RS66469B1

RS66469B1 - Nove imunogene formulacije koje obuhvataju linearne ili razgranate polimere poliakrilne kiseline kao adjuvanse

Info

Publication number: RS66469B1
Application number: RS20250057A
Authority: RS
Inventors: Guillaume Rigaut; Alexis Guy André Lucien Parisot; Luca Karelle De; Christine Michele Pierrette Andreoni; Lydie Remolue; Marie Garinot; Jean-Francois Cotte; Patricia Probeck-Quellec; Jean Haensler; Véronique Chambon; Philippe Talaga
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh; Sanofi Pasteur
Priority date: 2016-06-17
Filing date: 2017-06-15
Publication date: 2025-03-31
Also published as: EP3471760B1; CA3027877A1; BR112018076015A2; US20170360923A1; JP2019524873A; EP3471760A1; KR20190044052A; WO2017218819A1; ES3006465T3; US11554170B2; PL3471760T3; LT3471760T; MX2018015787A; AU2017286727B2; PT3471760T; MX395520B; KR102724939B1; DK3471760T3; JP7018941B2; CN109475615B

Description

Opis

UNAKRSNO UPUĆIVANJE NA POVEZANE PRIJAVE

[0001] Ova prijava ima prioritet u odnosu na U.S. privremenu prijavu br.62/351,492, koja je podneta 17. juna 2016.

UKLJUČIVANJE PUTEM REFERENCI

[0002] Sve prethodne prijave i svi dokumenti navedeni u njima ili tokom zahteva za njihovim priznanjem („dokumenti navedeni u prijavi“) i svi dokumenti navedeni ili dati kao reference u dokumentima navedenim u prijavi, i svi dokumenti navedeni ili dati kao reference u ovom tekstu („dokumenti navedeni u ovom tekstu“), kao i svi dokumenti navedeni ili dati kao referenca u dokumentima navedenim u ovom tekstu, zajedno sa uputstvom proizvođača, opisima, specifikacijama proizvoda i tehničkim listovima za bilo koje ovde pomenute proizvode mogu da se koriste u primeni ovog pronalaska. Navođenje ili otkrivanje bilo kog takvog dokumenta u ovoj prijavi nije potvrda da je takav dokument dostupan kao prethodno stanje struke za predmetni pronalazak i ni na koji način nije odraz validnosti, mogućnosti patentiranja i/ili izvodljivosti takvih navedenih patentnih dokumenata. Sve sekvence koje su ovde označene putem GenBank pristupnih brojeva su kao što su date u GenBank zaključno sa datumom podnošenja predmetne prijave.

OBLAST PRONALASKA

[0003] Ovaj pronalazak pripada oblasti vakcina. Konkretno, pronalazak se odnosi na određene adjuvanse i adjuvantne kompozicije i na procese za pripremu takvih adjuvanasa i adjuvantnih kompozicija.

OSNOVA PRONALASKA

[0004] Prethodno je već predložena upotreba polimera, uključujući jedinice akrilne kiseline, kao adjuvansa u sastavu vakcina. Polimeri poliakrilnih kiselina koji su preporučeni kao adjuvansi su najčešće umreženi polimeri. Na primer, US 3,790,665 i US 3,919,411 opisuju upotrebu polimera akrilne kiseline umreženog sa polialil saharidom, kao adjuvansa. Adjuvansi koji odgovaraju polimerima akrilne ili metakrilne kiseline koji su umreženi, naročito sa polialkenil etrima šećera ili polialkohola, takođe su opisani u US 7,163,926. Takvi polimeri se prodaju pod nazivom CARBOPOL<®>. Upotreba polimera CARBOPOL 974P, 934P i 971P, koji su umreženi polimeri sa velikom Mm (tj. oko 3 miliona za 974P, prema podacima koje daje proizvođač), opisana je u US 7,163,926, EP 1058 558 i WO 2009/118523.

[0005] Određeni istraživački napori su bili usmereni na upotrebu linearnih polimera poliakrilne kiseline koji imaju malu masu ili kopolimera akrilna kiselina / estar akrilne kiseline:

WO 2005/065712 predlaže kompleks koji obuhvata polimer sa uskim opsegom raspodele molekulske mase koji uključuje jedinice izvedene od akrilne kiseline ili njene soli, i supstancu koja ima farmakološku aktivnost na patogeni organizam ili kancer, ili jedan ili više antigena ili imunogena. Polimer može biti homopolimer ili kopolimer akrilne kiseline ili metakrilne kiseline ili soli prethodnog. Predlaže se molekulska masa od 100.000 ili manja.

US 6,610,310 i EP 0 804 234 opisuju upotrebu polimera koji ima anjonske gradivne ponavljajuće monomerne jedinice i hidrofobne gradivne ponavljajuće monomerne jedinice. Konkretno, EP0804234 otkriva upotrebu polimera koji se delimično sastoji od jedinica akrilne kiseline (anjonske gradivne ponavljajuće jedinice) i estara jedinice akrilne kiseline (gradivne hidrofobne ponavljajuće jedinice) kao adjuvansa za vakcinu u vodenom rastvoru. Polimer poliakrilne kiseline CARBOPOL<®>907 se u ovim dokumentima poredi sa njegovim predloženim homolognim delimično esterifikovanim polimerima poliakrilne kiseline i dovodi do lošijeg imunskog odgovora. Slično tome, rad autora L. Hilgers et al. u Vaccine, 2000, 18, 3319-3325 i Vaccine 1998 sveska 16, br. 16, 1575-1581 takođe otkriva upotrebu takvih esterifikovanih polimera i pokazuje da upotreba alkil estara poliakrilne kiseline u većini slučajeva dovodi do boljeg imunskog odgovora. CARBOPOL<®>907 je polimer poliakrilne kiseline koji danas više nije dostupan i čije karakteristike ne mogu pouzdano da se utvrde. Pripada porodici CARBOPOL, za koju je poznato da je čine umreženi polimeri. Ovaj polimer ima prosečnu molekulsku masu Mm koja se razlikuje od dokumentovane: publikacija Vaccine, 1998 sveska 16, br.16, strane 1575 do 1581 daje prosečnu molekulsku masu Mm od 450 kDa bez preciziranja u pogledu postupka koji je korišćen za njeno dobijanje. Ne pominje njen indeks polidisperznosti. Nasuprot tome, „Liquid Detergents“, surfactant series Science, sveska 67, strana 147 (1996, CRC Press, Publisher: Kuo-Yann Lai), za isti polimer navodi prosečnu molekulsku masu Mm od 603,3 kDa koja je određena pomoću hromatografske tehnike putem gel permeacije (GPC) i indeks polidisperznosti IP od 4,124. Postoje nedoumice vezane za karakteristike CARBOPOL<®>907. Pored toga, podaci o Mm koje daju proizvođači se najčešće razlikuju od Mm koja može da se odredi pomoću standardizovanih postupaka, kao što je prikazano u primerima iz predmetne patentne prijave.

[0006] Pored nedoumica u pogledu tačnih karakteristika postojećih polimernih adjuvanasa, i dalje postoji potreba za razvojem novih adjuvanasa sa poboljšanim svojstvima u pogledu bezbednosti i delotvornosti. Predmetno otkriće zadovoljava te potrebe tako što obezbeđuje bezbedne i delotvorne imunološke formulacije i formulacije vakcina koje obuhvataju neumrežene polimere akrilne kiseline kao adjuvanse.

KRATAK SAŽETAK PRONALASKA

[0007] U prvom aspektu, otkriće obezbeđuje formulacije koje obuhvataju novu klasu polimera kao adjuvans za vakcine. Kao što je ovde otkriveno, ova klasa polimera je pokazala bezbednost i delotvornost u pojačavanju formulacija za širok raspon antigena, za upotrebu u primeni na širokom rasponu životinjskih vrsta. Ova klasa polimera proizvodi povoljna adjuvantna svojstva, u poređenju sa drugim porodicama polimera poliakrilnih kiselina koje su korišćene u prethodnom stanju struke.

[0008] U jednom otelotvorenju prvog aspekta, ovaj pronalazak obezbeđuje porodicu polimera koji su naročito delotvorni kao adjuvans. U jednom konkretnom otelotvorenju, ovaj pronalazak obezbeđuje klasu polimera koji neočekivano promovišu snažne odgovore Th-1, pored odgovora Th-2.

[0009] Pored toga, neki polimeri izabrani prema pronalasku dovode do adjuvantne kompozicije i, usled toga, do kompozicije vakcina. U jednom konkretnom otelotvorenju, kompozicije vakcina iz predmetnog pronalaska su bezbednije, naročito u pogledu reproduktivnosti i smanjenja zagađivača, što je često nekompatibilno sa stabilnošću skladištenja vakcina. U još konkretnijem otelotvorenju, izabrani polimeri su takođe stabilni i mogu da se sterilišu pomoću autoklava.

[0010] U ovom kontekstu, ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutski prihvatljivu so linearnog ili razgranatog polimera poliakrilne kiseline, za upotrebu kao adjuvans u kompoziciji vakcina, naznačenu time što pomenuta so polimera poliakrilne kiseline ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 350 do 650 kDa i sadrži manje od 0,005% persulfata, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski prihvatljiva so linearnog ili razgranatog polimera poliakrilne kiseline može da sadrži manje od 0,001% m/m persulfata, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline.

[0011] Konkretno, pomenuta so polimera poliakrilne kiseline se sastoji isključivo od jedinica koje su so akrilne kiseline ili se sastoji isključivo od jedinica koje su oblik slobodne kiseline akrilne kiseline i jedinica koje su so akrilne kiseline.

[0012] Pomenuta so polimera poliakrilne kiseline pogodno sadrži manje od 0,005%, poželjno manje od 0,001% m/m oksidacionih sredstava, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline i/ili sadrži manje od 0,001% m/m persulfata, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline.

[0013] U konkretnijem otelotvorenju, pomenuti polimer poliakrilne kiseline je so sa Na<+>.

[0014] U konkretnim otelotvorenjima, pomenuta so polimera poliakrilne kiseline ima indeks polidisperznosti manji ili jednak oko 4, poželjno manji ili jednak oko 2,5.

[0015] U konkretnim otelotvorenjima, pomenuta so polimera poliakrilne kiseline ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4; ili ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4; ili ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2,5; ili ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2.

[0016] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski prihvatljiva so linearnog ili razgranatog polimera poliakrilne kiseline može imati nagib Mark-Hauvinkove krive veći ili jednak 0,7.

[0017] Pomenuta so polimera poliakrilne kiseline pogodno ima manje od 0,005% m/m monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili u obliku soli, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline.

[0018] Prema poželjnim otelotvorenjima, pomenuta so polimera poliakrilne kiseline je dijafiltrirana i sterilisana.

[0019] Pogodno, so polimera poliakrilne kiseline opisana u ovom pronalasku koristi se za pojačavanje imunskog odgovora Th1 koji se dobija pomoću kompozicije vakcine. Imunski odgovor Th1 je veći od imunskog odgovora Th1 koji se dobija kada se kao adjuvans koristi so polimera poliakrilne kiseline sa manjom molekulskom masom Mm.

[0020] Još jedan aspekt pronalaska se takođe bavi procesom za pripremu farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline opisane u pronalasku, koji obuhvata sledeće uzastopne korake:

a) postojanje rastvora polimera poliakrilne kiseline,

b) prečišćavanje rastvora polimera poliakrilne kiseline, kako bi se uklonile nečistoće, i

c) sterilizaciju prečišćenog rastvora polimera poliakrilne kiseline.

[0021] Pronalazak se takođe odnosi na proces za skladištenje rastvora soli polimera poliakrilne kiseline opisane u pronalasku koji obuhvata takav proces pripreme, nakon čega sledi korak skladištenja dobijene farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline u rastvoru.

[0022] U trećem aspektu, pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju vakcine koja obuhvata najmanje jedan aktivni agens za vakcinu (npr. imunogen ili nukleinska kiselina koja kodira imunogen) i farmaceutski prihvatljivu so polimera poliakrilne kiseline koja je u pronalasku opisana kao adjuvans. U jednom konkretnom otelotvorenju, imunogen može biti izabran od: inaktiviranih patogena, atenuisanih patogena, podjediničnih antigena, prečišćenih antigena, neprečišćenih antigena ili antigena koji su rekombinantno proizvedeni koristeći ćelije bakterija, kvasaca, biljaka, insekata ili životinja, ekspresione vektore uključujući plazmide, i slično. Antigeni mogu da se prečiste na načine koji su dobro poznati u struci uključujući, bez ograničenja, ultrafiltraciju, ultracentrifugiranje, gel filtraciju na molekulskim sitima, jonoizmenjivačku hromatografiju i prečišćavanje pomoću PEG. Patogen poreklom može biti bakterijski, virusni, protozoalni ili gljivični ili imunogen može predstavljati antitoksin.

[0023] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju vakcine koja obuhvata najmanje jedan aktivni agens za vakcinu i farmaceutski prihvatljivu so polimera poliakrilne kiseline opisanu ovde kao adjuvans za upotrebu u postupku izazivanja imunskog odgovora kod vakcinacije protiv patogena, što obuhvata primenu kompozicije vakcine iz predmetnog pronalaska na vakcinisanoj osobi.

[0024] Napominje se da u ovom otkriću, a naročito u zahtevima, termini poput „obuhvata“, „obuhvaćen“, „koji obuhvata“ i slično mogu imati značenje koje se pripisuje takvim terminima u U.S. patentnom zakonu; npr. mogu da znače „uključuje“, „uključen“, „uključujući“ i slično; i da termini poput „koji se suštinski sastoji od“ i „suštinski se sastoji od“ imaju značenje koje im je dodeljeno U.S. patentnim zahtevom, npr. dopuštaju elemente koji nisu izričito navedeni, ali isključuju elemente koji se nalaze u prethodnom stanju struke ili koji utiču na osnovne ili nove karakteristike pronalaska.

[0025] Termin „oko“, kao što se ovde koristi, znači približno, u okviru, grubo ili okvirno. Kada se termin „oko“ koristi zajedno sa numeričkim rasponom, on modifikuje taj raspon širenjem granica iznad i ispod numeričkih vrednosti koje su prikazane. Uopšteno, termin „oko“ ovde se koristi da modifikuje numeričku vrednost iznad i ispod navedene vrednosti za odstupanje od 10%. U jednom aspektu, termin „oko“ znači plus ili minus 20% numeričke vrednosti broja sa kojim se taj termin koristi. Stoga, oko 50% znači u rasponu od 45% do 55%. Numerički rasponi koji su ovde navedeni putem krajnjih tačaka uključuju sve brojeve i razlomke obuhvaćene tim rasponom (npr. 1 do 5 uključuje 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,90, 4 i 5). Takođe treba razumeti da svi brojevi i njihovi razlomci bivaju modifikovani pomoću termina „oko“.

[0026] Ova i druga otelotvorenja su otkrivena ili su očigledna na osnovu sledećeg detaljnog opisa i obuhvaćena su njime.

KRATAK OPIS SLIKA

[0027] Kompletno i omogućavajuće otkriće predmetnog pronalaska, uključujući njegov najbolji oblik, osobi sa uobičajenim znanjem i veštinama u ovoj oblasti konkretnije je prikazano u ostatku ove specifikacije, uključujući upućivanje na prateće slike, pri čemu:

SL. 1 je grafikon koji prikazuje titar antitela (IgG1 i IgG2a) za OF1 miševe koji su imunizovani dana D0, D21 i D35 sa 2,5 µg PS5-rEPA po mišu po injekciji, ubrizgano samostalno ili zajedno sa 200 µg CARBOPOL, PAA20 ili PAA225000;

SL. 2 je grafikon koji prikazuje geometrijsku sredinu titra neutrališućeg antitela (GMT) seruma grupa C57BL/6 miševa imunizovanih sa 2 µg hCMV-gB i skvalenskom emulzijom, PAA3000, PAA6000, PAA50000, PAA60000, PAA20 ili PAA225000, na osnovu merenja fibroblasta MRC5;

SL. 3 je grafikon koji prikazuje GMT za grupe sa SL. 2, kao što je utvrđeno seroneutralizacijom na ARPE-19 ćelijama (humane epitelne ćelije);

SL. 4 je grafikon koji prikazuje serumska IgG1 antitela usmerena na hCMV-gB antigen za grupe sa SL.2, određena pomoću ELISA testa;

SL. 5 je grafikon koji prikazuje serumska IgG2c antitela usmerena na hCMV-gB antigen za grupe sa SL.2, određena pomoću ELISA testa;

SL. 6 je grafikon koji prikazuje nivoe citokina IL5 za grupe sa SL.2, izmerene koristeći komplet CBA Flex set;

SL. 7 je grafikon koji prikazuje nivoe citokina IFNγ za grupe sa SL. 2, izmerene koristeći komplet CBA Flex set;

SL. 8 je grafikon koji prikazuje serologiju na besnilo za grupe pasa vakcinisane neaktivnim besnilom PAA225000; AF03; PAA60000; ili skvalenskom emulzijom;

SL. 9 je grafikon koji prikazuje serologiju na CIV za grupe pasa koji su vakcinisani rekombinantnim gripom vektorisanim virusom boginja kanarinca (1) PBS; (2) CARBOMER (4 mg/ml); (3) PAA60000 (4mg/ml); ili (4) PAA225000 (4 mg/ml). Grupa 5 je primila samo PBS (tj. ni rekombinantni antigen za grip ni adjuvans);

SL.10 je grafikon koji prikazuju ekspanziju seroloških podataka 41. dana koji su prikazani na SL.9;

SL. 11 je grafikon koji prikazuje srednji titar antitela na grip određen putem SRH za grupe konja koji su vakcinisani sa vCP1533+vCP2242 (svaki ima HA gen od virusa gripa) i toksinom tetanusa jednog od sledećeg: (A) CARBOMER (4 mg/ml); (B) PAA60000 (4 mg/ml); (C) PAA225000 (4 mg/ml); (D) ADVAX1 (20 mg/ml); (E) ADVAX2 (20 mg/ml). Grupa (F) je primila samo PBS (tj. ni antigen ni adjuvans);

SL. 12 je grafikon koji prikazuje serologiju na tetanus za svaku grupu konja do D35. Grupe: isto kao što je prikazano na SL.11;

SL.13 je grafikon koji prikazuje rezultate serologije na tetanus kod konja do D63;

SL. 14 je grafikon koji prikazuje srednju serologiju na SpaA za svaku grupu svinja (do D59). Grupe: (G1) SpaA TS6; (G2) SpaA PAA60000; (G3) SpaA PAA225000; SpaA-FlaB-His PBS; (G5) SpaA-FlaB-His PAA225000; (G6) PBS.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0028] Drugi predmeti, osobine i aspekti predmetnog pronalaska su otkriveni u sledećem detaljnom opisu ili su očigledni na osnovu njega. Osoba sa uobičajenim znanjem i veštinama u oblasti treba da razume da predmetno razmatranje predstavlja samo opis reprezentativnih otelotvorenja i nije namenjeno kao ograničenje širih aspekata predmetnog pronalaska, pri čemu su ti širi aspekti otelotvoreni u reprezentativnoj konstrukciji.

Osobine polimera poliakrilne kiseline

[0029] Polimer koji se koristi u pronalasku je linearni ili razgranati polimer poliakrilne kiseline, ali nije umreženi polimer. Kada kažemo „polimer poliakrilne kiseline“, mislimo na polimer koji je sačinjen isključivo od jedinica akrilne kiseline. Tako, u obliku soli, pomenuta so polimera poliakrilne kiseline je isključivo sačinjena od jedinica koje odgovaraju soli akrilne kiseline ili je isključivo sačinjena od jedinica koje odgovaraju obliku slobodne kiseline akrilne kiseline i od jedinica koje odgovaraju soli akrilne kiseline.

[0030] Linearni ili razgranati polimer poliakrilne kiseline se dobija polimerizacijom samo akrilne kiseline kao monomera. Polimerizacija se najčešće vrši putem radikalske polimerizacije, koristeći oksidaciono sredstvo kao inicijator ili katalizator. Najčešće korišćena oksidaciona sredstva su persulfat (peroksidisulfat), na primer natrijum ili kalijum persulfat. Razgranati polimeri poliakrilne kiseline su, na primer, opisani u Macromolecules 2011, 44, 5928-5936. Kada je polimer prema pronalasku linearan, nagib Mark-Hauvinkove krive je veći ili jednak 0,7 (Yan J.K., Pei J.J., Ma H.L., Wang Z.B.2015. Effects of ultrasound on molecular properties, structure, chain conformation and degradation kinetics of carboxylic curdlan. Carb. Polymers. 121, 64-70).

