RS66847B1 - Isporučivanje mikro-distrofina pomoću adeno-asociranog virusnog vektora radi lečenja mišićne distrofije - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak obezbeđuje vektore za gensku terapiju, kao što su adeno-asocirani virusni (AAV) vektori, koji eksprimiraju minijaturizovani humani gen mikro-distrofin, na primer za upotrebu u postupcima za ublažavanje i prevenciju fibroze kod ispitanika koji boluju od mišićne distrofije.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Značaj mišićne mase i sile za svakodnevne aktivnosti, kao što su kretanje i disanje, kao i za metabolizam celog tela je neosporan. Deficiti funkcije mišića dovode do mišićnih distrofija (MD) koje karakteriše slabost i atrofija mišića i one imaju ozbiljan uticaj na kvalitet života. Najbolje okarakterisane MD su posledica mutacija u genima koji kodiraju članove proteinskog kompleksa povezanog sa distrofinom (dystrophin-associated protein complex, DAPC). Ove MD su posledica krhkosti membrane koja je povezana sa gubitkom sarkolemalnog-citoskeletnog vezivanja putem DAPC. Dišenova mišična distrofija (DMD) jedna je od najrazornijih bolesti mišića koja se javlja kod 1 od 5000 novorođenih osoba muškog pola.

[0003] Ova prijava uključuje dva translaciona pristupa za razvoj lečenja za DMD. Fibrotična infiltracija je veoma prisutna kod DMD i predstavlja značajnu smetnju za bilo koju potencijalnu terapiju. Takođe je važno imati u vidu da i samu gensku terapiju ometa težina fibroze, koja je prisutna već kod veoma male dece koja boluju od DMD. Zapravo, biopsije mišića pri uobičajenom uzrastu postavljanja dijagnoze, između 4-5 godina starosti, pokazuju veoma izražene nivoe fibroze.

[0004] Uzrok DMD su mutacije u genu DMD koje dovode do redukcije iRNK i odsustva distrofina, proteina sarkoleme od 427 kD koji je povezan sa proteinskim kompleksom povezanim sa distrofinom (DAPC) (Hoffman et al., Cell 51(6):919-28, 1987). DAPC je sačinjen od više proteina na sarkolemi mišića koji čine strukturnu vezu između ekstracelularnog matriksa (ECM) i citoskeleta preko distrofina, proteina koji vezuje aktin, i alfa-distroglikana, proteina koji vezuje laminin. Ove strukturne veze stabilizuju membranu mišićne ćelije tokom kontrakcije i štite od oštećenja uzrokovanog kontrakcijom. Kada dođe do gubitka distrofina, krhkost membrane dovodi do pucanja sarkoleme i prodora kalcijuma, što aktivira kalcijumom aktivirane proteaze i nekrozu segmentnih vlakana (Straub et al., Curr Opin. Neurol.10(2): 168-75, 1997). Ovaj nekontrolisani ciklus degeneracije i regeneracije mišića na kraju iscrpljuje populaciju matičnih ćelija mišića (Sacco et al., Cell, 2010.143(7): str. 1059-71; Wallace et al., Annu Rev Physiol, 2009.71: str. 37-57), što dovodi do progresivnog slabljenja mišića, endomizijalne inflamacije i fibroznih ožiljaka.

[0005] Bez stabilizacije membrane koju vrši distrofin ili mikro-distrofin, DMD će dovesti do nekontrolisanih ciklusa povrede i obnavljanja tkiva i na kraju će zameniti uništena mišićna vlakna fibroznim ožiljačnim tkivom putem proliferacije vezivnih tkiva. Fibrozu karakteriše prekomerno taloženje proteina ECM matriksa, uključujući kolagen i elastin. Proteine ECM primarno proizvode citokini, kao što je TGFβ, koje oslobađaju aktivirani fibroblasti kao odgovor na stres i inflamaciju. Iako je primarna patološka karakteristika DMD degeneracija i nekroza mišićnih vlakana, fibroza, kao patološka posledica, ima podjednak značaj.

Prekomerna proizvodnja fibroznih tkiva ograničava regeneraciju mišića i doprinosi progresivnom slabljenju mišića kod pacijenta sa DMD. U jednoj studiji, prisustvo fibroze na inicijalnim biopsijama pacijenata sa DMD u velikoj meri se poklapalo sa lošim motoričkim rezultatima prilikom kontrole nakon 10 godina (Desguerre et al., J Neuropathol Exp Neurol, 2009. 68(7): str.762-7). Ovi rezultati ukazuju da je fibroza značajan faktor disfunkcije mišića kod DMD i ističu neophodnost razvoja terapija koje redukuju fibrozno tkivo. Većina antifibroznih terapija koje su testirane na mdx miševima deluje tako što blokira signalizaciju fibroznog citokina putem inhibicije TGFβ puta. MikroRNK (miRNK) su jednolančane RNK od ~22 nukleotida koje posreduju utišavanje gena na posttranskripcionom nivou putem sparivanja sa bazama u okviru 3' UTR iRNK, što inhibira translaciju ili promoviše razgradnju iRNK. Germinativna sekvenca od 7 bp na 5' kraju miRNK cilja miRNK. Dodatno prepoznavanje se ostvaruje putem ostatka ciljane sekvence, kao i njene sekundarne strukture. miRNK imaju važnu ulogu u patologiji bolesti mišića i imaju profile ekspresije koji su neuporedivo zavisni od vrste date mišićne distrofije Eisenberg et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007.104(43): str.17016-21). Sve je više dokaza koji ukazuju na to da miRNK učestvuju u fibroznim procesima u brojnim organima, uključujući srce, jetru, bubrege i pluća (Jiang et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2007.104(43): str.17016-21). Nedavno je dokazano da ova nishodna regulacija miR-29 doprinosi srčanoj fibrozi (Cacchiarelli et al., Cell Metab, 2010.

12(4): p.341-51), a smanjena ekspresija miR-29 je genetski povezana sa mišićima ljudskih pacijenata sa DMD (Eisenberg et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007.104(43): str.17016-2). Familija miR-29 obuhvata tri člana koja eksprimiraju dva bicistronska klastera miRNK. miR-29a se eksprimira zajedno sa miR-29b (miR-29b-1); miR-29c se eksprimira zajedno sa drugom kopijom miR-29b (miR-29b-2). Familija miR-29 deli očuvanu germinativnu sekvencu, a miR-29a i miR-29b se razlikuju od miR-29c samo po jednoj bazi. Nadalje, elektroporacija miR-29 plazmida (klaster miR-29a i miR-29b-1) u mišić mdx miševa smanjila je nivoe ekspresije komponenata ECM, kolagena i elastina, i značajno je smanjila taloženje kolagena u delovima mišića u roku od 25 dana od lečenja (Cacchiarelli et al., Cell Metab, 2010.12(4): str.341-51).

[0006] Adeno-asocirani virus (AAV) je parvovirus sa nedostatkom replikacije, čiji jednolančani DNK genom je dugačak oko 4,7 kb, uključujući invertovano terminalno ponavljanje (ITR) od 145 nukleotida. Postoji više serotipova AAV. Poznate su nukleotidne sekvence genoma serotipova AAV. Na primer, nukleotidna sekvenca genoma AAV serotipa 2 (AAV2) prikazana je u Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983) uz korekciju autora Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994). U vidu drugih primera, kompletan genom AAV-1 dat je pod GenBank pristupnim br. NC_002077; kompletan genom AAV-3 dat je pod GenBank pristupnim br. NC_1829; kompletan genom AAV-4 dat je pod GenBank pristupnim br. NC_001829; genom AAV-5 dat je pod GenBank pristupnim br. AF085716; kompletan genom AAV-6 dat je pod GenBank pristupnim br. NC_001862; barem delovi AAV-7 i AAV-8 genoma dati su pod GenBank pristupnim br. AX753246, odnosno AX753249 (vidite takođe U.S. patente br.7,282,199 i 7,790,449 koji se odnose na AAV-8); genom AAV-9 je dat u Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); genom AAV-10 je dat u Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); a genom AAV-11 je dat u Virology, 330(2): 375-383 (2004). AAVrh74 serotip je opisan u Rodino-Klapac et al. J. Trans. Med.5: 45 (2007). Cisdelujuće sekvence koje usmeravaju replikaciju (rep) virusne DNK, enkapsidaciju/pakovanje i integraciju hromozoma ćelije domaćina nalaze se unutar ITR. Tri AAV promotera (nazvana p5, p19 i p40 na osnovu njihovih relativnih lokacija na mapi) pokreću ekspresiju dva AAV interna otvorena okvira za čitanje koji kodiraju rep i cap gene. Dva rep promotera (p5 i p19), zajedno sa diferencijalnim splajsovanjem jednog AAV introna (npr. nukleotidi AAV22107 i 2227), dovode do proizvodnje četiri rep proteina (rep 78, rep 68, rep 52 i rep 40) od rep gena. Rep proteini imaju više enzimskih svojstava koja su na kraju odgovorna za replikaciju virusnog genoma. Cap gen se eksprimira iz p40 promotera i kodira tri kapsidna proteina VP1, VP2 i VP3. Alternativno splajsovanje i nekonsenzusna mesta početka translacije su odgovorni za proizvodnju tri povezana kapsidna proteina. Jedno konsenzusno mesto poliadenilacije se nalazi na poziciji 95 mape AAV genoma. Pregled životnog ciklusa i genetike AAV dat je u Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

[0007] AAV ima jedinstvene karakteristike koje ga čine atraktivnim kandidatom za vektor za isporuku strane DNK u ćelije, na primer, kod genske terapije. AAV infekcija ćelija u kulturi je necitopatska, a infekcija ljudi i drugih životinja prirodnim putem je tiha i asimptomatična. Štaviše, AAV inficira brojne ćelije sisara što omogućava ciljanje brojnih različitih tkiva in vivo. Štaviše, AAV transdukuje sporo deljive i nedeljive ćelije, i može se zadržati suštinski tokom celog životnog veka tih ćelija kao transkripciono aktivan nuklearni epizom (ekstrahromozomski element). AAV provirusni genom je infektivan kao klonirana DNK u plazmidima što omogućava konstruisanje rekombinantnih genoma. Pored toga, pošto se signali koji usmeravaju replikaciju AAV, enkapsidaciju i integraciju genoma nalaze unutar ITR genoma AAV, deo ili celina unutrašnjih približno 4,3 kb genoma (kodira replikaciju i strukturne kapsidne proteine, rep-cap) mogu se zameniti stranom DNK, kao što je genska kaseta koja sadrži promoter, DNK od interesa i signal za poliadenilaciju. Rep i cap proteini mogu biti obezbeđeni in trans. Još jedna značajna karakteristika AAV je što je izuzetno stabilan i otporan virus. Lako podnosi uslove koji se koriste za inaktivaciju adenovirusa (56 °C do 65 °C tokom nekoliko sati), što umanjuje značaj čuvanja AAV na hladnom. AAV može čak biti liofilizovan. Konačno, ćelije inficirane sa AAV nisu otporne na superinfekciju.

[0008] Više studija je pokazalo dugotrajnu (> 1,5 godina) ekspresiju proteina u mišićima posredovanu rekombinantnim AAV. Vidite, Clark et al., Hum Gene Ther, 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad Sc. USA, 93: 14082-14087 (1996); i Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996). Vidite, takođe, Chao et al., Mol Ther, 2:619-623 (2000) i Chao et al., Mol Ther, 4:217-222 (2001). Štaviše, pošto su mišići veoma prokrvljeni, transdukcija rekombinantnog AAV je dovela do nastanka transgenskih proizvoda u sistemskom krvotoku nakon intramuskularne injekcije, kao što je opisano u Herzog et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 5804-5809 (1997) i Murphy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94: 13921-13926 (1997). Pored toga, Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002) pokazali su da skeletna mišićna vlakna imaju neophodne ćelijske faktore za pravilnu glikozilaciju, savijanje i sekreciju antitela, što pokazuje da je mišić sposoban za stabilnu ekspresiju izlučenih proteinskih terapeutskih agensa.

[0009] Poboljšano funkcionisanje pacijenata koji boluju od DMD i drugih mišićnih distrofija zahteva obnavljanje gena kao i smanjenje fibroze. Neophodni su postupci za smanjenje fibroze koji mogu da se upare sa postupcima obnavljanja gena radi delotvornijeg lečenja DMD i drugih mišićnih distrofija. miR29 je potencijalni regulatorni gen i idealan kandidat za smanjenje fibroze mišića.

SAŽETAK PRONALASKA

[0010] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje rekombinantni AAVrh74 vektor koji sadrži kontrolni element specifičan za mišiće koji je operativno povezan sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 7.

[0011] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži rekombinantni AAVrh74 vektor iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0012] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje rekombinantni AAVrh74 vektor iz pronalaska ili kompoziciju iz pronalaska za upotrebu u lečenju mišićne distrofije.

[0013] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje rekombinantni AAVrh74 vektor iz pronalaska ili kompoziciju iz pronalaska za upotrebu u ublažavanju ili prevenciji fibroze kod ispitanika koji boluje od mišićne distrofije.

[0014] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje rekombinantni AAVrh74 vektor iz pronalaska ili kompoziciju iz pronalaska za upotrebu u povećanju sile mišića ili mišićne mase kod ispitanika koji boluje od mišićne distrofije.

[0015] U nekim otelotvorenjima, ispitanik boluje od Dišenove mišićne distrofije.

[0016] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje in vitro postupak za proizvodnju funkcionalnog proteina mikro-distrofina koji obuhvata inficiranje ćelije domaćina rekombinantnim AAVrh74 vektorom iz pronalaska i ekspresiju funkcionalnog proteina mikro-distrofina u ćeliji domaćinu.

[0017] Kombinovane terapije i pristupi za ublažavanje i prevenciju fibroze koje koriste vektore za gensku terapiju mogu da isporuče miR-29 radi potiskivanja fibroze zajedno sa mikro-distrofinom radi otklanjanja genskih nedostataka koji su uočeni kod DMD. Kao što je prikazano u primerima 5-7, kombinovano lečenje je dovelo do većeg ublažavanja fibroze, povećanog volumena mišića i povećane sile mišića.

[0018] Na primer, kontrolni element specifičan za mišiće je genski element humanog skeletnog aktina, genski element srčanog aktina, miocit specifičan faktor koji vezuje pojačivač MEF, mišična kreatin kinaza (MCK), tMCK (skraćena MCK), teški lanac miozina (MHC), C5-12 (sintetički promoter), element pojačavača mišje kreatin kinaze, genski element brzotrzajnog troponina C, genski element sporotrzajnog srčanog troponina C, genski element sporotrzajnog troponina I, hipoksijom inducibilni nuklearni faktori, steroidno inducibilni element ili glukokortikoidni element odgovora (GRE).

