RS66856B1 - Antitela koja se vezuju za sortilin i inhibiraju vezivanje progranulina - Google Patents

Antitela koja se vezuju za sortilin i inhibiraju vezivanje progranulina

Info

Publication number
RS66856B1
RS66856B1 RS20250507A RSP20250507A RS66856B1 RS 66856 B1 RS66856 B1 RS 66856B1 RS 20250507 A RS20250507 A RS 20250507A RS P20250507 A RSP20250507 A RS P20250507A RS 66856 B1 RS66856 B1 RS 66856B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
variable domain
chain variable
cdr
antibody
Prior art date
Application number
RS20250507A
Other languages
English (en)
Inventor
Rønn Lars Christian Biilmann
Ibrahim John Malik
Jeffrey B Stavenhagen
Søren Christensen
Jan Egebjerg
Arnout Gerritsen
Den Brink Edward Van
Paul Parren
Jong Rob De
Original Assignee
H Lundbeck As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by H Lundbeck As filed Critical H Lundbeck As
Publication of RS66856B1 publication Critical patent/RS66856B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/286—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against neuromediator receptors, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na monoklonalna anti-sortilin antitela korisna u korekciji deficijentog nivoa progranulina (PGRN). Određenije ova antitela se mogu primeniti u tretiranju frontotemporalne demencije (FTD) i amiotrofične lateralne skleroze (ALS). Dalje, predviđeno je da ova monoklonalna antitela takođe mogu biti korisna za tretiranje neurodegenerativnih poremećaja kao što je Alchajmerova bolest (AD).
Pozivanje na listu sekvenci
[0002] Ova prijava uključuje jednu ili više Lista sekvenci u skladu sa 37 C.F.R.1.821 et seq., koje su uključene na kompjuterski čitljivom mediju (naziv fajla: 0993_ST25.txt, kreiran 22. juna 2016, i veličine 144 kB), koji je dokument ovde u svojoj celosti uključen kao referenca.
Pozadina pronalaska
[0003] Sortilin je receptor za koji je prijavljeno da posreduje pro- apoptotične efekte pro-neutrofina i da posreduje trafiking i sortiranje neutrofin receptora (Nykjær et al, 2012, Trends Neurosci.
2012;35(4):261-70; Glerup et al, Handb Exp Pharmacol, 2014;220:165-89, Carlo et al, J Mol Med (Berl).
2014 Sep;92(9):905-11). Brojni ligandi sortilina su identifikovani uključujući neurotenzin za koji je lokalizovano mesto visokog afiniteta vezivanja putem kristalografije rendgenskih zraka unutar beta propeler tunelu u molekulu sortilina (Quistgaard et al, Nat Struct Mol Biol.2009 Jan; 16(1):96-8; Quistgaard et al, Protein Sci.2014, Sep;23(9):1291-300). Još skorije, pokazalo se da sortilin fukcioniše kao receptor visokog afiniteta za faktor rasta progranulin (PGRN, Hu et al. Neuron.2010 Nov 18;68(4):654-67.
[0004] PGRN ((proepitelin, granulin-epitelin prekursor, PC-ćelija-izveden faktor rasta, akrogranin)) je izlučeni glikozilovani protein sa anti-zapaljenske i neurotrofične-nalik aktivnosti (Za nedavnu recenziju, videti Nguyen, Trends Endocrinol Metab.2013 Dec;24(12):597-606). PGRN je proteolitički pocepan na granuline, ali ostaje dosta da se nauči u pogledu fiziološke uloge PGRN i granulina i identitu njihovih receptora. PGRN umešan je u nekoliko celularnih funkcija uključujući regulaciju ćelijskog ciklusa i pokretljivosti ćelija (He, Z. & Bateman, A., J. Mol. Med.57:600-612 (2003); Monami, G., et al., Cancer Res. (5(5:7103-7110 (2006)), zaceljivanje rana, zapaljenje (Zhu, J., et al., Cell 777:867-878 (2002)), indukciju faktora rasta kao što je vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF) (Tangkeangsiπsin, W. & Serrero, G, Carcinogenesis 25.1587-1592 (2004)), i tumorogeneza (He, Z. & Bateman, A., J. Mol. Med.
81:600- 612 (2003), Monami, G., et al., Cancer Res (5(5:7103-7110 (2006); Serrero, G., Biochem Biophys. Res. Commun.505-409-413 (2003), Lu, R & Serrero, G., Proc. Natl Acad Sci U.SA 98142-147 (2001); Liau, L M., et al., Cancer Res.60:1353-1360 (2000)). Prijavljeno je da PGRN vezuje TNF receptor (Tang W et al., Science 2011, 332(6028):478-84). ali je ova opservacija osporena od strane drugih (Chen et al., J Neurosci.2013, 33(21):9202-9213).
[0005] Vezivanje PGRN za sortilin mapirano je na neurotenzinskom mestu i prijavljeno da je u potpunosti posredovano putem PGRN C-terminalnog domena (Zheng et al. PLoS One.
2011;6(6):e21023; Lee et al. Hum Mol Genet.2013) na način sličan neurotenzinu i sa tim u vezi, neurotenzin je pokazao da blokira interakciju sortilina sa PGRN i drugim ligandima. Nakon vezivanja, sortilin posreduje klirens lizozoma kod PGRN i time reguliše ekstracelularne PGRN nivoe (Hu et al.2010). Tako, pokazalo se da nokdaun ili prekomerna ekspresija sortilina regulišu ekstracelularne PGRN nivoe kod ćelijske kulture (Carrasquillo et al. Am J Hum Genet.2010 Dec 10;87(6):890-7), a kod miševa, prijavljeno je da deficijencija sortilina povećava PGRN nivoe i obnavlja plazma i moždane PGRN-nivoe kod PGRN /- miševa (Hu et al.2010). Zanimljivo, pojedinačni nukleotidni polimorfizam (SNP) blizu sortilina povezan je sa sniženim PGRN u plazmi i povišenim sortilin mRNK nivoima (Carrasquillo et al. Am J Hum Genet.2010 Dec 10;87(6):890-7). Ove opservacije sugerišu da je sortilin ključni regulator ekstracelularnog PGRN.
[0006] PGRN je povezan sa frontotemporalnom demencijom (FTD), progresivnom demencijom koja je okarakterisana bihevioralnim i semantičkim promenama, kao i sa frontotemporalnim lobarnom degeneracijom (FTLD) i neuronalnim inkluzijama koje sadrže TAR DNK Vezivanje Proteina-43 (TDP-43) ili tau inkluzije (Baker et al, 2006, Nature.2006 Aug 24;442(7105):916-9; Cruts et al, Nature 442: 920-924 (2006); Am J Hum Genet.2010 Dec 10;87(6):890-7,M et al, Trends in Genetics 24: 186-194 (2008)). Većina sporadičnih i porodičnih FTD slučajeva pokazuju TDP-43 patologiju (~50%) sličnu ALS, a FTD-TDP43 i ALS neki smatraju da konstituišu spektar bolesti (Ito D Neurology.2011 Oct 25;77(17):1636-43; Boxer AL et al, Alzheimers Dement.2013 Mar;9(2):176-88; Rademakers et al, Nat Rev Neurol.2012 August; 8(8): 423-434) zbog zajedničkih patologija i genetskih faktora i nekih preklapanja u simptomatologiji. Ne postoje dostupne opcije bolest-modifikujućeg tretiranja za FTD. Podskup pacijenata sa frontotemporalnom demencijom sa TDP-43 patologijom imaju gubitak funkcionalnih mutacija u genu granulina (GRN) što rezultuje PGRN haplo-insuficijencijom. Do danas, 69 različitih mutacija u genu granulina, koje sve rezultuju u redukovanim PGRN nivoima i/ili funkciji, povezane su sa FTD i smatra se da bi se povećanje ekstracelularnog PGRN u plazmi i mozgu moglo suprotstaviti procesu bolesti.
[0007] PGRN mutacije su takođe povezane sa Alchajmerovom bolešću (AD) (Sheng et al., 2014, Gene.
2014 Jun 1;542(2):141-5; Brouwers et al., 2008, Neurology.2008 Aug 26;71(9):656-64) što sugeriše da PGRN deficijencija može da igra značajnu ulogu u AD patogenezi. Dalje, primećeni su neuroprotektivni efekti PGRN u mišjim AD modelima (Minami et al, 2014, Nat Med.2014 Oct;20(10):1157-64) čime se obezbeđuje podrška u pogledu da pojačani PGRN može biti dobar u AD i moguće drugim neurodegenerativnim stanjima.
[0008] Ova prijava opisuje generisanje i identifikaciju anti-humanih sortilin antitela koja mogu da regulišu PGRN u celularnim modelima i kod miševa. Ta antitela začuđujuće se vezuju za region na sortilinu koji je udaljen na prethodno prijavljenom mestu vezivanja progranulina, takozvanom neurotenzin-mestu, a ipak su sposobna za inhibiranje Sortilin-PGRN interakcije i da time povećaju ekstracelularni PGRN.
[0009] Pronalazači su definisali šest regiona vezivanja sortilina i začuđujuće identifikovali da većina efikasnih antitela vezuje region ("region D"). Kako PGRN ima neuroprotektivne i anti-zapaljenske efekte, otkrića pronalazača ukazuje da takva antitela koja ciljaju sortilin verovatno imaju dobrobitne efekte u tretiranju spektra neurodegenerativnih poremećaja uključujući FTD/FTLD. Podgrupa ovih pacijenata nosi mutaciju u genu koji enkodira PGRN što vodi do haploinsuficijencije. Antitela sortilina, prema tome, veoma imaju slične terapeutske benefite za pacijente koji boluju od drugih TDP-43 proteinopatija i bolesti kod kojih PGRN nivoi mogu da utiču na TDP43-funkciju i patologiju, uključujući ALS i AD.
Pregled pronalaska
[0010] Ovaj pronalazak naveden je u priloženim patentnim zahtevima. Bilo koji načini ostvarivanja ili aspekti koji nisu obuhvaćeni obimom patentnih zahteva, uključeni su samo kao referenca. Bilo koje pozivanje na postupak tretiranja smatra se i pozivanjem na jedinjenja i kompozicije ovog pronalaska za upotrebu u postupku tretiranja koji se sprovodi na ljudskom/životinjskom telu. Pronalazači ovog pronalaska generisali su monoklonalna antitela koja mogu da inhibiraju vezivanje PGRN za sortilin, i koja se začuđujuće vezuju za novi region sortilina denominiran "D-region" kako je definisano u SEQ ID NO:170. Nekoliko antitela identifikovanih od strane pronalazača imaju karakteristike slične D-regionu antitela, a eksperimentalni dokaz ukazuje da se takođe vezuju unutar D-regiona, i ta antitela se ovde nazivaju D+ antitela. U skladu sa tim, u jednom aspektu, ovaj opis odnosi se na takva antitela, na kompozicije i/ili komplete koji obuhvataju takva antitela, i na postupke za njihovu primenu.
[0011] Ovaj pronalazak takođe se odnosi na postupak preveniranja ili tretiranja bolesti povezane sa sniženim PGRN nivoima u mozgu kod nekog pacijenta, koji obuhvata davanje efektivne doze antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji se vezuje za D-region sortilina. Ove bolesti uključuju i.a. FTD, ALS i TDP43 proteinopatije kao što je AD.
Kratak opis crteža
[0012] FIG.1 obezbeđuje pregled generisanja dodeljivanja regiona humanih antitela na osnovu regiona vezivanje sortilina, efekta na PGRN-vezujući i PGRN-nivoe i na unakrsno blokiranje između antitela.
[0013] Sortilin-vezivajuća antitela odabrana su i dodeljena regionima A-E na osnovu vezivanja za nasumične konstrukte kod kojih je sekvenca odgovarala tetraodon sortilin sekvenci unutar odabranih regionia proteina (Primer 1, FIG.2).
[0014] Odabrano jer 20 antitela koja inhibiraju Sortilin-PGRN vezivanje (kako je izmereno HTRF analizom) (videti Primer 10, FIG.5 i FIG.6).15 od ovih antitela bila su D-region antitela dok su 3 bila D+ antitela (FIG.6). Naknadna analiza unakrsnog blokiranja pokazuje da 18 D-region i D+ antitela (D+ antitela imaju različit obrazac vezivanja za nasumične konstrukte u odnosu na D-region antitela. Ipak D+ antitela ne mogu sa sigurnošću biti dodeljena vezujućem regionu A-E kako je gore navedeno, ali dele funkcionalne karakteristike (ćelijski ogledi, itd.) slične D-region antitelima), sva međusobno unakrsnoblokirana što podržava da su u interakciji sa istim regionom sortilina (Primer 9, FIG.7). Kada su ispitivana sortilin antitela drugih regionskih klasa u ogledu HTRF sortilin-PGRN vezivanje, samo dva od 41 antitela pokazala su inhibitorni efekat. Jedno od ova dva antitela su unakrsno-blokirana sa D i D+, ali su imala atipičan nasumični obrazac vezivanja konstrukta (D-nalik osim što je vezao hB01-05 region), dok drugo antitelo nije unakrsno-blokiralo sa drugim antitelima koja inhibiraju PGRN-sortilin vezivanje, čime se podržava zaključak da se vezuje za neki drugi region sortilina.
[0015] Ove opservacije pokazuju da antitela koja se vezuju za neku oblast u sortilinu definisanu D-regionom, imaju potencijal da inhibiraju sortilin-PGRN vezivanje.
[0016] 19 unakrsno-blokirajuća antitela, od kojih 18 su D-region i D+ antitela, povišavaju ekstracelularni PGRN u celularnom ogledu (Primer 13, FIG.10 i FIG.11). Tri od ovih antitela ispitana su in vivo i pronađeno je da povećavaju PGRN u plazmi (FIG.13, Primer 15).
[0017] Kutije na FIG.1 ilustruju faze u odabiru antitela. A-E odnosi se na regione kojima su respektivna sortilin-vezivajuća antitela dodeljena na osnovu nasumičnih konstrukata kako je opisano u Primeru 1 i SEQ ID NOs:171-179. "Drugo" se odnosi na antitelo koje ne može biti dodeljeno jednom regionu, i koje se može vezati na međuprostoru između A- i B-regiona. Tet se odnosi na antitela koja takođe vezuju tetraodon-sortilin.
[0018] Pored prikazanih humanih antitela, skup mišjih anti-humanih sortilin antitela generisan je i slično okarakterisan. Dva od ovih antitela dodeljena su D Regionu i pokazuju da se unakrsno blokiraju sa humanim D-region i D+ antitelima, da inhibiraju sortilin-PGRN vezivanje i da povećavaju ekstracelularni PGRN (videti FIG.4).
[0019] FIG.2 prikazuje dodeljivanje regiona antitela na osnovu vezivanja za nasumične konstrukte sortilina.
[0020] Panel A prikazuje linearnu ilustraciju nasumičnih konstrukata upotrebljenih za dodeljivanje regiona antitela kako je opisano u Primeru 1. Nasumični konstrukti sortilina generisani su na osnovu humane sortilin sekvence (SEQ ID NO:169) (sekcije prikazane sivom bojom) u kojoj su aminokiselinski ostaci razmenjeni sa odgovarajućom aminokiselinom iz tetraodon sortilin sekvencom (prikazano crnom bojom) (SEQ ID NO:173) (Primeri 1-3).
[0021] Panel B prikazuje prediktovanu strukturu nasumičnih konstrukata ilustrovana linearno u A. Tamni ostaci ukazuju na ostatke promenjene u odgovarajuću tetraodon sekvencu u nasumičnim konstruktima.
[0022] Panel C ilustruje obrazac vezivanja antitela dodeljenih klasama D-regiona i E regionska respektivno. A "+" ukazuje na vezivanje za dati nasumični konstrukt,a "-" ukazuje na nedostatak vezivanja. Na osnovu obrasca vezivanja za različite nasumične konstrukte, antitela se dodeljuju regionima. Dobijene regionske klase antitela indikovane su A-E. Za ilustrovane D i E regione antitela, oba vezuju humane sekvence (sve sivo) kako je ilustrovano putem "+" i ni jedan ne vezuje sekvencu tetraodona (sve crno) kako je ilustrovano putem "-", dok se antitelo E regiona vezuje za hB45678 nasumični konstrukt dok se antitelo D regiona ne vezuje što rezultuje lokalizacijom vezivanja kako je ilustrovano na Panelu A. Za antitela D regiona, vezivanje zapaženo je vezivanje za sledeće nasumične regione: hsort, hB06-10, B12390. Antitela se nisu vezala za hB01-05, B45678, tet. Za D+ antitela, zapaženo je vezivanje za sledeći nasumični region: hsort, B12390. Antitela se nisu vezala za hB01-05, hB06-10, B45678, tet. F obrazac vezivanja bio je sličan D obrascu vezivanja osim što nije zapaženedostatak vezivanja za hB06-10 u slučaju D+ antitela.
[0023] Antitela se nisu u potpunosti vezala za tetraodon sortilin protein, osim dva. Ta dva antitela koja su sposobna za vezivanje sa sekvencom tetraodona označena su sa "tet". "Drugo" se odnosi na antitelo koje ne može biti dodeljeno jednom regionu.
[0024] FIG.3 prikazuje afiniteti vezivanja humanog D-region i D+ antitela. Afiniteti vezivanja za nasumične konstrukte sortilina primenom bioLayer interferometrije primenom Octet 384RED kako je opisano u Primeru 8 (EC50, ng/ml). Bez senčenja ukazuje na EC50 od 0.1-10 ng/ml, svetlo sivo senčenje ukazuje na EC50 >10 ng/ml, a sivo senčenje ukazuje na nedostatak vezivanja (NB). Dodeljivanje regiona na osnovu obrazaca vezivanja prikazano je na FIG.2. Nasumični konstrukti prikazani su na FIG.2, a sekvence date u SEQ ID NOs:171-179. mAb = monoklonalno antitelo.
[0025] FIG.4 prikazuje afinitete vezivanja mišjih anti-humani antitela za nasumične konstrukte sortilina kakvi su obezbeđeni putem bioLayer interferometrije primenom Octet 384RED kako je opisano u Primeru 8 (EC50, ng/ml). Bez senčenja ukazuje na vezivanje, a sivo senčenje ukazuje na nedostatak vezivanja (NB). Dodeljivanje regiona na osnovu obrazaca vezivanja prikazano je na FIG.2.
[0026] FIG.5 prikazuje efekat antitela sortilina na sortilin PGRN vezivanje. D region sortilin humano monoklonalno (humAb) antitelo 45 (ispunjeni kružići) sprečava PGRN vezivanje za sortilin, nasuprot kontrolnom sortilin E region antitelu (ispunjeni trouglići), i IgG kontroli, IgG1-b12 (otvoreni trouglići) koji se ne mešaju sa vezivanjem. Vezivanje antitela određeno je merenjem izmeštanja PGRN vezivanja za sortilin primenom homogene vremenski razlučene fluorescecije (HTRF) (Primer 10). Evaluacije doznog odgovora antitela izvedena je sa deset koncentracija koje pokrivaju 50pM do 1µM u 3-strukoj krivoj razblaživanja. Arednosti polu-maksimalnih inhibitornih koncentracija (IC50) izračunate su pomoću nelinearne regresije primenom sigmoidnog koncentracionog odgovora (varijabilni nagib) u XLfit 4 (IDBS, UK).
[0027] FIG.6 Pregled efekta antitela na Sortilin-PGRN vezivanje određeno homogenom vremenski razlučenom fluorescentnom (HTRF) analizom kako je prikazano na FIG.5. Ukupno, ispitano je 62 antitela – pronađeno je da 15 D-region antitela i 3 D+ antitela inhibiraju sortilin-PGRN vezivanje i određene su IC50 vrednosti. Za dva dodatna antitela (E i drugi regioni), zapažen je inhibitorni efekat. Sva preostala antitela bila su negativna u testu. * antitelo previše slabo da odgovara dozno zavisnoj krivi.6% inhibicija na 1 µM. ** kontrolno (ctrl) antitelo previše slabo da odgovara dozno zavisnoj krivi.37% inhibicija na 1 µM.
[0028] Ove opservacije pokazuju da su antitela sortilina okarakterisana njihovim D-regionom ili D+ dodeljivanje inhibira vezivanje sortilina za PGRN direktno i sposobno su za inhibiranje sortilin-PGRN vezivanje.
[0029] FIG.7 prikazuje unakrsno blokiranje između antitela. Humana antitela i mišja antitela su sva ispitana u pojedinačnom eksperimentu u kojima je svako antitelo vezano za humani divlji tip (WT) Sortilin (FIG.7). Naknadno sva druga antitela ispitana su na vezivanje za izvedeni sortilin:antitelo kompleks (Primer 9). Odabrana 15 D-region i 3 D+ humana antitela (na osnovu njihovog efekta u HTRF PGRN-sortilin ogledu, (FIG.5 i FIG.6) i dva mišji D region antitela sva su inhibirala međusobno vezivanje za humani WT sortilin.
[0030] Antitela se nisu unakrsno blokirala sa antitelima označenim za druge regionske klase (kako je ilustrovano za A-region, E-region i tetraodon prepoznavajuća antitela pod brojem AbA1-x, AbE1-x i Abtet u tabeli respektivno) osim za jedno unakrsno blokiranje A region antitela, jedno antitelo sa nepoznatim dodeljivanjem regiona ("drugo") i delimično blokiranje za D+ antitelo 548. Ovi podaci podržavaju da su D-region i D+ antitela sposobna za inhibiranje sortilin-PGRN vezivanja u HTRF ogledu sva imala reakciju sa istim regionom u sortilinu.
[0031] Unakrsno blokiranje između antitela sortilina iz istih ili različitih regiona (regioni na osnovu vezivanja za nasumične konstrukte kako je ilustrovano na FIG.2) određeno je analiziranjem mešanja sa antitelo-sortilin vezivanjem. Vezivanje antitela za sortilin-ECD-His izmereno je BioLayer Interferometrijom primenom Octet 384RED (Primer 9). Leva kolona ukazuje na primarna (imobilizovana) antitela, a gornji red ukazuje na sekundarna antitela (antitela koja su ispitana proiv imobilizovanih antitela). Vezivanje i primarnih i sekundarnih antitela za sortilin-ECD-His rezultovalo bi vrednosti odgovora višim od 0.1 i ukazuje na to da su oba antitela vezana za različite regione proteina. Vrednosti odgovora manje od 0.1 prikazuje nedostatak vezivanja sekundarnog antitela i efektivno unakrsno blokiranje od strane imobilizovanog (primarnog) antitela, što sugeriše da se oba antitela vezuju za isti region sortilina.
[0032] FIG.8 prikazuje efekat D-region i D+ sortilin antitela na vezivanje selektivnog liganda malog molekula AF38469 za sortilin. Mesto vezivanja za AF38469 pokazalo se da je slično mestu vezivanja neurotenzina i okarakterisan rendgenskom kristalografijom (Schrøder et al. Bioorg Med Chem Lett.2014 Jan 1;24(1):177-80). Prijavljeno je da PGRN koji se vezuje za isto mesto (Lee et al. Hum Mol Genet.2013) antitela 45 i 68, vezivajući se za D-region, i D+ respektivno, ne inhibira vezivanje AF38469 za sortilin. Ovi podaci pokazuju da ova antitela imaju mesto vezivanja za sortilin različito od mesta vezivanja za AF38469. Prema tome, antitela 45 i 68 inhibiraju PGRN-sortilin vezivanje putem mesta vezivanja različitog od do sada pretpostavljenog PGRN mesta vezivanja u sortilinu.
