RS67220B1 - Humanizovana ili himerna cd3 antitela - Google Patents

Humanizovana ili himerna cd3 antitela

Info

Publication number
RS67220B1
RS67220B1 RS20250910A RSP20250910A RS67220B1 RS 67220 B1 RS67220 B1 RS 67220B1 RS 20250910 A RS20250910 A RS 20250910A RS P20250910 A RSP20250910 A RS P20250910A RS 67220 B1 RS67220 B1 RS 67220B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sequence
seq
antibody
heavy chain
set forth
Prior art date
Application number
RS20250910A
Other languages
English (en)
Inventor
Edward Norbert Van Den Brink
Joost J Neijssen
Aran Frank Labrijn
Joyce Meesters
Janine Schuurman
Isil Altintas
Paul Parren
Rik Rademaker
Original Assignee
Genmab As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2014/050340 external-priority patent/WO2014108483A1/en
Application filed by Genmab As filed Critical Genmab As
Publication of RS67220B1 publication Critical patent/RS67220B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/112—Retroviridae (F), e.g. leukemia viruses
    • C07K16/114—Lentivirus (G), e.g. human immunodeficiency virus [HIV], feline immunodeficiency virus [FIV] or simian immunodeficiency virus [SIV]
    • C07K16/1145—Env proteins, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, principal neutralising domain [PND] or CD4-binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje se vezuje za humani CD3 i humani CD20.
Oblast pronalaska
Klaster diferencijacije 3 (CD3) poznat je već dugi niz godina i stoga je predmet interesovanja u mnogim aspektima. Konkretno, poznata su antitela koja se stvaraju protiv CD3 ili kompleksa T ćelijskih receptora, čiji je CD3 deo. Opisana je in vitro karakterizacija pet humanizovanih antitela sa varijantom efektorske funkcije OKT3 [1].
Lečenje anti-CD3 monoklonskim antitelom hOKT3gamma1 (Ala-Ala) rezultira poboljšanim odgovorima C-peptida i kliničkim parametrima najmanje 2 godine nakon pojave dijabetesa tipa 1 u odsustvu kontinuirane imunosupresivne terapije [2].
Obećavajući pristup za poboljšanje terapije ciljanim antitelima jeste isporuka citotoksičnih ćelija specifično ćelijama raka koje eksprimuju antigen. Ovaj koncept korišćenja T ćelija za efikasno ubijanje tumorskih ćelija je opisan [3]. Međutim, početne kliničke studije bile su prilično razočaravajuće, uglavnom zbog niske efikasnosti, teških neželjenih efekata (citokinska oluja) i imunogenosti bispecifičnih antitela [4]. Napredak u dizajnu i primeni bispecifičnih antitela delimično je prevazišao početnu barijeru citokinske oluje i poboljšao kliničku efikasnost bez toksičnosti koje ograničavaju dozu [5].
Na primer, određena bispecifična antitela koja jednim krakom ciljaju antigen na tumorskoj ćeliji, a drugim krakom, na primer CD3 na T ćelijama, obezbeđuju vezivanje Fc receptora putem Fc regiona. Nakon vezivanja, formira se kompleks T ćelija, tumorskih ćelija i efektorskih ćelija koje se vezuju za Fc region antitela, što dovodi do ubijanja tumorskih ćelija [4]. Katumaksomab se sastoji od heterodimera mišjeg IgG2a / pacovskog IgG2b i pokazao se uspešnim u lečenju ascitesa povezanog sa rakom nakon intraperitonealne primene [6].
Međutim, hibrid miša/pacova je imunogen [7] i ne može se administrirati za dugotrajno intravensko lečenje kod ljudi. Česti neželjeni događaji povezani sa lečenjem koji se pripisuju katumaksomabu uključivali su simptome povezane sa oslobađanjem citokina (tj. pireksija, mučnina, povraćanje, groznica, tahikardija i hipotenzija) [8]-[9], koji se odnose na efektorske funkcije Fc regiona katumaksomaba. Još jedno antitelo je ertumaksomab (HER2xCD3), koji indukuje citotoksičnost u ćelijskim linijama sa niskom ekspresijom HER2. Ertumaksomab je u fazi II kliničkog razvoja za metastatski rak dojke [10]-[11].