[0019] Na primer, bilo koji od rAAV vektora iz pronalaska je operativno povezan sa kontrolnim elementom specifičnim za mišiće koji sadrži nukleotidnu sekvencu MCK pojačivača SEQ ID NO: 10 i/ili nukleotidnu sekvencu MCK promotera SEQ ID NO: 11.

[0020] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije (koje se u ovom tekstu ponekad prosto nazivaju „kompozicije“) koje obuhvataju bilo koji od rAAV vektora iz pronalaska.

[0021] Pronalazak takođe obezbeđuje virusne čestice koje obuhvataju bilo koji od rekombinantnih AAV vektora iz pronalaska.

[0022] Na primer, bilo koji od rAAV iz pronalaska može da se primeni na ispitanicima koji boluju od mišićne distrofije kako bi se ublažila fibroza, a naročito ublažava fibrozu u skeletnom mišiću ili u srčanom mišiću ispitanika. Ovi postupci mogu dalje da obuhvataju korak primene rAAV koji eksprimira mikro-distrofin.

[0023] „Fibroza“ se odnosi na prekomerno ili nekontrolisano taloženje komponenata ekstracelularnog matriksa (ECM) i abnormalne procese popravke tkiva nakon povrede skeletnog mišića, srčanog mišića, jetre, pluća, bubrega i pankreasa. Komponente ECM koje se talože uključuju fibronektin i kolagen, npr. kolagen 1, kolagen 2 ili kolagen 3.

[0024] Na primer, bilo koji od rAAV iz pronalaska može da se primeni na ispitanicima koji boluju od mišićne distrofije kako bi se sprečila fibroza, npr. primenjuju se pre nego što je fibroza uočena kod ispitanika. rAAV iz pronalaska se primenjuju na ispitaniku koji boluje od mišićne distrofije kako bi se kod tih ispitanika sprečila nova fibroza. Ovi postupci mogu dalje da obuhvataju korak primene rAAV koji eksprimira mikro-distrofin.

Termini „kombinovana terapija“ i „kombinovano lečenje“ odnose se na primenu rAAV vektora koji eksprimira miR-29 i rAAV vektora koji eksprimira mikro-distrofin.

[0025] Ispitanik može bolovati od mišićne distrofije kao što je DMD, Bekerova mišićna distrofija ili bilo koja druga mišićna distrofija povezana sa distrofinom. Pored toga, ispitanik može bolovati od distrofinopatije.

[0026] Pronalazak obezbeđuje rekombinantne AAV vektore koji obuhvataju nukleotidnu sekvencu koja kodira protein mikro-distrofin. Pronalazak obezbeđuje rAAV koji obuhvata a) kontrolni element specifičan za mišiće koji je operativno povezan sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 7 ili b) nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 9.

[0027] Jedan primer za rAAV koji eksprimira mikro-distrofin iz pronalaska je pAAV.mck.mikro-distrofin koji obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 9 i prikazan je na slici 10 i 11. rAAV vektor obuhvata MCK promoter, sekvencu himernog introna, kodirajuću sekvencu za gen mikro-distrofin, polyA, ampicilinsku rezistenciju i pGEX plazmidni skelet sa pBR322 poreklom ili replikacijom. Rekombinantni AAV vektori iz pronalaska su AAVrh.74.

[0028] Opisani su rAAV vektori koji eksprimiraju mikro-distrofin koji obuhvataju nukleotidnu sekvencu sa najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, ili 89%, obično najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, ili 94% a još uobičajenije 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 7, i koja kodira funkcionalni protein mikro-distrofin.

[0029] Pronalazak obezbeđuje rAAV vektore koji eksprimiraju mikro-distrofin koji obuhvataju nukleotidnu sekvencu koja se u striktnim uslovima hibridizuje u sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 7, ili njoj komplementarne sekvence, i kodira funkcionalni protein mikro-distrofin.

[0030] Termin „striktni“ se koristi da označi uslove za koje se u struci obično smatra da su striktni. Striktnost hibridizacije prvenstveno određuju temperatura, jonska jačina i koncentracija denaturišućih agensa kao što je formamid. Primeri striktnih uslova za hibridizaciju i ispiranje su 0,015 M natrijum hlorid, 0,0015 M natrijum citrat na 65-68 °C ili 0,015 M natrijum hlorid, 0,0015 M natrijum citrat i 50% formamid na 42 °C.

Vidite Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izd., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y.1989). Takođe mogu da se koriste striktniji uslovi (kao što je viša temperatura, manja jonska jačina, veća koncentracija formamida ili drugog denaturišućeg agensa), međutim, to može uticati na stopu hibridizacije. U slučajevima kada je u pitanju hibridizacija dezoksioligonukleotida, dodatni primeri striktnih uslova za hibridizaciju uključuju ispiranje u 6x SSC 0,05% natrijum pirofosfatu na 37 °C (za oligonukleotide od 14 baza), 48 °C (za oligonukleotide od 17 baza), 55 °C (za oligonukleotide od 20 baza) i 60 °C (za oligonukleotide od 23 baze).

[0031] Drugi agensi mogu biti uključeni u pufere za hibridizaciju i ispiranje radi smanjenja nespecifične i/ili pozadinske hibridizacije. Primeri su 0,1% albumin goveđeg seruma, 0,1% polivinil-pirolidon, 0,1% natrijum pirofosfat, 0,1% natrijum dodecilsulfat, NaDodSO4, (SDS), fikol, Dernhatov rastvor, DNK iz sonifikovane sperme lososa (ili druga nekomplementarna DNK), i dekstran sulfat, mada mogu da se koriste i drugi pogodni agensi. Koncentracija i vrste ovih aditiva mogu da se promene bez suštinskog uticaja na striktnost uslova hibridizacije. Eksperimenti vezani za hibridizaciju se obično vrše na pH 6,8-7,4, međutim, u uslovima tipične jonske jačine, stopa hibridizacije skoro da ne zavisi od pH. Vidite Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, poglavlje 4, IRL Press Limited (Oxford, England). Stručnjak za ovu oblast može da prilagodi uslove hibridizacije kako bi uzeo u obzir ove varijable i omogućio da DNK različite srodnosti sekvence grade hibride.

[0032] U još jednom aspektu, rAAV vektori koji eksprimiraju mikro-distrofin obuhvataju kodirajuću sekvencu gena mikro-distrofina koja je operativno povezana sa kontrolnim elementom specifičnim za mišiće. Na primer, kontrolni element specifičan za mišiće je genski element humanog skeletnog aktina, genski element srčanog aktina, miocit specifičan faktor koji vezuje pojačivač MEF, mišična kreatin kinaza (MCK), tMCK (skraćena MCK), teški lanac miozina (MHC), C5-12 (sintetički promoter), element pojačavača mišje kreatin kinaze, genski element brzotrzajnog troponina C, genski element sporotrzajnog srčanog troponina C, genski element sporotrzajnog troponina I, hipoksijom inducibilni nuklearni faktori, steroidno inducibilni element ili glukokortikoidni element odgovora (GRE).

[0033] Pored toga, pronalazak obezbeđuje rAAV vektore koji eksprimiraju mikro-distrofin koji obuhvataju kontrolni element specifičan za mišiće koji obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 11.

[0034] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije (koje se u ovom tekstu ponekad prosto nazivaju „kompozicije“) koje obuhvataju bilo koji od rAAV vektora iz pronalaska.

[0035] Pronalazak takođe obezbeđuje virusne čestice koje obuhvataju bilo koji od rekombinantnih AAV vektora iz pronalaska.

[0036] Pronalazak takođe obezbeđuje in vitro postupke za proizvodnju funkcionalnog proteina mikro-distrofina koji obuhvataju inficiranje ćelije domaćina rekombinantnim AAV vektorom koji eksprimira mikro-distrofin iz pronalaska i ekspresiju funkcionalnog proteina mikro-distrofina u ćeliji domaćinu.

[0037] Ublažavanje fibroze kod ispitanika kome je to potrebno može da uključuje primenu terapeutski delotvorne količine bilo kog rAAV vektora iz pronalaska koji eksprimira mikrodistrofin. Na primer, bilo koji od rAAV iz pronalaska se primenjuje na ispitanicima koji boluju od mišićne distrofije ili distrofinopatije kako bi se ublažila fibroza, a naročito ublažava fibrozu u skeletnom mišiću ili u srčanom mišiću ispitanika.

[0038] Prevencija fibroze kod ispitanika kome je to potrebno može da uključuje primenu terapeutski delotvorne količine bilo kog od rekombinantnih AAV vektora iz pronalaska koji eksprimira mikro-distrofin. Na primer, bilo koji od rAAV iz pronalaska se primenjuje na ispitanicima koji boluju od mišićne distrofije ili distrofinopatije kako bi se sprečila fibroza, npr. rAAV iz pronalaska koji eksprimiraju mikro-distrofin se primenjuju pre nego što je fibroza uočena kod ispitanika. Pored toga, rAAV iz pronalaska koji eksprimiraju mikrodistrofin se primenjuju na ispitaniku koji je pod rizikom od nastanka fibroze, kao što su ispitanici koji boluju od distrofinopatije ili mišićne distrofije, npr. DMD ili Bekerove mišićne distrofije, ili imaju tu dijagnozu. rAAV iz pronalaska se primenjuju na ispitaniku koji boluje od distrofinopatije ili distrofinopatijske mišićne distrofije kako bi se kod tih ispitanika sprečila nova fibroza.

[0039] Termini „kombinovana terapija“ i „kombinovano lečenje“ odnose se na primenu rAAV vektora koji eksprimira miR-29 i rAAV vektora koji eksprimira mikro-distrofin.

[0040] Kada se primenjuje rAAV vektor koji eksprimira miR-29 i rAAV vektor koji eksprimira protein mikro-distrofin, ti rAAV vektori mogu da se primenjuju istovremeno, ili se primenjuju uzastopno gde se rAAV vektor koji eksprimira miR29 primenjuje neposredno pre rAAV koji eksprimira protein mikro-distrofin, ili se primenjuju uzastopno gde se rAAV vektor koji eksprimira miR29 primenjuje neposredno nakon rAAV koji eksprimira protein mikro-distrofin. Alternativno, AAV vektor koji eksprimira protein mikro-distrofin može da se primeni u roku od oko 1-5 sati ili 5-12 sati ili 12 do 15 sati ili 15 sati do 24 sata nakon primene rAAV koji eksprimira miR-29 ili AAV vektor koji eksprimira protein mikrodistrofin može da se primeni u roku od oko 1-5 sati ili 5-12 sati ili 12 do 15 sati ili 15 sati do 24 sata pre primene rAAV koji eksprimira miR-29. Alternativno, AAV vektor koji eksprimira protein mikro-distrofin može da se primeni u roku od oko 1 ili 6 ili 12 sati ili 24 sata nakon primene rAAV koji eksprimira miR-29 ili AAV vektor koji eksprimira protein mikrodistrofin može da se primeni u roku od oko 1 ili 6 ili 12 sati ili 24 sata pre primene rAAV koji eksprimira miR-29.

[0041] Bilo koji od AAV vektora iz pronalaska može da se primeni na pacijentima kojima je dijagnostikovana distrofinopatija ili mišićna distrofija, kao što je DMD ili Bekerova mišićna distrofija, pre nego što je kod ispitanika uočena fibroza ili pre nego što je sila mišića smanjena kod ispitanika ili pre nego što je mišićna masa smanjena kod ispitanika.

[0042] Bilo koji od rAAV iz pronalaska može da se primeni na ispitaniku koji boluje od distrofinopatije ili mišićne distrofije, kao što je DMD ili Bekerova mišićna distrofija, kod koga je već došlo do fibroze, kako bi se sprečila nova fibroza kod ovih ispitanika. Pronalazak takođe obezbeđuje primenu bilo kog od rAAV iz pronalaska na pacijentu koji boluje od mišićne distrofije kod koga je već došlo do smanjenja sile mišića ili je došlo do smanjenja mišićne mase, kako bi se mišići zaštitili od dalje povrede.

[0043] rAAV vektor može, na primer, da se primeni putem intramuskularne injekcije ili intravenske injekcije.

[0044] rAAV vektor ili kompozicija mogu da se primenjuju sistemski. Na primer, rAAV vektor ili kompozicija se primenjuju parenteralno putem injekcije, infuzije ili implantacije.

[0045] U još jednom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata rAAV vektore koji eksprimiraju mikro-distrofin ili koja obuhvata rAAV vektor koji eksprimira miR-29 kao i rAAV vektor koji eksprimira mikro-distrofin radi ublažavanja fibroze kod ispitanika kome je to potrebno. Pored toga, pronalazak obezbeđuje kompozicije koje obuhvataju rAAV vektore koji eksprimiraju mikro-distrofin ili obuhvataju rAAV vektor koji eksprimira miR-29 kao i rAAV vektor koji eksprimira mikro-distrofin radi prevencije fibroze kod pacijenta koji boluje od distrofinopatije ili mišićne distrofije, kao što je DMD ili Bekerova mišićna distrofija.

[0046] Pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije koje obuhvataju rAAV vektore koji eksprimiraju protein mikro-distrofin ili koje obuhvataju rAAV vektor koji eksprimira miR-29 kao i rAAV vektor koji eksprimira protein mikro-distrofin radi povećanja sile mišića i/ili mišićne mase kod ispitanika koji boluje od distrofinopatije ili mišićne distrofije, kao što je DMD ili Bekerova mišićna distrofija.

[0047] U jednom daljem otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje kompozicije koje obuhvataju rAAV vektore koji eksprimiraju protein mikro-distrofin ili koje obuhvataju rAAV vektor koji eksprimira miR-29 kao i rAAV vektor koji eksprimira protein mikro-distrofin za lečenje distrofinopatije ili mišićne distrofije, kao što je DMD ili Bekerova mišićna distrofija.

[0048] Kompozicije iz pronalaska su formulisane za intramuskularnu injekciju ili intravensku injekciju. Kompozicije iz pronalaska su takođe formulisane za sistemsku primenu, kao što je parenteralna primena putem injekcije, infuzije ili implantacije. Pored toga, bilo koja od kompozicija je formulisana za primenu na ispitaniku koji boluje od distrofinopatije ili mišićne distrofije, kao što je DMD, Bekerova mišićna distrofija ili bilo koja druga mišićna distrofija povezana sa distrofinom.

[0049] Pronalazak takođe obezbeđuje primenu bilo kog od rAAV iz pronalaska na pacijentu koji boluje od mišićne distrofije kod koga je već došlo do smanjenja sile mišića ili je došlo do smanjenja mišićne mase kako bi se mišići zaštitili od dalje povrede.

