RS66476B1 - Notch receptori sa zglobnim domenom - Google Patents

Notch receptori sa zglobnim domenom

Info

Publication number
RS66476B1
RS66476B1 RS20250107A RSP20250107A RS66476B1 RS 66476 B1 RS66476 B1 RS 66476B1 RS 20250107 A RS20250107 A RS 20250107A RS P20250107 A RSP20250107 A RS P20250107A RS 66476 B1 RS66476 B1 RS 66476B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
leu
ser
gly
asp
thr
Prior art date
Application number
RS20250107A
Other languages
English (en)
Inventor
Kole T Roybal
Raymond Liu
Iowis Zhu
Original Assignee
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ California filed Critical Univ California
Publication of RS66476B1 publication Critical patent/RS66476B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4214—Receptors for cytokines
    • A61K40/4215—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4254—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C07K2319/715—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16 containing a domain for ligand dependent transcriptional activation, e.g. containing a steroid receptor domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
IZJAVA U VEZI SA FEDERALNO SPONZORISANIM R&D
[0001] Ovaj pronalazak je urađen uz podršku vlade u okviru granta br. OD025751 dodeljenog od strane Nacionalnog instituta za zdravlje. Vlada ima određena prava na pronalazak.
OBLAST
[0002] Predmetni pronalazak se uopšteno odnosi na nove sintetičke ćelijske receptore koji vezuju ligande na površini ćelije i imaju selektivne specifičnosti i aktivnosti. Otkriće takođe pruža kompozicije i postupke korisne za produkciju takvih receptora, nukleinskih kiselina koje ih kodiraju, ćelije domaćina genetski modifikovane nukleinskim kiselinama, kao i postupke za modulaciju aktivnosti ćelije i/ili za lečenje različitih zdravstvenih stanja ili bolesti , kao što su kanceri.
STANJE TEHNIKE
[0003] Važan problem koji ograničava razvoj terapija baziranih na genetički modifikovanim ćelijama kod ljudi jeste regulacija ekspresije terapijskog gena kako bi se smanjile ili eliminisale interakcije koje dovode do značajnih neželjenih efekata prilikom primene himernih antigenskih receptora T ćelija (CAR-T, od eng. Chimeric Antigen Receptor T cells). Takvi efekti uključuju, na primer, nespecifičnu aktivnost („off-target“ aktivnost), specifičnu ali neželjenu aktivnost van tumorskog tkiva („on-target“, „off-tumor“ aktivnost (tj. gde se CAR-T ciljni antigen se takođe nalazi na normalnim ćelijama izvan tumora), kao i nemogućnost modulacije ili isklјučivanja aktivnosti CAR-T ćelija kada je to potrebno. Moguće rešenje ovih problema jeste upotreba sintetičkog receptora sposobnog da modifikuje ekspresiju gena i/ili ćelijsko ponašanje.
[0004] Notch receptori su transmembranski proteini koji posreduju u signalizaciji putem ćelijskoćelijskog kontakta i igraju centralnu ulogu u razviću i drugim aspektima komunikacije između ćelija, npr. komunikacija između dve kontaktne ćelije, u kojoj je jedna kontaktna ćelija ćelija „primalac“, a druga kontaktna ćelija je ćelija „pošilјalac“. Notch receptori eksprimirani u ćeliji „primaocu“ prepoznaju svoje ligande (npr., delta/serrate/lag, ili „DSL“ familiju proteina) eksprimirane na ćeliji pošiljaocu. Interakcija notch i delta na ovim kontaktnim ćelijama dovodi do dvostepene proteolize notch receptora koja na kraju dovodi do oslobađanje intracelularnog dela receptora iz membrane u citoplazmu. Notch ima mesto isecanja pomoću metaloproteaze (označeno kao „S2“), koje je normalno zaštićeno od isecanja Notch negativnim regulatornim regionom (NRR), domenom koji se sastoji od tri ponovljena regiona LIN-12-Notch (LNR) i domenom heterodimerizacije (HD) ekstracelularne subjedinice Notch (NEC). Veruje se da je ova proteoliza regulisana silom privlačenja koju vrši ćelija koja je „pošiljalac“: DSL ligand povlači Notch receptor što menja konformaciju negativnog regulatornog regiona, otkrivajući mesto delovanja metaloproteaze. Nakon toga, to mesto iseca konstitutivno aktivna proteaza, oslobađajući ekstracelularni domen vezivanja i negativni regulatorni region (NRR) receptora. Oslobađanje ekstracelularnog domena vezivanja receptora zauzvrat izlaže drugo mesto(a) intramembranskog isecanja (označeno sa „S3“), koje biva isečeno gama sekretazom unutar ćelijske membrane čime se oslobađa intracelularni domen sa ćelijske membrane koji difunduje u jedro. W.R. Gordon et al., Dev Cell (2015) 33:729-36. Ovaj oslobođeni domen menja ponašanje ćelije primaoca tako što funkcioniše kao regulator transkripcije. Notch receptori su uključeni i neophodni za različite ćelijske funkcije tokom razvića, kao i za funkciju velikog broja tipova ćelija kod različitih vrsta.
[0005] Primeri postojećih sintetičkih derivata prve generacije Notch receptora, koji se često nazivaju „SynNotch receptori“, koriste ovaj jednostavan signalni put zamenom ekstracelularnog domena koji vezuje ligand, i koji u „wild type“ Notch sadrži više ponovljenih sekvenci nalik na EGF, sa derivatom antitela, i zamenom citoplazmatskog domena sa aktivatorom transkripcije po izboru, dok se i dalјe oslanjaju na funkcionalnost Notch NRR (US9834608 B2 i L. Morsut et al., Cell (2016) 164:780-91). Generalno, SynNotch signalizacija je u korelaciji sa vezivanjem liganda, ali je teško prilagoditi osetlјivost i odgovor receptora. Pored toga, NRR obuhvata približno 160 aminokiselina, što ovaj domen čini veličine nekih zrelih proteina, poput insulina ili epidermalnog faktora rasta (EGF). Ovo smanjuje efikasnost ekspresije himernog receptora, i zbog ograničenja veličine vezanih za kapacitet vektora, rezultujući himerni receptori mogu premašiti kapacitet nekih vektora za kloniranje i transfekciju.
REZIME
[0006] Ovo otkriće se generalno odnosi na imunoterapeutike, kao što su himerni polipeptidi za upotrebu u modulaciji ćelijskih aktivnosti ili u lečenju različitih zdravstvenih stanja ili bolesti. Posebno, ovde su obezbeđeni oligomerizovani himerni receptori koji, iznenađujuće, zadržavaju sposobnost da prenose signale kao odgovor na vezivanje liganda uprkos potpunom odsustvu Notch ekstracelularne subjedinice (NEC), uklјučujući negativni regulatorni region (NRR). Tačnije, ovi receptori uklјučuju ekstracelularni domen oligomerizacije kako bi obezedili formiranje oligomernog oblika, npr., dimerni ili trimerni oblik himernih receptora. Bez vezivanja za bilo koju posebnu teoriju, ovaj dizajn olakšava oligomerizaciju ili grupisanje ekstracelularnih domena (ECD) i time zapravo okuplja intracelularne domene (ICD) da bi se aktivirala ćelijska signalizacija, npr., signalizacija T-ćelija. Dalјe, ovi receptori obezbeđuju opseg osetlјivosti. Dodatno, potpunim izostavlјanjem nativnog Notch NEC, broj polinukleotida koji kodiraju receptore iz otkrića može biti manji od broja polinukleotida koji kodiraju SynNotch, što omogućava upotrebu vektora koji imaju ograničeniji kapacitet, ili olakšava uklјučivanje dodatnih elemenata koji bi inače bili isklјučeni ograničenjima veličine vezane za vektorski kapacitet.
[0007] Reference na postupke lečenja terapijom u ovom opisu treba da se tumače kao reference na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog predmetnog pronalaska za upotrebu u tim postupcima.
[0008] U jednom aspektu, ovde su obezbeđeni himerni polinukleotidi uklјučujući, od N-kraja do C-kraja: (a) ekstracelularni domen koji vezuje ligand koji ima afinitet vezivanja odabranog liganda; (b) zglobni (eng., hinge) domen sposoban da promoviše formiranje oligomera himernog polipeptida preko intermolekularnog disulfidnog vezivanja; (c) transmembranski domen koji uklјučuje jedno ili više mesta proteolitičkog isecanja indukovanog ligandom; i (d) intracelularni domen koji uklјučuje regulator transkripcije, pri čemu vezivanje izabranog liganda za ekstracelularni domen koji vezuje ligand, indukuje isecanje na mestu proteolitičkog isecanja indukovanog ligandom a koje se nalazi između regulatora transkripcije i zglobnog domena, pri čemu himerni polipeptid ne uklјučuje LIN-12-Notch (LNR) ponovak i/ili domen heterodimerizacije (HD) Notch receptora.
[0009] Neograničavajući primeri izvođenja himernih polipeptida prema ovom predmetnom pronalasku uklјučuju jednu ili više sledećih karakteristika. U nekim realizacijama, transmembranski domen dalјe uklјučuje sekvencu za zaustavlјanje transfera. U nekim realizacijama, ekstracelularni domen uklјučuje deo koji se vezuje za antigen i ima sposobnost da se veže za ligand na površini ćelije. U nekim realizacijama, ćelija je patogen. U nekim realizacijama, ćelija je humana ćelija. U nekim realizacijama, humana ćelija je tumorska ćelija. U nekim realizacijama, humana ćelija je terminalno diferencirana ćelija. U nekim realizacijama, ligand uklјučuje protein ili uglјeni hidrat. U nekim realizacijama, ligand je marker diferencijacijske grupe (CD). U nekim realizacijama, CD marker se bira iz grupe koju čine CD1, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3d, CD3e, CD3g, CD4, CD5, CD7, CD8a, CD8b, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD34, CD40, CD45, CD48, CD52, CD59, CD66, CD70, CD71, CD72, CD73, CD79A, CD79B, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD94, CD95, CD134, CD140 (PDGFR4), CD152 , CD154, CD158, CD178, CD181 (CXCR1), CD182 (CXCR2), CD183 (CXCR3), CD210, CD246, CD252, CD253, CD261, CD262, CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD276 (B7H3), CD279, CD395, CD (JAG1), CD340 (HER2), EGFR, FGFR2, CEA, AFP, CA125, MUC-1, MAGE, alkalna fosfataza, placentalu sličan 2 (ALPPL2), antigen sazrevanja B ćelija (BCMA), zeleni fluorescentni protein (GFP), pobolјšani zeleni fluorescentni protein (EGFP) i signalni regulatorni protein α (SIRPα).
[0010] U drugom aspektu, ovde su obezbeđene nukleinske kiseline uklјučujući nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni polipeptid kao što je ovde opisano. U nekim realizacijama, nukleotidna sekvenca je ugrađena u ekspresionu kasetu ili ekspresioni vektor.
[0011] U nekim realizacijama, ovde su obezbeđene rekombinantne ćelije uklјučujući: (a) himerni polipeptid kao što je ovde opisano; i/ili (b) rekombinantnu nukleinsku kiselinu kao što je ovde opisana. Takođe su obezbeđene, u srodnom aspektu, ćelijske kulture koje uklјučuju najmanje jednu rekombinantnu ćeliju kako je ovde opisano i medijum za kulturu.
[0012] U drugom aspektu, ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje uklјučuju farmaceutski prihvatlјiv nosač i jedno ili više od sledećeg: (a) rekombinantnu nukleinsku kiselinu kao što je ovde opisano; i (b) rekombinantnu ćeliju kako je ovde opisano. U nekim realizacijama, opisana farmaceutska kompozicija uklјučuje rekombinantnu nukleinsku kiselinu kako je ovde opisano i farmaceutski prihvatlјiv nosač. U nekim realizacijama, rekombinantna nukleinska kiselina je inkapsulirana u virusni kapsid ili lipidne nanočestice.
[0013] U drugom aspektu, ovde su obezbeđeni postupci za modulaciju aktivnosti ćelije, uklјučujući: (a) obezbeđivanje rekombinantne ćelije prema pronalasku, i (b) njeno dovođenje u kontakt sa odabranim ligandom, pri čemu vezivanje odabranog liganda za ekstracelularni domen za vezivanje liganda himernog polipeptida indukuje isecanje proteolitičkog mesta isecanja indukovanog ligandom i oslobađanje transkripcionog regulatora, pri čemu oslobođeni transkripcioni regulator modulira aktivnost rekombinantne ćelije. Drugi aspekt se odnosi na postupke za modulaciju aktivnosti cilјne ćelije kod pojedinca, uklјučujući davanje efektivnog broja rekombinantnih ćelija pronalaska pojedincu, pri čemu rekombinantne ćelije inhibiraju aktivnost cilјne ćelije kod pojedinca.
[0014] Drugi aspekt se odnosi na postupke za lečenje zdravstvenog stanja (npr., bolesti) kod pojedinca, uklјučujući davanje efektivnog broja rekombinantnih ćelija pronalaska pojedincu, pri čemu rekombinantne ćelije leče zdravstveno stanje pojedinca.
[0015] U drugom aspektu, neke realizacije otkrića se odnose na sisteme za modulaciju aktivnosti ćelije, inhibiranje cilјne ćelije kancera ili lečenje zdravstvenog stanja (npr. bolesti) kod pojedinca kome je to potrebno, pri čemu sistem uklјučuje jedan ili više himernih polipeptida prema pronalasku; polinukleotid pronalaska; rekombinantnu ćeliju pronalaska; ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska.
[0016] Drugi aspekt otkrića se odnosi na postupke za dobijanje rekombinantne ćelije pronalaska, uklјučujući (a) obezbeđivanje ćelije sposobne za ekspresiju proteina i (b) dovođenje u kontakt obezbeđene ćelije sa rekombinantnom nukleinskom kiselinom pronalaska. U nekim realizacijama, ćelija se dobija leukaferezom izvedenom na uzorku dobijenom od subjekta, a ćelija se dovodi u kontakt ex vivo. U nekim realizacijama, rekombinantna nukleinska kiselina je inkapsulirana u virusni kapsid ili lipidne nanočestice.
[0017] Još jedan aspekt pronalaska je upotreba jednog ili više od: himernog polipeptida pronalaska; polinukleotida pronalaska; rekombinantne ćelije pronalaska; ili farmaceutske kompozicije pronalaska; za lečenje zdravstvenog stanja. U nekim realizacijama, zdravstveno stanje je bolest, kao što je kancer. U nekim realizacijama, kancer je solidni tumor, tumor mekog tkiva ili metastatska lezija.
[0018] Drugi aspekt pronalaska je upotreba jednog ili više od: himernog polipeptida pronalaska; polinukleotida pronalaska; rekombinantne ćelije pronalaska; ili farmaceutske kompozicije pronalaska; za proizvodnju leka za lečenje zdravstvenog stanja, npr. bolesti.
[0019] Prethodni rezime je samo ilustrativan i nema nameru da ga na bilo koji način ograničava. Pored ilustrativnih izvođenja i karakteristika koje su ovde opisane, dalјi aspekti, realizacije, objekti i karakteristike pronalaska će postati potpuno očigledni iz nacrta i detalјnog opisa i patentnih zahteva.
KRATAK OPIS NACRTA
[0020] Slike 1A-1B šematski ilustruju razlike između SynNotch receptora i himernog polipeptida pronalaska. Slika 1A prikazuje šematsku strukturu postojećeg sintetičkog Notch receptora (SynNotch), koji sadrži domen za prepoznavanje liganda (na primer, anti-CD19 scFv), jukstamembranski domen (JMD) koji uklјučuje Notch negativni regulatorni region (NRR), transmembranski domen sa jednim prolazom (TMD), sekvencu za zaustavljanje transfera (STS) i regulator transkripcije (na primer, Gal4VP64). Slika 1B prikazuje šematsku strukturu primernog sintetičkog Notch receptora druge generacije kako je ovde opisano (Hinge-Notch receptor), u kome je izbrisan ceo NEC „wild-type“ Notch polipeptid, uklјučujući NRR. Sekvenca polipeptida zgloba izvedena iz CD8 zglobnog domena je umetnuta na N-kraju u odnosu na TMD. Zglobna sekvenca CD8 sadrži polipeptidne motive koji promovišu formiranje dimera himernog polipeptida preko intermolekularnog disulfidnog povezivanja.
[0021] Slike 2A-2C šematski sumiraju dizajn Hinge-Notch receptora, njihovu ekspresiju i aktivaciju u primarnim T CD4+ T ćelijama. Slika 2A šematski prikazuje primerni SynNotch1 receptor (levi panel) koji je dizajniran na osnovu humanih Notch1 proteina. Srednji panel šematski prikazuje primerni CD8 Hinge-Notch1 receptor. U poređenju sa SynNotch1 receptorom na levom panelu, CD8 Hinge-Notch1 receptor ima zamenjen ceo JMD sa zglobnim domenom CD8A, koji sadrži ostatke cisteina za koje se zna da formiraju disulfidne veze. Desni panel šematski prikazuje primer skraćenog CD8 Hinge-Notch1 receptora (truncCD8 Hinge-Notch1). U poređenju sa CD8 Hinge-Notch1 receptorima, truncCD8 Hinge-Notch1 receptori sadrže deletiran CD8A zgloba na C-kraju, ostavlјajući jedan cisteinski ostatak i kraći ekstracelularni region. Slika 2B prikazuje rezime podataka dobijenih protočnom citometrijom ekspresije receptora. U ovim eksperimentima, primarne humane T-ćelije su transdukovane pomoću dva lentivirusna konstrukta koji eksprimiraju ili receptor ili plazmid sa transkripcionim reporterom, a aktivirane su sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads-om (Gibco). Signalizacija receptora je merena upotrebom anti-myc antitela obeleženog AlexaFluor647 (Cell Signaling). Ekspresija reportera je merena preko konstitutivno eksprimiranog gena za mCitrine koji se nalazi na reporterskom plazmidu. Ćelije koje su bile dvostruko pozitivne su sortirane petog dana nakon početne stimulacije T-ćelija i dalјe su proširene radi testiranja aktivacije. Slika 2C sumira rezultate testiranja aktivacije receptora, pri čemu je transkripciona aktivacija gena za inducibili BFP reporterski gen merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences).
[0022] Slika 3 šematski sumira rezultate eksperimenata izvedenih radi demonstriracije aktivacije receptora istovremeno sa aktivacijom T-ćelija. U ovim eksperimentima, da bi se simulisala aktivacija T-ćelija, korišćeni su anti-MCAM, anti-CD3 Bi-specifični T-ćelijski aktivatori (MCAM BiTE<®>s), koji aktiviraju T-ćelijski receptor u prisustvu K562 ćelija. Ukupno 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelije koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi ćelija zajedno sa: MCAM BiTE<®>s (gornji trag), 1 × 10<5>K562 ćelija MCAM BiTE<®>s (srednji trag) ili 1 × 10<5>CD19+ K562 ćelija MCAM BiTE<®>s (donji trag) tokom 24 sata. Transkripciona aktivacija gena za inducibilni BFP reporter je naknadno izmerena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences), i pokazao se povećani signal reportera u poređenju sa signalom dobijenim od neaktiviranih T-ćelija prikazanih na Slici 2.
[0023] Slike 4A-4D sumiraju rezultate eksperimenata sprovedenih radi optimizacije domena zgloba u kontekstu himernih Notch receptora. Slika 4A šematski prikazuje različite varijante skraćenja CD8 zgloba Notch uklјučujući jednu ili više komponenti zgloba označenih kao „a“, „b“, „c“ i „d“. Komponenta „a“ predstavlјa region N-kraja prvog cisteinskog ostatka. Komponenta „b“ predstavlјa prvi cisteinski ostatak. Komponenta „c“ predstavlјa region između prvog i drugog cisteinskog ostatka. Komponenta „d“ predstavlјa drugi cisteinski ostatak i region od drugog cisteinskog ostatka do transmembranskog domena receptora. Prikazane su komponente zgloba četiri testirane varijante.
Slika 4B sumira rezultate testiranja aktivacije receptora u Jurkat T-ćelijama. Transkripciona aktivacija gena za inducibili BFP reporter je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Slika 4C prikazuje kvantifikaciju %BFP pozitivnih ćelija na osnovu podataka sa Slike 4B. Slika 4D je dijagram odnosa signal:šum na osnovu podataka sa Slike 4B.
[0024] Slika 5 šematski sumira rezultate eksperimenata koji su izvedeni radi testiranja aktivacija truncCD8Hinge2 receptora uz istovremenu signalizaciju preko PKC (protein kinaza C). U ovim eksperimentima, za simulaciju signalnog puta preko PKC, dodat je forbol 12-miristat 13-acetat (PMA). Ukupno 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelije koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi zajedno sa: bez dodatnih ćelija (gornji trag), sa 1 × 10<5>K562 ćelija (srednji trag), ili sa 1 × 10<5>CD19 K562 ćelija (donji trag) tokom 24 sata, sa i bez PMA. Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences).
[0025] Slike 6A-6B šematski sumiraju rezultate sa Hinge-Notch receptorima koji sadrže alternativne domene zgloba izvedene iz drugih izvora. Kao što je pokazano na Slici 6A, pored CD8A, utvrđeno je da CD28, OX40 i IgG4 poseduju funkcionalne domene zgloba. U ovim eksperimentima testirana su četiri primerana Hinge-Notch receptora: pIZ343 (skraćeni CD8Hinge-Notch), pIZ358 (CD28Hinge-Notch), pIZ360 (OX40Hinge-Notch), pIZ359 (IgG4Hinge-Notch). Kratak opis za svaki od Hinge-Notch receptora je dat u Tabeli 2. Slika 6B prikazuje kvantifikaciju %BFP pozitivnih ćelija iz testiranja prikazanih na Slici 6A.
[0026] Slike 7A-7B šematski sumiraju rezultate eksperimenata izvedenih radi testiranja Hinge-Notch receptora koji sadrže druge domene za prepoznavanje liganda. Kao što je pokazano na Slici 7A, pored anti-CD19 scFv, mogu se koristiti anti-ALPPL2 scFv i eGFP kao domeni za prepoznavanje liganda. Kao što je prikazano na Slici 7B, prethodno generisana reporter pozitivna Jurkat T-ćelijska linija je transdukovana konstruktom receptora. Ekspresija receptora je merena upotrebom anti-myc antitela obeleženog sa AlexaFluor647 (Cell Signaling). Za testiranje aktivacije receptora, 1 × 10<5>Jurkat T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi zajedno sa: bez dodataka (gornji trag), 1 × 10<5>K562 ćelija (srednji trag), ili 1 × 10<5>ALPPL2+ K562 ćelija/1 × 10<5>K562 ćelija koje eksprimiraju anti-GFP nanotelo na površini ćelije (donji trag) tokom 24 sata. Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences).
[0027] Slike 8A-8B šematski sumiraju rezultate eksperimenata izvedenih za potrebe testiranja Hinge-Notch receptora sa drugom sekvencom za zaustavljanja transfera (STS). Kao što je prikazano na Slici 8A, pored Notch1 STS, još jedan STS (npr., Notch2 STS, Notch4 STS, DAG1 STS, PTPRF STS i KL STS) se može koristiti za modifikovanje ponašanja receptora. U ovim eksperimentima, primarne humane T-ćelije su aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta koji eksprimiraju ili receptor ili transkripcioni konstrukt reportera. Receptor/reporter pozitivne ćelije su sortirane 5. dana nakon početne stimulacije T-ćelija i dalјe korišćene radi testiranja aktivacije. Za potrebe testiranje, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore ćelije je gajeno u kulturi zajedno sa: bez dodataka (gornji trag), sa 1 × 10<5>K562 ćelija (srednji trag), ili sa 1 × 10<5>CD19+ K562 ćelija (donji trag) tokom 24 sata. Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Slika 8B prikazuje kvantifikaciju podataka o aktivaciji prikazanih na Slici 8A.
[0028] Slike 9A-9C šematski sumiraju rezultate eksperimenata koji su izvedeni da bi se procenila funkcionalnost različitih varijanti Hinge-Notch skraćivanja, kao što su primeri Hinge-Notch1 konstrukta, u cilјu optimizacije Hinge-Notch receptora. Slika 9A prikazuje dizajn konstrukta za varijante koje uključuju ili punu dužinu ili skraćeni oblik N-JMD domena konstrukta pIZ341. Crne trake označavaju aminokiseline koje čine svaku varijantu. „Pun“ se odnosi na varijantu pune dužine, koja uključuje SEQ ID NO: 12. „Trunc 1“ se odnosi na varijantu skraćenja br.1, koja uključuje SEQ ID NO: 39. „trunc 2“ se odnosi na varijantu skraćenja br.2, koja uključuje SEQ ID NO: 13. „Trunc 3“ se odnosi na skraćenu varijantu br.3, koja uključuje SEQ ID NO: 40. „Trunc“ 4 se odnosi na varijantu skraćenja br. 4, koja uključuje SEQ ID NO: NO: 41. Poređenje ekspresije ovih CD8 zglobnih varijanti je prikazano na Slika 9B. Konkretno, primarne humane CD4+ T-ćelije su aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih je jedan eksprimirao receptor varijante sa skraćenim zglobom, a drugi BFP transkripcioni reporter plus anti-alkalnu fosfatazu, placentalu-sličan 2 (ALPPL2) CAR. Ćelije koje sadrže oba konstrukta sortirane su 5. dana nakon početne stimulacije T-ćelija i dalјe podeljene za testiranje aktivacije. Pet panela sa leve strane Slike 9B prikazuje relativne nivoe ekspresije svakog receptora, koje su merene anti-myc-obeleženim bojenjem (y-osa), u odnosu na nivoe ekspresije konstrukata reportera, koje su merene sa GFP (x-osa). Krajnji desni panel Slike 9B prikazuje MFI kvantifikaciju ekspresije receptora za CD8 zglobne varijante u dvostruko pozitivnim ćelijama. Slika 9C prikazuje 5 panela, koji predstavljaju varijantu pune dužine i varijante skraćene dužine od 1 do 4, s leva na desno. Za svaku varijantu, T-ćelije koje eksprimiraju anti-CD19 receptore su gajene u kulturi sa, od vrha do dna, bez dodataka (gornji trag), sa ALPPL2+ K562 ćelija (drugi trag odozgo), sa CD19+ K562 ćelija (treći trag odozgo), ili sa ALPPL2+ CD19+ (donji trag). Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences).
[0029] Slika 10 šematski sumira rezultate eksperimenata sprovedenih radi testiranja Hinge-Notch varijanti sa različitim domenima vezivanja i njihove zavisnosti od proteolitičke aktivnosti. Primarne humane CD4+ T-ćelije su aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads-a i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih jedan eksprimira zglob (eng., hinge) receptor sa istaknutom varijantom sa skraćenom glavom vezivanja, a drugi transkripcioni reporter. Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane 5. dana nakon inicijalne stimulacije T-ćelija i dalјe korišćene za testiranje aktivacije. Za potrebe testiranja, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelije koje eksprimiraju receptore je gajeno u kulturi zajedno sa: 1 × 10<5>K562 ćelija (gornji trag), 1 × 10<5>Liganda ćelije K562 (drugi trag odozgo), 1 × 10<5>Liganda K562 ćelije sa inhibitorom ADAM10 (treći trag odozgo) ili 1 × 10<5>Liganda K562 ćelija sa inhibitorom gama-sekretaze, DAPT (donji trag). Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences).
[0030] Slike 11A-11C šematski sumiraju rezultate eksperimenata sprovedenih radi testiranje Hinge-Notch varijanti sa različitim domenima vezivanja i Notch2 STS domenom. Primarne humane CD4+ T-ćelije su aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih jedan eksprimira zglob receptora sa istaknutom glavom vezivanja zgloba Notch receptora, a drugi transkripcioni reporter. Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane 5. dana nakon inicijalne stimulacije T-ćelija i dalјe korišćene za testiranje aktivacije. Za potrebe testiranja, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju receptore je kokultivisano bez dodataka (gornji trag), sa 1 × 10<5>K562 ćelija (srednji trag), ili sa 1 × 10<5>BCMA+ K562 ćelija (donji trag) tokom dva dana (Slika 11A). Na Slici 11A. levi panel se odnosi na konstrukt sa anti-BCMA scFv glavom za vezivanje, srednji panel se odnosi na konstrukt sa anti-BCMA potpuno humanizovanom VH glavom za vezivanje, a desni panel se odnosi na konstrukt sa anti-BCMA potpuno humanizovanom VH glavom za vezivanje sa domenom zgloba optimizovanim za domen vezivanja (Hinge5). Slično je testirana SIRPα glava za vezivanje. 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelije koje eksprimiraju receptore je gajeno u kulturi zajedno sa bez dodataka (gornji trag), ili sa 1 × 10<5>K562 ćelija (donji trag) tokom dva dana (Slika 11B). Na Slici 11C, različiti scFv na HER2 antigen su testirani i upoređeni upotrebom sličnih postupaka. Za potrebe testiranja 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju receptore je gajeno u kulturi ćelija zajedno sa: bez dodataka (gornji trag), sa adherentnim HEK 293T ćelijama (drugi trag odozgo), sa adherentnim MBMDA-468 ćelijama (treći trag odozgo), sa adherentnim MCF7 ćelijama (četvrti trag odozgo), ili sa adherentnim SKBR3 ćelije (donji trag) tokom dva dana (Slika 11C). Levi panel predstavlja glavu vezivanje anti-HER24D5-7 scFv, dok desni panel predstavlja glavu vezivanje anti-HER24D5-8 scFv. Za eksperimente na Slikama 11A-11C, transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences).
[0031] Slika 12 šematski sumira rezultate eksperimenata koji su sprovedeni radi poređenja aktivacije Hinge-Notch varijanti sa različitim promotorima i STS domenima. Za potrebe testiranja, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi bez dodataka (gornji trag), sa 1 × 10<5>ALPPL2+ K562 ćelija (drugi trag odozgo), sa 1 × 10<5>CD19+ K562 ćelija (treći trag odozgo) ili sa 1 × 10<5>ALPPL2+ CD19+ K562 ćelija (donji trag). Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Aktivacija mišjih i humanih originalnih SynNotch konstrukata je uključena radi poređenja.
[0032] Slike 13A-13B šematski sumiraju rezultate eksperimenata mutacione analize Notch1 transmembranskog domena (TMD) u Hinge-Notch konstruktima. Pripremljene su varijante sa različitim mutacijama alanina u TMD domenu Hinge-Notch konstrukta. Svaki aminokiselinski ostatak od položaja 301 (F) do položaja 322 (S) u TMD Hinge-Notch je pojedinačno mutiran u alanin. Primarne humane CD4+ T-ćelije su aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih jedan eksprimira mutiranu varijantu TMD, a drugi sadrži BFP transkripcioni reporter. Ćelije koje su sadržale oba konstrukta su sortirane 5. dana nakon inicijalne stimulacije T-ćelija i dalјe korišćene za testiranje aktivacije. Na Slici 13A, levi panel prikazuje relativnu ekspresiju različitih receptora, merenu intenzitetom bojenja anti-myc-obeleženog antitela (y-osa), u odnosu na ekspresiju markera reporterskog konstrukta (x-osa), dok desni panel prikazuje MFI kvantifikaciju ekspresije mutiranih varijanti TMD receptora u dvostruko pozitivnim ćelijama. Na Slici 13B, T-ćelije koje eksprimiraju anti-CD19 receptore su gajene u kulturi u odnosu 1:1 sa kontrolnim CD19(-) ili CD19(+) K562 ćelijama. Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Levi panel prikazuje panele toka profila aktivacije. Desni panel predstavlјa BFP% prikazan kao linijski grafikon.