[0031] Kada kažemo „farmaceutski prihvatljive soli“ polimera poliakrilne kiseline, mislimo na soli anjonskih oblika polimera sa jednim ili više katjona, naročito sa jednim ili više jednovalentnih katjona, koje su farmaceutski prihvatljive. Primeri za jednovalentne katjone su katjoni alkalnih metala, kao što su Na<+>ili K<+>, ili amonijumovi katjoni, kao što je NH4<+>. U vodenom rastvoru sa pH od 5,5 do 8, na primer blizu 7, kisele grupe polimera poliakrilne kiseline će biti u anjonskom obliku, gradeći so sa katjonom koji će takođe biti prisutan u vodenom rastvoru. U ovom polimeru, možemo imati jedinice akrilne kiseline sa kiselom grupom u obliku slobodne kiseline i druge jedinice sa kiselom grupom u anjonskom obliku koje gradi so. U zavisnosti od pH, kisele grupe polimera mogu biti isključivo u obliku slobodne kiseline ili, u slučaju soli, kisele grupe polimera mogu biti isključivo u obliku soli, ili neke kisele grupe mogu biti u kiselom obliku, a druge u obliku soli. Poželjne soli polimera poliakrilne kiseline iz pronalaska su soli sa Na<+>. Tako, bez obzira na otelotvorenje opisano u

1

pronalasku, polimer poliakrilne kiseline će poželjno biti u obliku natrijumove soli, i u tom slučaju sve karakteristike (Mm, IP, sadržaj monomera i persulfata...) odnosiće se na so (tj. natrijumovu so) polimera poliakrilne kiseline.

[0032] U specifikaciji iz predmetne patentne prijave, ova „farmaceutski prihvatljiva so polimera poliakrilne kiseline“ naziva se jednostavno „so polimera poliakrilne kiseline“ i poželjno je natrijumova so polimera poliakrilne kiseline.

[0033] So polimera poliakrilne kiseline može biti u čvrstom obliku (talog ili prah) ili poželjno u tečnoj formulaciji. Tečna formulacija će obuhvatati so polimera poliakrilne kiseline i vodeni rastvor. Poželjno, takva formulacija ima pH u rasponu od 5,5 do 8,0. Ova pH vrednost može da se dobije uključivanjem baze kao što je NaOH u vodeni rastvor. Vodeni rastvor može biti puferovani vodeni rastvor, dobijen sa puferom kao što je fosfatni pufer, TRIS (2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiol), Hepes (4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonska kiselina), histidinski ili citratni pufer. Tečna formulacija takođe može da sadrži jednu ili više dodatnih soli, kao što je NaCl.

[0034] Prema ovom pronalasku, predloženo je da se kao adjuvans koristi so polimera poliakrilne kiseline ili tečna formulacija soli polimera poliakrilne kiseline, pri čemu pomenuta so polimera poliakrilne kiseline ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 350 do 650 kDa i obuhvata manje od 0,005% persulfata, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline sačinjen isključivo od jedinica akrilne kiseline, i ima jednu od sledećih karakteristika, bilo koju kombinaciju tih karakteristika ili čak sve sledeće karakteristike, ako se međusobno ne isključuju:

● so polimera poliakrilne kiseline ili tečna formulacija soli polimera poliakrilne kiseline sadrži manje od 0,005%, poželjno manje od 0,001% m/m oksidacionih sredstava, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline i/ili manje od 0,001% m/m persulfata, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline;

● so polimera poliakrilne kiseline ima indeks polidisperznosti manji ili jednak 4, poželjno manji ili jednak 2,5;

● so polimera poliakrilne kiseline ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4 ili ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4;

● so polimera poliakrilne kiseline ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2,5 ili ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2;

● so polimera poliakrilne kiseline ima nagib Mark-Hauvinkove krive veći ili jednak 0,7;

● so polimera poliakrilne kiseline ili tečna formulacija soli polimera poliakrilne kiseline sadrži manje od 0,005% m/m monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili u obliku soli, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline.

[0035] Konkretno, predloženo je da se kao adjuvans koristi so polimera poliakrilne kiseline ili tečna formulacija soli polimera poliakrilne kiseline, pri čemu je polimer poliakrilne kiseline sačinjen isključivo od jedinica akrilne kiseline, i karakteriše ga sledeće:

● prosečna molekulska masa Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4, sadržaj persulfata u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline manji od 0,005%, poželjno manji od 0,001%, m/m, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i sadržaj monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili obliku soli u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline manji od 0,005% m/m, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline; pogodno, ova so polimera poliakrilne kiseline ima nagib Mark-Hauvinkove krive veći ili jednak 0,7, ili

● prosečna molekulska masa Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2,5, sadržaj persulfata u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline manji od 0,005%, poželjno manji od 0,001%, m/m, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i sadržaj monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili obliku soli u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline manji od 0,005% m/m, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline; pogodno, ova so polimera poliakrilne kiseline ima nagib Mark-Hauvinkove krive veći ili jednak 0,7, ili

● prosečna molekulska masa Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4, sadržaj persulfata u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline manji od 0,005%, poželjno manji od 0,001%, m/m, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i sadržaj monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili obliku soli u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline manji od 0,005% m/m, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline; pogodno, ova so polimera poliakrilne kiseline ima nagib Mark-Hauvinkove krive veći ili jednak 0,7, ili

● prosečna molekulska masa Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2, sadržaj persulfata u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline manji od 0,005%, poželjno manji od 0,001%, m/m, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i sadržaj monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili obliku soli u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline manji od 0,005% m/m, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline; pogodno, ova so polimera poliakrilne kiseline ima nagib Mark-Hauvinkove krive veći ili jednak 0,7.

[0036] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski prihvatljiva so linearnog ili razgranatog polimera poliakrilne kiseline za upotrebu prema predmetnom pronalasku može biti dijafiltrirana.

[0037] So polimera poliakrilne kiseline u tečnoj formulaciji je poželjno dijafiltrirana.

1

[0038] So polimera poliakrilne kiseline ili tečna formulacija soli polimera poliakrilne kiseline je poželjno sterilizovana. Kada je so polimera poliakrilne kiseline ili tečna formulacija soli polimera poliakrilne kiseline dijafiltrirana, sterilizacija se vrši nakon dijafiltracije.

[0039] Prema ovom pronalasku, prosečna molekulska masa Mm se dobija hromatografijom na molekulskim sitima. Pogodno se koriste tri detektora nakon kolone za hromatografiju na molekulskim sitima; detektor raspršivanja svetlosti pod pravim uglom, detektor indeksa prelamanja i četvorokapilarni diferencijalni viskozimetar. Detaljni postupci koji su dati u primerima se poželjno koriste prema pronalasku za određivanje Mm, IP (indeks polidisperznosti), koncentracije polimera i nagiba Mark-Hauvinkove krive. Dn/dc koji se koristi za određivanje Mm je poželjno određen koristeći detektor indeksa prelamanja sa panelom polimera poliakrilne kiseline poznate koncentracije.

Sadržaj persulfata i sadržaj monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili u obliku soli može da se odredi pomoću anjonsko izmenjivačke hromatografije visokih performansi sa konduktometrijskom detekcijom. Poželjno može da se koristi protokol koji je detaljno opisan u primerima, naročito u odeljku B poglavlja „1.2 Određivanje persulfata i monomera akrilata“.

Priprema i skladištenje polimera poliakrilne kiseline

[0040] U sirovom polimeru poliakrilne kiseline postoji rezidualni sadržaj monomera koji odgovara sadržaju akrilne kiseline ili soli akrilata koji nisu polimerizovali. Prilikom polimerizacije polimera poliakrilne kiseline, inicijator polimerizacije, persulfat, koristi se kao katalizator za pokretanje polimerizacije. U sirovom polimeru poliakrilne kiseline može postojati rezidualni sadržaj inicijatora polimerizacije koji nije potrošen u procesu polimerizacije.

[0041] Polimeri poliakrilne kiseline dostupni na tržištu često nemaju specifikacije o rezidualnom monomeru i sadržaju oksidacionih sredstava i o njihovoj tačnoj Mm i sadržaju oligomera.

[0042] Predloženo je da se sistematski prečisti kupljeni sirovi polimer poliakrilne kiseline koji će se koristiti za pripremu adjuvantne kompozicije, kako bi se izbegao rizik od postojanja rezidualnog sadržaja takvih jedinjenja koji može biti štetan, imajući u vidu stabilnost adjuvantnih kompozicija i kompozicija vakcina koje sadrže adjuvans i/ili toksičnost kompozicije vakcina. Pored toga, prema pronalasku, otkriveno je da je značajan sadržaj persulfata štetan po stabilnost polimera prilikom izlaganja toploti i onemogućava sterilizaciju u autoklavu.

[0043] Pronalazak se odnosi na proces za pripremu farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline, kao što je definisano u odeljku „Osobine polimera poliakrilne kiseline“, koji obuhvata sledeće uzastopne korake:

a) postojanje rastvora polimera poliakrilne kiseline,

c) sterilizaciju prečišćenog rastvora polimera poliakrilne kiseline.

[0044] U nekim otelotvorenjima, postupak pripreme prema otkriću može biti takav da polimer poliakrilne kiseline iz rastvora iz koraka a) ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 300 do 550 kDa.

[0045] U koracima a), b) i c), rastvor može biti rastvor polimera poliakrilne kiseline neposredno u obliku željene farmaceutski prihvatljive soli, ili, barem delimično, u obliku slobodne kiseline. Ako je rastvor u koraku a) rastvor polimera poliakrilne kiseline u obliku slobodne kiseline, salifikacija može da se obavi nakon što se prečišćavanje iz koraka b) i sterilizacija iz koraka c) obave na rastvoru željene farmaceutski prihvatljive soli. Takođe je moguće da se sterilizacija iz koraka c) obavi na rastvoru polimera poliakrilne kiseline u obliku slobodne kiseline i da se obavi salifikacija nakon sterilizacije.

[0046] U bilo kojoj fazi, ako je neophodna salifikacija, ona može da se dobije uvođenjem baze, kao što je NaOH ili KOH, u rastvor, u zavisnosti od željene soli.

[0047] Na primer, prečišćavanje i/ili sterilizacija se obavljaju na rastvoru farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline. Ovaj rastvor je, na primer, puferovani vodeni rastvor, naročito sa fosfatnim puferom ili sa TRIS, Hepes, histidinskim ili citratnim puferom. Vodeni rastvor farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline takođe može da

1

sadrži jednu ili nekoliko dodatnih soli, kao što je NaCl. U takvim slučajevima, proces prema pronalasku, za pripremu farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline, kao što je definisano u odeljku „Osobine polimera poliakrilne kiseline“, obuhvata sledeće uzastopne korake:

a) postojanje rastvora izabrane farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline,

b) prečišćavanje rastvora soli polimera poliakrilne kiseline kako bi se uklonile nečistoće, i

c) sterilizaciju dobijenog prečišćenog rastvora soli polimera poliakrilne kiseline.

[0048] Pogodno, polimer poliakrilne kiseline iz rastvora iz koraka a) ima nagib Mark-Hauvinkove krive veći ili jednak 0,7. Kada se u rastvoru polimer poliakrilne kiseline nalazi u obliku soli, ovaj nagib Mark-Hauvinkove krive se odnosi na so polimera poliakrilne kiseline.

[0049] Prečišćavanjem će se ukloniti mali molekuli. Prečišćavanje može da se obavi putem dijalize, dijafiltracije, ultrafiltracije ili hromatografije na molekulskim sitima. Dijafiltracija i ultrafiltracija koriste filtraciju unakrsnog toka (takođe se naziva filtracija tangencijalnog toka) na poroznoj membrani. Rastvor koji obuhvata polimer poliakrilne kiseline cirkuliše preko membrane: deo rastvora koji sadrži male molekule je eliminisan u permeatu koji će proći kroz membranu. Još jedan deo rastvora, koji se naziva retentat, koji uključuje prečišćeni poliakrilni polimer, cirkulisaće na površini membrane. Retentat može da cirkuliše u kružnoj petlji i može biti nekoliko puta dijafiltriran ili ultrafiltriran. Rastvarač (obično vodeni pufer ili slani vodeni rastvor) dodaje se u retentat koji cirkuliše, kako bi se zamenila zapremina permeata, pri istoj brzini kao protok permeata, tako da zapremina retentata ostane nepromenjena. Veličina eliminisanih molekula se određuje preko granične tačke propusnosti membrane. Pogodno, mogu da se koriste membrane sa graničnom tačkom propusnosti od 1 do 80 kDa, poželjno od 2 do 50 kDa. Takve membrane su, na primer, dostupne od kompanije Merck Millipore. Granična tačka propusnosti membrane se ocenjuje na osnovu njene nominalne granice molekulske mase (NMWL) ili njene granične vrednosti molekulske mase (MWCO). Na primer, UF membrana naznačena za 30 kD će isključiti testirani protein molekulske mase od 30 kilodaltona. Devedeset posto tog testiranog proteina će ostati u retentatu, a 10% će proći u permeat, što dovodi do koncentrovanja proteina ako se u retentat tokom ovog procesa ne dodaje pufer ili fiziološki rastvor.

1

[0050] Protok cirkulacije retentata je obično od 50 do 80 l/h/m<2>. Transmembranski pritisak (TMP) je, na primer, 0,9 /- 0,1 bar.

[0051] Tako, prečišćavanje u koraku b) može da se obavi putem dijalize, dijafiltracije, ultrafiltracije ili hromatografije na molekulskim sitima. Prečišćavanje može da se obavi na rastvoru koji sadrži od 2 do 50 mg/ml, poželjno od 10 do 30 mg/ml polimera poliakrilne kiseline. Kada se u rastvoru polimer nalazi u obliku soli, ova koncentracija se odnosi na so polimera.

[0052] Poželjno, prečišćavanje se obavlja dijafiltracijom sa membranom koja ima graničnu tačku propusnosti od 1 do 80 kDa, poželjno od 2 do 50 kDa.

[0053] U nekim otelotvorenjima, postupak pripreme prema otkriću može karakterisati to što se prečišćavanje obavlja u uslovima koji omogućavaju dobijanje polimera poliakrilne kiseline u rastvoru, naznačeno time što pomenuta so polimera poliakrilne kiseline ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 350 do 650 kDa i sadrži manje od 0,005% persulfata, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline, i ima:

● manje od 0,005%, poželjno manje od 0,001% m/m oksidacionih sredstava, na osnovu ukupne suve mase pomenutog polimera poliakrilne kiseline koji je dobijen nakon prečišćavanja, i/ili manje od 0,005%, poželjno manje od 0,001% m/m persulfata, na osnovu ukupne suve mase pomenutog polimera poliakrilne kiseline koji je dobijen nakon prečišćavanja,

● manje od 0,005% m/m monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili u obliku soli, na osnovu ukupne suve mase pomenutog polimera poliakrilne kiseline koji je dobijen nakon prečišćavanja,

● so polimera poliakrilne kiseline ima: prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4; ili prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4; ili

1

prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2,5; ili prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2.

[0054] Poželjno, prečišćavanje se obavlja u uslovima koji omogućavaju izolovanje polimera poliakrilne kiseline u rastvoru, naznačeno time što pomenuta so polimera poliakrilne kiseline ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 350 do 650 kDa i obuhvata manje od 0,005% persulfata, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline, i ima:

● poželjno manje od 0,001% m/m persulfata, na osnovu ukupne suve materije rastvora koji je dobijen nakon prečišćavanja (naročito putem dijafiltracije), ili, uopštenije, manje od 0,005%, poželjno od 0,001% m/m oksidacionih sredstava, na osnovu ukupne suve materije rastvora koji je dobijen nakon prečišćavanja (naročito putem dijafiltracije), i/ili

● manje od 0,005% m/m monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili u obliku soli, na osnovu ukupne suve materije rastvora koji je dobijen nakon prečišćavanja (naročito putem dijafiltracije).

[0055] U nekim otelotvorenjima, postupak pripreme prema otkriću može biti takav da se prečišćavanje obavlja u uslovima koji omogućavaju dobijanje polimera poliakrilne kiseline u rastvoru koji ima:

1

● so polimera poliakrilne kiseline ima: prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4; ili prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4; ili prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2,5; ili prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2.

[0056] Prosečna molekulska masa Mm izolovanog polimera poliakrilne kiseline je u rasponu od 350 do 650 kDa, a njegov indeks polidisperznosti može biti manji ili jednak 4.

[0057] Uređaj za prečišćavanje će biti izabran tako da se uklone željene nečistoće. Na primer, kada se za prečišćavanje koristi ultrafiltracija ili dijafiltracija, granična tačka propusnosti membrane će biti izabrana na osnovu nečistoća koje treba da se uklone. Sa graničnom tačkom propusnosti od najmanje 20 kDa, mali molekuli poput persulfata i monomera se suštinski eliminišu putem unakrsne filtracije. Sa graničnom tačkom propusnosti većom od 20 kDa, veći molekuli poput oligomera se takođe eliminišu, pa usled toga prečišćavanje dovodi do smanjenja IP i do povećanja Mm.

● Poželjno, dijafiltracija ili ultrafiltracija se obavlja sa graničnom tačkom propusnosti za korišćenu membranu, ili, uopštenije, prečišćavanje se obavlja u uslovima koji omogućavaju izolovanje polimera poliakrilne kiseline u rastvoru, koji ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 350 do 650 kDa, koji sadrži manje od 0,005% persulfata, na osnovu ukupne suve materije rastvora koji je dobijen nakon prečišćavanja (naročito putem dijafiltracije) i polimer poliakrilne kiseline je sačinjen isključivo od jedinica akrilne kiseline i ima:

● prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2,5; ili prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2, i

● poželjno manje od 0,001% m/m persulfata, na osnovu ukupne suve materije rastvora koji je dobijen nakon prečišćavanja (naročito putem dijafiltracije), ili, uopštenije, manje od 0,005%, poželjno manje od 0,001% m/m oksidacionih sredstava, na osnovu ukupne

1

suve materije rastvora koji je dobijen nakon prečišćavanja (naročito putem dijafiltracije), i/ili

[0058] Pogodno, rastvor dobijen nakon koraka prečišćavanja sadrži od 2 do 50 mg/ml soli polimera poliakrilne kiseline, naročito najmanje 10 mg/ml soli polimera poliakrilne kiseline.

[0059] Glavni rezultat procesa prečišćavanja je uklanjanje malih molekula, kao što je oksidaciono sredstvo (tj. persulfat) i akrilatni monomeri.

[0060] Putem sistematskog obavljanja takvog koraka prečišćavanja, karakteristike polimerne kompozicije koja se koristi kao adjuvans mogu bolje da se definišu i kompozicija je bezbednija i stabilnija. Sadržaj monomera akrilne kiseline, za koje se sumnja da su embriotoksični i teratogeni, značajno je smanjen.

[0061] Kao što je prethodno objašnjeno, u zavisnosti od upotrebe uređaja, dijafiltracija (naročito granične tačke propusnosti membrane), dijaliza, ultrafiltracija ili hromatografija na molekulskim sitima takođe dovode do povećanja prosečne molekulske mase dobijenog polimera poliakrilne kiseline i do smanjenja indeksa polidisperznosti (IP). Zaista, u zavisnosti od tehnike koja se koristi, a naročito od granične tačke propusnosti korišćene membrane kod dijafiltracije, dijalize i ultrafiltracije, ili karakteristika propustljivosti gela koji se koristi u hromatografiji na molekulskim sitima, takođe se eliminišu oligomeri, što za posledicu ima povećanje Mm i smanjenje IP. U ovim slučajevima, kompozicija soli polimera je u još većoj meri regulisana.

[0062] Sterilizacija može da se obavi sterilizacionom filtracijom ili, poželjno, pomoću autoklava. Sterilizaciona filtracija se vrši na membrani sa porama od 0,2 µm. Eliminacija oksidacionog sredstva omogućava upotrebu sterilizacije putem autoklava, što preporučuju farmakopeje. Autoklaviranje može da se obavi na temperaturi od 100 do 150 °C, i u vremenu

2

od 5 minuta do jednog sata. Zahvaljujući koraku prečišćavanja, dobijeni polimer je stabilniji tokom vremena i otporniji na izlaganje toploti.

[0063] U nekim otelotvorenjima, proces pripreme prema otkriću može biti naznačen time što se sterilizacija vrši u autoklavu.

[0064] U nekim otelotvorenjima, proces pripreme prema otkriću može biti naznačen time što se prečišćavanje i sterilizacija obavljaju na rastvoru farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline.

[0065] U nekim otelotvorenjima, proces pripreme prema otkriću može biti naznačen time što se prečišćavanje obavlja na rastvoru koji sadrži od 2 do 50 mg/ml farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline.

[0066] Pronalazak se takođe odnosi na proces za skladištenje rastvora farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline, kao što je definisano u odeljku „Osobine polimera poliakrilne kiseline“, koji obuhvata proces pripreme kao što je definisano pronalaskom, a zatim korak skladištenja dobijene farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline u rastvoru. Korak skladištenja može trajati od 1 dana do 2 godine. Temperatura skladištenja će najčešće biti u rasponu od 0 do 30 °C, naročito na 2-8 °C ili na sobnoj temperaturi, obično oko 22 °C. Skladištenje može da se vrši neposredno nakon koraka sterilizacije c).

[0067] Takvo skladištenje adjuvansa u tečnom obliku je veoma pogodno i nije neophodna dodatna obrada, za razliku od skladištenja u suvom obliku kod koga je neophodno ponovo suspendovanje/razblaživanje polimera radi pripreme kompozicije vakcine.

[0068] Konkretno, kada tečni rastvor soli polimera poliakrilne kiseline sadrži manje od 0,005%, poželjno manje od 0,001% m/m oksidacionih sredstava na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline i/ili manje od 0,001% m/m persulfata na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, rastvor je naročito stabilan.

