjenja. Posle 1 h tretmana lekovima, monociti su stimulisani sa 0,1 µg/ml, dok su neutrofili sa 1 µg/ml ultračistim LPS iz E. coli 0111:B4 soja (InvivoGen). Posle 6 h LPS stimulacije, neutrofili i monociti su sakupljeni i centrifugirani na 300 × g tokom 5 minuta. Supernatanti bez ćelija su odmah zamrznuti na -80 °C.
Koncentracije citokina u supernatantima bez ćelija merene su komercijalno dostupnim ELISA kompletima, specifičnim za ljude: CXCL8, IL-6, TNF-α (Mabtech, Švedska). Granice detekcije ovih ELISA testova bile su: 4 pg/ml za CXCL8, 10 pg/ml za IL-6 i 4 pg/ml za TNF-α.
Statistička analiza je izvršena izračunavanjem srednje vrednosti i standardne devijacije (SD); značajnost je izračunata neuparenim t-testom. Sve statističke analize su obavljene korišćenjem GraphPad Prism 6 (GraphPad softver).
Vrednosti citokina su izražene u ng/ml za svako jedinjenje i sumirane za svako jedinjenje ispod njihove hemijske karakterizacije u paragrafu BIOPODACI.
Primer 3.5: In vitro inhibicija jedinjenjima VEGF-165 indukovana fosforilacija VEGF-receptora na primarnim endotelnim ćelijama umbilikalne vene (HUVEC), postupak
Ćelijska kultura: Primarne ćelije endotela umbilikalne vene (HUVEC) su rutinski uzgajane u 0,1% želatinom prethodno obloženim balonima ili posudama, do pasusa 6. Efekat samih jedinjenja u različitim koncentracijama (0, 1,25, 2,5, 5, 10 i 20 µm) na ćelijsku vitalnost je procenjen pomoću CCK-8 kompleta korišćenjem Tecan Microplate Reader-a (Genios). Da bi se izmerio efekat jedinjenja na vitalnost ćelija izazvanu VEGF-om, HUVEC (1 × 10<4>ćelija/bunariću) su tretirani VEGF (25 ng/ml) prethodno pomešanim sa različitim koncentracijama jedinjenja (0, 1,25, 2,5, 5, 10 i 20 µm) u medijumu kulture bez seruma i faktora rasta (medij za gladovanje) tokom 24 h i 48 h. Jedinjenja u ovom opsegu koncentracija nisu uticala na vitalnost ćelija.
Zečja primarna antitela za VEGFR-2, p-Tir1175 su nabavljena od Cell Signaling Technology (Leiden, Holandija). Fosfo-VEGFR-2 (Tir1175) sendvič ELISA komplet je iz Cell Signaling Technology.
HUVEC su prethodno inkubirani sa jedinjenjima na 0, 0,16, 0,31, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 i 20 µm tokom 60 minuta sa tri sledeća koraka ispiranja toplim medijumom pre stimulacije sa VEGF165 (25 ng/ml). Western blot analiza je izvedena korišćenjem anti-fosfo-VEGFR-2 antitela, a ukupni VEGFR-2 je korišćen kao kontrola opterećenja nakon uklanjanja membrane.
Rezultati inhibicije VEGFR-2-fosforilacije su izraženi kao IC50 u mikroM [µM] u odnosu na VEGF-tretiranu HUVEC kontrolu bez inhibitornog jedinjenja.
Odgovarajuće vrednosti IC50 izražene u [µM] za svako jedinjenje su sumirane ispod svakog jedinjenja ispod njihove hemijske karakterizacije u paragrafu BIOPODACI.
Primer 3.6: In vitro inhibicija oslobađanja citokina jedinjenjima nakon indukcije LPS u punoj krvi čoveka
Cilj ove in vitro metode je da proceni efekte jedinjenja na oslobađanje panela citokina iz pune krvi nakon inflamatorne reakcije izazvane lipopolisaharidom (LPS). Cela krv je inkubirana sa jedinjenjima 1 h pre indukcije LPS. Nivoi citokina u krvi mereni su pomoću panela zasnovanog na multipleksu FACS.
IC50 vrednosti određene za testirana jedinjenja izražene u mikroM [uM] i vrednosti za inhibiciju citokina su navedene za svako jedinjenje.
Efekat na oslobađanje citokina nakon indukcije LPS-a je izveden na jedinjenjima rastvorenim u DMSO ili H2O da bi se postigla 10-struko koncentrovana matična rastvora i rastvorena u medijumu za kulturu.
Test sistem: Puna krv je uklonjena iz jednog donora (u epruvete obložene litijum heparinom; BD Vacutainer; 367886) i razblažena 1:5 sa RPMI 1640 (Thermo Fisher, 61870036). U roku od 30 minuta od uzorkovanja, krv je inkubirana sa jedinjenjima 1 h pre LPS stimulacije (O111:B4 - Sigma L4391; 10 ng/ml konačna koncentracija). Stimulacija je nastavljena pod standardnim uslovima ćelijske kulture (37 °C sa 5% CO2) preko noći (18 h), nakon čega su ploče centrifugirane i supernatant uklonjen i zamrznut na -80 °C dok se ne koriste za analize.
Razblaživanje test jedinjenja: 10x koncentrovani rastvori (u vezi sa konačnim koncentracijama testa) svakog testiranog jedinjenja su pripremljeni sa odgovarajućim rastvaračem (u DMSO ili u vodi). Ovi 10× rastvori jedinjenja (10 µl) su zatim dodati u 90 µl prethodno razblažene pune krvi (puna krv: RPMI1640, 1:5) što rezultira konačnom koncentracijom testa.
Postupak testiranja: Razblažena puna krv (80 µl) je prethodno inkubirana sa jedinjenjima (10 µl) da bi se dobile konačne koncentracije testa od 100, 30, 10, 3, 1, 0,3 i 0,1 × 10<-6>M. Krv je inkubirana na 37 °C sa 5% CO2 tokom 1 sata. LPS je razblažen u medijumu ćelijske kulture do koncentracije od 110 ng/ml; 10 µl je dodato celoj krvi da bi se dobila konačna koncentracija od 10 ng/ml. Ploče su inkubirane na 37 °C tokom 18h. Ploče su centrifugirane na 3000 o/min tokom 5 minuta na 4 °C, a supernatant je uklonjen i zamrznut na -80 °C dok nije izvršena FACS analiza.
Oslobađanje citokina je mereno korišćenjem prilagođenog multipleks sistema (ELISA Genie) prema uputstvima proizvođača. Pripremljeni uzorci su pušteni na Attune NkT protočni citometar (Thermo Fisher).
Kvantifikacija inhibicije oslobađanja citokina: poznati standardi koncentracije su korišćeni kao deo panela citokina da bi se omogućila kvantifikacija svake koncentracije citokina u svakom uzorku. Ovo je izvedeno korišćenjem softvera FCAP Array v3.0. Za određivanje IC50, sirovi podaci su konvertovani u procentualne koncentracije u odnosu na kontrolu rastvarača, koja je postavljena na 100%. Vrednosti IC50 su određene korišćenjem softvera GraphPad Prism 8 sa ograničenjem od dna do 0 i od vrha do 100 korišćenjem krive nelinearne regresije sa promenljivim nagibom brda.
Rezultati: Odnos doze odgovora na oslobađanje citokina nakon LPS indukcije inflamatornog odgovora u punoj krvi je procenjen za sva jedinjenja. IC50 vrednosti su određene za svako jedinjenje za panel citokina (GM-CSF, IFN-gama, IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL -10, IL-12p40, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-18, IL-21, IL-22, IL-33, TGF-beta, TNF-alfa, TNF-beta). Odgovarajući IC50 citokina izraženi u [µM] vrednostima za svako jedinjenje su sumirani ispod svakog jedinjenja ispod njihove hemijske karakterizacije u paragrafu BIOPODACI i takođe u tabeli 13.
PRIMER 4: Formulacije jedinjenja
Primer 4.1: Oralne formulacije jedinjenja Ic-007a
Pet formulacija je razvijeno i pregledano za prikladnost. To su bile i suspenzije i rastvori čiji su detalji dati u sledećoj tabeli.
Tabela 21: Detalji formulacije za suspenziju i rastvore jedinjenja Ic-007a.
Proizvodnja: Suspenzija A i rastvor D:
Primer metode za 100 ml (skala prema potrebi za konačnu zapreminu). Zaliha rastvarača je pripremljena merenjem 5 ml DMSO u čistu posudu. Tačna količina jedinjenja Ic-007a je izmerena i postepeno dodavana u DMSO rastvor uz mešanje na šejkeru, vorteksu ili sonikatoru. Solutol je topljen u vodenom kupatilu na 60 °C u čistom suvom sudu. Kako se rastvor očvrsnuo na sobnoj temperaturi, rastopljeni Solutol je držan u vodenom kupatilu na 60 °C tokom pripreme formulacije. 10 g (10% vol./vol.) rastopljenog Solutola je dodato u zagrejan pogodan obeležen (do krajnje zapremine 100 ml) kontejner.10 ml PEG 400 je dodato u Solutol u zagrejanoj posudi od 100 ml. Osnovni rastvor DMSO leka je dodat u mešavinu Solutola i PEG400 i sadržaj je odmah pomešan, pa je dodato 35 ml dejonizovane vode i pomešano u kupatilu na 40 °C uz povremeno mešanje na vorteksu da bi se rastvorile velike čestice. Formulacija je ohlađena do sobne temperature i dopunjena do konačne zapremine od 100 ml dejonizovanom vodom.
Proizvodnja jedinjenja A, B i C:
Primer metode za 100 ml (skala prema potrebi za konačnu zapreminu). Zaliha rastvarača je pripremljena merenjem 5 ml DMSO u čistu posudu.1 g jedinjenja Ic-007a je izvagano i postepeno dodato u DMSO rastvor uz mešanje na šejkeru, vorteksu ili sonikatu ako je potrebno). Solutol je topljen u vodenom kupatilu na 60 °C u čistom suvom sudu. Kako se Solutol očvršćava na sobnoj temperaturi, rastopljeni Solutol je držan u vodenom kupatilu na 60 °C tokom pripreme formulacije.10 g (10% vol./vol.) rastopljenog Solutola je izvagano u zagrejan pogodan obeležen (do krajnje zapremine 100 ml) kontejner.10 ml PEG 400 je dodato u Solutol u zagrejanoj posudi od 100 ml. Osnovni rastvor DMSO leka je dodat u obeleženi kontejner mešavine Solutola i PEG 400 i odmah pomešan sa sadržajem. Dodato je 35 ml dejonizovane vode i pomešano sa sadržajem i stavljeno u kupatilo na 40 °C uz povremeno mešanje na vorteksu da bi se rastvorile velike čestice. Formulacija je ohlađena do sobne temperature i dalje je podešena pH formula koristeći 1M rastvor natrijum hidroksida (NaOH) na pH 6, 7, 8 i 9. Inicijalne formulacije su napravljene na skali od 1 ml i imale su početni pH od 4,3. Dodata je zapremina od 3 µl NaOH 1M da bi se postigao pH 6 (rastvor A), 22 µl za pH 8 (rastvor B) i 43 µl za pH 9 (rastvor C). Ove formulacije su dozirane odmah nakon proizvodnje.
Utvrđeno je da su formulacija suspenzije od 10 mg/ml i formulacija rastvora od 1 mg/ml fizički stabilne tokom dve nedelje u ambijentalnim uslovima.
Primer 4.2: Oralne formulacije jedinjenja Ia-001a-Tz
Jedinjenje Ia-001a-Tz je pripremljeno kao oralni rastvor od 10 mg/ml u formulacijama sa sastavima nosača prikazanom u tabeli ispod.
Vehikulum je bio nosač ili inertni medijum koji se koristi kao rastvarač (ili razblaživač) u kome je formulisan i/ili primenjen medicinski aktivni agens.
Tabela 22: Detalji formulacije za oralnu formulaciju jedinjenja Ia-001aTz.
Postupak proizvodnje
Da bi se pripremio rastvor od 10 mg/g, 10 mg jedinjenja je tačno izvagano u bočicu i 1 ml vehikuluma je dodat direktno na API i mešan na vorteksu da bi se dobio rastvor.
Priprema vehikuluma
Formulacija A: 10 g nosača je pripremljeno vaganjem 4 g PEG400 u čistu staklenu posudu od 20 ml. Dodat je 1 g Transcutola i komponente su pomešane mešanjem. Ovome je dodato 1 g Solutola HS15, a zatim 4 g vode tipa 1. Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Formulacija B: 10 g nosača je pripremljeno vaganjem 4 g PEG400 u čistu staklenu posudu od 20 ml. Dodat je 1 g Transcutola i komponente su pomešane mešanjem. Ovome je dodat 1 g Solutola HS15.0,5% HPMC 606 vodeni rastvor je pripremljen odmeravanjem 50 mg HPMC 606 u čistu staklenu bočicu. Tome je dodato 9,95 g vode tipa 1. Komponente su mešane 1 h na sobnoj temperaturi da bi se obezbedilo adekvatno mešanje.4 g vodenog rastvora koji sadrži 0,5% HPMC 606 je zatim dodato u rastvor PEG400, Transcutol i Solutol HS15. Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Formulacija C: 10 g nosača je pripremljeno vaganjem 4 g PEG400 u čistu staklenu posudu od 20 ml. Dodat je 1 g Transcutola i komponente su pomešane mešanjem. Ovome je dodat 1 g Solutola HS15. Vodeni rastvor Kollidon VA64 od 0,5% je pripremljen odmeravanjem 50 mg Kollidon VA64 u čistu staklenu bočicu. Tome je dodato 9,95 g vode tipa 1. Komponente su mešane 1 h na sobnoj temperaturi da bi se obezbedilo adekvatno mešanje.4 g vodenog rastvora koji sadrži Kollidon VA64 je zatim dodato u rastvor PEG400, Transcutol i Solutol HS15. Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore. Formulacija D: 10 g nosača je pripremljeno vaganjem 4 g PEG400 u čistu staklenu posudu od 20 ml. Dodat je 1 g Transcutola i komponente su pomešane mešanjem. Ovome je dodato 1 g Cremophor RH40, a zatim 4 g vode tipa 1. Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Formulacija E: 10 g nosača je pripremljeno vaganjem 4 g PEG400 u čistu staklenu posudu od 20 ml. Dodat je 1 g Transcutola i komponente su pomešane mešanjem. Ovome je dodato 1 g vitamina E TPGS, a zatim 4 g vode tipa 1. Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Formulacija F: 10 g nosača je pripremljeno vaganjem 4 g PEG400 u čistu staklenu posudu od 20 ml. Dodat je 1 g Transcutola i komponente su pomešane mešanjem. Tome je dodato 0,5 g Solutol HS15, a zatim 4,5 g vode tipa 1. Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Formulacija G: 10 g nosača je pripremljeno vaganjem 4 g PEG400 u čistu staklenu posudu od 20 ml. Dodat je 1 g Transcutola i komponente su pomešane mešanjem. Ovome je dodato 0,5 g Solutola HS15. Vodeni rastvor Kollidon VA64 od 1% je pripremljen odmeravanjem 100 mg Kollidon VA64 u čistu staklenu bočicu. Tome je dodato 9,9 g vode tipa 1. Komponente su mešane 1 h na sobnoj temperaturi da bi se obezbedilo adekvatno mešanje.4,5 g vodenog rastvora koji sadrži Kollidon VA64 je zatim dodato u rastvor PEG400, Transcutol i Solutol HS15. Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Primer 4.3. Oralne formulacije jedinjenja IIc-007a, IVc-059a, IIIc-061a
Jedinjenja IIc-007a, IVc-059a, IIIc-061a su pripremljena kao oralne formulacije korišćenjem komponenti navedenih u tabeli ispod.
Tabela 23: Detalji oralne formulacije za oralnu formulaciju jedinjenja IIc-007a, IVc-059a, IIIc-061a
Priprema vodenog rastvora SLS 15% na skali od 50 ml:
7,5 g SLS-a je tačno izmereno u volumetrijskom balonu od 50 ml.
Dodata je voda u zapreminu od 50 ml i mešana dok se ne postigne potpuna solubilizacija.
Priprema sredstava za formulaciju:
Formulacija 1: 100 g nosača je pripremljeno vaganjem 40 g PEG 400 (40,0%) u plastičnu čašu.3,5 g Transcutol (3,5%), 12,5 g Cremophor RH40 (12,5%), 4,0 g Meglumin (4,0%), 5 g DMSO (5,0%) i 35 g 15% SLS vod. rastvor (35,0%, konačni SLS 5,25%). Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Formulacija 2: 100 g nosača je pripremljeno vaganjem 40 g PEG 400 (40,0%) u plastičnu čašu.10,0 g Transcutol (10,0%), 15,0 g Cremophor RH40 (15,0%), 4,0 g Meglumin (4,0%), 5 g DMSO (5,0%) i 35 g 15% SLS vod. rastvor (35,0%, konačni SLS 5,25%). Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Vehikulum je dodat direktno u svako jedinjenje pre vorteksiranja i sonikacije tokom 10 minuta. Ako je potrebno, pH formulacije je podešen sa 1M natrijum hidroksidom ili 1M hlorovodoničnom kiselinom da bi se dostigao pH opseg pogodan za oralno doziranje. Rastvori IIc-007a su napravljeni u koncentracijama do i uključujući 70 mg/ml. Rastvori IIIc-061a su napravljeni u koncentracijama do i uključujući 40 mg/ml. IVc-059a rastvori su napravljeni u koncentracijama do i uključujući 150 mg/ml.
Primer 4.4: Intravenske (IV) formulacije
Jedinjenja Ia-001a, Ia-001a-Tz, Ia-001a-Tz/004a, Ic-007a, Ib-010a, IVc-059a, IIIc-061a su pripremljena kao intravenske formulacije.
Detalji formulacije dati u sledećoj tabeli 24 korišćeni su za IV primenu u različitim pretkliničkim in vivo modelima. Rastvori svakog jedinjenja su proizvedeni podešavanjem pH pomoću rastvora natrijum hidroksida dok se ne dobije rastvor.
Tabela 24: IV sastav formulacije
Postupak proizvodnje:
Primer postupka za 10 ml (skala prema potrebi za konačnu zapreminu). Zaliha rastvarača je pripremljena merenjem 0,5 ml DMSO u čistu posudu.100 mg svakog jedinjenja je izvagano i postepeno dodato u DMSO rastvor uz mešanje na šejkeru, vorteksu ili sonikatu ako je potrebno. Solutol je topljen u vodenom kupatilu na 60 °C u čistom suvom sudu. Kako se Solutol očvrsnuo na sobnoj temperaturi, rastopljeni Solutol je držan u vodenom kupatilu na 60 °C tokom pripreme formulacije. 1 g (10% vol./vol.) rastopljenog Solutola je izvagano u zagrejan pogodan obeležen (do krajnje zapremine 10 ml) kontejner.1 ml PEG 400 je dodato u Solutol u zagrejanoj posudi od 10 ml. Osnovni rastvor DMSO leka je dodat u obeleženi kontejner mešavine Solutola i PEG 400 i odmah pomešan sa sadržajem. Dodat je 0,9% fiziološki rastvor* da bi se postiglo 85% ciljne zapremine i sadržaj je pomešan u kupatilu na 40 °C uz povremeno mešanje na vorteksu da bi se rastvorile velike čestice. Formulacija je ohlađena do sobne temperature, dopunjena do krajnje ciljne zapremine (10 ml) sa 0,9% fiziološkim rastvorom* i pH formulacija je podešena korišćenjem 1M rastvora natrijum hidroksida (NaOH) na pH 7,4. Formulacije su filtrirane korišćenjem filtera od 0,2 µm u sterilnu bočicu unutar biološke haube klase II. Formulacije su korišćene za doziranje kod životinja.
* Za neka jedinjenja, 0,9% rastvor soli je zamenjen rastvorom PBS pH 7,4.
Primer 4.5: Intravenske (IV) i intraperitonealne (IP) formulacije
Jedinjenja Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a, IIIc-061a su pripremljena kao formulacije za intravensku i intraperitonealnu primenu. Formulacije su sadržale vodu i dietilamin u molarnim ekvivalentima svakog odgovarajućeg jedinjenja kao što je detaljno prikazano u Tabeli 25. Ove formulacije su korišćene za IV i IP administraciju u različitim pretkliničkim in vivo modelima.
Postupak proizvodnje:
Primer postupka za 1 ml (skala prema potrebi za konačnu zapreminu).
10 mg svakog jedinjenja je tačno izmereno u čistu bočicu. Odgovarajuća količina dietilamina je dodata u bočicu. Zatim je dodata voda da bi se postigla zapremina od 1 ml. Sadržaj je vorteksiran ili sonikiran da bi se formirao rastvor. Tamo gde je bilo potrebno, pH rastvora je promenjen korišćenjem 1M hlorovodonične kiseline da se ovo dovede u opseg pogodan za IV ili IP doziranje.
Tabela 25: molarni ekvivalenti dietilamina potrebni za jedinjenja u IV i IP formulacijama.
Primer 4.6: Očne formulacije
Nekoliko jedinjenja prema predmetnom pronalasku je podneto za razvoj formulacije u očni format. Jedinjenja, njihova konačna koncentracija i oblik su dati u sledećoj Tabeli 26.
Tabela 26: Očne formulacije
Sastav: Sastav formulacije je detaljno prikazan u sledećoj Tabeli 27. Koncentracija API-ja i njihov rezultujući format su varirali.
Tabela 27: Sastav očne formulacije.
Postupak proizvodnje:
Za ona jedinjenja koja su stvarala rastvore, korišćen je sledeći način proizvodnje:
Ukupno 50 mg Kolliphor-a EL je preneto u čistu suvu posudu. Tačna količina jedinjenja je odmerena i postepeno dodavana u Kolliphor EL uz mešanje na magnetnoj mešalici. Zagrevanje na 30 °C je pomoglo da se lek umeša u preparat Kolliphor. U posebnom kontejneru, pripremljen je vodeni rastvor HPMC na 0,5% vol./vol., povidon na 0,5% vol./vol. i polisorbat 80 na 0,1% u pH 7,4 puferu sa fosfatnim puferom (PBS). Zapremina od 600 µl vodenog rastvora je dodata u Kolliphor EL i lek tokom mešanja i odmah je mešana na vorteksu. pH je podešen na 7,4 korišćenjem 1 M NaOH u formulaciji uz mešanje. Zapremina je podešena na ciljnu zapreminu korišćenjem vodenog rastvora. Formulacija je filtrirana korišćenjem filtera od 0,2 µm u sterilnu bočicu unutar biološke haube klase II. Formulacije su spremne za doziranje.
Za jedinjenja koja su stvarala suspenzije, korišćen je sledeći način proizvodnje: Količina od 50 mg Kolliphor EL je izmerena u čistu suvu posudu. Tačna količina različitih jedinjenja je izmerena i postepeno dodavana u Kolliphor EL uz mešanje na magnetnoj mešalici. Zagrevanje na 30 °C je pomoglo da se lek umeša u Kolliphor. U posebnom kontejneru, pripremljen je vodeni rastvor HPMC na 0,5% vol./vol., povidon na 0,5% vol./vol. i polisorbat 80 na 0,1% u pH 7,4 puferu sa fosfatnim puferom (PBS). Vodeni rastvor je filtriran korišćenjem filtera od 0,22 µm. Zapremina od 600 µl vodenog rastvora je dodata Kolliphoru i leku dok se meša, a zatim se odmah meša na vorteks. pH je podešen na 7,4 korišćenjem filtriranog 1 M NaOH uz kontinuirano mešanje formulacije. Zapremina je podešena na ciljnu zapreminu korišćenjem vodenog rastvora. Formulacije su obrađene sonikacijom pre doziranja da bi se omogućilo da se flokulati razbiju i rasprše.
Okularna formulacija jedinjenja Ic-007a, IIc-007a
Tabela 28: Sastav okularne formulacije sa Ic-007a i IIc-007a.
Postupak proizvodnje:
Ukupno 50 mg Kolliphor-a EL je preneto u čistu suvu posudu. Tačna količina jedinjenja je odmerena i postepeno dodavana u Kolliphor EL uz mešanje na magnetnoj mešalici. Zagrevanje na 30 °C je pomoglo da se lek umeša u preparat Kolliphor. U posebnom kontejneru, pripremljen je vodeni rastvor HPMC na 0,5% vol./vol., povidon na 0,5% vol./vol. i polisorbat 80 na 0,1% u pH 7,4 puferu sa fosfatnim puferom (PBS). Zapremina od 600 µl vodenog rastvora je dodata u Kolliphor EL i lek tokom mešanja i odmah je mešana na vorteksu. pH je podešen na 7,4 korišćenjem 1 M NaOH u formulaciji uz mešanje. Zapremina je podešena na ciljnu zapreminu korišćenjem vodenog rastvora. Formulacija je filtrirana korišćenjem filtera od 0,2 µm u sterilnu bočicu unutar biološke haube klase II.
Rastvor jedinjenja IIc-007a: Ukupno 50 mg Kolliphor-a EL je preneto u čistu suvu posudu. Tačna količina jedinjenja (ciljna koncentracija 5 mg/ml) je odmerena i postepeno dodavana Kolliphor EL uz mešanje na magnetnoj mešalici. Zagrevanje na 30 °C je pomoglo da se lek umeša u preparat Kolliphor. U posebnom kontejneru, pripremljen je vodeni rastvor HPMC na 0,5% vol./vol., povidon na 0,5% vol./vol. i polisorbat 80 na 0,1% u pH 7,4 puferu sa fosfatnim puferom (PBS). Zapremina od 600 µl vodenog rastvora je dodata u Kolliphor EL i lek tokom mešanja i odmah je mešana na vorteksu. pH je podešen na 7,4 korišćenjem 0,5 M NaOH u formulaciji uz mešanje. Zapremina je podešena na ciljnu zapreminu korišćenjem vodenog rastvora. Formulacija je filtrirana korišćenjem filtera od 0,2 µm u sterilnu bočicu unutar biološke haube klase II. Formulacije su spremne za doziranje. Pre upotrebe, vorteks jedinjenja IIc-007a rastvore 2 minuta i koristite u roku od 10 minuta.
* može se primetiti izgled gel/koloidne strukture, ali se ponovo raspršuje nakon vorteksiranja.
Suspenzija jedinjenja Ic-007a: Ukupno 50 mg Kolliphor-a EL je preneto u čistu suvu posudu. Tačna količina jedinjenja (ciljna koncentracija 5 mg/ml) je odmerena i postepeno dodavana Kolliphor EL uz mešanje na magnetnoj mešalici. Zagrevanje na 30 °C je pomoglo da se lek umeša u preparat Kolliphor. U posebnom kontejneru, pripremljen je vodeni rastvor HPMC na 0,5% vol./vol., povidon na 0,5% vol./vol. i polisorbat 80 na 0,1% u pH 7,4 puferu sa fosfatnim puferom (PBS).
Vodeni rastvor je filtriran korišćenjem filtera od 0,22 µm. Zapremina od 600 µl vodenog rastvora je dodata u Kolliphor EL i lek tokom mešanja i odmah je mešana na vorteksu. pH je podešen na 7,4 korišćenjem 0,5 M NaOH u formulaciji uz mešanje. Zapremina je podešena na ciljnu zapreminu korišćenjem vodenog rastvora.
Pre upotrebe, suspenzija jedinjenja Ic-007a je obrađena ultrazvukom da bi se razbili flokulati/agregati korišćenjem sledećeg protokola: mala petrijeva posuda/čaša je napunjena vodom unutar sonikatora. Bočica je stavljena u čašu/petrijevu posudu i obrađena ultrazvukom 10 minuta na 40 °C. Posle 10 minuta, bočica je uklonjena i mešana 2 minuta i ponovo obrađena ultrazvukom 10 minuta. Proces se ponavljao ukupno 50 minuta.
Očne formulacije IIc-007a
Sastav vehikuluma i koncentracija jedinjenja prikazani su u Tabeli 29.
Tabela 29: sastav formulacija A, B i C
Da bi se pripremio rastvor od 10 mg/g, 10 mg jedinjenja je tačno izvagano u bočicu i 1 ml vehikuluma je dodat direktno na API i mešan na vorteksu da bi se dobio rastvor.
Da bi se pripremio rastvor od 5 mg/g, 5 mg jedinjenja je tačno izmereno u bočicu i 1 ml vehikuluma je dodat direktno na API i mešan na vorteksu da bi se dobio rastvor.
Priprema vehikuluma
Formulacija A: 50 g vehikuluma je pripremljeno vaganjem 0,25 g HPMC (0,5% vol./vol.) unutar duran staklene boce od 100 ml.49,25 g vode tipa 1 je zatim dodato u bocu, a zatim 0,200 g TRIS (0,4% vol./vol.), 50 mg Tween 80 (0,1% vol./vol.) i 0,25 g PVP K30 (0,5% vol./vol.). Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Formulacija B: 50 g vehikuluma je pripremljeno vaganjem 2,5 g kremofora EL (5% vol./vol.) unutar 100 ml duran staklene boce. Zatim je u bocu dodato 47,3 g vode tipa 1, a zatim 200 mg TRIS-a (0,4% vol./vol.).