[0033] Slika 14 šematski sumira rezultate eksperimenata sprovedenih radi mutacione analize za transmembranski domen (TMD) i STS domen u Hinge-Notch konstruktima. U ovom primeru su korišćena četiri tipa primernih Hinge Notch receptora, od kojih svi uklјučuju anti-CD19 scFv domen, skraćeni CD8 Hinge domen i Gal4VP64 domen, plus različite TMD domene (CLSTN1 TMD ili CLSTN2 TMD) i različite STS domene (CLSTN1 STS, CLSTN2 STS ili Notch1 STS). Primarne humane CD4+ T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih jedan eksprimira zglob receptora sa kombinacijom TMD/STS kao što je naznačeno, a drugi transkripcioni reporter sa konstitutivno eksprimiranim anti -ALPPL2 CAR. Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane 5. dana nakon inicijalne stimulacije T-ćelija i dalјe korišćene za testiranje aktivacije. Za potrebe testiranje, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju receptore je gajeno u kulturi zajedno sa: 1 × 10<5>K562 ćelija („-CAR“ paneli, plavo) ili 1 × 10<5>CD19+ K562 ćelija („-CAR“ paneli, crveno). Slično tome, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju receptore su testirani u prisustvu CAR aktivnosti kulturom zajedno sa 1 × 10<5>ALPPL2+ K562 ćelija („+CAR“ paneli, plavo) ili 1 × 10<5>ALPPL2+ CD19+ K562 ćelija paneli, crveno). Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences).
[0034] Slike 15A-15B šematski sumiraju rezultate eksperimenata podesive, ligand-zavisne ekspanzije T ćelija upotrebom Hinge-Notch-kontrolisane ekspresije konstruisanog citokina. Slika 15A prikazuje dijagram T ćelija konstruisanih sa Hinge-Notch STS varijantama koje omogućavaju lučenje projektovanog citokina koje je pokrenuto ligandom, čime se postiže autokrino i parakrino širenje T ćelija. Profil ekspresije anti-CD19 Hinge-Notch receptora sa naznačenim STS modifikacijama prikazan je na Slici 15B. Primarne humane T-ćelije su aktivirane anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih jedan eksprimira CAR protiv MCAM antigena, a drugi eksprimira Hinge-Notch receptor sa inducibilnim super-IL2 pod Gal4-UAS kontrolom. Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane 5. dana nakon inicijalne stimulacije T-ćelija i korišćene za testiranje aktivacije. Ekspresija receptora je određena anti-myc-obeleženim bojenjem (y-osa).
[0035] Slika 16 šematski sumira rezultate eksperimenata izvedenih kako bi se pokazalo da ekspresija super-IL2 izazvana ligandom pobolјšava viabilnost CAR-T ćelija. 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 HingeNotch Notch1 STS receptore je gajeno u kulturi u medijumu bez IL-2, bez K562 ćelija (gore levo), sa CD19+ K562 ćelijama kako bi se pokrenuo Hinge-Notch (gore desno), sa MCAM+ K562 ćelijama kako bi se pokrenula CAR aktivacija (dole levo) ili sa MCAM+ i CD19+ K562 ćelijama kako bi se pokrenula aktivacija oba receptora (dole desno). Posle 9 dana procenjen je udeo živih T ćelija merenjem prednjeg i bočnog rasipanja pomoću Fortessa X-50.
[0036] Slika 17 šematski sumira rezultate eksperimenata izvedenih kako bi se pokazala podesivost proliferacije T ćelija sa STS-varijantama Hinge-Notch. Primarne humane T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih je jedan eksprimirao CAR protiv MCAM antigena, a drugi je eksprimirao Hinge-Notch receptor sa inducibilnim super-IL2 pod Gal4-UAS kontrolom (desna četiri panela). Hinge-Notch receptori koji sadrže 3 različite STS varijante (NRG1, Notch1, Notch2) su testirani u odnosu na kontrolu bez Hinge-Notch. Slično, primarne humane T-ćelije su generisane bez CAR ekspresije (levi paneli). T ćelije su obojene sa CellTrace Violet u skladu sa protokolima proizvođača, koinkubirane sa CD19+ K562 ciljnim ćelijama u medijumu bez IL-2 i merene upotrebom Fortessa X-50 u naznačenim vremenskim tačkama kako bi se procenila proliferacija opadanjem CTV signala.
[0037] Slike 18A-18B šematski sumiraju rezultate eksperimenata izvedenih kako bi se pokazala podesivost sekrecije super-IL2 sa STS-varijantama Hinge-Notch. Primarne humane T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads i transdukovane lentivirusnim konstruktom Hinge-Notch receptora sa inducibilnim super-IL2 pod Gal4-UAS kontrolom (Slika 18A). Hinge-Notch receptori koji sadrže 3 različite STS varijante (NRG1, Notch1, Notch2) su testirani u odnosu na kontrolu bez HingeNotch. T ćelije su koinkubirane sa MCAM+ CD19+ K562 ćelijama u medijumu bez IL-2, i u naznačenim vremenskim tačkama, supernatant IL-2 je meren upotrebom Instant ELISA kompleta prema protokolima proizvođača uz očitavanje na čitaču mikroploča. Crvena tačkasta linija označava standardnu koncentraciju IL-2 koja se koristi za kultivisanje T ćelija. Postepeno lučenje super-IL2 je postignuto aktivacijom STS-podešenih Hinge-Notch receptora. Na Slici 18B, primarne humane T-ćelije su generisane sa dodatnim lentivirusnim vektorom koji eksprimira CAR na MCAM.
[0038] Slika 19 šematski sumira rezultate eksperimenata koji su izvedeni kako bi se pokazala podesivost sekrecije super-IL2 sa STS-varijantama Hinge-Notch koji poboljšavaju proliferaciju „bystander“ T ćelija. Primarne humane T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads i transdukovane lentivirusnim konstruktom koji uključuje Hinge-Notch receptor sa inducibilnim super-IL2 pod kontrolom Gal4-UAS (desni paneli). Testirani su HingeNotch receptori koji sadrže 3 različite STS varijante (NRG1, Notch1, Notch2) u odnosu na kontrolu bez HingeNotch. HingeNotch T ćelije su koinkubirane sa „bystander“ T ćelijama koje su obeležene sa CellTrace Far Red bojom, i koje su eksprimirale CAR na MCAM (levi panel) ili bez CAR (desni panel). T ćelije su koinkubirane sa MCAM+ CD19+ K562 ćelijama u medijumu bez IL-2, a proliferacija „bystander“ T ćelija je procenjena merenjem opadanja signala na Fortessa X-50.
[0039] Slika 20 šematski sumira rezultate eksperimenata izvedenih radi testiranja pojedinačnih lentivirusnih vektorskih konstrukata koji sadrže Hinge-Notch receptore u CAR modulima. Primarne humane T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads i transdukovane sa jednim lentivirusnim konstruktom koji sadrži konstitutivno eksprimirane Hinge-Notch receptore sa inducibilnom anti-MCAM CAR kasetom pod kontrolom Gal4-UAS.5. dana nakon inicijalne stimulacije T-ćelija, ćelije su sortirane za ekspresiju Hinge-Notch receptora upotrebom myc-obeleženog bojenja (myc-tag), i dalјe korišćene za testiranje aktivacije. Tri STS-varijante su testirane kako je naznačeno, sa konstitutivno eksprimiranim CAR koji je korišćen kao kontrola. Za testiranje, 1 × 10<5>T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi zajedno sa: bez dodataka (gornji trag), sa 5 × 10<5>
1
K562 ćelija (srednji trag), ili sa 5 × 10<4>CD19+ K562 ćelija (donji trag). Transkripciona aktivacija inducibilnog CAR je naknadno izmerena pomoću GFP oznake upotrebom Fortessa X-50.
[0040] Slika 21 šematski sumira rezultate eksperimenata koji su izvedeni radi demonstriracije specifičnog ubijanja cilјnih ćelija sa dva antigena od strane T ćelija konstruisanih sa jednim lentivektorom koji sadrži HingeNotch CAR modul. Primarne humane T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads i transdukovane sa jednim lentivirusnim konstruktom koji sadrži konstitutivno eksprimirane HingeNotch receptore sa inducibilnom anti-MCAM CAR kasetom pod kontrolom Gal4-UAS. Ćelije su selektovane za ekspresiju Hinge-Notch receptora preko myc-tag 5. dana nakon inicijalne stimulacije T-ćelija i potom dalјe korišćene za testiranje aktivacije. Testirane su tri STS-varijante kao što je naznačeno, dok je konstitutivno eksprimiran CAR korišćen kao kontrola. Za testiranje, 1 × 10<5>T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi ćelija zajedno sa sa 5 × 10<5>MCAM+ K562 ćelija ili 5 × 10<4>MCAM+ CD19+ K562 ćelija. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjeno analizom prednjeg i bočnog rasipanja populacije K562 upotrebom Fortessa X-50.
[0041] Slika 22 šematski sumira rezultate eksperimenata koji su izvedeni radi testiranja pojedinačnih lentivirusnih vektorskih konstrukata koji sadrže Hinge-Notch receptore za kontrolu aktivacije i iscrplјenosti T ćelija. Primarne humane T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads i transdukovane sa jednim lentivirusnim konstruktom koji sadrži konstitutivno eksprimirane Hinge-Notch receptore sa inducibilnom anti-MCAM CAR kasetom pod kontrolom Gal4-UAS. Ćelije su selektovane za ekspresiju Hinge-Notch receptora preko myc-tag 5. dana nakon inicijalne stimulacije T-ćelija i dalјe korišćene za testiranje aktivacije. Testirane su tri STS-varijante kao što je naznačeno, dok je konstitutivno eksprimiran CAR korišćen kao kontrola. Za testiranje, 1 × 10<5>T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi zajedno sa 5 × 10<4>CD19+ K562 ćelija. Transkripciona aktivacija inducibilnog CAR je naknadno izmerena pomoću GFP markera upotrebom Fortessa X-50 (krajnji levi panel). Aktivacija T ćelija, kao i njihova iscrpljenost su merene osnovu ekspresije CD25 (drugi panel sa leve strane) i CD39 (treći i četvrti panel sa leve strane), tim redom.
[0042] Slika 23 šematski sumira rezultate eksperimenata koji su izvedeni radi in vivo testiranja Hinge-Notch-to-CAR modula. Za unilateralne tumore, NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ (NSG) miševima je subkutano na levom boku tela implantirano 1 × 10<6>K562-BCMA/CD19 tumorskih ćelija. Za kontralateralne tumore, NSG miševima je implantirano 1 × 10<6>K562-BCMA/CD19 tumorskih ćelija na levom boku, kao i 1 × 10<6>K562-CD19 tumorskih ćelija na desnom boku tela. Četiri dana nakon implantacije tumora, 2,5 × 10<6>projektovanih primarnih humanih CD4+ i CD8+ T ćelija (ukupno 5 × 10<6>T ćelije) je ubrizgano i.v. u repnu venu. Veličina tumora je praćena pomoću kalipera 2-3 puta nedelјno, a utvrđeno je da su miševi dostigli krajnju tačku kada su tumori izmereni ≥20 mm. Za imunofenotipsku analizu, tumori i slezine su prikupljeni 10 dana nakon implantacije T ćelija. Tumori su ručno samleveni i digestirani u RPMI-1640 medijumu sa 4 mg/ml kolagenaze IV i 0,1 mg/ml DNaze I na 37°C tokom 30 minuta, a slezine su ručno disocirane i podvrgnute lizi crvenih krvnih zrnaca. Korišćena su sledeća antitela: anti-CD45, anti-CD3, anti-CD4 i anti-CD8. Mrtve ćelije su isklјučene pomoću Draq7. Uzorci su analizirani upotrebom FACSymphony X50 SORP, a podaci su analizirani upotrebom softvera FlowJo.
DETALjAN OPIS PRONALASKA
[0043] Predmetni pronalazak se , između ostalog, generalno odnosi na novu klasu himernih polipeptidnih receptora koji mogu oligomerizovati, a koji su konstruisani da modulišu regulaciju transkripcije na način zavisan od liganda. Konkretno, novi receptori (nazvani „Hinge-Notch“), iako su izvedeni iz Notch-a, ne zahtevaju Notch NEC subjedinicu, posebno NRR za koji se ranije smatralo da je od suštinskog značaja za funkcionisanje receptora. Ova nova klasa receptora je sintetička i rekombinantna i ne pojavlјuje se u prirodi. Kao što je opisano u nastavku, himerni polipeptidi koji su ovde opisani mogu biti sintetički polipeptidi, ili mogu biti konstruisani, dizajnirani ili modifikovani tako da obezbede želјena i/ili pobolјšana svojstva, npr., modulaciju transkripcije. Pokazano je da novi Hinge-Notch receptori koji su ovde opisani nisu samo funkcionalni, već pokazuju pojačanu biološku aktivnost što je iznenađujuće i u potpunosti odstupa od prethodnih saznanja u ovoj oblasti. Pored toga, novi himerni receptori koji su ovde opisani uklјučuju ekstracelularni domen oligomerizacije koji stimulišu formiranje oligomernih oblika, npr. dimerni ili trimerni oblik himernih receptora. Veruje se da ovakav dizajn olakšava oligomerizaciju/klasterizaciju ekstracelularnih domena (ECD) i pritom spaja intracelularne domene (ICD) kako bi se aktivirala ćelijska signalizacija, npr. signalizacija T-ćelija. U nekim realizacijama, ovde opisani receptori vezuju ciljni ligand na površini ćelije, koji pokreće proteolitičko isecanje himernog receptora i oslobađanje regulatora transkripcije koji dalje modulira uobičajeni transkripcioni program u ćeliji. Otkriće takođe takođe obezbeđuje kompozicije i postupke korisne za proizvodnju ovih receptora, nukleinskih kiselina koje ih kodiraju, ćelije domaćina genetski modifikovane sa ovim nukleinskim kiselinama, kao i postupke za modulaciju aktivnosti ćelije i/ili za lečenje različitih zdravstvenih stanja, kao što su bolesti (npr. rak).
[0044] U sledećem detalјnom opisu, upućuje se na priložene nacrte, koji čine deo ovog dokumenta. Na nacrtima slični simboli uglavnom označavaju slične komponente, osim ako kontekst ne nalaže drugačije.
DEFINICIJE
[0045] Oblici jednine (eng., "a", "an", and "the") uklјučuju i referiraju na množinu osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Na primer, izraz „ćelija“ uklјučuje jednu ili više ćelija, obuhvatajući njihove mešavine. „A i/ili B“ se ovde koristi tako da obuhvati sve sledeće alternative: „A“, „B“, „A ili B“, i „A i B“.
[0046] Termini „primena“ i „davanje“, kako se ovde koriste, odnose se na isporuku kompozicije ili formulacije kako je ovde opisano putem različitih načina davanja uključujući, ali ne ograničavajući se na, intravenski, intraarterijski, intrakranijalni, intramuskularni, intraperitonealni, subkutani, intramuskularni ili njihove kombinacije davanja. Termin uključuje, ali nije ograničen na, administraciju od strane medicinskog stručnjaka i samostalnu administraciju.
[0047] „Kancer“ se odnosi na prisustvo ćelija koje poseduju karakteristike tipične za kancerogene ćelije, kao što su nekontrolisana proliferacija, besmrtnost, metastatski potencijal, brz rast i stopa proliferacije, kao i određene karakteristične morfološke osobine. Neki tipovi kancerogenih ćelija mogu se grupisati u masu, poput tumora, ali neke kancerogene ćelije mogu postojati samostalno unutar subjekta. Tumor može biti čvrst tumor, tumor mekog tkiva ili metastatska lezija. Kako se ovde koristi, termin „kancer“ takođe obuhvata druge tipove kancera koji nisu tumori. Primeri koji nisu ograničavajući uklјučuju kancere krvi ili hematološke malignitete, kao što su leukemija, limfom i mijelom. Kanceri mogu uklјučivati premaligne, kao i maligne kancere.
[0048] Izrazi „ćelija domaćin“ i „rekombinantna ćelija“ se ovde koriste naizmenično. Podrazumeva se da se takvi termini, kao i „ćelija“, „ćelijska kultura“, „ćelijska linija“, odnose ne samo na određenu ćeliju ili ćelijsku liniju, već i na potomke ili potencijalno potomstvo takve ćelije ili ćelijske linije , bez obzira na broj prenosa ili pasažiranja u kulturi. Treba napomenuti da nisu svi potomci potpuno identični roditeljskoj ćeliji. To je zbog toga što se u narednim generacijama mogu pojaviti određene modifikacije bilo usled mutacija (npr., namernih ili nenamernih mutacije) ili zbog uticaja okoline (npr., metilacija ili druge epigenetske modifikacije), tako da potomstvo možda nije, u stvari, identično roditeljskoj ćeliji, ali je i dalјe obuhvaćeno opsegom termina koji se ovde koristi, sve dok potomstvo zadržava istu funkcionalnost kao i originalna ćelija ili ćelijska linija.
[0049] Izraz „operativno povezan“, kako se ovde koristi, označava fizičku ili funkcionalnu povezanost između dva ili više elemenata, npr., polipeptidnih sekvenci ili polinukleotidnih sekvenci, što im omogućava da funkcionišu na predviđen način.
[0050] Izraz „procenat identičnosti“, kako se ovde koristi u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili proteina, odnosi se na dve ili više sekvenci ili subsekvenci koje su identične ili imaju određeni procenat nukleotida ili aminokiselina koje su identične (npr., približno 60% identičnosti sekvence, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 %, ili veća identičnost u okviru specifičnog regionu, kada se uporede i poravnaju za maksimalnu podudarnost unutar okvira poređenje ili odabranog regiona) mereno korišćenjem BLAST ili BLAST 2.0 algoritama za poređenje sekvenci sa podrazumevanim parametrima opisanim u nastavku, ili sa ručnim poravnanjem i vizuelnom inspekcijom. Pogledajte npr., veb stranicu NCBI na ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Takve sekvence se onda nazivaju „suštinski identične“. Ova definicija se takođe odnosi na, ili se može primeniti na, komplement sekvence. Ova definicija takođe uključuje sekvence koje imaju delecije i/ili adicije, kao i one koje imaju supstitucije. Identičnost sekvence se može izračunati u okviru regiona koji ima najmanje približno oko 20 aminokiselina ili nukleotida u dužini, ili u okviru regiona koji je dužine 10-100 aminokiselina ili nukleotida, ili u okviru cele dužine date sekvence. Identičnost sekvence može se izračunati upotrebom objavljenih tehnika i široko dostupnih kompjuterskih programa, kao što su GCS programski paket (Devereux et al, Nucleic Acids Res.12:387, 1984), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al., J Mol Biol 215:403, 1990). Identičnost sekvence može se meriti upotrebom softvera za analizu sekvence kao što je softverski paket za analizu sekvenci (Sequence Analysis Software Package) Genetics Computer Group sa Biotehnološkog centru Univerziteta Viskonsin (1710 Universiti Avenue, Madison, Vis.53705), sa podrazumevanim parametrima tog softvera.
[0051] Kako se ovde koristi, i osim ako nije drugačije naznačeno, „terapijski efikasna količina“ agensa odnosi se na količina sredstva (agensa) dovoljnu da pruži terapeutsku korist u lečenju ili upravljanju zdravstvenim stanjem, kao što je bolest (npr., kancer), ili da odloži ili umanji jedan ili više simptoma povezanih sa bolešću. Terapijski efikasna količina jedinjenja označava količinu terapijskog agensa, samog ili u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima, koja obezbeđuje terapijsku korist u lečenju ili upravljanju bolesti. Izraz „terapijski efikasna količina“ može da obuhvati količinu koja pobolјšava ukupnu terapiju bolesti, smanjuje ili izbegava simptome ili uzroke bolesti, ili pobolјšava terapijsku efikasnost drugog terapeutskog agensa. Primer „efikasne količine“ je količina dovolјna da doprinese lečenju, prevenciji ili smanjenju jednog ili više simptoma bolesti, što se takođe može nazvati „terapijski efikasna količina“. „Smanjenje“ simptoma znači smanjenje težine ili učestalosti simptoma ili potpuno uklanjanje simptoma. Tačna količina kompozicije koja uključuje „terapijski efikasnu količinu“ zavisi od svrhe lečenja, i može je odrediti stručnjak u oblasti upotrebom poznatih tehnika (videti, npr. Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols.1-3, 2010); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (2016); Pickar, Dosage Calculations (2012); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
1
[0052] Kako se ovde koristi, „subjekat“ ili „pojedinac“ uklјučuje životinje, kao što su lјudi (npr. lјudske individue) i životinje koje nisu lјudi. U nekim primerima izvođenja, „subjekat“ ili „pojedinac“ je pacijent pod pažnjom lekara. DAxle, subjekat može biti pacijent ili pojedinac koji ima, kod koga postoji rizik da ima ili se sumnja da ima bolest od interesa (npr., kancer) i/ili jedan ili više simptoma bolesti. Subjekat takođe može biti pojedinac kod koga je dijagnostikovan rizik od stanja od interesa u trenutku postavlјanja dijagnoze ili kasnije. Izraz „nehumanoidne životinje“ uklјučuje sve kičmenjake, npr. sisare, npr. glodare, npr. miševe i one koje nisu sisari, kao što su nehumanoidni primati, npr. ovce, psi, krave, kokoške, vodozemci, gmizavci, itd.
[0053] Kada je naveden raspon vrednosti, podrazumeva se da svaka vrednost unutar opsega, do desetine jedinice donje granice, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije, između gornje i donje granice tog opsega i bilo koja druga navedena ili posredna vrednost u tom navedenom opsegu, je obuhvaćena otkrićem. Gornje i donje granice ovih manjih opsega mogu nezavisno biti uključene u manje opsege, i takođe su obuhvaćene ovim opisom, pod uslovom da nije izričito isključena neka granica u navedenom opsegu. Kada navedeni opseg uključuje jedno ili oba ograničenja, opsezi koji isključuju jedno ili oba navedena ograničenja su takođe uključeni u opis.
[0054] Svi opsezi koji su ovde opisani takođe obuhvataju bilo koje i sve moguće podopsege i njihove kombinacije podopsega. Bilo koji navedeni opseg može se prepoznati kao dovoljan ukoliko opisuje i omogućava da se isti opseg razbije na najmanje jednake polovine, trećine, četvrtine, petine, desetine, itd. Kao neograničavajući primer, svaki opseg koji se ovde razmatra može se lako razložiti na donju trećinu, srednju trećinu i gornju trećinu, i tako dalјe. Kao što će takođe razumeti stručnjak u ovoj oblasti, svi izrazi kao što su „do“, „najmanje“, „veće od“, „manje od“ i slično uključuju navedeni broj i odnose se na opsege koji se mogu naknadno razložiti na podopsege kao što je opisano gore. Konačno, kao što će razumeti stručnjak u ovoj oblasti, opseg uključuje svakog pojedinačnog člana. Tako, na primer, grupa koja ima 1-3 artikla se odnosi na grupe koje imaju 1, 2 ili 3 artikla. Slično, grupa koja ima 1-5 artikala se odnosi na grupe koje imaju 1, 2, 3, 4 ili 5 artikala, i tako dalјe.
[0055] Podrazumeva se da određene karakteristike otkrića, koje su, radi jasnoće opisane u kontekstu odvojenih primera realizacija, takođe mogu biti kombinovane u jednoj realizaciji. Suprotno tome, različite karakteristike otkrića, koje su radi sažetosti opisane u kontekstu jedne realizacije, takođe mogu biti obezbeđene odvojeno ili u bilo kojoj odgovarajućoj podkombinaciji. Sve kombinacije primera realizacija koje se odnose na otkriće su posebno obuhvaćene ovim otkrićem i ovde su opisane kao da je svaka takva kombinacija pojedinačno i eksplicitno opisana. Pored toga, sve podkombinacije različitih primera izvođenja i njihovih elemenata, takođe su posebno obuhvaćene ovim otkrićem i ovde su opisane baš kao da je svaka takva podkombinacija pojedinačno i eksplicitno ovde opisana.
NOTCH RECEPTORI
[0056] Notch receptori su transmembranski proteini koji normalno prenose signale nakon vezivanja za površinski vezane ligande koji su eksprimirani na susednim ćelijama. Signalizacija putem Notch receptora zavisi od kontakta između ćelija. Evolucionu divergenciju kičmenjaka i beskičmenjaka pratila su najmanje dva fa umnožavanja gena koji uklјučuju Notch receptore: mušice poseduju jedan Notch gen, crvi dva (GLP-1 i LIN-12), a sisari četiri (NOTCH1-4). Prenos Notch signala se oslanja na tri klјučna događaja: (i) prepoznavanje liganda, (ii) konformaciono izlaganje mesta isecanja zavisnog od liganda i (iii) sklapanje nuklearnog kompleksa za transkripcionu aktivaciju.
[0057] Kanonska signalizacija putem Notch receptora se prenosi procesom koji se naziva regulisana intramembranska proteoliza. Notch receptori se normalno održavaju u mirovanju, u proteolitički otpornoj konformaciji na površini ćelije, dok vezivanje liganda inicira proteolitičku kaskadu koja oslobađa intracelularni deo receptora (takođe poznat kao intracelularni Notch (ICN) ili Notch intracelularni domen (NICD)) iz membrana. Kritični i regulisani korak isecanja vrše ADAM metaloproteaze na mestu zvanom S2 neposredno izvan plazma membrane. Ovaj skraćeni receptor, nazvan NEXT (skraćenica za Notch extracellular truncation), ostaje vezan za membranu dok ga na mestu S3 ne iseče gama sekretaza, multiproteinski enzimski kompleks.
[0058] Nakon isecanja posredovanog gama sekretazom, ICN potom ulazi u jezgro, gde formira transkripcioni aktivacioni kompleks koji sadrži transkripcioni faktor nazvan CSL koji se vezuje za DNK (faktor vezivanja C-promotora kod sisara; takođe poznat kao RBP-J)/Suppressor of hairless kod Drosophila melanogaster ili Lag1 kod Caenorhabditis elegans), i transkripcioni koaktivator porodice Mastermind/Lag-3. Ovaj kompleks zatim dalje regrutuje dodatne koaktivatorske proteine poput p300 kako bi privukao osnovnu transkripcionu mašineriju i aktivirao ekspresiju nizvodnih cilјnih gena.
[0059] Notch receptori imaju modularnu organizaciju domena. Ekstracelularna subjedinica Notch (NEC) Notch receptora sastoji se od serije ponovljenih sekvenci sličnih N-terminalnom receptoru epidermalnog faktora rasta (EGFR) koje su odgovorne za vezivanje liganda. O-vezana glikozilacija ovih EGFR ponovaka, uklјučujući modifikaciju O-fukozom, Fringe i Rumi glikoziltransferazama, takođe moduliše aktivnost Notch receptora kao odgovor na različite podtipove liganda kod mušica i sisara.
[0060] EGFR ponovci su praćeni sa tri LIN-12/Notch repeat (LNR) modula, koji su jedinstveni za Notch receptore, i za koje se ukazuje da učestvuju u sprečavanju prerane aktivacije receptora.
Heterodimerizacioni (HD) domen Notch1 je podelјen isecanjem furinom, tako da njegov N-terminalni deo završava Notch ekstracelularnu subjedinicu (NEC), dok C-terminalni deo čini početak Notch transmembranske subjedinice (NTM). Iza ekstracelularnog HD-C regiona NEC nalazi se transmembranski segment i intracelularni region (ICN), koji uklјučuje aktivator transkripcije. Dodatne informacije u vezi sa Notch receptorima i Notch-posredovanom ćelijskom signalizacijom mogu se naći u npr. W.R. Gordon et al., Dev Cell (2015) 33:729-36 i W.R. Gordon et al., J. Cell Sci. (2008) 121:3109-19.
OTKRIVENE KOMPOZICIJE
[0061] Kao što je detalјnije opisano u nastavku ispod, ovo otkriće obezbeđuje novu klasu himernih polipeptidnih receptora koji se mogu oligomerizovati, koji su projektovani da modulišu regulaciju transkripcije na način zavisan od liganda, sa različitim prednostima u odnosu na postojeće sintetičke Notch receptore. Na primer, pošto su prirodni Notch receptori veliki, sa NEC subjedinicom koja sadrži nekoliko desetina tandemskih ponovaka sličnih EGFR, izostavlјanjem regulatornih regiona Notch-a, ili čak cele NEC subjedinice, polinukleotidi koji kodiraju receptore pronalaska mogu biti manji od prirodnih Notch receptora i postojećih polinukleotida koji kodiraju SynNotch, što omogućava upotrebu vektora sa ograničenijim kapacitetom, ili uklјučivanje dodatnih elemenata koji bi inače bili isklјučeni zbog ograničenja veličine povezanih za kapacitetom vektora.
[0062] Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da himerni polipeptidni receptori koji su ovde opisani olakšavaju pojačanu aktivaciju u određenim ćelijskim i okolinskim kontekstima. Ova vrsta povratne sprege o aktivnosti receptora je nova karakteristika koja se može iskoristiti za pobolјšanje i
1
prilagođavanje proizvodnje terapijskih molekula od strane konstruisanih ćelija. Štaviše, kao što je detalјnije opisano u nastavku, brojne varijante receptora koje su ovde otkrivene su lakše za ekspresiju od postojećih SynNotch receptora, jer se mogu transdukovati sa većom efikasnošću i eksprimirati na višim nivoima na površini primarnih humanih T ćelija.
[0063] Pored toga, kao što je detaljnije opisano u nastavku, određeni himerni polipeptidni receptori koji su ovde opisani imaju bolju aktivnost od postojećih SynNotch receptora što je utvrđeno, npr., nivoima signala indukovanih ligandom koji dovodi do željenog transkripcionog odgovora. Na primer, Hinge-Notch i truncHinge-Notch obezbeđuju veće nivoe signala indukovanih ligandom nego odgovarajući SynNotch receptori, dok generišu niže nivoe signala kada ligand nije prisutan. Pored toga, određeni himerni polipeptidni receptori koji su ovde opisani obezbeđuju modularniju platformu za projektovanje dodatnih Notch receptora. Ova modularna platforma omogućava da se domeni sa različitim funkcijama lako zamene sa odgovarajućim domenima, npr. drugih vrsta, što omogućava prilagođavanje profila aktivacije receptora. Kao što je detalјnije opisano u Primerima, određeni Hinge-Notch i truncHinge-Notch receptori koji su ovde opisani, pored toga što su manji od postojećih SynNotch receptora i dobro se eksprimiraju, mogu se u velikoj meri prilagoditi, sa svim elementima receptora uključujući ekstracelularne, transmembranske i intracelularne domene, koji su dostupni za prilagođavanje. Na primer, testiranje različitih CD8 HingeNotch receptora kao što je ovde opisano, pokazalo je da su mogući različiti ekstracelularni domeni. Nasuprot tome, sličan proces izveden na postojećem SynNotch1 regulatornom domenu dovodi do gubitka ekspresije ili do gubitka funkcije receptora slične prekidaču.