[0069] Korak skladištenja se vrši ubacivanjem rastvora soli polimera poliakrilne kiseline u ambalažu i njenim skladištenjem. Tokom skladištenja, uskladišteni rastvor, na primer, sadrži od 2 do 50 mg/ml soli polimera poliakrilne kiseline. Može da se obavi korak razblaživanja ili koncentrovanja kako bi se dobila željena koncentracija, na primer nakon koraka procesa pripreme b). Tokom skladištenja, so polimera poliakrilne kiseline može biti, na primer, u vodenom rastvoru ili u puferovanom vodenom rastvoru. pH vrednost skladištenog rastvora je obično od 5,5 do 8, a poželjnije od 6,5 do 7,5 (npr. oko 7). Stabilna pH vrednost može da se održava upotrebom pufera, npr. Tris pufera, citratnog pufera, fosfatnog pufera, Hepes pufera ili histidinskog pufera.

[0070] Vodeni rastvor takođe može da sadrži jednu ili više dodatnih soli, kao što je NaCl. Skladištenje može da se vrši držanjem rastvora soli polimera poliakrilne kiseline dalje od svetlosti. U tu svrhu može da se koristi zatamnjena ili neprozirna ambalaža.

Upotreba polimera poliakrilne kiseline kao adjuvansa

[0071] Pronalazak se takođe odnosi na so polimera poliakrilne kiseline, kao što je definisano u pronalasku, nezavisno od toga da li je opisano otelotvorenje vezano za prethodni odeljak „Osobine polimera poliakrilne kiseline“ za upotrebu kao adjuvansa za kompoziciju vakcine ili za upotrebu kao adjuvansa za aktivni agens za vakcinu za izazivanje imunskog odgovora kod pojedinca, naročito kod čoveka.

[0072] Adjuvantna kompozicija za vakcinu koja obuhvata vodeni rastvor farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline kao što je definisano u pronalasku, nezavisno od toga da li je opisano otelotvorenje vezano za prethodni odeljak „Osobine polimera poliakrilne kiseline“ takođe je predmet ovog pronalaska.

[0073] „Adjuvans“, kao što se ovde koristi, odnosi se na jedinjenje koje moduliše imunogenost kompozicije vakcine. Kompozicija vakcine klasično obuhvata aktivni agens za vakcinu koji može biti antigen ili vektor (živi rekombinantni virusni vektor ili nukleinska kiselina) koji kodira antigen. Preciznije, adjuvans moduliše imunogenost antigena koji je prisutan ili je kodiran putem nukleinske kiseline prisutne u kompoziciji. „Modulacija imunogenosti“ uključuje povećanje obima i/ili trajanja imunskog odgovora koji izaziva antigen, i posebno uključuje pojačavanje odgovora antitela (naročito antitela koja neutrališu virus ili baktericidnih antitela) i/ili pojačavanje ćelijskog imunskog odgovora (pojačavanje odgovora CD4+ i/ili CD8+ T ćelija).

[0074] Polimer izabran prema pronalasku ima različite prednosti, kao što je prikazano putem primera. Na primer, u poređenju sa analognim linearnim ili razgranatim polimerima sa manjom Mm, oni dovode do pojačanog imunskog odgovora.

[0075] CD4+ limfociti, koji se takođe nazivaju T „pomoćne“ ćelije, posreduju u imunskom odgovoru. Dve vrste odgovora efektorskih CD4+ T pomoćnih ćelija, koji se nazivaju Th1 i Th2, obično karakteriše profilisanje citokina i podtipizacija antitela. Prednost upotrebe polimera poliakrilne kiseline, kao što je definisano u pronalasku, je što podstiče jak odgovor Th-1 (dobijeni su rezultati na IFN-γ, TNF-α i IgG2a antitela kod miševa), pored odgovora Th-2 (dobijeni su rezultati na Il-4, IL-5 i IgG1 antitela) koji je uobičajeno indukovan putem humanih adjuvanasa iz prethodnog stanja struke (soli aluminijuma, emulzije ulja u vodi). Indukcija snažnog Th-1 imuniteta je važna za borbu protiv virusnih i intracelularnih bakterijskih infekcija, kao i kancera, pošto Th-1 imunski odgovori pospešuju aktivaciju makrofaga i drugih ćelija ubica (npr. CD8+ T limfocita ili citotoksičnih T limfocita) radi ubijanja intracelularnih patogena, inficiranih ćelija i tumorskih ćelija.

[0076] So polimera poliakrilne kiseline iz pronalaska i aktivni agens za vakcinu mogu biti formulisani u istoj kompoziciji, naročito u vodenoj kompoziciji, ili u dve različite kompozicije i pomešani neposredno pre primene.

[0077] Takođe je moguće da kompozicija vakcine bude u obliku kompleta sačinjenog od delova. Kompozicija vakcine može da uključuje dve bočice: jedna sadrži aktivni agens za vakcinu, a druga sadrži so polimera poliakrilne kiseline. Konkretno, so polimera poliakrilne kiseline u tečnoj formulaciji je sadržana u prvoj bočici, a aktivni agens za vakcinu u liofilizovanom obliku, naročito izabrani antigen u liofilizovanom obliku, sadržan je u drugoj bočici. Formulacija soli polimera poliakrilne kiseline će biti korišćena za rehidrataciju aktivnog agensa za vakcinu, naročito izabranog antigena.

[0078] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski prihvatljiva so linearnog ili razgranatog polimera poliakrilne kiseline za upotrebu prema predmetnom pronalasku može biti korišćena za pojačavanje Th1 imunskog odgovora koji je dobijen sa kompozicijom vakcine.

2

[0079] Pronalazak se takođe odnosi na so polimera poliakrilne kiseline, kao što je definisano u pronalasku, nezavisno od toga da li je opisano otelotvorenje vezano za prethodni odeljak „Osobine polimera poliakrilne kiseline“, za upotrebu u vidu adjuvansa za kompoziciju vakcine koji pojačava ostvareni Th1 imunski odgovor i/ili koji uravnotežuje ostvarene Th1 i Th2 imunske odgovore. Konkretno, so polimera poliakrilne kiseline, kao što je definisano u pronalasku, koristi se kao adjuvans za aktivni agens za vakcinu radi izazivanja imunskog odgovora kod pojedinca, naročito kod čoveka, i pojačavanje ostvarenog Th1 imunskog odgovora i/ili uravnotežavanje ostvarenih Th1 i Th2 imunskih odgovora.

Kompozicija vakcine i aktivni agens za vakcinu

[0080] U nekim otelotvorenjima, kompozicija vakcine prema otkriću može da sadrži najmanje jedan aktivni agens za vakcinu koji je antigen ili vektor, kao što je virusni vektor ili nukleinska kiselina, koji eksprimira antigen.

[0081] Kompozicija vakcine za upotrebu prema pronalasku može da obuhvata bilo koji aktivni agens za vakcinu, kao što je antigen ili vektor (živi virusni vektor ili nukleinska kiselina, uključujući DNK i RNK) koji kodira antigen.

[0082] U nekim otelotvorenjima, otkriće se odnosi na imunološku kompoziciju ili kompoziciju vakcine koja obuhvata terapeutski delotvornu količinu komponente antigena, farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač i adjuvans koji obuhvata neumreženi polimer poliakrilne kiseline (PAA) ili se suštinski sastoji od njega, i ima Mm od oko 350 kDa do oko 650 kDa uz manje od 0,005% persulfata, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline, i ima indeks polidisperznosti manji od oko 4 ili manji od oko 2.

[0083] U nekim otelotvorenjima, PAA može imati Mm od oko 400 kDa do oko 600 kDa.

[0084] U nekim otelotvorenjima, PAA može imati Mm od oko 400 kDa do oko 500 kDa.

[0085] Za potrebe predmetnog pronalaska, termin „antigen“ treba da označava bilo koji molekul koji sadrži jedan ili više epitopa (linearnih, konformacionih ili oba), koji izaziva imunološki odgovor. Antigeni koji mogu da se koriste u kompoziciji vakcine prema pronalasku mogu biti živi, atenuisani, ubijeni, inaktivirani ili neinfektivni kompletan mikroorganizam, ekstrakt ili deo mikroorganizma, oblik podjedinice prirodnog antigena, rekombinantni oblik ili hibridni oblik. Kada je u obliku podjedinice, priroda antigena nema veliki značaj. Antigen može biti peptid, protein, glikoprotein, polisaharid, glikolipid, lipoprotein, lipopeptid, VLP (čestica slična virusu), itd.

[0086] Aktivni agens za vakcinu prisutan u kompoziciji je antigen ili vektor (rekombinantni virus ili nukleinska kiselina) koji kodira antigen koji se koristi ili je pogodan za korišćenje u lečenju ili prevenciji različitih bolesti koje se mogu javiti kod ljudi ili životinja osim ljudi, uključujući, naročito: difteriju, tetanus, polio, besnilo, veliki kašalj, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, žutu groznicu, trbušni tifus, ovčije boginje, male boginje, zauške, rubeolu, japanski encefalitis, grip, meningitis, koleru, infekcije izazvane rotavirusom, norovirusom, rinovirusom, respiratornim sincicijalnim virusom, herpes simpleks virusom, papiloma virusom, citomegalovirusom, virusom Zapadnog Nila, denga virusom, Čikungunja virusom, HIV-om (AIDS), bakterijske bolesti koje izazivaju streptokoke, Chlamydia trachomatis i pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae i meningitidis, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, ili Haemophilus influenzae tipa B, listeriozu, šigelozu, salmonelozu, tuberkulozu, Lajmsku bolest, kancer, parazitske bolesti kao što je malarija, lišmanijaza, Šagasova bolest, šistomijaza, itd.

[0087] Antigeni po prirodi mogu biti bakterijski, virusni ili parazitski. Od antigena koji su pogodni za predmet pronalaska, pominju se bakterijski antigeni poreklom od Clostridium tetani, Clostridium diphtheriae, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae tip B, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Shigella sp, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus ili Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis i pneumoniae ili Streptococcus sp, virusni antigeni poreklom od virusa hepatitisa A, B ili C, virusa gripa, rinovirusa, respiratornog sincicijalnog virusa, virusa Zapadnog Nila, virusa besnila, poliovirusa, HIV virusa, denga virusa, virusa japanskog encefalitisa, virusa žute groznice, citomegalovirusa ili herpes virusa, parazitski antigeni poreklom naročito od Plasmodium sp., leishmania sp. ili schistosoma sp. i tumorski antigeni. Ovi antigeni mogu da se dobije koristeći postupke genetske rekombinacije ili koristeći postupke ekstrakcije koji su dobro poznati stručnjacima za ovu oblast.

2

[0088] Konkretno, aktivni agens za vakcinu prisutan u kompoziciji je antigen ili vektor (rekombinantni virus ili nukleinska kiselina) koji kodira antigen poreklom od Staphylococcus aureus, ili od citomegalovirusa.

[0089] U takvom otelotvorenju, kompozicija vakcine može biti u puferovanom vodenom rastvoru, naročito sa fosfatnim puferom ili u TRIS, Hepes, histidinskom ili citratnom puferu.

[0090] Kompozicija vakcine za upotrebu prema pronalasku može biti kompozicija namenjena za imunizaciju protiv jednog patogena ili kancera, to jest, ona sadrži jedan ili više aktivnih agensa za vakcinu, naročito jedan ili više antigena, za jedan patogen ili kancer, ili može biti kompozicija namenjena za imunizaciju protiv nekoliko patogena ili kancera.

[0091] Kompozicija vakcine za upotrebu u pronalasku takođe može da uključuje jedan ili nekoliko specifičnih aktivnih agensa za vakcinu, naročito jedan ili više antigena jedne bolesti, ali koji pripadaju različitim kategorijama ove bolesti (više serotipova ili sojeva, ili kladusa, u zavisnosti od prirode agensa).

[0092] So polimera poliakrilne kiseline iz pronalaska i aktivni agens za vakcinu mogu biti formulisani u kompoziciji sa bilo kojim farmaceutski prihvatljivim vehikulumom. U kontekstu ovog pronalaska, izraz „farmaceutski prihvatljiv vehikulum“ se odnosi na vehikulum koji je fiziološki prihvatljiv za primenu na sisaru, a naročito na čoveku, uz očuvanje fiziološke aktivnosti kompozicije prema pronalasku, tj. njene sposobnosti da izazove imunski odgovor. Jedan primer za farmaceutski prihvatljiv vehikulum je puferovani fiziološki rastvor. Drugi fiziološki prihvatljivi vehikulumi su poznati stručnjacima za ovu oblast i opisani su, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences (18. izdanje), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pa.

[0093] pH vrednost kompozicije je obično od 5,5 do 8, a poželjnije od 6,5 do 7,5 (npr. oko 7). Stabilna pH vrednost može da se održava upotrebom pufera, npr. Tris pufera, citratnog pufera, fosfatnog pufera, Hepes pufera ili histidinskog pufera. Tako, kompozicija obično uključuje pufer. Kompozicija može biti sterilna i/ili bez pirogena. Kompozicija može biti izotonična kada se radi o ljudskim bićima.

[0094] Kompozicija takođe može da sadrži jednu ili više dodatnih soli, kao što je NaCl.

2

[0095] Kompozicija za upotrebu u pronalasku obuhvata imunološki delotvornu količinu aktivnog agensa za vakcinu. „Imunološki delotvorna količina“ je količina koja je, kada se primeni na ispitaniku, delotvorna za izazivanje imunskog odgovora na antigen koji se koristi ili je generisan nakon ekspresije vektora i/ili nukleinske kiseline. Ova količina se može razlikovati u zavisnosti od zdravlja i fizičkog stanja ispitanika koji se leči, njegove starosti, sposobnosti ispitanikovog imunskog sistema da proizvodi antitela, željenog stepena zaštite, formulacije vakcine, procene zdravstvene situacije od strane nadležnog lekara.

[0096] Kompozicija vakcine za upotrebu u pronalasku takođe može da obuhvata alergen(e), naročito alergen(e) za desenzibilizaciju u lečenju alergija.

[0097] Kompozicija vakcine za upotrebu u pronalasku može da se primeni na bilo koji način koji se uobičajeno koristi za primenu vakcine. Biće korišćen režim koji dovodi do izazivanja očekivanog imunskog odgovora. Raspored imunizacije obično obuhvata nekoliko primena. Količina kompozicije koja se primenjuje je obično dovoljna da se postigne željeni imunski odgovor.

[0098] Kompozicija vakcine je poželjno u tečnom obliku, imajući u vidu dobre osobine polimera poliakrilne kiseline vezane za stabilnost, što omogućava upotrebu tečnih oblika čija proizvodnja je jeftinija.

[0099] Takođe su poželjne parenteralne injekcije (intramuskularna, supkutana, intradermalna i intravenska). Polimer poliakrilne kiseline ne izaziva primetna lokalna neželjena dejstva nakon intradermalne injekcije. To može biti prednost u odnosu na većinu drugih adjuvanasa (uključujući soli aluminijuma) koji su ponekad reaktogeni kada se vrši intradermalna primena.

[0100] U nastavku su opisane poželjne kompozicije vakcina za upotrebu u pronalasku:

Kompozicija vakcine za upotrebu u pronalasku koja obuhvata najmanje jedan aktivni agens za vakcinu i farmaceutski prihvatljivu so polimera poliakrilne kiseline, pri čemu pomenuta so polimera poliakrilne kiseline ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 350 do 650 kDa i obuhvata manje od 0,005% persulfata na osnovu ukupne suve mase pomenute soli

2

polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline.

[0101] Pogodno, kompozicija vakcine za upotrebu prema pronalasku po dozi sadrži od 0,1 do 8 mg farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline, poželjno od 0,1 do 4 mg, a poželjnije od 0,1 do 2 mg.

[0102] Poželjno, najmanje jedan aktivni agens za vakcinu je antigen ili vektor (virusni vektor ili nukleinska kiselina) koji kodira antigen, pri čemu je pomenuti antigen bakterijski antigen poreklom od Clostridium tetani, Clostridium diphtheriae, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae tip B, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Shigella sp, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus ili Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis ili pneumoniae ili Streptococcus sp; virusni antigen poreklom od virusa hepatitisa A, B ili C, virusa gripa, rinovirusa, respiratornog sincicijalnog virusa, virusa Zapadnog Nila, virusa besnila, poliovirusa, HIV virusa, denga virusa, virusa japanskog encefalitisa, virusa žute groznice, citomegalovirusa ili herpes virusa; parazitski antigen poreklom naročito od Plasmodium sp., leishmania sp. ili schistosoma sp. ili tumorski antigen. Konkretno, aktivni agens za vakcinu prisutan u kompoziciji je antigen ili vektor (rekombinantni virus ili nukleinska kiselina) koji kodira antigen poreklom od Staphylococcus aureus, ili od citomegalovirusa.

[0103] U nekim otelotvorenjima, kompozicija vakcine prema ovom otkriću može biti u tečnom obliku sa pH u rasponu od 6,0 do 8,0.

[0104] U jednom poželjnom otelotvorenju, kompozicije vakcine za upotrebu u pronalasku su u tečnom obliku sa pH u rasponu od 5,5 do 8,0. Na primer, one sadrže fosfatni pufer ili TRIS, Hepes, histidinski ili citratni pufer.

[0105] So polimera poliakrilne kiseline prisutna u kompoziciji vakcine ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 350 do 650 kDa, sadrži manje od 0,005% persulfata na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline sačinjen isključivo od jedinica akrilne kiseline i ima jednu od sledećih karakteristika, bilo koju kombinaciju tih karakteristika ili čak sve sledeće karakteristike, ako se međusobno ne isključuju:

2

● so polimera poliakrilne kiseline ili tečna formulacija soli polimera poliakrilne kiseline sadrži poželjno manje od 0,001% m/m oksidacionih sredstava na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline i/ili manje od 0,005%, poželjno manje od 0,001% m/m persulfata na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline;

● so polimera poliakrilne kiseline ili tečna formulacija soli polimera poliakrilne kiseline sadrži manje od 0,005% m/m monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili obliku soli, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline,

● farmaceutski prihvatljiva so linearnog ili razgranatog polimera poliakrilne kiseline je dijafiltrirana i/ili je sterilizovana.

[0106] Konkretno, so polimera poliakrilne kiseline prisutnu u kompoziciji vakcine karakteriše prosečna molekulska masa Mm u rasponu od 350 do 650 kDa, sadrži manje od 0,005% persulfata na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline, i ima:

2

prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4, sadržaj persulfata u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline poželjno manji od 0,001%, m/m na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i sadržaj monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili u obliku soli u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline manji od 0,005% m/m na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline; pogodno, ova so polimera poliakrilne kiseline ima nagib Mark-Hauvinkove krive veći ili jednak 0,7, ili

prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2,5, sadržaj persulfata u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline poželjno manji od 0,001%, m/m na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i sadržaj monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili u obliku soli u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline manji od 0,005% m/m na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline; pogodno, ova so polimera poliakrilne kiseline ima nagib Mark-Hauvinkove krive veći ili jednak 0,7, ili

prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4, sadržaj persulfata u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline poželjno manji od 0,001%, m/m na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i sadržaj monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili u obliku soli u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline manji od 0,005% m/m na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline; pogodno, ova so polimera poliakrilne kiseline ima nagib Mark-Hauvinkove krive veći ili jednak 0,7, ili

prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2, sadržaj persulfata u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline poželjno manji od 0,001%, m/m na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline i sadržaj monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili u obliku soli u soli polimera poliakrilne kiseline ili u tečnoj formulaciji soli polimera poliakrilne kiseline manji od 0,005% m/m na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline; pogodno, ova so polimera poliakrilne kiseline ima nagib Mark-Hauvinkove krive veći ili jednak 0,7.

[0107] Pronalazak se takođe odnosi na kompozicije vakcine iz pronalaska za upotrebu u izazivanju imunskog odgovora kod pojedinca, naročito čoveka. Predmet ovog pronalaska takođe obuhvata kompoziciju vakcine, kao što je ovde otkriveno, za upotrebu u postupku izazivanja imunskog odgovora kod pojedinca, naročito čoveka, koji obuhvata korak primene na pojedincu kome je to potrebno imunološki delotvorne količine kompozicije prema pronalasku. Pojedinac može biti čovek ili životinja izabrana od vrste pasa, mačaka, goveda, svinja, konja ili ovaca, kao i vrste kuna ili ptica.

[0108] Pronalazak se takođe odnosi na kompozicije vakcine iz pronalaska za upotrebu u izazivanju imunskog odgovora kod pojedinca, naročito čoveka, uz pojačavanje ostvarenog Th1 imunskog odgovora. Predmet ovog pronalaska takođe obuhvata kompoziciju vakcine za upotrebu u izazivanju imunskog odgovora kod pojedinca, naročito čoveka, uz pojačavanje ostvarenog Th1 imunskog odgovora, pri čemu pomenuti postupak obuhvata korak primene imunološki delotvorne količine kompozicije prema pronalasku na pojedincu kome je to potrebno.

Priprema kompozicije vakcine

[0109] Polimer poliakrilne kiseline ili so polimera poliakrilne kiseline su pogodno podvrgnuti prečišćavanju, kao što je dijafiltracija, pre dodavanja u kompoziciju vakcine. Preciznije, polimer poliakrilne kiseline ili so polimera poliakrilne kiseline su pogodno podvrgnuti prečišćavanju, kao što je dijafiltracija, a zatim sterilizaciji, pre uvođenja u kompoziciju vakcine. Sterilizacija može da se obavi sterilizacionom filtracijom ili, poželjno, pomoću autoklava.

