RS66837B1

RS66837B1 - Agensi sa dvostrukim vezivanjem za pd1 i vegfr2

Info

Publication number: RS66837B1
Application number: RS20250448A
Authority: RS
Inventors: William James Jonathan Finlay
Original assignee: Ottimo Pharma Ltd
Priority date: 2019-10-11
Filing date: 2020-10-09
Publication date: 2025-06-30
Also published as: GB201914747D0; JP2025134713A; US12479920B2; JP7689116B2; CN121758618A; US20260167726A1; FI4041763T3; AU2020365021B2; WO2021069670A1; EP4671279A3; EP4570824A3; US20250243276A1; EP4041763B1; SI4041763T1; HRP20250523T1; PL4041763T3; US20240101674A1; IL292158A; EP4041763A1; AU2020365021A1

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Pronalazak se odnosi na molekule antitela koji se specifično vezuju i za PD1 (takođe poznat kao programirana ćelijska smrt 1, PDCD1, CD279, PD-1, SLEB2, PD-I, SLE1) i za VEGFR2 (takođe poznat kao KDR, CD309, FLK1, receptor kinaznog umetnutog domena) i njihovu medicinsku primenu.

POZADINA PRONALASKA

[0002] PD1 je receptor na ćelijskoj površini za koji je pokazano da je posrednik imunološke „kontrolne tačke”. Aktivnost PD1 kontrolne tačke minimizira rizik od autoimunosti tako što promoviše apoptozu (programiranu ćelijsku smrt) u T ćelijama koje se nalaze u limfnim čvorovima i koje su reaktivne na sopstvene antigene, i tako što promoviše preživljavanje regulatornih (anti-inflamatornih) T ćelija. Antagonizam aktivnosti PD1 pomoću humanih ili humanizovanih monoklonskih antitela pokazao se kao uspešan terapijski pristup u lečenju više oblika kancera, jer može dovesti do reaktivacije T ćelija u tumoru. Ovaj klinički uspeh doveo je do porasta broja molekula anti-PD1 antitela koji se ispituju u kliničkim studijama, ali većina pacijenata i dalje ne postiže trajan antikancerogeni odgovor kada se leče samo anti-PD1 agensima.

[0003] Povećanje broja pacijenata koji će odgovoriti na terapiju anti-PD1 antitelima predstavlja značajan izazov. Moguća strategija za poboljšanje stopa kliničkog odgovora na anti-PD1 antitela je njihovo kombinovanje sa prethodno dokazanim terapijama protiv kancera, kao što su anti-angiogeni agensi. Jedna takva klasa agenasa su antitela koja blokiraju VEGF signalni put, kao što su anti-VEGFR2 ili anti-VEGF antitela. Međutim, takve kombinovane terapije zahtevaju upotrebu dva odvojena, skupa agensa, od kojih svaki nosi sopstvene rizike od toksičnosti. I dalje postoji potreba za jednim agensom koji pruža prednosti kombinovane terapije bez nedostataka kombinovanja dva odvojena agensa.

[0004] WO2015/085847A1 opisuje antagonistički mišji anti-PD1 IgG molekul nazvan „MAb005”, kao i pripremu humanizovanih oblika MAb005. Iz razloga koji se ovde navode, takvi humanizovani oblici MAb005 opisani u WO2015/085847A1 nisu idealni. Lu et al. (Cancer Res (2016) 76 (14_Supplement): 572) opisuje bispecifično anti-PDL1 x anti-VEGFR2 antitelo gde je jednolančano antitelo visokog afiniteta za PDL1 genetski fuzionisano sa C-krajem teškog lanca konvencionalnog IgG antitela protiv VEGFR2.

SAŽETAK PRONALASKA

[0005] Sadašnji pronalazak obezbeđuje brojna anti-PD1 i anti-VEGFR2 dvostruko antagonistička antitela, koja su definisana u patentnim zahtevima, i njihovu medicinsku primenu.

[0006] Pronalazak obezbeđuje antitelo koje se specifično vezuje i za PD1 i za VEGFR2 ili antigen-vezujući deo antitela, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), gde

(a) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 42) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO: 5) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11);

(b) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 42) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11);

(c) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 42) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence TASSLAD (SEQ ID NO: 40) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); ili

(d) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 42) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLAD (SEQ ID NO: 41) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11).

[0007] U nekim aspektima, ovde je obelodanjeno antitelo koje se specifično vezuje i za PD1 i za VEGFR2 ili antigen-vezujući deo antitela, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), gde

(a) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:49, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:44;

(b) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:49, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:47;

(c) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:49, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:45; ili

(d) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:49, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:46.

[0008] Takođe, prema pronalasku je obezbeđen imunokonjugat koji sadrži molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo prema pronalasku, fuzionisan ili konjugovan sa terapijskim agensom.

[0009] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo prema pronalasku.

[0010] Dalje je obezbeđen vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema pronalasku.

[0011] Takođe je obezbeđena ćelija domaćin koja sadrži molekul nukleinske kiseline ili vektor prema pronalasku kako je ovde definisano.

[0012] U daljem aspektu, obezbeđena je metoda za proizvodnju anti-PD1/VEGFR2 antitela i/ili njegovog antigen-vezujućeg dela, koja obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku pod uslovima koji rezultiraju ekspresijom i/ili proizvodnjom antitela i/ili njegovog antigen-vezujućeg dela, i izolovanje antitela i/ili njegovog antigen-vezujućeg dela iz ćelije domaćina ili kulture.

[0013] U drugom aspektu pronalaska obezbeđen je farmaceutski sastav koji sadrži molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo prema pronalasku kako je ovde definisano, ili molekul nukleinske kiseline prema pronalasku kako je ovde definisano, ili vektor prema pronalasku kako je ovde definisano.

[0014] Dalje je obezbeđena, radi reference, metoda za pojačavanje imunog odgovora kod subjekta, koja obuhvata primenu efektivne količine molekula antitela ili njegovog antigenvezujućeg dela prema pronalasku kako je ovde definisano, ili imunokonjugata prema pronalasku kako je ovde definisano, ili molekula nukleinske kiseline prema pronalasku kako je ovde definisano, ili vektora prema pronalasku kako je ovde definisano, ili farmaceutskog sastava prema pronalasku kako je ovde definisano.

[0015] U daljem aspektu obezbeđena je, radi reference, metoda za lečenje ili prevenciju kancera kod subjekta, koja obuhvata primenu efektivne količine molekula antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela prema pronalasku kako je ovde definisano, ili imunokonjugata prema pronalasku kako je ovde definisano, ili molekula nukleinske kiseline prema pronalasku kako je ovde definisano, ili vektora prema pronalasku kako je ovde definisano, ili farmaceutskog sastava prema pronalasku kako je ovde definisano.

[0016] Dalje je ovde obezbeđen molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo kako je ovde definisano, ili imunokonjugat kako je ovde definisano, ili molekul nukleinske kiseline kako je ovde definisano, ili vektor kako je ovde definisano, ili farmaceutski sastav kako je ovde definisano, za upotrebu kao medikament. Pronalazak takođe obezbeđuje molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo prema pronalasku kako je ovde definisano, ili imunokonjugat prema pronalasku kako je ovde definisano, ili molekul nukleinske kiseline prema pronalasku kako je ovde definisano, ili vektor prema pronalasku kako je ovde definisano, ili farmaceutski sastav prema pronalasku kako je ovde definisano, za upotrebu u lečenju kancera.

[0017] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje molekul antitela, ili njegov antigenvezujući deo, ili imunokonjugat, ili molekul nukleinske kiseline, ili vektor za upotrebu u metodama lečenja kako je ovde definisano, za odvojenu, sekvencijalnu ili simultanu upotrebu u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom, na primer, antikancerogenim agensom.

[0018] U daljem aspektu obezbeđena je, radi reference, upotreba molekula antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela prema pronalasku kako je ovde definisano, ili imunokonjugata prema pronalasku kako je ovde definisano, ili molekula nukleinske kiseline prema pronalasku kako je ovde definisano, ili vektora prema pronalasku kako je ovde definisano, ili farmaceutskog sastava prema pronalasku kako je ovde definisano, u proizvodnji medikamenta za lečenje kancera.

[0019] Takođe je obezbeđena, radi reference, metoda za lečenje ili prevenciju infektivne bolesti kod subjekta, koja obuhvata primenu efektivne količine molekula antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela kako je ovde definisano, ili imunokonjugata kako je ovde definisano, ili molekula nukleinske kiseline kako je ovde definisano, ili vektora kako je ovde definisano, ili farmaceutskog sastava kako je ovde definisano.

[0020] Infektivna bolest se u svim aspektima može izabrati iz grupe koju čine: virusne, bakterijske, gljivične ili parazitske bolesti. U jednom otelotvorenju, infektivna bolest je infekcija virusom humane imunodeficijencije (HIV).

[0021] Pronalazak takođe obezbeđuje molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo prema pronalasku, ili imunokonjugat prema pronalasku, ili molekul nukleinske kiseline prema pronalasku, ili vektor prema pronalasku, ili farmaceutski sastav prema pronalasku, za upotrebu u lečenju infektivne bolesti.

[0022] Dalje je obezbeđena, radi reference, upotreba molekula antitela ili njegovog antigenvezujućeg dela kako je ovde definisano, ili imunokonjugata kako je ovde definisano, ili molekula nukleinske kiseline kako je ovde definisano, ili vektora kako je ovde definisano, ili farmaceutskog sastava kako je ovde definisano, u proizvodnji medikamenta za lečenje infektivne bolesti.

[0023] Takođe je obezbeđena, radi reference, metoda za lečenje ili prevenciju infektivne bolesti kod subjekta, koja obuhvata primenu efektivne količine molekula antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela kako je ovde definisano, ili imunokonjugata kako je ovde definisano, ili molekula nukleinske kiseline kako je ovde definisano, ili vektora kako je ovde definisano, ili farmaceutskog sastava kako je ovde definisano.

KRATAK OPIS SLIKA

[0024]

SLIKA 1. Direktni ELISA test vezivanja anti-PD1 Fab fragmenata dobijenih iz biblioteke za humane i cyno PD1 i humane i rezus VEGFR2 proteine. Klonovi su dobijeni iz više grana selekcije biblioteke faga gde su populacije faga selektovane na biotinilovanim ciljnim proteinima u svakoj rundi. Nakon svake runde selekcije, klonovi dobijeni iz biblioteke (crni krugovi) su skrinirani kao Fab proteini eksprimirani u periplazmi, na humane (hu) i cyno (cy) PD1 i humane (hu) i rezus (rh) VEGFR2. hMAb005 v-domeni eksprimirani kao humani IgG1 Fab korišćeni su kao pozitivne kontrole na svakoj ploči (sivi rombovi).

SLIKA 2A - SLIKA 2B. Analiza kompeticije za epitop Fab proteina pomoću Alphascreen tehnologije Anti-PD1 klonovi su eksprimirani kao Fab u E. coli i preparati iz periplazme su primenjeni u testu kompeticije za epitop koristeći Alphascreen tehnologiju. U ovom testu, Fab fragmenti dobijeni iz biblioteke analizirani su na relativne afinitete i zadržavanje epitopa roditeljskog hMAb005 kompeticijom za vezivanje hMAb005 IgG1null za humani PD1 protein, u rastvoru.

SLIKA 3A - SLIKA 3B. Direktni ELISA test titracije za vezivanje prečišćenog IgG1 null za humane i cyno PD1-Fc, humane i rezus VEGFR2 proteine. hMab005, izotipska kontrola IgG1 i klonovi dobijeni iz biblioteke u humanom IgG1 null formatu titrirani su (u nM) u direktnom ELISA testu vezivanja za humane i cyno PD1 proteine (slika 3A), i humane i rezus VEGFR2 proteine (slika 3B).

SLIKA 4. Test antagonizma VEGFR2 zasnovan na ćelijama. hMab005, izotipska kontrola IgG1 i klonovi dobijeni iz biblioteke u humanom IgG1 null formatu titrirani su (u nM) u testu humane VEGFR2 signalizacije, u koji je dodat humani VEGF-165 protein da indukuje VEGFR2 signalizaciju. Ni hMab005 ni izotipska kontrola IgG1 protein nisu pokazali koncentraciono-zavisan antagonizam VEGFR2. Svih 11 vodećih klonova i pozitivna kontrola anti-VEGFR2 IgG1 Ramucirumab pokazali su potentan antagonizam, u nM opsegu.

SLIKA 5A - SLIKA 5K. Test antagonizma VEGFR2 zasnovan na ćelijama - analiza pojedinačnih klonova. Antagonizam VEGFR2 za vodeće klonove prikazane na slici 4 ponovo je analiziran za svaki klon pojedinačno. Dok su svih 11 vodećih klonova pokazali potentan antagonizam, klonovi dobijeni iz biblioteke sa mutacijama pronađenim u samo jednom CDR po klonu (slika 5A - slika 5E) pokazali su se kao manje potentni od klonova koji su kombinovali mutacije i u LCDR1 i u LCDR3 (slika 5F - slika 5K).

SLIKA 6. Test antagonizma PD1 zasnovan na ćelijama. hMab005 (SHR-1210 IgG1-3M), izotipska kontrola IgG1, Nivolumab IgG4 i klonovi MAB06.1-MAB06.8 (u humanom IgG1 null formatu) titrirani su u testu humane PD1 signalizacije, u kojem se mešaju humane PD1+ i humane PD-L1+ ćelije, a antagonizam interakcije PD1/PD-L1 rezultira povećanim signalom.

Izotipska kontrola IgG1 protein nije pokazala nikakav koncentraciono-zavisan antagonizam PD1. Klonovi MAB06.1-MAB06.8, hMab005 i pozitivna kontrola anti-PD1 IgG4 Nivolumab pokazali su potentan antagonizam, u nM opsegu.

SLIKA 7. Test antagonizma VEGFR2 zasnovan na ćelijama. hMab005 (SHR-1210 IgG1-3M), izotipska kontrola IgG1, Nivolumab IgG4 i klonovi MAB06.1-MAB06.8 (u humanom IgG1 null formatu) titrirani su u testu humane VEGFR2 signalizacije, u koji je dodat humani VEGF-165 protein da indukuje VEGFR2 signalizaciju. Ni hMab005 ni izotipska kontrola IgG1 protein nisu pokazali koncentraciono-zavisan antagonizam VEGFR2. Klonovi MAB06.1-MAB06.8 i pozitivna kontrola anti-VEGFR2 IgG1 Ramucirumab pokazali su potentan antagonizam, u nM opsegu.

SLIKA 8A - SLIKA 8H. Testovi antagonizma PD1 i VEGFR2 zasnovani na ćelijama -analiza pojedinačnih klonova. Antagonizam PD1 i VEGFR2 za vodeće klonove prikazane na slici 7 ponovo je analiziran za svaki klon pojedinačno. Uporedna analiza antagonizma PD1 i VEGFR2 za klonove MAB06.5 (slika 8A, slika 8B), MAB06.6 (slika 8C, slika 8D), MAB06.7 (slika 8E, slika 8F) i MAB06.8 (slika 8G, slika 8H) pokazala je da sekvenca klona MAB06 može prihvatiti mutaciju više ostataka u LCDR1, LCDR2 i HCDR2, uz zadržavanje sposobnosti antagonizovanja signalizacije oba receptora.

SLIKA 9. Dvostruki PD1-VEGFR2 antagonizam. Imune ćelije koje infiltriraju tumor mogu eksprimirati i PD1 i VEGFR2. Ćelije kancera (ili stromalne ćelije, druge imune ćelije itd.) u tumoru mogu eksprimirati PD-L1 i/ili VEGF. Ovi signali sarađuju u supresiji imune funkcije u mikrookruženju tumora. Dvostruko antagonistička antitela koja mogu efikasno blokirati signalizaciju i PD1 i VEGFR2 (na istim ili različitim ćelijama) stoga mogu imati poboljšanu antitumorsku potentnost u odnosu na antitela koja blokiraju samo PD1 ili VEGFR2.

SLIKA 10. Test agonizma VEGFR2 zasnovan na ćelijama. Ramucirumab, izotipska kontrola humani IgG1, MAB06.5, MAB06.8 i VEGF-165 protein titrirani su u testu humane VEGFR2 signalizacije. Ni Ramucirumab, ni izotip, ni klonovi MAB06.5 i MAB06.8 nisu pokazali nikakav koncentraciono-zavisan agonizam VEGFR2. Pozitivna kontrola VEGF-165 izazvala je potentan agonizam, u nM opsegu.