[0064] Bez vezivanja za određenu teoriju, smatra se da HingeNotch receptori opisani ovde mogu obezbediti više nivoe signala indukovanog ligandom u poređenju sa mišjim ili humanim verzijama SynNotch1. Takođe se smatra da HingeNotch receptori opisani ovde mogu obezbediti niže nivoe signala u odsustvu liganda u poređenju sa mišjim verzijama SynNotch1 (npr., niži signal signala šuma). Na primer, postojeći SynNotch receptori mogu biti konstruisani sa domenima koji vezuju ligand kao što su scFvs i nanotela, ali je bilo teško koristiti prirodne ekstracelularne domene iz receptora ili liganda na SynNotch receptorima. Nasuprot tome, Notch receptori druge generacije koji su ovde opisani pogodni su za korišćenje drugih tipova domena za vezivanje liganda, npr., domene koji vezuju ligande koji nisu scFv, čime se proširuje spektar ciljnih bolesti i tkiva. Na primer, eksperimenti prikazani u delu sa Primerima prikazuju sposobnost upotrebe eGFP kao domena za vezivanje liganda, koji može da veže anti-GFP nanotelo LaG17 eksprimirano na površini cilјne ćelije. Nasuprot tome, postojeći sintetički Notch receptor kao što su mišji i humani SynNotch1 nisu bili kompatibilni sa eGFP kao domenom za vezivanje liganda.
[0065] Kao što je opisano u Primerima, određeni himerni polipeptidni receptori su testirani i validirani u primarnim humanim T ćelijama. Očekuje se da će ovi novi receptori pokazati slične performanse na modelima miša. Receptori koji su ovde opisani mogu biti konstruisani u različitim tipovima imunskih ćelija radi poboljšane diskriminacije i eliminacije tumora, ili u projektovanim ćelijama radi kontrole autoimunosti i regeneracije tkiva. Shodno tome, projektovane ćelije, kao što su imunske ćelije koje su projektovane tako da eksprimiraju jedan od više himernih receptora koji su ovde opisani, takođe su u okviru ovog otkrića.
Himerni polipeptidi
1
[0066] Kao što je gore navedeno, određene realizacije ovog otkrića se odnose na nove himerne polipeptide koji se ne pojavljuju u prirodi, i koji su projektovani da modulišu regulaciju transkripcije na način zavisan od liganda. Konkretno, novi receptori, iako su izvedeni iz Notch, ne zahtevaju regulatorne regione Notch (NRR) za koje se ranije smatralo da su neophodni za funkcionisanje receptora. Pored toga, ovde opisani novi konstruisani receptori uključuju ekstracelularni domen oligomerizacije (npr. domen zgloba) koji podstiče oligomerizaciju kako bi se formirali oligomeri višeg reda, npr., dimerni ili trimerni, oblici himernih receptora. U nekim realizacijama, zglobni domen uključuje polipeptidne motive koji stimulišu formiranje oligomera himernog polipeptida preko intermolekularnih disulfidnih veza. Ekstracelularni domen oligomerizacije može zameniti deo ili ceo Notch ekstracelularni domen. U nekim primerima izvođenja, receptori koji su ovde opisani vezuju ciljni ligand na površini ćelije, koji pokreće proteolitičko isecanje receptora i oslobađanje transkripcionog regulatora koji modulira uobičajeni transkripcioni program u ćeliji.
[0067] Shodno tome, ovde je obezbeđen himerni polipeptid koji uključuje, od N-kraja do C-kraja: (a) ektracelularni domen za vezivanje liganda (ECD) koji ima afinitet vezivanja za odabrani ligand; (b) zglobni domen koji je sposoban da stimuliše formiranje oligomera himernog polipeptida preko intermolekularnih disulfidnih veza; (c) transmembranski domen (TMD) koji uključuje jedno ili više mesta proteolitičkog isecanja indukovanog ligandom; i (d) intracelularni domen (ICD) koji uključuje regulator transkripcije, pri čemu vezivanje odabranog liganda za ECD indukuje isecanje na mestu(ima) proteolitičkog cepanja koje je indukovano ligandom između regulatora transkripcije i domena zgloba, i gde himerni polipeptid ne uključuje LIN -12-Notch ponovak (LNR) i/ili heterodimerizacioni domen (HD) Notch receptora.
Ekstracelularni domeni (ECD)
[0068] U nekim realizacijama, ECD himernih polipeptidnih receptora (npr., Hinge-Notch receptora) koji su ovde opisani imaju afinitet vezivanja za jedan ili više cilјnih liganada. Cilјni ligand je eksprimiran na površini ćelije, ili je na neki drugi način usidren, imobilizovan ili ograničen tako da može da izvrši mehaničku silu na himerni receptor. Shodno tome, bez vezivanja za bilo koju posebnu teoriju, vezivanje ECD himernog receptora koji je ovde opisan za ligand na površini ćelije ne mora nužno da ukloni cilјni ligand sa površine cilјne ćelije, već umesto toga deluje mehaničkom silom tako a vuče himerni receptor. Na primer, ligand koji je inače rastvorlјivi može biti cilјan ako je vezan za površinu ćelije ili za molekul u ekstracelularnom matriksu. U nekim realizacijama, cilјani ligand je ligand na površini ćelije. Primeri koji nisu ograničavajući pogodnih tipova liganda uklјučuju receptore na površini ćelije; adhezivne proteine; uglјene hidrate, lipide, glikolipide, lipoproteine i lipopolisaharide vezane za površinu; integrine; mucine; i lektine. U nekim realizacijama, ligand je protein. U nekim realizacijama, ligand je uglјeni hidrat.
[0069] U nekim primerima izvođenja, ligand je marker diferencijacijske grupe (CD). U nekim realizacijama, CD marker se bira iz grupe koju čine CD1, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3d, CD3e, CD3g, CD4, CD5, CD7, CD8a, CD8b, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD34, CD40, CD45, CD48, CD52, CD59, CD66, CD70, CD71, CD72, CD73, CD79A, CD79B, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD94, CD95, CD134, CD140 (PDGFR4), CD152 , CD154, CD158, CD178, CD181 (CXCR1), CD182 (CXCR2), CD183 (CXCR3), CD210, CD246, CD252, CD253, CD261, CD262, CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD276 (B7H3), CD279, CD395, CD (JAG1), CD340 (HER2), EGFR, FGFR2, CEA, AFP, CA125, MUC-1 i MAGE.
1
[0070] U nekim realizacijama, ekstracelularni domen uključuje deo receptora koji se vezuje za ligand. U nekim realizacijama, ekstracelularni domen uklјučuje deo koji se vezuje za antigen koji se vezuje za jedan ili više cilјnih antigena. U nekim realizacijama, deo koji se vezuje za antigen uklјučuje jednu ili više determinanti antitela koje vezuju antigen ili njegovog funkcionalnog fragmenta koji vezuje antigen. Stručnjak u ovoj oblasti tehnike nakon što pročita ovaj predmetni pronalazak lako će razumeti da se izraz „njihov funkcionalni fragment“ ili „njegova funkcionalna varijanta“ odnosi na molekul koji ima kvantitativnu i/ili kvalitativnu biološku aktivnost zajedničku sa molekulom divlјeg tipa iz kojeg je izveden navedeni fragment ili varijanta. Na primer, funkcionalni fragment ili funkcionalna varijanta antitela je ona koja zadržava suštinski istu sposobnost vezivanja za isti epitop kao antitelo iz kojeg je izveden funkcionalni fragment ili funkcionalna varijanta. Na primer, antitelo sposobno da se veže za epitop receptora na površini ćelije može biti skraćeno na N-terminusu i/ili C-terminusu, a sposobnost njegove aktivnosti vezivanja epitopa je procenjena upotrebom testova poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. U nekim realizacijama, deo koji se vezuje za antigen je izabran iz grupe koju čine antitelo, nanotelo, diatelo, triatelo ili minitelo, F(ab')2fragment, F(ab) fragment, jednolančani varijabilni fragment (scFv) i antitelo sa jednim domenom (sdAb), ili njihov funkcionalni fragment. U nekim realizacijama, deo koji vezuje antigen uključuje scFv.
[0071] Deo koji vezuje antigen može uključivati prirodne sekvence aminokiselina ili može biti projektovan, dizajniran ili modifikovan da obezbedi željena i/ili poboljšana svojstva kao što su, npr., afinitet vezivanja. Generalno, afinitet vezivanja dela koji vezuje antigen, npr. antitela, za cilјni antigen (npr. CD19 antigen) može se izračunati Scatchard metodom opisanom od strane Frankel et al., Mol. Immunol, 16:101-06, 1979. U nekim realizacijama, afinitet vezivanja se meri brzinom disocijacije antigen/antitelo. U nekim drugim realizacijama, afinitet vezivanja se meri kompetitivnim radioimunološkim esejem. U nekim realizacijama, afinitet vezivanja se meri pomoću ELISA testa. U nekim realizacijama, afinitet antitela se meri protočnom citometrijom. Antitelo koje „selektivno vezuje“ antigen (kao što je CD19) je antitelo koje ima deo koji se vezuje za antigen koji se ne vezuje značajno za druge antigene, ali vezuje antigen sa visokim afinitetom, npr., sa konstantom ravnoteže (KD) od 100 nM ili manjom, kao što je 60 nM ili manjom, na primer, 30 nM ili manjom, kao što je, 15 nM ili manjom, ili 10 nM ili manjom, ili 5 nM ili manjom, ili 1 nM ili manjom, ili 500 pM ili manjom, ili 400 pM ili manjom, ili 300 pM ili manjom, ili 200 pM ili manjom, ili 100 pM ili manjom.
[0072] Stručnjak iz oblasti može da izabere ECD na osnovu želјene lokalizacije ili funkcije ćelije koja je genetski modifikovana da eksprimira himerni polipeptid ili Hinge-Notch receptor ovog predmetnog pronalaska. Na primer, himerni polipeptid ili miniNotch receptor sa ECD koji uklјučuje antitelo specifično za HER2 antigen može usmeriti ćelije na ćelije raka dojke koje eksprimiraju HER2. U nekim realizacijama, ECD polipeptidnog Hinge-Notch receptora pronalaska je sposoban da veže antigen povezan sa tumorom (TAA) ili tumor-specifičan antigen (TSA). Stručnjak iz oblasti će razumeti da TAA uklјučuju molekul, kao npr., protein, prisutan na tumorskim ćelijama i na normalnim ćelijama, ili na mnogim normalnim ćelijama, ali u mnogo nižoj koncentraciji nego na tumorskim ćelijama. Nasuprot tome, TSA obično uklјučuju molekul, kao npr., protein koji je prisutan na tumorskim ćelijama, ali ne i na normalnim ćelijama.
[0073] U nekim slučajevima, deo koji vezuje antigen je specifičan za epitop prisutan na antigenu koji eksprimira tumorska ćelija, tj. antigen povezan sa tumorom. Antigen povezan sa tumorom može biti antigen povezan sa, npr. ćelijama raka dojke, B-ćelijskim limfomom, karcinomom pankreasa, ćelijama Hočkinovog limfoma, kancerom ćelija jajnika, kancerom ćelija prostate, mezoteliomom, ćelijama kancera pluća, ne-Hočkinovim B-ćelijskim limfomom (B-NHL), kancerom ćelija jajnika, kancerom ćelija
1
prostate, mezoteliomom, ćelijama melanoma, ćelijama hronične limfocitne leukemije, ćelijama akutne limfocitne leukemije, ćelijama neuroblastoma, glioma, glioblastoma, ćelijama kolorektalnog karcinoma, itd. Takođe će se razumeti da antigen povezan sa tumorom može takođe biti eksprimiran u nekonceroznoj ćeliji. U nekim realizacijama, domen koji se vezuje za antigen je specifičan za epitop prisutan u tkivno-specifičnom antigenu. U nekim realizacijama, domen koji vezuje antigen je specifičan za epitop prisutan na antigenu povezanom sa bolešću.
[0074] Primeri koji nisu ograničavajući pogodnih cilјnih antigena uklјučuju CD19, B7H3 (CD276), BCMA (CD269), alkalnu fosfatazu, placentalu sličan 2 (ALPPL2), zeleni fluorescentni protein (GFP), pojačani zeleni fluorescentni protein (EGFP), signalni regulatorni protein α (SIRPα), CD123, CD171, CD179α, CD20, CD213A2, CD22, CD24, CD246, CD272, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD46, CD71, CD97, CEA, CLDN6, CLECL1, CS-1, EGFR, EGFRvIII, ELF2M, EpCAM, EphA2, Ephrin B2, FAP, FLT3, GD2, GD3, GM3, GPRC5D, HER2 (ERBB2/neu), IGLL1, IL-11Rα, KIT (CD 117), MUC1, NCAM, PAP, PDGFR-β, PRSS21, PSCA, PSMA, ROR1, SSEA-4, TAG72, TEM1/CD248, TEM7R, TSHR, VEGFR2, ALPI, citrulinirani vimentin, cMet i Axl.
[0075] U nekim realizacijama, antigen za ciljanu primenu je odabran iz: CD19, B7H3 (CD276), BCMA (CD269), ALPPL2, CD123, CD171, CD179α, CD20, CD213A2, CD22, CD24, CD246, CD272, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD46, CD71, CD97, CEA, CLDN6, CLECL1, CS-1, EGFR, EGFRvIII, ELF2M, EpCAM, EphA2, Ephrin B2, FAP, FLT3, GD2, GD3, GM3, GPRC5D, HER2 (ERBB2/neu), IGLL1, IL-11Ra, KIT (CD117), MUC1, NCAM, PAP, PDGFR-β, PRSS21, PSCA, PSMA, ROR1, SSEA-4, TAG72, TEM1/CD248, TEM7R, TSHR, VEGFR2, ALPI, citrulinirani vimentin, cMet, Axl, GPC2, receptor humanog epidermalnog faktora rasta 2 (Her2/neu), CD276 (B7H3), IL-13Rα1, IL-13Rα2, α-fetoprotein (AFP), karcinoembrionalni antigen (CEA), antigen raka-125 (CA-125), CA19-9, kalretinin, MUC-1, epitelni membranski protein (EMA), antigen tumora epitela (ETA), tirozinaza, antigen povezan sa melanomom (MAGE), CD34, CD45, CD123, CD93, CD99, CD117, hromogranin, citokeratin, dezmin, glijalni fibrilarni kiseli protein (GFAP), „gross cystic disease fluid protein 15” (GCDFP-15), ALK, DLK1, FAP, NY-ESO, WT1, HMB-45 antigen, protein melan-A (antigen melanoma kojeg prepoznaju T limfociti; MART-1), myo-D1, aktin specifičan za mišiće (MSA), neurofilament, enolaza specifična za neurone (NSE), placentalna alkalna fosfataza, sinaptofizin, tireoglobulin, tiroidni transkripcioni faktor-1, AOC3 (VAP-1), CAM- 3001, CCL11 (eotaksin-1), CD125, CD147 (bazigin), CD154 (CD40L), CD2, CD20, CD23 (IgE receptor), CD25 (subjedinica heterodimernog IL-2 receptora), CD3, CD4, CD5, IFN-α, IFN-γ, IgE, IgE Fc region, IL-1, IL-12, IL-23, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-4, IL-5, IL-5, IL-6, IL-6 receptor, integrin α4, integrin α4β7, LFA-1 (CD11α), miostatin, OX-40, skleroscin, SOST, TGFβ1, TNF-α, VEGF-A, piruvat kinaza izoenzim tip M2 (tumor M2-PK), CD20, CD5, CD7, CD3, TRBC1, TRBC2, BCMA, CD38, CD123, CD93, CD34, CD1α, SLAMF7/CS1, FLT3, CD33, CD123, TALLA-1, CSPG4, DLL3, Kapa laki lanac, Lamba laki lanac, CD16/ FcyRIII, CD64, FITC, CD22, CD27, CD30, CD70, GD2 (gangliozid G2), GD3, EGFRvIII (epidermalni faktor rasta varijanta III), EGFR i njegove izovarijante, TEM-8, protein sperme 17 (Sp17), mezotelin.
[0076] Dalјi primeri, koji nisu ograničavajući, pogodnih antigena uklјučuju PAP (prostatična kisela fosfataza), antigen matičnih ćelija prostate (PSCA), prostein, NKG2D, TARP (protein alternativnog okvira čitanja receptora T ćelija), Trp-p8, STEAP1 (šest transmembranskih epitelnih antigena prostate 1), abnormalni ras protein, abnormalni protein p53, integrin β3 (CD61), galaktin, K-Ras (V-Ki-ras2 virusni onkogen sarkoma Kirsten pacova), Ral-B, GPC2, CD276 (B7H3) ili IL-13Rα. U nekim realizacijama, antigen je Her2. U nekim realizacijama, antigen je ALPPL2. U nekim realizacijama, antigen je BCMA. U nekim realizacijama, deo ECD koji vezuje antigen je specifičan za reporterski protein, kao što su GFP i eGFP. Primeri koji nisu ograničavajući takvog dela koji vezuje antigen uklјučuju
1
LaG17 anti-GFP nanotelo. U nekim realizacijama, deo ECD koji vezuje antigen uklјučuje anti-BCMA potpuno humanizovani VH domen (FHVH). U nekim realizacijama, antigen je signalni regulatorni protein α (SIRPα).
[0077] Dodatni antigeni pogodni za ciljanu primenu himernih polipeptidnih receptora koji su ovde opisani uključuju, ali nisu ograničeni na: GPC2, receptor humanog epidermalnog faktora rasta 2 (Her2/neu), CD276 (B7H3), IL-13Rα1, IL-13Rα2, α-fetoprotein (AFP), karcinoembrionalni antigen (CEA), antigen raka-125 (CA-125), CA19-9, kalretinin, MUC-1, epitelni membranski protein (EMA), antigen tumora epitela (ETA). Drugi pogodni antigeni za ciljanu primenu uklјučuju, ali nisu ograničeni na, tirozinazu, antigen povezan sa melanomom (MAGE), CD34, CD45, CD123, CD93, CD99, CD117, hromogranin, citokeratin, dezmin, glijalni fibrilarni kiseli protein (GFAP), „gross cystic disease fluid protein 15” (GCDFP-15), ALK, DLK1, FAP, NY-ESO, WT1, HMB-45 antigen, protein melan-A (antigen melanoma kojeg prepoznaju T limfociti; MART-1), myo-D1, aktin specifičan za mišiće (MSA), neurofilament, enolazu specifičnu za neurone (NSE), placentalnu alkalnu fosfatazu, sinaptofizin, tireoglobulin, tiroidni transkripcioni faktor-1.
[0078] Dodatni antigeni pogodni za ciljanu primenu himernih receptora koji su ovde opisani uklјučuju, ali nisu ograničeni na, one povezane sa inflamatornom bolestima kao što su: AOC3 (VAP-1), CAM-3001, CCL11 (eotaksin-1), CD125, CD147 (bazigin), CD154 (CD40L), CD2, CD20, CD23 (IgE receptor), CD25 (subjedinica heteromernog IL-2 receptora), CD3, CD4, CD5, IFN-α, IFN-γ, IgE, IgE Fc region, IL-1, IL-12, IL-23, IL-13, IL-17 , IL-17A, IL-22, IL-4, IL-5, IL-5, IL-6, IL-6 receptor, integrin a4, integrin α4β7, LFA-1 (CD11α), miostatin, OX-40, skleroscin, SOST, TGFβ1, TNF-a i VEGF-A.
[0079] Dalјi antigeni pogodni za ciljanu primenu himernih polipeptida i Hinge-Notch receptora koji su ovde opisani uklјučuju, ali nisu ograničeni na, izoenzim piruvat kinaze tipa M2 (tumor M2-PK), CD20, CD5, CD7, CD3, TRBC1, TRBC2, BCMA, CD38, CD123, CD93, CD34, CD1α, SLAMF7/CS1, FLT3, CD33, CD123, TALLA-1, CSPG4, DLL3, Kapa laki lanac, Lamba laki lanac, CD16/ FcyRIII, CD64, FITC, CD22, CD27, CD30, CD70, GD2 (gangliozid G2), GD3, EGFRvIII (epidermalni faktor rasta varijanta III), EGFR i njegove izovarijante, TEM-8, protein sperme 17 (Sp17), mezotelin. Dalјi primeri, koji nisu ograničavajući, pogodnih antigena uklјučuju: PAP (prostatičnu kiselu fosfatazu), antigen matičnih ćelija prostate (PSCA), prostein, NKG2D, TARP (protein alternativnog okvira čitanja receptora T ćelija), Trp-p8, STEAP1 (šest transmembranskih epitelnih antigena prostate 1), abnormalni ras protein, abnormalni protein p53, integrin β3 (CD61), galaktin, K-Ras (V-Ki-ras2 virusni onkogen sarkoma Kirsten pacova) i Ral-B. U nekim realizacijama, antigen je GPC2, CD19, Her2/neu, CD276 (B7H3), IL-13Rα1 ili IL-13Rα2. U nekim realizacijama, antigen je Her2. U nekim realizacijama, antigen je ALPPL2. U nekim realizacijama, antigen je BCMA. U nekim realizacijama, deo ECD koji vezuje antigen je specifičan za reporterski protein, kao što su GFP i eGFP. Primeri koji nisu ograničavajući takvog dela koji vezuje antigen uključuju LaG17 anti-GFP nanotelo. U nekim realizacijama, deo ECD koji vezuje antigen uključuje anti-BCMA potpuno humanizovani VH domen (FHVH).
[0080] U nekim primerima izvođenja, antigeni pogodni za ciljanu primenu himernih polipeptida i Hinge-Notch receptora koji su ovde opisani uključuju ligande izvedene iz patogena. Na primer, antigen može biti HER2 sintetisan od HER2-pozitivnih ćelija raka dojke. U nekim primerima izvođenja, antigen može biti CD19 koji se eksprimiran u B-ćelijskoj leukemiji. U nekim primerima izvođenja, antigen može biti EGFR koji se eksprimira na glioblastomu multiforme (GBM), ali je znatno manje eksprimiran na zdravom CNS tkivu. U nekim realizacijama, antigen može biti CEA koji je povezan sa karcionomom kod odraslih, na primer karcionomom debelog creva.
2
[0081] U nekim realizacijama, deo koji vezuje antigen u ECD je specifičan za ciljni deo na površini ćelije. Primeri ciljnih delova na površini ćelije, bez ograničavanja, uklјučuju: CD19, CD30, Her2, CD22, ENPP3, EGFR, CD20, CD52, CD11α i α -integrin. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi i Hinge-Notch receptori koji su ovde opisani uklјučuju ekstracelularni domen koji ima deo za vezivanje antigena koji vezuje CD19, CEA, HER2, MUC1, CD20, ALPPL2, BCMA ili EGFR. U nekim primerima izvođenja, himerni polipeptidi opisani ovde (npr., Hinge-Notch receptori) uklјučuju ekstracelularni domen koji uključuje deo za vezivanje antigena koji vezuje CD19. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi opisani ovde (npr.Hinge-Notch receptori) uklјučuju ekstracelularni domen koji uklјučuje deo za vezivanja antigena koji vezuje ALPPL2. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi dati ovde (npr., Hinge-Notch receptori) uklјučuju ekstracelularni domen koji uključuje deo za vezivanje antigena koji vezuje BCMA. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi opisani ovde (npr., Hinge-Notch receptori) uklјučuju ekstracelularni domen koji uklјučuje deo za vezivanje antigena koji vezuje Her2.
[0082] U nekim primerima izvođenja, himerni polipeptidi i Hinge-Notch receptori koji su ovde opisani uklјučuju ekstracelularni domen koji uključuje deo za vezivanje antigena koji vezuje CD19, ALPPL2, BCMA ili Her2. U nekim primerima izvođenja, deo koji vezuje antigen uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnosti sekvence sa jednom ili više SEQ ID NOS: 9-11, 36-38 i 72 u Listi sekvenci. U nekim realizacijama, deo koji vezuje antigen uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 9-11, 36-38 i 72. U nekim realizacijama, deo koji vezuje antigen uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 9-11, 36-38 i 72. U nekim realizacijama, deo koji vezuje antigen uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima 100% identičnosti sekvence sa jednom ili više SEQ ID NOS: 9-11, 36-38 i 72. U nekim primerima izvođenja, deo koji vezuje antigen uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 9-11, 36-38 i 72, pri čemu jedan, dva, tri, četiri ili pet aminokiselinskih ostataka u bilo kojoj od SEQ ID NOS: 9-11, 36-38 i 72 je/su supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom.
Domen zgloba
[0083] Kao što je gore navedeno, ekstracelularni domeni Notch locirani N-terminalno u odnosu na TMD himernog polipeptida opisanog u ovom otkriću, uklјučuju domen oligomerizacije (npr., zglobni domen) koji sadrži jedan ili više polipeptidnih motiva koji promovišu formiranje oligomera himernih polipeptida putem intermolekularnih disulfidnih veza. U ovim slučajevima, unutar himernih Notch receptora koji su ovde opisani, domen zgloba (eng., hinge domain) generalno uklјučuje fleksibilni oligo- ili polipeptidni region vezivanja koji se nalazi između ECD i TMD. Dakle, domen zgloba obezbeđuje fleksibilnost između ECD i TMD i takođe obezbeđuje mesta za formiranje intermolekularnih disulfidnih veza između dva ili više himernih polipeptidnih monomera kako bi se formirao oligomerni kompleks. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje motive koji promovišu formiranje dimera himernih polipeptida koji su ovde opisani. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje motive koji promovišu formiranje trimera himernih polipeptida koji su ovde opisani (npr., domen zgloba izveden iz OX40).
[0084] Polipeptidne sekvence zgloba koje su pogodne za kompozicije i postupke koje su ovde otkrivene mogu biti prirodne sekvence polipeptida zgloba (npr., one iz prirodnih imunoglobulina).
Alternativno, polipeptida sekvenca zgloba može biti sintetička sekvenca koja odgovara prirodnoj polipeptidnoj sekvenci zgloba, ili može biti u celosti sintetička sekvenca, ili može biti projektovana, dizajnirana ili modifikovana da obezbedi želјena i/ili pobolјšana svojstva, npr., modulaciju transkripcije. Pogodne polipeptidne sekvence zgloba uklјučuju, ali nisu ograničene na, one izvedene iz podklasa IgA, IgD i IgG, kao što su IgG1 zglobni domen, IgG2 zglobni domen, IgG3 zglobni domen i IgG4 zglobni domen, ili njihova funkcionalna varijanta. U nekim realizacijama, polipeptida sekvenca zgloba sadrži jedan ili više CXXC motiva. U nekim realizacijama, polipeptida sekvenca zgloba sadrži jedan ili više CPPC motiva. Dodatne informacije u ovom pogledu mogu se naći u, na primer, preglednom revijskom radu autora Vidarsson G. et al., Frontiers Immunol.20. oktobra 2014.
[0085] Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, zglobni domen uklјučuje polipeptidnu sekvencu zgloba izvedenu iz domena zgloba IgG1 ili njegovu funkcionalnu varijantu. U nekim realizacijama, zglobni domen uklјučuje polipeptidnu sekvencu zgloba izvedenu iz domena zgloba IgG2 ili njegovu funkcionalnu varijantu. U nekim realizacijama, zglobni domen uklјučuje polipeptidnu sekvencu zgloba izvedenu iz domena zgloba IgG3 ili njegovu funkcionalnu varijantu. U nekim realizacijama, zglobni domen uklјučuje polipeptidnu sekvencu zgloba izvedenu iz domena zgloba IgG4 ili njegovu funkcionalnu varijantu. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje polipeptidnu sekvencu zgloba izvedenu iz domena zgloba IgA ili njegovu funkcionalnu varijantu. U nekim realizacijama, zglobni domen uklјučuje polipeptidnu sekvencu zgloba izvedenu iz domena zgloba IgD ili njegovu funkcionalnu varijantu.
[0086] Dodatne polipeptidne sekvence zgloba pogodne za kompozicije i postupke koje su ovde otkrivene uklјučuju, ali nisu ograničene na, polipeptidne sekvence zgloba izvedene iz: domena zgloba CD8α, domena zgloba CD28, domena zgloba CD152, domena zgloba PD-1, domena zgloba CTLA4, domena zgloba OX40, domena zgloba FcγRIIIα i njihove funkcionalne varijante. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje polipeptidnu sekvencu zgloba izvedenu iz zglobnog domena CD8α ili njegove funkcionalne varijante. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje polipeptidnu sekvencu zgloba izvedenu iz zglobnog domena CD28 ili njegove funkcionalne varijante. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje polipeptidnu sekvencu zgloba izvedenu iz zglobnog domena OX40 ili njegove funkcionalne varijante. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje polipeptidnu sekvencu zgloba izvedenu iz zglobnog domena IgG4 ili njegove funkcionalne varijante.
[0087] U principu, ne postoje posebna ograničenja u pogledu dužine i/ili aminokiselinskog sastava zglobnog domena osim što mora da obezbedi fleksibilnost i kapacitet za oligomerizaciju. Međutim, stručnjak u ovoj oblasti lako će razumeti da se dužina i aminokiselinski sastav polipeptidne sekvence zgloba mogu optimizovani kako bi se u odnosu jedan prema drugom varirala orijentacija i/ili blizina ECD i TMD, kao i između monomera himernih polipeptida, radi postizanja želјene aktivnosti himernog polipeptida pronalaska. U nekim primerima izvođenja, bilo koji proizvolјni jednolančani peptid koji sadrži oko jednog do 100 aminokiselinskih ostataka (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, itd. aminokiselinskih ostataka) može se koristiti kao domen zgloba. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje oko 5 do 50, oko 10 do 60, oko 20 do 70, oko 30 do 80, oko 40 do 90, oko 50 do 100, oko 60 do 80, oko 70 do 100, oko 30 do 60, oko 20 do 80, oko 30 do 90 aminokiselinskoh ostataka. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje oko 1 do 10, oko 5 do 15, oko 10 do 20, oko 15 do 25, oko 20 do 40, oko 30 do 50, oko 40 do 60, oko 50 do 70 aminokiselinskih ostataka. U nekim realizacijama, domen zgloba uključuje oko 40 do 70, oko 50 do 80, oko 60 do 80, oko 70 do 90 ili oko 80 do 100 aminokiselinskih ostataka. U nekim realizacijama, domen zgloba uključuje oko 1 do 10, oko 5 do 15, oko 10 do 20, oko 15 do 25 aminokiselinskih ostataka. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje sekvencu koja ima najmanje 80% sličnosti sekvence, kao što je, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili 99% identičnosti sekvence sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 12-16 i 39-42 u Listi sekvenci. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 12-16 i 39-42. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnost sekvence sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 12-16 i 39-42. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima oko 100% identičnost sekvence sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 12-16 i 39-42. U nekim realizacijama, domen zgloba uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 12-16 i 39-42, pri čemu jedan, dva, tri, četiri ili pet aminokiselinskih ostataka u bilo koja od SEQ ID NOS: 12-16 i 39-42 je/su supstituisana drugim aminokiselinskim ostatkom.
Transmembranski domen (TMD)
[0088] Kao što je gore navedeno, himerni polipeptidi prema pronalasku uklјučuju transmembranski domen koji uklјučuje jedno ili više mesta proteolitičkog isecanja indukovanog ligandom.