Opisana su CD3 antitela koja unakrsno reaguju sa CD3 kod makaki rakojeda (cynomolgus) i/ili rezus makaki (rhesus) majmuna [12]-[13], međutim, potrebna su dalja poboljšanja za takva unakrsno reaktivna antitela. WO 2007/042261 stavlja na uvid javnosti anti-CD3 antitela koja sadrže predmetne CDR sekvence.
Kratak opis pronalaska
Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi humanizovana ili himerna CD3 antitela.
Predmetni pronalazak, kako je definisano u patentnim zahtevima, obezbeđuje bispecifično antitelo, koje sadrži (i) prvi teški lanac i prvi laki lanac povezane preko disulfidnih mostova, koji formiraju prvi region vezivanja, koji se vezuje za humani CD3 i (ii) drugi teški lanac i drugi laki lanac povezane preko disulfidnih mostova koji formiraju drugi region vezivanja, koji se vezuje za humani CD20; pri čemu prvi teški lanac sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6, a prvi laki lanac sadrži VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i drugi teški lanac sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29, a drugi laki lanac sadrži VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu prvi i drugi teški lanac sadrže modifikovane konstantne regione IgG1, pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; pri čemu je u prvom teškom lancu amino-kiselina, na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 L, a u drugom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R; i pri čemu su date pozicije amino-kiselina u skladu sa Eu-numeracijom.
U jednoj realizaciji, prvi teški lanac sadrži sekvencu amino-kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO:25, a drugi teški lanac sadrži sekvencu amino-kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO:26.
Kratak opis tehničkih učenja
Tehničke informacije navedene u daljem tekstu mogu u nekim aspektima prevazilaziti opis pronalaska, koji je definisan priloženim patentnim zahtevima. Dodatne tehničke informacije su date da bi se stvarni pronalazak smestio u širi tehnički kontekst i da bi se prikazali mogući povezani tehnički razvoji. Takve dodatne tehničke informacije koje ne spadaju u obim priloženih patentnih zahteva, nisu deo pronalaska. Shodno tome, svi aspekti, realizacije i primeri predmetnog pronalaska koji ne spadaju u obim priloženih patentnih zahteva ne čine deo pronalaska i dati su samo u ilustrativne svrhe.
Dakle, u jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na humanizovano ili himerno antitelo koje se vezuje za humani CD3, pri čemu dato antitelo sadrži region vezivanja koji obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) CDR1, CDR2 i CDR3 koji ima sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1, 2 i 3, redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) CDR1, CDR2 i CDR3 koji ima sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 4, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 60, redom.
U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na humanizovano ili himerno antitelo koje se vezuje za humani CD3, pri čemu dato antitelo sadrži region vezivanja koji obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1, 2 i 3, redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) CDR1, CDR2 i CDR3 koji imaju sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 4, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 5, redom.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo, koje sadrži prvi region vezivanja antitela prema pronalasku i drugi region vezivanja koji se vezuje za drugačiji cilj od datog prvog regiona vezivanja antigena.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na konstrukt nukleinske kiseline koji kodira jednu ili više sekvenci amino-kiselina prema pronalasku.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na ekspresioni vektor, koji sadrži (i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu teškog lanca humanizovanog ili himernog antitela prema pronalasku, (ii) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu lakog lanca humanizovanog ili himernog antitela prema pronalasku, ili (iii) oba – i (i) i (ii).
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina, koja sadrži ekspresioni vektor prema pronalasku.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili bispecifično antitelo, kompoziciju ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku za upotrebu kao lek.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili bispecifično antitelo, kompoziciju ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku za upotrebu u lečenju bolesti.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak lečenja bolesti koji obuhvata davanje antitela ili bispecifičnog antitela, kompozicije ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku, subjektu kome je to potrebno.
U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak dijagnostikovanja bolesti koju karakteriše zahvaćenost ili akumulacija ćelija koje eksprimuju CD3, a koji obuhvata administriranje humanizovanog ili himernog antitela, kompozicije ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku subjektu, opciono pri čemu je dato humanizovano ili himerno antitelo obeleženo detektabilnim sredstvom.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju antitela ili bispecifičnog antitela prema pronalasku, koji obuhvata korake a) kultivacije ćelije domaćina prema pronalasku i b) prečišćavanja antitela iz podloge za kultivaciju.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na dijagnostičku kompoziciju, koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za detekciju prisustva CD3 antigena, ili ćelije koja eksprimuje CD3, u uzorku, koji obuhvata korake a) kontaktiranja uzorka sa antitelom ili bispecifičnim antitelom prema pronalasku, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela ili bispecifičnog antitela i CD3, i b) analiziranja da li je kompleks formiran.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na komplet za detekciju prisustva CD3 antigena, ili ćelije koja eksprimuje CD3, u uzorku koji sadrži i) antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku i ii) uputstvo za upotrebu kompleta.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na antiidiotipsko antitelo koje se vezuje za antitelo prema pronalasku.