Formulacija C: 50 g vehikuluma je pripremljeno vaganjem 2,5 g kremofora EL (5% vol./vol.) unutar 100 ml duran staklene boce. Zatim je u bocu dodato 46,45 g vode tipa 1, a zatim 450 mg TRIS (0,9% vol./vol.) i 600 mg PVP K90 (1,2% vol./vol.). Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Formulacija D: Dietilamin 0,3% zež./vol.: 9,9 g dietilaminskog nosača je pripremljeno dodavanjem 9869 µl vode tipa 1 u staklenu bočicu od 14 ml. Zatim je u bočicu pomoću pipete dodato 44,2 µl (31,3 mg) dietilamina. Rastvor je ostavljen 5 minuta uz mešanje da bi se obezbedila homogenost.
Očne formulacije IVc-059a
Sastav vehikuluma i koncentracija jedinjenja prikazani su u Tabeli 30.
Tabela 30: sastavi formulacija A, B i C
Da bi se pripremio rastvor od 10 mg/g, 10 mg jedinjenja je tačno izvagano u bočicu i 1 ml vehikuluma je dodat direktno na API i mešan na vorteksu da bi se dobio rastvor.
Priprema vehikuluma
Formulacija A: 50 g vehikuluma je pripremljeno vaganjem 2,5 g kremofora EL (5% vol./vol.) unutar 100 ml duran staklene boce. Zatim je u bocu dodato 46,45 g vode tipa 1, a zatim 450 mg TRIS (0,9% vol./vol.) i 600 mg PVP K90 (1,2% vol./vol.). Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Formulacija B: Dietilamin 0,3% vol./vol.: 9,9 g dietilaminskog nosača je pripremljeno dodavanjem 9869 µl vode tipa 1 u staklenu bočicu od 14 ml. Zatim je u bočicu pomoću pipete dodato 44,2 µl (31,3 mg) dietilamina. Rastvor je ostavljen 5 minuta uz mešanje da bi se obezbedila homogenost.
Formulacija C: 50 g vehikuluma je pripremljeno merenjem 49,45 g PBS (metoda pripreme u nastavku) izmereno je u boci od duran stakla od 100 ml. Uzastopno, 250 mg HPMC (0,5% vol./vol.), 250 mg PVP K30 (0,5% vol./vol.) i 50 µl (pipeta za pomeranje tečnosti) tween 80 (0,1% vol./vol.) dodato je u staklenu bocu. Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
PBS preparat: 799,1 mg NaCl, 21,6 mg KCl, 24,9 mg KH2PO4, 180,4 mg Na2HPO4·2H2O je tačno izmereno i rastvoreno u 100 ml vode tipa 1. pH rastvora je bio 7,6.
Očne formulacije Ic-007a i IIc-007a
Jedinjenja su formulisana kao rastvori u nosačima prikazanim u Tabeli 31.
Tabela 31: sastavi formulacija A, B, C i D
Priprema vehikuluma na skali od 50 g
Vehikulum A: 50 g nosača je pripremljeno dodavanjem 0,45 g TRIS-a (0,9% vol./vol.) i 2,5 g Cremphor EL (5,0% vol./vol.) u 47,05 g vode (94,1% vol./vol.). Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Vehikulum B: 50 g nosača je pripremljeno dodavanjem 0,45 g TRIS (0,9% vol./vol.), 2,5g Cremphor EL (5,0% vol./vol.) praćeno 0,1 g Kolliphor RH40 (0,2% vol./vol.) u 46,95% vode (93,9% vol./vol.). Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Vehikulum C: 50 g vehikuluma je pripremljeno dodavanjem 0,45 g TRIS (0,9% vol./vol.), 2,5g Cremphor EL (5,0% vol./vol.), a zatim 0,1 g Kolliphor RH40 (0,2% vol./vol.) i 0,2 g PEG400 u 46,75 vode (93,5% vol./vol.). Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Vehikulum D: 50 g nosača je pripremljeno dodavanjem 0,45 g TRIS (0,9% vol./vol.), 0,5 g meglume (1,0% vol./vol.), 2,5 g Cremphor EL (5,0% vol./vol.) praćeno 0,1 g Kolliphor RH40 (0,2% vol./vol.) do 46,45 vode (92,9% vol./vol.). Smeša je ostavljena da se meša 1 h na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo da se sve komponente rastvore.
Vehikulum je dodat direktno u API da bi se stvorile koncentracije navedene u Tabeli 32. Uzorak je vorteksiran i sonikiran dok se ne dobije rastvor.
Tabela 32: Koncentracija jedinjenja u formulacijama koje koriste nosač A, B, C i D
Da bi se pripremio rastvor od 10 mg/g, 10 mg jedinjenja je tačno izvagano u bočicu i 1 ml vehikuluma je dodat direktno na API i mešan na vorteksu da bi se dobio rastvor.
Da bi se pripremio rastvor od 20 mg/g, 20 mg jedinjenja je tačno izmereno u bočicu i 1 ml vehikuluma je dodat direktno na API i mešan na vorteksu da bi se dobio rastvor.
PRIMER 5: Terapeutska aktivnost jedinjenja
Primer 5.1: Lečenje i/ili prevencija akutnog pankreatisa
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema predmetnom pronalasku je procenjena na mišjem modelu akutnog pankreatitisa. Uzeti su uzorci tkiva da bi se omogućila naknadna analiza parametara pankreatitisa u životu. Uzorci plazme su takođe dobijeni za procenu nivoa izloženosti životinja nakon primene jedinjenja.
Životinje: Ukupno 70 ženki Balb/c miševa starih 8-10 nedelja, težine približno 20-25 g, korišćeno je za studiju (Charles River). Nakon 7 dana aklimatizacije, raspoređeni su u različite grupe. Miševi su smešteni u IVC kaveze (do 5 miševa po kavezu) sa pojedinačnim miševima identifikovanim po repu.
Kavezi, posteljina i voda su dezinfikovani pre upotrebe. Životinje su dobile posteljinu za obogaćivanje klipova kukuruza kako bi se obezbedilo obogaćivanje životne sredine i materijal za gnežđenje. Sve životinje su imale besplatan pristup standardnoj sertifikovanoj komercijalnoj ishrani i vodi. Prostorija za čuvanje životinja održavana je na sledeći način - rt 20-24 °C, vlažnost 30-70% i korišćen ciklus svetlo/mrak od 12 sati. Iako su životinje korišćene u ovoj studiji bile imunokompetentne, priprema rastvora za doziranje i doziranje/vaganje životinja obavljeni su u sterilnom biološkom kabinetu.
Ispitna supstanca i formulacija: u prvom eksperimentu, jedinjenja Ia-001a, Ia-001aTz, Ic-001aTz/004a, Ic-007a, Ib-010a, IIIc-061a, IVc-059a su izmerena i rastvorena u DMSO. Finalna formulacija je bila u 5% DMSO, 10% Solutol, 10% PEG400, 75% 0,9% fiziološki rastvor i pH je podešen na 7 sa 0,5M rastvorom NaOH.
U drugom eksperimentu, jedinjenja Ic-001aTz2, IIc-007a, IIIa-001aTz, IIIc-061a, IIIc-061a-E3, IVc-059a su izmerena i rastvorena u DMSO. Konačna formulacija je u 5% DMSO, 10% Solutol, 10% PEG400, 75% 0,9% fiziološki rastvor i pH je podešen na 7 sa 0,5M rastvorom NaOH. Za per os (PO) doziranje IVc-059a je formulisano u vodi. Rastvori lekova su formulisani na dan doziranja.
Svrha ove studije je bila da se proceni efikasnost jedinjenja u modelu akutnog pankreatitisa (14 dana), generišu uzorci tkiva da bi se omogućila postživotna analiza parametara pankreatitisa i generisala četiri uzorka plazme za procenu nivoa izloženosti životinja nakon prve i poslednje injekcije dobijene od uzorci krvi uzeti 1h i 24h nakon prve i poslednje injekcije.
Dizajn studije: Prvog dana ispitivanja životinje su nasumično raspoređene u grupe za tretman, obezbeđujući podjednak raspored telesne težine. Miševi (osim negativne kontrolne grupe) su tretirani testnim jedinjenjima koja su data 5 minuta pre doziranja ceruleina, nakon čega je sledila injekcija ceruleina u dozi od 2 µg/kg intraperitonealnim putem (IP) dnevno tokom studije.
Tabela 33: Prvi eksperiment.
Tabela 34: Drugi eksperiment.
Tretman test jedinjenja je dat 5 minuta pre doziranja ceruleina.
Tabela 35: raspored studije.
Serijska zapažanja
Telesna težina: telesna težina svih miševa u studiji je merena i beležena svakodnevno; ove informacije su korišćene za izračunavanje preciznog doziranja za svaku životinju.
Opšti znaci i simptomi: miševi su posmatrani svakodnevno i primećeni su bilo kakvi znaci uznemirenosti ili promene opšteg stanja, npr., krzno sa flekicama, nedostatak pokreta, otežano disanje.
Uzimanje uzoraka i analize nakon života: u gore navedenim vremenima uzorak pune krvi (60 µl) je uzet iz lateralne repne vene u epruvete obložene K2-EDTA. Uzorci plazme su pripremljeni i čuvani zamrznuti na -20 °C. Uzorci plazme su poslati klijentu koji pruža bioanalizu Eurofins (FR) za kvantifikaciju jedinjenja.
Terminalno uzorkovanje: Pre prekida, životinje su izmerene. Životinje završne studije su žrtvovane inhalacijom CO2. Terminalni uzorak krvi je uzet punkcijom srca i pripremljena plazma. Aktivnosti lipaze i amilaze su merene putem ELISA pomoću komercijalno dostupnih ELISA kompleta. Preostala plazma je uskladištena za buduće analize citokina. Tkivo pankreasa je resektovano i izmereno, a presek (50 µg) je zamrznut i analiziran za kvantifikaciju jedinjenja u uzorku pankreasa. Sekcija (50 µg) je obrađena za merenje aktivnosti MPO, nivoa IL-33 i TGF-B putem ELISA. Ostatak je fiksiran u formalinu i ugrađen u parafinski vosak. Urađeno je H&E bojenje i sekcija je ocenjena korišćenjem Schmidt standardnog sistema bodovanja, ispitujući: edem, inflamatornu infiltraciju, parenhimsku nekrozu, krvarenje. Izvedeno je Massonovo trihromsko bojenje i područje pokriveno fibroznim tkivom kvantifikovano je digitalno korišćenjem QuPath softvera. Terminalni uzorci seruma su korišćeni za procenu hemije krvi koristeći IdeXX CHEM15 i LYTE4 klip (4 životinje po grupi tretmana).
Rezultati akutnog pankreatitisa nakon 15 dana IV tretmana
Histopatološka procena povrede pankreasa na osnovu 4 kriterijuma: Edem, inflamatorna infiltracija, parenhimska nekroza, krvarenje i rezultat kao što je opisano u nastavku.
Tabela 36: Nivoi rezultata na osnovu 4 kriterijuma
Tabela 37: Nivoi rezultata za grupe životinja
Schmidt rezultat
Schmidt rezultat je procena efikasnosti jedinjenja na osnovu četiri histopatološka kriterijuma kao što je opisano u tabeli ispod. Redosled jedinjenja sa povećanjem Schmidt rezultata (najviši rezultat = 10 je indukovana karuleinom tretman vehikulumom i najniži rezultat = 0 su životinje koje nisu izazvane).
Grafikon Schmidt rezultata za jedinjenja na Slici 2 gde svi proizvodi pokazuju poboljšani Schmidt rezultat u poređenju sa kontrolnim životinjama sa ceruleinom.
Tabela 38: Tabela Schmidt rezultata i četiri parametra
Kao što je prikazano u tabelama ispod, sva jedinjenja Ia-001a, Ia-001aTz, Ic-001aTz/004a, Ic-007a, Ib-010a, IIIc-061a, IVc-059a su pokazala značajno smanjenje nivoa IL33 u tkivu pankreasa u poređenju sa „indukovanom“ grupom. Nivoi TGF-B su značajno smanjeni za Ic-007a, Ib-010a, IIIc-061a, IVc-059a. Globalni Schmidt rezultati su posebno poboljšani za sva jedinjenja, ali posebno za jedinjenja IIIc-061a, IVc-059a.
Tabele 39 i 40 ispod pokazuju terminalne koncentracije MPO u pankreasu u uzorku tkiva pankreasa, koncentracije tkiva IL33 i koncentracije TGF-B.
Tabela 39:
Tabela 40:
U drugom eksperimentu jedinjenja Ic-001a-TZ(2), IIc-007a, Ia-015a, IIIc-061a, IVc-059a su procenjena na 15 mg/k u istom modelu koristeći pirfenidon 100 mg/kg kao pozitivnu kontrolu.
Tabela 41: Rezultati
Amilaza: Sva testirana jedinjenja, osim Ia-015a, rezultirala su značajno nižim nivoima aktivnosti amilaze nego u kontrolama tretiranim indukovanim vehikulumom, međutim nivoi nisu dostigli nivoe kod neindukovanih životinja.
Lipaza: Aktivnost lipaze u serumu bila je veća kod životinja indukovanih i tretiranih vehikulumom nego kod neindukovanih životinja. Tretman pozitivnom kontrolom pirfenidona, Ia-015a, IIIc-061a i IVc 059a je rezultirao aktivnošću lipaze značajno nižom nego kod životinja tretiranih nosačem.
Mijeloperoksidaza (MPO): Aktivnost MPO u tkivu pankreasa kod životinja indukovanih i tretiranih vehikulom bila je značajno veća od one kod neindukovanih životinja, što ukazuje na pankreatitis. Tretman pozitivnom kontrolom pirfenidona, IIIc-061a i IVc-059a je rezultirao nivoima aktivnosti MPO koji su bili značajno niži od kontrola tretiranih indukovanim vehikulumom.
IL-33 i TGF-B: Svi tretmani, osim za IIIc-061a i IVc-059a dozirani PO, rezultirali su nivoima IL-33 u pankreasu koji su bili niži od kontrola koje su tretirane indukovanim nosačem. Kao i kod serumskih nivoa TGF-B rezultiralo je značajno nižim nivoima TGF-B u odnosu na kontrole tretirane indukovanim vehikulumom.
Klinički korišćeni Schmidt kriterijumi za bodovanje zasnovani na intersticijskom edemu, infiltraciji leukocita, nekrozi acinarnih ćelija i krvarenju korišćeni su za procenu delova tkiva pankreasa obojenih H&E. Sva testirana jedinjenja su rezultirala značajno nižim Schmidt rezultatom od kontrola tretiranih indukovanim vehikulumom, pri čemu su IIIc-061a (IV) i IVc-059a (IV) imali niže rezultate od pozitivne kontrole pirfenidona.
Bojenje fibrozom: Komercijalno dostupan komplet za bojenje (Abeam; ab150686, Trichrome Stain) je korišćen za bojenje delova tkiva pankreasa za kolagen. QuPath softver za digitalno snimanje je korišćen za kvantifikaciju procentualne površine pokrivene kolagenom (plavim) bojenjem. Sva testirana jedinjenja su rezultirala značajno nižim površinama trihroma bojenja u odnosu na kontrole tretirane indukovanim vehikulumom.
Primer 5.2: Lečenje i/ili prevencija kancera pankreasa i bubrega:
Cilj ove studije bio je da se pretklinički proceni in vivo studija terapeutske efikasnosti jedinjenja prema predmetnom pronalasku za lečenje singenog modela karcinoma pankreasa kod miševa (Pan02) kod ženki C57BL/6 miševa i singenog modela kancera bubrega (Renca) u ženke BALB/c miševa.
Životinje: C57BL/6 ženke miša (za model Pan02); BALB/c ženke miša (za model Renca), 6-8 nedelja, >17 g, do 5 miševa po kavezu
Pan02 model tretman i grupe: jedinjenja Ia-001a-Tz, Ic-007a, Ib-010a, IVc-059a, IIc-007a svakodnevno 5 dana nedeljno tokom dve nedelje putem IV bolus injekcije u dozi od 15 mg/kg.
Renca model tretman i grupe: jedinjenja Ia-001a-Tz, Ic-007a, Ib-010a, IVc-059a, IIc-007a svakodnevno 7 dana/nedeljno tokom tri nedelje putem IV bolus injekcije u dozi od 15 mg/kg
Kultura ćelija: Renca tumorske ćelije su održavane in vitro sa DMEM medijumom sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma na 37 °C u atmosferi od 5% CO2 u vazduhu. Ćelije u fazi eksponencijalnog rasta su sakupljene i kvantifikovane pomoću brojača ćelija pre inokulacije tumora.
Kultura ćelija: Pan02 tumorske ćelije su održavane in vitro sa RPMI 1640 medijumom sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma na 37 °C u atmosferi od 5% CO2 u vazduhu. Ćelije u fazi eksponencijalnog rasta su sakupljene i kvantifikovane pomoću brojača ćelija pre inokulacije tumora.
Inokulacija tumora za Renca model: svaki miš je inokuliran subkutano u regionu desnog zadnjeg boka sa Renca tumorskim ćelijama (1 × 10<6>) u 0,1 ml PBS-a za razvoj tumora.
Inokulacija tumora za Pan02 model: svaki miš je inokuliran subkutano u prednji desni bočni region sa Pan02 tumorskim ćelijama (3 × 10<6>) u 0,1 ml PBS-a za razvoj tumora.
Randomizacija: Randomizacija je započeta kada srednja veličina tumora dostigne približno 100 (80 - 110) mm<3>. Za oba modela, 48 miševa je uključeno u studiju. Sve životinje su nasumično raspoređene u 6 studijskih grupa. Randomizacija je izvršena na osnovu metode „Uparene distribucije“ metodom više zadataka (Softver StudyDirectorTM, verzija 3.1.399.19). Datum randomizacije je označen kao dan 0.
Posmatranje i prikupljanje podataka: Nakon inokulacije tumorskih ćelija, životinje su svakodnevno proveravane na morbiditet i mortalitet. Tokom rutinskog praćenja, životinje su proverene za bilo kakve efekte rasta tumora i tretmana na ponašanje kao što su pokretljivost, potrošnja hrane i vode, povećanje/gubitak telesne težine (telesna težina je merena dva puta nedeljno nakon randomizacije), matiranje očiju/dlake i bilo koje druge abnormalnosti. Detaljno je zabeležen mortalitet i uočeni klinički znaci za pojedine životinje.
Zapremine tumora su merene dva puta nedeljno nakon randomizacije u dve dimenzije pomoću kalipera, a zapremina je izražena u mm3 koristeći formulu: „V = (L × W × W)/2, pri čemu je V zapremina tumora, L je dužina tumora (najduža dimenzija tumora) i W je širina tumora (najduža dimenzija tumora okomita na L). Težina tumora je merena na kraju studije. Doziranje, kao i merenje tumora i telesne težine su sprovedeni u kabinetu za laminarni protok.
Krajnje tačke studije: Inhibicija rasta tumora (TGI): TGI% je korišćen kao indikacija antitumorske aktivnosti i izražen je kao: TGI (%) = 100*(1-T/C) T i C su bili srednja zapremina tumora (ili težina) tretirane i kontrolne grupe, respektivno, datog dana.
Statistička analiza razlike u srednjem volumenu tumora među grupama sprovedena je pomoću jedne od sledećih metoda:
Koristite podatke prikupljene poslednjeg dana doziranja/posmatranje za svaku pojedinačnu grupu, uprkos različitim pojedinačnim datumima prekida.
Koristite podatke prikupljene na dan kada srednja zapremina tumora grupe nosača dostigne humane krajnje tačke tako da se TGI može izvesti za sve/većinu miševa uključenih u studiju.
Koristite podatke prikupljene na dan kada je bilo koja od tretiranih ili kontrolnih grupa prekinuta čak i ako se preostale grupe tretiraju prema rasporedu.
Razlika u AUC (ΔAUC) = Statistička analiza izvedena sa linearnim modelom regresije mešovitih efekata. Kraj studije: Studija efikasnosti je sprovedena 3 nedelje.
Statistička analiza: Da bi se uporedile zapremine tumora različitih grupa na unapred određeni dan, Bartlett test je prvo korišćen za proveru pretpostavke o homogenosti varijanse u svim grupama. Kada je p-vrednost Bartlett testa ≥0,05, jednosmerna ANOVA je korišćena za testiranje ukupne jednakosti srednjih vrednosti u svim grupama.
Ako je p-vrednost jednosmerne ANOVA <0,05, izvršeno je post hoc testiranje pokretanjem Tukey HSD (iskrena značajna razlika) testova za sva poređenja u parovima i Dunett testovi za poređenje svake grupe tretmana sa grupom nosača. Kada je p-vrednost Bartlett testa <0,05, Kruskal-Wallis test je korišćen za testiranje ukupne jednakosti medijana među svim grupama. Ako je pvrednost Kruskal-Wallis testa <0,05, izvršeno je post hoc testiranje pokretanjem Conover neparametarskog testa za sva poređenja u paru ili za poređenje svake grupe tretmana sa grupom nosača, oba sa jednostepenim podešavanjem pvrednosti. Sve statističke analize su rađene na R-a jeziku i okruženju za statističko računanje i grafiku (verzija 3.3.1). Svi testovi su dvostrani osim ako nije drugačije naznačeno, a p-vrednosti <0,05 se smatraju statistički značajnim.
Rezultati
Tabela 42: Antitumorska aktivnost test artikala sa podacima prikupljenim 13. dana
Tabela 43: Statistička analiza zapremine tumora sa podacima prikupljenim 13. dana
Sažetak rezultata
U ovoj studiji, procenjena je in vivo terapeutska efikasnost test jedinjenja IVc-059a za lečenje potkožnog mišjeg singenog modela karcinoma pankreasa (Pan02) kod ženki C57BL/6 miševa. Jedinjenje IVc-059a, primenjeno u dozi od 15 mg/kg IV, značajno je potisnulo rast tumora, sa TGI vrednošću od 20,98% (P<0,05).
Tabela 44: Srednja vrednost % inhibicije zapremine tumora
Pan02 model
Tabela 45: Srednja vrednost % inhibicije zapremine tumora Renca model
Primer 5.3: Lečenje i/ili prevencija dijabetičke retinopatije (DR)
Životinjski model: Model db/db miša je korišćen i upoređen sa db/+ miševima kao kontrola bez dijabetesa. Miš db/db nosio je mutaciju gena za leptin receptor i bio je model za dijabetes tipa 2 izazvan gojaznošću. Bogdanov i sar. PLoS On, 2014, 9, e97302 je izvestio da db/db miševi reprodukuju karakteristike neurodegenerativnog procesa koji se dogodio u ljudskom dijabetičkom oku. Pored toga, ovaj model je razvio rane mikrovaskularne abnormalnosti (vaskularno curenje) izazvane dijabetesom (Hernandez i sar. Diabetes 2016, 65, 172-187; Hernandez i sar. Diabetologia 2017, 60, 2285-2298). Stoga se ovaj model smatra odgovarajućim modelom za testiranje efikasnosti jedinjenja iz predmetnog pronalaska za lečenje ranih stadijuma dijabetičke retinopatije (DR).
Efekat kapi za oči koje sadrže Ia-007a na vaskularno curenje izazvano dijabetesom testiran je na db/db modelu miša. Miševi, db/db (BKS.Cg-Dock7m /+ Leprdb/J) miševi i miševi bez dijabetesa (db/+) stari 8 nedelja su kupljeni od Charles River Laboratories (Calco, Italija).
Životinje su imale besplatan pristup hrani ad libitum (ENVIGO Global Diet Complete Feed for Rodents, Mucedola, Milano, Italija) i filtriranoj vodi. Miševi su održavani u strogim uslovima okoline temperature (20 °C) i vlažnosti (60%). Štaviše, imali su cikluse od 12 h/12 h svetlost/mrak.
Interventna studija: Kada su db/db miševi bili stari 10 nedelja, Ia-007a kapi za oči ili kapi za oči kao nosač su nasumično davani direktno na gornju površinu rožnjače svakog oka pomoću šprica. Jedna kap (5 µl) Ia-007a (5 mg/ml) u svako oko ili vehikulum (5 µl 0,9% natrijum hlorida) u svako oko je davana dva puta dnevno tokom 14 dana. Petnaestog dana, u oči životinjama je ukapljena kap Ia-007a ili vehikuluma otprilike jedan sat pre obdukcije. Svi eksperimenti su izvedeni u skladu sa principima Evropske zajednice (86/609/CEE).
Propustljivost retinalne vaskulature je ispitana ex vivo procenom curenja albumina iz krvnih sudova u mrežnjaču korišćenjem Evans Blue albuminske metode. U tu svrhu, četiri životinje po grupi su intraperitonealno ubrizgane rastvorom Evans Blue (E2129 SIGMA, Sant Louis, Missouri, USA) (5 mg/ml rastvorenog u PBS pH 7,4). Nakon injekcije, životinje su postale plave, potvrđujući uzimanje i distribuciju boje. Posle 2 sata, miševi su eutanazirani dislokacijom grlića materice, a oči su enukleisane. Mrežnice svake životinje su izolovane, izmerene i brzo zaštićene od svetlosti. Dobijeni su plosnati dijapozitivi, a poklopac je kliznuo sa kapi medijuma za montažu Prolong Gold antifade reagensa (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Oregon, SAD). Digitalne slike iz različitih nasumičnih polja svih mrežnjaka su dobijene korišćenjem konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (FV1000; Olimp, Hamburg, Nemačka) na ×60 koristeći lasersku liniju od 561 nm, a svaka slika je snimljena sa identičnim intenzitetom snopa u veličini od 1024 piksela × 1024 piksela. Za kvantitativnu analizu Evans Blue-a vezanog za albumin, izbrojan je broj ekstravazacija po polju od 0,44 mm<2>. Ovu analizu su izvršili istraživači koji nisu znali za tretman koji su primili miševi.
Rezultati
Koncentracija glukoze u krvi i telesna težina na kraju tretmana bili su slični kod db/db miševa lečenih Ia-007a kapima za oči nego kod db/db miševa tretiranih vehikulom. Ekstravaskularne lokacije Evans Blue identifikovane su u mrežnjači dijabetičkih miševa (Slika 1, bele strelice). Lokalni tretman sa Ia-007a je bio u stanju da značajno smanji broj ekstravazacija po polju, čime je sprečio vaskularno curenje usled narušavanja retinalne barijere krvi.
Primer 5.4: Lečenje i/ili prevencija peritonitisa
Terapeutska efikasnost jedinjenja iz predmetnog pronalaska je procenjena korišćenjem modela peritonitisa indukovanog tioglikolatom kod miševa kako su opisali Cook AD i sar. (J Immunol.2003;171(9):4816-4823) i Tsai JM i sar. (Blood Adv.2019;3(18):2713-2721. doi:10.1182/bloodadvances.2018024026).
C57BL/6J miševima je ubrizgano intraperitonealno (ip) 1 ml jedinjenja u dozi od 50 mg/kg 1 sat pre indukcije peritonitisa. Peritonitis je zatim indukovan sa 1 ml sterilnog tioglikolatnog bujona 4% (tež./vol.) ili PBS kao kontrola. Nakon 3 h, miševi su anestezirani ip injekcijom sa rastvorom PBS koji sadrži 5 mg/ml ketamina i 1 mg/ml ksilazina, a peritonealne šupljine su isprane sa 5 ml ledeno hladnog sterilnogCa2+/Mg2+ HBSS 1X koji sadrži EDTA 2 mm. Ćelije peritonealnog eksudata (PEC) su centrifugirane na 1200 o/min tokom 5 minuta na 4 °C i crvene ćelije su lizirane. PECs su isprani, resuspendovani u PBS 10% FBS, inkubirani sa anti-CD 16/CD32 i mIgG FcR blokatorima i zatim obojeni fluorescentno konjugovanim antitelima da bi se karakterisali migrirani leukociti (anti-CD45, anti-CD11b, anti-Ly6G, anti-CD8a, anti-CD4, anti-CD3). Vijabilnost ćelija je merena isključenjem 7-AAD. Uzorci su uzeti protočnom citometrijom koristeći MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotec) i analizirani korišćenjem softvera FlowJo. Životinje: četiri miša C57BL/6J po grupi za svako jedinjenje u odnosu na četiri miša tretirana nosačem.
Tretman cpds-om: 50 mg/kg ip injekcijom jedinjenja
− Ic-007a: Ubrizgana zapremina: Ic-007a 68,5 µl jedinjenja u DMSO (1,375 mg) 431,5 µl PBS (500 µl ukupna zapremina, 5,87 mm miš oko 28 g
− IIc-007a: Ubrizgana zapremina: 67,25 µl jedinjenja u DMSO (1,345 mg) 431,5 µl PBS-a (500 µl ukupne zapremine, 5,74 mm) pribl.27 g
− IIIc-061a: Ubrizgana zapremina: 58,75 µl jedinjenja u DMSO (1,175 mg) 441,25 µl PBS-a (500 µl ukupne zapremine, 4,56 mm) pribl.23,5 g − IVc-059a: Ubrizgana zapremina: 52,25 µl jedinjenja u DMSO (1,045 mg) 447,75 µl PBS-a (500 µl ukupne zapremine, 5,25 mm) pribl.20,9 g
Tretman proizvodima Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a, IVc-059a obavljen je 60 min pre peritonitisa izazvanog tioglikolatom. Očitavanje je obavljeno 1 h nakon injekcije tioglikolata.
Metoda očitavanja: protočna citometrija za karakterizaciju migriranih leukocita korišćenjem anti-CD45, anti-CD11b, anti-Li6G, anti-CD8a, anti-CD4, anti-CD3.