[0110] Prema pronalasku, kompozicija vakcine može da se pripremi prostim mešanjem soli polimera poliakrilne kiseline, naročito u tečnom obliku u vodenom rastvoru ili u puferovanom

1

vodenom rastvoru, i suspenzije jednog ili više aktivnih agensa za vakcinu i drugih komponenata koje mogu biti prisutne u kompoziciji. To može da se obavi dodavanjem jednog ili više izabranih aktivnih agensa za vakcinu u so polimera poliakrilne kiseline, naročito u so polimera poliakrilne kiseline u tečnoj formulaciji u vodenom rastvoru ili u puferovanom vodenom rastvoru, ili putem dodavanja polimera poliakrilne kiseline, naročito polimera poliakrilne kiseline u tečnoj formulaciji u vodenom rastvoru ili u puferovanom vodenom rastvoru, na suspenziju koja već sadrži izabrani aktivni agens za vakcinu. S jedne strane, u slučaju kada je poželjno da se formulišu kompozicije vakcine koje obuhvataju više aktivnih agensa za vakcinu, može biti poželjno da se prvo izvrši mešanje soli polimera poliakrilne kiseline sa jednim ili više aktivnih agensa za vakcinu i da se preostali uključe kasnije.

[0111] Alternativno, ako je aktivni agens za vakcinu formulisan kao liofilizovani proizvod, kompozicija vakcine može da se dobije rehidratacijom jednog ili više liofilizovanih agensa neposredno sa formulacijom (vodeni rastvor ili puferovani vodeni rastvor) koja sadrži so polimera poliakrilne kiseline.

[0112] So polimera poliakrilne kiseline, kao što je definisano u pronalasku, iz bilo kog opisanog otelotvorenja vezanog za prethodni odeljak „Osobine polimera poliakrilne kiseline“, može da se koristi u pripremi kompozicije vakcine koja sadrži najmanje jedan aktivni agens za vakcinu.

[0113] U postupku za dobijanje kompozicije vakcine može da se koristi mešanje soli polimera poliakrilne kiseline, kao što je definisano u pronalasku, iz bilo kog opisanog otelotvorenja vezanog za prethodni odeljak „Osobine polimera poliakrilne kiseline“, sa najmanje jednim aktivnim agensom za vakcinu.

[0114] Radi lakšeg korišćenja, ovde su sakupljeni neki termini koji se koriste u ovoj specifikaciji, primerima i priloženim patentnim zahtevima.

[0115] Kao što se ovde koristi, termin „životinja“ obuhvata sve kičmenjake, uključujući i ljude. Takođe obuhvata pojedinačnu životinju u svim stadijumima razvoja, uključujući stadijum embriona i fetusa. Konkretno, termin „kičmenjak“ obuhvata, bez ograničenja, ljude, pse (npr. domaće pse), mačke (npr. domaće mačke); konje, goveda (npr. krava, stoka), svinje (npr. prasiće), kao i ptice. Kao što se ovde koristi, termin „krava“ ili „stoka“ se obično koristi da se

2

označi životinja goveđeg porekla bilo koje starosti. Termini koji se koriste naizmenično uključuju „goveče“, „tele“, „vo“, „bik“, „junica“, „krava“ i slično. Termini koji se koriste naizmenično uključuju „prase“, „krmača“ i slično. Termin „ptica“, kao što se ovde koristi, odnosi se na bilo koju vrstu ili podvrstu taksonomske klase aves, kao što su, bez ograničenja, kokoške (za rasplod, proizvodnju mesa i nosilje), ćurke, patke, guske, prepelice, fazani, papagaji, zebe, jastrebovi, vrane i trkačice, uključujući nojeve, emue i kazuare. Termin „svinja“ ili „prase“ označava životinju svinjskog porekla, dok se „krmača“ odnosi na ženku koja je u reproduktivnom dobu i reproduktivno sposobna.

[0116] Kao što se ovde koristi, termin „virulentan“ označava izolat koji zadržava sposobnost da bude zarazan u životinji domaćinu.

[0117] Kao što se ovde koristi, termin „inaktivisana vakcina“ označava kompoziciju vakcine koja sadrži infektivni organizam ili patogen koji više nije sposoban za replikaciju ili rast. Patogen poreklom može biti bakterijski, virusni, protozoalni ili gljivični. Inaktivacija može da se postigne različitim postupcima, uključujući zamrzavanje i odmrzavanje, tretman hemikalijama (na primer, tretman formalinom), sonifikaciju, zračenje, toplotu ili bilo koji drugi uobičajeni način koji je dovoljan da se spreči replikacija ili rast organizma uz zadržavanje njegove imunogenosti.

[0118] Kao što se ovde koristi, termin „imunogenost“ označava sposobnost izazivanja imunskog odgovora na jedan ili više antigena kod životinje domaćina. Ovaj imunski odgovor predstavlja osnovu zaštitnog imuniteta koji uzrokuje vakcina protiv određenog zaraznog organizma.

[0119] Kao što se ovde koristi, termin „imunski odgovor“ odnosi se na odgovor izazvan kod životinje. Imunski odgovor može da se odnosi na ćelijski imunitet (CMI); humoralni imunitet, ili može da uključuje oba. Predmetni pronalazak takođe razmatra odgovor ograničen na deo imunskog sistema. Na primer, kompozicija vakcine iz predmetnog pronalaska može specifično da izaziva povećani odgovor na gama interferon.

[0120] Kao što se ovde koristi, termin „antigen“ ili „imunogen“ označava supstancu koja izaziva određeni imunski odgovor kod životinje domaćina. Antigen može da obuhvata kompletan organizam, mrtav, atenuisan ili živ; podjedinicu ili deo organizma; rekombinantni vektor koji obuhvata insert sa imunogenim osobinama; deo ili fragment DNK koji može da indukuje imunski odgovor nakon prezentovanja životinji domaćinu; protein; polipeptid, peptid, epitop, hapten, toksin, antitoksin; ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0121] Kao što se ovde koristi, termin „viševalentno“ znači da vakcina sadrži više od jednog antigena, bilo da su u pitanju antigeni iste vrste (tj. različiti izolati serotipova FMD virusa), različitih vrsta (tj. izolati Pasteurella haemolytica i Pasteurella multocida), ili da vakcina sadrži kombinaciju antigena različitih rodova (na primer, vakcina koja sadrži antigene Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnus i Clostridium).

[0122] Kao što se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač“ i „farmaceutski prihvatljiv vehikulum“ su sinonimi i odnose se na tečni vehikulum u kome se nalaze antigeni vakcine, koji se može ubrizgati domaćinu bez neželjenih dejstava. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači poznati u struci uključuju, bez ograničenja, sterilnu vodu, fiziološki rastvor, dekstrozu ili puferovane rastvore. Nosači mogu da uključuju pomoćne agense, uključujući, bez ograničenja, razblaživače, stabilizatore (tj. šećere i aminokiseline), konzervanse, kvašljivce, emulgatore, pH puferujuće agense, aditive za povećanje viskoznosti, boje, i slično.

[0123] Kao što se ovde koristi, termin „kompozicija vakcine“ obuhvata najmanje jedan antigen ili imunogen u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu koristan za izazivanje imunskog odgovora kod domaćina. Kompozicije vakcina mogu da se primene u dozama i pomoću tehnika koje su dobro poznate stručnjacima za oblast medicine ili veterine, uzimajući u razmatranje faktore kao što su starost, pol, težina, vrsta i stanje životinje primaoca, kao i način primene. Primena može da se vrši perkutano, putem mukozne primene (npr. oralno, nazalno, analno, vaginalno) ili parenteralnim putem (intradermalno, intramuskularno, supkutano, intravenski ili intraperitonealno). Kompozicije vakcina mogu da se primenjuju samostalno ili mogu da se primenjuju zajedno ili uzastopno sa drugim lečenjem ili terapijom. Oblici primene mogu da uključuju suspenzije, sirupe ili eliksire, kao i preparate za parenteralnu, supkutanu, intradermalnu, intramuskularnu ili intravensku primenu (npr. injektabilna primena), kao što su sterilne suspenzije ili emulzije. Kompozicije vakcina mogu da se primenjuju u vidu spreja ili pomešane sa hranom i/ili vodom ili da se isporuče u smeši sa odgovarajućim nosačem, razblaživačem ili ekscipijensom, kao što je sterilna voda, fiziološki rastvor, glukoza, i slično. Kompozicije mogu da sadrže pomoćne supstance kao što su kvašljivci ili emulgatori, pH puferujući agensi, adjuvansi, aditivi za želiranje ili povećanje viskoziteta, konzervansi, arome,

4

boje i slično, u zavisnosti od načina primene i željenog preparata. Mogu se konsultovati standardni farmaceutski tekstovi, kao što je „Remington's Pharmaceutical Sciences“, 1990, da bi se pripremili odgovarajući preparati, bez nepotrebnog eksperimentisanja.

[0124] Imunogen ili antigen pogodan za upotrebu u predmetnom pronalasku može biti izabran iz grupe koja se sastoji od inaktiviranih patogena, atenuisanih patogena, imunogenih podjedinica (npr. proteina, polipeptida, peptida, epitopa, haptena) ili rekombinantnih ekspresionih vektora, uključujući plazmide koji imaju imunogene inserte. U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, imunogen je mikroorganizam koji je inaktiviran ili mrtav. U još jednom otelotvorenju pronalaska, kompozicija vakcine sadrži imunogen izabran iz grupe ptičjih patogena, uključujući, bez ograničenja, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, virus infektivnog bronhitisa (IBV), Njukasl virus (NDV), virus sindroma pada nosivosti (EDS), ili virus infektivne burzalne bolesti (IBDV), ptičji grip i kombinacije prethodnog.

[0125] Alternativno, kompozicija vakcine sadrži imunogen izabran od mačjih patogena, kao što je mačji herpesvirus (FHV), mačji kalcivirus (FCV), virus mačje leukemije (FeLV), virus mačje imunodeficijencije (FIV), virus besnila, i kombinacije prethodnog.

[0126] U još jednom otelotvorenju, kompozicija vakcine sadrži imunogen izabran od psećih patogena, uključujući, bez ograničenja, virus besnila, pseći herpesvirus (CHV), pseći parvovirus (CPV), pseći koronavirus, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica i slično, i kombinacije prethodnog.

[0127] U još jednom otelotvorenju, kompozicija sadrži imunogen izabran od konjskih patogena, kao što je konjski herpesvirus (tipa 1 ili tipa 4), konjski grip, tetanus, virus Zapadnog Nila, i slično, ili kombinacije prethodnog.

[0128] U još jednom otelotvorenju, kompozicija sadrži imunogen izabran od goveđih patogena, kao što je virus bolesti slinavke i šapa (FMDV), virus besnila, goveđi rotavirus, goveđi virus parainfluence tipa 3 (bPIV-3), goveđi koronavirus, virus goveđe virusne dijareje (BVDV), goveđi respiratorni sincicijalni virus (BRSV), infektivni goveđi virus rinotraheitisa (IBR), E. coli, P. multocida, P. haemolytica i kombinacije prethodnog.

[0129] U još jednom otelotvorenju, kompozicija sadrži aktivni agens za vakcinu, uključujući imunogene i nukleinske kiseline koje kodiraju imunogene, izabran od svinjskog patogena, kao što je, bez ograničenja, virus svinjskog gripa (SIV), svinjski cirkovirus tipa 2 (PCV- 2), virus reproduktivnog i respiratornog sindroma svinja (PRRS), virus pseudobesnila (PRV), svinjski parvovirus (PPV), FMDV, M. hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, E. coli i slično, i kombinacije prethodnog.

[0130] Aktivni agensi za vakcine koji obuhvataju viruse, bakterije, gljive i slično mogu se proizvesti postupcima in vitro uzgajanja, koristeći odgovarajući medijum za uzgajanje ili ćelijske linije domaćina i uobičajene postupke koji su dobro poznati osobama sa uobičajenim znanjem i veštinama u struci. Na primer, PRRS može da se uzgaja u odgovarajućoj ćelijskoj liniji, kao što je ćelijska linija MA-104 (vidite US patente 5,587,164; 5,866,401; 5,840,563; 6,251,404). Na sličan način, PCV-2 može da se uzgaja koristeći ćelijsku liniju PK-15 (vidite US 6,391,314); SIV može da se uzgaja na jajima (US 6,048,537); a M. hyopneumoniae može da se uzgaja u odgovarajućem medijumu za uzgajanje (US 5,968,525; US 5,338,543).

[0131] Kako bi se dobila inaktivirana imunološka kompozicija ili kompozicija vakcine, patogen je poželjno inaktiviran nakon sakupljanja i, opciono, podvrgnut prečišćavanju putem hemijskog tretmana koristeći, na primer, formalin ili formaldehid, beta-propiolakton, etilenimin, binarni etilenimin (BEI), i/ili fizičkog tretmana (npr. izlaganje toploti ili sonifikacija). Postupci inaktivacije su dobro poznati stručnjacima za ovu oblast. Na primer, FMD virus može biti inaktiviran pomoću etilenimina (Cunliffe, HR, Applied Microbiology, 1973, str.747-750) ili pomoću visokog pritiska (Ishimaru et al., Vaccine 22 (2004) 2334-2339), PRRS virus može biti inaktiviran putem tretmana beta-propiolaktonom (Plana-Duran et al., Vet. Microbiol., 1997, 55: 361-370) ili putem tretmana sa BEI (US 5,587,164); inaktivacija PCV-2 virusa može da se postigne korišćenjem tretmana etileniminom ili tretmana betapropiolaktonom (US patent serijski br.6,391,314); virus svinjskog gripa može da se inaktivira koristeći deterdžent kao što je Triton, ili tretiranjem formaldehidom (US 6,048,537); M. hyopneumoniae bakterija može da se inaktivira tretiranjem formaldehidom (Ross R. F. supra), tretiranjem etileniminom ili sa BEI.

[0132] Inaktivirani patogen može biti koncentrovan uobičajenim tehnikama koncentrovanja, naročito ultrafiltracijom, i/ili prečišćen uobičajenim postupcima prečišćavanja, naročito koristeći tehnike hromatografije, uključujući, bez ograničenja, gel-filtraciju, ultracentrifugiranje na gradijentu saharoze, ili selektivno taloženje, naročito u prisustvu PEG.

[0133] Imunogeni koji su korisni u kompozicijama vakcina takođe uključuju ekspresione vektore. Takvi vektori uključuju, bez ograničenja, in vivo rekombinantne ekspresione vektore kao što je polinukleotidni vektor ili plazmid (EP-A2-1001025; Chaudhuri P. Res. Vet. Sci.

2001, 70: 255-6), virusne vektore kao što su, bez ograničenja, adenovirusni vektor, vektori poksvirusa kao što su vektori boginja ptica (US 5,174,993; US 5,505,941; i US 5,766,599) ili vektori virusa boginja kanarinca (US 5,756,103) ili bakterijski vektori (E. coli ili Salmonella sp.).

[0134] Može da se koristi formulacija viševalentnih imunoloških kompozicija ili kompozicija kombinovane vakcine. Na primer, antigeni korisni u kombinaciji goveđih inaktiviranih bakterijskih ćelija načinjenih prema predmetnom pronalasku uključuju, bez ograničenja, Mycoplasma bovis, Pasteurella sp., naročito P. multocida i P. haemolytica, Haemophilus sp., naročito H. somnus, Clostridium sp., Salmonella, Corynebacterium, Streptococcus, Staphylococcus, Moraxella, E. coli i slično.

[0135] Imunološka kompozicija ili kompozicija vakcine može biti za upotrebu u postupcima za izazivanje imunskog odgovora kod domaćina, npr. životinje, pri čemu postupci obuhvataju primenu imunološke kompozicije ili kompozicije vakcine prema pronalasku na domaćinu. Imunski odgovori koji su izazvani na ovaj način su posebno imunski odgovori antitela i/ili ćelija, a naročito odgovor na γ-interferon.

[0136] Kompozicije mogu biti za upotrebu u postupcima imunizacije protiv infekcije, ili za prevenciju ili smanjenje simptoma koje ona uzrokuje, kod životinje sa patogenim organizmom (na primer, infekcija putem virusa, bakterije, gljive ili protozoalnim parazitom). Postupak je koristan kod kičmenjaka, uključujući, bez ograničenja, ljude, pse (npr. domaće pse), mačke (npr. domaće mačke), konje, goveda (npr. stoka) i svinje, kao i kod ptica, uključujući, bez ograničenja, kokoške, ćurke, patke, guske, prepelice, fazane, papagaje, zebe, jastrebove, vrane i trkačice (noj, emu, kazuar, itd.).

[0137] Ovi postupci se sastoje od vakcinacije trudnih ženki pre porođaja, putem primene kompozicije vakcine koja je napravljena prema pronalasku. Ovi postupci dalje obuhvataju indukciju zaštitnih antitela izazvanu protokolom vakcinacije i prenos ovih zaštitnih antitela sa vakcinisanih trudnih ženki na njihovo potomstvo, kako bi potomstvo bilo zaštićeno od infekcije i bolesti.

[0138] Doza kompozicije vakcine napravljene prema predmetnom pronalasku će zavisiti od vrste, soja, starosti, veličine, istorije vakcinacije, i zdravstvenog stanja životinje koja se vakciniše. Drugi faktori, kao što su koncentracija antigena, dodatne komponente vakcine i način primene (tj. supkutana, intradermalna, oralna, intramuskularna ili intravenska primena) takođe će uticati na delotvornu dozu. Doza vakcine za primenu lako može da se odredi na osnovu koncentracije antigena u vakcini, načina primene i starosti i stanja životinje koja se vakciniše. Svaka serija antigena može biti pojedinačno prilagođena. Alternativno mogu da se koriste metodična ispitivanja imunogenosti različitih doza, kao i studije LD50 i drugi postupci skrininga, kako bi se odredila delotvorna doza za kompoziciju vakcine bez nepotrebnog eksperimentisanja. Na osnovu primera koji su dati u nastavku biće jasno koja približna doza i koja približna zapremina će biti odgovarajuće za upotrebu ovde opisane kompozicije vakcine. Ključni faktor je da doza obezbeđuje barem delimično zaštitno dejstvo protiv prirodne infekcije, što se može videti na osnovu smanjenja mortaliteta i morbiditeta povezanih sa prirodnom infekcijom. Osoba sa uobičajenim znanjem i veštinama u struci isto tako može lako da odredi odgovarajuću zapreminu. Na primer, kod ptica, zapremina doze može biti od oko 0,1 ml do oko 0,5 ml, a pogodno od oko 0,3 ml do oko 0,5 ml. Za mačke, pse i konje, zapremina doze može biti od oko 0,2 ml do oko 3,0 ml, pogodno od oko 0,3 ml do oko 2,0 ml, a pogodnije od oko 0,5 ml do oko 1,0 ml. Za goveda i svinje, zapremina doze može biti od oko 0,2 ml do oko 5,0 ml, pogodno od oko 0,3 ml do oko 3,0 ml, a pogodnije od 0,5 ml do oko 2,0 ml.

[0139] Ponovljena vakcinacija može biti poželjna u povremenim vremenskim intervalima kako bi se inicijalno pojačao imunski odgovor ili kada je prošao dug vremenski period od poslednje doze. U jednom otelotvorenju, kompozicija vakcine se primenjuje kao parenteralna injekcija (tj. supkutano, intradermalno ili intramuskularno). Kompozicija može da se primenjuje kao jedna doza ili, u alternativnim otelotvorenjima, primenjuje se u ponovljenim dozama sa oko dve do oko pet doza datih u intervalima od oko dve nedelje do oko šest nedelja, poželjno od oko dve nedelje do oko pet nedelja. Međutim, stručnjaku za ovu oblast će biti jasno da broj doza i vremenski interval između vakcinacija zavisi od više faktora, uključujući, bez ograničenja, starost vakcinisane životinje; stanje date životinje; način imunizacije; količinu antigena dostupnog po dozi, i slično. Za inicijalnu vakcinaciju, period će obično biti duži od nedelju dana, i poželjno će biti od oko dve nedelje do oko pet nedelja. Za prethodno vakcinisane životinje može da se primeni buster vakcina, pre trudnoće ili tokom nje, u intervalu od oko jedne godine.

[0140] Farmaceutske kompozicije napravljene prema pronalasku mogu biti za upotrebu u postupcima za lečenje domaćina, npr. životinje, pri čemu postupci obuhvataju primenu na domaćinu farmaceutske kompozicije napravljene prema pronalasku i koja sadrži najmanje jedan imunogen izabran iz grupe koja se sastoji od proteina ili peptida, inaktiviranog ili atenuisanog virusa, antitela, alergena, CpG ODN, faktora rasta, citokina ili antibiotika, a naročito CpG ODN ili citokina. Ove farmaceutske kompozicije mogu da se koriste da se poboljšaju performanse rasta životinja kao što su kokoške, svinje, krave ili stoka.