[0089] Primeri proteolitičkih mesta isecanja u Notch receptoru (npr., S2 ili S3) su kao što je iznad opisano. Dodatna mesta proteolitičkog isecanja pogodna za kompozicije i postupke koji su ovde opisani uklјučuju, ali nisu ograničeni na, mesto delovanja metaloproteinaze za MMP izabrane iz grupe koju čine kolagenaza-1, -2 i -3 (MMP-1, -8 i -13 ), želatinaza A i B (MMP-2 i -9), stromelizin 1, 2 i 3 (MMP-3, -10 i -11), matrilizin (MMP-7) i membranske metaloproteinaze (MT1-MMP i MT2-MMP). Na primer, sekvenca gde dolazi do isecanja sa MMP-9 je Pro-X-X-Hy (gde X predstavlјa proizvolјnu reziduu; Hy, hidrofobni ostatak kao što su Leu, Ile, Val, Phe, Trp, Tyr, Val, Met i Pro ) (SEQ ID NO: 64), npr. Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr) (SEQ ID NO: 65), npr. Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser (SEQ ID NO: 66) ili Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr (SEQ ID NO: 67). Drugi primer pogodnog mesta delovanja proteaze je mesto isecanja aktivatora plazminogena, npr. aktivator plazminogena tipa urokinaze (uPA) ili mesto isecanja tkivnog aktivatora plazminogena (tPA). Još jedan primer pogodnog mesta delovanja proteaze je mesto isecanja prolaktina. Specifični primeri sekvenci gde dolazi do isecanja uPA i tPA uklјučuju sekvence koje sadrže Val-Gly-Arg (SEQ ID NO: 68). Još jedan primer mesta delovanja proteaze koje može biti uklјučeno u proteolitičko isecanje linkera je mesto isecanja proteaze virusa duvana „tobacco etch virus“ (TEV), npr., Glu-Asn-Leu-Tyr-Thr-Gln-Ser (SEQ ID NO: 69), gde proteaza iseca između glutamina i serina. Naredni primer mesta isecanja proteazom koje može biti uklјučeno u proteolitički linker isecanja je mesto delovanja enterokinaze, npr., Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 70), gde se isecanje dešava nakon ostatka lizina. Naredni primer mesta isecanja proteazom koje može biti uklјučeno u proteolitički linker isecanja je mesto delovanja trombina, npr. Leu-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO: 71). Dodatni pogodni linkeri koji uklјučuju mesta delovanja proteaze uklјučuju sekvence koje se mogu isecati sledećim proteazama: PreScission<™>proteazom (fuzioni protein koji uključuje proteazu humanog rinovirusa 3C i glutation-S-transferazu), trombinom, katepsinom B, proteazom Epstein-Barr virusa, MMP-3 (stromelizin), MMP-7 (matrilizin), MMP-9; MMP sličan termolizinu, matriks metaloproteinazu 2 (MMP-2), katepsinom L; katepsinom D, matriks metaloproteinazom 1 (MMP-1), aktivatorom plazminogena tipa urokinaze (uPA), matriks metaloproteinazom tipa 1 (MT-MMP), stromelizinom 3 (ili MMP-11), termolizinom, fibroblast kolagenaza i stromelizinom-1, matriks metaloproteinazom 13 (kolagenaza-3), aktivatorom tkivnog plazminogena (tPA), humanim antigenom
2
specifičnim za prostatu, kalikreinom (hK3), neutrofilnom elastazom i kalpainom (neutralna proteaza aktivirana kalcijumom). Proteaze koje nisu nativne za ćeliju domaćina u kojoj je receptor eksprimiran (na primer, TEV) mogu se koristiti kao dalјi regulatorni mehanizam, u kome aktivacija Hinge-Notch nije moguća dok se proteaza ne eksprimira ili na drugi način obezbedi. Dodatno, proteaza može biti povezana sa tumorom ili bolešću (izražena u značajno većem stepenu nego u normalnom tkivu) i može posluži kao nezavisni regulatorni mehanizam. Na primer, neke matriksne metaloproteaze su visoko eksprimirane u određenim tipovima kancera.
[0090] Generalno, TMD pogodan za himerne polipeptide i Hinge-Notch receptore koji su ovde opisani može biti bilo koji transmembranski domen transmembranskog receptora tipa 1 koji uključuje najmanje jedno mesto isecanja γ-sekretazom. Detalјan opis strukture i funkcije kompleksa γ-sekretaze, kao i njenih supstratnih proteina, koji uključuju amiloidni prekursorski protein (APP) i Notch, mogu se, na primer, naći u nedavnom revijskom radu Zhang et al., Frontiers Cell Neurosci (2014). Bez ograničenja pogodni TMD iz transmembranskih receptora tipa 1 uklјučuju one iz CLSTN1, CLSTN2, APLP1, APLP2, LRP8, APP, BTC, TGBR3, SPN, CD44, CSF1R, CXCL16, CX3CL1, DCC, DLL1, DSG2, DAG1, CDH1, EPCAM, EPHA4, EPHB2, EFNB1, EFNB2, ErbB4, GHR, HLA-A, i IFNAR2, pri čemu TMD uklјučuje najmanje jedno mesto isecanja γ-sekretazom. Dodatni TMD pogodni za kompozicije i postupke koji su opisani ovde uklјučuju, ali nisu ograničeni na, transmembranske domene iz tipa 1 transmembranskih receptora IL1R1, IL1R2, IL6R, INSR, ERN1, ERN2, JAG2, KCNE1, KCNE2, KCNE3, KCNE4, KL, CHL1 , PTPRF, SCN1B, SCN3B, NPR3, NGFR, PLXDC2, PAM, AGER, ROBO1, SORCS3, SORCS1, SORL1, SDC1, SDC2, SPN, TYR, TYRP1, DCT, VASN, FLT1, CDH5, PKHD1, NECTIN1, PCDHGC3, NRG1, LRP1B, CDH2, NRG2, PTPRK, SCN2B, Nradd, i PTPRM. U nekim primerima izvođenja, TMD himernih polipeptida ili Notch receptora ovog pronalaska je TMD izveden iz TMD člana porodice kalsintenina, kao što su alkadein alfa i alkadein gama. U nekim primerima izvođenja, TMD himernih polipeptida ili Notch receptora ovog pronalaska je TMD poznat po Notch receptorima. U nekim primerima izvođenja, TMD himernih polipeptida ili Notch receptora ovog pronalaska je TMD izveden iz različitog Notch receptora. Na primer, u Hinge-Notch receptoru zasnovanom na humanom Notch1, Notch1 TMD može biti supstituisan sa Notch2 TMD, Notch3 TMD, Notch4 TMD ili Notch TMD od životinje koja nije čovek kao što su Danio rerio, Drosophila melanogaster, Xenopus laevis, ili Gallus gallus.
[0091] U nekim realizacijama, transmembranski domen uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja pokazuje najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identitičnosti sekvence sa jednom ili više SEQ ID NOS: 17, 77 i 78 koje se nalaze u Listi sekvenci. U nekim realizacijama, transmembranski domen uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine NOS: 17, 77 i 78. U nekim realizacijama, transmembranski domen uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine NOS: 17, 77 i 78. U nekim u primerima izvođenja, transmembranski domen uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima oko 100% identičnosti sekvence sa jednim ili više NOS: 17, 77 i 78. U nekim primerima izvođenja, transmembranski domen uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu izabranu iz grupe koju čine NOS: 17, 77 i 78, pri čemu jedan, dva, tri, četiri ili pet aminokiselinskih ostataka u bilo kom od NOS: 17, 77 i 78 je/su supstituisane drugim aminokiselinskim ostatkom. U nekim realizacijama, supstitucija(e) aminokiselina unutar TMD obuhvata jednu ili više supstitucija unutar „GV“ motiva TMD. U nekim realizacijama, najmanje jedna od takvih supstitucija je supstitucija za alanin. Na primer, jedan, dva, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih ostataka sekvence FMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLS (SEQ ID NO: 17), kao i sekvenca koja je navedena u SEQ ID NO: 77 ili 78, mogu biti zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom. U nekim realizacijama, aminokiselinski ostatak na poziciji 18 i/ili 19 „GV“ motiva u SEQ ID NO: 17 je supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom. U nekim realizacijama, glicinski ostatak na poziciji 18 SEQ ID NO: 17 je supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom. U nekim realizacijama, valinski ostatak na poziciji 19 SEQ ID NO: 17 je supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom. U nekim realizacijama, transmembranski domen uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu koja odgovara SEQ ID NO: 17 sa mutacijom na poziciji koja odgovara poziciji 18 SEQ ID NO: 17, kao što su G18A mutacije. U nekim realizacijama, transmembranski domen uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu koja odgovara SEQ ID NO: 17 sa mutacijom na poziciji koja odgovara poziciji 19 SEQ ID NO: 17, kao što su V 19A mutacije.
Sekvenca zaustavlјanja transfera
[0092] U nekim primerima izvođenja, himerni polipeptidi i Hinge-Notch receptori predmetnog pronalaska uklјučuju sekvencu zaustavlјanja transfera (STS) koju čini visoko naelektrisani domen koji se nalazi na C-terminalnom delu TMD. Bez vezivanja ni za jednu posebnu teoriju, tako visoko naelektrisan domen koji se nalazi između TMD i ICD sprečava ICD da uđe u membranu. STS je vezan za TMD i ICD sledećim redosledom, od N-kraja do C-kraja, TMD-STS-ICD. U principu, ne postoje posebna ograničenja za dužinu i/ili sastav aminokiselina STS-a. U nekim realizacijama, bilo koji proizvolјni jednolančani peptid koji obuhvata oko 4 do oko 40 aminokiselinskih ostataka (npr., 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20, itd. aminokiselinskih ostataka) može se koristiti kao STS. U nekim realizacijama, STS obuhvata oko 4 do 15, oko 6 do 20, oko 8 do 25, oko 10 do 30, oko 12 do 35, oko 14 do 40, oko 5 do 40, oko 10 do 35, oko 15 do 30, oko 20 do 25, oko 20 do 40, oko 10 do 30, oko 4 do 20, ili oko 5 do 25 aminokiselinskih ostataka. U nekim realizacijama, STS obuhvata oko 4 do 10, oko 5 do 12, oko 6 do 14, oko 7 do 18, oko 8 do 20, oko 9 do 22, oko 10 do 24 ili oko 11 do 26 aminokiselinskih ostataka . U nekim realizacijama, STS obuhvata oko 4 do 10 ostataka, kao što su 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka.
[0093] U nekim primerima izvođenja, STS uklјučuje sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti u sekvenci, kao što je, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili 99% identičnosti u sekvenci sa STS sekvencom Notch1, Notch2, Notch3, Notch4, CLSTN1, CLSTN2, CSF1R, CXCL16, DAG1, GHR, PTPRF, AGER, KL, NRG1, LRP1B, Jag2, EPCAM, KCNE3, CDH2, NRG2, PTPRK, BTC, EPHA3, IL1R2 ili PTPRM. U nekim primerima izvođenja, STS uklјučuje sekvencu koja sadrži samo Lys (K) ili Arg (R) u prva 4 ostatka. U nekim realizacijama, STS uklјučuje jedan, dva, tri, četiri, pet ili više osnovnih ostataka. U nekim primerima izvođenja, STS uklјučuje pet, četiri, tri, dva, jedan ili nula aromatičnih ostataka ili ostataka sa hidrofobnim i/ili sa glomaznim bočnim lancima.
[0094] U nekim primerima izvođenja, STS uklјučuje sekvencu koja ima najmanje 80% identitičnosti u sekvenci, kao što je, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili 99% identičnosti u sekvenci sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 18-19, 43-63, 79 i 80 iz Liste sekvenci. U nekim primerima izvođenja, STS uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identitetičnosti u sekvenci sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 18-19, 43-63, 79 i 80. U nekim primerima izvođenja, STS uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti u sekvenci sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 18-19, 43-63, 79 i 80. U nekim primerima izvođenja, STS uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima oko 100% identičnosti u sekvenci sa sekvencom izabranom iz grupe
2
koju čine SEQ ID NOS: 18-19, 43-63, 79 i 80. U nekim primerima izvođenja, STS uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 18-19, 43-63, 79 i 80, pri čemu jedan, dva, tri, četiri ili pet aminokiselinskih ostataka u bilo kom od SEQ ID NOS: 18-19, 43-63, 79 i 80 je/su supstituisani drugim aminokiselinskim ostatkom. U nekim primerima izvođenja, STS uklјučuje sekvencu koja ima najmanje 70% identitičnosti u sekvenci, kao što je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili 99% identitčnosti u sekvenci sa STS sekvencom Notch1, Notch2, Notch3, Notch4, CLSTN1, CLSTN2, JAG2, PTPRF, LRP1B, NRG2, KCNE2, KCNE3, KCNE4, AGER, PKHD1, GHR, PTPRM, DAG1, NRG1, EPCAM, KL, PTPRK, CXCL16 ili bilo kojom navedenom u Tabelama 3 i 4. U realizaciji, STS uklјučuje sekvencu koja sadrži samo Lys (K) ili Arg (R) u prva 4 ostatka. U nekim primerima izvođenja, STS uklјučuje jedan, dva, tri, četiri, pet ili više osnovnih ostataka. U nekim primerima izvođenja, STS obuhvata pet, četiri, tri, dva, jedan ili nula aromatičnih ostataka ili ostataka sa hidrofobnim i/ili sa glomaznim bočnim lancima.
Intracelularni domen
[0095] Himerni polipeptidi i Hinge-Notch receptori prema pronalasku uklјučuju regulator transkripcije. Regulator transkripcije prema pronalasku je polipeptidni element koji deluje tako da aktivira ili inhibira transkripciju DNK vođenu promotorom. Regulatori transkripcije pogodni za kompozicije i postupke ovde opisane, mogu biti prirodno prisutni transkripcioni regulatori ili mogu biti konstruisani, dizajnirani ili modifikovani tako da obezbede želјena i/ili pobolјšana svojstva, npr., modulaciju transkripcije. Kao što je ranije diskutovano, konstruisani receptori ovog predmetnog pronalaska imaju prednost u tome što mogu da obezbede mogućnost pokretanja prilagođenog programa transkripcije u projektovanim ćelijama. U nekim realizacijama, regulator transkripcije ovog otkrića je prilagođeni transkripcioni regulator koji pokreće transkripciju sa specifične sekvence koja se pojavlјuje samo jednom u projektovanoj ćeliji.
[0096] U nekim primerima izvođenja, transkripcioni regulator direktno reguliše diferencijaciju ćelije. U nekim primerima izvođenja, transkripcioni regulator indirektno moduliše (npr. reguliše) diferencijaciju ćelije tako što moduliše ekspresiju drugog transkripcionog faktora. Stručnjaci iz ove oblasti će razumeti da transkripcioni regulator može biti transkripcioni aktivator ili transkripcioni represor. U nekim realizacijama, transkripcioni regulator je represor transkripcije. U nekim realizacijama, transkripcioni regulator je aktivator transkripcije. U nekim realizacijama, transkripcioni regulator može da uključi signal za nuklearnu lokalizaciju. U nekim realizacijama, transkripcioni regulator je izabran između Gal4-VP16, Gal4-VP64, tetR-VP64, ZFHD1-VP64, Gal4-KRAB i HAP1-VP16. U nekim realizacijama, transkripcioni regulator je Gal4-VP64.
[0097] Himerni polipeptidi i Hinge-Notch receptori ovog predmetnog pronalaska mogu biti himerni polipeptidi bilo koje dužine, uklјučujući himerne polipeptide koji su generalno između oko 100 aminokiselina (aa) do oko 1000 aa, npr. od oko 100 aa do oko 200 aa, od oko 150 aa do oko 250 aa, od oko 200 aa do oko 300 aa, od oko 250 aa do oko 350 aa, od oko 300 aa do oko 400 aa, od oko 350 aa do oko 450 aa, od oko 400 aa do oko 500 aa dužine. U nekim realizacijama, opisani himerni polipeptidi su generalno između oko 400 aa do oko 450 aa, od oko 450 aa do oko 500 aa, od oko 500 aa do oko 550 aa, od oko 550 aa do oko 600 aa, od oko 600 aa do oko 650 aa, od oko 650 aa do oko 700 aa, od oko 700 aa do oko 750 aa, od oko 750 aa do oko 800 aa, od oko 800 aa do oko 850 aa, od oko 850 aa do oko 900 aa, od oko 900 aa do oko 950 aa, ili od oko 950 aa do oko 1000 aa dužine. U
2
nekim slučajevima, himerni polipeptidi predmetnog pronalaska imaju dužinu od oko 300 aa do oko 400 aa. U nekim slučajevima, himerni polipeptidi predmetnog pronalaska imaju dužinu od oko 300 aa do oko 350 aa. U nekim slučajevima, himerni polipeptidi predmetnog pronalaska imaju dužinu od oko 300 aa do oko 325 aa. U nekim slučajevima, himerni polipeptidi predmetnog pronalaska imaju dužinu od oko 350 aa do oko 400 aa. U nekim slučajevima, himerni polipeptidi predmetnog pronalaska imaju dužinu od 750 aa do 850 aa. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi predmetnog pronalaska imaju dužinu od oko 525 aa, oko 538 aa, oko 539 aa, oko 542 aa, oko 550 aa, oko 556 aa, ili oko 697 aa.
Dodatni domeni
[0098] U nekim realizacijama, Notch ekstracelularni domeni locirani N-terminalno u odnosu na TMD, mogu uključivati dodatni domen, na primer signal za lokalizaciju membrane kao što je signal CD8A, markere koji se mogu detektovati kao što su myc oznaka (eng. myc tag) ili his oznaka (eng. his tag), i slično. Bez vezivanja za određenu teoriju, može biti korisno ugraditi dodatne domene N-terminalno u domen zgloba. Ovo je zato što bi prisustvo većih struktura (kao što je NRR) neposredno pored TMD moglo uticati na aktivnost receptora, osim ako se ne postave na dovoljnoj udaljenosti. Takođe se smatra da himerni polipeptidi i HingeNotch receptori kako su ovde opisani mogu biti dalјe konstruisani tako da uklјučuju jednu ili više dodatnih karakteristika kao što su signalna sekvenca, oznaka koja se može detektovati, mesto isecanja specifično za tumor, mesto isecanja specifično za bolest, ili njihove kombinacije. Na primer, nekoliko proteaza (kao što su matriks metaloproteaze) se pojačano eksprimiraju u kancerima, omogućavajući isecanje na mestu isecanja koje je specifično za tumor ne preko samog specifičnog mesta isecanja, već preko povećanih nivoa specifičnih proteaza koje to isecanje vrše. Dodatne informacije u vezi s tim mogu se naći u npr. J.S. Dudani et al., Annu. Rev. Cancer Biol. (2018), 2:353-76.
[0099] U nekim primerima izvođenja, himerni polipeptid ili Hinge-Notch receptor predmetnog pronalaska obuhvata: (a) zglobni domen koji uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti u sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NO: 12-16 i 39-42; (b) transmembranski domen koji uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti u sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NOS: 17, 77 i 78; i (c) domen sekvence zaustavljanja transfera koja uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti u sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NOS: 18-19, 43-63, 79 i 80. U nekim realizacijama, himerni polipeptid ili Hinge-Notch receptor predmetnog pronalaska obuhvata: (a) zglobni domen koji uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti u sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NO: 12-16 i 39-42; (b) transmembranski domen koji uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti u sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NOS: 17, 77 i 78; i (c) domen sekvence zaustavljanja transfera koja uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti u sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NOS: 18-19, 43-63, 79 i 80. U nekim realizacijama, himerni polipeptid ili Hinge-Notch receptor predmetnog pronalasku obuhvata: (a) zglobni domen koji uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti u sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NO: 12-16 i 39-42; (b) transmembranski domen koji uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti u sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NOS: 17, 77 i 78; i (c) domen sekvence zaustavljanja transfera koji uklјučuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnost u sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NOS: 18-19, 43-63, 79 i 80.
2
[0100] U nekim realizacijama, himerni polipeptid predmetnog pronalaska obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa himernim receptorom koji je ovde opisan. U nekim realizacijama, ovde su obezbeđeni himerni polipeptidi obuhvataju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NOS : 1-8, 24-35 i 73-76 koje se mogu videti u Listi sekvenci. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 1. U nekim u realizaciji, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 2. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 3. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 4. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinska sekvenca koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 5. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 6. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 7. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% , 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 8. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 24. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 25. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 26. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 27. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinska sekvenca koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 28. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 29. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 30. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80 %, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 31. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 32. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 33. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96% , 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 34. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 35. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju
2
aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99%, ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 73. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% , ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 74. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 75. U nekim realizacijama, himerni polipeptidi uklјučuju aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 76.
Molekuli nukleinske kiseline
[0101] U drugom aspektu, ovde su obezbeđeni različiti molekuli nukleinske kiseline koji uključuju nukleotidne sekvence koje kodiraju himerne polipeptide i Hinge-Notch receptore pronalaska, uklјučujući ekspresione kasete, i vektore ekspresije koji sadrže ove molekule nukleinskih kiselina operativno povezane sa heterolognim sekvencama nukleinskih kiselina kao što su, na primer, regulatorne sekvence koje dopuštaju in vivo ekspresiju receptora u ćeliji domaćinu.
[0102] Molekuli nukleinske kiseline predmetnog pronalaska mogu biti bilo koje dužine, uklјučujući, na primer, između oko 1,5 Kb i oko 50 Kb, između oko 5 Kb i oko 40 Kb, između oko 5 Kb i oko 30 Kb, između oko 5 Kb i oko 20 Kb, ili između oko 10 Kb i oko 50 Kb, na primer između oko 15 Kb do 30 Kb, između oko 20 Kb i oko 50 Kb, između oko 20 Kb i oko 40 Kb, oko 5 Kb i oko 25 Kb, ili oko 30 Kb i oko 50 Kb.
[0103] Shodno tome, ovde je obezbeđen molekul nukleinske kiseline koji uklјučuje nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni polipeptid ili Hinge-Notch receptor, od N-kraja do C-kraja: (a) ekstracelularni domen za vezivanje liganda koji ima afinitet vezivanja za odabrani ligand; (b) zglobni domen sposoban da promoviše formiranje oligomera himernog polipeptida preko intermolekularnih disulfidnih veza; (c) transmembranski domen koji uklјučuje jedno ili više mesta proteolitičkog isecanja indukovanog ligandom; i (d) intracelularni domen koji uklјučuje transkripcioni regulator, pri čemu vezivanje izabranog liganda za vanćelijski domen koji vezuje ligand indukuje isecanje na mestu proteolitičkog isecanja koje je indukovano ligandom i koje se nalazi između transkripcionog regulatora i domena zgloba, i gde himerni polipeptid ne uklјučuje ponovke LIN-12-Notch (LNR) i/ili heterodimerizacioni domen (HD) Notch receptora.
[0104] U nekim realizacijama, nukleotidna sekvenca se inkorporira u ekspresionu kasetu ili vektor ekspresije. Podrazumeva se da ekspresiona kaseta generalno uklјučuje konstrukt genetičkog materijala koji sadrži kodirajuće sekvence i dovolјno regulatornih informacija da omoguće pravilnu transkripciju i/ili translaciju kodirajućih sekvenci u ćeliji primaocu, in vivo i/ili ex vivo. Generalno, ekspresiona kaseta može biti insertovana u vektor radi ciljanja u želјenu ćeliju domaćina i/ili pojedinca. Kao takva, u nekim realizacijama, ekspresiona kaseta ovog pronalaska uklјučuje kodirajuću sekvencu za himerni polipeptid kako je ovde opisano, koja je operativno povezana sa elementima za kontrolu ekspresije, kao što je promotor, i opciono, kao i sa bilo kojom ili kombinacijom drugih sekvenci nukleinskih kiselina koje utiču na transkripciju ili translaciju kodirajuće sekvence.
[0105] U nekim realizacijama, nukleotidna sekvenca je ugrađena u ekspresioni vektor. Stručnjak u oblasti će razumeti da se izraz „vektor“ generalno odnosi na rekombinantni polinukleotidni konstrukt dizajniran za transfer između ćelija domaćina, i koji se može koristiti u svrhu transformacije, npr., uvođenje heterologne DNK u ćeliju domaćina. Kao takav, u nekim realizacijama, vektor može biti
2
replikon, kao što je plazmid, fag ili kosmid, u koji se može ubaciti drugi segment DNK kako bi se ostvarila replikacija umetnutog segmenta. U nekim realizacijama, ekspresioni vektor može biti integrativni vektor.
[0106] U nekim realizacijama, ekspresioni vektor može biti virusni vektor. Kao što će proceniti stručnjak u ovoj oblasti, termin „virusni vektor“ se široko koristi za označavanje bilo molekula nukleinske kiseline (npr., transfernog plazmida) koji uklјučuje elemente nukleinske kiseline izvedene iz virusa, a koji generalno olakšavaju transfer molekula nukleinske kiseline ili integraciju u genom ćelije ili za označavanje virusne čestice koja posreduje u transferu nukleinske kiseline. Virusne čestice će generalno uklјučivati različite virusne komponente, a ponekad i komponente ćelije domaćina pored nukleinske kiseline(a). Izraz virusni vektor može se odnosi ili na virus ili virusnu česticu sposobnu da prenese nukleinsku kiselinu u ćeliju, ili na samu prenetu nukleinsku kiselinu. Virusni vektori i transferni plazmidi sadrže strukturne i/ili funkcionalne genetske elemente koji su primarno izvedeni iz virusa. Termin „retrovirusni vektor“ se odnosi na virusni vektor ili plazmid koji sadrži strukturne i funkcionalne genetske elemente, ili njihove delove, koji su primarno izvedeni iz retrovirusa. Termin „lentivirusni vektor“ se odnosi na virusni vektor ili plazmid koji sadrži strukturne i funkcionalne genetske elemente, ili njihove delove, uklјučujući LTR koji su primarno izvedeni iz lentivirusa, roda retrovirusa.
[0107] U nekim realizacijama, ovde su opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa himernim receptorom koji je ovde opisan. U nekim realizacijama, ovde su opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NOS: 1-8, 24-35 i 73-76 navedenih u Listi sekvenci. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 1. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 2. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 3. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 4. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 5. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 6. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 7. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 8. U nekim realizacijama , molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 24. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90 %, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID-om NE: 25. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci. SEQ ID NO: 26. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 27. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 28. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 29. U nekim realizacijama, nukleinska kiselina molekuli kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 30. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 31. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95 %, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 32. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 33. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 34. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 35. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 73. U nekim realizacijama, nukleinska kiselina molekuli kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 74. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 75. U nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline kodiraju polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom koja ima najmanje oko 80%, 90%, 95%, 96%, 97, 98%, 99% ili 100% identičnosti u sekvenci sa SEQ ID NO: 76.
[0108] Nukleotidne sekvence koje kodiraju himerne receptore mogu biti optimizovane za ekspresiju u ćeliji domaćina od interesa. Na primer, sadržaj G-C sekvenci može se podesi da bude na prosečnom nivou za datu ćeliju domaćina, što se izračunava pozivanjem na poznate gene eksprimirane u ćeliji domaćinu. Postupci za optimizaciju upotrebe kodona su poznate u tehnici. Upotreba kodona unutar kodirajuće sekvence himernog receptora koja je ovde opisana može se optimizovati za pobolјšanje ekspresije u ćeliji domaćinu, tako da je oko 1%, oko 5%, oko 10%, oko 25%, oko 50%, oko 75% ili do 100% kodona unutar kodirajuće sekvence optimizovano za ekspresiju u određenoj ćeliji domaćinu.
[0109] Neke realizacije koje su ovde opisane odnose se na vektore ili ekspresione kasete koje uključuju rekombinantni molekul nukleinske kiseline koji kodira himerne receptore koji su ovde opisani. Ekspresiona kaseta generalno sadrži kodirajuće sekvence i dovolјno regulatornih informacija da omoguće pravilnu transkripciju i/ili translaciju kodirajućih sekvenci u ćeliji primaocu, in vivo i/ili ex vivo. Ekspresiona kaseta može biti insertovana u vektor radi ciljanja u želјenu ćeliju domaćina i/ili pojedinca. Ekspresiona kaseta može biti insertovana u plazmid, kosmid, virus, autonomno replikativni polinukleotidni molekul, fag, u obliku linearne ili kružne, jednolančane ili dvolančane DNK ili RNK molekula polinukleotida, izvedenog iz bilo kog izvora, sposobnog za genomsku integraciju ili
1
autonomnu replikaciju, uklјučujući molekul nukleinske kiseline u kojem je jedna ili više sekvenci nukleinskih kiselina povezano na funkcionalno-operativan način, tj. operabilno povezano.
[0110] Ovde su takođe obezbeđeni vektori, plazmidi ili virusi koji sadrže jedan ili više molekula nukleinskih kiselina koji kodiraju bilo koji himerni receptor ili Hinge-Notch receptor koji je ovde opisan. Molekuli nukleinske kiseline mogu biti u vektoru koji je sposoban da usmeri ekspresiju u, na primer, ćeliju koja je transformisana/transdukovana vektorom. Pogodni vektori za upotrebu u eukariotskim i prokariotskim ćelijama su poznati u tehnici i komercijalno su dostupni, ili ih može lako pripremiti kvalifikovan stručnjak. Vidi na primer u: Sambrook, J., & Russell, D. W. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory and Sambrook, J., & Russel, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory (jointly referred to herein as "Sambrook"); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Wiley (including supplements through 2014); Bollag, D. M. et al. (1996). Protein Methods. New York, NY: Wiley-Liss; Huang, L. et al. (2005). Nonviral Vectors for Gene Therapy. San Diego: Academic Press; Kaplitt, M. G. et al. (1995). Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications. San Diego, CA: Academic Press; Lefkovits, I. (1997). The Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques. San Diego, CA: Academic Press; Doyle, A. et al. (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York, NY: Wiley; Mullis, K. B., Ferr6, F. & Gibbs, R. (1994). PCR: The Polymerase Chain Reaction. Boston: Birkhauser Publisher; Greenfield, E. A. (2014). Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.). New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Beaucage, S. L. et al. (2000). Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. New York, NY: Wiley, (including supplements through 2014); and Makrides, S. C. (2003). Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Amsterdam, NL: Elsevier Sciences B.V.).
[0111] DNK vektori se mogu uvesti u eukariotske ćelije putem konvencionalnih tehnika transformacije ili transfekcije. Odgovarajući postupci za transformaciju ili transfekciju ćelija domaćina mogu se naći u Sambrooku et al. (2012, supra) i drugim standardnim laboratorijskim priručnicima za molekularnu biologiju, kao što su transfekcija kalcijum fosfatom, transfekcija posredovana DEAE-dekstranom, posredovana transfekcija, mikroinjekcija, transfekcija posredovana katjonskim lipidima, elektroporacija, transdukcija, „scrape loading”, „ballistic introduction”, nukleoporacija i infekcija.
[0112] Virusni vektori koji se mogu koristiti u predmetnom pronalasku obuhvataju, na primer, vektore retrovirusa, vektore adenovirusa i vektore virusa koji su povezani sa adenovirusom, vektore lentivirusa, herpes virus, Simijan virus 40 (SV40) i vektore goveđeg papiloma virusa (videti, npr., Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Na primer, himerni receptor kao što je ovde opisan može se proizvesti u eukariotskom domaćinu, kao što su ćelije sisara (npr. COS ćelije, NIH 3T3 ćelije ili HeLa ćelije). Ove ćelije su dostupne iz mnogih izvora, uklјučujući American Type Culture Collection (Manassas, VA). Prilikom odabira ekspresionog sistema, treba voditi računa o tome da komponente budu kompatibilne jedna sa drugom. Stručnjaci ili sa uobičajenim veštinama u oblasti su u stanju da donesu takvu odluku. Štaviše, ako su potrebne smernice u odabiru ekspresionog sistema, kvalifikovani stručnjaci mogu biti konsultovati (P. Jones, “Vectors: Cloning Applications", John Wiley and Sons, New York, N.Y., 2009).