Rezultati i statistička analiza: Rezultati su analizirani korišćenjem softvera FlowJo. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM. Za statističku analizu se koristi dvostrani Student t test koji koristi nivo značajnosti 0,05.
Rezultati
Tabela 46: Primer podataka za jedinjenje Ic-007a
Tabela 47: sažetak rezultata za četiri jedinjenja
Primer 5.5: Lečenje i/ili prevencija dijabetičke kardiomiopatije
Terapeutska efikasnost jedinjenja iz predmetnog pronalaska je testirana korišćenjem mišjih modela dijabetičke kardiomiopatije koje su opisali Li C i sar. (Cardiovasc Diabetol. 2019;18(1):15. Objavljeno 2. februara 2019. doi:10.1186/s12933-019-0816-2).
Postupak na životinjama i lečenje lekovima: Trideset 8-nedeljnih KK-Ay miševa (genetski model dijabetesa tipa 2) i miševa C57BL/6J smešteni su u kavezima (4-6 po kavezu) sa slobodnim pristupom kutijama za piće/hranu. Miševi su smešteni u prostoriji na 24 °C sa ciklusom svetlo/mrak od 12:12 h.
Miševi modela dijabetesa tipa 2 se hrane ishranom sa visokim sadržajem masti. Glukoza u krvi se meri svakodnevno. Miševi sa koncentracijom glukoze u krvi većom od 15 mm (200 mg/dl) tokom 2 uzastopne nedelje su korišćeni za sledeće eksperimente. Nakon toga, životinje se randomiziraju u grupe (15 po grupi) i uzgajaju 8 nedelja. Grupe uključuju kontrolne grupe: (1) zdravi C57BL/6J miševi bez tretmana; (2) KK-Ay miševi sa dijabetesom tipa 2 bez tretmana; i (3) dijabetički KK-Ay miševi tipa 2 tretirani jedinjenjima iz predmetnog pronalaska.
Ehokardiografska evaluacija: Ehokardiografsko merenje se vrši pre eksperimentalne intervencije i na kraju perioda istraživanja. Ehokardiografija u M režimu opremljena sistemom transduktora sa linearnim nizom od 17,5 MHz (Vevo 2100<™>High Resolution Imaging Sistem; Visual Sonics). Ocenjuju se otkucaji srca (HR) i sledeće strukturne varijable: unutrašnja dimenzija leve komore u dijastoli (LVIDD), unutrašnja dimenzija leve komore u sistoli (LVIDS), debljina interventrikularnog septuma u sistoli (IVSs) i u dijastoli (IVSd) i LV debljina zadnjeg zida u sistoli (LVPWs) i dijastoli (LVPWd). Masa LV se izračunava pomoću formule [(LVIDd LVPWd IVSd)<3>- (LVIDd)<3>× 1,04 × 0,8 0,6]. Funkcija LV se procenjuje sledećim parametrima uključujući frakciono skraćivanje (FS), ejekcionu frakciju (EF) i E/A odnos. Sva merenja sprovodi jedan istraživač koji je slep za eksperimentalne grupe.
Koncentracija hidroksiprolina u miokardu: Meri se koncentracija hidroksiprolina u miokardu u levoj komori da bi se procenio sadržaj kolagena u miokardu. Merenja se vrše spektrofotometrom korišćenjem komercijalnog kompleta (BioVision, Mountain View, Kalifornija, SAD) prema protokolima proizvođača.
Detekcija nivoa serumskih lipida, glukoze, insulina i HbA1c: Na kraju studije, miševi su anestezirani inhalacijom 3% izopentana u vazduhu. Uzorci krvi natašte se sakupljaju u komercijalne epruvete koje sadrže litijum heparin kao antikoagulant kroz sublingvalnu venu svake životinje i centrifugiraju 6 minuta pri 3000 o/min. Plazma se čuva u običnoj epruveti i čuva na -20 °C do analize.
Koncentracije ukupnog holesterola (TC), triglicerida (TG), holesterola lipoproteina niske gustine (LDL-C) i holesterola lipoproteina visoke gustine (HDL-C) u plazmi se određuju spektrofotometrijskim metodama. Nivo glukoze u krvi se meri pomoću glukometra (ACCU-CHEK, Roche, SAD). Nakon gladovanja preko noći, nivoi insulina natašte i proinsulina se određuju korišćenjem kompleta za mišji insulin i proinzulinski enzimski imunosorbentni test (ELISA) (Nanjing Jiancheng Biotech, Kina). Krv se takođe zadržava za merenje HbA1c pomoću kompleta za hromatografsko-spektrofotometrijsku razmenu jona (Biosistems, Španija).
Procena oksidativnog stresa u srčanom tkivu: Životinje su eutanazirane, a srca se uklanjaju i ispiru retrogradno Krebs-Ringerovim rastvorom (115 mm NaCl, 5 mm KCl, 1,2 mm KH2PO4, 25 mm NaHCOs, 1,2 mm mgSO4, 1,25 mm CaCl2 i 11 mm glukoze) na kraju studije. Temperatura rastvora za perfuziju se održava na 37 °C. Srca su zatim izmerena, a srčana tkiva su homogenizovana na ledu u ohlađenom fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS) na pH 7,4, koji sadrži 1 mm EDTA. Homogenati se centrifugiraju u hladnom fiziološkom rastvoru 10 min pri 7000 o/min. Koncentracija proteina u supernatantu se određuje pomoću kompleta albumina goveđeg seruma kao standarda. Supernatanti se koriste za analizu nivoa lipidnog hidroperoksida i nivoa glutation peroksidaze (GSH-Pk), superoksid dismutaze (SOD) i malondialdehida (MDA). Merenja se vrše spektrofotometrom korišćenjem komercijalnih kompleta (Solarbio, Kina) prema protokolima proizvođača. Nivo lipidnog hidroperoksida se izražava kao nmol/mg proteina. Nivoi GSH-Px, SOD i MDA su izraženi kao µmol/mg proteina, nmol/mg proteina i mmol/mg proteina, respektivno. Nivo ekspresije NOX4 se meri Western blot-om. Koriste se mišje monoklonsko anti-Nox4 (1:1000, Abcam) i sekundarno antitelo konjugovano sa peroksidazom rena (CVBIO). β-Aktin (1:1000, Abeam) se koristi kao referenca.
Histološka i imunohistohemijska analiza: Srčana tkiva su fiksirana u 4% paraformaldehidu u 0,1 M fosfatnom puferu tokom 48 h, dehidrirana i ugrađena u parafin, presečena na 4 µm debljine i postavljena na staklene pločice. Massonovo trihromno bojenje se koristi za procenu obima fibroze u srčanom mišiću.
Za izvlačenje antigena, deparafinizovana stakla se drže u rastvoru 10 mm natrijum citrata (pH 6,0) 10 minuta na 100 °C. Sekcije se zatim inkubiraju u 3% vodonik peroksida za blokiranje aktivnosti endogene peroksidaze i inkubiraju sa primarnim antitelom (mišje monoklonsko antitelo na TGF-β1, kolagen I i kolagen III; Abcam) tokom 1,5 h, a zatim odgovarajuće sekundarno antitelo tokom 2,5 h na sobnoj temperaturi. Nakon toga, sekcije su isprane u PBS tri puta i inkubirane u 0,02% rastvoru diamino benzidina tokom 2-8 minuta. Nakon kontrastnog bojenja hematoksilinom, pločice se nakratko isperu, montiraju rezinenom i posmatraju u svetlosnom mikroskopu.
Analiza Nrf2/ARE i TGF-β/SMAD puta pomoću western blotinga:
Western blotting protokol je opisan u našoj prethodnoj studiji. Ukratko, tkivo miokarda se lizira u ledeno hladnom RIPA puferu (150 mm natrijum hlorida, 0,1% natrijum dodecil sulfata (SDS), 0,5% natrijum deoksiholata, 1,0% NP-40, PMSF 1 mm i 50 mm od Tris, pH 8.0) za ukupnu ekstrakciju proteina. Ukupna koncentracija proteina je kvantifikovana pomoću BCA Protein Assay Kit (Medchem Express, SAD). Jednake količine proteina se odvajaju elektroforezom u 12% SDS-poliakrilamidnom gelu (PAGE). Zatim se protein prenosi iz gela na poliviniliden fluoridnu membranu. Nakon blokiranja sa 5% obranog mleka, membrana se inkubira preko noći u primarnom antitelu (Nrf2, HO-1, TGF-β1, p-Smad2, Smad2, p-Smad3, Smad3, Smad7, α-SMA 1: 1000, Abcam). Trake se detektuju specifičnim sekundarnim antitelom konjugovanim sa peroksidazom rena (CVBIO). β-aktin (1: 1000, Abeam) se koristi kao referenca ukupnog ćelijskog proteina.
Primer 5.6: Lečenje i/ili prevencija dijabetesa i zarastanje dijabetičkih rana
Mišji modeli dijabetesa koji koriste streptozotocin (STZ-indukovani dijabetes) korišćeni su za procenu efikasnosti jedinjenja predmetnog pronalaska za zarastanje dijabetičkih rana i generisanje uzoraka tkiva da bi se omogućila post-životna analiza kožnog tkiva.
Životinje: ukupno 104 ženke CD-1 miševa starosti 5-7 nedelja, težine približno 25-30 g, implantirano je za studiju. Oni su kupljeni od Charles Rivera i aklimatizovani 7 dana po dolasku.
Smeštaj za životinje: Miševi su smešteni u IVC kaveze (do 5 miševa po kavezu) sa pojedinačnim miševima identifikovanim po repu. Kavezi, posteljina i voda su dezinfikovani pre upotrebe. Životinje su dobile posteljinu za obogaćivanje klipova kukuruza kako bi se obezbedilo obogaćivanje životne sredine i materijal za gnežđenje. Svaki kavez je bio jasno obeležen karticom sa naznakom broja životinja, pola, soja, roda rođenja, broja studije i datuma početka i lečenja. Kavezi su se menjali jednom nedeljno uz zamenu hrane i vode po potrebi.
Prostorija za čuvanje životinja održavana je na sledeći način - rt 20-24 °C, vlažnost 30-70% i korišćen ciklus svetlo/mrak od 12 sati.
Aseptička tehnika i doziranje: Iako su životinje koje će biti korišćene u ovoj studiji imunokompetentne, priprema rastvora za doziranje i doziranje/vaganje životinja obavljeni su u sterilnom biološkom kabinetu. IV doziranje: Jedinjenja su formulisana u 5% DMSO: 10% Solutol: 10% PEG400: 75% PBS i pH podešen na 7 sa 0,5M rastvorom NaOH. PO doziranje: formulacija je u vodi.
Rastvori lekova su formulisani na dan doziranja, svi preostali na kraju doziranja se čuvaju na -20 °C.
Dizajn studije: Miševima (osim negativne kontrolne grupe) je ubrizgan STZ (55 mg/kg; IP) dnevno tokom 5 uzastopnih dana. Miševi su gladovani 6 sati pre injekcije. Nedelju dana nakon završetka indukcionog nivoa glukoze praćeni su i miševi sa nivoima manjim od 15 mml/l (280 mg/gl) su uklonjeni iz studije jer nisu razvili idealnu težinu dijabetesa. Životinje su anestezirane i rana pune debljine 6 mm je napravljena korišćenjem sterilizovanog udarca za biopsiju. Rane su snimljene (0 dana). Životinje su tretirane i snimane svaka 2 dana do 14. dana (kada su kontrolne rane zalečene od miševa bez dijabetesa). Slike rana su digitalno procenjene za oblast rane i procenat zatvaranja u odnosu na vreme grafički ucrtane.
Tabela 48:
Lečenje će se nastaviti 2 nedelje (14 dana). Brojevi životinja u zagradama se doziraju tokom 7 dana, a zatim uzimaju uzorke za PD analizu usred studije.
Tabela 49: raspored studije:
Serijska zapažanja
Telesna težina: telesna težina svih miševa u studiji je merena i beležena svakodnevno; ove informacije se koriste za izračunavanje preciznog doziranja za svaku životinju.
Opšti znaci i simptomi: miševi su posmatrani svakodnevno i svi znaci uznemirenosti ili promene opšteg stanja, npr. primećeno je krzno sa flekicama, nedostatak pokreta, otežano disanje.
Uzorkovanje sredinom studije: Nakon 7 dana doziranja, 3 životinje po grupi su ubijene, a tkivo rane uklonjeno i podeljeno u 2 dela (A) i (B):
(A) Prvi deo je FFPE i obojen je sledećim: H&E, Massonov trihrom, CD31, TGF-β.
(B) Drugi deo se homogenizuje i koristi za sledeće ELISA testove: Nivoi SOD, GTPk, katalaze, TNF-α, IL-6, TGF-β.
Prekid: Životinje završne studije su ubijene inhalacijom CO2. Pre okončanja, životinje se mere. Raniji završetak: Rani prekid životinje se vrši ako se izmeri gubitak težine od ≥20% i za bilo koju ugroženu životinju koja pokazuje kritične znake i simptome ili nemogućnost da jede/pije.
Rezultati:
Glukoza u krvi: Indukcija sa STZ je rezultirala značajnim povećanjem glukoze u krvi u poređenju sa neindukovanim kontrolama vehikuluma. Tretman sa Ia-001a, IIIc-061a i IVc-059a IV je rezultirao značajnim smanjenjem nivoa glukoze u krvi u poređenju sa indukovanim kontrolama vehikuluma. Već posle 7 dana sva jedinjenja su pokazala određeni stepen ubrzanog zarastanja rana u modelu dijabetesa izazvanog STZ (Slika 10, 3 životinje po grupi uzorkovane nakon 7 dana doziranja). Uzorkovano je tkivo kože.
Primer 5.7: Lečenje i/ili prevencija dijabetičkih ulkusa stopala
Jedinjenja iz predmetnog pronalaska su testirana korišćenjem modela dijabetičkih ulkusa pacova kako su opisali Zhang Y i sar. (J Diabetes Res.2016, 2016, 5782904. doi: 10.1155/2016/5782904).
Zarastanje rana na koži i drugim mukoznim tkivima uključuje složen niz događaja uključujući zgrušavanje, akutnu i hroničnu upalu, reepitelizaciju, formiranje granulacionog tkiva, kontrakciju rane i remodeliranje vezivnog tkiva. Međutim, nekoliko genetskih i stečenih stanja, kao što su starenje, pothranjenost (npr. nedostatak vitamina C i proteina), infekcija, hipoksija i genetske bolesti kao što je Ehlers-Danlosov sindrom, mogu narušiti ovaj reparativni proces. Među ovim stanjima, dijabetes melitus je najčešći uzrok oštećenih ili nezaceljenih rana. Kao primer, klinički značaj dugotrajne hiperglikemije je naglašen alarmantnim podacima koji pokazuju da 85% nelečećih čireva na dijabetičkom stopalu na kraju zahteva amputaciju. „Put do hronične rane“, kako su istakli autori nedavne studije, fokusiran je na produženu ili hroničnu upalu koju karakteriše aktivacija makrofaga (kao i akumulacija neutrofila) što je dovelo do povišenih nivoa proinflamatornih citokina, reaktivnih vrsta kiseonika, matriks metaloproteinaze (MMP) i druge neutralne proteinaze (npr. elastaza). Ovo, zajedno sa nedostatkom endogenih inhibitora proteinaze, sve dovodi do „prekomerne degradacije matriksa, degradacije faktora rasta i poremećene epitelizacije“.
U prvom eksperimentu, petnaest odraslih mužjaka Sprague-Davlei pacova (telesne težine 300-325 g, Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA) je ubrizgano kroz repnu venu sa bilo 10 mm citratnog slanog pufera pH 4,5 (kontrole bez dijabetesa, NDC) ili isti rastvor koji sadrži streptozotocin (STZ; ENZO Life Sciences, Inc., Plymouth Meeting, PA; 70 mg/kg telesne težine) za izazivanje dijabetesa tipa I. Pacovi su zatim raspoređeni u pet eksperimentalnih grupa opisanih u nastavku (n = 3 pacova/grupi). Svim pacovima je dat neograničen pristup hrani i vodi. U roku od 48 sati, pacovi kojima je ubrizgana STZ pokazali su ozbiljno povišene nivoe glukoze u urinu. Tri nedelje nakon izazivanja dijabetesa, koža leđa svih pacova je obrijana i serija od šest standardnih rana po pacovima, svaka prečnika 6 mm, napravljena je pomoću hirurške trefine. Formirano je sledećih pet eksperimentalnih grupa (u ovom početnom eksperimentu, tretman u svim grupama trajao je sedam dana; dugoročna studija je opisana u nastavku u eksperimentu 3): pacovi nedijabetičke kontrole (NDC) tretirani svakodnevnom lokalnom primenom belog vazelina („vehikulum“); dijabetički pacovi (D grupa) lokalno tretirani dnevno samo vehikulumom; dijabetički pacovi tretirani ispitivanim jedinjenjima.
Na kraju ovog vremenskog perioda, šest kružnih rana po pacu se klinički procenjuje merenjem kaliperom prečnika rana u milimetrima, uzimaju se uzorci krvi, pacovi se žrtvuju, a uzorci kože seciraju radi histološke/histohemijske i biohemijska procena kao što je opisano u nastavku.
Sedmog dana nakon stvaranja standardizovanih rana, sve životinje se anesteziraju, uzimaju se uzorci krvi za glukozu u krvi (One Touch ultra Glucometer; Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ) i HbA1c (Bayer A1CNow Selfcheck, Sunnyvale, CA) merenja, i, nakon što su dole navedene procedure završene, pacovi su žrtvovani inhalacijom CO2.
Slike se prave za klinička merenja radi procene zatvaranja rane (18 rana po eksperimentalnoj grupi). Procenat smanjenja površine rane izračunava se merenjem prečnika (u milimetrima) svake rane pre i posle protokola tretmana.
Tkiva rane 7. dana su izrezana sa dva mesta po pacu i skupljena za biohemijsku analizu. Svaki bazen tkiva je homogenizovan, ekstrahovan na 4 °C sa 5 M uree u 50 mm Tris-HCl pufera (pH 7,8) koji sadrži 0,2 M NaCl i 5 mm CaCl2 preko noći, a zatim centrifugiran 1 sat na 11.000 × g, kako je opisano od nas ranije. Supernatanti se dijaliziraju protiv pufera Tris-HCl, NaCl i CaC12, a proteinaze su delimično prečišćene dodavanjem amonijum sulfata do 60% zasićenja. Precipitirane proteinaze su analizirane pomoću ELISA na kolagenaze mmP-8 (Sigma-Aldrich Life Sciences Inc., St. Louis, MO) i mmP-13 (TSZ Scientific LLC, Framingham, MA).
Biopsije svakog od dva mesta rane, uključujući okolno neranjeno tkivo, se uzimaju i fiksiraju u 10% neutralnom puferisanom formalinu tokom 24 sata, a zatim se prebacuju u 50% etanol pre nego što se gruša, dehidracija alkoholom, čišćenje ksilonom, ugradnja parafina i sekcija. Sekcije od pet mikrona su obojene H&E i Massonovim trihromom, a rastojanje između ivica rane se meri histomorfometrijski korišćenjem kalibrisanog okularnog mikrometra i potvrđene analize slike. Poslednje dve rane po pacovu su secirane, hidrolizovane i analizirane na hidroksiprolin kao što je opisano u nastavku.
Na kraju protokola tretmana od 14 i 30 dana, fizička merenja i histološke i histohemijske procene su iste kao one koje su gore opisane za 7-dnevni eksperiment. Pored toga, za sva tri vremenska perioda, uzorci tkiva iz biopsija 6 mm su hidrolizovani dva puta u 2 N NaOH na 120 °C po 1 sat svaki put. Alikvoti od 50 µl hidrolizata kožnog tkiva se zatim analiziraju na hidroksiprolin, aminokiselinu koja se u suštini nalazi samo u kolagenu.
Primer 5.8: Lečenje i/ili prevencija dijabetičke retinopatije i dijabetičke nefropatije
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema predmetnom pronalasku je procenjena korišćenjem dijabetičkog mišjeg modela korišćenjem DBA/2 soja miša sa STZ indukcijom dijabetesa i praćenjem dijabetičke retinopatije uključujući oštećenje bubrega. Pet nedelja nakon indukcije dijabetesa primenom male doze STZ injekcije tokom 5 uzastopnih dana, odnos albumin:Cr u urinu je 424 puta u poređenju sa 36,9 za kontrolne grupe odgovarajućeg uzrasta.
Za lečenje dijabetičke nefropatije, DBA/2 miševi su indukovani STZ (mala doza tokom 5 uzastopnih dana). Nedelju dana nakon završetka indukcije, praćeni su nivoi glukoze i miševi sa nivoima manjim od 15 mml/l (280 mg/0,1 l) su uklonjeni iz studije jer nisu razvili dijabetes dovoljne težine da bi doveli do povrede bubrega. Nivoi glukoze su praćeni nedeljno i 5 nedelja nakon STZ indukcije biohemijska procena oštećenja bubrega je sprovedena merenjem nivoa albumina i kreatinina u urinu i potvrđivanjem da su u željenom opsegu. Nakon uspešnog završetka ove faze životinje su raspoređene u grupe za tretman.
Tretman je obavljen četiri nedelje (IV doziranje) uz nedeljnu procenu nivoa glukoze u krvi i albumina/kreatinina u urinu. Na kraju perioda tretmana životinjama su uzeti sledeći uzorci:
− Krv za merenje glukoze i azota uree u krvi (BUN)
− Krv za merenje serumskog kreatinina
− Urin za konačni odnos albumin/kreatinin.
− Reseciran je bubreg i FFPE: Picro-Sirius Red, Massonov trihrom i H&E bojenje je obavljeno da bi se identifikovala područja fibroze, zajedno sa dokazima o mezangijalnoj sklerozi, arteriolarnoj hijalinozi, zadebljanju glomerularne bazalne membrane (GBM)
Da bi se procenio efekat jedinjenja na dijabetičku retinopatiju, životinje su imale nedeljne slike snimljene preko Fundus kamere. Neposredno pre žrtvovanja, životinjama je ubrizgan FITC-dekstran preko repne vene. Tokom uzorkovanja uzorkovane su oči i fiksirane u formalinu. Retinal Flatmounts su pripremljeni i ispitani fluorescentno posmatrajući efekte jedinjenja na vaskularnost i curenje krvnih sudova (okrivljeno visokim pozadinskim bojenjem). Grupe životinja (n=8 miševa po grupi):
Tabela 50:
Lečenje je nastavljeno tokom 4 nedelje (28 dana) uz nedeljno merenje glukoze u krvi i albumina/kreatinina u urinu.
Žrtvovanje nakon poslednjeg doziranja jedinjenja (agensa), uzorkovanja organa i krvi.
Tabela 51: raspored studije
Serijska zapažanja
Telesna težina: Telesna težina svih miševa u studiji je merena i beležena svakodnevno; ove informacije su korišćene za izračunavanje preciznog doziranja za svaku životinju.
Opšti znaci i simptomi: Miševi su posmatrani svakodnevno i primećeni su bilo kakvi znaci uznemirenosti ili promene opšteg stanja, npr. krzno sa zvezdicama, nedostatak pokreta, otežano disanje.
Uzorkovanje i naknadne analize u životu
• Neposredno pre terminalnog uzorkovanja, 4 životinje po grupi su ubrizgane FITC-dekstranom za procenu retine na ravnoj površini.
• Terminalno uzorkovanje:
∘ Terminalni uzorci krvi uzeti su punkcijom srca i pripremljeni plazma/serum od svake životinje.
▪ Meri se glukoza u krvi
▪ Izmeren kreatinin u serumu
▪ BUN mereno
▪ Urin ALB/KREATININ
▪ ELISA za CRP, TNF-α, IL-6 i TGF-β
▪ Preostala plazma je uskladištena za analizu citokina
∘ Bubrežno tkivo je resecirano i izmereno
▪ Jedan bubreg je brzo zamrznut radi moguće bioanalize ili druge analize.
▪ Jedan bubreg je fiksiran u formalinu i ugrađen u parafinski vosak. • H&E i Massonov trihrom bojenje skrining za
o mezangijalna i glomeruloskleroza,
o arteriolarna hialinoza
o GBM zadebljanje
∘ Očno tkivo da bude FFPE
▪ Drugo oko (4 po grupi tretmana) je korišćeno za analizu ravnog montiranja retine za merenje vaskularnog uzorka
▪ Područje pokriveno plovilima
▪ Procena vaskularnog curenja
Prekid: Životinje završne studije su žrtvovane inhalacijom CO2. Pre prekida, životinje su izmerene.
Rezultati: jedinjenja Ia-001a, IIIc-061 i IVc-059a značajno su smanjila nivo glukoze u krvi u DBA/2 soju miša sa STZ indukcijom dijabetesa kao što je prikazano na Slici 9 (prikazane jedna i dve nedelje).
Primer 5.9: Lečenje i/ili prevencija Beh etova bolest (BD)
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema predmetnom pronalasku je testirana korišćenjem mišjeg modela Behcetove bolesti kako su opisali ZHENG i sar. (Acta Derm Venereol 2015; 95: 952-958).
Behcetova bolest je hronični, rekurentni, multisistemski, inflamatorni poremećaj koji pogađa uglavnom oralnu i urogenitalnu sluzokožu i uvealni trakt. Iako su etiologija i patogeneza Behcetove bolesti nepoznate, predložene su brojne etiologije, uključujući faktore životne sredine, infektivne i imunološke faktore; autoimuna osnova, koju karakterišu cirkulišući imuni kompleksi i aktivacija komplementa, dobija sve veće prihvatanje. Da bi se testirala i razumela imunopatogeneza Behcetove bolesti, životinjski modeli su razvijeni na osnovu zagađivača životne sredine, peptida dobijenih od bakterijskih i humanih proteina toplotnog šoka i injekcija virusa. Korišćenje ovih životinjskih modela odvojeno i/ili istovremeno omogućava efikasnije istraživanje Behcetove bolesti.
Nedavno su razvijeni životinjski modeli kako bi se pronašle efikasne i bezbedne opcije lečenja. Aktivacija neutrofila je jedan od aspekata imunopatogeneze BD. Neutrofili imaju ključnu ulogu u urođenim imunim odgovorima. Kako tipične lezije BD kao što su pustularni folikulitis, reakcije patergije i hipopion imaju značajne neutrofilne infiltracije, ispitivane su funkcije neutrofila i status aktivacije. Postoje suprotstavljeni izveštaji o povećanoj, normalnoj ili smanjenoj bazalnoj i fMLP stimulisanoj proizvodnji superoksida, fagocitozi, hemotaksiji i neutrofilno-endotelnoj adheziji u BD. U modelu HLA-transgenog mikrofona koji se pretpostavlja za BD, jedina uočena abnormalnost je povećano oslobađanje superoksida kao odgovor na fMLP. Visoki superoksidni odgovori su takođe prisutni kod HLA-B51+ pacijenata i zdravih kontrola u istoj studiji.
Model miša sličan Behcetovoj bolesti razvijen je inokulacijom HSV tipa 1 uzgojenog u Vero ćelijama kod 4–5 nedelja starih muških miševa Instituta za istraživanje kancera (ICR). Ukratko, ušne školjke eksperimentalnih miševa se izgrebu iglom i dva puta se inokuliraju virusom, u razmaku od 10 dana. Inficirani miševi se posmatraju 16 nedelja nakon konačne inokulacije. HSV inokulisani miševi koji imaju najmanje 2 simptoma slična Behcetu korišćeni su kao BD model miša (n=5). I neinficirani ICR miševi (n = 2) i HSV inokulisani, ali asimptomatski, miševi.
Primer 5.10: Lečenje i/ili prevencija uveitisa (UVE)
Terapeutska efikasnost jedinjenja iz ovog pronalaska je testirana korišćenjem životinjskih modela autoimunog uveitisa uključujući uveitis izazvan endotoksinom (EIU) kod pacova kao što su opisali Fruchon S i sar. (Molecules. 2013;18(8):9305-9316. Objavljeno 5. avgusta 2013. doi:
10.3390/molecules18089305). Ovaj model se smatra klinički relevantnim modelom za ljudski prednji uveitis. Sastoji se u sistemskoj primeni lipopolisaharida (LPS) što dovodi do akutnog inflamatornog odgovora u prednjem i zadnjem segmentu oka sa slomom krvno-očne barijere i infiltracijom ćelija upale. Klinički znaci EIU odražavaju promene uočene u bolesti kod ljudi. Terapeutski efekat jedinjenja iz predmetnog pronalaska je stoga testiran na modelu EIU kod pacova, u poređenju sa „zlatnim standardom“ deksametazonom.
Životinje: Uključuju se samo životinje bez vidljivih znakova očnih defekata. Životinje se pregledaju tokom perioda pre testiranja, a posebna pažnja se poklanja očima. Oni se drže na posmatranju nedelju dana pre eksperimenta. Životinje su smeštene pojedinačno u standardnim kavezima i imale su slobodan pristup hrani i vodi iz slavine.