[0141] U jednom otelotvorenju, otkriće obezbeđuje imunološku kompoziciju ili kompoziciju vakcine koja sadrži formulaciju adjuvansa, terapeutski delotvornu količinu antigenske komponente i farmaceutski ili veterinarski prihvatljiv nosač, pri čemu formulacija adjuvansa obuhvata neumreženi polimer poliakrilne kiseline (PAA) koji ima prosečnu molekulsku masu (AMm) od oko 350 kDa do oko 650 kDa, koja obuhvata manje od 0,005% persulfata, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline. U nekim otelotvorenjima, antigenska komponenta može da obuhvata atenuisani rekombinantni virusni vektor, prirodni ili genetski konstruisani živi atenuisani virus ili mikroorganizam, inaktivirani virus ili mikroorganizam, kokcidijski mikroorganizam, zreli kokcidijski mikroorganizam, proteinsku podjedinicu, jednoćelijskog parazita, višećelijskog parazita ili bilo koju kombinaciju prethodnog.

[0142] U jednom konkretnom otelotvorenju, antigenska komponenta može da obuhvata: antigen psećeg koronavirusa (CCV), antigen štenećaka (CDV), antigen psećeg parvovirusa (CPV), antigen pseće parainfluence (CPI), antigen mačjeg kalcivirusa (FCV), antigen mačjeg virusa imunodeficijencije (FIV), antigen mišjeg virusa herpesa (FHV), antigen mačjeg virusa leukemije (FeLV), antigen kancera (npr. Her2-neu, tirozinaza, Il-2 i slično), Eimeria sp. ili njen antigen, Escherichia coli (E. coli) ili njen antigen, Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo), antigen goveđeg virusa dijareje (BDV), rekombinantni vektor virusa boginja kanarinca koji je sposoban za in vivo ekspresiju najmanje jednog zaštitnog imunogena i sadrži ga, inaktivirani glikoprotein besnila kompletne dužine, Erysipelothrix sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, površinski zaštitni antigen (SpaA) iz E. rhusiopathiae, fuzioni protein SpaA koji sadrži barem deo najmanje jednog dodatnog imunogena, fuzioni protein SpaA-FlaB, fuzioni protein SpaA-FlaB-His, B/C toksin Clostridium (C.) perfringens, D toksin C. perfringens, toksin C. septicum, toksin C. novyi, toksin C. tetani ili bilo koju kombinaciju prethodnog.

[0143] U nekim otelotvorenjima, antigenska komponenta može da sadrži Eimeria sp. ili njen antigen, Escherichia coli (E. coli) ili njen antigen, Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo), antigen goveđeg virusa dijareje (BDV), rekombinantni vektor virusa boginja kanarinca koji je sposoban za in vivo ekspresiju najmanje jednog zaštitnog imunogena i sadrži ga, inaktivirani glikoprotein besnila kompletne dužine, Erysipelothrix sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, površinski zaštitni antigen (SpaA) iz E. rhusiopathiae, fuzioni protein SpaA koji sadrži barem deo najmanje jednog dodatnog imunogena, fuzioni protein SpaA-FlaB, fuzioni protein SpaA-FlaB-His, B/C toksin Clostridium (C.) perfringens, D toksin C. perfringens, toksin C. septicum, toksin C. novyi, toksin C. tetani ili bilo koju kombinaciju prethodnog.

[0144] U još jednom otelotvorenju, antigenska komponenta obuhvata inaktivirani glikoprotein besnila kompletne dužine ili se sastoji od njega. Antigenska komponenta takođe može da obuhvata B/C toksin C. perfringens, D toksin C. perfringens, toksin C. septicum, toksin C. novyi, toksin C. tetani ili kombinacije prethodnog, ili da se sastoji od njih. U jednom konkretnom otelotvorenju, imunološka kompozicija ili kompozicija vakcine može da obuhvata antigensku komponentu koja obuhvata B/C toksin C. perfringens, D toksin C. perfringens, toksin C. septicum, toksin C. novyi i toksin C. tetani. PAA adjuvans koji je ovde otkriven omogućava „uštedu doze“.

[0145] U još jednom otelotvorenju, antigenska komponenta obuhvata antigen SpaA ili fuzioni protein koji obuhvata antigen SpaA.

[0146] U još jednom otelotvorenju, antigenska komponenta obuhvata atenuisani virus boginja ptica ili DNK plazmid koji obuhvata gen influence i sposoban je za njegovu in vivo ekspresiju. Antigenska komponenta takođe može da obuhvata atenuisani virus boginja ptica ili DNK plazmid koji obuhvata gen glikoproteina besnila i sposoban je za njegovu in vivo ekspresiju.

[0147] U nekim otelotvorenjima, antigenska komponenta može da obuhvata M. hyo.

4

[0148] U nekim otelotvorenjima, antigenska komponenta može da obuhvata FIV.

[0149] U nekim otelotvorenjima, antigenska komponenta može da obuhvata antigen kancera.

[0150] U nekim otelotvorenjima, antigenska komponenta može da obuhvata pseći koronavirus (CCV).

[0151] U nekim otelotvorenjima, antigenska komponenta može da obuhvata goveđi rotavirus.

[0152] U nekim otelotvorenjima, antigenska komponenta može da obuhvata virus psećeg gripa (CIV).

[0153] Kompozicije koje sadrže farmaceutski prihvatljivu so linearnog ili razgranatog PAA polimera koji ima raspon Mm od oko 350 kDa do oko 650 kDa, manje od 0,005% persulfata na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline, mogu biti za upotrebu u postupku za lečenje goveda od infekcije uzrokovane bakterijom, što obuhvata primenu vakcine pomenutih kompozicija na govečetu. U konkretnom otelotvorenju, PAA koji imaju Mm od oko 450 kDa su naročito korisni za izazivanje zaštitnih imunskih odgovora kod životinja, naročito goveda.

[0154] U nekim otelotvorenjima, otkriće se odnosi na kompoziciju vakcine iz otkrića za upotrebu u postupku lečenja psa ili konja od infekcije izazvane gripom, pri čemu postupak obuhvata primenu kompozicije vakcine na psu ili konju.

[0155] Kompozicija vakcine koja sadrži farmaceutski prihvatljivu so linearnog ili razgranatog PAA polimera koji ima raspon Mm od oko 350 kDa do oko 650 kDa, manje od 0,005% persulfata na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline, može biti za upotrebu u postupku lečenja psa ili konja od infekcije uzrokovane gripom, što obuhvata primenu na psu ili konju pomenute vakcine koja sadrži ptičje boginje ili DNK plazmid koji obuhvata antigen gripa i sposoban je za njegovu in vivo ekspresiju. U konkretnim otelotvorenjima, antigen gripa je HA gen.

[0156] Kompozicija vakcine koja sadrži farmaceutski prihvatljivu so linearnog ili razgranatog PAA polimera koji ima raspon Mm od oko 350 kDa do oko 650 kDa, manje od 0,005% persulfata na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline, može biti za upotrebu u postupku lečenja psa od infekcije uzrokovane virusom besnila, što obuhvata primenu na psu pomenute kompozicije vakcine koja obuhvata inaktivirani glikoprotein besnila.

[0157] Ptičje vakcine, uključujući ptičju vakcinu za kokcidiozu, za in ovo primenu, koje mogu da obuhvataju:

adjuvans koji obuhvata neumreženi PAA koji ima prosečnu Mm od oko 350 kDa do oko 650 kDa; manje od 0,005% persulfata na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline, i protozoalni antigen izabran od (1) jednog ili više rekombinantno eksprimiranih proteina; (2) jednog ili više proteina ili drugih makromolekula izolovanih iz pomenute protozoe uobičajenim putem; (3) ekstrakta celih ćelija ili preparata od pomenute protozoe; i (4) inaktiviranih, živih ili živih zrelih kokcidija izabranih od: Eimeria (E.) acervulina, E. adenoeides, E. brunetti, E. colchici, E. curvata, E. dispersa, E. duodenalis, E. fraterculae, E. gallopavonis, E. innocua, E. praecox, E. maxima, E. meleagridis, E. meleagrimitis, E. mitis, E. necatrix, E. phasiani, E. procera, E. tenella i kombinacija prethodnog.

[0158] U konkretnim otelotvorenjima, PAA ima prosečnu Mm od oko 450 kDa.

[0159] Kompozicija vakcine koja sadrži farmaceutski prihvatljivu so linearnog ili razgranatog PAA polimera koji ima raspon Mm od oko 350 kDa do oko 650 kDa, manje od 0,005% persulfata na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline, može biti za upotrebu u postupku lečenja goveda od infekcije uzrokovane putem E. coli ili M. hyo, što obuhvata primenu na govedu pomenute kompozicije vakcine koja obuhvata E. coli ili M. hyo. Kompozicija vakcine koja sadrži farmaceutski prihvatljivu so linearnog ili razgranatog PAA polimera koji ima raspon Mm od oko 350 kDa do oko 650 kDa, manje od 0,005% persulfata na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline, može biti za upotrebu u postupku lečenja svinje od infekcije uzrokovane putem M. hyo, što obuhvata primenu na svinji pomenute vakcine koja obuhvata M. hyo.

[0160] Imunološka kompozicija ili kompozicija vakcine može da obuhvata antigen koji odgovara agensu koji je odgovoran za mačju infekciju i/ili oboljenje. Antigen može da obuhvata virus mačje imunodeficijencije (FIV). Kompozicija vakcine koja sadrži farmaceutsku so linearnog ili razgranatog PAA polimera koji ima raspon Mm od oko 350 kDa do oko 650 kDa, manje od 0,005% persulfata na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline, može biti za upotrebu u postupku lečenja mačke od infekcije uzrokovane putem FIV, što obuhvata primenu na mački pomenute vakcine koja obuhvata FIV antigen i PAA.

[0161] Kompozicija vakcine može da obuhvata antigen kancera. Kompozicija vakcine koja sadrži farmaceutski prihvatljivu so linearnog ili razgranatog PAA polimera koji ima raspon Mm od oko 350 kDa do oko 650 kDa, manje od 0,005% persulfata na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline, može biti za upotrebu u postupku lečenja ispitanika od kancera, što obuhvata primenu na ispitaniku pomenute kompozicije vakcine koja obuhvata antigen kancera i PAA.

[0162] U nekim otelotvorenjima, otkriće se odnosi na kompoziciju vakcine za upotrebu u postupku lečenja psa od infekcije uzrokovane putem CVV (pseći koronavirus), pri čemu postupak obuhvata primenu kompozicije vakcine na psu.

[0163] U nekim otelotvorenjima, otkriće se odnosi na kompoziciju vakcine za upotrebu u postupku lečenja goveda od infekcije izazvane goveđim rotavirusom, pri čemu postupak obuhvata primenu kompozicije vakcine na govečetu.

[0164] U nekim otelotvorenjima, otkriće se odnosi na kompoziciju vakcine za upotrebu u postupku lečenja psa od infekcije putem CIV (pseći grip), pri čemu postupak obuhvata primenu kompozicije vakcine na psu.

4

[0165] Primeri dati u nastavku teksta, uz pozivanje na slike, ističu osobine i prednosti polimera koji se koriste u pronalasku. U ovim primerima, NaPAA označava natrijumovu so polimera, bilo da je prema pronalasku ili ne.

[0166] Kada nije naznačeno, „molekulska masa“ znači „prosečna molekulska masa“.

Primer 1 - materijali i postupci za karakterizaciju polimera

[0167] Svako određivanje Mm, nagiba Mark-Hauvinkove krive, IP, sadržaja monomera i sulfata je obavljeno prema procedurama koje su date u nastavku teksta.

1.1- Određivanje Mm, nagiba Mark-Hauvinkove krive i IP

1. Hemikalije i reagensi

[0168] Voda je prečišćena na sistemu Milli-Q-UF (Millipore, Milford, MA, SAD). Fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS 1C; 6,5 mMol.l-1 Na2 HPO4, 2H2 O; 1,5 mMol.l-1 KH2 PO4; 2,7 mMol.l-1 KCl; 137 mMol.l-1 NaCl; pH 6,8) pripremljen je interno. Određivanje karakteristika permeacije gela je obavljeno sa DNK (CAS broj 73049-39-5) od kompanije Sigma Aldrich (Saint Quentin Fallavier, Francuska) i saharozom (CAS broj 57-50-1) od kompanije VWR (Darmstadt, Nemačka).

[0169] Standardi korišćeni za kalibraciju sistema nabavljeni su od kompanije Malvern (Malvern, UK) za pululan 100 KDa i od kompanije Agilent (Santa Clara, CA) za pululan 400 KDa.

2. Hromatografija na molekulskim sitima (SEC) sa trostrukom detekcijom

[0170] Sistem Viscotek GPCmax VE2501 (Malvern Instrument, Malvern, UK) koji obuhvata HPLC pumpu sa integrisanim degaserom i automatskim uzorkivačem sa injekcionom petljom od 100 µl korišćen je za HP-SEC analize. Detektorski sistem Viscotek TDA 302 sa detektorima indeksa prelamanja, rasipanja svetlosti pod pravim uglom i četvorokapilarnim diferencijalnim viskozimetrom korišćen je za linijsku detekciju SEC signala. Detektori su imali sledeći redosled: LS (rasipanje svetlosti pod pravim uglom)-RI (indeks prelamanja)-VIS (četvorokapilarni diferencijalni viskozimetar). Najlonski predfilter od 0,22 µm je postavljen između kolone i detektora. Softverski program OmniSEC 4.7 je korišćen za beleženje i analizu podataka SEC. Svi detektori su kalibrisani sa standardom pulalan 100 kDa u mobilnoj fazi PBS 1C. PBS 1C mobilna faza je filtrirana kroz Millipore celuloza nitratni filter od 0,22 µm i degasirana pre korišćenja. Razdvajanje uzoraka NaPAA je postignuto kroz dve A6000M (8 mm ID x 30 cm L) kolone (Malvern) povezane u nizu. Elucija je bila izokratska sa protokom od 0,6 ml.min<-1>. Uzorci od 100 µl su injektovani sa ciljnom koncentracijom NaPAA sa približno 0,4 mg.ml<-1>za merenje Mm, IP i nagiba Mark-Hauvinkove krive. Standard pululan 400 kDa je korišćen kao „kontrolni“ uzorak za sve analize. Prazna zapremina kolone (V0) i ukupna zapremina permeacije (Vt) određene su putem injektovanja DNK velike molekulske mase, odnosno saharoze.

3. Priprema standarda i uzoraka

[0171] Pululan, DNK i saharoza za standarde su pripremljeni rastvaranjem sirovih supstanci u PBS 1C do finalnih koncentracija od 1, 0,1, odnosno 2 mg.ml<-1>. NaPAA su formulisane i razblažene do ciljne koncentracije u PBS 1C.

4. Određivanje vrednosti dn/dc za NaPAA i merenje Mm, nagiba Mark-Hauvinkove krive i IP.

[0172] Koeficijent dn/dc se odnosi na molarnu masu u skladu sa sledećim odnosom (Zimm, 1948, J. chem. Phys., 16, 1099-1116):

[0173] Kada K predstavlja optičku konstantu koja uključuje dn/dc za određeni sistem rasipanja opisan u sledećoj jednačini, C je koncentracija NaPAA u uzorku, Rθje višak intenziteta svetlosti rasute pod uglom θ, Mm je prosečna molekulska masa, a A2je drugi viralni koeficijent, za koji se može pretpostaviti da je nula, usled izuzetno niske koncentracije frakcija pojedinačnog uzorka. P(θ) je funkcija rasipanja čestica koja prikazuje zavisnost intenziteta rasipanja svetlosti od ugla, i povezana je sa radijusom okretanja (Rg) molekula polimera.

4

gde n0predstavlja indeks prelamanja rastvarača u uzorku; NAAvogadrov broj; λ0talasnu dužinu laserskog zraka u vakuumu.

[0174] Za male molekule veličine manje od λ0/20, pretpostavlja se da je intenzitet rasute svetlosti nezavisan od ugla rasipanja, tako da je P(θ) = 1 za sve uglove.

[0175] Dobijeni izraz je sada:

[0176] Dn/dc NaPAA je automatski izračunat pomoću softvera OmniSEC, koristeći rastuće poznate koncentracije NaPAA sa SEC sistemom za trostruku detekciju od 0,4 do 1 mg.ml<-1>. Svaka koncentracija je injektovana u duplikatu. Ovaj eksperiment je ponovljen u istim uslovima sa različitim reprezentativnim serijama NaPAA sa poznatim koncentracijama. Finalni koeficijent dn/dc je odgovarao proseku ovih utvrđenih vrednosti i utvrđeno je da je 0,172 ml.g<-1>. Ova vrednost dn/dc je korišćena za dalja određivanja molekulske mase.

[0177] Utvrđivanje Mm, IP i nagiba Mark-Hauvinkove krive je obavljeno sa rastvorom soli polimera poliakrilne kiseline u PBS 1C, uz poznatu koncentraciju soli polimera poliakrilne kiseline, na primer 0,4 mg.ml<-1>. Pošto so poliakrilne kiseline predstavlja više od 95% suve mase soli polimera poliakrilne kiseline, smatra se da je masa suve materije suva masa soli polimera poliakrilne kiseline.

[0178] Svojstveni viskozitet (IV) NaPAA je povezan sa njegovom molekulskom masom i konformacijom; i predstavljen je Mark-Hauvinkovim dijagramom:

[0179] Gde „a“ i „K“ predstavljaju konstante za dati sistem rastvorak-rastvarač i eksponent „a“ varira od 0 (čvrsta sfera) do 2 (oblik štapića).

4

[0180] Nagib Mark-Hauvinkove krive „a“ je određen na osnovu ove formule IV = K • Mm<a>.

[0181] Nagib „a“ veći ili jednak 0,7 znači da može da se smatra da je NaPAA linearan.

[0182] Indeks polidisperznosti (IP) definiše se kao Mm/Mn, gde je Mn broj prosečne molekulske mase. Mn za NaPAA je automatski izračunat pomoću softvera OmniSEC.

I.2 Određivanje persulfata i akrilatnih monomera

A. U sirovim supstancama

7. Hemikalije i reagensi

[0183] Voda je prečišćena na sistemu Milli-Q-UF (Millipore, Milford, MA).25 mM (faza A) i 200 mM (faza B) rastvori natrijum hidroksida su pripremljeni sa koncentrovanim natrijum hidroksidom 46 - 51% kompanije Fisher Scientific (Illkirch, Francuska). 0,1 N natrijum hidroksid je nabavljen od kompanije VWR (Darmstadt, Nemačka). Standardi koji su korišćeni za kalibraciju su nabavljeni od kompanije Fisher Scientific (Illkirch, Francuska) za natrijum persulfat i od kompanije Sigma Aldrich (Saint Quentin Fallavier, Francuska) za natrijum akrilat. Interni standard koji je korišćen za korekciju odstupanja u pripremi uzorka bio je natrijum oksalat kompanije Sigma Aldrich (Saint Quentin Fallavier, Francuska).

2. Anjonsko izmenjivačka hromatografija visokih performansi sa konduktometrijskom detekcijom

[0184] Akrilatne i persulfatne nečistoće u uzorcima NaPAA su istovremeno analizirane pomoću anjonsko izmenjivačke hromatografije visokih performansi (HPAEC) sa konduktometrijskom detekcijom. Korišćen je sistem za jonsku hromatografiju ICS-3000 (Dionex, Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Bio je opremljen SP-1 pumpom, termostatiranim automatskim uzorkivačem (5 °C), termostatiranom kolonom (40 °C) i odeljkom za konduktometrijski detektor (30 °C). ATC3 RFIC (9x24 mm) karbonatna kolona za hvatanje (Thermo Fisher Scientific) postavljena je ispred kolone kako bi se uhvatili karbonatni anjoni iz vode i poboljšala ukupna analitička osetljivost. Analitičko razdvajanje je postignuto na anjonsko izmenjivačkoj AS-11HC koloni (250x4 mm) kompanije Dionex

4

(Thermo Fisher Scientific) sa gradijentnom elucijom od 25 mM (faza A) do 200 mM (faza B) rastvora natrijum hidroksida. Gradijentni program je bio: 0% B (12 min), 0-40% B (5 min), 40-100% B (8 min), 100% B (25 min), 100-0% B (1 min), 0% B (9 min). Protok mobilne faze je bio 1 ml/min, a injekciona zapremina je bila 50 µl. Pretkolona AG-11HC (50x4 mm) kompanije Dionex (Thermo Fisher Scientific) korišćena je da se zaštiti analitička kolona. Dionex prigušivač provodljivosti (AERS 082540, Thermo Fisher Scientific) postavljen je ispred odeljka detektora kako bi se poboljšao signal. U ovim hromatografskim uslovima, retenciono vreme za akrilat, oksalat i persulfat bilo je oko 4, 11, odnosno 45 minuta.

3. Priprema uzoraka

[0185] Pre hromatografske analize, vrste sa velikom molekulskom masom su uklonjene iz uzoraka. Ukratko, uzorci NaPAA su desetostruko razblaženi vodom (što je dalo koncentraciju od 10 mg/ml u NaPAA) i dodat je interni standard natrijum oksalat kako bi se dostigla koncentracija od 50 µg/ml. Zatim je 500 µl uzoraka centrifugirano na 14.000 g tokom 30 minuta, redom kroz centrifugalni filter Amicon Ultracel 0,5 ml-100k i Amicon ultracel 0,5 ml-3k nabavljene od kompanije Merck Millipore (Darmstadt, Nemačka). Pre upotrebe, centrifugalni filteri Amicon su redom isprani vodom i sa 0,1 N NaOH kako bi se uklonio glicerol.