[0113] Obezbeđeni molekuli nukleinskih kiselina mogu da sadrže sekvence koje se javlјaju u prirodi, ili sekvence koje se razlikuju od onih koje se javlјaju u prirodi, ali, zbog degeneracije genetskog koda, kodiraju isti polipeptid, npr., antitelo. Ovi molekuli nukleinskih kiselina mogu se sastojati od RNK ili
2
DNK (na primer, genomske DNK, cDNK ili sintetičke DNK, kao što je ona proizvedena sintezom zasnovanom na fosforamiditu), ili kombinacije ili modifikacije nukleotida unutar ovih tipova nukleinskih kiselina. Pored toga, molekuli nukleinskih kiselina mogu biti dvolančani ili jednolančani (npr., bilo sense ili antisense lanac).
[0114] Molekuli nukleinskih kiselina nisu ograničeni na sekvence koje kodiraju polipeptide (npr. antitela); neke ili sve nekodirajuće sekvence koje leže uzvodno ili nizvodno od kodirajuće sekvence (npr., kodirajuće sekvence himernog receptora) takođe mogu biti uklјučene. Oni sa uobičajenim veštinama u oblasti molekularne biologije su upoznati sa rutinskim procedurama za izolovanje molekula nukleinskih kiselina. Mogu se, na primer, generisati tretmanom genomske DNK restrikcionom endonukleazom, ili putem lančane reakcije polimeraze (PCR). U slučaju da je molekul nukleinske kiseline ribonukleinska kiselina (RNK), molekuli se mogu generisati, npr. in vitro transkripcijom.
Rekombinantne ćelije i ćelijske kulture
[0115] Nukleinska kiselina predmetnog pronalaska može se uvesti u ćeliju domaćina, kao što je, na primer, humani T limfocit, da bi nastala rekombinantna ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline. Shodno tome, neki primeri izvođenja se odnose na postupke za dobijanje rekombinantne ćelije, koji uklјučuju (a) obezbeđivanje ćelije sposobne za ekspresiju proteina i (b) dovođenje u kontakt ove ćelije sa rekombinantnom nukleinskom kiselinom pronalaska.
[0116] Uvođenje molekula nukleinske kiseline predmetnog pronalasku u ćelije može se postići postupcima koji su poznati stručnjacima u oblasti. Ovi postupci su, na primer, virusna infekcija, transfekcija, konjugacija, fuzija protoplasta, lipofekcija, elektroporacija, nukleofekcija, precipitacija kalcijumfosfatom, transfekcija posredovana polietileniminom (PEI), transfekcija posredovana DEAE-dekstranom, transfekcija posredovana lipozomima, tehnologija „particle gun”, precipitacija kalcijumfosfatom, direktna mikro-injekcija, unošenje nukleinske kiseline posredovana nanočesticama i slično.
[0117] Shodno tome, u nekim realizacijama, molekuli nukleinske kiseline mogu se uneti u ćeliju pomoću virusnih ili nevirusnih nosača koji su poznati u tehnici. Na primer, molekul nukleinske kiseline može biti stabilno integrisan u genom domaćina, ili može biti epizomalno repliciran, ili prisutan u rekombinantnoj ćeliji domaćina kao mali kružni ekspresioni vektor za prolaznu ekspresiju. Shodno tome, u nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline se održava i replikuje u rekombinantnoj ćeliji domaćinu kao epizomalna jedinica. U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline je stabilno integrisan u genom rekombinantne ćelije. Stabilna integracija se može postići upotrebom klasičnih nasumičnih genomskih rekombinantnih tehnika ili preciznijim tehnikama kao što je RNK-vođeno CRISPR/Cas9 editovanje genoma ili editovanje genoma DNK-vođenom endonukleazom sa NgAgo (Natronobacterium gregorii Argonaute), ili TALENs editovanje genoma (eng., transcription activatorlike effector nucleases). U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline je prisutan u rekombinantnoj ćeliji domaćinu kao mali kružni ekspresioni vektor za prolaznu ekspresiju.
[0118] Molekuli nukleinske kiseline mogu biti inkapsulirani u virusni kapsid ili lipidne nanočestice, ili se mogu uneti u ćeliju virusnim ili nevirusnim sredstvima i postupcima koji su poznati u tehnici, kao što je elektroporacija. Na primer, uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije može se postići virusnom transdukcijom. U primeru koji nije ograničen, adeno-asocirani virus (AAV) je konstruisan tako da vrši isporuku nukleinske kiseline cilјnim ćelijama putem virusne transdukcije. Opisano je nekoliko AAV serotipova, i svi poznati serotipovi mogu inficirati ćelije iz različitih tipova tkiva. AAV je sposoban da transdukuje širok spektar vrsta i tkiva in vivo bez dokaza o toksičnosti, pri čemu izaziva relativno blage urođene i adaptivne imunske odgovore.
[0119] Vektorski sistemi izvedeni iz lentivirusa se takođe koriste za unošenje nukleinske kiseline i gensku terapiju putem virusne transdukcije. Lentivirusni vektori imaju nekoliko atraktivnih svojstava kao nosači za unos gena, koja uključuju: (i) kontinuiran unos gena kroz stabilnu integraciju vektora u genom domaćina; (ii) sposobnost inficiranja i ćelija koje se dele i ćelija koje se ne dele; (iii) tropizam različitih tkiva, uklјučujući važne tipove cilјnih ćelija za gensku i ćelijsku terapiju; (iv) odsustvo ekspresije virusnih proteina nakon vektorske transdukcije; (v) sposobnost da se unesu složeni genetski elementi, kao što su policistronske sekvence ili sekvence koje sadrže introne; (vi) potencijalno bezbedniji profil mesta za integraciju; i (vii) relativno lak sistem za manipulaciju i proizvodnju vektora.
[0120] U nekim realizacijama, ćelije domaćini mogu biti genetski projektovane (npr.transdukovane ili transformisane ili transfekovane) sa, na primer, vektorskim konstruktom ove aplikacije koja može biti, na primer, virusni vektor ili vektor za homolognu rekombinaciju koji uklјučuje sekvence nukleinske kiseline homologne delu genoma domaćina ćelija, ili može biti ekspresioni vektor za ekspresiju polipeptida od interesa. Ćelije domaćini mogu biti ili netransformisane ćelije ili ćelije u kojima je već izvršena transfekcija sa najmanje jednim molekulom nukleinske kiseline.
[0121] U nekim primerima izvođenja, rekombinantna ćelija je prokariotska ili eukariotska ćelija. U nekim primerima izvođenja, ćelija je ex vivo. U nekim primerima izvođenja, ćelija je in vitro. U nekim primerima izvođenja, rekombinantna ćelija je eukariotska ćelija. U nekim primerima izvođenja, rekombinantna ćelija je životinjska ćelija. U nekim primerima izvođenja, životinjska ćelija je ćelija sisara. U nekim primerima izvođenja, životinjska ćelija je humana ćelija. U nekim primerima izvođenja, ćelija je ćelija primata koja nije humana. U nekim primerima izvođenja, ćelija sisara je imunska ćelija, neuron, epitelna ćelija i endotelna ćelija, ili matična ćelija. U nekim primerima izvođenja, rekombinantna ćelija je ćelija imunskog sistema, npr. limfocit (npr., T ćelija ili NK ćelija), ili dendritska ćelija. U nekim primerima izvođenja, imunska ćelija je B ćelija, monocit, urođenoubilačka ćelija (NK), bazofil, eozinofil, neutrofil, dendritska ćelija, makrofag, regulatorna T ćelija, pomoćnička T ćelija (TH), citotoksična T ćelija (TCTL), ili druge T ćelije. U nekim primerima izvođenja, ćelija imunskog sistema je T limfocit.
[0122] U nekim realizacijama, ćelija je matična ćelija. U nekim realizacijama, ćelija je hematopoetska matična ćelija. U nekim realizacijama ćelija, ćelija je limfocit. U nekim realizacijama, ćelija je prekursorska T ćelija ili T regulatorna (Treg) ćelija. U nekim realizacijama, ćelija je CD34+, CD8+ ili CD4+ ćelija. U nekim realizacijama, ćelija je CD8+ citotoksična T limfocitna ćelija izabrana iz grupe koju čine naivne CD8+ T ćelije, CD8+ T ćelije centralne memorije, CD8+ T ćelije efektorske memorije i CD8+ T ćelije u masi. U nekim realizacijama ćelije, ćelija je CD4+ T pomoćnička limfocitna ćelija izabrana iz grupe koju čine naivne CD4+ T ćelije, centralne memorijske CD4+ T ćelije, efektorske memorijske CD4+ T ćelije i ukupne CD4+ T ćelije. U nekim realizacijama, ćelija se može dobiti leukaferezom izvedenom na uzorku dobijenom od subjekta. U nekim realizacijama, subjekat je pacijent.
[0123] U nekim primerima izvođenja, rekombinantna ćelija dalјe uklјučuje prvi i drugi molekul nukleinske kiseline kao što je ovde opisano, pri čemu prvi molekul nukleinske kiseline i drugi molekul nukleinske kiseline nemaju istu sekvencu. U nekim primerima izvođenja, rekombinantna ćelija dalјe uklјučuje prvi i drugi himerni polipeptid ili Hinge-Notch receptor kako je ovde opisano, pri čemu prvi himerni polipeptid ili Hinge-Notch receptor i drugi himerni polipeptid ili Hinge-Notch receptor nemaju
4
istu sekvencu. U nekim realizacijama, prvi himerni polipeptid ili Hinge-Notch receptor moduliše ekspresiju i/ili aktivnost drugog himernog polipeptida ili Hinge-Notch receptora.
[0124] U nekim realizacijama, rekombinantna ćelija dalјe uklјučuje ekspresionu kasetu koja kodira protein od interesa koji je operativno vezan za promotor, pri čemu je ekspresija proteina od interesa modulisana pomoću regulatora transkripcije himernog receptora. U nekim realizacijama, protein od interesa je heterologan za rekombinantnu ćeliju. Heterologni protein je onaj koji se normalno ne nalazi u ćeliji, npr. obično ne proizvodi ta ćelija. U principu, ne postoje posebna ograničenja u pogledu pogodnih proteina čija ekspresija može biti modulisana pomoću regulatora transkripcije himernog receptora. Primeri tipova proteina pogodnih za upotrebu u kompozicijama i postupcima koji su ovde opisani uklјučuju citokine, citotoksine, hemokine, imunomodulatore, pro-apoptotičke faktore, antiapoptotičke faktore, hormone, faktore diferencijacije, faktore dediferencijacije, receptore imunih ćelija ili reportere. U nekim realizacijama, receptor imunske ćelije je T-ćelijski receptor (TCR). U nekim realizacijama, receptor imunske ćelije je himerni antigenski receptor (CAR). U nekim realizacijama, ekspresiona kaseta koja kodira protein od interesa je ugrađena u isti molekul nukleinske kiseline koji kodira himerni receptor prema pronalasku. U nekim realizacijama, ekspresiona kaseta koja kodira protein od interesa je ugrađena u drugi ekspresioni vektor koji je odvojen od molekula nukleinske kiseline koji kodira himerni receptor prema pronalasku. U drugom aspektu, ovde su obezbeđene ćelijske kulture koje uklјučuju najmanje jednu rekombinantnu ćeliju kako je ovde opisano i medijum za kulturu. Uopšteno, medijum za kulturu može biti bilo koji pogodan medijum za gajenje ćelija opisanih ovde. Tehnike za transformaciju širokog spektra gore navedenih ćelija domaćina i vrsta su poznate u tehnici i opisane u tehničkoj i naučnoj literaturi. Shodno tome, ćelijske kulture koje uklјučuju najmanje jednu rekombinantnu ćeliju kao što je ovde opisano takođe su u okviru ove prijave. Postupci i sistemi pogodni za generisanje i održavanje ćelijskih kultura su poznati u tehnici.
Farmaceutske kompozicije
[0125] U nekim primerima izvođenja, nukleinske kiseline i rekombinantne ćelije pronalaska mogu biti ugrađene u kompozicije, uklјučujući farmaceutske kompozicije. Takve kompozicije generalno uklјučuju nukleinske kiseline, i/ili rekombinantne ćelije, i farmaceutski prihvatlјiv ekscipijens, npr., nosač.
[0126] Farmaceutske kompozicije pogodne za injektabilnu upotrebu obuhvataju sterilne vodene rastvore (gde su rastvorlјive u vodi) ili disperzije i sterilne prahove za pripremu sterilnih rastvora za injekcije ili disperzije u trenutku upotrebe. Za intravensku primenu, pogodni nosači uklјučuju fiziološki rastvor, bakteriostatsku vodu, Cremophor EL<™>. (BASF, Parsippany, N.J.) ili fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS). U svim slučajevima, kompozicija treba da bude sterilna i treba da bude tečna u meri u kojoj postoji lako ubrizgavanje. Trebalo bi da bude stabilna u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti zaštićena od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama kao što su bakterije i glјivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća tečnost se može održavati, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata, npr., natrijum dodecil sulfata. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može se postići raznim antibakterijskim i antifungalnim agensima, kao što su na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, askorbinska kiselina, timerosal i sl. U mnogim slučajevima, generalno se uklјučuju u kompoziciju izotonična sredstva, kao što su na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol i natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kompozicija za injekcije može se postići uklјučivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, kao što su na primer, aluminijum monostearat i želatin.
[0127] Sterilni rastvori za injekcije se mogu pripremiti mešanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka koji su gore nabrojani, prema potrebi, nakon čega sledi sterilizacija filtriranjem. Generalno, disperzije se pripremaju mešanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač, koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od gore nabrojanih.
[0128] U nekim realizacijama, himerni polipeptidi i Notch receptori predmetnog pronalaska takođe mogu da se daju transfekcijom ili infekcijom upotrebom postupaka poznatih u tehnici, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, metode opisane u McCaffrey et al. (Nature 418:6893, 2002), Xia et al. (Nature Biotechnol.20:1006-10, 2002), ili Putnam (Am. J. Health Syst. Pharm.53:151-60, 1996, erratum at Am. J. Health Syst. Pharm.53:325, 1996).
POSTUPCI PRONALASKA
[0129] Davanje bilo koje od terapeutskih kompozicija pronalaska, npr. nukleinske kiseline, rekombinantnih ćelija i farmaceutskih kompozicija, mogu se koristiti za lečenje pacijenata sa odgovarajućim zdravstvenim stanjima ili bolestima, kao što su kanceri i hronične infekcije. U nekim primerima izvođenja, nukleinske kiseline, rekombinantne ćelije i farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu biti uključene u terapeutske agense za upotrebu u postupcima lečenja pojedinca koji ima, za koga se sumnja da ima, ili koji može biti pod visokim rizikom za razvoj jednog ili više autoimunskih poremećaja ili bolesti povezanih sa inhibicijom kontrolne tačke. Primeri autoimunskih poremećaja i bolesti mogu uklјučivati, bez ograničenja, celijakiju, dijabetes tipa 1, Grejvsovu bolest, inflamatornu bolest creva, multiplu sklerozu, psorijazu, reumatoidni artritis i sistemski eritematozni lupus.
[0130] Shodno tome, u jednom aspektu, neke realizacije otkrića se odnose na postupke za inhibiciju aktivnosti cilјne ćelije kod pojedinca, postupci uklјučuju davanje pojedincu prve terapije koja uklјučuje jednu ili više nukleinskih kiselina, rekombinantnih ćelija i farmaceutskih kompozicija kao što je ovde opisano, pri čemu prva terapija inhibira cilјnu ćeliju. Na primer, cilјna ćelija može biti inhibirana ako je njena proliferacija smanjena, ako je njeno patološko ili patogeno ponašanje smanjeno, ako je uništena ili ubijena, itd. Inhibicija uklјučuje smanjenje izmerenog patološkog ili patogenog ponašanja za najmanje oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90% ili oko 95%. U nekim realizacijama, postupci uklјučuju davanje pojedincu efektivnog broja rekombinantnih ćelija koje su ovde opisane, pri čemu rekombinantne ćelije inhibiraju aktivnost cilјnih ćelija kod pojedinca. Generalno, cilјne ćelije u metodama opisanim u ovom pronalasku mogu biti bilo koji tip ćelije kod pojedinca i mogu biti, na primer ćelije akutne mijeloidne leukemije, ćelije anaplastičnog limfoma, ćelije astrocitoma, ćelije B-ćelijskog karcinoma, ćelija raka dojke, ćelije raka debelog creva, ćelije ependimoma, ćelije raka jednjaka, ćelije glioblastoma, ćelije glioma, ćelije lejomiosarkoma, ćelije liposarkoma, ćelije raka jetre, ćelije raka pluća, ćelije mantle ćelijskog limfoma, ćelije melanoma, ćelije neuroblastoma, ćelije raka pluća ne-malih ćelija, ćelije oligodendroglioma, ćelija raka jajnika, ćelija raka pankreasa, periferni T-ćelijski limfom, ćelija raka bubrega, ćelija sarkoma, ćelije raka želuca, ćelije karcinoma, ćelije mezotelioma ili ćelije sarkoma. U nekim realizacijama, cilјna ćelija je patogena ćelija.
[0131] U drugom aspektu, neke realizacije otkrića se odnose na postupke za lečenje zdravstvenog stanja (npr. bolesti) kod pojedinca kome je to potrebno. Ovi postupci uklјučuju davanje pojedincu prve terapije koja uklјučuje jednu ili više rekombinantnih ćelija i himerni polipeptid ili Hinge Notch receptor kao što je ovde opisano, i/ili farmaceutske kompozicije kao što je ovde opisano, pri čemu prva terapija tretira zdravstveno stanje pojedinca. U nekim primerima izvođenja, postupci uklјučuju davanje pojedincu prve terapije koja uklјučuje efikasan broj rekombinantnih ćelija kako je ovde opisano, pri čemu rekombinantne ćelije leče zdravstveno stanje.
[0132] U drugom aspektu, neke realizacije otkrića se odnose na postupke za pomoć u lečenju zdravstvenog stanja (npr., bolesti) kod pojedinca kome je to potrebno. Ovi postupci uklјučuju davanje pojedincu prve terapije koja uklјučuje jedan ili više himernih polipeptida, Hinge-Notch receptore, nukleinske kiseline, rekombinantne ćelije i farmaceutske kompozicije kao što je ovde opisano, i drugu terapiju, pri čemu prva i druga terapija zajedno leče bolest kod pojedinca. U nekim primerima izvođenja, postupci uklјučuju davanje pojedincu prve terapije koja uklјučuje efikasan broj rekombinantnih ćelija kao što je ovde opisano, pri čemu rekombinantne ćelije leče zdravstveno stanje.
Davanje rekombinantnih ćelija pojedincu
[0133] U nekim realizacijama, postupci otkrića uklјučuju davanje efikasne količine rekombinantnih ćelija iz otkrića pojedincu kome je potreban takav tretman. Ovaj korak administracije se može postići upotrebom bilo kojeg postupka implantacije u struci. Na primer, rekombinantne ćelije prema pronalasku mogu da se daju kao infuzija direktno u krvotok pojedinca ili da se na drugi način daju pojedincu.
[0134] U nekim realizacijama, postupci koje su ovde opisani uklјučuju administraciju, pri čemu se ovaj termin koristi naizmenično sa terminima „uvođenje“, „implantacija“ i „transplantacija“, rekombinantnih ćelija u individuu, metodom ili putem koji dovodi do barem delimične lokalizacije uvedenih ćelija na želјeno mesto tako da se postigne želјeni efekt(i). Rekombinantne ćelije ili njihovi diferencirani potomci mogu se dati bilo kojim odgovarajućim putem koji omogućava dostavljanje do želјene lokacije kod pojedinca, i gde bar deo primenjenih ćelija ili komponenti ćelija ostaje viabilan. Period viabilnosti ćelija nakon administracije pojedincu može trajati od nekoliko sati, npr., dvadeset četiri sata, do nekoliko dana, do nekoliko godina, ili čak tokom celog životnog veka pojedinca, tzvj. dugotrajno usađivanje.
[0135] Kada se daju profilaktički, rekombinantne ćelije ovde opisane mogu se davati pojedincu pre bilo kog simptoma bolesti ili stanja koje treba lečiti. Shodno tome, u nekim primerima izvođenja profilaktička primena populacije rekombinantnih ćelija sprečava pojavu simptoma bolesti ili stanja.
[0136] Kada se daje terapeutski u nekim realizacijama, rekombinantne ćelije se obezbeđuju u trenutku (ili nakon) pojave simptoma ili indikacija bolesti ili stanja, npr., na početku bolesti ili stanja.
[0137] Za upotrebu u različitim ovde opisanim realizacijama, efikasna količina rekombinantnih ćelija kako je ovde opisano, može biti najmanje 10<2>ćelija, najmanje 5 × 10<2>ćelija, najmanje 10<3>ćelija, najmanje 5 × 10<3>ćelija, najmanje 10<4>ćelija, najmanje 5 × 10<4>ćelija, najmanje 10<5>ćelija, najmanje 2 × 10<5>ćelija, najmanje 3 × 10<5>ćelija, najmanje 4 × 10<5>ćelija, najmanje 5 × 10<5>ćelija, najmanje 6 × 10<5>ćelija, najmanje 7 × 10<5>ćelija, najmanje 8 × 10<5>ćelija, najmanje 9 × 10<5>ćelija, najmanje 1 × 10<6>ćelija, najmanje 2 × 10<6>ćelija, najmanje 3 × 10<6>ćelija, najmanje 4 × 10<6>ćelija, najmanje 5 × 10<6>ćelija, najmanje 6 × 10<6>ćelija, najmanje 7 × 10<6>ćelija, najmanje 8 × 10<6>ćelija, najmanje 9 × 10<6>ćelija, ili višestruko više. Rekombinantne ćelije mogu biti dobijene od jednog ili više donora ili se mogu dobiti iz autolognog izvora. U nekim realizacijama, rekombinantne ćelije se umnože u kulturi pre davanja pojedincu kome su potrebne.
[0138] U nekim realizacijama, davanje kompozicije rekombinantnih ćelija (npr., kompozicija koja uklјučuje veći broj rekombinantnih ćelija prema bilo kojoj od ćelija opisanih ovde) pojedincu metodom ili putem koji dovodi do barem delimične lokalizacije uvedenih ćelija na želјeno mesto. Kompozicija koja uklјučuje rekombinantne ćelije može se davati bilo kojim odgovarajućim putem koji dovodi do efikasnog tretmana pojedinca, npr., administracija koja dovodi do dostavljanja ćelija na želјeno mesto kod pojedinca pri čemu je isporučen barem deo kompozicije, npr., najmanje 1 × 10<4>ćelije, dospeva na želјeno mesto tokom određenog vremenskog perioda. Načini primene uklјučuju injekciju, infuziju, instilaciju. „Injekcija“ uklјučuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intraventrikularnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, intracelebrospinalnu i intrasternalna injekcija i infuzija. U nekim realizacijama, put je intravenski. Za dostavljanje ćelija, unošenje injekcijom ili infuzijom je poželјan način primene.
[0139] U nekim primerima izvođenja, rekombinantne ćelije se daju sistemski, npr., putem infuzije ili injekcije. Na primer, populacija rekombinantnih ćelija se administrira na način koji nije direktno na cilјno mesto, tkivo ili organ, već ulazi u cirkulatorni sistem pojedinca i, prema tome, podleže metabolizmu i drugim sličnim biološkim procesima.
[0140] Efikasnost tretmana koji uklјučuje bilo koju od kompozicija datih ovde za lečenje bolesti ili stanja može odrediti kvalifikovani kliničar. Međutim, stručnjak u ovoj oblasti prepoznaju da se tretman smatra efikasnim ako se bilo koji ili svi znaci ili simptomi ili markeri bolesti pobolјšaju ili pobolјšaju. Efikasnost se takođe može meriti nedostatkom pogoršanja stanja kod pojedinca, što se procenjuje smanjenjem hospitalizacija ili potrebama za medicinskim intervencijama (npr., napredovanje bolesti je zaustavlјeno ili barem usporeno). Postupci merenja ovih indikatora su poznati stručnjacima u ovoj oblasti i/ili su ovde opisani. Tretman uklјučuje bilo koji tretman bolesti kod pojedinca ili životinje (neki neograničavajući primeri uklјučuju ljude ili sisare) i obuhvataju: (1) inhibiciju bolesti, npr., zaustavlјanje ili usporavanje progresije simptoma; ili (2) ublažavanje bolesti, npr., izazivanje regresije simptoma; i (3) sprečavanje ili smanjenje verovatnoće razvoja simptoma.
[0141] Kao što je prethodno diskutovano, terapeutski efikasna količina uklјučuje količinu terapijske kompozicije koja je dovolјna da promoviše određeni korisni efekat kada se daje pojedincu, kao što je onaj za koga se sumnja da ima ili je u opasnosti od bolesti. U nekim primerima izvođenja, efikasna količina uklјučuje količinu dovolјnu da spreči ili odloži razvoj simptoma bolesti, promeni tok simptoma bolesti (na primer, ali nije ograničeno na, uspori napredovanje simptoma bolesti), ili preokrene simptome bolesti. Podrazumeva se da za svaki konkretan slučaj, odgovarajuća efikasna količina može da se odredi od strane prosečnog stručnjaka u ovoj oblasti upotrebom rutinskih eksperimentalnih postupaka.
[0142] U nekim realizacijama opisanih postupaka, pojedinac je sisar. U nekim realizacijama, sisar je čovek. U nekim realizacijama, pojedinac ima ili se sumnja da ima bolest povezanu sa inhibicijom ćelijske signalizacije posredovane ligandom ili antigenom na ćelijskoj površini. Bolesti pogodne za lečenje kompozicijama i postupcima iz pronalaska uklјučuju, ali nisu ograničene na, kancere, autoimunske bolesti, inflamatorne bolesti i infektivne bolesti. U nekim realizacijama, bolest je kancer ili hronična infekcija.
Dodatne terapije
[0143] Kao što je gore diskutovano, rekombinantne ćelije i farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu da se primenjuju u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa kao što su, na primer, hemoterapeutici ili agensi protiv raka ili terapije protiv raka. Primena "u kombinaciji sa" jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa uklјučuje istovremenu (istovremenu) i uzastopnu primenu u bilo kom redosledu. U nekim realizacijama, jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa, hemoterapeutika, agenasa protiv raka ili terapija protiv karcinoma je izabrano iz grupe koju čine hemoterapija, radioterapija, imunoterapija, hormonska terapija, terapija toksinima i hirurgija. "Hemoterapija" i "sredstvo protiv raka" se ovde koriste naizmenično. Mogu se koristiti različite klase sredstava protiv raka. Neograničavajući primeri uklјučuju: agense za alkilovanje, antimetabolite, antracikline, bilјne alkaloide, inhibitore topoizomeraze, podofilotoksin, antitela (npr., monoklonalni ili poliklonalni), inhibitori tirozin kinaze (npr., imatinib mezilat (Gleevec<®>ili Glivec<®>)), hormonski tretmani, rastvorlјivi receptori i drugi antineoplastici.
Metode za modulaciju aktivnosti ćelije
[0144] U drugom aspektu, ovde su obezbeđeni različiti postupci za modulisanje aktivnosti ćelije. Postupci obuhvataju korake: (a) obezbeđivanja efikasne količine bilo koje rekombinantne ćelije pronalaska i (b) dovođenje ćelija u kontakt sa odabranim ligandom, pri čemu vezivanje izabranog liganda za ekstracelularni domen koji vezuje ligand izaziva isecanje na mestu proteolitičkog isecanja indukovanog ligandom i oslobađanje transkripcionog regulatora, pri čemu oslobođeni transkripcioni regulator moduliše aktivnost rekombinantne ćelije. Stručnjak u ovoj oblasti će nakon čitanja ovog otkrića shvatiti da se opisani postupci mogu sprovesti ex vivo, ili in vitro.
[0145] Primeri bez ograničavanja ćelijskih aktivnosti koje se mogu modulisati upotrebom postupaka koji su ovde dati uklјučuju, ali nisu ograničeni na, ekspresiju gena, proliferaciju, apoptozu, smrt ćelije koja nije apoptoza, diferencijaciju, dediferencijaciju, migraciju, sekreciju genskog proizvoda, ćelijsku adheziju, i citolitičku aktivnost.
[0146] U nekim primerima izvođenja, oslobođeni transkripcioni regulator moduliše ekspresiju gena ćelije. U nekim primerima izvođenja, oslobođeni transkripcioni regulator moduliše ekspresiju heterolognog genskog proizvoda u ćeliji. Heterologni genski proizvod je onaj koji se normalno ne nalazi u nativnoj ćeliji, npr., koje obično ne proizvodi ćelija. Na primer, ćelija može biti genetski modifikovana nukleinskom kiselinom koja uklјučuje nukleotidnu sekvencu koja kodira heterologni genski proizvod.
[0147] U nekim primerima izvođenja, heterologni genski proizvod je genski proizvod kojeg ćelija sekretuje. U nekim primerima izvođenja, heterologni genski proizvod je genski proizvod na ćelijskoj površini. U nekim slučajevima, heterologni genski proizvod je intracelularni genski proizvod. U nekim primerima izvođenja, oslobođeni transkripcioni regulator istovremeno moduliše ekspresiju dva ili više heterolognih genskih proizvoda u ćeliji.
[0148] U nekim primerima izvođenja, heterologni genski proizvod u ćeliji je izabran iz grupe koju čine hemokin, receptor hemokina, receptor himernog antigena, citokin, receptor citokina, faktor diferencijacije, faktor rasta, receptor faktora rasta, hormon, metabolički enzim, protein koji potiče od patogena, induktor proliferacije, receptor, RNK-vođena nukleaza, nukleaza specifična za mesto, receptor T-ćelija (TCR), himerni antigenski receptor (CAR), toksin, protein izveden iz toksina, transkripcioni regulator, transkripcioni aktivator, transkripcioni represor, regulator translacije, translacioni aktivator, translacioni represor, aktivirajući imunoreceptor, antitelo, inhibitor apoptoze, induktor apoptoze, projektovani T ćelijski receptor, imuno-aktivator, imuno-inhibitor i inhibirajući imunoreceptor.
[0149] U nekim primerima izvođenja, oslobođeni transkripcioni regulator moduliše diferencijaciju ćelije, gde je ćelija imunska ćelija, matična ćelija, progenitorna ćelija ili prekursorska ćelija.
[0150] Himerni receptori predmetnog pronalasku pružaju viši stepen ekspresije od standardnog SynNotch receptora kada se koriste identični vezujući domeni i ICD-ovi. U zavisnosti od para liganda i vezujućeg domen, i njihovog afiniteta, himerni polipeptidi ili Hinge-Notch receptori iz otkrića mogu obezbediti povećanje ekspresije za oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35 %, oko 40%, oko 45%, ili oko 50% više od odgovarajućeg SynNotch receptora.
