RS66264B1 - Genska terapija - Google Patents

Genska terapija

Info

Publication number
RS66264B1
RS66264B1 RS20241344A RSP20241344A RS66264B1 RS 66264 B1 RS66264 B1 RS 66264B1 RS 20241344 A RS20241344 A RS 20241344A RS P20241344 A RSP20241344 A RS P20241344A RS 66264 B1 RS66264 B1 RS 66264B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cell
cells
cancer
ifn
monocyte
Prior art date
Application number
RS20241344A
Other languages
English (en)
Inventor
Luigi Naldini
Giulia Escobar
Bernhard Rudolf Gentner
Adele Mucci
Original Assignee
Ospedale San Raffaele Srl
Fond Telethon Ets
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1706410.6A external-priority patent/GB201706410D0/en
Priority claimed from GBGB1801511.5A external-priority patent/GB201801511D0/en
Application filed by Ospedale San Raffaele Srl, Fond Telethon Ets filed Critical Ospedale San Raffaele Srl
Publication of RS66264B1 publication Critical patent/RS66264B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/405—Indole-alkanecarboxylic acids; Derivatives thereof, e.g. tryptophan, indomethacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4231—Cytokines
    • A61K40/4232—Tumor necrosis factors [TNF] or CD70
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/007—Vectors comprising a special translation-regulating system cell or tissue specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu genske terapije citokinima, naročito gensku terapiju interferonom (npr. interferon alfa ili gama), u kombinaciji sa T-ćelijom specifičnom za tumorski antigen (TAA) za lečenje ili prevenciju kancera.
OSNOVA PRONALASKA
[0002] Imunoterapija je odnedavno ponovo razmatrana kao lečenje za kancer, usled potencijala da indukuje dugotrajnu remisiju. Unapređeno razumevanje mehanizama koje ćelije kancera kooptiraju kako bi izbegle imunski odgovor dovelo je do razvoja novih terapeutskih agensa koji ciljaju imunske kontrolne tačke, čime se oslobađa potencijal imunskog sistema<1>. Kliničko testiranje ovih lekova je dovelo do nezabeleženih stopa dugotrajnih odgovora kod tumora za koje se prethodno smatralo da su neumitno smrtonosni, kao što je metastatski melanom<2,3>. Međutim, uprkos ovom napretku, veliki procenat pacijenata nema odgovor na ove terapije, bilo da je to posledica nemogućnosti da se generišu T-ćelije specifične za tumor ili postojanja imunosupresivnog tumorskog mikrookruženja, što dovodi do otpornosti na blokiranje klasičnih negativnih kontrolnih tačaka, CTLA4 ili PD1/PDL14.
[0003] Aktuelni napori su stoga usmereni na otkrivanje novih ciljnih imunskih kontrolnih tačaka i kombinovanih terapija pomoću kojih veći broj pacijenata sa tumorom može imati korist od imunoterapije. Usled toga, postoji obnovljeno interesovanje za upotrebu citokina, kao što su interferoni (IFN), kao agensa protiv kancera<5>. Pored citostatičkog i antiangiogenog dejstva na tumorske ćelije i krvne sudove, IFN, naročito interferoni tipa I, povećavaju sazrevanje i kapacitet dendritskih ćelija (DC) za unakrsno prajmovanje, proliferaciju i citotoksičnost T-ćelija, kapacitet ćelija prirodnih ubica (NK) za ubijanje i promenu klase imunoglobulina B-ćelija<6,7>. Prethodno smo objavili potvrdu principa da strategija ćelijske i genske terapije koja selektivno eksprimira transgen interferona-alfa (IFNα) u tumor infiltrirajućem potomstvu monocita/makrofaga transplantiranih, genetski konstruisanih hematopoetskih matičnih ćelija (HSC) može povećati antitumorski odgovor. Strategija isporučivanja IFNα usmerenog na tumor nije pokazala sistemsku toksičnost kod miševa i inhibirala je rast spontanih tumora dojke kao i metastaza na plućima i jetri ćelija kancera dojke, odnosno kolorektalnog kancera<8-10>. EP 2856876 A1 zastupa kombinovanje T-ćelija specifičnih za tumorske antigene sa različitim citokinima, uključujući interferone, GM-CSF ili eritropoetin.
[0004] Još jedan pristup imunoterapije je adaptivni transfer genetski konstruisanih T-ćelija koje eksprimiraju transgeni T-ćelijski receptor (TCR) ili himerni antigenski receptor (CAR) usmeren na tumorski antigen (TAA)<11,12>. Ovaj pristup je naročito pogodan za malignitete sa malim opterećenjem mutacijama koji ne izazivaju endogene T-ćelijske odgovore na TAA. CAR T-ćelije koje prepoznaju CD19 antigen su pokazale izuzetnu efikasnost kod relapsnih i refraktornih B-ćelijskih maligniteta. Međutim, ove studije su takođe pokazale da je terapeutsko dejstvo manje uočljivo kod nodalnih bolesti u slučaju bolesti koštane srži (BM) ili leukemije, što sugeriše da imunosupresivno mikrookruženje predstavlja značajnu prepreku za uspešnu imunoterapiju, naročito kod čvrstih masa tumora. Štaviše, kod brzorastućih tumora kao što je B-ćelijska akutna limfoblastna leukemija (B-ALL), gubitak antigena se javlja kod do 20% pacijenata koji su lečeni CD19 CAR T-ćelijama, što pokazuje ograničenje imunoterapije koja je usmerena na samo jedan antigen<11,13>. Međutim, nema puno raspoloživih podataka o tome da li leukemija indukuje TAA-specifične T-ćelijske odgovore kada nije u pitanju alogeni transplantat, i da li takav odgovor može da se iskoristi u terapeutske svrhe.
[0005] I dalje su neophodne poboljšane terapije za kancer. Predmetni pronalazak zadovoljava ovu potrebu tako što pokazuje da poboljšana efikasnost može da se ostvari kada se citokin, kao što je IFNα, koji se isporučuje genskom terapijom, koristi u kombinaciji sa drugim strategijama imunoterapije.
SAŽETAK PRONALASKA
[0006] Pronalazači su iznenađujuće otkrili da citokin kao što je interferon koji se isporučuje genskom terapijom može da pojača indukciju, konsolidaciju i održavanje antitumorskih odgovora i da deluje u sinergiji sa drugim strategijama imunoterapije, naročito lečenjem sa inhibitorima imunskih kontrolnih tačaka i lečenjem sa T-ćelijama specifičnim za tumorski antigen (TAA).
[0007] Prema jednom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđena je hematopoetska matična ćelija (HSC), hematopoetska progenitorna ćelija (HPC), mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit koji obuhvata vektor pri čemu taj vektor obuhvata najmanje jednu mir-130a i/ili mir-126 ciljnu sekvencu koja je operativno povezana sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citokin za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera kod pacijenta, pri čemu se HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit koriste u kombinaciji sa T-ćelijom specifičnom za tumorski antigen (TAA).
[0008] U nekim otelotvorenjima, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit se dalje koriste u kombinaciji sa inhibitorom imunske kontrolne tačke.
[0009] Prema još jednom aspektu predmetnog pronalaska obezbeđena je T-ćelija specifična za TAA za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera kod pacijenta, pri čemu je na pacijentu prethodno primenjen HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit koji obuhvata vektor pri čemu taj vektor obuhvata najmanje jednu mir-130a i/ili mir-126 ciljnu sekvencu koja je operativno povezana sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citokin. U nekim otelotvorenjima, T-ćelija specifična za TAA eksprimira CAR i/ili transgeni TCR.
[0010] Prema još jednom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit koji obuhvata vektor pri čemu taj vektor obuhvata najmanje jednu mir-130a i/ili mir-126 ciljnu sekvencu koja je operativno povezana sa nukleotidnom sekvencom koja kodira interferon tipa 1 za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera kod pacijenta, pri čemu se HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit koriste u kombinaciji sa T-ćelijom specifičnom za tumorski antigen (TAA).
[0011] U nekim otelotvorenjima, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit se dalje koriste u kombinaciji sa inhibitorom imunske kontrolne tačke.
[0012] Prema još jednom aspektu predmetnog pronalaska obezbeđena je T-ćelija specifična za TAA za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera kod pacijenta, pri čemu je na pacijentu prethodno primenjen HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit koji obuhvata vektor pri čemu taj vektor obuhvata najmanje jednu mir-130a i/ili mir-126 ciljnu sekvencu koja je operativno povezana sa nukleotidnom sekvencom koja kodira interferon tipa 1. U nekim otelotvorenjima, T-ćelija specifična za TAA eksprimira CAR i/ili transgeni TCR.
[0013] U jednom otelotvorenju, T-ćelija specifična za TAA eksprimira himerni antigenski receptor (CAR) i/ili transgeni T-ćelijski receptor (TCR). U jednom otelotvorenju, T-ćelija specifična za TAA eksprimira CAR. U jednom otelotvorenju, T-ćelija specifična za TAA eksprimira transgeni TCR.
[0014] Tako predmetni pronalazak može da koristi T-ćeliju konstruisanu da eksprimira CAR ili TCR specifičan za TAA.
[0015] U jednom otelotvorenju, citokin je interferon (IFN), IL-12 ili faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF).
[0016] U jednom otelotvorenju, citokin je interferon (IFN). Poželjno, citokin je interferon tipa I ili interferon tipa II.
[0017] U jednom poželjnom otelotvorenju, citokin je IFNα.
[0018] U drugom poželjnom otelotvorenju, citokin je interferon-gama (IFNγ).
[0019] U jednom otelotvorenju, interferon tipa 1 je interferon-alfa (IFNα) ili interferon-beta (IFNβ).
[0020] U jednom otelotvorenju, interferon tipa 1 je IFNα.
[0021] U jednom otelotvorenju, interferon tipa 1 je IFNβ.
[0022] U jednom otelotvorenju, interferon tipa II je interferon-gama (IFNγ).
[0023] U jednom otelotvorenju, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit iz predmetnog pronalaska su obezbeđeni za upotrebu u prevenciji ponovnog javljanja kancera kod pacijenta.
[0024] U jednom otelotvorenju, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit iz predmetnog pronalaska su obezbeđeni za upotrebu u prevenciji progresije kancera kod pacijenta.
[0025] U jednom otelotvorenju, TAA je izabran od jednog ili više od karcinoembrionalnog antigena (CEA), estrogenskog receptora, progesteronskog receptora, efrinB2, ROR1, mezotelina, c-Met, GD-2, i MAGE A3 TCR, 4-1BB, antigena adenokarcinoma, alfafetoproteina, BAFF, ćelije B-limfoma, C242 antigena, karbonske anhidraze 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (IgE receptor), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNT0888, CTLA-4, DR5, EpCAM, CD3, ekstra domena fibronektina-B, receptora folata 1, glikoproteina 75, GPNMB, HGF, kinaze humanog receptora faktora rasipanja, IGF-1 receptora, IGF-I, IgGI, L1-CAM, IL-13, IL-6, receptora faktora rasta nalik insulinu I, integrina α5β1, integrina αvβ3, MORAb-009, MS4A1, mucina CanAg, N-glikolil neuraminske kiseline, NPC-1C, PDGF-Rα, PDL192, fosfatidilserina, ćelija karcinoma prostate, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, tenascina C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, tumorskog antigena CTAA16.88, vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentina, 5T4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1 (CDw52), HLA-DR, anti-idiotipa, TAG-72, Ep-CAM, MUC1, folat vezujućeg proteina, A33, G250, membranskog antigena specifičnog za prostatu, (PSMA), antigena specifičnog za prostatu (PSA), feritina, gangliozida (npr. GD2, GD3, GM2), Le<y>, CA-125, CA19-9, receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), p185HER2, IL-2 receptora, de2-7 EGFR, proteina aktivacije fibroblasta (FAP), tenascina, metaloproteinaza, endosijalina, karbonske anhidraze, galektina 9, aldolaze A, elFγ4, tirozinaze, galektina 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, restina, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-katenina/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) i DAM-10 (MAGE-B1), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MC1R, miozina/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NY-ESO-1, P15, p190 minor bcrabl, Pml/RARa, PRAME, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, proteina 1, gp75, TRP-2, TRP-2/INT2 ili WT1.
[0026] U jednom otelotvorenju, TAA je CD19.
[0027] U jednom poželjnom otelotvorenju, T-ćelija specifična za TAA eksprimira CAR specifičan za CD19.
[0028] U jednom otelotvorenju, T-ćelija specifična za TAA je dobijena od ćelije koja je izolovana od pacijenta.
[0029] U jednom otelotvorenju, T-ćelija specifična za TAA je konstruisana da ometa najmanje jedan endogeni gen, poželjno pri čemu je najmanje jedan endogeni gen izabran od endogenog gena koji kodira α lanac TCR, β lanac TCR i glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC).
[0030] U jednom otelotvorenju, inhibitor imunske kontrolne tačke je antitelo, poželjno pri čemu je inhibitor imunske kontrolne tačke izabran iz grupe koja se sastoji od anti-CTLA4 antitela, anti-PD1 antitela, anti-PDL1 antitela, anti-PDL2 antitela i anti-LAG-3 antitela.
[0031] U jednom otelotvorenju, vektor obuhvata najmanje jednu mir-130a ciljnu sekvencu i najmanje jednu mir-126 ciljnu sekvencu, poželjno, vektor obuhvata dve mir-130a ciljne sekvence i dve mir-126 ciljne sekvence.
[0032] U jednom otelotvorenju, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit koji se koriste u predmetnom pronalasku obuhvataju najmanje jednu mir-130a ciljnu sekvencu i najmanje jednu mir-126 ciljnu sekvencu, poželjno, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit koji se koriste u predmetnom pronalasku obuhvataju dve mir-130a ciljne sekvence i dve mir-126 ciljne sekvence.
[0033] Vektor dalje može da obuhvata promoter specifičan za tkivo operativno povezan sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citokin, na primer interferon tipa 1. Poželjni promoter specifičan za tkivo je TEK (Tie2) promoter.
[0034] U jednom otelotvorenju, kancer je hematološki malignitet ili čvrsti tumor, poželjno pri čemu je hematološki malignitet izabran iz grupe koja se sastoji od akutne mijeloidne leukemije (AML), limfoblastne leukemije, akutne limfoblastne leukemije (ALL), mijelodisplastičnih sindroma (MDS), mijeloproliferativne neoplazme (MPN), primarne mijelofibroze, esencijalne trombocitemije, policitemije vera, atipične hronične mijeloidne leukemije, hronične mijeloidne leukemije (CML), limfoma, multiplog mijeloma, non-Hodžkinovog limfoma i Hodžkinovog limfoma; ili poželjno pri čemu je čvrsti tumor izabran iz grupe koja se sastoji od kancera pluća, kancera dojke, kancera jednjaka, kancera želuca, kancera kolona, holangiokarcinoma, kancera pankreasa, kancera jajnika, kancera glave i vrata, sinovijalnog sarkoma, angiosarkoma, osteosarkoma, tiroidnog kancera, kancera endometrijuma, neuroblastoma, rabdomiosarkoma, kancera jetre, melanoma, kancera prostate, kancera bubrega, sarkoma mekog tkiva, urotelijalnog kancera, bilijarnog kancera, glioblastoma, kancera grlića materice i kolorektalnog kancera.
[0035] U jednom otelotvorenju, kancer je metastaza primarnog tumora.
[0036] U jednom otelotvorenju, ćelija koja se koristi u predmetnom pronalasku je HSC koji obuhvata vektor ili polinukleotid, pri čemu taj vektor ili polinukleotid obuhvata najmanje jednu mir-130a i/ili mir-126 ciljnu sekvencu operativno povezanu sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citokin, na primer interferon tipa 1.
[0037] U jednom otelotvorenju, ćelija koja se koristi u predmetnom pronalasku je HPC koji obuhvata vektor ili polinukleotid, pri čemu taj vektor ili polinukleotid obuhvata najmanje jednu mir-130a i/ili mir-126 ciljnu sekvencu operativno povezanu sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citokin, na primer interferon tipa 1.
[0038] U jednom otelotvorenju, ćelija koja se koristi u predmetnom pronalasku je mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija koja obuhvata vektor ili polinukleotid, pri čemu taj vektor ili polinukleotid obuhvata najmanje jednu mir-130a i/ili mir-126 ciljnu sekvencu operativno povezanu sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citokin, na primer interferon tipa 1.
[0039] U jednom otelotvorenju, ćelija koja se koristi u predmetnom pronalasku je makrofag koji obuhvata vektor ili polinukleotid, pri čemu taj vektor ili polinukleotid obuhvata najmanje jednu mir-130a i/ili mir-126 ciljnu sekvencu operativno povezanu sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citokin, na primer interferon tipa 1.
[0040] U jednom otelotvorenju, ćelija koja se koristi u predmetnom pronalasku je monocit koji obuhvata vektor ili polinukleotid, pri čemu taj vektor ili polinukleotid obuhvata najmanje jednu mir-130a i/ili mir-126 ciljnu sekvencu operativno povezanu sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citokin, na primer interferon tipa 1.
[0041] U jednom otelotvorenju, IFN je IFN tipa II (poželjno IFNγ) ili IFN tipa I (poželjno IFNα ili IFNβ)
[0042] U jednom otelotvorenju, citokin je IFNγ. U jednom otelotvorenju, citokin je IFNα. U jednom otelotvorenju, citokin je IFNβ.
OPIS CRTEŽA
[0043]
Slika 1. Inhibicija rasta OVA-ALL kod IFN miševa putem indukcije OVA-specifičnih CD8+ T-ćelija.
a, Šematski prikaz lentivirusnih vektora (LV) koji su korišćeni za konstruisanje HSC i generisanje spontane B-ALL. b, Dizajn eksperimenta. c, Apsolutni brojevi (srednja vrednost ± SEM) matične ALL u perifernoj krvi (PB) tokom vremena za CTRL (n=10, lečeni izotipskim kontrolnim antitelom), IFN ((n=10, lečeni izotipskim kontrolnim antitelom), CTRL aCTLA4 (n=14) i IFN aCTLA4 (n=13) miševe. Svaka tačka predstavlja jednog miša. *p<0,05, **p<0,01, ****p<0,0001, neparametarski postupak baziran na rangu za longitudinalne podatke u faktorijalnim eksperimentima. d, e, f Apsolutni brojevi (srednja vrednost ± SEM) za OVA-ALL (konstruisano sa NGFR/OVA dvosmernim LV prikazanim na vrhu) u PB tokom vremena (d), i u BM i slezini (e, f; 14 dana nakon injekcije tumora) za IFN (n=15) i CTRL (n=15) miševe (prikazan je jedan od 9 eksperimenata). Svaka tačka predstavlja jednog miša. ****p<0,0001, neparametarski postupak baziran na rangu za longitudinalne podatke u faktorijalnim eksperimentima (d); *p<0,05, ** p<0,01, Man-Vitnijev test (e, f). g, CD8+ T-ćelije u slezini IFN miševa, 13 dana nakon injekcije tumora, ili od CTRL (naivni C57BI/6, n=1) miševa bez tumora koji su testirani pomoću IFNg-ELISPOT na EL4 ciljnu ćelijsku liniju transdukovanu sa NGFR-OVA ili NGFR-CD20 BdLV. Svaka tačka predstavlja jednog miša, srednja vrednost ± SEM. Malo opterećenje tumorom (n=5): 5,2 ± 4,9 (srednja vrednost ± SEM) % OVA-ALL; srednje opterećenje tumorom (n=1): 33% OVA-ALL; veliko opterećenje tumorom (n=6): 51 ± 4,9 %OVA-ALL. h, Procenat (srednja vrednost ± SEM) OVA-specifičnih T-ćelija u PB IFN (n=14-6) i CTRL (n=15-8) miševa. **p<0,01, Man-Vitnijev test obavljen 9 dana nakon injekcije OVA-ALL. Svaka tačka predstavlja jednog miša. T-ćelije transgenih OT-I miševa su korišćene kao pozitivna kontrola (nije prikazano). i, j, Apsolutni brojevi (srednja vrednost ± SEM) OVA-specifičnih T-ćelija u BM (i) i slezini (j), 9 dana nakon injekcije tumora, kod IFN (n= 23) i CTRL (n=26) miševa iz 3 zasebna eksperimenta. **p<0,01, ***p< 0,001, Man-Vitnijev test. Svaka tačka predstavlja jednog miša. k, CD8+ T-ćelije slezine IFN (n=7) i CTRL (n=8) miševa 9 dana nakon injekcije tumora ili kod miševa koji nemaju tumor koji su testirani kao što je opisano pod (g). Stimulacija konkanavalinom A (ConA) i T-ćelije OT-I miševa (nije prikazano) korišćeni su kao pozitivna kontrola. Svaka tačka predstavlja jednog miša. l, m, Procenat (l) i apsolutni brojevi (m) (srednja vrednost ± SEM) OVA-ALL u PB IFN (n=9), CD8-iscrpljenih IFN (n=7) i CTRL (n=9) miševa. **p<0,01, ****p<0,0001, neparametarski postupak baziran na rangu za longitudinalne podatke u faktorijalnim eksperimentima (l); *p<0,05, ****p<0,0001, Kruskal-Volisov test sa p-vrednošću koja je prilagođena pomoću Danovog testa (m).
Slika 2. Adaptivno transferisane OT-I T ćelije se ekspanduju i sadrže OVA-ALL kod IFN miševa.
a, b, Dizajn eksperimenta (a) i rast OVA-ALL tokom vremena (b, procenat u PB; srednja vrednost ± SEM) kod IFN (n=7) ili CTRL (n=7) miševa. c, Apsolutni brojevi (srednja vrednost ± SEM) OTI T ćelija u BM i slezini IFN (n= 7), CTRL (n=7) i miševa bez tumora (C57BI/6 bez tumora, n=3) 3 dana nakon adaptivnog transfera OT-I. *p<0,05, **p<0,01, Man-Vitnijev test. Svaka tačka predstavlja jednog miša. d, Procenat (srednja vrednost ± SEM) naivnih ćelija (CD44-CD62L+), centralnih memorijskih (CD44+CD62L+) i efektorskih memorijskih (CD44+CD62L-) ćelija u okviru OT-I T-ćelija u BM i slezini miševa iz (c) 3 dana nakon adaptivnog transfera. **p<0,01, neparametarski kombinovani test. e, f, Dizajn eksperimenta (e) i kriva preživljavanja (f) CTRL (n=12), IFN OT-I (n=9) i CTRL OT-I (n=10) miševa kojima je injektovan OVA-ALL. *p<0,05, ****p<0,0001 Mantel-Henšelov test, pvrednost prilagođena pomoću Bonferonijevog testa. g, Apsolutni brojevi (srednja vrednost ± SEM) adaptivno transferovanih OT-I T ćelija u PB tokom vremena kod CTRL OT-I i IFN OT-I miševa iz (f), i C57BI/6 miševa bez tumora (n=3). Miševi koji preživljavaju u dužem periodu su prikazani zelenom bojom. Svaka linija predstavlja jednog miša. h, Procenat (srednja vrednost ± SEM) ekspresije Lag3 na OT-I T-ćelijama u PB miševa iz (f, g). Svaka linija predstavlja jednog miša.
Slika 3. ISG/Th1 prajmovani genski potpis i povećani klasični monociti i M1 sklonost kod IFN miševa.
a, Dijagram raspršivanja koji pokazuje promene ekspresije panela imunskih gena kancera u BM i slezini IFN i CTRL miševa pre izazova sa OVA-ALL i nakon njega. Horizontalne isprekidane linije označavaju prag značajnosti (FDR<0,05). Vertikalne isprekidane linije označavaju gene sa 2-struko povećanom/smanjenom ekspresijom u odnosu na CTRL miševe. ISG su prikazani narandžastom bojom, geni za aktivaciju Th1 i T ćelija svetlo plavom bojom, geni koji su zajednički za IFN i Th1 odgovore zelenom bojom, geni za aktivaciju makrofaga i DC crvenom bojom, geni za aktivaciju NK ćelija ljubičastom bojom, geni za obradu antigena plavom bojom, geni povezani sa leukemijom sivom bojom. Gejtovani umeci su prikazani uvećano na desnoj strani. n=3 miša za svaki uzorak, osim za CTRL BM ALL, n=2. b, Analiza ekspresije putem RT-qPCR za naznačene Th1 gene (prosečna promena u odnosu na CTRL miševe kojima je injektovan OVA-ALL ± SEM) u CD4+ T-ćelijama slezine IFN (n=6) i CTRL (n=5) miševa kojima je injektovan OVA-ALL 9 dana nakon injekcije tumora i C57BI/6 miševa bez tumora. Svaka tačka predstavlja jednog miša. *p<0,05, Man-Vitnijev test. c, Procenat (srednja vrednost ± SEM) naznačenih mijeloidnih populacija u PB IFN (n=11) i CTRL (n=13) miševa pre i posle (12 dana) injekcije OVA-ALL. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001, Kruskal-Volisov test sa p-vrednošću koja je prilagođena pomoću Danovog testa. Statistička analiza je obavljena za svaku pojedinačnu populaciju mijeloidnih ćelija.
Slika 4. IFN ćelijska i genska terapija indukuje dugotrajne antikancerske odgovore i kada se kombinuje sa terapijom imunskim kontrolnim tačkama dalje poboljšava preživljavanje.
a, b, c, d Krive preživljavanja IFN i CTRL miševa kojima je injektovan OVA-ALL nakon prvog (a; n=11,13; *p<0,05, Mantel-Henšelov test) i sledećih tumorskih izazova sa naznačenim ALL ćelijama (b: n=3 dugoročno preživljavanje IFN miševa iz (a) u odnosu na 4 naivna miša; c: ista 3 miša koja su preživela iz (a, b) u odnosu na 4 naivna miša; d: 2 od 3 preživela miša iz (a, b, c) u odnosu na 4 naivna miša. e, Dizajn eksperimenta. f, g, Krive preživljavanja za (f) IFN (n=14), CTRL (n=14), IFN aCTLA4 (n=14) i CTRL aCTLA4 (n=15) miševe kojima je injektovan OVA-ALL, *p<0,05, ***p<0,001, Mantel-Henšelov test, p-vrednost prilagođena pomoću Bonferonijevog postupka; i (g) IFN aCTLA4 (n=10) i CTRL aCTLA4 (n=12) miševe, *p<0,05, Mantel-Henšelov test. h, PBMC preživelih miševa iz (f) (IFN n=3, CTRL n=1, IFN aCTLA4 n=4, CTRL aCTLA4 n=3) 51 dan miševa nakon injekcije tumora i miševa bez tumora (OT-I, n=1 i transplantirani CTRL miševi, n=2) koji su testirani pomoću IFNg-ELISPOT na EL4 ciljnu ćelijsku liniju koja je transdukovana sa NGFR-OVA ili NGFR-CD20 BdLV ili PGK-OFP ili PGK-tTA LV. Isprekidana linija predstavlja viši medijalni osnovni nivo koji se vidi u odnosu na EL4 NGFR ciljne ćelije. Svaka tačka predstavlja jednog miša koji je testiran na sva četiri TAA. i, Klonalnost i sličnost TCR-beta CDR repertoara preživelih miševa (svaka strelica predstavlja jednog miša) iz (f) pre injekcije OVA-ALL (početak strelice, T0) i 4 dana nakon drugog izazova tumorom (vrh strelice, T2). j, PBMC miševa iz (g) (IFN αCTLA-4 preživeli, popunjeni plavi simboli, n=3; CTRL αCTLA-4 preživeli, popunjeni crveni simboli, n=1; IFN αCTLA-4 bez odgovora, prazni plavi simboli, n=7; CTRL αCTLA-4, prazan crveni simbol, n=8 od 12 kontrola bez odgovora) testiranih pomoću IFNg-ELISPOT kao pod (h), 19 dana nakon injekcije tumora. Svaka tačka predstavlja jednog miša testiranog na sva četiri TAA. k, Kriva preživljavanja miševa iz (g) stratifikovana na osnovu njihove imunske reaktivnosti procenjene pomoću IFNg-ELISPOT testa koji je prikazan pod (j). Miševi prikazani crvenom bojom reaguju na 2 ili više antigena; miševi prikazani crnom bojom reaguju na 1 antigen ili ne reaguju ni na jedan antigen. Imajte u vidu da se reaktivnost na OVA i NGFR broji kao 1 pošto je njihova ekspresija koregulisana njihovim dvosmernim promoterom koji je prisutan u BdLV.
Slika 5. Konstruisani OVA-ALL pokazuje povećanu imunogenost u poređenju sa matičnim ALL.
a, Šematski prikaz dvosmernog LV (BdLV) koji se koristi za stvaranje OVA-ALL sa reprezentativnim dijagramom koji prikazuje ekspresiju NGFR na prečišćenim OVA-ALL. a, Strategija gejtovanja koja se koristi za identifikovanje ekspresije B-ALL (CD19+OFP+) i NGFR na ALL u PB miševa kojima je injektovan tumor. c, Gore: Procenat (srednja vrednost ± SEM) OVA-ALL u PB imunokompetentnih C57BI/6 (n=5) i imunodeficijentnih NSG (n=6) miševa i matičnog ALL u PB imunokompetentnih C57BI/6 (n=5) miševa. Dole: ekspresija markera NGFR na ALL prisutnom u PB imunokompetentnih C57BI/6 (n=5) i imunodeficijentnih NSG (n=6) miševa. Imajte u vidu da je ekspresija NGFR i OVA antigena koregulisana putem dvosmernog promotera koji je prisutan u BdLV. d, e, Procenat (srednja vrednost ± SEM) OVA-ALL i ekspresije NGFR markera na ćelijama leukemije koje su prisutne u BM imunokompetentnih C57BI/6 (n=6) (d) i imunodeficijentnih NSG (n=6) miševa (e) u trenutku žrtvovanja.
Slika 6. Inhibicija rasta OVA-ALL kod IFN miševa i indukcija T-ćelija specifičnih za OVA.
a, Strategija gejtovanja koja se koristi za identifikovanje CD8+ T-ćelija specifičnih za OVA. b, c, d, Procenat (b) i apsolutni brojevi (c, d) (srednja vrednost ± SEM) OVA-ALL u PB (b) i u BM i slezini (c, d) IFN (n=14-6) i CTRL (n=15-8) miševa, 9 dana nakon injekcije tumora. ***P<0,001, Man-Vitnijev test. Svaka tačka predstavlja jednog miša. e, Procenat OVA-ALL u PB IFN (n=9), IFN bez CD8 (n=7) i CTRL (n=9) miševa 9 dana nakon tumorskog izazova. Svaka tačka predstavlja jednog miša. *p<0,05, ***p<0,001, Kruskal-Volisov test sa p-vrednošću koja je prilagođena pomoću Danovog testa.