SLIKA 11A - SLIKA 11F. Jednosmerni test mešane limfocitne reakcije (MLR) humanih DC:T ćelija. MAB06.5, MAB06.8 i Nivolumab (anti-PD1) titrirani su (nM) u humanom MLR testu, sa 3 odvojena para humanih donora, u dva ponovljena izvođenja. MAB6.5 i MAB6.8 pokazali su koncentraciono-zavisne potentnosti u IFN-γ signalizaciji vođenoj blokadom PD1, koje su bile ekvivalentne Nivolumabu. Ovo je utvrđeno u oba izvođenja za par donora 1 (slika 11A, slika 11B), par donora 2 (slika 11C, slika 11D) i par donora 3 (slika 11E, slika 11F).

SLIKA 12A - SLIKA 12D. Direktni ELISA test titracije za vezivanje prečišćenog IgG1 null za humane i cyno PD1-Fc, humane i cynomolgus VEGFR2 proteine. SHR-1210 IgG1-3M, izotipska kontrola IgG1 i sedam klonova treće generacije u humanom IgG1 null formatu titrirani su (u nM) u direktnom ELISA testu vezivanja za humane i cyno PD1 proteine (slika 12A, slika 12B), i humane i cynomolgus VEGFR2 proteine (slika 12C, slika 12D).

SLIKA 13A - SLIKA 13B. Testovi antagonizma PD1 i VEGFR2 zasnovani na ćelijama.

Uporedna analiza antagonizma PD1 (slika 13A) i VEGFR2 (slika 13B) za klonove SHR-1210 IgG1-3M, Nivolumab, izotipsku kontrolu IgG1 i sedam klonova treće generacije u humanom IgG1 null formatu.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0025] Pronalazak se zasniva na otkriću antitela koja neočekivano antagonizuju i PD1 i VEGF puteve. Inhibicija VEGF signalnog puta može pružiti efikasnu kombinaciju sa inhibicijom PD1 puta. VEGF-VEGFR2 signalizacija ne samo da pokreće neovaskularizaciju, već je takođe pokazano da pojačava imunosupresiju u mikrookruženju tumora, pri čemu se VEGFR2 eksprimira na više tipova imunih ćelija. Generisanje antitela dvostrukog inhibitora je, međutim, složen i nepredvidiv zadatak, jer uključuje generisanje jednog antitela sa potentnom modulacijom dva ciljna proteina, npr. PD1 i VEGFR2, koji su veoma različiti po sekvenci aminokiselina i strukturi. Ova razlika u sekvenci i strukturi između dva cilja predstavlja prepreku za uspeh u generisanju takvog antitela.

[0026] WO2015/085847A1 opisuje antagonistički mišji anti-PD1 IgG molekul nazvan „MAb005”, kao i pripremu humanizovanih oblika MAb005. Pokazalo se u kliničkim ispitivanjima da humanizovani MAb005 (hMAb005) ima veoma neobičan neželjeni efekat indukcije hemangioma. In vitro studije su uspešno utvrdile poreklo ovog problema u reaktivnosti antitela van cilja, uključujući vezivanje za VEGFR2 (Finlay et al. (2019) mAbs, 11:1, 26-44). Važno je istaći, pokazano je da vezivanje hMAb005 (takođe poznatog kao SHR-1210) za VEGFR2 dovodi do potentnog agonizma (aktivacije) receptora, što je verovatno glavni pokretač neželjenog efekta hemangioma. Iz razloga navedenih gore, takvi humanizovani oblici MAb005 opisani u WO2015/085847A1 nisu idealni. Dalje, ne može se a priori predvideti koje promene u molekularnim karakteristikama mogu pretvoriti antagonist/agonist antitelo kao što je Mab005, u dvostrukog antagonistu i PD1 i VEGFR2 puteva. Pronalazak obezbeđuje antitela koja zadržavaju potentan PD1 antagonizam, ali takođe potentno antagonizuju VEGFR2. Takva antitela mogu pružiti sinergističku kliničku korist.

[0027] Ovde je obezbeđena metoda generisanja antitela izvedenog iz hMAb005 koje se specifično vezuje za PD1 i antagonizuje VEGF-VEGFR2 signalizaciju. Na primer, takvo antitelo se može generisati uvođenjem mutacija u jednu ili više CDR sekvenci antitela hMAb005. U nekim otelotvorenjima, mutacije se uvode u LCDR1 i/ili LCDR2 i/ili HCDR2 sekvence antitela hMAb005.

[0028] U nekim aspektima, obezbeđeno je antitelo koje se specifično vezuje i za humani PD1 i za humani VEGFR2 ili antigen-vezujući deo navedenog antitela. U nekim otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo je sposoban da antagonizuje i PD1-PDL1 signalni put i VEGFR2-VEGF signalni put. U nekim otelotvorenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo antagonizuje vezivanje humanog PD1 za humani PD-L1 i antagonizuje signalizaciju humanog VEGFR2 kao odgovor na humani VEGF.

[0029] U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili antigen-vezujući deo, kako je ovde obezbeđeno, specifično se vezuje za PD1 protein koji sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:32 ili SEQ ID NO:33. U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili antigenvezujući deo, kako je ovde obezbeđeno, specifično se vezuje za PD1 protein koji ima sekvencu aminokiselina koja je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:32 ili SEQ ID NO:33.

[0030] U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili antigen-vezujući deo, kako je ovde obezbeđeno, specifično se vezuje za VEGFR2 protein koji sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:34 ili SEQ ID NO:35. U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili antigen-vezujući deo, kako je ovde obezbeđeno, specifično se vezuje za VEGFR2 protein koji ima sekvencu aminokiselina koja je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:34 ili SEQ ID NO:35.

[0031] HCDR1 molekula antitela ili antigen-vezujućeg dela može isključivati sekvencu GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1; HCDR1 mišjeg/humanizovanog antitela MAb005 obelodanjena u WO2015/085847A1; US2016/376367A1), i/ili HCDR2 molekula antitela ili antigen-vezujućeg dela može isključivati sekvencu TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2; HCDR2 mišjeg/humanizovanog antitela MAb005 obelodanjena u WO2015/085847A1; US2016/376367A1), i/ili HCDR3 molekula antitela ili antigenvezujućeg dela može isključivati sekvencu QLYYFDY (SEQ ID NO:3; HCDR3 mišjeg/humanizovanog antitela MAb005 obelodanjena u WO2015/085847A1;

US2016/376367A1).

[0032] LCDR1 molekula antitela ili antigen-vezujućeg dela može isključivati sekvencu LASQTIGTWLT (SEQ ID NO:9; LCDR1 mišjeg/humanizovanog antitela MAb005 obelodanjena u WO2015/085847A1; US2016/376367A1), i/ili LCDR2 molekula antitela ili antigen-vezujućeg dela može isključivati sekvencu TATSLAD (SEQ ID NO:5; LCDR2 mišjeg/humanizovanog antitela MAb005 obelodanjena u WO2015/085847A1;

US2016/376367A1) i/ili LCDR3 molekula antitela ili antigen-vezujućeg dela može isključivati sekvencu QQVYSIPWT (SEQ ID NO:6; LCDR3 mišjeg/humanizovanog antitela MAb005 obelodanjena u WO2015/085847A1; US2016/376367A1).

[0033] U nekim otelotvorenjima, anti-PD1 antitela prema pronalasku odabrana su tako da imaju ekvivalentnost u specifičnosti i afinitetu vezivanja i za humani PD1, kao i za PD1 cynomolgus majmuna (kako bi se omogućile maksimalno precizne toksikološke i farmakokinetičke studije na primatima). Dalje prečišćavanje optimizovanih molekula antitela, kako je ovde opisano, obezbedilo je poboljšano vezivanje za ortologe PD1 cynomolgus majmuna i/ili održanu ili poboljšanu potentnost u neutralizaciji PD1/PD-L1 signalizacije. Od ključne važnosti je da ova antitela takođe dramatično poboljšavaju svoju potencijalnu kliničku aktivnost i smanjuju rizik od indukovanja hemangioma u poređenju sa MAb005 (WO2015/085847A1; US2016/376367A1) time što postaju potentni antagonisti humanog receptora VEGFR2.

[0034] U nekim aspektima, molekuli anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela prema sadašnjem pronalasku ne moraju nužno imati maksimalan broj supstitucija humane germinativne linije na odgovarajućim pozicijama mišjih CDR ili drugih (kao što su okvirni regioni) aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, „maksimalno humanizovani” molekuli antitela nisu nužno „maksimalno optimizovani” u smislu karakteristika vezivanja za anti-PD1 ili anti-VEGFR2 i/ili drugih poželjnih svojstava.

[0035] Sadašnje obelodanjivanje pruža modifikacije sekvence aminokiselina molekula antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela kako je ovde definisano. Na primer, sadašnje obelodanjivanje pruža molekule antitela i odgovarajuće antigen-vezujuće delove koji sadrže funkcionalno ekvivalentne varijabilne regione i CDR koji ne utiču značajno na njihova svojstva, kao i varijante koje imaju povećanu ili smanjenu aktivnost i/ili afinitet. Na primer, sekvenca aminokiselina može biti mutirana kako bi se dobilo antitelo sa željenim afinitetom vezivanja za PD1 i VEGFR2. Predviđene su insercije koje uključuju fuzije na amino- i/ili karboksi-terminalu u rasponu dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i intrasekvencione insercije pojedinačnih ili višestrukih ostataka aminokiselina. Primeri terminalnih insercija uključuju molekul antitela sa N-terminalnim metionil ostatkom ili molekul antitela fuzionisan sa epitopskom oznakom. Druge insercione varijante molekula antitela uključuju fuziju enzima ili polipeptida koji povećava poluživot antitela u cirkulaciji krvi na N- ili C-kraj antitela.

[0036] Molekul antitela ili antigen-vezujući deo prema pronalasku može uključivati glikozilovane i neglikozilovane polipeptide, kao i polipeptide sa drugim post-translacionim modifikacijama, kao što su, na primer, glikozilacija različitim šećerima, acetilacija i fosforilacija. Molekul antitela ili antigen-vezujući deo prema pronalasku može biti mutiran da promeni takve post-translacione modifikacije, na primer dodavanjem, uklanjanjem ili zamenom jednog ili više ostataka aminokiselina kako bi se formiralo ili uklonilo mesto glikozilacije.

[0037] Molekul antitela ili antigen-vezujući deo prema pronalasku može biti modifikovan na primer supstitucijom aminokiselina kako bi se uklonila potencijalna proteolitička mesta u antitelu.

[0038] Ovde je obezbeđeno antitelo koje se specifično vezuje i za PD1 i za VEGFR2 ili antigen-vezujući deo antitela, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), gde

(a) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQGIGPWLS (SEQ ID NO:4), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVYSIPWT (SEQ ID NO:6); [MAB02A03]

(b) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQPLGIWLS (SEQ ID NO:7), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVYSIPWT (SEQ ID NO:6); [MAB02B03]

(c) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQESGIWLS (SEQ ID NO:8), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVYSIPWT (SEQ ID NO:6); [MAB02D08]

(d) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQTIGTWLT (SEQ ID NO:9), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVAELPFG (SEQ ID NO:10); [MAB05G03]

(e) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQTIGTWLT (SEQ ID NO:9), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB05E08]

(f) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQGIGPWLS (SEQ ID NO:4), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVAELPFG (SEQ ID NO:10); [MAB01]

(g) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQPLGIWLS (SEQ ID NO:7), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVAELPFG (SEQ ID NO:10); [MAB02]

(h) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQESGIWLG (SEQ ID NO:12), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVAELPFG (SEQ ID NO:10); [MAB03]

(i) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQGIGPWLS (SEQ ID NO:4), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB04]

(j) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQPLGIWLS (SEQ ID NO:7), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB05] ili

(k) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQESGIWLS (SEQ ID NO:8), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06] ili

(l) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYVDSVKG (SEQ ID NO: 38) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.1] ili

(m) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYVDSVKG (SEQ ID NO: 38) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence TASSLAD (SEQ ID NO: 40) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.2] ili

(n) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYVDSVKG (SEQ ID NO: 38) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLAD (SEQ ID NO: 41) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.3] ili

(o) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYVDSVKG (SEQ ID NO:38) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.4] ili

(p) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO:42) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO: 5) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.5] ili

(q) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO:42) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence TASSLAD (SEQ ID NO: 40) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.6] ili

(r) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO:42) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLAD (SEQ ID NO: 41) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.7] ili

(s) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO:42) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.8] ili

(t) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYLMS (SEQ ID NO: 61), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO:42) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.8.1] ili

(u) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYLMS (SEQ ID NO: 61), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO:42) i HCDR3 sekvence QVYYFDY (SEQ ID NO: 64); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.8.2] ili

(v) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYLMS (SEQ ID NO: 61), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO:42) i HCDR3 sekvence QLYGFDY (SEQ ID NO: 65); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.8.3] ili

(w) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYLMS (SEQ ID NO: 61), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO:42) i HCDR3 sekvence QLYYADY (SEQ ID NO: 66); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.8.4] ili

(x) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYLMS (SEQ ID NO: 61), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO:42) i HCDR3 sekvence QLYFFDY (SEQ ID NO: 62); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.8.5] ili

(y) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYLMS (SEQ ID NO: 61), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO:42) i HCDR3 sekvence QLYYYDY (SEQ ID NO: 63); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11) ; [MAB06.8.6] ili

(z) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO:42) i HCDR3 sekvence QVYYFDY (SEQ ID NO: 64); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.8.7] ili

(aa) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO:42) i HCDR3 sekvence QLYYADY (SEQ ID NO: 66); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); [MAB06.8.8] ili

(bb) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO:42) i HCDR3 sekvence QLYYYDY (SEQ ID NO: 63); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11). [MAB06.8.9]

[0039] Ovde je obelodanjeno anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), gde sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od

[0040] Ovde je obelodanjeno anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), gde VH region sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13, a VL region sadrži ili se sastoji od bilo koje od sekvenci aminokiselina VL regiona iz tabele 5 ili tabele 8.

[0041] Ovde je obelodanjeno antitelo koje se specifično vezuje i za PD1 i za VEGFR2 ili antigen-vezujući deo antitela, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), gde

(a) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:14;

(b) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:15;

(c) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:16;

(d) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:17;

(e) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:18;

(f) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:19;

(g) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:20;

(h) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:21;

(i) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:22;

(j) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:23;

(k) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:24;

(l) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:48, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:44;

(m) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:48, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:45;

(n) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:48, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:46;

(o) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:48, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:47;

(p) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:49, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:44;

(q) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:49, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:45;

(r) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:49, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:46;

(s) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:49, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:47;

(t) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:67, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:47;

(u) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:68, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:47;

(v) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:69, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:47;

(w) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:70, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:47;

(x) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:71, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:47;

(y) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:72, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:47;

(z) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:73, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:47;

(aa) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:74, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:47; ili

(bb) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži SEQ ID NO:75, a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži SEQ ID NO:47.

[0042] U nekim aspektima, ovde je obelodanjeno anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), gde

(a) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:14;

(b) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:15;

(c) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:16;

(d) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:17;

(e) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:18;

(f) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:19;

(g) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:20;

(h) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:21;

(i) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:22;

(j) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:23;

(k) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:13, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:24;

(l) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:48, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:44;

(m) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:48, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:45;

(n) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:48, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:46;

(o) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:48, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:47;

(p) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:49, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:44;

(q) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:49, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:45;

(r) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:49, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:46; ili

(s) sekvenca aminokiselina VH regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:49, a sekvenca aminokiselina VL regiona je najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98% ili najmanje oko 99% identična sa SEQ ID NO:47. U nekim aspektima, sekvence aminokiselina CDR anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela su 100% identične sekvencama aminokiselina CDR u navedenim sekvencama, dok su sekvence aminokiselina FR manje od 100% identične sekvencama aminokiselina FR u navedenim sekvencama.

[0043] U nekim aspektima, antitelo ili antigen-vezujući deo, kako je ovde definisano, može biti izolovan.