[0151] Dodatno, himerni receptori predmetnog pronalaska mogu obezbediti regulaciju transkripcije koja reaguje na stepen aktivacije T ćelija nezavisno od vezivanja liganda. Na primer, kada se eksprimiraju u T ćeliji, neki receptori prema pronalasku obezbeđuju jači signal indukovan ligandom kada je T-ćelija aktivirana u poređenju sa signalom indukovanim ligandom kada T-ćelija nije aktivirana. Ovo omogućava dodatnu fleksibilnost u upotrebi, na primer u slučajevima kada se želi pojačati ili suprimirati odgovor T ćelija kada se aktivira uprkos odsustvu liganda himernog receptora.
SISTEMI I KOMPLETI
[0152] Ovde su takođe obezbeđeni sistemi i kompleti koji uklјučuju himerne polipeptide, Hinge-Notch receptore, rekombinantne nukleinske kiseline, rekombinantne ćelije ili farmaceutske kompozicije koje su ovde date i opisane, kao i pisana uputstva za dobijanje i korišćenje istih. Na primer, ovde su obezbeđeni, u nekim realizacijama, sistemi i/ili kompleti koji uklјučuju jedan ili više od: himernog polipeptida kao što je ovde opisano, Hinge-Notch receptora kao što je ovde opisano, rekombinantne nukleinske kiseline kao što je ovde opisano, rekombinantne ćelije kao što je ovde opisano, ili farmaceutske kompozicije kao što je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, sistemi i/ili kompleti iz ovog otkrića dalјe uklјučuju jedan ili više špriceva (uklјučujući prethodno napunjene špriceve) i/ili katetera (uklјučujući prethodno napunjene špriceve) koji se koriste za davanje pojedincu jednog od obezbeđenih himernih polipeptida, Hinge- Notch receptora, rekombinantnih nukleinskih kiselina, rekombinantnih ćelija ili farmaceutskih kompozicija. U nekim primerima izvođenja, komplet može imati jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa koji se mogu davati istovremeno ili uzastopno sa drugim komponentama kompleta za postizanje želјenog efekta, npr., za modulaciju aktivnosti ćelije, inhibiranje cilјne ćelije kancera ili lečenje zdravstvenog stanja (npr. bolesti) kod pojedinca kome je to potrebno.
[0153] Bilo koji od gore opisanih sistema i kompleta može dalјe da sadrži jedan ili više dodatnih reagensa, pri čemu se takvi dodatni reagensi mogu izabrati između: pufera za razblaživanje; rastvora za rekonstituciju, pufera za ispiranje, kontrolnih reagenasa, kontrolnih vektora ekspresije, polipeptida negativne kontrole, polipeptida pozitivne kontrole, reagenasa za in vitro proizvodnju polipeptida himernih receptora.
[0154] U nekim realizacijama, komponente sistema ili kompleta mogu biti u odvojenim kontejnerima. U nekim drugim realizacijama, komponente sistema ili kompleta mogu biti kombinovano u jednom kontejneru.
4
[0155] U nekim realizacijama, sistem ili komplet može dalјe da sadrži uputstva za korišćenje komponenti kompleta za izvođenje postupka. Uputstva za izvođenje postupka su uglavnom snimlјena na odgovarajućem medijumu za snimanje. Na primer, uputstva se mogu odštampati na podlozi, kao što je papir ili plastika, itd. Uputstva se mogu nalaziti u kompletima kao umetak u pakovanju, na etiketi kontejnera kompleta ili njegovih komponenti (tj., povezano sa ambalažom ili pod pakovanjem), itd. Instrukcije mogu biti elektronski fajl podataka za skladištenje na odgovarajućem računarskom čitlјivom medijumu za skladištenje, e.g. CD-ROM, disketa, fleš disk, itd. U nekim slučajevima, prava uputstva za upotrebu kompleta ne moraju biti u samom kompletu, već samo instrukcije za dobijanje uputstva sa udalјenog izvora (e.g., putem interneta). Primer ove realizacije je komplet koji uklјučuje veb adresu na kojoj se uputstva mogu videti i/ili sa koje se uputstva mogu preuzeti. Kao i kod uputstva, ova informacija za dobijanje instrukcija može se snimiti na odgovarajuću podlogu.
[0156] Ne priznaje se da bilo koja ovde citirana referenca predstavlјa prethodno stanje tehnike. Diskusija o referencama navodi ono što njihovi autori tvrde, a pronalazači zadržavaju pravo da ospore tačnost i relevantnost citiranih dokumenata. Jasno se podrazumeva da, iako se ovde pominju brojni izvori informacija, uklјučujući članke iz naučnih časopisa, patentne dokumente i udžbenike; takvo poimanje ne predstavlјa priznanje da bilo koji od ovih dokumenata čini deo osnovnog opšteg znanja u struci.
[0157] Diskusija o opštim postupcima datim ovde je namenjena samo u ilustrativne svrhe.
PRIMERI
[0158] Praksa ovog predmetnog pronalaska će koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike molekularne biologije, mikrobiologije, ćelijske biologije, biohemije, hemije nukleinskih kiselina i imunologije, koje su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u gore citiranoj literaturi.
[0159] Dodatna izvođenja su razotkrivena detalјnije u sledećim primerima, koji su dati kao ilustracija i ni na koji način nisu namenjeni da ograniče obim ovog otkrića ili patentnih zahteva.
PRIMER 1
Dizajn i konstrukcija himernih receptora i elemenata odgovora konstrukata
[0160] Ovaj primer opisuje dizajn i konstrukciju familije himernih Notch receptora. Detalјne informacije o različitim primerima receptora otkrića mogu se naći u Tabelama 1 i 2 ispod.
TABELA 1. Ova tabela daje kratak opis za svaki od himernih Notch receptora, njihovih odgovarajućih komponenti, kao i odgovarajućih identifikatora sekvenci kako je navedeno u Listi sekvenci. ECD: ekstracelularni domen; N-JMD: N-terminalni jukstamembranski domen (tj., domen zgloba); TMD: transmembranski domen; STS: sekvenca za zaustavljanje transfera; TF: transkripcioni faktor.
4 TABELA 2. Ova tabela daje kratak opis za svaki od himernih Notch receptora i odgovarajuće komponente (sa komponentama odvojenim zarezima). Osim ako nije drugačije naznačeno, unos se odnosi na protein humanog porekla. Na primer, „Notchl, Notchl“ označava da su dve sekvence iz Notchl-a fuzionisane da bi bio generisan ovaj proteinski modul.
4
[0161] Himerni receptori opisani u Tabelama 1-2 iznad napravljeni su spajanjem jednolančanog antigen-vezujućeg fragmenta (scFv) koji prepoznaje CD19 (Porter DL et al., 2011), ALPPL2 (FYIA), BCMA, Her2 ili anti-BCMA potpuno humanizovani VHdomen, na odgovarajući receptorsku potku i sintetički transkripcioni regulator GAL4-VP64. Za nastanak ovih receptora, fragmenti DNK koji kodiraju sekvence aminokiselina date u Tabeli 1 i Listi sekvenci su PCR amplifikovani iz sintetizovanih fragmenata gena ili plazmida koji sadrže DNK sekvencu za navedeni protein, i sastavlјeni upotrebom standardnih tehnika kloniranja (e.g., „overhang“ PCR, fuzioni PCR i kloniranje u fuziji) sa bočnim
4
sekvencama početka i zaustavlјanja translacije, u BamHI mestu kloniranja lentivirusnog vektora ekspresije pHR-SIN-pGK (L. Morsut et al., Cell (2016) 164:780-91; Addgene plazmid #76120).
[0162] Transkripcioni regulator GAL4-VP64 korišćen u ovim eksperimentima sadržao je DNK domen transkripcionog faktora GAL4 kvasca fuzionisanog sa aktivacionim domenom VP64, koji se sastoji od tetramernog ponavlјanja domena minimalne aktivacije (aminokiseline 437-447) herpes simpleks proteina VP16 . Kao što je ilustrovano u Tabeli 2, većina primera receptora je sadržala N-terminalni CD8α signalni peptid (MALPVTALLLPLALLLHAARP) (SEQ ID NO: 21) za cilјanu primenu na membrani, dok je jedan primerni receptor (pIZ343eGFP) sadržao mišji IgKVIII signalni peptid. Pored toga, većina primera receptora sadržala je mic-oznaku (eng., „myc-tag“) (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO: 22) za pogodno određivanje ekspresije na površini sa antitelom konjugovanim sa fluorescentnom bojom (α-myc A647<®>, Cell Signaling Technology, Cat #2233). Svaki od receptora je kloniran u modifikovani lentivirusni vektor pHR'SIN:CSW (KT Roybal et al., Cell 2016, 6. oktobar; 167(2):419-32) koji je sadržao promotor fosfoglicerat kinaze (PGK) za sve eksperimente primarne T ćelije opisane u Primerima 3-4 u nastavku.
[0163] Vektor pHR'SIN:CSW je takođe modifikovan da produkuje regulatorne elemente odgovora plazmida. U tu svrhu, pet kopija cilјne sekvence za vezivanje GAL4 DBD domena (GGAGCACTGTCCTCCGAACG) (SEQ ID NO: 23) je klonirano na 5' kraj minimalnog pybTATA promotora. Takođe je uklјučen u elemente odgovora plazmida i PGK promotor koji konstitutivno pokreće ekspresiju žutog fluorescentnog reporter proteina (mCitrine) da bi se na odgovarajući način identifikovale uspešno transdukovane T ćelije.
[0164] Za konstrukciju svih inducibilnih BFP vektora, kodirajuća sekvenca za plavi fluorescentni reporter protein (BFP) je klonirana preko BamHI mesta u okviru višestrukog mesta za kloniranje koje se nalazi 3' od GAL4 regulatonog elementa odgovora. Za konstrukciju svih inducibilnih CAR vektora, CAR-ovi su označeni na C-kraju sa zelenim fluorescentnim reporter proteinom (GFP) i klonirani su preko BamHI mesto u okviru višestrukog mesta za kloniranje koje se nalazi 3' od GAL4 regulatonog elementa odgovora. Svi konstrukti su klonirani upotrebom kompleta za kloniranje (In-Fusion<®>cloning, Clontech #ST0345) prema uputstvima proizvođača.
PRIMER 2
Izolacija i kultura primarnih humanih T-ćelija
[0165] Ovaj primer opisuje izolaciju i kulturu primarnih humanih T ćelija koje su kasnije korišćene u različitim eksperimentima transdukcije ćelija opisanim u Primeru 3 ispod.
[0166] U ovim eksperimentima primarne CD4<+>i CD8<+>T ćelije su izolovane iz krvi nakon afereze i obogaćene negativnom selekcijom upotrebom kompleta za izolaciju humanih T-ćelija (Human CD4<+>ili CD8<+>enrichment cocktail; STEMCELL Technologies Cat #15062 i 15063). Krv je dobijena iz centara za krv Pacifika (San Francisko, Kalifornija) uz odobrenje Univerzitetskog institucionalnog odbora za etiku. T ćelije su kriokonzervirane u medijumu za rast (RPMI-1640, UCSF cell culture core) sa 20% humanog AB seruma (Valley Biomedical Inc., #HP1022) i 10% DMSO. Nakon odmrzavanja, T ćelije su kultivisane u medijumu za humane T ćelija koji sadrži X-VIVO<™>15 (Lonza #04-418Q), 5% humanog AB seruma i 10 mM neutralizovanog N-acetil L-cisteina (Sigma-Aldrich #A9165) sa dodatkom 30 jedinica/mL IL-2 (NCI BRB Preclinical Repository) za sve eksperimente.
4
PRIMER 3
Humane T ćelije su stabilno transdukovane lentivirusnim vektorima
[0167] Primer opisuje opšti protokol koji se koristi za lentivirusnu transdukciju humanih T ćelija, osim ako nije drugačije navedeno u ovoj specifikaciji.
[0168] Generalno, lentivirusni vektori pseudotipizirani sa G proteinom omotača virusa vezikularnog stomatitisa (VSV-G) (pantropski vektori) proizvedeni su transfekcijom Lenti-X<™>293T ćelije (Clontech #11131D) sa pHR'SIN:CSW transgenskim ekspresionim vektorom i plazmidima za pakovanje virusa pCMVdR8.91 i pMD2.G uz upotrebu Mirus TransIT<®>-Lenti (Mirus, #MIR 6606). Uopšteno, primarne T ćelije su odmrznute istog dana i, nakon 24 sata u kulturi, stimulisane su kuglicama koje imaju anti-CD3 i anti-CD28 antitela vezana za površinu (Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads<®>, Life Technologies #11131D) u odnosu ćelija:perla 1:3. Nakon 48 sati, virusni supernatant je sakuplјen i primarne T ćelije su izložene virusu tokom 24 sata. Petog dana nakon stimulacije T-ćelija, kuglice su uklonjene, a T ćelije su se dalje gajene do 14. dana kada su mirovale i mogle su da se koriste u testovima. T ćelije su sortirane za testove sa protočnim citometrom Beckton Dickinson (BD Biosciences) FACSAria<™>II. T ćelije koje su pokazivale bazalnu ekspresiju CAR su izuzete tokom sortiranja.
PRIMER 4
In vitro stimulacija primarnih T ćelija
[0169] Ovaj primer opisuje eksperimente izvedene da bi se pokazala in vitro stimulacija primarnih T ćelija ovde opisanim himernim polipeptidima Hinge-Notch, osim ako nije drugačije navedeno u ovoj specifikaciji.
[0170] Za sve in vitro stimulacije T-ćelija, 1 × 10<5>T ćelija je gajeno u kulturi zajedno sa ćelijama pošilјaocima u odnosu 1:1 u pločama za kulturu tkiva sa 96 bunarčića sa ravnim dnom. Aktivacija reportera je analizirana u kulturi nakon 24 sata pomoću BD Fortessa<™>X-50. Sve analize protočne citometrije su izvedene u FlowJo<™>softveru (TreeStar, Inc.).
PRIMER 5
Dizajn CD8Hinge-Notch receptora, ekspresija i aktivacija u primarnim T CD4<+>T ćelijama
[0171] Ovaj primer opisuje dizajn CD8Hinge-Notch receptora i rezultate eksperimenata koji su izvedeni da bi se procenila njihova ekspresija i aktivacija u primarnim T CD4<+>T ćelijama. Konstruisane su dve varijante CD8Hinge-Notch receptora. Kao što je prikazano na Slici 2A, primer SynNotch1 receptora je prikazan na levom panelu, gde je receptor dizajniran na osnovu humanih Notchl proteina. Srednji panel šematski prikazuje primer CD8 Hinge-Notch1 receptora. U poređenju sa SynNotch1 receptorom na levom panelu, CD8 Hinge-Notch1 receptori zamenjuju NRR sa CD8 zglobnim domenom, koji sadrži ostatke cisteina za koje se zna da formiraju disulfidne veze. Desni panel šematski prikazuje primere skraćenih CD8 Hinge-Notch1 receptora (truncCD8 Hinge-Notch1). U poređenju sa CD8 Hinge-Notch1 receptorima, truncCD8 Hinge-Notchl receptori sadrže C-terminalnu deleciju sekvence CD8 zgloba, pri čemu ostaju jedan cisteinski ostatak i kraći ekstracelularni region. Slika 2B je rezime podataka dobijenih protočnom citometrijom ekspresije receptora. U ovim eksperimentima, primarne humane T-ćelije su aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna
4
konstrukta koji eksprimiraju ili receptor ili transkripcioni reporterski konstrukt. Ekspresija receptora je merena upotrebom anti-myc antitela obeleženog sa AlexaFluor647 (Cell Signaling). Ekspresija reportera je merena preko konstitutivnog eksprimiranog mCitrine gena koji se nalazi na reporterskom plazmidu. Dvostruko pozitivne ćelije su sortirane petog dana nakon početne stimulacije T-ćelija i dalјe korišćene za testiranje aktivacije. Slika 2C sumira rezultate testiranja aktivacije receptora. U ovim eksperimentima, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi zajedno sa: bez dodataka (gornji trag), 1 × 10<5>K562 ćelija (srednji trag), ili 1 × 10<5>CD19+ K562 ćelija (donji trag) tokom 24 sata. Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Rezultati opisani u ovom primeru pokazuju da su i CD8Hinge-Notch receptor i truncCD8 Hinge-Notchl eksprimirani u primarnim T CD4<+>T ćelijama.
PRIMER 6
Aktivacija CD8Hinge receptora uz stimulaciju T-ćelija
[0172] Ovaj primer opisuje rezultate eksperimenata izvedenih da bi se demonstrirala aktivacija gena uz pomoć CD8Hinge-Notch receptora opisanih ovde sa istovremenom aktivacijom T-ćelija. Ovi eksperimenti su sprovedeni upotrebom istih CD8Hinge-Notch varijanti receptora opisanih iznad u Primeru 5. Rezultati testiranja aktivacije receptora sa istovremenom aktivacijom T-ćelija prikazani su na Slici 3B. U ovim eksperimentima, za simulaciju aktivacije T-ćelija, korišćeni su anti-MCAM, anti-CD3 Bi-specifični T-cell Engagers (MCAM BiTEs), koji aktiviraju receptor T-ćelije u prisustvu K562 ćelija.1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi sa: MCAM BiTEs (gornji trag), 1 × 10<5>K562 ćelija MCAM BiTE (srednji trag), ili 1 × 10<5>CD19+ K562 ćelija MCAM BiTE (donji trag) tokom 24 sata. Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Rezultati opisani u ovom primeru pokazuju da i CD8Hinge-Notch receptor i truncCD8 Hinge-Notchl mogu aktivirati transkripciju sa ili bez istovremene aktivacije T-ćelija.
PRIMER 7
CD8Hinge optimizacija
[0173] Ovaj primer opisuje rezultate eksperimenata izvedenih za optimizaciju domena zgloba CD8 u kontekstu himernih Notch receptora. Testirane su četiri varijante domena zgloba CD8: truncCD8 Hinge1, truncCD8 Hinge2, truncCD8 Hinge3 i truncCD8 Hinge4. Strukturne razlike između ovih CD8 varijanti domena zgloba su prikazane na Slici 4A, gde su komponente zgloba označene kao „a“, „b“, „c“ i „d“. Komponenta „a“ predstavlјa region N-kraja prvog ostatka cisteina. Komponenta „b“ predstavlјa prvi cisteinski ostatak. Komponenta „c“ predstavlјa region između prvog i drugog ostataka cisteina. Komponenta „d“ predstavlјa drugi cisteinski ostatak i region od drugog ostatka cisteina do receptorskog transmembranskog domena. Slika 4B sumira rezultate testiranja aktivacije receptora u Jurkat T-ćelijama. Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Slika 4C prikazuje kvantifikaciju %BFP pozitivnih ćelija iz podataka sa Slike 4B. Rezultati opisani u ovom primeru pokazuju da sve četiri varijante domena zgloba CD8 mogu da aktiviraju transkripciju, merenu preko nivoa ekspresije BFP. Međutim, receptori
4
truncCD8 Hinge1 i 2-Notch1 su optimalni po tome što aktiviraju transkripciju do visokih nivoa sa ligandom i pokazuju minimalnu regulaciju transkripcije nezavisnu od liganda (Slika 4B).
PRIMER 8
Testiranje aktivacije receptora TruncCD8Hinge2 uz istovremenu PKC signalizaciju
[0174] Ovaj primer opisuje rezultate eksperimenata izvedenih radi testiranja aktivacija gena posredovane truncCD8Hinge2 receptorom opisanim u Primeru 7 iznad, uz istovremenu signalizaciju preko PKC. U ovim eksperimentima, za stimulaciju PKC signalizacije, dodat je forbol 12-miristat 13-acetat (PMA), DAG analog. Kao što je prikazano na Slici 5, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi zajedno sa: bez dodatnih ćelija (gornji trag), 1 × 10<5>K562 ćelija (srednji trag), ili 1 × 10<5>CD19+ K562 ćelija (donji trag) tokom 24 sata, sa i bez PMA. Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Rezultati opisani u ovom primeru pokazuju da truncCD8 Hinge2-Notch1 može da aktivira transkripciju sa ili bez istovremene PKC signalizacije.
PRIMER 9
Testiranje domena zgloba iz alternativnih izvora
[0175] Ovaj primer opisuje rezultate eksperimenata izvedenih sa Hinge-Notch receptorima koji sadrže alternativne domene zgloba izvedene iz drugih izvora. U ovim eksperimentima, Hinge-Notch receptori su konstruisani sa domenom zgloba koji potiče od CD28, OX40 i IgG4 (vidi, npr. Slika 6A). Ispitana su četiri primera Hinge-Notch receptora: pIZ343 (skraćeni CD8Hinge2-Notch), pIZ358 (CD28Hinge-Notch), pIZ360 (OX40Hinge-Notch), pIZ359 (IgG4Hinge-Notch). Kratak opis za svaki od Hinge-Notch receptora je takođe dat u Tabeli 2. Kao što je prikazano na Slici 6B, svaka od Hinge-Notch konstrukcija pIZ343 (skraćeni CD8Hinge-Notch), pIZ358 (CD28Hinge-Notch), pIZ360 (OX40Hinge-Notch), pIZ359 (IgG4Hinge-Notch) su bile u stanju da stimulišu primarne T ćelije što je procenjeno ekspresijom BFP reporter gena. Prethodno generisana reporterski pozitivna Jurkat T-ćelijska linija je transdukovana konstruktom receptora. Ekspresija receptora je merena upotrebom anti-myc antitela obeleženih sa AlexaFluor647 (Cell Signaling). Za testiranje aktivacije receptora, 1 × 10<5>Jurkat T-ćelije koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je kultivisano tokom 24 sata zajedno sa: bez dodataka (gornji trag), 1 × 10<5>K562 ćelija (srednji trag), ili 1 × 10<5>CD19+ K562 ćelija (donji trag). Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences).
Slika 6B prikazuje kvantifikaciju %BFP pozitivnih ćelija iz rezultata testiranja sa Slike 6A. Eksperimenti opisani u ovom primeru pokazuju da pored CD8A, drugi upotreblјivi domeni zgloba mogu biti izvedeni iz alternativnih izvora kao što su CD28, OX40 i IgG4.
PRIMER 10
Testiranje Hinge-Notch receptora koji sadrže alternativne domene za prepoznavanje liganda
[0176] Ovaj primer opisuje rezultate eksperimenata izvedenih radi testiranja Hinge-Notch receptora koji sadrže alternativne domene za prepoznavanje liganda.
[0177] Kao što je prikazano na Slici 7A, pored anti-CD19 scFV, takođe su korišćeni kao domeni za prepoznavanje liganda anti-ALPPL2 scFV i eGFP. Kao što je prikazano na Slici 7B, prethodno generisana reporterska pozitivna Jurkat T-ćelijska linija je transdukovana konstruktom receptora. Ekspresija receptora je merena upotrebom anti-myc antitela obeleženih sa AlexaFluor647 (Cell Signaling). Za testiranje aktivacije receptora, 1 × 10<5>Jurkat T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi zajedno sa: bez dodataka (gornji trag), 1 × 10<5>K562 ćelija (srednji trag), ili 1 × 10<5>ALPPL2+ K562 ćelija/1 × 10<5>K562 ćelija koje eksprimiraju anti-GFP nanotelo na površini ćelije (donji trag) tokom 24 sata. Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Eksperimenti opisani u ovom primeru pokazuju da pored CD19, drugi upotreblјivi domeni za prepoznavanje liganda mogu biti izvedeni iz alternativnih izvora.
PRIMER 11
Testiranje Hinge-Notch receptora koji sadrže alternativne stop-transfer sekvence (STS).
[0178] Ovaj primer opisuje rezultate eksperimenata izvedenih radi testiranja Hinge-Notch receptora koji sadrže alternativne STS.
[0179] Kao što je prikazano na Slici 8A, pored Notch1 STS, još jedan STS (e.g., Notch2 STS, Notch4 STS, DAG STS, PTPRF STS i KL STS) se može koristiti tako da moduliše ponašanje receptora. U ovim eksperimentima, primarne humane T-ćelije su aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta koji eksprimiraju ili receptor ili konstrukt transkripcionog reportera. Receptor/reporter pozitivne ćelije su sortirane petog dana nakon početne stimulacije T-ćelija i dalјe korišćene za testiranje aktivacije. Za testiranje, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi tokom 24 sata zajedno sa: bez dodataka (gornji trag), 1 × 10<5>K562 ćelija (srednji trag), ili 1 × 10<5>CD19+ K562 ćelija (donji trag). Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Slika 8B prikazuje kvantifikaciju podataka o aktivaciji sa Slike 8A.
Eksperimenti opisani u ovom primeru pokazuju da pored Notch1 STS, druge odgovarajuće sekvence zaustavlјanja transfera mogu biti izvedene iz alternativnih izvora.
PRIMER 12
Generisanje reporterskih Jurkat T ćelija
[0180] Ovaj primer opisuje stvaranje reporterskih Jurkat T ćelija koje su kasnije korišćene za testiranje različitih Hinge-Notch receptora koji su opisani ovde.
[0181] U ovim eksperimentima, E6-1 Jurkat T ćelije (ATCC# TIB-152) su transdukovane lentivirusom sa reporterskim plazmidom koji nosi inducibilni BFP reporter gen i konstitutivni mCitrine reporter gen, kao što je prethodno opisano (K.T. Roybal et al., Cell, 164:1-10, 2016). Reporter-pozitivne Jurkat ćelije su sortirane za ekspresiju mCitrina upotrebom Beckton Dickinson (BD Biosciences) FACSAria<™>II protočnog citometra i proširene.
[0182] Lentivirusne čestice su proizvedene sa transgenim vektorom ekspresije receptora kao što je prethodno opisano (L. Morsut et al., Cell (2016) 164:780-91). Reporter-pozitivne Jurkat ćelije su transdukovane sa pojedinačnim receptorima i podeljene za upotrebu u eksperimentu na pločama sa 96 bunara.
1
PRIMER 13
[0183] Ovaj primer opisuje eksperimente izvedene da bi se demonstrirala in vitro stimulacija Jurkat T ćelija pomoću himernih Hinge-Notch polipeptida opisanih ovde.
[0184] Testirane su četiri CD8 Hinge-Notch varijante. Slika 4A šematski prikazuje četiri varijante skraćenih CD8 Hinge-Notch receptora koje uklјučuju jednu ili više komponenti zgloba. Slika 4B sumira rezultate eksperimenata izvedenih radi testiranja aktivacije receptora u Jurkat T-ćelijama. U ovim eksperimentima, prethodno generisana Jurkat T-ćelijska linija sa reporterski pozitivnim statusom je transdukovana sa svakom od varijanti CD8 Hinge-Notch. Ekspresija receptora je merena anti-myc antitelom koji je obeležen sa AlexaFluor647 (Cell Signaling). Za testiranje aktivacije receptora, 1 × 10<5>Jurkat T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi zajedno sa: bez dodataka (gornji trag), 1 × 10<5>K562 ćelija (srednji trag), ili 1 × 10<5>CD19+ K562 ćelija (donji trag) tokom 24 sata. Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporter gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Na osnovu ovog testiranja, utvrđeno je da je truncCD8 Hinge2 optimalna konfiguracija i korišćena je u narednim studijama. Slika 4C prikazuje kvantifikaciju %BFP pozitivnih ćelija iz podataka sa Slike 4B (bez dodataka, sa K562, sa CD19+ K562 ćelijama). Slika 4D je dijagram odnosa signal:šum iz podataka sa Slike 4B. Vrednosti iz Jurkat T-ćelija stimulisanih sa CD19+ K562 podelјene su vrednostima iz Jurkat T-ćelija stimulisanih sa K562 ćelijama.
PRIMER 14
[0185] Ovaj Primer opisuje eksperimente izvedene za optimizaciju himernih CD8 Hinge-Notch polipeptida opisanih ovde.
[0186] Pripremlјeno je više primeraka varijanti skraćenih CD8 Hinge. Kao što je prikazano na Slici 9A, primeri varijanti uklјučuju ili punu dužinu ili skraćeni oblik sekvence TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 12), koji odgovara N-JMD domenu konstrukta pIZ341. Crne trake označavaju aminokiseline koje čine svaku varijantu. Kao rezultat, varijante za poređenje na Slikama 9A-9C su: „Full“ varijanta, koja uklјučuje SEQ ID NO: 12; varijanta „Trunc 1“, koja uklјučuje SEQ ID NO: 39; „Trunc 2“ varijanta, koja uklјučuje SEQ ID NO: 13; „Trunc 3“ varijanta, koja uklјučuje SEQ ID NO: 40; i „Trunc“ 4 varijanta, koja uklјučuje SEQ ID NO: 41. Poređenje ekspresije ovih CD8 Hinge varijanti je prikazano na Slici 9B. Konkretno, primarne humane CD4+ T-ćelije su aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih je jedan eksprimirao receptor sa varijantom skraćenog domena zgloba (Hinge domen), a drugi je eksprimirao BFP transkripcioni reporter i anti-ALPPL2 CAR. Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane petog dana nakon početka stimulacije T-ćelija i dalјe proširene za testiranje aktivacije. Levih pet panela na Slici 9B prikazuju relativne nivoe ekspresije svakog receptora, merene anti-myc-obeleženim bojenjem (y-osa), u odnosu na nivoe ekspresije reporterskog konstrukta, koje su merene sa GFP (x-osa). Najdesniji panel na Slici 9B prikazuje kvantifikaciju MFI ekspresije receptora CD8 zglobnih varijanti u dvostruko pozitivnim ćelijama. Kao što je prikazano od vrha ka dnu na svakom panelu Slike 9C, T-ćelije koje eksprimiraju anti-CD19 receptore su gajenae u kulturi zajedno sa: bez dodataka (gornji trag), ALPPL2+ K562 ćelijama (drugi trag odozgo), CD19+ K562 ćelijama (treći trag odozgo) ili ALPPL2+ CD19+ (donji trag). Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno izmerena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences).
2
PRIMER 15
[0187] Ovaj primer opisuje eksperimente sprovedene kako bi se demonstrirala aktivacija Hinge-Notch konstrukata sa različitim domenima za vezivanje liganda i njihovu zavisnost od proteolitičke aktivnosti ADAM proteaza i gama-sekretaze.
[0188] Pripremlјena su tri primera Hinge-Notch konstrukta, uklјučujući jedan konstrukt koji ima anti-CD19 scFv kao domen za prepoznavanje liganda i Notch2 STS domen, drugi konstrukt koji ima anti-LaG17 nanotelo kao domen za prepoznavanje liganda i Notch2 STS domen, i treći konstrukt koji ima eGFP ekstracelularni domen i Notch1 STS domen. Primarne humane CD4+ T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih jedan eksprimira Hinge receptor sa naznačenom varijantom skraćene glave vezivanja, a drugi eksprimira transkripcioni reporter. (Slika 10). Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane 5. dana nakon početka stimulacije T-ćelija i dalјe podeljene za testiranje aktivacije. Za testiranje, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju receptore je gajeno u kulturi zajedno sa 1 × 10<5>K562 ćelija (gornji trag), 1 × 10<5>Ligand ćelije K562 (drugi trag odozgo), 1 × 10<5>Ligand K562 ćelije sa inhibitorom ADAM10 (treći trag odozgo) ili 1 × 10<5>Ligand K562 ćelije sa inhibitorom gama-sekretaze, DAPT (donji trag). Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno izmerena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences).