Slika 7. Strategija gejtovanja koja se koristi za procenu OVA-ALL apoptoze, ćelijskog ciklusa i brzine proliferacije.
a, b, Strategija gejtovanja (a) i analiza (b) (procenat, srednja vrednost ± SEM) ranih apoptotičnih (aneksin+7-AAD-), kasnih apoptotičnih (aneksin+7-ADD+), mrtvih/nekrotičnih (aneksin-7AAD+) i živih (aneksin-7-AAD-) OVA-ALL ćelija koje su prisutne u BM i slezini IFN (n=11) i CTRL (n=15) miševa, 9 dana nakon injekcije tumora. *p<0,05, Man-Vitnijev test. c, d, Strategija gejtovanja (c) i analiza (d: procenat, srednja vrednost ± SEM) raspodele OVAALL u G0 (Ki67-Hoechst<nisko>), G1 (Ki67+Hoechst<nisko>) i S-G2-M (Ki67+Hoechstvisoko) fazi ćelijskog ciklusa u BM i slezini IFN (n=11) i CTRL (n=15) miševa, 9 dana nakon injekcije tumora. e, f, Strategija gejtovanja (e) i analiza (f: procenat, srednja vrednost ± SEM) proliferativnih EdU+ ALL ćelija koje su prisutne u BM i slezini IFN (n=11) i CTRL (n=15) miševa, 9 dana nakon injekcije tumora. **p<0,01, Man-Vitnijev test.
Slika 8. Adaptivni transfer OT-I T ćelija kod CTRL, IFN miševa kojima je injektovan OVA-ALL i C57BI/6 miševa bez tumora.
a, Apsolutni brojevi (srednja vrednost ± SEM) OVA-ALL u PB CTRL (n=7) i IFN (n=7) miševa u naznačenom terminu nakon adaptivnog transfera OT-I. Svaka tačka predstavlja jednog miša. b, Ekspresija Lag3 na OT-I T ćelijama u BM i slezini IFN (n= 7), CTRL (n=7) i miševa bez tumora (C57BI/6 bez tumora, n=3), 3 dana nakon adaptivnog transfera OT-I T-ćelija. Svaka tačka predstavlja jednog miša. c, Strategija gejtovanja koja se koristi za identifikaciju adaptivno transferisanih OT-I T ćelija (CD45.2+) i ekspresije Lag3 na OT-I T ćelijama koje su prisutne u BM i slezini miševa iz (a, b). OVA-ALL ćelije su prvo izdvojene gejtovanjem na OFP-CD8+ T-ćelijama. CD45.1 i CD45.2 markeri se koriste za pravljenje razlike između CD8+ T-ćelija otpornih na zračenje dobijenih od primaoca (CD45.1+), CD8+ T-ćelija dobijenih od donora (CD45.1.2+) i adaptivno transferisanih OT-I T ćelija (CD45.2+). Kod miševa bez tumora, adaptivno transferisane OT-I T-ćelije se definišu kao CD8+ T-ćelije i razlikuju se od CD8+ T-ćelija dobijenih od primaoca (CD45.1+) putem gejtovanja na CD45.2+ CD8+ T-ćelijama. d, Strategija gejtovanja koja se koristi za identifikovanje naivnih (CD62L+CD44-), centralnih memorijskih (CD62L+CD44+) i efektorskih memorijskih (CD62L-CD44+) adaptivno transferisanih OT-I T-ćelija. OT-I T-ćelije su identifikovane kao što je opisano pod (c, OVA-ALL su prvo izdvojeni putem gejtovanja na CD19-CD8+ T-ćelijama). e, f, Apsolutni brojevi OVA-ALL (e) (srednja vrednost ± SEM) i ekspresije NGFR markera (f) na ALL u BM i slezini miševa prikazanih pod (a, b) 3 dana nakon adaptivnog transfera OT-I T-ćelija. Svaka tačka predstavlja jednog miša. **p<0,01, ***p<0,001, Man-Vitnijev test (e).
Dopunska slika 6. Analiza genske ekspresije prototipskih Th2 i Treg gena u prečišćenim CD4+ T-ćelijama slezine.
a, Analiza ekspresije putem RT-qPCR za naznačene Th2 i Treg gene (prosečna promena u odnosu na CTRL miševe kojima je injektovan OVA-ALL ± SEM) u CD4+ T-ćelijama slezine koje su prečišćene od IFN (n=6) i CTRL (n=5) miševa kojima je injektovan OVA-ALL 9 dana nakon injekcije tumora i naivnog C57BI/6 miša bez tumora. Svaka tačka predstavlja jednog miša.
Slika 9. Adaptivno transferisane OT-I T-ćelije se ekspanduju i sadrže OVA-ALL kod IFN miševa.
a, b, c, d, Procenat (srednja vrednost ± SEM) ALL ćelija i ekspresije NGFR markera na ALL ćelijama u PB (a, b) i BM (c, d) IFN OT-I (n=9, a, c) i CTRL OT-I (n=10, b, d) miševa. Miševi koji preživljavaju u dužem periodu su prikazani zelenom bojom. Imajte u vidu da ekspresija NGFR nije prikazana za preživele miševe kod kojih je leukemija eliminisana. Svaki pojedinačni miš je predstavljen jednom tačkom (b, d) ili linijom (a, b). e, f, Procenat (srednja vrednost ± SEM) naivnih (CD62L+CD44-), centralnih memorijskih (CD62L+CD44+) i efektorskih memorijskih (CD62LCD44+) OT-I T-ćelija u BM, slezini i limfnim čvorovima eutanaziranih miševa sa tumorom iz (a, b, c, d, CTRL OT-I, n=8; IFN OT-I, n=3). f, Procenat (srednja vrednost ± SEM) ekspresije PD1 na OT-I T-ćelijama koje su prisutne u BM, slezini i limfnim čvorovima miševa koji su prikazani pod (e). Svaka tačka predstavlja jednog miša.
Slika 11. Analiza protočnom citometrijom mijeloidnih ćelija u PB i slezini IFN i CTRL miševa sa tumorom i bez injekcije tumora.
a, b, c, Strategija gejtovanja (a) i analiza (b, apsolutni brojevi, srednja vrednost ± SEM) populacija mijeloidnih ćelija u slezini IFN i CTRL miševa bez tumora i sa injekcijom OVA-ALL (CTRL: n=3, IFN n=2, CTRL ALL: n=9, IFN ALL: n=7), 10 dana nakon injekcije tumora. Makrofagi (MF) identifikovani su kao CD19-CD11c-Ly6G-F4/80+ ćelije i dalje su razdvojeni na MHC-II+ MF i MHC-II- Mf koristeći lAb (MHC-II) marker. Izdvojili smo CD19-F4/80-CD11c+MHCII- mijeloidne ćelije iz CD19-F4/80-CD11c+MHCII+ dendritskih ćelija. Definisali smo granulocite kao CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6C+Ly6G+, klasične monocite kao CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6ClowLy6G- a neklasične monocite kao CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6C-Ly6G-. **p<0,01, Kruskal-Volisov test sa p-vrednošću koja je prilagođena pomoću Danovog testa. Statistička analiza je obavljena za svaku pojedinačnu mijeloidnu populaciju. d, Procenat MHC-II makrofaga prisutnih u IFN i CTRL miševima bez tumora ili sa tumorom iz (c). **p<0,01, Kruskal-Volisov test sa p-vrednošću koja je prilagođena pomoću Danovog testa.
Slika 12. Analiza protočnom citometrijom mijeloidnih ćelija u BM i T regulatornih ćelija u BM i slezini IFN i CTRL miševa sa tumorom i bez injekcije tumora.
a, b, c, Strategija gejtovanja i analiza (apsolutni brojevi, srednja vrednost ± SEM) populacija mijeloidnih ćelija u BM IFN i CTRL miševa bez tumora i sa injekcijom OVA-ALL (CTRL: n=3, IFN: n=2, CTRL ALL: n=9, IFN ALL: n=7), 10 dana nakon injekcije tumora. Svaka tačka predstavlja jednog miša. Makrofagi (MF) su identifikovani kao CD19-CD11c-Ly6G-F4/80+ ćelije, dendritske ćelije (DC) kao CD19-F4/80-CD11c+MHCII+, granulociti kao CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6C+Ly6G+, klasični monociti kao CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6ClowLy6G- a neklasični monociti kao CD19-F4/80-CD11c-CD11b+Ly6CLy6G-.*p<0,05, **p<0,01, Kruskal-Volisov test sa p-vrednošću koja je prilagođena pomoću Danovog testa. Statistička analiza je obavljena za svaku pojedinačnu mijeloidnu populaciju. c, d, Strategija gejtovanja (c) i analiza (d, apsolutni brojevi, srednja vrednost ± SEM) T regulatornih ćelija u BM i slezini IFN i CTRL miševa bez tumora i sa injekcijom OVA-ALL iz (b). Svaka tačka predstavlja jednog miša. T regulatorne ćelije su definisane kao CD3+CD4+CD25+FoxP3+.
**p<0,01, Kruskal-Volisov test sa p-vrednošću koja je prilagođena pomoću Danovog testa. Statistička analiza je obavljena za svako pojedinačno tkivo.
Slika 13. Analiza protočnom citometrijom NK i NKT ćelija u slezini IFN i CTRL miševa sa tumorom i bez injekcije tumora.
a, b, Strategija gejtovanja (a) i analiza (b, apsolutni brojevi, srednja vrednost ± SEM) NK i NKT ćelija prisutnih u slezini i BM IFN i CTRL miševa bez tumora ili sa injekcijom OVA-ALL (CTRL: n=3, IFN: n=2, CTRL ALL: n=9, IFN ALL: n=7), 10 dana nakon injekcije tumora. Svaka tačka predstavlja jednog miša. NK ćelije su identifikovane kao CD19-CD3-NK1.1+ a NKT ćelije kao CD19-CD3+NK1.1+.
Pomoću CD11b i CD27 markera dalje smo napravili razliku između najnezrelijih NK ćelija (CD11b-CD27+), zrelih i najviše citotoksičnih i najvećih proizvođača citokina (CD11b+CD27+) i zrelih i manje citotoksičnih i manjih proizvođača citokina (CD11b+CD27-). **p<0,01, ***p<0,001, Kruskal-Volisov test sa p-vrednošću koja je prilagođena pomoću Danovog testa. Statistička analiza je obavljena za svaku pojedinačnu populaciju. c, Procenat (srednja vrednost ± SEM) naznačenih potpopulacija NK ćelija u slezini (gore) i BM (dole) IFN i CTRL miševa bez tumora ili sa tumorom iz (b). Svaka tačka predstavlja jednog miša. d, e, Procenat (srednja vrednost ± SEM) ekspresije NKG2D i NKp46 na CD11b+CD27+ (d) i CD11b+CD27-(d, e) NK ćelijama koje su prisutne u slezini (d) i BM (e) miševa iz (b). Svaka tačka predstavlja jednog miša. *p<0,05, **p>0,01, Kruskal-Volisov test sa p-vrednošću koja je prilagođena pomoću Danovog testa. Statistička analiza je obavljena za svaku pojedinačnu populaciju.
Slika 14. Imunski pritisak koji vrše T-ćelije specifične za OVA dovodi do imunske selekcije OVA-negativnih ALL ćelija kod miševa.
a, Procenat (srednja vrednost ± SEM) OVA-ALL u PB svakog pojedinačnog IFN (n=11) i CTRL (n=13) miša. Svaka linija predstavlja jednog miša. b, Ekspresija NGFR na ALL koji infiltrira BM (ili ALL koji cirkuliše u PB za miševe za koje BM analiza nije dostupna) i apsolutni brojevi (srednja vrednost ± SEM) T-ćelija specifičnih za OVA (svaka linija predstavlja jednog miša) u PB IFN (n=8) i CTRL (n=13) miševa koji pokazuju brz ili usporen tok bolesti (brz tok bolesti: CTRL: 13-29 dana (raspon), 20,4 ± 1,3 (srednja vrednost ± SEM), n=11; IFN:16-27 dana, 20,8 ± 1,8, n=5; usporen tok bolesti: CTRL: 34-44 dana, 39 ± 5, n=2; IFN: 34-100 dana, 56 ± 22, n=3). c, apsolutni brojevi (srednja vrednost ± SEM) T-ćelija specifičnih za OVA u PB IFN (n=3) miševa sa dugoročnim preživljavanjem. Svaka linija predstavlja jednog miša. d, Procenat (srednja vrednost ± SEM) T-ćelija specifičnih za OVA kod preživelih IFN miševa (n=3) u odnosu na 4 naivna miša sa slike 4b, 14 dana nakon drugog tumorskog izazova sa OVA-ALL. Svaka tačka predstavlja jednog miša. e, Reprezentativni dijagram koji prikazuje OVA-ALL i matične ALL ćelije pomešane u odnosu 1 prema 1 pre ubrizgavanja u miševe.
Slika 15. Kinetika rasta leukemije kod pojedinačnog miša.
a, b, Procenat (srednja vrednost ± SEM) OVA-ALL u PB svakog pojedinačnog (a) IFN (n=14), CTRL (n=14), IFN aCTLA4 (n=14) i CTRL aCTLA4 (n=15) miša i (b) IFN aCTLA4 (n=10) i CTRL aCTLA4 (n=12) miša. Svaka linija predstavlja jednog miša.
Slika 16. Imunska selekcija OVA-negativnih ALL ćelija je povećana kod IFN kao i CTRL miševa tretiranih sa CTLA4.
a, Ekspresija NGFR na ALL koji infiltrira BM (ili ALL koji cirkuliše u PB za miševe za koje BM analiza nije dostupna) i apsolutni brojevi (srednja vrednost ± SEM) T-ćelija specifičnih za OVA (svaka linija predstavlja jednog miša) u PB IFN (n=14), CTRL (n=14), IFN+aCTLA4 (n=14) i CTRL+aCTLA4 (n=15) miševa koji pokazuju brz, usporen tok bolesti ili dugoročno preživljavanje. Brz tok bolesti: CTRL: 14-21 dana (raspon), 15,66 ± 0,8 (srednja vrednost ± SEM), n=12; IFN: 17-25 dana, 21 ± 1,3, n=8; CTRL CTLA4: 14-21 dana, 19 ± 1,2, n=6; IFN CTLA4: 25 dana, 25 ± 0, n=2; usporen tok bolesti: CTRL: 36 dana, n=1; IFN: 30-36 dana, 34 ± 2, n=3; CTRL CTLA4, 30-64 dana, 42 ± 7,4, n=5; IFN CTLA4: 25-64 dana, 44 ± 4,9, n=7). b, Procenat T-ćelija specifičnih za OVA u okviru CD8+ T-ćelija u PB miševa iz (a). *p<0,05, **p<0,01, ****p<0,0001, neparametarski postupak baziran na rangu za longitudinalne podatke u faktorijalnim eksperimentima. c, Klonalnost i sličnost TCR-beta CDR repertoara miševa koji dugoročno preživljavaju bez tumora (svaka strelica predstavlja jednog miša) sa slike 4f pre injekcije OVA-ALL (početak strelice, T0) i 30 dana nakon izazova sa OVA-ALL (vrh strelice, T1).
Slika 17. IFN genska terapija inhibira rast ALL putem aktivacije adaptivnog imuniteta.
Apsolutni brojevi (srednja vrednost ± SEM) matičnih ALL u perifernoj krvi (PB) tokom vremena za CTRL (n=10, lečeni izotipskim kontrolnim antitelom), IFN (n=10, lečeni izotipskim kontrolnim antitelom), CTRL αCTLA4 (n=14) i IFN αCTLA4 (n=13) miševe. Svaka tačka predstavlja jednog miša. *p<0,05, **p<0,01, ****p<0,0001, neparametarski postupak baziran na rangu za longitudinalne podatke u faktorijalnim eksperimentima.
Slika 18. IFN genska terapija predstavlja program stimulacije imunskog sistema kod TME.
Procenat DC koje prezentuju imuno-dominantni OVA (SINFEKL) peptid na molekulima MHC-I u BM miševa iz CTRL ALL (n=7) i IFN ALL (n=8). *p<0,05 Man-Vitnijev test.
Slika 19. Transkripciono reprogramiranje TME leukemije putem IFN genske terapije.
a,b, Dijagrami raspršivanja (levi paneli) koji pokazuju diferencijalno eksprimirane gene (aps. log2FC>1,5, FDR<0,05) koji su ushodno regulisani (zelena boja) ili nishodno regulisani (narandžasta boja) u makrofagima slezine miševa sa tumorom (ALL) u poređenju sa kontrolnim (CTRL) miševima (a) ili ALL miševa koji su lečeni (IFN+ALL) ili nisu (ALL) IFN genskom terapijom (b). Stubasti dijagrami (desni panel) pokazuju GO termine koji su obogaćeni kod ushodno regulisanih (zelena boja) ili nishodno regulisanih (narandžasta boja) gena iz naznačenih poređenja. c,d, Snimci izabranih RNK-Seq deregulisanih gena kod makrofaga ALL miševa (c) ili ISG indukovanih kod IFN+ALL miševa (d). e, f, tSNE dijagrami koji inkorporiraju podatke scRNK-Seq od 10.821 CD11b<+>ćelija koje su sortirane iz slezine CTRL ili ALL miševa, koji jesu ili nisu lečeni IFN genskom terapijom. Transkripciono definisani klasteri i povezani tipovi ćelija (e) naznačeni su brojevima i bojama u legendi. Podaci za jednoćelijske RNK-Seq u ćelijama iz klastera 1 (neklasični monociti), obojeni na osnovu uslova eksperimenta (f). g, GO termini obogaćeni u 100 najboljih gena (rangirani pomoću log2FC) koji su ushodno regulisani (zelena boja) ili nishodno regulisani (narandžasta boja) u podacima scRNK-Seq iz klastera 1 (neklasični monociti) u naznačenim poređenjima. h, Prosečna ekspresija (log transformisane vrednosti TPM, normalizovane za broj ćelija) u neklasičnim monocitima izabranih gena za naznačene uslove. i, Analiza sa minimalno razapinjućim stablom (MST) podataka scRNK-Seq iz klastera 1 (neklasični monociti), nakon pravljenja potklastera. Svaki kružni dijagram predstavlja potklaster i prikazuje njegovu veličinu (broj ćelija) i sastav (eksperimentalni uslov). Kružni dijagrami obeleženi zvezdicom predstavljaju manje potklastere sa raspršenim sastavom.
Slika 20. IFN genska terapija povećava aktivaciju adaptivno transferisanih T-ćelija transdukovanih sa CAR19 i povećava preživljavanje.
a, b, Dizajn eksperimenta (a) i rast ALL tokom vremena (b, apsolutni brojevi u PB; srednja vrednost ± SEM) u CTRL CTRLT (n=5), IFN CTRLT (n=5), CTRL CART19 (n=7), IFN CART19 (n=7). ****p<0,0001, neparametarski postupak baziran na rangu za longitudinalne podatke u faktorijalnim eksperimentima. c, Procenat (srednja vrednost ± SEM) ekspresije Lag3 na CD8+NGFR+ CART19 ćelijama u PB miševa iz (b). Miševi koji preživljavaju u dužem periodu su prikazani zelenom bojom. Svaka linija predstavlja jednog miša. d, e, Dizajn eksperimenta (d) i rast ALL tokom vremena (e, apsolutni brojevi u PB; srednja vrednost ± SEM) kod CTRL CTRLT (n=7), IFN CTRLT (n=6), CTRL CART19 (n=7), IFN CART19 (n=6), CTRL iCART19 (n=7), IFN iCART19 (n=6), IFN CTRLT kasnih (n=6, kasno intervencijsko ispitivanje), IFN iCART19 kasnih (n=6, kasno intervencijsko ispitivanje). ****p<0,0001, neparametarski postupak baziran na rangu za longitudinalne podatke u faktorijalnim eksperimentima. Statistička analiza je obavljena za izabrane grupe (vidite dopunsku onlajn tabelu 9 i 10) f, Procenat tokom vremena (srednja vrednost ± SEM) ekspresije Lag3 na CD8+NGFR+ CART19 ćelijama u PB miševa iz (b). CTRL CART19 i CTRL iCART19 miševi su zajedno prikazani na dijagramu. Miševi koji preživljavaju u dužem periodu su prikazani zelenom bojom. Svaka linija predstavlja jednog miša. g, Kriva preživljavanja miševa koji su lečeni sa CART19 ili iCART19 ćelijama iz (b i e). CTRL miševi lečeni sa CART19 i iCART19 sa slike 20. b, e su predstavljeni zajedno (CTRL i/CART19, n=21), IFN CART19 (n=13), IFN iCART19 (n=6), IFN iCART19 kasni (n=6). ****p≤0,0001, Mantel-Henšelov test, p-vrednost prilagođena pomoću Bonferonijevog postupka.
Slika 21. Konstruisane OVA-ALL pokazuju povećanu imunogenost u poređenju sa matičnim ALL.
Kriva preživljavanja za ALL-injektovane CTRL (n=10, lečeni izotipskim kontrolnim antitelom), IFN (n=10, lečeni izotipskim kontrolnim antitelom), CTRL αCTLA4 (n=14) i IFN αCTLA4 (n=13) miševe. *p<0,01 Mantel-Henšelov test.
Slika 22. Analize zbirnih RNK-Seq u makrofagima jetre.
a, Kutijasti dijagrami koji prikazuju nivoe ekspresije u naznačenim uslovima gena koji su ushodno regulisani (n=213) ili nishodno regulisani (n=258) u makrofagima ALL miševa koji su lečeni IFN genskom terapijom (IFN+ALL) u poređenju sa ALL kontrolama. Brojevi predstavljaju rezultate Vilkoksonov testa ranga sa znakom u naznačenim poređenjima. b, Toplotna karta korelacije između skupova podataka za RNK-Seq u makrofagima iz naznačenih uslova. Brojevi označavaju izračunate koeficijente determinacije (R<2>). Uzorci su poređani na osnovu hijerarhijskog klasterovanja bez nadzora.
Slika 23. Određivanje vrste ćelija u podacima scRNK-Seq dobijenim od CD11b<+>ćelija slezine.
a, tSNE dijagrami koji pokazuju nivoe ekspresije pojedinačne ćelije za naznačene genske potpise (GS). Neklasični monociti: Cd300e, 1700011I03Rik, Tspan9, Dmpk, Fxyd2; klasični monociti: Ly6c2, Tarm, Tfec, Psrc1, Mmp8; neutrofili: II1f9, Pglyrp4, Nlrp12, Mrgpra2b, Mmp8, Ltf, Amer2, Stfa2I1, Gm5483; dendritske ćelije: Adam23, Procr, Mab21I3, Sucnr1, Fndc5, Rnf186, Flt3, Cd207, Adam11, Apol7c, Htr7; makrofagi: Vcam1, Mertk, Actn1, Fcna, Crip2, Spic, Kcna2, Gfra2, Stab2, Jup; NK ćelije: Khdc1c, Khdc1b, Phactr3, Col8a2, Klra4, Adamts14, Gzma, Cma1, Gzmb, Clip4; T-ćelije: Cd3g, Cd3e, Bcl11b, Actn2, Camk4; B-ćelije: Pax5, Cd79a, Cd19, Chst3, Scn4a, Cacna1i, Ly6d, Klhl14, Mzb1. Skala boja prikazuje prosečnu ekspresiju (log transformisani TPM) za gene u okviru svakog potpisa. b, Toplotna karta prikazuje ekspresiju (skalirane log transformisane vrednosti TPM) 20 diskriminativnih gena za svaki klaster. Izabrani reprezentativni geni za svaki klaster prikazani su na desnoj strani. Za svaki klaster je prikazano do 200 pojedinačnih ćelija.
Slika 24. Promene indukovane leukemijom i sa IFN u podacima scRNK-Seq o CD11b<+>ćelijama slezine.
tSNE dijagrami prikazuju scRNK-Seq podatke iz klastera 2-11, obojene na osnovu uslova eksperimenta.
Slika 25. Dalje grupisanje podataka scRNK-Seq dobijenih od neklasičnih monocita i analiza ekspresije gena na CD4 T-ćelijama.
a, Dijagrami protočne citometrije koji prikazuju OVA-ALL ćelije (gore) i OVA-specifične CD8 T-ćelije (dole) u slezini 3 reprezentativna miša sa injekcijom ALL, CTRL (CTRL ALL), IFN bez odgovora (IFN ALL NR) i IFN sa odgovorom (IFN ALL R). CD11b+ ćelije ovih miševa su analizirane putem scRNK-seq. b, tSNE dijagrami koji prikazuju potklastere ćelija u okviru populacije neklasičnih monocita, boje na bazi klasterovanja (gornji dijagram) ili eksperimentalnih uslova (donji dijagram). Zaokruženi potklasteri predstavljaju manje potklastere sa dispergovanom kompozicijom i odgovaraju potklasterima koji su obeleženi zvezdicom na Slici 19i.
Slika 26. IFN genska terapija povećava aktivaciju CART19 ćelija.
a, Šematski prikaz dvosmernog LV (BdLV) koji se koristi za transdukciju mišjih T-ćelija i procenat ekspresije NGFR u netransdukovanim (UT) i transdukovanim (CART19) CD4 i CD8 T-ćelijama pre infuzije miševima sa slike 20b. b, Procenat naivnih (CD62L+CD44+), centralnih memorijskih (CD62L+CD44+) i efektorskih memorijskih (CD62L-CD44+) UT ili CART19 T ćelija pre infuzije miševima sa slike 20b. c, Reprezentativni dijagram protočne citofluorimetrije IFN CART19 preživelih miševa sa slike 20b koji pokazuju aplaziju B ćelija u PB. d, Procenat tokom vremena (srednja vrednost ± SEM) ekspresije PD1 na CD8+NGFR+ CART19 ćelijama CTRL CART19 (n=7) i IFN CART19 (n=7) miševa. Miševi koji preživljavaju u dužem periodu su prikazani zelenom bojom. Svaka linija predstavlja jednog miša. e, f, Nivo (srednji intenzitet fluorescencije, MFI) ekspresije NGFR tokom vremena na CD4+ (e) i CD8+ (f) CART19 ćelijama miševa pod (d). Miševi koji preživljavaju u dužem periodu su prikazani zelenom bojom. Svaka linija predstavlja jednog miša.
Slika 27. IFN genska terapija povećava aktivaciju iCART19 ćelija.
a, Procenat ekspresije NGFR u netransdukovanim (UT) i transdukovanim (CART19) CD4 i CD8 T-ćelijama pre infuzije miševima sa slike 20e. b, Procenat naivnih (CD62L+CD44+), centralnih memorijskih (CD62L+CD44+) i efektorskih memorijskih (CD62L-CD44+) UT ili CART19 T ćelija pre infuzije miševima sa slike 20e. c, Apsolutni brojevi (srednja vrednost ± SEM) CD4 (gore) i CD8 (dole) NGFR+ CART19 ćelija kod CTRL CART19 (n=7), IFN CART19 (n=6), CTRL iCART19 (n=7), IFN iCART19 (n=6) i IFN iCART19 kasnih (n=6,ispitivanje sa kasnom intervencijom) miševa. Miševi koji preživljavaju u dužem periodu su prikazani zelenom bojom. Svaka linija predstavlja jednog miša. d, Nivo (srednji intenzitet fluorescencije, MFI) ekspresije NGFR tokom vremena na CD4+ (gore) i CD8+ (dole) CART19 ćelijama miševa pod (c). Miševi koji preživljavaju u dužem periodu su prikazani zelenom bojom. Svaka linija predstavlja jednog miša.
Slika 28
Struktura konstrukata NGFR kontrole (gore), Tig126/130a (sredina) i Tta126/130a (dole)
Slika 29
Procena isporučivanja IFNγ na rast leukemije i protumorsko mikrookruženje indukovano leukemijom.
Slika 30
Procena istovremenog isporučivanja nekoliko imunostimulatornih citokina u mikrookruženje leukemije koristeći konstrukciju Tie2 vektora.
Slika 31
Procena sinergije između isporučivanja IFNγ na bazi genske terapije sa drugim imunoterapijskim strategijama, uključujući inhibitore kontrolne tačke anti-CTLA-4 i anti-LAG-3, i inhibitor indolamin-2,3-dioksigenaze (IDO), 1-metil-triptofan (1-MT).
DETALJAN OPIS ĆELIJE
[0044] Matična ćelija može da se diferencira u brojne vrste ćelija. Ćelija koja može da se diferencira u sve vrste ćelija je poznata kao totipotentna. Kod sisara, totipotentni su samo zigot i rane embrionske ćelije. Matične ćelije se mogu naći kod većine, ako ne i kod svih višećelijskih organizama. Njih karakteriše sposobnost da se obnavljaju putem mitotičke ćelijske deobe i diferenciraju u širok raspon specijalizovanih vrsta ćelija. Dve široke klase matičnih ćelija sisara su embrionske matične ćelije koje se izoluju iz unutrašnje ćelijske mase blastocisti i odrasle matične ćelije koje se nalaze u odraslim tkivima. Kod embriona u razvoju, matične ćelije mogu da se diferenciraju u sva specijalizovana embrionska tkiva. Kod odraslih organizama, matične ćelije i progenitorne ćelije deluju kao sistem za popravku organizma, gde obnavljaju specijalizovane ćelije, ali takođe održavaju uobičajenu konverziju regenerativnih organa, kao što su krv, koža ili intestinalna tkiva.
[0045] Hematopoetske matične ćelije (HSC) su multipotentne matične ćelije koje se nalaze, na primer, u perifernoj krvi, koštanoj srži i krvi iz pupčane vrpce. HSC su sposobne za samostalno obnavljanje i diferencijaciju u bilo koju ćelijsku liniju. Mogu ponovo da kolonizuju ceo imunski sistem, i eritroidne i mijeloidne linije u svim hematopoetskim tkivima (kao što su koštana srž, slezina i timus). Tokom celog života obezbeđuju proizvodnju svih linija hematopoetskih ćelija.
[0046] Hematopoetske progenitorne ćelije (HPC) imaju sposobnost da se diferenciraju u specifičnu vrstu ćelije. Međutim, za razliku od matičnih ćelija, one su već znatno specifičnije: usmerene su da se diferenciraju u svoju „ciljnu“ ćeliju. Razlika između HSC i HPC je što HPC mogu beskonačno da se repliciraju, dok HPC mogu da se dele ograničen broj puta.
[0047] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak može da koristi mešovitu populaciju ćelija koja sadrži HSC i HPC (npr. populaciju HSPC).
[0048] Diferencirana ćelija je ćelija koja je postala u većoj meri specijalizovana u poređenju sa matičnom ćelijom ili progenitornom ćelijom. Diferencijacija se odvija tokom razvoja višećelijskog organizma dok se organizam transformiše iz jednog zigota u složeni sistem tkiva i različitih ćelija. Diferencijacija je takođe uobičajeni proces kod odraslih jedinki: odrasle matične ćelije se dele i stvaraju potpuno diferencirane ćelije ćerke tokom obnavljanja tkiva i uobičajenog ćelijskog obrta. Diferencijacija dramatično menja veličinu, oblik, membranski potencijal, metaboličku aktivnost i responsivnost na signale date ćelije. Ove promene su u velikoj meri posledica veoma kontrolisanih modifikacija ekspresije gena. Drugim rečima, diferencirana ćelija je ćelija koja ima specifične strukture i obavlja određene funkcije usled razvojnog procesa koji uključuje aktivaciju i deaktivaciju određenih gena. Ovde, diferencirana ćelija uključuje diferencirane ćelije hematopoetske linije kao što su monociti, makrofagi, neutrofili, bazofili, eozinofili, eritrociti, megakariociti/trombociti, dendritske ćelije, T-ćelije, B-ćelije i NK ćelije. Na primer, diferencirane ćelije hematopoetske linije mogu da se razlikuju od HSC i HPC detekcijom molekula na površini ćelije koji se ne eksprimiraju ili se eksprimiraju u manjoj meri na nediferenciranim ćelijama (HSC i HPC). Primeri za pogodne markere humane linije uključuju CD33, CD13, CD14, CD15 (mijeloidni), CD19, CD20, CD22, CD79a (B), CD36, CD71, CD235a (eritroidni), CD2, CD3, CD4, CD8 (T), CD56 (NK).
