RS67068B1

RS67068B1 - Nove imunoregulatorne ćelije i postupci za nјihovu proizvodnјu

Info

Publication number: RS67068B1
Application number: RS20250764A
Authority: RS
Inventors: James Hutchinson; Edward Geissler
Original assignee: Ferring Ventures Sa
Priority date: 2016-03-11
Filing date: 2017-03-13
Publication date: 2025-08-29
Also published as: JP2021052774A; EP3216861A1; EP4471130A3; JP2023030114A; HUE072322T2; SI3426771T1; CN109415701A; EP3426771A1; EP4471130A2; CA3017409C; CA3017409A1; SMT202500366T1; JP2025081763A; WO2017153607A1; US20260009002A1; ES3037515T3; EP3426771B1; FI3426771T3; HRP20250930T1; JP2019508067A

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na nove imunoregulatorne ćelije makrofaga, koje su korisne u lečenju različitih imunoloških i neimunoloških bolesti i stanja. Ćelije su naznačene specifičnim markerom i obrascem aktivnosti, koji ih razlikuje od drugih ćelija. Pronalazak, takođe, obezbeđuje postupak za pripremu imunoregulatornih ćelija makrofaga iz monocita iz krvi. U još jednom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži imunoregulatorne ćelije makrofaga predmetnog pronalaska.

OBLAST PRONALASKA

[0002] Transfer imunoregulatornih ćelija sa tolerantnog donora na netolerantnog primaoca kao sredstvo za uspostavljanje tolerancije kod primaoca je dobro poznata tehnika u eksperimentalnoj imunologiji, ali njena klinička primena tek sada dobija značajnu pažnju [1]. Trenutno, nekoliko tipova imunoregulatornih ćelija dostiže tačku pretkliničkog razvoja, što će im omogućiti da budu ispitani kao imunosupresivna sredstva u ranim fazama kliničkih ispitivanja, uključujući regulatorne T ćelije [2], tolerogene dendritske ćelije [3] i regulatorne makrofage [4].

[0003] Širok spektar imunoloških stanja može biti podložan lečenju ćelijskim imunoregulatornim terapijama, uključujući autoimune bolesti posredovane T i B ćelijama, hronične inflamatorne poremećaje, bolest kalem protiv domaćina (GVHD) i odbacivanje transplantata. U ovim stanjima, ćelijske imunoregulatorne terapije mogu da smanje ili čak da otklone potrebu za opštom imunosupresivnom ili antiinflamatornom terapijom, čime čuvaju pacijente od pratećih komplikacija. Pošto je vrsta imunološke tolerancije koju podržavaju regulatorne ćelije dominantna i samoodrživa, postoji mogućnost da ćelijska imunoregulatorna terapija ponudi lekovitu opciju kod bolesti koje bi inače zahtevale dugoročnu opštu imunosupresivnu ili antiinflamatornu terapiju.

[0004] Jedan tip ćelija kandidata koji posebno obećanja za upotrebu kao pomoćno imunosupresivno sredstvo u transplantaciji je imunoregulatorni makrofag (ovde i u literaturi nazvan „Mreg“). Mreg ćelija odražava jedinstveno stanje diferencijacije makrofaga, koje se razlikuje od makrofaga u drugim stanjima aktivacije po svom robusnom fenotipu i snažnoj funkciji supresora T-ćelija [5]. Humani Mreg snažno suzbijaju proliferaciju mitogenom stimulisanih T-ćelija in vitro, što se može pripisati aktivnosti indolamin 2,3-dioksigenaze indukovanoj interferonom (IFN) γ, kao i kontaktno zavisnoj deleciji aktiviranih T ćelija. Pored toga, Mreg pokreću razvoj aktiviranih indukovanih regulatornih T ćelija koje, zauzvrat, suzbijaju proliferaciju efektorskih T ćelija i inhibiraju sazrevanje dendritskih ćelija. Stoga, kada se Mreg daju primaocu, pretpostavlja se da se pokreće petlja imunološke regulacije koja dovodi do dugoročnog imunološkog prihvatanja stranog transplantata ili prevencije imunopatologije. Ćelijski preparati koji sadrže Mreg davani su ukupno 19 primalaca transplantata bubrega kao oblik dodatne imunosupresivne terapije u nizu studija slučaja i dva klinička ispitivanja u ranoj fazi [5]-[9]. Ove pilot studije jasno pokazuju izvodljivost ove tehnike za transplantaciju čvrstih organa.

[0005] Dodatna dva primaoca transplantacije bubrega od živog donora sada su lečena sa približno 8,0×10<6>ćelija/kg čistijih Mreg ćelija dobijenih od donora [5]. Ova dva pacijenta su sada više od 6 godina nakon transplantacije sa stabilnom bubrežnom funkcijom na monoterapiji niskim dozama takrolimusa kao jedinim imunosupresivom za održavanje. Dodatno kliničko ispitivanje Mreg terapije kod transplantacije bubrega od živog donora sada ima regulatorno odobrenje u okviru studije ONE (Clinicaltrials.gov: NCT02085629). Ovo ispitivanje ima za cilj lečenje 16 pacijenata Mreg ćelijama dobijenim od donora u dozi od 2,5×10<6>do 7,5×10<6>/kg telesne težine uz primenu mikofenolat mofetila u dozi od 500 mg/dan, 7. dana pre operacije.

[0006] WO 2015/048641 A2 stavlja na uvid javnosti postupak pomeranja makrofaga ka imunoregulatornom M2 fenotipu ili inhibiranja formiranja profibrotičnih makrofaga dodatkom serumskog amiloida P (SAP). Ancuta et al. (2009): „Transcriptional profiling reveals developmental relationship and distinct biological functions of CD16+ and CD16- monocyte subsets“, BMC GENOM-ICS, vol. 10, br. 1, strana 403 opisuje razvojni odnos i različite biološke funkcije CD16+ i CD16- monocitnih podskupova. Publikacija se bavi monocitima i ne odnosi se na regulatorne makrofage. Hutchinson et al. (2011): „Human regulatory macrophages“, Methods in Molecular Biology, vol. 677, str. 181-192 i Hutchinson et al. (2012): „Human regulatory macrophages as a cell-based medicinal product“, Current Opinion in Organ Transplantation, vol. 17, br. 1, str. 48-54 odnose se na stvaranje i karakterizaciju imunoregulatornih makrofaga, uključujući ćelijsku kulturu CD14+ monocita sa komponentama ćelijske kulture kao što su M-CSF i interferon gama. Međutim, nijedna od ovih publikacija ne opisuje kultivaciju u kesama.

[0007] Uprkos velikom napretku koji je postignut poslednjih godina u oblasti imunoregulatornih ćelija, postoji stalna potreba za regulatornim ćelijama koje se mogu koristiti u terapeutske svrhe, npr. za indukovanje imunološkog prihvatanja stranog transplantata kod primaoca, i za postupcima pripreme ovih ćelija na najefikasniji način. Posebno, postoji potreba za terapijama zasnovanim na ćelijama koje omogućavaju smanjenje uobičajeno korišćenih imunosupresivnih lekova koji su redovno povezani sa visokim stepenom toksičnosti za pacijenta.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0008] Predmetni pronalazak obezbeđuje novi tip Mreg ćelija koji se značajno razlikuje od Mreg ćelija koje su ranije opisane. Utvrđeno je da je modifikovani postupak za proizvodnju Mreg ćelija neočekivano doveo do novog tipa Mreg ćelija. Posebno, pronalazači su otkrili da kada su monocitne ćelije korišćene za pripremu Mreg ćelija kultivisane u gas propusnim kesama umesto u bocama za ćelijsku kulturu, dobijene su Mreg ćelije jedinstvenog fenotipa koje pokazuju imunoregulatorna svojstva koja ih čine veoma pogodnim za terapijske pristupe zasnovane na ćelijama. Ove ćelije su ovde označene kao „Mreg-bc“ kako bi se razlikovale od poznatih Mreg ćelija.

[0009] Shodno tome, u prvom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju novog tipa makrofaga koji uključuje kultivaciju monocita iz uzorka krvi subjekta u gas propusnoj kesi u prisustvu M-CSF, CD16 liganda (kao što je imunoglobulin) i IFN-γ.

[0010] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na novi tip Mreg ćelija, tj. Mreg-bc ćelije, koje se mogu dobiti postupkom navedenom u prvom aspektu pronalaska. Mreg-be ćelija ima jedinstven fenotip koji nije primećen u prethodnom stanju tehnike. Mreg-bc ćelija posreduje u biološkim aktivnostima koja daju korisna terapeutska svojstva koja su jedinstvena za ovaj tip ćelija i nisu opisana u prethodnom stanju tehnike.

[0011] U trećem aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži Mregbc ćeliju prema drugom aspektu pronalaska. Farmaceutska kompozicija koja sadrži novi tip ćelija pronalaska može, takođe, da sadrži dodatne aktivne sastojke ili ekscipijense po potrebi.

[0012] U četvrtom aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu Mreg-bc ćelije prema drugom aspektu pronalaska ili farmaceutske kompozicije prema trećem aspektu pronalaska u terapeutske svrhe, posebno za suzbijanje neželjenih imunoloških reakcija.

[0013] Konačno, u petom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za pripremu imunoregulatorne T ćelije kokultivacijom T ćelija iz uzorka krvi subjekta sa Mreg-bc ćelijom prema drugom aspektu pronalaska.

KRATAK OPIS SLIKA

[0014]

Slika 1 pokazuje da je ligacija FcγRIII pokreće razvoj Mreg. (A) Humani Mreg generisani u medijumu dopunjenom sa 10% HABS pokazuju karakterističnu morfologiju širenja, dok IFN-γ MΦ uzgajan u medijumu koji sadrži 10% FCS, ali pod inače identičnim uslovima, dobija nepravilan, izduženi oblik (stubić = 50 µm). (B&C) Nakon tretmana HABS-a hloroformom (Chl-HABS) njegov kapacitet indukovanja Mreg nije izgubljen, što ukazuje na postojanje nelipidne komponente humanog seruma odgovorne za razvoj Mreg (n=6). (D) Kultura monocita u humanom serumu sa smanjenim Ig smanjila je eksprimovanje DHRS9 mRNK u poređenju sa Mreg uzgajanim u 10% HABS (n=4). Dodavanjem ili Ig prečišćenog iz seruma ili IVIG povratilo je eksprimovanje DHRS9 mRNK. (D&E) Eksprimovanje DHRS9 mRNK makrofagima kultivisanim u 10% FCS moglo se indukovati donekle i prečišćenim Ig i IVIg. (H) Antitelo protiv FcγRIII je najefikasnije u sprečavanju HABS indukovane eksprimovanja DHRS9 mRNK od strane makrofaga uzgajanih u uslovima kulture Mreg (n=5). (G) Dodavanje blokirajućeg antitela protiv FcγRIII, ali ne i drugih Fcγ-receptora, sprečilo je monocite da steknu Mreg morfologiju (stubić = 50 µm). (H) Utišavanje ekspimovanja FcγRIII korišćenjem siRNK potvrdilo je ulogu FcγRIII u indukciji Mreg fenotipa serumskim imunoglobulinom. U svim slučajevima, stubičasti grafikoni prikazuju srednju vrednost ± SEM.

Slika 2 prikazuje poređenje fenotipa Mreg kultivisanih u bocama i Mreg-bc. (A) Mreg kultivisani u bocama (crveni tragovi) i Mreg-bc (plavi tragovi) su eksprimovali konstelaciju ćelijskih površinskih markera koja definiše Mreg<->CD14<-/nisko>CD16<-/nisko>CD80<-/nisko>CD86<+>CD85h<+>CD258<+>. Signali izotipske kontrole su prikazani sivom bojom. (B) Deo Mreg-bc, ali ne i Mreg kultivisani u bocama, eksprimovao je antigene CD10, Clec9a i CD103. (C) Mreg kultivisani u bocama, ali ne i Mreg-bc, eksprimovali su visoke nivoe antigena CD209, Syndecan-3 i CD38.

Slika 3 pokazuje da eksprimovanje člana 9 (DHRS9) dehidrogenaze/reduktaze (SDR familija) jedinstveno identifikuje Mreg fenotip. (A) ASOT1 mAb je prepoznao antigen koji eksprimuju Mreg, ali ne i drugi tipovi makrofaga. (B) Antigen od oko 35 kD je specifično istaložen pomoću ASOT1. Ovaj istaloženi antigen je identifikovan masenom spektrometrijom kao DHRS9. (C) Jako eksprimovanje DHRS9 mRNK je detektovano u Mreg, ali ne i u drugim tipovima makrofaga (n=6). (D) ASOT1 je istaložio antigen koji je, takođe, prepoznat od strane zečjeg pAb i mišjeg mAb anti-DHRS9, potvrđujući da ASOT1 prepoznaje DHRS9. (E) Imunobloting sa zečjim anti-DHRS9 pAb pokazao je da eksprimovanje DHRS9 na nivou proteina razlikuje Mreg od drugih tipova makrofaga.

Slika 4 prikazuje koeksprimovanje IDO i arginaze-1 od strane Mreg. (A) Mreg ćelije, Mreg ćelije proizvedene bez stimulacije IFN-γ i Mreg ćelije tretirane lipopolisaharidom eksprimovale su značajno veće nivoe ARG1 mRNK nego uporedni tipovi makrofaga (n=3; srednja vrednost ± SEM). (B) Bojenje protočnom citometrijom otkriva koeksprimovanje IDO i Arg1 od strane pojedinačnih Mreg ćelija.

Slika 5 pokazuje da T ćelije koje su kokultivisane sa Mreg-bc inhibiraju proliferaciju T ćelija. Funkcionalne posledice izlaganja Mreg-bc za alogene CD3<+>T ćelije su ispitivane u eksperimentima kokulture. (A) Humani Mreg-bc generisani iz CD14<+>monocita iz periferne krvi su kokultivisani u odnosu 1:1 sa alogenim CD3<+>T ćelije izolovanim korišćenjem CD3 mikroperlica (Miltenyi) u X-vivo 10 medijumu dopunjenom sa 2 mM Glutamax-a i 25 ng/ml rhM-CSF tokom 5 dana. Alternativno, Mreg-bc su kokultivisani u odnosu 1:1 sa alogenim nativnim CD4<+>T ćelijama izolovanim korišćenjem mikroperlica (Miltenyi) iz kompleta za negativnu izolaciju nativnih CD4<+>T ćelija, koje su zatim inkubirane sa CD3 mikroperlicama (Miltenyi). Nakon 5 dana kokulture, T ćelije su ponovo izolovane za fenotipizaciju protočnom citometrijom. Korišćenjem konvencionalnih postupaka za bojenje ćelijske površine i intracelularno bojenje, npr. Foxp3 puferski komplet za fiksaciju i permeabilizaciju (eBiosciences), kokultivisane T ćelije su obogaćene sa CD4<+>CD25<+>TIGIT<+>FoxP3<+>Treg. Alternativno, ponovo izolovane T ćelije se koriste kao supresorske ćelije u testu proliferacije alogenih T ćelija stimulisanih anti-CD3, zasnovanom na razblaživanju CFSE. (B) Proliferacija CD4<+>T ćelija respondera obeleženih sa CFSE stimulisanih anti-CD3 vezanim za pločicu bila je inhibirana u većoj meri alogenim T ćelijama kokultivisanim sa Mreg nego T ćelijama koje su kultivisane same tokom 5 dana (n=6; srednja vrednost ± SEM). (C) CD3<+>T ćelije kokultivisane sa alogenim Mreg-bc tokom 5 dana obogaćene su za CD25<+>FoxP3<+>Treg, koje su se lako razlikovale od CD25<+>FoxP3<nisko>poliklono aktiviranih T ćelija, koje su stimulisane αCD3/αCD28 perlicama tokom 5 dana. (Podaci reprezentativni za n=4 para donora.)

Slika 6 pokazuje da Mreg ispoljavaju jedinstvenu morfologiju i fenotip ćelijske površine. (A) Mreg u kulturi stiču prepoznatljivu morfologiju (stubić = 50 µm). (B) Transmisiona elektronska mikrografija Mreg pokazuje čvrsto prianjanje na površinu kulture, aktivna jezgra sa obilnim finim hromatinom, brojne ćelijske procese i lipidne inkluzije. (C) Mreg se pouzdano razlikuju od drugih stanja polarizacije makrofaga po svojoj karakterističnoj morfologiji u kulturi. (D) Mreg se razlikuju od panela uporednih makrofaga po konstelaciji markera ćelijske površine: CD14<-/nisko>CD16<->TLR2<-/nisko>i CD163<->(n=6; srednja vrednost ± SEM).