Kratak opis slika
Slika 1: Prikazuje krive vezivanja (Slika 1A) monospecifične varijante antitela IgG1-huCD3 i (Slika 1B) bispecifične varijante antitela bsIgG1 huCD3xHER2 na humanu T ćelijsku liniju Jurkat. Prikazani podaci su srednji intenziteti fluorescencije (MFI) jednog reprezentativnog eksperimenta, kao što je opisano u Primeru 2. Tabele prikazuju koncentracije antitela (µg/mL) koje rezultiraju polumaksimalnim vezivanjem (EC50).
Slika 2: Prikazuje krive vezivanja (Slika 2A) monospecifične varijante antitela IgG1-huCD3 i (Slika 2B) bispecifične varijante antitela bsIgG1 huCD3xHER2 na T ćelijsku liniju makaki rakojeda HSC-F. Prikazani podaci predstavljaju srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) jednog reprezentativnog eksperimenta, kao što je opisano u Primeru 2.
Slika 3: Aktivacija T ćelija varijantama IgG1-huCD3 antitela. Ekspresija CD69 na T ćelijama iz humanog (Slika 3A) i makaki rakojed (Slika 3B) porekla u PBMC kulturi je merena FACS analizom, kao što je opisano u Primeru 3. Ovi eksperimenti su izvedeni dva puta i prikazani su reprezentativni rezultati iz jednog eksperimenta.
Slika 4: Proliferacija T ćelija indukovana varijantama IgG1-huCD3 antitela. Humane (Slika 4A) ili od makaki rakojed (Slika 4B) PBMC su inkubirane sa varijantama IgG1-huCD3 antitela tokom 3 dana, nakon čega je proliferacija merena ELISA testom za ćelijsku proliferaciju, kao što je opisano u Primeru 4. Prikazani su reprezentativni rezultati iz dva nezavisna eksperimenta.
Slika 5: Indukcija humane (Slika 5A) i makaki rakojed (Slika 5B) citotoksičnosti posredovane T ćelijama varijanti huCD3 antitela sa neaktivirajućim LFLEDA mutacijama određena je kao što je objašnjeno u Primeru 5. Prikazani su reprezentativni rezultati dva nezavisna eksperimenta izvedena u duplo tehnici.
Slika 6: Prikazuje krive vezivanja neaktivirajućih, monospecifičnih varijanti antitela IgG1-huCD3 (Slika 6A) i neaktivirajuće, bispecifične varijante antitela bsIgG1-huCD3xHER2 (Slika 6B) na humanu T ćelijsku liniju Jurkat. Prikazani podaci predstavljaju srednje vrednosti intenziteta fluorescencije (MFI) jednog reprezentativnog eksperimenta, kao što je opisano u Primeru 2. Tabele prikazuju koncentracije antitela (µg/mL) koje rezultiraju polumaksimalnim vezivanjem (EC50).
Slika 7: Prikazuje krive vezivanja neaktivirajućih, monospecifičnih varijanti antitela IgG1-huCD3 (Slika 7A) i neaktivirajuće, bispecifične varijante antitela bsIgG1-huCD3xHER2 (Slika 7B) na liniju T ćelija makaki rakojeda HSC-F. Prikazani podaci su srednji intenziteti fluorescencije (MFI) jednog reprezentativnog eksperimenta, kao što je opisano u Primeru 2. Tabele prikazuju koncentracije antitela (µg/mL) koje rezultiraju polumaksimalnim vezivanjem (EC50).
Slika 8: Aktivacija T ćelija neaktivirajućim monospecifičnim IgG1-huCD3 (Slika 8A i B) ili neaktivirajućim bispecifičnim varijantama antitela bsIgG1-huCD3xHER2 (Slika 8C i D). Ekspresija CD69 na T ćelijama humanog (Slika 8A i C) i makaki rakojed (Slika 8B i D) porekla u PBMC kulturi je mereno FACS analizom, kao što je opisano u Primeru 3. Ovi eksperimenti su izvedeni dva puta i prikazani su reprezentativni rezultati iz jednog eksperimenta.