[0033] FIG.9 Efekat antitela 45 i 68 na celularno vezivanje i endocitozu PGRN (Primer 12). Antitela 45 i 68 inhibiraju vezivanje i/ili endocitozu PGRN putem ćelija koje prekomerno eksprimiraju sortilin.
Dodavanje neurotenzina (NT, 10uM) slično redukuje vezivanje ili endocitozu PGRN kako se reflektuje u redukovanoj fluorescenciji kako se i očekuje dok izotip kontrolno antitelo B12 ne utiče na nivoe PGRN fluorescencije.
[0034] Antitela (100nM) koja se ispituju dodata su u S18 ćelije 30 min pre dodavanje rekombinantnog PGRN tokom 4 h. Ćelije su zatim fiksirane, obojene za PGRN i analizirane od strane Cellomics. PGRN fluorescencija je izmerena kao prosečna fluorescencija po ćeliji. Podaci su prikazani kao prosek ± SD. Podaci su analizirani jednosmernom Anova praćeno Dunnetovom analizom, sve grupe su upoređene sa PGRN. *p<0.05; **p<0.01
[0035] FIG.10 Ekstracelularni PGRN nivoi procenjeni su putem ELISA u podlozi od kultura HEK ćelije koje prekomerno eksprimiraju sortilin (S18). Sortilin D-region (45, 811) i D+ (68) antitela povišavaju PGRN nivoe, a sličan efekat sortilin ligand neurotenzina je zapažen, dok kontrolno antitelo B12 nije imalo efekat. Ove opservacije ukazuju da su D-region i D+ sortilin antitela sposobna za inhibiranje sortilinposredovanog klirensa PGRN čime se povećava ekstracelularni PGRN. Sva antitela ispitana su na 100nM. Neurotenzin je ispitan na 10uM. PGRN nivoi su normalizovani do kontrole. Podaci su prikazani kao prosek ± SD. Podaci su analizirani jednosmernom Anova praćeno Dunnetovom analizom, sve grupe su upoređene sa CTRL *p<0.05; **p<0.01. (Primer 13).
[0036] FIG.11 prikazuje efekat antitela na ekstracelularni PGRN u humanim HEK ćelijama koje prekomerno eksprimiraju sortilin izmereno sa ELISA kako je opisano u Primeru 13. Sva odabrana D-region antitela i tri odabrana D+ antitela povećala su ekstracelularni PGRN. PGRN nivoi su analizirani kako je gore opisano. PGRN nivoi su normalizovani do netretiranih kontrola i dati su u %. Dva antitela su gajena u mišjem umesto humanom sortilinu (1F2F4 & 5E1F6), a ostalo su humana antitela. Ab= monoklonalno antitelo.
[0037] FIG.12 (Gornji i donji paneli) prikazuje efekat antitela sortilina na ekstracelularni PGRN u neuronski diferenciranim iPSC ćelijama (Primer 14). Sortilin D-region antitelo 45 i D+ antitelo 68 povećavaju PGRN nivoe, dok kontrolna antitela B12 i anti-HEL nisu imala efekat.
[0038] Neuronski diferencirane iPSC ćelije zasejane su u ploču sa 96 bazenčića. Nedelju dana kasnije, antitela su dodata u ćelije. Podloga iz ćelija je sakupljana na 48 h ili 96 h i analizirana humanom PGRN ELISA (Enzo Life sciences), a uzorci su analizirani prema instrukcijama proizvođača. Sortilin humana antitela 45 i 68 povećala su PGRN nivoe u podlozi u obe vremenske tačke. Kontrolna izotip antitela B12 i Anti-Hel (negativna kontrola) nisu promenila ekstracelularni PGRN. Podaci su prikazani kao prosek ± SD. Podaci su analizirani jednosmernom Anova praćeno Dunnetovom analizom *p<0.05; **p<0.01 (Primer 14)
[0039] FIG.13 (Paneli A-C) prikazuje PGRN u nivoima plazme u humanim sortilin eksprimirajući knock in (KI) miševima tretiranim sa sortilin humanim antitelom (Primer 15). Sortilin antitelo 45 povećava PGRN u nivoima plazme dok kontrolno antitelo nije imalo efekat.
[0040] A Studija vremenskog toka: Povišeni nivoi PGRN u plazmi zapaženi su posle injekcije antitela 45 (D Region). Miševima su injektovani sa 45 (n=5) ili kontrolim (n=3) antitelom sc pri dozi od 10mg/kg. Svaka grupa je žrtvovana u različitim vremenskim tačkama. Kod miševa tretiranih kontrolnim antitelima (Anti-Hel) nije bilo promene u PGRN u plazmi, dok kod miševa tretiranih sa 45 bilo je postepeno povećavanje u nivoima PGRN. Čini se da je efekat bio u piku između 24 i 48h i postepeno opadao do dana 4-7.
[0041] B Subhronična studija: Miševi su tretirani dva puta nedeljno sa 10mg/kg 45 i kontrolnog antitela (Anti-Hel). Uzorci su sakupljani od krvi iz obraza svake nedelje. PGRN u plazmi povišen je u nedelji 1 i ostao na približno istom nivou kroz celu studiju u poređenju sa životinjama tretiranim sa kontrolnim antitelom (n=20).
[0042] C Studija doznog odgovora: Različite doze (4 doze: 0.1, 0.4, 2 i 10 mg/kg) sortilin (45) i kontrolnog antitela (Anti-Hel) su injektovane i miševi su žrtvovani na dan 2. PGRN u plazmi povišen je kod miševa tretiranih sa 45 (10 i 2mg/kg). niže doze (0.4 i 0.1 mg/kg) nisu imale efekat na PGRN u plazmi. Podaci su prikazani kao prosek ± SD. Podaci su analizirani svostranom Anova praćeno Bonferonijevom analizom *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 (Primer 15).
[0043] FIG.14 obezbeđuje ilustraciju regiona sortilina, na osnovu nasumičnih konstrukata sortilina, nametnute na prediktovanu sortilin konstrukciju. Ti regioni čine sekcije protein sortilina u kojima promena odabranih aminokiselinskih ostataka iz humane sekvence u tetraodon sekvencu inhibira vezivanje za antitela te klase regiona. Strelica ukazuje na prijavljeno mesto vezivanja visokog afiniteta za neurotenzin i PGRN (Quistgaard Nat Struct Mol Biol.2009 Jan;16(1):96-8, Lee et al, Hum Mol Genet.
2013).
[0044] FIG.15a (Paneli 1-6) i 15b (Paneli 1-3) Prikazuje reprezentativne peptide koji pokrivaju konformacioni epitop antitela 45, 68 i 811. Svi od prikazanih peptida pokazuju zaštitu od razmene veću od 0.5D, osim peptida 115-125. Peptid 115-125 je primer peptida koji nije pogođen prisustvom antitela 45, 68 ili 811, i time nije deo konformacionog vezujućeg epitopa (Primer 16)
[0045] FIG.16a (Paneli 1-6) i 16b (Paneli 1-3) prikazuje reprezentativne peptide koji pokrivaju konformacioni epitop antitela 30. Svi od prikazanih peptida pokazuju zaštitu od razmene veću od 0.5D, osim peptida 563-572, peptida 646-656 i peptida 704-714. Ova tri peptidi su primeri peptida koji nisu pogođeni prisustvom antitela 30, i time nisi deo konformacionog vezivanja (Primer 16)
[0046] FIG.17 prikazuje ilustraciju mikrodijalize za proceduru.
[0047] FIG.18a prikazuje vremenski kurs: efekat sistemskog davanja antitela 45 ili PBS (50 mg/kg, 10 ml/kg, s.c.) 24h pre eksperimenata mikrodijalize na nivoima za PRGN u hipokampusu slobodno kretajućih hSORT1 miševa tokom vremena (24h). (Primer 17)
[0048] FIG.18b prikazuje rezultate pulovane 24h dijalize: bazalni PRGN u hipokampusu slobodno kretajućih hSORT1 miševa u mab#45- i PBS-tretiranih miševa, 3.3 ± 0.3 ng/ml i 1.1 ± 0.1 ng/ml, respektivno, kako je određeno putem push-pull mikrodijalize (Primer 17).
[0049] FIG.18c predstavlja tabelu koja pokazuje PRGN nivoe (prosek ± SEM) u hipokampusu slobodno kretajućih hSORT1 miševa izmereno svaka 2h tokom 24h, 1d pošto su životinje tretirane sa mab#45 (n= 10) ili PBS (n=8) (Primer 17).
Detaljan opis pronalaska
[0050] Kako se ovde koristi, pojam "Sortilin" je sinonim za protein sortilina (identifikovan u na primer UniProt kao Q99523, 1 i 2). Aminokiselinska numeracija sortilina data je u odnosu na SEQ ID NO:169 kako je prikazano u nastavku, pri čemu je Met aminokiselina 1:
[0051] Kako se ovde koristi, pojam "D Region" namenjen je da se odnosi na region na sortilinu (što odgovara ostacima 523-610 iz SEQ ID NO:169) koji se sastoji od aminokiselina u SEQ ID NO:170 kako je prikazano u nastavku:
[0052] For D Region antitela, zapaženo je vezivanje za sledeće nasumične regione: hsort, hB06-10, B12390. Antitela se ne vezuju za hB01-05, B45678, tet. Za D+ antitela, zapaženo je vezivanje za sledeće nasumične regione: hsort, B12390. Antitela se ne vezuju za hB01-05, hB06-10, B45678, tet. Za antitela nazvana "D+" sličan obrazac vezivanja zapažen je kao za "D" region antitela osim što je zapažen nedostatak vezivanja za hB06-10 kod D+ antitela. I pored različitog obrasca vezivanja za nasumične konstrukte, D+ antitela dele funkcionalne karakteristike (ćelijski ogledi, itd.) sa D-region antitelima.
[0053] Određen D i D vezujuća antitela vezuju se za određeni region kako je definisano u SEQ ID NO:185, 186 ili 187. Tako, ovaj pronalazak odnosi se u određenim načinima ostvarivanja na antitela ili njihove antigen vezujuće fragmente koji se vezuju za D region sekvence iz SEQ ID 170, i unutar tog regiona SEQ ID NO:185, 186 ili 187. Vezivanjem, ova antitela ili antigen-vezujući fragmenti, utiču na PGRN nivoe i time se mogu primeniti za tretiranje bolesti koja je povezana sa PGRN, kao što je FTD, ALS i AD.
[0054] Daljom analizom vezivanja D i D+ antitela ovog pronalaska, delimično vezivanje za susedni region (A region) identifikovan je za neka antitela. Ovaj region odgovara aminokiselinama 78-254 iz SEQ ID NO:169, kako je prikazano na SEQ ID NO:180 i ispod:
Ovom regionu dodeljen je pojam "A region".
[0055] Tako, u određenim načinima ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitela ili njihove antigen vezujuće fragmente koji se vezuju za D region kako je prethodno definisano i u SEQ ID NO 170, 185, 186 ili 187, i koji dalje imaju afinitet za A region identifikovan u SEQ ID NO 180. Unutar A regiona određena antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti imaju afinitet za A region aminokiseline identifikovane u SEQ ID NO 181, 182, 183 ili 184.
[0056] PGRN (proepitelin, granulin-epitelin prekursor, PC-ćelija-izveden faktor rasta, akrogranin) enkodira 68.5 kDa izlučeni glikoprotein koji ima 7.5 ponavljanja manjih granulin motiva, koji se kreću od 6-25 kDa, koji mogu biti proteolitički pocepani iz prekursora PGRN (He, Z. & Bateman, A., J. Mol. Med.
81:600-6X2 (2003)). Kod ne-neuronskih ćelija, PGRN je povezan sa raznim pojavama, kao što je regulacija ćelijskog ciklusa i pokretljivosti ćelija (He, Z. & Bateman, A., J. Mol. Med.57:600-612 (2003); Monami, G., et ah, Cancer Res. (5(5:7103-7110 (2006)), zaceljivanje rana, zapaljenje (Zhu, J., et ah, Cell 777:867-878 (2002)), indukcija faktora rasta kao što je vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF) (Tangkeangsiπsin, W. & Serrero, G, Carcinogenesis 25.1587-1592 (2004)), i tumorogeneza (He, Z. & Bateman, A., J. Mol. Med.81:600- 612 (2003), Monami, G., et al., Cancer Res (5(5:7103-7110 (2006); Serrero, G., Biochem Biophys. Res. Commun.505-409-413 (2003), Lu, R & Serrero, G., Proc. Natl Acad Sa U.SA 98142-147 (2001); Liau, L M., et al., Cancer Res.60:1353-1360 (2000)).
[0057] PGRN mutacije rezultuju u haploinsuficijenciju (Baker, M., et ah, Nature 442:916-919 (2006); Cruts, M., et ah, Nature 442:920-924 (2006)) i poznato je da su prisutne u blizu 50% porodičnih FTD slučajeva, čineći PGRN mutaciju glavnim genetskim kontributorom FTD (Cruts, M. & Van Broeckhoven, C, Trends Genet.24:186-194 (2008); Le Ber, I., et ah, Brain 129:3051- 3065 (2006)).
Heterozigotni karakter gubljenja funckije PGRN mutacija implikuje da kod zdravih pojedinaca, PGRN ekspresija igra dozno zavisnu, kritičnu ulogu u zaštiti zdravih pojedinaca od razvoja FTD.
[0058] Pojam "antitelo" (Ab) u kontekstu ovog pronalaska se odnosi na imunoglobulinski molekul ili u skladu sa nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, fragment imunoglobulinskog molekula koji ima sposobnost da se vezuje za epitop molekula ("antigen"). Prirodna antitela tipično obuhvataju tetramer koji je obično sastavljen od najmanje dva teška (H) lanca i najmanje dva laka (L) lanca. Svaki teški lanac je sastavljen od varijabilnog domena teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantnog domena teškog lanca, obično sastavljen od tri domena (CH1, CH2 i CH3). Teški lanci mgu biti bilo kog izotipa, uključujući IgG (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 podtipovi), IgA (IgA1 i IgA2 podtipovi), IgM i IgE. Svaki laki lanac je sastavljen od varijabilnog domena lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantan domen lakog lanca (CL). Laki lanci uključuju kapa lance i lambda lance. Varijabilni domen teškog i lakog lanca tipično je odgovoran za prepoznavanje antigena, dok konstantan domen teškog i lakog lanca može posredovati vezivanje imunoglobulina za tkiva domaćina ili faktore, uključujući razne ćelije imunološkog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog komplementnog sistema. VH i VL domeni mogu dalje biti podeljeni na regione hipervarijabilnosti, pod nazivom "regioni koji određuju komplementarnost," koji su isprekidani domenima konzervativnije sekvence, nazvani "regioni okvira" (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR Domena i četiri FR Domena raspoređeni od amino-terminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Varijabilni domeni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji ulazi u interakciju sa antigenom. Od posebnog značaja su antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti koji su "izolovani" tako da postoje u fizičkoj sredini različitoj od jedno u kojoj se javljaju u prirodi ili su modifikovani tako da se razlikuju od prirodnog antitela u aminokiselinoj sekvenci.
[0059] Pojam "epitop" označava antigensku determinantu sposobnu za specifično vezivanje za antitelo. Epitopi se obično sastoje od površinskih grupacija molekula kao što su aminokiseline ili šećerni bočni lanci i obično imaju specifične tro dimenzionalne strukturalne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i linearni epitopi ističu se u tome da se vezivanje za prethodni, ali ne poslednji, uvek gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop može da obuhvata aminokiselinske ostatke direktno uključeni u vezivanje i druge aminokiselinske ostatke, koji nisu direktno uključeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci koji su efektivno blokirani od strane specifičnog antigen-vezujućeg peptida (drugim rečima, aminokiselinski ostatak je unutar otiska specifičnog antigen-vezujućeg peptida).
[0060] Kako se ovde koristi, pojam "antigen-vezujući fragment antitela" označava fragment, deo, region ili domen antitela (bez obzira na to kako je proizveden (npr., putem cepanja, rekombinantno, sintetički, itd.)) koji je sposoban za vezivanje za epitop, i tako pojam "antigen-vezujući" namenjen je da označi isto što i "epitop-vezujući" tako da, na primer, "antigen-vezujući fragment antitela" namenjen je da bude isti kao "epitop-vezujući fragment antitela". Antigen-vezujući fragment može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 CDR Domena takvog antitela i, iako sposoban za vezivanje za takav epitop, može da ispoljava specifičnost, afinitet ili selektivnost prema takvom epitopu da se razlikuje od takvog antitela. Poželjno, međutim, antigen-vezujući fragment sadržaće svih 6 CDR Domena takvog antitela. Antigen-vezujući fragment antitela može biti deo, ili obuhvatati, pojedinačni polipeptidni lanac (npr., scFv), ili može biti deo, ili obuhvatati, dva ili više polipeptidnih lanaca, od kojih svaki ima amino-terminus i karboksil terminus (npr., diatelo, Fab fragment, Fab2fragment, itd.). Fragmenti antitela koji ispoljavaju antigenvezujuću sposobnost mogu se dobiti, na primer, proteaza cepanjem netaknutog antitela. Poželjnije, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, prirodno kodirana odvojenim genima, ili polinukleotidi koji enkodiraju takve genske sekvence (npr., njihova enkodirajuća cDNK) mogu biti spojeni, primenom rekombinantnih postupaka, fleksibilni linker im omogućava da budu kao pojedinačni proteinski lanac u kojem su VL i VH regioni spojeni da obrazuju monovalente antigen-vezujuće molekule (poznati kao pojedinačni-lančani Fv (scFv); videti npr., Bird et al. , (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:5879-5883). Alternativno, upošljavanjem fleksibilng linkera koji je previše kratak (npr., manje od oko 9 ostataka) da bi se omogućilo da se VL i VH domeni pojedinačnog polipeptidnog lanca međusobno povežu, može se obrazovati bispecifično antitelo, diatelo, ili sličan molekul (u kojem su dva takva polipeptida lanca međusobno povezana radi obrazovanja bivalentnog antigen-vezujućeg molekula) (videti primera radi PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993) za opis diatela).
Primeri antigen-vezujućih fragmenata obuhvaćeni unutar ovog pronalaska uključuju (i) Fab' ili Fab fragment, monovalenti fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena, ili monovalentno antitelo kako je opisano u WO2007059782; (ii) F(ab')2 fragmente, bivalentne fragmente koji obuhvataju dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom na domenu šarke; (iii) Fd fragment koji se sastoji suštinski od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji suštinski od VL i VH domena, (v) dAb fragment (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), koji se sastoji suštinski od VH domena i takođe se zove domen antitela (Holt et al; Trends Biotechnol.2003 Nov;2i(ll) :484-90); (vi) kamelid ili nanotela (Revets et al; Expert Opin Biol Ther.2005 Jan;5_(I): I II-24) i (vii) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR). Dalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana odvojenim genima, mogu biti spojena, primenom rekombinantnih postupaka, sintetičkim linkerom koji im omogućava da budu pripremljeni kao pojedinačni proteinski lanac u kojem se VL i VH domeni uparuju da bi obrazovali monovalentne molekule (poznato kao jednolančana antitela ili jednolančani Fv (scFv), videti primera radi Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) i Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Ovi i drugi korisni fragmenti antitela u kontekstu ovog pronalaska opisani su u nastavku. Takođe se podrazumeva da pojam antitelo, ukoliko nije drugačije naznačeno, takođe uključuje antitelo-nalik polipeptide, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela, i fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost da se vezuju za antigen (antigen-vezujući fragmenti) obezbeđeni bilo kojom poznatom tehnikom, kao što je enzimatično cepanje, sinteza peptida, i rekombinantne tehnike. Antitelo kada je generisano može da poseduje bilo koji izotip. Kako se ovde koristi, "izotip" se odnosi na imunoglobulinsku klasu (primera radi IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koja je enkodirana putem gena konstantnog domena teškog lanca. Takvi fragmenti antitela se dobijaju primenom konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima iz ove oblasti; pogodni fragmenti sposobni za vezivanje za poželjan epitop mogu se lako izabrati za primenu na isti način kao netaknuto antitelo.
[0061] Pojam "bispecifično antitelo" se odnosi na antitelo koje sadrži dva nezavisna antigen-vezujuća fragmenta od kojih svaki targetira nezavisne mete. Ove mete mogu biti epitopi prisutni na različitim proteinima ili različit epitopi prisutni na istoj meti. Molekuli bispecifičnog antitela mogu se pripremiti primenom kompenzatorskim aminokislinskim promenama u konstantnim domenima HCs roditeljskih molekula monospecifičnog bivalentnog antitela. Dobijeno heterodimerno antitelo sadrži jedan Fabs dobijen od dva različita roditeljska monospecifična antitela. Aminokiselinske promene u Fc domenu vode ka povišenoj stabilnosti heterodimernog antitela sa bispecifičnosti koja je stabilna tokom vremena. (Ridgway et al., Protein Engineering 9, 617-621 (1996), Gunasekaran et al., JBC 285, 19637-1(2010), Moore et al., MAbs 3:6546-557 (2011), Strop et al., JMB 420, 204-219 (2012), Metz et al., Protein Engineering 25:10571-580 (2012), Labrijn et al., PNAS 110:113, 5145 -5150 (2013), Spreter Von Kreudenstein et al., MAbs 5:5646-654 (2013)). Bispecifična antitela takođe mogu da uključe molekule koji su generisani primenom ScFv fuzija. Dva monospecifična scfv zatim su nezavisno spojena u Fc domenima čime se omogućava da obrazuju stabilne heterodimere za generisanje pojedinačnog bispecifičnog molekula (Mabry et al., PEDS 23:3115-127 (2010). Bispecifični molekuli imaju sposobnosti dvostrukog vezivanja.
[0062] "Anti-sortilin antitelo" ili "Sortilin antitelo" (koji se ovde koriste naizmenično, zavisno od konteksta u kojem se pominje) je antitelo i njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuju specifično za sortilin, i naročito za sortilin D Region, SEQ ID NO:170. Anti-sortilin antitelo koje se vezuje za sortilin D Region obično se vezuje za konformacioni epitop ili linearni epitop od 3, 4, 5, 6 ili 7 uzastopne aminokiseline unutar D-Regiona (na primer SEQ ID NOs:185, 186 ili 187) sa afinitetom (IC50) na ili ispod 22 nM, kao što je između 22 nM i 1 nM, između 10 nM i 1 nM ili između 5 nM i 1 nM. U skladu sa nekim načinima ostvarivanja anti-Sortilin antitela takođe mogu da se vezuju za A region (SEQ ID NOs:180, 181, 182, 183 ili 184) iako je naglašeno da se smatra da se njihova glavna biološka funkcija postiže vezivanjem za D Region.