Slika 7 prikazuje eksprimovanje CD85h (LILRA2; ILT1) i CD258 (TNFSF14; LIGHT), koji su identifikovani analizama biomikročipova kao markeri humanih Mreg, koji se eksprimuju na površini ćelije pomoću Mreg, ali ne i pomoću IFN-γ makrofaga, što je pokazano protočnom citometrijom.

Slika 8 pokazuje da Mreg-bc generišu TIGIT+ Treg koji proizvode IL-10 in vivo. (A) Sposobnost humanih Mreg-bc ćelija da indukuju TIGIT+ iTreg in vivo ispitivana je korišćenjem imunodeficijentnog (NSG) modela miša. NSG miševi primili su ili (i) i.v. injekciju od 5 × 10<6>samo humanih nativnih CD4+ T ćelija ili (ii) i.v. injekciju od 5 × 10<6>humanih nativne CD4+ T ćelije plus odvojenu i.v. injekciju od 5 × 10<6>alogenih humanih Mreg ćelija. Nakon 5 dana, procenjeni su nivoi humanog IL-10 u serumu i frekvenciju humanih TIGIT+ Treg ćelija u slezini (n=12 parova donora). (B) Primaoci tretirani Mreg pokazali su veću frekvenciju Treg ćelija u slezini i nešto veće frekvencije TIGIT+ CD4+ T ćelija nego netretirane kontrolne životinje. (C) Nivoi humanog IL-10 u serumu bili su značajno viši kod primalaca tretiranih sa Mreg nego kod kontrolne grupe.

Slika 9 prikazuje postavku eksperimenta za testiranje da li Mreg-bc ćelije proizvode angiogeni faktor VEGF-A nakon stimulacije monofosforil lipidom A (MPLA).

Slika 10 prikazuje eksprimovanje članova porodice vaskularnog endotelnog faktora rasta pomoću Mreg nakon stimulacije lipopolisaharidom (LPS) ili pod hipertoničnim uslovima kulture. (A) LPS stimulacija je izazvala eksprimovanje VEGF-A, VEGF-C, ali ne i VEGF-D; međutim, LPS stimulacija je, takođe, izazvala eksprimovanje TNF-α, snažnog inflamatornog citokina. (B) Mreg su reagovali na povećanje koncentracije NaCl lučenjem VEGF-C, ali ne i VEGF-A ili VEGF-D; kritično je da hipertoničnost nije izazvala eksprimovanje TNF-α.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0015] Prema predmetnom pronalasku, Mreg-bc ćelije izvedene su iz humanih CD14+ monocita iz krvi. Da bi se indukovale karakteristične biološke osobine Mreg-bc ćelija, monociti se tretiraju specifičnom kombinacijom faktora rasta, citokina i receptorskih liganda. Ćelije dobijene postupkom predmetnog pronalaska naznačene su jedinstvenim fenotipom, koji ih razlikuje od monocita iz krvi, drugih vrsta makrofaga izvedenih iz monocita, dendritskih ćelija izvedenih iz monocita i drugih supresivnih mijelomonocitnih ćelijskih proizvoda opisanih u stanju tehnike.

[0016] Shodno tome, u prvom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za pripremu novog tipa imunoregulatornih ćelija makrofaga, a dati postupak obuhvata:

(a) izolovanje CD14 pozitivnih monocita iz uzorka krvi subjekta;

(b) kultivisanje monocita u gas propusnoj plastičnoj kesi u medijumu za ćelijsku kulturu koji sadrži (i) M-CSF i (ii) ligand CD16, pri čemu je koncentracija M-CSF u rasponu od 5-100 ng/ml;

(c) dovođenje ćelija u kontakt sa IFN-γ, pri čemu je koncentracija IFN-γ u rasponu od 5-100 ng/ml; i

(d) dobijanje imunoregulatorne ćelije makrofaga iz medijuma za ćelijsku kulturu,

pri čemu se monociti u koraku (b) kultivišu najmanje 5 dana pre stimulacije sa IFN-γ.

[0017] Postupak prema pronalasku koristi monocite u krvi kao polazni materijal. Iako će biti poželjno da se postupak prema pronalasku koristi za generisanje Mreg-bc ćelija iz monocita iz humane krvi, pronalazak nije ograničen na diferencijaciju ćelija humanog porekla. U stvari, pronalazak je primenljiv i na druge tipove ćelija koje nisu humane, posebno ćelije kičmenjaka, npr. ćelije primata koji nisu ljudi ili svinja. Na ovaj način, pronalazak pruža važan doprinos u oblasti ksenogene transplantacione medicine.

[0018] Prema jednoj poželjnoj realizaciji, postupak prema pronalasku se koristi za diferencijaciju CD14 pozitivnih monocita humanog donora u Mreg-bc. Monociti koji služe kao polazni materijal za postupak prema pronalasku dobijaju se iz periferne krvi humanog donora. Donor može biti zdrav subjekt ili pacijent koji pati od jedne ili više bolesti. U jednoj realizaciji, donor monocita je predviđeni primalac diferenciranih Mreg-bc ćelija (autologni pristup). U drugoj realizaciji, donor monocita je osoba odvojena od predviđenog primaoca diferenciranih Mreg-bc ćelija (alogeni pristup). U ovom drugom slučaju, donor i primalac mogu biti genetski srodni ili nesrodni. U drugoj realizaciji, donor monocita je osoba odvojena od predviđenog primaoca diferenciranih Mreg-bc ćelija, ali je takođe i donor drugih ćelija, tkiva ili organa za transplantaciju istom primaocu. Preferirani odnos između donora i primaoca zavisi od kliničke primene. Upotreba autolognih Mreg-bc ćelija može pomoći u izbegavanju određenih neželjenih reakcija. Stoga je upotreba autolognih Mreg-bc ćelija poželjnija u slučaju regenerativnih ili antiinflamatornih terapija. U uslovima transplantacije, upotreba Mreg-bc ćelija dobijenih od donora kao imunosupresivne terapije je poželjnija, jer su ćelije koje eksprimuju antigen donora efikasnije od ćelija dobijenih od recipijenta [11].

[0019] Različiti postupci su poznati u tehnici za obogaćivanje mononuklearnih ćelija iz periferne krvi, i svaki od ovih postupaka može se koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska. Na primer, krv dobijena venepunkcijom može se tretirati antikoagulansom, a zatim odvojiti upotrebom medijuma za razdvajanje, kao što je Ficoll-Paque Plus. Za ovo se uzorak krvi tretiran antikoagulansom nanosi na rastvor Ficoll-Paque Plus-a i centrifugira, što će rezultirati formiranjem slojeva koji sadrže različite tipove ćelija. Donji sloj sadrži eritrocite koji su agregirani i sedimentovani pomoću reagensa Ficoll-Paque Plus-a. Sloj neposredno iznad sloja eritrocita sadrži uglavnom granulocite koji su migrirali kroz sloj Ficoll-Paque Plus-a. Zbog svoje manje gustine, monociti i limfociti se nalaze na granici između plazme i Ficoll-Paque Plus-a. Obogaćivanje frakcije mononuklearnih ćelija može se postići izolacijom sloja i naknadnim ispiranjem i centrifugiranjem.

[0020] Još jedan rutinski korišćeni postupak za odvajanje mononuklearnih leukocita iz uzoraka krvi uključuje leukaferezu. Leukafereza je specifična vrsta afereze u kojoj se bela krvna zrnca dobijaju iz periferne krvi prema njihovoj relativnoj gustini u kontinuiranom procesu. U ovom postupku, krv subjekta se propušta kroz poseban uređaj za centrifugiranje, koji sakuplja odabranu frakciju belih krvnih zrnaca i vraća preostale krvne ćelije i plazmu nazad davaocu. Leukafereza je danas rutinska klinička mera za dobijanje leukocita ili matičnih ćelija iz periferne krvi. Dostupni su različiti uređaji od nekoliko proizvođača, koji se mogu koristiti za izvođenje leukafereze u kontekstu predmetnog pronalaska, npr. COBE<®>Spectra Apheresis System od Terumo BCT. Tamo gde se leukafereza sprovodi pomoću COBE<®>Spectra Apheresis System-a, poželjno je koristiti ručni protokol koji je obezbedio proizvođač, jer je utvrđeno da ovaj protokol rezultira monocitima boljeg kvaliteta u poređenju sa AutoPBSC protokolom.

[0021] I upotreba medijuma za razdvajanje kao što je Ficoll-Paque Plus i upotreba uređaja za leukaferezu obezbediće ćelijsku frakciju koja, pored monocita, sadrži i limfocite. Prema predmetnom pronalasku, monociti se mogu obogatiti i odvojiti od limfocita poznatim postupcima, npr. magnetnom separacijom perli, sortiranjem protočnom citometrijom, elurijacijom, filtracijom ili plastičnom adhezijom, pre nego što se ćelije uvedu u postupak pripreme iz predmetnog pronalaska. Međutim, nije obavezno koristiti homogenu frakciju monocita u postupku predmetnog pronalaska. U stvari, prisustvo količine od 0,1-20%, poželjno 10-20% limfocita u frakciji monocita može pozitivno uticati na diferencijaciju monocita u regulatorne makrofage.

[0022] U jednoj realizaciji pronalaska, frakcija monocita koja se koristi u postupku pronalaska je u suštini čista i sadrži manje od 15%, manje od 10%, manje od 5%, manje od 4%, manje od 3%, manje od 2% ili manje od 1% nemonocitnih nuklearnih krvnih ćelija, kao što su limfociti ili granulociti. Za dobijanje preparata mononuklearnih ćelija koji je obogaćen monocitima, mononuklearne ćelije periferne krvi mogu se dovesti u kontakt, npr. sa CD14 mikroperlicama za koje se vezuju CD14-pozitivni monociti. U jednoj realizaciji, monociti u koraku (a) se izoluju leukaferezom, a zatim podvrgavaju koraku razdvajanja korišćenjem CD14 afinitetnih molekula, poželjno CD14 antitela. Takav korak prečišćavanja značajno smanjuje kontaminaciju početnog materijala nemonocitima. Smanjenje kontaminacije T ćelija je veoma vredno sa stanovišta bezbednosti pacijenata jer minimizira potencijalni rizik od reakcija ’donor protiv primaoca’. U poželjnoj realizaciji pronalaska, CD14 monociti, koji se koriste u postupku pronalaska, izolovani su pomoću CliniMACS<®>tehnologije (Miltenyi Biotec GmbH, Bergiš Gladbah, Nemačka).

[0023] Frakcija monocita, koja je izolovana leukaferezom i/ili drugim postupcima, može se direktno koristiti za diferencijaciju inkubacijom sa M-CSF i CD16 ligandom, ili se može čuvati u autolognoj plazmi dopunjenoj rastvorom antikoagulansnog citrata i dekstroze (ACD-A) ili bilo kojim drugim odgovarajućim puferom do dalje upotrebe. Ako se izolovana frakcija monocita mora transportovati na drugo mesto gde se sprovodi proces diferencijacije, treba voditi računa da se diferencijacija ćelija inkubacijom sa M-CSF započne u roku od 24 sata nakon izolacije ćelija, poželjno u roku od 18 sati, u roku od 12 sati, u roku od 6 sati, u roku od 4 sata ili u roku od 2 sata nakon izolacije monocita. Za dugoročno skladištenje, frakcija monocita može se resuspendovati u odgovarajućem rastvoru za krioprezervaciju i čuvati na temperaturama ispod 20°C, poželjno ispod 80°C tokom dužeg vremenskog perioda.

[0024] Nakon izolacije monocita, ćelije se inkubiraju u prisustvu M-CSF i CD16 liganda. Na primer, ćelije mogu biti suspendovane u medijumu koji sadrži M-CSF i CD16 ligand. Alternativno, takođe je moguće dodati M-CSF i CD16 ligand neko vreme nakon početka kultivacije ćelija. Medijum za ćelijsku kulturu koji se koristi u koraku (b) gore navedenog postupka može biti bilo koji medijum koji je u literaturi opisan kao pogodan za upotrebu u kultivaciji monocita i/ili makrofaga. Pogodni medijumi za ćelijsku kulturu uključuju, na primer, PromoCell Macrophage Generation Medium (PromoCell GmbH, Hajdelberg, Nemačka), Dulbecco-ov modifikovani Eagle medijum (DMEM), DMEM:F12 smešu, Medium 199 ili RPMI-1640 medijum. Medijum za ćelijsku kulturu je poželjno hemijski definisan medijum. Pored M-CSF, medijum za ćelijsku kulturu može da sadrži i druge faktore za podsticanje preživljavanja i diferencijacije Mreg, uključujući: faktore rasta i citokine, kao što su epidermalni faktor rasta (EGF) ili IL-4; masne kiseline, holesterol i drugi lipidi; vitamini, transferin i elementi u tragovima; insulin, glukokortikoidi, holekalciferol ili ergokalciferol i drugi hormoni; nespecifični imunoglobulin i drugi proteini plazme. U poželjnoj realizaciji pronalaska, medijum za ćelijsku kulturu je RPMI-1640 ili medijum izveden iz njega.

[0025] Medijum za ćelijsku kulturu koja se koristi za inkubaciju izolovanih CD14 pozitivnih monocita sadrži faktor stimulacije kolonija makrofaga (M-CSF, takođe poznat kao CSF1). M-CSF je u tehnici poznat kao hematopoetski faktor rasta koji utiče na proliferaciju, diferencijaciju i preživljavanje monocita, makrofaga i progenitorskih ćelija kostne srži. Faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF, takođe poznat kao CSF2) je monomerni glikoprotein koji funkcioniše kao citokin i luče ga makrofagi, T ćelije, mastociti, NK ćelije, endotelne ćelije i fibroblasti. Proteini M-CSF i GM-CSF različitih vrsta su opisani i mogu se kupiti od različitih proizvođača. Izbor M-CSF koji se koristi u postupku predmetnog pronalaska zavisiće od porekla monocita koji treba da se diferenciraju u Mreg-bc ćelije. Na primer, ako se humani monociti diferenciraju u Mreg-bc korišćenjem ovde opisanog postupka, korišćeni medijum će da sadrži humani M-CSF, poželjno rekombinantni humani M-CSF. Slično tome, ako se svinjski monociti koriste u postupku diferencijacije, M-CSF dodat u medijum biće svinjskog porekla. U posebno poželjnoj realizaciji pronalaska, M-CSF je humanog porekla, kao što je rekombinantni humani M-CSF, a monociti su humani monociti.

[0026] Stručnjak će biti u stanju da pronađe količinu M-CSF koja je pogodna za diferencijaciju velikog udela monocita u Mreg-bc rutinskim postupcima. Prema pronalasku, koncentracija M-CSF u medijumu za ćelijsku kulturu u koraku (b) gore navedenog postupka je u rasponu od 5-100 ng proteina po ml medijuma. Eksperimenti vremenskog toka za merenje količine M-CSF u medijumu za ćelijsku kulturu pokazali su da je M-CSF potrošen ili razgrađen tokom vremena, tako da su kulture sa početnom dozom od 5 ng/ml M-CSF sadržale subfiziološke koncentracije do 2. dana kultivacije; nasuprot tome, kulture sa početnom dozom od 25 ng/ml M-CSF održavale su koncentracije >10 ng/ml tokom 7-dnevnog perioda kultivacije. Dakle, u poželjnoj realizaciji pronalaska, koncentracija M-CSF u medijumu za ćelijsku kulturu je u rasponu od 20-75 ng/ml, 20-50 ng/ml ili 20-25 ng/ml. Posebno je poželjna koncentracija od najmanje 25 ng M-CSF po ml medijuma za ćelijsku kulturu. Poželjno je da se gore navedene koncentracije odnose na rekombinantni humani M-CSF.

[0027] U slučajevima kada se u medijumu koriste i M-CSF i GM-CSF, ukupne koncentracije ova dva faktora rasta biće u gore pomenutom rasponu, tj. u rasponu od 20-75 ng/ml, 20-50 ng/ml ili 20-25 ng/ml. Posebno je poželjna ukupna koncentracija M-CSF i GM-CSF od 25 ng M-CSF po ml medijuma za ćelijsku kulturu.