Izvor ćelija
[0049] U jednom otelotvorenju, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit koji se koriste u predmetnom pronalasku su dobijeni iz uzorka tkiva.
[0050] Na primer, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit mogu biti dobijeni iz periferne krvi odrasle jedinke ili fetusa, krvi iz pupčane vrpce, koštane srži, jetre ili slezine. Ove ćelije su poželjno dobijene iz periferne krvi ili koštane srži. One mogu biti dobijene nakon mobilizacije ćelija in vivo putem tretiranja faktorom rasta.
[0051] Mobilizacija HSC ili HPC može da se obavi koristeći, na primer, G-CSF, pleriksafor ili njihove kombinacije. Drugi agensi, kao što su NSAIL, CXCR2 ligandi (Grobeta) i inhibitori dipeptidil peptidaze takođe mogu biti korisni kao agensi za mobilizaciju.
[0052] Imajući u vidu dostupnost faktora rasta matičnih ćelija GM-CSF i G-CSF, većina postupaka transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija sada se vrši koristeći matične ćelije prikupljene iz periferne krvi, a ne iz koštane srži. Prikupljanje matičnih ćelija periferne krvi daje veći graft, ne zahteva da donor bude podvrgnut totalnoj anesteziji kako bi se graft prikupio, za posledicu ima kraće vreme do graftovanja i može dovesti do manje dugoročne stope relapsa.
[0053] Koštana srž može da se prikupi standardnim postupcima aspiracije (u stacionarnom stanju ili nakon mobilizacije), ili koristeći alat za prikupljanje nove generacije.
[0054] Pored toga, HSC takođe mogu da se dobiju iz indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija.
Karakteristike HSC
[0055] HSC obično imaju mali profil prednjeg i bočnog rasipanja na osnovu procedura protočne citometrije. Neke su metabolički neaktivne, kao što je pokazano putem obeležavanja rodaminom koje omogućava određivanje mitohondrijske aktivnosti. HSC mogu da sadrže određene markere na ćelijskoj površini, kao što su CD34, CD45, CD133, CD90 i CD49f. Takođe mogu da se definišu kao ćelije koje nemaju ekspresiju CD38 i CD45RA markera na ćelijskoj površini. Međutim, ekspresija nekih od ovih markera zavisi od stadijuma razvoja i konteksta HSC specifičnog za tkivo. Neke HSC, koje se nazivaju „ćelije bočne populacije“, isključuju boju Hoechst 33342 što se detektuje protočnom citometrijom. Tako, HSC imaju deksriptivne karakteristike koje omogućavaju da budu identifikovane i izolovane.
Negativni markeri
[0056] CD38 je najpoznatiji i najkorisniji pojedinačni negativni marker za humane HSC.
[0057] Humane HSC takođe mogu biti negativne na linijske markere, kao što su CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD24, CD36, CD56, CD66b, CD271 i CD45RA. Međutim, može biti neophodno da se ovi markeri koriste u kombinaciji za obogaćivanje HSC.
[0058] Pod negativnim markerom se podrazumeva da humane HSC nemaju ekspresiju tih markera.
Pozitivni markeri
[0059] CD34 i CD133 su najkorisniji pozitivni markeri za HSC.
[0060] Neke HSC su takođe pozitivne na linijske markere, kao što su CD90, CD49f i CD93. Međutim, može biti neophodno da se ovi markeri koriste u kombinaciji za obogaćivanje HSC.
[0061] Pod pozitivnim markerom se podrazumeva da humane HSC eksprimiraju te markere.
[0062] Shodno tome, terapeutska populacija ćelija može biti CD34<+>CD38-. Može se obaviti dalje razdvajanje kako bi se dobile, na primer, CD34<+>CD38-CD45RA-CD90<+>CD49f<+>ćelije.
Ekspresija miRNK
[0063] Ekspresija miRNK mir-126 i mir-130a u ćeliji pokazuje da je ćelija HSC ili HPC. Konkretnije, ekspresija mir-126 pokazuje da je ćelija primitivni HPC. Ekspresija mir-130a pokazuje da je ćelija primitivniji HPC.
CITOKINI
[0064] Citokini su kategorija malih proteina, tipično veličine približno 5-20 kDa, koji imaju značajnu ulogu u ćelijskoj signalizaciji. Citokini mogu da uključuju interferone, hemokine, interleukine, limfokine i faktore nekroze tumora, i proizvodi ih širok raspon ćelija, uključujući makrofage, B limfocite, T limfocite, mastocite, endotelne ćelije i fibroblaste.
[0065] Citokini deluju preko receptora, i imaju naročito značajnu ulogu u imunskom sistemu, gde modulišu ravnotežu između humoralnih imunskih odgovora i imunskih odgovora na bazi ćelija.
[0066] Citokini uključuju interferone (IFN), IL-12 i faktor stimulacije kolonije granulocitamakrofaga (GM-CSF).
[0067] Interferoni (IFN) su grupa signalnih proteina koje ćelije domaćina proizvode kao odgovor na prisustvo patogena (npr. virusa, bakterija i parazita) i tumorskih ćelija.
[0068] IFN se obično dele na tri klase: tip I, tip II i tip III.
INTERFERONI (IFN) TIPA I
[0069] Interferoni (IFN) tipa I su klasa citokina koje proizvode imunske ćelije (leukociti, npr. NK ćelije, B-ćelije, T-ćelije, makrofagi, itd.). IFN tipa I se nazivaju plejotropni citokini jer mogu imati specifično IFN dejstvo na više vrsta ćelija.
[0070] U jednom otelotvorenju, interferon tipa I je interferon-alfa (IFNα). IFNα je takođe poznat kao IFN-alfa, IFNa, INFα-1/13.
[0071] Na primer, aminokiselinska sekvenca IFNα je:
[0072] U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFN tipa I kodira IFNα protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFN tipa I kodira IFNα protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,5% identičnosti sa SEQ ID NO:6, i pri čemu je funkcionalnost IFNα proteina koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 suštinski održana.
[0073] Jedan primer za nukleotidnu sekvencu koja kodira IFNα je:
[0074] U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFNα obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 7. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFNα obuhvata nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,5% identičnosti sa SEQ ID NO:7, pri čemu pomenuta nukleotidna sekvenca kodira protein koji ima suštinski istu funkciju kao protein sa SEQ ID NO: 6.
[0075] U jednom otelotvorenju, interferon tipa 1 je interferon-beta (IFNβ; IFNb).
[0076] Na primer, aminokiselinska sekvenca IFNβ je:
[0077] U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFN tipa I kodira IFNβ protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFN tipa I kodira IFNβ protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,5% identičnosti sa SEQ ID NO: 8, i pri čemu je funkcionalnost IFNβ proteina koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8 suštinski održana.
[0078] Jedan primer za nukleotidnu sekvencu koja kodira IFNβ je:
[0079] U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFNβ obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 9. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFNβ obuhvata nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,5% identičnosti sa SEQ ID NO:9, pri čemu pomenuta nukleotidna sekvenca kodira protein koji ima suštinski istu funkciju kao IFNβ protein sa SEQ ID NO: 8.
[0080] U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFN tipa I ima optimizaciju kodona.
INTERFERON TIPA II - INTERFERON-γ (IFNγ)
[0081] Interferon-γ (IFNγ), poznat i kao imunski interferon, aktivira se putem interleukina-12 i ima značajnu ulogu u regulisanju i aktivaciji imunskog odgovora.
[0082] Na primer, aminokiselinska sekvenca IFNγ je:
[0083] Aminokiseline 1-23 SEQ ID NO: 12 mogu da deluju kao signalni peptid i da budu raskinute kako bi se dobio zreli protein koji je predstavljen aminokiselinama 24-161 SEQ ID NO: 12. Jedan primer za zrelu aminokiselinsku sekvencu IFNγ je:
[0084] U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFNγ kodira IFNγ protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 ili 13. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFNγ kodira IFNγ protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,5% identičnosti sa SEQ ID NO: 12 ili 13, i pri čemu je funkcionalnost IFNγ proteina koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 ili 13 suštinski održana.
[0085] Dalji primer za aminokiselinsku sekvencu IFNγ je:
[0086] U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFNγ kodira IFNγ protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFNγ kodira IFNγ protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,5% identičnosti sa SEQ ID NO: 17, i pri čemu je funkcionalnost IFNγ proteina koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17 suštinski održana.
[0087] Jedan primer za nukleotidnu sekvencu koja kodira IFNγ je:
[0088] Jedan primer za nukleotidnu sekvencu koja kodira zreli oblik IFNγ je:
[0089] Dalji primer za nukleotidnu sekvencu koja kodira IFNγ je:
[0090] U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFNγ obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 14, 15 ili 16. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFNγ obuhvata nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,5% identičnosti sa SEQ ID NO: 14, 15 ili 16, pri čemu pomenuta nukleotidna sekvenca kodira protein koji ima suštinski istu funkciju kao protein sa SEQ ID NO: 12 ili 13.
[0091] Dalji primer za nukleotidnu sekvencu koja kodira IFNγ je:
[0092] U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFNγ obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 18. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFNγ obuhvata nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,5% identičnosti sa SEQ ID NO: 18, pri čemu pomenuta nukleotidna sekvenca kodira protein koji ima suštinski istu funkciju kao protein sa SEQ ID NO: 17.
[0093] U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira IFNγ ima optimizaciju kodona.
FAKTOR NEKROZE TUMORA α (TNFα)
[0094] Faktor nekroze tumora α (TNFα) je citokin koji učestvuje u sistemskoj inflamaciji. Ima primarnu ulogu u regulaciji imunskih ćelija.
[0095] TNFα prvenstveno proizvode aktivirani makrofagi, ali ih takođe proizvode druge vrste ćelija, kao što su CD4+ limfociti, NK ćelije, neutrofili, mastociti, eozinofili i neuroni.
[0096] Na primer, aminokiselinska sekvenca TNFα je:
[0097] U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira TNFα kodira protein TNFα koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira TNFα kodira TNFα protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,5% identičnosti sa SEQ ID NO: 19, i pri čemu je funkcionalnost TNFα proteina koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 suštinski održana.
[0098] Jedan primer za nukleotidnu sekvencu koja kodira TNFα je:
[0099] U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira TNFα obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 20. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira TNFα obuhvata nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,5% identičnosti sa SEQ ID NO: 20, pri čemu pomenuta nukleotidna sekvenca kodira protein koji ima suštinski istu funkciju kao protein sa SEQ ID NO: 19.
1-METIL-TRIPTOFAN (1-MT)
1-metil triptofan (1-MT) je inhibitor kataboličkog enzima triptofana indolamin 2,3-dioksigenaze (IDO) i ima sledeću strukturu:
[0101] 1-MT može biti prisutan u obliku soli ili estra, naročito farmaceutski prihvatljive soli ili estra.
[0102] 1-ML može biti D-1-MT.1-ML može biti L-1-MT.1-ML može biti racemska smeša.
[0103] Farmaceutski prihvatljive soli agensa iz pronalaska uključuju njihove pogodne kisele adicione ili bazne soli. Pregled pogodnih farmaceutskih soli nalazi se u Berge et al. (1977) J Pharm Sci 66: 1-19.
[0104] Ovaj pronalazak takođe uključuje, kada je to pogodno, sve enantiomere i tautomere agensa. Stručnjak će prepoznati jedinjenja koja imaju optička svojstva (npr. jedan ili više hiralnih atoma ugljenika) ili tautomerne karakteristike. Odgovarajući enantiomeri i/ili tautomeri mogu da se izoluju/pripreme postupcima koji su poznati u struci.
CILJNA SEKVENCA MIKRO RNK
[0105] Geni mikroRNK su raštrkani po svim humanim hromozomima, osim Y hromozoma. Oni mogu da se nalaze u nekodirajućim regionima genoma ili u intronima gena koji kodiraju proteine. Oko 50% miRNK se javlja u klasterima koji se prepisuju kao policistronski primarni transkripti. Slično genima koji kodiraju proteine, miRNK se obično prepisuju iz promotera polimeraze-II, što daje takozvani primarni transkript miRNK (pri-miRNK). Ovaj pri-miRNK se zatim obrađuje u nizu endonukleolitičkih koraka raskidanja, koje vrše dva enzima koja spadaju u familiju RNAza tipa III, droša i dajser. Iz pri-miRNK, matična petlja dugačka oko 60 nukleotida, koja se naziva prekursor mirnk (pre-mirnk), iseca se pomoću specifičnog nuklearnog kompleksa, koji se sastoji od droša i gena kritičnog regiona Didžordžovog sindroma (DGCR8), koji seče oba lanca blizu osnove primarne matične petlje i ostavlja 5' fosfat i 3' prepust dugačak 2 bp. Pre-mirnk se zatim aktivno transportuje iz jedra u citoplazmu pomoću RAN-GTP i eksportina. Dajser zatim seče dvostruki lanac na kraju matične petlje koji nije definisan droša sečenjem, dajući dvojnu spiralu od 19-24 bp, koja je sačinjena od zrele miRNK i suprotnog lanca dvojne spirale, koji se naziva miRNK*. U skladu sa pravilom termodinamičke asimetrije, samo jedan lanac dvojne spirale je selektivno nanet u RNK indukovani utišavajući kompleks (RISC), i akumulira se kao zrela mikroRNK. Ovaj lanac je obično onaj čiji 5' kraj je manje čvrsto uparen sa svojim komplementom, što je pokazano pomoću pogrešnih spajanja pojedinačnih nukleotida koji su uvedeni u 5' kraj oba lanca dvojne spirale siRNK. Međutim, postoje neke miRNK koje u sličnoj meri podržavaju akumulaciju oba lanca dvojne spirale.
[0106] MikroRNK aktiviraju RNKi, veoma nalik malim interferirajućim RNK (siRNK) koje se naširoko koriste za eksperimentalno izbacivanje gena. Glavna razlika između miRNK i siRNK je njihova biogeneza. Kada se ubaci u RISC, vodeći lanac malog molekula RNK interaguje sa mRNK ciljnim sekvencama koje se preferencijalno nalaze u 3' neprevedenom regionu (3'UTR) gena koji kodiraju proteine. Pokazano je da su nukleotidi 2-8 izbrojani od 5' kraja miRNK, takozvana germinativna sekvenca, ključni za aktivaciju RNKi. Ako je cela sekvenca vodećeg lanca savršeno komplementarna sa mRNK ciljem, što je obično slučaj za siRNK i biljne miRNK, mRNK se endonukleolitički raskida dejstvom argonaut (Ago) proteina, koji se takođe naziva „slajser“ male dvojne spirale RNK, na RNK indukovani utišavajući kompleks (RISC). DGRC (gen kritičnog regiona Didžordžovog sindroma 8) i TRBP (TAR (HIV) RNK vezujući protein 2) su dvolančani RNK vezujući proteini koji olakšavaju biogenezu zrele miRNK putem droša, odnosno dajser enzima RNaze III. Vodeći lanac dvojne spirale miRNK je inkorporisan u efektorski kompleks RISC, koji prepoznaje specifične ciljeve putem nesavršenog baznog sparivanja i indukuje posttranskripciono utišavanje gena. Predloženo je nekoliko mehanizama za ovaj režim regulacije: miRNK mogu da indukuju potiskivanje započinjanja translacije, označe ciljne mRNK za razgradnju putem deadenilovanja ili sekvestriraju ciljeve u citoplazmatsko P-telo.
[0107] S druge strane, ako je samo osnova savršeno komplementarna sa ciljnim mRNK ali preostale baze pokazuju nepotpuno sparivanje, RNKi deluje putem više mehanizama koji dovode do potiskivanja translacije. Razgradnja eukariotske mRNK se prvenstveno odvija putem skraćivanja poliA repa na 3' kraju mRNK, i skidanja zatvarača na 5' kraju, nakon čega sledi digestija 5'-3' egzonukleazom i akumulacija miRNK u odvojenim delovima citoplazme, takozvanim P-telima, obogaćenim komponentama puta raspadanja mRNK.
[0108] Prema predmetnom pronalasku, ekspresija citokina, kao što je IFN tipa 1, regulisana je endogenom miRNK koristeći odgovarajuće ciljne sekvence miRNK. Pomoću ovog postupka, miRNK koja se endogeno eksprimira u ćeliji sprečava ili smanjuje ekspresiju transgena u toj ćeliji putem vezivanja za njegove odgovarajuće ciljne sekvence miRNK pozicionirane u vektoru ili polinukleotidu. Ovo ima više prednosti u odnosu na oslanjanje na promotere specifične za tkivo, od kojih nije zanemarljiva činjenica da su promoteri specifični za tkivo često povezani sa propustljivom ekspresijom u frakciji ćelija koje nisu ciljane.
[0109] Ciljne sekvence miRNK koje su korisne u predmetnom pronalasku su ciljne sekvence miRNK koje su eksprimirane u HSC ali koje nisu značajno eksprimirane u diferenciranim ćelijama, npr. mijeloidnim ćelijama (uključujući makrofage koji infiltriraju tumor). Ovo je naročito važno jer je poznato da je ekspresija IFNα toksična za HSC.
[0110] Poželjni primeri ciljnih sekvenci miRNK za upotrebu u pronalasku su mir-130a i mir-126.
[0111] Vezivanje mir-126 miRNK za ciljne sekvence mir-126 veoma delotvorno blokira ekspresiju u HSC i u ćelijama eritroidne linije. Tako, ciljna sekvenca mir-126 je naročito pogodna za primene genske terapije koje se oslanjaju na robusnu ekspresiju transgena u mijeloidnoj ili limfoidnoj liniji.
[0112] miRNK mir-126 može imati nukleotidnu sekvencu:
UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG (SEQ ID NO: 1).
[0113] U jednom otelotvorenju, mir-126 ciljna sekvenca obuhvata nukleotidnu sekvencu GCATTATTACTCACGGTACGA (SEQ ID NO:2).
[0114] U jednom otelotvorenju, vektor ili polinukleotid koji se koristi u predmetnom pronalasku obuhvata najmanje jednu, najmanje dve ili najmanje tri kopije nukleotidne sekvence SEQ ID NO:2. U jednom poželjnom otelotvorenju, mir-126 ciljna sekvenca obuhvata dve kopije nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 2.
[0115] U jednom otelotvorenju, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit koji se koriste u predmetnom pronalasku obuhvataju najmanje jednu, najmanje dve ili najmanje tri kopije nukleotidne sekvence SEQ ID NO:2. U jednom poželjnom otelotvorenju, mir-126 ciljna sekvenca obuhvata dve kopije nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 2.
[0116] Kopije ciljnih sekvenci mir-126 mogu biti odvojene sekvencom spejsera. Sekvenca spejsera može da obuhvata najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri ili najmanje četiri ili najmanje pet nukleotidnih baza.
[0117] Vezivanje mir-130a miRNK za ciljne sekvence mir-130a veoma delotvorno blokira ekspresiju u HSC i u ćelijama eritroidne linije (slično miR-126). Tako, ciljna sekvenca miR-130a je naročito pogodna za primene genske terapije koje se oslanjaju na robusnu ekspresiju transgena u mijeloidnoj ili limfoidnoj liniji.
[0118] miRNK mir-130a može imati nukleotidnu sekvencu:
CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU (SEQ ID NO: 3).
[0119] U jednom otelotvorenju, ciljna sekvenca mir-130a obuhvata nukleotidnu sekvencu ATGCCCTTTTAACATTGCACTG (SEQ ID NO: 4).
[0120] U jednom otelotvorenju, ciljna sekvenca mir-130a obuhvata najmanje jednu, najmanje dve ili najmanje tri kopije nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 4. U jednom poželjnom otelotvorenju, ciljna sekvenca mir-130a obuhvata dve kopije nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 4.
[0121] Kopije ciljnih sekvenci mir-130a mogu biti odvojene sekvencom spejsera. Sekvenca spejsera može da obuhvata najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri ili najmanje pet nukleotidnih baza.
[0122] U jednom otelotvorenju, vektor obuhvata dve kopije ciljne sekvence mir-126 i dve kopije ciljne sekvence mir-130a.
[0123] U jednom otelotvorenju, dve kopije ciljne sekvence mir-126 i dve kopije ciljne sekvence mir-130a su sadržane u nukleotidnoj sekvenci:
[0124] Kombinovane ciljne sekvence, npr. ciljna sekvenca koja obuhvata dve kopije ciljne sekvence mir-126 i dve kopije ciljne sekvence mir-130a, naročito su poželjne za upotrebu u predmetnom pronalasku pošto upotreba ove kombinacije maksimizuje potiskivanje vektora u HSC i ekspresije u mijeloidnom potomstvu.
[0125] Nadalje, kada se koristi kombinovani cilj, nishodna regulacija transgena u HSC je osigurana pomoću dve nezavisne miRNK, a rizik od ometanja regulacije endogene miRNK je smanjen, čime se povećava bezbednost i delotvornost ciljne sekvence.
VEKTOR
[0126] Vektor je alat koji omogućava ili olakšava transfer entiteta iz jednog okruženja u drugo. Prema predmetnom pronalasku, i kao primer, neki vektori koji se koriste u tehnikama rekombinantnih nukleinskih kiselina omogućavaju da entiteti kao što je segment nukleinske kiseline (npr. segment heterologne DNK, kao što je segment heterologne kDNK) budu prebačeni u ciljnu ćeliju. Vektor može imati svrhu održavanja heterologne nukleinske kiseline (DNK ili RNK) unutar ćelije, olakšavanja replikacije vektora koji obuhvata segment nukleinske kiseline, ili olakšavanja ekspresije proteina koji je kodiran segmentom nukleinske kiseline. Vektori mogu biti nevirusni ili virusni. Primeri za vektore koji se koriste u tehnikama rekombinantnih nukleinskih kiselina uključuju, bez ograničenja, plazmide, hromozome, veštačke hromozome i viruse. Vektor takođe može biti, na primer, gola nukleinska kiselina (npr. DNK). U svom najprostijem obliku, sam vektor može biti nukleotid od interesa.
[0127] Vektori koji se koriste u pronalasku mogu biti, na primer, plazmidni ili virusni vektori i mogu da uključuju promoter za ekspresiju polinukleotida i opciono regulator promotera. U jednom poželjnom otelotvorenju, vektor je virusni vektor.
[0128] Vektori koji obuhvataju polinukleotide koji se koriste u pronalasku mogu da se uvedu u ćelije koristeći različite tehnike koje su poznate u struci, kao što je transformacija, transfekcija i transdukcija. U struci je poznato nekoliko tehnika, na primer, transdukcija rekombinantnim virusnim vektorima, kao što su retrovirusni, lentivirusni, adenovirusni, adenoasocirani virusni, bakulovirusni i herpes simpleks virusni vektori, vektori uspavane lepotice; direktna injekcija nukleinskih kiselina i biolistička transformacija.
[0129] Nevirusni sistemi za isporučivanje uključuju, bez ograničenja, postupke DNK transfekcije. Ovde, transfekcija uključuje proces koji koristi nevirusni vektor za isporučivanje gena u ciljnu ćeliju. Uobičajeni postupci transfekcije uključuju elektroporaciju, DNK biolistiku, transfekciju posredovanu lipidom, transfekciju posredovanu kompaktiranom DNK, lipozome, imunolipozome, lipofektin, transfekciju posredovanu katjonskim agensom, katjonske facijalne amfifile (CFA) (Nature Biotechnology 199614; 556) i njihove kombinacije.
[0130] Treba razumeti da termin „transfekcija“ obuhvata isporučivanje polinukleotida u ćelije putem virusne kao i nevirusne isporuke.
[0131] Pored toga, pronalazak može da koristi postupke ciljanja gena, na primer, isporučivanje agensa koji modifikuju DNK.
[0132] Virusni sistemi za isporučivanje uključuju, bez ograničenja, adenovirusni vektor, adenoasocirani virusni (AAV) vektor, herpes virusni vektor, retrovirusni vektor, lentivirusni vektor i bakulovirusni vektor.
[0133] Retrovirusi su RNK virusi čiji životni ciklus se razlikuje od litičkih virusa. U pogledu navedenog, retrovirus je infektivni entitet koji se replicira preko DNK posrednika. Kada retrovirus inficira ćeliju, njegov genom se konvertuje u oblik DNK putem enzima reversne transkriptaze. Kopija DNK služi kao šablon za proizvodnju novih RNK genoma i virusno kodiranih proteina koji su neophodni za sklapanje infektivnih virusnih čestica.
[0134] Postoje brojni retrovirusi, na primer, virus mišje leukemije (MLV), virus humane imunodeficijencije (HIV), infektivni virus konjske anemije (EIAV), mišji virus tumora dojke (MMTV), virus Rausovog sarkoma (RSV), virus Fudžinama sarkoma (FuSV), Molounijev virus mišje leukemije (Mo-MLV), FBR virus mišjeg osteosarkoma (FBR MSV), Molounijev virus mišjeg sarkoma (Mo-MSV), Abelsonov virus mišje leukemije (A-MLV), ptičji virus mijelocitomatoze-29 (MC29) i ptičji virus eritroblastoze (AEV) i svi drugi retroviridiae uključujući lentiviruse.
[0135] Detaljan spisak retrovirusa nalazi se u Coffin et al („Retroviruses“ 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus str.758-763).
[0136] Lentivirusi takođe pripadaju porodici retrovirusa, ali oni mogu da inficiraju ćelije koje se dele kao i ćelije koje se ne dele (Lewis et al (1992) EMBO J.3053-3058).
[0137] U jednom otelotvorenju, vektor je lentivirusni vektor.
PROMOTER
[0138] U jednom otelotvorenju, vektor obuhvata promoter specifičan za tkivo. Poželjno, promoter specifičan za tkivo pokreće specifičnu ekspresiju u podskup mijeloidnih ćelija koje infiltriraju tumor, kao što su Tie2 eksprimirajući monociti (TEM) ili M2 polarizovani makrofagi.
[0139] U jednom poželjnom otelotvorenju, promoter specifičan za tkivo je TEK (Tie2) promoter.
[0140] Na primer, nukleotidna sekvenca TEK je:
[0141] U jednom otelotvorenju, TEK promoter obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 10. U jednom otelotvorenju, TEK promoter obuhvata nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,5% identičnosti sa SEQ ID NO:10.
[0142] TEK (Tie2) promoter može da se kombinuje sa ciljnom sekvencom mir-126 i/ili ciljnom sekvencom mir-130a. To omogućava ekspresiju specifičnog transgena u podskupu mijeloidnih ćelija koje infiltriraju tumor, npr. makrofaga koji infiltriraju tumor.
[0143] U jednom otelotvorenju, vektor dalje može da obuhvata sekvencu pojačivača TEK (Tie2).
[0144] Na primer, sekvenca pojačivača TEK (Tie2) je:
[0145] U jednom otelotvorenju, sekvenca pojačivača TEK obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 11. U jednom otelotvorenju, TEK pojačivač obuhvata nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99,5% identičnosti sa SEQ ID NO: 11.
OPTIMIZACIJA KODONA
[0146] Polinukleotidi koji se koriste u predmetnom pronalasku mogu imati optimizaciju kodona. Optimizacija kodona je prethodno opisana u WO 1999/41397 i WO 2001/79518.
[0147] Različite ćelije se razlikuju po njihovoj upotrebi određenih kodona. Ova kodonska pristrasnost odgovara pristrasnosti u relativnom izobilju određenih tRNK u datoj vrsti ćelije. Izmenom kodona u sekvenci tako da budu prilagođeni da odgovaraju relativnom izobilju odgovarajućih tRNK, moguće je da se poveća ekspresija. Na isti način, moguće je da se ekspresija smanji putem namernog odabira kodona za koje je poznato da su odgovarajuće tRNK retke u određenoj vrsti ćelija. Usled toga je moguć veći stepen kontrole translacije.
[0148] Brojni virusi, uključujući HIV i druge lentiviruse, koriste veliki broj retkih kodona i njihovom promenom tako da odgovaraju uobičajeno korišćenim kodonima sisara može se postići povećana ekspresija komponenata pakovanja u proizvodnim ćelijama sisara. Tabele upotrebe kodona su poznate u struci za ćelije sisara, kao i za raznovrsne druge organizme.
[0149] Optimizacija kodona takođe može da uključuje uklanjanje mRNK motiva nestabilnosti i kriptičnih mesta splajsovanja.
TUMORSKI ANTIGEN (TAA)
[0150] Kao što se ovde koristi, termin tumorski antigen (TAA; poznat i kao tumor asocirani antigen) odnosi se na antigenski molekul koji eksprimira ćelija kancera, npr. ćelija tumora. TAA može biti prepoznat od strane imunske ćelije koja eksprimira imunski receptor (npr. TCR, transgeni TCR ili CAR) koji je sposoban da se specifično veže za deo (npr. epitop) molekula TAA.
[0151] Kao što se ovde koristi, termin T-ćelija specifična za TAA se odnosi na T-ćeliju koja eksprimira TCR ili CAR koji je specifičan za TAA.
[0152] T-ćelija koja eksprimira TCR specifičan za TAA ili CAR specifičan za TAA može biti sposobna da specifično cilja i ubija ćelije tumora koje eksprimiraju TAA. TCR specifičan za TAA može biti transgeni TCR.
[0153] U jednom otelotvorenju, T-ćelija specifična za TAA ne mora biti genetski konstruisana. T-ćelije mogu biti prirodno indukovane T-ćelije specifične za tumor. Na primer, T-ćelije koje se koriste u predmetnom pronalasku mogu biti ekspandovane iz tumora ili limfnog čvora.
[0154] Konkretni TAA može biti eksprimiran sa visokim relativnim izobiljem na određenoj vrsti ćelije tumora u poređenju sa netumorskim ćelijama (npr. zdrava ćelija).
[0155] Primeri za TAA uključuju karcinoembrionalni antigen (CEA), estrogenski receptor, progesteronski receptor, efrinB2, ROR1, mezotelin, c-Met, GD-2, i MAGE A3 TCR, 4-1BB, antigen adenokarcinoma, alfa-fetoprotein, BAFF, ćeliju B-limfoma, C242 antigen, karbonsku anhidrazu 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (IgE receptor), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNT0888, CTLA-4, DR5, EpCAM, CD3, ekstra domen fibronektina-B, receptor folata 1, glikoprotein 75, GPNMB, HGF, kinazu humanog receptora faktora rasipanja, IGF-1 receptor, IGF-I, IgGI, L1-CAM, IL-13, IL-6, receptor faktora rasta nalik insulinu I, integrin α5β1, integrin αvβ3, MORAb-009, MS4A1, mucin CanAg, N-glikolil neuraminsku kiselinu, NPC-1C, PDGF-Rα, PDL192, fosfatidil serin, ćeliju karcinoma prostate, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, tenascin C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, tumorski antigen CTAA16.88, vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentin, 5T4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1 (CDw52), HLA-DR, anti-idiotip, TAG-72, Ep-CAM, MUC1, folat vezujući protein, A33, G250, membranski antigen specifičan za prostatu, (PSMA), antigen specifičan za prostatu (PSA), feritin, gangliozid (npr. GD2, GD3, GM2), Le<y>, CA-125, CA19-9, receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), p185HER2, IL-2 receptor, de2-7 EGFR, protein aktivacije fibroblasta (FAP), tenascin, metaloproteinaze, endosijalin, karbonsku anhidrazu, galektin 9, aldolazu A, elFγ4, tirozinazu, galektin 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, restin, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, bkatenin/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) i DAM-10 (MAGE-B1), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MC1R, miozin/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NY-ESO-1, P15, p190 minor bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, protein 1, gp75, TRP-2, TRP-2/INT2 ili WT1.