Slika 9: Proliferacija T ćelija izazvana neaktivirajućim monospecifičnim IgG1-huCD3 (Slika 9A i B) ili neaktivirajućim bispecifičnim varijantama antitela bsIgG1-huCD3xHER2 (Slika 9C i D). Proliferacija T ćelija je merena kod humanih (Slika 9A i C) ili makaki rakojed (Slika 9B i D) PBMC koje su inkubirane sa različitim varijantama antitela tokom 3 dana, nakon čega je proliferacija merena ELISA testom za ćelijsku proliferaciju, kao što je opisano u Primeru 4. Prikazani su reprezentativni rezultati iz dva nezavisna eksperimenta.
Slika 10: Indukcija humene (Slika 10A) i makaki rakojed (Slika 10B) citotoksičnosti posredovane T ćelijama varijantama huCD3 antitela sa neaktivirajućim LFLEDA mutacijama određena je kao što je objašnjeno u Primeru 5. Prikazani su reprezentativni rezultati dva nezavisna eksperimenta izvedena u duplo tehnici.
Slika 11: Aktivacija rezus T ćelija varijantama antitela IgG1-huCD3. Ekspresija CD69 na T ćelijama rezus porekla u PBMC kulturi merena je FACS analizom, kao što je opisano u Primeru 6.
Slika 12: Aktivacija T ćelija neaktivirajućim varijantama huCLB-T3/4 antitela. IgG1-huCLB-T3/4 varijante su titrirane na PBMC ćelijama. Ekspresija CD69 na T ćelijama u PBMC kulturi je merena FACS analizom, kao što je opisano u Primeru 7. Prikazani su reprezentativni primeri 3 eksperimenta.
Slika 13: Proliferacija T ćelija neaktivirajućim varijantama huCLB-T3/4 antitela. PBMC su inkubirane sa antitelima tri dana, nakon čega je proliferacija merena ELISA testom za ćelijsku proliferaciju, kao što je opisano u Primeru 8. Prikazani su reprezentativni rezultati iz dva nezavisna eksperimenta.
Slika 14: In vitro T ćelijski posredovana citotoksičnost izazvana neaktivirajućim varijantama antitela CD3 antitela. Indukcija T ćelijski posredovane citotoksičnosti varijantama antitela (N297Q, LFLE, LFLENQ, LFLEDA, DANQ, LFLEDANQPS) [Slika 14A-G]) je određena kao što je objašnjeno u Primeru 9. Prikazani su proseci iz dva eksperimenta izvedena u duplo tehnici.
Slika 15: In vitro T ćelijski posredovana citotoksičnost izazvana neaktivirajućim huCLB-T3/4 varijantama. Indukcija T ćelijski posredovane citotoksičnosti varijantama antitela (LFLEDA LAL) [Slika 15A-C] je određena kao što je opisano u Primeru 9. Prikazani su proseci iz jednog eksperimenta izvedenog u duplo tehnici.
Slika 16: Evaluacija vezivanja C1q za neaktivirajuće varijante huCLB-T3/4 antitela. Vezivanje C1q za monospecifični IgG1 huCLB-T3/4 (Slika 16A-C-) i bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2 (Slika B-D) i njihove neaktivirajuće varijante antitela su procenjene ELISA metodom kao što je opisano u Primeru 10. Rezultati na grafikonima su reprezentativni za n=2 eksperimenta.
Slika 17: Farmakokinetička (PK) analiza neaktivirajućih varijanti huCLB-T3/4 antitela upoređena je sa analizom divljeg tipa IgG1-huCLB-T3/4 antitela kao što je opisano u Primeru 11. Koncentracija humanog IgG1 u plazmi je prikazana u odnosu na vreme. (Slika 17A). Brzina klirensa plazme izračunata kao što je opisano u Primeru 11 (Slika 17B). Horizontalna isprekidana linija predstavlja prosečnu brzinu klirensa humanih IgG1 antitela kod SCID miševa (10 mL/dan/kg).