[0028] Pored M-CSF, medijum za ćelijsku kulturu koji se koristi u koraku (b) gore navedenog postupka takođe sadrži i CD16 ligand. Utvrđeno je da je stimulacija CD16 ćelijskog površinskog receptora na monocitima potrebna da bi se indukovala njihova diferencijacija u Mreg-bc ćelije. Konkretnije, eksperimenti sprovedeni u toku predmetnog pronalaska otkrili su da se monociti uzgajani u medijumu dopunjenom humanim AB serumom (HABS) razvijaju u Mreg, dok se monociti uzgajani u medijumu dopunjenom fetalnim telećim serumom (FCS) ne razvijaju u Mreg. Monociti uzgajani u jednakoj smeši oba seruma razvijaju Mreg-fenotip. Stoga, HABS sadrži pozitivnu Mreg indukujuću aktivnost (videti Sl. 1A&B). Uklanjanje frakcije HABS koja se može ekstrahovati hloroformom pokazalo je da se Mreg indukujuća aktivnost HABS uglavnom nalazi unutar frakcije otporne na hloroform, tako da je verovatno da je u pitanju protein (videti Sl. 1B&C). Frakcionisanjem po veličini, utvrđeno je da je glavna proteinska komponenta HABS odgovorna za razvoj Mreg-bc >100 kDa, što je dovelo do hipoteze da je nepoznati faktor imunoglobulin (Ig). HABS osiromašen za Ig korišćenjem protein A/G sefaroze nije bio u stanju da podrži razvoj morfologije Mreg-bc i eksprimovanje DHRS9 mRNK (videti Sl. 1D). Ponovno dodavanje elutriranog Ig nazad u serum osiromašen za Ig (ili dodavanje IVIg) obnovilo je njegovu sposobnost da indukuje eksprimovanje DHRS9 (videti Sl. 1D). Slično, kada su monociti kultivisani u FCS dopunjenom humanim Ig, povećanje eksprimovanja DHRS9 mRNK je primećeno u poređenju sa kontrolama, koje su tretirane samo sa FCS, i dobijena je normalna morfologija Mreg-bc (Sl. 1D&E). Monociti tretirani sa anti-FcγRIII antitelom eksprimovali su značajno niže nivoe DHRS9 mRNK nego monociti tretirani anti-Fc saγRI (CD64), anti-FcγRIIa/b (CD32a/b) ili kontrolnim antitelom (videti Sl. 1F) i nisu razvili Mreg-bc morfologiju (videti Sl. 1G). Blokada samo bilo kog od FcγRIIb ili DC-SIGN, ili oba receptora zajedno, nije imala uticaja na stvaranje DHRS9<+>Mreg (videti Sl. 1H). Da bi se pojačalo zapažanje da je FcγRIII neophodan za stvaranje Mreg-bc, eksprimovanje FcγRIII je utišano korišćenjem siRNK (videti Sl. 1I). Prolazna supresija eskprimovanja transkripta FCGR3A i FCGR3B postignuta je u sveže izolovanim monocitima kultivisanim u 10% HABS; važno je da eksprimovanje FCGR2B nije smanjeno ovom manipulacijom. Knockdown FcγRIII na nivou proteina je dokazano protočnom citometrijom (35,2% ± 4,4 CD16<+>ćelija korišćenjem negativne kontrolne siRNK, u odnosu na 15,3% ± 3,7 sa FCGR3 siRNK; n=4, p=0,002). Utišavanje eksprimovanja FcγRIII (ali ne i supresija eksprimovanja MAPK1 ili tretman sa siRNK negativnom kontrolom) rezultiralo je značajnim smanjenjem eksprimovanja DHRS9 mRNK (videti Sl.1I).

[0029] Iz gore navedenih nalaza zaključeno je da serumski Ig deluje preko FcγRIII (CD16) da indukuje Mreg fenotip. Zavisnost Mreg diferencijacije od FcγRIII razlikuje Mreg od drugih tipova makrofaga indukovanih Ig kompleksom opisanih u stanju tehnike. Konkretno, način derivacije razlikuje Mreg indukovan FcγRIII od makrofaga indukovanog FcγRIIb, makrofag indukovan FcγRI i makrofage generisane u odsustvu imunoglobulina koji su opisani u stanju tehnike.

[0030] Pošto je stimulacija receptora na površini CD16 ćelija ključna za diferencijaciju u željeni Mreg-bc fenotip, postupak prema pronalasku uključuje inkubaciju monocita sa CD16 ligandom u koraku (b). Ligand koji se vezuje za receptor će poželjno biti humani ili nehumani imunoglobulin, a još poželjnije humani imunoglobulin ili njegov fragment. Fragment imunoglobulina može biti, na primer, Fc fragment imunoglobulina. Imunoglobulin ili fragment imunoglobulina se poželjno dodaje u medijum za ćelijsku kulturu bez seruma. Alternativno, mogu se koristiti rekombinantni proteini koji sadrže sekvencu imunoglobulina ili fragment imunoglobulina, kao što je sekvenca humanog imunoglobulina. U drugoj realizaciji, nehumano ili humano antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za CD16 preko svog domena za prepoznavanje antigena koristi se za podsticanje Mreg-bc diferencijacije. U još jednoj realizaciji, mali molekuli se koriste za stimulaciju CD16 signalnog puta kako bi se podstakla Mreg-bc diferencijacija.

[0031] U poželjnoj realizaciji, medijum koji se koristi za generisanje Mreg-bc ćelija sadrži 1-20% humanog seruma ili ekvivalentne količine određenih komponenti seruma, kao što je imunoglobulin. Poželjnije je da se medijum dopuni sa 10% seruma. Ako se za sprovođenje postupka predmetnog pronalaska koriste medijumi koji sadrže serum, medijum sadrži između 5-15%, poželjno 10%, humanog seruma. Posebno je poželjan medijum koji sadrži 10% humanog AB seruma. Drugim rečima, poželjno je da se serum doda u koncentraciji od oko 0,01 do 10 mg/ml, poželjno oko 0,1 do 1 mg/ml, a još poželjnije oko 1 mg/ml. Nešto niže koncentracije mogu se koristiti kada se koriste imunoglobulin ili fragmenti imunoglobulina kao CD16 ligandi. Značajno niže koncentracije mogu se koristiti ako su imunoglobulin ili drugi CD16 ligandi imobilizovani na površinama tkivne kulture, perlama ili drugim fizičkim matricama. Dalje je poželjno da humani serum, kao što je AB serum, potiče od muških donora. Kada se koristi serum od ženskih donora, treba voditi računa da donori ne koriste progesteronska ili progesteron-estrogenska kontraceptivna sredstva. Dalje je poželjno da dati medijum ne sadrži antitela protiv monocita ili Mreg-bc ćelija ili bilo kog intermedijarnog oblika, uključujući antitela protiv glavnih molekula histokompatibilnosti.

[0032] Takođe je utvrđeno da antibiotici u medijumu za ćelijsku kulturu nisu imali merljiv efekat na vitalnost, prinos, fenotip ili supresivnu funkciju Mreg-bc proizvedenih postupkom prema pronalasku. Shodno tome, poželjno je da medijum koji se koristi u koraku (b) postupka prema pronalasku ne sadrži nikakav antibiotik.

[0033] Tamo gde su Mreg-bc ćelije namenjene za upotrebu u terapeutskim primenama u kojima je poželjna indukcija angiogeneze (videti u daljem tekstu), medijum koji se koristi za kultivisanje monocita u koraku (b) postupka predmetnog pronalaska može da sadrži, pored M-CSF i CD16 liganda, ligand receptora nalik toll-u (TLR), kao što je lipopolisaharid (LPS), monofosforil lipid A (MPLA) ili protein 1 grupe visoke mobilnosti (HMGB1) radi poboljšanja proizvodnje angiogenih faktora kao što je VEGF-A. TLR ligand se može dodati u medijum za ćelijsku kulturu u rasponu koncentracije od 1000 ng/ml do 1 µg/ml, poželjno između 50-500 ng/ml, kao što je 100 ng/ml, 200 ng/ml, 300 ng/ml ili 400 ng/ml. U slučajevima kada se dodaje više od jednog TLR liganda, ukupna koncentracija ovih liganda treba da bude u gorenavedenom rasponu. TLR ligand se može dodati u bilo kojoj fazi proizvodnog postupka. Može biti prisutan u početnom medijumu koji se koristi za kultivaciju monocita, tj.0. dana kultivisanja, ili se može dodati u kasnijoj fazi, npr. 5, 6. ili 7. dana kultivisanja. Poželjno je da se TLR ligand dodaje istovremeno sa dodatkom IFN-γ.

[0034] Prema predmetnom pronalasku, postupak za pripremu Mreg-bc ćelija uključuje kultivisanje monocita u prisustvu M-CSF i CD16 liganda u gas propusnoj kesi. Kada se monociti suspenduju u odgovarajućem medijumu, ćelijske suspenzije se prenose u gas propusne plastične kese za ćelijsku kulturu i diferencijaciju. Kese za ćelijsku kulturu ćelija dostupne su od različitih dobavljača, na primer, od Miltenyi Biotec GmbH (Bergiš Gladbah, Nemačka), Thermo Fisher Scientific (Šverte, Nemačka) ili Merck (Darmštat, Nemačka). Kese će biti napravljene od plastičnog materijala koji omogućava pričvršćivanje kultivisanih ćelija za unutrašnju površinu kese za ćelijsku kulturu. Poželjne su kese koje se sastoje od poliolefina ili polietilena.

[0035] Kese će poželjno biti dizajnirane tako da omoguće gustinu ćelijske naslage od 1-2 × 10<6>monocita po cm<2>unutrašnje površine kulture. To znači da ćelijska suspenzija koja sadrži 180 × 10<6>monocita se poželjno kultiviše u kesi koja ima unutrašnju površinu od najmanje 90 cm<2>i ne više od 180 cm<2>. Optimalna gustina ćelija u suspenziji je poželjno između oko 1 × 10<5>ćelija/ml i 1 × 10<7>ćelija/ml, a poželjnije 1 × 10<6>ćelije/ml. Odnos zapremine ćelijske suspenzije i zapremine kese je najmanje 1,0, poželjno 0,2, a još poželjnije 0,06 kako bi se minimizirala količina medijuma iz kojeg se Mreg-bc mora koncentrovati na kraju kultivisanja. To znači da će kesa za ćelijsku kulturu od 3 l biti napunjena sa 1 l ćelijske suspenzije ili manje, poželjno 600 ml ili manje, a još poželjnije 180 ml ili manje. U poželjnoj realizaciji postupka prema predmetnom pronalasku, zapremina kesa koje se koriste za kultivaciju monocita u medijumu koji je dopunjen sa M-CSF i CD16 ligandom je najmanje 3 l.

[0036] Nakon što su monociti prebačeni u kese za ćelijsku kulturu, ćelije se inkubiraju u kesama u prisustvu M-CSF i CD16 liganda, npr. humanog seruma ili humanih imunoglobulina, najmanje 5 dana pre stimulacije IFN-γ. Kako se ovde koristi, period kultivacije od „1 dan“ odnosi se na 24 sata kultivacije. Shodno tome, period kultivacije od „najmanje 3 dana“ odnosi se na 72 sata kultivacije ili više. Optimalni period stimulacije IFN-γ je najmanje 12 sati, poželjno 18 sati, a još poželjnije 24 sata. Prema predmetnom pronalasku, ukupan period kultivacije, tj. vremenski period od unošenja monocita u kese za ćelijsku kulturu do sakupljanja Mreg-bc je najmanje 5 dana, najmanje 6 dana, najmanje 7 dana ili najmanje 8 dana. Drugim rečima, ukupan period kultivacije je između 5 i 8 dana, poželjno između 6 i 8 dana, još poželjnije 7 dana. Monociti u kesama za ćelijsku kulturu se inkubiraju pod uslovima koji omogućavaju njihov rast i diferencijaciju u Mreg-bc ćelije. Opšti uslovi za kultivaciju monocita ili makrofaga su poznati stručnjaku u oblasti kultivacije ćelija.

[0037] Na primer, kese koje sadrže suspenzije mogu se preneti u inkubacionu komoru koja omogućava izbor definisanih uslova temperature, vlažnosti i CO2. Pogodni uslovi su temperatura u rasponu od 30-40°C, poželjno između 32-38°C, a još poželjnije između 37-38°C, npr. 37°C. Vlažnost koja se koristi za kultivaciju je obično u rasponu od 30-70%, poželjno 40-60%, a još poželjnije 50-60%, npr.60% vlažnosti. Inkubaciona komora može da sadrži do 10% CO2. Sadržaj do 5% CO2, do 4% CO2, do 3% CO2, do 2% CO2, ili do 1% CO2je posebno poželjno. Kese su poželjno postavljene ravno na policu inkubacione komore tokom inkubacije.

[0038] Monociti u kesama se poželjno povremeno blago tresu kako bi se omogućilo njihovo poluadherentno pričvršćivanje za donji list (stranu) kese za ćelijsku kulturu. Poželjno je da se kese okreću najmanje jednom tokom ukupnog perioda kultivacije kako bi se omogućilo njihovo pričvršćivanje za suprotni list kese. U drugoj realizaciji, kesa se okreće najmanje dva puta tokom ukupnog perioda kultivacije. U drugoj realizaciji, kesa se okreće najmanje tri ili četiri puta tokom ukupnog perioda kultivacije. U još jednoj realizaciji, kesa se okreće svaka 24 sata tokom ukupnog perioda kultivacije. U drugoj realizaciji, kesa se okreće svakih 36 sati tokom ukupnog perioda kultivacije. U još jednoj realizaciji, kesa se okreće svakih 48 sati tokom ukupnog perioda kultivacije.

[0039] U koraku (c) postupka pronalaska, ćelije se dovode u kontakt sa citokinskim interferonom gama (IFN-γ). Poznato je u tehnici da citokin menja transkripciju više od 30 gena, čime proizvodi različite fiziološke i ćelijske odgovore. IFN-γ proteini su izolovani iz različitih vrsta i mogu se kupiti od različitih proizvođača. Izbor IFN-γ koji se koristi u postupku pronalaska zavisiće od porekla monocita koji se podvrgavaju postupku pronalaska. Na primer, ako se humani monociti diferenciraju u Mreg-bc korišćenjem ovde opisanog postupka, dodatni IFN-γ biće humani IFN-γ, poželjno rekombinantni humani IFN-γ. Slično, ako se svinjski monociti koriste u postupku diferencijacije, IFN-γ dodat u medijum biće svinjskog porekla. U posebno poželjnoj realizaciji pronalaska, IFN-γ je humani IFN-γ, poželjnije rekombinantni humani IFN-γ.

[0040] Može se dodati bilo koja količina IFN-γ, koja je efikasna za indukovanje eksprimovanja indolamin 2,3-dioksigenaze (IDO) od strane monocita u kulturi. Količina IFN-γ koja se dodaje u kulturu monocita je u rasponu od 5-100 ng/ml, poželjnije između 10-80 ng/ml, još poželjnije između 20-50 ng/ml. Količina od 25 ng IFN-γ po ml medijuma za ćelijsku kulturu je ovde posebno poželjna.

[0041] IFN-γ se može dodati u medijum istovremeno sa M-CSF i CD16 ligandom, što znači da se citokin može dodati, npr. u vreme kada se monociti unose u kese za ćelijsku kulturu. U takvoj realizaciji, monociti koji se diferenciraju postupkom pronalaska biće kultivisani u prisustvu M-CSF, CD16 liganda i IFN-γ tokom čitavog perioda kultivacije. Međutim, poželjno je da period kultivacije u prisustvu IFN-γ bude znatno kraći od perioda kultivacije u prisustvu M-CSF, što znači da se IFN-γ dodaje tek nakon što su ćelije kultivisane najmanje 5 dana u prisustvu M-CSF. Poželjno je da su ćelije kultivisane najmanje 6 dana u prisustvu M-CSF pre dodavanja IFN-γ. U posebno poželjnoj realizaciji, IFN-γ se dodaje nakon što su ćelije kultivisane 5-6 dana u prisustvu M-CSF, a kultivacija se zatim nastavlja još 18-72 sata.