Studija očne tolerancije: Studija se sastojala od tri grupe od tri mužjaka Sprague-Dawley pacova. Dana 0, životinje su izvagane, anestezirane i primenjene jednom intravitrealnom injekcijom od 5 µl u oba oka. Prva grupa prima fiziološki nosač (NaCl 0,9%), a druge grupe dobijaju različite doze jedinjenja iz predmetnog pronalaska. Svaka životinja se zatim procenjuje kliničkim posmatranjem i pregledima očiju. Očni pregledi uključuju funduskopiju, pregled rožnjače pomoću prorezne lampe (SLE) korišćenjem fluoresceinske boje koja omogućava McDonald-Shadduck bodovanje. McDonald-Shadduck sistem bodovanja se bavi: parametrima konjunktiva (zagušenje, otok i iscjedak), vodeni plamen (intenzitet Tindallovog fenomena) kao pretpostavljeni dokaz sloma krvno-vodene barijere; ubrizgavanje sekundarnih i tercijalnih sudova u iris; zamućenost, njena relativna površina, neovaskularizacija i integritet epitela (obeležavanje fluoresceinom) rožnjače; integritet sočiva. Nakon završnog pregleda oka, sve životinje se žrtvuju. Oči su sakupljene na obdukciji, fiksirane u modifikovanom Dejvidsonovom rastvoru tokom 12 h, zatim 10% neutralnog puferovanog formalina i obrađene za histologiju. Sekcije tkiva obojene hematoksilinom-eozinom se procenjuju svetlosnim mikroskopom od strane veterinarskog patologa sa sertifikatom odbora.
Model uveitisa izazvan endotoksinom (EIU) pacova: Trideset šest ženki albino Lewis pacova nasumično je podeljeno u šest grupa od po šest životinja. EIU se indukuje injekcijom od 100 µl sterilnog fiziološkog rastvora bez pirogena koji sadrži 200 µg LPS (lipopolisaharida iz Salmonella tiphimurium, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin, Francuska). Životinje su tretirane neposredno pre indukcije EIU intravitrealnom injekcijom od 5 µl u oba oka fiziološkog rastvora (NaCl 0,9%) koji ne sadrži aktivni sastojak, ili sa testiranim jedinjenjima, ili 20 µg deksametazona. Životinje se ispituju pomoću prorezne lampe (SLE) na 24 h, odnosno, klinički vrhunac bolesti u ovom modelu. Intenzitet kliničke upale oka se ocenjuje na skali od 0 do 5 za svako oko. Ocena 0 ukazuje na odsustvo upale. Stepen 1 ukazuje na prisustvo minimalne vazodilatacije irisa i konjunktiva, ali bez posmatranja žarišta ili ćelija u prednjoj komori (AC). Stepen 2 ukazuje na prisustvo umerenog proširenja irisa i konjunktivalnih sudova, ali bez evidentnog proširenja ili ćelija u AC. Ocena 3 ukazuje na prisustvo intenzivne dilatacije krvnih sudova irisa, rasplamsavanja i manje od deset ćelija po polju prorezane lampe u AC. Stepen 4 ukazuje na prisustvo težih kliničkih znakova od stepena 3, sa više od deset ćelija po polju prorezne lampe u AC, sa ili bez formiranja hipopiona. Ocena 5 ukazuje na prisustvo intenzivne inflamatorne reakcije, formiranje fibrina u AC i potpunu izolaciju zenice. Na kraju eksperimenta, tj.24 h nakon izazivanja LPS-a, pacovi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom pentobarbitala (30 mg/kg), a zatim ubijeni smrtonosnom dozom pentobarbitala.
Merenje koncentracije citokina u očnim tečnostima: Očna vodica i staklasto telo iz oba oka svake životinje uzimaju se nakon žrtvovanja. Multipleks analizom određuju se količine proinflamatornih T pomoćnih citokina TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-17 i IFNγ, kao i antiinflamatornih citokina IL-4 i IL-10.
Merenje koncentracije citokina u serumu: Serumi od tri grupe pacova (fiziološki nosač, jedinjenje 10 µg i deksametazon) su sakupljeni na kraju eksperimenta i čuvani na -80 °C. Koriste se za istovremeno određivanje pet nivoa citokina (IFNγ, TNFα, IL-2, IL-4 i IL-10) pomoću Citometric Bead Arrai (pacov CBA Flek set, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) na FACS Calibur protočni citometar (BD Biosciences) prema uputstvima proizvođača. Količine svakog od citokina su analizirane u odnosu na standardne krive korišćenjem softvera FCAP Array (BD Biosciences).
Primer 5.11: Lečenje i/ili prevencija dijabetičke senzomotorne polineuropatije i dijabetičke neuropatije
Terapeutska efikasnost jedinjenja iz ovog pronalaska je testirana korišćenjem pacovskih modela dijabetičke periferne neuropatije (Kambiz S. i sar. (PLoS One.2015;10(6):e0131144]; PLoS One.2015;10(5):e0126892. Objavljeno 18. maja 2015. doi:10.1371/journal.pone.0126892).
Životinje: Ženke pacova VAG/RijHsd (n = 27, stare 10 nedelja, težine 130-150 grama) su kupljene od Charles River-a (l'Arbresle, Francuska). Životinje su smeštene u parovima u kavezima sa kapuljačom na sobnoj temperaturi po 12-časovnom rasporedu svetlo/mrak i daju im se voda i hrana ad libitum.
Indukcija dijabetesa: Dijabetes je kod 21 pacova izazvan jednom intraperitonealnom injekcijom STZ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) u dozi od 65 mg/kg telesne težine u 0,05 mol/l natrijum citratnog pufera, pH 4,5, kao što je prethodno opisano. Pacovi su nasumično raspoređeni u 3 grupe: A, B i C (n = 7 u svakoj grupi). Nakon indukcije dijabetesa, grupa A je ubijena nakon 4 nedelje, grupa B nakon 6 nedelja i grupa C nakon 8 nedelja. Kontrolnu grupu čini 6 pacova koji primaju jednu intraperitonealnu injekciju sa jednakom zapreminom vehikuluma bez STZ. Kontrolni pacovi su praćeni 8 nedelja. Glukoza u krvi se meri iz krvi iz repne vene pomoću glukometra (OneTouch, Life Scan, Milpitas, Kalifornija, SAD). Dijabetes se dijagnostikuje kod pacova kada je nivo glukoze u krvi veći od
20 mmol/l tokom cele 4 nedelje nakon indukcije dijabetesa.
Protok krvi i oksigenacija kože zadnjih šapa: Kombinovani sistem laserske dopler flovmetrije i spektrofotometrije (O2C, LEA Medizintechnik, Giessen, Nemačka) se koristi za neinvazivno merenje protoka krvi i zasićenosti kiseonikom golih stopala zadnjih šapa. I kod dijabetičara i kod kontrolnih pacova, procenat zasićenosti kiseonikom i količina krvotoka kože procenjeni su na 4, 6 i 8 nedelja.
Stopa zagrevanja nakon izlaganja hladnoći: Temperatura kože se procenjuje korišćenjem ugrađene infracrvene digitalne video kamere (320 × 240 piksela) sistemom za prikupljanje podataka od 1 Hz (ThermaCAM Researcher 2001 HS; FLIR Systems, Berchem, Belgija), a svi podaci se kontinuirano prikupljaju pomoću laptopa. Udaljenost između kamere i zadnje šape je 13 cm ± 2 cm. Veličina piksela snimaka temperature je 0,8 × 0,8 mm. Temperatura kože cele plantarne zadnje šape se beleži dok je životinja fiksirana nakon što je životinja stavljena na ploču od 14°C u trajanju od 5 sekundi. Minimalna temperatura zadnjih šapa se eksportuje u tekstualne datoteke pomoću ThermaCAM Researcher Pro (verzija 2001-HS; FLIR Systems, Wilsonville, Oregon, USA). Područje interesovanja se bira crtanjem linije koja okružuje čitave plantarne zadnje šape. Prosečna stopa zagrevanja se pokazuje kao povećanje temperature kože za 120 sekundi.
Termička osetljivost: Da bi se utvrdila pojava termičke preosetljivosti, sprovode se testovi hladne i vruće ploče kao što je prethodno opisano. Ukratko, pacovi su smešteni u komoru otvorenog tipa sa čistim zidovima sa temperaturom površine od 5 °C (hladna ploča) ili 50 °C (vruća ploča). Ovi eksperimenti se izvode u odvojenim danima kako bi se sprečile smetnje. Primećuje se vreme do povlačenja zadnje šape ili lizanja.
Von Frey test: U Von Frey testu, koji se koristi za određivanje praga mehaničke osetljivosti za nocicepciju, svaki pacov je smešten u komoru sa mrežastim metalnim podom. Zatim, Von Freydlake, u rasponu od 2 do 300 grama, se primenjuju 5 puta, a rezultat je pozitivan kada se posmatraju najmanje 3 mahanja šapama (odgovor refleksnog povlačenja životinje), kao što je prethodno opisano. Kontrolna grupa je služila kao referentna grupa.
Elektromiografija (EMG): Inervacija motornih aksona u mišićima se procenjuje snimanjem izazvanih CMAP vrh-vrh amplituda i latencije mišića gastrocnemiusa u grupama sa dijabetesom i kontrolnim životinjama. CMAP vrhvrh amplitude i latencije se snimaju i usredsređuju za grupu od 20 odgovora.
Prosečne amplitude u svakoj grupi dijabetesa su upoređene sa kontrolnom grupom. MNCV se izračunava kao rastojanje stimulativne elektrode do elektrode za snimanje (mm)/latencija (ms). Priprema tkiva: Posle 4, 6 ili 8 nedelja, životinje su ubijene prevelikom dozom pentobarbitala (100 mg/kg ip). Za svakog pacova, plantarna koža zadnje šape je secirana i direktno fiksirana u uranjanju u 2% paraformaldehid-lizin-periodat (PLP) tokom 24 sata na 4 °C. Koža se dalje obrađuje i ugrađuje u želatin kao što je prethodno opisano. Konačno, ugrađena koža je presečena na 40 µm mikrotomom za zamrzavanje i sakupljena u glicerolu za dugotrajno skladištenje na -20 °C.
Tkivo pankreasa pacova je sakupljeno, fiksirano u 10% neutralnom puferisanom rastvoru formalina i stavljeno u parafin. Nakon toga, ovi uzorci su obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E). Svaki uzorak se procenjuje pomoću mikroskopa sa svetlim poljem i skenira u digitalne slajdove (Nanozoomer 2.0 serija, Hamamatzu, Japan).
Imunohistohemija: Imunohistohemija delova kože se izvodi kao što je prethodno opisano da bi se polukvantificirala gustina senzornih nervnih vlakana koja inerviraju kožu i da bi se procenilo prisustvo CD-31 pozitivnih endotelnih ćelija. Sekcije kože se inkubiraju 48 sati u koktelu od 2% BSA koji sadrži razblaženo primarno antitelo Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5, 1/10.000, antizec, Life Sciences, New York, SAD) ili anti- CD31+ (1/5000, anti-zec, Spring Bioscience, California, SAD) na 4 °C. Nakon toga, delovi kože se inkubiraju sa odgovarajućim sekundarnim biotinilovanim antitelom obeleženim peroksidazom rena (HRP) (1/200, Biotine, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) tokom 90 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija 3,-3' diaminobenzidina (DAB) se zatim koristi da bi se otkrila mesta vezivanja antigena primarnih antitela. Nakon toga, preseci su postavljeni na stakalce, a preseci obojeni CD31+ su obojeni sa 0,05% tionina tokom 4 minuta, što je obojilo keratinocite u plavo. Konačno, svi delovi kože su dehidrirani korišćenjem apsolutnog etanola (< 0,01% metanola), prebačeni u ksilen, i poklopac je kliznuo sa Permountom (Fisher Scientific, Hampton, NH).
Svaki deo kože je skeniran u 3 sloja od 8 µm svaki pomoću Nanozoomer 2.0 serije (Nanozoomer 2.0 serije, Hamamatzu, Japan). Četiri proksimalna i 4 distalna dela kože plantarne zadnje šape su kvantifikovana za epidermalna nervna vlakna u središnjem delu plantarne zadnje šape (80.000 µm2) korišćenjem 40x objektiva u softveru ImageScope (Aperio ImageScope v11.12.760). Prosečna obeležena nervna vlakna po mm2 i prosečna debljina epiderme su izračunati za svakog pacova. Procenat CD31-pozitivnih ćelija izračunava Leica Cell-D (Olimpus, softver za snimanje za mikroskopiju nauke o životu, SAD) u 4 proksimalna i 4 distalna preseka kože preko celog gornjeg dermisa plantarne zadnje šape.
Primer 5.12: Lečenje i/ili prevencija crevne fibroze
Terapeutska efikasnost jedinjenja iz predmetnog pronalaska je testirana korišćenjem modela pacova ili miša kao što su opisali Pham BT i sar. (Physiol Rep. 2015;3(4):e12323. doi: 10.14814/phi2.12323).
Priprema crevnih jezgara pacova i miša: Korišćeni su odrasli mužjaci Wistar pacova koji nisu postili i miševi C57BL/6 (Harlan PBC, Zeist, Holandija). Pacovi i miševi su smešteni u ciklusu svetlosti/mraka od 12 sati u prostoriji sa kontrolisanom temperaturom i vlažnošću sa hranom (Harlan chow no 2018, Horst, Holandija) i vodom ad libitum. Životinjama je dozvoljeno da se aklimatizuju najmanje sedam dana pre početka eksperimenta.
Pacovi i miševi su anestezirani izofluranom/O2 (Nicholas Piramal, London, UK). Jejunum pacova (oko 25 cm distalno od stomaka i 15 cm dužine) i jejunum miša (oko 15 cm distalno od želuca i 10 cm dužine) se izrezuju i čuvaju u ledeno hladnom Krebs-Henseleit puferu (KHB) sa dodatkom 25 mm d-glukoze (Merck, Darmstadt, Nemačka), 25 mm NaHCO3 (Merck), 10 mm HEPES (MP Biomedicals, Aurora, OH), zasićen karbogenom (95% O2/5% CO2) i podešen na pH 7,4. Jejunum se čisti ispiranjem KHB kroz lumen i zatim se deli na segmente od 2 cm. Ovi segmenti su napunjeni 3% (tež./vol.) rastvorom agaroze u 0,9% NaCl na 37 °C i ugrađeni u jedinicu za ugradnju jezgra agaroze.
Priprema crevnih jezgara čoveka: Zdravo ljudsko tkivo jejunuma dobija se za istraživanje iz creva koje je resektovano od pacijenata koji su podvrgnuti pankreatikoduodenektomiji.
Zdrav jejunum se čuva u ledeno hladnom KHB do postupka ugradnje. Submukoza, muskularis i seroza se pažljivo uklanjaju sa sluzokože u roku od sat vremena nakon sakupljanja tkiva. Sluzokoža je podeljena na listove 0,4 cm × 1 cm. Ovi listovi su ugrađeni u 3% rastvor agaroze (tež./vol.) u 0,9% NaCl na 37 °C i umetnuti u jedinicu za ugradnju.
Priprema PCIS-a: PCIS se priprema u ledeno hladnom KHB od strane Krumdieck rezača tkiva (Alabama Research and Development). Kriške vlažne težine od 3-4 mg imale su procenjenu debljinu od 300-400 µm. Kriške se čuvaju u ledeno hladnom KHB do početka eksperimenata.
Inkubacija crevnih kriški: Rezovi se inkubiraju u pločama sa 12 jažica za humani PCIS (hPCIS) i PCIS pacova (rPCIS) ili u pločama sa 24 jažica za PCIS miša (mPCIS). hPCIS i rPCIS se inkubiraju pojedinačno u 1,3 ml, a mPCIS u 0,5 ml Williams Medium E sa L-glutaminom (Invitrogen, Paisly, UK) sa dodatkom glukoze od 25 mm, 50 µg/ml gentamicina (Invitrogen) i 2,5 µg/amphocina-B (Invitrogen). Tokom inkubacije (na 37 °C i 80% O2/5% CO2) u inkubatoru (MCO-18M, Sanio), ploče se horizontalno tresu na 90 o/min (amplituda 2 cm). rPCIS su inkubirani do 24 h, mPCIS i hPCIS su inkubirani do 72 h, sa i bez humanog TGF-β1 (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemačka) u opsegu koncentracija od 1 do 10 ng/ml. Sve inkubacije se izvode višestruko (koristeći 3-6 kriški inkubiranih pojedinačno u odvojenim bunarima) i ponavljaju se sa crevima od 3 do 16 različitih ljudi, pacova ili miševa.
Vijabilnost i morfologija: Vijabilnost se procenjuje merenjem sadržaja adenozin trifosfata (ATP) u PCIS-u. Ukratko, nakon inkubacije, kriške se prebacuju u 1 ml sonikacionog rastvora (koji sadrži 70% etanola i 2 mm EDTA), brzo se zamrzavaju u tečnom azotu i čuvaju na -80 °C. Da bi se odredila održivost, nivoi ATP-a se mere u supernatantu uzoraka koji su sonikirani tokom 45 sekundi i centrifugirani 2 minuta na 4°C na 16.000 × g, koristeći ATP bioluminiscencijski komplet (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemačka). Vrednosti ATP (pmol) su normalizovane na ukupan sadržaj proteina (µg) PCIS procenjenog Lovri metodom (BIO-rad RC DC Protein Assay, Bio Rad, Veenendaal, Holandija). Da bi se procenila morfologija, inkubirane kriške su fiksirane u 4% formalina i ubačene u parafin. Sekcije od 4 µm su isečene i obojene hematoksilinom i eozinom (HE). HE sekcije se boduju prema modifikovanom Park rezultatu, koji opisuje redosled razvoja povrede tkiva u crevima nakon ishemije i reperfuzije. Integritet sedam segmenata PCIS-a se ocenjuje na skali od 0 do 3. Vijabilnost epitela, strome, kripta i mišićnog sloja se posebno boduje ocenom 0 ako nema nekroze i 3 ako je prisutna masivna nekroza. Ostali delovi crevnog preseka su ocenjeni na sledeći način: Oblik epitela: 0 = kubični epitel, 3 = više od 2/3 ćelija je ravno, spljoštene resice: 0 = normalno, 3 = više od 2/3 resica je spljošteno, a količina edema: 0 = nema edema, 3 = jak edem. Maksimalni rezultat od 21 ukazuje na ozbiljno oštećenje. U uzorcima ljudi, morfološki rezultat muscularis mucosae se određuje u odeljku „mišićni sloj“. B.T.P., W.T.v.H. i J.N. su izvršili bodovanje na slepo; izračunava se srednja vrednost tri ukupna rezultata.
Ekspresija gena: Ekspresija gena fibroze, odnosno COL1A1, αSMA, HSP47, CTGF, FN2, TGF-β1, PAI-1 i SIN određena je ili Taqman ili SIBRgreen metodom. U hPCIS, ekspresija ELA gena je takođe merena SIBRgreen metodom.
Intestinalna fibroza je ozbiljan, ali čest ishod kod pacijenata sa inflamatornom bolešću creva (IBD). Uprkos napretku u razvoju novih modaliteta lečenja za kontrolu hronične upale creva karakteristične za IBD, do danas ne postoje efikasne antifibrozne terapije. Kao takvo, dublje razumevanje molekularnih mehanizama koji leže u osnovi crevne fibroze i dostupnost relevantnih životinjskih modela su od ključnog značaja za pomeranje ove oblasti istraživanja napred.
IL-17 i pridruženi medijatori: Th17 ćelije definišu podskup T pomoćnih ćelija koje uglavnom proizvode IL-17A, ali i IL-17F, IL-21 i IL-22, i sve se više prepoznaju kao najvažniji kod nekoliko hroničnih inflamatornih poremećaja, uključujući IBD (7). IL-17A je umešan u fibrozu u više organa, uključujući pluća (8), jetru (9) i srce (10); nedavne studije takođe podržavaju njegovu ulogu u crevima, povezujući imune odgovore IL-17/Th17 i druge povezane medijatore u patogenezi fibroze creva.
Ostali životinjski modeli fibroze creva su opisani u nastavku:
Tabela 52:
Primer 5.13: Lečenje i/ili prevencija fibroze jajnika
Terapeutska efikasnost jedinjenja iz predmetnog pronalaska je testirana korišćenjem mišjeg modela sindroma hiperstimulacije jajnika (OHSS) koji je opisao Pala i sar. (Drug Des Devel Ther.2015;9: 1761-1766. Objavljeno 24. marta 2015. doi: 10.2147/DDDT.S75266) u cilju ispitivanja efekata testiranih jedinjenja na histopatologiju jajnika, nivoe VEGF-a u serumu i endotelina 1 kod sindroma hiperstimulacije jajnika (OHSS) u eksperimentalnom okruženju.
Životinje: Korišćene su ženke Wistar albino pacova, starosti 22 dana i nasumično podeljene u grupe. Folikul-stimulišući hormon 10 IU se primenjuje subkutano kod 15 pacova 4 uzastopna dana, sa indukcijom OHSS 5. dana sa 30 IU humanog horionskog gonadotropina. Grupa 1 obuhvata kontrolne pacove stare 35 dana, grupa 2 uključuje OHSS pacove stare 35 dana, grupa 3 obuhvata 27-dnevne OHSS pacove koji su primali testirana jedinjenja tokom 7 dana. Svi pacovi su zatim obezglavljeni 35. dana. Serumski VEGF, endotelin 1 i folikularna rezerva jajnika su procenjeni kod svih pacova.
Merenje hematokrita i težine se vrši 13. dana, a dekapitacija 35. dana pod opštom anestezijom intraperitonealnom primenom ketamina (75 mg/kg) i ksilazina (10 mg/kg).
Enzimski imunosorbentni test: Približno 3 ml uzorka krvi dobijenog od svakog obezglavljenog pacova. Serumi se odvajaju centrifugiranjem uzoraka krvi na 2.500 rpm tokom 4 minuta i čuvaju na -20 °C dok se ne testiraju VEGF i endotelin 1. VEGF se ispituje korišćenjem kompleta za test imunosorbenta vezanog za enzimski VEGF miša (ELM-VEGF-001; RaiBio, SAD) i endotelin se mere korišćenjem endotelina 1 E/Kit (EK-023-01; Phoenix Pharmaceuticals, SAD).
Morfologija jajnika: Posle laparotomije, jajnici se uklanjaju i čiste od prilepljenog tkiva u medijumu za kulturu i mere se. Tkivo jajnika je fiksirano sa 10% formaldehida, a zatim se uzorci tkiva ugrađeni u parafin seku na poprečne preseke od 4 µm za procenu srednjeg broja folikula jajnika. Sekcije su obojene Massonovim trihromom da bi se odredio OFR pod svetlosnom mikroskopijom (Olympus BX-50). Poprečni preseci debljine 4 µm postavljeni su u intervalima od 50 µm na mikroskopska stakla kako bi se sprečilo brojanje iste strukture dva puta, prema prethodno opisanoj metodi.12 folikula su klasifikovane kao primordijalne, primarne, sekundarne i tercijarne. Atretični folikul (AF) je definisan kao folikul koji predstavlja više od deset piknotičkih jezgara; za najmanje folikule, kriterijumi za atreziju su degenerisani oocit, prerano formiranje antruma ili oboje.
Glavne mere ishoda: Glavne mere ishoda su starost (dani), težina (g), hematokrit (%), težina jajnika (mg), nivoi VEGF-a u serumu (pg/ml) i endotelina 1 (ng/ml) i ukupan broj folikula sa određivanje primordijalnog, primarnog, sekundarnog i tercijarnog broja folikula.
Primer 5.14: Lečenje i/ili prevencija sindroma policističnih
jajnika (PCOS)
Terapeutska efikasnost jedinjenja iz predmetnog pronalaska je testirana korišćenjem životinjskog modela hiperfibroze jajnika izazvane DHEA, kao što su opisali Wang D i sar. (J Ovarian Res.2018;11(1):6. Objavljeno 10. januara 2018. doi:10.1186/s13048-017-0375-7).
Sindrom policističnih jajnika (PCOS) je uobičajen metabolički i endokrini poremećaj sa patološkim mehanizmima koji ostaju nejasni. Sledeća studija istražuje hiperfibrozu jajnika koja se formira putem signalnog puta transformišućeg faktora rasta-β (TGF-β) u modelu pacova sa sindromom policističnih jajnika (PCOS) izazvan dehidroepiandrosteronom (DHEA).
Životinje: Za ovaj test je korišćeno trideset ženki Sprague-Dawley (SD) pacova, starih 21 dan, težine ~50 g. Životinje su smeštene u okruženju bez specifičnih patogena (SPF) sa temperaturom od 22 ± 1 °C, relativnom vlažnošću od 50 ± 1%, i ciklusom svetlosti/mraka od 12/12 h. Obezbeđen je slobodan pristup hrani i vodi.
Postupci: Trideset ženki Sprague-Dawley pacova nasumično je podeljeno u grupu prazno (n = 6), grupu ulje (n = 6) i grupu modela indukovanu uljem DHEA (n = 6 12). Grupe modela se uspostavljaju subkutanom injekcijom DHEA tokom 35 uzastopnih dana. Pacovi su dodatno podeljeni u grupu nosača (n = 6) i tretiranu grupu (n = 6). Tretman se daje jednom dnevno i traje 35 dana. Osamnaest dana nakon tretmana, vaginalni razmazi se sakupljaju od svih pacova na dnevnoj bazi procenjivanjem tipova ćelija tokom 14 dana, kako bi se odredili njihovi estrusni ciklusi dnevno.36. dana, svi pacovi u grupama tretiranim ničim i uljem i šest pacova modelnih grupa izazvanih DHEA su eutanazirani (koristeći intraperitonealnu injekciju viška 5% hloral hidrata), krv je sakupljena (iz gornje šuplje vene), bilateralni jajnici i maternica su secirani.
Jajnici su fiksirani u 4% paraformaldehidu 24 sata na 4 °C, a zatim stavljeni u parafin. Ostatak tkiva je zamrznut na -80 °C radi daljeg Western blotinga i analize lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (RT-PCR).
Preostalih 12 pacova iz DHEA-indukovanih modelnih grupa su randomizirani u dodatne dve grupe: tretirana grupa i grupa za tretman nosača (kontrolna grupa), šest pacova po grupi. Tokom ovog tretmana, DHEA se više ne daje pacovima. Tretman traje 2 nedelje, nakon čega se sve životinje eutanaziraju, uzima se krv i seciraju obostrani jajnici i materice prema gore navedenim uputstvima.
Morfologija jajnika, lokalizacija fibrina i kolagena i ekspresija u jajnicima se detektuju korišćenjem H&E bojenja, imunohistohemije i Sirius crvenog bojenja. Protein jajnika i RNK se ispituju korišćenjem Western blota i RT-PCR.
Estrusni ciklus: 18. dana nakon tretmana DHEA, vaginalni razmazi su sakupljeni od svih pacova. Uzorci se zatim tretiraju toluidin plavim tokom 30 minuta, a posledično se morfologija ćelije i estrusni ciklusi ispituju pod optičkim mikroskopom (Leica Microsistems, Nemačka).
Nivo hormona u serumu: Uzorci krvi se uzimaju iz gornje šuplje vene. Serum se odmah odvaja i čuva na -20 °C za dalje određivanje hormona enzimskim imunosorbentnim testom (ELISA) (testosteron (T), estradiol (E2), luteinizirajući hormon (LH), folikul stimulišući hormon (FSH)) (pacov T, E2, LH i FSH ELISA kompleti, USCN, Wuhan, Kina).
Primer 5.15: Lečenje i/ili prevencija primarnog bilijarnog holangitisa (PBC)
Terapeutska efikasnost jedinjenja iz predmetnog pronalaska je procenjena korišćenjem PBC mišjeg modela kako su opisali Hohenester S i sar. (Cells. 2020, 9(2), 281. doi: 10.3390/cells9020281).
Holestatske bolesti jetre kao što su primarni bilijarni holangitis (PBC) ili primarni sklerozirajući holangitis (PSC) su hronični progresivni poremećaji koji često rezultiraju cirozom jetre, sa kasnijim komplikacijama. Smatra se da hidrofobne žučne soli promovišu fibrozu jetre u holestazi. Međutim, dokazi za ovu široko prihvaćenu hipotezu i dalje su oskudni.
U ustanovljenim životinjskim modelima holestaze, na primer, nokautom Mdr2, holestaza i fibroza su sekundarne zbog oštećenja žuči.
Stoga, da bi se testirao specifični doprinos akumulacije žučnih soli fibrozi jetre kod holestatske bolesti, korišćen je jedinstveni model inducibilne hepatocelularne holestaze kod Atp8b1G308V/G308V miševa hranjenih holatom. Glikohenodeoksiholat (GCDCA) je dopunjen da bi se humanizovao bazen žučne soli miša, što je potvrđeno HPLC. Biomarkeri holestaze i fibroze jetre su kvantifikovani. Zvezdaste ćelije jetre (HSC) izolovane od miševa divljeg tipa su stimulisane žučnim solima. Određuje se proliferacija, akumulacija ćelija i depozicija kolagena HSC. Kod holestatskih Atp8b1G308V/G308V miševa, povećana hepatična ekspresija αSMA i kolagen1a mRNA i višak depozicije kolagena u jetri ukazuje na razvoj fibroze jetre samo nakon dodavanja GCDCA. In vitro, broj miofibroblasta i taloženje kolagena su povećani nakon inkubacije sa hidrofobnim, ali ne i hidrofilnim žučnim solima i povezani sa EGFR i MEK1/2 aktivacijom. Žučne soli mogu imati direktne profibrozne efekte na HSC, navodno uključuju EGFR i MEK1/2 signalizaciju.