4. Kalibracija i rezultati

[0186] Kvantifikacija persulfatnih i akrilatnih nečistoća je obavljena pomoću eksterne kalibracije obavljene sa komercijalnim standardima. Šest koncentracija u rasponu od 1 - 100 µg/ml natrijum akrilata i persulfata pomešano je u vodi i 200 µl od 500 µg/ml internog standarda natrijum oksalata dodato je u svaku koncentraciju. Kriva kalibracije je pratila linerani model za persulfat, a kvadratni model za akrilat. Sadržaj nečistoća je izražen u % m/m (% mase akrilatne ili persulfatne nečistoće u odnosu na suvu masu NaPAA) ili u µg persulfatne ili akrilatne nečistoće po gramu sirovog NaPAA.

B. U NaPAA polimerima dobijenim nakon prečišćavanja

[0187] Nečistoće u vidu persulfata i rezidualne akrilne kiseline u uzorcima NaPAA nakon koraka prečišćavanja (putem dijalize, ultrafiltracije ili gel filtracije) određene su kao što je

4

prethodno opisano za određivanje u uzorcima sirovog NaPAA. Međutim, kod prečišćenih uzoraka, korak 10-strukog razblaživanja je izostavljen iz procedure pripreme uzorka. Za persulfat, hromatografski uslovi su bili isti kao za sirovi NaPAA, a analiza je vršena kao granični test sa granicom detekcije od 100 ng/ml. Za akrilat, korišćen je isti sistem HPAEC, ali analitičko razdvajanje je postignuto na anjonsko izmenjivačkoj koloni CarboPacTM SA10 (250x4 mm) kompanije Dionex (Thermo Fisher Scientific) sa gradijentnom elucijom od 30 mM (faza A) do 200 mM (faza B) rastvora natrijum hidroksida. Gradijentni program je bio: 0% B (14 min), 0-100% B (6 min), 100% B (15 min), 100-0% B (1 min), 0% B (9 min). Protok mobilne faze je bio 1 ml/min, a injekciona zapremina je bila 50 µl. Kolona CarboPacTM SA10G (50x4 mm) kompanije Dionex (Thermo Fisher Scientific) korišćena je da se zaštiti analitička kolona. Dionex prigušivač provodljivosti (AERS 082540, Thermo Fisher Scientific) postavljen je ispred odeljka detektora kako bi se poboljšao signal. U ovim hromatografskim uslovima, retenciono vreme za akrilat je bilo oko 11 minuta. Nečistoća u vidu rezidualne akrilne kiseline je utvrđena na osnovu linearne krive kalibracije koja je konstruisana koristeći eksterni standard akrilne kiseline koncentracije 20 - 500 ng/ml u PBS 1C. Rezultati su, kao iznad, izraženi u % m/m (% mase akrilatne ili persulfatne nečistoće u odnosu na suvu masu NaPAA) ili u µg persulfatne ili akrilatne nečistoće po ml adjuvantnog rastvora NaPAA.

Primer 2 - Testovi na adjuvantne aktivnosti

1) Ispitivanje adjuvantnog dejstva PAA prema pronalasku u poređenju sa 2 PAA iz prethodnog stanja struke, u vezi sa antigenom Staphylococcus aureus

[0188] Adjuvantna aktivnosti formulacija na bazi polimera je testirana na zatvorenoj populaciji genetski varijabilnih OF1 miševa koristeći polisaharid tipa 5 iz S. aureus (PS5) konjugovan sa rekombinantnim egzotoksinom A iz Pseudomonas aeruginosa (rEPA) kao model antigen.

[0189] Antigen je pripremljen na sledeći način:

Staphylococcus aureus (Rejnoldov soj) uzgajan je tokom 72 sata u medijumu SATA-1 bujonu uz mešanje (100 o/min), a zatim inaktiviran dodavanjem 1/1 (V/V) rastvora fenol/etanol do finalne koncentracije od 2% m/V. Bakterijske ćelije su nataložene na 16.000 g tokom 75 min. Ćelijska pasta je suspendovana na 0,5 g (vlažna masa) po ml u 50 mM Tris-2 mM MgSO4, pH 7,5. Dodat je lizostafin (100 µg/ml) i suspenzija je inkubirana na 37 °C tokom 4 sata uz

4

mešanje. Nakon toga je dodata benzonaza u koncentraciji od 5 j/ml i inkubacija je nastavljena tokom još 2 sata. Reakciona smeša je koncentrovana tangencijalnom protočnom filtracijom (granična tačka propusnosti na molekulskoj masi od 30.000 Da). Dobijena koncentrovana supstanca je digestirana pomoću benzonaze (5 j/ml) tokom 6 sati na 37 °C, a zatim pomoću pronaze (4 j./ml) na 37 °C tokom 15 sati u odgovarajućem puferu (Tris 50 mM pH 8,0 koji sadrži 1 mM MgCl2i 1 mM CaCl2). Nakon centrifugiranja na 5000 g tokom 30 min, supernatant je koncentrovan tangencijalnom protočnom filtracijom (MWCO 30.000 Da). Ovaj rastvor je zatim podešen na finalnu koncentraciju od 50 mM Tris HCl, pH 7,5. Alikvoti su naneti na kolonu Q Sepharose (20 ml) ekvilibrisanu pomoću 50 mM Tris HCl, pH 7,5. Kolona je eluirana sa protokom od 2 ml/min i sakupljene su frakcije od 5 ml. Kolona je isprana sa 5 zapremina početnog pufera. Polisaharidi su zatim eluirani sa 250 ml linearnog gradijenta od 0 do 0,5 M NaCl u 50 mM Tris HCl, pH 7,5. Frakcije koje sadrže polisaharide i ne sadrže teihoinsku kiselinu, što je detektovano optičkom apsorpcijom na 210 nm i putem anjonsko izmenjivačke hromatografije visokih performansi (HPAEC-PAD), dijalizovane su i liofilizovane.

[0190] Prečišćeni polisaharid je zatim aktiviran u NaCl putem dihidrazida adipinske kiseline (ADH). pH vrednost je podešena na 4,9 i dodat je etil dimetil aminopropil karbodiimid (EDAC). Tokom progresije aktivacije, koja je trajala 90 min na sobnoj temperaturi, pH vrednost je konstantno podešavana na vrednost 4,9 pomoću 0,1 N HCl. Reakcija je prekinuta dodatkom NaOH do neutralizacije (pH 7,0). Aktivirani polisaharid je zatim dijalizovan naspram 500 mM vodenog rastvora NaCl, a zatim naspram vode. Aktivirani i dijalizovani polisaharid je zatim liofilizovan. Procenat funkcionalizacije je procenjen na oko 5,9% (m/m).

[0191] Rastvor aktiviranog polisaharida je pomešan sa nosećim proteinom (eEPA) u NaCl i EDAC. Konjugacija se odigrala na 4 °C, pri čemu je pH vrednost održavana na 5,7 dodavanjem 0,1 N HCl. Nakon 90 min, reakcija je prekinuta dodatkom 0,2 N NaOH do pH 7. Konjugovani antigen je zatim dijalizovan naspram vodenog rastvora NaCl, a zatim prečišćen hromatografijom na molekulskim sitima na koloni sefaroza Cl-4B ekvilibrisanom sa 200 mM NaCl u 10 mM fosfatnom puferu, pH 7,2. Kombinovane su frakcije koje sadrže konjugate (kao što je detektovano optičkom apsorpcijom na 206 nm i 278 nm) i koje su prevashodno eluirane sa mrtvom zapreminom kolone.

[0192] Formulacije polimera su pripremljene na sledeći način:

Proizvod nazvan PAA225000 (Ref. 18613, natrijumova so) nabavljen je od kompanije Polysciences Europe (Eppelheim, Nemačka) u obliku koncentrovanog rastvora. Razblažen je vodom da bi se dobila koncentracija od 20 mg/ml i održavan uz mešanje na sobnoj temperaturi tokom 12 sati. pH vrednost je podešena na 7,55 pomoću HCl i rastvor je dijalizovan na sobnoj temperaturi naspram 150 mM vodenog rastvora NaCl (3 uzastopne kupke) koristeći dijalizne kasete sa granicom od 2 kDa (Thermo Fischer Scientific, Courtaboeuf, Francuska). Rastvor je zatim filtriran kroz PVDF membranu od 0,22 µm radi sterilizacije. Molekulska masa soli polimera je zatim izmerena i iznosi 488.550 Da. Njena Mn je 129.070 Da, a IP 3,8.

[0193] Polimer je zatim skladišten na 4 °C kao rastvor koji sadrži 20 mg/ml polimera u 150 mM vodenom rastvoru NaCl. Ovaj rastvor je zatim pomešan sa PBS 1C koncentrovanim 10 puta sa sterilnom vodom, kako bi se dobio slani rastvor koji sadrži 2 mg/ml soli polimera.

[0194] Proizvod nazvan PAA20 je nabavljen kao natrijumova so od kompanije Polymer Expert (Pessac, Francuska) u obliku suvog praha. Rehidriran je u vodi do koncentracije od 20 mg/ml i održavan uz mešanje na sobnoj temperaturi tokom 12 sati. Rastvor je zatim filtriran kroz PVDF membranu od 0,22 µm radi sterilizacije. Molekulska masa soli polimera je zatim izmerena na 100.700 Da. Njena Mn je 46.700 Da, a IP 2,2. Polimer je zatim skladišten na 4 °C, kao rastvor koji sadrži 20 mg/ml soli polimera u 150 mM vodenom rastvoru NaCl. Ovaj rastvor je zatim pomešan sa PBS 10C i sterilnom vodom, kako bi se dobio slani rastvor koji sadrži 2 mg/ml soli polimera.

[0195] CARBOPOL<®>974 P (nazvan CARBOPOL<®>) koji je mrežasti PAA polimer sa molekulskom masom od nekoliko miliona Da, razblažen je PBS-om kako bi se dobio rastvor koji sadrži 2 mg/ml polimera.

[0196] Adjuvantne formulacije koje se ubrizgavaju životinjama su pripremljene mešanjem V/V rastvora antigena i rastvora polimera. Svaka ubrizgana doza je imala 200 µg polimera i 2,5 µg polisaharida u PBS 1C rastvoru.

Imunizacije:

[0197] Grupe od 5 do 10 OF1 miševa starih 7 do 9 nedelja imunizovane su samo sa PAA20, PAA225000 ili CARBOPOL<®>(korišćeni kao negativne kontrole) ili formulacijama koje sadrže

1

antigen kao i adjuvans. Jednoj grupi miševa je ubrizgan samo PS5-rEPA. Doze su primenjivane supkutano (s.c.) u skapularni region dana D0, D21 i D35. Uzorci krvi su sakupljeni dana D42 radi analize imunskog odgovora.

[0198] Uzorci krvi su sakupljeni u Vacutainer epruvete koje sadrže aktivator koagulacije i gel za odvajanje seruma (Becton Dickinson, Meylan, Francuska). Epruvete su centrifugirane na 2600 g tokom 20 minuta kako bi se serum odvojio od ćelija. Serumi su preneti u ploče sa dubokim bunarčićima i inaktivirane toplotom na 56 °C tokom 30 minuta, nakon čega su skladištene na -20 °C do korišćenja u daljim testovima.

[0199] Test je obuhvatao sledeće različite grupe:

PBS

Carbopol<®>

PAA20

PAA225000

PS5-rEPA

PS5-rEPA Carbopol<®>

PS5-rEPA PAA20

PS5-rEPA PAA225000

[0200] Uzorci krvi su korišćeni za testiranje specifičnih IgG1 i IgG2a antitela koja proizvode imunizovani miševi.

[0201] ELISA test je koristio aktivirani polisaharid PS5 (PS5 konjugovan sa ADH: PS5-AH) kao antigen za oblaganje. Ukratko, ELISA ploče su obložene sa 100 µl po bunarčiću 1 µg/ml rastvora aktiviranog polisaharida u PBS 1C. Ploče su inkubirane tokom 12 sati na 4 °C i

2

ispražnjene okretanjem ploča. Bunarčići su blokirani dodavanjem 150 µl saturacionog pufera 1 (PBS 1C / Tween 0,05% m/V/ goveđi albumin 1% m/V) i inkubirane tokom 1 h na 37 °C. ELISA ploče su ispražnjene okretanjem. Dvostruka serijska razblaženja svakog seruma (12 puta) obavljena su neposredno u ELISA pločama koristeći pufer 1 kao pufer za razblaživanje radi dobijanja konačne zapremine od 100 µl po bunarčiću. Ploče su inkubirane tokom 90 minuta na 37 °C, a zatim isprane 3 puta (250 µl po bunarčiću) puferom 2 (PBS 1C/Tween 0,05% m/V). Antimišji IgG1 ili konjugat antimišji IgG2a peroksidaza razblaženi su u puferu 1 (1/8000) i korišćeni kao sekundarna antitela (100 µl po bunarčiću). Nakon 90 minuta inkubacije na 37 °C, ELISA ploče su isprane 3 puta puferom 2 (250 µl po bunarčiću). Reakcija je razvijena dodavanjem 100 µl rastvora supstrata tetrametil benzidina u svaki bunarčić i zaustavljena nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi pomoću 100 µl 1 N HCl/bunarčiću. Apsorbanca je izmerena na 450-650 nm. Titri antitela su izraženi u proizvoljnim jedinicama koje odgovaraju recipročnim razblaženjima seruma za OD450nm= 1 koristeći softver SoftmaxPro.

[0202] Dobijeni rezultati su rezimirani na SL.1 i pokazuju sledeće:

1) Nije izmeren pozadinski nivo u serumima za negativnu kontrolu (<1,3 Log) miševa imunizovanih samo ubrizgavanjem PBS 1C ili formulacija na bazi polimera (podaci nisu prikazani).

2) Specifični imunski odgovor na PS5 polisaharid, prvenstveno anti-PS5 IgG1 (4,8 Log), dobijen je nakon treće imunizacije samo sa konjugatom PS5-rEPA. Odgovor u vidu anti-PS5 antitela izazvan putem ubrizgavanja samo PS5-rEPA konjugata bio je prvenstveno pokrenut sa Th2, sa odnosom IgG1/IgG2a blizu 126.

3) Titri anti-PS5 IgG1 nisu povećani kada je PS5-rEPA konjugat formulisan sa Carbopol<®>, PAA20 ili PAA225000, pri čemu je prosečna vrednost anti-PS5 titra blizu 4,8 Log. Zajedničko ubrizgavanje Carbopol<®>ili PAA20 izazvalo je povećanje titra anti-PS5 IgG2a, ali ovi odgovori u vidu anti-PS5 antitela su i dalje prvenstveno pokrenuti sa Th2, sa odnosom IgG1/IgG2a blizu 50, odnosno 63. Veliko povećanje titra anti-PS5 IgG2a (4,5 Log) uočeno je kada je konjugat PS5-rEPA ubrizgan zajedno sa PAA225000. Zajedničko ubrizgavanje PAA225000 dovelo je do odgovora u vidu anti-PS5 antitela pod uticajem Th1, sa odnosom IgG1/IgG2a blizu 2.

[0203] Dakle, ovaj test je pokazao da, mada je prvenstveno sam antigen izazvao odgovor Th2, adjuvans prema predmetnom pronalasku je u poređenju sa drugim testiranim polimerima mogao da izazove mnogo izraženiji Th-1 imunski odgovor, bez uticaja na Th-2 odgovor.

[0204] Uzorci krvi su takođe testirani na sposobnost da izazovu opsonsku aktivnost u humanim perifernim mononuklearnim ćelijama (hPMN). Za ovaj test, objedinjeni serumi iz svake grupe su testirani u serijskim desetostrukim razblaženjima koristeći Levenštajnov soj (ATCC 49521) uzgajan tokom 20 h na 37 °C u TBS medijumu, čistom ili sa suplementom (stacionarna faza).

[0205] Humana periferna krv zdravih ljudskih dobrovoljaca je sakupljena u Vacutainer epruvete koje sadrže natrijum heparin. Bilo je potrebno deset mililitara po davaocu. Leukociti su izolovani liziranjem crvenih krvnih zrnaca u amonijum hloridnom puferu za lizu. Ćelije su dva puta isprane u PBS 1C i konačno suspendovane u 5 ml OPA medijuma (RPMI-Hepes sa dodatkom 0,5% BSA i 2 mM glutamina). Veliki leukociti (prvenstveno hPMN (95%)) zatim su prebrojani na brojaču Multisizer Coulter i koncentracija im je podešena na 0,25 × 10<6>/ml u OPA medijumu.

[0206] Nakon 20 h uzgajanja, bakterije su dva puta isprane u PBS 1C i ponovo suspendovane u 5 ml PBS 1C. Koncentracija bakterija je podešena na 10<8>CFU/ml u OPA medijumu.

[0207] Test oksidativnog naleta je obavljen u polipropilenskoj ploči sa dubokim bunarčićima sa 96 bunarčića. Ploča je držana na ledu nakon rednog dodavanja reagensa. Reagensi su dodavani u bunarčiće sledećim redosledom: 50 µl toplotno inaktiviranih specifičnih seruma u utvrđenom razblaženju od 1/10 do 1/640, 250 µl bakterija, 50 µl komplementa mladunčeta zeca 1/10, 100 µl leukocita i 50 µl DHR (Molecular Probe, D632) koncentracije 1 mg/ml. Finalna zapremina reakcije je bila 500 µl. Ploča je zatim inkubirana tokom 25 minuta na 37 °C uz blago tresenje, u mraku. Finalni odnos bakterija/velikih leukocita je bio 100:1, finalno razblaženje seruma i komplementa je bilo u rasponu od 1/100 do 1/6400, a finalna koncentracija DHR je bila 0,1 mg/ml. Na kraju perioda inkubacije, ploča je stavljena na led kako bi se zaustavila reakcija. Analiza je obavljena na Cytomics FC500. Oksidisani oblik DHR, rodamin 123, emituje jarku fluorescenciju prilikom ekscitacije na 488 nm. Na tačkastom dijagramu (FSC/SSC), gejt je definisan na velikoj granularnoj populaciji leukocita radi diferencijacije populacije PMN. Tri hiljade događaja iz svakog bunarčića uhvaćeno je na ovom

4

gejtu. Rezultati su izraženi kao procenat fluorescentno aktiviranih PMN (PMN pozitivni na rodamin 123) u celoj populaciji PMN.

[0208] Rezultati su prikazani u Tabeli 1, ispod:

Tabela 1

[0209] Ovi rezultati u Tabeli 1 pokazuju sledeće:

1) Nisu detektovani aktivirani PMN sa serumima za negativnu kontrolu miševa imunizovanih samo ubrizgavanjem PBS-a ili formulacija na bazi polimera (podaci nisu prikazani).

2) Konjugat PS5-rEPA je doveo do anti-PS5 serumskih antitela koja su sposobna da slabo aktiviraju hPMN u prisustvu bakterija. Procenat aktiviranih hPMN koje proizvode oksidativni nalet je procenjen na 30% do 70% za serumsko razblaženje 1/100.

3) Zajedničko ubrizgavanje PS5-rEPA uz Carbopol ili PAA20 je donekle povećalo sposobnost anti-PS5 serumskih antitela da prepoznaju površinu S. aureus soja Levenštajn. Procenat aktiviranih hPMN koje proizvode oksidativni nalet je procenjen na 80% do 100% za serumsko razblaženje 1/100.

4) Zajedničko ubrizgavanje PS5-rEPA sa PAA225000 jasno je povećalo (desetostruko povećanje) sposobnost anti-PS5 serumskih antitela da prepoznaju površinu S. aureus soja Levenštajn. Procenat aktiviranih hPMN koje proizvode oksidativni nalet je procenjen na 80% do 100% za serumsko razblaženje 1/1000.

[0210] Serumi dobijeni sa PAA225000 i PAA20 ili serumi dobijeni sa miševima koji su imunizovani samo antigenom takođe su testirani na sposobnost da ubiju Staphylococcus aureus Levenštajn bakterije u prisustvu humanih PMN.

[0211] Za ovaj test, puna krv je od zdravih ljudskih davalaca sakupljena u kese sa natrijum citratom od strane EFS (Etablissement Français du Sang) i sveži humani polimorfonuklearni leukociti (PMN) izolovani su u skladu sa sledećom procedurom. Eritrociti su lizirani putem inkubacije 5 ml krvi i 45 ml pufera za lizu tokom 10 min na 20 °C. PMN su dva puta isprani u HEPES slanom puferu (HBSS bez CaMg, ref pH 7,4). Vijabilnost PMN je bila veća od 90%, kao što je pokazano isključivanjem boje tripan plavo. Suspenzija PMN je razblažena na 10<7>ćelija po ml.

[0212] Levenštajnov soj S. aureus je uzgajan tokom 12 sati u TSB medijumu. Bakterijske ćelije su peletirane, isprane OPA medijumom (RPMI+5% SVF+0,05% Tween 20), i suspendovane u normalnom fiziološkom rastvoru do 5 × 10<7>ćelija po ml. U svaku epruvetu su dodate sledeće supstance: 0,25 ml PMN, 50 µl razblaženog testiranog seruma, 50 µl homolognih ćelija S. aureus (odnos 1 ćelija/1 bakterija), 50 µl 0,5% m/V zečjeg komplementa i OPA medijuma do kompletne zapremine od 500 µl/bunarčiću. Kontrolne epruvete sa S. aureus u prisustvu PMN, testiranim serumom ili samo komplementom su uključene u test. Epruvete za testiranje su inkubirane tokom 1 sata na 37 °C uz tresenje. Razblaženja su obavljena u 3 koraka (3* razblaženja 1/15) i 50 µl različitih razblaženja je ukapano šest puta u TSA agar i inkubirano tokom 12 sati. Procenat bakterijskog preživljavanja je definisan u svakoj tački razblaženja, ako je to moguće, koristeći formulu: (broj vijabilnih bakterija/prvobitni inokulum) x100.