[0050] Kod bilo koje od upotreba iz pronalaska, lek je formulisan za intramuskularnu injekciju. Pored toga, bilo koji od lekova može biti pripremljen za primenu na ispitaniku koji boluje od mišićne distrofije kao što je DMD ili bilo koja druga mišićna distrofija povezana sa distrofinom.

[0051] Pored toga, bilo koji od lekova iz pronalaska može biti kombinovana terapija u kojoj se rAAV vektori koji eksprimiraju miR-29 i rAAV vektori koji eksprimiraju mikro-distrofin primenjuju istovremeno, ili se primenjuju uzastopno gde se rAAV vektor koji eksprimira miR29 primenjuje neposredno pre rAAV koji eksprimira mikro-distrofin, ili se primenjuju uzastopno gde se rAAV vektor koji eksprimira miR29 primenjuje neposredno nakon rAAV koji eksprimira mikro-distrofin. Alternativno, lek obuhvata primenu AAV vektora koji eksprimira mikro-distrofin koji se primenjuje u roku od oko 1-5 sati nakon primene rAAV koji eksprimira miR-29 ili lek obuhvata AAV vektor koji eksprimira mikro-distrofin koji se primenjuje u roku od oko 1-5 sati pre primene rAAV koji eksprimira miR-29.

KRATAK OPIS SLIKA

[0052]

Slika 1 daje šematski prikaz rAAV vektora scAAVCrh.74.CMV.miR29c i nukleotidne sekvence miR-29c u skeletu prirodnog miR-30 i nukleotidne sekvence predviđene strukture ukosnice.

Slika 2A-CD pokazuje da injekcija miR-29c u mišić smanjuje nivo kolagena u celom mišiću i obnavlja ekspresiju miR-29c.

Slika 3A-3C pokazuje da injekcija miR-29c poboljšava apsolutnu silu mišića (panel A) i specifičnu silu mišića (panel B), ali ne pruža zaštitu od oštećenja izazvanog kontrakcijom (panel C).

Slika 4A-4C prikazuje broj mišićnih vlakana koja eksprimiraju mikro-distrofin kako bi se izmerila delotvornost transgene isporuke.

Slika 5A-5C pokazuje da zajedničko isporučivanje miR-29c sa mikro-distrofinom smanjuje ekspresiju kolagena (panel A) i ekspresiju distrofina indukovanu fibrozom.

Slika 6A-6D pokazuje da intramuskularna injekcija miR-29c/mikro-distrofina inhibira ekstracelularni matriks (ECM) kod mdx/utrn<+/->miševa, što je izmereno na osnovu kolagena 1 alfa (panel A), kolagena 3 alfa (panel B), fibronektina (panel C) i TGF-β (panel D).

Slika 7A-7C pokazuje da je intramuskularna injekcija miR-29c povećala apsolutnu silu (panel A), normalizovanu specifičnu silu (panel B) i obezbedila zaštitu od oštećenja mišića izazvanog kontrakcijom (panel C).

Slika 8 pokazuje da kombinacija miR-29c/µ-dys povećava volumen mišića kod miševa koji su tretirani u uzrastu od 3 meseca. Prikazani su isečci trbušastog mišića lista tretiranih i netretiranih mdx/utrn<+/->miševa obojeni picrosirius crvenom bojom kako bi se video kolagen. Fibrotične oblasti su ružičaste boje, dok je netaknuti mišić zelen. Na makroskopskom nivou, kombinacija miR-29c/µ-dys smanjuje fibrozu i povećava ukupnu površinu poprečnog preseka.

Slika 9A-F pokazuje da lečenje sa miR-29c koji se isporučuje zajedno sa mikrodistrofinom povećava hipertrofiju i hiperplaziju mišića, što se može videti na osnovu povećanja ukupne težine trbušastog mišića listanakoin ubrizgavanja u poređenju sa samostalnim ubrizgavanjem bilo koje od komponenata (panel A), povećanja prosečne veličine vlakana (panel B), povećanja površine poprečnog preseka mišića (panel D; bez injekcije: 24,6 u odnosu na miR-29c: 26,3 u odnosu na mikro-dis: 26,6 u odnosu na mikro-dis/miR-29c: 33,1) i povećanja broja mišićnih vlakana (panel E), ali nije bilo uticaja na broj mišićnih vlakana po jedinici površine (panel F). Panel C poredi mdx/utrn<+/->kontrolne miševe sa mdx/utrn<+/->miševima koji su lečeni sa miR-29c/µdys, prosečni prečnik je povećan sa 25,96 na 30,97 µm

Slika 10A-G pokazuje da je rano lečenje kombinovanom terapijom koja se sastoji od AAV.miR-29c/mikro-distrofina delotvornije za smanjenje fibroze i ekspresije ECM. Panel A pokazuje bojenje picrosirius crvenom divljeg tipa, bez injekcije, AAV.miR-29c, AAV.mikro-distrofina i AAV.miR-29c/AAV.mikro-distrofina miševa kojima je injekcija data kada su bili stari 4-5 nedelja izmereno dvanaest nedelja nakon injekcije. Panel B daje kvantifikaciju bojenja picrosirius crvenom bojom koja pokazuje da je kod mišića lečenih kombinovanom terapijom došlo do 51,1% smanjenja kolagena u poređenju sa trbušastim mišićem lista bez injekcije. Panel C pokazuje da qRT-PCR potvrđuje porast nivoa transkripta miR-29c u lečenim kohortama. Polukvantitativna qRT-PCR pokazuje značajno smanjenje nivoa kolagena I i III (paneli d, e), fbn (panel f) i TGF-β1 (panel g) kod miševa koji su lečeni AAV.miR-29c/AAV.mikrodistrofinom u poređenju sa kontralateralnim udom i svakom od pojedinačnih terapija Interval greške. SEM za n=5 (scAAVrh.74.CMV.miR-29c), n=5 (scAAVrh.74.CMV.miR-29c/ssAAVrh.74.MCK.mikro-distrofin), n=6 (ssAAVrh.74.MCK.mikro-distrofin), n=9(mdx/utrn<+/->miševi).1-smerna ANOVA (*p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001)

Slika 11 pokazuje da rana kombinovana terapija obnavlja silu i štiti od oštećenja izazvanog kontrakcijama. Merenje apsolutne (panel A) i normalizovane specifične sile (panel B) nakon tetaničke kontrakcije u sva tri trbušasta mišića lista u koja je ubrizgana terapija bilo je značajno povećano u poređenju sa netretiranim mišićem mdx/utrn<+/->miševa (panel C). Mišići su zatim testirani na gubitak sile nakon ponovljenih ekscentričnih kontrakcija. Samo je kod miševa koji su lečeni kombinacijom miR-29c/mikro-distrofin i samo mikro-distrofinom uočena zaštita od gubitka sile u poređenju sa mišićima nelečenih mdx/utrn<+\->miševa (plava boja).

Dvosmerna analiza varijanse pokazuje značaj na krivama propadanja Intervali greške SEM za n=5 (rAAVrh.74.CMV.miR-29c), n=6 (rAAVrh.74.CMV.miR-29c/rAAVrh.74.MCK.mikro-distrofin), n=5 (rAAVrh.74.MCK.mikro-distrofin), n=15 (mdx/utrn+/- miševi). 1-smerna ANOVA (*p<0,05,**p<0,01, *** p<0,001, ****p<0,0001).

Slika 12 pokazuje da lečenje kombinacijom miR-29c/mikro-distrofin povećava volumen mišića kod miševa koji su tretirani u uzrastu od 1 meseca. Trbušasti mišići lista tretiranih i netretiranih mdx/utrn<+/->miševa su isečeni i obojeni picrosirius crvenom bojom kako bi se video kolagen. Fibrotične oblasti su ružičaste boje, dok je netaknuti mišić zelen. Na makroskopskom nivou, kombinacija miR-29c/mikrodistrofin smanjuje fibrozu i povećava ukupnu površinu poprečnog preseka.

Slika 13A-G pokazuje da je rano lečenje (u uzrastu 4-5 nedelja) kombinovanom terapijom koja se sastoji od AAV.miR-29c/mikro-distrofina delotvornije za smanjenje fibroze i ekspresije ECM. Panel A pokazuje bojenje picrosirius crvenom bez injekcije i AAV.MCK.miR-29c/AAV.MCK.mikro-distrofina miševa kojima je injekcija data kada su bili stari 4-5 nedelja izmereno dvanaest nedelja nakon injekcije. Prvobitno uvećanje, x20 panel B daje kvantifikaciju bojenja picrosirius crvenom koje pokazuje da je kod mišića lečenog kombinovanom terapijom došlo do smanjenja kolagena od 50,9% u poređenju sa nelečenim trbušastim mišićem lista. Panel C daje qRT-PCR koji potvrđuje porast nivoa transkripta miR-29c u lečenoj kohorti. Polukvantitativna qRT-PCR pokazuje značajno smanjenje nivoa kolagena 1A (Col1A; panel D) i kolagena 3A (Col3A; panel E), fibronektina (Fbn; panel F) i Tgfβ1 (panel G) u mišiću lečenom sa AAV.MCK.miR-29c/AAV.mikro-distrofinom u poređenju sa terapijama kontralateralnog uda. (*p<0,05,****p<0,0001).

Slika 14A-G pokazuje da je kasno lečenje (lečenje u uzrastu 12 nedelja) kombinovanom terapijom koja se sastoji od AAV.miR-29c/mikro-distrofina delotvorno za smanjenje fibroze i ekspresije ECM. Panel A daje bojenje picrosirius crvenom nelečenih miševa, miševa lečenih sa AAV.MCK.miR-29c i AAV.MCK.miR-29c/AAV.mikro-distrofinom dvanaest nedelja nakon injekcije. Prvobitno uvećanje, x20. Panel B daje kvantifikaciju bojenja picrosirius crvenom bojom koja pokazuje da je kod mišića lečenih kombinovanom terapijom došlo do 30,3% smanjenja kolagena u poređenju sa trbušastim mišićem lista bez lečenja. Panel C daje qRT-PCR koji potvrđuje porast nivoa transkripta miR-29c u lečenim kohortama. Polukvantitativna qRT-PCR pokazuje značajno smanjenje nivoa kolagena 1A (Col1A; panel D) i kolagena 3A (Col3A; panel E), fibronektina (Fbn; panel F) i Tgfβ1 (panel G) u mišiću lečenom sa AAV.miR-29c/AAV.mikro-distrofinom u poređenju sa kontralateralnim udom. Jednosmerna ANOVA. Svi podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM. (** p<0,01, ****p<0,0001).

Slika 15A-15C pokazuje da je rana kombinovana terapija (lečenje u uzrastu 4-5 nedelja) obnovila silu i štitila od oštećenja izazvanog kontrakcijama. Merenje apsolutne (panel A) i normalizovane specifične sile (panel B) nakon tetaničke kontrakcije trbušastih mišića lista u koje je ubrizgan MCK.miR-29c/mikro-distrofin bilo je značajno povećano u poređenju sa netretiranim mišićem mdx/utrn<+/->miševa. (C) Mišići su zatim testirani na gubitak sile nakon ponovljenih ekscentričnih kontrakcija. Samo je kod miševa koji su lečeni kombinacijom miR-29c/mikrodistrofin i samo mikro-distrofinom uočena zaštita od gubitka sile u poređenju sa mišićima nelečenih mdx/utrn<+\->miševa (crvena boja). Dvosmerna ANOVA. Svi podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM (****p<0,0001).

Slika 16A-16C pokazuje da je kasna kombinovana terapija obnavljala silu i štitila od oštećenja izazvanog kontrakcijama. Merenje apsolutne (panel A) i normalizovane specifične sile (panel B) nakon tetaničke kontrakcije trbušastih mišića lista u koje je ubrizgan rAAV.MCK.miR-29c i rAAV koji eksprimira mikro-distrofin bilo je značajno povećano u poređenju sa netretiranim mišićem mdx/utrn<+/->miševa. U panelu C, mišići su zatim testirani na gubitak sile nakon ponovljenih ekscentričnih kontrakcija. Kod miševa koji su lečeni kombinacijom rAAV.MCK.miR-29c/rAAV koji eksprimira mikro-distrofin uočena je zaštita od gubitka sile u poređenju sa mišićima nelečenih mdx/utrn<+\->miševa (crvena boja). Dvosmerna ANOVA. Svi podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM (**p<0,01, ****p<0,0001).

Slika 17A-17D pokazuje da kombinovano lečenje povećava hipertrofiju mišića 3 meseca nakon injekcije. Panel A pokazuje da rAAV. MCK.miR-29c isporučen zajedno sa rAAV koji eksprimira mikro-distrofin nije uspeo da poveća ukupnu masu trbušastog mišića lista u koji se vrši ubrizgavanje. Panel B pokazuje da je kombinovano lečenje sa rAAV.MCK.miR-29c/rAAV koji eksprimira mikro-distrofin dovelo do povećanja prosečne veličine vlakana. Kada se mdx/utrn<+/->kontrolni miševi porede sa mdx/utrn<+/->miševima koji su lečeni sa miR-29c/mikro-distrofinom, prosečni prečnik je povećan sa 28,96 na 36,03 µm. Panel C pokazuje da je zajednička isporuka dovela do pomaka ka raspodeli veličine vlakana koja se javlja kod divljeg tipa. Panel D je pokazao da je broj mišićnih vlakana po mm<2>kod kombinovanog lečenja sa miR-29c/mikro-distrofinom bio značajno manji nego kod nelečenih miševa i miševa divljeg tipa (***p<0,01, ****p<0,0001).

Slika 18A-18B daje sekvencu nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 1 pAAV.CMV.Mir29C) reprezentativnog rAAV vektora koji obuhvata zreli vodeći lanac miR-29c (nukleotidi 1257-1284) i prirodni mi-30 skelet (nukleotidi 1088-1375). Taj konstrukt takođe obuhvata CMV promoter (nukleotidi 120-526), dva EF1a introna na nukleotidima 927-1087 i 1380-1854 i polA na nukleotidima 1896-2091.

Slika 19 daje šematski prikaz rAAV vektora pAAV.MCK.mikro-distrofina.

Slika 20A-D daje sekvencu nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 9; pAAV.MCK.mikrodistrofin) reprezentativnog rAAV vektora koji eksprimira mikro-distrofin.

Slika 21A-D daje nukleotidnu sekvencu humanog mikro-distrofina (SEQ ID NO: 7) Slika 22 daje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 12 pAAV.MCK.Mir29C) reprezentativnog rAAV vektora koji obuhvata zreli vodeći lanac miR-29c (nukleotidi 1487-1512) i prirodni mi-30 skelet (nukleotidi 1088-1375). Taj konstrukt takođe obuhvata MCK pojačivač (nukleotidi 190-395), MCK promoter (nukleotidi 396-753), dva EF1a introna na nukleotidima 1155-1315 i 1609-2083 i polA na nukleotidima 2094-2148.