[0156] Dodatni TAA mogu da se identifikuju koristeći postupke koji su poznati u struci, vidite, npr. članak sa pregledom autora Zilberberg et al.2015 (Biology of Blood and Marrow Transplantation, sveska 21, izdanje 6, June 2015, strane 1000-1007) čiji sadržaj je ovde uključen u vidu reference.
T-ĆELIJA
[0157] Kao što se ovde koristi, termin „T-ćelija“ može da se odnosi na CD8+ T-ćelije, CD4+ T-ćelije, naivne T-ćelije, memorijske matične T-ćelije, centralne memorijske T-ćelije, dvostruko negativne T-ćelije, efektorske memorijske T-ćelije, efektorske T-ćelije, Th0 ćelije, Tc0 ćelije, Th1 ćelije, Tc1 ćelije, Th2 ćelije, Tc2 ćelije, Th17 ćelije, Th22 ćelije, gama/delta T-ćelije.
[0158] T-ćelija koja se koristi u predmetnom pronalasku može da se koristi za adaptivni transfer T-ćelija. Predmetni pronalazak takođe obuhvata adaptivni transfer limfocita koji infiltriraju tumor (TIL) i/ili limfocita koji infiltriraju srž (MIL).
[0159] Kao što se ovde koristi, termin „adaptivni transfer T-ćelija“ se odnosi na primenu populacije T-ćelija na pacijentu. T-ćelija može biti izolovana od ispitanika a zatim genetski modifikovana i uzgajana in vitro (ex vivo) radi ekspresije TCR ili CAR specifičnog za TAA pre primene na pacijentu.
[0160] Adaptivni ćelijski transfer može biti alogeni ili autologni.
[0161] Pod „autolognim ćelijskim transferom“ podrazumeva se da je početna populacija ćelija dobijena od istog ispitanika na kome se vrši primena populacije transdukovanih T-ćelija. Prednost autolognog transfera je što se izbegavaju problemi povezani sa imunološkom nekompatibilnošću i dostupan je za ispitanike nevezano za postojanje donora sa genetskim poklapanjem.
[0162] Pod „alogenim ćelijskim transferom“ podrazumeva se da je početna populacija ćelija dobijena od ispitanika koji se razlikuje od onog na kome se vrši primena populacije transdukovanih ćelija. Poželjno, donor će se genetski poklapati sa ispitanikom na kome se primenjuju ćelije kako bi se rizik od imunološke nekompatibilnosti sveo na najmanju moguću meru. Alternativno, donor može biti bez poklapanja i nepovezan sa pacijentom.
[0163] Odgovarajuće doze populacija transdukovanih ćelija su takve da budu terapeutski i/ili profilaktički delotvorne. Doza koja se primenjuje može da zavisi od ispitanika i stanja koje se leči, i stručnjak za oblast lako može da je odredi.
[0164] T-ćelija može biti dobijena od T-ćelije koja je izolovana od pacijenta. T-ćelija može biti deo mešovite populacije ćelija izolovane od ispitanika, kao što je populacija limfocita periferne krvi (PBL). T-ćelije u populaciji PBL mogu da se aktiviraju postupcima koji su poznati u struci, na primer, upotrebom anti-CD3 i/ili anti-CD28 antitela ili perlica veličine ćelija koje su konjugovane sa anti-CD3 i/ili anti-CD28 antitelima.
[0165] T-ćelija može biti CD4<+>pomoćna T-ćelija ili CD8<+>citotoksična T-ćelija. T-ćelija se može nalaziti u mešovitoj populaciji CD4<+>pomoćnih T-ćelija/CD8<+>citotoksičnih T-ćelija. Poliklonska aktivacija, na primer koristeći anti-CD3 antitela opciono u kombinaciji sa anti-CD28 antitelima, pokrenuće proliferaciju CD4<+>i CD8<+>T-ćelija.
[0166] T-ćelija može biti izolovana od ispitanika kome će se adoptivno transferisati genetski modifikovana ćelija. U tom pogledu, ćelija može da se napravi izolovanjem T-ćelije od ispitanika, opciono uz aktiviranje T-ćelije, prenos TCR gena u ćeliju ex vivo. Dalja imunoterapija ispitanika zatim može da se obavlja putem adaptivnog transfera TCR transdukovanih ćelija. Kao što se ovde koristi, ovaj proces se odnosi na autologni T-ćelijski transfer, tj. TCR transdukovane ćelije se primenjuju na istom ispitaniku od koga su T-ćelije prvobitno dobijene.
[0167] Alternativno, T-ćelija može biti izolovana od drugog ispitanika, tako da je alogena. T-ćelija može biti izolovana od donorskog ispitanika. Na primer, ako se na ispitaniku vrši transplantacija alogenih hematopoetskih matičnih ćelija (Allo-HSCT) ili transplantacija čvrstog organa ili terapija matičnim ćelijama, ćelija može biti dobijena od donora od koga su dobijeni organi, tkiva ili ćelije. Donor i ispitanik koji se leči mogu biti u srodstvu.
[0168] Alternativno, T-ćelija može biti dobijena od matične ćelije, kao što je hematopoetska matična ćelija (HSC). Genski transfer u HSC ne dovodi do ekspresije TCR na ćelijskoj površini pošto matične ćelije ne eksprimiraju molekule CD3. Međutim, kada se matična ćelija diferencira u limfoidne prekursore koji migriraju u timus, započinjanje ekspresije CD3 dovodi do površinske ekspresije uvedenog TCR u timocitima.
[0169] Prednost ovog pristupa je što zrele T-ćelije kada se proizvedu eksprimiraju samo uvedeni TCR i malo ili nimalo endogenih lanaca TCR, pošto ekspresija uvedenih lanaca TCR potiskuje preuređenje segmenata endogenog TCR gena radi nastanka funkcionalnih TCR alfa i beta gena. Dalja prednost je to što su genetski modifikovane matične ćelije kontinuirani izvor zrelih T-ćelija sa željenom antigenskom specifičnošću. Shodno tome, HSC, HPC ili vektor, kao što je ovde definisano, mogu da se koriste u kombinaciji sa genetski modifikovanom matičnom ćelijom, poželjno genetski modifikovanom hematopoetskom matičnom ćelijom koja nakon diferencijacije proizvodi T-ćeliju koja eksprimira TCR specifičan za TAA.
[0170] Drugi pristupi koji su poznati u struci mogu da se koriste za smanjenje, ograničenje, prevenciju, utišavanje ili ukidanje ekspresije endogenih gena u ćelijama iz predmetnog pronalaska ili ćelijama koje su pripremljene postupcima iz predmetnog pronalaska.
[0171] Kao što se ovde koristi, termin „ometanje“ se odnosi na smanjenje, ograničenje, prevenciju, utišavanje ili ukidanje ekspresije gena. Stručnjak za oblast može da koristi bilo koji postupak koji je poznat u struci za ometanje endogenog gena, npr. bilo koji odgovarajući postupak za izmenu genoma, utišavanje gena, nokdaun gena ili izbacivanje gena.
[0172] Na primer, endogeni gen može da se ometa pomoću veštačke nukleaze. Veštačka nukleaza je, npr. veštački restrikcioni enzim koji je konstruisan da selektivno cilja specifičnu polinukleotidnu sekvencu (npr. koja kodira gen od interesa) i indukuje cepanje dvostrukog lanca u pomenutoj polinukleotidnoj sekvenci. Dvolančano cepanje (DSB) obično će biti popravljeno spajanjem nehomolognih krajeva koje je sklono greškama (NHEJ), što će dovesti do nastanka nefunkcionalne polinukleotidne sekvence, koja možda neće biti u stanju da eksprimira endogeni gen.
[0173] U nekim otelotvorenjima, veštačka nukleaza je izabrana iz grupe koja se sastoji od nukleaza cinkovog prsta (ZFN), efektorskih nukleaza nalik aktivatoru transkripcije (TALEN) i CRISPR/Cas (npr. CRISPR/Cas9).
T-ĆELIJSKI RECEPTOR (TCR)
[0174] Tokom obrade antigena, antigeni se razgrađuju u ćelijama i zatim se prenose na ćelijsku površinu pomoću molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). T-ćelije mogu da prepoznaju ovaj kompleks peptid:MHC na površini ćelije koja prezentuje antigen. Postoje dve različite klase molekula MHC: MHC I i MHC II, svaka klasa isporučuje peptide iz različitih delova ćelije na ćelijsku površinu.
[0175] T-ćelijski receptor (TCR) je molekul koji se nalazi na površini T-ćelija koji je odgovoran za prepoznavanje antigena vezanih za molekule MHC. TCR heterodimer se sastoji od alfa (α) i beta (β) lanca u oko 95% T-ćelija, dok oko 5% T-ćelija ima TCR koji se sastoje od gama (γ) i delta (δ) lanaca.
[0176] Interakcija TCR sa antigenom i MHC dovodi do aktivacije T limfocita na kome se TCR eksprimira u nizu biohemijskih događaja koji su posredovani povezanim enzimima, koreceptorima i specijalizovanim pomoćnim molekulima.
[0177] Svaki lanac TCR je član superfamilije imunoglobulina i ima jedan N-terminalni varijabilni (V) domen imunoglobulina (Ig), jedan Ig-konstantni (C) domen, transmembranski region/region koji se proteže preko ćelijske membrane, i kratki citoplazmatski rep na C-terminalnom kraju.
[0178] Varijabilni domen α lanca kao i β lanca TCR ima tri hipervarijabilna regiona ili regiona za određivanje komplementarnosti (CDR). CDR3 je glavni CDR odgovoran za prepoznavanje obrađenog antigena, mada se pokazalo da CDR1 alfa lanca takođe interaguje sa N-terminalnim delom antigenskog peptida, dok CDR1 beta lanca interaguje sa C-terminalnim delom peptida. Smatra se da CDR2 prepoznaje molekul MHC.
[0179] Konstantni domen TCR domena se sastoji od kratkih vezivnih sekvenci u kojima cisteinski ostatak gradi disulfidnu vezu, koja čini vezu između dva lanca.
[0180] TCR koji se koristi u predmetnom pronalasku može imati jedan ili više dodatnih cisteinskih ostataka u svakom od α i β lanaca tako da TCR može da sadrži dve ili više disulfidnih veza u konstantnim domenima.
[0181] Ta struktura omogućava TCR da se poveže sa drugim molekulima poput CD3 koji ima tri različita lanca (γ, δ, i ε) kod sisara i ζ-lanac. Ovi pomoćni molekuli imaju negativno naelektrisane transmembranske regione i od ključnog su značaja za propagaciju signala iz TCR u ćeliju. CD3- i ζ-lanci, zajedno sa TCR, grade strukturu koja je poznata kao kompleks T-ćelijskog receptora.
[0182] Signal iz T-ćelijskog kompleksa je pojačan istovremenim vezivanjem molekula MHC putem specifičnog koreceptora. Za pomoćne T-ćelije, ovaj koreceptor je CD4 (specifičan za MHC klasu II); dok je za citotoksične T-ćelije ovaj koreceptor CD8 (specifičan za MHC klasu I). Koreceptor omogućava produženu interakciju između ćelije koja prezentuje antigen i T-ćelije i regrutuje esencijalne molekule (npr. LCK) u ćeliji koja učestvuje u signalizaciji aktiviranog T limfocita.
[0183] Shodno tome, kao što se ovde koristi, termin „T-ćelijski receptor“ (TCR) odnosi se na molekul koji može da prepoznaje peptid kada ga prezentuje molekul MHC. Molekul može biti heterodimer dva lanca α i β (ili opciono γ i δ) ili može biti jednolančani konstrukt TCR.
[0184] TCR koji se koristi u predmetnom pronalasku može biti hibridni TCR koji obuhvata sekvence dobijene od više od jedne vrste. Na primer, iznenađujuće je otkriveno da su mišji TCR delotvornije eksprimirani u humanim T-ćelijama nego humani TCR. TCR stoga može da obuhvata humane varijabilne regione i mišje konstantne regione.
[0185] Nedostatak ovog pristupa je što mišje konstantne sekvence mogu izazvati imunski odgovor, što dovodi do odbacivanja prebačenih T-ćelija. Međutim, režimi kondicioniranja koji se koriste da se pacijenti pripreme za adaptivnu T-ćelijsku terapiju mogu dovesti do dovoljne imunosupresije kako bi se omogućilo graftovanje T-ćelija koje eksprimiraju mišje sekvence.
[0186] Deo TCR koji uspostavlja većinu kontakta sa antigenim peptidom koji je vezan za glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) je region za određivanje komplementarnosti 3 (CDR3), koji je jedinstven za svaki klon T-ćelije. CDR3 region je generisan nakon događaja somatskog preuređivanja koji se odvijaju u timusu i uključuju neuzastopne gene koji pripadaju varijabilnim (V), raznovrsnim (D, za β i δ lance) spajajućim (J) genima. Nadalje, nasumični nukleotidi umetnuti/izbačeni na mestima preuređenja svakog gena TCR lanca mogu značajno povećati raznolikost veoma varijabilne sekvence CDR3. Tako, učestalost specifične sekvence CDR3 u biološkom uzorku ukazuje na zastupljenost specifične populacije T-ćelija. Velika raznolikost repertoara TCR kod zdravih ljudskih bića pruža opsežnu zaštitu od raznovrsnih stranih antigena koje molekuli MHC prezentuju na površini ćelija koje prezentuju antigen. Vezano za to, treba napomenuti da u timusu u teoriji može da se generiše do 10<15>različitih TCR.
[0187] Raznolikost T-ćelijskog receptora je usmerena na CDR3 i ovaj region je prvenstveno odgovoran za prepoznavanje antigena.
[0188] CDR mogu, na primer, da obuhvataju jednu, dve ili tri supstitucije, adicije ili delecije u odnosu na datu sekvencu, pod uslovom da TCR zadržava sposobnost da vezuje peptid dobijen od TAA kada ga prezentuje molekul MHC.
[0189] Stručnjak za oblast lako može da generiše TCR specifične za TAA koristeći bilo koji postupak poznat u struci.
[0190] Na primer, TCR specifični za TAA mogu da se identifikuju postupkom hvatanja TCR gena iz Linnemann et al (Nature Medicine 19, 1534-1541 (2013)). Ukratko, ovaj postupak koristi visokopropusnu strategiju na bazi DNK za identifikovanje sekvenci TCR putem hvatanja i sekvenciranja fragmenata genomske DNK koji kodiraju TCR gene i mogu da se koriste za identifikovanje TCR specifičnih za TAA.
POBOLJŠANA EKSPRESIJA TCR I SMANJENO POGREŠNO SPARIVANJE TCR
[0191] Povećanje ponude molekula CD3 može povećati ekspresiju TCR, na primer, u ćeliji koja je modifikovana da eksprimira TCR iz predmetnog pronalaska. Shodno tome, T-ćelija može biti modifikovana (npr. koristeći vektor) da sadrži jedan ili više gena koji kodiraju CD3-gama, CD3-delta, CD3-epsilon i/ili CD3-zeta. U jednom otelotvorenju, T-ćelija obuhvata gen koji kodira CD3-zeta. T-ćelija može da obuhvata gen koji kodira CD8. Vektor koji kodira takve gene može da kodira selektabilni marker ili samoubilački gen, kako bi se poboljšao bezbednosni profil genetski konstruisane ćelije. Geni mogu biti vezani preko samoraskidivih sekvenci, kao što je samoraskidiva sekvenca 2A.
[0192] Alternativno, jedan ili više zasebnih vektora koji kodiraju gen CD3 može biti obezbeđeno za zajednički transfer u T-ćeliju istovremeno, redom ili zasebno sa jednim ili više vektora koji kodiraju TCR.
[0193] Transgeni TCR može da se eksprimira u T-ćeliji koja se koristi u predmetnom pronalasku kako bi se izmenila specifičnost T-ćelije za antigen. T-ćelije transdukovane sa TCR eksprimiraju najmanje dva TCR alfa i dva TCR beta lanca. Dok endogeni TCR alfa/beta lanci grade receptor koji je samotolerišući, uvedeni TCR alfa/beta lanci grade receptor sa definisanom specifičnošću za dati ciljni antigen.
[0194] Međutim, TCR genska terapija zahteva dovoljnu ekspresiju prenetih (tj. transgenih) TCR, pošto preneti TCR može biti razblažen prisustvom endogenog TCR, što dovodi do suboptimalne ekspresije TCR specifičnog za tumor. Nadalje, može da se odigra pogrešno sparivanje između endogenih i uvedenih lanaca kako bi nastali novi receptori, koji mogu ispoljavati neočekivane specifičnosti za svojstvene antigene i izazvati autoimunsko oštećenje kada se prebace u pacijente.
[0195] Stoga je ispitano nekoliko strategija za smanjenje rizika od pogrešnog sparivanja između endogenih i uvedenih lanaca TCR. Mutacije međupovršine TCR alfa/beta predstavljaju jednu strategiju koja se trenutno koristi za smanjenje neželjenog pogrešnog sparivanja. Na primer, uvođenje cisteina u konstantne domene alfa i beta lanca omogućava nastanak disulfidne veze i povećava sparivanje uvedenih lanaca, dok istovremeno smanjuje pogrešno sparivanje sa lancima divljeg tipa.
[0196] Shodno tome, TCR koji se koriste u predmetnom pronalasku mogu da obuhvataju jednu ili više mutacija na međupovršini α lanac/β lanac, tako da, kada su α lanac i β lanac eksprimirani u T-ćeliji, učestalost pogrešnog sparivanja između pomenutih lanaca i endogenih α i β TCR lanaca je smanjena. U jednom otelotvorenju, jedna ili više mutacija uvode cisteinski ostatak u domen konstantnog regiona svakog α lanca i β lanca, pri čemu cisteinski ostaci mogu da formiraju disulfidnu vezu između α lanca i β lanca.
[0197] Još jedna strategija za smanjivanje pogrešnog sparivanja se oslanja na uvođenje polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju siRNK, koje se dodaju genima koji kodiraju α i/ili β lance TCR specifičnih za tumor, i predviđenih da ograniče ekspresiju endogenih TCR gena (Okamoto S. Cancer research 69, 9003-9011, 2009).
[0198] Shodno tome, vektor ili polinukleotid koji kodira TCR koji se koriste u predmetnom pronalasku može da obuhvata jednu ili više siRNK ili drugih agensa sa ciljem ograničavanja ili ukidanja ekspresije endogenih TCR gena.
[0199] Takođe je moguće da se kombinuju veštačke nukleaze, kao što su nukleaze cinkov prst (ZFN), efektorske nukleaze nalik aktivatoru transkripcije (TALEN) i/ili CRISPR/Cas sistemi, konstruisani da ciljaju konstantne regione endogenih TCR gena (TRAC i/ili TRBC), kako bi se postiglo trajno ometanje gena endogenih TCR alfa i/ili beta lanaca, što omogućava punu ekspresiju TCR specifičnog za tumor, te tako smanjuje ili ukida rizik od pogrešnog sparivanja TCR. Ovaj postupak, poznat kao uređivanje TCR gena, pokazao se kao superioran u odnosu na transfer TCR gena in vitro i in vivo (Provasi E., Genovese P., Nature Medicine May; 18(5):807-15; 2012).
[0200] Pored toga, tehnologija za uređivanje genoma omogućava ciljanu integraciju ekspresione kasete koja obuhvata polinukleotid, koji kodira TCR koji se koristi u predmetnom pronalasku, i, opciono, jednog ili više promoterskih regiona i/ili drugih sekvenci za kontrolu ekspresiju, u endogeni gen koji se ometa pomoću veštačkih nukleaza (Lombardo A., Nature biotechnology 25, 1298-1306; 2007).
[0201] Još jedna strategija koja je razvijena za povećanje ekspresije transgenih TCR i za smanjenje pogrešnog sparivanja TCR sastoji se od „murinizacije“, što zamenjuje konstantne humane regione TCR α i TCR β (npr. regioni TRAC, TRBC1 i TRBC2) njihovim mišjim parnjacima. Murinizacija konstantnih regiona TCR je opisana, na primer, u Sommermeyer i Uckert J Immunol; 2010 (184:6223-6231). Shodno tome, TCR koji se koristi u predmetnom pronalasku može biti murinizovan.
HIMERNI ANTIGENSKI RECEPTOR (CAR)
[0202] CAR obuhvataju ekstracelularni ligand vezujući domen, najčešće jednolančani varijabilni fragment monoklonskog antitela (scFv) povezan sa intracelularnim signalnim komponentama, najčešće CD3ζ samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više kostimulatornih domena. Spejser se često dodaje između ekstracelularnog antigen vezujućeg domena i transmembranskog ostatka kako bi se optimizovala interakcija sa ciljem.
[0203] CAR za upotrebu u predmetnom pronalasku može da obuhvata:
(i) antigen specifični ciljajući domen;
(ii) transmembranski domen;
(iii) opciono najmanje jedan kostimulatorni domen; i
(iv) intracelularni signalni domen.
[0204] Poželjno, antigen specifični ciljajući domen obuhvata antitelo ili njegov fragment, poželjnije jednolančani varijabilni fragment.
[0205] Poželjno, antigen specifični ciljajući domen cilja TAA.
[0206] U jednom otelotvorenju, antigen specifični ciljajući domen cilja CD19.
[0207] Primeri za transmembranske domene uključuju transmembranski domen zeta lanca kompleksa T-ćelijskog receptora, CD28 i CD8a.
[0208] Primeri za kostimulatorne domene uključuju kostimulatorne domene od CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), DaplO, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30 i CD40.
[0209] U jednom otelotvorenju, kostimulatorni domen je kostimulatorni domen CD28.
[0210] Primeri za intracelularne signalne domene uključuju zeta lanac humanog CD3, FcyRIII, FcsRI, citoplazmatski rep Fc receptora i aktivacioni imunoreceptorski motiv na bazi tirozina (ITAM) koji ima citoplazmatske receptore.
Himerni antigenski receptori
[0211] „Himerni antigenski receptor“ ili „CAR“, kao što se ovde koristi, odnosi se na konstruisane receptore koji ćelijama (na primer, T-ćelijama kao što su naivne T-ćelije, centralne memorijske T-ćelije, efektorske memorijske T-ćelije ili njihove kombinacije) mogu da daju specifičnost za antigen. CAR su takođe poznati kao veštački T-ćelijski receptori, himerni T-ćelijski receptori ili himerni imunoreceptori. CAR iz pronalaska poželjno obuhvataju antigen specifični ciljajući region, ekstracelularni domen, transmembranski domen, opciono jedan ili više kostimulatornih domena i intracelularni signalni domen.
Antigen specifični ciljajući domen
[0212] Antigen specifični ciljajući domen CAR daje sposobnost da se vezuje za ciljni antigen od interesa. Antigen specifični ciljajući domen poželjno cilja antigen od kliničkog interesa protiv koga bi bilo poželjno pokrenuti efektorski imunski odgovor koji dovodi do ubijanja tumora.
[0213] Antigen specifični ciljajući domen može biti bilo koji protein ili peptid koji ima sposobnost da specifično prepozna biološki molekul i da se za njega veže (npr. receptor na ćelijskoj površini ili protein tumora, ili komponenta prethodnog). Antigen specifični ciljajući domen obuhvata bilo kog prirodnog, sintetičkog, polusintetičkog ili rekombinantno proizvedenog vezujućeg partnera za biološki molekul od interesa.
[0214] Primeri za antigen specifične ciljajuće domene uključuju antitela ili fragmente ili derivate antitela, ekstracelularne domene receptora, ligande za molekule/receptore na ćelijskoj površini, ili njihove receptor vezujuće domene, i proteine koji vezuju tumor.
[0215] U jednom poželjnom otelotvorenju, antigen specifični ciljajući domen je antitelo ili je dobijen od njega. Ciljajući domen dobijen od antitela može biti fragment antitela ili genetski konstruisan proizvod jednog ili više fragmenata antitela, pri čemu taj fragment učestvuje u vezivanju sa antigenom. Primeri uključuju varijabilni region (Fv), region za određivanje komplementarnosti (CDR), Fab, jednolančano antitelo (scFv), varijabilni region teškog lanca (VH), varijabilni region lakog lanca (VL) i kamelidno antitelo (VHH).
[0216] U jednom poželjnom otelotvorenju, vezujući domen je jednolančano antitelo (scFv). scFv može biti mišji, humani ili humanizovani scFv.
[0217] „Region za određivanje komplementarnosti“ ili „CDR“, kada se odnosi na antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, označava veoma varijabilnu petlju u varijabilnom regionu teškog lanca ili lakog lanca antitela. CDR mogu da interaguju sa konformacijom antigena i u velikoj meri određuju vezivanje sa antigenom (iako je poznato da i neki regioni okvira učestvuju u vezivanju). Varijabilni region teškog lanca kao i varijabilni region lakog lanca obuhvataju 3 CDR-a.
[0218] „Varijabilni region teškog lanca“ ili „VH“ odnosi se na fragment teškog lanca antitela koji obuhvata tri CDR umetnuta između bočnih nizova koji su poznati kao regioni okvira, koji su očuvani u većoj meri u odnosu na CDR-ove i formiraju konstrukciju koja podržava CDR-ove.
[0219] „Varijabilni region lakog lanca“ ili „VL“ odnosi se na fragment lakog lanca antitela koji obuhvata tri CDR-a umetnuta između regiona okvira.
[0220] „Fv“ se odnosi na najmanji fragment antitela koji nosi kompletno mesto vezivanja antigena. Fv fragment se sastoji od varijabilnog regiona jednog lakog lanca koji je vezan za varijabilni region jednog teškog lanca.
[0221] „Jednolančano Fv antitelo“ ili „scFv“ odnosi se na konstruisano antitelo koje se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca i varijabilnog regiona teškog lanca koji su međusobno povezani neposredno ili preko sekvence peptidnog linkera.
[0222] Antitela koja specifično vezuju molekul na površini ćelije tumora mogu da se pripreme koristeći postupke koji su dobro poznati u struci. Takvi postupci uključuju displej faga, postupke za dobijanje humanih ili humanizovanih antitela, ili postupke koji koriste transgenu životinju ili biljku konstruisanu da proizvodi humana antitela. Biblioteke displeja faga delimično ili u potpunosti sintetičkih antitela su dostupne i mogu da se pretraže kako bi se našlo antitelo ili njegov fragment koji mogu da se vezuju za ciljni molekul. Takođe su dostupne biblioteke displeja faga za humana antitela. Nakon što je identifikovana, aminokiselinska sekvenca ili polinukleotidna sekvenca koja kodira antitelo može da se izoluje i/ili odredi.
[0223] Što se tiče ciljajućih domena koji ciljaju antigene kancera, odabir ciljajućeg domena će zavisiti od vrste kancera koji se leči, i može da cilja tumorske antigene. Uzorak tumora od ispitanika može da se okarakteriše na prisustvo određenih biomarkera ili markera na površini ćelije. Na primer, ćelije kancera dojke od ispitanika mogu biti pozitivne ili negativne na Her2Neu, estrogenski receptor i/ili progesteronski receptor. Bira se tumorski antigen ili molekul na površini ćelije koji je pronađen na tumorskim ćelijama pojedinačnog ispitanika. Poželjno, antigen specifični ciljajući domen cilja molekul na ćelijskoj površini koji se može naći na tumorskim ćelijama i suštinski se ne nalazi na normalnom tkivu, ili je njegova ekspresija ograničena na nevitalna normalna tkiva.
[0224] TAA koji može da se cilja putem CAR koji se koristi u predmetnom pronalasku uključuje, bez ograničenja, jedno ili više od karcinoembrionalnog antigena (CEA), estrogenskog receptora, progesteronskog receptora, efrinB2, ROR1, mezotelina, c-Met, GD-2, i MAGE A3 TCR, 4-1BB, antigena adenokarcinoma, alfa-fetoproteina, BAFF, ćelije B-limfoma, C242 antigena, karbonske anhidraze 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (IgE receptor), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNT0888, CTLA-4, DR5, EpCAM, CD3, ekstra domena fibronektina-B, receptora folata 1, glikoproteina 75, GPNMB, HGF, kinaze humanog receptora faktora rasipanja, IGF-1 receptora, IGF-I, IgGI, L1-CAM, IL-13, IL-6, receptora faktora rasta nalik insulinu I, integrina α5β1, integrina αvβ3, MORAb-009, MS4A1, mucina CanAg, N-glikolil neuraminske kiseline, NPC-1C, PDGF-Rα, PDL192, fosfatidil serina, ćelija karcinoma prostate, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, tenascina C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, tumorskog antigena CTAA16.88, vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentina, 5T4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1 (CDw52), HLA-DR, anti-idiotipa, TAG-72, Ep-CAM, MUC1, folat vezujućeg proteina, A33, G250, membranskog antigena specifičnog za prostatu, (PSMA), antigena specifičnog za prostatu (PSA), feritina, gangliozida (npr. GD2, GD3, GM2), Le<y>, CA-125, CA19-9, receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), p185HER2, IL-2 receptora, de2-7 EGFR, proteina aktivacije fibroblasta (FAP), tenascina, metaloproteinaza, endosijalina, karbonske anhidraze, galektina 9, aldolaze A, elFγ4, tirozinaze, galektina 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, restina, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-katenina/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) i DAM-10 (MAGE-B1), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MC1R, miozina/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NY-ESO-1, P15, p190 minor bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, proteina 1, gp75, TRP-2, TRP-2/INT2 ili WT1.
Kostimulatorni domen
[0225] CAR koji se koristi u predmetnom pronalasku takođe može da obuhvata jedan ili više kostimulatornih domena. Ovaj domen može da poveća ćelijsku proliferaciju, ćelijsko preživljavanje i razvoj memorijskih ćelija.
[0226] Svaki kostimulatorni domen obuhvata, na primer, kostimulatorni domen jednog ili više članova superfamilije TNFR, CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), DaplO, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 ili kombinacije prethodnog. Kostimulatorni domeni drugih proteina takođe mogu da se koriste sa CAR koji se koristi u predmetnom pronalasku. Dodatni kostimulatorni domeni će biti poznati stručnjacima za oblast.
Intracelularni signalni domen
[0227] CAR koji se koristi u predmetnom pronalasku takođe može da obuhvata intracelularni signalni domen. Ovaj domen može biti citoplazmatski i može da transdukuje signal efektorske funkcije i da usmeri ćeliju da vrši svoju specijalizovanu funkciju. Primeri za intracelularne signalne domene uključuju, bez ograničenja, ζ lanac T-ćelijskog receptora ili bilo kog od njegovih homologa (npr. η lanac, FcεR1γ i β lanac, MB1 (Igα) lanac, B29 (Igβ) lanac, itd.), CD3 polipeptide (Δ, δ and ε), syk familiju tirozinskih kinaza (Syk, ZAP 70, itd.), src familiju tirozinskih kinaza (Lck, Fyn, Lyn, itd.) i druge molekule koji učestvuju u T-ćelijskoj transdukciju, kao što su CD2, CD5 i CD28. Intracelularni signalni domen može biti zeta lanac humanog CD3, FcyRIII, FcsRI, citoplazmatski repovi Fc receptora, imunoreceptorski aktivacioni motiv na bazi tirozina (ITAM) koji ima citoplazmatske receptore ili kombinacije prethodnog.