[0042] U posebno poželjnoj realizaciji pronalaska, diferencirane ćelije se sakupljaju 7. dana, npr. nakon 6 dana kultivacije monocita u medijumu koji sadrži M-CSF i CD16 ligand, nakon čega sledi 18-24 sata IFN-γ stimulacije. Kada je nekoliko kesica kultivisano uporedno, sadržaj kesica se može sakupiti na kraju procesa kultivacije. Diferencirani makrofagi mogu se isprati puferom, koji je kompatibilan za upotrebu sa makrofagima. Na primer, Ringerov rastvor ili fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS), poželjno dopunjen sa 5% humanog serumskog albumina, mogu se koristiti za ispiranje ćelija serijskom izmenom pufera centrifugiranjem i dekantovanjem supernatanta. U toku predmetnog pronalaska, utvrđeno je da upotreba tripsina ne poboljšava prinos imunoregulatornih makrofaga. Stoga je ovde poželjno da korak sakupljanja ne uključuje dodavanje tripsina.

[0043] Ove Mreg-bc ćelije mogu se preneti i čuvati u transfuzionoj kesi, staklenom infuzionom uređaju ili u drugom kontejneru zatvorenog sistema koji omogućava transport ćelija do centra za lečenje ili do pacijentovog kreveta. U tu svrhu, diferencirane ćelije će biti suspendovane u odgovarajućem medijumu za konzervaciju. Medijum za konzervaciju može biti, na primer, Ringerov rastvor, koji je poželjno dopunjen sa 5% humanog serumskog albumina. U posebno poželjnoj realizaciji, medijum za konzervaciju je medijum spreman za upotrebu, koji ne sadrži serum i/ili proteine. Pogodan medijum spreman za upotrebu koji je komercijalno dostupan je HypoThermosol<®>FRS (Stemcell Technologies SARL, Keln, Nemačka). Poželjno je da medijum ima pH vrednost između 6,5 i 8,0, još poželjnije između 7,0 i 7,5, kao što je 7,4. Ćelijski rastvor treba čuvati na 4°C kako bi se minimizirala potrošnja energije i ćelijska adhezija. Alternativno, Mreg-bc ćelije se mogu resuspendovati u rastvoru za krioprezervaciju i čuvati u zamrznutom obliku do konačne upotrebe.

[0044] Fenotipska i funkcionalna stabilnost diferenciranih ćelija makrofaga predmetnog pronalaska zavisi od izbora ekscipijensa i temperature skladištenja. Kada se resuspenduju u Ringerovom rastvoru dopunjenom humanim serumskim albuminom, makrofagi predmetnog pronalaska su stabilni na 20°C do 25°C do 24 sata nakon sakupljanja ćelija. Kada se resuspenduju u HipoTermosolu<®>FRS, makrofagi se mogu čuvati na 2-8°C, poželjno 4°C, najmanje 72 sata nakon sakupljanja ćelija. Kada su potrebni duži periodi skladištenja, ćelije se mogu podvrgnuti zamrzavanju ili krioprezervaciji. Generalno, utvrđeno je da su ćelije predmetnog pronalaska stabilne u svom imunosupresivnom fenotipu. Tretman proinflamatornim medijatorima, npr. lipopolisaharidom, ne dovodi do razvoja stimulatornog fenotipa kod njih.

[0045] Postupak za pripremu Mreg-bc ćelija prema predmetnom pronalasku može se automatizovati prema uobičajenim postupcima, npr. korišćenjem platforme koja je u skladu sa GMP propisima i nudi integrisana rešenja koja pojednostavljuju radne procese obrade ćelija. Proces se poželjno odvija u „zatvorenom sistemu“ koji koristi prednosti zatvorenih posuda za jednokratnu upotrebu, opcionog prilagođavanja kompleta cevi, pufera i reagensa, višestrukih ulaznih linija sa sterilnim filterima, izlaznih linija za opcione kontrole tokom procesa i znatno smanjenih zahteva za čistom prostorijom. Na primer, platforma može da obhvata sistem za odvajanje ćelija, koji omogućava odvajanje monocita od frakcije belih krvnih zrnaca. Sistem za odvajanje ćelija treba da bude u stanju da odvoji monocite iz početne zapremine od 100-1000 ml aferezata ili cele periferne krvi. Monociti koji se nalaze u izolovanim mononuklearnim frakcijama belih krvnih zrnaca mogu se zatim izolovati, npr. putem magnetnih perli, koje se vezuju za CD14+ ćelije. Ove ćelije se zatim kultivišu u odgovarajućem medijumu za ćelijsku kulturu. Platforma omogućava obezbeđivanje medijuma, faktora rasta i/ili citokina ćelijskoj kulturi preko višestrukih ulaznih portova. Na kraju procesa kultivacije, ćelije se automatski ispiraju, sakupljaju i prenose u odgovarajuće sterilne kese za isporuku. Može se koristiti prilagođeni zatvarač epruveta koji omogućava sterilno zatvaranje PVC i EVA epruveta. Ćelijski proizvod može biti bar-kodiran, a ceo proces proizvodnje može se pratiti onlajn radi kontrole kvaliteta.

[0046] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na novi tip Mreg ćelija, nazvanih Mreg-bc ćelije, koje se mogu dobiti postupkom prvog aspekta pronalaska. Ćelije koje obezbeđuje pronalazak su humani makrofagi izvedeni iz monocita i, kao takve, eksprimuju uobičajene leukocitne markere i markere makrofagne loze, posebno CD45, CD11b, CD33 i HLA-DR. Mreg ćelije se razlikuju od monocita, panela uporednih makrofaga (tj. makrofagi u mirovanju, M1, M2a, M2b i M2c) i dendritskih ćelija izvedenih iz monocita po konstelaciji loze i aktivacionih markera - naime, CD14.<-/nisko>CD16<-/nisko>CD80<-/nisko>CD86<+>CD85h<+>CD258<+>(videti Sl.2A). CD85h se eksprimuje u Mreg i monocitima, ali se njegova ekspresija gubi u makrofagima u mirovanju, M1 makrofagima, M2a makrofagima, M2b (stimulisanim Ig kompleksom) makrofagima, M2c (tretiranim deksametazonom) makrofagima i dendritskim ćelijama izvedenim iz monocita. CD258 se eksprimuje u Mreg i M2b makrofagima, ali se ne eksprimuje u monocitima, makrofagima u mirovanju, M1 makrofagima, M2a makrofagima, M2c (tretiranim deksametazonom) makrofagima i dendritskim ćelijama izvedenim iz monocita.

[0047] Upoređujući Mreg-bc, tj. ćelije kultivisane u kesama, sa Mreg kultivisanim pod inače identičnim uslovima u bocama, Mreg-bc konstantno eksprimuju niže nivoe CD14, CD16 i CD80 nego ćelije kultivisane u bocama. Mreg-bc konstantno eksprimuju više nivoe CD85h i CD258 nego Mreg kultivisani u bocama. Mreg-bc se mogu razlikovati od onih koji su kultivisani u bocama po eksprimovanju markera Clec-9a, CD10 i CD103 (videti Sl. 2B). Alternativno, za razliku od uobičajenih Mreg, Mreg-bc ne eksprimuju (ili eksprimuju samo u malim količinama) markere CD38, CD209 i Syndecan-3 (videti Sl.2C). Karakteristično je da svi humani Mreg, bilo kultivisani u kesama ili kultivisani u bocama, eksprimuju relativno visoke nivoe DHRS9, retinol dehidrogenaze iz SDR porodice retinol dehidrogenaza (videti Sl.

3). Pojedinačne humane Mreg ćelije, bilo kultivisane u kesi ili kultivisane u boci, istovremeno eksprimuju i indolamin 2,3-dioksigenazu (IDO) i arginazu-1 (Arg1), što nije primećeno kod drugih tipova makrofaga izvedenih iz monocita opisanih u stanju tehnike (videti Sl.4).

[0048] Shodno tome, pronalazak obezbeđuje Mreg-bc ćeliju koja se može dobiti postupkom pronalaska opisanim gore, a koja ne eksprimuje jedan ili više markera CD38, CD209 i Syndecan-3 (ili eksprimuje ove markere samo na niskom nivou). Ovde je ćelija negativna za određeni površinski marker ako je njen intenzitet fluorescencije, izmeren protočnom citometrijom, manji od intenziteta fluorescencije 99. percentila odgovarajućeg izotipskog kontrolno obojenog uzorka. Poželjno je da su Mreg-bc ćelije pronalaska negativne za CD209. Mreg-bc ćelije su dalje ili negativne za CD38, ili eksprimuju niske nivoe CD38. Tokom generisanja Mreg-bc ćelija, početna populacija monocita smanjuje eksprimovanje CD38 na površini ćelije. Smanjenje eksprimovanja CD38 tokom razvoja Mreg-bc može se izraziti kao procenat eksprimovanja CD38 na Mreg-bc 7. dana u poređenju sa monocitima 0. dana (d0) kulture. Eksprimovanje CD38 je proporcionalno razlici u srednjem intenzitetu fluorescencije između ćelije obojene kontrolnim izotipom i specifičnog CD38 signala. Dakle, % smanjenja = 100 - 100 × (CD38d7- Izod7)/(CD38d0- Isod0), gde je CD38d7specifični signal 7. dana; Isod7je izotipski kontrolni signal 7. dana; CD38d0je specifični signal 0. dana; Isod0je izotipski kontrolni signal 0. dana. Smanjenje eksprimovanja CD38 od strane Mreg-bc ćelija može se pogodno odrediti korišćenjem standardnih postupaka protočne citometrije. Prema poželjnoj realizaciji, eksprimovanje CD38 od strane Mreg-bc ćelija je smanjena za više od 50% u odnosu na početnu eksprimovanje CD38 od strane monocita 0. dana kulture, poželjnije za više od 60%, za više od 70%, za više od 80%, za više od 90%, za više od 95% ili za više od 99%.

[0049] Slično tome, tokom generisanja Mreg-bc ćelija, početna populacija monocita stiče nizak nivo eksprimovanja Syndecana-3 na površini ćelije, dok Mreg ćelije kultivisane u bocama stiču viši nivo eksprimovanja Syndecana-3 na površini ćelije. Stoga, diferencirane Mreg-bc ćelije dobijene postupkom predmetnog pronalaska ne eksprimuju marker Syndecan-3 ili eksprimuju marker samo na relativno niskom nivou. Eksprimovanje Syndecana-3 od strane Mreg-bc ćelija može se izraziti u odnosu na eksprimovanje Syndecana-3 na Mreg ćelijama kultivisanim u bocama. Eksprimovanje Syndecana-3 je proporcionalna razlici u srednjem intenzitetu fluorescencije između ćelije obojene kontrolnim izotipom i specifičnog signala Syndecana-3. Dakle, % eksprimovanja = (Syndecan-3Mreg-bc- IsoMreg-bc)/(Syndecan-3boca- Isoboca), pri čemu Syndecan-3Mreg-bcje specifični signal Mreg-bc ćelija obojenih sa Syndecan-3 7. dana; IsoMreg-

bcje signal izotipski kontrolno obojenih Mreg-bc ćelija 7. dana; Syndecan-3bocaje specifični signal ćelija Mreg obojenih sa Syndecan-3 kultivisanih u boci 7. dana; Izobocaje signal izotipski kontrolno obojenih Mreg ćelija kultivisanih u boci 7. dana. Relativno eksprimovanje Syndecana-3 od strane Mreg-bc ćelija i Mreg kultivisanih u boci može se pogodno odrediti korišćenjem standardnih postupaka protočne citometrije. Prema poželjnoj realizaciji, relativno eksprimovanje Syndecana-3 od strane Mreg-bc ćelija u poređenju sa Mreg kultivisanim u boci (izraženo kao % eksprimovanja) je manje od 50%, poželjnije manja od 40%, manje od 30%, manje od 20%, manje od 15%, manje od 10%, manje od 5% ili manje od 1%.

[0050] Poželjno je da Mreg-bc ćelije pronalaska eksprimuju najmanje jedan od markera CD85h i CD258, još poželjnije oba markera. Mreg-bc ćelija poželjno eksprimuje jedan ili više markera Clec-9a, CD103 i CD10. Drugim rečima, pronalazak obezbeđuje Mreg-bc ćeliju koja eksprimuje jedan ili više markera Clec-9, CD103 i CD10. Poželjno je da data ćelija eksprimuje najmanje jedan od markera CD85h i CD258, još poželjnije oba markera. Mreg-bc ćelija poželjno, takođe, ne eksprimuje jedan ili više markera CD38, CD209 i Syndecan-3 (ili eksprimuje jedan ili više ovih markera samo na relativno niskom nivou). U posebno poželjnoj realizaciji, Mreg-bc ćelija koja je ovde data ne eksprimuje markere CD38, CD209 i Syndecan-3, a istovremeno eksprimuje markere CD85h, CD258, Clec-9, CD103 i CD10. Dakle, Mreg-bc ćelije dobijene postupkom predmetnog pronalaska su makrofagi koji se mogu opisati jednim od sledećih obrazaca markera:

(1). CD45<+>, CD85h<+>, CD38<-/nisko>;

(2). CD45<+>, CD85h<+>, CD209<-/nisko>;

(3). CD45<+>, CD85h<+>, Syndecan 3<-/nisko>;

(4). CD45<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>;

(5). CD45<+>, CD258<+>, CD209<-/nisko>;

(6). CD45<+>, CD258<+>Syndecan 3<-/nisko>;

(7). CD45<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>;

(8). CD45<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD209<-/nisko>;

(9). CD45<+>, CD85h<+>, CD258<+>Syndecan 3<-/nisko>;

(10). CD45<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>, CD209<-/nisko>;

(11). CD45<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>Syndecan 3<-/nisko>;

(12). CD45<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD209<-/nisko>Syndecan 3<-/nisko>;

(13). CD45<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>, CD209<-/nisko>Syndecan 3<-/nisko>; (14). CD33<+>, CD85h<+>, CD38<-/nisko>;

(15). CD33<+>, CD85h<+>, CD209<-/nisko>;

(16). CD33<+>, CD85h<+>, Syndecan 3<-/nisko>;

(17). CD33<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>;

(18). CD33<+>, CD258<+>, CD209<-/nisko>;

(19). CD33+, CD258<+>Syndecan 3<-/nisko>;

(20). CD33<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>;

(21). CD33<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD209<-/nisko>;

(22). CD33<+>, CD85h<+>, CD258<+>, Syndecan 3<-/nisko>;

(23). CD33<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>, CD209<-/nisko>;

(24). CD33<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>, Syndecan 3<-/nisko>;

(25). CD33<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD209<-/nisko>, Syndecan 3<-/nisko>;

(26). CD33<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>, CD209<-/nisko>, Syndecan 3<-/nisko>; (27). CD11b<+>, CD85h<+>, CD38<-/nisko>;

(28). CD11b<+>, CD85h<+>, CD209<-/nisko>;

(29). CD11b<+>, CD85h<+>, Syndecan 3<-/nisko>;

(30). CD11b<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>;

(31). CD11b<+>, CD258<+>, CD209<-/nisko>;

(32). CD11b<+>, CD258<+>, Syndecan 3<-/nisko>;

(33). CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>;

(34). CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD209<-/nisko>;

(35). CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, Syndecan 3<-/nisko>;

(36). CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>, CD209<-/nisko>;

(37). CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>, Syndecan 3<-/nisko>;

(38). CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD209<-/nisko>, Syndecan 3<-/nisko>;

(39). CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>, CD209<-/nisko>, Syndecan 3<-/nisko>; (40). CD45<+>, CD11b<+>, CD85h<+>, CD38<-/nisko>;

(41). CD45<+>, CD11b<+>, CD85h<+>, CD209<-/nisko>;

(42). CD45<+>, CD11b<+>, CD85h<+>, Syndecan 3<-/nisko>;

(43). CD45<+>, CD11b<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>;

(44). CD45<+>, CD11b<+>, CD258<+>, CD209<-/nisko>;

(45). CD45<+>, CD11b<+>, CD258<+>, Syndecan 3<-/nisko>;

(46). CD45<+>, CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>;

(47). CD45<+>, CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD209<-/nisko>;

(48). CD45<+>, CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, Syndecan 3<-/nisko>;

(49). CD45<+>, CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>, CD209<-/nisko>;

(50). CD45<+>, CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>, Syndecan 3<-/nisko>; (51). CD45<+>, CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD209<-/nisko>, Syndecan 3<-/nisko>; (52). CD45<+>CD11b<+>CD85h<+>CD258<+>CD209<-/nisko>Clec-9a<+>

(53). CD45<+>, CD11b<+>, CD85h<+>, CD258<+>, CD38<-/nisko>, CD209<-/nisko>, Syndecan 3<-/nisko>;

[0051] Posebno je poželjno da Mreg-bc ćelija ne eksprimuje ili ne eksprimuje u značajnoj meri CD34. CD34 je uobičajeno korišćeni marker za hematopoetske matične ćelije i progenitorske ćelije u kliničkoj hematologiji. Poželjno je da manje od 30% Mreg-bc ćelija dobijenih postupkom pronalaska eksprimuje CD34 nakon 7 dana kultivacije, poželjnije manje od 20%, manje od 15%, manje od 10%, manje od 5% ili manje od 1%. U jednoj realizaciji pronalaska, ćelije makrofaga pronalaska su izvedene od humanog subjekta, tj. humanog su porekla.