DETALJAN OPIS

[0053] Biopsije mišića uzete u najranijem uzrastu u kojem se dijagnostikuje MDM otkrivaju izraženu proliferaciju vezivnog tkiva. Fibroza mišića je štetna na više načina. Ona smanjuje normalan prolazak endomizijalnih hranljivih materija kroz barijere od vezivnih tkiva, smanjuje protok krvi i mišić lišava hranljivih gradivnih materija dobijenih iz krvi, i funkcionalno doprinosi ranom gubitku kretanja usled kontrakture udova. Tokom vremena se množe izazovi sa kojima se terapija suočava usled izražene fibroze u mišićima. Ovo može da se uoči na biopsijama mišića koje porede proliferaciju vezivnog tkiva u uzastopnim terminima. Ovaj proces zatim nastavlja da se pogoršava što dovodi do gubitka kretanja i kontrole, naročito kod pacijenata kojima su potrebna kolica.

[0054] Bez paralelnog pristupa za smanjenje fibroze malo je verovatno da se ikada u potpunosti mogu ostvariti koristi od preskakanja egzona, očitavanja zaustavnog kodona ili genskih terapija. Čak će i strategije malih molekula ili zamene proteina verovatno doživeti neuspeh bez pristupa koji bi smanjio fibrozu mišića. Prethodno istraživanje kod ostarelih mdx miševa sa postojećom fibrozom koji su lečeni AAV-mikro-distrofinom pokazalo je da ne možemo postići potpuno obnavljanje funkcije (Human molecular genetics 22, 4929-4937 (2013)). Takođe je poznato da je progresija DMD kardiomiopatije praćena ožiljcima i fibrozom ventrikularnog zida. Isporučivanje mikro-RNK je naročito inovativno zbog nepostojanja imunskih barijera i relativne lakoće isporučivanja. MikroRNK su male (~200 bp), te stoga mogu da se upakuju u AAV zajedno sa terapeutskom kasetom radi otklanjanja ili zaobilaženja genetskog defekta.

[0055] Kao što se ovde koristi, termin „AAV“ je standardna skraćenica za adeno-asocirani virus. Adeno-asocirani virus je parvovirus sa jednolančanom DNK koji raste samo u ćelijama u kojima su određene funkcije obezbeđene putem koinficirajućeg pomoćnog virusa. Do danas je okarakterisano trinaest serotipova AAV. Opšte informacije i pregled AAV možete pronaći, na primer, u Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, sveska 1, str.169-228, i Berns, 1990, Virology, str.1743-1764, Raven Press, (New York). Međutim, u potpunosti je očekivano da ovi isti principi mogu da se primene na dodatne serotipove AAV pošto je dobro poznato da su različiti serotipovi veoma blisko povezani, kako strukturno tako i funkcionalno, čak i na genetskom nivou. (Vidite, na primer, Blacklowe, 1988, str. 165-174 Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; i Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). Na primer, svi serotipovi AAV pokazuju veoma slična svojstva replikacije posredovane homolognim rep genima, i svi imaju tri povezana kapsidna proteina kao što su oni koji su eksprimirani u AAV2. Na taj stepen srodnosti dalje ukazuje analiza heterodupleksa koja otkriva zastupljenu unakrsnu hibridizaciju između serotipova duž celog genoma; i prisustvo analognih samokomplementarno vezujućih segmenata na terminusima koji odgovaraju „sekvencama invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR)“. Slični obrasci infektivnosti takođe sugerišu da su funkcije replikacije u svakom serotipu pod sličnom regulatornom kontrolom.

[0056] „AAV vektor“, kao što se ovde koristi, odnosi se na vektor koji obuhvata jedan ili više polinukleotida od interesa (ili transgena) oko kojih se nalaze sekvence terminalnog ponavljanja AAV (ITR). Takvi AAV vektori mogu da se repliciraju i upakuju u infektivne virusne čestice kada su prisutni u ćeliji domaćinu koja je transficirana vektorom koji kodira i eksprimira rep i cap genske proizvode.

[0057] „Virion AAV“ ili „virusna čestica AAV“ ili „čestica AAV vektora“ odnosi se na virusnu česticu koja je sačinjena od najmanje jednog AAV kapsidnog proteina i enkapsidovanog polinukleotidnog AAV vektora. Ako čestica obuhvata heterologni polinukleotid (tj. polinukleotid koji nije genom AAV divljeg tipa kao što je transgen koji treba da se isporuči u ćeliju sisara), ona se obično naziva „čestica AAV vektora“ ili prosto „AAV vektor“. Tako, proizvodnja čestice AAV vektora nužno uključuje proizvodnju AAV vektora, pošto je takav vektor sadržan u čestici AAV vektora.

AAV

[0058] Genomi rekombinantnog AAV iz pronalaska obuhvataju molekul nukleinske kiseline iz pronalaska i jedan ili više AAV ITR koji se nalaze oko molekula nukleinske kiseline. DNK AAV u genomima rAAV može biti od bilo kog serotipa AAV za koji može da se dobije rekombinantni virus, uključujući, bez ograničenja, AAV serotipove AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 i AAV-13. Proizvodnja pseudotipovanog rAAV otkrivena je, na primer, u WO 01/83692. Takođe se razmatraju druge vrste varijanti rAAV, na primer rAAV sa mutacijama kapsida. Vidite, na primer, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014). Kao što je prethodno navedeno u odeljku Osnova pronalaska, nukleotidne sekvence genoma različitih serotipova AAV su poznate u struci. AAV1, AAV6, AAV8 ili AAVrh.74 mogu da se koriste za promovisanje ekspresije specifične za skeletne mišiće.

[0059] DNK plazmidi mogu da obuhvataju genome rAAV iz pronalaska. Ovi DNK plazmidi se prenose u ćelije koje mogu da se inficiraju zajedno sa pomoćnim virusom AAV (npr. adenovirus, adenovirus sa izbacivanjem E1 ili herpes virus) radi sklapanja genoma rAAV u infektivne virusne čestice. Tehnike za proizvodnju čestica rAAV, u kojima su genom AAV koji treba da se upakuje, rep i cap geni i funkcije pomoćnog virusa obezbeđeni ćeliji, uobičajene su za struku. Za proizvodnju rAAV neophodno je da sledeće komponente budu prisutne u jednoj ćeliji (ovde se naziva ćelija za pakovanje): genom rAAV, rep i cap geni AAV odvojeni od genoma rAAV (tj. ne nalaze se u njemu), i funkcije pomoćnog virusa. AAV rep i cap geni mogu biti od bilo kog serotipa AAV za koji može da se dobije rekombinantni virus i mogu biti poreklom od različitog serotipa AAV u odnosu na ITR genoma rAAV, uključujući, bez ograničenja, AAV serotipove AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAVrh.74, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12 i AAV-13. Proizvodnja pseudotipovanog rAAV otkrivena je, na primer, u WO 01/83692.

[0060] Postupak za proizvodnju ćelije za pakovanje obuhvata kreiranje ćelijske linije koja stabilno eksprimira sve neophodne komponente za proizvodnju čestice AAV. Na primer, plazmid (ili više plazmida) koji sadrži genom rAAV koji nema rep i cap gene AAV, rep i cap geni AAV odvojeni od genoma rAAV i selektabilni marker, kao što je gen koji daje rezistenciju na neomicin, integrisani su u genom ćelije. Genomi AAV su uvedeni u bakterijske plazmide pomoću postupaka kao što su GC rastezanje (Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081), dodavanje sintetičkih linkera koji obuhvataju mesta raskidanja restrikcione endonukleaze (Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73) ili putem neposredne ligacije tupog kraja (Senapathy i Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666). Ćelijska linija za pakovanje se zatim inficira pomoćnim virusom kao što je adenovirus.

Prednosti ovog postupka su što su ćelije selektabilne i pogodne su za proizvodnju rAAV u velikom obimu. Drugi primeri odgovarajućih postupaka koriste adenovirus ili bakulovirus umesto plazmida za uvođenje genoma rAAV i/ili rep i cap gena u ćelije za pakovanje.

[0061] Pregled opštih principa za proizvodnju rAAV je dat, na primer, u Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; i Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129). Različiti pristupi su opisani u Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol.5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); i Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); U.S.

patentu br.5,173,414; WO 95/13365 i odgovarajućem U.S. patentu br.5,658.776 ; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO

97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; U.S. patentu br.5,786,211; U.S. patentu br.5,871,982; i U.S. patentu br.

6,258,595.

[0062] Opisane su ćelije za pakovanje koje proizvode infektivni rAAV. U jednom otelotvorenju, ćelije za pakovanje mogu biti stabilno transformisane ćelije kancera kao što su HeLa ćelije, 293 ćelije i PerC.6 ćelije (srodna 293 linija). U još jednom otelotvorenju, ćelije za pakovanje su ćelije koje nisu transformisane ćelije kancera, kao što su 293 ćelije sa malim presejavanjem (ćelije bubrega humanog fetusa transformisane sa E1 adenovirusa), MRC-5 ćelije (fibroblasti humanog fetusa), WI-38 ćelije (fibroblasti humanog fetusa), Vero ćelije (ćelije bubrega majmuna) i FRhL-2 ćelije (ćelije pluća rezus majmuna).

[0063] Rekombinantni AAV (tj. infektivne enkapsidirane čestice rAAV) iz pronalaska obuhvata genom rAAV. U reprezentativnim otelotvorenjima, genomi oba rAAV nemaju DNK rep i cap AAV, to jest, ne postoji DNK rep ili cap AAV između ITR genoma. Primeri za rAAV koji mogu biti konstruisani tako da obuhvataju molekule nukleinske kiseline iz pronalaska su prikazani u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2012/047999 (WO 2013/016352).

[0064] rAAV može da se prečisti koristeći postupke koji su uobičajeni u struci, kao što je hromatografija na koloni ili cezijum hloridni gradijenti. Postupci za prečišćavanje rAAV vektora od pomoćnog virusa su poznati u struci i uključuju postupke koji su otkriveni, na primer, u Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp i Clark, Methods Mol. Med., 69427-443 (2002); U.S. patentu br.6,566,118 i WO 98/09657.

[0065] U još jednom otelotvorenju, pronalazak razmatra kompozicije koje obuhvataju rAAV iz predmetnog pronalaska. Kompozicije iz pronalaska obuhvataju rAAV i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kompozicije takođe mogu da obuhvataju druge sastojke kao što su razblaživači i adjuvansi. Prihvatljivi nosači, razblaživači i adjuvansi su netoksični za primaoce i poželjno su inertni u dozama i koncentracijama koje se koriste, i uključuju pufere kao što su fosfatna, citratna ili druge organske kiseline; antioksidanse kao što je askorbinska kiselina; polipeptide male molekulske mase; proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što je glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljovodonike koji uključuju glukozu, manozu ili dekstrine; helatore kao što je EDTA; šećerne alkohole kao što su manitol ili sorbitol; kontrajone koji grade soli kao što je natrijum; i/ili nejonske surfaktante kao što su Tween, pluronici ili polietilen glikol (PEG).

[0066] Titri rAAV koji se primenjuju u ovde opisanim postupcima će varirati u zavisnosti, na primer, od konkretnog rAAV, režima primene, cilja lečenja, pojedinca i vrste ćelija koje se ciljaju, i mogu da se odrede koristeći postupke koji su uobičajeni u struci. Titri rAAV mogu biti u rasponu od oko 1×10<6>, oko 1×10<7>, oko 1×10<8>, oko 1×10<9>, oko 1×10<10>, oko 1×10<11>, oko 1×10<12>, oko 1×10<13>do oko 1×10<14>ili više čestica otpornih na DNazu (DRP) po ml. Doze takođe mogu da se izraze u jedinicama virusnih genoma (vg).

[0067] Opisani su postupci transdukcije ciljne ćelije sa rAAV, in vivo ili in vitro. In vivo postupci obuhvataju korak primene delotvorne doze, ili više delotvornih doza, kompozicije koja obuhvata rAAV iz pronalaska na životinji (uključujući čoveka) kojoj je to potrebno. Ako se doza primenjuje pre javljanja poremećaja/bolesti, primena je profilaktička. Ako se doza primenjuje nakon javljanja poremećaja/bolesti, primena je terapeutska. U otelotvorenjima pronalaska, delotvorna doza je doza koja ublažava (otklanja ili smanjuje) najmanje jedan simptom povezan sa poremećajem/bolešću koji se leče, koja usporava ili sprečava progresiju poremećaja/bolesti, koja usporava ili sprečava progresiju poremećaja/bolesti, koja smanjuje opseg bolesti, koja dovodi do remisije (delimične ili potpune) bolesti, i/ili koja produžava preživljavanje. Jedan primer bolesti čija prevencija ili lečenje se razmatraju putem postupaka iz pronalaska je FSHD.

[0068] Ovaj pronalazak takođe razmatra kombinovano lečenje. Kombinacija, kao što se ovde koristi, obuhvata istovremeno lečenje kao i sekvencijalna lečenja. Naročito su razmatrane kombinacije postupaka iz pronalaska sa standardnim medicinskim lečenjima (npr. kortikosteroidima), kao i kombinacije sa novim terapijama.

[0069] Primena delotvorne doze kompozicija se može vršiti uobičajenim postupcima iz struke, uključujući, bez ograničenja, intramuskularno, parenteralno, intravenski, oralno, bukalno, nazalno, pulmonarno, intrakranijalno, intraosealno, intraokularno, rektalno ili vaginalno. Način(e) primene i serotip(ove) komponenata AAV koje čine rAAV (naročito, ITR AAV i kapsidni protein) iz pronalaska stručnjaci za ovu oblast mogu izabrati i/ili uskladiti uzimajući u obzir infekciju i/ili bolest koja se leči i ciljne ćelije/tkiva koje treba da eksprimiraju miRNK miR-29 i/ili mikro-distrofin.

[0070] Pronalazak predviđa lokalnu primenu i sistemsku primenu delotvorne doze rAAV i kompozicija iz pronalaska uključujući kombinovanu terapiju iz pronalaska. Na primer, sistemska primena je primena u krvotok tako da utiče na celo telo. Sistemska primena uključuje enteralnu primenu kao što je apsorpcija kroz gastrointestinalni trakt i parenteralnu primenu putem injekcije, infuzije ili implantacije.