PRIMER 16
[0189] Ovaj primer opisuje eksperimente sprovedene kako bi se demonstrirale karakteristike aktivacije primeraka Notch2 STS Hinge-Notch konstrukata sa proširenim skupom domena za vezivanje liganda.
[0190] Testiranja su izvedena sa različitim domenima za vezivanje koja ciljaju antigen BCMA. Primarne CD4+ humane T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih jedan eksprimira zglobni receptor sa naznačenom hingeNotch glavom vezivanja receptora, a drugi eksprimira transkripcioni reporter. Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane 5. dana nakon početka stimulacije T-ćelija i dalјe podeljene za testiranje aktivacije. Za testiranje, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju receptore je gajeno dva dana zajedno sa: bez ikakvog dodavanja (gornji trag), 1 × 10<5>K562 ćelija (srednji trag), ili 1 × 10<5>BCMA+ K562 ćelija (donji trag) (Slika 11A). Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno izmerena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Na Slici 11A, levi panel se odnosi na konstrukt sa anti-BCMA scFv vezivnom glavom, srednji panel se odnosi na konstrukt sa potpuno humanizovanom anti-BCMA VH glavom za vezivanje, a desni panel se odnosi na konstrukt sa anti-BCMA potpuno humanizovanom VH glavom za vezivanje sa domenom zgloba optimizovanim za vezivanje (HingeS).
[0191] Slično je testirana i SIRPa glava za vezivanje. Primarne humane CD8+ T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih jedan eksprimira zglobni receptor sa naznačenom hingeNotch glavom vezivanja receptora, a drugi eksprimira transkripcioni reporter. Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane 5. dana nakon početka stimulacije T-ćelija i dalјe podeljenje za testiranje aktivacije. Za testiranje, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju receptore je gajeno zajedno sa: bez ikakvog dodavanja (plavo), ili 1 × 10<5>K562 ćelija kao što je naznačeno (crveno) tokom dva dana (Slika 11B). Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno izmerena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences).
[0192] Testirani su i upoređeni različiti scFv protiv antigena HER2. Primarne humane CD4+ T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih jedan eksprimira zglobni receptor sa naznačenom hingeNotch glavom vezivanja receptora, a drugi eksprimira transkripcioni reporter. Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane 5. dana nakon početne stimulacije T-ćelija i dalјe podeljene za testiranje aktivacije. Za testiranje, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju receptore je gajeno u kulturi zajedno sa: bez ikakvog dodavanja (gornji trag), sa adherentnim HEK 293T ćelijama (drugi trag odozgo), adherentnim MBMDA-468 ćelijama (treći trag odozgo), adherentnim MCF7 ćelijama (četvrti trag odozgo ), ili adherentnim SKBR3 ćelijama (donji trag) tokom dva dana (Slika 11C). Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Na Slici 11C, levi panel predstavlјa anti-HER24D5-7 scFv glavu za vezivanje, dok desni panel predstavlјa anti-HER24D5-8 scFv glavu za vezivanje.
PRIMER 17
[0193] Ovaj primer opisuje eksperimente izvedene radi upoređivanja aktivacija Hinge-Notch varijanti sa različitim promotorima i STS domenima. Za testiranje, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi zajedno sa: bez dodataka (gornji trag), 1 × 10<5>ALPPL2+ K562 ćelija (drugi trag odozgo), 1 × 10<5>CD19+ K562 ćelija (treći trag odozgo) ili 1 × 10<5>ALPPL2+ CD19+ K562 ćelija (donji trag) (Slika 12). Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog- gena je naknadno izmerena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Aktivacija mišjih i hunanih originalnih SynNotch konstrukata je uklјučena za poređenje.
PRIMER 18
[0194] Ovaj primer opisuje analizu mutacije Notchl transmembranskog domena (TMD) u Hinge-Notch konstruktima.
[0195] Pripremlјene su varijante sa različitim mutacijama alanina u TMD domenu Hinge-Notch konstrukta. Svaki aminokiselinski ostatak od pozicije 301 (F) do pozicije 322 (S) u TMD Hinge-Notch je pojedinačno mutiran u alanin. Primarne humane CD4+ T-ćelije su aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih je jedan eksprimirao varijantu TMD sa mutacijom, a drugi je sadržao BFP transkripcioni reporter. Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane 5. dana nakon početka stimulacije T-ćelija i dalјe podeljenje za testiranje aktivacije. Na Slici 13A, levi panel prikazuje relativnu ekspresiju različitih receptora, merenu anti-mycobeleženim bojenjem (y-osa), u odnosu na ekspresiju markera reporterskog konstrukta (x-osa), dok desni panel predstavlјa MFI kvantifikaciju ekspresije TMD mutiranih varijanti receptora u dvostruko pozitivnim ćelijama.
[0196] Kao što je prikazano na Slici 13B, T-ćelije koje eksprimiraju anti-CD19 receptore su kultivisane u odnosu 1:1 zajedno sa kontrolnim CD19(-) ili CD19(+) K562 ćelijama. Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Levi panel prikazuje panele toka profila aktivacije. Desni panel predstavlјa BFP% prikazan na grafiku sa
4
linijskim prikazom. Rezultati ukazuju na značaj ostataka glicina (G) i valina (V) u C-terminalnom kraju TMD.
PRIMER 19
[0197] Ovaj primer opisuje analizu mutacija transmembranskog domena (TMD) i STS domena u Hinge-Notch konstruktima.
[0198] U ovom primeru su korišćena četiri tipa reprezentativnih Hinge Notch receptora (SEQ ID NOS: 73-76), od kojih svi sadrže anti-CD19 scFv domen, skraćeni CD8 Hinge domen i Gal4VP64 domen. Za izbor STS i TMD domena, četiri konstrukta obuhvataju: CLSTN1 TMD i CLSTN1 STS (SEQ ID NO: 73), CLSTN2 TMD i CLSTN2 STS (SEQ ID NO: 74), CLSTN1 TMD i Notch1 STS (SEQ ID NO: 75 ), CLSTN2 TMD i Notch1 STS (SEQ ID NO: 76). Primarne humane CD4+ T-ćelije su aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih je jedan eksprimirao zglobni receptor sa kombinacijom TMD/STS kako je naznačeno, a drugi je eksprimirao transkripcioni reporter sa konstitutivno eksprimiranim anti -ALPPL2 CAR. Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane 5. dana nakon početka stimulacije T-ćelija i dalјe podeljene za testiranje aktivacije. Kao što je prikazano na Slici 14, 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju receptore je gajeno u kulturi zajedno sa: 1 × 10<5>K562 ćelija ("-CAR" paneli, plavi) ili 1 × 10<5>CD19+ K562 ćelija ("-CAR" paneli, crveni). Slično, 1 × 10<5>dvostruko pozitivni receptori koji eksprimiraju T-ćelije su testirani u prisustvu aktivnosti CAR u kulturi zajedno sa 1 × 10<5>ALPPL2+ K562 ćelija ("+CAR" paneli, plavi) ili 1 × 10<5>ALPPL2+ CD19+ K562 ćelija ("+CAR" paneli, crveni). Transkripciona aktivacija inducibilnog BFP reporterskog gena je naknadno merena upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences).
PRIMER 20
[0199] Ovaj primer opisuje Tabelu 3 sa karakteristikama aktivacija varijanti HingeNotch STS bez dodatne stimulacije T ćelija.
[0200] Primarne humane CD4+ T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih jedan eksprimira zglobni receptor, a drugi transkripcioni reporter sa konstitutivno eksprimiranim eGFP-označenim anti-ALPPL2 CAR. Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane 5. dana nakon početne stimulacije T-ćelija i dalјe podeljenje za testiranja aktivacije. Za potrebe testiranja, T-ćelije koje eksprimiraju receptore su gajene u kulturi zajedno sa K562 ćelijama ili CD19+ K562 ćelijama. BFP reporterski gen je naknadno meren upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Odnosi signala i šuma dobijen iz MFI vrednosti BFP+ ćelija u uslovima CD19+ K562 naspram K562 grafički je prikazan u odnosu na delta promene MFI u dva uslova, kao u Tabeli 3 ispod.
TABELA 3. Ova tabela prikazuje podatke o koeksprimiranju anti-ALPPL2 CAR sa ALPPL2+ K562 bez stimulacije. „Samo reporter" predstavlјa reporterski plazmid koji je eksprimiran u svim uzorcima.
PRIMER 21
[0201] Ovaj primer opisuje Tabelu 4 koja prikazuje karakteristike aktivacije varijanti HingeNotch STS sa stimulacijom T ćelija.
[0202] Primarne humane CD4+ T-ćelije su aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih jedan eksprimira zglobni receptor, a drugi eksprimira transkripcioni reporter sa konstitutivno eksprimiranim eGFP+ anti-ALPPL2 CAR. Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane 5. dan nakon početka stimulacije T-ćelija i dalјe podeljene za testiranja aktivacije. Za potrebe testiranja, T-ćelije koje eksprimiraju receptore koji su gajene u kulturi zajedno sa K562 ćelijama ili CD19+ K562 ćelijama. BFP reporterskog gen je naknadno izmeren upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Odnosi signala i šuma dobijen iz MFI vrednosti BFP+ ćelija u uslovima CD19+ K562 u odnosu na K562, grafički je prikazan u odnosu na delta promenu MFI u dva uslova. Aktivacija je ispitivana kao u Primeru 19, ali uz dodatnu koinkubaciju sa ALPPL2+ K562 za CAR aktivaciju.
TABELA 4. Ova tabela prikazuje podatke o koeksprimiranju sa stimulacijom anti-ALPPL2 CAR sa ALPPL2+ K562. „Samo reporter" predstavlјa reporterski plazmid koji je eksprimiran u svim uzorcima.
PRIMER 22
[0203] Ovaj primer opisuje eksperimente sprovedene radi demonstracije kontrolisane produkcije IL-2 od strane T ćelija projektovanih sa Hinge-Notch STS varijantama.
[0204] Slika 15A prikazuje dijagram T ćelija koje su konstruisane sa Hinge-Notch STS varijantama kako bi dovele do ligandom stimulisane sekrecije citokina koji dovodi do autokrine i parakrine ekspanzije T ćelija. Profil ekspresije anti-CD19 Hinge-Notch receptora sa navedenim modifikacijama STS je prikazan na Slici 15B. Primarne humane T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih jedan eksprimira CAR na MCAM antigen, a drugi eksprimira Hinge-Notch receptor sa inducibilnim super-IL2 pod kontrolom Gal4-UAS. Ćelije koje sadrže oba konstrukta su sortirane 5. dana od početka stimulacije T-ćelija i dalјe podeljene za testiranje aktivacije. Ekspresija receptora je određena pomoću anti-myc-obeleženog bojenja (y-osa).
PRIMER 23
[0205] Ovaj primer opisuje eksperimente sprovedene kako bi se demonstriralo da ekspresija super-IL2, pokrenuta vezivanjem liganda, pobolјšava viabilnosti CAR-T ćelija.
[0206] 1 × 10<5>dvostruko pozitivnih T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 Hinge-Notch Notch1 STS receptore je gajeno u kulturi u medijumu bez IL-2, bez K562 ćelija (gore levo), sa CD19+ K562 ćelijama radi pokretanja aktivacije Hinge-Notch (gore desno), sa MCAM+ K562 ćelijama radi pokretanja aktivacije CAR (dole levo), ili sa MCAM+ i CD19+ K562 ćelijama radi pokretanja aktivacije oba receptora (dole desno) (Slika 16). Posle 9 dana procenjen je udeo živih T ćelija merenjem prednjeg i bočnog rasipanjem pomoću Fortessa X-50 (BD Biosciences). Koaktivacija oba receptora dovela je do najveće viabilnosti ćelija, praćenom aktivacijom Hinge-Notch (i naknadnom indukcijom super-IL2), zatim samo aktivacijom CAR, i najmanju viabilnost su pokazale ćelije bez aktivacije bilo kojeg od receptora.
PRIMER 24
[0207] Ovaj primer opisuje eksperimente sprovedene kako bi se demonstrirao podesiv proliferativni odgovor T-ćelija sa Hinge-Notch varijantama STS.
[0208] Primarne humane T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa dva lentivirusna konstrukta, od kojih jedan eksprimira CAR na MCAM antigen, a drugi eksprimira Hinge-Notch receptor sa inducibilnim super-IL2 pod kontrolom Gal4-UAS (desna četiri panela Slike 17). Hinge-Notch receptori koji sadrže 3 različite STS varijante (NRG1, Notch1, Notch2) su testirani u odnosu na kontrolu bez Hinge-Notch. Slično tome, primarne humane T-ćelije su generisane bez ekspresije CAR (levi paneli Slike 17). T ćelije su obojene sa CellTrace Violet (Invitrogen) prema protokolima proizvođača, koinkubirane sa CD19+ K562 cilјnim ćelijama u medijumu bez IL-2, i izmerene upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences) u naznačenim vremenskim tačkama kako bi se procenila proliferacija putem opadanja CTV signala.
PRIMER 25
[0209] Ovaj primer opisuje eksperimente sprovedene kako bi se pokazala podesiva sekrecija super-IL2 sa STS varijantama Hinge-Notch.
[0210] Primarne humane T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane lentivirusnim konstruktom sa Hinge-Notch receptorom koji eksprimira inducibilni super-IL2 pod kontrolom Gal4-UAS (Slika 18A). Hinge-Notch receptori koji sadrže 3 različite STS varijante (NRG1, Notch1, Notch2) su testirani u odnosu na kontrolu bez HingeNotch. T ćelije su koinkubirane sa MCAM+ CD19+ K562 ćelijama u medijumu bez IL-2, a u naznačenim vremenskim tačkama, supernatant IL-2 je meren upotrebom Instant ELISA kompleta (Invitrogen) prema protokolima proizvođača, uz korišćenje čitača mikroploča (Tecan). Crvena tačkasta linija predstavlja standardnu koncentraciju IL-2 koja se koristi za kultivisanje T ćelija. Postepena sekrecija super-IL2 je postignuta aktivacijom HingeNotch receptora podešenih sa STS.
[0211] Na Slici 18B, primarne humane T-ćelije su generisane sa dodatnim lentivirusnim vektorom koji eksprimira CAR na MCAM. Pojačano preuzimanje IL-2 od strane ćelija koje eksprimiraju CAR dovelo je do gubitka supernatantog IL2 u T ćelijama koje eksprimiraju samo CAR i NRG1-STS Hinge-Notch. Nasuprot tome, veća indukcija super-IL2 pomoću receptora baziranih na Notch1 i Notch2-STS u početku nadmašuje ovaj unos, dok proliferacija i eliminacija K562 smanjuju nivoe supernatanta.
PRIMER 26
[0212] Ovaj primer opisuje eksperimente sprovedene kako bi se pokazalo da podesiva sekrecija super-IL2 sa STS-varijantama Hinge-Notch pobolјšava proliferaciju „bystander“ T ćelija.
[0213] Primarne humane T-ćelije su aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane lentivirusnim konstruktom koji uklјučuje Hinge-Notch receptor sa inducibilnim super-IL2 pod kontrolom Gal4-UAS (desni paneli Slike 19). HingeNotch receptori koji sadrže 3 različite STS varijante (NRG1, Notch1, Notch2) su testirani u odnosu na kontrolu bez HingeNotch. HingeNotch T ćelije su koinkubirane sa „bystander“ T ćelijama, obojenim sa CellTrace Far Red (Invitrogen), koje eksprimiraju CAR protiv MCAM (levi panel Slike 19) ili bez CAR (desni panel Slike 19). T ćelije su koinkubirane sa MCAM+ CD19+ K562 ćelijama u medijumu bez IL-2, a proliferacija „bystander“ T ćelija je procenjena merenjem opadanja signala na Fortessa X-50 (BD Biosciences). Za „bystander“ T ćelije sa i bez CAR ekspresije, proliferacija je pobolјšana na stepenast način u zavisnosti od aktivacije Hinge-Notch T-ćelija sa STS-varijantama.
PRIMER 27
[0214] Ovaj primer opisuje eksperimente izvedene radi testiranja pojedinačnih lentivirusnih vektorskih konstrukata koji sadrže CAR module Hinge-Notch receptora.
[0215] Primarne humane T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa jednim lentivirusnim konstruktom koji sadrži konstitutivno eksprimirane Hinge-Notch receptore sa inducibilnom anti-MCAM CAR kasetom pod kontrolom Gal4-UAS. Ćelije su sortirane prema ekspresiji Hinge-Notch receptora preko myc-tag-a 5. dana nakon početne stimulacije T-ćelija i dalјe podeljene za testiranje aktivacije. Testirane su tri STS-varijante kako je prikazano, sa konstitutivno eksprimiranim CAR kao kontrolom (Slika 20). Za testiranje, 1 × 10<5>T ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi ćelija zajedno sa: bez dodataka (gornji trag), 5 k 10<5>K562 ćelija (srednji trag), ili 5 × 10<4>CD19+ K562 ćelija (donji trag). Transkripciona aktivacija inducibilnog CAR je naknadno izmerena pomoću GFP oznake upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences).
PRIMER 28
[0216] Ovaj primer opisuje eksperimente izvedene radi demonstracije specifičnog ubijanja cilјnih ćelija sa dva antigena od strane T ćelija projektovanih sa jednim lentivektorom koji sadrži HingeNotch CAR modul.
[0217] Primarne humane T-ćelije su aktivirane sa anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa jednim lentivirusnim konstruktom koji sadrži konstitutivno eksprimirane HingeNotch receptore sa inducibilnom anti-MCAM CAR kasetom pod kontrolom Gal4-UAS. Ćelije su sortirane prema ekspresiji Hinge-Notch receptora preko myc-tag 5. dana nakon početka stimulacije T-ćelija i korišćene za dalje testiranje aktivacije. Tri STS-varijante su testirane kako je prikazano, sa konstitutivno eksprimiranim CAR kao kontrolom. Za testiranje, 1 × 10<5>T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi ćelija zajedno sa 5 × 10<5>MCAM+ K562 ćelija ili 5 × 10<4>MCAM+ CD19+ K562 ćelija. Ubijanje cilјnih ćelija je procenjeno analizom prednjeg/bočnog rasipanja populacije K562 upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences). Kao što je prikazano na Slici 21, Henge-Notch moduli efikasno i specifično eliminišu cilјne ćelije koje sadrže i MCAM+ i CD19+ antigene.
PRIMER 29
[0218] Ovaj primer opisuje eksperimente izvedene radi testiranja pojedinačnih lentivirusnih vektorskih konstrukata koji sadrže Hinge-Notch receptore namenjene kontroli aktivacije i iscrplјenosti T ćelija.
[0219] Primarne humane T-ćelije su aktivirane pomoću anti-CD3/anti-CD28 Dynabeads (Gibco) i transdukovane sa jednim lentivirusnim konstruktom koji sadrži konstitutivno eksprimirane Hinge-Notch receptore sa inducibilnom anti-MCAM CAR kasetom pod kontrolom Gal4-UAS. Ćelije su sortirane prema ekspresiji Hinge-Notch receptora preko myc-tag 5. dana nakon početka stimulacije T-ćelija i proširene dalјe za testiranje aktivacije. Tri STS-varijante su testirane kako je prikazano, sa konstitutivno eksprimiranim CAR kao kontrolom. Za testiranje, 1 × 10<5>T-ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 receptore je gajeno u kulturi ćelija zajedno sa 5 × 10<4>CD19+ K562 ćelija. Transkripciona aktivacija inducibilnog CAR je naknadno izmerena pomoću GFP markera upotrebom Fortessa X-50 (BD Biosciences) (krajnji levi panel Slike 22). Aktivacija T ćelija i njihova iscrplјenost merene su ekspresijom CD25 i CD39, respektivno (Slika 22).
PRIMER 30
[0220] Ovaj primer opisuje eksperimente sprovedene za potrebe in vivo testiranja Hinge-Notch-to-CAR modula.
[0221] Kao što je prikazano na Slici 23, za unilateralne tumore, NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1Vjl>/SzJ (NSG) miševima je subkutano na levom boku implantirano 1 × 10<6>K562-BCMA/CD19 tumorskih ćelija. Za kontralateralne tumore, NSG miševima je implantirano 1 × 10<6>K562-BCMA/CD19 tumorskih ćelija na levom boku i 1 × 10<6>K562-CD19 tumorskih ćelija na desnom boku. Četiri dana nakon implantacije tumora, 2,5 × 10<6>genetički modifikovanih primarnih humanih CD4+ i CD8+ T ćelija (ukupno 5 × 10<6>T ćelija) je ubrizgano i.v. kroz injekciju u repnu venu. Veličina tumora je praćena pomoću kalipera 2-3 puta nedelјno, i miševi su praćeni do dostizanja krajnje tačke veličine tumora ≥20 mm. Za imunofenotipsku analizu, tumori i slezine su prikupljeni 10. dana nakon implantacije T ćelija. Tumori su mehanički usitnjeni i digestirani u RPMI-1640 sa 4 mg/ml kolagenaze IV (Worthington Biochemical Corporation) i 0,1 mg/ml DNase I (MilliporeSigma) na 37°C tokom 30 minuta, dok su slezine ručno disocirane i podvrgnute lizi crvenih krvnih zrnaca (ACK; KD medical). Korišćena su sledeća antitela: anti-CD45 (2D1, 368516, Biolegend), anti-CD3 (UCHT1, 300464, Biolegend), anti-CD4 (SK3, 563552, BD biosciences) i anti-CD8 (RPA-T8, 563823 , BD Biosciences). Mrtve ćelije su isklјučene sa Draq7 (Abcam). Uzorci su analizirani upotrebom FACSymphony X50 SORP (BD Biosciences), a podaci su analizirani upotrebom softvera FlowJo (BD Biosciences).
PRIMER 31
[0222] Ovaj primer sumira rezultate eksperimenata koji su ovde dati i diskutovani za Notch receptore opisane u Tabeli 1.
Tabela 5
1
2
REFERENCE
[0223]
Dudani J. S., Warren A. D., and Bhatia S. N., Harnessing Protease Activity to Improve Cancer Care. Annu. Rev. Cancer Biol.2018.2:353-76.
David L. Porter, M.D., Bruce L. Levine, Ph.D., Michael Kalos, Ph.D., Adam Bagg, M.D., and Carl H. June, M.D. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl J Med.2011 Aug 25; 365(8):725-33.
Gordon WR et al., The molecular logic of Notch signaling - a structural and biochemical perspective. J. Cell Sci. (2008) 121:3109-19.
Gordon WR et al., Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch. Dev Cell (2015) 33:729-36.
Morsut L, Roybal KT, Xiong X, Gordley RM, Coyle SM, Thomson M, and Lim WA. Engineering Customized Cell Sensing and Response Behaviors Using Synthetic Notch Receptors. Cell.2016 February 11; 164(4):780-91.
Naso MF, Tomkowicz B, Perry WL 3rd, Strohl WR. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs.2017; 31(4):317-34.
Nasri M, Karimi A, Allahbakhshian Farsani M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology.2014; 66(6):1031-38.
Roybal KT, Jasper Z. Williams, Leonardo Morsut, Levi J. Rupp, Isabel Kolinko, Joseph H. Choe, Whitney J. Walker, Krista A. McNally, and Wendell A. Lim. Engineering T cells with Customized Therapeutic Response Programs Using Synthetic Notch Receptors. Cell. 2016 Oct 6; 167(2):419-32.
Samulski and Muzyczka (2014). AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes. Annu. Rev. Virol.1:427.
Sakuma, et al. (2012). Lentiviral vectors: basic to translational. Biochem. J.443:603. Watson D.J., Wolfe J.H. Viral vectors for gene therapy: methods and protocols. Totowa, NJ, USA: Humana Press; 2003. pp.383-404.
Vidarsson G. et al., IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers Immunol. (2014) Oct 20; 5:520.