[0052] Profil markera Mreg-bc ćelije može se pogodno odrediti korišćenjem standardnih postupaka protočne citometrije. Postupci i reagensi koji su korisni za određivanje površinskih markera ćelija opširno su opisani u literaturi. Poželjno je da se fenotip markera Mreg-bc ćelija pronalaska određuje kao što je opisano u delu Primeri.

[0053] Ovde je utvrđeno da se prelazak monocita u regulatorne makrofage odvija postepeno. Tokom generisanja ćelija, početna populacija CD14+ monocita postepeno gubi eksprimovanje CD14 na površini ćelije. Stoga, u drugoj poželjnoj realizaciji, diferencirana Mreg-bc ćelija dobijena postupkom pronalaska ne eksprimuje ili ne eksprimuje u značajnoj meri marker CD14 koji je karakterističan za monocitnu lozu. Smanjenje eksprimovanja CD14 tokom razvoja Mreg-bc može se izraziti kao procenat eksprimovanja CD14 na Mreg-bc 7. dana u poređenju sa monocitima 0. dana kulture. Eksprimovanje CD14 je proporcionalna razlici u intenzitetu fluorescencije između ćelije obojene kontrolnim izotipom i specifičnog CD14 signala. Dakle, % smanjenja eksprimovanja = 100 - 100 × (CD14d7- Isod7)/(CD14d0- Isod0) gde je: CD14d7specifični signal 7. dana; Isod7izotipski kontrolni signal 7. dana; CD14d0je specifični signal 0. dana; Isod0je izotipski kontrolni signal 0. dana. Smanjenje eksprimovanja CD14 od strane Mreg-bc ćelija može se pogodno odrediti korišćenjem standardnih postupaka protočne citometrije. Poželjno je da tokom procesa diferencijacije monocita u Mreg-bc, eksprimovanje CD14 bude smanjeno za više od 25%, poželjno za više od 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, a još poželjnije za više od 95%.

[0054] Mreg-bc ćelije su posebno pogodne za upotrebu u terapeutske svrhe, kao što je detaljnije objašnjeno u daljem tekstu. U konceptu, Mreg-bc terapija je terapija dobitka funkcije, što znači da će primena Mreg-bc ćelija sa imunosupresivnim, antiinflamatornim ili tkivno-reparativnim funkcijama nadoknaditi deficit tih ćelijskih funkcija kod primaoca. Primenom odgovarajuće velikih doza, biće moguće obnoviti ili premašiti date aktivnosti kod primaoca. U modelima transplantacije i autoimunih bolesti, Mreg-bc tretman ima terapeutski efekat koji traje duže od njihovog životnog veka kod primaoca. Ovaj trajni efekat može se objasniti uticajem Mreg-bc tretmana na T ćelije primaoca. Administriranje Mreg-bc ćelija može uticati na odgovore T ćelija primaoca na tri komplementarna načina.

(a) Mreg-bc ćelije direktno interreaguju sa T ćelijama primaoca, što rezultira specifičnom delecijom T ćelija ili konverzijom u aktivirane indukovane regulatorne T ćelije (iTreg).

(b) Mreg-bc ćelije menjaju ponašanje dendritskih ćelija primaoca putem direktne interakcije ili oslobađanja antiinflamatornih medijatora. Jedna važna funkcija Mreg-bc ćelija može biti da umru u odgovarajuće samokondicioniranom okruženju i predaju antigene dendritskim ćelijama primaoca, koje zauzvrat specifično suzbijaju T ćelije primaoca.

(c) Mreg-bc ćelije vrše aktivno ili pasivno nespecifično supresivno dejstvo kroz oslobađanje rastvorljivih medijatora koji mogu delovati direktno ili vršiti efekte preko mijelomonocitnih ćelija primaoca.

[0055] Pored svoje supresivne aktivnosti na T ćelije, Mreg-bc ćelije pronalaska pokazuju dodatne karakteristične odlike koje ih čine vrednim za terapeutsku upotrebu. Kao što je prikazano u Primeru 6, Mreg-bc ćelije pronalaska luče biološki relevantne količine vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF-A) i drugih proangiogenih medijatora nakon stimulacije ligandima receptora nalik toll-u (TLR), kao što su lipopolisaharid (LPS), monofosforil lipid A (MPLA) ili protein 1 grupe visoke mobilnosti (HMGB1). Kao posledica toga, Mreg-bc ćelije pronalaska su pogodne za lečenje bolesti i stanja gde je poželjna indukcija angiogeneze, kao što su ishemijske bolesti i stanja.

[0056] U četvrtom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži Mreg-bc ćeliju iz drugog aspekta pronalaska. Farmaceutska kompozicija će sadržati, kao prvu komponentu, efikasnu količinu Mreg-bc ćelija iz pronalaska. Kako se ovde koristi, efikasna količina Mreg-bc ćelija koja se primenjuje na pacijenta biće u rasponu od oko 1×10<4>do oko 1×10<8>/kg telesne težine, poželjno između oko 1×10<5>i oko 1×10<7>/kg telesne težine, a poželjnije između oko 1×10<6>i oko 9×10<6>/kg telesne težine, kao što je oko 1×10<6>/kg, oko 2×10<6>/kg, oko 3×10<6>/kg, oko 4×10<6>/kg, oko 5×10<6>/kg, oko 6×10<6>/kg, oko 7×10<6>/kg, ili oko 8×10<6>/kg telesne težine pacijenta koji se leči.

[0057] Pored ćelija, farmaceutska kompozicija može da sadrži dodatne ekscipijense, kao što su puferi, sredstva za regulisanje pH vrednosti, konzervansi i slično. Priroda i količine ekscipijenasa uključenih u farmaceutsku kompoziciju pronalaska zavisiće od predviđenog načina davanja. Generalno, različiti načini davanja/administriranja su izvodljivi za obezbeđivanje Mreg-bc ćelija pronalaska pacijentu kome je potrebno lečenje. Poželjno je da farmaceutska kompozicija pronalaska bude formulisana za parenteralnu primenu, kao što je supkutana, intramuskularna, intravenska ili intradermalna primena. Posebno je poželjno da se Mreg-bc ćelije ili kompozicija koja sadrži navedene ćelije ili frakcije primenjuju kod pacijenta intravenskom primenom.

[0058] Formulacija Mreg-bc ćelija pronalaska u farmaceutske kompozicije može se postići primenom rutinskih postupaka poznatih u oblasti formulacije lekova. Pogodni postupci opisani su, na primer, u standardnim udžbenicima. Farmaceutske kompozicije pogodne za intravenoznu primenu putem injekcije ili infuzije obično uključuju sterilne vodene rastvore ili suspenzije i sterilne praškove za ekstemporalnu pripremu sterilnih rastvora ili suspenzija. Kompozicija namenjena za injekciju mora biti sterilna i treba da bude tečna kako bi se omogućilo praktično rukovanje u špricu ili infuzionoj kesi.

[0059] Kompozicija treba da bude stabilan pod uslovima administriranja i poželjno je zaštićen od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice, na primer, uključivanjem parabena, hlorobutanola, fenola, askorbinske kiseline, timerosala i sličnog u kompoziciju. Za intravenoznu primenu, pogodni nosači mogu da sadrže fiziološki rastvor, bakteriostatsku vodu, Cremophor EL<™>(BASF) ili fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS). Nosač, takođe, može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), i njihove odgovarajuće smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održati, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sterilni rastvori za injekcije mogu se pripremiti ugradnjom ćelija u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili više gorepomenutih sastojaka, nakon čega sledi sterilna filtracija. Generalno, suspenzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja, tj. ćelija, u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih pomenutih gore. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, postupci pripreme su vakuumsko sušenje i liofilizacija, što daje prah ćelija plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0060] Kompozicija namenjena za infuziju ili injekciju imaće zapreminu između 50 i 500 ml, pri čemu je posebno poželjna zapremina između 90 ml i 250 ml, a još poželjnija je zapremina između 90 ml i 150 ml.

[0061] Mreg-bc ćelije mogu se davati pacijentu kome je potrebno lečenje različitim režimima administriranja. Na primer, kada se ćelije ili ćelijske frakcije daju pacijentu intravenskom infuzijom, ukupna količina Mreg-bc ćelija ili Mreg-bc ćelijskih frakcija koje treba da se administriraju može se dati jednom ili više infuzija. U poželjnoj realizaciji, Mreg-bc ćelije ili ćelijske frakcije se daju pacijentu preko infuzionog seta sa filterom od 200 µm. Suspenzija koja sadrži Mreg-bc ćelije ili Mreg-bc ćelijske frakcije može se pripremiti sa 0,9% NaCl. Suspenzija se može dati u jednoj infuziji, poželjnije kratkotrajnom infuzijom u roku od manje od 60 minuta, npr. u roku od 60 minuta, 30 minuta, 20 minuta ili 15 minuta. Poželjno, za primenu Mreg-bc suspenzije koristi centralni venski kateter.

[0062] Davanje Mreg-bc ćelija ili ćelijskih frakcija može biti praćeno prethodnim, istovremenim ili naknadnim davanjem drugih aktivnih sredstava. Na primer, tamo gde se Mregbc ćelije ili ćelijske frakcije pronalaska daju da bi se sprečio imuni odgovor kod pacijenta koji prima transplantaciju organa, imunosupresivni lek može se davati zajedno sa ćelijama ili ćelijskim frakcijama pronalaska. Imunosupresivni lekovi koji se rutinski koriste u oblasti transplantacione medicine obuhvataju, ali nisu ograničeni na, ciklosporin A (CSA), takrolimus, azatioprin (AZA), mikofenolat mofetil, rapamicin i steroide (STE). Generalno, prisustvo imunosupresivnih lekova u krvi primaoca ne utiče na efikasnost ćelija ili ćelijskih frakcija pronalaska.

[0063] Iako Mreg-bc ćelije dobijene postupkom opisanim u prvom aspektu pronalaska pokazuju stabilan fenotip, iz bezbednosnih razloga se preporučuje da se Mreg-bc ćelije primenjuju u roku od 24 sata nakon sakupljanja iz ćelijskih kultura. Poželjno, ćelije se administriraju u roku od 20 sati, u roku od 16 sati, u roku od 12 sati, u roku od 8 sati ili u roku od 4 sata nakon sakupljanja ćelija iz kultura.

[0064] U četvrtom aspektu, pronalazak se odnosi na terapeutsku primenu Mreg-bc ćelija prema drugom aspektu pronalaska ili kompozicija prema trećem aspektu pronalaska. Kao što je ovde naznačeno na drugom mestu, Mreg-bc ćelije koje obezbeđuje predmetni pronalazak pokazuju brojna farmakološka svojstva, kao što su imunosupresivna, imunoregulatorna, angiogena i antiinflamatorna svojstva, što ih čini veoma pogodnim za upotrebu u imunosupresivnim, antiinflamatornim ili terapijama za reparaciju tkiva. Na primer, veštački indukovane Mreg-bc ćelije pronalaska su supresivne za T ćelije i posreduju u aktivnom brisanju aktiviranih T ćelija. Kao takve, ćelije su veoma pogodne za upotrebu kao dodatna imunosupresivna terapija kod različitih imunološki posredovanih bolesti, kao što je transplantacija organa.

[0065] Shodno tome, u jednoj realizaciji pronalaska, Mreg-bc ćelija prema drugom aspektu pronalaska ili farmaceutska kompozicija prema trećem aspektu pronalaska se koriste u postupku suzbijanja odbacivanja transplantata i/ili produženja preživljavanja transplantata kod subjekta koji prima transplantat. Pronalazak se stoga odnosi na postupak suzbijanja odbacivanja transplantata i/ili produženja preživljavanja transplantata kod subjekta koji prima transplantat, koji obuhvata (i) davanje efikasne količine Mreg-bc ćelije prema drugom aspektu pronalaska, ili (ii) davanje farmaceutske kompozicije prema trećem aspektu pronalaska. Poželjno je da transplantat bude transplantacija organa, tkiva ili ćelija. Vrsta organa koji se transplantira nije ograničena prema pronalasku, ali će poželjno biti bubreg, jetra, srce, pluća ili pankreas. Posebno je poželjno da organ koji se transplantira primaocu bude humani organ.

[0066] Mreg-bc predmetnog pronalaska može se, takođe, koristiti za suzbijanje odbacivanja transplantata i/ili produženje preživljavanja transplantata u slučajevima kada je transplantat transplantacija tkiva, a ne transplantacija organa. Ponovo, tkivo koje se transplantira primaocu nije posebno ograničeno. Odbacivanje bilo kog tkiva, koje je dobijeno od alogenog donora, kod primaoca može se sprečiti ili ublažiti pomoću Mreg-bc predmetnog pronalaska. Tkivo koje se transplantira poželjno će biti humano tkivo, kao što je crevno tkivo, rožnjača, koža, kompozitno tkivo, koštana srž ili tkivo Langerhansovih (pankerasnih) ostrvaca.

[0067] Mreg-bc pripremljen prema postupku pronalaska, takođe, može da podrži transplantaciju ćelija u primaoca suzbijanjem imunog odgovora kod primaoca. Kada je transplantacija ćelijska transplantacija, priroda ćelije koja se transplantira generalno nije ograničena, ali je poželjno da ćelija koja se transplantira bude izabrana iz grupe koja se sastoji od transplantacije odraslih matičnih ćelija, izolovanog transplantata hepatocita ili transplantata leukocitnih ćelija. Mreg-bc ćelije pronalaska su, takođe, sposobne da proizvode rastvorljive faktore koji podstiču ukalemljenje i učvršćivanje (engrafment) odraslih matičnih ćelija, kao što je katelicidin. U poželjnoj realizaciji predmetnog pronalaska, Mreg-bc ćelije se koriste za olakšavanje učvršćivanja hematopoetskih matičnih ćelija (HSC) nakon transplantacije koštane srži ili HSC.

[0068] Da bi se suzbilo odbacivanje transplantata kod primaoca i indukovalo prihvatanje alogene transplantacije organa, tkiva ili ćelija, Mreg-bc ćelije pronalaska ili farmaceutska kompozicija koji sadrži Mreg-bc ćelije mogu se primeniti intravenozno putem injekcije ili infuzije, kao što je gore opisano. Injekcija ili infuzija se može dati predoperativno ili postoperativno. Ako se Mreg-bc ćelije daju predoperativno, one će biti administrirane primaocu najmanje jednom, poželjno dva puta, a još poželjnije tri puta pre operacije. Poželjno je da se Mreg-bc ne daju primaocu ranije od jedne nedelje pre operacije, npr.6 dana, 5 dana, 4 dana, 3 dana, 2 dana ili 1 dan pre operacije. Ako se Mreg-bc ćelije daju postoperativno, prov administriranje će poželjno biti u roku od 24 sata nakon operacije, još poželjnije u roku od 36 sati, 48 sati, 60 sati ili 72 sata nakon operacije. Alternativno, kod stabilno imunosupresovanih primalaca transplantata, Mreg-bc terapija može se administrirati u bilo kom trenutku nakon transplantacije. Alternativno, Mreg-bc se može primeniti kod primalaca transplantata koji prolaze kroz akutno ili hronično odbacivanje transplantata. Mreg-bc su tada sposobni da odbiju T-ćelijski odgovor imunog sistema primaoca protiv transplantata i da perzistiraju u telu primaoca (posebno u slezini, jetri, plućima i koštanoj srži) dovoljno dugo da bi se primaocu obezbedilo dugoročno prihvatanje transplantata.