[0071] Konkretno, sama primena rAAV iz predmetnog pronalaska može da se postigne koristeći bilo koji fizički postupak koji će preneti rekombinantni vektor rAAV u ciljno tkivo životinje. Primena prema pronalasku uključuje, bez ograničenja, injekciju u mišić, krvotok i/ili neposredno u jetru. Pokazalo se da je prosta ponovna suspenzija rAAV u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom dovoljna da se dobije vehikulum koji je koristan za ekspresiju u mišićnom tkivu, i nema poznatih ograničenja u pogledu nosača ili drugih komponenata koje mogu da se primenjuju zajedno sa rAAV (mada kompozicije koje razgrađuju DNK treba izbegavati u skladu sa uobičajenom primenom rAAV). Kapsidni proteini rAAV mogu biti modifikovani tako da rAAV bude usmeren na određeno tkivo od interesa kao što je mišić. Vidite, na primer, WO 02/053703. Farmaceutske kompozicije mogu da se primene kao injektabilni rastvori ili kao topikalne formulacije koje se isporučuju u mišiće putem transdermalnog transporta. Prethodno su razvijene brojne formulacije za intramuskularnu injekciju i transdermalni transport i one mogu da se koriste za praktikovanje pronalaska. rAAV mogu da se koriste sa bilo kojim farmaceutski prihvatljivim nosačem radi lakše primene i rukovanja.

[0072] Doza rAAV koji se primenjuju u ovde otkrivenim postupcima će varirati u zavisnosti, na primer, od konkretnog rAAV, režima primene, cilja lečenja, pojedinca i vrste ćelija koje se ciljaju, i može da se odredi koristeći postupke koji su uobičajeni u struci. Titri svakog rAAV koji se primenjuje mogu biti u rasponu od oko 1x106, oko 1x107, oko 1x108, oko 1x109, oko 1x1010, oko 1x1011, oko 1x1012, oko 1x1013, oko 1x1014, ili oko 1x1015 ili više čestica otpornih na DNazu (DRP) po ml. Doze takođe mogu da se izraze u jedinicama virusnih genoma (vg) (tj.1×10<7>vg, 1×10<8>vg, 1×10<9>vg, 1×10<10>vg, 1×10<11>vg, 1×10<12>vg, 1×10<13>vg, 1×10<14>vg, 1×10<15>). Doze takođe mogu da se izraze u jedinicama virusnih genoma (vg) po kilogramu (kg) telesne težine (tj.1×10<10>vg/kg, 1×10<11>vg/kg, 1×10<12>vg/kg, 1×10<13>vg/kg, 1×10<14>vg/kg, 1×10<15>vg/kg). Postupci za titrisanje AAV su opisani u Clark et al., Hum. Gene Ther., 10: 1031-1039 (1999).

[0073] Konkretno, sama primena rAAV iz predmetnog pronalaska može da se postigne koristeći bilo koji fizički postupak koji će preneti rekombinantni vektor rAAV u ciljno tkivo životinje. Primena prema pronalasku uključuje, bez ograničenja, injekciju u mišić, krvotok i/ili neposredno u jetru. Pokazalo se da je prosta ponovna suspenzija rAAV u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom dovoljna da se dobije vehikulum koji je koristan za ekspresiju u mišićnom tkivu, i nema poznatih ograničenja u pogledu nosača ili drugih komponenata koje mogu da se primenjuju zajedno sa rAAV (mada kompozicije koje razgrađuju DNK treba izbegavati u skladu sa uobičajenom primenom rAAV). Kapsidni proteini rAAV mogu biti modifikovani tako da rAAV bude usmeren na određeno tkivo od interesa kao što je mišić. Vidite, na primer, WO 02/053703. Farmaceutske kompozicije mogu da se primene kao injektabilni rastvori ili kao topikalne formulacije koje se isporučuju u mišiće putem transdermalnog transporta. Prethodno su razvijene brojne formulacije za intramuskularnu injekciju i transdermalni transport i one mogu da se koriste za praktikovanje pronalaska. rAAV mogu da se koriste sa bilo kojim farmaceutski prihvatljivim nosačem radi lakše primene i rukovanja.

[0074] Za potrebe intramuskularne injekcije mogu da se koriste rastvori u adjuvansu kao što je ulje susama ili kikirikija ili u vodenom propilen glikolu, kao i sterilni vodeni rastvori. Takvi vodeni rastvori po želji mogu biti puferovani, a tečni razblaživač prvo učinjen izotoničnim pomoću fiziološkog rastvora ili glukoze. Rastvori rAAV u obliku slobodne kiseline (DNK sadrži kisele fosfatne grupe) ili farmakološki prihvatljive soli mogu da se pripreme u vodi koja je odgovarajuće pomešana sa surfaktantom kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzija rAAV takođe može da se pripremi u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i smešama prethodnog i u uljima. U uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans kako bi se sprečio rast mikroorganizama. S tim u vezi, svi sterilni vodeni medijumi koji se koriste lako mogu da se dobiju standardnim tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima za ovu oblast.

[0075] Farmaceutski nosači, razblaživači ili ekscipijensi pogodni za injektabilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporalnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima dati oblik mora biti sterilan i mora biti tečan u toj meri da postoji laka mogućnost primene putem šprica. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti zaštićen od kontaminirajućeg delovanja mikroorganizama kao što su bakterije i gljive. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol i slično), njihove odgovarajuće smeše i biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost može da se očuva, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem odgovarajuće veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može da se postigne različitim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer, parabenima, hlorbutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U brojnim slučajevima će biti poželjno da se uključe izotonični agensi, na primer, šećeri ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može da se ostvari upotrebom agensa koji odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0076] Sterilni injektabilni rastvori se pripremaju inkorporacijom rAAV u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa raznim drugim sastojcima koji su prethodno navedeni, po potrebi, nakon čega sledi sterilna filtracija. Disperzije se obično pripremaju inkorporacijom sterilisanog aktivnog sastojka u sterilni vehikulum koji sadrži bazni medijum za disperziju i druge potrebne sastojke sa prethodno navedenog spiska. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupci pripreme su tehnika vakuumskog sušenja i liofilizacije koja daje prašak aktivnog sastojka i bilo koji dodatni željeni sastojak iz njihovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0077] Transdukcija sa rAAV takođe može da se obavi in vitro. U jednom otelotvorenju, željene ciljne mišićne ćelije su uklonjene iz ispitanika, transdukovane sa rAAV i ponovo uvedene u ispitanika. Alternativno, mogu da se koriste singene ili ksenogene mišićne ćelije gde te ćelije neće izazvati neodgovarajući imunski odgovor kod ispitanika.

[0078] U struci su poznati odgovarajući postupci za transdukciju i ponovno uvođenje transdukovanih ćelija u ispitanika. U jednom otelotvorenju, ćelije mogu da se transdukuju in vitro kombinovanjem rAAV sa mišićnim ćelijama, npr. u odgovarajućim medijumima, i pretraživanjem ćelija koje imaju DNK od interesa koristeći konvencionalne tehnike kao što je sadern blot i/ili PCR, ili koristeći selektabilne markere. Transdukovane ćelije zatim mogu da se formulišu u farmaceutske kompozicije, a te kompozicije uvedu u ispitanika koristeći različite tehnike, na primer, intramuskularnom, intravenskom, supkutanom i intraperitonealnom injekcijom, ili injekcijom u glatki i srčani mišić, koristeći, npr. kateter.

[0079] Transdukcija ćelija sa rAAV iz pronalaska dovodi do produžene ekspresije mikrodistrofina. Opisani su postupci za primenu/isporučivanje rAAV koji eksprimiraju miR-29 ili mikro-distrofin na životinji, poželjno ljudskom biću. Ti postupci uključuju transdukciju tkiva (uključujući, bez ograničenja, tkiva kao što su mišići, organe kao što su jetra i mozak, i žlezde kao što su pljuvačne žlezde) sa jednim ili više rAAV iz predmetnog pronalaska. Transdukcija može da se obavi pomoću genskih kaseta koje obuhvataju kontrolne elemente specifične za tkivo. Na primer, jedno otelotvorenje obezbeđuje postupke za transdukciju mišićnih ćelija i mišićnih tkiva koja je usmerena kontrolnim elementima specifičnim za tkivo, uključujući, bez ograničenja, one dobijene iz familije gena aktina i miozina, kao što je familija gena myoD [vidite Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)], miocit specifičan faktor koji vezuje pojačivač MEF-2 [Cserjesi i Olson, Mol Cell Biol 11: 4854-4862 (1991)], kontrolne elemente dobijene od genskog elementa humanog skeletnog aktina [Muscat et al., Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)], genske elemente srčanog aktina, elemente sekvence mišićne kreatin kinaze [vidite Johnson et al., Mol Cell Biol, 9:3393-3399 (1989)] i element pojačavača mišje kreatin kinaze (mCK), kontrolne elemente dobijene od gena skeletnog brzotrzajućeg troponina C, gena sporotrzajućeg srčanog troponina C i gena sporotrzajnog troponina I: hipoksijom inducibilne nuklearne faktore (Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)), steroidno inducibilne elemente i promotere uključujući glukokortikoidni element odgovora (GRE) (vidite Mader i White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607 (1993)), i druge kontrolne elemente.

[0080] Mišićno tkivo predstavlja atraktivnu metu za in vivo isporučivanje DNK, pošto nije vitalan organ i lako mu je pristupiti. Opisana je produžena ekspresija miRNK iz transdukovanih mišićnih vlakana.

[0081] Kada se kaže „mišićna ćelija“ ili „mišićno tkivo“ misli se na ćeliju ili grupu ćelija dobijenih od mišića bilo kog tipa (na primer, skeletnog mišića i glatkog mišića, npr. iz digestivnog trakta, mokraćne bešike, krvnih sudova ili srčanog tkiva). Takve mišićne ćelije mogu biti diferencirane ili nediferencirane, kao što su mioblasti, miociti, miotubule, kardiomiociti i kardiomioblasti.

[0082] Termin „transdukcija“ se koristi da se označi primena/isporučivanje miiR29 vodećeg lanca ili kodirajućeg regiona mikro-distrofina ćeliji primaocu in vivo ili in vitro, putem rAAV sa nedostatkom replikacije, što za posledicu ima ekspresiju miR29 ili mikro-distrofina u ćeliji primaocu.

[0083] Tako, opisani su postupci za primenu delotvorne doze (ili doza, koje se primenjuju suštinski istovremeno ili doza koje se daju u određenim intervalima) rAAV koji kodiraju miR29 i/ili mikro-distrofin na pacijentu kome je to potrebno.

PRIMERI

Primer 1

Potvrda modela Dišenove mišićne distrofije

[0084] Mdx miševi predstavljaju pogodan, pa ipak nepotpun, životinjski model za proučavanje patogeneze DMD. Ovaj model je ukrštanje mdx miša sa heterozigotnim izbacivanjem gena utrofina (mdx:utrn+/-), što dovodi do povećane fibroze i verodostojnije rezimira patologiju humanog DMD. Mdx miševi imaju nonsens mutaciju u egzonu 23 DMD koja dovodi do relativno umerenog fenotipa i skoro normalnog životnog veka. Do 3. nedelje starosti, u mišićima dijafragme i udova mdx miševa javljaju se znakovi endomizijalne inflamacije. Ovi simptomi slabe u mišićima udova nakon što miš dostigne odrasli uzrast, dok inflamacija u mišićima dijafragme nastavlja progresivno da se pogoršava. Kod mdx miševa koji nemaju telomerazu, mišićna distrofija se progresivno pogoršava sa starenjem; mdx miševi koji nemaju utrofin (DKO) imaju fenotip koji je karakterističniji za humani DMD uz rano javljanje slabosti mišića, tešku fibrozu i preranu smrt. Utrofin, autozomni paralog distrofina, deli veliki stepen homologije sekvence koji može nadomestiti nedostatak distrofina kod mdx miševa sa dvostrukim KO (distrofin plus utrofin). Uočen je težak fenotip sa ranom smrću. Prerana smrt kod DKO miševa sprečava progresiju inflamacije i fibroze, ali mdx:utrn<+/->miš predstavlja model koji ima sličnosti sa ljudskom bolešću i pokazuje izuzetan stepen fibroze, kao i duže preživljavanje od DKO, te tako predstavlja bolji model za naše predložene translacione studije. Nedavni izveštaj potvrđuje korišćenje mdx:utrn<+/->miša kao idealnog modela za proučavanje fibroze u kontekstu DMD. U predmetnoj studiji, povećanu fibrozu, kao što je izmereno bojenjem sirijus crvenom bojom, pratili su povećani nivoi kolagenskog transkripta i smanjeni nivoi mir29c.

Primer 2

Isporučivanje miR29 u miševe sa DMD smanjuje fibrozu

[0085] Preliminarne studije su pokazale da postoji značajno povećanje bojenja sirius crvenom bojom za kolagen i smanjenje nivoa miR-29c kod ljudskih pacijenata sa DMD i mdx/utrn<+/->miševa. Isporuka gena miR-29 koristeći AAV vektore specifične za mišiće je potencijalno bezbedna i delotvorna. Kako bi se generisao vektor rAAV, koji se ovde naziva rAAVrh.74.CMV.miR29c, sekvenca miR29c od 22 nukleotida (ciljni lanac SEQ ID NO: 3 i vodeći lanac SEQ ID NO: 4) klonirana je u skelet miR-30 uz pomoć CMV promotera.

Ekspresiona kaseta (SEQ ID NO: 2) klonirana je u samokomplementarni AAV plazmid i upakovana koristeći AAVrh.74, serotip za koji je poznato da ima dobru ekspresiju u mišiću. kDNK miR-29c je sintetisana koristeći prilagođeni prajmer koji obuhvata ciljni (sens) lanac miR-29c, matičnu petlju miR-30 i vodeći (antisens) lanac miR-29c u miR-30 skeletu.

Modifikovane su tri baze sekvence miR-29c. Ova sekvenca je zatim klonirana u samokomplementarni AAV ITR koji sadrži plazmid koji pokreću CMV promoter i sekvenca poly A.

[0086] Kao što je prikazano na slici 1, pAAV.CMV.miR29C plazmid obuhvata kDNK mir29c u skeletu matične petlje miR-30 gde je okružen sekvencama invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR) AAV2. Ova sekvenca je enkapsidirana u AAVrh.74 virione. Pored toga, nekoliko nukleotida u ciljnoj sekvenci miR-29c je promenjeno da oponaša Votson-Krikovo sparivanje na ovom mestu kao kod shRNK-miR(luc). Na osnovu dizajna ShRNK-luc, ukosnica treba da bude savršeno komplementarna celom svojom dužinom. Osim toga, što više promena postoji u pratećem lancu, verovatnija je eliminacija bilo kog endogenog mehanizma koji reguliše obradu miR-29 koji bi mogao da prepozna miRNK putem matične petlje.19. baza vodećeg lanca je modifikovana u citozin tako da oponaša nukleotid koji prethodi mestu raskidanja u prirodnoj sekvenci mi-29c, a odgovarajuća baza na drugom lancu je promenjena kako bi se očuvalo sparivanje.