Transmembranski domen
[0228] CAR koji se koristi u predmetnom pronalasku takođe može da obuhvata transmembranski domen. Transmembranski domen može da obuhvata transmembransku sekvencu bilo kog proteina koji ima transmembranski domen, uključujući bilo koje transmembranske proteine tipa I, tipa II ili tipa III. Transmembranski domen CAR koji se koristi u predmetnom pronalasku takođe može da obuhvata veštačku hidrofobnu sekvencu. Transmembranski domeni CAR koji se koriste u predmetnom pronalasku mogu biti izabrani tako da ne dolazi do njihove dimerizacije. Dodatni transmembranski domeni će biti poznati stručnjacima za oblast. Primeri za transmembranske (TM) regione koji se koriste u konstruktima CAR su: 1) CD28 TM region (Pule et al, Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Brentjens et al, CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Casucci et al, Blood, 2013, Nov 14;122(20):3461-72.); 2) OX40 TM region (Pule et al, Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41); 3) 41BB TM region (Brentjens et al, CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35); 4) CD3 zeta TM region (Pule et al, Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Savoldo B, Blood, 2009, Jun 18;113(25):6392-402.); 5) CD8a TM region (Maher et al, Nat Biotechnol, 2002, Jan;20(1):70-5.; Imai C, Leukemia, 2004, Apr;18(4):676-84; Brentjens et al, CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Milone et al, Mol Ther, 2009, Aug;17(8):1453-64.).
INHIBITOR IMUNSKE KONTROLNE TAČKE
[0229] Kao što se ovde koristi, termin inhibitor imunske kontrolne tačke se odnosi na molekul, jedinjenje, antitelo ili lek koji inhibiraju, blokiraju, sprečavaju, smanjuju ili nishodno regulišu ekspresiju inhibitornog molekula kontrolne tačke ili na drugi način antagonistički deluju na njega. Kada se eksprimira na ćelijskoj površini, inhibitorni molekul kontrolne tačke inhibira ili umanjuje T-ćelijski posredovan imunski odgovor na pomenutu ćeliju. Na primer, ekspresija inhibitornih molekula kontrolne tačke može da spreči da ćelija bude ubijena T-ćelijskim odgovorom. Ovaj mehanizam je naročito štetan kada ćelija kancera eksprimira inhibitorne molekule kontrolne tačke jer to može omogućiti ćeliji kancera da izbegne T-ćelijski odgovor domaćina. Shodno tome, kada su inhibitorni molekuli kontrolne tačke na tumorskim ćelijama inhibirani pomoću inhibitora imunske kontrolne tačke, očekuje se da će doći do pojačanog T-ćelijskog odgovora domaćina protiv tumorske ćelije.
[0230] U jednom otelotvorenju, inhibitor imunske kontrolne tačke inhibira inhibitorni molekul kontrolne tačke izabran iz grupe koja se sastoji od A2AR (receptor adenozina A2A), B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), BTLA (atenuator B i T limfocita; CD272), HVEM (medijator ulaska herpes virusa), CTLA-4 (protein povezan sa citotoksičnim T limfocitom 4; CD152), IDO (indolamin 2,3-dioksigenaza), TDO (triptofan 2,3-dioksigenaza), KIR (receptor ćelije ubice sličan imunoglobulinu), LAG3 (gen aktivacije limfocita-3), PD-1 (receptor programirane smrti 1), PD-L1 (PD-1 ligand 1), PD-L2 (PD-1 ligand 2), TIM-3 (T-ćelijski domen imunoglobulina i domen mucina 3), VISTA (V-domen Ig supresora T-ćelijske aktivacije), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86). Takođe mogu da se koriste kombinacije inhibitora kontrolne tačke.
[0231] U jednom otelotvorenju, inhibitor imunske kontrolne tačke je inhibitor PD-1; poželjno, inhibitor PD-1 je anti-PD-1 antitelo.
[0232] U drugom otelotvorenju, inhibitor imunske kontrolne tačke je inhibitor PD-L1; poželjno, inhibitor PD-L1 je anti-PD-L1 antitelo.
[0233] U drugom otelotvorenju, inhibitor imunske kontrolne tačke je inhibitor PD-L2, poželjno, inhibitor PD-L2 je anti-PD-L2 antitelo.
[0234] U drugom otelotvorenju, inhibitor imunske kontrolne tačke je inhibitor CTLA4, poželjno, inhibitor CTLA4 je anti-CTLA4 antitelo.
[0235] U drugom otelotvorenju, inhibitor imunske kontrolne tačke je inhibitor LAG-3; poželjno, inhibitor LAG-3 je anti-LAG-3 antitelo.
[0236] Kao što se ovde koristi, termin „antitelo“ se tumači kao polipeptid koji je suštinski kodiran genom imunoglobulina ili genima imunoglobulina, ili njihovim fragmentima, koji suštinski vezuje i prepoznaje antigen (npr. marker na površini ćelije). Kao što se ovde koristi, termin „antitelo“ se odnosi na ceo ili netaknut molekul antitela (npr. IgM, IgG (uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4), IgA, IgD ili IgE) ili bilo koji njegov antigen vezujući fragment.
[0237] Antitelo može biti poliklonsko antitelo ili monoklonsko antitelo. Monoklonska antitela proizvode identične imunske ćelije (npr. hibridomi koji mogu da se generišu fuzijom antitela koje proizvodi B-ćelijsku liniju i kancerske B-ćelijske linije). Monoklonsko antitelo koje je usmereno na određeni antigen će prepoznati jedan specifičan epitop na pomenutom antigenu. Nasuprot tome, poliklonska antitela se proizvode u više neidentičnih ćelijskih linija i stoga prepoznaju nekoliko različitih epitopa na određenom antigenu.
[0238] Antigen vezujući fragmenti antitela uključuju, npr. jednolančano antitelo, jednolančani Fv fragment (scFv), Fd fragment, Fab fragment, Fab' fragment, ili F(ab')2fragment. scFv fragment je jedan lanac polipeptida koji uključuje varijabilne regione teškog kao i lakog lanca antitela od koga je dobijen scFv. Pored toga, intratela, minitela, trijatela i dijatela (vidite, npr. Todorovska et al. (2001) J Immunol Methods 248(1):47-66; Hudson i Kortt (1999) J Immunol Methods 231(1):177-189; Poljak 25 (1994) Structure 2(12): 1121-1123; Rondon i Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 21:257-283, takođe su obuhvaćena definicijom antitela i kompatibilna su za upotrebu u postupcima koji su ovde opisani. Termin „antitelo“, kao što se ovde koristi, takođe uključuje fragmente antitela koji su proizvedeni modifikacijom celih antitela ili one koji su sintetisani de novo koristeći rekombinantne postupke.
[0239] Pogodni postupci za proizvodnju antitela ili njihovih antigen vezujućih fragmenata usmerenih na određeni antigen su poznati u struci (vidite, npr. Greenfield (2014) Antibodies: A Laboratory Manual, drugo izdanje 201-221).
VARIJANTE, DERIVATI, ANALOZI, HOMOLOZI I FRAGMENTI
[0240] Pored specifičnih proteina i polinukleotida koji su ovde pomenuti, predmetni pronalazak takođe uključuje upotrebu njihovih varijanti, derivata, analoga, homologa i fragmenata.
[0241] U kontekstu predmetnog pronalaska, varijanta bilo koje date sekvence je sekvenca u kojoj je specifična sekvenca ostataka (bilo ostataka aminokiselina ili nukleinskih kiselina) modifikovana na takav način da dotični polipeptid ili polinukleotid suštinski zadržava najmanje jednu svoju endogenu funkciju. Varijanta sekvence može da se dobije adicijom, delecijom, supstitucijom, modifikacijom, zamenom i/ili varijacijom najmanje jednog ostataka koji je prisutan u prirodnom proteinu.
[0242] Termin „derivat“, kao što se ovde koristi, u vezi sa proteinima ili polipeptidima iz predmetnog pronalaska uključuje bilo koju supstituciju, varijaciju, modifikaciju, zamenu, deleciju i/ili adiciju jednog aminokiselinskog ostatka sekvence (ili više njih), pod uslovom da dobijeni protein ili polipeptid suštinski zadržava najmanje jednu svoju endogenu funkciju.
[0243] Termin „analog“, kao što se ovde koristi, vezano za polipeptide ili polinukleotide uključuje bilo koji mimetik, to jest, hemijsko jedinjenje koje ima najmanje jednu od endogenih funkcija polipeptida ili polinukleotida koje oponaša.
[0244] Proteini koji se koriste u predmetnom pronalasku takođe mogu imati delecije, insercije ili supstitucije aminokiselinskih ostataka koje daju neprimetnu promenu i mogu dati funkcionalno isti protein. Planske aminokiselinske supstitucije mogu da se vrše na osnovu sličnosti polariteta, naelektrisanja, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti i/ili amfipatičke prirode ostataka sve dok se zadržava endogena funkcija. Na primer, negativno naelektrisane aminokiseline uključuju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu; pozitivno naelektrisane aminokiseline uključuju lizin i arginin; a aminokiseline sa nenaelektrisanim polarnim glavnim grupama koje imaju slične vrednosti hidrofilnosti uključuju asparagin, glutamin, serin, treonin i tirozin.
[0245] Supstitucija može da uključuje zamenu aminokiseline sličnom aminokiselinom (konzervativna supstitucija). Slična aminokiselina je ona koja ima ostatak bočnog lanca sa srodnim svojstvima na osnovu zajedničkog grupisanja, na primer kao što je prikazano ispod:
(i) bazni bočni lanci: lizin (K), arginin (R), histidin (H);
(ii) kiseli bočni lanci: asparaginska kiselina (D) i glutaminska kiselina (E);
(iii) nenaelektrisani polarni bočni lanci: asparagin (N), glutamin (Q), serin (S), treonin (T) i tirozin (Y); ili
(iv) nepolarni bočni lanci: glicin (G), alanin (A), valin (V), leucin (L), izoleucin (I), prolin (P), fenilalanin (F), metionin (M), triptofan (W) i cistein (C).
[0246] Varijante sekvenci mogu da obuhvataju aminokiselinske supstitucije, adicije, delecije i/ili insercije.
[0247] Mogu da se načine konzervativne supstitucije, adicije ili delecije, na primer, u skladu sa tabelom datom ispod. Aminokiseline u istom bloku u drugoj koloni i poželjno u istom redu u trećoj koloni mogu se međusobno supstituisati:
[0248] Predmetni pronalazak takođe obuhvata homologne supstitucije (supstitucija i zamena se ovde koriste da označe zamenu postojećeg aminokiselinskog ostatka alternativnim ostatkom), npr. ekvivalentnu supstituciju kao što je bazna za baznu, kisela za kiselu, polarna za polarnu, itd. Takođe mogu da se vrše nehomologne supstitucije, npr. iz jedne klase ostatka u drugu ili alternativno koje uključuju uvođenje neprirodnih aminokiselina, kao što je ornitin.
[0249] Termin „varijanta“, kao što se ovde koristi, može da označava entitet koji ima određenu homologiju sa aminokiselinskom sekvencom divljeg tipa ili sa nukleotidnom sekvencom divljeg tipa. Termin „homologija“ može da se poistoveti sa terminom „identičnost“.
[0250] Varijanta sekvence može da uključuje aminokiselinsku sekvencu koja može biti najmanje 50%, 55%, 65%, 75%, 85% ili 90% identična, poželjno najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična predmetnoj sekvenci. Varijante će obično obuhvatati ista aktivna mesta, itd. kao i predmetna aminokiselinska sekvenca. Iako homologija takođe može da se posmatra u pogledu sličnosti (tj. aminokiselinski ostaci koji imaju slična hemijska svojstva/funkcije), u kontekstu predmetnog pronalaska poželjno je da se homologija izražava u vidu identičnosti sekvence.
[0251] Varijanta sekvence može da uključuje nukleotidnu sekvencu koja može biti najmanje 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 75%, 85% ili 90% identična, poželjno najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identična predmetnoj sekvenci. Iako homologija takođe može da se posmatra u pogledu sličnosti, u kontekstu predmetnog pronalaska poželjno je da se homologija izražava u vidu identičnosti sekvence.
[0252] Poželjno, upućivanje na sekvencu koja ima procenat identičnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO prikazanih ovde odnosi se na sekvencu koja ima navedeni procenat identičnosti celom dužinom SEQ ID NO na koji se upućuje.
[0253] Poređenje identičnosti može da se vrši golim okom, ili, što je češće slučaj, uz pomoć dostupnih programa za poređenje sekvenci. Ovi komercijalno dostupni računarski programi mogu da izračunaju procenat homologije ili identičnosti između dve ili više sekvenci.
[0254] Procenat homologije može da se izračuna za neprekinute sekvence, tj. jedna sekvenca se poravnava sa drugom sekvencom i svaka aminokiselina u jednoj sekvenci se neposredno poredi sa odgovarajućom aminokiselinom u drugoj sekvenci, jedan po jedan ostatak. Ovo se naziva poravnavanje „bez uvođenja praznina“. Takva poravnavanja bez uvođenja praznina se obično vrše samo za relativno mali broj ostataka.
[0255] Iako ovo predstavlja veoma jednostavan i dosledan postupak, ne uzima u obzir da, na primer, u paru sekvenci koji je inače identičan, jedna insercija ili delecija u nukleotidnoj sekvenci može dovesti do toga da sledeći kodoni ne budu poravnati, što potencijalno dovodi do velikog smanjenja procenta homologije kada se vrši opšte poravnavanje. Usled toga, većina postupaka za poređenje sekvenci je osmišljena da obezbede optimalno poravnavanje koje uzima u obzir moguće insercije i delecije bez nepotrebnih penala za ocenu ukupne homologije. Ovo se postiže insercijom „praznina“ u poravnavanje sekvence kako bi se lokalna homologija dovela na najviši mogući nivo.
[0256] Međutim, ovi složeniji postupci dodeljuju „penale za praznine“ za svaku prazninu koja se javlja u poravnjavanju tako da za isti broj identičnih aminokiselina, poravnavanje sekvenci sa što manje praznina, što ukazuje na veću povezanost između dve sekvence koje se porede, dobija veću ocenu nego poravnavanje sa mnogo praznina. Obično se koriste „afine cene praznine“ koje nameću relativno visoku cenu za postojanje praznine i manju kaznu za svaki sledeći ostatak u praznini. Ovo je sistem za ocenjivanje praznina koji se najčešće koristi. Visoki penali za praznine će naravno dati optimizovana poravnavanja sa manje praznina. Većina programa za poravnavanje omogućava da se penali za praznine modifikuju. Međutim, poželjno je da se koriste podrazumevane vrednosti kada se takav softver koristi za poređenje sekvenci. Na primer, kada se koristi paket GCG Wisconsin Bestfit, podrazumevani penal za prazninu za aminokiselinske sekvence je -12 za prazninu i -4 za svako produženje.
[0257] Za izračunavanje maksimalnog procenta homologije stoga je prvo neophodno dobijanje optimalnog poravnavanja, imajući u vidu penale za praznine. Odgovarajući računarski program za vršenje takvog poravnavanja je paket GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, SAD; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res.12: 387). Primeri za druge softvere koji mogu da vrše poređenje sekvenci uključuju, bez ograničenja, paket BLAST (vidite Ausubel et al. (1999) ibid - pog.18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) i GENEWORKS paket alata za poređenje. BLAST i FASTA su dostupni za oflajn i onlajn pretraživanje (vidite Ausubel et al. (1999) ibid, strane 7-58 do 7-60). Međutim, za neke primene, poželjno je da se koristi program GCG Bestfit. Još jedan alat koji se naziva BLAST 2 Sequences takođe je dostupan za poređenje proteinskih i nukleotidnih sekvenci (vidite FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8).
[0258] Iako konačni procenat homologije može da se izmeri u pogledu identičnosti, sam proces poravnavanja se obično ne zasniva na poređenju parova „sve ili ništa“. Umesto toga, obično se koristi matrica skalirane ocene sličnosti koja dodeljuje ocene za poređenje svakog para na osnovu hemijske sličnosti ili evolutivne udaljenosti. Jedan primer za takvu matricu koji se uobičajeno koristi je matrica BLOSUM62 - podrazumevana matrica za paket programa BLAST. Programi GCG Wisconsin generalno koriste javne podrazumevane vrednosti ili prilagođenu tabelu poređenja simbola ako je dostupna (za više informacija vidite korisnički priručnik). Za neke primene, poželjno je da se koriste javne zadate vrednosti za paket GCG, ili u slučaju drugog softvera, podrazumevana matrica, kao što je BLOSUM62.
[0259] Kada softver proizvede optimalno poravnavanje, moguće je izračunati procenat homologije, poželjno procenat identičnosti sekvence. Softver to obično obavlja u okviru poređenja sekvenci i daje numerički rezultat.
[0260] „Fragmenti“ su takođe varijante i termin se obično odnosi na izabrani region polipeptida ili polinukleotida koji je od interesa u pogledu funkcije ili, na primer, u testu. „Fragment“ se tako odnosi na sekvencu aminokiseline ili nukleinske kiseline koja je deo polipeptida ili polinukleotida kompletne dužine.
[0261] Takve varijante mogu da se pripreme koristeći standardne tehnike rekombinantne DNK, kao što je mutageneza usmerena na mesto. Kada treba da se izvrše insercije, može da se napravi sintetička DNK koja kodira inserciju zajedno sa 5' i 3' bočnim regionima koji odgovaraju prirodnoj sekvenci koja se nalazi sa obe strane insercije. Bočni regioni će obuhvatati pogodna mesta restrikcije koja odgovaraju mestima u prirodnoj sekvenci tako da sekvenca može da se preseče odgovarajućim enzimom (ili enzimima) i sintetička DNK se ligira u presek. DNK se zatim eksprimira u skladu sa pronalaskom kako bi se napravio kodirani protein. Ovi postupci su samo primer brojnih standardnih tehnika koje su poznate u struci za obradu sekvenci DNK i mogu da se koriste i druge poznate tehnike.
KOMBINACIJA
[0262] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa T-ćelijom specifičnom za TAA. U nekim otelotvorenjima, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti se dalje koriste u kombinaciji sa inhibitorom imunske kontrolne tačke.
[0263] Alternativno, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa T-ćelijom specifičnom za TAA koja eksprimira CAR. U nekim otelotvorenjima, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti se dalje koriste u kombinaciji sa inhibitorom imunske kontrolne tačke.
[0264] Alternativno, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa T-ćelijom specifičnom za TAA koja eksprimira transgeni TCR. U nekim otelotvorenjima, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti se dalje koriste u kombinaciji sa inhibitorom imunske kontrolne tačke.
[0265] Kao što se ovde koristi, fraza „koristi se u kombinaciji sa“ obuhvata primenu HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređenih progenitornih ćelija, makrofaga ili monocita iz predmetnog pronalaska sekvencijalno, zasebno ili istovremeno sa inhibitorom imunske kontrolne tačke i/ili T-ćelijom specifičnom za TAA.
[0266] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju najmanje 5 minuta, najmanje 10 minuta, najmanje 15 minuta, najmanje 30 minuta, najmanje 45 minuta, najmanje 60 minuta pre T-ćelije specifične za TAA i/ili inhibitora imunske kontrolne tačke.
[0267] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju najmanje 1 sat, najmanje 2 sata, najmanje 3 sata, najmanje 4 sata, najmanje 5 sati, najmanje 6 sati, najmanje 12 sati, najmanje 24 sata, najmanje 48 sati, najmanje 72 sata pre T-ćelije specifične za TAA i/ili inhibitora imunske kontrolne tačke.
[0268] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju najmanje jedan dan, najmanje dva dana, najmanje tri dana, najmanje četiri dana, najmanje pet dana, najmanje šest dana, najmanje sedam dana ili najmanje 14 dana pre T-ćelije specifične za TAA i/ili inhibitora imunske kontrolne tačke.
[0269] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju najmanje jednu nedelju, najmanje dve nedelje, najmanje tri nedelje, najmanje četiri nedelje, najmanje pet nedelja, najmanje šest nedelja, najmanje sedam nedelja, najmanje osam nedelja, najmanje devet nedelja, najmanje 10 nedelja, najmanje 11 nedelja ili najmanje 12 nedelja pre T-ćelije specifične za TAA i/ili inhibitora imunske kontrolne tačke.
[0270] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju najmanje jedan mesec, najmanje dva meseca, najmanje tri meseca, najmanje četiri meseca, najmanje pet meseci, najmanje šest meseci, najmanje sedam meseci, najmanje osam meseci, najmanje devet meseci, najmanje 10 meseci, najmanje 11 meseci, ili najmanje 12 meseci pre T-ćelije specifične za TAA i/ili inhibitora imunske kontrolne tačke.
[0271] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju najmanje jedan mesec, najmanje dva meseca, najmanje tri meseca, najmanje četiri meseca, najmanje pet meseci, najmanje šest meseci, najmanje sedam meseci, najmanje osam meseci, najmanje devet meseci, najmanje 10 meseci, najmanje 11 meseci, ili najmanje 12 meseci pre T-ćelije specifične za TAA i/ili inhibitora imunske kontrolne tačke.
[0272] Kao što se ovde koristi, fraza „koristi se u kombinaciji sa“ obuhvata primenu HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređenih progenitornih ćelija, makrofaga ili monocita iz predmetnog pronalaska sekvencijalno, zasebno ili istovremeno sa 1-metil-triptofanom (1-MT).
[0273] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju najmanje 5 minuta, najmanje 10 minuta, najmanje 15 minuta, najmanje 30 minuta, najmanje 45 minuta, najmanje 60 minuta pre 1-metil-triptofana (1-MT).
[0274] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju najmanje 1 sat, najmanje 2 sata, najmanje 3 sata, najmanje 4 sata, najmanje 5 sati, najmanje 6 sati, najmanje 12 sati, najmanje 24 sata, najmanje 48 sati, najmanje 72 sata pre 1-metil-triptofana (1-MT).
[0275] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju najmanje jedan dan, najmanje dva dana, najmanje tri dana, najmanje četiri dana, najmanje pet dana, najmanje šest dana, najmanje sedam dana ili najmanje 14 dana pre 1-metil-triptofana (1-MT).
[0276] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju najmanje jednu nedelju, najmanje dve nedelje, najmanje tri nedelje, najmanje četiri nedelje, najmanje pet nedelja, najmanje šest nedelja, najmanje sedam nedelja, najmanje osam nedelja, najmanje devet nedelja, najmanje 10 nedelja, najmanje 11 nedelja ili najmanje 12 nedelja pre 1-metil-triptofana (1-MT).
[0277] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju najmanje jedan mesec, najmanje dva meseca, najmanje tri meseca, najmanje četiri meseca, najmanje pet meseci, najmanje šest meseci, najmanje sedam meseci, najmanje osam meseci, najmanje devet meseci, najmanje 10 meseci, najmanje 11 meseci, ili najmanje 12 meseci pre 1-metil-triptofana (1-MT).
[0278] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi ili monociti iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju najmanje jedan mesec, najmanje dva meseca, najmanje tri meseca, najmanje četiri meseca, najmanje pet meseci, najmanje šest meseci, najmanje sedam meseci, najmanje osam meseci, najmanje devet meseci, najmanje 10 meseci, najmanje 11 meseci, ili najmanje 12 meseci pre 1-metil-triptofana (1-MT).
FARMACEUTSKA KOMPOZICIJA
[0279] HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređene progenitorne ćelije, makrofagi, monociti inhibitori imunske kontrolne tačke, T-ćelije specifične za TAA, vektori, 1-metiltriptofan (1-MT) i njihove kombinacije za upotrebu prema predmetnom pronalasku mogu da se formulišu sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijensom.
PACIJENT
[0280] Pacijent može biti ljudski pacijent. Pacijent može biti životinja koja nije čovek.
[0281] Pacijent može bolovati od kancera. Alternativno, pacijent može biti pod rizikom od nastanka kancera.
[0282] Za pacijenta može prethodno biti utvrđeno da je pod rizikom od nastanka kancera. Povećani rizik može biti utvrđen putem genetskog skrininga i/ili pregledanjem pacijentove porodične istorije. Za pacijenta može biti utvrđeno da eksprimira jedan ili više genetskih markera koji ukazuju na povećani rizik od nastanka kancera.
[0283] Pogodno, stručnjak za oblast će biti svestan genetskih faktora rizika (npr. genetski markeri) koji su povezani sa povećanim rizikom od nastanka kancera. Stručnjak može da koristi bilo koji odgovarajući postupak ili tehniku poznate u struci da utvrdi da li kod ispitanika postoji povećani rizik od nastanka kancera.
[0284] Ispitanik može biti onaj koji je prethodno lečen od kancera. Kod ispitanika može postojati remisija kancera. Ispitanik može biti rezistentan na hemoterapiju.
[0285] U nekim aspektima predmetnog pronalaska, na pacijentu su prethodno primenjivani hematopoetska matična ćelija (HSC), hematopoetska progenitorna ćelija (HPC), mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit iz pronalaska pre primene T-ćelije specifične za TAA i/ili inhibitora imunske kontrolne tačke.
[0286] U jednom otelotvorenju, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit iz predmetnog pronalaska se primenjuju na pacijentu najmanje 6 sati, najmanje 12 sati, najmanje 24 sata, najmanje 48 sati, najmanje 72 sata pre primene T-ćelije specifične za TAA i/ili inhibitora imunske kontrolne tačke.
[0287] U jednom otelotvorenju, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit iz predmetnog pronalaska se primenjuju na pacijentu najmanje jedan dan, najmanje dva dana, najmanje tri dana, najmanje četiri dana, najmanje pet dana, najmanje šest dana, najmanje sedam dana ili najmanje 14 dana pre primene T-ćelije specifične za TAA i/ili inhibitora imunske kontrolne tačke.
[0288] U jednom otelotvorenju, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit iz predmetnog pronalaska se primenjuju na pacijentu najmanje jednu nedelju, najmanje dve nedelje, najmanje tri nedelje, najmanje četiri nedelje, najmanje pet nedelja, najmanje šest nedelja, najmanje sedam nedelja, najmanje osam nedelja, najmanje devet nedelja, najmanje 10 nedelja, najmanje 11 nedelja ili najmanje 12 nedelja pre primene T-ćelije specifične za TAA i/ili inhibitora imunske kontrolne tačke.
[0289] U jednom otelotvorenju, HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit iz predmetnog pronalaska se primenjuju na pacijentu najmanje jedan mesec, najmanje dva meseca, najmanje tri meseca, najmanje četiri meseca, najmanje pet meseci, najmanje šest meseci, najmanje sedam meseci, najmanje osam meseci, najmanje devet meseci, najmanje 10 meseci, najmanje 11 meseci, ili najmanje 12 meseci pre T-ćelije specifične za TAA i/ili inhibitora imunske kontrolne tačke.
[0290] Na pacijentu prethodno mogu biti primenjivani hematopoetska matična ćelija (HSC), hematopoetska progenitorna ćelija (HPC), mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit iz pronalaska pre primene 1-metil-triptofana (1-MT). HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju na pacijentu najmanje 6 sati, najmanje 12 sati, najmanje 24 sata, najmanje 48 sati, najmanje 72 sata pre primene 1-metil-triptofana (1-MT). HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju na pacijentu najmanje jedan dan, najmanje dva dana, najmanje tri dana, najmanje četiri dana, najmanje pet dana, najmanje šest dana, najmanje sedam dana ili najmanje 14 dana pre primene 1-metil-triptofana (1-MT). HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju na pacijentu najmanje jednu nedelju, najmanje dve nedelje, najmanje tri nedelje, najmanje četiri nedelje, najmanje pet nedelja, najmanje šest nedelja, najmanje sedam nedelja, najmanje osam nedelja, najmanje devet nedelja, najmanje 10 nedelja, najmanje 11 nedelja ili najmanje 12 nedelja pre primene 1-metil-triptofana (1-MT). HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit iz predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju na pacijentu najmanje jedan mesec, najmanje dva meseca, najmanje tri meseca, najmanje četiri meseca, najmanje pet meseci, najmanje šest meseci, najmanje sedam meseci, najmanje osam meseci, najmanje devet meseci, najmanje 10 meseci, najmanje 11 meseci ili najmanje 12 meseci pre primene 1-metil-triptofana (1-MT). Lečenje ljudi i životinja je obuhvaćeno opsegom predmetnog pronalaska.
[0291] Termini „koji obuhvata“, „obuhvata“ i „sastoji se od“, kao što se ovde koriste, sinonimi su sa „koji uključuje“ ili „uključuje“ ili „koji sadrži“ ili „sadrži“, i inkluzivni su i otvoreni i ne isključuju dodatne nenavedene članove, elemente ili korake. Termini „koji obuhvata“, „obuhvata“ i „sastoji se od“ takođe uključuju termin „sačinjen je od“.
[0292] Praktikovanje predmetnog pronalaska će obuhvatati, ako nije drugačije naznačeno, uobičajene tehnike ćelijske biologije, molekularne biologije, histologije, imunologije, onkologije, koje su poznate osobi sa uobičajenim znanjem i veštinama u oblasti. Takve tehnike su objašnjene u literaturi.
[0293] Vidite, na primer, Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 i povremene dopune) Current Protocols in Molecular Biology, pog. 9, 13 i 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. i Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing:
Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. i McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; i Lilley, D.M. i Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press.
[0294] Različite poželjne osobine i otelotvorenja predmetnog pronalaska će sada biti opisane pomoću neograničavajućih primera.
PRIMERI
Primer 1 - IFNα ciljan na tumor pojačava T-ćelijski posredovane antitumorske odgovore na modelu ALL
[0295] C57BI/6 miševima smo transplantirali HSC koje su transdukovane sa mTie2-IFN-mirT LV (IFN miševi) ili mTie2-GFP-mirT LV ili lažno transdukovane (oba se koriste kao kontrolni miševi), radi ciljanja ekspresije INF/GFP za diferencirano TIE2+ potomstvo monocita, koje je veoma obogaćeno kod tumora<15,16>. Kao što je prethodno prikazano, rekonstitucija sa mTie2-IFN-mirT LV transdukovanim ćelijama daje funkcionalni višelinijski graft, bez izraženih neželjenih dejstava<8-10>. Zatim smo rekonstituisane miševe izazvali pomoću našeg prethodno opisanog modela B-ALL (sl.1a) i otkrili smo inhibiciju rasta leukemije kod IFN miševa u odnosu na kontrolne miševe (Sl.1b,c). Primena anti-CTLA4 blokirajućeg antitela (aCTLA4) nije imala dejstvo kod kontrolnih miševa ali je dalje značajno poboljšala inhibiciju ALL kod IFN miševa, što ukazuje na imunski doprinos uočenom odgovoru kod IFN miševa. Kombinacija IFN genske terapije i αCTLA4 je značajno poboljšala preživljavanje miševa (Slika 21). Kako bi se ispitalo indukovanje antitumorskog imuniteta, konstruisali smo ALL ćelije sa lentivirusnim vektorom (LV) koje omogućavaju koordinatnu ekspresiju antigena modela ovalbumina (OVA) i markera na ćelijskog površini skraćenog oblika receptora faktora rasta nerava (NGFR) iz dvosmernog promotera (OVA-ALL, sl.5a,b).