[0044] Molekul antitela ili antigen-vezujući deo kako je ovde definisano može se unakrsno takmičiti za vezivanje za PD1 i VEGFR2 sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom koji sadrži setove CDR obelodanjene ovde. Ovde je obezbeđeno anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu se antitelo ili antigen-vezujući deo unakrsno takmiči za vezivanje za PD1 i VEGFR2 sa antitelom ili antigen-vezujućim delom koji sadrži setove CDR obelodanjene ovde; i (a) sadrži sekvence aminokiselina okvirnih regiona koje su potpuno humane germinativne linije; (b) specifično se vezuje za humani PD1, PD1 cynomolgus majmuna, humani VEGFR2 i VEGFR2 rezus majmuna; i (c) antagonizuje vezivanje humanog PD1 za humani PD-L1 i antagonizuje signalizaciju humanog VEGFR2 kao odgovor na humani VEGF.

[0045] U nekim otelotvorenjima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili antigen-vezujući deo ima minimalnu imunogenost. U određenim slučajevima, antitelo ili antigen-vezujući deo ispoljava smanjenu imunogenost u poređenju sa anti-PD1 antitelom koje sadrži HCDR1 sekvence SEQ ID NO: 1, HCDR2 sekvence SEQ ID NO: 2, HCDR3 sekvence SEQ ID NO: 3, LCDR1 sekvence SEQ ID NO: 9, LCDR2 sekvence SEQ ID NO: 5, i LCDR3 sekvence SEQ ID NO: 6. U nekim primerima, rizik imunogenosti antitela ili antigen-vezujućeg dela može se odrediti in silico identifikovanjem lokacije epitopa T ćelija u antitelu ili delu (npr. u varijabilnim regionima antitela ili dela).

[0046] Na primer, epitopi T ćelija u antitelu ili antigen-vezujućem delu mogu se identifikovati korišćenjem iTope<™>. iTope<™>se može koristiti za analizu sekvenci VL i VH regiona na peptide sa promiskuitetnim vezivanjem visokog afiniteta za humane MHC klase II. Smatra se da promiskuitetni peptidi visokog afiniteta za vezivanje za MHC klase II koreliraju sa prisustvom epitopa T ćelija koji su indikatori visokog rizika za kliničku imunogenost proteinskih lekova. Softver iTope<™>predviđa povoljne interakcije između bočnih lanaca aminokiselina peptida i specifičnih vezivnih džepova (posebno pozicija džepova; p1, p4, p6, p7 i p9) unutar otvorenih vezivnih žlebova 34 humana MHC alela klase II. Ovi aleli predstavljaju najčešće HLA-DR alele pronađene širom sveta, bez davanja težine onima koji su najčešće zastupljeni u bilo kojoj određenoj etničkoj populaciji. Dvadeset alela sadrži 'otvorenu' p1 konfiguraciju, a 14 sadrži 'zatvorenu' konfiguraciju gde je glicin na poziciji 83 zamenjen valinom. Lokacija ključnih vezivnih ostataka postiže se in silico generisanjem 9mer peptida koji se preklapaju za osam aminokiselina, obuhvatajući sekvencu testiranog proteina. Ovaj proces uspešno diskriminiše sa visokom tačnošću između peptida koji se vezuju ili ne vezuju za molekule MHC klase II.

[0047] Epitopi T ćelija u antitelu ili antigen-vezujućem delu mogu se identifikovati analizom sekvenci VL i VH regiona korišćenjem TCED<™>(T Cell Epitope Database<™>) radi pretrage podudaranja sa epitopima T ćelija prethodno identifikovanim in vitro analizama mapiranja epitopa humanih T ćelija drugih proteinskih sekvenci. TCED<™>se koristi za pretragu bilo koje testirane sekvence u velikoj (>10.000 peptida) bazi podataka peptida izvedenih iz nesusednih proteinskih i antitelskih sekvenci.

[0048] U nekim otelotvorenjima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili antigen-vezujući deo može ispoljavati nisku imunogenost jer antitelo ili deo ima mali broj jednog ili više sledećih peptida u svojim sekvencama: visokog afiniteta stranog porekla ('HAF' - visok rizik imunogenosti), niskog afiniteta stranog porekla ('LAF' - niži rizik imunogenosti) i/ili TCED+ (prethodno identifikovan epitop u TCED<™>bazi podataka).

[0049] U nekim otelotvorenjima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili antigen-vezujući deo može imati visok sadržaj epitopa germinativne linije (GE) u svojoj sekvenci. U nekim primerima, anti-PD1 antitelo ili antigen-vezujući deo ima 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 (ili više od 20) epitopa germinativne linije u svojoj sekvenci (npr. u sekvenci VL i/ili VH regiona). Epitop germinativne linije može se definisati kao sekvenca peptida humane germinativne linije sa visokim afinitetom vezivanja za MHC klase II.9mer peptidi epitopa germinativne linije verovatno nemaju imunogeni potencijal zbog tolerancije T ćelija, što je validirano prethodnim studijama sa širokim spektrom peptida germinativne linije. Važno je da se takvi epitopi v-domena germinativne linije (dodatno potpomognuti sličnim sekvencama u konstantnim regionima humanih antitela) takođe takmiče za zauzimanje MHC klase II na membrani antigen-prezentujućih ćelija, smanjujući rizik da prezentacija stranog peptida bude dovoljna da postigne 'prag aktivacije' potreban za stimulaciju T ćelija. Visok sadržaj GE je stoga korisno svojstvo u kliničkom razvoju terapeutskog antitela i može obezbediti nisku imunogenost.

[0050] U određenim otelotvorenjima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili antigen-vezujući deo može imati smanjen broj HAF, LAF i/ili TCED+ epitopa pronađenih u okvirnim regionima i teškog i lakog lanca varijabilnih regiona u poređenju sa anti-PD1 antitelom koje sadrži sekvence varijabilnih domena antitela Mab005 (tabele 1 i 2). U nekim otelotvorenjima, HAF, LAF i/ili TCED+ epitopi nisu prisutni u sekvencama VL i/ili VH regiona anti-PD1 antitela ili antigen-vezujućeg dela.

[0051] Termini „unakrsno se takmičiti”, „unakrsna kompeticija”, „unakrsno blokirati”, „unakrsno blokiran” i „unakrsno blokirajući” koriste se ovde naizmenično da označe sposobnost antitela ili njegovog dela da ometa vezivanje, direktno ili indirektno putem alosterne modulacije, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela prema pronalasku za ciljeve PD1 i VEGFR2 (npr. humani PD1, humani VEGFR2). Stepen do kojeg antitelo ili njegov deo može ometati vezivanje drugog za cilj, i stoga da li se može reći da unakrsno blokira ili se unakrsno takmiči, može se odrediti korišćenjem testova kompeticionog vezivanja. Jedan primer testa kompeticionog vezivanja je homogena vremenski razlučiva fluorescencija (HTRF). Jedan posebno pogodan kvantitativni test unakrsne kompeticije koristi pristup zasnovan na FACS tehnologiji ili AlphaScreen metodi za merenje kompeticije između obeleženog (npr. sa Hisoznakom, biotinilovanog ili radioaktivno obeleženog) antitela ili njegovog dela i drugog antitela ili njegovog dela u smislu njihovog vezivanja za cilj. Generalno, unakrsnokompetitivno antitelo ili njegov deo je, na primer, ono koje će se vezati za cilj u testu unakrsne kompeticije tako da, tokom testa i u prisustvu drugog antitela ili njegovog dela, zabeleženo pomeranje pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina ili polipeptida prema pronalasku iznosi do 100% (npr. u testu kompeticije zasnovanom na FACS) maksimalnog teorijskog pomeranja (npr. pomeranje hladnim (npr. neobeleženim) antitelom ili njegovim fragmentom koji treba da bude unakrsno blokiran) od strane potencijalno unakrsno blokirajućeg antitela ili njegovog fragmenta koji je prisutan u datoj količini.

Poželjno je da unakrsno-kompetitivna antitela ili njihovi delovi imaju zabeleženo pomeranje koje je između 10% i 100%, ili između 50% i 100%.

[0052] Molekul antitela ili antigen-vezujući deo kako je ovde definisano može sadržati jednu ili više supstitucija, delecija i/ili insercija koje uklanjaju mesto post-translacione modifikacije (PTM), na primer mesto glikozilacije (N-vezano ili O-vezano), mesto deaminacije, mesto fosforilacije ili mesto izomerizacije/fragmentacije.

[0053] Poznato je više od 350 tipova PTM. Ključni oblici PTM uključuju fosforilaciju, glikozilaciju (N- i O-vezanu), sumoilaciju, palmitoilaciju, acetilaciju, sulfataciju, miristoilaciju, prenilaciju i metilaciju (K i R ostataka). Statističke metode za identifikovanje pretpostavljenih mesta aminokiselina odgovornih za specifične PTM dobro su poznate u struci (videti Zhou et al., 2016, Nature Protocols 1: 1318-1321). Razmatra se uklanjanje takvog mesta, na primer supstitucijom, delecijom i/ili insercijom, a zatim opciono testiranje (eksperimentalno i/ili teorijski) na (a) aktivnost vezivanja i/ili (b) gubitak PTM.

[0054] Molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo može biti humani, humanizovani ili himerni.

[0055] Molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo može sadržati jedan ili više okvirnih skeleta humanih varijabilnih domena u koje su insertovani CDR. Na primer, VH region, VL region, ili i VH i VL region mogu sadržati jednu ili više sekvenci aminokiselina humanih okvirnih regiona.

[0056] Molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo može sadržati IGHV3-7 humani skelet germinativne linije u koji su insertovane odgovarajuće HCDR sekvence. Molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo može sadržati VH region koji sadrži sekvencu aminokiselina IGHV3-7 humanog skeleta germinativne linije u koju je insertovan set odgovarajućih HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvenci aminokiselina.

[0057] Molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo može sadržati IGKV1-39 humani skelet germinativne linije u koji su insertovane odgovarajuće LCDR sekvence. Molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo može sadržati VL region koji sadrži sekvencu aminokiselina IGKV1-39 humanog skeleta germinativne linije u koju je insertovan set odgovarajućih LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvenci aminokiselina.

[0058] Molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo može sadržati IGHV3-7 humani skelet germinativne linije u koji su insertovane odgovarajuće HCDR sekvence i IGKV1-39 humani skelet germinativne linije u koji su insertovane odgovarajuće LCDR sekvence.

Molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo može sadržati VH region koji sadrži sekvencu aminokiselina IGHV3-7 humanog skeleta germinativne linije u koju je insertovan set odgovarajućih HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvenci aminokiselina i VL region koji sadrži sekvencu aminokiselina IGKV1-39 humanog skeleta germinativne linije u koju je insertovan set odgovarajućih LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvenci aminokiselina. Sekvence aminokiselina HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 mogu biti sekvence aminokiselina HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 bilo kog od sledećih klonova (MAB02A03, MAB02B03, MAB02D08, MAB05G03, MAB05E08, MAB01, MAB02, MAB03, MAB04, MAB05, MAB06, MAB06.1, MAB06.2, MAB06.3, MAB06.4, MAB06.5, MAB06.6, MAB06.7, MAB06.8, MAB06.8.1, MAB06.8.2, MAB06.8.3, MAB06.8.4, MAB06.8.5, MAB06.8.6, MAB06.8.7, MAB06.8.8 ili MAB06.8.9) (pri čemu svih šest CDR sekvenci potiče iz istog klona).

[0059] U nekim aspektima, molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo može sadržati konstantni region imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, konstantni region imunoglobulina je IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 ili IgA2. U dodatnim otelotvorenjima, konstantni region imunoglobulina je IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 ili IgA2. Molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo može sadržati imunološki inertan konstantni region. U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo može sadržati konstantni region imunoglobulina koji sadrži humani IgG1 konstantni region divljeg tipa, humani IgG1 konstantni region koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A ili humani IgG1 konstantni region koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S. U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo može sadržati konstantni region imunoglobulina koji sadrži humani IgG2 konstantni region divljeg tipa ili humani IgG4 konstantni region divljeg tipa. U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo može sadržati konstantni region imunoglobulina koji sadrži bilo koju od sekvenci aminokiselina iz tabele 6. Sekvence Fc regiona u tabeli 6 počinju od CH1 domena. U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo može sadržati konstantni region imunoglobulina koji sadrži sekvencu aminokiselina Fc regiona humanog IgG4, humanog IgG4(S228P), humanog IgG2, humanog IgG1, humanog IgG1-3M ili humanog IgG1-4M. Na primer, humani IgG4(S228P) Fc region sadrži sledeću supstituciju u poređenju sa Fc regionom humanog IgG4 divljeg tipa: S228P. Na primer, humani IgG1-3M Fc region sadrži sledeće supstitucije u poređenju sa Fc regionom humanog IgG1 divljeg tipa: L234A, L235A i G237A, dok humani IgG1-4M Fc region sadrži sledeće supstitucije u poređenju sa Fc regionom humanog IgG1 divljeg tipa: L234A, L235A, G237A i P331S. U nekim aspektima, pozicija ostatka aminokiseline u konstantnom regionu molekula imunoglobulina numerisana je prema EU nomenklaturi (Ward et al., 1995 Therap. Immunol.

2:77-94). U nekim aspektima, konstantni region imunoglobulina može sadržati RDELT (SEQ ID NO: 36) motiv ili REEM (SEQ ID NO: 37) motiv (podvučeno u tabeli 6). REEM (SEQ ID NO: 37) alotip se nalazi u manjoj ljudskoj populaciji nego RDELT (SEQ ID NO: 36) alotip. U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo može sadržati konstantni region imunoglobulina koji sadrži bilo koju od SEQ ID NO:25-31. U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo može sadržati šest sekvenci aminokiselina CDR bilo kog od sledećih klonova (MAB02A03, MAB02B03, MAB02D08, MAB05G03, MAB05E08, MAB01, MAB02, MAB03, MAB04, MAB05, MAB06, MAB06.1, MAB06.2, MAB06.3, MAB06.4, MAB06.5, MAB06.6, MAB06.7, MAB06.8, MAB06.8.1, MAB06.8.2, MAB06.8.3, MAB06.8.4, MAB06.8.5, MAB06.8.6, MAB06.8.7, MAB06.8.8 ili MAB06.8.9) (pri čemu svih šest CDR sekvenci potiče iz istog klona) i bilo koju od sekvenci aminokiselina Fc regiona iz tabele 6. U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo može sadržati konstantni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži bilo koju od sekvenci aminokiselina Fc regiona iz tabele 6 i konstantni region lakog lanca imunoglobulina koji je konstantni region kapa lakog lanca ili konstantni region lambda lakog lanca.

[0060] Ovde je obelodanjeno anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH), varijabilni region lakog lanca (VL) i konstantni region teškog lanca, gde

(a) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQGIGPWLS (SEQ ID NO:4), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVYSIPWT (SEQ ID NO:6); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(b) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQPLGIWLS (SEQ ID NO:7), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVYSIPWT (SEQ ID NO:6); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(c) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQESGIWLS (SEQ ID NO:8), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVYSIPWT (SEQ ID NO:6); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(d) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQTIGTWLT (SEQ ID NO:9), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVAELPFG (SEQ ID NO:10); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(e) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQTIGTWLT (SEQ ID NO:9), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(f) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQGIGPWLS (SEQ ID NO:4), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVAELPFG (SEQ ID NO:10); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(g) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQPLGIWLS (SEQ ID NO:7), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVAELPFG (SEQ ID NO:10); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(h) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQESGIWLG (SEQ ID NO:12), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVAELPFG (SEQ ID NO:10); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(i) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQGIGPWLS (SEQ ID NO:4), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(j) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQPLGIWLS (SEQ ID NO:7), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(k) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYPDSVKG (SEQ ID NO:2) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence LASQESGIWLS (SEQ ID NO:8), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(l) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYVDSVKG (SEQ ID NO: 38) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO:5) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(m) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYVDSVKG (SEQ ID NO: 38) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence TASSLAD (SEQ ID NO: 40) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(n) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYVDSVKG (SEQ ID NO: 38) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLAD (SEQ ID NO: 41) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(o) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGANTYYVDSVKG (SEQ ID NO: 38) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(p) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 42) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence TATSLAD (SEQ ID NO: 5) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(q) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 42) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence TASSLAD (SEQ ID NO: 40) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(r) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 42) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLAD (SEQ ID NO: 41) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31; ili

(s) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži HCDR1 sekvence GFTFSSYMMS (SEQ ID NO:1), HCDR2 sekvence TISGGGSNKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 42) i HCDR3 sekvence QLYYFDY (SEQ ID NO:3); a sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži LCDR1 sekvence RASQESGIWLS (SEQ ID NO: 39), LCDR2 sekvence AASSLQS (SEQ ID NO: 43) i LCDR3 sekvence QQVSVTPFT (SEQ ID NO:11); a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31. U nekim otelotvorenjima, antitelo dodatno sadrži konstantni region lakog lanca imunoglobulina koji je konstantni region kapa lakog lanca ili konstantni region lambda lakog lanca.