[0063] Identifikovano mesto vezivanja je zapravo jedinstveno kako je prikazano na primer vezivanjem selektivnog liganda malog molekula AF38469 za sortilin. Mesto vezivanja za AF38469 pokazalo se da je slično mestu vezivanja neurotenzina i okarakterisano je rendgenskom kristalografijom (Schrøder et al. Bioorg Med Chem Lett.2014 Jan 1;24(1):177-80). Prijavljeno je da se PGRN vezuje za isto mesto (Lee et al. Hum Mol Genet.2013). Antitela 45 i 68, vezivanje za D-region, i D+ respektivno, neinhibiraju vezivanje AF38469 za sortilin. Ovi podaci pokazuju da ova antitela imaju mesto vezivanja za sortilin različito od mesta vezivanja za AF38469 i neurotenzin. Prema tome, u određenim načinima ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, sposobno za konkretno vezivanja za sortilin i inhibiranje vezivanja PGRN za sortilin, ali koje vezivanje ne inhibira ili suštinski inhibira vezivanje neurotenzina ili AF38469 za sortilin. Ovo može biti prikazano primenom na primer izmeštanja vezivanja za sortilin primenom ogledom scintilacione blizine (SPA) (Primer 11). Jedan način za objašnjenje ovog otkrića je to da antitela, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, se vezuju za površine sortilina dok se mali molekuli poput neurotenzina vezuju unutar vezujućeg džepa.
[0064] Pojam "humano antitelo" (koje može biti skraćeno na "humAb" ili "HuMab"), kako se ovde koristi, namenjeno je da uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne domene izveden iz imunoglobulinih sekvenci humane klice. Humana antitela ovog pronalaska mogu da uključuju aminokiselinske ostatke koji nisu enkodirani imunoglobulinskim sekvencama humane klice (npr., mutacije uvedene nasumičnom ili po mestu-specifičnom mutagenezom in vitro ili tokom rearanžiranja gena ili somatskom mutacijom in vivo).
[0065] Pojmovi "monoklonalno antitelo" ili "kompozicija monoklonalnog antitela" kako se ovde koristi odnosi se na pripremu molekula antitela pojedinačne molekuske kompozicije. Konvencionalna kompozicija monoklonalnog antitela pokazuje pojedinačie nedostatak specifičnosti vezivanja i afinitet prema određenom epitopu. U određenim načinima ostvarivanja, monoklonalno antitelo može biti sastavljeno od više od jednog Fab domena čime se povećava specifičnost ka više od jedne mete.
Pojmovi "monoklonalno antitelo" ili "kompozicija monoklonalnog antitela" nisu namenjeni da se ograniče bilo kojim posebnim postupkom proizvodnje (npr., rekombinantno, transgeno, hibridom, itd.).
[0066] Antitela ovog pronalaska, i njihovi sortilin antigen-vezujući fragmenti poželjno će biti humani ili, na primer za mišja antitela (označena 1F2, 5E1), "humanizovana," određenije ako su uposlena za terapeutske svrhe. Pojam "humanizovano" odnosi se na molekul, generalno pripremljen primenom rekombinantnih tehnika, koji ima antigen-vezujuće mesto izvedeno iz imunoglobulina iz ne-humanih vrsta i preostalu imunoglobulinsku strukturu bazirana na strukturi i/ili sekvenci humanog imunoglobulina. Antigen-vezujuće mesto može da obuhvata ili varijabilne domene kompletno nehumanog antitela spojene sa humanim konstantnim domenima, ili samo regione koji određuju komplementarnost (CDRs) takvih varijabilnih domena graftovanih na pogodne humane regione okvira humanih varijabilnih domena. Ostaci okvira takvih humanizovanih molekula mogu biti divlji tip (npr., potpuno humani) ili mogu biti modifikovani da sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje se ne mogu naći kod humanog antitela čija sekvenca služi za bazu za humanizaciju. Humanizacija smanjuje ili eliminiše verovatnoću da se konstantan domen molekula ponaša kao imunogen u humanim pojedincima, ali ostaje mogućnost imunološkog odgovora na strani varijabilni domen (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). Još jedan pristup fokusira se ne samo na obezbeđivanje humano-izvedenih konstantnih domena, već i modifikujuće varijabilnih domena tako da ih preoblikuju što je moguće bliže humanom obliku. Poznato je da varijabilni domeni oba i teških i lakih lanaca sadrže tri regiona koja određuju komplementarnost (CDRs) koji variraju u odgovoru na antigene u pitanju i određuju sposobnost vezivanja, koji su flankirani od strane četiri regiona okvira (FRs) koji su relativno sačuvani u datim vrstama i koji navodno obezbeđuju skele za CDRs. Kada su nehumana antitela pripremljena u odnosu na određeni antigen, varijabilni domeni mogu biti "preoblikovani" ili "humanizovani" putem graftovanja CDRs izvedenih iz nehumanog antitela na FRs prisutnim u humanom antitelu koje modifikuje. Primena ovog pristupa na različitim antitelima prijavljena od strane Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) " Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323‑327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534‑1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773‑3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity," Human Antibodies Hybridoma 2:124‑134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181‑4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo," Bio/Technology 9:266‑271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869‑2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285‑4289; and Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity
For The CD33 Antigen," J. Immunol.148:1149‑1154. U nekim načinima ostvarivanja, humanizovana antitela čuvaju sve CDR sekvence (na primer, humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDRs iz mišjih antitela). U drugim načinima ostvarivanja, humanizovana antitela imaju jedan ili više CDRs (jedan, dva, tri, četiri, pet, šest) koja su izmenjena u odnosu na originalno antitelo, koja se takođe nazivaju jedan ili više CDRs "izvedeni iz" jednog ili više CDRs iz originalnog antitela. Sposobnost da se humanizuje antigen je dobro poznata (videti, npr., US Patente Br.5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,859,205; 6,407,213; 6,881,557).
[0067] Pojam "antitelo "XX" namenjen je da označi antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (na primer antitelo "5E1"), koji obuhvata ili se sastoji od lakog lanca, varijabilnog domena lakog lanca, ili varijabilnog domena lakog lanca CDR1-3, kako je definisano od strane njihove respektivne SEQ ID NO, i teškog lanca, varijabilnog domena teškog lanca, ili varijabilnog domena teškog lanca CDR1-3 kako je definisano od strane njihove respektivne SEQ ID NO. U određenim načinima ostvarivanja antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment definisani su njihovim celim varijabilnim domenom teškog lanca koji obuhvata kako je definisano od strane njihove SEQ ID NO i njihovim varijabilnim domenom lakog lanca kako je definisano od strane njihove SEQ ID NO.
[0068] Numeracija aminokiselinskih ostataka u ovom regionu je u skladu sa IMGT<®>, the international ImunoGeneTics information system<®>ili, Kabatom, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no.
91‑3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987). Canonical structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins. J. Mol. Biol.196, 901‑917.
[0069] Kako se ovde koristi, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment pomenuto je da se "specifično" vezuje za region još jednog molekula (tj., epitop) ako reaguje ili se poveže češće, brže, sa dužim trajanjem i/ili sa većim afinitetom ili avidnosšću sa epitopom u odnosu na alternativne epitope. U jednom načinu ostvarivanja, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, ovog pronalaska vezuju se najmanje 10-puta snažnije za svoju metu (Sortilin) nego za drugi molekul; poželjno najmanje 50-puta snažnije i poželjnije najmanje 100-puta snažnije. Poželjno, antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, vezuju se pod fiziološkim uslovima, na primer, in vivo. Tako, pod "konkretno vezivanje za sortilin", uključuje sposobnost antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, da se veže za sortilin sa takvom specifičnšću i/ili pod tim uslovima. Postupci pogodni za određivanje takvog vezivanja biće poznati stručnjacima iz ove oblasti, a primerni postupci opisani su u pratećim Primerima. Kako se ovde koristi, pojam "vezivanje" u kontekstu vezivanja antitela za preodređen antigen tipično se odnosi na vezivanje sa afinitetom koji odgovara KD od oko 10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10-
<9>M ili manje kada je određeno primera radi tehnologijom rezonance povrinskog plazmona (SPR) bilo u BIAcore<®>3000 ili T200 instrumentu primenom antigena kao liganda i antitela kao analita, i vezuje se za preodređeni antigen sa afinitetom koji odgovara KD koji je najmanje deseto-struko niži, kao što je najmanje 100 puta niži, primera radi najmanje 1,000 puta niži, kao što je najmanje 10,000 puta niži, primera radi najmanje 100,000 puta niži od njegovog afiniteta za vezivanje za ne-specifičan antigen (npr., BSA, casein) pored onog koji je preodređeni antigen ili blisko-povezan antigen. Količina sa kojom je afinitet niži zavisna je od KD antitela, to da kada su KD antitela veoma niska (to jest, antitelo je veoma specifično), tada količina sa kojom je afinitet za antigen niža od afiniteta za ne-specifičan antigen može biti najmanje 10,000 puta. Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na anti-sortilin antitela koja ispoljavaju afinitet vezivanja koji odgovara ili je ispod 22 nM, kao što je između 22 nM i 1 nM, između 10 nM i 1 nM ili između 5 nM i 1 nM, kako je određeno putem, primera radi, bioLayer interferometrijom primenom Octet 384RED (Primer 8).
[0070] U određenim načinima ostvarivanja ovog pronalaska ovaj pronalazak odnosi se na antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji može da uđe u kompeticiju sa humAb antitelom 45 ili humAb antitelom 68 radi vezivanja za sortilin. U još jednom načinu ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji može da uđe u kompeticiju sa antitelom 45 radi vezivanja za D Region sortilina kako je definisano u SEQ ID NO:170. Takva kompetitivna inhibicija vezivanja može biti određena primenom ogleda i postupaka dobro poznatih u struci, na primer primenom BIAcore<®>čipova sa imobiliziovanim humanim sortilinom i inkubacijom sa referentnim antitelom (kao što je antitelo "45" ili "68") sa i bez polipeptidom antitela koji se ispituje. Alternativno, može se primeniti pristup uparenog mapiranja, u kojem je referentno antitelo (kao što je antitelo "45" ili "68") imobiliziovano za površinu BIAcore<®>čipa, antigen humanog soritilina vezan je za imobiliziovano antitelo, a zatim se drugo antitelo ispituje na sposobnost jednovremenog vezivanja za humani sortilin (videti 'BIAcore<®>Assay Handbook', GE Healthcare Life Sciences, 29-0194-00 AA 05/2012.
[0071] Pojam "kd" (sek -1 ili 1/s), kako se ovde koristi, se odnosi na konstantu brzine disocijacije određene antitelo-antigen interakcije. Pomenuta vrednost takođe se naziva i koff vrednost.
[0072] Pojam "ka" (M-1 x sec-1 ili 1/Msec), kako se ovde koristi, se odnosi na konstantu brzine asocijacije određene interakcije antitelo-antigen.
[0073] Pojam "KD" (M), kako se ovde koristi, se odnosi na konstantu ravnoteže disocijacije određene interakcije antitelo-antigen i dobija se deljenjem kd sa ka.
[0074] Pojam "KA" (M-1 ili 1/M), kako se ovde koristi, se odnosi na konstanta ravnoteže asocijacije određene interakcije antitelo-antigen i dobija se deljenjem ka sa kd.
[0075] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koje ispoljava jednu ili više od sledećih osobina:
(i) afinitet vezivanja (KD) za sortilin od između 0.5-10 nM, kao što je 1-5 nM ili 1-2 nM;
(ii) sposobnost da redukuju i/ili inhibiraju PGRN vezivanje za sortilin;
(iii) sposobnost da redukuju i/ili inhibiraju klirens PGRN putem sortilin-eksprimirajućih ćelija;
(iv) sposobnost da redukuju i/ili inhibiraju endocitozu PGRN putem sortilin-eksprimirajućih ćelija; (v) sposobnost da povećavaju količinu i/ili koncentraciju PGRN u plazmi u humanim-sortilineksprimirajućim nok-in miševima.
[0076] Pojam "sposobnost da redukuju i/ili inhibiraju PGRN vezivanje za sortilin" uključuje antitelo kje ima sposobnost da inhibira vezivanje za PGRN pri IC50 manje od 50nM ali poželjno između 10nM i 0.2 nM primenom fluorescentnog testa sa vremenskim razlučivanjem (HTFR) opisan u Primeru 10.
[0077] Pojam "sposobnost da redukuju i/ili inhibiraju klirens PGRN putem sortilin-eksprimirajućih ćelija" uključuje sposobnost da povećavaju koncentraciju PGRN u podlozi za najmanje 25%, kao što je između 25% i 500%, između 25% i 400% ili između 25% i 200% kako je izmereno ELISA ogledom kako je opisano u Primeru 13.
[0078] "Sposobnost da redukuju i/ili inhibiraju endocitozu PGRN putem sortilin-eksprimirajućih ćelija" uključuje sposobnost redukovanja intracelularne koncentracije PGRN za najmanje 10% ali poželjno između 20 i 100 % kako je izmereno putem Cellomics baziranog ogleda kako je opisano u Primeru 12.
[0079] "Sposobnost da povećavaju količinu i/ili koncentraciju PGRN u plazmi u humanim-sortilineksprimirajućim nok-in miševima" uključuje sposobnost da povećavaju koncentraciju PGRN u plazmi za najmanje 25% ali poželjno između 50 i 500 procenata kako je izmereno ELISA ogledom kako je opisano u Primeru 15.
[0080] Predviđeno je da sposobnost da povećavaju PGRN u mozgu takođe može biti ispitana putem na primer mikrodijalize. Tako pod "sposobnost da povećavaju količinu i/ili koncentraciju PGRN u mozgu" uključuje sposobnost da povećavaju koncentraciju PGRN u mozgu za najmanje 25% ali poželjno između 50 i 500 procenata kako je izmereno mikrodijalizom.
[0081] Kod nekih antitela, samo deo CDR, određenije podskup CDR ostataka potreban za vezivanje, nazvan SDRs, potreban je za održavanje vezivanja u humanizovanom antitelu. CDR ostaci koji ne dolaze u kontakt sa relevantnim epitopom i koji nisu u SDRs mogu biti identifikovani na osnovu prethodnih studija (na primer ostaci H60-H65 u CDR H2 često nisu neophodni), iz regiona Kabat CDRs koji se nalazi izvan Čotijinih hipervarijabilnih petlji (videti, Kabat et al. (1992 SEQUENCES OF
PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, National Institutes of Health Publication No.91‑3242;
Chothia, C. et al. (1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins," J. Mol. Biol.196:901‑917), molekulskim modelovanjem i/ili empirijski, ili kako je opisano u Gonzales, N.R. et al. (2004) " SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity," Mol. Imunol.41:863-872. Kod takvih humanizovanoh antitela u položajima u kojima jedan ili više donor CDR ostataka je odsutan ili u kojem je ceo CDR izostavljen, aminokiselina koja zauzima taj položaj može biti neka aminokiselina koja zauzima taj odgovarajući položaj (Kabat numeracijom) u prihvatač antitelo sekvenci. Brojne takve supstitucije prihvatača za donor aminokiseline u CDRs koje se uključuju odražavaju ravnotežu suprotstavljenih razmatranja. Takve supstitucije potencijalno su poželjne u snižavanju broja mišjih aminokiselina u humanizovanom antitelu i konsekventno u snižavanju potencijalne imunogenosti. Međutim, supstitucije takođe mogu da izazovu promene afiniteta, a značajne redukcije u afinitetu je poželjno zaobići. Položaji za supstituciju unutar CDRs i aminokiselina koje se supstituišu takođe se može odabrati empirijski.
[0082] Činjeninca da pojedinačna aminokiselinska izmena CDR ostatka može dovesti do gubitka funkcionalnog vezivanja (Rudikoff, S. itd. (1982) " Single Amino Acid Substitution Altering Antigenbinding Specificity," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6):1979-1983) obezbeđuje sredstvo za sistematično identifikovanje funkcionalnih CDR sekvenci. U jednom poželjnom postupku za dobijanje takvih varijanti CDRs, polinukleotid koji enkodira CDR je mutagenizovan (na primer putem nasumičnih mutageneza ili putem postupka usmerenog na mestu (npr., polimeraza lancem-posredovana amplifikacija sa prajmerima koji enkodiraju mutirani lokus)) radi proizvodnje CDR koji ima supstituisani aminokiselinski ostatak. Poređenjem identiteta relevantnog ostatka u originalnoj (funkcionalnoj) CDR sekvenci sa identitetom supstituisane (ne-funkcionalne) varijantne CDR sekvence, BLOSUM62.iij supstitucija daje rezultat da ta supstitucija može biti identifikovana. BLOSUM sistem obezbeđuje matricu aminokiselinskih supstitucija krerirane analiziranjem baze podataka sekvenci za pouzdana poravnanja (Eddy, S.R. (2004) "Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?," Nature Biotech.
22(8):1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) " Amino acid substitution matrices from protein blocks," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:10915‑10919; Karlin, S. et al. (1990) "Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2264‑2268; Altschul, S.F. (1991) "Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective," J. Mol. Biol.219, 555‑565. Trenutno, najnaprednija BLOSUM baza podataka je BLOSUM62 baza podataka (BLOSUM62.iij). Tabela 1 predstavlja BLOSUM62.iij supstituciione skorove (što je viši skor to je konzervativnija supstitucija i tako je verovatnije da ta supstitucija neće uticati na funkciju). Ako antigen-vezujući fragment koji obuhvata dobijene CDR ne uspe da se veže za sortilin, na primer, tada se BLOSUM62.iij supstitucioni skor smatra nedovoljno konzervativnim, i bira se nova kandidat supstitucija i proizvodi koja imaju viši skor supstitucije. Tako, na primer, ako je originalni ostatak glutamat (E), a ne-funkcionalni supstitucioni ostatak histidin (H), tada će BLOSUM62.iij supstitucioni skor biti 0, i konzervativnije promene (kao što je to aspartat, asparagin, glutamin, ili lizin) su poželjne.
[0083] Ovaj pronalazak tako predviđa primenu nasumičnih mutageneza radi identifikovanja poboljšanih CDRs. U kontekstu ovog pronalaska, konzervativne supstitucije mogu biti definisane supstitucijama unutar klasa aminokiselina prikazane u jednoj ili više od sledećih tabela:
Klase aminokiselinskih ostataka za konzervativne supstitucije:
[0084]
Tabela 2
Alternativne klase supstitucije konzervativnih aminokiselinskih ostataka:
[0085]
Tablela 3
Alternativne fizičke i funkcionalne klasifikacije aminokiselinskih ostataka:
[0086]
Tabela 4
[0087] Konzervativnije supstitucipne grupacije uključuju: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizinarginin, alanin-valin, i asparagin-glutamin.
[0088] Dodatne grupe aminokiselina takođe mogu biti formulisane primenom principa opisanih u, npr., Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2d Ed.1993), W. H. Freeman and Company.
[0089] Tehnologija prikaza faga alternativno se može primeniti da poveća (ili snizi) CDR afinitet. Ova tehnologija, koja se naziva sazrevanje afiniteta, koristi mutagenezu ili "CDR hodanje", a ponovnoi-odabir koristi ciljani antigen ili njegov antigenski antigen-vezujući fragment radi identifikovanja antitela koja imaju CDRs koja se vezuju sa višim (ili nižim) afinitetom za antigen u poređenju sa inicijalnim ili roditeljskim antitelom (Videti, npr. Glaser et al. (1992) J. Imunology 149:3903). Mutageniziranjem celokupnih kodona umesto pojedinačnih nukleotida rezultuje u polu-randomizovanom repertoarom aminokiselinskih mutacija. Blioteke mogu biti konstruisane da se sastoje od pula varijantnih klonova od kojih se svaki razlikuje pojedinačnom aminokiselinskom izmenom na pojedinačnom CDR i koji sadrže varijante koje predstavljaju svaku moguću aminokiselinsku supstituciju za svaki CDR ostatak. Mutanti sa povišenim (ili sniženim) afinitetom vezivanja za antigen mogu biti skrinovani dovođenjem u kontakt imobilizovanih mutanata sa obeleženim antigenom. Bilo koji skrining postupak poznat u struci može se primeniti radi identifikovanja mutant antitela sa povišenim ili sniženim afinitetom ka antigenu (npr., ELISA) (Videti Wu et al.1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:6037; Yelton et al., 1995, J. Imunology 155:1994). CDR hodanje koje randomizira laki lanac moguće je primeniti (videti, Schier et al., 1996, J. Mol. Bio.263:551).
[0090] Postupci za postizanje takvog sazrevanja afiniteta opisani su u na primer: Krause, J.C. et al. (2011) "An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody," MBio.2(1) pii: e00345‑10. doi: 10.1128/mBio.00345‑10; Kuan, C.T. et al. (2010) "Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas," Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) "Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes," J. Mol. Biol.401(1):84‑96; Montgomery, D.L. et al.
(2009) "Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV‑1 gp41," MAbs 1(5):462‑474; Gustchina, E. et al. (2009) "Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naïve Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV‑1 Neutralization Potency And Breadth," Virology 393(1):112‑119; Finlay, W.J. et al. (2009) "Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions," J. Mol. Biol.388(3):541‑558; Bostrom, J. et al. (2009) "Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development," Methods Mol. Biol.525:353‑376; Steidl, S. et al. (2008) "In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification," Mol. Immunol.46(1):135‑144; and Barderas, R. et al. (2008) "Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26):9029‑9034.
[0091] Tako, sekvenca CDR varijanti obuhvaćenih antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata mogu se razlikovati od sekvence CDR roditeljskog antitela kroz supstitucije; primera radi supstituisan 4 aminokiselinski ostatak, 3 aminokiselinski ostatak, 2 aminokiselinski ostatak ili 1 od aminokiselinskih ostataka. U skladu sa načinom ostvarivanja ovog pronalaska dalje je predviđeno da aminokiseline u CDR regionima mogu biti supstituisane kroz konzervativne supstitucije, kako je definisano u 3 tabele u nastavku.
[0092] Pojam "transgena ne-humana životinja" odnosi se na ne-humanu životinju koja ima genom koji obuhvata jedan ili više transgena ili trans-hromozoma sa humanim teškim i/ili lakim lancem (bilo integrisan ili ne-integrisan u prirodnu genomsku DNK životinje) i koji je sposoban da eksprimira potpuno humana antitela. Na primer, transgeni miš može imati transgen humanog lakog lanca i trans-hromozom bilo humanog teškog lanca bilo humanog teškog lanca, tako da miš proizvodi humano anti-sortilin antitelo kada je imunizovan sa sortilin antigenom i/ili ćelijama koje eksprimiraju sortilin. Humani transgen teškog lanca može biti integrisan u hromozomsku DNK miša, u slučaju transgenih miševa, primera radi HuMAb miševa, kao što su HCo7 ili HCo12 miševi, ili humani transgen teškog lanca može biti održavan ekstra-hromozomski, kao što je u slučaju za trans-hromozomske KM miševe kako je opisano u WO02/43478. Takvi transgeni i trans-hromozomski miševi (ovde kolektivno označeni kao "transgeni miševi") sposobni su da proizvedu višestruke izotipove humanih monoklonalnih antitela za dati antigen (kao što je IgG, IgA, IgM, IgD i/ili IgE) podvrgavanjem V-D-J rekombinaciji i menjanju izotipova.