[0087] Vektor za gensku terapiju scrAAVrh.74.CMV.miR29c (1×10<11>vg) ubrizgan je u kvadriceps 3 meseca starih mdx/utrn<+/->miševa. Kvadriceps je analiziran 3 meseca nakon injekcije putem bojenja sirius crvenom bojom i analiziran pomoću softvera NIH ImageJ kao što je opisano u Nevo et al. (PloS One, 6: e18049 (2011). Nivoi miR29c, kolagena i elastina su kvantifikovani pomoću RT-PCR. Isporučivanje miR-29c mladim mdx/utrn<+/->miševima značajno povećava nivoe mir-29c i značajno smanjuje bojenje sirius crvenom bojom u kvadricepsu 6 meseci starih mdx/utrn<+/->miševa (3 meseca nakon injekcije). Uočeno je smanjenje nivoa kolagena i elastina u tretiranim mišićima kada su ispitani pomoću RT-PCR.

[0088] Pokazani porast fibroze i smanjenje ekspresije miR29 kod mdx/utrn<+/->miševa i pacijenata sa nedostatkom distrofina potvrđuje da je mišji model reprezentativan za bolest ljudi. Inicijalni rezultati koji su ostvareni koristeći miR29 isporučen pomoću AAV kao antifibroznu terapiju ukazuju na značajno korisno dejstvo uz smanjenje bojenja sirius crvenom bojom i nivoa kolagena i elastina, što su ključni faktori koji učestvuju u fibrozi.

Primer 3

Injekcija miR-29c smanjuje nivo kolagena i obnavlja miR-29c

[0089] Kako bi se odredilo da li rAAVrh.74.CMV.MiR-29c može da umanji fibrozu, 12 nedelja stari mdx/utrn<+\->miševi su primili intramuskularnu injekciju rAAVrh.74.CMV.MiR-29c sa 5×10<11>vg u trbušasti mišić lista (gastrocnemius, GAS) na levoj strani. Miševi su analizirani 12 nedelja nakon injekcije. Bojenje picrosirius crvenom bojom je pokazalo značajno smanjenje kolagena u celom GAS mišiću (sl. 2a) u poređenju sa netretiranim kontralateralnim GAS mišićem mdx/utrn /- miša. Kvantifikacija bojenja picrosirius crvenom bojom pokazuje da je u tretiranom mišiću došlo do smanjenja kolagena od 18,3% u poređenju sa netretiranim mišićem (tretirani - 23,3%±1,3 u odnosu na netretirani - 29,5% ±0,7)(sl. 2b). Kako bi se potvrdila prekomerna ekspresija miR-29c u tretiranom mišiću, ukupna RNK je ekstrahovana iz GAS mišića 24 nedelje starih miševa divljeg tipa, miševa tretiranih sa miR-29c i mdx/ utrn<+/->miševa i podvrgnuta je kvantitativnoj PCR analizi sa reversnom transkripcijom (qRT-PCR) kako bi se odredila ekspresija miR-29c. Ovi rezultati pokazuju da je nivo miR-29c bio značajno povećan u GAS mišiću tretiranih miševa u poređenju sa netretiranim miševima (sl.2d).

Primer 4

miR-29c poboljšava apsolutnu i specifičnu silu mišića ali ne pruža zaštitu od oštećenja izazvanog kontrakcijama

[0090] Pošto znamo da fibroza može uticati na funkciju mišića, želeli smo da testiramo da li bi smanjenje fibroze putem povećanja ekspresije miR-29c moglo da zaštiti mišić mdx/utrn<+/->miševa od povrede izazvane kontrakcijom i poveća ukupnu silu. Procenjena su funkcionalna svojstva trbušastog mišića lista mdx/utrn<+/->miševa koji su tretirani sa rAAVrh.74.CMV.MiR-29c. Dvanaest nedelja nakon injekcije, GAS je izolovan radi in vivo merenja sile.

[0091] Procedura za GAS sledi protokol koji su dali Hakim et al., (Methods Mol Biol.709: 75-89, 2011) za analizu fiziologije poprečnog trbušnog mišića, ali prilagođenu za GAS. Ukratko, miševi su anestezirani koristeći smešu ketamin/ksilazin. Koža zadnjeg uda je uklonjena kako bi se otkrio GAS mišić i Ahilova tetiva. Distalna tetiva je uklonjena isecanjem i dvostruki podvezani čvor je vezan oko tetive sa šavom 4-0 što je bliže moguće mišiću, drugi dvostruki podvezani čvor je vezan odmah pored prvog čvora, nakon čega je tetiva isečena. Izloženi mišić je konstantno vlažen pomoću fiziološkog rastvora. Miševi su zatim prebačeni na platformu sa kontrolisanom temperaturom i držani na 37 °. Koleno je pričvršćeno za platformu iglom koja prolazi kroz patelarnu tetivu, prišivanjem tetive za krak transduktora sile (Aurora Scientific, Aurora, ON, Kanada), a stopalo je pričvršćeno trakom. Kontrakcije GAS mišića su izazvane stimulacijom velikog sedalnog živca pomoću bipolarnih platinastih elektroda. Nakon stabilizacije mišića, optimalna dužina je određena postepenim istezanjem mišića sve dok nije dostignuta maksimalna trzajna sila. Nakon 3-minutnog perioda odmora, GAS je stimulisan na 50, 100, 150 i 200 Hz, uz dopuštanje 1-minutnog perioda odmora između svakog stimulansa kako bi se odredila maksimalna tetanička sila. Izmerena je dužina mišića. Nakon 5-minutnog odmora, procenjena je podložnost GAS mišića oštećenju koje je izazvano kontrakcijama. Nakon 500 ms stimulacije, mišić je produžen za 10% optimalne dužine. Ovo je uključivalo stimulaciju mišića na 150 Hz tokom 700 ms. Nakon stimulacije, mišić se vratio na optimalnu dužinu. Ovaj ciklus je ponavljan na svaki minut za ukupno 5 ciklusa. Specifična sila je izračunata deljenjem maksimalne tetaničke sile sa površinom poprečnog preseka GAS mišića. Nakon ekscentričnih kontrakcija, miševi su eutanazirani i GAS mišić je uklonjen isecanjem, izmeren i zamrznut radi analize.

[0092] Svaki GAS mišić je podvrgnut nizovima ponovljenih ekscentričnih kontrakcija.

Poređenje odnosa sile svake kontrakcije u odnosu na prvu kontrakciju pokazalo je da nakon pete kontrakcije netretirani mišić opada za 0,56± 0,05 u odnosu na tretirani mišić 0,50± 0,04 (p ≤ 0,0001). Grupa na kojoj je vršeno ubrizgavanje pokazuje blago smanjenje stepena zaštite u poređenju sa WT kontrolama, kod kojih je došlo do opadanja 0,92 ± 0,02 (sl.3c). Ovi podaci pokazuju da smanjenje fibroze putem povećanja ekspresije miR-29c dovodi do porasta apsolutne kao i specifične sile, ali mišiću ne pruža značajnu zaštitu od povrede izazvane kontrakcijama.

[0093] GAS mišić tretiran sa rAAVrh.74.MiR-29c pokazao je značajno poboljšanje apsolutne sile u poređenju sa netretiranim GAS mišićem mdx/utrn<+/->miševa(rAAV.miR-29c- 2277 ±161,7 u odnosu na netretirane mdx/utrn<+/->- 1722± 145,7; sl.3a), kao i poboljšanje specifično za normalizovanu specifičnu silu GAS mišića tretiranog sarAAVrh.74.miR-29c u poređenju sa netretiranim GAS mišićem (rAAV.miR-29c- 204,7 ± 11,7 u odnosu na netretirane mdx/utrn<+/->- 151,6 ± 14,5; sl.3b). Sila je i dalje bila značajno smanjena u poređenju sa kontrolama divljeg tipa (rAAV.miR-29c- 204,7 ± 11,7 u odnosu na divlji tip-312,0 ± 34,1).

Primer 5

Zajedničko isporučivanje sa mikro-distrofinom dodatno smanjuje fibrozu

[0094] Kako bi se odredilo da li bi pristup kombinovane genske terapije sa miR-29c/mikrodistrofinom bio korisniji za smanjenje fibroze, 12 nedelja stari mdx/utrn<+\->miševi su primili intramuskularnu injekciju rAAVrh.74.CMV.MiR-29c sa 5×10<11>vg u trbušasti mišić lista na levoj strani. Sledeći vektor za gensku terapiju su primenjivani putem intramuskularne injekcije (i.m.) u levi trbušasti mišić lista (GAS) 3 meseca starih mdx/utrn<+/->miševa, koji predstavljaju mišji model DMD: scAAVrh.74.CMV.miR-29c samostalno, isporučen zajedno sa rAAVrh.74.MCK.mikro-distrofinom i rAAVrh.74.MCK.mikro-distrofin samostalno.

[0095] Plazmid pAAV.MCK.mikro-distrofin obuhvata kDNK ekspresionu kasetu humanog mikro-distrofina oko koje se nalaze sekvence invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR) AAV2, kao što je prikazano na sl.10. Ova sekvenca je enkapsidirana u rh.74 virione AAV. Plazmid pAAV.MCK.mikro-distrofin je konstruisan insercijom ekspresione kasete MCK koja pokreće kDNK sekvencu humanog mikro-distrofina sa optimizovanim kodonom u AAV vektor za kloniranje kao što je opisano u Rodino-Klapac et al. (Mol Ther. 2010 Jan;18(1):109-17). Sekvenca MCK promotera/pojačivača je korišćena za pokretanje ekspresije gena specifičnog za mišić i sačinjena je od mišjeg MCK pojačivača jezgra (206 bp) koji je fuzionisan sa MCK pojačivačem jezgra od 351 bp (proksimalno). Nakon promotera jezgra, endogeni mišji MCK egzon1 od 53 bp (netranslatovan) uveden je za efikasno započinjanje transkripcije, nakon čega slede SV40 kasni 16S/19S signali za splajsovanje (97 bp) i mali 5'UTR (61 bp). Intron i 5' UTR su izvedeni od plazmida pCMVβ (Clontech).

Kaseta sa mikro-distrofinom ima Kozak konsenzus odmah ispred početka ATG i mali sintetički polyA signal za prekid iRNK od 53 bp. Kaseta sa humanim mikro-distrofinom obuhvata domene (R4-R23/Δ71-78). Kodon komplementarne DNK je optimizovan za ljudsku upotrebu i sintetisan je od strane kompanije GenScript (Piscataway, NJ).

[0096] Miševi su analizirani 12 nedelja i 24 nedelje nakon injekcije. Prvo, broj mišićnih vlakana koja eksprimiraju mikro-distrofin je korišćen za procenu delotvornosti transgene isporuke i kako bi se osiguralo da se slični nivoi mikro-distrofina eksprimiraju u svakoj grupi. Otkrili smo da se mikro-distrofin ne razlikuje između kohorti koje su tretirane samo mikrodistrofinom (71,85±2,25%) u poređenju sa kombinovanom terapijom sa miR-29c/mikrodistrofinom (75,03±1,91%) (sl. 4).

[0097] GAS mišić je analiziran 12 meseci nakon injekcije kako bi se ispitala akumulacija kolagena pomoću bojenja sirius crvenom bojom i kasnije kvantifikacije putem ImageJ.

Dodatni ishodi su uključivali nivoe miR-29c i transkripta kolagena, merenje sile u GAS mišiću, merenje prečnika vlakana i vestern blot analizu kako bi se otkrili proteini koji učestvuju u regeneraciji mišića (MyoD, Myogenin). Opseg fibroze je analiziran bojenjem picrosirius crvenom bojom, što je otkrilo značajno smanjenje kolagena u celini GAS mišića u svim tretiranim grupama (sl.5a) u poređenju sa netretiranim kontralateralnim GAS mišićem mdx/utrn+/- miševa ili tretiranjem samo mikro-distrofinom. Kvantifikacija bojenja picrosirius crvenom bojom pokazuje da je u kombinovano tretiranom mišiću došlo do smanjenja kolagena od 40,8% u poređenju sa netretiranim mišićem (tretirani - 17,47%±0,75 u odnosu na netretirani - 29,5% ±0,7)(sl.5b). qRT-PCR je obavljena na GAS mišiću kako bi se potvrdila ekspresija miR-29c i sve terapijske grupe su imale povećanje miR-29c u poređenju sa netretiranim mišićem (sl.5c).

[0098] Analogno tkivu zahvaćenom sa DMD, uočeno je značajno smanjenje nivoa miR-29c u mišiću mdx/utrn<+/->miševa, što je odgovaralo porastu fibroze koje je izmereno bojenjem picrosirius crvenom bojom. Nakon 3 meseca lečenja samo sa scAAV.miR-29c, došlo je do značajnog smanjenja fibroze (tretirani-23,5%±1,3 u odnosu na netretirane-27,8% ±0,6) u GAS mišiću. Kada se isporučuje zajedno sa mikro-distrofinom, dalje smanjenje kolagena (41%) uočeno je pomoću bojenja picrosirius crvenom bojom (kombinovano lečenje:

17,47%±0,75 u odnosu na netretirani: 29,5% ±0,7) (p<0,0001) (sl.5b). qRT-PCR je obavljena na GAS mišiću kako bi se potvrdila ekspresija miR-29c i sve terapijske grupe su imale povećanje miR-29c u poređenju sa netretiranim mišićem (sl.5b).

[0099] 24 nedelje nakon injekcije, rezultati su bili slični rezultatima koji su uočeni 12 nedelja nakon injekcije. Došlo je do smanjenja kolagena od 47% na osnovu bojenja picrosirius bojom u poređenju sa netretiranim mišićem (kombinovano lečenje: 16,5±1,23 u odnosu na netretirani: 31,07±0,93; p<0,0001) i podudarnog porasta nivo transkripta miR-29c.

[0100] Kako bi se dalje potvrdilo smanjenje kolagena koje je uočeno na osnovu bojenja picrosirius crvenom bojom, na mišiću je obavljen qRT-PCR kako bi se kvantifikovali nivoi transkripta Col1A, Col3A, kao i još jedne komponente ECM, fibronektina (Fbn). qRT-PCR analiza je detektovala smanjenje Col1A i Col3A nakon svake terapije, međutim samo je u kohorti koja je lečena sa mikro-distrofinom i miR-29c uočeno značajno smanjenje (sl.6a i 6b). Analiza je pokazala da je Fbn značajno smanjen samo u kohorti sa kombinovanim lečenjem (sl. 6c).