[0061] Ovde je obelodanjeno anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH), varijabilni region lakog lanca (VL) i konstantni region teškog lanca, gde

a) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:14; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(b) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:15; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(c) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:16; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(d) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:17; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(e) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:18; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(f) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:19; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(g) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:20; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(h) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:21; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(i) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:22; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(j) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:23; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(k) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:24; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(l) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:48; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:44; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(m) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:48; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:45; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(n) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:48; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:46; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(o) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:48; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:47; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(p) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:49; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:44; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(q) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:49; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:45; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S;

(r) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:49; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:46; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S; ili

(s) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:49; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:47; a konstantni region teškog lanca sadrži konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa; konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A; ili konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A, G237A i P331S.

[0062] Ovde je obelodanjeno anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH), varijabilni region lakog lanca (VL) i konstantni region teškog lanca, gde

a) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:14; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(b) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:15; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(c) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:16; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(d) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:17; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(e) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:18; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(f) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:19; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(g) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:20; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(h) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:21; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(i) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:22; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(j) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:23; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(k) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:13; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:24; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(l) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:48; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:44; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(m) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:48; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:45; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(n) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:48; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:46; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(o) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:48; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:47; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(p) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:49; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:44; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(q) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:49; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:45; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31;

(r) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:49; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:46; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31; ili

(s) sekvenca aminokiselina VH regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:49; sekvenca aminokiselina VL regiona sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO:47; a konstantni region teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31.

[0063] U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo može biti bez efektorske funkcije. U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo ne indukuje imunu efektorsku funkciju i, opciono, supresuje imunu efektorsku funkciju. U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo može nemati merljivo vezivanje za humane FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa i FcγRIIIb receptore, ali zadržava vezivanje za humani FcγRIIb receptor i opciono zadržava vezivanje za humani FcRn receptor. FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa i FcγRIIIb su primeri aktivirajućih receptora. FcγRIIb je primer inhibitornog receptora. FcRn je primer reciklirajućeg receptora. U nekim aspektima, afinitet vezivanja anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela za humane Fc receptore može se meriti BIACORE<®>analizom. U nekim aspektima, homogena vremenski razlučiva fluorescencija (HTRF) može se koristiti za proučavanje vezivanja anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela za humane Fc receptore. U jednom primeru HTRF, humani IgG1 (divlji tip) se obeležava, kao i ceo set Fc gama receptora, a zatim se antitela sa inženjerski modifikovanim Fc fragmentima koriste u kompeticiji titracijom. U nekim aspektima, PD1-pozitivne i/ili VEGFR2-pozitivne ćelije mogu se pomešati sa humanim leukocitima i anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelima, i može se meriti ubijanje ćelija putem CDC, ADCC i/ili ADCP. U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo koje sadrži sekvencu aminokiselina Fc regiona humanog IgG1-3M (videti tabelu 6) je bez efektorske funkcije. U nekim aspektima, anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo koje sadrži sekvencu aminokiselina Fc regiona humanog IgG1-3M (videti tabelu 6) je bez efektorske funkcije.

[0064] Molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo može biti Fab fragment, F(ab)2 fragment, Fv fragment, tetramerno antitelo, tetravalentno antitelo, multispecifično antitelo (na primer, bivalentno antitelo), domen-specifično antitelo, jednodomensko antitelo, monoklonsko antitelo ili fuzioni protein. U jednom otelotvorenju, antitelo može biti multispecifično antitelo koje sadrži dva ili više antigen-vezujućih domena. U nekim otelotvorenjima, prvi antigen-vezujući domen se specifično vezuje za PD1 i VEGFR2, a drugi antigen-vezujući domen se specifično vezuje za antigen koji nije ni PD1 ni VEGFR2. Molekuli antitela i metode za njihovu konstrukciju i upotrebu opisani su, na primer, u Holliger & Hudson (2005, Nature Biotechnol.23(9): 1126-1136).

[0065] U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je imunokonjugat koji sadrži molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo prema pronalasku kako je ovde definisano, povezan sa terapijskim agensom.

[0066] Primeri pogodnih terapijskih agenasa uključuju citotoksine, radioizotope, hemoterapijske agense, imunomodulatorne agense, anti-angiogene agense, antiproliferativne agense, pro-apoptotske agense i citostatičke i citolitičke enzime (na primer RNaze). Dalji terapijski agensi uključuju terapijsku nukleinsku kiselinu, kao što je gen koji kodira imunomodulatorni agens, anti-angiogeni agens, anti-proliferativni agens ili pro-apoptotski agens. Ovi deskriptori leka nisu međusobno isključivi, te se terapijski agens može opisati korišćenjem jednog ili više gore navedenih termina.

[0067] Primeri pogodnih terapijskih agenasa za upotrebu u imunokonjugatima uključuju taksane, maitansine, CC-1065 i duokarmicine, kaliheamicine i druge enediine, i auristatine. Drugi primeri uključuju antifolate, vinka alkaloide i antracikline. Biljni toksini, drugi bioaktivni proteini, enzimi (tj. ADEPT), radioizotopi, fotosenzibilizatori takođe se mogu koristiti u imunokonjugatima. Pored toga, konjugati se mogu praviti korišćenjem sekundarnih nosača kao citotoksičnog agensa, kao što su lipozomi ili polimeri. Pogodni citotoksini uključuju agens koji inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili dovodi do uništenja ćelija.

Reprezentativni citotoksini uključuju antibiotike, inhibitore polimerizacije tubulina, alkilirajuće agense koji se vezuju za DNK i remete je, i agense koji remete sintezu proteina ili funkciju esencijalnih ćelijskih proteina kao što su proteinske kinaze, fosfataze, topoizomeraze, enzimi i ciklini.

[0068] Reprezentativni citotoksini uključuju, ali nisu ograničeni na, doksorubicin, daunorubicin, idarubicin, aklarubicin, zorubicin, mitoksantron, epirubicin, karubicin, nogalamicin, menogaril, pitarubicin, valrubicin, citarabin, gemcitabin, trifluridin, ancitabin, enocitabin, azacitidin, doksifluridin, pentostatin, broksuridin, kapecitabin, kladribin, decitabin, floksuridin, fludarabin, guggerotin, puromicin, tegafur, tiazofurin, adriamicin, cisplatin, karboplatin, ciklofosfamid, dakarbazin, vinblastin, vinkristin, mitoksantron, bleomicin, mehloretamin, prednizon, prokarbazin, metotreksat, fluorouracili, etopozid, taksol, analozi taksola, platini kao što su cisplatin i karboplatin, mitomicin, tiotepa, taksani, vinkristin, daunorubicin, epirubicin, aktinomicin, autramicin, azaserini, bleomicini, tamoksifen, idarubicin, dolastatini/auristatini, hemiasterlini, esperamicini i maitansinoidi.

[0069] Pogodni imunomodulatorni agensi uključuju antihormone koji blokiraju dejstvo hormona na tumore i imunosupresivne agense koji supresuju proizvodnju citokina, smanjuju ekspresiju sopstvenih antigena ili maskiraju MHC antigene.

[0070] Takođe je obezbeđen molekul nukleinske kiseline koji kodira molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo prema pronalasku kako je ovde definisano. Molekul nukleinske kiseline može kodirati (a) sekvencu aminokiselina VH regiona ili (b) sekvencu aminokiselina VL regiona. Molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku kodiraju i sekvence aminokiselina VH i VL regiona anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela ili njegovog antigenvezujućeg dela prema pronalasku. U nekim aspektima, molekul nukleinske kiseline kako je ovde definisano može biti izolovan.

[0071] Dalje je obezbeđen vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema pronalasku kako je ovde definisano. Vektor može biti ekspresioni vektor.

[0072] Takođe je obezbeđena ćelija domaćin koja sadrži molekul nukleinske kiseline ili vektor prema pronalasku kako je ovde definisano. Ćelija domaćin može biti rekombinantna ćelija domaćin. U nekim aspektima, ćelija domaćin može sadržati vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira i sekvencu aminokiselina VH regiona i sekvencu aminokiselina VL regiona anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela opisanog ovde. U nekim aspektima, ćelija domaćin može sadržati prvi vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira sekvencu aminokiselina VH regiona i drugi vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira sekvencu aminokiselina VL regiona anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela opisanog ovde.

[0073] U daljem aspektu obezbeđena je metoda proizvodnje anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela i/ili njegovog antigen-vezujućeg dela, koja obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku pod uslovima koji rezultiraju ekspresijom i/ili proizvodnjom antitela i/ili njegovog antigen-vezujućeg dela, i izolovanje antitela i/ili njegovog antigen-vezujućeg dela iz ćelije domaćina ili kulture.

[0074] U drugom aspektu pronalaska obezbeđen je farmaceutski sastav koji sadrži molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo prema pronalasku kako je ovde definisano, ili molekul nukleinske kiseline prema pronalasku kako je ovde definisano, ili vektor prema pronalasku kako je ovde definisano.

[0075] Reference na metode lečenja u ovom opisu treba tumačiti kao reference na jedinjenja, farmaceutske sastave i medikamente prema sadašnjem pronalasku za upotrebu u tim metodama.

[0076] Dalje je obezbeđena metoda za pojačavanje imunog odgovora kod subjekta, koja obuhvata primenu efektivne količine molekula antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela prema pronalasku kako je ovde definisano, ili imunokonjugata prema pronalasku kako je ovde definisano, ili molekula nukleinske kiseline prema pronalasku kako je ovde definisano, ili vektora prema pronalasku kako je ovde definisano, ili farmaceutskog sastava prema pronalasku kako je ovde definisano, subjektu.

[0077] U daljem aspektu obezbeđena je metoda za lečenje ili prevenciju kancera kod subjekta, koja obuhvata primenu efektivne količine molekula antitela ili njegovog antigenvezujućeg dela prema pronalasku kako je ovde definisano, ili imunokonjugata prema pronalasku kako je ovde definisano, ili molekula nukleinske kiseline prema pronalasku kako je ovde definisano, ili vektora prema pronalasku kako je ovde definisano, ili farmaceutskog sastava prema pronalasku kako je ovde definisano, subjektu. U nekim otelotvorenjima, kancer je povezan sa ekspresijom ili prekomernom ekspresijom PD1 i/ili VEGFR2.

[0078] Na primer, kancer može biti rak pankreasa, melanom, rak dojke, rak pluća, rak bronhija, kolorektalni rak, rak prostate, rak želuca, rak jajnika, rak mokraćne bešike, rak mozga ili centralnog nervnog sistema, rak perifernog nervnog sistema, rak jednjaka, rak grlića materice, rak materice ili endometrijuma, rak usne duplje ili ždrela, rak jetre, rak bubrega, rak testisa, rak žučnih puteva, rak tankog creva ili slepog creva, rak pljuvačnih žlezda, rak štitne žlezde, rak nadbubrežne žlezde, osteosarkom, hondrosarkom ili rak hematoloških tkiva.

[0079] Pronalazak takođe obezbeđuje molekul antitela ili njegov antigen-vezujući deo prema pronalasku kako je ovde definisano, ili imunokonjugat prema pronalasku kako je ovde definisano, ili molekul nukleinske kiseline prema pronalasku kako je ovde definisano, ili vektor prema pronalasku kako je ovde definisano, ili farmaceutski sastav prema pronalasku kako je ovde definisano, za upotrebu u lečenju kancera.

[0080] U drugom aspektu pronalazak obezbeđuje molekul antitela, ili njegov antigenvezujući deo, ili imunokonjugat, ili molekul nukleinske kiseline, ili vektor za upotrebu, ili metodu lečenja prema pronalasku kako je ovde definisano, za odvojenu, sekvencijalnu ili simultanu upotrebu u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom, na primer antikancerogenim agensom.

[0081] U daljem aspektu obezbeđena je upotreba molekula antitela ili njegovog antigenvezujućeg dela prema pronalasku kako je ovde definisano, ili imunokonjugata prema pronalasku kako je ovde definisano, ili molekula nukleinske kiseline prema pronalasku kako je ovde definisano, ili vektora prema pronalasku kako je ovde definisano, ili farmaceutskog sastava prema pronalasku kako je ovde definisano, u proizvodnji medikamenta za lečenje kancera.

[0082] Pronalazak takođe obezbeđuje metodu za lečenje ili prevenciju infektivne ili imune bolesti kod subjekta, koja obuhvata primenu efektivne količine molekula antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela kako je ovde definisano, ili imunokonjugata kako je ovde definisano, ili molekula nukleinske kiseline kako je ovde definisano, ili vektora kako je ovde definisano, ili farmaceutskog sastava kako je ovde definisano, subjektu.

[0083] U jednom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji sadrži sekvence aminokiselina obelodanjene ovde za upotrebu u terapiji.

[0084] Farmaceutski sastav prema pronalasku može sadržati farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, nosač ili diluent. Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens može biti jedinjenje ili kombinacija jedinjenja koja ulaze u farmaceutski sastav, koja ne izaziva sekundarne reakcije i koja omogućava, na primer, olakšavanje primene molekula anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela, povećanje njegovog veka trajanja i/ili njegove efikasnosti u telu ili povećanje njegove rastvorljivosti u rastvoru. Ovi farmaceutski prihvatljivi nosači su dobro poznati i stručnjak u datoj oblasti će ih prilagoditi u zavisnosti od načina primene molekula anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela.

[0085] U nekim otelotvorenjima, molekul anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela može biti obezbeđen u liofilizovanom obliku za rekonstituciju pre primene. Na primer, liofilizovani molekuli antitela mogu se rekonstituisati u sterilnoj vodi i pomešati sa fiziološkim rastvorom pre primene osobi.

[0086] Molekuli anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela obično će se primenjivati u obliku farmaceutskog sastava, koji može sadržati najmanje jednu komponentu pored molekula antitela. Tako farmaceutski sastavi mogu sadržati, pored molekula anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela, farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, nosač, pufer, stabilizator ili druge materijale dobro poznate stručnjacima u datoj oblasti. Takvi materijali treba da budu netoksični i ne bi trebalo da ometaju efikasnost molekula anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela. Precizna priroda nosača ili drugog materijala zavisiće od puta primene, koji može biti bolus, infuzija, injekcija ili bilo koji drugi pogodan put, kao što je diskutovano u nastavku.

[0087] Za parenteralnu, na primer supkutanu ili intravensku primenu, npr. injekcijom, farmaceutski sastav koji sadrži molekul anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela može biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora koji je bez pirogena i ima odgovarajući pH, izotoničnost i stabilnost. Stručnjaci u relevantnoj oblasti su sposobni da pripreme pogodne rastvore koristeći, na primer, izotonične nosače, kao što su injekcija natrijum hlorida, Ringerova injekcija, laktatna Ringerova injekcija. Konzervansi, stabilizatori, puferi, antioksidansi i/ili drugi aditivi mogu se koristiti po potrebi, uključujući pufere kao što su fosfatni, citratni i druge organske kiseline; antioksidanse, kao što su askorbinska kiselina i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid; benzentonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni, kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3'-pentanol; i m-krezol); polipeptide niske molekulske mase; proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji formiraju soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. Zn-proteinski kompleksi); i/ili nejonske surfaktante, kao što su TWEEN<™>, PLURONICS<™>ili polietilen glikol (PEG).

[0088] Farmaceutski sastav koji sadrži molekul anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela može se primenjivati sam ili u kombinaciji sa drugim tretmanima, bilo simultano ili sekvencijalno u zavisnosti od stanja koje se leči.

[0089] Molekul anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela kako je ovde opisano može se koristiti u metodi lečenja ljudskog ili životinjskog tela, uključujući profilaktičko ili preventivno lečenje (npr. lečenje pre početka stanja kod osobe kako bi se smanjio rizik od pojave stanja kod te osobe; odložio njegov početak; ili smanjila njegova težina nakon početka). Metoda lečenja može obuhvatati primenu molekula anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela osobi kojoj je to potrebno.