[0093] Transgena, nehumana životinja takođe može biti upotrebljena za proizvodnju antitela protiv specifičnog antigena, uvođenjem gena koji enkodiraju takvo specifično antitelo, na primer operativno povezujući gene za gen koji je eksprimiran u mleku te životinje.
[0094] Pojam "tretiranje" ili "tretirati" kako se ovde koristi označava ublažavanje, usporavanje, zaustavljanje ili peokretanje progresa ili težine bolesti ili poremećaja, ili ublažavanje, usporavanje, zaustavljanje ili peokretanje jednog ili više simptoma ili sporednih efekata takve bolesti ili poremećaja. U svrhe ovog pronalaska, "tretiranje" ili "tretirati" dalje označava pristup za dobijanje poboljšanih ili poželjnih kliničkih rezultata, gde "poboljšani ili poželjni klinički rezultati" uključuju, bez ograničenja, ublažavanje simptoma, umanjivanje stepena poremećaja ili bolesti, stabilizovanje (tj., nepogoršavanje) stanja bolesti ili poremećaja, odlaganje ili usporavanje progresije stanja bolesti ili poremećaja, ublažavanje ili zbrinjavanje stanja bolesti ili poremećaja, i remisija bolesti ili poremećaja, bilo delimična ili u potpunosti detektabilna ili nedetektabilna.
[0095] "Efektivna količina," kada se primenjuje na antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ovog pronalaska, odnosi se na neku količinu dovoljnu, u dozama i potrebnim vremenskim periodima, da postigne namenjeni biološki efekat ili poželjni terapeutski rezultat uključujući, bez ograničenja, kliničke rezultate. Fraza "terapeutski efektivna količina," kada se primenjuje na antitelo ili njegov antigenvezujući fragment ovog pronalaska, namenjena je da označi neku količinu antitela, ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta, koja je dovoljna da ublaži, zbrine, stabilizuje, preokrene, uspori, zaustavi ili odloži progresiju stanja poremećaja ili bolesti, ili simptoma poremećaja ili bolesti. U jednom načinu ostvarivanja, postupak ovog pronalaska obezbeđuje davanje antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, u kombinaciji sa drugim jedinjenjem. U takvim slučajevima, "efektivna količina" je količina kombinacije dovoljna da izazove namenjeni biološki efekat.
[0096] Terapeutski efektivna količina anti-sortilin antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta ovog pronalaska može varirati u skladu sa faktorima kao što je stanje bolesti, starost, pol, težina pojedinca, i sposobnost anti-sortilin antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta da izazove poželjni odgovor kod pojedinca. Terapeutski efektivna količina je takođe ona kod koje bilo koji toksični ili štetni efekti antitela ili dela antitela je nadmašen terapeutski benefitnim efektima.
[0097] Antitela su poželjno humano ili humanizovano antitelo.
[0098] Numeracija aminokiselinskih ostataka u ovom regionu je u skladu sa IMGT<®>, the international ImMunoGeneTics information system® ili, Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesmann, K. S. & Foeller, C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no.
91‑3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia, C. & Lesk, A. M. (1987). Canonical structures For The Hypervariable domains Of Immunoglobulins. J. Mol. Biol.196, 901‑917.
Antitelo 5E1:
[0099] U skladu sa tim, ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:1;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:2;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:3;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:4;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:5; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:6.
[0100] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:8 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:7.
Antitelo 1F2:
[0101] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:9;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:10;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:11;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:12;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:13; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:14.
[0102] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:16 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:15.
Antitelo 068:
[0103] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:17;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:18;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:19;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:20;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:21; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:22.
[0104] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:24 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:23.
Antitelo 1320:
[0105] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:25;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:26;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:27;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:28;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:29; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:30.
[0106] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:32 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:31.
Antitelo 93-05:
[0107] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:33;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:34;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:35;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:36;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:37; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:38.
[0108] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:40 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:39.
Antitelo 93-01:
[0109] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:41;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:42;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:43;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:44;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:45; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:46.
[0110] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:48 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:47.
Antitelo 924:
[0111] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:49;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:50;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:51;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:52;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:53; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:54.
[0112] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:56 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:55.
Antitelo 1276:
[0113] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:57;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:58;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:59;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:60;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:61; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:62.
[0114] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:64 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:63.
Antitelo 849:
[0115] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:65;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:66;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:67;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:68;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:69; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:70.
[0116] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:72 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:71.
Antitelo 531-02:
[0117] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:73;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:74;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:75;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:76;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:77; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:78.
[0118] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:80 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:79.
Antitelo 548-01:
[0119] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:81;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:82;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:83;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:84;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:85; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:86.
[0120] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:88 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:87.
Antitelo 548-02:
[0121] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:89;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:90;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:91;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:92;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:93; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:94.
[0122] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:96 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:95.
Antitelo 1289-02:
[0123] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:97;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:98;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:99;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:100;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:101; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:102.
[0124] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:104 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:103.
Antitelo 811-02:
[0125] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:105;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:106;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:107;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:108;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:109; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:110.
[0126] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:112 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:111.
Antitelo 566-01:
[0127] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:113;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:114;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:115;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:116;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:117; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:118.
[0128] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:120 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:119.
Antitelo 562:
[0129] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:121;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:122;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:123;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:124;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:125; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:126.
[0130] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:128 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:127.
Antitelo 193:
[0131] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:129;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:130;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:131;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:132;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:133; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:134.
[0132] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:136 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:135.
Antitelo 88:
[0133] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:137;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:138;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:139;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:140;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:141; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:142.
[0134] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:144 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:143.
Antitelo 045:
[0135] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:145;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:146;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:147;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:148;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:149; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:150.
[0136] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:152 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:151.
Antitelo 044:
[0137] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:153;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:154;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:155;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:156;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:157; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:158.
[0138] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:160 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:159.
Antitelo 002:
[0139] U skladu sa još jednim načinom ostvarivanja ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji obuhvata ili se sastoji od sledećeg:
(a) laki lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:161;
(b) laki lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:162;
(c) laki lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:163;
(d) teški lanac CDR1 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:164;
(e) teški lanac CDR2 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:165; i
(f) teški lanac CDR3 koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:166.
[0140] Poželjno, monoklonalno antitelo može da obuhvata ili da se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca od SEQ ID NO:168 i varijabilnog domena lakog lanca od SEQ ID NO:167.
[0141] Antitela prethodno pomenuta mogu, u skladu sa jednim načinom ostvarivanja, dalje da obuhvataju varijantu sa ne više od 4 aminokiselinskih razlika, ili ne više od 3 aminokiselinske razlike, ili ne više od 2 aminokiselinske razlike, ili ne više od 1 aminokiselinske razlike od pomenutih CDR1, CDR2, i/ili CDR3 (VH i/ili VL) sekvenci.
[0142] Dalje, antitela mogu biti u kompoziciji zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Antitela ovog pronalaska mogu se primeniti u terapiji. Određenije, antitela ovog pronalaska mogu se primeniti u tretiranju FTD ili ALS ili TDP43 proteinopatije kao što su Alchajmerove bolesti (AD).
[0143] Tretiranje predviđeno ovim pronalaskom može biti hronično i pacijent može biti tretiran najmanje 2 nedelje, kao što je najmanje 1 mec, 6, meseci, 1 godinu ili više.
[0144] Antitela ovog pronalaska mogu, na primer, biti monoklonalna antitela proizvedena od strane postupka hibridomom koji je prvo objašnjen od strane Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ili mogu biti monoklonalna antitela proizvedena rekombinantnom DNK ili drugim postupcima. Monoklonalna antitela takođe mogu biti izolovana iz biblioteke fagnih antitela primenom tehnika opisanih u, na primer, Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol.222, 581-597 (1991). Monoklonalna antitela mogu se dobiti iz bilo kog pogodnog izvora. Tako, na primer, monoklonalna antitela mogu se dobiti iz hibridoma pripremljenih iz ćelija mišjih B limfocita slezine dobijenih od miševa imunizovanih sa antigenom od interesa, primera radi, u obliku ćelija koje eksprimiraju antigen na površini, ili nukleinske kiseline koja enkodira antigen od interesa. Monoklonalna antitela se takođe mogu dobiti iz hibridoma izvedenih iz antitelo-eksprimirajućih ćelija imunizovanih ljudi ili ne-humanih sisara kao što su pacovi, zečevi, psi, ovce, koze, primati, itd.
[0145] U jednom načinu ostvarivanja, antitelo ovog pronalaska je humano antitelo. Humana monoklonalna antitela usmerena protiv sortilina mogu biti generisana primenom transgenih ili transhromozomskih miševa koji nose delove humanog imunog sistema pre nego mišjeg sistema. Takvi transgeni i trans-hromozomski miševi uključuju miševe koji su ovde označeni kao HuMAb miševi i KM miševi, respektivno.
[0146] HuMAb miš sadrži human imunoglobulinski genski minilokus koji enkodira neraspoređene humane imunoglobulinske sekvence teškog varijabilnog i konstantnog (µ i Y) i lakog varijabilnog i konstantnog (κ) lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje deaktiviraju endogene lokuse µ i K lanca (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). U skladu sa tim, miševi ispoljavaju redukovanu ekspresiju mišjih IgM ili K i u odgovoru na imunizaciju, uvedeni human transgeni teškog i lakog lanca, prolaze kroz promenu klasa i somatsku mutaciju radi generisanja humanih IgG, κ monoklonalnih antitela visokog afiniteta (Lonberg, N. et al. (1994), gore; recenzirano od strane Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49‑101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol.
13 65‑93 (1995) and Harding, F. and Lonberg, N., Ann. N. Y. Acad. Sci 764536‑546 (1995)). The preparation of HuMAb mice is opisan in detail in Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287‑6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647‑656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol.152, 2912‑2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579‑591 (1994), Fishwild,
D. et al., Nature Biotechnology 14, 845‑851 (1996). Videti takođe US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 and WO 01/09187.
[0147] HCo7, HCo12, HCo17 i HCo20 miševi imaju JKD prekid u svojim edogenim genima (kapa) lakog lanca (kako je opisano u Chen et al., EMBO J.12, 811-820 (1993)), CMD prekid svojim edogenim genima teškog lanca (kako je opisano u Primeru 1 iz WO 01/14424), i KCo5 humani kapa transgen lakog lanca (kako je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)). Dodatno, HCo7 miševi imaju HCo7 humani transgen teškog lanca (kako je opisano u US 5,770,429), HCo12 miševi imaju HCo12 humani transgen teškog lanca (kako je opisano u Primeru 2 iz WO 01/14424), HCo17 miševi imaju HCo17 humani transgen teškog lanca (kako je opisano u Primeru 2 iz WO 01/09187) i HCo20 miševi imaju HCo20 humani transgen teškog lanca. Dobijeni miševi eksprimiraju humane imunoglobulinske transgene teškog i kapa lakog lanca u homozigotnoj pozadini za prekid endogenog mišjeg locija teškog i kapa lakog lanca.
[0148] U KM mišjem soju, endogeni mišji gen kapa lakog lanca je homozigotno poremećen kako je opisano u Chen et al., EMBO J.12, 811-820 (1993), a endogeni mišji gen teškog lanca je homozigotno poremećen kako je opisano u Primeru 1 iz WO 01/09187. Mišji soj nosi humani transgen kapa lakog lanca, KCo5, kako je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Mišji soj takođe nosi humani transhromozom teškog lanca sastavljen od hromozoma 14 fragmenta hCF (SC20) kako je opisano u WO 02/43478. HCo12-Balb/c, HCo17-Balb/c i HCo20-Balb/c miševi mogu biti generisani ukršranjem HCo12, HCo17 i HCo20 sa KCo5[J/K](Balb) kako je opisano u WO 09/097006.
[0149] U KM mišjem soju, endogeni mišji gen kapa lakog lanca je homozigotno poremećen kako je opisano u Chen et al., EMBO J.12, 811-820 (1993) i endogeni mišji gen teškog lanca je homozigotno poremećen kako je opisano u Primeru 1 iz WO 01/09187. Mišji soj nosi humani transgen kapa lakog lanca, KCo5, kako je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Mišji soj takođe nosi humani trans-hromozom teškog lanca sastavljen od hromozom 14 antigen-vezujućeg fragmenta hCF (SC20) kako je opisano u WO 02/43478.
[0150] Splenociti iz ovih transgenih miševa mogu se primeniti za generisanje hibridoma koji luče humana monoklonalna antitela u skladu sa dobro poznatim tehnikama. Humana monoklonalna ili poliklonalna antitela ovog pronalaska, ili antitela ovog pronalaska koja potiču od neke druge vrste takođe mogu biti generisana transgenim generisanjem još jednog ne-humanog sisara ili biljke koja je transgena za imunoglobulinske sekvence teškog i lakog lanca od interesa i proizvodnjom antitela u obliku koji se može obnoviti odatle. U vezi sa transgenom proizvodnjom kod sisara, antitela mogu biti proizvedena u, i obnovljena iz, mleka koza, krava, ili drugih sisara. Videti primera radi US 5,827,690, US 5,756,687, US 5,750,172 i US 5,741,957.
[0151] Antitelo ovog pronalaska može biti bilo kog izotipa. Odabir izotipa tipično će biti vođen poželjnim efektorskim funkcijama, kao što je ADCC indukcija. Primerni izotipovi su IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. Bilo koji humani konstantan domen lakih lanaca, kapa ili lambda, mogu se primeniti. Ako je poželjno, klasa antisortilin antitela ovog pronalaska može se promeniti poznatim postupcima. Na primer, antitelo ovog pronalaska koje je originalno IgM može promeniti klasu u IgG antitelo ovog pronalaska. Dalje, tehnike promene klasa mogu se primeniti da konvertuju jednu IgG podklasu u drugu, primera radi iz IgGI u IgG2. Tako, efektorska funkcija antitela ovog pronalaska može se promeniti promenom izotipa u, npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ili IgM antitelo za različite terapeutske primene. U jednom načinu ostvarivanja antitelo ovog pronalaska je IgG1 antitelo, primera radi IgG1, κ. Pomenuto je da je antitelo određenog izotipa ukoliko je aminokiselinsku sekvencu najhomolognija tom izotipu, u odnosu na druge izotipove.
[0152] U jednom načinu ostvarivanja, antitelo ovog pronalaska je antitelo pune dužine, poželjno IgG antitelo, određenije IgG1, κ antitelo. U još jednom načinu ostvarivanja, antitelo ovog pronalaska je antigen-vezujući fragment antitela ili jednolančano antitelo.
[0153] Antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu se npr. dobiti antigen-vezujućom fragmentacijom primenom konvencionalnih tehnika, a antigen-vezujući fragmenti skrinovani za primenu na isti način kakav je ovde opisan za cela antitela. Na primer, F(ab')2 antigen-vezujući fragmenti mogu biti generisani tretiranjem antitela pepsinom. Dobijeni F(ab')2 antigen-vezujući fragment može biti tretiran radi redukovanja disulfidnih mostova radi proizvodnje Fab' antigen-vezujućih fragmenata. Fab antigen-vezujući fragmenti mogu se dobiti tretiranjem IgG antitela pomoću papaina; Fab' antigenvezujući fragmenti mogu se dobiti pepsin digestijom IgG antitela. F(ab') antigen-vezujući fragment takođe može biti proizveden vezivanjem Fab'-opisanog ispod putem tioetarske veze ili disulfidne veze. Fab' antigen-vezujući fragment je antigen-vezujući fragment antitela dobijen prekidanjem disulfidne veze domena šarke od F(ab')2. Fab'- antigen-vezujući fragment može se dobiti tretiranjem
F(ab')2antigen-vezujućeg fragmenta redukujućim agensom, kao što je ditiotreitol. Antigen-vezujući fragment antitela takođe može biti generisan ekspresijom nukleinskih kiselina koje enkodiraju takve antigen-vezujuće fragmente u rekombinantnim ćelijama (videti primera radi Evans et al., J. Imunol. Meth. 184, 123-38 (1995)). Na primer, himerni gen koji enkodira deo F(ab')2 antigen-vezujućeg fragmenta može da uključuje DNK sekvence koje enkodiraju CH1 domen i domen šarke H lanca, praćeno translacionim zaustavnim kodonom da bi se dobio takav skraćen molekul antigen-vezujućeg fragmenta antitela.
[0154] U jednom načinu ostvarivanja, anti-sortilin antitelo je monovalentno antitelo, poželjno monovalentno antitelo kako je opisano u WO2007059782 koje ima brisanje na regionu šarke. U skladu sa tim, u jednom načinu ostvarivanja, antitelo je monovalentno antitelo, pri čemu je pomenuto antisortilin antitelo konstruisano postupkom koji obuhvata : i) obezbeđivanje konstrukta nukleinske kiseline koji enkodira laki lanac pomenutog monovalentnog antitela, pri čemu pomenuti konstrukt obuhvata nukleotidnu sekvencu koja enkodira VL region odabranog antigen specifičnog anti-sortilin antitela i nukleotidnu sekvencu koja enkodira konstantan CL region od Ig, pri čemu su pomenuta nukleotidna sekvenca koja enkodira VL region odabranog antigen specifičnog antitela i pomenuta nukleotidna sekvenca koja enkodira CL region od Ig, međusobno opreativno povezana, i pri čemu, u slučaju IgG1 podtipa, nukleotidna sekvenca koja enkodira CL region je modifikovana tako da CL region ne sadrži bilo koju od aminokiselina sposobnih za formiranje disulfindnih veza ili kovalentnih veza sa drugim peptidima koji obuhvataju identičnu aminokiselinsku sekvencu CL regiona u prisustvu poliklonalnog humanog IgG ili kada se daje životinji ili čoveku; ii) obezbeđivanje konstrukta nukleinske kiseline koja enkodira teški lanac pomenutog monovalentnog antitela, pri čemu pomenuti konstrukt obuhvata nukleotidnu sekvencu koja enkodira VH region odabranog antigen specifičnog antitela i nukleotidnu sekvencu koja enkodira konstantan CH region humanog Ig, pri čemu je nukleotidna sekvenca koja enkodira CH region modifikovana tako da region koji odgovara regionu šarke and, što je zahtevano od strane Ig podtipa, drugi regioni CH regiona, kao što je CH3 region, ne obuhvataju bilo koji aminokiselinski ostatak koji učestvuje u formiranju disulfidnih veza ili kovalentnih ili stabilnih nekovalentnih unutrašnjih veza teških lanaca sa drugim peptidima koji obuhvataju identičnu aminokiselinsku sekvencu CH regiona humanog Ig u prisustvu poliklonalnog humanog IgG ili kada se daje životinji čoveku, pri čemu su pomenuta nukleotidna sekvenca koja enkodira VH region odabranog antigen specifičnog antitela i pomenuta nukleotidna sekvenca koja enkodira CH region pomenutog Ig međusobno operatvno povezane; iii) obezbeđivanje sistema za ekspresiju ćelija za proizvodnju pomenutog monovalentnog antitela; iv) proizvodnja pomenutog monovalentnog antitela koeksprimiranjem konstrukata nukleinskih kiselina iz (i) i (ii) u ćelijama sistema za ekspresiju ćelija iz (iii).
[0155] Slično, u jednom načinu ostvarivanja, anti-sortilin antitelo je monovalentno antitelo, koje obuhvata:
(i) varijabilni domen antitela ovog pronalaska kakav je ovde opisan ili antigen-vezujući deo pomenutog domena, i
(ii) CH domen imunoglobulina ili njegov domen koji obuhvata CH2 i CH3 domene, pri čemu je CH domen ili njegov domen modifikovan tako da domen odgovara domenu šarke a, ako imunoglobulin nije IgG4 podtipa, drugi domeni CH domena, kao što je CH3 domen, ne obuhvataju bilo koji aminokiselinski ostatak, koji su sposobni za obrazovanje disulfindnih veza sa identičnim CH domenom ili drugih kovalentnih ili stabilnih ne-kovalentnih unutrašnjih veza teškog lanca sa identičnim CH domenom u prisustvu poliklonalnog humanog IgG.
[0156] U daljem načinu ostvarivanja, teški lanac monovalentog antitela je modifikovan tako da je ceo region šarke obrisan.
[0157] U još jednom daljem načinu ostvarivanja, sekvenca monovalentog antitela je modifikovana tako da ne obuhvata bilo koje mesto prihvatanja za N-povezanu glikozilaciju.
[0158] Ovaj pronalazak takođe uključuje "Bispecifična Antitela," pri čemu je anti-sortilin vezujući region (npr., sortilin-vezujući region anti-sortilin monoklonalnog antitela) deo bivalentnog ili polivalentnog bispecifičnog mosta koji cilja više od jednog epitopa, (na primer drugi epitop može da obuhvata epitop aktivnog receptora transporta, tako da bi bispecifično antitelo ispoljilo poboljšanu transcitozu preko biološke barijere, kao što je krvno moždana barijera). Tako, u još jednom daljem načinu ostvarivanja, monovalentno Fab anti-sortilin antitela može se združiti dodatnom Fab ili scfv koji cilja različit protein za generisanje bispecifičnog antitela. Bispecifično antitelo može imati dvostruku funkciju, na primer terapeutsku funkciju koju prenosi anti-sortilin vezujući domen i transportnu funkciju koja se može vezati za receptorski molekul da bi se ojačao transfer kroz biološku barijeru, kao što je krvno moždana barijera.
[0159] Antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti ovog pronalaska takođe uključuju jednolančana antitela. Jednolančana antitela su peptidi u kojim su Fv domeni teškog i lakog lanca povezani. U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje jednolančano Fv (scFv) pri čemu su teški i laki lanci u Fv anti-sortilin antitela ovog pronalaska spojeni sa fleksibilnim peptidnim linkerom (tipično od oko 10, 12, 15 ili više aminokiselinskih ostataka) u pojedinačnom peptidnom lancu. Postupci proizvodnje takvih antitela su opisani u primera radi US 4,946,778, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269‑315 (1994), Bird et al., Science 242, 423‑426 (1988), Huston et al., PNAS USA 85, 5879‑5883 (1988) and McCafferty et al., Nature 348, 552‑554 (1990). Jednolančano antitelo može biti monovalentno, ako se koriste samo pojedinačni VH i VL, bivalentno, ako sse koriste dva VH i VL, ili polivalentno, ako se koristi više od dva VH i VL.