[0296] Kada se injektuje u imunokompetentne C57BI/6 miševe, OVA-ALL pokazuje sporiju kinetiku rasta i odloženo javljanje kod frakcije miševa u poređenju sa matičnim ALL.
Prilikom nekropsije, svi miševi su pokazali opsežnu infiltraciju BM od strane ALL ćelija, uz rast NGFR negativnih blasta kod miševa sa odloženom bolešću (Sl.5c,d). Kada su OVA ALL ćelije injektovane u imunodeficitarne NOD-SCID-IL2Rg-/- (NSG) miševe uočili smo uporediv rast tumora kao za matične ćelije i nije bilo gubitka ekspresije NGFR (Sl.5c,e). Ovi rezultati zajedno ukazuju na povećanu imunogenost OVA-ALL varijante koja dovodi do imunske izmene i odabira netransdukovanih ili utišanih (OVA/NGFR negativnih) ALL klonova koji su verovatno prisutni u proizvodu za infuziju. Međutim, nijedan miš nije preživeo nijedan od ova dva izazova. Zato smo testirali sposobnost IFN ćelije ciljane na tumor i isporuke na osnovu gena da pojača antitumorski imunski odgovor na OVA-ALL. Dok se
[0297] ALL rapidno širila kod kontrolnih miševa (Sl.1d-f), došlo je do odloženog javljanja i akumulacije blasta u krvi, i smanjene infiltracije u BM i slezinu IFN miševa. Treba napomenuti da je samo frakcija IFN miševa pokazala odsustvo leukemije u svim analiziranim organima.
[0298] In vitro stimulisane prečišćene CD8+ T-ćelije slezine IFN miševa su pokazale indukciju specifičnog odgovora na OVA na osnovu g-IFN-ELISPOT, uz rastući broj ćelija sa odgovorom kod miševa koji pokazuju najmanje opterećenje tumorom (Sl.1g). OVAspecifične CD8+ T-ćelije su detektovane bojenjem OVA257-264-H-2Kb -pentamerom kod IFN kao i kontrolnih miševa, uz veće procente i brojeve u krvi i BM prve grupe (Sl.1h-j i Sl.
6a).
[0299] Štaviše, CD8+ T-ćelije kontrolnih miševa nisu oslobađale IFN-g nakon ex-vivo ponovne stimulacije sa OVA, kao što je bio slučaj sa T-ćelijama IFN miševa (Sl.1k), što ukazuje na disfunkciju, u skladu sa izostankom inhibicije tumora kod kontrolnih miševa u odnosu na IFN miševe (Sl.6b-d). Iznenađujuće je otkriveno da iscrpljivanje CD8+ T-ćelija kod IFN miševa ukida antitumorski odgovor (Sl.1l,m). Sveukupno, ovi rezultati ukazuju na indukciju CTL koja može dovesti do delotvornog odgovora na tumorski neo-antigen kod IFN miševa.
[0300] Takođe smo primetili prvobitno manje opterećenje tumorom kod IFN miševa kojima je iscrpljen CD8 u poređenju sa kontrolom, što ukazuje da dodatni mehanizmi osim CD8 posredovane kontrole mogu doprineti, barem inicijalno i privremeno, inhibiciji tumora (Sl.
6e). Iako nije bilo razlike u frakciji apoptotskih ćelija i raspodeli ćelijskog ciklusa ALL ćelija BM i slezine između IFN i kontrolnih miševa (Sl.7a-d), stopa proliferacije, izmerena putem inkorporacije EdU, bila je niža u BM, ali ne i u slezini, IFN miševa (Sl.7e,f). Odlaganje proliferacije, koje potencijalno direktno može biti izazvano putem IFN, može pogodovati akumulaciji CTL specifičnog za tumor na delotvornom efektoru do ciljnog odnosa radi potiskivanja rasta ćelija tumora.
Primer 2 - Adaptivno transferovane OT-I T-ćelije se samo ekspanduju i sadrže leukemiju kod IFN miševa
[0301] Da bismo ispitali uticaj IFN tipa I na regrutaciju i aktivaciju T-ćelija, adaptivno smo transferovali naivne transgene OVA-specifične T-ćelije (OT-I) u IFN i kontrolne miševe (Sl.
2a). Prilagodili smo vreme infuzije između 2 grupe radi infuzije OT-I ćelija sa uporedivim opterećenjem leukemijom (Sl.2b i Sl.8a) i analizirali smo miševe 3 dana kasnije. Uočili smo značajno veće brojeve OT-I ćelija u slezini i BM IFN miševa u poređenju sa kontrolnim miševima kojima je injektovana leukemija, kod kojih su OT-I ćelije izolovane u manjem broju, slično kao kod kontrola bez tumora (Sl.2c). Citofluorimetrijska analiza je pokazala da je većina OT-I ćelija ushodno regulisala aktivirajući receptor LAG3, i stekla fenotip centralne memorije ili efektorske memorije, kod IFN i kontrolnih miševa sa leukemijom, uz povećanu aktivaciju u prvoj grupi.
[0302] Ova otkrića su bila radikalno suprotna kontrolnim miševima bez tumora, kod kojih su OT-I ćelije zadržale naivni fenotip sakupljenih ćelija (Sl.2d i SL.8b-d). Opterećenje leukemijom je značajno smanjeno kod IFN u poređenju sa kontrolnim miševima već ubrzo nakon adaptivnog T-ćelijskog transfera (Sl.8e). Dok su skoro sve ćelije leukemije kontrolnih miševa eksprimirale NGFR marker, postojala je rastuća frakcija NGFR negativnih ćelija kod IFN miševa, što ukazuje na selektivni pritisak na OVA-ALL (Sl.8f).
[0303] Ispitali smo sinergiju IFN ćelijske terapije i adaptivnog transfera OT-I T-ćelija u pospešivanju preživljavanja (Sl.2e). Dok je infuzija OT-I T-ćelija dovela do preživljavanja 20% miševa u odnosu na nijednog preživelog u kontrolnoj grupi, kombinovano lečenje je značajno poboljšalo preživljavanje na 67% (Sl.2f). Longitudinalna analiza IFN OT-I miševa pokazala je ekspanziju OT-I, sa pikom 6 dana nakon infuzije, koju prati prolazna ushodna regulacija LAG3 i klirens OVA-ALL (Sl.2g,h i Sl.9a). Treba napomenuti da su IFN OT-I miševi koji su podlegli bolesti (prikazani crnom bojom na Sl.2g,h i Sl.9a) pokazali rast NGFR negativnih ALL ćelija u krv i BM, što potvrđuje da su ćelije leukemije koje eksprimiraju OVA istrebljene pomoću infuziranih OT-I ćelija (Sl.9a,c). Nasuprot tome, OT-I ćelije kod većine kontrolnih miševa nisu se ekspandovale i pokazuju konstitutivne visoke nivoe ekspresije LAG3, što je znak iscrpljivanja T-ćelija (Sl.2g,h). Dakle, infuzirane OT-I ćelije nisu uspele da istrebe B-ALL ćelije koje eksprimiraju OVA kod ovih miševa, što se može videti na osnovu inicijalnog, ali prolaznog smanjenja ćelija leukemije koje eksprimiraju NGFR u krvotoku, nakon čega sledi njihov rast u krvi i BM (Sl.9b,d).
[0304] Prilikom nekropsije, mada je dobar deo OT-I T-ćelija u BM, slezini i limfnim čvorovima IFN OT-I miševa ostao u obliku objedinjenih memorijskih ćelija i nishodno je regulisao PD1 inhibitorni marker, veći deo OT-I T-ćelija kod CTRL OT-I miševa je imao osobine iscrpljenih efektorskih ćelija, pošto su sve eksprimirale PD1 marker (Sl.9e,f). Kao što je očekivano, OT-I T-ćelije infuzirane u kontrolne miševe bez injekcije tumora nisu se ekspandovale i nisu ushodno regulisale ekspresiju Lag3 (Sl.2g,h). Sveukupno, ovi podaci pokazuju da, mada su OT-I ćelije prošle robusnu aktivaciju i ekspanziju u IFN miševima, što je dovelo do klirensa tumora, ove ćelije su bile hipofunkcionalne kod kontrolnih miševa, nisu uspele da se ekspanduju i pokazale su fenotipske dokaze o iscrpljenosti.
Primer 3 - Prajmovan imunski genski potpis za M1 i Th1 odgovore kod IFN miševa; i IFN genska terapija odlaže promene u mikrookruženju tumora (TME) indukovane leukemijom i dovodi do imunostimulatornog programa
[0305] Kako bismo proučili da li strategija isporučivanja IFN gena menja mikrookruženje leukemije tako da pogoduje indukciji delotvornih imunskih odgovora, obavili smo višestruko merenje ekspresije gena na panelu 750 gena koji se koristi za imunsko profilisanje kancera na slezini i BM kontrolnih i IFN miševa, pre izazova leukemijom i nakon njega. Skoro svi značajno ushodno regulisani geni u tkivima IFN u odnosu na kontrolne miševe su bili IFN stimulisani geni (ISG), a u slezini aktivacija T-ćelija, obrada antigena, aktivacija makrofaga/DC, aktivacija NK i uređeni imunski geni potvrđuju da je naše lečenje dovelo do potpisa odgovora IFN / Th1 u ovim tkivima. Ove promene su ostale uočljive nakon tumorskog izazova i bile su praćene nishodnom regulacijom gena povezanih sa leukemijom (Sl. 3a). Zatim smo dodali prečišćene CD4+ T-ćelije slezine kako bismo ispitali odabrane gene, i pokazali značajnu ushodnu regulaciju Tbx21, koji kodira TBET faktor transkripcije Th1, i izostanak promena prototipnih Th2 i Treg gena u IFN u odnosu na kontrolne miševe sa tumorom. Takođe smo uočili ushodnu regulaciju gena II17 kod IFN miševa, ali ova promena nije praćena ushodnom regulacijom drugih prototipnih gena II22 i Rorc Th17 (Sl.3b i Sl. 10a).
[0306] Zatim smo okarakterisali fenotip mijeloidnih ćelija u krvi, slezini i BM. Otkrili smo povećani procenat klasičnih (Ly6C+Ly6Glow) i smanjen procenat neklasičnih (Ly6C-Ly6G-) monocita u krvi IFN u odnosu na kontrolne miševe, a te razlike su zatim dalje povećane nakon izazova leukemijom (Sl.3c i Sl.11a). Takođe smo otkrili porast granulocita u cirkulaciji (Ly6Cint Ly6G+) IFN miševa. Rast leukemije u slezini kontrolnih miševa je praćen ekspanzijom nezrelih mijeloidnih ćelija (CD11cint MHCII-F4/80-) i povećanim procentom MHC-II negativnih M2 makrofaga, dok nijedna od ovih promena nije viđena kod IFN miševa (Sl.11b-d). Promene povezane sa leukemijom su takođe odsutne u mijeloidnim ćelijama BM IFN miševa, gde se umesto toga može videti porast DC i frakcije DC koje prezentuju imunodominantan OVA257-264peptid na MHC-I (Sl.12a,b i Slika 18). Slično tome, promene NK i NKT ćelija koje se mogu videti u slezini i BM miševa sa leukemijom, uključujući smanjenu ekspresiju aktivirajućeg NKG2D receptora, nisu prisutne kod IFN miševa (Sl. 13a-e).
[0307] Analiza RNK-sekvenciranjem (RNK-Seq) pokazala je leukemijom indukovane transkripcione promene u makrofagima, koje su suštinski otklonjene putem IFN genske terapije (Slika 22a,b). Makrofagi slezine ALL miševa u odnosu na kontrolne miševe su ushodno regulisali gene koji kodiraju imunosupresivni citokin IL-10, inhibitornu imunsku kontrolnu tačku PD-1 kao i gene koji su povezani sa ćelijskom deobom i odgovorom na termine genske ontologije (GO) imunskih stimulusa. Nishodno regulisani geni su obogaćeni u GO terminima koji se odnose na metabolizam masnih kiselina, aktivaciju leukocita i prezentaciju antigena (Slika 19a,c). IFN genska terapija kod ALL miševa izazvala je imunostimulatorni program okarakterisan ushodnom regulacijom IFN stimulisanih gena (ISG) koji su obogaćeni u pogledu odbrambenog odgovora, migracije leukocita i odgovora na GO termine interferona, i ukinula je leukemijom indukovanu ushodnu regulaciju II10 i nishodnu regulaciju MHC II gena (Slika 19b-d). IFN genska terapija kod ALL miševa je indukovala ISG na nivoima koji su viši od onih koji su indukovani kod kontrola (Slika 19d i Slika 22a) i transkriptomi makrofaga kontrolnih i IFN miševa bez tumora pokazuju veliku korelaciju, pri čemu se izrazito razlikuju od ALL i IFN+ALL grupa (Slika 22b). Ovi podaci potvrđuju i dopunjavaju prethodne izveštaje da naša monocitno posredovana genska terapija preferencijalno cilja IFN u odnosu na TME (De Palma, M. et al. (2008) Cancer Cell 14: 299-311; Escobar, G. et al. (2014) Sci. Transl. Med.6: 217ra3; Catarinella, M. et al. (2016) EMBO Mol. Med.8: 155-170).
[0308] Kako bi se uticaj leukemije i IFN genske terapije na TME objektivnije ispitao, obavili smo jednoćelijsku (sc)RNK-Seq na CD11b+ ćelijama koje su izolovane iz slezine kontrolnih miševa i miševa sa tumorom, koji jesu ili nisu lečeni IFN genskom terapijom. Koristeći pristup na bazi kapljice (Zheng, G.X. et al. (2017) Nat. Commun. 8: 14049), generisali smo podatke scRNK-Seq od 10.821 ćelije, uz detekciju prosečno 1.338 gena/ćeliji. Grupisanjem na bazi grafikona i analizama genskih potpisa koristeći objavljene skupove podataka (Lavin, Y. et al. (2014) Cell 159: 1312-1326; Varol, D. et al. (2017) Immunity 46: 1030-1044;
ImmGen) identifikovano je 11 klastera koji odgovaraju monocitima (kl.1-3), neutrofilima (kl. 4-6), dendritskim ćelijama (kl.7), makrofagima (kl.8), prirodnim ubicama i T-ćelijama (kl. 9), mastocitima (kl.10) i B-ćelijama (kl.11). Uočena je heterogenost u populacijama monocita i neutrofila, koje obuhvataju neklasične (kl.1) i klasične (kl.2) monocite, klaster koji zajedno eksprimira gene monocita i neutrofila (kl.3) (Yáñez, A. et al. (2017) Immunity 47: 890-902) i intermedijere za sazrevanje neutrofila (Slika 19e i Slika 23a,b). Leukemija ima značajan uticaj na transkripciono okruženje neklasičnih monocita (Slika 19f), koji su ekspandovani u slezini miševa sa tumorom (vidite Sliku 11c). Druge populacije mijeloidnih ćelija, uključujući makrofage i DC, pokazuju komparativno manje izmena koje su indukovane leukemijom (Slika 24). Neklasični monociti povezani sa tumorom su ushodno regulisali gene koji su obogaćeni u GO terminima kao što je aktivacija komplementa i negativna regulacija inflamacije, dok su nishodno regulisali gene koji su povezani sa obradom i prezentovanjem antigena (Slika 19g). IFN genska terapija je neklasičnim monocitima ALL miševa nametnula ISG aktivirani imunostimulatorni program, što se može videti na osnovu ushodne regulacije gena koji su obogaćeni u GO terminima koji se odnose na odbranu i urođeni imunski odgovor, kao i MHC II gena (Slika 19g,h). Transkripciono reprogramiranje TME putem IFN genske terapije je bilo manje delotvorno kod neklasičnih monocita miševa koji nisu imali odgovor na IFN gensku terapiju (Slika 25a), što se vidi na osnovu grupisanja na bazi grafikona i diferencijalne ekspresije gena (Slika 19f,h). Daljim grupisanjem podataka scRNK-Seq dobijenih od neklasičnih monocita otkrivena su četiri glavna potklastera (1A do 1D; Slika 25b). Potklaster 1A je bio sačinjen od ćelija miševa bez bolesti iz grupa kontrolnih i IFN miševa, dok su se preostala tri potklastera u velikoj meri preklapala sa ćelijama IFN+ALL miševa sa odgovorom (1B), IFN+ALL miševa bez odgovora (1C) i ALL (1D). Analiza sa minimalno razapinjućim stablom (MST) otkrila je putanju od 1A od 1D, što potvrđuje parcijalno u odnosu na delotvorno reprogramiranje u ćelijama IFN miševa bez odgovora u odnosu na one sa odgovorom (Slika 19i).
[0309] Neočekivano, takođe smo otkrili veće brojeve FOXP3+CD25+CD4+ T-ćelija u BM IFN miševa kojima je injektovan tumor (Sl.12c,d). Sveukupno, ove promene su konzistentne sa prajmovanjem za aktivaciju M1 i Th1 odgovora kod IFN miševa, što nakon izazova leukemijom može dovesti do indukcije zaštitnog imunskog odgovora.
Primer 4 - Lečenje sa IFN indukuje dugotrajne antitumorske odgovore koji ciljaju više tumorskih antigena
[0310] Zatim smo istražili da li bi IFNα lečenje usmereno na tumor takođe moglo da promoviše dugotrajne odgovore kod miševa. Iznenađujuće, prosečno je 24% (prosek 5 različitih eksperimenata, n=11, 14, 8, 16, 12) IFN miševa dugoročno preživelo i delotvorno su izlečeni od bolesti, dok je samo 2% kontrolnih miševa (n=13, 14, 8, 16, 13) preživelo (jedan reprezentativni eksperiment prikazan na Sl.4a i Sl.14a). Treba napomenuti da smo putem klasifikovanja miševa na osnovu vremena preživljavanja otkrili da su miševi koji su rano eutanazirani nakon injekcije tumora pokazali mali procenat OVA-specifičnih T-ćelija u krvotoku i nisu uočeni NGFR negativni ALL (Sl.14b). Nasuprot tome, miševi koji su eutanazirani u kasnijim terminima pokazali su indukciju varijabilnih procenata OVA-specifičnih T-ćelija u krvotoku i prisustvo NGFR-negativnih ALL klonova (Sl.14b). Ovi rezultati sugerišu da miševi koji su podlegli bolesti nisu uspeli da pokrenu imunski odgovor i umrli su veoma rano, ili su pokrenuli anti-OVA odgovore ali su na kraju umrli usled neuspeha ovih ćelija da zaštite miševe, usled iscrpljenosti ili nastanka imunski odabranih OVA negativnih ALL klonova. Miševi koji su dugoročno preživeli pokazali su stabilne OVA-specifične T-ćelije u krvotoku i kada su ponovo izazvani sa OVA-ALL ostali su izlečeni (Sl.
4b i Sl.14c). Klirens tumora je povezan sa ekspanzijom OVA-specifičnih T-ćelija u krvotoku, što sugeriše da razvoj memorijskih T-ćelijskih odgovora ima ključnu ulogu u zaštiti miševa od daljeg tumorskog izazova (Sl.14d). Iznenađujuće, IFN miševi koji su dugoročno preživeli izbacili su ALL ćelije koje eksprimiraju OVA kao i matične, OVA-negativne ALL ćelije, kada su ponovo izazvani sa odnosom 1 prema 1 ovih ćelija ili matičnih klonova samostalno, što sugeriše da je došlo do širenja odgovora na dodatne tumorske antigene (TAA), i da to može biti potrebno za postizanje dugotrajne zaštite (Sl.4c,d i Sl.14e).
Primer 5- Kombinacija IFN lečenja i blokade CTLA-4 povećava preživljavanje leukemije
[0311] Zatim smo ispitali kombinaciju terapije blokadom CTLA-4 sa IFNα lečenjem usmerenim na tumor na našem eksperimentalnom modelu OVA-ALL (Sl.4e). Mada su sve terapijske grupe – IFN genska terapija ili lečenje sa aCTLA4 samostalno ili u kombinaciji – značajno povećale preživljavanje miševa u poređenju sa kontrolom, kombinovana terapija je bila delotvornija (IFN 21%; aCTLA420%; CTRL+izotipsko kontrolno antitelo 7%;
IFN+aCTLA4 36%; Sl.4f i Sl.15a), što je potvrđeno drugim eksperimentom (IFN+αCTLA4 30% u odnosu na αCTLA48%; Sl.4g i Sl.15b). Lečenje sa IFN ili aCTLA-4 je povećalo procenat OVA207 specifičnih T-ćelija u PB, koji je dalje povećan u kombinovanoj grupi (Sl.
16b). Shodno tome, imunski odabir NGFR-negativnih ALL je bio uočljiviji u grupama sa IFN+aCTLA4 i aCTLA4, mada nije bio konzistentno praćen odloženim tokom bolesti (Sl. 16a), što sugeriše da imunski odgovor na jedan neo-antigen ne mora da obezbedi zaštitu od tumora. Pored dominantnog OVA antigena, naš model ALL takođe eksprimira OFP (koji je eksprimiran zajedno sa miR-126) i prokariotski transaktivator tTA (koji ushodno reguliše ekspresiju miR-126) kao potencijalne neo-antigene koji pomažu u pokretanju transformisanog fenotipa (vidite Sl.1a). Stimulisali smo mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) miševa koji su dugoročno preživeli (iz eksperimenta koji je prikazan na Sl.4f) ciljnim ćelijama koje su transdukovane sa LV koji eksprimira tTA, OFP, NGFR ili OVA, i izmerili smo proizvodnju γ-IFN pomoću ELISPOT. Većina ovih miševa je pokazala reaktivnost na jedan ili više neo-antigena pored OVA, pri čemu je najjači odgovor uočen na tTA, a najslabiji na NGFR (Sl.4h).
[0312] Ovi rezultati pokazuju da se širenje imunskog odgovora na dodatne neo-antigene odigralo kod većine miševa sa dugoročnim preživljavanjem. Zatim smo ponovo izazvali ove miševe sa odnosom 1:1 OVA-pozitivnih i negativnih ALL i otkrili smo da je većina njih preživela ponovni izazov. Zanimljivo, analiza pojedinačnih miševa je pokazala da oni koji nisu preživeli nisu uspeli da generišu širok odgovor na tumorske antigene i/ili su podlegli odabiru ALL klonova koji nemaju više od jednog neo-antigena (dopunska tabela 1). Kao dalji pokazatelj adaptivnog imunskog odgovora koji je u osnovi preživljavanja miševa, uporedili smo repertoar TCR-β regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) PBMC pre i posle izazova leukemijom. Produktivna klonalnost (mera raznolikosti u rasponu od 0=poliklonsko do 1=monoklonsko kod svakog miša) kao i sličnost repertoara između različitih miševa su povećani nakon ponovnog izazova leukemijom, što ukazuje na ekspanziju T-ćelijskih klonova koji reaguju na tumor za zajednički skup TAA kod preživelih miševa (Sl.4i i Sl.16c).
[0313] Kako bismo dalje utvrdili da li je stvaranje odgovora na više neo-antigena prediktor dugoročnog preživljavanja, obavili smo novi eksperiment i sakupili PBMC rano nakon izazova sa OVA-ALL kako bismo ispitali T-ćelijsku reaktivnost na sve poznate TAA pomoću testa IFNg-ELISPOT. Miševi koji pokazuju antitumorski repertoar koji obuhvata više TAA imali su daleko veću verovatnoću dugoročnog preživljavanja nego miševi koji imaju odgovor na jedan ili nijedan TAA, koji su redom umrli od bolesti (Sl.4j,k).
[0314] Sveukupno, ovi podaci pokazuju da IFN genska terapija i blokada CTLA4 povećavaju T-ćelijsko prajmovanje i šire repertoar odgovora na tumorske neo-antigene, i da ti odgovori mogu biti aditivni i pružati dugoročnu zaštitu od tumora.
Primer 6 - IFN genska terapija povećava aktivaciju i ekspanziju adaptivno transferovanih CAR19-transdukovanih T-ćelija i povećava preživljavanje
[0315] Kako bismo dalje ispitali sinergiju između IFN genske terapije i adaptivnog T-ćelijskog transfera na klinički relevantnom modelu, generisali smo T-ćelije koje eksprimiraju prethodno opisanu drugu generaciju (2G) CAR koje ciljaju mišji CD19 (CART19 ćelije) i obuhvataju CD28 endokostimulatorni domen (Kochenderfer, J.N. et al. (2010) Blood 116: 3875-3886), i lečili smo miševe kojima su injektovane matične (OVA-negativne) ALL. Za transfer CAR gena smo iskoristili LV koji koordinirano eksprimira CAR i NGFR marker iz dvosmernog promotera (Casucci, M. et al. (2013) Blood 122: 3461-3472) (Slika 26a,b). Kako bi se omogućilo graftovanje CART19 ćelija (Davila, M.L. et al. (2013) PLoS One 8: 1-14), miševi su kondicionirani ciklofosfamidom pre infuzije (Slika 20a). Dok CART19 ćelije samostalno skoro da nisu imale uticaj na brzorastuće ALL kod kontrolnih miševa u uslovima našeg eksperimenta, one su značajno inhibirale opterećenje leukemijom i istrošile normalne B-ćelije kod IFN miševa (Slika 20b i Slika 26c). Slično rezultatima za OT-I T-ćelije, CART19 ćelije su pokazale ranu i prolaznu ushodnu regulaciju LAG3 i PD1 kod IFN ali ne i kod kontrolnih miševa, sa najvećim pikom kod IFN miša sa dugoročnim preživljavanjem (Slika 20c i Slika 26d, IFN miš sa dugoročnim preživljavanjem prikazan zelenom bojom).
Zanimljivo, ekspresija NGFR je takođe ushodno regulisana na CART19 ćelijama IFN miševa, što je verovatno odraz povećane aktivnosti promotera fosfoglicerat kinaze (PGK) kao odgovor na veću metaboličku aktivaciju CART ćelija kod IFN miševa (Slika 26e,f). Pošto je u našem LV ekspresija NGFR i CAR19 zajedno regulisana putem PGK promotera, veća ekspresija potonjeg takođe može pogodovati delotvornijem ubijanju CD19+ ALL kod IFN miševa. Takođe smo testirali unapređenu verziju CD19 CAR (iCAR19), koja obuhvata inaktivirajuće mutacije u prvom i trećem CD3zeta ITAM domenu i objavljeno je da povećava delotvornost ubijanja i povećava T-ćelijsku vijabilnost u poređenju sa standardnim CAR19 (Kochenderfer, J.N. et al. (2010) Blood 116: 3875-3886). Lečili smo kontrolne ili IFN miševe T-ćelijama koje eksprimiraju CAR19 ili kontrolnim T-ćelijama pri malom ili velikom opterećenju leukemijom (Slika 20d i Slika 27a,b). Dok su CART19 i iCART19 ćelije imale detektabilno ali zanemarljivo dejstvo na opterećenje tumorom kod kontrolnih miševa, one su značajno inhibirale ALL kod IFN miševa u ranim i kasnim ispitivanjima sa intervencijom (Slika 20e). Takođe smo potvrdili ranu ushodnu regulaciju LAG3 kod obe vrste CART19 ćelija IFN miševa (Slika 20f). Longitudinalne analize su otkrile pikove ekspanzije iCART19 kod IFN miševa koji se podudaraju sa inhibicijom rasta ili klirensom ALL, i ranu ushodnu regulaciju ekspresije NGFR/CAR19 kod IFN miševa (Slika 27c,d). Sveukupno, značajan deo IFN miševa koji su lečeni CART19 ćelijama je i dalje bio živ prilikom poslednje kontrole (Slika 20g).
MATERIJALI I POSTUPCI
Dizajn eksperimenta
[0316] Veličina uzorka je izabrana na osnovu prethodnog iskustva sa eksperimentalnim modelima i testovima. Nijedan uzorak niti životinja nisu isključeni iz analiza. Miševi su nasumično raspoređeni u svaku eksperimentalnu grupu. Studija nije bila maskirana za istraživače.
Konstrukcija plazmida i proizvodnja LV
[0317] mTie2-IFN-mirT, mTie2-GFP-mirT, PGK-OFP, PGK-tTA LV su prethodno opisani<9,10,14>. BdLV za transfer NGFR-OVA je stvoren kloniranjem OVA kDNK (Agel - Sall) koja je amplifikovana iz PGK-OVA LV37 putem PCR umesto GFP kDNK (Agel - Sall) u NGFR-GFP BdLV38. Korišćeni su sledeći prajmeri: prajmer Fw: 5'-CGACCGGTCCACAAAGACAGCACCATGACA; prajmer Rv: 5'-ATTGTCGACTTAAGGGGAAACACATCTGCCAAAGA. BdLV za transfer NGFR-CD20 je stvoren kloniranjem kDNK humanog CD20 sa optimizovanim kodonom iz sintetisanog plazmida (Kpnl blunt - Sall) umesto GFP kDNK (Agel blunt - Sall) u NGFR-GFP BdLV. BdLV za transfer NGFR-CAR19 i NGFR-iCAR19 su stvoreni kloniranjem sekvenci CAR19 i neaktivnog CAR19 koje su prethodno opisane (Kochenderfer, J.N. et al. (2010) Blood 116: 3875-3886) putem PCR umesto GFP kDNK (Agel - Sall) u NGFR-GFP BdLV koristeći sledeće prajmere: prajmer Rv (neaktivan CAR19): 5'-AAACAGCTCCTCGAGTTATCTAGGGGCCA; prajmer Rv (CAR19): 5'-AAACAGCTCCCTCGAGTCATCTAGGGGCCAGT; prajmer Fw (CAR19 i neaktivan CAR19): 5'-AACACCGGTGTACCGAATTCATGGGCGTG. Koncentrovani LV pseudotipovani sa VSV-G su proizvedeni i titrisani kao što je prethodno opisano (Follenzi, A. et al. (2000) Nat. Genet.25: 217-222).
Miševi
[0318] C57BI/6 Ly45.2 i Ly45.1 miševi su kupljeni od Charles River Laboratory. C57BI/6 Ly45.1/Ly45.2 su dobijeni ukrštanjem C57BI/6 Ly45.2 i C57BI/6 Ly45.1 miševa u istraživačkoj ustanovi za životinje San Raffaele Scientific Institute i korišćeni kao donori za HPC transplantat. Transgeni OT-I C57BI/6 Ly45.2 miševi su čuvani kao kolonija u istraživačkoj ustanovi za životinje San Raffaele Scientific Institute. Sve procedure na životinjama su vršene u skladu sa protokolima koje je odobrio komitet za brigu o životinjama i njihovu upotrebu San Raffaele Scientific Institute (IACUC 600) i koji su preneti Ministarstvu zdravlja i lokalnim organima u skladu sa italijanskim zakonom.