[0101] Prethodno je pokazano da je TGF-β1 ushodno regulisan u distrofičnom mišiću, i verovatno ima ulogu u pokretanju fibrotične kaskade. TGF-β1 je poznati profibrotični citokin koji nishodno reguliše miR-29c i odgovoran je za konverziju mioblasta u miofibroblaste uz porast kolagena i fibrogeneze mišića. qRT-PCR analiza pokazuje da je mišić lečen kombinovanom terapijom ima značajno niže nivoe TGF-β1 u poređenju sa mišićem bez injekcije i bilo kojim lečenjem samostalno (sl. 6d). 6 meseci nakon injekcije, mišić lečen kombinovanom terapijom nastavio je da pokazuje snižene nivoe Col1A, Col3A, Fbn i TGF-β1, dok je samo malo sniženje nivoa iRNK Col1A uočeno u grupama koje su lečene samo sa miR-29 i mikro-distrofinom.

[0102] Povećanje specifične i apsolutne sile je uočeno kod mišića koji je tretiran samo sa miR-29c u poređenju sa netretiranim udom, što je u kombinaciji sa mikro-distrofinom dovelo do apsolutne i specifične sile koja se nije značajno razlikovala od miševa divljeg tipa. Takođe smo uočili značajno povećanje mase trbušastog mišića lista kod mišića koji su lečeni kombinovanom terapijom.

[0103] Inicijalni rezultati koji su ostvareni koristeći rAAV.miR-29c kao antifibroznu terapiju ukazuju na značajno korisno dejstvo uz smanjenje nivoa kolagena, ključnog faktora koji učestvuje u fibrozi. Štaviše, kada se kombinuje sa mikro-distrofinom radi unapređenja stabilnosti membrane, miR29 ushodno reguliše normalizovanu silu mišića.

Primer 6

Dalje povećanje apsolutne sile i dodatna zaštita od oštećenja izazvanog kontrakcijama [0104] Imajući u vidu da je kod mišića lečenog sa miR-29 došlo do skromnog ali značajnog povećanja apsolutne i specifične sile, ispitan je uticaj kombinovane terapije koja se sastoji od prekomerne ekspresije miR-29c i genske terapije mikro-distrofinom na funkciju mišića.

Dvanaest nedelja nakon injekcije, izolovali smo GAS za koji smo vršili merenje sile in vivo. rAAVrh.74.MiR-29c vektor opisan iznad u primeru 2 i rAAV

[0105] Kod GAS mišića lečenog kombinovanom terapijom koja se sastoji od rAAVrh.74.MiR-29c i rAAV koji eksprimira Micro-Dys uočeno je značajno poboljšanje apsolutne sile u poređenju sa GAS mišićem netretiranih mdx/utrn<+/->miševa (kombinovana terapija- 3582,4 ±79,4 nM u odnosu na netretirane mdx/utrn<+/->miševe- 1722± 145,7 nM u odnosu na divlji tip- 3005±167,3 nM) (sl.7), kao i poboljšanje normalizovane specifične sile kod GAS mišića lečenog sa rAAVrh.74.miR-29c/micro-dys u poređenju sa netretiranim GAS mišićem (miševi lečeni kombinovanom terapijom-244,2 ± 6,6 nM/mm<2>u odnosu na netretirane mdx/utrn<+/->miševe- 151,6 ± 14,5 nM/mm<2>u odnosu na 312,0 ± 34,1 nM/mm<2>) (sl.

7). Ni apsolutna ni specifična sila nisu se značajno razlikovale od kontrole divljeg tipa.

[0106] Svaki GAS mišić je podvrgnut nizovima ponovljenih ekscentričnih kontrakcija.

Poređenje odnosa sile svake kontrakcije u odnosu na prvu kontrakciju pokazalo je da je nakon pete kontrakcije netretirani mišić opadao na 0,54± 0,06 u odnosu na kombinovanu terapiju 0,66± 0,04 (p ≤ 0,0001), što može da se pripiše mikro-distrofinu, pošto je i kod samostalne primene mikro-distrofina došlo do opadanja na 0,66± 0,04. Rezultat kod lečene grupe i dalje je bio značajno niži nego kod divljeg tipa gde je došlo do opadanja na 0,92 ± 0,02 (sl.7c). Slični rezultati su uočeni 24 nedelje nakon injekcije. Ovi podaci pokazuju da smanjenje fibroze i genska terapija dovode do porasta apsolutne i specifične sile i značajno štite mišić od oštećenja izazvanog kontrakcijama.

Primer 7

Kombinovano lečenje povećava hipertrofiju i hiperplaziju mišića

[0107] MiR-29c isporučen zajedno sa mikro-distrofinom povećao je ukupnu masu trbušastog mišića lista u koji je vršeno ubrizgavanje u poređenju sa bilo kojim pojedinačnim ubrizgavanje pri tri meseca starosti (sl.8, sl.9a). Kako bi se ispitao uzrok povećane mišićne mase, izmereni su prečnici mišićnih vlakana. Lečenje kombinacijom miR-29c/µ-dys pokazuje porast prosečnih dimenzija vlakana. Kada se mdx/utrn<+/->kontrolni miševi porede sa mdx/utrn<+/->miševima koji su lečeni sa miR-29c/µ-dys, prosečni prečnik je povećan sa 25,96 na 30,97µm (sl. 9b). Zajednička isporuka proizvoda je dovela do pomaka ka raspodeli veličine vlakana koja se javlja kod divljeg tipa (sl.9c). Iako je došlo do porasta prosečnih dimenzija vlakana, to ne objašnjava povećanje bruto mase mišića od ~30%. Takođe je izmerena ukupna površina poprečnog preseka mišića. Trbušasti mišići lista svih grupa su digitalno snimljeni i izmerena je ukupna površina. Mišići lečeni kombinovanom terapijom micro-dys/miR-29c imali su značajno povećanje površine poprečnog preseka u poređenju sa netretiranim mišićima ili bilo kojim lečenjem samostalno (bez injekcije: 24,6 u odnosu na miR-29c: 26,3 u odnosu na mikro-dis: 26,6 u odnosu na mikro-dis/miR-29c: 33,1) (sl.8, sl.

9d).

[0108] Prijavljeno je da miR-29c ima ulogu u putu myoD/Pax7/miogenin i pretpostavljeno je da miR-29c može uticati na obnavljanje i aktivaciju satelitskih ćelija (matičnih ćelija mišića) radi njihove diferencijacije u miogenu liniju. Da bismo to testirali, prebrojan je ukupan broj mišićnih vlakana sa digitalno načinjenih snimaka. Povećan broj mišićnih vlakana nakon kombinovanog lečenja sa miR-29c/µ-dys (sl.9e). Konačno, imajući u vidu da su prečnici mišićnih vlakana kod mdx/utrn+/- heterogeni uz brojna mala vlakna i neka hipertrofična vlakna, utvrđeno je da li je lečenje uticalo na broj vlakana po jedinici površine (ćelije/mm2). Kombinovano lečenje sa miR-29c/µ-dys nije se razlikovalo od divljeg tipa (sl.9f).

Primer 8

Rano lečenje kombinacijom sprečava fibrozu

[0109] Imajući u vidu potencijalni značaj kombinacije miR-29c i mikro-distrofina kao profilaktičke terapije za DMD, kohorta mlađih mdx/utrn<+/->miševa lečena je u uzrastu 4 nedelje. Koristeći istu paradigmu kao za ostale grupe koje su ovde opisane, upoređena je efikasnost sledećih lečenja u prevenciji fibroze putem intramuskularne injekcije u GAS: scAAVrh.74.CMV.miR-29c samostalno, ssAAVrh74.MCK.mikro-distrofin scAAVrh.74.CMV.miR-29c kombinovana terapija, ili ssAAVrh74.MCK.mikro-distrofin samostalno u istoj dozi. Izvršena je nekropsija miševa 12 nedelja nakon injekcije. Uočeno je značajno smanjenje bojenja kolagena u celini GAS mišića svih lečenih grupa u poređenju sa kontralateralnim GAS mišićem nelečenih mdx/utrn<+/->miševa (sl.10A). Kvantifikacija bojenja picrosirius crvenom bojom je pokazala da je kod mišića lečenih kombinacijom mikro-distrofin/miR-29c došlo do 51% smanjenja kolagena u poređenju sa netretiranim mišićem (lečeni- 11,32%± 1,18 u odnosu na netretirani-23,15% ±0,90) (p<0,0001) (sl.10) i qRT-PCR je potvrdio smanjenje Col1A, Col3A, Fbn i TGF-β1 nakon kombinovane terapije (sl. 10D i E).

Primer 9

Rana kombinovana terapija obnavlja silu i štiti od oštećenja izazvanog kontrakcijama bolje od kasnijeg lečenja

[0110] In vivo merenje sile obavljeno je na GAS miševa koji su rano tretirani kombinovanom terapijom kao što je opisano u primeru 8. Kod 4 nedelje starih mdx/utrn<+/->miševa, kombinovano lečenje koristeći miR-29c/mikro-distrofin pokazalo je značajno poboljšanje apsolutne sile u poređenju sa netretiranim mdx/utrn<+/->miševima i nije bilo nikakve razlike u odnosu na divlji tip (lečeni kombinacijom: 2908± 129,5 mN u odnosu na netretirane: 1639,4± 116,9 mN u odnosu na divlji tip: 3369,73± 154,1 mN). Specifična sila je nakon kombinovane terapije takođe normalizovana na nivoe viđene kod divljeg tipa (lečeni kombinacijom 338,9 ± 22,34 mN/mm2 u odnosu na netretirane 184,3 ± 13,42 mN/mm<2>u odnosu na WT 364,3 ± 7,79 mN/mm<2>) (sl.11A i B i 12).

[0111] Nakon toga, svaki GAS mišić je podvrgnut nizovima ponovljenih ekscentričnih kontrakcija. Poređenje odnosa sile svake kontrakcije u odnosu na petu kontrakciju pokazalo je da netretirani mišić opada za 0,53± 0,04 u odnosu na mišić lečen kombinacijom 0,82± 0,04 (p ≤ 0,0001). Grupa sa kombinovanim lečenjem je ostvarila neznatno niže vrednosti od divljeg tipa ali bez značajne razlike, gde je došlo do opadanja na 0,93 ± 0,01 (sl.11C). Ovi podaci pokazuju da smanjenje fibroze i genska terapija dovode do porasta apsolutne i specifične sile i značajno štite mišić od oštećenja izazvanog kontrakcijama.

[0112] Ovi eksperimenti ukazuju na to da gensku terapiju treba započeti u neonatalnom periodu. Čine se jasni napori da se DMD i druge mišićne distrofije identifikuju u neonatalnom periodu. Studija ispitivanja novorođenčadi u Ohaju pokazuje potencijal za otkrivanje DMD kod novorođenčadi koristeći CK 7 Neurol. kao biomarker (>2000 U/l) uz DNK potvrdu na istoj osušenoj kapi krvi (Mendell et al., Ann. Neurol.71: 304-313, 2012). Ova metodologija se sada proširuje na druge države u SAD (PPMD May 16, 2016: Next Steps with Newborn Screening) i na druge zemlje, naročito UK (Nacionalni komitet za skrining UK) i Kinu (Perkin Elmer<™>pokreće skrining u Kini).

[0113] miR-29 takođe je pokazao potencijal kao modalitet za lečenje fibroze srca, pluća i jetre. Infarkt miokarda kod miševa i ljudi je povezan sa nishodnom regulacijom miR-29. Rooij et al. (Proc. Natl. Acad. Sci, USA 105:13027-13032, 2008) pokazali su da izlaganje fibroblasta imitatoru miR-29b smanjuje transkripte kolagena što obezbeđuje put za kliničku translaciju za srčanu fibrozu. Dalje studije su pokazale da na mišjem modelu fibroze pluća uzrokovane bleomicinom, ublažavanje fibroze može da se postigne koristeći isporučivanje miR-29b.14 zasnovano na Sleeping Beauty (SB) transpozonskom sistemu. Imitator miR-29b trenutno se ispituje u lokalnom intradermalnom ispitivanju bezbednosti-podnošljivosti faze 1 kod zdravih dobrovoljaca (miRagen Therapeutics<™>MRG-201). U poređenju sa oligonukleotidnom isporukom miR-29 koja bi zahtevala ponovljenu primenu usled poluživota oligonukleotida, AAV genska terapija potencijalno može da obezbedi put za transfer gena u jednoj isporuci.

Primer 10

Lečenje ekspresijom miR-29 specifičnom za mišiće i mikro-distrofinom smanjena fibroza i ekspresija ECM

[0114] AAV vektori koji obuhvataju sekvencu miR29c i MCK promoter specifičan za mišić takođe su generisani i testirani kao kombinovana terapija sa AAV vektorima koji eksprimiraju mikro-distrofin. Kako bi se generisao vektor rAAV, koji se ovde naziva rAAV.MCK.miR29c, sekvenca miR29c od 22 nukleotida (ciljni lanac SEQ ID NO: 3 i vodeći lanac SEQ ID NO: 4) klonirana je u skelet miR-30 uz pomoć MCK promotera (SEQ ID NO: 11). Ekspresiona kaseta (SEQ ID NO: 12) klonirana je u jednolančani AAV plazmid i upakovana koristeći AAVrh74, serotip za koji je poznato da ima dobru ekspresiju u mišiću. kDNK miR-29c je sintetisana koristeći prilagođeni prajmer koji obuhvata ciljni (sens) lanac miR-29c, matičnu petlju miR-30 i vodeći (antisens) lanac miR-29c u miR-30 skeletu.

Modifikovane su tri baze sekvence miR-29c. Ova sekvenca je zatim klonirana u jednolančani AAV ITR koji sadrži plazmid koji pokreću MCK promoter i sekvenca polyA.

[0115] pAAV.MCK.miR29C plazmid obuhvata kDNK mir29c u skeletu matične petlje miR-30 gde je okružen sekvencama invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR) AAV2. Ova sekvenca je enkapsidirana u AAVrh74 virione. Pored toga, nekoliko nukleotida u ciljnoj sekvenci miR-29c je promenjeno da oponaša Votson-Krikovo sparivanje na ovom mestu kao kod shRNK-miR(luc). Na osnovu dizajna ShRNK-luc, ukosnica treba da bude savršeno komplementarna celom svojom dužinom. Osim toga, što više promena postoji u pratećem lancu, verovatnija je eliminacija bilo kog endogenog mehanizma koji reguliše obradu miR-29 koji bi mogao da prepozna miRNK putem matične petlje.19. baza vodećeg lanca je modifikovana u citozin tako da oponaša nukleotid koji prethodi mestu raskidanja u prirodnoj sekvenci mi-29c, a odgovarajuća baza na drugom lancu je promenjena kako bi se očuvalo sparivanje.