[0069] Kada se koristi Mreg-bc predmetnog pronalaska za suzbijanje odbacivanja transplantata ili produženje preživljavanja transplantata kod subjekta koji prima transplantat, transplantat će normalno biti alogeni transplantat, tj. transplantat koji potiče od donora koji, iako genetski drugačiji, pripada istoj vrsti kao i primalac. U ovom slučaju, Mreg-bc ćelije se generišu na osnovu monocita krvi koji su dobijeni od datog donora. Monociti se mogu dobiti od živog donora ili mrtvog donora. U slučaju mrtvog donora, tj. donacije tela, telo donora se obično ispira perfuzionim medijumom kanalizacijom glavne arterije radi očuvanja organa. Venska krv se uklanja iz tela i može se sakupiti za pripremu Mreg-bc prema ovde opisanom postupku. Alternativno, Mreg-bc se, takođe, može pripremiti od mijelomononuklearnih ćelija koje su izolovane iz slezine donora. U slučaju postoperativne primene, Mreg-bc koji su pripremljeni od preminulog donora, odbacivanje transplantiranog organa može se sprečiti primenom imunosupresora koji se rutinski koriste u tu svrhu tokom transplantacije organa.

[0070] U drugoj realizaciji, Mreg-bc ćelije prema drugom aspektu pronalaska ili farmaceutska kompozicija prema trećem aspektu pronalaska se koristi u postupku za podsticanje ili održavanje kalemljenja ili efekta lekova zasnovanih na regulatornim T ćelijama. Pronalazak se stoga, takođe, odnosi na postupak za podsticanje ili održavanje kalemljenja ili efekta lekova zasnovanih na regulatornim T ćelijama kod subjekta koji obuhvata (i) davanje efikasne količine Mreg-bc ćelije prema drugom aspektu pronalaska, ili (ii) davanje farmaceutske kompozicije prema trećem aspektu pronalaska.

[0071] Pored imunoregulatornih i imunosupresivnih svojstava, Mreg-bc ćelije predmetnog pronalaska imaju antiinflamatorna svojstva, koja omogućavaju suzbijanje hroničnih inflamatornih imunih procesa. Shodno tome, Mreg-bc ćelije koje su ovde date su, takođe, korisne za lečenje bolesti ili poremećaja, koje karakteriše deregulisani imuni status ili prekomerna inflamatorna reakcija, posebno hroničnih inflamatornih bolesti. Takve bolesti ili poremećaji uključuju, na primer, autoimune bolesti, inflamatorne bolesti i reakcije preosetljivosti.

[0072] Dakle, u još jednoj realizaciji, Mreg-bc ćelija prema drugom aspektu pronalaska ili farmaceutska kompozicija prema trećem aspektu pronalaska se koristi u postupku lečenja ili sprečavanja autoimune bolesti, inflamatorne bolesti ili reakcije preosetljivosti.

[0073] Kada se Mreg-bc koriste za lečenje autoimune bolesti, data bolest može biti (a) uglavnom posredovana T ćelijama, (b) uglavnom posredovana antitelima ili (c) uglavnom posredovana drugim ćelijskim komponentama imunog sistema. Bolest može biti lokalno ili sistemsko autoimuno stanje. Vrsta autoimunih stanja koja se leče Mreg-bc terapijom nije ograničena prema pronalasku i uključuje sistemski eritemski lupus (SLE), sklerodermu, Sjogrenov sindrom, polimiozitis, dermatomiozitis i druga sistemska autoimuna stanja; reumatoidni artritis (RA), juvenilni reumatoidni artritis i druge inflamatorne artritise; ulcerozni kolitis, Kronovu bolest i druge inflamatorne bolesti creva; autoimuni hepatitis, primarnu bilijarnu cirozu i druge autoimune bolesti jetre; kožni vaskulitis malih krvnih sudova, granulomatozu sa poliangiitisom, eozinofilnu granulomatozu sa poliangiitisom, Behčetovu bolest, Birgerovu bolest, Kavasakijevu bolest i druge vaskulitise velikih, srednjih ili malih krvnih sudova autoimune etiologije; multiplu sklerozu (MS) i neuroimunološke poremećaje; dijabetes tipa I, autoimunu disfunkciju štitne žlezde, autoimunu disfunkciju hipofize i druge autoimune endokrinološke poremećaje; hemolitičku anemiju, trombocitopenijsku purpuru i druge autoimune poremećaje krvi i kostne srži; psorijazu, pemfigus vulgaris, pemfigoid i druga autoimuna dermatološka stanja.

[0074] Mreg-bc ćelije su, takođe, efikasne za lečenje akutnih ili hroničnih inflamatornih bolesti i bolesti sa patofiziološki značajnom inflamatornom komponentom. Inflamatorna bolest koja se leči može biti lokalna ili sistemska. Vrsta inflamatornih bolesti ili stanja koja imaju koristi od lečenja sa Mreg-bc nije ograničena i uključuje, ali nije ograničena na, arterijske okluzivne bolesti, kao što su periferna arterijska okluzivna bolest (pAOD), kritična ishemija ekstremiteta, arterioskleroza, cerebralni infarkt, infarkt miokarda, infarkt bubrega, infarkt creva, angina pektoris i druga stanja uzrokovana arterijskom okluzijom ili suženjem; mikrovaskularna angina, takođe poznata kao srčani sindrom X; sistemska upala povezana sa metaboličkim poremećajima, uključujući dijabetes tipa II i metabolički sindrom povezan sa gojaznošću; dermatološke bolesti, uključujući ekcem. Poželjno je da inflamatorna bolest koja se leči bude okarakterisana hroničnom upalom intime arterijskog zida, npr. infarkt miokarda, moždani udar, vaskulitis kritične ishemije ekstremiteta i pAOD.

[0075] Tamo gde je poželjno lečenje reakcije preosetljivosti, reakcija preosetljivosti je poželjno izabrana iz grupe astme, ekcema, alergijskog rinitisa, angioedema, preosetljivosti na lekove i mastocitoze.

[0076] Lečenje pAOD je posebno poželjno. Poznato je da je pAOD kod pacijenata koji nisu pogodni za procedure revaskularizacije, bilo zbog obima ili lokacije njihovih arterijskih okluzija, ili zbog značajnih komorbiditeta, teško iscrpljujuće i rasprostranjeno stanje za koje je amputacija jedina terapijska opcija. Amputacija ostaje tretman poslednje mere i povezana je sa relativno visokom smrtnošću, a samo manjina pacijenata naknadno oporavlja punu pokretljivost. U toku predmetnog pronalaska, utvrđeno je da Mreg-bc ćelije dobijene postupkom opisanim ovde imaju angiogena svojstva. Mreg-bc aktivno promovišu neovaskularizaciju, tj. formiranje novih krvnih sudova, kroz bazalno i stimulisano eksprimovanje proangiogenih faktora rasta, kao što su VEGF, FIGF (VEGF-D), PDGFB i MDK. Konkretno, Mreg-bc ćelije proizvode visoke nivoe vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) nakon stimulacije sa TLR4 ligandima. Posebno je ovde utvrđeno da Mreg-bc indukuje eksprimovanje vaskularnog endotelnog faktora rasta C (VEGF-C). U literaturi je objavljeno da je VEGF-C angiogeni faktor koji efikasno stimuliše neovaskularizaciju in vivo [16].

[0077] U jednoj realizaciji, Mreg-bc ćelije se ubrizgavaju intramuskularno ili supkutano u ishemični ud. U ishemičnom tkivu, Mreg-bc ćelije će neizbežno biti izložene mikrobnim komponentama i komponentama nekrotičnog tkiva (npr. HMGB1) koje deluju kao TLR4 agonisti. Stoga, Mreg-bc se može koristiti za podsticanje regeneracije tkiva putem lokalne sekrecije proangiogenih faktora rasta. U drugoj realizaciji, Mreg-bc ćelije mogu biti stimulisane ex vivo sa TLR ligandima tokom procesa proizvodnje kako bi se osigurala njihova proizvodnja VEGF na visokom nivou. Dati TLR ligandi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, lipopolisaharid (LPS) ili monofosforil lipid A (MPLA). pAOD koji se tretira sa Mreg-bc pronalaska može biti pAOD bilo kog stepena ili kategorije. Na primer, pAOD može biti pAOD stepena I, kategorija 1-4 ili pAOD stepena II-IV.

[0078] Pošto Mreg-bc ćelije predmetnog pronalaska imaju angiogena svojstva, ovde se razmatra njihova upotreba kod drugih bolesti ili stanja koja zahtevaju neovaskularizaciju. Stoga se pronalazak, takođe, odnosi na Mreg-bc ćeliju prema drugom aspektu pronalaska ili farmaceutsku kompoziciju prema trećem aspektu pronalaska koje se koriste u postupku indukovanja angiogeneze ili vaskulogeneze u hipoksičnim tkivima, koji pospešuju procese popravke tkiva učestvujući u remodeliranju tkiva, regeneraciji tkiva, sprečavanju ili smanjenju fibroze, smanjenju ishemijskog bola ili izbegavanju veće amputacije udova. Pronalazak se stoga odnosi na postupak indukovanja angiogeneze ili vaskulogeneze u hipoksičnim tkivima, promoviše procese popravke tkiva učestvujući u remodeliranju tkiva, regeneraciji tkiva, sprečavanju ili smanjenju fibroze, smanjenju ishemijskog bola ili izbegavanju veće amputacije udova, koji obuhvata (i) davanje efikasne količine Mreg-bc ćelije prema drugom aspektu pronalaska, ili (ii) davanje farmaceutske kompozicije prema trećem aspektu pronalaska.

[0079] Lečenje autoimunih bolesti, inflamatornih bolesti ili reakcija preosetljivosti može se postići ili pomoću Mreg-bc koji su izvedeni iz monocita koji su alogeni za pacijenta, kao što je gore opisano u kontekstu primene transplantacije, ili pomoću monocita koji su autologni za pacijenta kome je potrebno lečenje. Gde je to moguće, lečenje autoimunih bolesti, inflamatornih bolesti ili reakcija preosetljivosti će se sprovoditi autolognim monocitima. U tu svrhu, Mreg-bc se može primenjivati intravenozno sa ili bez istovremenih lokalnih intramuskularnih injekcija.

[0080] U još jednoj realizaciji, Mreg-bc ćelija prema drugom aspektu pronalaska ili farmaceutska kompozicija prema trećem aspektu pronalaska se koristi kao sredstvo za isporuku genske terapije. Pronalazak se, stoga, odnosi na postupak isporuke genske terapije koji obuhvata (i) davanje efikasne količine Mreg-bc ćelije prema drugom aspektu pronalaska koja sadrži transgen, ili (ii) davanje farmaceutske kompozicije koja sadrži Mreg-bc ćeliju prema drugom aspektu pronalaska koja sadrži transgen.

[0081] Prema petom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za pripremu imunoregulatorne T ćelije, a dati postupak obuhvata:

(a) dobijanje T ćelija subjekta;

(b) kokultivisanje T ćelija sa imunoregulatornom ćelijom makrofaga kao što je gore opisano;

(c) dobijanje imunoregulatornih T ćelija iz medijuma za ćelijsku kulturu.

[0082] Kao što je ovde opisano, T ćelije koje su kokultivisane sa Mreg-bc ćelijama inhibiraju proliferaciju T ćelija. Shodno tome, imunoregulatorne T ćelije dobijene gorenavedenim postupcima mogu se koristiti, same ili u kombinaciji sa Mreg-bc ćelijama pronalaska, za lečenje bilo koje od bolesti ili poremećaja o kojima se ovde govori. U prvom koraku, dobijaju se T ćelije iz uzorka krvi subjekta. Ćelije se mogu dobiti, npr. iz uzorka krvi ili aferezata, ili iz tkiva subjekta, npr. iz koštane srži ili slezine. Ćelije se mogu dobiti konvencionalnim postupcima, npr. u slučaju ćelija iz krvi putem venepunkcije. T ćelije koje se koriste u gorenavedenom postupku biće, na primer, CD3+ T ćelije ili njihovi podskupovi. Pre nego što se kokultivišu sa Mreg-bc ćelijama, CD3+ T ćelije se mogu prečistiti ili obogatiti konvencionalnim postupcima, npr. magnetnom separacijom mikroperlica ili sortiranjem protočnom citometrijom.

[0083] T ćelije se zatim dovode u kontakt sa Mreg-bc ćelijama predmetnog pronalaska. Ćelije se mogu dovesti u kontakt u različitim odnosima Mreg:Treg. Na primer, ćelijske frakcije se mogu dovesti u kontakt u odnosu Mreg:Treg između 1:5 i 5:1, poželjno između 1:2 i 2:1. Poželjnije je da odnos Mreg:Treg bude oko 1:1. Za postupak kokultivacije mogu se koristiti različiti medijumi. Medijumi mogu biti oni koji su gore opisani u vezi sa postupkom za pripremu Mreg-bc ćelija. U poželjnoj realizaciji, medijum je X-vivo 10 od Lonza. Medijum može da sadrži dodatne aditive kao što su M-CSF i/ili GM-CSF, poželjno humani rekombinantni M-CSF i/ili GM-CSF. Količina M-CSF i/ili GM-CSF biće u rasponu navedenom ovde na drugom mestu, npr. 5-100 ng/ml, poželjno 20-25 ng/ml. Medijum može da sadrži i druge aditive, kao što je Glutamaks u količini od 1-5 mM, poželjno 2 mM.

[0084] Ćelije će biti kokultivisane 1-8 dana, poželjno najmanje 3 dana, najmanje 4 dana ili najmanje 5 dana. Nakon unapred određenog perioda kultivacije, T ćelije se mogu ponovo izolovati konvencionalnim postupcima, npr. obogaćivanjem ćelija za CD4.<+>CD25<+>TIGIT<+>FoxP3<+>Treg. Ako je potrebno, ćelije se mogu dalje formulisati u farmaceutske proizvode.

[0085] Takođe je ovde opisan postupak za detekciju imunoregulatornih ćelija makrofaga, koji obuhvata

(a) obezbeđivanje uzorka koji sadrži ćelije makrofaga;

(b) detekciju u datom uzorku prisustva DHRS9 proteina i/ili eksprimovanja DHRS9 gena;

pri čemu prisustvo DHRS9 proteina i/ili eksprimovanje DHRS9 gena ukazuje da uzorak sadrži imunoregulatorne ćelije makrofaga.

[0086] Postupak se može koristiti za razlikovanje imunoregulatornih ćelija makrofaga (Mreg) i makrofaga u drugim stanjima aktivacije, kao što su makrofagi izvedeni iz monocita (Mφ), uključujući Mφ u mirovanju, Mφ stimulisane LPS IFNγ, Mφ stimulisane IL-4 i Mφ stimulisane imunoglobulinom (Ig). Pošto je eksprimovanje DHRS9 pronađeno samo u Mreg, ovaj marker se može koristiti za identifikaciju Mreg u heterogenoj populaciji makrofaga, npr. populaciji koja sadrži Mreg i najmanje jedan od sledećih tipova makrofaga: Mφ u mirovanju, Mφ stimulisane LPS IFNγ, Mφ stimulisane IL-4 i Mφ stimulisane imunoglobulinom (Ig). Detekcija DHRS9 markera može se postići protočnom citometrijom korišćenjem standardnih antitela protiv DHRS9 polipeptida ili njegovih fragmenata. Eksprimovanje DHRS9 može se detektovati sa PCR, RT-PCR, PCR u realnom vremenu i drugim rutinskim postupcima.

[0087] Takođe je ovde opisan postupak za izolovanje imunoregulatornih ćelija makrofaga iz heterogene populacije makrofaga, koji obuhvata

(a) obezbeđivanje heterogene populacije makrofaga;

(b) izolovanje imunoregulatornih ćelija makrofaga putem njihovog afiniteta prema molekulima koji se specifično vezuju za DHRS9 protein.