Transplantacija hematopoetske matične progenitorne ćelije (HSPC) Transplantacija HSPC kod C57BI/6 miševa
[0319] Šest nedelja stari C57BI/6 Ly45.2/Ly45.1 miševi su eutanazirani pomoću CO2 i BM je sakupljena ispiranjem femura i tibija. Ćelije negativne na linijske markere obogaćene sa HS/PC su izolovane iz ukupne BM koristeći imunomagnetni sistem za prečišćavanje ćelija na bazi kolone (mišji komplet za iscrpljivanje ćelija linije, Miltenyi, br.130-090-858).10<6>ćelija negativnih na linijske markere/ml je zatim prethodno stimulisano tokom 3-4 h u StemSpan medijumu bez seruma (StemCell Technologies) koji sadrži koktel citokina (20 ng/ml IL-3, 100 ng/ml SCF, 100 ng/ml FLT-3L, 50 ng/ml TPO, sve nabavljeno od kompanije Peprotech) i zatim transdukovano naznačenim lentivirusnim vektorima u dozi od 10<8>transdukujućih jedinica/ml tokom 12 h u istom medijumu koji sadrži citokine. Nakon transdukcije, ćelije su isprane i 10<6>ćelija je infuzirano u repnu venu smrtonosno ozračenih 6 nedelja starih ženki C57BI/6 Ly45.1. Doze zračenja su bile 935 cGy podeljeno u dve doze. Transdukovane ćelije su takođe uzgajane in vitro tokom 15 dana u IMDM sa dodatkom 10% FBS, SCF (100 ng/ml), FLT3L (100 ng/ml), penicilina (100 IU/ml), streptomicina (100 ug/ml) i 2% glutamina i zatim testirane zajedno sa PBMC ćelijama koje su izolovane od miševa kojima je izvršena transplantacija pri stabilnoj hematopoetskoj rekonstituciji (6 nedelja) kako bi se VCN kvantifikovao putem qPCR, kao što je prethodno opisano (De Palma et al., Blood 2005).
Studije tumora
Mišji OVA-ALL
[0320] Potklon OVA-ALL je stvoren transdukcijom matičnog ALL klona br.1114 sa NGFR-OVA BdLV. Ukratko, ALL su držani u kulturi u koncentraciji od 2×10<6>ćelija/ml u Stem Span sa dodatkom 10% FBS, penicilina (100 IU/ml), streptomicina (100 ug/ml), 2% glutamina, IL3 (20 ng/ml), SCF (100 ng/ml), FLT3L (100 ng/ml), TPO (50 ng/ml) i transdukovane sa 2x107 TU/ml sa NGFR-OVA BdLV. Nakon 6 sati izlaganja LV, transdukovani ALL su isprani i intravenski injektovani u C57BI/6 Ly45.2 miševe primaoce koji su ozračeni dozom manjom od smrtonosne (450 cGy). Miševi sa leukemijom su žrtvovani 14 dana kasnije, kada su ALL dostigli 90% ukupnih ćelija PB, a BM je sakupljena ispiranjem femura i tibija.
[0321] NGFR+ transdukovane ćelije su izolovane obeležavanjem imunskim magnetnim perlicama (komplet CD271 MicroBead, Miltenyi, br.130-099-023). Čistoća izabranih ALL je utvrđena analizom putem protočne citometrije obeležavanjem ćelija anti-NGFR antitelom i procenjena je na 98% (NGFR+ ALL; vidite Sl.5a). Serija OVA-ALL je zatim zamrznuta u više alikvota, čuvana u tečnom azotu i korišćena za sve eksperimente. Miševima je za tumorski izazov intravenski injektovana doza od 10<5>OVA-ALL ili 3×10<4>matičnih ALL ponovo suspendovanih u 200 µl fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom (PBS). Za eksperimente sa ponovnim izazovom, pomešali smo OVA-ALL i matične (OVA-negativne) ALL u odnosu 1:1 (ukupno 105 ALL). Sastav proizvoda za infuziju je potvrđen putem analize protočnom citometrijom pre in vivo injekcije uz obeležavanje pomešanih ćelija anti-NGFR antitelom. Kinetika rasta tumora je utvrđena citofluorimetrijskom analizom na periodičnim uzorcima PB. Za studije preživljavanja miševi su svakodnevno ispitivani i status njihove bolesti je ispitan kada su pokazali znake bolesti i zatim su eutanazirani i BM i slezina su prikupljeni u sterilnim uslovima za dalju analizu. Za eksperimente blokiranja CTLA-4, mišje antimišje CTLA4 blokirajuće monoklonsko antitelo (mAb klon 9D9 BioXCell, br. BE0164) ili mišje izotipsko kontrolno antitelo (mAb klon MCP-11 BioXCell, br. BE0086) primenjeni su intraperitonealno od 3. dana nakon injekcije matičnih ALL ili OVA-ALL sa inicijalnom dozom od 200 µg/mišu, a zatim dozom od 100 µg/mišu na svaka 3-4 dana za ukupno pet infuzija antitela.
In vivo iscrpljivanje CD8 T-ćelija
[0322] Za in vivo iscrpljivanje T-ćelija, monoklonsko antitelo protiv iscrpljivanja CD8 (mAb 53-6.72 BioXCell, br. BE0004-1) primenjeno je intraperitonealno na miševima u dozi od 200 ug/mišu jedan dan pre injekcije OVA-ALL i zatim na svaka 3 dana tokom celog trajanja eksperimenta.
Adaptivni transfer OT-I T-ćelija
[0323] Za eksperimente sa adaptivnim T-ćelijama, OT-I T-ćelije su prečišćene iz slezine 8 nedelja starih transgenih ženki OT-I C57BI/6 Ly45.2 miševa putem imunomagnetnog odabira (komplet za izolovanje CD8+ T-ćelija Miltenyi, br.130-104-075). Čistoća odabranih OT-I T-ćelija je procenjena citofluorimetrijskom analizom koristeći panel anti-CD8, CD4 i CD3 antitela. 1×10<6>naivnih OT-I T-ćelija je intravenski injektovano u IFN ili CTRL miševe kojima je obavljena transplantacija u naznačeno vreme nakon injekcije OVA-ALL.
Dobijanje CART19 ćelija
[0324] T-ćelije su prvo prečišćene iz slezine 8 nedelja starih ženki C57BI/6 CD45.2+ miševa putem imunomagnetnog odabira (komplet za izolovanje Pan T-ćelija, br.130-095-130) i nakon toga su aktivirane pomoću anti-CD3/CD28 Dyna perlica (ThermoFisher br.11452D), prema uputstvu proizvođača. T-ćelije su uzgajane u RPMI sa dodatkom 10%FBS, penicilina (100 U/ml), streptomicina (100 ug/ml), 1% glutamina, IL2 (30 u/ml), IL7 (5 ng/ml), IL15 (5 ng/ml), Na piruvata (1 mM), Hepesa (20 mM), NEAA (1 uM) i beta-merkaptoetanola (0,05 mM). Jedan dan nakon aktivacije, T-ćelije su transdukovane pri koncentraciji od
1×10<6>ćelija/ml sa 10<8>TU/ml NGFR-CAR19 ili NGFR-iCAR19 BdLV.12 sati nakon izlaganja LV T-ćelije su isprane i ekspandovane u kulturi tokom 8 dana pre infuzije u miševe u dozi od 7 × 10<6>(eksperiment sa slike 20b) i 107 (eksperiment sa slike 20e) NGFR+ T-ćelija.
In vivo test proliferacije Edu
[0325] In vivo testovi proliferacije su obavljeni koristeći 5-etinil-2'dezoksiuridin (EdU, Invitrogen), analog timina koji se koristi kao alternativa za BrdU. EdU je rastvoren u sterilnom 1x PBS-u u koncentraciji od 10 mg/ml. Miševima je i.p. injektovano 100 µg EdU 24 h pre analize. BM i slezina su sakupljeni i obrađeni prema uputstvu proizvođača (ClickiT<®>EdU komplet za test protočne citometrije, Invitrogen, br. C10636), i procenat inkorporacije EdU u ćelije leukemije je izmeren analizom putem protočne citometrije.
Uzgajanje i transdukcija ćelija
[0326] Ćelijska linija limfoma izvedena od mišjeg EL4 C57BI/6 održavana je u IMDM-u sa dodatkom 10% FBS, penicilina (100 IU/ml), streptomicina (100 µg/ml) i 2% glutamina. Transdukcija je obavljena u koncentraciji od 106 ćelija/ml sa dozom od 10<8>TU/ml naznačenog osnovnog rastvora vektora. Ćelije su inkubirane tokom 12 sati a zatim isprane radi uklanjanja vektora. OFP na transdukovanim ćelijama je procenjen nakon 7 dana uzgajanja putem analize protočnom citometrijom. Ekspresija NGFR i CD20 je procenjena bojenjem ćelija anti-NGFR ili anti-CD20 antitelom 7 dana nakon transdukcije (vidite odeljak o protočnoj citometriji). VCN transdukovanih ćelija je određen pomoću qPCR u realnom vremenu nakon 15 dana uzgajanja, kao što je prethodno opisano (De Palma et al., Blood 2005).
Protočna citometrija
[0327] Sve citometrijske analize su obavljene koristeći instrumente FACSCanto II i LSRFortessa (BD Bioscience) i analizirane softverom FlowJo (v.9.3, Tree Star Inc.).
Uzgajane ćelije
[0328] EL4 ćelije su isprane i ponovo suspendovane u PBS-u koji sadrži 2% FBS. Za imunološko bojenje, ćelije su inkubirane sa antimišjim Fc receptor blokirajućim antitelima tokom 15 min na 4 °C, a zatim obojene tokom 20 min na 4 °C anti-NGFR ili anti-CD20 antitelima (za antitela vidite dopunsku tabelu 1). Kako bi se mrtve ćelije isključile iz analize, ćelije su isprane i ponovo suspendovane u PBS-u koji sadrži 10 ng/ml 7-aminoaktinomicina D (7-AAD).
Periferna krv
[0329] Za svakog miša, 250 µl periferne krvi je dodato u 10 µl PBS koji sadrži 45 mg/ml EDTA. Za imunološko bojenje, poznata zapremina pune krvi (100 µl) prvo je inkubirana sa antimišjim FcγIII/II receptor (Cd16/Cd32) blokirajućim antitelima tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim inkubirana u prisustvu monoklonskih antitela (za antitela vidite dopunsku tabelu 1) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Eritrociti su uklonjeni lizom pomoću radne stanice TQ-Prep (Beckman-Coulter) u prisustvu jednake zapremine FBS (100 µl) kako bi se zaštitila bela krvna zrnca. Za kvantitativnu protočnu citometriju, prvo smo obojili i lizirali poznatu zapreminu krvi (100 µl), kao što je prethodno opisano, a zatim smo dodali fiksnu zapreminu (50 µl) Flow-count fluorosfera, sa poznatom koncentracijom Beckman Coulter, br.7547053). Kako bismo odredili apsolutan broj ćelija koristili smo formulu: apsolutni broj (ćelija/µl) = [ukupan broj prebrojanih ćelija/(ukupan broj prebrojanih fluorosfera × 2)] × koncentracija Flow-count fluorosfera. Za bojenje OVA-specifičnim pentamerom, puna krv je prvo lizirana sa H2O.1×10<6>PBMC je zatim ponovo suspendovano u 50 ul PBS-a koji sadrži 2 mM EDTA i 0,5% albumina goveđeg seruma (BSA) i inkubirano sa antimišjim Fcylll/ll receptor (Cd16/Cd32) blokirajućim antitelima tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim sa OVA-specifičnim pentamernim reagensom (0,5 µg/1×10<6>ćelija) i monoklonskim antitelima (za antitela vidite dopunsku tabelu 1) još 10 minuta na sobnoj temperaturi. Kako bi se mrtve ćelije isključile iz analize, ćelije su isprane i ponovo suspendovane u PBS-u koji sadrži 2% FBS i 10 ng/ml 7-aminoaktinomicina D (7-AAD). Za bojenje Treg ćelija u PB, prvo smo obavili površinsko bojenje na 50 µl pune krvi (za antitela vidite dopunsku tabelu 1), kao što je prethodno opisano. Obojena puna krv je zatim isprana i ponovo suspendovana u 100 ul rastvora za fiksiranje/permeabilizaciju (eBioscience, br.00-5523-00) i inkubirana tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi, isprana i ponovo suspendovana u 50 µl rastvora za permeabilizaciju koji sadrži antimišji FoxP3 ili izotipska kontrolna antitela i inkubirana je tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi.
Koštana srž
[0330] BM ćelije su dobijene ispiranjem femura u PBS 2% rastvoru FBS i propuštanjem ćelijske suspenzije kroz najlonski filter od 40 µm. Ćelije (1x106 - 3x106 ćelija) su isprane, ponovo suspendovane u 100 µl PBS koji sadrži 2 mM EDTA i 0,5% goveđi BSA i inkubirane sa antimišjim Fcylll/ll receptor (Cd16/Cd32) blokirajućim antitelima tokom 15 minuta na 4 °C. Bojenje je zatim obavljeno monoklonskim antitelima (za antitela vidite dopunsku tabelu 1) tokom 20 minuta na 4 °C. Za bojenje OVA-specifičnim pentamerom, 1×10<6>BM ćelija je obojeno kao što je prethodno opisano za PB. Za svo intracelularno bojenje i za deo površinskog bojenja, LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Staining (ThermoFisher, br. L34959) korišćen je da se napravi razlika između živih i mrtvih ćelija prema uputstvu proizvođača. Za bojenje Treg u BM, prvo smo obavili površinsko bojenje na 1×10<6>BM ćelija, kao što je prethodno opisano za PB.
Slezina
[0331] Slezine su prvo smrvljene i dobijena ćelijska suspenzija je propuštena kroz najlonski filter od 40 µm. Eritrociti su lizirani pomoću H20 i dobijena ćelijska suspenzija je dalje propuštena kroz najlonski filter od 40 µm i isprana u hladnom PBS-u koji sadrži 2 mM EDTA i 0,5% BSA. Ćelije su obrađene i imunološki obojene kao što je prethodno opisano za BM.
Bojenje ćelijskog ciklusa
[0332] BM ćelije i splenociti miševa kojima su injektovani OVA-ALL su sakupljeni kao što je prethodno opisano. Ćelije su zatim obojene na površinske markere, isprane i fiksirane koristeći pufer BD Cytofix (BD br.554655), isprane i permeabilizovane pomoću BD Perm 2 (BD br.347692), isprane i obojene sa PerCP-Cy5.5- ili APC-konjugovanim Ki67 antitelom i konačno ponovo suspendovane u puferu BD Cytofix sa Hoechst bojom pri 1 µg/ml. Ćelije su zatim analizirane na mašini BD LSRFortessa sa UV laserom.
Bojenje ćelijske apoptoze
[0333] BM ćelije i splenociti miševa kojima su injektovani OVA-ALL su sakupljeni kao što je prethodno opisano. Ćelije su zatim obojene površinskim markerima kao što je prethodno opisano. Obojene ćelije su zatim dva puta isprane puferom za ćelijsko bojenje (BioLegend, br. 420201) i ponovo suspendovane u vezujućem puferu Annexin V (Biolegend br.422201) i inkubirane sa 5 ul Annexina V konjugovanog sa bojom Pacific blue i 10 ul 7-AAD (Biolegend, br.420403/420404) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi.400 ul vezujućeg pufera Annexin V je zatim dodato u svaki uzorak i procenat apoptotičnih/mrtvih ćelija u OVA-ALL je izmeren protočnom citometrijom u roku od 30 minuta od bojenja.
ELISPOT test
[0334] g-IFN ELISPOT je obavljen na ploči sa ravnim dnom sa 96 bunarčića (Millipore) koja je obložena sa 5 µg/ml antimišjeg IFN-g primarnog antitela (BD, br.554430). CD8+ efektorske T-ćelije slezine su prvo prečišćene obeležavanjem sa imunskim magnetnim ćelijama (komplet CD8 MicroBead, Miltenyi, br.130-049-401) i čistoća je procenjena citofluorimetrijskom analizom koristeći panel anti-CD8, CD4 i CD3 antitela. Efektorske T-ćelije su zatim zasejane pri finalnoj koncentraciji od 105 ili 2×10<5>ćelija/bunarčiću u prisustvu ozračenih (6000 cGy) 10<5>EL4 ciljnih ćelija. Za neke eksperimente, efektorske T-ćelije smo takođe stimulisali sa 2,5 µg/ml konkanavalina A, kao kontrole. Nakon 46 sati inkubacije na 37 °C / 5%CO2, ćelije su isprane i inkubirane sa biotinilovanim antimišjim IFN-g antitelom (klon XGM 1.2, BD br.554410, 1 µg/ml) tokom dva sata. Ploče su zatim četiri puta isprane sa PBS-Tween, nakon čega je usledilo 3 ispiranja sa PBS-om i zatim je dodavan avidin-POD (Roche br.11089153001) (razblažen 1:5000 u PBS-u) tokom 1 sata. Ploče su zatim isprane četiri puta sa PBS-Tween, nakon čega je usledilo 3 ispiranja sa PBS-om i zatim je u svaki bunarčić dodato 50 µl supstrata 3-amino-9-etilkarbazola (AEC, SIGMA br. A6926/50tab) tokom 15-20 minuta. Reakcija je prekinuta dodatkom vode sa česme, a tačke su kvantifikovane pomoću čitača ELI-Expert.Elispot-Reader i analizirane pomoću Eli.Analyze Version 5.1 (A.EL.VIS). Kada se sve PBMC koriste kao efektorske ćelije, ukupna krv je prvo lizirana sa H2O kako bi se uklonili eritrociti, izolovane PBMC su prebrojane i zasejane pri finalnoj koncentraciji od 10<5>ćelija/bunarčiću.
Ekstrakcija RNK, qPCR i analiza ekspresije gena
[0335] Ekstrahovanje RNK iz ćelija BM, splenocita i prečišćenih CD4+ T-ćelija slezine je obavljeno koristeći komplet RNeasy Plus mini (Qiagen). Ćelije su lizirane u puferu RLT plus, sa dodatkom beta-merkaptoetanola. Lizat je zatim propušten kroz iglu veličine 20. RNK je zatim ekstrahovana prema uputstvu proizvođača. Ekstrahovane mRNK su retrotranskribovane koristeći komplet SuperScript Vilo (11754250; Invitrogen). Sve Q-PCR analize na pojedinačnim genima su obavljene koristeći sonde TaqMan proizvođača Applied Biosystems (vidite ispod). QPCR je vršena tokom 40 ciklusa koristeći instrument Viia 7, dok je softver Viia 7 zatim korišćen za ekstrakciju sirovih podataka (Ct). Kako bi se odredila genska ekspresija, izračunata je razlika (ΔCt) između graničnog ciklusa (Ct) svakog gena i date vrednosti za referentni gen. Što je niži ΔCt, viši je nivo ekspresije gena. Kako bi se dobile relativne vrednosti kvantifikacije, zatim smo izračunali obim promene ekspresije gena od interesa tokom njegove ekspresije u referentnom uzorku, na osnovu formule 2<-ΔΔCt>.
Vrednosti p su izračunate na osnovu Man-Vitnijevog testa srednjih vrednosti 2<-ΔΔCt>za svaki gen između dve grupe.
[0336] Sledeće sonde Taqman su korišćene na prečišćenim mišjim CD4+ T-ćelijama slezine: II10 Mm00439616_m1), II17 (Mm00439618_m1), Ifng (Mm01168134_m1), II2 Mm00434256_m1), Tbx21 (TBET)
(Mm00450960_m1), Rorc (Mm01261022_m1), Foxp3 Mm00475156_m1), Gata3 (Mm00484683_m1), II22 (Mm00444241_m1), II4 Mm00445259_m1).
Sekvenciranje TCR
[0337] Ulazna DNK je dobijena iz PBMC IFN i CTRL miševa pre injekcije tumora (T0), 30 dana nakon injekcije OVA-ALL kod miševa sa dugoročnim preživljavanjem bez tumora (T1) i 4 dana nakon ponovnog izazova sa OVA-ALL i matičnim ALL pomešanim u odnosu 1:1 (T2). Sekvenciranje lanca TCRβ je obavljeno u kompaniji Adaptive Biotechnologies koristeći platformu ImmunoSEQ sa prajmerima koji su specifični za svih 54 poznatih eksprimiranih Vβ i svih 13 Jβ regiona. Svaki jedinstveni obrazac CDR na aminokiselinskom nivou je kvantifikovan u delovima na milion (cpm). Klonalnost je procenjena kao 1 - Pielou ujednačenost<39>:
[0338] Gde H' predstavlja entropiju uzorka, izračunatu za broj obrazaca veći od 0 (tj. skup svih uočljivih obrazaca kod miša), a H predstavlja maksimalnu teorijsku entropiju za miša, koja se definiše putem
[0339] Gde S predstavlja broj različitih obrazaca kod miša. Sličnost je procenjena kao 1 -Brej-Kurtisova razdaljina između uzorka s i srednjeg broja obrazaca u terminu t.
[0340] Ova mera je ekvivalentna Sorensen-Dajsovom indeksu sličnosti i procenjena je koristeći sve i uočene obrasce u terminu t.
Sekvenciranje zbirne RNK
[0341] RNK je ekstrahovana iz 10.000-50.000 sortiranih ćelija koristeći sistem ReliaPrep RNA MiniPrep (Promega) i biblioteke RNK-Seq su pripremljene pomoću protokola SMART-Seq2 (Picelli, S. et al. (2014) Nat. Protoc.9: 171-181), uz manje modifikacije. Ukratko, RNK (1-5 ng) reversno je transkribovana koristeći prilagođeni oligodT i LNA oligo sa zamenom obrazaca (sekvence), nakon čega je sledila PCR amplifikacija i čišćenje (perlice Ampure XP, Beckman Coulter). Dobijena kDNK (0,5-1 ng) označena je na 55 °C tokom 30 minuta i finalne biblioteke RNK-Seq su dobijene koristeći reagense iz kompleta za pripremu biblioteke DNK Nextera XT (Illumina). Sekvenciranje je obavljeno na mašini NextSeq 500 (Illumina, San Diego, CA) koristeći komplet NextSeq 500/550 High Output v2 (75 ciklusa).
Sekvenciranje jednoćelijske RNK
[0342] Digitalno scRNK-Seq 3' kraja na bazi kapljice je obavljeno na kontroleru Chromium Single-Cell (10X Genomics, Pleasanton, CA) koristeći komplet Chromium Single Cell 3' Reagent v2 prema uputstvu proizvođača. Ukratko, suspendovane pojedinačne ćelije su razdeljene na gel perlice u emulziji (GEM) i lizirane, nakon čega je usledilo bar-kodiranje RNK, reversna transkripcija i PCR amplifikacija (12-14 ciklusa). scRNK-Seq spremne za sekvenciranje su pripremljene prema uputstvu proizvođača, proverene i kvantifikovane na instrumentima 2100 Bioanalyzer (Agilent Genomics, Santa Clara, CA) i Qubit 3.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sekvenciranje je obavljeno na mašini NextSeq 500 (Illumina, San Diego, CA) koristeći komplet NextSeq 500/550 High Output v2 (75 ciklusa).
Računarski postupci
[0343] Sirova očitavanja su obrađena i poravnata sa transkriptomom ENSEMBL mm10 koristeći Cell Ranger verziju 1.3 (https://support.10xgenomics.com/single-cell-geneexpression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger) sa podrazumevanim parametrima. Zadržana su samo pouzdano mapirana očitavanja, koja nisu PCR duplikati, sa validnim barkodovima i UMI (jedinstveni molekulski identifikatori). Filtracijom smo uklonili ćelije lošeg kvaliteta. Bilo je potrebno najmanje 300 jedinstvenih gena detektovanih za ćeliju, dodatno su odbačene ćelije sa odnosom ekspresije mitohondrija prema endogenom genu koji premašuje 0,1. Dobijenih 10.821 ćelija je zadržano za dalju analizu. Vrednosti ekspresije gena su kvantifikovane za log transformisani transkript po milionu [log(TPM 1)]. Nishodne analize su obavljene koristeći softverski paket R Seurat verzija 2.1 (https://github.com/satijalab/seurat/). Grupisanje ćelija i tSNE analiza su obavljeni na 1.031 najvarijabilnijih gena, koji su izabrani sa srednjom ekspresijom koja je veća od 0,01 i odnosom log transformisane varijanse prema srednjoj vrednosti većim od 0,5.
Analiza podataka nanoniza
[0344] Ekspresija RNK je procenjena na instrumentu nCounter SPRINT koristeći nCounter PanCancer Immune Profiler za mišji panel (Nanostring Technologies) prema uputstvu proizvođača. Brojevi transkripta koji su dobijeni sa NanoString<®>su obrađeni na sledeći način. Sirovi brojevi u RCC datotekama su normalizovani koristeći R/Bioconductor biblioteku NanoStringNorm (v 1.1.21)<40>; varijacija tehničkog testa je normalizovana koristeći geometrijsku sredinu internih kontrola, pozadinski nivo je procenjen izračunavanjem srednje vrednosti negativnih kontrola, brojevi RNK su normalizovani koristeći geometrijsku sredinu ekspresije domaćinskih gena, primenjena je dodatna stabilizacija varijanse. DIferencijalna ekspresija normalizovanih podataka je procenjena putem linearnih modela koji su implementirani u biblioteci R/Bioconductor limma<41>. Smatrano je da su transkripti diferencijalno eksprimirani sa pragom prilagođene p-vrednosti <0,05 (Benjamini-Hohbergova korekcija).
Statistička analiza
[0345] Vrednosti su eksprimirane kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (SEM) kao što je naznačeno. Statističke analize su obavljene pomoću Man-Vitnijevog testa ili Kruskal-Volisovog testa, nakon čega je usledila Danova korekcija nakon testa, osim ako nije drugačije naznačeno. Razlike su smatrane statistički značajnim na p<0,05. Analize su obavljene sa R 3.2.2<42>, NPC Test R10<43>i Prism (GraphPad Prism verzija 7.0). Analiza ćelijske populacije na Sl.2 je obavljena nanoparametarskim kombinovanim testom<43>, koji je alternativni test na bazi permutacija za parametarski Hotelingov T-kvadratni test dva uzorka. Ova metodologija omogućava vršenje multivarijantnih poređenja srednjih vrednosti u grupama sa malim brojem opservacija koje ne zadovoljavaju pretpostavku za multivarijantnu normalnost. Sl. 1a, I, Sl.16b, Slika 17 i Slika 20b,e su modelovane u neparametarskom okviru koji omogućava da se u obzir uzme mali uzorak, prisustvo izuzetaka, ne-Gausovska i veoma pristrasna raspodela podataka, za šta parametarski postupci nisu prikladni. Primenjen je robustan i fleksibilan postupak baziran na rangu pogodan za longitudinalnu analizu u faktorijalnom dizajnu<44,45>. U ovom kontekstu, testiranje hipoteze je usmereno na otkrivanje razlika u raspodeli sakupljenih promenljivih, a ne razlika između srednjih vrednosti<46,47>. Ova analiza je obavljena koristeći paket nparLD koji je razvijen u R46. Krive preživljavanja su procenjene putem Kaplan-Majerovog postupka (KM). Promenljiva događaja koja je ovde razmatrana je vreme do smrti, nije došlo do cenzure informacija. Statistički podaci iz neparametarskog log-rank (Mantel-Henšelovog) testa su korišćeni za poređenje k krivih preživljavanja koje su povezane sa k-uzorcima<48>. U prisustvu više od 2 grupe, problem višestrukog poređenja je otklonjen prilagođavanjem p-vrednosti Bonferonijevim postupkom.
Primer 7
[0346] Razvili smo novi konstrukt lentivirusnog vektora za tumorski specifičnu ekspresiju interferona-gama (IFNγ), interferona tipa II. Specifičnost za tumor se dobija putem transkripcione kontrole pomoću sekvenci pojačivača/promotera iz Tie2 (Tek) lokusa koji pokreće ekspresiju transgena selektivno u podskupu mijeloidnih ćelija koje infiltriraju tumor, uz sprečavanje ekspresije u hematopoetskim matičnim i progenitornim ćelijama uz pomoć ciljnih sekvenci mikroRNK koje prepoznaju miR-126-3p i miR-130a, kao što je prethodno opisano (Escobar, G. et al. (2014) Sci Transl Med 6: 217ra3). Ovaj konstrukt se naziva „Tig126/130a“.
[0347] Analogni konstrukt za ekspresiju interferona-alfa pod kontrolom Tie2 i miR-126 ciljne sekvence (tj. Tie2.lfna.126T) nazvan je „Tia126“.
[0348] Pored Tig126/130a i Tia126 vektora, razvili smo lentivirusni vektor koji nosi kDNK gena faktora nekroze tumora alfa (Tnfa), koji je nazvan „Tta126/130a“. Struktura konstrukta (npr. Tig126/130a i Tta126/130a) prikazana je na Slici 28.
[0349] Terapija se isporučuje transdukcijom ex vivo hematopoetskih i progenitornih ćelija (HSPC) sa Tig126/130a, nakon čega sledi transplantacija konstruisanih ćelija u kondicioniranog primaoca. Nakon graftovanja, HSPC potomstvo će se ekspandovati i diferencirati, i neke od njih će biti regrutovane u mikrookruženje tumora. Aktivnost promotera je specifično ushodno regulisana u podskupu monocita/makrofaga koji infiltriraju tumor, naročito kod monocita/makrofaga koji eksprimiraju Tie2 (TEM) koji se lokalizuju u perivaskularnim oblastima i imaju proangiogenu i imunosupresivnu funkciju (De Palma, M.
et al. (2005) Cancer Cell 8: 211-226; De Palma, M. et al. (2008) Cancer Cell 14: 299-311), isporučujući teret (npr. IFNγ) na ovu stratešku poziciju.
[0350] Koristili smo transplantabilni model B-akutne limfoblastne leukemije (B-ALL) koja blisko oponaša humani Philadelphia-like B-ALL (Nucera, S. et al. (2016) Cancer Cell 29: 905-921), koji lako indukuje protumorsko, imunosupresivno mikrookruženje koje karakteriše, na primer, pojava mijeloidno dobijenih supresorskih ćelija, nishodna regulacija gena MHC klase II i ushodna regulacija IL10 i PD1.
[0351] Prvo smo ispitali posledice isporučivanja IFNγ na bazi Tig126/130a na rast leukemije i protumorsko mikrookruženje indukovano leukemijom (Slika 29).
[0352] 6 do 8 nedelja stari C57/BL6 miševi su rekonstituisani sa HSPC negativnim na linijske markere transdukovane sa Tig126/130a, Tta126/130a ili kontrolnim lentivirusnim vektorom koji eksprimira biološki neaktivan gen skraćenog receptora nervnog faktora rasta (NGFR). Doza Tig126/130a i Tta126/130a je kvantifikovana kao broj vektorske kopije 1,39, odnosno 2,01 in vitro, i 0,44, odnosno 0,83 in vivo. Osam nedelja nakon transplantacije, nakon rekonstitucije periferne krvi, životinje su primile B-ALL, nakon čega je usledilo često vađenje krvi. U poređenju sa kontrolnim životinjama, miševi konstruisani da eksprimiraju IFNγ su pokazali značajno sporije napredovanje bolesti (Slika 29A). Štaviše, prilikom žrtvovanja smo uočili ushodnu regulaciju ekspresije MHC klase II na makrofagima slezine (Slika 29B), kao i smanjenje mijeloidno dobijenih supresorskih ćelija u koštanoj srži (Slika 29C), što ukazuje na konverziju mikrookruženja tumora u stanje polarizacije „nalik M1“ koje je u većoj meri antitumorsko. Nivo inhibicije leukemije putem Tig126/130a genske terapije je bilo uporediv sa onim što smo prethodno uočili sa isporukom interferona tipa I (odnosno interferona-alfa) koja se vrši koristeći sličnu vektorsku konstrukciju (Tia126), istu platformu za isporuku i isti model leukemije. Nasuprot tome, Tta126/130a vektor nije imao merljiv uticaj na rast leukemije ako se koristi kao monoterapija.