[0213] Podaci dobijeni u 2 nezavisne analize prikazani su u Tabeli 2 (ONS = nespecifična opsonofagocitoza), ispod:

Tabela 2

[0214] Ovi rezultati prikazani u Tabeli 2 pokazuju sledeće:

1) Nije detektovano ubijanje bakterija serumima za negativnu kontrolu miševa imunizovanih samo ubrizgavanjem PBS-a ili formulacija na bazi polimera (podaci nisu prikazani).

2) PS5-rEPA konjugat je izazvao anti-PS5 serumska antitela koja pokazuju slabu aktivnost ubijanja u prisustvu hPMN, uz procenat bakterijskog ubijanja 39% pri serumskom razblaženju 1/100. Aktivnost bakterijskog ubijanja više nije merena kada je objedinjeni serum razblažen na 1/500.

3) Zajedničko ubrizgavanje PS5-rEPA sa PAA20 nije povećalo sposobnost anti-PS5 serumskih antitela da ubijaju S. aureus Levenštajnov soj.

4) Adjuvantno dejstvo PAA225000 na ubijanje bakterija je uočeno u testu 1, sa procentom ubijanja bakterija 50% u odnosu na 39% za neadjuvantni PS5-rEPA pri serumskom razblaženju 1/100 i sa procentom ubijanja bakterija 23% u odnosu na 9% za neadjuvantni PS5-rEPA pri serumskom razblaženju 1/500.

[0215] Uopšteni zaključak za ovaj test u pogledu stafilokoknog antigena je da je adjuvans iz predmetnog pronalaska pokazao bolju delotvornost u poređenju sa adjuvansima koji imaju manju molekulsku masu.

2) Testiranje adjuvantnog dejstva različitih polimera na imunski odgovor indukovan putem hCMV-gB

[0216] Cilj ove studije je da se proceni uticaj molekulske mase polimera poliakrilne kiseline (PAA) na adjuvantno dejstvo. To je obavljeno koristeći kao model antigen rekombinantni protein koji je dobijen od gB glikoproteina humanog citomegalovirusa (hCMV-gB).

[0217] Ovaj rekombinantni protein je proizvela rekombinantna CHO ćelijska linija transficirana plazmidom koji se naziva 0708985pEE14.4, koji sadrži modifikovani gen gB. Kako bi se olakšala proizvodnja ovog rekombinantnog proteina od strane CHO linije, gB gen, čija sekvenca je opisana u U.S. pat. br.5,834,307, prethodno je modifikovan izbacivanjem dela gena koji kodira transmembranski region gB proteina koji odgovara aminokiselinskoj sekvenci između valina 677 i arginina 752 i uvođenjem 3 tačkaste mutacije na mesto cepanja. Protein proizveden od strane CHO linije, koji se naziva gBdTM, odgovara skraćenom gB proteinu koji nema mesto raskidanja i transmembranski region.

[0218] gBdTM protein proizveden u medijumu za uzgajanje je zatim prečišćen pomoću hromatografije i skladišten u obliku osnovnog rastvora koji sadrži >0,2 mg/ml gBdTM u fosfatnom puferu.

[0219] PAA sa različitim molekulskim masama su bili sledeći:

PAA20 i PAA225000 kao što su opisani i pripremljeni u odeljku „1) Ispitivanje adjuvantnog dejstva PAA prema pronalasku u poređenju sa 2 PAA iz prethodnog stanja struke, u vezi sa antigenom Staphylococcus aureus.“

[0220] PAA3000 (Ref.06568), PAA6000 (Ref.06567), PAA50000 (Ref.00627) i PAA60000 (Ref. 18611) su NaPAA i nabavljeni su od kompanije Polysciences u obliku suvog praha (za PAA6000) ili koncentrovanih rastvora za ostale.

[0221] PAA20 je pomešan sa vodom do koncentracije od 20 mg/ml i održavan uz mešanje na sobnoj temperaturi tokom 12 sati. Rastvor je zatim filtriran kroz PVDF membranu od 0,22 µm i skladišten na 4 °C, kao rastvor koji sadrži 20 mg/ml polimera u 150 mM vodenom rastvoru NaCl. Ovaj rastvor je zatim pomešan sa PBS 10C i sterilnom vodom, kako bi se dobio slani rastvor koji sadrži 2 mg/ml polimera.

[0222] PAA kompanije Polysciences su zatim razblaženi sterilnom vodom do koncentracije od 20 mg/ml, pH vrednost je podešena na oko 7,4 (sa izuzetkom PAA60000 čija pH vrednost nije podešena) pomoću NaOH ili HCl i dijalizovani naspram 150 mM NaCl (3 uzastopne kupke) koristeći kasete za dijalizu sa granicom od 2 kDa (Thermo Fischer Scientific, Courtaboeuf, Francuska). Rastvori su zatim filtrirani kroz PVDF membranu od 0,22 µm, radi sterilizacije. Određeni su Mm, Mn i IP i polimeri su skladišteni na 4 °C, kao rastvor koji sadrži 20 mg/ml soli polimera u 150 mM vodenom rastvoru NaCl.

[0223] Molekulske mase (Mm i Mn) i PI polimera su dati u Tabeli 3 ispod:

Tabela 3

[0224] Skvalenska emulzija koja sadrži iste komponente kao MF59<®>skvalenska emulzija kompanije Novartis je pripremljena mikrofluidizacijom radi poređenja adjuvantne aktivnosti različitih polimera sa adjuvansom iz prethodnog stanja struke koji je korišćen kao referenca.

[0225] Adjuvantne formulacije su pripremljene V/V mešanjem rastvora antigena i adjuvantnog rastvora.

[0226] Količina adjuvansa je bila 200 µg polimera po ubrizganoj dozi ili, u slučaju emulzije, finalna doza vakcine je sadržala 2,5% V/V skvalena.

[0227] Testirane su sledeće različite formulacije (gB predstavlja hCMV-gB:2/µg u svakoj formulaciji)

● samo gB,

● gB skvalenska emulzija,

● gB PAA3000,

● gB PAA6000,

● gB PAA50000,

● gB PAA60000,

● gB PAA20 (PBS)

● gB PAA225000

[0228] C57BL/6 miševi (8-10 po grupi) imunizovani su dva puta, 0. dana i 28. dana, rekombinantnim hCMV-gB antigenom (2 µg/injekciji) u kombinaciji sa adjuvansom ili bez njega, i.m. (levi kvadriceps, finalna zapremina 50 µl). Test je kao kontrolu uključivao grupu imunizovanu samo sa hCMV-gB antigenom.

[0229] Uzorci krvi su od svih životinja pod dejstvom anestezije uzeti iz submandibularne vene dana D28 (intermedijerno krvarenje) i nakon iskrvavljenosti putem reza karotide dana D41. Anestezija je vršena pomoću preparata Imalgène (1,6 mg ketamina) i Rompun (0,32 mg ksilazina) primenjenih u zapremini od 150 µl, intraperitonealno (i.p.).

[0230] Za testove humoralnog odgovora na D28, 200 µl krvi je sakupljeno u bočice koje sadrže aktivator zgrušavanja i sredstvo za odvajanje seruma (Becton Dickinson Microtainer SST, ref.

365951). Nakon jedne noći na 4 °C, krv je centrifugirana na 10.000 o/min tokom 5 minuta i serum je sakupljen i skladišten na -20 °C do analize. Dana D41, 1 ml krvi je sakupljen u bočice koje sadrže aktivator zgrušavanja i sredstvo za odvajanje seruma (BD Vacutainer SST ref.

367783). Nakon 12 sati na 4 °C, krv je centrifugirana na 3000 o/min tokom 20 minuta i serum je sakupljen i skladišten na -20 °C do analize.

[0231] Za testove ćelijskog odgovora dana D41, slezine su sakupljene u sterilnim uslovima od 5 miševa po grupi. Splenociti su izolovani na sledeći način: sveže sakupljene slezine su razdvojene pomoću disocijatora Gentlemax (Miltenyi Biotec), ćelijske suspenzije su propuštene kroz ćelijsko sito i isprane RPMI medijumom. Crvena krvna zrnca su lizirana koristeći pufer za lizu crvenih krvnih zrnaca (Sigma). Nakon ispiranja, splenociti su prebrojani i odmah korišćeni za ćelijske testove.

Testovi seroneutralizacije:

[0232] Ova tehnika je korišćena za titraciju funkcionalnih neutrališućih antitela koja su prisutna u serumu životinja imunizovanih sa hCMV-gB. Na osnovu sposobnosti citomegalovirusa da inficira MRC5 fibroblaste i ARPE-19 ćelije (humane epitelne ćelije), serum koji sadrži specifična funkcionalna antitela na HCMV-Gb može da inhibira virusnu infekciju ćelija.

a. SN50 na MRC5

[0233] Ukratko, 1×10<4>MRC-5 fibroblasta je uzgajano u pločama sa ravnim dnom sa 96 bunarčića u DMEM 1% FBS tokom 1 dana u inkubatoru za uzgajanje ćelija sa 5% CO2na 37 °C. Toplotno inaktivirani serumi imunizovanih životinja su serijski razblaženi sa 1% FBS (fetalni goveđi serum) u DMEM (Dulbekov modifikovan Iglov medijum) sa dodatkom 10% komplementa mladunčeta zeca i inkubirani V/V sa 3,3 log CCID50 (doza koja inficira 50% ćelijske kulture)/ml hCMV Towne soja tokom 1 sata u inkubatoru za uzgajanje ćelija. Smeše seruma/virusa su zatim prebačene na monoslojeve MRC-5 ćelija. Nakon 7 dana inkubacije, supernatanti kulture su uklonjeni i ćelije su četiri puta isprane sa PBS 1C i zatim fiksirane sa 100 µl 85% acetona u vodi tokom 15 min na -20 °C. Ploče su tri puta isprane sa PBS 1C i osušene vazduhom. Inficirane ćelije su detektovane kolorimetrijskom reakcijom. Smeša dva specifična hCMV biotinilovana antitela (anti-IE1 CH160 i anti-gB CH177 HCMV proteini) dodata je u bunarčiće sa 0,5/µg/ml tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane u PBS

1

1C /0,05% Tween 20 (PBST) pre dodavanja streptavidin alkalne fosfataze tokom 1 sata na sobnoj temperaturi (22 °C). Ploče su isprane u PBST i obojene sa 100 µl hromogena NBT/BCIP tokom 30 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, ploče su osušene vazduhom i skenirane koristeći kolorimetrijski ELISPOT čitač ploča (Microvision Instruments, Evry, Francuska). Tamno obojena jedra koja predstavljaju citopatsko dejstvo uočena su u svakom bunarčiću. Smatra se da je razblaženje seruma neutrališuće ako u odgovarajućem bunarčiću nije uočen tamni fokus. Svako razblaženje seruma je testirano u 4 primerka. Za svako razblaženje, 50% neutralizacije (SN50) izračunato je putem regresije najmanjih kvadrata. Vrednost SN50 (u log 10) definisana je kao recipročna vrednost najvećeg razblaženja seruma koje smanjuje broj inficiranog bunarčića za 50%. Prosečni titar neutrališućih antitela je izračunat za svaku grupu miševa.

b. µPRNT50 na ARPE-19

[0234] Ukratko, 2,5×10<4>ARPE-19 ćelija je dozirano u tamne ploče sa 96 bunarčića dan pre testa mikroneutralizacije (MN). Dana D0, serumi su toplotno inaktivirani na 56 °C tokom 30 minuta. Uzorci seruma su serijski dvostruko razblaženi u DMEM/F121% FBS, počevši od 1/10 do 1/10.240 na tamnoj ploči sa dubokim bunarčićima sa 96 bunarčića i inkubirani sa 4,2 log FFU/ml BADrUL131-Y4 HCMV soja virusa tokom 60 min na 37 °C u 5% CO2 inkubatoru za uzgajanje ćelija. Smeše seruma/virusa su zatim prebačene na ARPE-19 ćelije i inkubirane na 37 °C u inkubatoru za uzgajanje ćelija sa 5% CO2 tokom 4 dana.

[0235] Dana D4, nakon uklanjanja supernatanta kulture, ćelije su fiksirane sa 100 µl 1% formola u PBS 1C tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim tri puta isprane sa PBS 1C i osušene na vazduhu na sobnoj temperaturi pre analize na Microvision fluorescentnom čitaču ploča kako bi se prebrojale inficirane ćelije u svakom bunarčiću.

[0236] Kao kontrola, na svakoj ploči su bila prisutna dva bunarčića sa ćelijskom kontrolom (bez virusa) i šest bunarčića sa ćelijama inficiranim sa pola virusnog razblaženja koje sadrže 4,2 log FFU/ml. Prosečna vrednost ovih šest bunarčića je definisala granicu seroneutralizacije, određenu kao 50% specifične vrednosti signala.

[0237] Titri krajnje tačke neutralizacije su definisani kao recipročna vrednost poslednjeg razblaženja koje je bilo ispod izračunate 50% specifične vrednosti signala. Neutrališući titri

2

(µPRNT50) definisani su za svaki pojedinačni serum kao poslednje razblaženje koje je indukovalo 50% smanjenja inficiranih ćelija, tj. poslednje razblaženje koje je indukovalo manju ćelijsku infekciju od izračunate 50% specifične vrednosti signala. Geometrijska sredina titra neutrališućih antitela je izračunata za svaku grupu.

[0238] Rezultati GMT (geometrijska sredina titra neutrališućeg antitela) dobijeni za svaku grupu imunizovanih miševa su prikazani na SL. 2 i 3:

Slični profili su uočeni sa oba testa seroneutralizacije na MRC5 fibroblastima i ARPE epitelnim ćelijama, koja god grupa da je analizirana. Nepostojeći ili mali neutrališući titar antitela je detektovan kod miševa koji su imunizovani neadjuvantnim hCMV-gB (GMT=6).

[0239] Polimer poliakrilne kiseline iz predmetnog pronalaska je dao daleko najbolji odgovor.

Odgovori IgG1 i IgG2c antitela

[0240] Serumska IgG1 i IgG2c antitela usmerena na hCMV-gB antigen su titrisana pomoću robotskog ELISA testa prema sledećoj proceduri.

[0241] Dynex mikroploče sa 96 bunarčića su obložene tokom 12 sati na 4 °C sa 1 µg/bunarčiću hCMV-gB, u 0,05 M karbonatnom/bikarbonatnom puferu, pH 9,6 (Sigma). Ploče su zatim blokirane tokom 1 sata na 37 °C sa 150 µl/bunarčiću PBS Tween-mleka (PBS pH 7,1, 0,05 % Tween 20, 1% (m/V) obranog mleka u prahu (DIFCO)). Sve sledeće inkubacije su vršene u finalnoj zapremini od 100 µl, nakon čega su usledila 3 ispiranja sa PBS pH 7,1, 0,05% Tween 20. Serijska dvostruka razblaženja uzoraka seruma su obavljena u PBS-Tween-mleku (počevši od 1/100 ili 1/1000) i dodata su u bunarčiće. Ploče su inkubirane tokom 90 min na 37 °C. Nakon ispiranja, antimišji IgG1 ili IgG2c peroksidaza konjugat (Southern Biotech) razblažen u PBS-Tween-mleku do 1/2000 dodat je u bunarčiće i ploče su inkubirane tokom 90 min na 37 °C. Ploče su dodatno isprane i inkubirane u mraku tokom 30 min na 20 °C sa 100 µl/bunarčiću rastvora supstrata tetrametil benzidina (TMB) spremnog za korišćenje (TEBU). Reakcija je prekinuta sa 100 µl 1M HCl/bunarčiću (Prolabo). Optička gustina (OD) izmerena je na 450 nm-650 nm pomoću čitača ploča (Spectra Max - Molecular Devices). Titri IgG antitela su izračunati koristeći softver CodUnit, za raspon vrednosti OD od 0,2 do 3,0 sa krive titracije (referentni mišji hiper imunski serum stavljen na svaku ploču). Titar IgG za ovu referencu, izražen u proizvoljnim ELISA jedinicama (EU) odgovarao je log10 recipročnog razblaženja koje daje OD 1,0. Granica detekcije antitela je bila 10 ELISA jedinica (1,0 log10). Svi finalni titri su izraženi u log10 (Log).

[0242] Rezultati su prikazani na SL.4 i 5:

Ovi rezultati pokazuju da je adjuvantni hCMV-gB antigen izazvao povećane imunske odgovore u poređenju sa neadjuvantnim antigenom, kako za titre IgG1 tako i za IgG2c, sa izuzetkom PAA3000 i PAA6000 koji imaju najmanju molekulsku masu.

[0243] Zanimljivo je napomenuti da je PAA iz predmetnog pronalaska naročito delotvorna za povećanje imunskog odgovora T pomoćnika tipa 1 (Th1), pošto su titri IgG2c naročito veliki kod miševa imunizovanih sa hCMV-gB u kombinaciji sa PAA iz predmetnog pronalaska.

Merenje citokina:

[0244] Splenociti imunizovanih miševa su izolovani odmah nakon žrtvovanja 41. dana, zasejani sa 2,5×10<5>ćelija po bunarčiću na ploče sa 96 bunarčića i inkubirani sa hCMV-gb (5 µg/bunarčiću), konkavalinom A (0,25 µg/bunarčiću; pozitivna kontrola) ili samo medijumom (RPMI-GSPβ-10% FCS; osnovni nivo). Nakon 6 dana inkubacije, izlučivanje IL5 i IFNγ citokina je izmereno koristeći komplet CBA Flex set. Rezultati su izraženi kao koncentracije citokina u pg/ml (geometrijska sredina po grupi). Granica za pozitivnu detekciju citokina je bila 5 pg/ml za IL-5 i 2,5 pg/ml za IFNγ.

[0245] Rezultati su prikazani na SL.6 i 7:

Ovi podaci pokazuju da je sa adjuvansom za emulziju nivo IL5 visok, dok je nivo IFNγ nizak. Zanimljivo je da adjuvans poliakrilna kiselina prema predmetnom pronalasku indukuje nizak nivo IL5, ali visok nivo IFNγ, što ukazuje na imunski odgovor skloniji Th1 tipu. Ovaj rezultat je u skladu sa rezultatima imunoglobulinske podtipizacije.

3) Poređenje dijafiltriranog PAA prema pronalasku sa sirovinom pre dijafiltracije.

[0246] U ovom testu, pokazano je da dijafiltracija nije uticala na adjuvantne osobine polimera.

4

[0247] Testirane su različite formulacije koje sadrže hCMV-gB antigen sa 0,08 mg/ml, koje su dobijene kao što je opisano u odeljku „2) Testiranje adjuvantnog dejstva različitih polimera na imunski odgovor indukovan putem hCMV-gB“.

[0248] Koristeći natrijumovu so polimera poliakrilne kiseline kompanije Polysciences, primenjena su dva različita procesa (priprema bez dijafiltracije i priprema sa dijafiltracijom).

[0249] Za pripremu bez dijafiltracije, proizvod koji je nabavljen od kompanije Polysciences je jednostavno razblažen sa PBS i sterilno filtriran kroz membranu granične tačke propusnosti od 0,2 µm. Koncentracija soli PAA je bila 17,4 mg/ml. Određeni su Mm, IP i nagib Mark-Hauvinkove krive.

[0250] Za dijafiltriranu formulaciju, proizvod nabavljen od kompanije Polysciences je tretiran prema sledećem protokolu:

a) mešanje vodenog rastvora nabavljenog od kompanije Polysciences sa PBS 1C pH 7,4 uz mešanje tokom 15 minuta kako bi se dobio rastvor PBS koji sadrži 14 mg/ml polimera,

b) dijafiltracija rastvora dobijenog u koraku a) naspram 5 zapremina PBS, sa membranom granične tačke propusnosti od 50 kDa,

c) filtracija proizvoda dobijenog u koraku b) na filteru za sterilizaciju od 0,2 µm.

[0251] Dobijeni rastvor je sadržao 15,9 mg/ml soli PAA pH 7,3. Određeni su Mm, IP i nagib Mark-Hauvinkove krive.

[0252] Vrednosti Mm, IP i nagiba Mark-Hauvinkove krive dobijene pre i posle dijafiltracije predstavljene su u Tabeli 4.

Tabela 4

[0253] Molekulske mase Mm i IP polimera pre i posle dijafiltracije su u skladu sa činjenicom da su monomeri i mali oligomeri, naročito oni sa manje od 2000 daltona, uklonjeni pomoću koraka dijafiltracije.

[0254] Takođe je važno uočiti da je Mm koju prijavljuje kompanija Polyscience, koja je utvrđena pomoću GPC (gel filtracija), bila 887.000 Da, što je veoma daleko od Mm izmerene pre dijafiltracije.