[0090] Primena je obično u „terapijski efektivnoj količini”, što je dovoljno da pokaže korist za pacijenta. Takva korist može biti bar ublažavanje najmanje jednog simptoma. Stvarna primenjena količina, kao i brzina i vremenski tok primene, zavisiće od prirode i težine onoga što se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničkog stanja pojedinačnog pacijenta, uzroka poremećaja, mesta primene sastava, metoda primene, rasporeda primene i drugih faktora poznatih lekarima. Propisivanje lečenja, npr. odluke o doziranju itd., u nadležnosti je lekara opšte prakse i drugih lekara i može zavisiti od težine simptoma i/ili progresije bolesti koja se leči. Odgovarajuće doze molekula antitela dobro su poznate u struci (Ledermann J.A. et al., 1991, Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al., 1991, Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). Specifične doze mogu biti navedene ovde ili u Physician's Desk Reference (2003) prema potrebi za tip medikamenta koji se primenjuje. Terapijski efektivna količina ili pogodna doza molekula antitela može se odrediti poređenjem njegove in vitro aktivnosti i in vivo aktivnosti u životinjskom modelu. Metode za ekstrapolaciju efektivnih doza kod miševa i drugih test životinja na ljude su poznate. Precizna doza zavisiće od niza faktora, uključujući da li je antitelo za prevenciju ili za lečenje, veličinu i lokaciju područja koje se leči, preciznu prirodu antitela (npr. celo antitelo, fragment) i prirodu bilo koje detektabilne oznake ili drugog molekula vezanog za antitelo.

[0091] Tipična doza antitela biće u rasponu od 100 µg do 1 g za sistemske primene, i 1 µg do 1 mg za topikalne primene. Može se primeniti početna viša udarna doza, praćena jednom ili više nižih doza. Tipično, antitelo će biti celo antitelo, npr. IgG1 ili IgG4 izotip. Ovo je doza za jedan tretman odraslog pacijenta, koja se može proporcionalno prilagoditi za decu i odojčad, a takođe prilagoditi za druge formate antitela srazmerno molekulskoj masi. Tretmani se mogu ponavljati u dnevnim, dvonedeljnim, nedeljnim ili mesečnim intervalima, po nahođenju lekara. Raspored lečenja za pojedinca može zavisiti od farmakokinetičkih i farmakodinamičkih svojstava sastava antitela, puta primene i prirode stanja koje se leči.

[0092] Lečenje može biti periodično, a period između primena može biti oko dve nedelje ili više, npr. oko tri nedelje ili više, oko četiri nedelje ili više, otprilike jednom mesečno ili više, oko pet nedelja ili više, ili oko šest nedelja ili više. Na primer, lečenje može biti svake dve do četiri nedelje ili svake četiri do osam nedelja. Lečenje se može dati pre, i/ili posle operacije, i/ili se može primeniti direktno na anatomskom mestu hirurškog lečenja ili invazivnog postupka. Pogodne formulacije i putevi primene opisani su gore.

[0093] U nekim otelotvorenjima, molekuli anti-PD1 i anti-VEGF antitela kako su ovde opisani mogu se primenjivati kao supkutane injekcije. Supkutane injekcije se mogu primenjivati pomoću autoinjektora, na primer za dugoročnu profilaksu/lečenje.

[0094] U nekim otelotvorenjima, terapijski efekat molekula anti-PD1 i anti-VEGF antitela može trajati nekoliko poluživota, u zavisnosti od doze. Na primer, terapijski efekat jedne doze molekula anti-PD1 i anti-VEGF antitela može trajati kod osobe 1 mesec ili više, 2 meseca ili više, 3 meseca ili više, 4 meseca ili više, 5 meseci ili više, ili 6 meseci ili više.

[0095] Takođe je obezbeđena, radi reference, metoda proizvodnje molekula antitela koji se specifično vezuje za humani PD1 i humani VEGFR2 i opciono takođe za PD1 cynomolgus majmuna i VEGFR2 majmuna, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, koja obuhvata korake:

(1) presađivanje anti-PD1 CDR iz nehumanog izvora u okvir humanog v-domena radi proizvodnje humanizovanog molekula anti-PD1 antitela ili njegovog antigenvezujućeg dela;

(2) generisanje biblioteke klonova humanizovanog molekula anti-PD1 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela koji sadrži jednu ili više mutacija u CDR;

(3) skrining biblioteke na vezivanje za humani PD1 i opciono takođe za PD1 cynomolgus majmuna, humani VEGFR2 i VEGFR2 rezus majmuna;

(4) selekcija klonova iz koraka skrininga (3) koji imaju specifičnost vezivanja za humani PD1 i opciono takođe za PD1 cynomolgus majmuna, humani VEGFR2 i VEGFR2 rezus majmuna; i

(5) proizvodnja molekula antitela koji se specifično vezuje za humani PD1 i opciono takođe za PD1 cynomolgus majmuna, humani VEGFR2 i VEGFR2 rezus majmuna, ili njegovog antigen-vezujućeg dela iz klonova odabranih u koraku (4);

(6) sprovođenje testiranja mutageneze u pravcu germinativne linije u CDR radi utvrđivanja potencijala za dalje poboljšanje molekularnih svojstava antitela.

[0096] Metoda može obuhvatati dalji korak proizvodnje dodatnih klonova zasnovanih na klonovima odabranim u koraku (4), na primer zasnovanih na daljoj eksploratornoj mutagenezi na specifičnim pozicijama u CDR klonova odabranih u koraku (4), radi poboljšanja humanizacije i/ili minimiziranja sadržaja epitopa humanih T ćelija i/ili poboljšanja proizvodnih svojstava u molekulu antitela ili njegovom antigen-vezujućem delu proizvedenom u koraku (5).

[0097] Kako se koristi ovde, termin „PD1” odnosi se na protein programirane ćelijske smrti 1 i njegove varijante koje zadržavaju bar deo biološke aktivnosti PD1. Kako se koristi ovde, PD1 može uključivati sve vrste PD1 nativne sekvence, uključujući humani, pacovski, mišji i pileći. Termin „PD1” može se koristiti da uključi varijante, izoforme i homologe vrsta humanog PD1. U nekim otelotvorenjima, „PD1” se odnosi na humani oblik PD1 divljeg tipa. Antitela prema pronalasku mogu unakrsno reagovati sa PD1 iz drugih vrsta osim humane, posebno sa PD1 iz cynomolgus majmuna (Macaca fascicularis). Primeri sekvenci aminokiselina humanog i cynomolgus PD1 dati su u tabeli 7. U određenim otelotvorenjima, antitela mogu biti potpuno specifična za humani PD1 i ne moraju ispoljavati nehumanu unakrsnu reaktivnost.

[0098] Kako se koristi ovde, termin „VEGFR2” odnosi se na receptor 2 vaskularnog endotelnog faktora rasta (takođe poznat kao KDR ili FLK1) i njegove varijante koje zadržavaju bar deo biološke aktivnosti VEGFR2. Kako se koristi ovde, VEGFR2 može uključivati sve vrste VEGFR2 nativne sekvence, uključujući humani, pacovski, mišji i pileći. Termin „VEGFR2” može se koristiti da uključi varijante, izoforme i homologe vrsta humanog VEGFR2. U nekim otelotvorenjima, „VEGFR2” se odnosi na humani oblik VEGFR2 divljeg tipa. Antitela prema pronalasku mogu unakrsno reagovati sa VEGFR2 iz drugih vrsta osim humane, posebno sa VEGFR2 iz rezus majmuna (Macaca mulatta). Primeri sekvenci aminokiselina humanog i rezus VEGFR2 dati su u tabeli 7. U određenim otelotvorenjima, antitela mogu biti potpuno specifična za humani VEGFR2 i ne moraju ispoljavati nehumanu unakrsnu reaktivnost.

[0099] Kako se koristi ovde, „antagonist” kako se koristi u kontekstu antitela prema pronalasku ili „anti-PD1 i anti-VEGFR2 antagonističko antitelo” (naizmenično nazivano „anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitelo”) odnosi se na antitelo koje je sposobno da se veže za PD1 i VEGFR2 i inhibira biološku aktivnost PD1 i VEGFR2 i/ili nizvodne puteve posredovane PD1 i/ili VEGFR2 signalizacijom. Anti-PD1 i anti-VEGFR2 antagonističko antitelo obuhvata antitela koja mogu blokirati, antagonizovati, supresovati ili smanjiti (uključujući značajno) biološku aktivnost PD1 i VEGFR2, uključujući nizvodne puteve posredovane PD1 i/ili VEGFR2 signalizacijom, kao što su vezivanje receptora i/ili izazivanje ćelijskog odgovora na PD1 i VEGFR2. Za potrebe sadašnjeg pronalaska, eksplicitno će se podrazumevati da termin „anti-PD1 i anti-VEGFR2 antagonističko antitelo” obuhvata sve termine, nazive i funkcionalna stanja i karakteristike pri čemu su sami PD1 i VEGFR2, i biološka aktivnost PD1 i VEGFR2 (uključujući ali ne ograničavajući se na njegovu sposobnost da supresuje aktivaciju antitumorske aktivnosti T ćelija), ili posledice aktivnosti ili biološke aktivnosti, suštinski poništene, smanjene ili neutralisane u bilo kom značajnom stepenu.

[0100] Antitelo se „specifično vezuje”, „specifično interaguje”, „preferencijalno vezuje”, „vezuje” ili „interaguje” sa PD1 ili VEGFR2 ako se vezuje sa većim afinitetom, aviditetom, lakše i/ili sa većim trajanjem nego što se vezuje za druge receptore.

[0101] „Molekul antitela” je molekul imunoglobulina sposoban za specifično vezivanje za cilj, kao što je ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid, polipeptid, itd., preko najmanje jednog mesta prepoznavanja antigena, smeštenog u varijabilnom regionu molekula imunoglobulina. Kako se koristi ovde, termin „molekul antitela” obuhvata ne samo intaktna poliklonska ili monoklonska antitela, već i bilo koji fragment koji vezuje antigen (na primer, „antigenvezujući deo”) ili njegov jednolančani oblik, fuzione proteine koji sadrže antitelo, i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju molekula imunoglobulina koja sadrži mesto prepoznavanja antigena uključujući, na primer bez ograničenja, scFv, jednodomenska antitela (na primer, antitela ajkule i kamile), maksitela, minitela, intratela, dijatela, trijatela, tetratela, v-NAR i bis-scFv.

[0102] „Molekul antitela” obuhvata antitelo bilo koje klase, kao što je IgG, IgA ili IgM (ili njihove podklase), i antitelo ne mora biti bilo koje određene klase. U zavisnosti od sekvence aminokiselina konstantnog regiona njegovih teških lanaca, imunoglobulini se mogu dodeliti različitim klasama. ThPostoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, a nekoliko od njih se može dalje podeliti na podklase (izotipove), na primer IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Konstantni regioni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se alfa, delta, epsilon, gama i mi, respektivno. Subjedinične strukture i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate.

[0103] Termin „antigen-vezujući deo” molekula antitela, kako se koristi ovde, odnosi se na jedan ili više fragmenata intaktnog antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za PD1. Funkcije vezivanja antigena molekula antitela mogu obavljati fragmenti intaktnog antitela. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih terminom „antigen-vezujući deo” molekula antitela uključuju Fab; Fab'; F(ab')2; Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela; fragment jednodomenskog antitela (dAb), i izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR).

[0104] Termin „Fc region” koristi se za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina. „Fc region” može biti Fc region nativne sekvence ili varijantni Fc region. Iako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu varirati, Fc region teškog lanca humanog IgG obično se definiše da se proteže od ostatka aminokiseline na poziciji Cys226, ili od Pro230, do njegovog karboksilnog kraja. Numerisanje ostataka u Fc regionu je prema EU indeksu kao u Kabatu. Fc region imunoglobulina generalno sadrži dva konstantna domena, CH2 i CH3. Kao što je poznato u struci, Fc region može biti prisutan u dimernom ili monomernom obliku.

[0105] „Varijabilni region” antitela odnosi se na varijabilni region lakog lanca antitela ili varijabilni region teškog lanca antitela, bilo sam ili u kombinaciji. Kao što je poznato u struci, varijabilni regioni teškog i lakog lanca svaki se sastoje od četiri okvirna regiona (FR) povezana sa tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR) takođe poznatih kao hipervarijabilni regioni, doprinose formiranju mesta vezivanja antigena antitela. Prilikom odabira FR da okružuju CDR, na primer prilikom humanizacije ili optimizacije antitela, preferirani su FR iz antitela koja sadrže CDR sekvence u istoj kanonskoj klasi.

[0106] Definicije CDR korišćene u sadašnjoj prijavi kombinuju domene korišćene u mnogim različitim, često konfliktnim šemama koje su stvorene u ovoj oblasti, a koje se zasnivaju na kombinaciji analiza repertoara imunoglobulina i strukturnih analiza antitela u izolaciji i u njihovim kokristalima sa antigenima (videti pregled Swindells et al., 2016, abYsis: Integrated Antibody Sequence and Structure-Management, Analysis, and Prediction. J Mol Biol.

[PMID: 27561707; Epub 22 August 2016]). Definicija CDR korišćena ovde („unificirana” definicija) uključuje uvide iz svih takvih prethodnih saznanja i uključuje sve odgovarajuće pozicije petlji potrebne za obuhvatanje celog pejzaža ostataka koji potencijalno posreduje komplementarnost vezivanja za cilj.

[0107] Tabela 1 prikazuje sekvence aminokiselina VL domena humanizovanog anti-PD1 antitela MAb005 sa CDR kako su ovde definisani. Tabela 2 prikazuje sekvence aminokiselina VH domena humanizovanog anti-PD1 antitela MAb005 sa CDR kako su ovde definisani.

[0108] Kako se koristi ovde, termin „konzervativna supstitucija” odnosi se na zamenu jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ne menja značajno štetno funkcionalnu aktivnost. Preferirani primer „konzervativne supstitucije” je zamena jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima vrednost ≥ 0 u sledećoj BLOSUM 62 matrici supstitucije (videti Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89: 10915-10919):

[0109] Termin „monoklonsko antitelo” (Mab) odnosi se na antitelo, ili njegov antigenvezujući deo, koje je izvedeno iz jedne kopije ili klona, uključujući na primer bilo koji eukariotski, prokariotski ili fag klon, a ne na metodu kojom se proizvodi. Poželjno je da monoklonsko antitelo prema pronalasku postoji u homogenoj ili suštinski homogenoj populaciji.

[0110] „Humanizovani” molekul antitela odnosi se na oblik nehumanih (na primer, mišjih) molekula antitela, ili njihovog antigen-vezujućeg dela, koji su himerni imunoglobulini, lanci imunoglobulina ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ili druge antigenvezujuće podsekvence antitela) koji sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela mogu biti humani imunoglobulini (antitelo primaoca) u kojima su ostaci iz CDR primaoca zamenjeni ostacima iz CDR nehumane vrste (antitelo donora) kao što su miš, pacov ili kunić, koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet.

[0111] „Humano antitelo ili potpuno humano antitelo” odnosi se na molekul antitela, ili njegov antigen-vezujući deo, izveden iz transgenih miševa koji nose gene za humana antitela ili iz humanih ćelija.

[0112] Termin „himerno antitelo” namenjen je da se odnosi na molekul antitela, ili njegov antigen-vezujući deo, u kojem su sekvence varijabilnog regiona izvedene iz jedne vrste, a sekvence konstantnog regiona izvedene iz druge vrste, kao što je molekul antitela u kojem su sekvence varijabilnog regiona izvedene iz mišjeg antitela, a sekvence konstantnog regiona izvedene iz humanog antitela.

[0113] „Konjugat antitelo-lek” i „imunokonjugat” odnose se na molekul antitela, ili njegov antigen-vezujući deo, uključujući derivate antitela koji se vezuju za PD1 i VEGFR2 i konjugovani su sa citotoksičnim, citostatičkim i/ili terapijskim agensima.

[0114] Molekuli antitela prema pronalasku, ili njihov antigen-vezujući deo, mogu se proizvoditi korišćenjem tehnika dobro poznatih u struci, na primer rekombinantnih tehnologija, tehnologija prikaza faga, sintetičkih tehnologija ili kombinacija takvih tehnologija ili drugih tehnologija lako poznatih u struci.