[0116] Rano lečenje kombinovanom terapijom koja se sastoji od AAV.MCK.miR-29c/mikrodistrofina je bilo delotvornije za smanjenje fibroze i ekspresije ECM.4-5 nedelja stari mdx/utrn<+\->miševi primili su intramuskularnu injekciju rAAVrh.74.MCK.MiR-29c i rAAVrh74.MCK.mikro-distrofina sa 5×10<11>vg u levi trbušasti mišić lista kao što je opisano u primeru 5. Mišići su sakupljeni dvanaest nedelja nakon injekcije. Bojenje picrosirius crvenom bojom mišića sakupljenih od miševa bez injekcije i miševa kojima je ubrizgana kombinovana terapija koja se sastoji od rAAV.MCK.miR-29c/rAAV.MCK.mikro-distrofina pokazalo je da su mišići lečeni kombinovanom terapijom imali 50,9% smanjenje kolagena u poređenju sa netretiranim GAS mišićem (vidite sl.13a i 13b). qRT-PCR potvrđuje porast nivoa transkripta miR-29c u lečenoj kohorti (sl.13c). Polukvantitativna qRT-PCR pokazala je značajno smanjenje nivoa kolagena A1 i kolagena 3A (sl.13d, e), fibronektina (sl.13f) i Tgfβ1 (sl.13g) u mišiću lečenom sa AAV.MCK.miR-29c/AAV.mikro-distrofinom u poređenju sa terapijama kontralateralnog uda. (*p<0,05,****p<0,0001). Kasno lečenje kombinovanom terapijom koja se sastoji od AAV.MCK.miR-29c/mikro-distrofina je delotvorno za smanjenje fibroze i ekspresije ECM. Tri meseca stari mdx/utrn<+\->miševi primili su intramuskularnu injekciju rAAVrh.74.MCK.MiR-29c i rAAVrh.74.MCK.mikro-distrofina sa 5×10<11>vg u levi trbušasti mišić lista kao što je opisano u primeru 5. Mišići su sakupljeni dvanaest nedelja nakon injekcije. Bojenje picrosirius crvenom bojom nelečenih mišića, mišića lečenih sa AAV.MCK.miR-29c i AAV.MCK.miR-29c/AAV.mikro-distrofinom pokazalo je da su mišići lečeni kombinovanom terapijom imali 30,3% smanjenje kolagena u poređenju sa netretiranim GAS mišićem (vidite sl.14a i 14b). qRT-PCR potvrđuje porast nivoa transkripta miR-29c u lečenim kohortama (sl.14c). Polukvantitativna qRT-PCR pokazuje značajno smanjenje nivoa kolagena 1A i kolagena 3A (sl. 14d, e), fibronektina (sl.

14f) i Tgfβ1 (sl.14G) u mišiću lečenom sa AAV.miR-29c/AAV.mikro-distrofinom u poređenju sa kontralateralnim udom. Jednosmerna ANOVA. Svi podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM. (** p<0,01, ****p<0,0001).

Primer 11

Rana kombinovana terapija obnavlja silu i štiti od oštećenja izazvanog kontrakcijama bolje od kasnijeg lečenja

[0117] In vivo merenje sile obavljeno je na GAS miševa koji su rano lečeni ekspresijom miR-29 specifičnom za mišić i mikro-distrofinom, kao što je opisano u primerima 8 i 9. Kod 4 nedelje starih mdx/utrn<+/->miševa, kombinovano lečenje koristeći rAAV.MCK.miR-29c/i rAAV koji eksprimira mikro-distrofin pokazalo je značajno poboljšanje apsolutne sile u poređenju sa netretiranim mdx/utrn<+/->miševima i nije bilo nikakve razlike u odnosu na divlji tip (sl.15a). Specifična sila je nakon kombinovane terapije takođe normalizovana na nivoe kao kod divljeg tipa (sl.15b).

[0118] Mišići su zatim testirani na gubitak sile nakon ponovljenih ekscentričnih kontrakcija kao što je opisano u primeru 9. Samo je kod miševa koji su lečeni kombinacijom rAAV.MCK.miR-29c/rAAV.MCK.mikro-distrofin i samo rAAV.MCK.mikro-distrofinom uočena zaštita od gubitka sile u poređenju sa mišićima nelečenih mdx/utrn<+\->miševa (sl. 15c).

[0119] Kod 12 nedelja starih mdx/utrn<+/->miševa, kombinovano lečenje koristeći rAAV.MCK.miR-29c/i rAAV koji eksprimira mikro-distrofin obnovilo je silu i obezbedilo zaštitu od oštećenja izazvanog kontrakcijama. Merenje apsolutne (sl.16a) i normalizovane specifične sile (sl.16b) nakon tetaničke kontrakcije trbušastih mišića lista u koje je ubrizgan rAAV.MCK.miR-29c i rAAV koji eksprimira mikro-distrofin bilo je značajno povećano u poređenju sa netretiranim mišićem mdx/utrn<+/->miševa. Mišići su zatim testirani na gubitak sile nakon ponovljenih ekscentričnih kontrakcija kao što je opisano u primeru 9. Kod miševa koji su lečeni kombinacijom MCK.miR-29c/mikro-distrofin uočena je zaštita od gubitka sile u poređenju sa mišićima nelečenih mdx/utrn<+\->miševa (sl.16c). Ovi podaci pokazuju da smanjenje fibroze i genska terapija dovode do porasta apsolutne i specifične sile i značajno štite mišić od oštećenja izazvanog kontrakcijama.

Primer 12

Rano kombinovano lečenje povećava hipertrofiju i hiperplaziju mišića

[0120] Zajednička isporuka rAAV.MCK.miR-29 sa rAAV koji eksprimira mikro-distrofin nije povećala ukupnu masu trbušastog mišića lista u koji se vrši ubrizgavanje u poređenju sa bilo kojom terapijom pojedinačno tri meseca nakon injekcije (sl. 17a). Takođe su izmereni prečnici mišićnih vlakana. Kombinovano lečenje sa miR-29c/mikro-distrofinom pokazalo je porast prosečnih dimenzija vlakana. Kada se mdx/utrn<+/->kontrolni miševi porede sa mdx/utrn<+/->miševima koji su lečeni sa miR-29c/mikro-distrofinom, prosečni prečnik je povećan sa 28,96 na 36,03 µm (sl.17b). Zajednička isporuka proizvoda je dovela do pomaka ka raspodeli veličine vlakana koja se javlja kod divljeg tipa (sl.17c). Broj mišićnih vlakana po mm<2>kod kombinovanog lečenja sa miR-29c/mikro-distrofinom bio je značajno manji nego kod nelečenih miševa i miševa divljeg tipa (sl.17d; ***p<0,01, ****p<0,0001).

REFERENCE

[0121]

1. Hoffman, E.P., Brown, R.H., Jr. i Kunkel, L.M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell 51, 919-928 (1987).

2. Straub, V. i Campbell, K.P. Muscular dystrophies and the dystrophin-glycoprotein complex. Curr Opin Neurol 10, 168-175 (1997).

3. Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell 143, 1059-1071 (2010).

4. Wallace, G.Q. i McNally, E.M. Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies. Annu Rev Physiol 71, 37-57 (2009).

5. Zhou, L. i Lu, H. Targeting fibrosis in Duchenne muscular dystrophy. J Neuropathol Exp Neurol 69, 771-776 (2010).

6. Desguerre, I., et al. Endomysial fibrosis in Duchenne muscular dystrophy: a marker of poor outcome associated with macrophage alternative activation. J Neuropathol Exp Neurol 68, 762-773 (2009).

7. Kim, J., et al. microRNA-directed cleavage of ATHB 15 mRNA regulates vascular development in Arabidopsis inflorescence stems. Plant J 42, 84-94 (2005).

8. Ambros, V. MicroRNA pathways in flies and worms: growth, death, fat, stress, and timing. Cell 113, 673-676 (2003).

9. Eisenberg, I., et al. Distinctive patterns of microRNA expression in primary muscular disorders. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 17016-17021 (2007).

Jiang, X., Tsitsiou, E., Herrick, S.E. i Lindsay, M.A. MicroRNAs and the regulation of fibrosis. FEBS J 277, 2015-2021 (2010).

van Rooij, E., et al. Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 13027-13032 (2008).

Cacchiarelli, D., et al. MicroRNAs involved in molecular circuitries relevant for the Duchenne muscular dystrophy pathogenesis are controlled by the dystrophin/nNOS pathway. Cell Metab 12, 341-351 (2010).

DiPrimio, N., McPhee, S.W. i Samulski, R.J. Adeno-associated virus for the treatment of muscle diseases: toward clinical trials. Curr Opin Mol Ther 12, 553-560 (2010). Mendell, J.R., et al. Sustained alpha-sarcoglycan gene expression after gene transfer in limb-girdle muscular dystrophy, type 2D. Ann Neurol 68, 629-638 (2010).

Mendell, J.R., et al. Limb-girdle muscular dystrophy type 2D gene therapy restores alpha-sarcoglycan and associated proteins. Ann Neurol 66, 290-297 (2009).

Mendell, J.R., et al. A phase 1/2a follistatin gene therapy trial for becker muscular dystrophy. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 23, 192-201 (2015).

Carnwath, J.W. i Shotton, D.M. Muscular dystrophy in the mdx mouse: histopathology of the soleus and extensor digitorum longus muscles. J Neural Sci 80, 39-54 (1987).

Coulton, G.R., Morgan, J.E., Partridge, T.A. i Sloper, J.C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol 14, 53-70 (1988).

Cullen, M.J. i Jaros, E. Ultrastructure of the skeletal muscle in the X chromosomelinked dystrophic (mdx) mouse. Comparison with Duchenne muscular dystrophy. Acta Neuropathol 77, 69-81 (1988).

Dupont-Versteegden, E.E. i McCarter, R.J. Differential expression of muscular dystrophy in diaphragm versus hindlimb muscles of mdx mice. Muscle Nerve 15, 1105-1110 (1992).

Stedman, H.H., et al. The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature 352, 536-539 (1991).

Deconinck, A.E., et al. Utrophin-dystrophin-deficient mice as a model for Duchenne muscular dystrophy. Cell 90, 717-727 (1997).

Grady, R.M., et al. Skeletal and cardiac myopathies in mice lacking utrophin and dystrophin: a model for Duchenne muscular dystrophy. Cell 90, 729-738 (1997). Love, D.R., et al. An autosomal transcript in skeletal muscle with homology to dystrophin. Nature 339, 55-58 (1989).

Tinsley, J.M., et al. Primary structure of dystrophin-related protein. Nature 360, 591-593 (1992).

Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med 4, 1441-1444 (1998).

Squire, S., et al. Prevention of pathology in mdx mice by expression of utrophin: analysis using an inducible transgenic expression system. Hum Mol Genet 11, 3333-3344 (2002).

Rafael, J.A., Tinsley, J.M., Potter, A.C., Deconinck, A.E. i Davies, K.E. Skeletal muscle-specific expression of a utrophin transgene rescues utrophin-dystrophin deficient mice. Nat Genet 19, 79-82 (1998).

Zhou, L., et al. Haploinsufficiency of utrophin gene worsens skeletal muscle inflammation and fibrosis in mdx mice. J Neural Sci 264, 106-111 (2008).

Gutpell, K.M., Hrinivich, W.T. i Hoffman, L.M. Skeletal Muscle Fibrosis in the mdx/utrn+/- Mouse Validates Its Suitability as a Murine Model of Duchenne Muscular Dystrophy. PloS one 10, e0117306 (2015).

Rodino-Klapac, L.R., et al. Micro-dystrophin and follistatin co-delivery restores muscle function in aged DMD model. Human molecular genetics 22, 4929-4937 (2013).

Cushing, L., et al. MIR-29 is a Major Regulator of Genes Associated with Pulmonary Fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol (2010).

Roderburg, C., et al. Micro-RNA profiling reveals a role for miR-29 in human and murine liver fibrosis. Hepatology 53, 209-218 (2011).

Nevo, Y., et al. The Ras antagonist, farnesylthiosalicylic acid (FTS), decreases fibrosis and improves muscle strength in dy/dy mouse model of muscular dystrophy. PloS one 6, e18049 (2011).

Rodino-Klapac, L.R., et al. A translational approach for limb vascular delivery of the micro-dystrophin gene without high volume or high pressure for treatment of Duchenne muscular dystrophy. J Transl Med 5, 45 (2007).

Mulieri, L.A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E.M. i Alpert, N.R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circ Res 65, 1441-1449 (1989).

Rodino-Klapac, L.R., et al. Persistent expression of FLAG-tagged micro dystrophin in nonhuman primates following intramuscular and vascular delivery. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 18, 109-117 (2010).

Grose, W.E., et al. Homologous recombination mediates functional recovery of dysferlin deficiency following AAV5 gene transfer. PloS one 7, e39233 (2012).

Liu, M., et al. Adeno-associated virus-mediated microdystrophin expression protects young mdx muscle from contraction-induced injury. Mol Ther 11, 245-256 (2005).

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Rekombinantni AAVrh74 vektor koji sadrži kontrolni element specifičan za mišić operativno povezan sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 7.

2. Rekombinantni AAVrh74 vektor iz zahteva 1, pri čemu je kontrolni element specifičan za mišić izveden iz mišićne kreatin kinaze (MCK).

3. Rekombinantni AAVrh74 vektor iz zahteva 2, pri čemu kontrolni element specifičan za mišić obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 11.

4. Kompozicija koja obuhvata rekombinantni AAVrh74 vektor iz bilo kog od zahteva 1-3 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

5. Rekombinantni AAVrh74 vektor iz bilo kog od zahteva 1-3 ili kompozicija iz zahteva 4 za upotrebu u lečenju mišićne distrofije.

6. Rekombinantni AAVrh74 vektor iz bilo kog od zahteva 1-3 ili kompozicija iz zahteva 4 za upotrebu u smanjenju ili prevenciji fibroze kod ispitanika koji boluje od mišićne distrofije.

7. Rekombinantni AAVrh74 vektor iz bilo kog od zahteva 1-3 ili kompozicija iz zahteva 4 za upotrebu u povećanju sile mišića ili mišićne mase kod ispitanika koji boluje od mišićne distrofije.

8. Rekombinantni AAVrh74 vektor ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 5-7, pri čemu se rekombinantni AAVrh74 vektor ili kompozicija primenjuju pre nego što je fibroza uočena kod ispitanika ili pre smanjenja sile mišića ispitanika ili pre smanjenja mišićne mase ispitanika.

9. Rekombinantni AAVrh74 vektor ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 5-8, pri čemu ispitanik boluje od Dišenove mišićne distrofije.

10. In vitro postupak za proizvodnju funkcionalnog proteina mikro-distrofina koji obuhvata inficiranje ćelije domaćina rekombinantnim AAVrh74 vektorom iz bilo kog od zahteva 1-3 i ekspresiju funkcionalnog proteina mikro-distrofina u ćeliji domaćinu.