Eksperimenti na životinjama: Muške životinje se koriste za in vivo studije u dobi od 8 nedelja. Životinje se drže u ciklusu od 12 sati svetlo-mrak i smeštaju se u obogaćeno okruženje sa ad libitum pristupom ishrani i vodi.
Biohemija seruma i merenja žučne soli u serumu: Nivoi alkalne fosfataze, bilirubina i alanin aminotransferaze u serumu se kvantifikuju iz svežeg seruma u potpuno automatizovanom analizatoru respons<®>910 (DiaSys, Holzheim, Nemačka). Ukupni nivoi žučne soli u serumu se kvantificiraju enzimski pomoću kompleta za ukupne žučne soli Diazime (Diazyme Laboratories, Poway, CA, SAD) prema uputstvima proizvođača.
Histologija jetre, imunohistohemija i kvantifikacija hidroksiprolina:
Parafinski blokovi su isečeni na kriške debljine 4 µm i postavljeni na mikroskopska stakla (Superfrost plus, Thermo Scientific/Menzel, Braunschweig, Nemačka).
Nakon postepene deparafinizacije i rehidratacije, stakalca se boje hematoksilinom i eozinom prema standardnim procedurama. Imunohistohemija se izvodi protiv alfa-SMA, koristeći monoklonsko zečje anti-alfa antitelo na aktin glatkih mišića (Abcam, Cambridge, UK). Za kvantifikaciju kolagena, stakalca su obojena 1 h sa Direct Red 80 (Sirius Red, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Nemačka) i dva puta su obojena u etanolu i jednom u ksilolu. Da bi se kvantifikovala ukupna DNK kao surogat broja ćelija, HSC se inkubiraju sa PicoGreen<®>(Invitrogen, Carlsbad, CA, SAD) i fluorescentni signali se detektuju pomoću sistema CitoFluor 4000 (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, SAD). Proliferacija HSC se kvantifikuje korišćenjem kompleta za analizu BrdU (Roche, Penzberg, Nemačka) prema uputstvima proizvođača. Da bi se kvantifikovao ukupan broj ćelija, HSC, zasejani u Lab-Tek II Chamber Slides (Nunc, Rochester, NI, USA), montiraju se na pokrovne stakalce sa medijumom za montiranje Vectashield uključujući DAPI (Vector, Burlingame, CA, USA). Slajdovi se skeniraju Pannoramic Midi Slide Scanner-om (3DHistech, Budimpešta, Mađarska), a brojanje nukleusa se vrši softverom ImageJ2 na celom slajdu (0,7 cm2).
Kvantifikacija kolagena in vitro: Ćelije su isprane PBS-om i obojene 1 h sa 0,1% Sirius Red u zasićenoj pikrinskoj kiselini. Ćelije su zatim isprane tri puta sa 100% etanolom, vezana boja je rastvorena u 50% metanol/natrijum hidroksidu (50 mmol/l), a apsorpcija se meri na 540 nm.
Primer 5.16: Lečenje i/ili prevencija fibroze ili ciroze jetre (HF)
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema predmetnom pronalasku za inhibiciju spontane, hronične inflamacije i fibroze jetre je procenjena korišćenjem ustanovljenih modela mišjih NOD-inflamacione fibroze (N-IF), kao što su opisali Fransen Pettersson i sar. (PLoS One.2018 13(9): e0203228. doi:
10.1371/journal.pone.0203228).
Životinje: N-IF miševi spontano razvijaju hroničnu upalu i fibrozu jetre izazvane T-ćelijskim receptorom (TCR) transgenim prirodnim ubicama T (NKT)-II ćelijama koje su generisane u imunodeficijentnim NOD.Rag2-/- miševima.
Nekoliko komponenti patologije jetre kod N-IF miševa se preklapaju sa onima kod ljudskih stanja u kojima progresivna hronična upala prethodi razvoju fibroze.
Štaviše, pokazalo se da je fibroza koja se razvija u jetri N-IF miša povezana sa akumulacijom zvezdastih ćelija jetre koje eksprimiraju α-SMA. Ove fenotipske sličnosti čine N-IF mišji model jedinstvenim u poređenju sa drugim dostupnim modelima glodara za fibrozu jetre i pružaju novi alat za testiranje efikasnosti kandidata za lekove protiv fibroze.
Životinje se svakodnevno posmatraju zbog znakova lošeg zdravlja, sakuplja se urin, a proteini se mere u urinu. Težina jetre i bubrega se beleži u vreme disekcije. Jetra i bubreg su secirani od svake životinje fiksirane, isečene i obojene Sirius Red i H&E. Komad svake jetre se koristi za merenje hidroksiprolina.
Merenje hidroksiprolina: Sadržaj hidroksiprolina u jetri i slezini se određuje korišćenjem kompleta za kolorimetrijsku analizu hidroksiprolina (BioVision, Milpitas, CA, SAD).
Histologija: Nakon tretmana, miševi su anestezirani i perfuzirani sa PBS intrakardijalnom punkcijom. Jetra i slezina se mere, a biopsije organa se fiksiraju u 4% neutralnom puferisanom formalinu, stavljaju u parafin i seku se.
Primer 5.17: Lečenje i/ili prevencija nealkoholnog
steatohepatitisa (NASH)
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema predmetnom pronalasku je procenjena korišćenjem NASH mišjeg modela kako su opisali Barbara Ulmasov B. i sar. (Hepatologi Communications, 2018, 3(2) -https://doi.org/10.1002/hep4.1298).
Miševi: C57BL/6J muški miševi stari 5 nedelja smešteni su u standardnim objektima pod kontrolisanim uslovima temperature, vlažnosti i 12-časovnog/12-časovnog ciklusa svetlo/mrak sa slobodnim pristupom vodi.
Deficit holina, model NASH-a, definisan L-amino-kiselinama, sa visokim sadržajem masti: Dijeta sa nedostatkom holina, definisana aminokiselinama, sa visokim sadržajem masti (CDAHFD)22 dobijena je od Research Diets (A06071309; New Brunswick, NJ). Ova dijeta je formulisana kao dijeta sa visokim sadržajem masti, sa nedostatkom holina i koja uključuje 0,1% metionina i 45% kalorija% masti (20% svinjskog masti, 25% sojinog ulja). Kontrolna dijeta je standardna hrana za glodare koja sadrži 13,6% kalorija iz masti. Počevši od starosti od 6 nedelja, 30 miševa se stavlja na CDAHFD, a 30 miševa na standardnu ishranu. Na kraju 6 nedelja, 10 miševa iz svake grupe sa ishranom je gladno 5 sati i ubijeno. Uzimaju se uzorci krvi i jetre. Jetre su podeljene na delove koji su fiksirani u 10% formalinu puferisanom fosfatom, zamrznuti u tečnom azotu ili stavljeni u rastvor za stabilizaciju RNK za buduću procenu. Preostali miševi se drže na dijeti još 4 nedelje, ukupno 10 nedelja, a zatim se gladuju, ubijaju i uzimaju uzorci.
Biohemijska analiza: Sadržaj triglicerida u jetri je meren korišćenjem kompleta za kolorimetrijsku analizu triglicerida (Caiman Chemicals, Ann Arbor, MI) prema uputstvima proizvođača. Nivoi alanin aminotransferaze (ALT), aspartat aminotransferaze (AST), glukoze, insulina, triglicerida i holesterola u plazmi su komercijalno mereni od strane Advanced Veterinari Laboratori (Saint Louis, MO).
RT-PCR: Lančana reakcija polimeraze reverzne transkripcije u realnom vremenu se izvodi da bi se izračunale promene u obilju mRNK.
Histopatologija: Sekcije jetre fiksirane u formalinu su ugrađene u parafin, presečene na 5 µm i obojene hematoksilinom i eozinom (H&E) korišćenjem standardnog protokola za mikroskopsku procenu. Da bi se procenio sadržaj kolagena u jetri, delovi jetre ugrađeni u parafin su obojeni sirius crvenom/brzozelenom bojom. Sirius crvena se vezuje za sve vrste kolagena, dok brza zelena mrlja nekolagene proteine.
Sekcije jetre su prethodno obrađene da bi se uklonio parafin, a jezgra su obojena primenom Veigertovog rastvora gvožđa hematoksilina. Nakon pranja, tkiva su obojena sa 0,1% sirius crvenom (Direct Red 80; Sigma, Saint Louis, MO), 0,1% brze zelene FCF sertifikovane (Sigma) u zasićenoj pikrinskoj kiselini tokom 2 sata. Stakalca se zatim isperu u vodi, dehidriraju etanolom i ksilelom i na kraju se montiraju u Permaslip (Alban Scientific, Inc., Saint Louis, MO). Stepen akumulacije kolagena se procenjuje morfometrijskom analizom.
Određivanje sadržaja hidroksiprolina u jetri: Sadržaj hidroksiprolina se određuje kao mera količine ukupnog kolagena prisutnog u jetri. Tkivo jetre se homogenizuje u destilovanoj vodi, istaloži trihlorosirćetnom kiselinom i hidrolizuje 48 sati u 12 N HCl na 105 °C. Uzorci se upare, a suve pelete se rekonstituišu u destilovanoj vodi. Rekonstituisani uzorci se centrifugiraju 10 minuta na 13.000 g, a supernatanti se razblažuju sa 12 N HCl da bi se postigla koncentracija od 4 N HCl u konačnim uzorcima. Sadržaj hidroksiprolina u jetri se određuje pomoću testa hidroksiprolina osetljivog tkiva.
Imunohistohemija: Tkiva jetre fiksirana u formalinu su prethodno obrađena da bi se uklonio parafin standardnim metodama. Aktivnost endogene peroksidaze je blokirana inkubacijom u 3,3% vodonik peroksidu u metanolu tokom 1 sata na sobnoj temperaturi.
Detekcija apoptotičkih ćelija u tkivima jetre: Apoptotične ćelije u tkivima jetre se identifikuju obeležavanjem i otkrivanjem prekida DNK lanca metodom označavanja krajnjeg kraja deoksiuridin trifosfat posredovane deoksiuridin trifosfatom (TUNEL) pomoću ApopTag kompleta za detekciju peroksidaze (Millipore, Temecula, CA). Prebrojane su obojene apoptotičke ćelije sa morfologijom hepatocita. Da bi se otkrile apoptotičke ćelije sa HSC morfologijom, TUNEL-om obojena tkiva jetre su naknadno obojena antitelom na desmin (markerom HSC), osim što se aktivnost sekundarne peroksidaze antitela detektuje pomoću ImmPACT VIP Peroksidaze supstrata kita (Vector Laboratories).
Western Blot: Western blot se izvodi kako je opisano korišćenjem sledećih primarnih antitela: antifosforilisane majke protiv dekapentaplegičnog homologa 3 (p-SMAD3), ab52903, 1: 1000 (Abeam); anti-gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (anti-GAPDH), sc-25778 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX).
Primer 5.18: Lečenje i/ili prevencija dijabetičke nefropatije ili dijabetesne bolesti bubrega (DN ili DKD)
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema ovom pronalasku je istražena in vivo korišćenjem mišjeg modela dijabetesa tipa I (dijabetes izazvan STZ).
Životinjski model: Mužjaci 129/SV miševa stari 10 nedelja (Charles River, Nemačka) drže se u individualno ventilisanim kavezima, na standardnoj ishrani sa besplatnim pristupom vodi iz česme. Miševi 129/SV usklađene težine primaju ili 125 mg/kg telesne težine STZ (Sigma-Aldrich) u 50 mm natrijum citratu (pH 4,5) ili natrijum citratnom puferu (kontrolna grupa bez dijabetesa) intraperitonealno 1. i 4. dana za indukciju hiperglimije (hipergl. glukoza >
15 mmol/1). Miševi ne dobijaju insulin tokom studije.
Dijabetičkim miševima se daje placebo (fiziološki rastvor) tokom 12 nedelja ili testirana jedinjenja. Telesna težina i nivo glukoze se mere svake nedelje. HbA1c (Olimpus AU400) i funkcija bubrega (kreatinin u serumu) mere se u 6. i 12. nedelji. Albuminurija se procenjuje korišćenjem ELISA kompleta za mišji albumin. Studije brzine provodljivosti senzornih nerava (NCV) su sprovedene kod miševa anesteziranih sa 2% izoflurana u nedelji 6 i 12. Senzorni NCV repa se određuje stimulacijom proksimalno duž repa na zabeleženoj udaljenosti od 3 cm. Za merenje se koristi neuro-ekran kompanije Toennies Inc. Posle 12 nedelja praćenja, miševi su eutanazirani, obavljena je bilateralna torakotomija i laparotomija, a bubrezi su perfuzirani ledeno hladnim fiziološkim rastvorom preko leve srčane komore.
Imunohistohemija: Za imunofluorescenciju, obrađuju se delovi tkiva fiksirani paraformaldehidom i parafinom (2 µm). Nakon blokiranja sa 10% zečjeg seruma, parafinski preseci su obojeni antitelima protiv pP38 i F4/80 i sekundarnim antitelom konjugovanim sa Cy3.
Primer 5.19: Lečenje i/ili prevencija dijabetičke nefropatije, dijabetesne bolesti bubrega i dijabetičke retionpatije u STZ-indukovanom dijabetičkom modelu.
Za studiju je korišćeno ukupno 70 ženki CD-1 miševa starosti 5-7 nedelja, težine približno 25-30 g. Oni su kupljeni od Charles Rivera, UK i imali su period aklimatizacije od 7 dana. Životinje su smeštene u IVC kaveze (do 5 po kavezu) sa pojedinačnim miševima identifikovanim po repu. Svim životinjama je bio dozvoljen slobodan pristup standardnoj sertifikovanoj komercijalnoj ishrani i dezinfekciji tokom studije. Sala za zadržavanje je održavana u standardnim uslovima: 18-24 °C, 55-70% vlažnosti i ciklus svetlo/mrak od 12 sati.
Svi protokoli korišćeni u ovoj studiji su odobreni od strane Komiteta za dobrobit životinja i etičku reviziju, a sve procedure su sprovedene u skladu sa smernicama Zakona o životinjama (naučne procedure) iz 1986. godine.
Miševima (osim negativne kontrolne grupe) je ubrizgan STZ (55 mg/kg; IP) dnevno tokom 5 uzastopnih dana. Miševi su gladovani 6 sati pre injekcije. Nedelju dana nakon završetka indukcionog nivoa glukoze praćeni su i miševi sa nivoima manjim od 15 mml/l (280 mg/gl) su uklonjeni iz studije jer nisu razvili idealnu težinu dijabetesa. Nivoi glukoze su se pratili nedeljno, a 5 nedelja nakon STZ indukcije biohemijska procena oštećenja bubrega je vršena merenjem nivoa albumina i kreatinina u urinu i potvrđivanjem da su u željenom opsegu. Nakon uspešnog završetka ove faze životinje su raspoređene u grupe za tretman.
Tabela 53:
Lečenje je nastavljeno tokom 4 nedelje (28 dana) uz nedeljno merenje glukoze u krvi i albumina/kreatinina u urinu. Raspored istraživanja je detaljno prikazan u nastavku, posmatrajući nedeljne (5. do 9. nedelje) nivoe glukoze u krvi, odnos kreatinija albumina u urinu i terminalnu (9. nedelju) hemiju krvi i citokine, histologiju bubrega i curenje iz oka-retine.
Tabela 54:
Rezultati
Klinički znaci: Početni pad telesne težine je primećen za mnoge grupe tretmana, što se može očekivati i u većini slučajeva telesna težina se postepeno oporavljala do kraja perioda doziranja. Telesna težina nekih životinja pala je ispod 90% početne telesne težine, međutim nijedna životinja nije morala da bude stavljena na odmor za doziranje.
Glukoza u krvi: Indukcija sa STZ je dovela do značajnog povećanja glukoze u krvi u poređenju sa neindukovanim kontrolama vehikuluma (Tabela 55). Tretman IVc-059a IV je doveo do značajnog smanjenja** nivoa glukoze u krvi u poređenju sa indukovanim kontrolama vehikuluma 28. dana. Tretman sa IIIc-061a IV je takođe rezultirao smanjenjem nivoa glukoze u krvi, ali to nije dostiglo statistički značaj.
Tabela 55: Srednja koncentracija glukoze u krvi na dan 0 i dan 28 ženki ICR-CD1 miševa u STZ-indukovanom modelu dijabetesa. Prikazane vrednosti su srednje vrednosti ±SD; n=3 za neindukovane i indukovane grupe nosača; n=8 za sve ostale grupe tretmana.
Težina bubrega: Nije bilo statističke razlike ni u težini vlažnog bubrega, ni u težini bubrega kao procentu telesne težine životinje.
Albumin u urinu: Kreatinin (ALB: CRE): Urin je sakupljan nedeljno i prikupljan za svaku tretiranu grupu. Tretman sa Ib-010a, IIIc-061a i IVc-059a je rezultirao smanjenjem ALB:CREA (tabela 56) poslednjeg dana tretmana 28. pre žrtvovanja (9. nedelja rasporeda).
Azot uree u krvi (BUN): Tretman sa Ic-007, Ib-010a, IIIc-061a i IVc-059a je rezultirao nivoima azota ureje u krvi koji su bili značajno niži od indukovanih kontrola nosača.
ELISA: Na kraju perioda lečenja krv je sakupljena i prerađena u serum. Nivoi CRP, TGF-β, IL-6 i TNF-α u serumu su kvantifikovani korišćenjem komercijalno dostupnih ELISA kompleta, rezultati su prikazani u Tabeli 56.
Serum CRP: Nivoi CRP u serumu kod ženki ICR-CD1 miševa u STZ-indukovanom modelu dijabetesa nakon 28 dana lečenja. Nivoi CRP u serumu su značajno povećani kod životinja izazvanih STZ. Tretman sa Ia-001a, Ia-001aTz i kontrolnom kaptoprilom je rezultirao značajno smanjenim nivoima serumskog CRP u poređenju sa kontrolama indukovanim vehikulom (**p=0,0074, *p=0,0304 i **p=0,0026 respektivno, One-vai ANOVA, Tabela 56).
Serum TGF-β: Nivoi TGF-β u serumu su bili značajno povišeni u kontrolama izazvanim STZ. Tretman sa svim jedinjenjima osim Ic-007a i IIIc-061a je rezultirao nivoima TGF-β koji su bili značajno niži od kontrola indukovanih nosačem (p≤0,05; Jednosmerna ANOVA, Tabela 56).
Nivoi IL-6 u serumu su bili značajno povišeni u kontrolama izazvanim STZ. Tretman sa svim jedinjenjima osim IVc-059a i kontrolnog jedinjenja kaptoprila rezultirao je nivoima IL-6 koji su bili značajno niži od kontrola indukovanih vehikulom (p≤0,05; Jednosmerna ANOVA, Tabela 56).
Nivoi TNF-α u serumu su bili značajno povišeni u kontrolama izazvanim STZ. Tretman sa Ia-001a, Ia-001aTz, Ic-001aTz/1-004a i IIIc-061a je rezultirao nivoima TNF-α koji su bili značajno niži od kontrola indukovanih vehikulom (p≤0,05; Jednosmerna ANOVA, Tabela 56).
Histologija bubrega: Kvantifikacija kolagena je izvršena na kraju perioda doziranja, životinje su ubijene i bubreg je reseciran. Tkivo je fiksirano formalinom i umetnut parafinski vosak, a zatim obojen Massonovim trihromom prema uputstvima proizvođača. Kolagen je kvantifikovan korišćenjem objavljene metode od strane Chen et al., 2017. Pokrivenost kolagenom je značajno povećana u kontrolama vehikuluma izazvanim STZ u poređenju sa neindukovanim kontrolama nosača. Tretman sa IIIc-061a i IVc-059a je rezultirao značajno smanjenim nivoima kolagena u poređenju sa indukovanim kontrolama vehikuluma (p=0,0210 i p=0,0134 respektivno; Jednosmerna ANOVA, Tabela 56).
Ocena bolesti: Rezultat bolesti bubrega je kvantifikovan korišćenjem H&E bojenja i procene mezangijalne i glomeruloskleroze, arteriolarne hijalinoze i zadebljanja GBM. Očigledno, skor bolesti je značajno povećan u kontrolama vehikuluma izazvanim STZ u poređenju sa neindukovanim kontrolama vehikuluma. Tretman sa svim jedinjenjima osim Ic-001aTz/1-004a je rezultirao značajno smanjenim rezultatom bolesti u poređenju sa indukovanim kontrolama vehikuluma (p≤0,005; Jednosmerna ANOVA, Tabela 56).
Histologija mrežnjače oka: na kraju perioda doziranja, neposredno pre terminalnog uzorkovanja, 4 životinje po grupi kojima je ubrizgan FITC-dekstran za procenu ravnih površina mrežnjače i životinje su ubijene, a oči resecirane.
Retinalni ravni nosači su pripremljeni i snimljeni pomoću fluorescentnog mikroskopa (EVOS, Thermo Fisher). Površina pokrivena vaskulaturom je značajno povećana u kontrolama vehikuluma izazvanim STZ u poređenju sa kontrolama vehikuluma koje nisu indukovane. Tretman sa Ic-007a, IIIc-061a i IVc-059a je rezultirao značajno smanjenom pokrivenošću vaskulature u poređenju sa indukovanim kontrolama nosača (p=0,0432, p=0,0337 i p=0,0131 respektivno; Jednosmerna ANOVA, Tabela 56).
Tabela 56: Odnos kreatinina u urinu albumina (ALB:CRE), Blood-BUN, Blood-CRP, Blood-TGF-beta, Blood-IL-6, Blood-TNF-alfa, trihrom bojenje (fibroza bubrega), rezultat bolesti i područje oko po danu 28 tretmana (9. nedelja rasporeda)
Primer 5.20: Lečenje i/ili prevencija policistične bolesti bubrega (PKD ili PCKD)
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema ovom pronalasku je istražena in vivo korišćenjem Pci mišjeg modela kako su opisali Lee EC et al. (Nat Commun 10, 4148 (2019).
Pretklinički model: pci miš, genetski relevantan PKD model glodara ima blisku korelaciju sa ljudskom bolešću za upotrebu u proceni efikasnosti novog agensa. Ovaj model razvija PKD povezan sa genom koji izaziva ljudsku bolest, pružajući prenosivi model glodara, koji blisko odražava razvoj PKD kod ljudi.
Detaljno je okarakterisan za progresiju bolesti i odgovor na lečenje, pružajući visok nivo poverenja za studije otkrivanja lekova.
Životinjski model: pci miš, CD-1-pci<Iusm>soj (CrownBio) koji nosi mutaciju gena povezanu sa istim genom koji uzrokuje ljudsku nefronoftizu tipa 3. Simptomi i progresija bolesti su sporo progresivna bubrežna cistična bolest sa cistama koje se razvijaju u sabirnim tubulima i drugim segmentima nefrona postaju cistične kako bolest napreduje. Muškarci i ženke miševa su na sličan način pogođeni bolešću. Miševi su stari 5 nedelja i primaju ili normalnu ishranu, normalnu ishranu sa nosačem (negativna kontrola), odnosno pozitivnu kontrolu i test jedinjenja, sve pomešano sa normalnom ishranom. Kontrole: nosač koji se koristi za jedinjenja se koristi kao negativna kontrola u jednoj grupi životinja, a antagonist tolvaptan receptora vazopresina-2 (V2) se koristi kao pozitivna kontrola u jednoj grupi životinja.
Ispis i krajnje tačke: Obim ciste i fibroza u bubregu, uključujući histološku verifikaciju, težinu bubrega, serumski BUN, koncentraciju ispitivanog artikla u krvi, telesnu težinu i unos hrane se beleže nedeljno.
Primer 5.21: Lečenje i/ili prevencija fibroze izazvane zračenjem (RIF)
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema ovom pronalasku je istražena in vivo korišćenjem RIF mišjeg modela kako su opisali Ryu SH i sar. (Oncotarget.
2016, 7(13), 15554-15565, doi:10.18632/oncotarget.6952).
Fibroza izazvana zračenjem (RIF) je jedna od najčešćih kasnih komplikacija zračne terapije. U RIF modelu miša, test kontrakture nogu se koristi za testiranje in vivo efikasnosti jedinjenja.
Fibrozu izazvanu zračenjem (RIF) karakteriše prekomerna akumulacija ekstracelularnog matriksa u koži i mekim tkivima, a proliferacija fibroblasta je jedna od najčešćih kasnih komplikacija zračne terapije. Takođe, RIF je ireverzibilan proces mrtvog fibroznog tkiva i dinamički proces vezan za remodeliranje ožiljnog tkiva reaktiviranim miofibroblastima.
RIF model miša: Muški BALB/c miševi se koriste za RIF model miša. Pod anestezijom, desni zadnji ekstremitet svakog miša prima doze zračenja od 44 Gi (22 Gi × 2 puta tokom 2 nedelje) koristeći linearni akcelerator. Za zaštitu ostatka tela koristi se specijalno dizajnirana zaštita, a bolus debljine 1 cm se nanosi preko kože kako bi se obezbedila adekvatna doza zračenja na površini zadnje noge. Nakon zračenja, miševi su nasumično podeljeni u dve grupe. Svaka grupa će biti tretirana jednom dnevno fiziološkim rastvorom (kontrolna grupa) ili jedinjenjima (tretirana grupa). Miševi koji nisu dobili zračenje ili lek su korišćeni kao negativna kontrolna grupa.
Da bi se demonstrirao antifibrozni efekat jedinjenja u koži i mekom tkivu ozračenih nogu, debljina epitela od površine epidermisa do baze dermisa se meri H&E bojenjem.
Primer 5.22: Lečenje i/ili prevencija Stargardove bolesti (SD)
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema ovom pronalasku je istražena in vivo korišćenjem SD mišjeg modela kako su opisali Fang I. et al. (Faseb Journal, 2020, DOI: 10.1096/fj.201901784RR).
Životinje: Miševi Pigmentirani Abca4-/- miševi (129S4/SvJae-Abca4tm1Ght) će biti kupljeni od The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, SAD). Pigmentirani miševi divljeg tipa (VT) (129S2/SvPas) dobijeni su od Janvier Labs (Le Genest-Saint-Isle, Francuska). U svakoj grupi odnos mužjaka i ženki je 1:1. Miševi su uzgajani i smešteni u ciklusu svetlosti od 12:12h (približno 50 luksa u kavezima) sa hranom i vodom ad libitum.
Osvetljenje plavim svetlom (BLI): Pigmentirani Abca4-/- i VT miševi odgovarajućeg uzrasta (9 meseci) su intraperitonealno anestezirani trokomponentnom narkozom koja se sastoji od 0,05 mg/kg fentanila, 5 mg/kg midazolama i 0,5 mg/kg medetomidina. Zenice su proširene mešavinom 0,5% tropikamida i 2,5% fenilefrin hidrohlorida. METHOCEL (Omni Vision, Puchheim, Nemačka) primenjuje se za vlaženje rožnjače. Tokom svetlosnog osvetljenja, na rožnjaču izloženog oka stavlja se staklo. Osvetljeno oko svakog miša je izloženo plavoj svetlosti (talasna dužina: 430-nm) pri intenzitetu od 50 mV/cm2 tokom 15 minuta. Neosvetljeno oko kao kontrola je pažljivo pokriveno da bi se zaštitilo od zalutalog svetla.
Izvodi se niz testova uključujući optičku koherentnu tomografiju (OCT), svetlosnu mikroskopiju i transmisionu elektronsku mikroskopiju (TEM), kvantifikaciju bisretinoida pomoću HPLC, kao i elektroretinografiju punog polja ERG pre i sedam dana nakon BLI.
Primer 5.23: Lečenje i/ili prevencija proliferativne
vitreoretinopatije (PVR)
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema ovom pronalasku je istražena in vivo korišćenjem PVR mišjeg modela kako su opisali Hou H i sar. (Ophthalmic Res 2018; 60: 195-204. doi: 10.1159/000488492) ili od Márkus B. i sar. (FEBS Open Bio.2017 (7) / 8 (1166-1177) Objavljeno 29. juna 2017. doi: 10,1002/2211-5463,12252).
Uzorci životinja: Mišji model PVR se koristi primenom intravitrealne injekcije proteolitičkog enzima, dispase. Poznato je da ovaj model izaziva glijalnu aktivaciju, kao i formiranje epi- i subretinalne membrane.
Ženke divljeg tipa starosti od 4 do 6 meseci se anesteziraju pentobarbitalom (90 mg·kg-1, ip), a takođe dobijaju jednu kap 1% prokain hidrohlorida (Novocaine, EGIS, Budimpešta, Mađarska) za lokalnu anesteziju i jedna kap tropikamida (Mydrum, Chauvin Aubeans, Montpellier, Francuska) za proširenje šarenice. Četiri mikrolitra dispase (Sigma-Aldrich; 0,4 U·µL-1, rastvorenog u sterilnom fiziološkom rastvoru soli) se ubrizgava intravitrealno u desne oči pod stereomikroskopskom kontrolom (Ctrl) korišćenjem automatske pipete. Ctrl životinje dobijaju 4 µl sterilnog fiziološkog rastvora soli. Stratus optičke koherentne tomografije (OCT; Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, SAD) se uzimaju nakon injekcija da bi se potvrdila indukcija PVR i pratila progresija bolesti. Miševi tretirani Ctrl i dispazom žrtvovani su 14. dana nakon injekcija kada su evidentni znaci formiranja PVR: prisustvo epiretinalne membrane i/ili ablacija retine na OCT pregledu.