[0115] Termin „izolovani molekul” (gde je molekul, na primer, polipeptid, polinukleotid ili antitelo) je molekul koji na osnovu svog porekla ili izvora izvođenja (1) nije povezan sa prirodno povezanim komponentama koje ga prate u njegovom nativnom stanju, (2) suštinski je slobodan od drugih molekula iz iste vrste, (3) eksprimiran je od strane ćelije iz druge vrste, ili (4) ne javlja se u prirodi. Dakle, molekul koji je hemijski sintetisan, ili eksprimiran u ćelijskom sistemu različitom od ćelije iz koje prirodno potiče, biće „izolovan” od svojih prirodno povezanih komponenti. Molekul takođe može biti učinjen suštinski slobodnim od prirodno povezanih komponenti izolacijom, korišćenjem tehnika prečišćavanja dobro poznatih u struci. Čistoća ili homogenost molekula može se ispitivati na više načina dobro poznatih u struci. Na primer, čistoća uzorka polipeptida može se ispitivati korišćenjem elektroforeze na poliakrilamidnom gelu i bojenjem gela radi vizualizacije polipeptida korišćenjem tehnika dobro poznatih u struci. Za određene svrhe, viša rezolucija može se postići korišćenjem HPLC ili drugih sredstava dobro poznatih u struci za prečišćavanje.

[0116] Termin „epitop” odnosi se na onaj deo molekula sposoban da bude prepoznat i vezan od strane molekula antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, na jednom ili više antigenvezujućih regiona molekula antitela. Epitopi se mogu sastojati od definisanih regiona primarne, sekundarne ili tercijarne strukture proteina i uključuju kombinacije sekundarnih strukturnih jedinica ili strukturnih domena cilja prepoznatih od strane antigen-vezujućih regiona antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela. Epitopi se takođe mogu sastojati od definisanog hemijski aktivnog površinskog grupisanja molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Termin „antigenski epitop”, kako se koristi ovde, definisan je kao deo polipeptida za koji se molekul antitela može specifično vezati, što se određuje bilo kojom metodom dobro poznatom u struci, na primer, konvencionalnim imunotestovima, testovima kompetitivnog vezivanja antitela ili rendgenskom kristalografijom ili srodnim metodama određivanja strukture (na primer NMR).

[0117] Termin „afinitet vezivanja” ili „KD” odnosi se na brzinu disocijacije određene interakcije antigen-antitelo. KD je odnos brzine disocijacije, takođe nazvane „brzina disocijacije (koff)”, prema brzini asocijacije, ili „brzini asocijacije (kon)”. Dakle, KDje jednako koff/ koni izražava se kao molarna koncentracija (M). Iz toga sledi da što je manji KD, jači je afinitet vezivanja. Stoga, KDod 1 µM ukazuje na slab afinitet vezivanja u poređenju sa KDod 1 nM. KD vrednosti za antitela mogu se odrediti korišćenjem metoda dobro utvrđenih u struci. Jedna metoda za određivanje KD antitela je korišćenje površinske plazmonske rezonance (SPR), obično korišćenjem biosenzorskog sistema kao što je Biacore<®>sistem.

[0118] Termin „potentnost” je merenje biološke aktivnosti i može se označiti kao IC50, ili efektivna koncentracija antitela ili konjugata antitelo-lek za antigen PD1 ili VEGFR2 koja inhibira 50% aktivnosti izmerene u testu aktivnosti PD1 ili VEGFR2 kako je ovde opisano.

[0119] Izraz „efektivna količina” ili „terapijski efektivna količina”, kako se koristi ovde, odnosi se na količinu neophodnu (pri dozama i u vremenskim periodima i za načine primene) da se postigne željeni terapijski rezultat. Efektivna količina je najmanje minimalna količina, ali manja od toksične količine, aktivnog agensa koja je neophodna da pruži terapijsku korist subjektu.

[0120] Termin „inhibirati” ili „neutralisati”, kako se koristi ovde u odnosu na bioaktivnost molekula antitela prema pronalasku, označava sposobnost antitela da suštinski antagonizuje, zabranjuje, sprečava, ograničava, usporava, remeti, eliminiše, zaustavlja, smanjuje ili preokreće, na primer, progresiju ili težinu onoga što se inhibira, uključujući, ali ne ograničavajući se na, biološku aktivnost ili vezivnu interakciju molekula antitela za PD1 ili VEGFR2.

[0121] „Ćelija domaćin” uključuje pojedinačnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja može biti ili je bila recipijent za vektore radi inkorporacije polinukleotidnih inserata. Ćelije domaćini uključuju potomstvo jedne ćelije domaćina, a potomstvo ne mora nužno biti potpuno identično (u morfologiji ili u komplementu genomske DNK) originalnoj roditeljskoj ćeliji zbog prirodne, slučajne ili namerne mutacije. Ćelija domaćin uključuje ćelije transfektovane in vivo sa polinukleotidima ovog pronalaska.

[0122] Kako se koristi ovde, „vektor” označava konstrukt koji je sposoban da isporuči, i, poželjno, eksprimira, jedan ili više gena ili sekvenci od interesa u ćeliji domaćinu. Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore, gole DNK ili RNK ekspresione vektore, plazmidne, kozmidne ili fag vektore, DNK ili RNK ekspresione vektore povezane sa kationskim kondenzacionim agensima, DNK ili RNK ekspresione vektore inkapsulirane u lipozome, i određene eukariotske ćelije, kao što su proizvodne ćelije.

[0123] Termin „lečenje”, kako se koristi ovde, osim ako nije drugačije naznačeno, označava preokretanje, ublažavanje, inhibiranje napredovanja, odlaganje progresije, odlaganje početka ili prevenciju poremećaja ili stanja na koje se takav termin odnosi, ili jednog ili više simptoma takvog poremećaja ili stanja. Termin „tretman”, kako se koristi ovde, osim ako nije drugačije naznačeno, odnosi se na čin lečenja kako je gore definisano. Termin „lečenje” takođe uključuje adjuvantni i neoadjuvantni tretman subjekta. Radi izbegavanja sumnje, referenca ovde na „tretman” uključuje referencu na kurativni, palijativni i profilaktički tretman. Radi izbegavanja sumnje, reference ovde na „tretman” takođe uključuju reference na kurativni, palijativni i profilaktičkiu tretman.

[0124] Podrazumeva se da gde god su otelotvorenja opisana ovde jezikom „koji sadrži”, takođe su obezbeđena inače analogna otelotvorenja opisana terminima „koji se sastoji od” i/ili „koji se suštinski sastoji od”.

[0125] Gde su aspekti ili otelotvorenja pronalaska opisani u terminima Markuš grupe ili drugog grupisanja alternativa, sadašnji pronalazak obuhvata ne samo celu navedenu grupu kao celinu, već i svakog člana grupe pojedinačno i sve moguće podgrupe glavne grupe, ali i glavnu grupu bez jednog ili više članova grupe. Sadašnji pronalazak takođe predviđa eksplicitno isključivanje jednog ili više bilo kojih članova grupe u traženom pronalasku.

[0126] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju isto značenje kao što ih uobičajeno shvata stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. U slučaju sukoba, sadašnja specifikacija, uključujući definicije, biće merodavna. Kroz ovu specifikaciju i patentne zahteve, reč „sadržati” , ili varijacije kao što su „sadrži” ili „sadržavajući” podrazumevaće uključivanje navedenog elementa ili grupe elemenata, ali ne i isključivanje bilo kog drugog elementa ili grupe elemenata. Osim ako kontekst ne zahteva drugačije, termini u jednini uključivaće množinu, a termini u množini uključivaće jedninu. Bilo koji primeri koji slede iza termina „npr.” ili „na primer” nisu namenjeni da budu isključivi ili ograničavajući.

[0127] Praksa sadašnjeg pronalaska koristiće, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike molekularne biologije (uključujući rekombinantne tehnike), mikrobiologije, ćelijske biologije, biohemije i imunologije, koje su u domenu veštine stručnjaka.

[0128] Posebni neograničavajući primeri biće sada opisani uz pozivanje na prateće crteže.

PRIMER 1. Generisanje optimizovanih anti-PD1 terapijskih antitela

Uvod

[0129] U ovom primeru, uspešno smo generisali panel antagonističkih, optimizovanih, anti-PD1 antitela koja su takođe simultano antagonisti VEGFR2. Ova anti-PD1 antitela su dobro eksprimirana, biofizički stabilna, visoko rastvorljiva i imaju maksimalan identitet sa preferiranim humanim germinativnim linijama.

Materijali i metode

Generisanje i selekcija PD1 biblioteke

[0130] PD1 Fab repertoar je sastavljen masovnom sintezom oligonukleotida i PCR.

Mutageneza je primenjena na CDR i regione proksimalne CDR VL (tabela 1) i VH (tabela 2) domena. Amplifikovani Fab repertoar je zatim kloniran putem restrikcije-ligacije u fagemidni vektor, transformisan u E.coli TG-1 ćelije, a repertoar faga je izolovan suštinski kao što je prethodno detaljno opisano (Finlay et al., 2011, Methods Mol Biol 681: 383-401).

[0131] Selekcije faga su vršene premazivanjem streptavidinskih magnetnih mikrokuglica biotinilovanim ciljnim proteinom PD1 ili VEGFR2 (bilo humanim ili majmunskim), pranjem kuglica tri puta sa PBS i resuspendovanjem u PBS pH 7.4 plus 5% proteina obranog mleka. Ove kuglice su premazane sa 100 nM ciljnog proteina u prvoj rundi selekcije, nakon čega su sledile smanjene koncentracije antigena u tri uzastopne runde. U svakoj rundi, fagi su eluirani korišćenjem tripsina pre reinfekcije u TG1 ćelije.

Proizvodnja periplazmatskih ekstrakata (mala skala)

[0132] Izvršena je proizvodnja rastvorljivih Fab fragmenata u pojedinačnim E. coli klonovima. E. coli TG1 ćelije u logaritamskoj fazi rasta indukovane su izopropil-1-tio-β-D-galaktopiranozidom. Periplazmatski ekstrakti koji sadrže rastvorljivi Fab generisani su ciklusom zamrzavanja/odmrzavanja: Peleti bakterijskih ćelija zamrznuti su na -20 °C preko noći, a zatim odmrznuti na sobnoj temperaturi i resuspendovani u PBS pH 7,4. Supernatanti koji sadrže rastvorljivi Fab prikupljeni su nakon mućkanja na sobnoj temperaturi i centrifugiranja.

Ekspresija i prečišćavanje IgG

[0133] Sintetički geni optimizovani za kodone sisara koji kodiraju varijabilne domene teškog i lakog lanca vodećeg panela anti-PD1 antitela plus Mab005 klonirani su u ekspresione vektore za sisare koji sadrže humani IgG1 bez efektorske funkcije ('IgG1null'; humani IgG1 koji sadrži mutacije L234A, L235A, G237A u donjem regionu šarke koje poništavaju normalne ADCC, ADCP i CDC funkcije imunoglobulina) i humane Cκ domene, respektivno. Izvršena je kotransfekcija vektora koji sadrže teški i laki lanac u ekspresionom sistemu sisara, nakon čega je sledilo prečišćavanje IgG zasnovano na proteinu A, kvantifikacija i kontrola kvaliteta na denaturišućoj i nedenaturišućoj SDS-PAGE elektroforezi.

Direktni ELISA test vezivanja za Fab i IgG

[0134] Vezivanje i unakrsna reaktivnost vodećeg panela za rekombinantne proteine inicijalno su procenjeni ELISA testom vezivanja. Humani PD1 rekombinantni protein sa humanom Fc oznakom i PD1 rekombinantni protein cynomolgus majmuna sa humanom Fc oznakom premazani su na površinu MaxiSorp<™>ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom u koncentraciji od 1 µg/ml. Prečišćeni uzorci Fab ili IgG titrirani su u dvostrukim serijskim razblaženjima počevši od 500 nM do 0,98 nM i ostavljeni da se vežu za premazane antigene. Fab fragmenti su detektovani korišćenjem mišjeg anti-c-myc antitela praćenog magarećim anti-mišjim IgG konjugovanim sa peroksidazom rena. IgG antitela su detektovana korišćenjem mišjeg antihumanog IgG konjugovanog sa peroksidazom rena. Signali vezivanja vizualizovani su rastvorom supstrata 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) i apsorbanca je merena na 450 nm.

Alphascreen test kompeticije za epitop za Fab periplazmatske preparate

[0135] AlphaScreen test (Perkin Elmer) izveden je u konačnom volumenu od 25 µl u belim mikrotitarskim pločama sa 384 bunarčića (Greiner). Reakcioni pufer sadržao je 1xPBS pH 7,3 (Oxoid, kat. br. BR0014G ) i 0,05 % (v/v) Tween<®>20 (Sigma, kat. br. P9416). Uzorci periplazmatskih preparata razblaženi u reakcionom puferu inkubirani su sa biotinilovanim humanim PD1-His/AviTag u konačnoj koncentraciji od 0,6 nM tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. hMAb005 IgG u koncentraciji od 0,3 nM i akceptorske kuglice anti-humanog IgG1 u koncentraciji od 20 µg/ml (konačne koncentracije) dodati su i smeša je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega je sledilo dodavanje streptavidinskih donorskih kuglica u koncentraciji od 20 µg/ml (konačna koncentracija) i inkubacija 30 minuta na sobnoj temperaturi. Emisija svetlosti merena je u EnVision čitaču ploča sa više obeležja (Perkin Elmer) i analizirana pomoću EnVision Manager softvera. Vrednosti su izražene kao broj očitavanja u sekundi (CPS) i korigovane za unakrsni signal. Procenti smanjenja signala izračunati su u odnosu na irelevantni uzorak.

Ćelijski test antagonizma PD1/PD-L1

[0136] Ćelijski biotest blokade PD1/PD-L1 (Promega) korišćen je za merenje potentnosti antitela u blokiranju interakcije PD1/PD-L1. Dan pre testa, PD-L1 aAPC/CHO-K1 ćelije su odmrznute i prenete u medijum za oporavak ćelija (90% Ham's F12/10% FBS). Suspenzija ćelija je dozirana u svaki od unutrašnjih 60 bunarčića dve bele, test ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, po 100 µl po bunarčiću. Medijum za oporavak ćelija dodat je u svaki od spoljašnjih bunarčića i test ploče su inkubirane preko noći na 37 °C/5% CO2. Na dan testa, uzorci IgG razblaženi su 4 puta u test puferu (99% RPMI 1640/1% FBS) od 300 nM do 0,04 nM i 40 µl po razblaženju dodato je u test ploče koje sadrže PD-L1 aAPC/CHO-K1 ćelije. Pozitivne kontrole inhibicije uključivale su mAb005 u IgG1null obliku i Nivolumab IgG4. Kao negativna kontrola inhibicije, uključen je irelevantni IgG. PD1 efektorske ćelije su zatim odmrznute u test puferu (99% RPMI 1640/1% FBS) i suspenzija ćelija dodata je u bunarčiće test ploča koje sadrže PD-L1 aAPC/CHO-K1 ćelije i uzorke titracije IgG. Test ploče su inkubirane šest sati u inkubatoru na 37 °C/5 % CO2, ostavljene da se ekvilibriraju na ambijentalnoj temperaturi 5-10 minuta, zatim je dodato 80 µl Bio-Glo<™>reagensa (Promega). Test ploče su inkubirane na ambijentalnoj temperaturi dodatnih 5-30 minuta i signali luminescencije su naknadno mereni na 10, 20 i 30 minuta.

Jednosmerni test mešovite limfocitne reakcije (MLR) humanih DC:T ćelija

[0137] CD14+ monociti izolovani su iz PBMC od tri donora i kultivisani in vitro u prisustvu GM-CSF i IL-4 radi proizvodnje nezrelih dendritskih ćelija izvedenih iz monocita (mo-DC). Mo-DC su dalje sazrele u kulturi dodavanjem TNFα. Pan-T ćelije izolovane su iz alogenih donora PBMC. Jednosmerni MLR testovi postavljeni su kokultivisanjem zrelih DC sa sveže izolovanim pan T ćelijama u odnosu 10:1 T ćelija:DC tokom ~ 5 dana u prisustvu titriranih testnih supstanci. Aktivnost je merena kvantifikovanjem produkcije IFN-γ petog dana MLR putem ELISA testa.