[0088] Na primer, u jednoj realizaciji, imunoregulatorne ćelije makrofaga unutar heterogene populacije makrofaga mogu se izolovati vezivanjem za antitela usmerena protiv DHRS9. Takva antitela mogu biti monoklonskog ili poliklonskog porekla. U poželjnoj realizaciji, anti-DHRS9 antitela mogu se imobilizovati na čvrstu fazu, kao što je dno ležišta mikrotitarske ploče. Populacija makrofaga se inkubira u ležištu kako bi se omogućilo vezivanje anti-DHRS9 antitela za DHRS9 koji je prisutan na površini imunoregulatornih ćelija makrofaga. Nakon ispiranja nevezanih makrofaga, dobija se homogena populacija imunoregulatornih ćelija makrofaga. U drugoj realizaciji, anti-DHRS9 antitela mogu se imobilizovati na površini magnetnih perli. Perle se inkubiraju sa populacijom makrofaga kako bi se omogućilo vezivanje antitela za DHRS9. Nakon odvajanja perli od rastvora koji sadrži populaciju makrofaga, dobija se homogena populacija imunoregulatornih ćelija makrofaga.

[0089] Shodno tome, ovde je takođe opisana upotreba molekula koji se specifično vezuje za DHRS9, posebno anti-DHRS9 antitela, za detekciju ili izolaciju imunoregulatornih ćelija makrofaga.

PRIMERI

[0090] Mreg-bc ćelije su proizvedene u skladu sa važećim principima dobre proizvodne prakse (GMP) za proizvodnju sterilnih lekova. U svakom koraku obraća se pažnja na zaštitu proizvoda, materijala i opreme od kontaminacije i nečistoća.

Primer 1: Priprema Mreg-bc ćelija

[0091] Zdravi humani donori su podvrgnuti leukaferezi radi prikupljanja mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) koje se koriste kao polazni materijal za generisanje Mreg-bc. Svi donori su podvrgnuti skriningu na relevantne markere bolesti, uključujući zarazne bolesti, ne više od 30 dana pre leukafereze. Donori su ponovo podvrgnuti skriningu na iste markere bolesti na dan leukafereze. Leukafereza je obavljena pomoću uređaja Terumo BCT Cobe Spectra ili ekvivalentnog.

[0092] CD14+ monociti su izolovani iz proizvoda leukafereze korišćenjem Miltenyi CliniMACS<®>sistema, u skladu sa uputstvima proizvođača. Ukratko, proizvod leukafereze je prebačen u kesu, koja je napunjena PBS/EDTA-puferom koji sadrži 0,5% humanog serumskog albumina (HSA). Ćelije su isprane jednom pre obeležavanja sa CliniMACS<®>CD14 reagensom prema uputstvima proizvođača. Obeležena ćelijska suspenzija je povezana sa sterilnim setom cevi i instalirana na CliniMACS<®>uređaj kako bi se izolovali CD14+ monociti magnetnom separacijom. Pozitivno izolovana frakcija CD14+ monocita je isprana medijumom za ćelijsku kulturu kako bi se uklonio CliniMACS<®>separacioni pufer.

[0093] Gustina monocita je zatim podešena na 10<6>ćelija/ml u medijumu za ćelijsku kultivaciju. CD14+ monociti su uzeti za analizu protočnom citometrijom kao kontrola u procesu. Broj ćelija za proračune u vezi sa procesom određen je pomoću automatizovanog brojača krvi korišćenjem parametra WBC kao ukupan broj leukocita. Vitalnost svih tipova ćelija procenjena je protočnom citometrijom.

[0094] Izolovani CD14+ monociti su resuspendovani na gustinu od 10<6>ćelija/ml u RPMI medijumu, koji je dopunjen sa 10% muškog humanog AB seruma (objedinjenog i inaktiviranog toplotom), 2 mM GlutaMAX<™>i 25 ng/ml rekombinantnog faktora stimulacije kolonija humanih monocita (M-CSF).

[0095] Ova suspenzija monocita je distribuirana u Miltenyi<®>kese za ćelijsku diferencijaciju, tako da je svaka kesa zasejana sa 1 × 10<6>ćelije/cm<2>unutrašnje površine. Za kultivaciju, kese za diferencijaciju su postavljene ravno na police unutar inkubatora koji je podešen na 36-38°C, 5 ± 1% CO22, ≥ 60% vlažnosti. Monociti su ostavljeni da se talože na donjem listu (strani) kesica za ćelijsku kulturu tokom 1 dana. Prvog dana, kesice su okrenute kako bi se monocitima omogućilo da se prilepe za suprotni list. Kulture su održavane u inkubatoru još 5 dana.

[0096] Da bi se indukovala konačna diferencijacija monocita u Mreg-bc i da bi se indukovalo eksprimovanje indolamin 2,3-dioksigenaze (IDO), monociti su stimulisani dodatkom 25 ng/ml IFN-γ. Nakon dodavanja IFN-γ, kesice za diferencijaciju su ponovo okrenute. Kesice su zatim inkubirane dodatnih 18-24 sata na 36-38°C, 5 ± 1% CO2, ≥ 60% vlažnosti.

[0097] Sedmog dana, diferencirani Mreg-bc su sakupljeni. Ćelije iz svih paralelnih kesa za ćelijsku kulturu su sakupljene i isprane pre fenotipske i funkcionalne analize.

Primer 2: Fenotipska karakterizacija Mreg-bc

[0098] Fenotip Mreg-bc dobijen postupkom u Primeru 1 je detaljno analiziran. U kulturi, makrofagi pokazuju karakterističnu morfologiju, pri čemu ćelije usvajaju teselacionu, epitelioidnu morfologiju formirajući gotovo konfluentne monoslojeve (videti Sl. 6A). Pojedinačni makrofagi su velike, gusto granulirane ćelije sa istaknutim centralnim telom i tankom citoplazmatskom suknjom (’balerina suknjom’), koja se simetrično širi preko površine posude za ćelijsku kulturu. Ultrastrukturni pregled makrofaga transmisionom elektronskom mikroskopijom potvrđuje utisak velike, spljoštene ćelije koja se veoma blisko prilepljuje uz donju površinu (videti Sl.6B). U većini aspekata, ultrastrukturni izgled makrofaga je uobičajen za aktivirani makrofag: produžeci se protežu od spoljašnjeg oboda i gornje površine ćelija; jezgra izgledaju aktivna sa obilnim finim hromatinom; a citoplazma sadrži brojne endocitne vezikule, lipidne inkluzije i istaknuti glatki endoplazmatski retikulum.

[0099] Fenotip ćelijske površine Mreg-bc ćelija je okarakterisan protočnom citometrijom. Da bi se Mreg-bc ćelije pripremile za analizu protočnom citometrijom, ćelije su sakupljene i jednom isprane u DPBS bez Ca<2+>/Mg<2+>pre resuspendovanja na 1-5 × 10<5>ćelije/100 µl u DPBS bez Ca<2+>/Mg<2+>koji sadrži 1% BSA, 0,02% NaN3, i 10% FcR bloka (Miltenyi). Uzorci su zatim inkubirani na 4°C tokom 15 minuta. Antitela konjugovana sa fluorohromom su nabavljena od različitih proizvođača i naneta na ćelijske suspenzije, a uzorci su vrtloženi pre inkubacije na 4°C tokom 20 minuta u mraku. Nakon dodavanja 10 µl 7-AAD, svaki uzorak je kratko vrtložen i inkubiran još 10 minuta na 4°C u mraku. Uzorci su potom isprani dva puta u hladnom DPBS bez Ca<2+>/Mg<2+>i resuspendovani za analizu. FASER reagensi (Miltenyi) korišćeni u 2 kruga prema uputstvima proizvođača korišćeni su za pojačavanje Clec-9a signala. Za intracelularno bojenje, ćelije su prvo obojene za antigene na ćelijskoj površini kao što je gore opisano, zatim fiksirane i permeabilizovane korišćenjem Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set (eBioscience) kompleta prema uputstvima proizvođača. Ćelije su resuspendovane u permeabilizacionom puferu koji sadrži 10% FcR bloka, a zatim su inkubirane 15 minuta na 4°C u mraku. Fluorohromom konjugovana antitela su primenjena na ćelijske suspenzije, a uzorci su kratko vrtloženi pre inkubacije na 4°C tokom 30 minuta u mraku. Ćelije su dva puta isprane u permeabilizacionom puferu i resuspendovane za analizu. Podaci su prikupljeni na protočnom citometru Canto II (BD Biosciences, Nemačka) i analizirani pomoću softvera FlowJo 7.6 (TreeStar, SAD) ili softvera Kaluza 1.1 (Beckman Coulter, Nemačka).

[0100] Ova analiza protočne citometrije otkriva da održive humane Mreg-bc ćelije predmetnog pronalaska pokazuju fenotip CD14<-/nisko>CD209<-/nisko>CD16<-/nisko>CD80<-/nisko>CD86<+>CD10<+/->CD103<+/->CD38<-/nisko>CD85h<+>CD258<+>Syndecan-3<-/nisko>Clec-9a<+>(Sl.2).

Primer 3: Jedinstvenost Mreg fenotipa

[0101] Fenotipski odnos Mreg prema makrofagima u drugim stanjima aktivacije poznatim u stanju tehnike utvrđen je generisanjem panela tipova makrofaga za poređenje sa Mreg u smislu morfologije, eksprimovanja markera na površini ćelija, proizvodnje citokina i opštih profila eksprimovanja gena. Mreg se mogu lako razlikovati od svih ovih drugih tipova makrofaga po svojoj karakterističnoj morfologiji (videti Sl. 6C) i po svom posebnom fenotipu na površini ćelija (videti Sl.6D). Posebno je utvrđeno da su Mreg jedinstveni po smanjenju eksprimovanja CD14 i po nedostatku eksprimovanja CD16, TLR2 i CD163 na površini ćelija.

[0102] Mreg i panel uporednih makrofaga takođe su se razlikovali po svojim profilima proizvodnje citokina i hemokina. Mreg konstitutivno proizvode samo male količine TNF-α i IL-6 i ne luče detektabilne količine IL-12p40. Mreg eksprimuju detektabilne nivoe TGF-β i velike količine IL-1Ra, ali znatno manje IL-10 nego drugi tipovi makrofaga. Ovaj profil sekrecije citokina ostaje relativno stabilan nakon izlaganja IFN-γ i LPS.

[0103] Da bi se identifikovali markeri koje isključivo eksprimuju Mreg, Mreg i IFN-γ-Mφ su generisani prema prethodno opisanim postupcima [10] iz leukocita periferne krvi dobijenih kao nusproizvod sakupljanja trombocita od zdravih donora. Ukratko, CD14+ monociti su izolovani iz PBMC pripremljenih Ficoll-om pozitivnom selekcijom sa anti-CD14 mikroperlicama (Miltenyi, Bergiš Gladbah) i zatim su zasejani na Cell+ ploče sa 6 ležišta (Sarstedt, Nimbreht) na 10<5>ćelija/cm<2>u RPMI-1640 (Lonza, Keln) dopunjenom sa 10% toplotno inaktiviranog humanog AB seruma (Lonza), 2 mM Glutamaksa (Invitrogen, Karlsrue), 100 U/mL penicilina (Lonza), 100 µg/mL streptomicina (Lonza) i rhM-CSF (R&D Systems, Visbaden-Nordenštat) u koncentraciji od 25 ng/ml na 0,1% humanog albumina (CSL-Behring, Hatershajm na Majni).

6. dana kultivacije, ćelije su stimulisane dodatnih 18-24 sata sa 25 ng/ml rhIFN-γ (Chemicon, Billerica, MA). IFN-γ-stimulisani makrofagi (IFN-γ-Mφ) su generisani kultivacijom CD14+ monocita pod identičnim uslovima kao i Mreg, osim što je humani serum zamenjen sa 10% toplotno inaktiviranog fetalnog telećeg seruma (FCS) (Biochrom, Berlin). Makrofagi (Mφ) u drugim definisanim stanjima polarizacije generisani su iz pozitivno izolovanih CD14+ monocita prema protokolima adaptiranim iz literature [12]-[15]. Ukratko, monociti su kultivisani 7 dana na 10<5>ćelija/cm<2>u Cell+ plastičnim posudama (Sarstedt) u RPMI medijumu sa 100 U/ml penicilina, 100 µg/ml streptomicina i 2mM GlutaMAX™, dopunjenom na sledeći način: Mφ u mirovanju - 20% FCS plus 100 ng/ml M-CSF tokom 7 dana; Mφ aktiviran lipopolisaharidom (LPS) - 20% FCS plus 100 ng/ml M-CSF sa dodatkom 100 ng/ml LPS (Enzo Life Sciences) i 20 ng/ml IFN-γ 6. dana; Mφ stimulisan IL-4 - 20% FCS plus 100 ng/ml M-CSF sa dodatkom 20 ng/ml IL-4 (R&D Systems) 6. dana; Mφ stimulisan Ig - 10% FCS plus 100 ng/ml M-CSF, ćelije uzgajane u plastičnim posudama prethodno obloženim humanim IVIg (Privigen™, CSL Behring) i sa dodatkom 100 ng/ml LPS 6. dana; Mφ stimulisan glukokortikoidima (GC) - 20% FCS plus 100 ng/ml M-CSF sa dodatkom 10-7 M deksametazona (Sigma-Aldrich) 6. dana.

[0104] Serija monoklonskih antitela (mAb) je generisana vakcinacijom miševa humanim Mreg lizatima. Skrining ovih mAb imunocitohemijom identifikovao je klon mAb (ASOT1) koji je snažno reagovao sa Mreg, ali ne i sa drugim makrofagima (Mφ) izvedenim iz monocita, uključujući Mφ u mirovanju, LPS IFNγ-stimulisane Mφ, IL-4-stimulisane Mφ i Mφ stimulisane imunoglobulinom (Ig) (videti Sl. 3A). Imunoprecipitacijom i sekvenciranjem njegovog antigena, pokazano je da ASOT1 mAb prepoznaje DHRS9, malo proučavanu retinol dehidrogenazu iz SDR porodice (videti Sl. 3B). Kvantitativna PCR je potvrdila da je eksprimovanje DHRS9 mRNK ograničeno na Mreg (Sl. 3C). Zečje poliklonsko antitelo generisano protiv N-terminalnog epitopa DHRS9 reagovalo je protiv proteina od oko 35 kD imunoprecipitiranog pomoću ASOT1 (videti Sl. 3D). Pošto je komercijalno dostupno monoklonsko antitelo (klon 3C6) koje prepoznaje DHRS9, takođe, reagovalo sa istim proteinom, koji je detektovalo zečje antitelo, može se sa sigurnošću zaključiti da i ASOT1 i zečje poliklonsko antitelo prepoznaju DHRS9. Koristeći ovo zečje pAb, pokazano je da je eksprimovanje proteina DHRS9 jedinstveno za Mreg (Sl.3E).

[0105] Profilisanje eksprimovanja čitavog genoma korišćeno je da bi se dobio opšti uvid u fenotipsku bliskost između Mreg i makrofaga u drugim stanjima aktivacije. Analize biomikročipom su sprovedene sa panelom od devet uporednih tipova makrofaga, koji su paralelno pripremljeni od tri odvojena donora. Geni koji su bili više od 20 puta diferencijalno eksprimovani između bilo koja dva uzorka odabrani su i hijerarhijski grupisani, otkrivajući da su uzorci Mreg bili najsličniji Mreg koji nisu tretirani IFN-γ i Mreg koji su stimulisani LPS nego bilo kom drugom uzorku makrofaga. Ovaj obrazac grupisanja ostao je stabilan kada su sve značajno diferencijalno eksprimovane sonde korišćene za analizu. Mreg uzorci su bili sličniji Ig-stimulisanim M2b makrofagima nego drugim tipovima makrofaga, što naglašava važnost stimulacije sa Ig u razvoju Mreg fenotipa prema aspektu 1, korak (c). Makrofagi u mirovanju i IFN-γ-stimulisani makrofagi grupisani su sa M2a i M2c makrofagima. Klasično aktivirani M1 makrofagi bili su različitiji od uporednih tipova makrofaga nego što su uporedni makrofagi bili jedni od drugih. Iz ovih zapažanja može se zaključiti da su Mreg u jedinstvenom stanju aktivacije i da su relativno otporni na repolarizaciju prema M1 fenotipu stimulacijom sa LPS.

[0106] Rezultati dobijeni upotrebom biomikročipa bili su u skladu sa nalazima protočne citometrije u meri u kojoj su CD163, IL-10 i CD14 pronađeni na listi gena sa smanjenom regulacijom koji su razlikovali Mreg od svih ostalih uporednih makrofaga. Unutar skupa gena koji su jedinstveno pojačano regulisani pomoću Mreg, CD258 (TNFSF14, LIGHT) i CD85H (ILT1, LILRA2) su identifikovani kao korisni markeri za identitet Mreg. Eksprimovanje CD258 i CD85b od strane Mreg, ali ne i od strane makrofaga stimulisanih IFN-γ, potvrđeno je protočnom citometrijom (Sl.7).