Priprema i identifikacija uzorka: Staklasta tela miševa se izoluju nakon uklanjanja rožnjače giljotinom zajedno sa skleralnim galerom pomoću sečiva skalpela, nakon čega sledi uklanjanje sočiva. Posle solubilizacije staklastog tela puferom za lizu (pH 8,5) koji sadrži 7 m uree, 30 mm Tris, 2 m tiouree i 4% CHAPS-a, lizati su sonikirani u ledeno hladnom vodenom kupatilu 5 minuta i centrifugirani na 16900 g 10 min na 4 °C. Supernatanti se prenose u LoBind Eppendorf epruvete i prečišćavaju pomoću Readi-Prep 2-D CleanUp kompleta (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SAD) prema protokolu proizvođača.
Ukratko, nakon precipitacije i centrifugiranja, pelete se osuše i resuspenduju u 240 µl pufera za rehidrataciju koji sadrži 7 m uree, 2 m tiouree, 4% tež./vol.
CHAPS, 1% ditiotreitola (DTT), 2% vol./vol. Bio-Lite Bio-Rad) i 0,001% bromofenola plava, i odmah se koristi za izoelektrično fokusiranje.
2D gel elektroforeza: Tri uzorka staklastog tela poreklom iz svake grupe su podvrgnuta 2-DE. Prve trake sa imobilisanim pH gradijentom (IPG) sa IPG (24 cm, pH 4-7; Bio-Rad) su rehidrirani ekstrahovanim proteinima staklastog tela koristeći pasivnu rehidrataciju na 20 °C preko noći. Nakon toga sledi izoelektrično fokusiranje koje se izvodi primenom 300 V tokom 3 h, koje se postepeno povećava na 3500 V za 5 h i zatim drži na 3500 V tokom 18 h. Nakon izoelektričnog fokusiranja, IPG trake se odmah postavljaju na -70 °C do ekvilibracije. IPG trake su ekvilibrisane 15 minuta u puferu za ravnotežu (500 mm Tris/HCl, pH 8,5, 6 m urea, 2% SDS, 20% glicerol) koji sadrži 0,6% DTT i 15 minuta u puferu za ravnotežu koji sadrži 1,2% id. U drugoj dimenziji, trake se polažu na vrh 12% poliakrilamidnih gelova i prekrivaju agarozom. Koristeći Protean Plus Dodeca Cell (Bio-Rad) elektroforeza se izvodi pri 100 mA po gelu tokom 24 h dok bromofenol plava boja ne dođe do dna gela. Svih 12 gela rade zajedno pod istim uslovima. Proteini su obojeni korišćenjem rutenijum II tris(batofenantrolin disulfonata) fluorescentne boje 25 pripremljene u kući, a slike u gelu su snimljene korišćenjem Pharos FKS Plus molecular Imager (Bio-Rad). U svim slučajevima se analiziraju tri biološke replike, uzorci iz Ctrl i grupa tretiranih dispasom se obrađuju zajedno istog dana.
Primer 5.24: Lečenje i/ili prevencija vlažne i suve makularne degeneracije povezane sa starenjem (ARMD ili AMD)
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema ovom pronalasku je istražena in vivo korišćenjem AMD mišjeg modela kako su opisali Matsuda Y i sar. (Mol Ther Nucleic Acids.2019;17:819-828. doi:10.1016/j.omtn.2019.07.018).
Životinje: Ženke C57BL/6J miševa su dobijene od Charles River Laboratories Japan. Dobijaju se mužjaci BN pacova. Muški novozelandski beli (NZV) zečevi se dobijaju iz Kitayama Labes, Japan. Miševi, pacovi i zečevi se održavaju u posebnim uslovima bez patogena.
EMT analiza RPE ćelija: RPE ćelije kultivisane na 37 °C su zasejane pri 1 × 105 ćelija/bunariću u mikrotitarske ploče za kulturu sa 96 jažica. Posle inkubacije od 24 h, ćelije su tretirane sa FGF2 (2 ng/ml) i TGF-02 (3 ng/ml) sa i bez jedinjenja prema predmetnom pronalasku tokom 3 dana. Nivoi ekspresije mRNK biomarkera EMT α-SMA i kolagena tipa I su procenjeni kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu.
Matrigel Plug Assay: 0,5 ml rastvora Matrigel Matrik GFR (smanjen faktor rasta)-PRF (bez fenola crvenog) (BD Biosciences) se pomeša sa 1 µg FGF2 i subkutano implantira u desni bok ženki miševa C57BL/6J (8 nedelja, n = 3. Jedinjenja prema predmetnom pronalasku se daju intraperitonealno, a Matrigel čepovi se uklanjaju i fotografišu 7. dana nakon implantacije. Stepen angiogeneze se određuje koncentracijom hemoglobina u Matrigel čepu, primenom metode cijanmethemoglobina prema uputstvima proizvođača. Vrednosti optičke gustine uzoraka na 540 nm (OD540) merene su u čitaču mikroploče, a koncentracije hemoglobina su izračunate u skladu sa standardima za hemoglobin (Sigma-Aldrich).
Laserski indukovani CNV modeli miša: Midrin-P oftalmološki rastvor se ukapava u oči mužjaka C57BL/6J miševa da bi se proširile zenice. Zatim lasersko zračenje (talasna dužina, 532 nm; veličina tačke, 50 µm; vreme zračenja, 0,1 s; laserski izlaz, 120 mV) se sprovodi na 6 mesta oka pomoću prorezne lampe (SL-130) i višebojnog laserskog fotokoagulatora (MC-300), izbegavajući velike kapilare mrežnjače. Neposredno nakon indukcije CNV laserskim zračenjem, testirana jedinjenja prema pronalasku i kontroli se daju intravitrealnom injekcijom. Sedam dana nakon laserskog zračenja, 4% rastvor FITC-dekstrana se primenjuje u repnu venu u zapremini od 0,5 ml/životinji. Jedan do pet minuta nakon primene FITC-dekstrana, životinje su eutanazirane dislokacijom grlića materice. Očne jabučice se uklanjaju i fiksiraju u 4% paraformaldehid-fosfatnom puferu 12-24 h. Horoidni ravni nosači se pripremaju pod stereoskopskim mikroskopom. Fotografije CNV mesta se snimaju pomoću konfokalnog mikroskopa. Tokom laserski indukovanih CNV eksperimenata na životinjama, uspešno zračenje je potvrđeno za svako zračenje kao formiranje vazdušnih mehurića u oku životinjskih modela.
Modeli CNV i subretinalne fibroze izazvani laserom pacova: Ista tehnika će biti korišćena u modelu pacova koristeći mužjake BN pacova. Za model CNV, podešavanja lasera su veličina tačke 80 µm i vreme zračenja od 0,05 s na 120 mV na 8 mesta u retina-horoidei. Za CNV model subretinalne fibroze, korišćena snaga lasera je 240 mV. Odmah nakon laserskog zračenja, vrši se intravitrealna injekcija sa kontrolnim i testiranim jedinjenjima prema ovom pronalasku. Za CNV studije subretinalne fibroze koriste se (1) fiziološki nosač i (2) jedinjenja ovog pronalaska (15 µg/oku za jednu injekciju ili 2 ili 3 injekcije u intervalima od 2 nedelje). Nakon laserskog zračenja, za CNV studije, FITC-dekstran protokol kao gore se koristi 14 dana nakon laserskog zračenja, sa pripremom enukleisanih očiju za konfokalnu mikroskopiju ravne horoide. Za studije subretinalne fibroze, nakon 6 nedelja, životinje su žrtvovane, a oči sa enukleacijom se pripremaju za histopatološke studije da bi se kvantifikovala subretinalna fibroza pomoću svetlosne mikroskopije. Oči su ugrađene u parafinske blokove i isečene i obojene Masson trihromom prema rutinskim metodama. Fibrozu ocenjuju na slepo od dva ili tri nezavisna istraživača prema sledećoj skali: ocena 0, nijedna; ocena 1, minimalna; stepen 2, blaga; ocena 3, umerena; ocena 4, teška.
Primer 5.25: Lečenje i/ili prevencija pterigija (PTE)
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema ovom pronalasku je procenjena na horoidalnu angiogenezu i rast pterigijuma korišćenjem horoidalnog neovaskularnog mišjeg modela (CNV), direktnog in vivo testa angiogeneze (DIVAA) i pterigijum mišjeg modela.
Pterigijum je benigni fibrovaskularni rast očne površine koji se obično povezuje sa nelagodnošću i crvenim očima, a kako bolest napreduje često je povezan sa smanjenim vidom (topografski astigmatizam) i ograničenjem očne pokretljivosti u teškim slučajevima. Širok spektar proinflamatornih citokina indukovanih fibrogenim faktorima rasta, oksidativnim stresom i metilacijom DNK je uključen u patogenezu pterigijuma. Pošto na neke od ovih faktora utiče izlaganje ultraljubičastom (UV) svetlu, trenutni dokazi iz više izvora sugerišu da su osobe sa visokom izloženošću sunčevoj svetlosti pod povećanim rizikom od pterigijuma. Uprkos opsežnim istraživanjima, nema jasnog razumevanja patogeneze pterigijuma, ali jedan od najvažnijih faktora koji doprinose patogenezi su neoplastične promene limbalnih matičnih ćelija koje su povezane sa izlaganjem UV svetlosti i moguća uloga onkogenog virusa (humanog papiloma virusa).
Do danas su opisana tri životinjska modela pterigijuma, koristeći injekciju humanih epitelnih ćelija pterigijuma, egzogenog ekstracelularnog matriksa ili UV rasejanog zračenja kod zečeva i miševa. Rezultati modela zeca koji koristi UV rasejanu svetlost fokusirani su na kompjutersko predviđanje veličine i oblika rasta tkiva, bez histološke analize. Mišji model pokazao je histološke karakteristike humanog pterigijuma, međutim, manipulacija zečevima za oftalmološke procedure je lakša s obzirom da struktura i veličina oka više liče na ljudske.
Postupci: Miševi dobijaju vodu sa ili bez testiranih jedinjenja. Za CNV, zapremina neovaskularne lezije se određuje u ravnim nosačima pigmentnog epitela horoida i retine (RPE) korišćenjem konfokalne mikroskopije sedam dana nakon laserske indukcije. Za DIVAA, silikonske kapsule koje sadrže 10.000 humanih epitelnih ćelija pterigijuma se implantiraju u bokove miševa subkutano. Posle jedanaest dana, neovaskularizacija (NV) je kvantifikovana pomoću spektrofluorimetrije nakon injekcije dekstrana obeleženog fluorescein izotiocijanatom (FITC) u mišju repnu venu. Model pterigijumskih epitelnih ćelija je razvijen ubrizgavanjem 10.000 humanih epitelnih ćelija pterigijuma u nazalni subkonjunktivalni prostor kod atimičnih golih miševa.
Glavne mere ishoda: Studentov t-test se koristi za procenu podataka za CNV i DIVAA modele, a histološki preparati se koriste za procenu lezija pterigije.
Primer 5.26: Lečenje i/ili prevencija centralne serozne horioretinopatije (CSC)
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema ovom pronalasku je istražena in vivo korišćenjem CSC životinjskog modela kako su opisali Wei-Da Chio, i sar., Life Sci J 2019;16(12): 115-126 ISSN: 1097-8135
Patogeneza centralne serozne horioretinopatije (CSC) još uvek nije u potpunosti shvaćena. Učešće kortikosteroida je nesporno, iako njihova
tačna uloga nije razjašnjena; drugi delovi osnovnog mehanizma CSC su uglavnom razjašnjeni tehnikama snimanja kao što su fluoresceinska i indocijaninska zelena angiografija. Iako je većina slučajeva CSC samoograničavajuća, postoje teški i rekurentni tokovi, a za ove pacijente je dostupan samo ograničen broj opcija lečenja: laserska fotokoagulacija, sa rizikom od skotoma i horoidalne neovaskularizacije, i fotodinamička terapija.
Postupak: Tretman je izveden sa mužjacima SD pacova sa CSCR. Desno oko slučajeva je nasumično podeljeno u 2 grupe (sa kontrolom i sa testiranim jedinjenjima) koje su bile podvrgnute nizu pregleda uključujući indirektnu oftalmoskopiju i OCT skeniranje svake nedelje. Svi SD pacovi se prvo uvode u CSCR model. Ako CSCR nestane pod OCT snimanjem, jedinjenje se smatra efikasnim.
Primer 5.27: Lečenje i/ili prevencija cistične fibroze (CF) koja utiče na pluća, ali i pankreas, jetru, bubrege i creva
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema predmetnom pronalasku je istražena in vivo korišćenjem CF mišjeg modela kako su opisali McCarron A i sar. (Respir Res.2018 (19) / 1 (54) Objavljeno 2. aprila 2018. doi: 10,1186/s 12931-0 18-0750-i)
Kod ljudi, bolest pluća cistične fibroze (CF) karakteriše hronična infekcija, upala, remodeliranje disajnih puteva i opstrukcija sluzi. Nedostatak plućnih manifestacija kod CF mišjih modela ometa istraživanje patogeneze bolesti disajnih puteva, kao i razvoj i testiranje potencijalnih terapeutika. Međutim, nedavno generisani CF životinjski modeli, uključujući modele pacova, tvorova i svinja, pokazuju niz dobro okarakterisanih fenotipova bolesti pluća sa različitim stepenom ozbiljnosti. Dostupni su različiti fenotipovi disajnih puteva trenutno dostupnih CF životinjskih modela i predstavljaju potencijalnu primenu svakog modela u istraživanju CF u vezi sa disajnim putevima. Konkretno, razvijeni su mutantni aleli sa uobičajenim mutacijama koje izazivaju CF kod ljudi (npr., Phe508del ili Gli551Asp) uvedeni u CFTR sekvencu miša.
Primer 5.28: Lečenje i/ili prevencija idiopatske plućne fibroze (IPF)
Terapeutska efikasnost jedinjenja prema ovom pronalasku je istražena in vivo korišćenjem IPF životinjskog modela kako su opisali Chen SS i sar. (J Thorac Dis.2017;9(1):96-105. doi: 10.21037/jtd.22.01.2017.).
IPF je hronična progresivna intersticijska bolest pluća sa teškom plućnom fibrozom. Etiologija IPF-a ostaje nejasna. Pacijenti obično prežive samo 2-3 godine nakon što im se dijagnostikuje IPF. Incidencija i razvoj IPF-a su povezani sa povredom epitelnih ćelija, proliferacijom fibrocita, inflamatornim reakcijama i depozicijom ekstracelularnog matriksa. Patološka manifestacija IPF-a je uobičajena intersticijska pneumonija (UIP). Trenutno je smrtnost pacijenata sa IPF-om prilično visoka. Međutim, nedostaju efikasni tretmani za IPF. Glavni uzrok smrti uzrokovane IPF-om je akutna egzacerbacija IPF-a (AE-IPF), koja čini više od 50% smrtnih slučajeva povezanih sa IPF-om. Većina pacijenata sa AE-IPF ne može da toleriše bronhoskopiju ili biopsiju pluća zbog svog kritičnog stanja.
Nedostatak biopsije AE-IPF značajno ograničava dubinska istraživanja AE-IPF. Eksperimentalni životinjski modeli koji bi mogli da oponašaju AE-IPF bili bi korisni alati za proučavanje AE-IPF.
Koriste se životinjski modeli IPF-a izazvanog bleomicinom (BLM).
Model IPF kod pacova je razvijen intratrahealnom perfuzijom sa BLM. Teoretski, druga intratrahealna perfuzija sa BLM bi trebalo da izazove dodatnu povredu pluća kod pacova koji već razviju plućnu fibrozu od prve perfuzije. Dodatna povreda pluća može ličiti na patološke karakteristike AE-IPF.
Sprague Dawley (SD) pacovi su randomizirani u različite grupe: kontrolna grupa tretirana samo jedinjenjima, AE-IPF modelna grupa sa jedinjenjima BLM BLM grupa, AE-IPF grupa modela (cpd BLM BLM grupa), Grupa IPF modela tretirana jedinjenjima (Cpd BLM grupa), grupa IPF modela (BLM grupa) i normalna kontrolna grupa bez BLM.
Pacovi u BLM BLM grupama prolaze drugu perfuziju sa BLM 28. dana nakon prve perfuzije sa BLM. Pacovi u druge dve grupe dobijaju fiziološki rastvor kao drugu perfuziju. Šest pacova u svakoj grupi je žrtvovano 31. dana, 35. dana i 42. dana nakon prve perfuzije, respektivno.
Patofiziološke karakteristike pacova u grupi BLM BLM podsećaju na one kod pacijenata sa AE-IPF i kao što je opisano (Chen SS, J Thorac Dis 2017; 9(1):96-105), izgleda da druga perfuzija sa BLM izaziva akutnu pogoršanje plućne fibroze i može se koristiti za modeliranje AE-IPF kod pacova. Efekti formulacija jedinjenja u ovom modelu pacova korišćenjem AE-IPF indukovanog upotrebom jedne, odnosno dve intratrahealne perfuzije bleomicinom, trebalo bi da poboljšaju histopatološke nalaze (H&E- i Masson obojeni preseci analizirani i ocenjeni za akutnu povredu pluća) kao i preživljavanje.
Primer 5.29: Plućna fibroza izazvana bleomicinom kod C57BL/6 miševa sa 21 danom
Ukupno 40 muških Balb/c miševa starosti 8-10 nedelja je korišćeno za istraživanje. Oni su kupljeni od Charles Rivera, UK i imali su period aklimatizacije od 7 dana. Životinje su smeštene u IVC kaveze (do 5 po kavezu) sa pojedinačnim miševima identifikovanim po repu. Svim životinjama je bio dozvoljen slobodan pristup standardnoj sertifikovanoj komercijalnoj ishrani i dezinfekciji tokom studije. Sala za zadržavanje je održavana u standardnim uslovima: 18-24 °C, 55-70% vlažnosti i ciklus svetlo/mrak od 12 sati.
Svi protokoli korišćeni u ovoj studiji su odobreni od strane Komiteta za dobrobit životinja i etičku reviziju, a sve procedure su sprovedene u skladu sa smernicama Zakona o životinjama (naučne procedure) iz 1986. godine.
Miševi su anestezirani primenom IP injekcije ksilazina i ketamina.
Jednom kada je postignut odgovarajući nivo anestezije, životinjama je ukapljeno 1,0 U/kg bleomicin sulfata intratrahealnim putem. Ukupna zapremina tečnosti bila je 50 µl. Miševi su nasumično raspoređeni u grupe za tretman kao što je prikazano u Tabeli 57 ispod:
Tabela 57:
Doziranje IV i pozitivne kontrole (pirfenidon) počelo je 24 sata nakon instilacije bleomicina.
Rastvor leka je formulisan neposredno pre doziranja. Za dozu od 15 mg/kg (dovoljno za 12, 30 g miševa) izvagano je 4,5 mg jedinjenja. Dodato je 75 µl (5%) DMSO i mešano dok lek nije u rastvoru. Dodato je 150 µl (10%) rastvora i lagano mešalo, 150 µl (10%) PEG400 je dodato i lagano mešano. Dodato je 1000 ul PBS (pH7) i matrica je izmerena da bi se obezbedilo održavanje pH 7,0. Dodan je preostali PBS (do ukupno 1500 ul). Jedinjenje je ostalo u rastvoru.
Uzimanje uzoraka nakon završetka (konačni dan doziranja): Na dan uzorkovanja, 2 sata nakon konačne doze, miševi su žrtvovani uz pomoć prevelike doze anestezije. Životinje su uzorkovane za sledeće:
Serum: Odmah nakon žrtvovanja, krv je uzeta kardijalnom punkcijom i stavljena u Ependorfove epruvete. Epruvete su čuvane na sobnoj temperaturi najmanje 20 minuta pre centrifugiranja na 6.000 obrtaja u minuti tokom 5 minuta. Uzorci su čuvani na -80 °C.
Ukupna obdukcija: Nakon prekida, unutrašnji organi su izloženi i posmatrani. Zabeležene su bilo kakve abnormalnosti.
Pluća: Pluća su naduvana formalinom pre resekcije. Ukratko, traheja miša je bila izložena, a mali rez je napravljen pomoću oštrice. Materijal za šav je nežno postavljen oko zadnjeg dela traheje ispod reza i labavo vezan. Formalin je nežno ubačen u pluća i šav je čvrsto zatvoren da bi se obezbedilo naduvavanje. Pluća su stavljena u formalin i obojena trihromom i H&E bojom za analizu taloženja kolagena i progresije bolesti (Ashcroftov skor). Deo plućnog tkiva je naglo zamrznut.
Ashcroft bodovanje:
0 Normalna pluća
1 Minimalno fibrozno zadebljanje alveolarnih ili bronhiolarnih sudova
2 Između minimalnog i umerenog
3 Umereno zadebljanje zidova bez očiglednih oštećenja plućne arhitekture
4 Između umerene i povećane fibroze sa oštećenjem strukture pluća
5 Povećana fibroza sa definitivnim oštećenjem strukture pluća i formiranjem fibroznih traka ili malih fibroznih masa
6 Između povećane fibroze i teške distorzije strukture pluća
7 Ozbiljna distorzija strukture i velika vlaknasta područja;
„pluća u saću“
8 Totalna fibrozna obliteracija polja
Rezultati
Klinički znaci: Nisu zabeležene promene u telesnoj težini i nijedna životinja nije morala da ima odmor za doziranje tokom studije.
Ashcroft rezultat: Pluća svake životinje su FFPE, isečena i obojena H&E u skladu sa internim protokolom. Slajdovi su snimljeni na Glissando skeneru slajdova da bi se dobile cele slike slajdova. Svako pluće je ocenjeno korišćenjem Ashcroftovog sistema ocenjivanja za merenje stepena upale/fibroze prema Hübner i sar., 2008. Bodovanje je obavljeno na slep način. I pirfenidon u dozi od
100 mg/kg i IVc-059a u dozi od 15 mg/kg smanjili su početak fibroze u plućima miša (p=0,0018 i 0,0130, respektivno, ANOVA). Tretman pirfenidonom imao je isti efekat na početak fibroze kao tretman IVc-059a (p=0,4441, 2-strani T-test).
Reprezentativne slike su prikazane na slici 11A.
Slika 11A prikazuje reprezentativne slike fibroze pluća 21. dana lečenja: Primeri slika trihromskog bojenja vezivnog tkiva (k20); (A1) neindukovano (zdravo); A2, Bleomicin izazvan tretmanom vehikulom; A3, Bleomicin izazvan tretmanom pirfenidonom od 100 mg/kg; A4, Bleomicin izazvan tretmanom IVc-059a. Slika 11B prikazuje Ashcroftov rezultat zdravog, netretiranog izazvanog bleomicinom u odnosu na pirfenidon u odnosu na IVc-059a.
Celo plućno krilo svake životinje je fiksirano formalinom i uskladišteno u 70% etanolu. Ovi delovi su dehidrirani u rastućoj koncentraciji etanola pre nego što su umetnuti u parafinski vosak. Sekcije su isečene na 5 µm i pečene na Superfrost pločicama 2 sata. Sekcije su obojene korišćenjem komercijalno dostupnog kompleta za vezivno tkivo (Abeam ab150686). Procenat površine pokrivene trihromskim bojenjem je kvantifikovan korišćenjem softvera Kupath i ImageJ.
Primer 5.30: In vitro rezultati i ADME toksikologija
Sveobuhvatna procena ADME-toksikologije je izvršena na jedinjenjima Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a i IVc-059a.
Analiza srčanih jonskih kanala (CiPA) Core QPatch Panel je procenjen na Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a i IVc-059a: Za CiPA su korišćena tri sledeća testa: Nav1.5 QPatch CiPA test na ćelijama sa jonskim natrijumovim kanalima, hERG QPatch CiPA test na ćelijskim ćelijama sa jonskim kalijumom, Cav1.2 (L tip) QPatch CiPA test na ćelijama sa ljudskim jonskim kanalima.
Procenjivani su mikrozomi hepatocita i metabolizam humanih hepatocita. Procenjeni su sveobuhvatni set testova vezivanja, enzima i uzimanja, kao i svojstva rastvora, in vitro apsorpcija, metabolizam i toksičnost. Gebnetska toksičnost je procenjena korišćenjem AMES* i mikronukleusnih testova.
*Ames je bakterijski test za identifikaciju jedinjenja koja mogu da proizvedu mutaciju gena i pokazuje visoku prediktivnu vrednost testovima kancerogenosti glodara. In vitro
** In vitro mikronukleus testovi koji se koriste za identifikaciju jedinjenja koja izazivaju oštećenje hromozoma (klastogeni i aneugeni)
Rezultati
Visoko polarna jedinjenja pokazuju nizak metabolizam u mikrozomima jetre sa poluživotom dužim od 60 min. Nije primećen značajan toksični efekat na ćelije hepatocita gledajući na održivost. Većina negativno naelektrisanih jedinjenja je visoko vezana za proteine plazme. Nije primećen efekat genotoksičnosti.
Jedinjenja ne pokazuju značajan uticaj na Amesove testove fluktuacije* TA100 -S9, TA100 S9, TA1535 - S9, TA1535 S9, TA1537 - S9, TA1537 S9, TA98 -S9, TA98 S9 u koncentraciji od 5 µm do 0,1 mm. Nije primećena toksičnost za bakterije na TA100 -S9, TA1535 - S9, TA1537 - S9, TA98 - S9.
Nisu primećeni efekti u mikronukleus testu za opseg koncentracija procenjenih od 8 µm do 1 mm. U CiPA panelu, korišćena su tri testa zasnovana na ćelijama. Cav1.2 (L-tip) automatizovani CiPA test na ćelijskom zakrpanju zasnovanom na ćelijskim jonskim kanalima, hERG automatizovani CiPA test na ćelijskim kanalima kalijuma i Nav1.5 CiPA test sa automatskim patch Clamp-om na bazi ćelija sa ljudskim jonskim kanalima: svi rezultati su procenjeni na 3 nivoa koncentracije i nije primećena značajna inhibicija između 0,1 µm i 10 µm.
U testu bezbednosnog panela, jedinjenja nisu imala ili su imala veoma niske inhibicione efekte na sledeće enzimske sisteme koji pokazuju dobar bezbednosni profil na humanom transporteru 5-HT (h) (antagonistički radioligand); 5-HT1A (h) (agonist radioligand); 5-HT1B (h) (antagonist radioligand); 5-HT2A (h) (agonist radioligand); 5-HT2B (h) (agonist radioligand); 5-HT3 (h) (antagonist radioligand); A2A (h) (agonistički radioligand); acetilholinesteraza (h); alfa 1A (h) (antagonist radioligand); alfa 2A (h) (antagonist radioligand); AR(h) (agonistički radioligand); beta 1 (h) (agonist radioligand); beta 2 (h) (antagonist radioligand); BZD (centralni) (agonistički radioligand); Ca2+ kanal (L, dihidropiridin mesto) (antagonist radioligand); CB1 (h) (agonistički radioligand); CB2 (h) (agonistički radioligand); CCK1 (CCKA) (h) (agonistički radioligand); D1 (h) (antagonist radioligand); D2S (h) (agonistički radioligand); delta (DOP) (h) (agonist radioligand); transporter dopamina (h) (antagonist radioligand); ETA (h) (agonist radioligand); GR (h) (agonist radioligand); H1 (h) (antagonist radioligand); H2 (h) (antagonist radioligand); kapa (h) (KOP) (agonistički radioligand); KV kanal (antagonist radioligand); Lck kinaza (h); M1 (h) (antagonist radioligand); M2 (h) (antagonist radioligand); M3 (h) (antagonist radioligand); MAO-A (antagonist radioligand); mu (MOP) (h) (agonist radioligand); N neuronski alfa 4beta 2 (h) (agonistički radioligand); Na+ kanal (mesto 2) (antagonist radioligand); nmDA (antagonist radioligand); transporter norepinefrina (h) (antagonist radioligand); PDE3A (h); PDE4D2 (h); Kalijumski kanal hERG (human)- [3H] dofetilid; V1a (h) (agonistički radioligand).
Anti-inflamatorni efekat jedinjenja bio je u skladu sa delimičnom inhibicijom enzima ciklooksigenaze, na primer Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a i IVc-059a su pokazali delimičnu inhibiciju COX2 (cikloksigenaze-2).
Primer 5.31: In vitro profilisanje pomoću BioMap Plus
Serija in vitro testova je izvedena korišćenjem testova zasnovanih na primarnim ljudskim ćelijama koji modeliraju kompleksnu biologiju tkiva i bolesti organa (vaskulatura, imuni sistem, koža, pluća) i opštu biologiju tkiva za fenotipsko profilisanje jedinjenja u uslovima koji čuvaju preslušavanje i mehanizme povratne sprege. relevantne za in vivo ishode.