[0353] Zatim smo kombinovali istovremenu isporuku nekoliko imunostimulatornih citokina u mikrookruženje leukemije koristeći konstrukciju Tie2 vektora sa različitim transgenskim teretom. Zajedno smo transdukovali HSPC negativne na linijske markere sa dvostrukim kombinacijama Tia126, Tig126/130a i Tta126/130a vektora u poređenju sa Tia126 monoterapijom ili kontrolnom grupom koja je transdukovana biološki neaktivnim Tie2.NGFR vektorom, i transplantirali smo ćelije u miševe primaoce koji su ozračeni smrtonosnom dozom. Miševi su rekonstituisani u skladu sa očekivanjima, bez aditivne toksičnosti usled kombinovane ekspresije citokina. Broj vektorske kopije pojedinačnih vektora izmeren putem specifičnih kvantitativnih PCR testova je bio relativno nizak u rasponu od 0,1 do 0,3 kod rekonstituisanih miševa. Miševi su izazvani sa B-ALL, kao što je prethodno opisano. Tia126 klon je samostalno pokazao smanjenje rasta leukemije u poređenju sa kontrolom, slično kombinacijama sa Tig126/130a ili Tta126/130a (Slika 30A).
[0354] Neočekivano, kombinacija Tig126/130a i Tta126/130a je dovela do dramatičnog smanjenja progresije leukemije, što je povezano sa značajnim porastom ekspresije MHC klase II na makrofagima slezine (Slika 30B), smanjenjem MDSC (Slika 30C) i povećanjem broja citotoksičnih CD8+ T-ćelija u slezini (Slika 30D). Ovi podaci ukazuju na sinergiju između IFNγ i TNFa, koji se lokalno eksprimiraju u mikrookruženju tumora preko mijeloidnih ćelija koje infiltriraju leukemiju pod kontrolom Tie2 pojačivača/promotera.
[0355] Nadalje, procenili smo potencijalnu sinergiju našeg isporučivanja IFNγ na bazi genske terapije sa drugim imunoterapijskim strategijama, uključujući inhibitore kontrolne tačke anti-CTLA-4 i anti-LAG-3, i inhibitor IDO, 1-metil-triptofan (1-MT). Transdukovali smo HSPC negativne na linijske markere sa Tig126/130a ili kontrolnim biološki neaktivnim Tie2.NGFR vektorom, i transplantirali smo ćelije u miševe primaoce koji su ozračeni smrtonosnom dozom. Miševi su rekonstituisani u skladu sa očekivanjima, bez aditivne toksičnosti usled kombinovane ekspresije citokina. Broj vektorske kopije pojedinačnih vektora izmeren putem specifičnih kvantitativnih PCR testova je bio 0,72 za Tig126/130a i 0,84 za kontrole kod rekonstituisanih miševa. Miševi su izazvani sa B-ALL, kao što je prethodno opisano.
[0356] Uočili smo da, mada anti-CTLA-4 (αCTLA4) i anti-LAG-3 (αLAG3) već pokazuju određenu delotvornost kao monoterapija za smanjenje progresije B-ALL, lečenje sa 1-MT nije imalo korisno dejstvo (Slika 31A). Štaviše, kombinacija isporučivanja IFNγ na bazi genske terapije sa 1-MT kao i inhibitorima kontrolne tačke je povećala delotvornost lečenja, što je dovelo do smanjenja progresije bolesti (Slika 31A) povezane sa značajnim povećanjem ekspresije MHC klase II na makrofagima slezine i koštane srži (Slika 31A i 31B) i povećanjem broja citotoksičnih CD8+ T-ćelija u slezini (Slika 31D).
REFERENCE
1. Khalil, D. N., Smith, E. L., Brentjens, R. J. i Wolchok, J. D. The future of cancer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy. Nat. Rev. Clin. Oncol.13, 273-290 (2016).
2. Topalian, S. L., Drake, C. G. i Pardoll, D. M. Immune Checkpoint Blockade : A Common Denominator Approach to Cancer Therapy. Cancer Cell 27, 450-461 (2015).
3. Schadendorf, D. et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J. Clin. Oncol. 33, 1889-94 (2015).
4. Pitt, J. M. et al. Resistance Mechanisms to Immune-Checkpoint Blockade in Cancer: Tumor-Intrinsic and -Extrinsic Factors. Immunity 44, 1255-1269 (2016). 5. Parker, B. S., Rautela, J. i Hertzog, P. J. Antitumour actions of interferons: implications for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer 16, 131-44 (2016).
6. Hervas-Stubbs, S. et al. Direct effects of type I interferons on cells of the immune system. Clin. Cancer Res.17, 2619-27 (2011).
7. Fuertes, M. B., Woo, S. R., Burnett, B., Fu, Y. X. i Gajewski, T. F. Type I interferon response and innate immune sensing of cancer. Trends Immunol.34, 67-73 (2013). 8. De Palma, M. et al. Tumor-Targeted Interferon-Alpha Delivery by Tie2-Expressing Monocytes Inhibits Tumor Growth and Metastasis. Cancer Cell 14, 299-311 (2008).
9. Escobar, G. et al. Genetic engineering of hematopoiesis for targeted IFN-α delivery inhibits breast cancer progression. Sci. Transl. Med. 6, 217ra3 (2014).
10. Catarinella, M. et al. IFNα gene/cell therapy curbs colorectal cancer colonization of the liver by acting on the hepatic microenvironment. EMBO Mol. Med.8, 155-70 (2016).
11. Fesnak, A. D., June, C. H. i Levine, B. L. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer 16, 566-81 (2016).
12. Rosenberg, S. A. i Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science (80-. ).348, 62-68 (2015).
13. Sotillo, E. et al. Convergence of acquired mutations and alternative splicing of CD19 enables resistance to CART-19 immunotherapy. Cancer Discov.5, 1282-1295 (2015).
14. Nucera, S. et al. miRNA-126 Orchestrates an Oncogenic Program in B Cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell 29, 905-921 (2016).
15. De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C. i Naldini, L. Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells. Nat. Med.9, 789-95 (2003).
16. De Palma, M. et al. Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors. Cancer Cell 8, 211-26 (2005).
17. Mellman, I., Coukos, G. i Dranoff, G. Cancer immunotherapy comes of age. Nature 480, 480-9 (2011).
18. Kumar, V., Patel, S., Tcyganov, E. i Gabrilovich, D. I. The Nature of Myeloid-Derived Suppressor Cells in the Tumor Microenvironment. Trends Immunol. 37, 208-220 (2016).
19. Ruffell, B. i Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell 27, 462-472 (2015).
20. Joyce Johanna A. i Fearon Douglas T. T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment. Science (80-. ).348, (2015).
21. Verdegaal, E. M. E. et al. Neoantigen landscape dynamics during human melanoma-T cell interactions. Nature 536, 91-5 (2016).
22. Matsushita, H. et al. Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting. Nature 482, 400-4 (2012).
23. Linnemann, C. et al. High-throughput epitope discovery reveals frequent recognition of neo-antigens by CD4+ T cells in human melanoma. Nat Med 21, 81-85 (2015).
24. Lu, Y. C. et al. Efficient identification of mutated cancer antigens recognized by T cells associated with durable tumor regressions. Clin. Cancer Res.20, 3401-3410 (2014).
25. McGranahan, N. et al. Clonal neoantigens elicit T cell immunoreactivity and sensitivity to immune checkpoint blockade. Science (80-. ).351, 1463-1469 (2016).
26. Schumacher, T. N. i Schreiber, R. D. Neoantigens in cancer immunotherapy. Science (80-. ).348, 69-74 (2015).
27. Sharma, P. i Allison, J. P. Immune Checkpoint Targeting in Cancer Therapy : Toward Combination Strategies with Curative Potential. Cell 161, 205-214 (2015).
28. Schildberg, F. A., Klein, S. R., Freeman, G. J. i Sharpe, A. H. Coinhibitory Pathways in the B7-CD28 Ligand-Receptor Family. Immunity 44, 955-972 (2016).
29. Yang, X. et al. Targeting the Tumor Microenvironment with Interferon-β Bridges Innate and Adaptive Immune Responses. Cancer Cell 25, 37-48 (2014).
30. Huang, T.-H., Chintalacharuvu, K. R. i Morrison, S. L. Targeting IFN-alpha to B Cell Lymphoma by a Tumor-Specific Antibody Elicits Potent Antitumor Activities. J. Immunol. 179, 6881-6888 (2007).
31. Wilson, E. B. et al. Blockade of chronic type I interferon signaling to control persistent LCMV infection. Science 340, 202-7 (2013).
32. Sandler, N. G. et al. Type I interferon responses in rhesus macaques prevent SIV infection and slow disease progression. Nature 511, 601-605 (2014).
33. Joseph Benci, A. L. et al. Tumor Interferon Signaling Regulates a Multigenic Resistance Program to Immune Checkpoint Blockade. Cell 167, 1540-1554 (2016).
34. Gentles, A. J. et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nat. Med.21, 938-945 (2015).
35. Mlecnik, B. et al. Integrative Analyses of Colorectal Cancer Show Immunoscore Is a Stronger Predictor of Patient Survival Than Microsatellite Instability. Immunity 44, 698-711 (2016).
36. Bachireddy, P., Burkhardt, U. E., Rajasagi, M. i Wu, C. J. Haematological malignancies: at the forefront of immunotherapeutic innovation. Nat. Rev. Cancer 15, 201-215 (2015).
37. Mátrai, J. et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk.
Hepatology 53, 1696-1707 (2011).
38. Amendola, M., Venneri, M. A., Biffi, A., Vigna, E. i Naldini, L. Coordinate dualgene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters. Nat. Biotechnol. 23, 108-116 (2005).
39. Tumeh, P., Harview, C., Yearley, J. i Al, E. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature 515, 568-571 (2014).
40. Waggott, D. et al. NanoStringNorm: An extensible R package for the preprocessing of nanostring mRNA and miRNA data. Bioinformatics 28, 1546-1548 (2012).
41. Ritchie, M. E. et al. limma powers differential expression analyses for RNA742 sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res.43, e47 (2015).
42. R Development Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing Vienna Austria 0, {ISBN} 3-900051-07-0 (2016).
43. Pesarin, F. i Salmaso, L. Permutation Tests for Complex Data. Permutation Tests for Complex Data: Theory, Applications and Software (2010). doi:10.1002/9780470689516
44. Brunner, E. i Puri, M. L. Nonparametric methods in factorial designs. Stat. Pap.
42, 1-52 (2001).
45. Brunner, E., Domhof, S. i Langer, F. Nonparametric analysis of longitudinal data in factorial experiments. Wiley Ser. Probab. Stat. xvii, 261 (2002).
46. Noguchi, K., Gel, Y. R., Brunner, E. i Konietschke, F. nparLD: An R software package for the nonparametric analysis of longitudinal data in factorial experiments. J. Stat. Softw.50, 1-23 (2012).
47. Feys, J. New Nonparametric Rank Tests for Interactions in Factorial Designs with Repeated Measures New Nonparametric Rank Tests for.15, (2016).
48. Therneau, T. M. A Package for Survival Analysis in S. Survival (2015).

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Hematopoetska matična ćelija (HSC), hematopoetska progenitorna ćelija (HPC), mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit koji obuhvata vektor, pri čemu taj vektor obuhvata najmanje jednu mir-130a i/ili mir-126 ciljnu sekvencu koja je operativno povezana sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citokin za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera kod pacijenta, pri čemu se HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit koriste u kombinaciji sa T-ćelijom specifičnom za tumorski antigen (TAA),
poželjno pri čemu, citokin je interferon (IFN), IL-12 ili faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF),
poželjno, pri čemu, IFN je IFN tipa I (poželjno IFNα ili IFNβ) ili IFN tipa II (poželjno IFNγ),
poželjnije, pri čemu, IFN tipa I je IFNα.
2. HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu se HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit dalje koriste u kombinaciji sa inhibitorom imunske kontrolne tačke.
3. HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu T-ćelija specifična za TAA eksprimira himerni antigenski receptor (CAR) i/ili transgeni T-ćelijski receptor (TCR).
4. HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu, TAA je izabran iz grupe koja se sastoji od karcinoembrionalnog antigena (CEA), estrogenskog receptora, progesteronskog receptora, efrinB2, ROR1, mezotelina, c-Met, GD-2, i MAGE A3 TCR, 4-1BB, antigena adenokarcinoma, alfa-fetoproteina, BAFF, ćelije B-limfoma, C242 antigena, karbonske anhidraze 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (IgE receptor), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNT0888, CTLA-4, DR5, EpCAM, CD3, ekstra domena fibronektina-B, receptora folata 1, glikoproteina 75, GPNMB, HGF, kinaze humanog receptora faktora rasipanja, IGF-1 receptora, IGF-I, IgGI, L1-CAM, IL-13, IL-6, receptora faktora rasta nalik insulinu I, integrina α5β1, integrina αvβ3, MORAb-009, MS4A1, mucina CanAg, N-glikolil neuraminske kiseline, NPC-1C, PDGF-Rα, PDL192, fosfatidil serina, ćelija karcinoma prostate, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, tenascina C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, tumorskog antigena CTAA16.88, vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentina, 5T4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1 (CDw52), HLA-DR, anti-idiotipa, TAG-72, Ep-CAM, MUC1, folat vezujućeg proteina, A33, G250, membranskog antigena specifičnog za prostatu, (PSMA), antigena specifičnog za prostatu (PSA), feritina, gangliozida (npr. GD2, GD3, GM2), Le<y>, CA-125, CA19-9, receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), p185HER2, IL-2 receptora, de2-7 EGFR, proteina aktivacije fibroblasta (FAP), tenascina, metaloproteinaza, endosijalina, karbonske anhidraze, galektina 9, aldolaze A, elFγ4, tirozinaze, galektina 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, restina, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-katenina/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) i DAM-10 (MAGE-B1), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MC1R, miozina/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NY-ESO-1, P15, p190 minor bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, proteina 1, gp75, TRP-2, TRP-2/INT2 i WT1,
poželjno, pri čemu T-ćelija specifična za TAA eksprimira CD19-specifičan CAR.
5. HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, pri čemu je T-ćelija specifična za TAA dobijena od ćelije koja je izolovana od pacijenta.
6. HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, pri čemu je T-ćelija specifična za TAA konstruisana da ometa najmanje jedan endogeni gen, poželjno pri čemu je najmanje jedan endogeni gen izabran od endogenog gena koji kodira α lanac TCR, β lanac TCR i glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC).
7. HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2-6, pri čemu, inhibitor imunske kontrolne tačke: (i) je antitelo, poželjno pri čemu je inhibitor imunske kontrolne tačke izabran iz grupe koja se sastoji od anti-CTLA4 antitela, anti-PD1 antitela, anti-PDL1 antitela, anti-PDL2 antitela i anti-LAG-3 antitela; i/ili
(ii) inhibira inhibitorni molekul kontrolne tačke izabran iz grupe koja se sastoji od A2AR (receptor adenozina A2A), B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), BTLA (atenuator B i T limfocita; CD272), HVEM (medijator ulaska herpes virusa), CTLA-4 (protein 4 povezan sa citotoksičnim T limfocitom; CD152), IDO (indolamin 2,3-dioksigenaza), TDO (triptofan 2,3-dioksigenaza), KIR (receptor ćelije ubice sličan imunoglobulinu), LAG3 (gen aktivacije limfocita-3), PD-1 (receptor programirane smrti 1), PD-L1 (PD-1 ligand 1), PD-L2 (PD-1 ligand 2), TIM-3 (T-ćelijski domen imunoglobulina i domen mucina 3), VISTA (V-domen Ig supresora T-ćelijske aktivacije), B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86).
8. HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, pri čemu vektor obuhvata:
(i) najmanje jednu mir-130a ciljnu sekvencu i najmanje jednu mir-126 ciljnu sekvencu, poželjno pri čemu vektor obuhvata dve mir-130a ciljne sekvence i dve mir-126 ciljne sekvence; i/ili
(ii) promoter specifičan za tkivo koji je operativno povezan sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citokin, poželjno pri čemu, promoter specifičan za tkivo je TEK (Tie2) promoter.
9. HSC, HPC, mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, pri čemu, kancer je hematološki malignitet ili čvrsti tumor, poželjno pri čemu je hematološki malignitet izabran iz grupe koja se sastoji od akutne mijeloidne leukemije (AML), limfoblastne leukemije, akutne limfoblastne leukemije (ALL), mijelodisplastičnih sindroma (MDS), mijeloproliferativne neoplazme (MPN), primarne mijelofibroze, esencijalne trombocitemije, policitemije vera, atipične hronične mijeloidne leukemije, hronične mijeloidne leukemije (CML), limfoma, multiplog mijeloma, non-Hodžkinovog limfoma i Hodžkinovog limfoma; ili poželjno pri čemu je čvrsti tumor izabran iz grupe koja se sastoji od kancera pluća, kancera dojke, kancera jednjaka, kancera želuca, kancera kolona, holangiokarcinoma, kancera pankreasa, kancera jajnika, kancera glave i vrata, sinovijalnog sarkoma, angiosarkoma, osteosarkoma, tiroidnog kancera, kancera endometrijuma, neuroblastoma, rabdomiosarkoma, kancera jetre, melanoma, kancera prostate, kancera bubrega, sarkoma mekog tkiva, urotelijalnog kancera, bilijarnog kancera, glioblastoma, kancera grlića materice i kolorektalnog kancera.
10. T-ćelija specifična za tumorski antigen (TAA) za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera kod pacijenta pri čemu su na pacijentu prethodno primenjivani hematopoetska matična ćelija (HSC), hematopoetska progenitorna ćelija (HPC), mijeloidno/monocitno predodređena progenitorna ćelija, makrofag ili monocit koji obuhvataju vektor, pri čemu vektor obuhvata najmanje jednu mir-130a i/ili mir-126 ciljnu sekvencu operativno povezanu sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citokin, poželjno pri čemu je TAA izabran iz grupe koja se sastoji od karcinoembrionalnog antigena (CEA), estrogenskog receptora, progesteronskog receptora, efrinB2, ROR1, mezotelina, c-Met, GD-2, i MAGE A3 TCR, 4-1BB, antigena adenokarcinoma, alfa-fetoproteina, BAFF, ćelije B-limfoma, C242 antigena, karbonske anhidraze 9 (CA-IX), CCR4, CD152, CD200, CD22, CD19, CD22, CD123, CD221, CD23 (IgE receptor), CD28, CD4, CD40, CD44, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CS-1, CNT0888, CTLA-4, DR5, EpCAM, CD3, ekstra domena fibronektina-B, receptora folata 1, glikoproteina 75, GPNMB, HGF, kinaze humanog receptora faktora rasipanja, IGF-1 receptora, IGF-I, IgGI, L1-CAM, IL-13, IL-6, receptora faktora rasta nalik insulinu I, integrina α5β1, integrina αvβ3, MORAb-009, MS4A1, mucina CanAg, N-glikolil neuraminske kiseline, NPC-1C, PDGF-Rα, PDL192, fosfatidil serina, ćelija karcinoma prostate, RANKL, RON, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, tenascina C, TGF beta 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, tumorskog antigena CTAA16.88, vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, vimentina, 5T4, CD5, CD19, CD20, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, CAMPATH-1 (CDw52), HLA-DR, anti-idiotipa, TAG-72, Ep-CAM, MUC1, folat vezujućeg proteina, A33, G250, membranskog antigena specifičnog za prostatu, (PSMA), antigena specifičnog za prostatu (PSA), feritina, gangliozida (npr. GD2, GD3, GM2), Le<y>, CA-125, CA19-9, receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), p185HER2, IL-2 receptora, de2-7 EGFR, proteina aktivacije fibroblasta (FAP), tenascina, metaloproteinaza, endosijalina, karbonske anhidraze, galektina 9, aldolaze A, elFγ4, tirozinaze, galektina 4, HERKV-K10, p53, NY-LU-12, restina, NY-CO-38, MAGE-1, MAGE-4a, SSX2, NY-ESO-1, SCP-1, 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, b-katenina/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27m, CDK4/m, CT, Cyp-B, DAM-6 (MAGE-B2) i DAM-10 (MAGE-B1), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT (hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/melan-A, MC1R, miozina/m, MUC1, MUM-1, MUM2, MUM-3, NA88-A, NY-ESO-1, P15, p190 minor bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, RAGE, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, proteina 1, gp75, TRP-2, TRP-2/INT2 i WT1, poželjno pri čemu T-ćelija specifična za TAA eksprimira himerni antigenski receptor (CAR) i/ili transgeni T-ćelijski receptor (TCR),
poželjno pri čemu, citokin je interferon (IFN), IL-12 ili faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF),
poželjno, pri čemu, IFN je IFN tipa I (poželjno IFNα ili IFNβ) ili IFN tipa II (poželjno IFNγ),
poželjnije, pri čemu, IFN tipa I je IFNα,
poželjno, pri čemu T-ćelija specifična za TAA eksprimira CAR specifičan za CD19.
11. T-ćelija specifična za TAA za upotrebu prema zahtevu 10, pri čemu vektor obuhvata:
(i) najmanje jednu mir-130a ciljnu sekvencu i najmanje jednu mir-126 ciljnu sekvencu, poželjno pri čemu vektor obuhvata dve mir-130a ciljne sekvence i dve mir-126 ciljne sekvence; i/ili
(ii) promoter specifičan za tkivo koji je operativno povezan sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citokin, poželjno pri čemu, promoter specifičan za tkivo je TEK (Tie2) promoter.
12. T-ćelija specifična za TAA za upotrebu prema zahtevu 10 ili 11, pri čemu, kancer je hematološki malignitet ili čvrsti tumor, poželjno pri čemu je hematološki malignitet izabran iz grupe koja se sastoji od akutne mijeloidne leukemije (AML), limfoblastne leukemije, akutne limfoblastne leukemije (ALL), mijelodisplastičnih sindroma (MDS), limfoma, multiplog mijeloma, non-Hodžkinovog limfoma i Hodžkinovog limfoma; ili poželjno pri čemu je čvrsti tumor izabran iz grupe koja se sastoji od kancera pluća, kancera dojke, kancera jednjaka, kancera želuca, kancera kolona, holangiokarcinoma, kancera pankreasa, kancera jajnika, kancera glave i vrata, sinovijalnog sarkoma, angiosarkoma, osteosarkoma, tiroidnog kancera, kancera endometrijuma, neuroblastoma, rabdomiosarkoma, kancera jetre, melanoma, kancera prostate, kancera bubrega, sarkoma mekog tkiva, urotelijalnog kancera, bilijarnog kancera, glioblastoma, kancera grlića materice i kolorektalnog kancera.
13. Proizvod koji sadrži: (a) hematopoetsku matičnu ćeliju (HSC), hematopoetsku progenitornu ćeliju (HPC), mijeloidno/monocitno predodređenu progenitornu ćeliju, makrofag ili monocit koji obuhvataju vektor, pri čemu taj vektor obuhvata najmanje jednu mir-130a i/ili mir-126 ciljnu sekvencu koja je operativno povezana sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citokin; i (b) T-ćeliju specifičnu za tumorski antigen (TAA), poželjno pri čemu, citokin je interferon (IFN), IL-12 ili faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF),
poželjno, pri čemu, IFN je IFN tipa I (poželjno IFNα ili IFNβ) ili IFN tipa II (poželjno IFNγ),
poželjnije, pri čemu, IFN tipa I je IFNα.
RS20241344A 2017-04-21 2018-04-20 Genska terapija RS66264B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1706410.6A GB201706410D0 (en) 2017-04-21 2017-04-21 Type 1 interferon gene therapy
GBGB1801511.5A GB201801511D0 (en) 2018-01-30 2018-01-30 Gene therapy
EP18724470.2A EP3612624B1 (en) 2017-04-21 2018-04-20 Gene therapy
PCT/EP2018/060238 WO2018193119A1 (en) 2017-04-21 2018-04-20 Gene therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66264B1 true RS66264B1 (sr) 2024-12-31

Family

ID=62165525

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20241344A RS66264B1 (sr) 2017-04-21 2018-04-20 Genska terapija

Country Status (23)

Country Link
US (1) US20200078408A1 (sr)
EP (2) EP4491233A3 (sr)
JP (2) JP7252135B2 (sr)
KR (1) KR102733541B1 (sr)
CN (1) CN110785488A (sr)
AU (1) AU2018253959B2 (sr)
BR (1) BR112019021953A2 (sr)
CA (1) CA3060145A1 (sr)
DK (1) DK3612624T3 (sr)
ES (1) ES2995785T3 (sr)
FI (1) FI3612624T3 (sr)
HR (1) HRP20241603T1 (sr)
HU (1) HUE069690T2 (sr)
IL (2) IL270028B2 (sr)
LT (1) LT3612624T (sr)
MX (2) MX2024012023A (sr)
PL (1) PL3612624T3 (sr)
PT (1) PT3612624T (sr)
RS (1) RS66264B1 (sr)
SG (1) SG11201909814WA (sr)
SI (1) SI3612624T1 (sr)
SM (1) SMT202400506T1 (sr)
WO (1) WO2018193119A1 (sr)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113710796A (zh) * 2019-02-09 2021-11-26 美国卫生和人力服务部 作为减少或预防转移、治疗自身免疫和炎性病症以及重新平衡免疫环境和失调的小生境的平台的基因修饰的造血干细胞和祖细胞(hspc)及间充质细胞
CA3129036A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-27 Oncolytics Biotech Inc. T cell repertoire dynamics and oncolytic viral therapy
EP3941490A4 (en) * 2019-03-20 2023-01-04 2seventy bio, Inc. ADOPTIVE CELLULAR THERAPY
CN112280829B (zh) * 2020-04-07 2023-12-26 南方科技大学 一种试剂盒、样本标记方法、单细胞测序方法
KR20230010231A (ko) * 2020-05-11 2023-01-18 아빈투스 바이오, 인코포레이티드 생체내 형질도입을 위한 벡터 및 방법
GB202007169D0 (en) * 2020-05-14 2020-07-01 Ospedale San Raffaele Srl Epidermal growth factor receptor
EP4161536A4 (en) * 2020-06-04 2024-08-14 Carisma Therapeutics Inc. Novel constructs for chimeric antigen receptors
CN114426953A (zh) * 2020-10-29 2022-05-03 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达il-12的多能干细胞衍生物及应用
JP2023547692A (ja) * 2020-11-03 2023-11-13 ▲広▼州▲輯▼因医▲療▼科技有限公司 細胞製剤、造血幹細胞を特徴付けるためのタンパク質の使用、及び造血幹細胞を判定するための方法
CN114807155A (zh) * 2021-01-18 2022-07-29 华东师范大学 用于基因编辑的组合物及其应用
CN115819612A (zh) * 2022-03-11 2023-03-21 郑州大学第一附属医院 表达载体、宿主细胞、抗肿瘤药物组合物及其应用
WO2024068617A1 (en) * 2022-09-26 2024-04-04 Institut Curie Myeloid cells expressing il-2 and uses thereof for quick anticancer therapy
CN120603934A (zh) * 2023-02-08 2025-09-05 国立大学法人九州大学 能够在肿瘤组织内分化成m2巨噬细胞且分化成m2巨噬细胞时表达炎性细胞因子的细胞和含有该细胞的组合物
WO2024194223A2 (en) * 2023-03-17 2024-09-26 Ospedale San Raffaele S.R.L. Gene therapy
WO2025217427A1 (en) * 2024-04-11 2025-10-16 Genenta Science S.P.A. Combination immunotherapy of solid cancers

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9803351D0 (en) * 1998-02-17 1998-04-15 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
GB0009760D0 (en) 2000-04-19 2000-06-07 Oxford Biomedica Ltd Method
SI2856876T1 (en) * 2007-03-30 2018-04-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred T lymphocytes
PL2424571T3 (pl) * 2009-04-30 2020-10-19 Ospedale San Raffaele S.R.L Wektor genowy
AU2013374345A1 (en) * 2013-01-17 2015-08-06 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
US10562952B2 (en) * 2015-09-10 2020-02-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-CD276 chimeric antigen receptors
WO2017093969A1 (en) * 2015-12-04 2017-06-08 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology

Also Published As

Publication number Publication date
PL3612624T3 (pl) 2025-02-24
EP4491233A3 (en) 2025-04-16
MX2024012023A (es) 2025-02-10
IL320674A (en) 2025-07-01
IL270028A (sr) 2019-12-31
HUE069690T2 (hu) 2025-04-28
EP3612624B1 (en) 2024-09-25
WO2018193119A1 (en) 2018-10-25
DK3612624T3 (da) 2024-12-09
IL270028B2 (en) 2025-10-01
KR20200020677A (ko) 2020-02-26
AU2018253959B2 (en) 2024-11-21
JP7252135B2 (ja) 2023-04-04
HRP20241603T1 (hr) 2025-01-31
SI3612624T1 (sl) 2025-03-31
CA3060145A1 (en) 2018-10-25
IL270028B1 (en) 2025-06-01
JP2020517261A (ja) 2020-06-18
ES2995785T3 (en) 2025-02-11
EP4491233A2 (en) 2025-01-15
FI3612624T3 (fi) 2024-12-04
LT3612624T (lt) 2025-01-10
MX2024012024A (es) 2025-02-10
EP3612624A1 (en) 2020-02-26
KR102733541B1 (ko) 2024-11-22
JP2023078376A (ja) 2023-06-06
SMT202400506T1 (it) 2025-01-14
PT3612624T (pt) 2024-11-29
SG11201909814WA (en) 2019-11-28
US20200078408A1 (en) 2020-03-12
CN110785488A (zh) 2020-02-11
BR112019021953A2 (pt) 2020-07-21
AU2018253959A1 (en) 2019-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102733541B1 (ko) 유전자 치료법
US11344577B2 (en) Car+ T cells genetically modified to eliminate expression of T-cell receptor and/or HLA
JP6866475B2 (ja) マイナー組織適合性（ｈ）抗原ｈａ−１に特異的なｔｃｒ及びその使用
KR102357004B1 (ko) 입양 세포 면역요법의 효능을 강화하기 위한 조성물 및 방법
EP3368075B1 (en) Chimeric antigen receptor molecules and uses thereof
AU2015254595B2 (en) CS1 specific multi-chain chimeric antigen receptor
US20250152717A1 (en) Binding proteins and engineered cells specific for neoantigens and uses thereof
CA2997749A1 (en) Ny-eso-1 specific tcrs and methods of use thereof
KR20160068960A (ko) 면역요법을 위한 다클론성 감마 델타 t 세포
JP2022542102A (ja) Ｓｕｖ３９ｈ１欠損免疫細胞
CN117441010A (zh) 从诱导多能干细胞产生α-βT细胞的组合物和方法
KR20210021522A (ko) Cd79a 키메라 항원 수용체
CN115885038A (zh) 表达嵌合抗原受体的免疫活性细胞
KR20250046298A (ko) 자연 살해 세포 기능을 향상시키기 위한 표적 유전자의 유전자 편집
JP2026021420A (ja) 二重ｃａｒ－ｔ細胞
JP2024541976A (ja) キメラアダプターポリペプチド
JP2024502170A (ja) 癌のための改良された養子細胞移植療法
JP2024502170A5 (sr)
EA046120B1 (ru) Генная терапия
WO2024238938A1 (en) Modulation of the btla-hvem axis to enhance adoptive cell transfer immunotherapy
HK1260234B (en) Chimeric antigen receptor molecules and uses thereof
HK1260234A1 (en) Chimeric antigen receptor molecules and uses thereof