[0160] Antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti opisani ovde mogu biti modifikovani inkluzijom bilo kog pogodnog broja modifikovanih aminokiselina i/ili asocijacija sa takvim konjugovanim supstituentima. Pogodnost u ovom kontekstu je generalno određeno sposobnošću da najmanje suštinski zadrži sortilin selektivnost i/ili sortilin specifičnost povezanu sa ne-derivatizovanim roditeljskim anti-sortilin antitelom. Inkluzija jednog ili više modifikovanih aminokiselina može biti akorisno u, na primer, povećavanju polu-života polipeptida u serumu, redukovanje antigenosti polipeptida, ili povećavanje stabilnosti polipeptida tokom skladištenja. Aminokiselina(e) su modifikovane, na primer, ko-translaciono ili post-translaciono tokom rekombinantne proizvodnje (npr., N-povezana glikozilacija na N-X-S/T motivima tokom ekspresije u ćelijama sisara) ili modifikovane sintetičkim putem. Neograničavajući primeri modifikovane aminokiselina uključuje glikozilovanu aminokiselinu, sulfatisanu aminokiselinu, prenilovanu (npr., farnezilovanu, geranil-geranilovanu) aminokiselinu, acetilovanu aminokiselinu, acilovanu aminokiselinu, PEGilovanu aminokiselinu, biotinilovanu aminokiselinu, karboksilovanu aminokiselinu, fosforilovanu aminokiselinu, i slično. Reference adekvatne da vode stručnjaka u modifikaciji aminokiselina svuda su po literaturi. Primerni protokoli mogu se naći kod Walker (1998) Protein Protocols On CD-Rom, Humane Press, Totowa, NJ. Modifikovana aminokiselina može, primera radi, biti odabrana od glikozilovane aminokiseline, PEGilovane aminokiseline, farnezilovane aminokiseline, acetilovane aminokiseline, biotinilovane aminokiseline, aminokiseline konjugovane za lipidni ostatak, ili aminokiseline konjugovane za organski agens derivatizacije.
[0161] Antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti ovog pronalaska, takođe mogu biti hemijski modifikovani kovalentnom konjugacijom za polimer zbog primera radi povećavanja njihovog polu-života cirkulisanja. Primerni polimeri, i postupci za njihovo pričvršćivanje za peptide, prikazani su primera radi u US 4,766,106; US 4,179,337; US 4,495,285 i US 4,609,546. Dodatni ilustrativni polimeri uključuju polioksietilovane poliole i polietilen glikol (PEG) (npr., PEG molekulske mase od između oko 1,000 i oko 40,000, kao što je između oko 2,000 i oko 20,000, npr., oko 3,000-12,000 g/mol).
[0162] Antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti ovog pronalaska mogu se dalje primeniti u dijagnostičkom postupku ili kao ligand za dijagnostičli snimanje.
[0163] U jednom načinu ostvarivanja, obezbeđena su antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti ovog pronalaska koji obuhvataju jedan ili više radioobeleženih aminokiselina. Radioobeleženo anti-sortilin antitelo može se primeniti i za dijagnostičke i za terapeutske svrhe (konjugacija za radioobeležene molekule je još jedna moguća osobina). Ne-ograničavajući primeri takvih obeležja uključuju, bez ograničenja bizmut (<213>Bi), ugljenik (<11>C,<13>C,<14>C), hrom (<51>Cr), kobalt (<57>Co,<80>Co), bakar (<64>Cu), disprozijum (<165>Dy), erbijum (<169>Er), fluor (<18>F), gadolinijum (<153>Gd,<159>Gd), galijum (<68>Ga,<67>Ga), germanijum (<68>Ge), zlato (<198>Au), holmijum (<166>Ho), vodonik (<3>H), indijum (<111>In,<112>In,<113>In,<115>In), jod (<121>I,<123>I,<125>I,<131>I), iridijum (<192>Ir), železo (<59>Fe), kripton (<81m>Kr), lantanijum (<140>La), lutelijum (<177>Lu), mangan (<54>Mn), molibden (<99>Mo), azot (<13>N,<15>N), kiseonik (<15>O), paladijum (<103>Pd), fosfor (<32>P), kalijum (<42>K), prazeodimijum (<142>Pr), prometijum (<149>Pm), renijum (<186>Re,<188>Re), rodijum (<105>Rh), rubidijum (<81>Rb,<82>Rb), rutenijum (<82>Ru,<97>Ru), samarijum (<153>Sm), skandijum (<47>Sc), selen (<76>Se), natrijum (<24>Na), strontijum (<85>Sr,<89>Sr,<92>Sr), sumpor (<35>S), tehnecijum (<99>Tc), talijum (<201>TI), kalaj (<113>Sn,<117>Sn), ksenon (<133>Xe), iterbijum (<169>Yb,<175>Yb,<177>Yb), itrijum (<90>Y) i cnk (<65>Zn). Postupci za pripremanje radioobeleženih aminokiselina i povezanih peptidnih derivata poznati su u struci (videti primera radi Junghans et al., in Cancer Chemdrugoapy and Bidrugoapy 655-686 (2. izdanje, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) i US 4,681,581, US 4,735,210, US 5,101,827, US 5,102,990 (US RE35,500), US 5,648,471 i US 5,697,902. Na primer, a radioizotop može biti konjugovan hloramin T postupkom (Lindegren, S. et al. (1998) "Chloramine-T In High-Specific-Activity Radioiodination Of Antibodies Using N-Succinimidyl‑3‑(Trimetilstannyl)Benzoate As An Intermediate," Nucl. Med. Biol.25(7):659‑665; Kurth, M. et al. (1993) "Site-Specific Conjugation Of A Radioiodinated Phenetilamine Derivative To A Monoclonal Antibody Rezultati In Increased Radioactivity Localization In Tumor," J. Med. Chem.
36(9):1255‑1261; Rea, D.W. et al. (1990) "Site-specifically radioiodinated antibody for targeting tumors," Cancer Res.50(3 Suppl):857s‑861s).
[0164] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje anti-sortilin antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente koji su detektabilno obeleženi primenom fluorescentnog obeležja (kao što je helat retkih zemalja (npr., a europijum helat)), fluorescein-vrsta obeležja (npr., fluorescein, fluorescein izotiocijanat, 5-karboksifluorescein, 6-karboksi fluorescein, dihlorotriazinilamin fluorescein), rodamin-vrsta obeležja (npr., ALEXA FLUOR<®>568 (Invitrogen), TAMRA<®>ili dansil hlorid), VIVOTAG 680 XL FLUOROCHROME<™>(Perkin Elmer), fikoeritrin; umbeliferon, Lisamin; cijanin; fikoeritrin, Teksas crvena, BODIPY FL-SE<®>(Invitrogen) ili neki njihov analog, od kojih su svi pogodni za optičku detekciju.
Hemiluminescentna obeležja mogu se primeniti (npr., luminol, luciferaza, luciferin, i ekvorin). Takva dijagnoza i detekcija takođe se mogu postići udruživanjem dijagnostičkog molekula ovog pronalaska sa detektabilnim supstancama uključujući, bez ograničenja, različite enzime, enzime uključujući, ali ne ograničavajući se na, peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu, ili komplekse protetičkih grupa kao što je, bez ograničenja, streptavidin/biotin i avidin/biotin.
[0165] Hemiluminescentna obeležja mogu se primeniti (npr., luminol, luciferaza, luciferin, i ekvorin). Takva dijagnoza i detekcija takođe se mogu postići udruživanjem dijagnostičkog molekula ovog pronalaska sa detektabilnim supstancama uključujući, bez ograničenja, različite enzime, enzime uključujući, ali ne ograničavajući se na, peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu, ili komplekse protetičkih grupa kao što je, bez ograničenja, streptavidin/biotin i avidin/biotin. Paramagnetna obeležja takođe mogu biti uposlena, a poželjno se detektuju primenom Pozitronske emisione tomografije (PET) ili Kompjuterizovanom tomografijom sa jednom fotonskom emisijom (SPECT). Takva paramagnetna obeležja uključuju, bez ograničenja jedinjenja koja sadrže paramagnetne jone Aluminjuma (Al), Barijuma (Ba), Kalcijuma (Ca), Cerijuma (Ce), Disprozijuma (Dy), Erbijuma (Er), Europijuma (Eu), Gandolinijuma (Gd), Holmijuma (Ho), Iridijuma (Ir), Litijuma (Li), Magnezijuma (Mg), Mangana (Mn), Molibdena (M), Neodimijuma (Nd), Osmijuma (Os), Kiseonika (O), Paladijuma (Pd), Platine (Pt), Rodijuma (Rh), Rutenijuma (Ru), Samarijuma (Sm), Natrijuma (Na), Strontijuma (Sr), Terbijuma (Tb), Tulijuma (Tm), Kalaja (Sn), Titanijuma (Ti), Volframa (W), i Cirkonijuma (Zi), a određenije, Co<+2>, CR<+2>, Cr<+3>, Cu<+2>, Fe<+2>, Fe<+3>, Ga<+3>, Mn<+3>, Ni<+2>, Ti<+3>, V<+3>, i V<+4>, metale koji emituju pozitrone primenom raznih pozitronskih emisionih tomografija, i neradioaktivne paramagnetne metalne jone.
[0166] Tako u jednom načinu ostvarivanja anti-sortilin antitelo ili njegov sortilin-vezujući fragment prema ovom pronalasku, može biti obeležen fluorescentnim obeležjem, hemiluminescentnim obeležjem, paramagnetnim obeležjem, radioizotopnim obeležjem ili enzimskim obekežjem. Obeleženo antitelo fragmenta može se primeniti u detektovanju ili merenju prisustva ili količine pomenutog sortilina u mozgu nekog subjekta. Ovaj postupak može da obuhvata detekciju ili merenje in vivo snimanja anti-sortilin antitela ili sortilin-vezujućeg fragmenta vezanog za pomenuti sortilin i može da obuhvata ex vivo snimanje pomenutog anti-sortilin antitela ili sortilin-vezujućeg fragmenta vezanog za takav sortilin.
[0167] U daljem aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na ekspresioni vektor koji enkodira jedan ili više polipeptidnih lanaca antitela ovog pronalaska ili ngov antigen-vezujući-domen. Takvi ekspresioni vektori mogu se primeniti za rekombinantnu proizvodnju antitela i antigen-vezujućig fragmenata ovog pronalaska.
[0168] Ekspresioni vektor u kontekstu ovog pronalaska može biti bilo koji pogodni DNK ili RNK vektor, uključujući hromozomski, ne-hromozomski, i sintetičke vektore nukleinske kiseline (sekvenca nukleinske kiseline koja obuhvata pogodni set elemenata za kontrolu ekspresije). Primeri takvih vektora uključuju derivate SV40, bakterijske plazmide, fagnu DNK, bakulovirus, plazmide kvasca, vektore izvedene iz kombinacija plazmida i fagne DNK, i vektore virusne nukleinske kiseline (RNK ili DNK). U jednom načinu ostvarivanja, anti-sortilin antitelo-enkodirajuća nukleinska kiselina je sastavljena u golom DNK ili RNK vektoru, uključujući, na primer, linearno ekspresioni element (kako je opisano u, primera radi, Sykes and Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)), kompaktni vektor nukleinske kiseline (kako je opisano u primera radi US 6,077,835 i/ili WO 00/70087), plazmidni vektor kao što je pBR322, pUC 19/18, ili pUC 118/119, "patuljasti" vektor nukleinske kiseline minimalne veličine (kako je opisano u, primera radi, Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), ili kao istaloženi konstrukt vektora nukleinske kiseline, kao što je CaPO4-istaloženi konstrukt (kako je opisano u, primera radi, WO
00/46147, Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Ćelija 14, 725 (1978), i Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 2, 603 (1981)). Takvi vektori nukleinske kiseline i njihova primena dobro su poznati u struci (videti primera radi US 5,589,466 i US 5,973,972).
[0169] U jednom načinu ostvarivanja, vektor je pogodan za ekspresiju anti-sortilin antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata u bakterijskoj ćeliji. Primeri takvih vektora uključuju ekspresione vektore kao što je BlueScript (Stratagene), pIN vektori (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), pET vektori (Novagen, Madison, WI) i slično).
[0170] Ekspresioni vektor mogu takođe ili alternativno da budu vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca. Bilo koji vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca može se primeniti . Pogodni vektori uključuju, na primer, vektore koji obuhvataju konstituitivne ili inducibilne promotere kao što je alfa faktor, alkohol oksidaza i PGH (obrađeno u: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987), Mattanovich, D. et al. Methods Mol. Biol.824, 329-358 (2012), Celik, E. et al. Biotechnol. Adv.30(5), 1108-1118 (2012), Li, P. et al. Appl. Biochem. Biotechnol.142(2), 105-124 (2007), Böer, E. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol.77(3), 513-523 (2007), van der Vaart, J.M. Methods Mol. Biol.178, 359-366 (2002), and Holliger, P. Methods Mol. Biol.178, 349-357 (2002)).
[0171] U ekspresionim vektorima ovog pronalaska, anti-sortilin antitelo-enkodirajuće nukleinske kiseline mogu da obuhvataju ili da budu povezani sa bilo kojim pogodnim promoterom, pojačivačem, i drugim elementima koji pospešuju ekspresiju. Primeri takvih elemenata uključuju snažne promotere ekspresije (npr., humani CMV IE promoter/osnaživač kao i RSV, SV40, SL3-3, MMTV, i HIV LTR promoteri), efektivne poli (A) terminacione sekvence, porekla replikacije za proizvodnju plazmida u E. coli, gen rezistentan na antibiotik kao selektabilan marker, i/ili pogodno mesto za kloniranje (npr., polilinker). Nukleinske kiseline mogu takođe da obuhvataju inducibilni promoter nasuprot konstitutivnom promoteru kao što je CMV IE (stručnjaku iz ove oblasto je jasno da ovi pojmovi zapravo opisuju stepen genske ekspresije pod određenim uslovima).
[0172] U čak daljem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na rekombinantnu eukariotsku ili prokariotsku ćeliju domaćin, kao što je transfektom, koji proizvodi antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ovog pronalaska kako je ovde definisano ili bispecifičan molekul ovog pronalaska kakav je ovde definisan. Primeri ćelija domaćina uključuju kvasac, bakteriju, i ćelije sisara, kao što su CHO ili HEK ćelije. Na primer, u jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje ćeliju koja obuhvata nukleinsku kiselinu stabilno integrisanu u celularni genom koji obuhvata sekvencu koja kodira ekspresiju antisortilin antitela ovog pronalaska ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. U još jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje ćeliju koji obuhvata ne-integrisanu nukleinsku kiselinu, kao što je plazmid, kozmid, fagamid, ili linearno ekspresioni element, koji obuhvata sekvencu koja kodira ekspresiju anti-sortilin antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta ovog pronalaska.
[0173] U daljem aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na postupak za proizvodnuju anti-sortilin antitela ovog pronalaska, pri čemu pomenut postupak obuhvata faze a) uzgajanja hibridoma ili ćelije domaćina ovog pronalaska kakvi su ovde opisani, i b) prečišćavanje antitela ovog pronalaska od podloge sa kulturama.
[0174] U jednom načinu ostvarivanja, ovaj se pronalazak odnosi na pripravka koji, kao što se takav termin koristi ovde, obuhvata anti-sortilin antitelo kako je ovde definisano, i koji je suštinski bez prirodno-javljajućih antitela koja nisu sposobna za vezivanje za sortilin ili koja materijalno ne menjaju anti-sortilin funkcionalnost pripravka. Tako, takav pripravak ne obuhvata prirodno-javljajući serum, ili prečišćen derivat takvog seruma, koji obuhvata mešavinu anti-sortilin antitela i još jednog antitela koje ne menja funkcionalnost anti-sortilin antitela pripravka, pri čemu takva funkcionalnost predstavlja:
(i) afinitet vezivanja (KD) za sortilin;
(ii) sposobnost da redukuju i/ili inhibiraju PGRN vezivanje za sortilin;
(iii) sposobnost da redukuju i/ili inhibiraju klirens PGRN putem sortilin-eksprimirajućih ćelija; (iv) sposobnost da redukuju i/ili inhibiraju endocitozu PGRN putem sortilin-eksprimirajućih ćelija; (v) sposobnost da povećavaju količinu i/ili koncentraciju PGRN u plazmi u humanim-sortilineksprimirajućim nok-in miševima; sposobnost da povećavaju količinu i/ili koncentraciju PGRN u mozgu i/ili
(vi) sposobnost, kada se daje hronično, da obezbede tretiranje frontotemporalne demencije (FTD) i/ili amiotrofične lateralne skleroze (ALS).
[0175] Ovaj pronalazak određenije odnosi se na pripreme takvog anti-sortilin antitela koje ima strukturalnu promenu u svojoj aminokiselinskoj sekvenci (u bilo kojim svojim CDRs, varijabilnim domenima, ostacima okvira i/ili konstantnim domenima) u odnosu na strukturu prirodno-javljajućeg anti-sortilin antitela, pri čemu pomenuta strukturalna promena izaziva monoklonalno antitelo antisortilin antitela da eksprimira značajno izmenjenu funkcionalnost (tj., više od 20% razlike, više od 40% razlike, više od 60% razlike, više od 80% razlike, više od 100% razlike, više od 150% razlike, više od 2-struke razlike, više od 4-struke razlike, više od 5-struke razlike, ili više od 10-struke razlike u funckionalnosti) u odnosu na funckionalnost pokazana od strane pomenutog prirodno-javljajućeg antisortilin antitela; pri čemu takva funckionalnost predstavlja:
(i) afinitet vezivanja (KD) za sortilin;
(ii) sposobnost da redukuju i/ili inhibiraju PGRN vezivanje za sortilin;
(iii) sposobnost da redukuju i/ili inhibiraju klirens PGRN putem sortilin-eksprimirajućih ćelija; (iv) sposobnost da redukuju i/ili inhibiraju endocitozu PGRN putem sortilin-eksprimirajućih ćelija;
(vi) sposobnost da povećavaju količinu i/ili koncentraciju PGRN u plazmi u humanim-sortilineksprimirajućim nok-in miševima;
(vii) sposobnost da povećavaju količinu i/ili koncentraciju PGRN u mozgu i/ili
(vi) sposobnost, kada se daje hronično, da obezbede tretiranje frontotemporalne demencije (FTD), amiotrofične lateralne skleroze (ALS) i/ili Alchajmerove bolesti (AD).
naročito pri čemu je takva izmenjena funckionalnost rezultat strukturalne promene i takva je neodvojiva od njega.
[0176] Pojam "suštinski bez" prirodno-javljajućih antitela odnosi se na potpuno odsustvo takvih prirodno-javljajućih antitela u takvom pripravku, ili inkluzije koncentracije takvih prirodno-javljajućih antitela u takvom pripravku koji materijalno ne utiče na sortilin-vezujuće osobine pripravka. Za antitelo se kaže da je "izolovano" ako nema prirodno-javljajući kontradeo ili je odvojeno ili prečišćeno od komponenti koje ga prirodno prate.
[0177] Pojam "prirodno-javljajuća antitela," kada se odnosi na takve pripravke, odnosi se na antitela (uključujući prirodno-javljajuća autoantitela) stvorena unutar živih pojedinaca ili drugih životinja, kao prirodna posledica funkcionisanja njihovih imunih sistema.
[0178] Tako, pripravci ovog pronalaska ne isključuju, i zaista eksplicitno obuhvataju, takve pripravke koji sadrže anti-sortilin antitelo i namerno dodato dodatno antitelo sposobno za vezivanje za epitop koji nije zaposet sortilinom. Takvi pripravci određenije uključuju njihove načine ostvarivanja pri čemu taj pripravak ispoljava pojačanu efikasnost u tretiranju frontotemporalne demencije (FTD) i/ili amiotrofične lateralne skleroze (ALS).
[0179] Antitela njihovih antigen-vezujućih fragmenata ovog pronalaska mogu biti proizvedena u različitim ćelijskim linijama, kao što je humana ćelijska linija, sisarska ne-humana ćelijska linija, i ćelijska linija insekata, na primer CHO ćelijska linija, HEK ćelijska linija, BHK-21 ćelijska linija, mišja ćelijska linija (kao što je ćelijska linija mijeloma), ćelijska linija fibrosarkoma, PER.C6 ćelijska linija, HKB-11 ćelijska linija, CAP ćelijska linija i HuH-7 humana ćelijska linija (Dumont et al, 2015, Crit Rev Biotechnol. Sep 18:1-13., čiji su sadržaji ovde uključeni kao referenca).
[0180] U još daljem aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na farmaceutsku kompoziciju koji obuhvata:
(i) anti-Sortilin antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, oba kako je ovde definisano, ili pripravak, kako je ovde takav pojam definisan, koji obuhvata takvo anti-sortilin antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment; i
(ii) farmaceutski-prihvatljiv nosač.
[0181] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima kao i bilo kojim drugim poznatim adjuvansi i ekscipijensi u skladu sa konvencionalnim tehnikama kao što su one opisane u Remingtonu: The Science and Practice of Pharmacy, 22. Izdanje, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2013.
[0182] Farmaceutski prihvatljivi nosači ili razblaživači kao i bilo koji drugi poznati adjuvansi i ekscipijensi trebalo bi da su pogodni za odabrano jedinjenje ovog pronalaska i odabrani način davanja. Pogodnost za nosače i druge komponente farmaceutske kompozicije, određena je na osnovu nemanja značajnog negativnog uticaja na poželjne biološke osobine odabranog jedinjenja ili farmaceutske kompozicije ovog pronalaska (npr., manje suštinskog uticaja (10% ili manje relativne inhibicije, 5% ili manje relativne inhibicije, itd.)) na epitop vezivanje.
[0183] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može takođe da uključuje razblaživače, punioce, soli, pufere, deterdžente (npr., ne-jonski deterdžent, kao što je Tween-20 ili Tween- 80), stabilizatore (npr., sećere ili aminokiseline bez proteina), prezervativ, fiksative za tkivo, solubilizatore, i/ili druge materijale pogodne za uključivanje farmaceutske kompozicije. Razblaživač je odabran tako da ne utiče na biološku aktivnost kombinacije. Primeri takvih razblaživača su destilovana voda, fiziološki fosfat-puferovan slani rastvor, Ringerovi rastvori, dekstrozni rastvor, i Hankov rastvor. Pored toga, farmaceutska kompozicija ili formulacija može takođe da uključuje druge nosače, ili ne-toksične, neterapeutske, ne-imunogene stabilizatore i slično. Kompozicije mogu takođe da uključuju velike, sporo metabolizovane makromolekule, kao što su proteini, polisaharidi kao što je hitosan, polilaktične kiseline, poliglikolne kiseline i kopolimeri (npr., lateks funkcionalizovana sefaroza, agaroza, celuloza, i slično), polimerne aminokiseline, aminokiselinski kopolimeri, i lipidni agregati (npr., kapljice ulja ili lipozomi).
[0184] Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska mogu da variraju tako da se dobije količina aktivnog sastojska koja je efektivna da postigne poželjni terapeutski odgovor za određenog pacijenta, kompoziciju, i način davanja. Odabrani dozni nivo zavisiće od raznih farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određene kompozicije ovog pronalaska koja se upošljava, ili njenog amida, putanje davanja, vremena davanja, brzine izlučivanja određenog jedinjenja koje se upošljava, trajanja tretiranja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijale koji su upotrebljeni u kombinaciji sa određenim uposlenim kompozicijama, starosti, pola, težint, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se tretira, i sličnih faktora dobro poznatih u medicinskim oblastima.