[0255] Koristeći ove dve različite pripreme, imunizacione formulacije su pripremljene mešanjem jednog od preparata polimera sa rastvorom gB u odgovarajućem odnosu, kako bi se dobile doze od 50 µl, od koji je svaka sadržala 2 µg gB i:

● 25, 50, 100 ili 200 µg soli polimera iz dijafiltrirane formulacije,

● ili 25, 50, 100 ili 200 µg soli polimera iz nedijafiltrirane formulacije.

C57BL/6J miševi stari 7 nedelja su dva puta intramuskularno imunizovani 0. dana i 21. dana, koristeći jednu od pripremljenih formulacija. Svaki preparat je testiran na grupi od 5 miševa. Jedna grupa od 5 miševa je primala samo antigen radi kontrole.

[0256] Ćelijski (IFNγ i IL5) humoralni odgovori (IgG potklase antitela, seroneutrališuća antitela) imunizovanih miševa su praćeni 2 nedelje nakon poslednje imunizacije (35. dana) na isti način kao što je opisano u odeljku „2) Testiranje adjuvantnog dejstva različitih polimera na imunski odgovor indukovan putem hCMV-gB“.

[0257] Rezultati su pokazali da je, kao i u prethodnom testu, adjuvans prema predmetnom pronalasku izazvao jak Th-1 imunski odgovor praćen indukcijom velikog titra antitela koja neutrališu virus, i da nije bilo značajne razlike između miševa imunizovanih dijafiltriranom formulacijom i miševa koji su imunizovani nedijafiltriranom formulacijom.

4) Ispitivanje stabilnosti dijafiltriranog PAA u poređenju sa sirovim PAA

[0258] Kako bi se proverila stabilnost PAA adjuvansa prema pronalasku, obavljena je studija koja analizira varijacije molekulske mase soli polimera na testovima ubrzanog starenja.

[0259] Za ovaj test su korišćeni nedijafiltrirani preparat i dijafiltrirani preparat. Prečišćavanje je obavljeno dijafiltracijom na membrani sa granicom od 50 kDa, a dobijeni dijafiltrirani preparat je sadržao 8 mg/ml soli polimera PAA sa molekulskom masom od 443.553 Da u PBS 1C.

[0260] Sadržaj natrijum persulfata je bio manje od 0,0007% (m/m) suvog polimera, dok je utvrđeno da je sadržaj natrijum akrilata 0,0011% suvog polimera.

[0261] Ovaj preparat je sipan u staklene bočice i držan na+5 °C, 25 °C ili 37 °C.

[0262] Analize su obavljene tokom 24 meseca na 5 °C, 9 meseci na 25 °C i 3 meseca na 37 °C. Rezultati dobijeni tokom ovog ispitivanja stabilnosti prikazani su u Tabeli 5 ispod:

Tabela 5

[0263] Ovi rezultati pokazuju da nije bilo značajnog smanjenja Mm nakon skladištenja na 5 °C tokom 24 meseca, nakon skladištenja na 25 °C tokom 9 meseci i nakon skladištenja na 37 °C tokom 3 meseca, a indeks polidisperznosti polimera je ostao nepromenjen.

[0264] Ovo je u suprotnosti sa rezultatima koji su dobijeni sa kompozicijom koja odgovara vodenom rastvoru koji sadrži 10% m/m uporedive soli PAA koja nije dijalizovana, i koja je sadržala natrijum persulfat u koncentraciji od 0,42% m/m u odnosu na kompoziciju suve mase. Utvrđeno je da je inicijalna Mm soli polimera 470.269 Da, dok je Mm koju prijavljuje dobavljač utvrđena putem GPC bila 351.100 Da.

[0265] Rezultati dobijeni tokom ispitivanja stabilnosti za ovaj nedijalizovani rastvor polimera prikazani su u Tabeli 6 ispod, i pokazuju da se molekulska masa vremenom smanjuje, naročito nakon skladištenja na 25 °C i 37 °C.

Tabela 6

5) Test koji prikazuje štetno dejstvo sadržaja persulfata

[0266] Natrijumova so polimera poliakrilne kiseline (kompanije Polysciences) sterilisana je u autoklavu na temperaturi 121 °C tokom 15 minuta. Koncentracija soli PAA u rastvoru je bila 101,8 mg/g. Tabela 7 u nastavku pokazuje Mm, IV (svojstveni viskozitet) i nagib Mark-Hauvinkove krive soli PAA pre i posle autoklava.

Tabela 7

[0267] Izgleda da je tretiranje u autoklavu dovelo do drastičnog smanjenja Mm i IV. Obavljena je dodatna studija za proučavanje parametara koji mogu biti odgovorni za ovu razgradnju polimera pod uticajem toplote. Ova studija je pokazala da je prečišćavanje soli polimera, naročito putem dijafiltracije, moglo da stabilizuje polimer nakon sterilizacije putem autoklaviranja.

[0268] Smeša polimera NaPAA i persulfata je izložena toploti, kako bi se reprodukovali uslovi autoklaviranja: kompozicija je okarakterisana putem Mm NaPAA i sadržaja persulfata pre i posle inkubacije na 120 °C tokom 15 minuta. Tabela 8 daje detaljan prikaz karakteristika kompozicije u pogledu Mm NaPAA i sadržaja persulfata.

Tabela 8

[0269] Ovi rezultati pokazuju da persulfati, nakon izlaganja toploti, dovode do smanjenja Mm. Nasuprot tome, PAA sa veoma malim sadržajem persulfata je imao veoma stabilnu Mm.

Kao zaključak, toplotna stabilnost rastvora PAA može se direktno povezati sa sadržajem persulfata. Korakom dijafiltracije koji je uveden u proces iz predmetnog pronalaska uklonjene su nečistoće u vidu persulfata iz rastvora PAA i dobijeni su toplotno stabilni rastvori PAA kompatibilni sa sterilizacijom pomoću autoklava.

Primer 3 - PAA podržava jak odgovor i smanjuje antigensko opterećenje

[0270] Potreba za sveobuhvatnijom zaštitom od patogena koji napadaju stoku zahtevala je dodavanje antigena postojećim formulacijama vakcina (npr. SINTOXAN<®>proizvodi, koji obično sadrže inaktivirane toksine i/ili bakterine plus adjuvans aluminijum hidroksid), ili formulaciju zasebnih vakcina sa pojedinačnim antigenima. Pošto je obezbeđivanje kombinovanih vakcina komercijalno poželjnije, podnosioci prijave su smatrali da mogu da dodaju nove antigene uz održanje postojeće zapremine doze, pod uslovom da mogu da identifikuju potentniji adjuvans sa dobrim bezbednosnim profilom.

[0271] Značajno je reći da, kao što je poznato stručnjaku za oblast vakcina i imunologije, nije moguće predvideti da li će molekulska vrsta funkcionisati kao bezbedan i delotvoran imunogeni adjuvans. Štaviše, čak i kada su adjuvantna svojstva utvrđena za novi molekul, usled nepredvidljive prirode ove struke, stručnjak ne može razumno očekivati uspeh u primeni novog adjuvansa u različitim situacijama. Promenljive koje utiču na to da li će nova formulacija funkcionisati kao bezbedna i protektivna vakcina uključuju, bez ograničenja: 1) vrstu/prisustvo adjuvansa; 2) vrstu/prirodu antigena (peptid, nukleinska kiselina, ubijeni virus, bakterin, itd.); 3) postupak primene; 4) vrstu/soj ciljnog patogena; i 5) ciljnu vrstu koja se vakciniše. Shodno tome, bezbednost i delotvornost novog adjuvansa za vakcine mora se pokazati za najmanje nekoliko kombinacija ovih promenljivih pre nego što se može doneti bilo kakav zaključak vezan za njegovu opštu primenljivost.

[0272] U predmetnom slučaju, kada vrsta antigena većinom obuhvata inaktivirane bakterije, podnosioci predmetne prijave su zaključili da bi novi, potentniji adjuvans koji omogućava uštedu doze morao biti otporan na lipazu. Nažalost, jedinjenja koja omogućavaju da formulacija bude otporna na lipazu često mogu dovesti do neželjenih reakcija na mestu primene. Usled toga, bilo je potrebno naći odgovarajući balans između bezbednosti, delotvornosti i stabilnosti vakcine.

[0273] Eksperimentalne SINTOXAN<®>vakcine (Merial Brazil - C. perfringens B/C; C. perfringens D; C. septicum; C. novyi; C. tetani) pripremljene su i testirane na miševima, zamorcima i zečevima. Na primer, dizajn studije na zamorcima i njeni rezultati prikazani su u Tabeli 9, odnosno 10.

Tabela 9. Pristup sa uštedom doze koristeći adjuvans PAA225000 poliakrilne kiseline

1

Tabela 10. Sažetak delotvornosti imunogenih formulacija koje dovode do uštede doze

2

[0274] Bezbednost je bila dobra za zamorce, miševe i zečeve i, kao što je naznačeno u Tabeli 10, delotvornost je bila dobra, naročito sa formulacijama koje nisu imale aluminijum hidroksid (vidite, npr. kolone Novyi, Septicum i Sordellii; koje porede E u odnosu na D). Ovi rezultati su bili prilično iznenađujući, pošto je bilo razumno očekivati da se kombinacija aluminijum hidroksida i novog polimernog adjuvansa (grupa E) pokaže bolje od nove formulacije koja sadrži samo polimer (grupa D).

Primer 4 - PAA podržava zaštitni odgovor kod pasa kada se formuliše sa klasičnim inaktiviranim ili rekombinantnim vakcinama

[0275] Studija inaktiviranog besnila. Vakcine su pripremljene prema Tabeli 11, a rezultati su prikazani na SL.8. Izgleda da su svi testirani adjuvansi bezbedni za upotrebu kod pasa, i svi adjuvansi su indukovali serokonverziju do 7. dana, pri čemu su pozitivni titri održani do 70 dana nakon vakcinacije. PAA 225000 je bio najdelotvorniji adjuvans za poboljšanje kratkoročne imunogenosti inaktiviranog besnila.

Tabela 11. Formulacije vakcina sa inaktiviranim besnilom (IMRAB<®>kompanije Merial sa različitim adjuvansima)

[0276] Studija gripa vektorisanog virusom boginja kanarinca. Formulacije vakcine gripa vektorisanog virusom boginja kanarinca su pripremljene i testirane na 5 grupa, od kojih svaka obuhvata 7 pasa (Tabela 12) i rezultati su predstavljeni na SL. 10. Visoki nivoi ćelija koje proizvode IFNy su otkriveni u svim grupama dana D14, D27 i D41. Slično trendu koji je uočen za klasične inaktivirane formulacije vakcina iznad, PAA sa većom Mm (tj. PAA225000) su bolji adjuvansi za antigene gripa vektorisane virusom boginja kanarinca. vCP2242 je u potpunosti opisan i omogućen pomoću US 7,425,336 (kompanije Merial). Ali, ukratko, vCP2242 je ovde rekombinantni ALVAC koji obuhvata HA gen sa optimizovanim kodonom iz H3N8 virusa konjskog gripa (EIV), pri čemu je HA gen umetnut na lokus ALVAC C5. Podnosioci predmetne prijave tvrde da ovde otkriveni rezultati podržavaju opšti zaključak da su rekombinantni vektori virusa boginja kanarinca kompatibilni sa neumreženim PAA iz predmetnog otkrića i predstavljaju dobre adjuvanse za njih (vidite, npr. SL.9).

4

Tabela 12. Formulacije vakcine gripa psa vektorisanog virusom boginja kanarinca

Primer 5 - Neumreženi PAA je delotvoran adjuvans za konjske vakcine

[0277] Studija konjskog gripa vektorisanog virusom boginja kanarinca tetanus toksin. Na konjima su primenjivane formulacije prema Tabeli 13. Kao što je naznačeno ispod, i na SL.11-13, PAA je snažan adjuvans za dva nepovezana antigena kako bi se kod konja izazvao zaštitni imunološki odgovor.

Tabela 13. Formulacije vakcine konjskog gripa vektorisanog virusom boginja tetanus

[0278] Rezultati. Do D14, sve PAA225000 životinje su imali zaštitni titar ≥ 0,05 i.j./ml. Dana D14, 6 od 8 životinja iz grupe sa vakcinama sa adjuvansom karbomerom i dalje su imale < 0,05 i.j./ml. Shodno tome, formulacije vakcina sa adjuvansom PAA225000 dovele su do značajno bolje serokonverzije nego imunološka formulacija sa adjuvansom karbomerom. Do D49 (nakon druge vakcinacije), titri u PAA225000 grupi su značajno i delotvorno visoki kod svih životinja.

Primer 6 - PAA je delotvoran adjuvans za svinjske vakcine

[0279] Studija „SpaA“ antigena kod svinja. „SpaA“ označava „površinski zaštitni antigen“ Erysipelothrix rhusiopathiae, patogena koji inficira svinje i druge životinje, uključujući pse. Erysipelothrix rhusiopathiae je gram-pozitivna, katalaza-negativna, štapićasta, nemotilna bakterija koja ne gradi spore i nije otporna na kiseline. Kod svinja, E. rhusiopathiae izaziva „crveni vetar“. „TS6“ označava emulziju ulja u vodi opisanu, na primer, u US 7,371,395 (kompanije Merial). TS6 je formulisan dodavanjem oko jednog (1) dela vodene komponente koja sadrži antigen u oko dva (2) dela uljane komponente, a zatim emulgovanjem dve komponente kako bi se dobila finalna emulzija.

Tabela 14. Grupa i definicije lečenja

[0280] Mada je G1 dala najbolje rezultate, treba napomenuti da značajan deo zapremine emulzija ulja u vodi zauzimaju neantigenske komponente (kao iznad, odnos uljanih komponenata prema vodenim antigenskim komponentama je 2:1).

[0281] Kao što je ovde otkriveno, podnosioci predmetne prijave su po prvi put otkrili da su određeni rasponi molekulskih masa neumreženog (tj. linearnog i razgranatog) polimera poliakrilne kiseline (PA) naročito pogodni za pospešivanje dejstva imunogenih antigena, kao i za izazivanje imunoloških odgovora nezavisnih od antigena. Važno je reći da su podnosioci predmetne prijave iznenađujuće otkrili da su ovi neumreženi PAA adjuvansi naširoko primenljivi za brojne različite vrste antigena: atenuisani rekombinantni virusni vektor; klasično inaktivirani glikoprotein besnila; podjedinicu SpaA peptida; i bakterijske toksine. Štaviše, otkriveni PAA adjuvansi su dobro funkcionisali za različite vrste životinja. Shodno tome, podnosioci predmetne prijave tvrde da otkriveni neumreženi PAA predstavljaju novi i inventivni „univerzalni adjuvans“.

Claims

Patentni zahtevi

1. Farmaceutski prihvatljiva so linearnog ili razgranatog polimera poliakrilne kiseline, za upotrebu u vidu adjuvansa u kompoziciji vakcine, naznačena time što pomenuta so polimera poliakrilne kiseline ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 350 do 650 kDa i obuhvata manje od 0,005% m/m persulfata, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline, i pri čemu je polimer poliakrilne kiseline isključivo sačinjen od jedinica akrilne kiseline.

2. Farmaceutski prihvatljiva so linearnog ili razgranatog polimera poliakrilne kiseline, za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što je pomenuta so polimera poliakrilne kiseline sačinjena isključivo od jedinica akrilne kiseline koje su so akrilne kiseline ili je sačinjena isključivo od jedinica akrilne kiseline koje su oblik slobodne kiseline akrilne kiseline i jedinica akrilne kiseline koje su so akrilne kiseline.

3. Farmaceutski prihvatljiva so linearnog ili razgranatog polimera poliakrilne kiseline, za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, naznačena time što:

(i) sadrži manje od 0,005% m/m oksidacionih sredstava, poželjno manje od 0,001% m/m oksidacionih sredstava, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline;

(ii) sadrži manje od 0,001% m/m persulfata, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline;

(iii) pomenuti polimer poliakrilne kiseline je so sa Na<+>;

(iv) sadrži manje od 0,005% m/m monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili u obliku soli, na osnovu ukupne suve mase pomenute soli polimera poliakrilne kiseline; i/ili

(v) nalazi se u tečnoj formulaciji koja ima pH u rasponu od 5,5 do 8,0, poželjno formulisanoj u puferovanom vodenom rastvoru, dobijenom sa puferom kao što je fosfatni pufer, Tris, Hepes, histidinski ili citratni pufer.

4. Farmaceutski prihvatljiva so linearnog ili razgranatog polimera poliakrilne kiseline, za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što pomenuta so polimera poliakrilne kiseline ima:

(i) indeks polidisperznosti manji ili jednak 4, poželjno manji ili jednak 2,5; i/ili (ii) nagib Mark-Hauvinkove krive veći ili jednak 0,7.

5. Farmaceutski prihvatljiva so linearnog ili razgranatog polimera poliakrilne kiseline, za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što pomenuta so polimera poliakrilne kiseline ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4; ili ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4; ili ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2,5; ili ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2.

6. Farmaceutski prihvatljiva so linearnog ili razgranatog polimera poliakrilne kiseline, za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što je dijafiltrirana i/ili sterilisana.

7. Farmaceutski prihvatljiva so linearnog ili razgranatog polimera poliakrilne kiseline, za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što se koristi za povećanje imunskog odgovora Th1 koji se dobija pomoću kompozicije vakcine.

8. Kompozicija vakcine koja sadrži najmanje jedan aktivni agens za vakcinu i farmaceutski prihvatljivu so polimera poliakrilne kiseline prema bilo kom od zahteva 1 do 7, kao adjuvans.

9. Kompozicija vakcine prema zahtevu 8, naznačena time što po dozi sadrži od 0,1 do 8 mg farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline, poželjno od 0,1 do 4 mg, a poželjnije od 0,1 do 2 mg.

10. Kompozicija vakcine prema zahtevu 8 ili 9, naznačena time što je najmanje jedan aktivni agens za vakcinu antigen ili vektor, kao što je virusni vektor ili nukleinska kiselina, koji eksprimiraju antigen, poželjno pri čemu je antigen bakterijski antigen poreklom od Clostridium tetani, Clostridium diphtheriae, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae tipa B, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Shigella sp, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis ili pneumoniae ili Streptococcus sp; ili je virusni antigen poreklom od virusa hepatitisa A, B ili C, virusa gripa, respiratornog sincicijalnog virusa, rinovirusa, virusa Zapadnog Nila, virusa besnila, poliovirusa, HIV virusa, denga virusa, virusa japanskog encefalitisa, virusa žute groznice, citomegalovirusa ili herpes virusa; ili je parazitski antigen poreklom od Plasmodium sp., leishmania sp. ili schistosoma sp.; ili je tumorski antigen.

11. Kompozicija vakcine prema bilo kom od zahteva 8 do 10 naznačena time što je najmanje jedan aktivni agens za vakcinu antigen ili vektor, kao što je rekombinantni virus ili nukleinska kiselina koja kodira antigen, pri čemu je pomenuti antigen poreklom od Staphylococcus aureus ili od citomegalovirusa.

12. Kompozicija vakcine prema bilo kom od zahteva 8 do 11 za upotrebu u izazivanju imunskog odgovora kod pojedinca, naročito čoveka, uz povećanje ostvarenog imunskog odgovora Th1 i/ili uz ravnotežu između ostvarenih imunskih odgovora Th1 i Th2.

13. Proces za pripremu farmaceutski prihvatljive soli polimera poliakrilne kiseline prema bilo kom od zahteva 1 do 7 koji obuhvata sledeće uzastopne korake:

a) postojanje rastvora polimera poliakrilne kiseline,

b) prečišćavanje rastvora polimera poliakrilne kiseline, kako bi se uklonile nečistoće, i c) sterilizaciju prečišćenog rastvora polimera poliakrilne kiseline.

14. Postupak pripreme prema zahtevu 13, naznačen time što:

(i) polimer poliakrilne kiseline iz rastvora iz koraka a) ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 300 do 550 kDa;

(ii) prečišćavanje se obavlja dijalizom, dijafiltracijom, ultrafiltracijom ili hromatografijom na molekulskim sitima, poželjno pri čemu se prečišćavanje obavlja dijafiltracijom sa membranom sa granicom od 1 do 80 kDa, ili od 2 do 50 kDa; i/ili (iii) sterilizacija se obavlja u autoklavu.

15. Postupak pripreme prema zahtevu 13 ili zahtevu 14, naznačen time što se prečišćavanje obavlja u uslovima koji omogućavaju dobijanje rastvora polimera poliakrilne kiseline koji ima:

- manje od 0,005%, poželjno manje od 0,001% m/m oksidacionih sredstava, na osnovu ukupne suve mase pomenutog polimera poliakrilne kiseline koji je dobijen nakon prečišćavanja, i/ili manje od 0,005%, poželjno manje od 0,001% m/m persulfata, na osnovu ukupne suve mase pomenutog polimera poliakrilne kiseline koji je dobijen nakon prečišćavanja,

- manje od 0,005% m/m monomera akrilne kiseline u obliku slobodne kiseline ili u obliku soli, na osnovu ukupne suve mase pomenutog polimera poliakrilne kiseline koji je dobijen nakon prečišćavanja,

- so polimera poliakrilne kiseline: ima prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4; ili prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 4; ili prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 380 do 620 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2,5; ili prosečnu molekulsku masu Mm u rasponu od 400 do 600 kDa i indeks polidisperznosti manji ili jednak 2.

1