Potencija, selektivnost, bezbednost, mehanizam delovanja i indikacija bolesti jedinjenja Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a, IVc-059a su procenjeni pri koncentracijama 30 µm, 10 µm, 3,3 µm, 1,1 µm na sledećim ćelijskim sistemima koristeći BioMaps Plus fenotipski ćelijski test (Eurofins-DiscoverX, San Francisco, CA, SAD):
− Venularne endotelne ćelije za procenu kardiovaskularnih bolesti, hronične upale, astme, alergije, autoimune bolesti, atopijske bolesti
− PBMC sa venularnim endotelnim ćelijama za procenu kardiovaskularnih bolesti, hronične upale, autoimune bolesti, hronične upale;
− B ćelije sa PBMC za procenu autoimune bolesti, upale;
− Bronhijalne epitelne ćelije za procenu upale pluća, HOBP
− Glatke mišićne ćelije koronarne arterije za procenu kardiovaskularne upale, restenoze
− Dermalni fibroblasti za procenu fibroze, hronične upale, zarastanja rana, remodeliranja tkiva, modulacije matriksa
− Keratinociti/dermalni fibroblasti za procenu psorijaze, dermatitisa, biologije kože
− Fibroblasti pluća za procenu fibroze, hronične upale, remodeliranja matriksa
− Venularne endotelne ćelije sa makrofagima za procenu kardiovaskularne upale, restenoze, hronične upale
BioMpas Plus reference: Knjiga: Phenotypic Drug Discovery, Chapter 2 - Development and Validation of Disease Assays for Phenotypic Screening. Ellen L. Berg, Sheryl P. Denker and Alison O'Mahony. https://doi.org/10.1039/9781839160721-00020 ISBN 978-1-83916-072-1
Assessing bioactivity-exposure profiles of fruit and vegetable extracts in the BioMAP profiling system. Wetmore BA, Clewell RA, Cholewa B, Parks B, Pendse SN, Black MB, Mansouri K, Haider S, Berg EL, Judson RS, Houck KA, Martin M, Clewell HJ 3rd, Andersen ME, Thomas RS, McMullen PD. Toxicology in Vitro. 2019,54,41-57.
Rezultati
Ic-007a nije bio citotoksičan u koncentracijama testiranim u ovoj studiji. Ic-007a je bio antiproliferativan za ljudske primarne T ćelije (30 µm) i fibroblaste (30 µm, 10 µm, 3,3 µm, 1,1 µm). Ic-007a je bio aktivan sa 20 obeleženih očitavanja, a posredovane promene u ključnim aktivnostima biomarkera su navedene po biološkim klasifikacijama i klasifikacijama bolesti. Uglavnom je Ic-007a uticao na aktivnosti povezane sa zapaljenjem (smanjenje VCAM-1, sTNFα, MIP-1α, I-TAC, MIG; povećan IL-8; modulisan IP-10), imunomodulatorne aktivnosti (smanjenje CD40, M-CSF) i aktivnosti remodeliranja tkiva (smanjenje kolagena I, kolagena IV, TIMP-1, tPA, kolagena III, PAI-1, uPAR, bFGF).
Ic-007a nije bio citotoksičan u koncentracijama testiranim u ovoj studiji. IIc-007a nije bio citotoksičan u koncentracijama testiranim u ovoj studiji.
IIc-007a je bio aktivan sa 12 obeleženih očitavanja, a posredovane promene u ključnim aktivnostima biomarkera su navedene po biološkim klasifikacijama i klasifikacijama bolesti. Uglavnom je IIc-007a uticao na aktivnosti povezane sa zapaljenjem (smanjenje sTNFα, MIP-1α; povećan IL-8; modulisani MCP-1), imunomodulatorne aktivnosti (smanjenje sIL-10, sIL-2) i aktivnosti remodeliranja tkiva (smanjenje kolagena I, kolagena IV, kolagena III, PAI-1).
IIIc-061a nije bio citotoksičan u koncentracijama testiranim u ovoj studiji. IIIc-061a nije imao nikakav antiproliferativni efekat na ove ljudske primarne ćelije u testiranim koncentracijama. IIIc-061a je bio aktivan sa šest obeleženih očitavanja, a posredovane promene u ključnim aktivnostima biomarkera su navedene po biološkim klasifikacijama i klasifikacijama bolesti. IIIc-061a je uticao na aktivnosti povezane sa upalom (smanjenje I-TAC, MIG), imunomodulatorne aktivnosti (smanjenje sIL-17A) i aktivnosti remodeliranja tkiva (smanjenje kolagena I, kolagena III, PAI-1).
IVc-059a nije bio citotoksičan u koncentracijama testiranim u ovoj studiji. IVc-059a je bio antiproliferativan za ljudske primarne endotelne ćelije (1,1 µm). IVc-059a je bio aktivan sa tri obeležena očitavanja, a posredovane promene u ključnim aktivnostima biomarkera su navedene po biološkim klasifikacijama i klasifikacijama bolesti. IVc-059a je uticao na aktivnosti povezane sa upalom (smanjenje sTNFα) i imunomodulatorne aktivnosti (smanjenje sIL-10, sIL-2).
Primer 5.32: In vitro rezultati na ljudskim pigmentnim epitelnim ćelijama retine (RPE) ARPE-19 i humanim endotelnim ćelijama retine (HRECs)
Jedinjenja Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a i bevacizumab (BEVA)) su procenjena na njihov efekat na poremećaj unutrašnje i spoljašnje krvne retinalne barijere izazvane dijabetičkim stanjima. Dve različite koncentracije jedinjenja su procenjene 25 µm i 50 µm Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a. Mehanizmi delovanja uključeni u efekat anti-permeabilnosti testiranih tretmana su istraženi procenom permeabilnosti za proizvodnju fluorescentnog dekstrana i proinflamatornih citokina korišćenjem nivoa njihove ekspresije mRNA pomoću RT-PCR.
Uslovi retinalne barijere spoljašnje krvi: kulture ljudskih pigmentnih epitelnih ćelija retine (RPE) ARPE-19, spontano ovekovečena ljudska RPE ćelijska linija dobijene su iz American Tipe Culture Collection (Manassas, VA, SAD). ARPE-19 ćelije i one su uzgajane u euglikemijskim uslovima (D-glukoza (D-Glc), 5,5 mmol/L) i hiperglikemijskim uslovima (D-glukoza, 25 mmol/l) tokom 18 dana na 37°C ispod 5% (vol./vol.) CO2 u medijumu (DMEM/F12) sa dodatkom 10% (vol./vol.) FBS (Hiclone; Thermo Fisher Scientific, UT, SAD) i 1% (vol./vol.) penicilin/streptomicin (Hiclone; Thermo Fisher Scientific). Korišćene su ćelije ARPE-19 iz pasaža 20, a medijum se menjao svaka 3-4 dana. Za studije permeabilnosti, ARPE-19 ćelije su zasejane pri 400,000 ćelija/ml (80,000 RPE ćelija/bunariću) u 0,33 cm<2>HTS-Transvells (Costar; Corning, NY, USA). Za PCR u realnom vremenu, vestern blot analiza i ćelije imunofluorescencije su zasejane pri 20.000 ćelija/ml.
Eksperimentalni uslovi i tretmani: osim euglikemijskog stanja, osamnaest različitih stanja je testirano u ćelijama uzgajanim pod 25 mmol/l D-glukoze:
Stanje 1) Kontrolne ćelije nisu primile nikakav tretman 5 mm D-glukoze
Stanje 2) Ćelije se tretiraju dijabetičkim miljeom 25 mm D-glukoze vehikulum (15., 16. i 17. dan po jednoj aplikaciji/dan) kako bi se procenio njihov efekat u prevenciji oštećenja ćelija izazvanih dijabetičkim miljeom.
Stanje 3, 4, 5, 6, 7, 8) Ćelije su tretirane sa 25 mm D-glukoze i dve različite koncentracije svakog proizvoda: Ic-007a (3, 4) 25 µg/ml (=53 µm) i 50 µg/mL (=107 µm); IIc-007a (5, 6) 25 µg/ml (=53 µm) i 50 µg/ml (=107 µm); IVc-059a (7, 8) 20 µg/ml (=50 µm) i 40 µg/ml (=100 µm) tokom 72 h (15., 16. i 17. dani po jednoj aplikaciji/dan) da bi se procenili njihovi potencijalni citotoksični efekti. Stanje 9) Ćelije su tretirane sa 25 mm D-glukoze i bevacizumabom (0,2 mg/ml) tokom 72 h (15., 16. i 17. dan po jednoj aplikaciji/dan) da bi se procenili njihovi potencijalni citotoksični efekti.
Stanje 10) = dijabetički milje; ćelije su tretirane sa 25 mm D-glukoze IL-1β (10 ng/ml) TNF-α (25 ng/ml) VEGF (25 ng/ml), tokom 48 h (16. i 17. dan u jednoj primeni/ dan) kako bi se izazvalo narušavanje monosloja.
Stanje 11, 12, 13, 14, 15, 16) Ćelije su tretirane dijabetičkim miljeom (25 mm D-glukoza IL-1β (10 ng/ml) TNF-α (25 ng/ml) VEGF (25 ng) /ml)) dve koncentracije novih jedinjenja (Ic-007a, IIc-007a i IVc-059a (15., 16. i 17. dan po jednoj aplikaciji/dan) kako bi se procenio njihov efekat u prevenciji oštećenja ćelija izazvanih dijabetičkim miljeom.
Stanje 17) Ćelije su tretirane dijabetičkim miljeom (25 mm D-glukoza IL-1β (10 ng/ml) TNF-α (25 ng/ml) VEGF (25 ng/ml)) bevacizumab
(0,2 mg/ ml) (15., 16. i 17. dan po jednoj aplikaciji/dan) kako bi se procenila njihov efekat u sprečavanju oštećenja ćelija izazvanih dijabetičkim miljeom.
Merenje propustljivosti ARPE-19: Permeabilnost RPE ćelija je određena na 18 dana merenjem apikalnog ka bazolateralnom kretanju FITC-dekstrana (40 kDa) (Sigma, St Louis, MI, SAD) prema proceduri koju su prethodno izvestili Villarroel et al. Ekp Eie Res, 2009, 89, 913-920.
Stanja retinalne barijere unutrašnje krvi: primarne ljudske endotelne ćelije retine (HREC) su dobijene iz bočice kriokonzerviranih ćelija kupljenih od Innoprota (Vizcay, Španija). Ove ćelije su izolovane iz humanog retinalnog tkiva kadaveričnih očiju digestiranih sa 0,1 mg/ml kolagenaze tipa I na 37 °C tokom 1 sata. Zatim su endotelne ćelije konačno odabrane magnetnim kuglicama obloženim CD31 antitelom (DynaBeads; Dynal, Oslo, Norveška). HREC su odmrznuti u laboratoriji i kultivisani u endotelnoj bazalnoj podlozi (EBM) koja sadrži 5,5 mm D-glukoze, 5% FBS (fetalni goveđi serum), 100 U/ml penicilina, 100 µg/mL streptomicina i EKG (Endotheli Cell Grovth). Dodatak) dodatak (Innoprot, Vizcai, Španija). Humani fibronektin (MerckMillipore, Madrid, Španija) od 5 µg/ml je korišćen za vezivanje ćelija. Za eksperimente će se koristiti ćelije na pasusima 2-3. Za eksperimentisanje, HRECs su uzgajani do konfluencije, a zatim je medijum ćelijske kulture promenjen u medijum sa dodatkom 1% FBS tokom 24 h, a zatim izložen različitim tretmanima.
Uslovi i tretmani: Korišćeni su isti uslovi navedeni za eksperiment u ćelijama ARPE-19. Merenje HREC permeabilnosti: Permeabilnost u HREC monoslojevima je dobijena na propusnim nosačima pri 12 × 10<5>ćelija/bunariću (24 bunara, PCF filteri, Merk Millipore). Inserti su inkubirani 48 sati na 37°C u 5% CO2-vazduhu da bi se formirao monosloj. Na kraju, medijum je iscrpljen serumom 24 h pre nego što se nastavi sa tretmanima. Donja komora je napunjena sa 600 µl kompletnog EBM medijuma, a gornja komora sa 100 µl ćelijske suspenzije u osiromašenom serumu (1%).
Da bi se otkrile promene u permeabilnosti, 100 µg/ml fluorescentnog FITC-DEKSTRAN-a (Sigma, Madrid, Španija) je dodato na gornju stranu umetka. Alikvoti od 200 µl iz bazalnog odeljka su očitani u SpectraMak Gemini (Molecular Devices, Sunnivale, CA) na talasnoj dužini ekscitacije/emisije 485/528 nm svakih 30 min. Konačno, koncentracija dekstrana je određena ekstrapolacijom očitavanja fluorescencije u standardnoj krivoj. Svaki uslov je testiran u tri primerka.
Vijabilnost i proliferacija ćelije: Brojanje ćelija i MTT test su izvedeni u HREC-ima da bi se procenila održivost ćelija u testiranim uslovima. Izmerena je održivost i proliferacija HREC-a. Ukratko, ćelije su obojene DAPI i fotografije su snimljene (20x) u fluorescentnom invertovanom mikroskopu (Olympus iX71 sa V-RFL-T Olimpusom). Ćelijska jezgra su prebrojana uz pomoć softvera Image J u tri različita polja za svako stanje. Eksperimenti su ponovljeni tri puta. Pored toga, MTT test (Sigma, Madrid, Španija) je korišćen za procenu održivosti ćelija.
Ukratko, 10 µl 5 mg/ml MTT u PBS je dodato u svaki bunar nakon tretmana i inkubirano dodatnih 1 h na 37 °C. Medijum je uklonjen, a dobijene granule formazana su rastvorene u 100% dimetil sulfoksidu (DMSO) i detektovana je apsorpcija na 562 nm pomoću ELISA čitača ploča (ELx800. Bio-Tek Instruments, VT, USA). Ovaj test je isključio potencijalnu pristrasnost u rezultatima zbog promena u proliferaciji ćelija među različitim uslovima.
Mehanizmi delovanja:
− Proinflamatorni citokini su procenjeni u ARPE-19 ćelijama pomoću RT-PCR i mRNA za IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-18, VEGF, IL-10, FGF su mereni korišćenjem dvostruke delta CT metode 2-ΔΔCT sa Cts vrednostima za gen od interesa i endogeni humani B-aktin za dobijanje ΔCT; Vrednosti mRNA su izražene kao relativna promena u odnosu na stanje 25 mm D-Gluc. (ref: Livak KJ, Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method, Methods, 2001, 25(4), 402-408, doi 10.1006/meth.2001.1262)
− Proizvodnja ROS je procenjena korišćenjem OkiSelect<™>intracelularnog ROS testa Cell Biolabs (Zelena fluorescencija) (Bionova, Madrid, Španija). Test koristi fluorogenu sondu propustljivu za ćelije 2', 7'-dihlorodihidrofluorescin diacetat (DCFH-DA), oksidovanu u visoko fluorescentni 2', 7'-dihlorodihidrofluorescein (DCF) ćelijskim ROS.
− Ekspresija endotelina-1, PDGF i VCAM-1 je analizirana u HREC monoslojevima imunohistohemijskom analizom i RT-PCR.
− Ekspresija TJ (ZO) je analizirana u monoslojevima ARPE-19 i HREC imunohistohemijskom analizom.
Rezultati:
Rezultati permeabilnosti spoljašnje krvne retinalne barijere (ARPE19 monosloj) i unutrašnje krvne retinalne barijere (HREC) prikazani su u tabeli 58. Jedinjenja Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a su smanjila permeabilnost spoljašnjih i unutrašnjih monoslojeva.
Uticaj jedinjenja Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a na proizvodnju ROS i TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-18 i VEGF-mRNA u monoslojnim ćelijama ARPE19 izloženim nedijabetičkim i dijabetički milje prikazani su u Tabeli 59.
Tabela 58: Propustljivost spoljne krvne retinalne barijere i unutrašnje krvne retinalne barijere korišćenjem curenja fluorescencije FITC-dekstran (ng/mL/cm<2>).
Tabela 59: Proizvodnja ROS i TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-18 i VEGF mRNA od strane jednoslojnih ćelija ARPE19 u nedijabetičkom i dijabetičkom okruženju.
_____________________

Claims (21)

  1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Supstituisani hidrohinon formule (I):
    pri čemu: Ra, Rb = H, C1-4acil, arilC1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil; R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, ili CONH-R10; jedan od R2 ili R3 je H, a drugi je R5; R4= H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-Cealkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R5 = R6, R7, ili R8 R6 = CONH-R9, CONHCOR9, CONH(CH2)n-R9, CONHCH(COOR4)(CH2)kR9,; pri čemu je k = 0-4; R7 = benzoheteroaril supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, 5-člani heterocikli koji sadrže N ili fluor; R8 = (CH2)mX(CH2)pR9; X = O, S, SO2, NH, NAc, ili N(CH2)qR9; R9 = aril, heteroaril, supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 5-člani heterocikli koji sadrže N, fluor, C=O, ili NHCO-R10; R10 = aril, heteroaril, supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 5-člani heterocikli koji sadrže N, ili fluor; pri čemu je aril R9 i R10 aromatična grupa koja sadrži od 6 do 14 atoma ugljenika, izabrana između fenil, naftil, bifenil grupe; i heteroaril R9 i R10 je aromatična grupa koja sadrži 1 do 14 atoma ugljenika i jedan ili više azota; i n, m, p i q su nezavisno 1-4.
  2. 2. Jedinjenje formule (I), prema patentnom zahtevu 1:
    pri čemu: Ra, Rb = H, C1-4acil, arilC1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil; R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, ili CONH-R10; jedan od R2 ili R3 je H, a drugi je R5; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R5 = R6, ili R7, R6 = CONH-R9, CONHCOR9, CONH(CH2)n-R9, ili CONHCH(COOR4)(CH2)kR9; pri čemu je k = 0-4; R7 = benzoheteroaril supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, 5-člani heterocikli koji sadrže N ili fluor; R9 = aril, heteroaril, supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 5-člani heterocikli koji sadrže N, fluor, C=O, ili NHCO-R10; R10 = aril, heteroaril, supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 5-člani heterocikli koji sadrže N, ili fluor; pri čemu je aril R9 i R10 aromatična grupa koja sadrži od 6 do 14 atoma ugljenika, izabrana između fenil, naftil, bifenil grupe; i heteroaril R9 i R10 je aromatična grupa koja sadrži 1 do 14 atoma ugljenika i jedan ili više azota; i n je nezavisno 1-4.
  3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, pri čemu: (A) Ra, Rb = H, C1-4acil, arilC1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil; R1 = COOR4, R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R2 = H; R3 = R5; i R5 = R6 = CONH-R9; ili (B) Ra, Rb = H, C1-4acil, arilC1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil; R1 = COOR4, R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R3 = H; R2 = R5; i R5 = R6 = CONH-R9; ili pri čemu je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od: 4-(2-karboksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 4-(2-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 2,5-dihidroksi-4-(2-sulfofenilaminokarbonil)benzoeva kiselina; 4-(3-karboksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 4-(3-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 2,5-dihidroksi-4-(3-sulfofenilaminokarbonil)benzoeva kiselina; 4-(4-karboksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 4-(4-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 2,5-dihidroksi-4-(4-sulfofenilaminokarbonil)benzoeva kiselina; 4-(3-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 4-(4-karboksi-3-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 4-(4-karboksi-2,5-dihidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 4-(2-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 3,5-bis(2,5-dihidroksi-4-karboksibenzoilamino)benzoeva kiselina; 3-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)ftalna kiselina; 2-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)tereftalna kiselina; 2-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalna kiselina; 4-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)ftalna kiselina; 5-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalna kiselina; 2-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinska kiselina; 2-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)izonikotinska kiselina; 6-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinska kiselina; 6-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinska kiselina; 2-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)-5-fluoronikotinska kiselina; 6-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)piridin-2,5-dikarboksilna kiselina; 2-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)piridin-3,5-dikarboksilna kiselina; 3-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)izonikotinska kiselina; 5-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinska kiselina; 5-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinska kiselina; 3-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinska kiselina; 5-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)-2-fluoroizonikotinska kiselina; 4-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinska kiselina; 4-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinska kiselina; 4-(4-(karboksimetil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 4-(3-(karboksimetil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 2,5-dihidroksi-4-(3-(1-hidroksi-1H-pirazol-4-il)fenilaminokarbonil)benzoeva kiselina; 4-(2-(karboksimetil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; etil 4-(2-(etoksikarbonil)fenilaminokarbonil)-2,5-diacetoksibenzoat; etil 4-(2-(etoksikarbonil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoat; etil 4-(2-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-diacetoksibenzoat; etil 4-(2-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoat; etil 2,5-dihidroksi-4-(4-hidroksi-3-(metoksikarbonil)fenilaminokarbonil)benzoat; etil 3,5-bis(2,5-diacetoksi-4-etoksikarbonilbenzoilamino)benzoat; etil 3,5-bis(2,5-dihidroksi-4-etoksikarbonilbenzoilamino)benzoat; etil 3-(4-(etoksikarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)izonikotinat; etil 4-(4-etoksikarbonil-2,5-dihidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoat; 3-(2-karboksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 3-(2-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; ,5-dihidroksi-3-(2-sulfofenilaminokarbonil)benzoeva kiselina; -(3-karboksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; -(3-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; ,5-dihidroksi-3-(3-sulfofenilaminokarbonil)benzoeva kiselina; -(4-karboksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; -(4-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; ,5-dihidroksi-3-(4-sulfofenilaminokarbonil)benzoeva kiselina; -(3-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; -(4-karboksi-3-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; -(2-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; ,5-bis(2,5-dihidroksi-3-karboksibenzoilamino)benzoeva kiselina; -(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)ftalna kiselina; -(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)tereftalna kiselina; -(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalna kiselina; -(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)ftalna kiselina; -(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalna kiselina; -(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinska kiselina; -(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)izonikotinska kiselina; -(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinska kiselina; -(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinska kiselina; -(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)-5-fluoronikotinska kiselina; 6-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)piridin-2,5-dikarboksilna kiselina; 2-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)piridin-3,5-dikarboksilna kiselina; 3-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)izonikotinska kiselina; 5-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinska kiselina; 5-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinska kiselina; 3-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinska kiselina; 5-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)-2-fluoroizonikotinska kiselina; 4-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinska kiselina; 4-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinska kiselina; 3-(4-(karboksimetil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 3-(3-(karboksimetil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; 2,5-dihidroksi-3-(3-(1-hidroksi-1H-pirazol-4-il)fenilaminokarbonil)benzoeva kiselina; 3-(2-(karboksimetil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina; etil 3-(2-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoat; i etil 3-(2-(etoksikarbonilmetil)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoat;
  4. 4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, pri čemu: (A) Ra, Rb = H; R1 = SO3H; R2 = H; R3 = R5; i R5 = R6 = CONH-R9; ili (B) Ra, Rb = H; R1 = SO3H; R3 = H; R2 = R5; i R5 = R6 = CONH-R9; ili pri čemu je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od: 2-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)benzoeve kiseline; 2,5-dihidroksi-4-(2-sulfofenilaminokarbonil)benzensulfonske kiseline; 3-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)benzoeve kiseline; 2,5-dihidroksi-4-(3-sulfofenilaminokarbonil)benzensulfonske kiseline; 4-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)benzoeve kiseline; 2,5-dihidroksi-4-(4-sulfofenilaminokarbonil)benzensulfonske kiseline; 5-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline; 4-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)-5-hidroksibenzoeve kiseline; 3,5-bis(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)benzoeve kiseline; 3-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)ftalne kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)tereftalne kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)izoftalne kiseline; 4-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)ftalne kiseline; 5-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)izoftalne kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)nikotinske kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)izonikotinske kiseline; 6-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)nikotinske kiseline; 6-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)pikolinske kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)-5-fluoronikotinske kiseline; 6-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)piridin-2,5-dikarboksilne kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)piridin-3,5-dikarboksilne kiseline; 3-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)izonikotinske kiseline; 5-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)nikotinske kiseline; 5-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)pikolinske kiseline; 3-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)pikolinske kiseline; 5-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)-2-fluoroizonikotinske kiseline; 4-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)nikotinske kiseline; 4-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)pikolinske kiseline; (4-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)fenil)sirćetne kiseline; (3-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)fenil)sirćetne kiseline; (2-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)fenil)sirćetne kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)benzoeve kiseline; 2,5-dihidroksi-3-(2-sulfofenilaminokarbonil)benzensulfonske kiseline; 3-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)benzoeve kiseline; 2,5-dihidroksi-3-(3-sulfofenilaminokarbonil)benzensulfonske kiseline; 4-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)benzoeve kiseline; 2,5-dihidroksi-3-(4-sulfofenilaminokarbonil)benzensulfonske kiseline; 5-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline; 4-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)-5-hidroksibenzoeve kiseline; 3-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)-5-(2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)benzoeve kiseline 3-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)ftalne kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)tereftalne kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)izoftalne kiseline; 4-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)ftalne kiseline; 5-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)izoftalne kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)nikotinske kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)izonikotinske kiseline; 6-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)nikotinske kiseline; 6-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)pikolinske kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)-5-fluoronikotinske kiseline; 6-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)piridin-2,5-dikarboksilne kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)piridin-3,5-dikarboksilne kiseline; 3-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)izonikotinske kiseline; 5-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)nikotinske kiseline; 5-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)pikolinske kiseline; 3-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)pikolinske kiseline; 5-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)-2-fluoroizonikotinske kiseline; 4-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)nikotinske kiseline; 4-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)pikolinske kiseline; (4-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)fenil)sirćetne kiseline; (3-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)fenil)sirćetne kiseline; i (2-(2,5-dihidroksi-3-sulfobenzamido)fenil)sirćetne kiseline.
  5. 5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, pri čemu: (A) Ra, Rb = H, R1 = (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, Ci-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R2 = H ili R5, R3 = R5; i R5 = R6 = CONH-R9; ili (B) Ra, Rb = H; R1 = (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-Ci-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi1-etil, Ci-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R3 = H; R2 = R5; i R5 = R6 = CONH-R9; ili pri čemu je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od: 2-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)benzoeve kiseline; (2-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; (2,5-dihidroksi-4-(2-sulfofenilaminokarbonil)fenil)sirćetne kiseline; 3-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)benzoeve kiseline; (2,5-dihidroksi-4-(3-sulfofenilaminokarbonil)fenil)sirćetne kiseline; 4-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)benzoeve kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-4-(4-sulfofenilaminokarbonil)fenil)sirćetne kiseline; 5-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline; 4-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline; 2-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)-5-hidroksibenzoeve kiseline; 3,5-bis(2,5-dihidroksi-4-karboksimetilbenzoilamino)benzoeve kiseline 3-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)ftalne kiseline; 2-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)tereftalne kiseline; 2-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalne kiseline; 4-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)ftalne kiseline; 5-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalne kiseline; 2-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinske kiseline; 2-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)izonikotinske kiseline; 6-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinske kiseline; 6-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinske kiseline; 2-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)-5-fluoronikotinske kiseline; 6-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)piridin-2,5-dikarboksilne kiseline; 2-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)piridin-3,5-dikarboksilne kiseline; 3-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)izonikotinske kiseline; 5-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinske kiseline; 5-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinske kiseline; 3-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinske kiseline; 5-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-fluoroizonikotinske kiseline; 4-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinske kiseline; 4-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinske kiseline; (4-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)fenil)sirćetne kiseline; (3-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)fenil)sirćetne kiseline; (2-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)fenil)sirćetne kiseline; metil 2-(4-(etoksikarbonilmetil)-2,5-dihidroksibenzamido)benzoata; etil (4-(2-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)acetata; dietil 5-(4-(etoksikarbonilmetil)-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalata; metil 3,5-bis(4-(etoksikarbonilmetil)-2,5-dihidroksibenzamido)benzoata; 2-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)benzoeve kiseline; (2,5-dihidroksi-3-(2-sulfofenilaminokarbonil)fenil)sirćetne kiseline; 3-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)benzoeve kiseline; (2,5-dihidroksi-3-(3-sulfofenilaminokarbonil)fenil)sirćetne kiseline; 4-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)benzoeve kiseline; (2,5-dihidroksi-3-(4-sulfofenilaminokarbonil)fenil)sirćetne kiseline; 5-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline; 4-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline; 2-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)-5-hidroksibenzoeve kiseline; 3,5-bis(2,5-dihidroksi-3-karboksimetilbenzoilamino)benzoeve kiseline 3-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)ftalne kiseline; 2-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)tereftalne kiseline; 2-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalne kiseline; 4-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)ftalne kiseline; 5-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)izoftalne kiseline; 2-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinske kiseline; 2-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)izonikotinske kiseline; 6-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinske kiseline; 6-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinske kiseline; 2-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)-5-fluoronikotinske kiseline; 6-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)piridin-2,5-dikarboksilne kiseline; 2-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)piridin-3,5-dikarboksilne kiseline; 3-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)izonikotinske kiseline; 5-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinske kiseline; 5-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinske kiseline; 3-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinske kiseline; 5-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-fluoroizonikotinske kiseline; 4-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)nikotinske kiseline; 4-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)pikolinske kiseline; (4-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)fenil)sirćetne kiseline; (3-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)fenil)sirćetne kiseline; i (2-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksibenzamido)fenil)sirćetne kiseline.