[0185] Farmaceutska kompozicija može se davati bilo kojom pogodnom putanom i načinom, uključujući: parenteralno, topikalno, oralno ili intranazalno sredstvo za profilaktičko i/ili terapeutsko tretiranje. U jednom načinu ostvarivanja, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska daje se parenteralno. Izrazi "parenteralno davanje" i "dat parenteralno" kako se ovde koristi označava načine davanja pored enteralnog i topikalnog davanja, obično injekcijama, i uključuju epidermalno, intravenozno, intramuskularno, intraarterijalno, intratekalno, intrakapsularno, intraorbitalno, intrakardijalno, intradermalno, intraperitonealno, intratetivno, transtrahealno, subkutano, subkutikularno, intraartikularno, subkapsularno, subarahnoidalni, intraspinalno, intrakranijalno, intratorakalno, epiduralno i intrasternalno davanje injekcijama i infuzijom. Dodatne pogodne putanje davanja jedinjenja ovog pronalaska in vivo i in vitro dobro su poznata u struci i mogu se odabrati od strane stručnjaka iz ove oblasti. U jednom načinu ostvarivanja ta farmaceutska kompozicija daje se intravenoznim ili subkutanim injekcijama ili infuzijom.
[0186] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju bilo koje i sve pogone rastvarače, disperziona sredstva, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, agense izotoničnosti, antioksidanse i agense za odlaganje apropcije, i slično koji su fiziološki kompatibilni sa jedinjenjem ovog pronalaska.
[0187] Primeri pogodnih vodenih i ne-vodenih nosača koji se mogu primeniti u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska uključuju vodu, slani rastvor, fosfatni puferovani slani rastvor, etanol, dekstrozu, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne mešavine, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, kukuruzno ulje, kikiriki ulje, ulje semena pamuka, i susamovo ulje, koloidni rastvori karboksimetil celuloze, tragakant guma i injekcione organske estre, kao što je etil oleat, i/ili razni puferi. Drugo nosači dobro su poznati u oblastima farmacije.
[0188] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za improvizovane pripreme sterilnih injekcionih rastvora ili disperzije. Primena takvih podloga i agenasa za farmaceutski aktivne supstance poznato je u struci. Jedino u slučaju da bilo koji od konvencionalne podloge ili agensa nije kompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, predviđena je njihova primena u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska.
[0189] Pravilna fluidnost može se održavati, na primer, primenom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije, i primenom surfaktanata.
[0190] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu takođe da obuhvataju farmaceutski prihvatljive antioksidanse primera radi (1) u vodi rastvorivi antioksidansi, kao što je askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; (2) u ujlju rastvorivi antioksidansi, kao što je askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa- tokoferol, i slično; i (3) metal helirajući agensi, kao što je limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina, i slično.
[0191] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu takođe da obuhvataju agense izotoničnosti, kao što su sećeri, polialkoholi, kao što je manitol, sorbitol, glicerol ili natrijum hlorid u kompozicijama.
[0192] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu takođe da sadrže jedan ili više adjuvanasa pogodnih za odabranu putanju davanja kao što je prezervativ, agensi kvašenja, emulzifikatori, dispergujući agensi, prezervativ ili puferi, koji mogu da poboljšaju rok trajanja ili efektivnost farmaceutske kompozicije. Jedinjenja ovog pronalaska mogu biti pripremljeni sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje protiv brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere, i mikroenkapsulirane sisteme dostave. Takvi nosači mogu da uključuju želatin, gliceril monostearat, gliceril distearat, biorazgradive, biokompatibilne polimere kao što je etilen vinil acetat, polianhidride, poliglikolnu kiselinu, kolagen, poliortoestre, i polimlečnu kiselinu sama ili sa voskom, ili druge materijale dobro poznate u struci. Postupci za pripremu takvih formulacija su generalno poznata stručnjacima iz ove oblasti. Videti, npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[0193] U jednom načinu ostvarivanja, jedinjenja ovog pronalaska mogu biti formulisana da obezbede pravilnu distribuciju in vivo. Farmaceutski prihvatljivi nosači za parenteralno davanje uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za improvizovanu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Primena takvih podloga i agenasa za farmaceutski aktivne supstance poznato je u struci. Jedino u slučaju da bilo koji od konvencionalne podloge ili agensa nije kompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, predviđena je njihova primena u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska. Dodatna aktivna jedinjenja takođe se mogu uključiti u ove kompozicije.
[0194] Farmaceutske kompozicije za injekcije moraju tipično da budu sterilne i stabilne pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikro-emulzija, lipozom, ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti vodeni ili ne-vodeni rastvarač ili dispreziona podloga koja sadrži primera radi vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne mešavine, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i injekcione organske estre, kao što je etil oleat. Pravilna fluidnost može se održavati, na primer, primenom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i primenom surfaktanata. U mnogim slučajevima, biće poželjno da se uključe izotonični agensi, na primer, sećeri, polialkoholi kao što je glicerol, manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid u kompoziciji. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može se izvesti uključivanjem u kompoziciju agensa za odloganje apsorpcije antitela, na primer, monostearatnih soli i želatina. Sterilni injekcioni rastvori mogu biti pripremljeni inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u pogodni rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka npr. kakvi su navedeni gore, ukoliko je potrebno, praćeno sterilizacijom mikrofiltriranjem. Generalno, disperzije su pripremljene inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilno vozilo koje sadrži baznu disperzionu podlogu i potrebne ostale sastojke npr. koji su navedeni gore. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, primeri postupaka pripreme su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koji daju prah aktivnog sastojka plus bilo kog dodatnog poželjnog sastojka iz njihovog prethodno sterilno-filtriranog rastvora.
[0195] Sterilni injekcioni rastvori mogu biti pripremljeni inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u pogodni rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka navedenih gore, po potrebi, praćeno sterilizcionom mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilno vozilo koje sadrži baznu disperzionu podlogu i potrebne ostale sastojke koji su navedeni gore.
U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, primeri postupaka pripreme su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koji daju prah aktivnog sastojka plus bilo kog dodatnog poželjnog sastojka iz njihovog prethodno sterilno-filtriranog rastvora.
[0196] Dozni režimi u gornjim postupcima tretiranja i primenama opisanim ovde, podešeni su da obezbede optimalni poželjni odgovor (npr., terapeutski odgovor). Na primer, pojedinačni bolus može se davati, nekoliko podeljenih doza može se davati tokom nekog vremena ili se doza može proprocionalno redukovati ili povećati ko je indikovano zahtevima terapeutske situacije. Parenteralne kompozicije mogu biti formulisane u dozni jedinični oblik za lakše davanje i uniformno doziranje. Dozni jedinični oblik kako se ovde koristi se odnosi na fizički diskretne jedinice pogodne za unitarne doze za subjekte koji se tretiraju; svaka jedinica sadrži preodređenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatog za proizvodnju poželjnog terapeutskog efekta zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacije doznih jediničnih oblika ovog pronalaska određene su od strane i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapeutskog efekta koji bi da se postigne, i (b) ograničenja svojstvenih u oblasti slaganja takvog jednog aktivnog jedinjenja za tretiranje osetljivosti kod pojedinaca.
[0197] Efektivne doze i dozni režimi za anti-sortilin antitela zavise od bolesti ili stanja koje se tretira i može biti određeno od strane stručnjaka iz ove oblasti. Primerni, ne-ograničavajući opseg za terapeutski efektivnu količinu antitela ovog pronalaska je oko 0.1-10 mg/kg/telesna masa, kao što je oko 0.1-5 mg/kg/telesna masa, na primer oko 0.1-2 mg/kg/telesna masa, kao što je oko 0.1-1 mg/kg/telesna masa, primera radi oko 0.15, oko 0.2, oko 0.5, oko 1, oko 1.5 ili oko 2 mg/kg/telesna masa.
[0198] Lekar ili veterinar koji su stručnjaci iz ove oblasti mogu lako odrediti i prepisati efektivne količine potrebne farmaceutske kompozicije. Na primer, lekar ili veterinar mogu započeti doze anti-sortilin antitela uposlenih u farmaceutskoj kompoziciji pri nivoima koji su niži od potrebnih kako bi se postigao poželjni terapeutske efekat, i postepeno povećavati dozu dok se ne postigne poželjni efekat. Generalno, pogodne dnevne doze kompozicije ovog pronalaska biće ona količina jedinjenja koja je najniža doza efektivna da proizvede terapeutski efekat. Takva efektivna doza generalno će zavisiti od faktora opisanih gore. Davanje može npr. biti intravenozno, intramuskularno, intraperitonealno, ili subkutano, i primera radi dato proksimalno od mesta cilja. Ako je poželjno, efektivna dnevna doza farmaceutske kompozicije može se davati kao dve, tri, četiri, pet, šest ili više pod-doza datih odvojeno u pogodnim intervalima tokom dana, opciono, u jediničnim doznim oblicima. Iako je moguće da se jedinjenje ovog pronalaska daje samo, poželjno je davati ovo jedinjenje kao farmaceutsku kompoziciju opisanu gore.
[0199] Obeležena antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti ovog pronalaska mogu se upotrebiti u dijagnostičke svrhe da detektuju, dijagnostikuju, ili prate bolesti ili poremećaje. Ovaj pronalazak obezbeđen je za detekciju ili dijagnostiku neurodegenerativne ili kognitivne bolesti ili poremećaja, uključujući bez ograničavanja, FTD, ALS ili TDP43 proteinopatije kao što su Alchajmerove bolesti (AD), što obuhvata: (a) ispitivanje postojanja piroglutamatovanih Aβ fragmenata u uzorcima ćelija ili tkiva subjekta primenom jednog ili više antitela koja se specifično vezuju za sortilin; i (b) poređenje nivoa antigena sa kontrolim nivoom, npr. nivoi u normalnim uzorcima tkiva, pri čemu je povećavanje u ispitanom nivou antigena u poređenju sa nivoom kontrole indikativno za bolest ili poremećaj, ili indikativno za težinu bolesti ili stanja.
[0200] Antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti ovog pronalaska mogu se primeniti u ispitivanju sortilina ili antigen-vezujućih fragmenata sortilina u biološkom uzorku primenom imuno-histohemijskih postupaka dobro poznatih u struci. Drugi antitelo-bazirani postupci korisni za detektovanje proteina uključuju imunooglede kao što je sa enzimima povezan imunoogled (ELISA) i radioimunoogled (RIA) i ogledi zasnovani na platformi za otkrivanje mezoskala (MSD). Pogodna obeležja antitela mogu se primeniti u takvim kompletima i postupcima, a obeležja poznata u struci uključuju enzimska obeležja, kao što je alkalin fosfataza i glukozna oksidaza; radioizotopna obeležja, kao što je jod (<125>I,<131>I), ugljenik (<14>C), sumpor (<35>S), tricijum (<3>H), indijum (<121>In), i tehnecijum (<99m>Tc); i luminescentna obeležja, kao što su luminol i luciferaza; i fluorescentna obeležja, kao što su fluorescein i rodamin.
[0201] Prisustvo obeleženih anti-sortilin antitela ili njihovih sortilin-vezujućih fragmenata, može biti detektovano in vivo za dijagnostičke svrhes. U jednom načinu ostvarivanja, dijagnoza obuhvata: a) davanje subjektu neke efektivne količine tako obeleženog molekula; b) čekanje tokom nekog vremenskog intervala nakon administracije da bi se omogućilo da se obeleženi molekul koncentruje na mestima (ukoliko ih ima) Aβ taloženja i da se omogući da se nevezan obeleženi molekul kliruje na pozadinski nivo; c) određivanje pozadinskog nivoa; i d) detektovanje obeleženog molekula kod subjekta, tako da detekcija obeleženog molekula iznad pozadinskog nivoa predstavlja indikaciju da subjekt ima bolest ili stanje, ili je pokazatelj težine bolesti ili stanja. U skladu sa stakvim načinom ostvarivanja, taj molekul je obeležen sa grupom za snimanje pogodnom za detekciju primenom određenih sistema za snimanje koji su poznati stručnjacima iz ove oblasti. Pozadinski nivoi mogu biti određeni raznim postupcima poznatim u struci, uključujući poređenje količine obeleženog antitela koje su detektovane sa standardnom vrednošću koja je prethodno određena za određeni sistem snimanja. Postupci i sistemi koji se mogu primeniti u dijagnostičkim postupcima ovog pronalaska uključuju, bez ograničenja, kompjutersku tomografiju (CT), skeniranje celog tela kao što je Pozitronska emisiona tomografija (PET), snimanje magnetnom rezonancom (MRI), i sonografija.
[0202] U daljem aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, ovog pronalaska, za upotrebu u medicini.
[0203] U daljem aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, ovog pronalaska, za upotrebu u tretiranju bolesti povezane sa sniženim PGRN nivoima u mozgu nekog pacijenta,
[0204] U daljem aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na primenu antitela, ili njihovog antigen-vezujućeg fragmenta, ovog pronalaska, u proizvodnji leka za tretiranje bolesti povezane sa sniženim PGRN nivoima u mozgu nekog pacijenta,
[0205] Poželjno je da u primenama i postupcima aspekata ovog pronalaska, bolest predstavlja: FTD; ALS; ili TDP43 proteinopatije, kao što je AD.
[0206] Poželjno, u primenama i postupcima aspekata ovog pronalaska, tretiranje je hronično, i poželjno je tokom najmanje 2 nedelje, kao što je najmanje tokom 1 meseca, 6, meseci, 1 godine ili više.
[0207] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje komplet koji obuhvata antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, u skladu sa ovim pronalaskom.
Tabela 5 - Sekvence Antitela
Seq ID No: 180 "A region" kakav je identifikovan ovim pronalaskom
Seq ID No: 181 A region 109-114
Seq ID No: 182 A region 126-153
Seq ID No: 183 A region 126-144
Seq ID No: 184 A region 154-159
Seq ID No: 185 D Region 570-572
Seq ID No: 186 D Region 588-597
Seq ID No: 187 D Region 593-597
Seq ID No: 188 Sekvence upotrebljene za HDX
[0208] Navođenje ili diskusija u ovoj specifikaciji o očigledno prethodno objavljenom dokumentu ne treba nužno shvatiti kao priznanje da je dokument deo stanja tehnike ili da je opštepoznato znanje.
[0209] Poželjno, ne-ograničavajući primeri which obuhvataju određene aspekte ovog pronalaska biće sada opisani, uz pozivanje na prateće crteže.
PRIMERI
Primeri 1-3 opisuju generisanje konstrukata sortilina
[0210] Primer 1 opisuje nasumične konstrukte. Primer 2 opisuje ekspresiju konstrukata
sortilina. Primer 3 opisuje prečišćavanje konstrukata sortilina.
Primeri 4-7 opisuju generisanje antitela sortilina
[0211] Primer 4 opisuje imunizaciju i hibridome. Primer 5 opisuje analizu sekvenci. Primer 6 opisuje prečišćavanje antitela. Primer 7 opisuje generisanje mišjeg antitela.
Primeri 8-17 opisuju karakterizaciju antitela sortilina
[0212] Primer 8 opisuje vezivanje za sortilin. Primer 9 opisuje sposobnost unakrsnog blokiranja antitela sortilina. Primer 10 opisuje HTRF PGRN-sortilin vezivanje. Primer 11 opisuje NTS vezivanje. Primer 12 opisuje celularnu PGRN vezivanje i endocitozu. Primer 13 opisuje ekstracelularne PGRN nivoe. Primer 14 opisuje iPSC PGRN nivoe. Primer 15 opisuje PGRN u nivoima plazme. Primer 16 opisuje epitop mapiranje pomoću HDX. Primer 17 opisuje mikrodijalizu PGRN u mozgu.
Primer 1
[0213] Za upotrebu i u hibridom skrining procesu i kao diverzifikacija panela antitela, takozvani 'nasumični konstrukti" su dizajnirani, konstruisani i proizvedeni, praveći skup himernih sortilin molekula koji sadrže aminokiselinske sekvence izvedene iz oba humanog sortilina i udaljeno povezanih vrsta (tetraodon) sa značajnim redukovanjem homoligije sekvenci. Razlog je taj što je celokupna sortilin struktura i funckionalnost od himernih konstrukata zadržana ali da gubitak vezivanja antitela za određene himerne konstrukte ukazuje na umešanost specifičnih razmenjenih regiona u vezivanju. Rastvorivi konstrukti ekstracelularnog regiona (ECD, aa 1-755) obeleženi su sa bilo BAP obeležjem (biotinski prihvatač peptida), omogućavajući "in vitro" biotinilaciju proteina ko-ekspresijom biotin ligaze ili His obeležja, omogućavajući lako prečišćavanje. Primenjeni su ekspresioni vektori koji enkodiraju sledeće proteine: SORT-ECDBAP, SORT-ECDBAP-hB01-05, SORT-ECDBAP-hB06-10, SORT-ECDBAP-hB12390, SORT-ECDBAP-hB45678, SORT-ECDBAP-tetra, SORT, SORT-tetra.
[0214] Sortilin sekvence mogu se pronaći u SEQ ID NOs:169-180, a FIG.2 prikazuje šematski prikaz dodeljivanja regiona antitela na osnovu vezivanja za nasumične konstrukte sortilina.
Primer 2
[0215] U slučaju ekspresije antitela, pogodni vektori teškog lanca i lakog lanca, kako je opisano u Primerima 4, 5 i 6, ko-eksprimirani su u HEK-293F ćelijama.
Primer 3: Prečišćavanje His-obeleženog sortilina
[0216] SORTECDHis je eksprimiran u HEK-293F ćelijama. His-tag u proteinima omogućava prečišćavanje afinitetnom hromatografijom imobilisanih metala. U ovom procesu NiNTA Superflow Cartridge (Qiagen) je uravnotežen sa 50mM NAH2PO4, 300 mM NaCl i 10mM Imidazolom pH 8.0. Kolona je ispunjena His obeleženim proteinom sa vremenom zadržavanja od 1 minuta. Kolona je oprana sa 50mM NAH2PO4, 300 mM NaCl i 20mM Imidazolom pH 8.0. Protein je eluiran sa 50mM NAH2PO4, 300 mM NaCl i 250mM Imidazolom pH 8.0. Naknadno, protein je dijaliziran u PBS primenom Slide-A-Lyzer sa isečkom od 10.000 mwco (Thermo Scientific). Nakon dijaliziranja, protein je sterilno filtriran primenom 0.2 mikronskog SFCA filtera (Thermo Scientific).
[0217] S18-HEK ćelijska linija generisane je transfekcijom HEK293 ćelija sa humanim sortilin ekspresionim vektorom divljeg tipa (WT). Stabilne transfektovane ćelije izvedene su nakon pasaže u prisustvu odabranog agensa. Pojedinčni klonovi su odabrani kloniranjem razblaživanjem. Klonovi su za sortilin mRNK ekspresiju primenom QPCR. Najviše eksprimirajući klonovi zatim su analizirani pomoću FACS (Guava, Millipore) primenom anti-sortilin poliklonalnog antitela (Poliklonalno kozije sortilin biotininilovano Ab, Kat.Br.: BAF2934_(R&D Systems)) da bi se odredili po površini eksprimirani nivoi sortilina.
Primer 4
A – Procedura imunizacije transgenih miševa
[0218] Antitela HuMab Sortilin izveden su iz imunizacija HuMAb mišjih sojeva HCo12, HCo17, HCo20, HCo12-BALB/c, HCo17-BALB/c i HCo20-BALB/c (humano monoklonalno antitelo; Medarex Inc., San Jose, CA, USA), Ovi miševi su podvrgnuti dvostrukom knock out-u zar mišji imunoglobulin (Ig) teški i mišji kapa laki lanac, što suštinski deaktivira ekspresiju antitela koja su u potpunosti mišja. Raznih mišji sojevi napravljeni su transgenim umetanjem lokusa humanih Ig teških i humanih Ig kapa lakih lanaca i razlikovali su se u broju humanih VH (varijabilni domen teškog lanca) i VL (varijabilni domen lakog lanca) gena. HCo12-BALB/c miševi izveden su ukrštanjem sa KCo5-BALB/c (transgeni sa kapa lakim lancem) miševima.
[0219] 48 miševa je imunizovano naizmenično intraperitonealno (IP) sa 20 µg SORTECDHis (SEQ ID NO: 179) i subkutano (SC, u korenu repa) primenom istog proteina, sa intervalom od 14 dana. Izvedeno je maksimalno osam imunizacija, 4 IP i 4 SC.
[0220] U jednom protokolu, prva imunizacija izvedena je sa SORTECDHis u kompletnom Freundovom adjuvansu (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), praćeno imunizacijama u nekompletnom Freundovom adjuvansu (IFA). Drugi protokol je koristio SAS kao adjuvansu svim fazama imunizacije. Kada je pronađeno da su titri seruma bili dovoljni (razblaživanje seruma od 1/50 ili niži pronađen je pozitivan u antigen specifičnom skrining ogledu na najmanje dva uzastopna, dvonedeljna, skrininga), miševi su dodatno bustovanu dva puta intravenozno (IV) sa 10 µg SORTECDHis proteina u 100 µL PBS, četiri i tri dana pre fuzije.
B - Generisanje HuMab hibridoma
[0221] HuMAb miševi sa dovoljnim razvojem antigen-specifičnim titrom kako je prethodno definisano su žrtvovani i iz njih sakupljeni slezina i limfni čvorovi sa bočne trbušne aorte i suplje vene. Fuzija splenocita i ćelija limfnih čvorova sa ćelijskom linijom mišjeg mijeloma pripremljeni su electrofuzijom primenom CEEF 50 Electrofuzionog Sistema (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, USA), suštinski u skladu sa instrukcijama proizvođača. Fuzionisane ćelije su zasejane u fuzionu podlogu koja sadrži 10% Fetalni klon i goveđi serum (Perbio), 1 mM natrijum piruvat (Cambrex), 0.5 U/mL penicilina, 0.5 U/mL streptomicina (Cambrex), 50 µM 2-merkaptoetanol (Invitrogen), 600 ng/mL interleukina 6 (IL-6) (Strathmann), 1 x HAT (Sigma) i 0.5 mg/mL kanamicina (Invitrogen) u HyQ mADCF-Mab (Perbio). Nakon deset dana, supernatant je sakupljen, a ćelije su osvežene sa sakupljenom podlogom, koja sadrži 10 % Fetalni klon i goveđi serum, 0.5 U/mL penicilina, 0.5 U/mL streptomicina, 600 ng/mL IL-6 i 1 x proHT (Cambrex) u HyQ mADCF-Mab. Supernatanti hibridom kulture skrinovani su primarnim skrining ogledima i streptavidin perlama kuplovanim u SORTECDBAP (SEQ ID NO 171), SORTECDBAPhB06-10 (SEQ ID NO 176), SORTECDBAPhB12390 (SEQ ID NO 177), radi detektovanja hibridoma koji proizvode humana (ili himerna) anti-Sortilin antitela. Hibridom ćelije iz najboljih primarnih bazenčića zasejane su u polučvrstoj podlozi od 40% CloneMedia (Genetix, Hampshire, UK) i 60% HyQ 2x kompletna podloga (Hyclone, Waltham, USA). Za svaki primarni bazenčićl, zasejan je bazenčić Genetix black ploče sa 6 bazenčića. Za svaki bazenčić, 25 sub klonova je odabrano, primenom ClonePix sistema (Genetix). Sub klonovi su odabrani u podlozi za sakupljanje. Nakon sedam dana, supernatanti sub klonova ponovo su skrinovani again za sortilin-specifično humano IgG vezivanje i koncentracija humanog IgG je izmerena primenom Octet 384red (Fortebio, Menlo Park, USA). Iz svakog primarnog bazenčića, najbolji sub klon je odabran i proširen u ekspanzionoj podlozi koja sadrži samo 600 ng/mL IL-6, 0.5 U/mL penicilina, 0.5 U/mL streptomicina i 1 x proHT. Sub klonovi su prošireni iz jednog bazenčića ploče sa 96 bazenčića u jedan bazenčić ploče sa 24 bazenčiža, pa u četiri bazenčića ploče sa 24 bazenčića, pa u šest bazenčića ploče sa 6 bazenčića. Klonovi izvedeni ovim postupkom označeni su kao primarni klonovi (PC).