Rezultati i diskusija

Generisanje i skrining biblioteke

[0138] Varijabilni domeni antagonističkog anti-PD1 IgG hMAb005 klonirani su u vektor za prikaz faga u formatu humanog IgG1-kapa Fab. Mutageneza oligonukleotida korišćenjem NNK randomizacije primenjena je u segmentima od 5-6 ostataka po podbiblioteci, što je dovelo do generisanja 5 VL podbiblioteka (tabela 1) i 6 VH (tabela 2). Ove biblioteke su transformisane u E. coli, izolovane, a populacije faga iz svake biblioteke podvrgnute su 4 runde selekcije na proteinima humanog i cyno PD1 i humanog i VEGFR2 rezus majmuna.

[0139] Zatim je izvršen ELISA skrining Fab fragmenata u formatu periplazmatskih preparata kako bi se ispitalo vezivanje pojedinačnih klonova iz selekcije svake biblioteke za humani PD1, cyno PD1, humani VEGFR2 i cyno VEGFR2 (slika 1). Ove analize su pokazale da su pojedinačni klonovi u svim rundama selekcije ispoljili vezivanje za oba PD1 ortologa koje je bilo slično po signalu pozitivnoj kontroli hMAb005 Fab. Važno je da su analize vezivanja takođe pokazale da su u nekoliko biblioteka obogaćene populacije klonova koje ne samo da su zadržale aktivnost prema PD1, već su ispoljile značajno poboljšano vezivanje za humani i/ili cyno VEGFR2.168 klonova iz ovih odabranih populacija je pažljivo odabrano i dalje okarakterisano i Alphascreen testom kompeticije za PD1 epitop sa hMAb005 IgG i sekvenciranjem DNK VL i VH domena. Alphascreen analize su pokazale da su jedinstvene sekvence i u bibliotekama LCDR1 i LCDR3 sa poboljšanim vezivanjem za VEGFR2 (slika 1), zadržale kompeticiju za epitop za vezivanje hMAb005 za PD1 (slika 2). Nasuprot tome, klonovi iz biblioteka HCDR1, 2 i 3 koji su ispoljili poboljšano vezivanje za VEGFR2 nisu se efikasno takmičili sa hMAb005, sugerišući da su mutacije u VH domenu koje poboljšavaju afinitet za VEGFR2 dovele do promene epitopa na PD1 (slika 2). Analiza sekvence svih klonova sa poboljšanim vezivanjem za VEGFR2 koji su zadržali vezivanje za PD1 pokazala je značajan broj mutacija koje su pozitivno selektovane, i u LCDR1 (tabela 3) i u LCDR3 (tabela 4).

[0140] Na osnovu gore navedenih analiza, 5 reprezentativnih klonova sa mutacijama u LCDR1 ili LCDR3 koji su ispoljili visoko vezivanje za oba ortologa PD1 i oba ortologa VEGFR2 (slika 1), i procenat smanjenja signala interakcije hMAb005/PD1 od >75% (slika 2), odabrani su za ekspresiju i karakterizaciju u IgG formatu (tabela 5). Pored toga, napravljeno je 6 eksperimentalnih kombinatornih IgG klonova koji su kombinovali potencijalno korisne mutacije i u LCDR1 i u LCDR3 (klonovi MAB01-MAB06, tabela 5).

Ovih 11 vodećih IgG klonova generisano je u formatu humanog IgG1 bez efektorske funkcije.

Karakteristike specifičnosti i potentnosti vodećih IgG

[0141] 11 vodećih klonova IgG1 bez efektorske funkcije navedenih u tabeli 4, zajedno sa hMAb005 i izotipskim IgG1 bez efektorske funkcije ispitani su ELISA testom vezivanja titracijom za humani i cyno PD1 (slika 3A). Ova analiza je pokazala da su svih 11 vodećih klonova imali slično potentno vezivanje za humani i cyno PD1 kao hMAb005 IgG1, dok izotipska kontrola nije pokazala vezivanje ni za jedan protein. Nasuprot tome, kada su IgG testirani na vezivanje za VEGFR2 protein, svih 11 vodećih klonova pokazalo je značajno povećanu potentnost vezivanja i za humani i za rezus ortolog u poređenju sa hMAb005 (slika 3B).

[0142] Da bi se ispitalo da li je ova povećana reaktivnost prema VEGFR2 kod vodećih klonova u odnosu na hMab005 sposobna da promeni farmakološki odnos sa receptorom, korišćen je reporterski test humanog VEGFR2 za ispitivanje indukcije ekspresije luciferaze pod kontrolom prirodnog VEGF responzivnog elementa NFAT (Promega, izvedeno prema uputstvima proizvođača). U ovom testu, rastvorljivi VEGF-165 protein dodat je u reporterske ćelije VEGFR2 i svi IgG1 proteini ispitani su na sposobnost antagonizovanja signala indukovanog VEGF-165 (slika 4). IgG1 hMAb005 i izotipski IgG1 nisu pokazali antagonizam VEGFR2 signala. Iznenađujuće, međutim, sva vodeća antitela IgG1 bez efektorske funkcije pokazala su potentan antagonizam indukcije VEGF-VEGFR2 signala, pri čemu je jedan broj klonova ispoljavao potentnosti u sličnom opsegu kao klinički odobren lek protiv kancera anti-VEGFR2 'Ramucirumab' (slika 4). Ovo su bili veoma neočekivani nalazi jer je pokazano da hMAb005 IgG1 potentno agonizuje VEGFR2. Gore navedeni podaci sugerisali su zadržanu specifičnost za PD1 epitop, ali potpuni preokret VEGFR2 farmakologije za sva vodeća antitela. Da bi se ovi podaci dalje ispitali, generisane su pojedinačne analize za klonove izvedene iz biblioteke (slika 5A-5E) i klonove koji su kombinovali mutacije u LCDR 1 i 3 (slika 5F-5K). Ove analize sugerisale su da su antitela MAB01-MAB06 najpotentniji inhibitori VEGFR2 signalizacije, pokazujući da se poboljšanja u vezivanju za VEGFR2 posredovana svakim CDR mogu sinergistički kombinovati.

[0143] Kombinovane analize navedene ovde pokazale su da je, iznenađujuće, duboko uzorkovanje raznovrsnosti aminokiselina u CDR ovih antitela omogućilo simultanu optimizaciju specifičnosti vezivanja za ciljeve PD1 i VEGFR2, rezultirajući preokretom VEGFR2 agonističkog fenotipa progenitorskog antitela hMAb005 kod više vodećih molekula. Rezultirajuća vodeća antitela imaju korisnu karakteristiku dvostrukog antagonizma klinički relevantnih PD1 i VEGFR2 signalnih puteva.

Generisanje i analiza varijanti vodećih IgG

[0144] Generisano je osam varijanti klona MAB06 (MAB06.1-MAB06.8) kako bi se eksperimentalno ispitalo više ostataka CDR na njihovu sposobnost da budu mutirani u sekvencu humane germinativne linije, radi smanjenja rizika imunogenosti. Ovi klonovi sadržali su mutacije u pravcu germinativne linije u LCDR1 i 2 (tabela 8), i u HCDR2 (tabela 9). Svih osam klonova eksprimirano je i prečišćeno u formatu IgG1 bez efektorske funkcije. Svi klonovi su lako eksprimirani i prečišćeni putem afinitetne kolone sa proteinom A, a rezultirajući proteini ispoljili su % monomernog IgG od >94% (mereno pomoću SEC).

[0145] MAB06.1-MAB06.8 IgG antitela testirana su na sposobnost antagonizovanja i PD1 i VEGFR2 signalizacije. Svih 8 klonova zadržalo je sposobnost antagonizovanja PD1 signalizacije u ćelijskom biološkom testu signalizacije PD1/PD-L1, sa potentnostima sličnim i SHR-1210 IgG1-3M i Nivolumabu (slika 6). Slično tome, svih 8 klonova zadržalo je sposobnost antagonizovanja VEGFR2 signalizacije zavisnu od koncentracije u ćelijskom biološkom testu signalizacije VEGF/VEGFR2, sa potentnostima sličnim Ramucirumabu (slika 7). Uporedna analiza antagonizma PD1 i VEGFR2 za klonove MAB06.5 (slika 8A, 8B), MAB06.6 (slika 8C, 8D), MAB06.7 (slika 8E, 8F) i MAB06.8 (slika 8G, 8H) pokazala je da sekvenca klona MAB06 može prihvatiti humanizaciju više ostataka u LCDR1, LCDR2 (tabela 8) i HCDR2 (tabela 9), zadržavajući sposobnost antagonizovanja signalizacije oba receptora. Važno je da je pokazano da kontrolni SHR-1210 IgG13M (hMab005) nije sposoban da inhibira VEGFR2 signalizaciju u prisustvu VEGF, kao što je demonstrirano na slikama 4, 5, 7 i 8.

[0146] Gore navedeni nalazi pokazuju da sposobnost antagonizovanja i PD1 i VEGFR2 puteva u jednom molekulu može pružiti kliničku korist u odnosu na antitelo SHR-1210 (hMab005), blokiranjem dva ključna imunosupresivna signala za koje je poznato da su veoma aktivni u mikrookruženju tumora. Zaista, pokazano je da su i PD1 i VEGFR2 receptori ko-eksprimirani na imunim ćelijama u humanim tumorima, sugerišući da agensi sa dvostrukim antagonizmom mogu potencijalno delovati na bifunkcionalni način na pojedinačnim ćelijama, kao što je prikazano na slici 9.

[0147] Antitela koja se vezuju za signalne receptore sa visokim afinitetom u riziku su da postanu potentni agonisti aktivnosti receptora kada ligand receptora nije prisutan. Da bi se ovo ispitalo, VEGFR2 biološki test ponovljen je u odsustvu VEGF. Kontrolno antitelo anti-VEGFR2 IgG1 visokog afiniteta Ramucirumab, izotipska kontrola humani IgG1, MAB06.5, MAB06.8 i VEGF-165 protein titrirani su u ovom testu, pri čemu su proteini antitela počinjali od koncentracije 1000 nM (slika 10). Samo VEGF-165 pokazao je aktivaciju receptora zavisnu od koncentracije, što je potvrdilo da su MAB06.5 i MAB06.8 IgG1 antagonisti VEGFR2 u prisustvu VEGF (slika 8), a nisu agonisti VEGFR2 u odsustvu VEGF (slika 10).

[0148] Da bi se dalje potvrdila potentnost antagonizma PD1 za MAB06.5 i MAB06.8, oba molekula analizirana su u jednosmernom MLR testu humanih DC:T ćelija, sa Nivolumabom (anti-PD1) kao pozitivnom kontrolom i IFN-γ merenim kao indikatorom aktivnosti (slika 11). MLR testovi izvedeni su sa 3 odvojena para humanih donora, u dva ponovljena izvođenja. Ove analize pokazale su da su i MAB6.5 i MAB6.8 pokazali potentnosti zavisne od koncentracije u IFN-γ signalizaciji pokrenutoj blokadom PD1 koje su bile ekvivalentne Nivolumabu. Ovo je utvrđeno u oba izvođenja za par donora 1 (slika 11A, slika 11B), par donora 2 (slika 11C, slika 11D) i par donora 3 (slika 11E, slika 11F), pokazujući visoku reproducibilnost u blokiranju funkcije PD1 na T ćelijama.

Generisanje i analiza varijanti vodećih IgG 3. generacije

[0149] WO2019170885A1 obelodanjuje brojne mutacije koje se mogu napraviti u VH domenu hMab005 koje imaju potencijal da poboljšaju afinitet molekula za PD1. Da bi se ispitala moguća korisnost ovih prethodno definisanih mutacija u kontekstu novih klonova opisanih ovde, generisano je devet varijanti klona MAB06.8 kako bi se eksperimentalno ispitalo više ostataka VH CDR na njihovu sposobnost da budu mutirani radi potencijalnog daljeg poboljšanja vezivanja za PD1 i/ili VEGFR2. Ovi klonovi su svi sadržali MAB06.8 VL sekvencu (SEQ ID NO: 47, tabela 8), eksprimiranu sa 9 jedinstvenih VH sekvenci (tabela 10). Svih osam klonova eksprimirano je i prečišćeno u formatu IgG1 bez efektorske funkcije.

Svi klonovi (osim MAB06.8.3 i MAB06.8.5, koji su oba imali problem sa agregacijom) lako su eksprimirani i prečišćeni putem afinitetne kolone sa proteinom A, a rezultirajući proteini ispoljili su % monomernog IgG od >95% (mereno pomoću SEC).

[0150] 7 dobro eksprimiranih klonova IgG1 bez efektorske funkcije (MAB06.8.3 i MAB06.8.5 izostavljeni), zajedno sa hMAb005 i izotipskim IgG1 bez efektorske funkcije ispitani su ELISA testom vezivanja titracijom za humani i cyno PD1 (slika 12A, slika 12B). Ova analiza je pokazala da je većina ovih 7 klonova zadržala vezivanje za humani i cyno PD1, dok izotipska kontrola nije pokazala vezivanje ni za jedan protein. Jedan značajan izuzetak bio je MAB06.8.4, koji je izgubio sposobnost vezivanja za cyno PD1 (slika 12B). Kada su IgG testirani na vezivanje za VEGFR2 protein, svih 7 klonova pokazalo je vezivanje za oba, humani i cyno, ortologa (slika 12C, slika 12D).

[0151] Uprkos ovom zadržavanju prividnog afiniteta vezivanja i za PD1 i za VEGFR2 kod većine klonova, kada je 7 varijanti zatim ispitano u biološkim testovima antagonizma PD1 i VEGFR2, korisna svojstva MAB06.8 nisu niti zadržana niti poboljšana. Svih 7 klonova ispoljilo je smanjenu sposobnost antagonizovanja PD1, VEGFR2, ili oba, u poređenju sa pozitivnim kontrolama (slika 13A, slika 13B) i u poređenju sa MAB06 (slika 5), MAB06.5 (slika 8) i MAB06.8 (slika 8).

[0152] Pominjanje bilo koje reference, članka, publikacije, patenta, patentne publikacije i patentne prijave citirano ovde nije, i ne treba se shvatiti kao priznanje, ili bilo koji oblik sugestije, da oni predstavljaju validno prethodno stanje tehnike ili čine deo opšteg poznatog znanja u bilo kojoj zemlji na svetu.

[0153] Iako je sadašnji pronalazak opisan uz pozivanje na preferirana ili primerna otelotvorenja, stručnjaci u datoj oblasti će prepoznati da se različite modifikacije i varijacije istog mogu postići.

Tabela 1. Sekvence aminokiselina VL podbiblioteka mutageneze hMAb005.

Tabela 2. Sekvence aminokiselina VH podbiblioteka mutageneze hMAb005.

Tabela 3. Poziciono-specifične mutacije pronađene u LCDR1 klonova koje ispoljavaju poboljšano vezivanje za VEGFR2.

Tabela 4. Poziciono-specifične mutacije pronađene u LCDR3 klonova koje ispoljavaju poboljšano vezivanje za VEGFR2.

Tabela 5. Sekvence varijabilnog regiona lakog lanca IgG antitela koje ispoljavaju poboljšano vezivanje za VEGFR2.

Tabela 6. Primeri sekvenci aminokiselina Fc regiona antitela.

Tabela 7. Primeri sekvenci aminokiselina membranskih proteina.

Tabela 8. Sekvence aminokiselina varijabilnog regiona lakog lanca IgG antitela koje ispoljavaju poboljšano vezivanje za VEGFR2.

Tabela 9. Sekvence aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca IgG antitela koje ispoljavaju poboljšano vezivanje za VEGFR2.

Tabela 10. Sekvence aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca, kombinovane sa sekvencom aminokiselina VL regiona SEQ ID NO: 47, za formiranje IgG antitela 3. generacije.