  6. 6. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, pri čemu: (A) Ra, Rb = H, C1-4acil, arilC1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil; R1 = CONH-R10; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, Ci-ceaciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R2 = H; R3 = R5; i R5 = R6 = CONH-R9; ili (B) Ra, Rb = H, C1-4acil, arilC1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil; R1 = CONH-R10; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-Ci-cealkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, Ci-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R3 = H; R2 = R5; i R5 = R6 = CONH-R9. ili pri čemu je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od: 5-(4-(2-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline; N1,N4-bis(2-(1H-tetrazol-5-il)fenil)-2,5-dihidroksitereftalamida; 5-(4-(3-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline; 5-(2,5-dihidroksi-4-(4-hidroksi-3-sulfofenilaminokarbonil)benzamido)-2-hidroksibenzensulfonske kiseline; 4-(4-(4-karboksi-3-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline; 4-(2,5-dihidroksi-4-(3-hidroksi-4-sulfofenilaminokarbonil)benzamido)-2-hidroksibenzensulfonske kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-4-(4-hidroksi-2-karboksifenilaminokarbonil)benzamido)-5-hidroksibenzoeve kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-4-(4-hidroksi-2-sulfofenilaminokarbonil)benzamido)-5-hidroksibenzen sulfonske kiseline; metil 5-(4-(2-(1H-tetrazol-5-il)fenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoata; metil 5-(2,5-diacetoksi-4-(4-acetoksi-3-(metoksikarbonil)fenilaminokarbonil)benzamido)-2-acetoksibenzoata; metil 5-(2,5-dihidroksi-4-(4-hidroksi-3-(metoksikarbonil)fenilaminokarbonil)benzamido)-2-hidroksibenzoata; metil 2-(2,5-dihidroksi-4-(4-hidroksi-2-(metoksikarbonil)fenilaminokarbonil)benzamido)-5-hidroksibenzoata; 1-(2,2-dimetilpropanoiloksi)etil 5-[[4-[[3-[1-(2,2-dimetilpropanoiloksi)etoksikarbonil]-4-hidroksi-fenil]aminokarbonil]-2,5-dihidroksibenzoil] amino]-2-hidroksibenzoata 5-(3-(3-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline; 5-(2,5-dihidroksi-3-(4-hidroksi-3-sulfofenilaminokarbonil)benzamido)-2-hidroksibenzensulfonske kiseline; 4-(3-(3-hidroksi-4-karboksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeve kiseline; 4-(2,5-dihidroksi-3-(3-hidroksi-4-sulfofenilaminokarbonil)benzamido)-2-hidroksibenzensulfonske kiseline; 2-(3-(2-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-5-hidroksilbenzoeve kiseline; i 2-(2,5-dihidroksi-3-(4-hidroksi-2-sulfofenilaminokarbonil)benzamido)-5-hidroksibenzensulfonske kiseline.
  7. 7. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2 koje ima formulu (I):
    pri čemu: Ra, Rb = H; R1 = CONH-R10; R10 = fenil supstituisan sa COOR4 i sa OR4; R2 = H; R3 = CONH-R9; R9 = fenil supstituisan sa COOR4 i sa OR4; i R4 = H; i pri čemu je jedinjenje 5-(4-(3-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeva kiselina.
  8. 8. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2 koje ima formulu (I):
    pri čemu: Ra, Rb = H; R1 = CONH-R10; R10 = fenil supstituisan sa COOR4 i sa OR4; R2 = CONH-R9; R3 = H; R9 = fenil supstituisan sa COOR4 i sa OR4; i R4 = H; i pri čemu je jedinjenje 5-(3-(3-karboksi-4-hidroksifenilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzamido)-2-hidroksibenzoeva kiselina.
  9. 9. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, pri čemu: (A) Ra, Rb = H; R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R2 = H; R3 = R5; i R5 = R6 = CONHCOR9; ili (B) Ra, Rb = H; R<1>= COOR4; (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R3 = H; R2 = R5; i R5 = R6 = CONHCOR9; ili pri čemu je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od: N-(1,3,4,5-tetrahidroksicikloheksilkarbonil) 4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamida; N-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzoil) 4-karboksi-2,5-dihidroksi-benzamida; N-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzoil) 4-karboksi-2,5-dihidroksi-benzamida; N-(3,4-dihidroksibenzoil) 4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamida; N-(3,5-dihidroksibenzoil) 4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamida; N-(1,3,4,5-tetrahidroksicikloheksilkarbonil) 3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamida; N-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzoil) 3-karboksi-2,5-dihidroksi-benzamida; N-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzoil) 3-karboksi-2,5-dihidroksi-benzamida; N-(3,4-dihidroksibenzoil) 3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamida; N-(3,5-dihidroksibenzoil) 3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamida; N-(1,3,4,5-tetrahidroksicikloheksilkarbonil) 4-karboksimetil-2,5-dihidroksibenzamida; N-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzoil) 4-karboksimetil-2,5-dihidroksibenzamida; N-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzoil) 4-karboksimetil-2,5-dihidroksibenzamida; N-(3,4-dihidroksibenzoil) 4-karboksimetil-2,5-dihidroksibenzamida; N-(3,5-dihidroksibenzoil) 4-karboksimetil-2,5-dihidroksibenzamida; N-(1,3,4,5-tetrahidroksicikloheksilkarbonil) 3-karboksimetil-2,5-dihidroksibenzamida; N-(4-karboksi-2,5-dihidroksibenzoil) 3-karboksimetil-2,5-dihidroksibenzamida; N-(3-karboksi-2,5-dihidroksibenzoil) 3-karboksimetil-2,5-dihidroksibenzamida; N-(3,4-dihidroksibenzoil) 3-karboksimetil-2,5-dihidroksibenzamida; i N-(3,5-dihidroksibenzoil) 3-karboksimetil-2,5-dihidroksibenzamida.
  10. 10. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, pri čemu: (A) Ra, Rb = H; R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R2 = H; R3 = R5; i R5 = R6 = CONH(CH2)n-R9; ili (B) Ra, Rb = H; R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R3 = H; R2 = R5; i R5 = R6 = CONH(CH2)n-R9; ili pri čemu je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od: 4-(3,4-dihidroksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-(2-(3,4-dihidroksifenil)etilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-(3,5-dihidroksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-((4,5-dihidroksi-3-oksocikloheks-1-enil)metilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 2,5-dihidroksi-4-((3,4,5-trihidroksicikloheksil)metilaminokarbonil)benzoeve kiseline; 4-(2-karboksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-(3-karboksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-(4-karboksifenilmetilaminokarbonil) 2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-(3,4-dihidroksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-(2-(3,4-dihidroksifenil)etilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-(3,5-dihidroksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-((4,5-dihidroksi-3-oksocikloheks-1-enil)metilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 2,5-dihidroksi-3-((3,4,5-trihidroksicikloheksil)metilaminokarbonil)benzoeve kiseline; 3-(2-karboksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-(3-karboksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-(4-karboksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; (4-(3,4-dihidroksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; (4-(3,5-dihidroksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; (4-((4,5-dihidroksi-3-oksocikloheks-1-enil)metilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; (2,5-dihidroksi-4-((3,4,5-trihidroksicikloheksil)metilaminokarbonil)fenil)sirćetne kiseline; (4-(2-karboksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; (4-(3-karboksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; (4-(4-karboksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; (3-(3,4-dihidroksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; (3-(3,5-dihidroksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; (3-((4,5-dihidroksi-3-oksocikloheks-1-enil)metilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; (2,5-dihidroksi-3-((3,4,5-trihidroksicikloheksil)metilkarbonilamino)fenil)sirćetne kiseline; (3-(2-karboksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; (3-(3-karboksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; i (3-(4-karboksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline.
  11. 11. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što je jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od: N-(1,3,4,5-tetrahidroksicikloheksilkarbonil) 4-karboksi-2,5-dihidroksibenzamida; N-(1,3,4,5-tetrahidroksicikloheksilkarbonil) 3-karboksi-2,5-dihidroksibenzamida; N-(1,3,4,5-tetrahidroksicikloheksilkarbonil) 4-karboksimetil-2,5-dihidroksibenzamida; N-(1,3,4,5-tetrahidroksicikloheksilkarbonil) 3-karboksimetil-2,5-dihidroksibenzamida; 4-((4,5-dihidroksi-3-oksocikloheks-1-enil)metilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 2,5-dihidroksi-4-((3,4,5-trihidroksicikloheksil) metilaminokarbonil)benzoeve kiseline; 3-(3,5-dihidroksifenilmetilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-((4,5-dihidroksi-3-oksocikloheks-1-enil)metilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; (4-((4,5-dihidroksi-3-oksocikloheks-1-enil)metilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; (2,5-dihidroksi-4-((3,4,5-trihidroksicikloheksil)metilaminokarbonil)fenil)sirćetne kiseline; (3-((4,5-dihidroksi-3-oksocikloheks-1-enil)metilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; i (2,5-dihidroksi-3-((3,4,5-trihidroksicikloheksil)metilkarbonilamino)fenil)sirćetne kiseline.
  12. 12. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, pri čemu: Ra, Rb = H; R1 = SO3H; R2 = H; R3 = R5; i R5 = R6 = CONH(CH2)n-R9; ili pri čemu je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od: 2-((2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)metil)benzoeve kiseline; 3-((2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)metil)benzoeve kiseline; i 4-((2,5-dihidroksi-4-sulfobenzamido)metil)benzoeve kiseline.
  13. 13. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, pri čemu: (A) Ra, Rb = H; R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-Ci-cealkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R2 = H; R3 = R5; i R5 = R6 = CONHCH(COOR4)(CH2)kR9; ili (B) Ra, Rb = H; R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R3 = H; R2 = R5; i R5 = R6 = CONHCH(COOR4)(CH2)kR9; ili pri čemu je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od: 4-(1-karboksi-2-(3,4-dihidroksifenil)etilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-(karboksi(3,4-dihidroksifenil)metilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-(1-karboksi-2-(3,4-dihidroksifenil)etilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline 3-(karboksi(3,4-dihidroksifenil)metilaminokarbonil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; (4-(karboksi(3,4-dihidroksifenil)metilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline; i (3-(karboksi(3,4-dihidroksifenil)metilaminokarbonil)-2,5-dihidroksifenil)sirćetne kiseline.
  14. 14. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, pri čemu: (A) Ra, Rb = H; R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SOsH, (CH2)nSO3H, CONH-R10; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, Ci-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R2 = H; R3 = R5; i R5 = R7 = benzoheteroaril supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, 5-člani heterocikli koji sadrže N ili fluor; ili (B) Ra, Rb = H; R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, CONH-R10; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, Ci-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R3 = H; R2 = R5; i R5 = R7 = benzoheteroaril supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, 5-člani heterocikli koji sadrže N ili fluor; ili pri čemu je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od: 2-(4-karboksi-2,5-dihidroksifenil)-1H-benzo[d]imidazol-4-karboksilne kiseline; metil 2-(4-etoksikarbonil-2,5-dihidroksifenil)-1H-benzo[d]imidazol-4-karboksilata; 2-(2,5-dihidroksi-4-sulfofenil)-1H-benzo[d]imidazol-4-karboksilne kiseline; 2-(4-karboksi-2,5-dihidroksifenil)-1H-benzo[d]imidazol-5-karboksilne kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-4-sulfofenil)-1H-benzo[d]imidazol-5-karboksilne kiseline; 2-(3-karboksi-2,5-dihidroksifenil)-1H-benzo[d]imidazol-4-karboksilne kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-3-sulfofenil)-1H-benzo[d]imidazol-4-karboksilne kiseline; 2-(3-karboksi-2,5-dihidroksifenil)-1H-benzo[d]imidazol-5-karboksilne kiseline; 2-(2,5-dihidroksi-3-sulfofenil)-1H-benzo[d]imidazol-5-karboksilne kiseline; 2-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksifenil)-1H-benzo[d]imidazol-4-karboksilne kiseline; 2-(4-(karboksimetil)-2,5-dihidroksifenil)-1H-benzo[d]imidazol-5-karboksilne kiseline; 2-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksifenil)-1H-benzo[d]imidazol-4-karboksilne kiseline; i 2-(3-(karboksimetil)-2,5-dihidroksifenil)-1H-benzo[d]imidazol-5-karboksilne kiseline.
  15. 15. Jedinjenje formule (I), prema patentnom zahtevu 1:
    pri čemu: Ra, Rb = H, C1-4acil, arilC1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil; R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SOsH, (CH2)nSO3H, ili CONH-R10; jedan od R2 ili R3 je H, a drugi je R5; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R5 = R8 R8 = (CH2)mX(CH2)pR9; X = O, S, SO2, NH, NAc, ili N(CH2)qR9; R9 = aril, heteroaril, supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 5-člani heterocikli koji sadrže N, fluor, C=O, ili NHCO-R10; R10 = aril, heteroaril, supstituisan sa najmanje jednom ili više grupa izabranih od COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 5-člani heterocikli koji sadrže N, ili fluor; pri čemu je aril R9 i R10 aromatična grupa koja sadrži od 6 do 14 atoma ugljenika, izabrana između fenil, naftil ili bifenil grupe; i heteroaril R9 i R10 je aromatična grupa koja sadrži 1 do 14 atoma ugljenika i jedan ili više azota; i n, m, p i k su ceo broj nezavisno jednak 1-4.
  16. 16. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 14, pri čemu: (A) Ra, Rb = H, C1-4acil, arilC1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil; R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SOsH, (CH2)nSO3H, CONH-R10; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, Ci-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R2 = H; R3 = R5; i R5 = R8 = (CH2)mX(CH2)pR9; pri čemu X = O, S, SO2, NH, NAc ili N(CH2)qR9; ili (B) Ra, Rb = H, C1-4acil, arilC1-4alkil, C6-C10arilCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7alkilNHCO, fosfono, fosfonooksimetil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil ili C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil; R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, CONH-R10; R4 = H, C1-4alkil, arilC1-4alkil, morfolino-C1-C6alkil, pirolidino-C1-C6alkil, N-metilpiperazino-C1-C6alkil, C1-C6aciloksimetil, C1-C6aciloksi-1-etil, C1-C6alkoksikarboniloksimetil, C1-C6alkoksikarboniloksi-1-etil, ili (oksodioksolil)metil; o-metoksifenil (gvajakol estar); R3 = H; R2 = R5; i R5 = R8 = (CH2)mX(CH2)pR9; pri čemu X = O, S, SO2, NH, NAc ili N(CH2)qR9; ili pri čemu je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od: bis(4-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)amina; 4-((2,5-dihidroksi-4-sulfofenilmetilamino)metil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-((2,5-dihidroksi-3-sulfofenilmetilamino)metil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; bis(2,5-dihidroksi-4-sulfofenilmetil)amina; N,N-bis(4-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)acetamida; N-(2,5-dihidroksi-4-sulfofenilmetil) N-(4-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)acetamida; N-(2,5-dihidroksi-3-sulfofenilmetil) N-(4-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)acetamida; N,N-bis(2,5-dihidroksi-4-sulfofenilmetil)acetamida; 4-((2,5-dihidroksi-4-karboksifenil)metiltiometil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-((2,5-dihidroksi-4-sulfofenil)metiltiometil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-((2,5-dihidroksi-3-sulfofenil)metiltiometil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-((2,5-dihidroksi-4-sulfofenil)metiltiometil)-2,5-dihidroksibenzensulfonske kiseline; 4-((2,5-dihidroksi-4-karboksifenil)metilsulfonilmetil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-((2,5-dihidroksi-4-sulfofenil)metilsulfonilmetil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-((2,5-dihidroksi-3-sulfofenil)metilsulfonilmetil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-((2,5-dihidroksi-4-sulfofenil)metilsulfonilmetil)-2,5-dihidroksibenzensulfonske kiseline; 4-((2,5-dihidroksi-4-karboksifenil)metoksimetil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-((2,5-dihidroksi-4-sulfofenil)metoksimetil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-((2,5-dihidroksi-3-sulfofenil)metoksimetil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 4-((2,5-dihidroksi-4-sulfofenil)metoksimetil)-2,5-dihidroksibenzensulfonske kiseline; Tris (4-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)amina; Tris (4-etoksikarbonil-2,5-dihidroksifenilmetil)amina; Bis(3-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)amina; 3-((2,5-dihidroksi-3-sulfofenilmetilamino)metil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-((2,5-dihidroksi-4-sulfofenilmetilamino)metil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; Bis(2,5-dihidroksi-3-sulfofenilmetil)amina; N,N-bis(3-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)acetamida; N-(2,5-dihidroksi-3-sulfofenilmetil) N-(3-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)acetamida; N-(2,5-dihidroksi-4-sulfofenilmetil) N-(3-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)acetamida; N,N-bis(2,5-dihidroksi-3-sulfofenilmetil)acetamida; 3-((2,5-dihidroksi-3-karboksifenil)metiltiometil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-((2,5-dihidroksi-3-sulfofenil)metiltiometil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-((2,5-dihidroksi-4-sulfofenil)metiltiometil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-((2,5-dihidroksi-3-sulfofenil)metiltiometil)-2,5-dihidroksibenzensulfonske kiseline; 3-((2,5-dihidroksi-3-karboksifenil)metilsulfonilmetil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-((2,5-dihidroksi-3-sulfofenil)metilsulfonilmetil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-((2,5-dihidroksi-4-sulfofenil)metilsulfonilmetil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-((2,5-dihidroksi-3-sulfofenil)metilsulfonilmetil)-2,5-dihidroksibenzensulfonske kiseline; 3-((2,5-dihidroksi-3-karboksifenil)metoksimetil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-((2,5-dihidroksi-3-sulfofenil)metoksimetil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-((2,5-dihidroksi-4-sulfofenil)metoksimetil)-2,5-dihidroksibenzoeve kiseline; 3-((2,5-dihidroksi-3-sulfofenil)metoksimetil)-2,5-dihidroksibenzensulfonske kiseline; metil 3-((2,5-diacetoksi-3-metoksikarbonilfenil)metilsulfonilmetil)-2,5-diacetoksibenzoata; metil 3-((2,5-dihidroksi-3-metoksikarbonilfenil)metilsulfonilmetil)-2,5-hidroksibenzoata; 2-morfolinoetil 3-((2,5-dihidroksi-3-(2-morfolinoetoksikarbonil)fenil)metilsulfonilmetil)-2,5-hidroksibenzoata; tris (3-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)amina; i tris (3-etoksikarbonil-2,5-dihidroksifenilmetil)amina.
  17. 17. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2 koje ima formulu (I):
    pri čemu: Ra, Rb = H; R1 = COOR4; R2 = H; R3 = R8; R4 = H; R8 = (CH2)mX(CH2)pR9; R9 = fenil supstituisan sa COOR4 i sa OR4; X = N(CH2)qR9; i m, p i k = 1; i pri čemu je jedinjenje tris (4-karboksi-2,5-dihidroksifenilmetil)amin.
  18. 18. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2 koje ima formulu (I):
    pri čemu: Ra, Rb = H; R1 = COOR4; R2 = (CH2)mX(CH2)pR9 R3 = H; R9 = fenil supstituisan sa COOR4 i sa OR4; R4 = H; X = SOz; i m i p = 1; i jedinjenje je 3-((2,5-dihidroksi-3-karboksifenil)metilsulfonilmetil)-2,5-dihidroksibenzoeva kiselina.
  19. 19. Farmaceutski sastav koji sadrži terapeutski efikasnu količinu jedinjenja prema bilo kom od patentnih zahteva 1-18 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, ili stereoizomer, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
  20. 20. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-19 za upotrebu u postupku lečenja i/ili prevencije autoimunih, imunoloških, reumatoloških, vaskularnih poremećaja, oftalmoloških poremećaja, fibroznih poremećaja, metaboličkih i gastrointestinalnih poremećaja, neuroinflamatornih i neurodegenerativnih bolesti, neoplazme i poremećaja povezanih sa rakom, bolesti povezanih sa hormonima ili imunoloških poremećaja koji su rezultat virusnih i/ili bakterijskih infektivnih bolesti i/ili njihovih komplikacija.
  21. 21. Intermedijeri u sintezi jedinjenja prema patentnom zahtevu 2, pri čemu su intermedijeri izabrani između 2,5-bis(benziloksi)-4-(etoksikarbonil)benzoeve kiseline; 2,5-bis(benziloksi)izoftalaldehida; 2,5-bis(benziloksi)izoftalne kiseline; etil 2,5-bis(benziloksi)-4-(hidroksimetil)benzoata; ili etil 2,5-bis(benziloksi)-3-(hidroksimetil)benzoata.
RS20241332A 2020-03-11 2021-03-08 Derivati para-hidrohinona kao vegf, tnf i/ili il inhibitori za lečenje neuroinflamtornih bolesti RS66246B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20162558.9A EP3878837A1 (en) 2020-03-11 2020-03-11 2,5- or 2,6-disubstituted hydroquinone derivatives with at least one carboxy, sulfo or amido group useful as medicaments
EP21709062.0A EP4118069B1 (en) 2020-03-11 2021-03-08 Para-hydroquinone derivatives as vegf, tnf and/or il inhibitors for the treatment of neuroinflammatory diseases
PCT/EP2021/055791 WO2021180655A1 (en) 2020-03-11 2021-03-08 2,5- or 2,6-disubstituted hydroquinone derivatives with at least one carboxy, sulfo or amido group useful as medicaments

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66246B1 true RS66246B1 (sr) 2024-12-31

Family

ID=69804747

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241332A RS66246B1 (sr) 2020-03-11 2021-03-08 Derivati para-hidrohinona kao vegf, tnf i/ili il inhibitori za lečenje neuroinflamtornih bolesti

Country Status (31)

Country Link
US (1) US20230150951A1 (sr)
EP (2) EP3878837A1 (sr)
JP (1) JP7655933B2 (sr)
KR (1) KR20220152549A (sr)
CN (1) CN115279730B (sr)
AR (1) AR121537A1 (sr)
AU (1) AU2021236256A1 (sr)
BR (1) BR112022018121A2 (sr)
CA (1) CA3165209A1 (sr)
CL (1) CL2022001986A1 (sr)
CO (1) CO2022011590A2 (sr)
CR (1) CR20220488A (sr)
CU (1) CU24719B1 (sr)
DK (1) DK4118069T3 (sr)
ES (1) ES3002189T3 (sr)
FI (1) FI4118069T3 (sr)
HR (1) HRP20241596T1 (sr)
HU (1) HUE069498T2 (sr)
IL (1) IL295005B2 (sr)
LT (1) LT4118069T (sr)
MX (1) MX2022010813A (sr)
PE (1) PE20221594A1 (sr)
PH (1) PH12022552129A1 (sr)
PL (1) PL4118069T3 (sr)
PT (1) PT4118069T (sr)
RS (1) RS66246B1 (sr)
SI (1) SI4118069T1 (sr)
SM (1) SMT202400512T1 (sr)
TW (1) TWI869568B (sr)
WO (1) WO2021180655A1 (sr)
ZA (1) ZA202208406B (sr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023079466A2 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 Sulfagenix, Inc. Treatment of sequelae of coronavirus infections
CN118240250B (zh) * 2024-04-17 2024-11-22 扬州博恒新能源材料科技有限公司 一种耐高温耐老化复合集流体用基膜及其制备方法
CN119224170A (zh) * 2024-12-03 2024-12-31 天津医科大学总医院空港医院 一种快速检测人血浆中镇静催眠药的方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR6163M (sr) 1966-01-20 1968-07-08
JPS5126839B1 (sr) 1970-01-16 1976-08-09
AU6795374A (en) 1973-04-20 1975-10-16 Microbial Chem Res Found Inhibitors
JPS5126839A (ja) 1974-08-21 1976-03-05 Dainippon Pharmaceutical Co Benzuaniridojudotaino seizoho
US4208328A (en) * 1978-04-27 1980-06-17 General Electric Company Alkyl 3,5-dihydroxy-4-(2-benzothiazolyl)benzoates
JP2000508308A (ja) 1996-04-03 2000-07-04 ラボラトリオス デル ドクトール エステベ，エス．アー． 内皮機能の正常化、性的機能障害、糖尿病の血管合併症及び内皮起源の血管障害の治療用の医薬の製造のための２，５―ジヒドロキシベンゼンスルホン酸誘導体の使用
AU3910700A (en) * 1999-03-22 2000-10-09 Immugen Pharmaceuticals, Inc. Treatment of immune diseases
DZ3276A1 (fr) * 2000-03-31 2001-10-04 Pfizer Prod Inc Acides malonamiques et leurs derives, utiles comme ligands de recepteurs thyroidiens
US6479548B2 (en) * 2000-06-02 2002-11-12 Telik, Inc. Substituted stilbenes as glucose uptake enhancers
KR20060033817A (ko) * 2004-10-16 2006-04-20 주식회사 엘지생명과학 신규한 3-(2-아미노-6-피리디닐)-4-히드록시페닐 케톤유도체
US8101641B2 (en) * 2006-09-25 2012-01-24 Ptc Therapeutics, Inc. Hydroxylated 1,2,4-oxadiazole benzoic acid compounds and compositions thereof
CA2763717A1 (en) * 2009-06-10 2010-12-16 Cellzome Limited Pyrimidine derivatives as zap-70 inhibitors
US10640457B2 (en) * 2009-12-10 2020-05-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Histone acetyltransferase activators and uses thereof
WO2011146801A1 (en) 2010-05-20 2011-11-24 Synta Pharmaceuticals Corp. Formulation and dosing of hsp90 inhibitory compounds
FR3012070B1 (fr) * 2013-10-22 2015-10-30 Saint Gobain Vitrage pour systeme de visualisation
KR101765678B1 (ko) * 2013-12-20 2017-08-07 니폰 하이폭스 라보레토리즈 인코포레이티드 당뇨병성 신장병증상의 예방 또는 치료제
CN106986789B (zh) * 2016-01-20 2019-07-16 中国人民解放军军事医学科学院生物医学分析中心 对苯二酚类化合物及其制备方法与在抗肿瘤或免疫调节中的应用
WO2018160618A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Wisconsin Alumni Research Foundation High-and low-potential, water-soluble, robust quinones
CN109678915A (zh) * 2018-11-29 2019-04-26 蔡霈 卤代苯二酚葡萄糖苷的制备方法及其药用用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP4118069B1 (en) 2024-10-23
TW202200537A (zh) 2022-01-01
SMT202400512T1 (it) 2025-01-14
HRP20241596T1 (hr) 2025-01-31
CN115279730A (zh) 2022-11-01
ES3002189T3 (en) 2025-03-06
PH12022552129A1 (en) 2024-01-29
KR20220152549A (ko) 2022-11-16
PE20221594A1 (es) 2022-10-10
TWI869568B (zh) 2025-01-11
MX2022010813A (es) 2022-09-27
AR121537A1 (es) 2022-06-15
CL2022001986A1 (es) 2023-05-19
CU24719B1 (es) 2024-08-15
IL295005B2 (en) 2026-04-01
WO2021180655A1 (en) 2021-09-16
CU20220052A7 (es) 2023-04-10
HUE069498T2 (hu) 2025-03-28
EP4118069A1 (en) 2023-01-18
US20230150951A1 (en) 2023-05-18
BR112022018121A2 (pt) 2022-10-25
SI4118069T1 (sl) 2025-02-28
CN115279730B (zh) 2025-02-14
CO2022011590A2 (es) 2022-08-30
EP3878837A1 (en) 2021-09-15
PT4118069T (pt) 2024-12-20
ZA202208406B (en) 2023-12-20
CA3165209A1 (en) 2021-09-16
JP7655933B2 (ja) 2025-04-02
FI4118069T3 (fi) 2024-11-28
PL4118069T3 (pl) 2025-03-31
AU2021236256A1 (en) 2022-08-18
LT4118069T (lt) 2024-12-27
IL295005A (en) 2022-09-01
CR20220488A (es) 2023-01-12
IL295005B1 (en) 2025-12-01
JP2023517693A (ja) 2023-04-26
DK4118069T3 (da) 2024-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6797310B2 (ja) 老化細胞が介在する疾患を治療するためのペプチド系プロテアソーム阻害物質、およびがんを治療するためのペプチド系プロテアソーム阻害物質
JP2019514884A (ja) Ｅｚｈ２インヒビターおよびそれらの使用
EP4118069B1 (en) Para-hydroquinone derivatives as vegf, tnf and/or il inhibitors for the treatment of neuroinflammatory diseases
JP7457360B2 (ja) 線維症の処置
JP2012529432A (ja) アミノピロリジノン誘導体及びその使用
JP7082861B2 (ja) 新規な細胞透過性サクシネート化合物
US20220280484A1 (en) Novel use
CN111825611B (zh) 4(1h)-奎诺酮衍生物及其用途
TW201043226A (en) Salts of 3-pentylphenylacetic acid and pharmaceutical uses thereof
JP2019523260A (ja) キラルペプチド
CN112469411A (zh) 供在由衰老细胞引起或介导的状况的临床管理中使用和用于治疗癌症的作为Bcl家族拮抗剂的氨基膦酸酯
JP2016516745A (ja) 非造血細胞におけるｅｐｏ媒介ヘモグロビン発現とミトコンドリア新生を誘導するための組成物および方法
RU2827702C1 (ru) 2,5- или 2,6-дизамещенные производные гидрохинона, содержащие по крайней мере одну карбокси-, сульфо- или амидогруппу, применяемые в качестве лекарственных средств
CN111108083B (zh) 氨基亚甲基环己烷1,3-二酮化合物的用途
TW202120082A (zh) 鈣蛋白酶(calpain)抑制劑及其用於治療神經疾病之用途
CN110650955B (zh) 用于治疗癫痫、神经变性病症和其他cns病症的化合物
JP2025531823A (ja) Ｃｌｅｃ１６ａの機能不全または欠損に関連する症状を改善するための組成物および方法
KR20240069638A (ko) 리포-하이드록삼산 유도체 및 이의 약학적 용도
HK40129651A (zh) 恶二唑衍生物化合物及包含其的药物组合物