4
SEQUENCE LISTING
<110> The Regents of the University of California
<120> Notch Receptors With Hinge Domain
<130> 048536-654001WO
<140> Herewith
<141> Herewith
<150> US 62/905,251
<151> 2019-09-24
<150> US 62/905,263
<151> 2019-09-24
<160> 80
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 556
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 290 295 300
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Met 305 310 315 320
Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly 325 330 335
Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile 340 345 350
Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys 355 360 365
Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg 370 375 380
Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr 385 390 395 400
Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile 405 410 415
Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln 420 425 430
Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn 435 440 445
Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro 450 455 460
Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu 465 470 475 480
Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly 485 490 495
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu 500 505 510
Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu 515 520 525
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp 530 535 540
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
545 550 555
<210> 2
<211> 538
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Phe Met Tyr Val 290 295 300
Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu 305 310 315 320
Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln 325 330 335
Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys 340 345 350
Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser 355 360 365
Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val 370 375 380
Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro 385 390 395 400
Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile 405 410 415
Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp 420 425 430
Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr 435 440 445
Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser 450 455 460
Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser 465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met 485 490 495
Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 500 505 510
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu 515 520 525
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
530 535
<210> 3
<211> 550
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 3
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 275 280 285
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 290 295 300
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala 305 310 315 320
Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys 325 330 335
Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile 340 345 350
Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala 355 360 365
Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys 370 375 380
Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu 385 390 395 400
Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu 405 410 415
Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu 420 425 430
Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp 435 440 445
Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln 465 470 475 480
Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 485 490 495
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp 500 505 510
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp 515 520 525
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp 530 535 540
Leu Asp Met Leu Gly Ser
545 550
<210> 4
<211> 538
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 4
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu 305 310 315 320
Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln 325 330 335
Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys 340 345 350
Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser 355 360 365
Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val 370 375 380
Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro 385 390 395 400
Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile 405 410 415
Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp 420 425 430
Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr 435 440 445
Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser 450 455 460
Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser 465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met 485 490 495
Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 500 505 510
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu 515 520 525
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
530 535
<210> 5
<211> 697
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 5
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys 275 280 285
His Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser 290 295 300
Gln Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val 305 310 315 320
Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser 325 330 335
Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys 340 345 350
Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val 355 360 365
Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln 370 375 380
Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu 385 390 395 400
Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro 405 410 415
Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile 420 425 430
Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser 435 440 445
Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Phe Met Tyr Val Ala 450 455 460
Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu 465 470 475 480
Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala 485 490 495
Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro 500 505 510
Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro 515 520 525
Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu 530 535 540
Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg 545 550 555 560
Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys 565 570 575
Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala 580 585 590
Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu 595 600 605
Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn 610 615 620
Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly 625 630 635 640
Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu 645 650 655
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp 660 665 670
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp 675 680 685
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
690 695
<210> 6
<211> 539
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 6
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Phe Met Tyr Val 290 295 300
Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu 305 310 315 320
Leu Ser Lys Arg Lys Arg Lys His Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu 325 330 335
Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu 340 345 350
Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr 355 360 365
Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu 370 375 380
Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe 385 390 395 400
Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp 405 410 415
Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys 420 425 430
Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu 435 440 445
Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser 450 455 460
Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly 465 470 475 480
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp 485 490 495
Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly 500 505 510
Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala 515 520 525
Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
530 535
<210> 7
<211> 542
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 7
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln 20 25 30
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser 35 40 45
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 50 55 60
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 65 70 75 80
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 85 90 95
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 100 105 110
Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 115 120 125
Lys Glu Gly Asp Ser Ser Arg Trp Ser Tyr Asp Leu Trp Gly Arg Gly 130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val 165 170 175
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser 180 185 190
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro 195 200 205
Gly Lys Ala Pro Lys Val Met Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser 210 215 220
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser 225 230 235 240
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 245 250 255
Ser Ser Tyr Thr Ile Ala Ser Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr 260 265 270
Lys Leu Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 275 280 285
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 290 295 300
Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly 305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser 325 330 335
Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys 340 345 350
Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu 355 360 365
Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His 370 375 380
Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu 385 390 395 400
Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser 405 410 415
Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn 420 425 430
Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp 435 440 445
Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser 450 455 460
Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala 465 470 475 480
Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe 485 490 495
Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp 500 505 510
Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly 515 520 525
Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 530 535 540
<210> 8
<211> 525
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 8
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly 20 25 30
Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys 35 40 45
Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu 50 55 60
Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro 65 70 75 80
Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr 85 90 95
Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu 100 105 110
Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr 115 120 125
Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg 130 135 140
Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly 145 150 155 160
His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala 165 170 175
Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn 180 185 190
Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr 195 200 205
Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser 210 215 220
Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met 225 230 235 240
Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp 245 250 255
Glu Leu Tyr Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 260 265 270
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Phe 275 280 285
Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys 290 295 300
Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser 305 310 315 320
Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser 325 330 335
Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys 340 345 350
Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu 355 360 365
Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu 370 375 380
Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu 385 390 395 400
Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val 405 410 415
Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met 420 425 430
Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala 450 455 460
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp 465 470 475 480
Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met 485 490 495
Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 500 505 510
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
515 520 525
<210> 9
<211> 273
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser
<210> 10
<211> 277
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Synthetic construct
<400> 10
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln 20 25 30
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser 35 40 45
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 50 55 60
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 65 70 75 80
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 85 90 95
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 100 105 110
Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 115 120 125
Lys Glu Gly Asp Ser Ser Arg Trp Ser Tyr Asp Leu Trp Gly Arg Gly 130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val 165 170 175
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser 180 185 190
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro 195 200 205
Gly Lys Ala Pro Lys Val Met Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser 210 215 220
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser 225 230 235 240
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 245 250 255
Ser Ser Tyr Thr Ile Ala Ser Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr 260 265 270
Lys Leu Thr Val Leu
275
<210> 11
<211> 260
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 11
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly 20 25 30
Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys 35 40 45
Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu 50 55 60
Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro 65 70 75 80
Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr 85 90 95
Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu 100 105 110
Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr 115 120 125
Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg 130 135 140
Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly 145 150 155 160
His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala 165 170 175
Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn 180 185 190
Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr 195 200 205
Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser 210 215 220
Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met 225 230 235 240
Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp 245 250 255
Glu Leu Tyr Lys
260
<210> 12
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 12
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 13
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 13
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
20 25
<210> 14
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 14
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
<210> 15
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
20 25
<210> 16
<211> 186
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 16
Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His 1 5 10 15
Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln 20 25 30
Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val 35 40 45
Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly 50 55 60
Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg 65 70 75 80
Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp 85 90 95
Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala 100 105 110
Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln 115 120 125
Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro 130 135 140
Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr 145 150 155 160
Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr 165 170 175
Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala
180 185
<210> 17
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 17
Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly 1 5 10 15
Cys Gly Val Leu Leu Ser
20
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 18
Arg Lys Arg Arg Arg
1 5
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Synthetic construct
<400> 19
Lys Arg Lys Arg Lys His
1 5
<210> 20
<211> 211
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 20
Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu 1 5 10 15
Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu 20 25 30
Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro 35 40 45
Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu 50 55 60
Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile 65 70 75 80
Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu 85 90 95
Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala 100 105 110
Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser 115 120 125
Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu 130 135 140
Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp 145 150 155 160
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp 165 170 175
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp 180 185 190
Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met 195 200 205
Leu Gly Ser
210
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 21
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 22
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 23
ggagcactgt cctccgaacg 20
<210> 24
<211> 537
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 24
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Phe Met Tyr Val Ala 290 295 300
Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu 305 310 315 320
Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala 325 330 335
Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro 340 345 350
Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro 355 360 365
Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu 370 375 380
Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg 385 390 395 400
Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys 405 410 415
Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala 420 425 430
Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu 435 440 445
Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn 450 455 460
Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly 465 470 475 480
Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu 485 490 495
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp 500 505 510
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp 515 520 525
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
530 535
<210> 25
<211> 529
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 25
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe 275 280 285
Ala Cys Asp Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe 290 295 300
Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys 305 310 315 320
Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys 325 330 335
Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn 340 345 350
Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr 355 360 365
Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln 370 375 380
Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys 385 390 395 400
Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val 405 410 415
Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val 420 425 430
Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr 435 440 445
Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val 450 455 460
Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu 465 470 475 480
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe 485 490 495
Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp 500 505 510
Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly 515 520 525
Ser
<210> 26
<211> 530
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 275 280 285
Phe Ala Cys Asp Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu 290 295 300
Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met 305 310 315 320
Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys 325 330 335
Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys 340 345 350
Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu 355 360 365
Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu 370 375 380
Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu 385 390 395 400
Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe 405 410 415
Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser 420 425 430
Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala 435 440 445
Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr 450 455 460
Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala 465 470 475 480
Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp 485 490 495
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu 500 505 510
Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
530
<210> 27
<211> 543
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 27
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln 20 25 30
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser 35 40 45
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 50 55 60
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 65 70 75 80
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 85 90 95
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 100 105 110
Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 115 120 125
Lys Glu Gly Asp Ser Ser Arg Trp Ser Tyr Asp Leu Trp Gly Arg Gly 130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val 165 170 175
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser 180 185 190
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro 195 200 205
Gly Lys Ala Pro Lys Val Met Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser 210 215 220
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser 225 230 235 240
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 245 250 255
Ser Ser Tyr Thr Ile Ala Ser Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr 260 265 270
Lys Leu Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 275 280 285
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 290 295 300
Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly 305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Ser Lys Arg Lys Arg Lys His Met Lys Leu Leu 325 330 335
Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys 340 345 350
Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp 355 360 365
Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe 385 390 395 400
Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp 405 410 415
Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp 420 425 430
Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr 435 440 445
Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser 450 455 460
Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala 465 470 475 480
Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp 485 490 495
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu 500 505 510
Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu 515 520 525
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 530 535 540
<210> 28
<211> 542
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 28
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln 20 25 30
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 35 40 45
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr 50 55 60
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 65 70 75 80
Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr 85 90 95
Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met 100 105 110
Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 115 120 125
Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 130 135 140
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu 165 170 175
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln 180 185 190
Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln 195 200 205
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 210 215 220
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr 245 250 255
Tyr Cys Ser Gln Ser Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 260 265 270
Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 275 280 285
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 290 295 300
Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly 305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser 325 330 335
Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys 340 345 350
Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu 355 360 365
Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His 370 375 380
Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu 385 390 395 400
Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser 405 410 415
Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn 420 425 430
Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp 435 440 445
Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser 450 455 460
Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala 465 470 475 480
Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe 485 490 495
Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp 500 505 510
Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly 515 520 525
Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
530 535 540
<210> 29
<211> 543
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 29
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln 20 25 30
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 35 40 45
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr 50 55 60
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 65 70 75 80
Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met 100 105 110
Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 115 120 125
Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 130 135 140
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu 165 170 175
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln 180 185 190
Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln 195 200 205
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 210 215 220
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 225 230 235 240
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr 245 250 255
Tyr Cys Ser Gln Ser Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 260 265 270
Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 275 280 285
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 290 295 300
Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly 305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Ser Lys Arg Lys Arg Lys His Met Lys Leu Leu 325 330 335
Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys 340 345 350
Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp 355 360 365
Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala 370 375 380
His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe 385 390 395 400
Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp 405 410 415
Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp 420 425 430
Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr 435 440 445
Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser 450 455 460
Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala 465 470 475 480
Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp 485 490 495
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu 500 505 510
Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu 515 520 525
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 530 535 540
<210> 30
<211> 542
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 30
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val 50 55 60
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 100 105 110
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 115 120 125
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser 130 135 140
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val 180 185 190
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro 195 200 205
Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 210 215 220
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 225 230 235 240
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly 245 250 255
Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 260 265 270
Val Ser Ser Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 275 280 285
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 290 295 300
Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly 305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser 325 330 335
Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys 340 345 350
Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu 355 360 365
Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His 370 375 380
Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu 385 390 395 400
Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser 405 410 415
Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn 420 425 430
Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp 435 440 445
Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser 450 455 460
Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala 465 470 475 480
Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe 485 490 495
Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp 500 505 510
Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly 515 520 525
Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 530 535 540
<210> 31
<211> 543
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 31
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val 50 55 60
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 100 105 110
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 115 120 125
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser 130 135 140
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val 180 185 190
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro 195 200 205
Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 210 215 220
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 225 230 235 240
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly 245 250 255
Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 260 265 270
Val Ser Ser Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 275 280 285
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 290 295 300
Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly 305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Ser Lys Arg Lys Arg Lys His Met Lys Leu Leu 325 330 335
Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys 340 345 350
Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp 355 360 365
Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala 370 375 380
His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe 385 390 395 400
Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp 405 410 415
Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp 420 425 430
Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr 435 440 445
Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser 450 455 460
Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala 465 470 475 480
Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp 485 490 495
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu 500 505 510
Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu 515 520 525
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 530 535 540
<210> 32
<211> 542
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 32
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val 50 55 60
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 100 105 110
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 115 120 125
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser 130 135 140
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val 180 185 190
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro 195 200 205
Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 210 215 220
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 225 230 235 240
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly 245 250 255
Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 260 265 270
Val Ser Ser Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 275 280 285
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 290 295 300
Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly 305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser 325 330 335
Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys 340 345 350
Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu 355 360 365
Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His 370 375 380
Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu 385 390 395 400
Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser 405 410 415
Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn 420 425 430
Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp 435 440 445
Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser 450 455 460
Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala 465 470 475 480
Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe 485 490 495
Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp 500 505 510
Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly 515 520 525
Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser <210> 33
<211> 543
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 33
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val 50 55 60
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 100 105 110
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 115 120 125
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser 130 135 140
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val 180 185 190
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro 195 200 205
Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 210 215 220
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 225 230 235 240
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly 245 250 255
Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 260 265 270
Val Ser Ser Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 275 280 285
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 290 295 300
Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly 305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Ser Lys Arg Lys Arg Lys His Met Lys Leu Leu 325 330 335
Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys 340 345 350
Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp 355 360 365
Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala 370 375 380
His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp 405 410 415
Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp 420 425 430
Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr 435 440 445
Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser 450 455 460
Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala 465 470 475 480
Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp 485 490 495
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu 500 505 510
Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu 515 520 525
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 530 535 540
<210> 34
<211> 416
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 34
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Val Gln 20 25 30
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 35 40 45
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 50 55 60
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile 65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 100 105 110
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu 115 120 125
Gly Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Ala Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr 130 135 140
Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 145 150 155 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 165 170 175
Cys Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val 180 185 190
Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser Lys Arg Lys Arg Lys His Met Lys Leu 195 200 205
Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu 210 215 220
Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn 225 230 235 240
Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu 260 265 270
Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met 275 280 285
Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln 290 295 300
Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu 305 310 315 320
Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser 325 330 335
Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser 340 345 350
Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp 355 360 365
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp 370 375 380
Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met 385 390 395 400
Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 405 410 415
<210> 35
<211> 426
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 35
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Val Gln 20 25 30
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 35 40 45
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 50 55 60
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile 65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 100 105 110
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu 115 120 125
Gly Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Ala Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr 130 135 140
Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro 145 150 155 160
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 165 170 175
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Phe Met Tyr Val Ala 180 185 190
Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu 195 200 205
Ser Lys Arg Lys Arg Lys His Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln 210 215 220
Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser 245 250 255
Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val 260 265 270
Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro 275 280 285
Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile 290 295 300
Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp 305 310 315 320
Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr 325 330 335
Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser 340 345 350
Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser 355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met 370 375 380
Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 385 390 395 400
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu 405 410 415
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
420 425
<210> 36
<211> 277
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Synthetic construct
<400> 36
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln 20 25 30
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser 35 40 45
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr Tyr 50 55 60
Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 65 70 75 80
Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr 85 90 95
Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met 100 105 110
Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 115 120 125
Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 130 135 140
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu 165 170 175
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln 180 185 190
Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 210 215 220
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 225 230 235 240
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr 245 250 255
Tyr Cys Ser Gln Ser Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 260 265 270
Lys Leu Glu Ile Lys
275
<210> 37
<211> 277
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 37
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val 50 55 60
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 100 105 110
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 115 120 125
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser 130 135 140
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val 180 185 190
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro 195 200 205
Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 210 215 220
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 225 230 235 240
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly 245 250 255
Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 260 265 270
Val Ser Ser Gly Ser
275
<210> 38
<211> 150
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Synthetic construct
<400> 38
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Glu Val Gln 20 25 30
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 35 40 45
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 50 55 60
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile 65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 100 105 110
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu 115 120 125
Gly Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Ala Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr 130 135 140
Leu Val Thr Val Ser Ser
145 150
<210> 39
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 39
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
20 25
<210> 40
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 40
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala 1 5 10 15
Cys Asp
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 41
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe 1 5 10 15
Ala Cys Asp
<210> 42
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 42
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu 20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys
35
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 43
Arg Arg Arg Arg Glu His
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 44
Lys Tyr Lys Gln Lys Pro Lys
1 5
<210> 45
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 45
Lys Arg Arg Arg
1
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Synthetic construct <400> 46
Arg Lys Lys Arg Lys Gly Lys 1 5
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Synthetic construct <400> 47
Lys Gln Gln Arg Ile Lys
1 5
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Synthetic construct <400> 48
Lys Arg Lys Arg Thr His 1 5
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Synthetic construct <400> 49
Arg Arg Gln Arg Arg
1 5
<210> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 50
Lys Lys Gly Arg Arg Ser Tyr Lys
1 5
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 51
Lys Thr Lys Lys Gln Arg Lys Lys Leu His Asp Arg Leu Arg 1 5 10
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 52
Lys Arg Lys Arg Arg Thr Lys Thr Ile Arg Arg
1 5 10
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 53
Arg Lys Arg Arg Lys Glu Arg Glu Arg Ser Arg Leu Pro Arg 1 5 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 54
Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys
1 5 10
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 55
Arg Ser Arg Lys Val Asp Lys Arg
1 5
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 56
Lys Arg Arg Asp Lys Glu Arg Gln Ala Lys
1 5 10
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 57
Lys Thr Lys Lys Gln Arg Lys Gln Met His Asn His Leu Arg 1 5 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 58
Lys Lys Ser Lys Leu Ala Lys Lys Arg Lys
1 5 10
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 59
His Pro Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Lys 1 5 10
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 60
Arg Arg Arg Ser Lys Tyr Ser Lys Ala Lys
1 5 10
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 61
His Arg Arg Cys Lys His Arg Thr Gly Lys
1 5 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 62
Lys Lys Arg Lys Leu Ala Lys Lys Arg Lys
1 5 10
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 63
Arg Arg Lys Arg Glu His
1 5
<210> 64
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> X can be any amino acid residue
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X represents a hydrophobic residue such as Leu, Ile, Val, Phe, Trp, Tyr, Val, Met, and Pro
<400> 64
Pro Xaa Xaa Xaa
1
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> X can be any amino acid residue
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X represents a hydrophobic residue such as Leu, Ile, Val, Phe, Trp, Tyr, Val, Met, and Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X is either Ser or Thr
<400> 65
Pro Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X is either Leu or Gln
<400> 66
Pro Xaa Gly Met Thr Ser
1 5
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2)
<223> X is either Leu or Gln <400> 67
Pro Xaa Gly Met Thr
1 5
<210> 68
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Synthetic construct <400> 68
Val Gly Arg
1
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Synthetic construct <400> 69
Glu Asn Leu Tyr Thr Gln Ser 1 5
<210> 70
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Synthetic construct <400> 70
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 71
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 71
Leu Val Pro Arg
1
<210> 72
<211> 277
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 72
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val 50 55 60
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 100 105 110
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 115 120 125
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser 130 135 140
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val 180 185 190
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro 195 200 205
Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 210 215 220
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 225 230 235 240
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly 245 250 255
Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 260 265 270
Val Ser Ser Gly Ser
275
<210> 73
<211> 543
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 73
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Ala Thr Val Val 290 295 300
Ile Val Val Cys Val Ser Phe Leu Val Phe Met Ile Ile Leu Gly Val 305 310 315 320
Phe Arg Ile Arg Ala Ala His Arg Arg Thr Met Arg Met Lys Leu Leu 325 330 335
Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys 340 345 350
Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp 355 360 365
Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala 370 375 380
His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe 385 390 395 400
Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp 405 410 415
Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp 420 425 430
Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr 435 440 445
Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser 450 455 460
Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala 465 470 475 480
Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp 485 490 495
Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu 500 505 510
Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu 515 520 525
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 530 535 540
<210> 74
<211> 541
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 74
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Ile Ala Thr Val 290 295 300
Val Ile Ile Ile Ser Val Cys Met Leu Val Phe Val Val Ala Met Gly 305 310 315 320
Val Tyr Arg Val Arg Ile Ala His Gln His Met Lys Leu Leu Ser Ser 325 330 335
Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser 340 345 350
Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys 355 360 365
Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu 370 375 380
Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu 385 390 395 400
Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu 405 410 415
Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val 420 425 430
Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met 435 440 445
Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu 450 455 460
Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala 465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp 485 490 495
Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met 500 505 510
Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
530 535 540
<210> 75
<211> 537
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 75
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr 225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Ala Thr Val Val 290 295 300
Ile Val Val Cys Val Ser Phe Leu Val Phe Met Ile Ile Leu Gly Val 305 310 315 320
Phe Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala 325 330 335
Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro 340 345 350
Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro 355 360 365
Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg 385 390 395 400
Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys 405 410 415
Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala 420 425 430
Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu 435 440 445
Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn 450 455 460
Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly 465 470 475 480
Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu 485 490 495
Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp 500 505 510
Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp 515 520 525
Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
530 535
<210> 76
<211> 538
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 76
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp 20 25 30
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp 35 40 45
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu 50 55 60
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr 65 70 75 80
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 85 90 95
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu 100 105 110
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr 165 170 175
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln 180 185 190
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu 195 200 205
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys 210 215 220
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly 245 250 255
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Ile Ala Thr Val 290 295 300
Val Ile Ile Ile Ser Val Cys Met Leu Val Phe Val Val Ala Met Gly 305 310 315 320
Val Tyr Arg Lys Arg Arg Arg Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln 325 330 335
Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys 340 345 350
Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser 355 360 365
Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val 370 375 380
Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro 385 390 395 400
Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile 405 410 415
Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp 420 425 430
Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr 435 440 445
Leu Arg Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser 450 455 460
Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser 465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met 485 490 495
Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser 500 505 510
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu 515 520 525
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser
530 535
<210> 77
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 77
Ala Thr Val Val Ile Val Val Cys Val Ser Phe Leu Val Phe Met Ile 1 5 10 15
Ile Leu Gly Val Phe
20
<210> 78
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 78
Ile Ala Thr Val Val Ile Ile Ile Ser Val Cys Met Leu Val Phe Val Val Ala Met Gly Val Tyr
20
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 79
Arg Ile Arg Ala Ala His Arg Arg Thr Met Arg 1 5 10
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 80
Arg Val Arg Ile Ala His Gln His
1 5

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Himerni polipeptid koji obuhvata, od N-kraja do C-kraja:
a) ekstracelularni domen za vezivanje liganda koji ima afinitet vezivanja za odabrani ligand;
b) zglobni domen sposoban da promoviše formiranje oligomera himernog polipeptida putem intermolekularnog disulfidnog vezivanja;
c) transmembranski domen koji obuhvata jedno ili više mesta proteolitičkog isecanja indukovanog ligandom; i
d) intracelularni domen koji obuhvata transkripcioni regulator, pri čemu vezivanje odabranog liganda za ekstracelularni domen za vezivanje liganda indukuje sečenje na proteolitičkom mestu koje je indukovano ligandom i koje se nalazi između transkripcionog regulatora i domena zgloba,
i pri čemu himerni polipeptid ne sadrži LIN-12-Notch ponovke (LNR) i/ili heterodimerizacioni domen (HD) Notch receptora.
2. Himerni polipeptid patentnog zahteva 1, pri čemu transmembranski domen dodatno obuhvata sekvencu za zaustavlјanja transfera.
3. Himerni polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, pri čemu ekstracelularni domen obuhvata deo koji vezuje antigen i koji je sposoban da se veže za ligand na površini ćelije.
4. Himerni polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, gde je:
(i) ligand odabran iz grupe koju čine CD1, CD1a, CD1b, CD1c, CD Id, CD1e, CD2, CD3d, CD3e, CD3g, CD4, CD5, CD7, CD8a, CD8b, CD19, CD20, CD21, CD22 , CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD34, CD40, CD45, CD48, CD52, CD59, CD66, CD70, CD71, CD72, CD73, CD79A, CD79B, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD94, CD95, CD134, CD140 (PDGFR4), CD152, CD154 , CD158, CD178, CD181 (CXCR1), CD182 (CXCR2), CD183 (CXCR3), CD210, CD246, CD252, CD253, CD261, CD262, CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD276 (B7H3), CD279, CD295, CD339 (JAG1), CD340 (HER2), EGFR, FGFR2, CEA, AFP, CA125, MUC-1, MAGE, alkalna fosfataza, placentalu sličan 2 (ALPPL2), antigen sazrevanja B-ćelija (BCMA), zeleni fluorescentni protein (GFP), pobolјšani zeleni fluorescentni protein (EGFP) i signalni regulatorni protein α (SIRPα); i/ili
(ii) ligand je odabran između receptora na površini ćelije, adhezivnih proteina, integrina, mucina, lektina, tumorskih antigena i tumor-specifičnih antigena; i/ili
(iii) ligand je antigen povezan sa tumorom ili tumor-specifični antigen; i/ili
(iv) ekstracelularni domen koji vezuje ligand obuhvata deo receptora koji vezuje ligand.
5. Himerni polipeptid patentnog zahteva 3 ili 4, gde:
(i) deo koji vezuje antigen izabran je iz grupe koju čine antitelo, nanotelo, diatelo, triatelo, minitelo, F(ab')2fragment, F(ab)v fragment, jednolančani varijabilni fragment (scFv), jednodomensko antitelo (sdAb) i njihov funkcionalni fragment; i/ili
(ii) deo koji vezuje antigen specifično se vezuje za antigen povezan sa tumorom, odabran je iz grupe koju čine CD19, B7H3 (CD276), BCMA (CD269), ALPPL2, CD123, CD171, CD179a, CD20, CD213A2, CD22, CD2 CD246, CD272, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD46, CD71, CD97, CEA, CLDN6, CLECL1, CS-1, EGFR, EGFRvIII, ELF2M, EpCAM, EphA2, Ephrin B2, FAP, FLT3, GD2, GD3, GM3, GPRC5D, HER2 (ERBB2/neu), IGLL1, IL-11Rα, KIT (CD117), MUC1, NCAM, PAP, PDGFR-β, PRSS21, PSCA, PSMA, ROR1, SIRPα, SSEA-4, TAG72, TEM1/CD248, TEM7R, TSHR, VEGFR2, ALPI, citrulinirani vimentin, cMet, i Axl.
6. Himerni polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, pri čemu:
(i) jedno ili više mesta proteolitičkog isecanja indukovanog ligandom obuhvata mesto sečenja gama sekretazom; i/ili
(ii) intracelularni domen obuhvata sekvencu nuklearne lokalizacije i sekvencu transkripcionog regulatora odabranu iz grupe koju čine Gal4-VP16, Gal4-VP64, tetR-VP64, ZFHD1-VP64, Gal4-KRAB i HAP1-VP16; i/ili
(iii) himerni polipeptid koji dodatno obuhvata dodatno proteolitičko mesto isecanja, signalnu sekvencu, detektabilnu oznaku, tumorski specifično mesto za isecanje, mesto isecanja specifično za bolest i njihove kombinacije; i/ili
(iv) domen zgloba je izveden iz domena zgloba CD8α, domena zgloba CD28, domena zgloba CD152, domena zgloba PD-1, domena zgloba CTLA4, domena zgloba OX40, domena zgloba IgG1, domena zgloba IgG2 , domena zgloba IgG3, domena zgloba IgG4, ili funkcionalne varijante bilo kojeg od njih; i/ili
(v) zglobni domen je izveden iz zglobnog domena CD8α, zglobnog domena CD28, zglobnog domena OX40, zglobnog domena IgG4 ili njihove funkcionalne varijante; i/ili
(vi) zglobni domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NOS: 12-16 i 39-42; i/ili
(vii) sekvenca zaustavljanja transfera obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NOS: 18-19, 43-63, 79 i 80; i/ili
(viii) transmembranski domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NOS: 17, 77 i 78; i/ili
(ix) himerni polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NOS: 1-8, 24-35 i 73-76; i/ili
(x) himerni polipeptid ne obuhvata LIN-12-Notch ponovke (LNR) niti heterodimerizacioni domen (HD) Notch receptora.
7. Rekombinantna nukleinska kiselina koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira himerni polipeptid prema patentnim zahtevima 1 do 6.
8. Rekombinantna ćelija koja obuhvata:
a) himerni polipeptid prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6; i/ili
b) rekombinantnu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 7.
9. Rekombinantna ćelija patentnog zahteva 8, koja obuhvata:
1
a) prvi himerni polipeptid i drugi himerni polipeptid prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6; i/ili
b) prvu nukleinsku kiselinu i drugu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 7; pri čemu prvi himerni polipeptid i drugi himerni polipeptid nemaju istu sekvencu, i/ili prva nukleinska kiselina ili druga nukleinska kiselina nemaju istu sekvencu, opciono pri čemu prvi himerni polipeptid moduliše ekspresiju i/ili aktivnost drugog himernog polipeptida.
10. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata farmaceutski prihvatlјiv nosač i jedno ili više od sledećeg:
a) rekombinantnu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 7; i
b) rekombinantnu ćeliju prema patentnom zahtevu 8 ili 9.
11. ex vivo ili in vitro postupak za modulaciju aktivnosti ćelije, postupak obuhvata:
a) obezbeđivanje rekombinantne ćelije prema patentnom zahtevu 8 ili 9; i
b) dovođenje u kontakt rekombinantne ćelije sa odabranim ligandom, pri čemu vezivanje izabranog liganda za vanćelijski domen koji vezuje ligand indukuje isecanje na mestu proteolitičkog isecanja indukovanog ligandom i oslobađanje transkripcionog regulatora, pri čemu oslobođeni transkripcioni regulator moduliše aktivnost rekombinantne ćelije.
12. Rekombinantna ćelija za upotrebu u postupku za lečenje zdravstvenog stanja kod pojedinca kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata davanje pojedincu prve terapije koja uključuje efikasan broj rekombinantnih ćelija prema patentnom zahtevu 8 ili 9, gde rekombinantna ćelija leči zdravstveno stanje pojedinca.
13. Rekombinantna ćelija za upotrebu u patentnom zahtevu 12, koja dalјe uključuje davanje pojedincu druge terapije, koja može biti izabrana iz grupe koju čine hemoterapija, radioterapija, imunoterapija, hormonska terapija i terapija toksinom, opciono pri čemu se prva terapija i druga terapija daju (i) zajedno u istoj kompoziciji ili u odvojenim kompozicijama, ili (ii) u isto vreme.
14. Rekombinantna ćelija za upotrebu u patentnom zahtevu 12 ili 13, gde je zdravstveno stanje kancer koji može biti solidni tumor, tumor mekog tkiva ili metastatska lezija.
15. Postupak za dobijanje rekombinantne ćelije prema patentnom zahtevu 8 ili 9, koji obuhvata:
a) obezbeđivanje ćelije sposobne za ekspresiju proteina;
b) dovođenje u kontakt obezbeđene ćelije sa rekombinantnom nukleinskom kiselinom prema patentnom zahtevu 7 u obezbeđenu ćeliju, opciono gde se ćelija dobija leukaferezom izvedenom na uzorku dobijenom od subjekta, i ćelija se dovodi u kontakt ex vivo.
1
RS20250107A 2019-09-24 2020-09-23 Notch receptori sa zglobnim domenom RS66476B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962905263P 2019-09-24 2019-09-24
US201962905251P 2019-09-24 2019-09-24
PCT/US2020/052327 WO2021061862A1 (en) 2019-09-24 2020-09-23 Notch receptors with hinge domain
EP20869739.1A EP4034252B1 (en) 2019-09-24 2020-09-23 Notch receptors with hinge domain

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66476B1 true RS66476B1 (sr) 2025-03-31

Family

ID=75167117

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250107A RS66476B1 (sr) 2019-09-24 2020-09-23 Notch receptori sa zglobnim domenom

Country Status (21)

Country Link
US (3) US11202801B2 (sr)
EP (2) EP4461748A3 (sr)
JP (2) JP2022548796A (sr)
KR (1) KR20220087454A (sr)
CN (2) CN119569894A (sr)
AU (1) AU2020355031A1 (sr)
BR (1) BR112022005283A2 (sr)
CA (1) CA3155661A1 (sr)
DK (1) DK4034252T3 (sr)
ES (1) ES3008682T3 (sr)
FI (1) FI4034252T3 (sr)
HR (1) HRP20250135T1 (sr)
HU (1) HUE069963T2 (sr)
IL (2) IL291558B2 (sr)
LT (1) LT4034252T (sr)
PL (1) PL4034252T3 (sr)
PT (1) PT4034252T (sr)
RS (1) RS66476B1 (sr)
SI (1) SI4034252T1 (sr)
SM (1) SMT202500031T1 (sr)
WO (1) WO2021061862A1 (sr)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS66476B1 (sr) 2019-09-24 2025-03-31 Univ California Notch receptori sa zglobnim domenom
CA3179954A1 (en) * 2020-04-09 2021-10-14 The Regents Of The University Of California Humanized notch receptors with hinge domain
AU2022244245A1 (en) * 2021-03-23 2023-10-05 The Regents Of The University Of California Synthetic intermembrane proteolysis receptors for custom antigen-induced transcriptional regulation
JP2024537991A (ja) 2021-10-14 2024-10-18 アーセナル バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 共発現されるｓｈＲＮＡと論理ゲートシステムとを有する免疫細胞
EP4444748A4 (en) * 2021-12-07 2025-12-24 Univ California SYNTHETIC CYTOKINE CIRCUITS TO PROMOTE INFILTRATION AND ELIMINATION OF SOLID TUMORS EXCLUDED FROM THE IMMUNE SYSTEM BY MODIFIED IMMUNE CELLS
CN114349840B (zh) * 2021-12-13 2024-07-12 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种融合蛋白及其制备方法与应用
CN114621929B (zh) * 2021-12-21 2023-05-30 河南省肿瘤医院 一种抗肿瘤树突状细胞及其制备方法、表达载体及应用
CA3253061A1 (en) * 2022-05-16 2023-11-23 The Regents Of The University Of California T-LYMPHOCYTE ACTIVATION-SENSITIVE CONSTRUCTIONS FOR ENHANCED T-LYMPHOCYTE THERAPY (CAR)
US12257304B2 (en) 2023-03-03 2025-03-25 Arsenal Biosciences, Inc. Systems targeting PSMA and CA9
WO2024249416A2 (en) * 2023-06-01 2024-12-05 Vanderbilt University Engineered cells to detect and respond to amyloid beta peptides
CN117304343B (zh) * 2023-10-11 2024-05-07 北京景达生物科技有限公司 Gpc3靶向的car-nk细胞的制备及其应用
CN120248130A (zh) * 2023-12-28 2025-07-04 上海恩凯细胞技术有限公司 特异性靶向肿瘤的转基因重组免疫细胞及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE234011T1 (de) * 1994-08-02 2003-03-15 Gen Hospital Corp Zellen, die einen cd4-scheinrezeptor tragen und entsprechende moleküle und verfahren
KR20230007559A (ko) * 2013-12-20 2023-01-12 프레드 허친슨 캔서 센터 태그된 키메라 이펙터 분자 및 그의 리셉터
JP6784687B2 (ja) * 2015-02-24 2020-11-11 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 結合誘発型転写スイッチ及びその使用方法
KR102917220B1 (ko) * 2016-01-11 2026-01-22 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 키메라 단백질 및 유전자 발현을 조절하는 방법
KR102637610B1 (ko) * 2016-08-23 2024-02-19 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 단백질용해 절단가능한 키메라 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법
EP3568466A4 (en) * 2017-01-10 2020-07-15 The General Hospital Corporation TARGETED T CELLS WITH CYTOTOXICITY TO IMMUNOSUPPRESSIVE CELLS
US11325957B2 (en) * 2017-06-19 2022-05-10 Cell Design Labs, Inc. Methods and compositions for reducing the immunogenicity of chimeric notch receptors
US10724680B2 (en) * 2017-07-06 2020-07-28 Robert Anthony Benson, SR. Personal device holder
WO2019079486A1 (en) * 2017-10-18 2019-04-25 Intrexon Corporation POLYPEPTIDE COMPOSITIONS COMPRISING SPACERS
RS66476B1 (sr) 2019-09-24 2025-03-31 Univ California Notch receptori sa zglobnim domenom

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020355031A1 (en) 2022-05-19
US20240075062A1 (en) 2024-03-07
IL307609B1 (en) 2024-11-01
EP4461748A2 (en) 2024-11-13
PT4034252T (pt) 2025-01-31
ES3008682T3 (en) 2025-03-24
PL4034252T3 (pl) 2025-03-10
IL291558B2 (en) 2024-03-01
IL307609B2 (en) 2025-03-01
US11202801B2 (en) 2021-12-21
EP4034252B1 (en) 2024-11-06
IL307609A (en) 2023-12-01
SMT202500031T1 (it) 2025-03-12
HRP20250135T1 (hr) 2025-03-28
SI4034252T1 (sl) 2025-04-30
DK4034252T3 (da) 2025-01-27
EP4034252A4 (en) 2023-11-08
EP4461748A3 (en) 2025-01-22
FI4034252T3 (fi) 2025-01-30
CN114761084A (zh) 2022-07-15
US20210268024A1 (en) 2021-09-02
HUE069963T2 (hu) 2025-04-28
BR112022005283A2 (pt) 2022-08-16
WO2021061862A1 (en) 2021-04-01
IL291558A (en) 2022-05-01
JP2026047360A (ja) 2026-03-13
LT4034252T (lt) 2025-02-10
CA3155661A1 (en) 2021-04-01
US11617766B2 (en) 2023-04-04
CN119569894A (zh) 2025-03-07
US20220133797A1 (en) 2022-05-05
EP4034252A1 (en) 2022-08-03
JP2022548796A (ja) 2022-11-21
CN114761084B (zh) 2023-10-27
KR20220087454A (ko) 2022-06-24
IL291558B1 (en) 2023-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11617766B2 (en) Notch receptors with hinge domain
US20220372101A1 (en) Novel receptors having a heterologous stop transfer sequence for ligand-dependent transcriptional regulation
US20220348677A1 (en) Receptors with heterologous transmembrane domain
US20220340637A1 (en) Notch receptors with minimal linker
US20230183709A1 (en) Humanized notch receptors with hinge domain
US20240181057A1 (en) Synthetic intermembrane proteolysis receptors for custom antigen-induced transcriptional regulation
US20230174612A1 (en) Notch receptors with zinc finger-containing transcriptional effector
US20220356225A1 (en) Notch receptors with zinc finger-containing transcriptional effector
US20240262882A1 (en) Novel receptors for ligand-dependent transcriptional regulation
US20220348628A1 (en) Novel receptors having a fibronectin repeat for ligand-dependent transcriptional regulation
EA047690B1 (ru) Рецепторы notch с шарнирным доменом
HK40120333A (zh) 具有铰链结构域的notch受体