SPISAK SEKVENCI

<110> ULTRAHUMAN EIGHT LIMITED

<120> AGENSI SA DVOSTRUKIM VEZIVANJEM ZA PD1 I VEGFR2 <130> UHEL-002/02WO 332951-2018

<150> GB 2013180.1

<151> 2020-08-24

<150> GB 1914747.9

<151> 2019-10-11

<160> 75

<170> PatentIn verzija 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HCDR1

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Met Met Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HCDR2

<400> 2

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HCDR3

<400> 3

Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR1

<400> 4

Leu Ala Ser Gln Gly Ile Gly Pro Trp Leu Ser 1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR2

<400> 5

Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR3

<400> 6

Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR1

<400> 7

Leu Ala Ser Gln Pro Leu Gly Ile Trp Leu Ser 1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR1

<400> 8

Leu Ala Ser Gln Glu Ser Gly Ile Trp Leu Ser 1 5 10

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR1

<400> 9

Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Thr 1 5 10

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR3

<400> 10

Gln Gln Val Ala Glu Leu Pro Phe Gly

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR3

<400> 11

Gln Gln Val Ser Val Thr Pro Phe Thr

1 5

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR1

<400> 12

Leu Ala Ser Gln Glu Ser Gly Ile Trp Leu Gly

1 5 10

<210> 13

<211> 116

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region teškog lanca (VH)

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Gly Ile Gly Pro Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Pro Leu Gly Ile Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Glu Ser Gly Ile Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ala Glu Leu Pro Phe

85 90 95

Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp 20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ser Val Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Gly Ile Gly Pro Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ala Glu Leu Pro Phe

85 90 95

Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Pro Leu Gly Ile Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ala Glu Leu Pro Phe

85 90 95

Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Glu Ser Gly Ile Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ala Glu Leu Pro Phe

85 90 95

Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 22

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Gly Ile Gly Pro Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ser Val Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 23

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Pro Leu Gly Ile Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ser Val Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Glu Ser Gly Ile Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ser Val Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 25

<211> 327

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 26

<211> 327

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> Fc region humanog IgG4(S228P) antitela

<400> 26

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 27

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 28

<211> 330

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> Fc region humanog IgG1-3M antitela

<400> 28

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 29

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 30

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 31

<211> 329

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> Fc region antitela IgG1-3M „REEM” alotipa

<400> 31

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240

Met Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 32

<211> 288

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190

Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220

Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240

Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly

245 250 255

Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270

Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285

<210> 33

<211> 288

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis

<400> 33

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Glu Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30

Asn Ala Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Leu Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Ala Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190

Ser Arg Ala Ala Gln Gly Thr Ile Glu Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220

Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Ala Pro 225 230 235 240

Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly

245 250 255

Leu Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270

Ser Pro Arg Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285

<210> 34

<211> 1356

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu 1 5 10 15

Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro 20 25 30

Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr 35 40 45

Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro 50 55 60

Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser 65 70 75 80

Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn

85 90 95

Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser 100 105 110

Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser 115 120 125

Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys 130 135 140

Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser 145 150 155 160

Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg

165 170 175

Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile 180 185 190

Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser 195 200 205

Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr 210 215 220

Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 225 230 235 240

Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile

245 250 255

Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 260 265 270

Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 275 280 285

Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 290 295 300

Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 305 310 315 320

Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met

325 330 335

Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala 340 345 350

Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly 355 360 365

Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr 370 375 380

Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu 385 390 395 400

Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val

405 410 415

Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val 420 425 430 Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr 435 440 445

Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu 450 455 460

Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr 465 470 475 480

Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys

485 490 495

Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys 500 505 510

Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr 515 520 525

Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser 530 535 540

Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln 545 550 555 560

Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser

565 570 575

Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro 580 585 590

Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr 595 600 605

Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile 610 615 620

Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr 625 630 635 640

Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val

645 650 655 Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn 660 665 670

Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys 675 680 685

Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn 690 695 700

Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg 705 710 715 720

Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr

725 730 735

Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe 740 745 750

Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu 755 760 765

Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile 770 775 780

Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly 785 790 795 800

Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His

805 810 815

Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp 820 825 830

Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val 835 840 845

Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr 850 855 860

Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg 865 870 875 880 Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu

885 890 895

Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu 900 905 910

Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu 915 920 925

Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg 930 935 940

Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys 945 950 955 960

Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly

965 970 975

Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro 980 985 990

Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr 995 1000 1005

Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys 1010 1015 1020

Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu 1025 1030 1035

Lys Asn Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile 1040 1045 1050

Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro 1055 1060 1065

Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr 1070 1075 1080

Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile 1085 1090 1095

Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu 1100 1105 1110

Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro 1115 1120 1125

Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp 1130 1135 1140

His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Ser Glu Leu Val Glu 1145 1150 1155

His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln Asp Gly Lys 1160 1165 1170

Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu Ser Met Glu Glu 1175 1180 1185

Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser Cys Met Glu 1190 1195 1200

Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala 1205 1210 1215

Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro 1220 1225 1230

Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu 1235 1240 1245

Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val 1250 1255 1260

Leu Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu 1265 1270 1275

Ser Pro Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser 1280 1285 1290

Val Ala Ser Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly 1295 1300 1305

Tyr His Ser Asp Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu 1310 1315 1320

Ala Glu Leu Leu Lys Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser 1325 1330 1335

Thr Ala Gln Ile Leu Gln Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser 1340 1345 1350

Pro Pro Val

1355

<210> 35

<211> 1356

<212> PRT

<213> Macaca mulatta

<400> 35

Met Ala Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu 1 5 10 15

Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro 20 25 30

Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr 35 40 45

Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro 50 55 60

Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser 65 70 75 80

Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn

85 90 95

Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser 100 105 110

Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser 115 120 125

Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys 130 135 140

Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser 145 150 155 160

Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg

165 170 175

Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile 180 185 190

Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser 195 200 205

Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr 210 215 220

Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Val Glu Leu Ser Val Gly Glu 225 230 235 240

Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile

245 250 255

Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 260 265 270

Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 275 280 285

Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 290 295 300

Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 305 310 315 320

Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met

325 330 335

Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Val 340 345 350 Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly 355 360 365

Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Val Lys Val Gly His Val Leu Thr 370 375 380

Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu 385 390 395 400

Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val

405 410 415

Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val 420 425 430

Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr 435 440 445

Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu 450 455 460

Glu Cys Pro Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr 465 470 475 480

Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys

485 490 495

Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys 500 505 510

Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr 515 520 525

Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser 530 535 540

Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Leu Gln 545 550 555 560

Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Lys Ser

565 570 575 Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro 580 585 590

Val His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr 595 600 605

Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Ile Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile 610 615 620

Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr 625 630 635 640

Val Cys Val Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val

645 650 655

Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Met Ile Thr Gly Asn 660 665 670

Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Thr Ile Glu Val Ser Cys 675 680 685

Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn 690 695 700

Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg 705 710 715 720

Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr

725 730 735

Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe 740 745 750

Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu 755 760 765

Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile 770 775 780

Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly 785 790 795 800 Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His

805 810 815

Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp 820 825 830

Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val 835 840 845

Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr 850 855 860

Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg 865 870 875 880

Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu

885 890 895

Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu 900 905 910

Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu 915 920 925

Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg 930 935 940

Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys 945 950 955 960

Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly

965 970 975

Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro 980 985 990

Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr 995 1000 1005

Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys 1010 1015 1020

Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu 1025 1030 1035

Lys Asn Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile 1040 1045 1050

Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro 1055 1060 1065

Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr 1070 1075 1080

Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile 1085 1090 1095

Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu 1100 1105 1110

Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro 1115 1120 1125

Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp 1130 1135 1140

His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Ser Glu Leu Val Glu 1145 1150 1155

His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln Asp Gly Lys 1160 1165 1170

Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu Ser Met Glu Glu 1175 1180 1185

Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser Cys Met Glu 1190 1195 1200

Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala 1205 1210 1215

Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro 1220 1225 1230

Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu 1235 1240 1245

Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val 1250 1255 1260

Leu Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu 1265 1270 1275

Ala Pro Ser Phe Ser Gly Met Val Ser Ser Lys Ser Arg Glu Ser 1280 1285 1290

Val Ala Ser Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly 1295 1300 1305

Tyr His Ser Asp Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu 1310 1315 1320

Ala Glu Leu Leu Lys Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser 1325 1330 1335

Thr Ala Gln Ile Leu Gln Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser 1340 1345 1350

Pro Pro Val

1355

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> Nepoznato

<220>

<223> motiv konstantnog regiona imunoglobulina

<400> 36

Arg Asp Glu Leu Thr

1 5

<210> 37

<211> 4

<212> PRT

<213> Nepoznato

<220>

<223> motiv konstantnog regiona imunoglobulina <400> 37

Arg Glu Glu Met

1

<210> 38

<211> 17

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HCDR2

<400> 38

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 39

<211> 11

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR1

<400> 39

Arg Ala Ser Gln Glu Ser Gly Ile Trp Leu Ser

1 5 10

<210> 40

<211> 7

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR2

<400> 40

Thr Ala Ser Ser Leu Ala Asp

1 5

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR2

<400> 41

Ala Ala Ser Ser Leu Ala Asp

1 5

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HCDR2

<400> 42

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR2

<400> 43

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 44

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 44

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ser Gly Ile Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ser Val Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 45

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 45

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ser Gly Ile Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Thr Ala Ser Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ser Val Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 46

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 46

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ser Gly Ile Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ser Val Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 47

<211> 107

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region lakog lanca (VL)

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ser Gly Ile Trp 20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ser Val Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 48

<211> 116

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region teškog lanca (VH)

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 49

<211> 116

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region teškog lanca (VH)

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LFR1

<400> 50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 51

<211> 15

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LFR2

<400> 51

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15

<210> 52

<211> 32

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LFR3

<400> 52

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 53

<211> 10

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LFR4

<400> 53

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 54

<211> 25

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HFR1

<400> 54

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 55

<211> 12

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HFR2

<400> 55

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

1 5 10

<210> 56

<211> 19

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HCDR2

<400> 56

Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser 1 5 10 15

Val Lys Gly

<211> 32

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HFR3

<400> 57

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30

<210> 58

<211> 11

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HFR4

<400> 58

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 59

<211> 11

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR1

<220>

<221> MISC_ODLIKA

<222> (5)..(5)

<223> Xaa je Thr, Glu, Gly, Lys, Pro ili Ser

<220>

<221> MISC_ODLIKA

<222> (6)..(6)

<223> Xaa je Ile, Ala, Leu, Ser ili Val

<220>

<221> MISC_ODLIKA

<222> (7)..(7)

<223> Xaa je Gly, Arg ili Ser

<220>

<221> MISC_ODLIKA

<222> (8)..(8)

<223> Xaa je Thr, Gly, Ile, Leu ili Pro

<220>

<221> MISC_ODLIKA

<222> (11)..(11)

<223> Xaa je Thr ili Ser

<400> 59

Leu Ala Ser Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Leu Xaa

1 5 10

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VL LCDR3

<220>

<221> MISC_ODLIKA

<222> (4)..(4)

<223> Xaa je Tyr, Ala, Phe, Asn ili Ser

<220>

<221> MISC_ODLIKA

<222> (5)..(5)

<223> Xaa je Ser, Ala, Glu, Met, Asn, Gln ili Val <220>

<221> MISC_ODLIKA

<222> (6)..(6)

<223> Xaa je Ile, Leu, Thr ili Val

<220>

<221> MISC_ODLIKA

<222> (8)..(8)

<223> Xaa je Trp ili Phe

<220>

<221> MISC_ODLIKA

<222> (9)..(9)

<223> Xaa je Thr, Ala, Gly, Asn, Arg ili Ser <400> 60

Gln Gln Val Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa

1 5

<211> 10

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HCDR1

<400> 61

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Leu Met Ser 1 5 10

<210> 62

<211> 7

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HCDR3

<400> 62

Gln Leu Tyr Phe Phe Asp Tyr

1 5

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HCDR3

<400> 63

Gln Leu Tyr Tyr Tyr Asp Tyr

1 5

<210> 64

<211> 7

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HCDR3

<400> 64

Gln Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HCDR3

<400> 65

Gln Leu Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 66

<211> 7

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> VH HCDR3

<400> 66

Gln Leu Tyr Tyr Ala Asp Tyr

1 5

<210> 67

<211> 116

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region teškog lanca (VH)

<400> 67

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 68

<211> 116

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region teškog lanca (VH)

<400> 68

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<211> 116

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region teškog lanca (VH)

<400> 69

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 70

<211> 116

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region teškog lanca (VH)

<400> 70

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 71

<211> 116

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region teškog lanca (VH)

<400> 71

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 72

<211> 116

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region teškog lanca (VH)

<400> 72

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<211> 116

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region teškog lanca (VH)

<400> 73

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 74

<211> 116

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region teškog lanca (VH)

<400> 74

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 75

<211> 116

<212> PRT

<213> Sintetička sekvenca

<220>

<223> varijabilni region teškog lanca (VH)

<400> 75

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje se specifično vezuje i za PD1 i za VEGFR2 ili antigen-vezujući deo antitela, pri čemu antitelo ili antigen-vezujući deo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), gde

2. Antitelo ili antigen-vezujući deo prema patentnom zahtevu 1, gde

3. Antitelo ili antigen-vezujući deo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde:

je antitelo humanizovano ili himerno; i/ili

VH region, VL region ili i VH i VL region sadrže jednu ili više sekvenci aminokiselina humanih okvirnih regiona; i/ili

VH region, VL region ili i VH i VL region sadrže sekvencu aminokiselina okvirnog skeleta humanog varijabilnog regiona u koju su inserirani CDR.

4. Antitelo ili antigen-vezujući deo prema patentnom zahtevu 1, gde

VH region sadrži sekvencu aminokiselina IGHV3-7 humanog skeleta germinativne linije u koju su insertovane sekvence aminokiselina HCDR1, HCDR2 i HCDR3; i/ili

VL region sadrži sekvencu aminokiselina IGKV1-39 humanog skeleta germinativne linije u koju su insertovane sekvence aminokiselina LCDR1, LCDR2 i LCDR3.

5. Antitelo ili antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, pri čemu antitelo ili antigen-vezujući deo sadrži konstantni region imunoglobulina; opciono pri čemu je konstantni region imunoglobulina:

(i) IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ili IgY; opciono IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 ili IgA2; ili (ii) imunološki inertan; ili

(iii) konstantni region humanog IgG4 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG4 koji sadrži supstituciju aminokiseline S228P, konstantni region humanog IgG1 divljeg tipa, konstantni region humanog IgG1 koji sadrži supstitucije aminokiselina L234A, L235A i G237A ili konstantni region humanog IgG2 divljeg tipa; ili

(iv) sadrži bilo koju od SEQ ID NO: 25-31.

6. Antitelo ili antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, pri čemu je antitelo ili antigen-vezujući deo Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv, maksitelo, dijatelo, trijatelo, tetratelo ili bis-scFv.

7. Antitelo ili antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu je antitelo ili antigen-vezujući deo tetramerno, tetravalentno ili multispecifično.

8. Imunokonjugat koji sadrži antitelo ili antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 povezan sa terapijskim agensom; opciono pri čemu je terapijski agens citotoksin, radioizotop, hemoterapijski agens, imunomodulatorni agens, citostatički enzim, citolitički enzim, terapijska nukleinska kiselina, anti-angiogeni agens, antiproliferativni agens ili proapoptotski agens.

9. Farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 ili imunokonjugat prema patentnom zahtevu 8, i farmaceutski prihvatljiv nosač, diluent ili ekscipijens.

10. Molekul nukleinske kiseline koji kodira i sekvence aminokiselina VH i VL regiona antitela ili antigen-vezujućeg dela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7.

11. Ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 10.

12. Rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 10 ili ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 11.

13. Metoda proizvodnje anti-PD1 i anti-VEGFR2 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela, pri čemu metoda obuhvata:

kultivisanje rekombinantne ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 12 pod uslovima pri kojima se molekul nukleinske kiseline eksprimira, čime se proizvodi antitelo ili antigenvezujući deo; i

izolovanje antitela ili antigen-vezujućeg dela iz ćelije domaćina ili kulture.

14. Antitelo ili antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, imunokonjugat prema patentnom zahtevu 8 ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 9, za upotrebu kao medikament.

15. Antitelo ili antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, imunokonjugat prema patentnom zahtevu 8 ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 9 za upotrebu u lečenju kancera, infektivne bolesti ili imune bolesti.

16. Antitelo ili antigen-vezujući deo, imunokonjugat ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, gde:

(i) je kancer rak pankreasa, melanom, rak dojke, rak pluća, rak bronhija, kolorektalni rak, rak prostate, rak želuca, rak jajnika, rak mokraćne bešike, rak mozga ili centralnog nervnog sistema, rak perifernog nervnog sistema, rak jednjaka, rak grlića materice, rak materice ili endometrijuma, rak usne duplje ili ždrela, rak jetre, rak bubrega, rak testisa, rak žučnih puteva, rak tankog creva ili slepog creva, rak pljuvačnih žlezda, rak štitne žlezde, rak nadbubrežne žlezde, osteosarkom, hondrosarkom ili rak hematoloških tkiva; ili

(ii) infektivna bolest je virusna, bakterijska, gljivična ili parazitska; ili

(iii) infektivna bolest je infekcija virusom humane imunodeficijencije (HIV).