[0222] Anti-sortilin HuMab antitela ovog pronalaska identifikovana i podvrgnuta analizi sekvenci.
Primer 5: Analiza sekvenci sortilin-specifično HuMab varijabilnih domena i kloniranje u ekspresionim vektorima
[0223] Ukupna RNK je pripremljena iz 0.2 do 5x106 hibridom ćelija, a 5'-RACE-Komplementarne DNK (cDNK) je pripremljena od 100 ng ukupne RNK, primenom SMART RACE cDNK Amplifikacionog kompleta (Clontech), u skladu sa instrukcijama proizvođača. VH i VL kodirajući regioni su amplifikovani putem PCR i klonirani direktno, u okviru, u p33G1f i p33Kapa ekspresionim vektorima (koji sadrže humani IgG1./ kapa konstantan domen koji enkodira sekvence), ligacionim nezavisnim kloniranjem (Aslanidis, C. i P.J. de Jong, Nucleic Acids Res 1990;18(20): 6069-74). Za svako antitelo, 16 VL klonova i 16 VH klonova je sekvencionirano. Klonovi sa odgovarajućim okvirom otvorenog čitanja (ORF) odabrani su za dalje ispitivanje i ekspresiju. Vektori svih kombinacija teških lanaca i lakih lanaca tranzijentno su koeksprimirani u FreestyleTM 293-F ćelijama primenom 293fektina.
[0224] Dobijene sekvence prikazane su u listi sekvenci (SEQ ID NOs:1-168) ovde. CDR sekvence definisane su u skladu sa objavljenim smernicama.
Primer 6: Prečišćavanje antitela
[0225] Supernatant kulture je filtriran preko 0.2 µm filtera sa slepim krajem, uvedeni u 5 mL Protein A kolone (rProtein A FF, Amersham Bioscience) i eluirani sa 0.1 M limunska kiselina-NaOH, pH 3. Eluat je odmah neutralizovan sa 2M Tris-HCl, pH 9 i dijaliziran u 12.6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 (B.Braun), O/N (preko noći). Nakon dijaliza, uzorci su sterilno-filtrirani preko 0.2 µm filtera sa slepim krajem. Čistoća je određena sa SDS-PAGE, a koncentracija izmerena nefelometrijom i apsorbancom na 280 nm. Prečišćena antitela alikvotirana su i uskladištena na -80°C. Nakon otapanja, alikvoti prečišćenih antitela održavani su na 4°C. Masena spektrometrija izvedena je radi identifikovanja molekulske mase teških i lakih lanaca antitela eksprimiranih od strane hibridoma.
Primer 7: Generisanje mišjeg antitela (1F2 i 5E1) Imunogen
[0226] Sintetičko gensko kodiranje za himerni imunogen hSortilin-FC, (humani Sortilin AA (78-756) iz SEQ ID NO:169) i humani IgG1-FC AA (104-330) iz SEQ ID NO:169 klonirano je u pcDNA3.1 i upotrebljeno za ekspresiju primenom sistema slobodnog slita od Invitrogen. Antigen je prečišćen od supernatanata ćelijske kulture protein-A afinitetnom hromatografijom primenom standardnih procedura za prečišćavanje antitela kako je ovde opisani za humana antitela.
Generisanje hibridoma
[0227] hSortilin-FC je upotrebljen kao imunogen i 5 BALB/c miševi su imunizovani. Miš sa zadovoljavajućim imunim odgovorom je odabran za ćelijsku fuziju i generisanje hibridoma.
Supernatatnti hibridoma skrinovani su sa ELISA primenom hSortilin-ECD kao oblagajućeg antigena. Generisano je ukupno osamnaest ćelijskih linija hibridoma izvedenih od devet roditeljskih klonova.
Ekspresija
[0228] Hibridomi su inicijalno uzgajani u kompletnoj podlozi za rast, DMEM sa 10%FBS+antibiotici i naknadno adaptirani u CDhibridom podlozi (Invitrogen) za eksperimente ekspresije.
Prečišćavanje
[0229] Mišja monoklonalna antitela prečišćena su od supernatanata hibridom ćelijske kulture protein-G sefarozom u skladu sa standardnim postupcima preporučenim od strane dobaljača (GE healthcare).
Primer 8: Afinitet sortilin specifičnog HuMab i mišjih antitela prema rekombinantnom ekstracelularnom regionu sortilina
[0230] Vezujuće kinetike anti-sortilin HuMab antitela za sortilin određene su primenom Octet 384RED (Fortebio, Menlo Park, USA). HuMab rastvori od 2 µg/ml pripremljeni su razblaživanjem u uzorku razblaživaču (ForteBio, art. No.18-5028). Prot A senzori (ForteBio, art.no.18-0004) prethodno su nakvašeni puferom kinetika (1:10 uzorak razblaživač u PBS) tokom najmanje 600 sekundi. Naknadni senzori imobilizovani su sa HuMab rastvorom tokom 600 sekudni. Odgovor osnovne linije je obezbeđen putem potapanja u pufer kinetika tokom 120 sekundi. Ascijacija SORTECD konstrukata izvedena je tokom 1000 sekundi inkubacije. Ovo je praćeno disocijacijom u puferu kinetika tokom 100 sekundi. Nakon disocijacije, senzori su regenerisani (10 mM Glycine pH 1.0) i neutralizovani (pufer kinetika) 3 puta tokom 5 sekundi. Sva HuMab su analizirana primenom četiri koncentracije SORTECD konstrukata (10, 5, 2.5 i 1.25 µg/ml). Molekulska masa 76.8 kDA upotrebljena je za SORTECDHis. Podaci su fitovani sa ForteBio Analiza 6.4 softverom, primenom globalnog potpunog prilagođavanja. Rezultati su prikazani na FIG.3 i FIG.4.
Primer 9: Unakrsno blokiranje antitela za anti-sortilin HuMabs
[0231] Ispitivanja unakrsnog blokiranja antitela izvedena su primenom Octet 384RED (Fortebio, Menlo Park, USA). Rastvori HuMab antitela od 2 µg/ml pripremljeni su razblaživanjem u razblaživaču uzorku (ForteBio, art. No.18-5028). Aminski reaktivni senzori (ForteBio, art.no.18-0008) upotrebljeni su za imobilizaciju HuMabs. Pre kuplovanja sa aminskim reaktivnim senzorima, HuMabs su razblažena u MES pH 6.0 puferu (18-5027). Kuplovanje je izvedeno na 30°C i 1000 o/min kako sledi: Aminski reaktivni senzori su prethodno nakvašeni u PBS i naknadno aktivirani sa EDC/NHS (ForteBio. Art.no.18-1033/18-1034) aktivacionim rastvorom (u skladu sa instrukcijama proizvođača) tokom 300 sekundi. Aktivirani senzori imobilizovani su sa HuMabs tokom 600 sekundi. Imobilizovani senzori ugašeni su na preostalu aminsku reaktivnost sa atanolaminom (ForteBio, cat no.18-1039). Nakon gašenja senzori su smešteni u PBS do upotrebe. Analiza unakrsnog blokiranja započinje utvrđivanjem odgovora osnovne linije na 30°C i 1000 o/min. Odgovor osnovne linije je obezbeđen potapanjem u razblaživač uzorak tokom 120 sekundi. Asocijacija SORTECDHis izvedena je tokom 300 sekundi direktno praćeno asocijacijom HuMab tokom 300 sekundi. Nakon asocijacije HuMab, senzori su regenerisani (10 mM glicin pH 1.0) i neutralizovani (razblaživač uzorak) 3 puta tokom 5 sekundi. Podaci usobrađeni primenom ForteBio Analiza 6.4 softvera.
[0232] Antitela su grupisana na osnovu njihovih profila vezivanja na različitim nasumičnim konstruktima sortilina (FIG.2, FIG.3 i FIG.4). Da bi se potvrdilo da se sva antitela iz Regiona D (i regiona F) vezuju za isti region na humanom sortilin ECD divljeg tipa, njihova sposobnost da blokiraju jedan drugo od vezivanja humani sortilin ECD divljeg tipa okarakterisana je u studiji unakrsnog blokiranja primenom Octet384 crveno. Na primer, kada su ispitana antitela iz istog regiona, primarno antitelo bi blokiralo vezivanje sekundarnog antitela i obrnuto. Međutim, kada su ispitana antitela iz različitih regiona, nije bilo unakrsnog blokiranja jer je samo jedan region blokiran primarnim antitelom, a preostali regioni bili su dostupni za vezivanje sa sekundarnim antitelom. FIG.7 prikazuje da sva D-region i D+ antitela unakrsno blokiraju jedan drugog što potvrđuje klasifikaciju antitela na Region D i D+ na osnovu nasumičnih konstrukata. Dalje, ovi podaci takođe potvrđuju da himerni sortilin konstrukti zadržavaju sličnost sa nativnim humanim sortilin ECD divljeg tipa.
Primer 10: Karakterizacija sortilina - PGRN ligand vezivanje u prisustvu anti-sortilin antitela.
[0233] IC50 vrednosti za antitela određena su merenjem izmeštanja PGRN vezivanja za sortilin primenom homogenog vremenski razlučenog fluorescentnog (HTRF, CisBio) ogleda, videti FIG.5 i FIG.6.
[0234] Eksperimenti su izvedeni u oglednom puferu (50mM Fosfat, pH 7.0, 0.1% BSA) u ukupnoj zapremini od 20µl u Greiner beloj ploči niske zapremine mikrotitra sa 384 bazenčića, (784075, Greiner).
[0235] Antitela su prethodno inkubisana tokom 15min na sobnoj temperaturi sa 50nM HIS-obeleženim sortilin ECD i 4nM PGRN (SULU20110924) pre nego što su 7nM anti-6HIS-d2 i 0.7nM anti-PGRN-Eu kriptat (Cisbio) razblaženi u konjugovanom puferu (50mM Fosfat, pH 7.0, 0.8mM KF, 0.1% BSA) dodati.
20µM neurotenzin je upotrebljen kao pozitivna kontrola i DMSO u puferu je upotrebljen kao negativna kontrola.
[0236] Ispitna ploča je inkubisana tokom 60min na sobnoj temperaturi i preko noći na 4°C pre nego što je ploča očitana u EnVision čitaču (Perkin Elmer).
[0237] Neobeleženi neurotenzin i DMSO prazan upotrebljeni su kao pozitivna i negativna kontrola za postavku ogleda, respektivno. Evaluacije doznog odgovora antitela izvedena je sa deset koncentracija između 1µM i 50pM u 3-strukoj krivoj razblaživanja.
[0238] Polu-maksimalna inhibitorna koncentracija (IC50) izračunata je pomoću ne-linearne regresije primenom sigmoidnog koncentracionog odgovora (varijabilni nagib) u XLfit 4 (IDBS, UK). (FIG.5 i 6).
Primer 11: Karakterizacija sortilin-neurotenzin vezivanja u prisustvu anti-sortilin antitela
[0239] IC50 za sortilin specifično jedinjenje AF38469 (Schrøder et al, Bioorg Med Chem Lett.2014 Jan 1;24(1):177-80, 2014) određeno je merenjem izmeštanja<3>H-Neurotenzin vezivanja za sortilin primenom ogleda scintilacione blizine (SPA).
[0240] Eksperimenti su izvedeni u oglednom puferu (50mM HEPES, pH 7.4, 100mM NaCl, 2mM CaCl2, 0.1% BSA, 0.1% Tween-20) u ukupnoj zapremini od 40µl u Optiploči sa 384 bazenčića, bela neprozirna, (6007299, Perkin Elmer).
[0241] 150nM HIS-obeležen sortilin je prethodno inkubisan tokom 15min na sobnoj temperaturi sa ili bez 1µM sortilin specifičnog antitela (IgG1-6003-045 ili IgG1-6003-068) ili sa humanom IgG1 izotip kontrolom pre nego što su proteinski rastvori dodati u bazenčiće koji sadrže AF38469 u koncentracionim serijama 50µM do 2.5nM. Mešavina je inkubisana tokom 15min na sobnoj temperaturi na mešaču pre nego što su dodate 5nM<3>H-Neurotenzin i Ni-helat perlice za snimanje (RPNQ0266, Perkin Elmer). Ogled je inkubisan dodatno tokom 60min pod istim uslovima.
[0242] Nakon 6h, ploča je očitana na ViewLux (360s vreme izlaganja). Neobeleženi neurotenzin i DMSO prazan upotrebljeni su kao pozitivna i negativna kontrola, respektivno.
[0243] Evaluacije doznog odgovora za AF38469 izvedene su sa deset koncentracija između 50µM i 2.5nM u 3-strukoj krivi razblaživanja. Polu-maksimalna inhibitorna koncentracija (IC50) izračunata je pomoću ne-linearne regresije primenom sigmoidalkoncentracionog odgovora (varijabilni nagib) u XLfit 4 (IDBS, UK). Rezultati se mogu videti na FIG.8.
Primer 12: Karakterizacija sortilin - PGRN ligand vezivanja na površini ćelija u prisustvu anti-sortilin antitela.
[0244] Obe i sortilin transientno transfektovane ćelije i stabilne ćelije ćelijske linije S18-HEK (humane HEK ćelije koje prekomerno eksprimiraju sortilin) upotrebljene su ovom ogledu. Ćelije su tripsinizirane i poseađene u ploču pri gustini od 42,000 ćelije po bazenčiću u ploči sa 96 bazenčića. U slučaju tranzijentno transfektovanih ćelija, ćelije su zasejane 24 h nakon transfekcije u pločama sa 96 bazenčića. Sledeći dan, podloga je potpuno promenjena, a test jedinjenja razblažena u podlozi dodata su u ćelije tokom 30 min. praćeno dodavanjem PGRN tokom 4h. Na kraju ispitivanja (nakon 4.5 h), ćelije su fiksirane i obojene na PGRN. Sve obojene ploče analizirane su pomoću Cellomics Array Scan (Thermo Fischer), a prosečan intenzitet bojenja za PGRN/ćelija/bazenčić upotrebljen je za analizu.
[0245] PGRN koji je upotrebljen za ogled sakupljen je iz podloge posle transientne transfekcije PGRN ekspresije plazmida u HEK 293 ćelijama. PGRN nivoi izmereni su primenom PGRN ELISA kompleta (R&D).
[0246] PGRN dodat ćelijama lako se vezao i endocitozovao što je dovelo do povišenog fluorescencionog signala u sortilin transfektovanim bazenčićima. Dodavanjem neurotenzina, sprečeno je sortilin vezivanje za PGRN, a intenzitet PGRN fluorescencije bio je sličan kontrolnim nivoima što indikuje da PGRN nije vezan i endocitozovan u prisustvu neurotenzina.
[0247] Oba sortilin HumAbs (45 i 68) blokirla su preuzimanje PGRN sa efikasnošću sličnom neurotenzinu. Izotip kontrolno antitelo, B12, nije imalo efekat na PGRN endocitozu ili vezivanji. Rezultati se mogu videti na FIG.9.
Primer 13: Efekat antitela na ekstracelularne PGRN nivoe
[0248] Pronađeno je da obe HEK293 ćelije i S18-HEK ćelije sekretuju PGRN kontinualno u podlogu bez bilo kakve stimulacije.
[0249] Antitela i kontrolni agensi dodati su u S18-HEK ćelije da bi se procenio efekat na PGRN.
Dodavanje neurotenzina, poznatog peptidnog sortilin ligand, ili humanih antitela, 45, 68 i 811 u S18-HEK ćelije doelo je do povećavanja PGRN u podlozu ćelijske kulture. Dva od sortilin humanih antitela (45 i 68) imala su efekat sličan neurotenzinu koji povišava PGRN nivoe do 202% i 201 % respektivno. Antitelo 811 povećava PGRN do 146% u podlozi u poređenju sa kontrolama B12, izotip kontrolno antitelo je upotrebljen kao negativna kontrola u svim našim ispitivanjima i nije pokazalo bilo kakav efekat na PGRN nivoe. Ove opservacije ukazuju da ispitana sortilin antitela inhibiraju sortilin-posredovanu internalizaciju PGRN, čime se povećava ekstracelularni PGRN.
[0250] Na dan1, S18-HEK ćelije su zasejane u ploču sa 96 bazenčića. Nakon 24h, podloga je potpuno zamenjena bilo samom podlogom (kontrola) ili podlogom dopunjenom test jedinjenjem. Sva jedinjenja ispitana su na 10uM, a antitela na 100nM ukoliko nije drugačije naznačeno. Podloga je sakupljena na dan 3 i analizirana primenom PGRN ELISA (R&D). Vijabilnost ćelija bila je određena Cell TiterGlo (Pro Mega) radi procene citotoksičnog efekta jedinjenja. PGRN nivoi u podlozi su analizirani sa ELISA i vrednosti su normalizovane u kontrolnim bazenčićima. Rezultati se mogu videti na FIG.10.
Primer 14: ELISA ogled za ekstracelularni PGRN u iPSCs
[0251] Indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSCs) generisane su pomoću ne-integrativnog reprogramiranja humanih fibroblastova (Normal humani dermalni fibroblasti 18god muškarca; Lonza) kako je već opisano (Rasmussen et al., Stem Cell Reports.2014 Sep 9;3(3):404-13.). NHDF K1_shp53 liija upotrebljena je za ova ispitivanja. iPSCs su inicijalno generisane u mTESR podlozi, a naknadno uzgajane u monosloju u Pluripro (Cell Guidance System). Neuronska diferencijacija je započetacna dan 0 prekrivanjem ćelija na poli-L-ornitin/laminin obložene sudove i uzgajane u N3 podlozi (50% DMEM/F12 50% Neurobazalna podloga dopunjena sa 0.5% N2, 1% B27 sa RA, 0,5 mM GlutaMAX, 0,5& NEA, 50 µM 2-merkaptoetanol i 2.5 mg/mL insulin) sa 500 ng/mL noginom i 10 µM SB431542. Podloga je osvežena svaki dan. Nakon 11 dana indukcije sa nogin/SB431542, ćelije su podeljene sa dispazom i ponovo zasejane u ploču na poli-L-ornitin/laminin u N3 podlozi. Od tog trenutka, N3 podloga je osvežena svaka 2-3 dana, a ćelije su podeljene približno svaki 10-14 dan primenom akutaze.
[0252] Neuronske diferencirane iPSC ćelije zasejane su u ploču sa 96 bazenčića. Nedelju dana kasnije, antitela su dodata u ćelije. Podloga iz ćelija je sakupljana na 48h ili 96 h i analizirana humanom PGRN ELISA (Enzo Life sciences), a uzorci su analizirani prema instrukcijama proizvođača.
[0253] Ispitana sortilin humana antitela (45 i 68) povećala su PGRN nivoe na različitim nivoima u podlozi na 48h i 96 h. B12 i Anti-Hel su kontrolna izotip antitela (negativna kontrola). Podaci su prikazani kao prosek ± SD. Podaci su analizirani jednosmernom Anova praćeno Dunnetovom analizom *p<0.05;
**p<0.01. Rezultati se mogu videti na FIG.12.
Primer 15
[0254] Da bi se analizirao efekat antitela na PGRN nivoe u plazmi, humanizovani sortilin KI miševima date su pojedinačne ili više injekcija (10mg/kg) sortilin antitela ili izotip kontrole subkutanim injektovanjima. Životinje su anestezirane i žrtvovane na raznim vremenskim tačkama nakon doziranja, a PGRN u nivoima plazme određen je sa ELISA.
A. Studija vremenskog toka: Miševi su tretirani antitelima (sortilin humab ili kontrolno ab) i žrtvovani u različitim vremenskim tačkama. Miševi tretirani kontrolnim antitelima (Anti-Hel), nisu pokazali promenu u PGRN u plazmi dok je kod miševa tretiranim sa sortilin humab 45, postojalo povećanje u PGRN nivoima za koje se čini da je bilo u piku između 24 i 48h, a zatim postepeno opadalo od oko dana 4. PGRN nivoi su i dalje povišeni na dan 7.
B. Subhronična studija: Na osnovu podataka iz studije vremenskog toka, sortilin KI miševi dozirani su dva puta nedeljno sa 10mg/kg, s.c, bilo sa sortilin humanim antitelom 45 ili izotip kontrolnim antitelom, kako bi se održao stabilan nivo antitela za subhroničnu studiju (4 nedelje). Krvni uzorci su sakupljani na početku studije i svake nedelje da bi se pratile promene PGRN u plazmi. PGRN u nivoima plazme na početku studije bili su slični u obe grupe životinja. Viši nivoi PGRN u plazmi zapaženi su kod miševa tretiranih sa sortilin antitelom 45 od nedelje 1 i ostali su povišeni kroz studiju. Miševi tretirani sa kontrolnim ab, nisu pokazali bilo kakvo povećanje u PGRN u plazmi i ostali su na nivoima osnovne linije (nedelja 0).
C. Studija doznog odgovora: Različite doze (4 doze: 10, 2, 0.4 i 0.1 mg/kg) sortilin (45) i kontrolno antitelo (Anti-Hel) su injektovane i miševi žrtvovani na dan 2. PGRN u plazmi povišen je sa 10mg/kg i 2mg/kg kod miševa tretiranih sa sortilin humab, a niže doze nisu imale efekat na PGRN u plazmi što jasno pokazuje dozno zavisan efekat sortilin antitela na PGRN u nivoima plazme. Miševi tretirani sa kontrolnim antitelom nisu pokazali nikakvu promenu u PGRN nivoima.
[0255] Miševi su anestezirani sa 0,4 ml Avertin IP i krv iz srca je sakupljena i transferovana u 500 ul kEDTA bočicu. Uzorci su održavani na ledu do centrifugiranja pri 3600G tokom 15 min na 4C. Plazma je izdvojena pipetom u mikronsku bočicu i zamrznuta na -20C. PGRN u uzorcima je izmeren primenom PGRN ELISA kompleta (Adipogen) prema instrukcijama proizvođača. Rezultati se mogu videti na FIG.13.