[0107] Konstelacija CD45<+>CD11b<+>CD11c<+>CD14<-/nisko>CD209<-/nisko>CD16<-/nisko>CD80<-/nisko>CD86<+>CD10<+/->CD103<+/->CD38<-/nisko>CD85h<+>CD258<+>Syndecan-3<-/nisko>Clec-9a<+>DHRS9<+>i Arg-1<+>i IDO<+>je rigorozna i stabilna definicija fenotipa Mreg.

Primer 4: Generisanje aktiviranih periferno indukovanih humanih Treg ćelija alogenim Mreg-bc tretmanom kod NOD/SCID/IL2rγ<null>miševa

[0108] Mreg-bc ćelije pronalaska su pripremljene kao što je opisano u Primeru 1. Imunodeficijentni NOD/SCID/IL2rγ<null>(NSG) miševi su rekonstituisani humanim T ćelijama. Ovi miševi su ili tretirani Mreg-bc ćelijama pronalaska ili ne (videti Sl.8A). Humane T ćelije izolovane su iz slezine miševa primalaca 5 dana nakon tretmana Mreg-bc ćelijama. Populacija T ćelija kod miševa tretiranih Mreg je obogaćena za FoxP3<+>Treg i TIGIT<+>FoxP3<+>Treg ćelije u poređenju sa primaocima koji nisu tretirani sa Mreg-bc (videti Sl. 8B). Serumski nivoi humanog IL-10 bili su značajno viši kod NSG miševa koji su tretirani sa Mreg-bc ćelijama u poređenju sa netretiranim životinjama (videti Sl.8C). Ovaj primer pokazuje da humani Mregbc mogu direktno da interaguju sa alogenim humanim T ćelijama in vivo da bi se indukovao razvoj Treg ćelija.

Primer 5: Tretiranje primaoca transplantiranog bubrega ćelijama Mreg-bc pre operacije

[0109] Mreg-bc ćelije pronalaska su pripremljene kao što je opisano u Primeru 1. Mreg-bc ćelije su date 43-godišnjem potencijalnom primaocu transplantacije bubrega od živog donora sa terminalnom bubrežnom insuficijencijom usled policistične bolesti bubrega. Mreg-bc ćelije su proizvedene iz monocita prikupljenih od zdravog 62-godišnjeg oca primaoca, koji je potom donirao bubreg svom sinu. Donor i primalac su imali pojedinačne neusklađenosti na HLA-A, -B i -DR lokusima.

[0110] Ukupno 4,75 × 10<8>održivih Mreg-bc ćelija je administrirano sporom centralnom venskom infuzijom. Nisu primećene neželjene reakcije. Konkretno, nije bilo dokaza o plućnoj vaskularnoj opstrukciji, naprezanju desnog srca, transfuzijskim reakcijama, reakcijama preosetljivosti ili biohemijskim poremećajima. Lečenje Mreg-bc ćelijama nije izazvalo stvaranje HLA antitela protiv donora kod primaoca.

[0111] Primalac je sada više od 15 meseci nakon transplantacije sa stabilnom funkcijom alografta. Primalac se trenutno održava na smanjenoj dozi imunosupresivnog režima koji uključuje takrolimus i MMF. Ovaj slučaj ilustruje izvodljivost primene Mreg-bc ćelija kod predoperativnog primaoca transplantata bubrega.

Primer 6: Proizvodnja angiogenih faktora od strane Mreg-bc ćelija

[0112] Testirano je da li Mreg-bc ćelije proizvode angiogeni faktor VEGF-A nakon stimulacije monofosforil lipidom A (MPLA). Postavka ovog eksperimenta je prikazana na Sl.9.

[0113] U prvom test uslovu, Mreg-bc su uzgajane kao što je opisano u Primeru 1 do 7. dana, uključujući standardnu stimulaciju sa 25 ng/ml IFN-γ 6. dana. 7. dana, Mreg-bc ćelije su sakupljene i ponovo posejane u 1 ml RPMI-1640 1% HABS Pen-Strep 2 mM GlutaMAX u koncentraciji od 0,5 × 10<6>ćelija po ležištu u ploči sa 24 ležišta. Ove ponovo posejane Mregbc ćelije su zatim ili stimulisane sa 1 µg/ml LPS ili ne. Uporedno, Mreg-bc ćelije su sakupljene i ispitane protočnom citometrijom na CD14, CD10, CD16, CD38, CD80, CD86, CD85h, CD103, CD258, CD209 i Syndecan-3.

[0114] U drugom uslovu, Mreg-bc ćelije su dodatno stimulisane sa 100 ng/ml MPLA 6. dana kultivisanja, istovremeno kada je dodat IFN-γ. 7. dana, sakupljene Mreg-bc ćelije iz uslova 2 su ponovo posejane i stimulisane kao u uslovu 1. Pored toga, Mreg-bc ćelije iz uslova 2 su analizirane protočnom citometrijom na markere CD14, CD10, CD16, CD38, CD80, CD86, CD85h, CD103, CD258, CD209 i Syndecan-3.

[0115] U trećem uslovu, Mreg-bc ćelije su stimulisane sa 25 ng/ml IFN-γ kao i obično 6. dana.

7. dana, ćelije su dodatno stimulisane sa 100 ng/ml MPLA tokom još 24 sata. Ćelije su zatim sakupljene 8. dana za analizu kao kod uslova 1 i 2.

[0116] Sekrecija VEGF-A od strane ćelija iz sva tri uslova merena je ELISA testom. Fenotip ćelija iz sva tri uslova upoređen je protočnom citometrijom kako bi se procenila stabilnost fenotipa ćelijske površine koji definiše Mreg-bc pod uslovima testiranja.

[0117] Rezultat: Rezultat određivanja VEGF-A je prikazan na Sl.9. Utvrđeno je da tretman sa 100 ng/ml MPLA 6. ili 7. dana povećava eksprimovanje VEGF indukovano LPS. U roku od 24 sata, tretman sa 100 ng/ml MPLA ne menja dramatično fenotip Mreg-bc: primećeno je samo manje povećanje eksprimovanja CD80. Ovi primeri ukazuju da tretman MPLA tokom kultivisanja Mreg-bc može biti koristan način za poboljšanje proizvodnje VEGF-A od strane Mreg-bc ćelija pre primene na pacijentu.

Primer 7: Proizvodnja angiogenih faktora od strane Mreg-bc ćelija

[0118] Testirano je da li Mreg-bc ćelije proizvode faktore povezane sa angiogenezom. U tu svrhu, više od 30 × 10<6>CD14+ monociti/donor je izolovano od 5 svežih donora. Medijum (RPMI-1640 10% HABS 2 mM GlutaMax PS 25 ng/ml rekombinantnog humanog M-CSF) je pripremljen za 5 × 500 ml kesica. Jedna kesica od 500 ml po donoru je napunjena sa 30 × 10<6>monociti/kesica. 6. dana, sve kesice su stimulisane sa IFN-γ. 7. dana, Mreg su sakupljeni i prebrojani.

[0119] Nakon toga, pripremljen je Mreg medijum (RPMI-1640 10% HABS 2 mM GlutaMax PS 25 ng/ml rekombinantnog humanog M-CSF) za rekulturu. Tačno 15 ml medijuma je dodato u svaku od 8 × 50 ml epruveta. Rastvor NaCl ili 10 ng/ml LPS (Enzo) je dodat na sledeći način i vrtložen:

Mregovi su zasejani u količini od 1 × 10<6>ćelija/ležište u pločama sa 24 ležišta. 1 ležište po uslovu i donoru:

[0120] Kulture su inkubirane tačno 48 sati. Supernatanti su sakupljeni i prečišćeni. Pripremljena su 2 alikvota od ≥ 500 µl. Uzorci su čuvani na -80°C do analize ELISA postupkom za VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D i TNF-α.

[0121] Rezultat: Rezultat ELISA testa je prikazan na Sl.10. Kao što se može videti na Sl.10A, Mreg u kombinaciji sa LPS su indukovali VEGF-A, VEGF-C i TNF-α, ali ne i VEGF-D. Pod hipertioničnim uslovima, Mreg su indukovani da eksprimuju VEGF-C, ali ne i VEGF-A, VEGF-D ili TNF-α (Sl.10B).

Literatura

[0122]

[1] Geissler EK, Hutchinson JA. Cell therapy as a strategy to minimize maintenance immunosuppression in solid organ transplant recipients. Curr Opin Organ Transplant 2013; 18: 408-15.

[2] Tang Q, Bluestone JA, Kang SM. CD4(+) Foxp3(+) regulatory T cell therapy in transplantation. J Mol Cell Biol 2012; 4: 11-21.

[3] Moreau A, Varey E, Bouchet-Delbos L, et al. Cell therapy using tolerogenic dendritic cells in transplantation. Transplant Res 2012; 1: 13.

[4] Broichhausen C, Riquelme P, Geissler EK, et al. Regulatory macrophages as therapeutic targets and therapeutic agent in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant 2012; 17: 332-42.

[5] Hutchinson JA, Riquelme P, Sawitzki B, et al. Cutting edge: immunological consequences and trafficking of human regulatory macrophages administered to renal transplant recipients. J Immunol 2011; 187: 2072-8.

[6] Hutchinson JA, Riquelme P, Brem-Exner BG, et al. Tranplant acceptance-inducing cells as an immune-conditioning therapy in renal transplantation. Transpl Int 2008; 21: 728-41.

[7] Hutchinson JA, Brem-Exner BG, Riquelme P, et al. A cell-based approach to the minimization of immunosuppression in renal transplantation. Transpl Int 2008; 21: 742-54.

[8] Hutchinson JA, Roelen D, Riquelme P, et al. Preoperative treatment of a presensitized kidney transplant recipient with donor-derived transplant acceptanceinducing cells. Transpl Int 2008; 21: 808-13.

[9] Hutchinson JA, Govert F, Riquelme P, et al. Administration of donor-derived transplant acceptance-inducing cells to the recipients of renal transplants from deceased donors is technically feasible. Clin Transplant 2009; 23: 140-5.

[10] Hutchinson JA, Riquelme P, Geissler EK, and Fändrich F. Human regulatory macrophages. Methods Mol. Biol.2011; 677: 181-192.

[11] Riquelme P, Tomiuk S, Kammler A, Fändrich F, Schlitt HJ, Geissler EK, Hutchinson JA. Mol Ther.2013; 21(2):409-22.

[12] Martinez FO, Gordon S, Locati M, Mantovani A. J Immunol 2006;177: 7303-7311.

[13] Munn DH, Shafizadeh E, Attwood JT, Bondarev I, Pashine A, Mellor AL. J Exp Med 1999;189: 1363-1372.

[14] Sironi M, Martinez FO, D'Ambrosio D et al. J Leukoc Biol 2006;80: 342-349.

[15] Kzhyshkowska J, Workman G, Cardo-Vila M et al. J Immunol 2006;176: 5825-5832.

[16] Cao Y, Linden P, Farnebo J, Cao R, Eriksson A, Kumar V, Qi JH, Claesson-Welsh L, Alitalos K, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95: 14389-14394.

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak za pripremu imunoregulatorne ćelije makrofaga, pri čemu dati postupak obuhvata:

(a) izolovanje CD14 pozitivnih monocita iz uzorka krvi subjekta;

pri čemu se monociti u koraku (b) kultivišu najmanje 5 dana pre stimulacije IFN-γ.

2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu medijum za ćelijsku kulturu u koraku (b) sadrži humani krvni serum, kao što je humani AB serum.

3. Postupak prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je koncentracija M-CSF u koraku (b) u rasponu od 20-25 ng/ml.

4. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu se monociti u koraku (b) kultivišu najmanje 6 ili najmanje 7 dana pre stimulacije IFN-γ.

5. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu je gas propusna plastična kesa napravljena od poliolefina.

6. Postupak prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu je koncentracija IFN-γ u koraku (c) u rasponu od 20-25 ng/ml.

7. Imunoregulatorna ćelija maktrofaga, pri čemu data ćelija

(a) eksprimuje najmanje jedan od markera CD103, CD10 i Clec-9a; i

(b) pri čemu je eksprimovanje markera CD38 smanjeno za više od 70% u odnosu na eksprimovanje datog markera od strane monocita.

8. Imunoregulatorna ćelija maktrofaga prema zahtevu 7, pri čemu data ćelija ne eksprimuje jedan ili više od sledećih markera: CD38, CD209 i Syndecan-3.

9. Imunoregulatorna ćelija maktrofaga prema bilo kom od zahteva 7 ili 8, pri čemu data ćelija dalje eksprimuje najmanje jedan od markera CD85h i CD258.

10. Farmaceutska kompozicija koji sadrži imunoregulatornu ćeliju maktrofaga prema bilo kom od zahteva 7-9.

11. Imunoregulatorna ćelija maktrofaga prema bilo kom od zahteva 7-9 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10 za upotrebu u postupku

(a) suzbijanja odbacivanja transplantata i/ili produžavanja preživljavanja transplantata kod subjekta koji prima transplantat, poželjno alogeni transplantat;

(b) lečenja ili prevencije autoimune bolesti, inflamatorne bolesti ili reakcije preosetljivosti; ili

(c) podsticanja procesa reparacije tkiva učešćem u remodeliranju tkiva, regeneraciji tkiva, angiogenezi, vaskulogenezi ili prevenciji/ograničavanju fibroze.

12. Imunoregulatorna ćelija makrofaga ili farmaceutska kompozicija za upotrebu u postupku prema zahtevu 11, pri čemu je data autoimuna bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od sistemskog eritemskog lupusa (SLE), skleroderme, Sjogrenovog sindroma, polimiozitisa, dermatomiozitisa i drugih sistemskih autoimunih stanja; reumatoidnog artritisa (RA), juvenilnog reumatoidnog artritisa i drugih inflamatornih artritisa; ulceroznog kolitisa, Kronove bolesti i drugih inflamatornih bolesti creva; autoimunog hepatitisa, primarne bilijarne ciroze i drugih autoimunih bolesti jetre; kožnog vaskulitisa malih krvnih sudova, granulomatoze sa poliangiitisom, eozinofilne granulomatoze sa poliangiitisom, Behčetove bolesti, Birgerove bolesti, Kavasakijeve bolesti i drugih vaskulitisa velikih, srednjih ili malih krvnih sudova autoimune etiologije; multiple skleroze (MS) i neuroimunoloških poremećaja; dijabetesa tipa I, autoimune disfunkcije štitne žlezde, autoimune disfunkcije hipofize i drugih autoimunih endokrinoloških poremećaja; hemolitičke anemije, trombocitopenične purpure i drughi autoimunih poremećaja krvi i kostne srži; psorijaze, pemfigus vulgarisa, pemfigoida i drugih autoimunih dermatoloških stanja.

13. Imunoregulatorna ćelija makrofaga ili farmaceutska kompozicija za upotrebu u postupku prema zahtevu 11, pri čemu je data inflamatorna bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od arterijskih okluzivnih bolesti, kao što su periferna arterijska okluzivna bolest (pAOD), kritična ishemija ekstremiteta, arterioskleroza, cerebralni infarkt, infarkt miokarda, infarkt bubrega, infarkt creva, angina pektoris i druga stanja uzrokovana arterijskom okluzijom ili suženjem; mikrovaskularna angina, takođe poznata kao srčani sindrom X; upala povezana sistemski sa metaboličkim poremećajima, uključujući dijabetes tipa II i metabolički sindrom povezan sa gojaznošću; dermatološke bolesti, uključujući ekcem.

14. Imunoregulatorna ćelija makrofaga ili farmaceutska kompozicija za upotrebu u postupku prema zahtevu 11, pri čemu je data reakcija preosetljivosti izabrana iz grupe koja se sastoji od astme, ekcema, alergijskog rinitisa, angioedema, preosetljivosti na lekove i mastocitoze.

15. Postupak za pripremu imunoregulatorne T ćelije, pri čemu dati postupak obuhvata:

(a) dobijanje T ćelija subjekta;

(b) kokultivisanje T ćelija sa imunoregulatornom makrofagnom ćelijom prema bilo kom od zahteva 7-9;

(c) dobijanje imunoregulatorne T ćelije iz medijuma za ćelijsku kulturu.