Primer 16: Epitop mapiranje antitela koja ciljaju progranulin-sortilin interakciju od strane vodonik/deuterijum razmene praćeno masenom spektrometrijom
[0256] U vodonik/deuterijum razmenu praćeno masenom spektrometrijom (HDX-MS) izmerena je brzina razmene u amidnim vodonicima kičmene osnove u proteinu. Na taj način, moguće je ispitati konformacione dinamike cele proteinske kičme osim na ostacima prolina. Brzina reakcije razmene određena je vezivanjem vodonika sa statusom amida kičme i u manjoj meri njenom dostupnoću rastvarača. Suptilne promene u ova dva parametra npr. Izazvana prisustvom liganda, mogu se zapaziti kao promena u inkorporaciji deuterijuma.
[0257] Kako bi se pod-lokalizovale promene u inkorporaciji deuterijuma, protein je tretiran sa kiselom stabilnom proteazom (npr. pepsin), koja generiše lokalne regione tipično deset do petnaest aminokiselina. Regioni koji prikazuju smetnju u prisustvu liganda su bilo direktno uključeni u vezivni međuprostor ili su alosterički pogođeni događajem vezivanja.
Epitop mapiranje antitela
[0258] Inkorporacija deuterijuma ekstra celularnog regiona sortilina (SEQ ID NO:188) je izmerena u odsustvu i prisustvu mAb45, mAb68, mAb811 i antitela označenog kao mAb30 koje ne vezuje D region. Da bi se obezbedilo da se merenja sprovedu u uslovima mirovanja, kompleksi su ekvilibrisani tokom 15min na 25°C pre nego što je započeta reakcija razmene. Reakcija razmene je započeta razblaživanjem uzoraka proteina 1:9 (v/v) u deuterizovanom puferu (99% D2O, 20mM tris, 150mM NaCl, pDread = 7.6). Nakon raznih vremenskih tačkaka (15s, 1min, 10min, 1h i 8h) reakcija razmene je ugašena sa 1:1 (v/v) razblaženjem sa ledeno-hladnim puferom za gašenje (2M glicin, 0.8M tris-(2-karboksietil)fosfin (TCEP), pH = 2.3), sa vremenom smanjivanja pH do 2.46. Ugašeni uzorci odmah su smešteni u zamrzivač na -80° i uskladišteni do analize. Potpuno deutorezovani kontrolni uzorci pripremljeni su razblaživanjem sortilin uzoraka 1:9 (v/v) u deuterizovan pufer (6M gvanidinjium hlorid, 99% D2O, 20mM tris, 150mM NaCl, pDread = 7.6) praćeno inkubacijom na 25°C tokom 16h pre nego što su ugašeni i obrađeni kako je prethodno opisano.
[0259] Ugašeni uzorci otopljeni su i injektovani u ohlađeni (0°C) reverzno-fazni UPLC-HDX-sistem (Waters Inc., USA) opremljen sa kućno upakovanim kolonama pepsina (unutrašnja zapremina od 60µL, pepsin perlice dobijene od Thermo Scientific Inc.). Ovde, deuterizovani uzorci proteina podvrgnuti su online pepsin digestiji na 20°C, i dobijeni peptični peptidi razdvojeni su reverzno-faznom UPLC. Peptidi su jonizovani elektrosprej jonizacijom u masenom spektrometru (Synapt G2 maseni spektrometar, Waters Inc, UK), gde su peptidi dalje razdvojeni jonskom mobilnošću pre finalne masene determinacije.
[0260] Identifikaciju peptida izvedena je na potpuno redukovanim i nedeuterizovanim uzorcima dvostrukom masenom spektrometrijom primenom kombinacije akvizicije nezavisne od podataka (MSe) i akvizicije zavisne od podataka.
Analiza podataka
Identifikacija peptida
[0261] Stečeni maseni spektri su zaključano maseno korigovani u odnosu na GFP i analiziran u PLGS 3.0, što je odgovaralo prekursor i fragment jonima u lokalnoj bazi podataka proteina. Sve identifikacije peptida pažljivo su ručno procenjene.
[0262] Određivanje inkorporacije deuterijuma: Stečeni maseni spektri su zaključano maseno korigovani u odnosu na GFP, a softver DynamX 3.0 (Waters Inc., USA) je upotrebljen za određivanje inkorporacije deuterijuma za sve peptide sortilina bilo u odsustvu ili u prisustvu antitela.
[0263] Peptid se smatra delom vezujućeg epitopa ako je zaštita od razmene veća od 0.5D zapažena u prisustvu antitela.
Table 1 - Tabela identifikovanih konformacionih epitopa pomoću HDX-MS.
Anti Epitop mapiranje pomoću HDX-MS u odnosu na SEQ ID NO:169
45 109-114 126-153 570-572 588-597
68 109-114 126-144 570-572 593-597
Primer 17: Mikrodijaliza za procenu progranulin nivoa u mozgu budnih životinja koje se slobodno kreću
[0264] Postupak mikrodijalize po principu pritisni i povuci upotrebljen za procenu mozgova ISF progranulina (PRGN) kod budnih miševa koji se slobodno kreću. Miševi su pojedinačno-smešteni pod kontrolalisanom temperaturom (22 ± 1.5°C) i uslovima vlažnosti (55-65%) i držani u 12:12 časovnom ciklusu svetlo/tama (svetla paljena u 06:00h). Hrana i voda su bili dostupni ad libitum. Trenutna studija izvedena je u hipokampusu humanih sortilin knock-in (hSORT1) miševa (22 nedelje stari). Da bi se omogućila mikrodijaliza u hipokampusu, miševi su anestezirani izofluranom i pomoću intracerebralne kanule vođice (CMA) stereotaksikalno implantirane u mozak, čime su pozicionirane mikrodijalizne sonde hipokampusu (ko-ordinate sonde tip: 3.1 mm iza i 2.8 mm bočno od bregme, i 1.3 mm blizu dura mater) u skladu sa atlasom iz Paxinos i Franklin 2001. Akrilni cement je upotrebljen za fiksiranje kanula vođica. Nakon implantacije, kanuliranim miševima je dozvoljeno da se oporave od zahvata tokom 7 dana pre dijalize. Tokom prvih 5 dana, uključujući dan zahvata, životinjama su imale tretmane protiv bolova i sa antibioticima (Rimadyl i Noromox Prolongatum).24h pre početka eksperimenata mikrodijalize, pumpa je takođe povezana za izlaz cevi kako bi se sprečio gubitak perfuzione tečnosti iz sonde, izvlačeći tečnost kroz cevi. Kao perfuzioni pufer, 25% goveđa albumin frakcija V (Sigma) je razblažena do 0.2 % sa veštačkim CSF (aCSF; u mM: 147 NaCl, 2.7 KCl, 1.2 CaCl2, 0.85 MgCl2) na dan upotrebe i filtrirana kroz 0.1-µm membranu. Stvarna brzina protoka pumpe određena je bez povezane sonde. Cevčice uzoraka izmerene su pre i nakon uzorkovanja tokom datog vremnskog perioda, i izračunata je brzina protoka. Pumpa je zatim podešena da ima konstantan protok od 1 µL/min.120-min režim uzorkovanja je upotrebljen kroz eksperimentalni period i 12 uzoraka (12h sakupljanja) su sakupljani (FIG.17, za proceduru). Na kraju eksperimenata, od životinja je uzeta krv, životinje su perfuzirane i sakupljeni su mozgovi. Dijalizati, plazme i mozgovi su uskladišteni na -80 °C do PRGN određivanja putem ELISA.
[0265] Merenje PRGN nivoa svakih 2h tokom 24h prikazano je na FIG.17. U svakom vremenskom periodu, osim 24h nakon započinjanja sakupljanja dijalizata, PRGN nivoi su bili značajno povišeni kod životinja-tretiranih sa mab #45 povišenim kada se uporedi sa onim kod životinja tretiranimhsa PBS (FIG.
18a). PRGN nivoi su bili stabilni tokom vremena od 4h do 16h nakon umetanja sonde u hipokampus. U prvom dijalizatu, PRGN su povišeni verovatno zbog umetanja sonde u hipokampus. Pretpostavlja se da su se nivoi PRGN snizili ≥ 18h/20h nakon umetanja sonde, verovatno zbog zapušavanja membrane sonde, što se dogodilo u obe grupe (i što je prethodno zapaženo kod drugih ispitivanja po principu pritisni i povuci).

Claims (9)

  1. [0266] Prosek ± SEM 12 uzoraka dijalize 24h nakon tretiranja antitelom ili vozilom, za svaku životinju, a zatim i sve pulovane životinje, uzet je kao osnovna linija (FIG.18b). Razlike između životinja-tretiranih sa mab #45 i PBS analizirane su neuparenim t-testom. Osnovni nivoi PRGN kod životinja-tretiranih sa mab #45 bili su značajno povišeni kada se uporede sa onim kod životinja tretiranih sa PBS (p<0.001, F10.0, DFn, 9 Dfd 7; 3.3 ± 0.3 ng/ml, n= 10 versus 1.1 ± 0.1 ng/ml, n= 8) (FIG.18b).
    Patentni zahtevi
    1. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, sposobno za vezivanje specifično za sortilin i inhibiranje ili redukovanje vezivanja PGRN za sortilin, pri čemu se pomenuto antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje za D Region sortilina kako je definisano od strane SEQ ID NO:170, pri čemu je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment odabrano iz grupe koju čini antitelo (3)-(21):
    Antitelo (3) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:17;
    b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:18;
    c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:19;
    d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:20;
    e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:21; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:22.
    Antitelo (4) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:25;
    b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:26;
    c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:27;
    d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:28;
    e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:29; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:30.
    Antitelo (5) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:33;
    b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:34;
    c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:35;
    d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:36;
    e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:37; i
    f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:38.
    Antitelo (6) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:41; b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:42; c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:43; d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:44; e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:45; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:46.
    Antitelo (7) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:49; b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:50; c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:51; d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:52; e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:53; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:54.
    Antitelo (8) i ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:57; b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:58; c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:59; d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:60; e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:61; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:62.
    Antitelo (9) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:65; b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:66; c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:67; d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:68; e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:69; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:70.
    Antitelo (10) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:73; b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:74; c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:75; d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:76; e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:77; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:78.
    Antitelo (11) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:81; b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:82; c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:83; d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:84; e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:85; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:86.
    Antitelo (12) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:89; b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:90; c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:91; d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:92; e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:93; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:94.
    Antitelo (13) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:97; b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:98; c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:99; d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:100; e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:101; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:102.
    Antitelo (14) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:105; b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:106; c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:107; d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:108; e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:109; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:110.
    Antitelo (15) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:113; b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:114; c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:115; d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:116; e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:117; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:118.
    Antitelo (16) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:121; b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:122; c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:123; d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:124; e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:125; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:126.
    Antitelo (17) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:129; b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:130; c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:131; d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:132; e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:133; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:134.
    Antitelo (18) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:137; b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:138; c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:139; d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:140; e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:141; i f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:142.
    Antitelo (19) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:145;
    b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:146;
    c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:147;
    d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:148;
    e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:149; i
    f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:150.
    Antitelo (20) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:153;
    b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:154;
    c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:155;
    d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:156;
    e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:157; i
    f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:158.
    Antitelo (21) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata:
    a. varijabilni domen lakog lanca L-CDR1 koji obuhvata SEQ ID NO:161;
    b. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:162;
    c. varijabilni domen lakog lanca L-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:163;
    d. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 1 koji obuhvata SEQ ID NO:164;
    e. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 2 koji obuhvata SEQ ID NO:165; i
    f. varijabilni domen teškog lanca H-CDR 3 koji obuhvata SEQ ID NO:166.
  2. 2. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1, pri čemu:
    Antitelo (3) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:24 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:23.
    Antitelo (4) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:32 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:31.
    Antitelo (5) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:40 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:39.
    Antitelo (6) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:48 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:47.
    Antitelo (7) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:56 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:55.
    Antitelo (8) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:64 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:63.
    Antitelo (9) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:72 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:71.
    Antitelo (10) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:80 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:79.
    Antitelo (11) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:88 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:87.
    Antitelo (12) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:96 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:95.
    Antitelo (13) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:104 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:103.
    Antitelo (14) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:112 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:111.
    Antitelo (15) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:120 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:119.
    Antitelo (16) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:128 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:127.
    Antitelo (17) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:136 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:135.
    Antitelo (18) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:144 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:143.
    Antitelo (19) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:152 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:151.
    Antitelo (20) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:160 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:159.
    Antitelo (21) ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:168 i varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata SEQ ID NO:167.
  3. 3. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, prema zahtevima 1-2, pri čemu je antigen-vezujući fragment odabran iz grupe koju čine: Fv fragment (npr. jednolančani Fv ili disulfidno-vezan Fv); Fab-nalik fragment (npr. Fab fragment, Fab' fragment ili F(ab)2 fragment); i domeniko antitelo (npr. pojedinačni VH varijabilni domen ili VL varijabilni domen).
  4. 4. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu se antitelo sastoji od netaknutog antitela.
  5. 5. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je antitelo odabrano iz grupe koju čine: antitelo podtipa IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.
  6. 6. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment humano, humanizovano, rekombinantno ili himerno antitelo.
  7. 7. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 6, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
  8. 8. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 6, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7, za upotrebu u medicini.
  9. 9. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 6, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u tretiranju frontotemporalne demencije (FTD), amiotrofične lateralne skleroze (ALS) ili Alchajmerove bolesti (AD).
RS20250507A 2015-07-13 2016-07-12 Antitela koja se vezuju za sortilin i inhibiraju vezivanje progranulina RS66856B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1512215.3A GB201512215D0 (en) 2015-07-13 2015-07-13 Agents,uses and methods
EP16739087.1A EP3322726B1 (en) 2015-07-13 2016-07-12 Antibodies that bind to sortilin and inhibit the binding of progranulin
PCT/EP2016/066516 WO2017009327A1 (en) 2015-07-13 2016-07-12 Antibodies that bind to sortilin and inhibit the binding of progranulin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66856B1 true RS66856B1 (sr) 2025-06-30

Family

ID=54013862

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250507A RS66856B1 (sr) 2015-07-13 2016-07-12 Antitela koja se vezuju za sortilin i inhibiraju vezivanje progranulina

Country Status (35)

Country Link
US (6) US10479835B2 (sr)
EP (1) EP3322726B1 (sr)
JP (2) JP6979397B2 (sr)
KR (1) KR102778576B1 (sr)
CN (3) CN107849135A (sr)
AR (1) AR105335A1 (sr)
AU (1) AU2016292980B2 (sr)
BR (1) BR112018000771A2 (sr)
CA (1) CA2989739A1 (sr)
CL (2) CL2018000092A1 (sr)
CO (1) CO2017012988A2 (sr)
CR (1) CR20180002A (sr)
DO (1) DOP2018000014A (sr)
EA (1) EA201890038A1 (sr)
EC (1) ECSP18002725A (sr)
ES (1) ES3024469T3 (sr)
GB (1) GB201512215D0 (sr)
HR (1) HRP20250602T1 (sr)
HU (1) HUE071424T2 (sr)
IL (1) IL256503B (sr)
JO (1) JO3710B1 (sr)
MA (1) MA42440B1 (sr)
MX (1) MX2018000506A (sr)
NI (1) NI201800007A (sr)
PE (1) PE20181014A1 (sr)
PH (1) PH12018500100A1 (sr)
PL (1) PL3322726T3 (sr)
RS (1) RS66856B1 (sr)
RU (1) RU2735639C2 (sr)
SV (1) SV2018005613A (sr)
TN (1) TN2017000534A1 (sr)
TW (1) TWI760305B (sr)
UA (1) UA125136C2 (sr)
WO (1) WO2017009327A1 (sr)
ZA (1) ZA201708613B (sr)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3991748A3 (en) 2015-04-07 2022-08-24 Alector LLC Anti-sortilin antibodies and methods of use thereof
US10849992B1 (en) 2015-04-07 2020-12-01 Alector Llc Methods of screening for sortilin binding antagonists
GB201512215D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
US10894833B2 (en) * 2017-07-20 2021-01-19 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods for treatment
PT3618928T (pt) 2018-07-13 2023-03-29 Alector Llc Anticorpos anti-sortilina e métodos de utilização dos mesmos
EP3666281A1 (en) * 2018-12-14 2020-06-17 Insusense ApS Compositions comprising sortilin-1
AU2020270966B2 (en) * 2019-04-10 2025-05-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies that bind ret and methods of use thereof
MX2022007486A (es) * 2019-12-23 2022-06-29 Denali Therapeutics Inc Variantes de progranulina.
AU2021297540A1 (en) * 2020-06-24 2023-02-02 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing sortilin
WO2023247754A1 (en) 2022-06-23 2023-12-28 Draupnir Bio Aps Bifunctional molecules that selectively induce degradation of extracellular targets in lysosomes
CN118496354A (zh) * 2023-02-15 2024-08-16 三优生物医药(上海)有限公司 包含共同轻链的抗体库、其制备方法及其用途
WO2025031098A1 (zh) * 2023-08-09 2025-02-13 瑞诺元(苏州)生物科技有限公司 一种分拣蛋白1特异性的纳米抗体、含有其的重组aav及应用
WO2025132764A1 (en) * 2023-12-21 2025-06-26 Amylonix Ab A sortilin-binding polypeptide

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
JP3070763B2 (ja) 1989-08-09 2000-07-31 ロメッド インコーポレイティド テクネチウムまたはレニウムでの抗体または他のタンパク質の直接放射能標識
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5101990A (en) 1990-03-23 1992-04-07 Continental Pet Technologies, Inc. Stretch blow molded oblong or oval container
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
AU8507191A (en) 1990-08-29 1992-03-30 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
JPH06508880A (ja) 1991-07-08 1994-10-06 ユニバーシティ　オブ　マサチューセッツ　アット　アムハースト サーモトロピック液晶セグメント化ブロックコポリマー
ES2146648T3 (es) 1993-03-09 2000-08-16 Genzyme Corp Procedimiento de aislamiento de proteinas de la leche.
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
CA2361421A1 (en) 1999-02-03 2000-08-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
DE60037896D1 (de) 1999-07-29 2008-03-13 Medarex Inc Menschliche antikörper gegen her2/neu
CN102766210B (zh) 1999-08-24 2015-07-08 E.R.施贵宝&圣斯有限责任公司 人ctla-4抗体及其应用
IL155977A0 (en) 2000-11-30 2003-12-23 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
ATE545429T1 (de) 2002-12-20 2012-03-15 Lundbeck & Co As H Modulation der neurotrophinaktivität;screeningsverfahren
US10155816B2 (en) 2005-11-28 2018-12-18 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
WO2008076262A2 (en) 2006-12-15 2008-06-26 Merck & Co., Inc. Receptor for amyloid beta and uses thereof
ES2777652T3 (es) 2006-12-21 2020-08-05 H Lundbeck As Modulación de la actividad de proneurotrofinas
WO2009097006A2 (en) 2007-08-10 2009-08-06 Medarex, Inc. Hco32 and hco27 and related examples
EP2274327B1 (en) 2008-04-27 2019-03-27 H. Lundbeck A/S Crystal structure of human sortilin and uses thereof for identifying ligands to sortilin
JP2011524741A (ja) 2008-05-27 2011-09-08 協和発酵キリン株式会社 インターロイキン１０受容体（ｉｌ−１０ｒ）抗体及び使用方法
WO2010022175A1 (en) 2008-08-19 2010-02-25 Yale University Identification of sortilin as a neuronal receptor for the frontotemporal dementia protein, progranulin
US8703125B2 (en) * 2008-12-19 2014-04-22 H. Lundbeck A/S Modulation of the Vps10p-domain receptor family for the treatment of mental and behavioural disorders
RU2536232C2 (ru) * 2011-07-01 2014-12-20 Олег Ильич Эпштейн Лекарственное средство для лечения болезни альцгеймера и способ лечения болезни альцгеймера
US9822366B2 (en) 2012-11-02 2017-11-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Sortilin 1 is a novel inducer of vascular calcification
EP3991748A3 (en) * 2015-04-07 2022-08-24 Alector LLC Anti-sortilin antibodies and methods of use thereof
GB201512215D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
US10894833B2 (en) 2017-07-20 2021-01-19 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods for treatment
PT3618928T (pt) 2018-07-13 2023-03-29 Alector Llc Anticorpos anti-sortilina e métodos de utilização dos mesmos

Also Published As

Publication number Publication date
US12331123B2 (en) 2025-06-17
PE20181014A1 (es) 2018-06-26
CN114478774A (zh) 2022-05-13
TWI760305B (zh) 2022-04-11
JO3710B1 (ar) 2021-01-31
DOP2018000014A (es) 2018-04-15
US10428147B2 (en) 2019-10-01
EP3322726B1 (en) 2025-03-12
CN107849135A (zh) 2018-03-27
WO2017009327A1 (en) 2017-01-19
US20250277040A1 (en) 2025-09-04
HK1254356A1 (en) 2019-07-19
CR20180002A (es) 2018-04-09
CO2017012988A2 (es) 2018-05-21
CA2989739A1 (en) 2017-01-19
ECSP18002725A (es) 2018-03-31
JP6979397B2 (ja) 2021-12-15
UA125136C2 (uk) 2022-01-19
US20180305455A1 (en) 2018-10-25
EP3322726A1 (en) 2018-05-23
SV2018005613A (es) 2018-02-23
GB201512215D0 (en) 2015-08-19
KR20180030045A (ko) 2018-03-21
IL256503B (en) 2022-02-01
US10479835B2 (en) 2019-11-19
MA42440A (fr) 2018-05-23
US20200190188A1 (en) 2020-06-18
US20170267761A1 (en) 2017-09-21
IL256503A (en) 2018-02-28
JP2018529635A (ja) 2018-10-11
AR105335A1 (es) 2017-09-27
US10889650B2 (en) 2021-01-12
BR112018000771A2 (pt) 2018-09-25
MA42440B1 (fr) 2025-05-30
AU2016292980A1 (en) 2018-01-18
NI201800007A (es) 2018-10-18
TW201702273A (zh) 2017-01-16
CN114478775A (zh) 2022-05-13
TN2017000534A1 (en) 2019-04-12
US11548950B2 (en) 2023-01-10
ZA201708613B (en) 2021-03-31
PH12018500100A1 (en) 2018-07-30
CL2018000092A1 (es) 2018-07-06
JP2022003058A (ja) 2022-01-11
CL2020002468A1 (es) 2021-01-29
HUE071424T2 (hu) 2025-08-28
RU2018100824A (ru) 2019-08-13
MX2018000506A (es) 2018-05-11
ES3024469T3 (en) 2025-06-04
AU2016292980B2 (en) 2022-10-06
HRP20250602T1 (hr) 2025-07-18
RU2018100824A3 (sr) 2020-01-17
EP3322726C0 (en) 2025-03-12
KR102778576B1 (ko) 2025-03-07
EA201890038A1 (ru) 2018-06-29
PL3322726T3 (pl) 2025-06-23
RU2735639C2 (ru) 2020-11-05
US20210269524A1 (en) 2021-09-02
US20230159643A1 (en) 2023-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12331123B2 (en) Agent, uses and methods for treatment
KR102800556B1 (ko) 치료를 위한 제제, 용도 및 방법
HK1254356B (en) Antibodies that bind to sortilin and inhibit the binding of progranulin
EA053189B1 (ru) Средства, пути применения и способы лечения