Slika 18: Učestalost pozitivnih T ćelijskih odgovora među zdravim donorima sa HLA tipom. SI indeksi od ≥1,9 i u testovima proliferacije i sekrecije IL-2 smatrani su pozitivnim odgovorima. Humanizovani A33 je korišćen kao kliničko referentno kontrolno antitelo koje pokazuje visok nivo imunogenosti u klinici i rutinski indukuje 20-30% T ćelijskih odgovora u EpiScreen testu. KLH odgovori su uključeni da bi se proverio kvalitet PBMC (nakon odmrzavanja).
Slika 19: Poravnanje sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca (VH) i lakog lanca (VL) humanizovanih CD3 antitela.
Slika 20: Nivoi eksprimovanja varijanti IgG1-huCD3-H1L1 u supernatantima Expi293F mereni pomoću Octet RED korišćenjem senzora imobilizovanih antihumanim IgG.
Slika 21: Vezivanje IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA mutanata za Jurkat ćelije.
Slika 22: Vezivanje varijanti bispecifičnih antitela CD3 za humane T ćelije. Krugovi prikazuju vezivanje varijanti huCD3-H1L1-LFLEDA, trouglovi prikazuju vezivanje varijanti huCD3-H1L1-LFLEDA-LK55N, a kvadrati prikazuju vezivanje varijanti CD3-hmAb286-LFLEDA.
Slika 23: Citotoksičnost varijanti afiniteta huCD3 x HER2 antitela na ćelijama A431 (ćelije sa niskom ekspresijom HER2) (Sl. 23A) i ćelijama AU565 (ćelije sa visokom ekspresijom HER2) (Sl.23B) tretiranim CD3 i HER2 varijantama afiniteta.
Slika 24: Smanjenje veličine tumora kod NOD-SCID miševa pomoću huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA 7, 14, 21 i 28 dana nakon inokulacije tumora (Sl. 24A) i 29. dana (Sl.24B).
Slika 25: Smanjenje veličine tumora kod NOD-SCID miševa pomoću huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA 7, 14 i 21 dan nakon inokulacije tumora (Sl. 25A) i 21. dana (Sl. 25B).
Detaljan opis pronalaska
U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na humanizovano ili himerno antitelo koje se vezuje za humani CD3, pri čemu dato antitelo sadrži region vezivanja koji obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) CDR1, CDR2 i CDR3 koji ima sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1, 2 i 3, redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) CDR1, CDR2 i CDR3 koji ima sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 4, sekvencu GTN i sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 60, redom.
U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak se odnosi na humanizovano ili himerno antitelo koje se vezuje za humani CD3, pri čemu dato antitelo sadrži region vezivanja koji obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) CDR1, CDR2 i CDR3 sa sekvencama kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1, 2 i 3, redom, i varijabilni region lakog lanca (VL) CDR1, CDR2 i CDR3 sa sekvencama kao što je navedeno u SEQ ID NO: 4, sekvenci GTN i sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO: 5, redom.
Izraz „antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul imunoglobulina, fragment molekula imunoglobulina ili derivat bilo kog od njih, koji ima sposobnost da se specifično veže za antigen pod uobičajenim fiziološkim uslovima sa poluživotom značajnih vremenskih perioda, kao što je najmanje oko 30 minuta, najmanje oko 45 minuta, najmanje oko jedan sat, najmanje oko dva sata, najmanje oko četiri sata, najmanje oko 8 sati, najmanje oko 12 sati, oko 24 sata ili više, oko 48 sati ili više, oko 3, 4, 5, 6, 7 ili više dana, itd., ili bilo koji drugi relevantni funkcionalno definisan period (kao što je vreme dovoljno da indukuje, promoviše, pojača i/ili modulira fiziološki odgovor povezan sa vezivanjem antitela za antigen i/ili vreme dovoljno da antitelo regrutuje efektorsku aktivnost). Region vezivanja (ili domen vezivanja koji se, takođe, može koristiti ovde, oba izraza imaju isto značenje) koji interaguje sa antigenom, obuhvata varijabilne regione i teškog i lakog lanca molekula imunoglobulina. Konstantni regioni antitela (Abs) mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (kao što su efektorske ćelije i T ćelije) i komponente sistema komplementa kao što je C1q, prva komponenta u klasičnom putu aktivacije komplementa. Kao što je gore naznačeno, izraz antitelo, kako se ovde koristi, osim ako nije drugačije naznačeno ili jasno nije u suprotnosti sa kontekstom, uključuje fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost specifične interakcije, kao što je vezivanje, za antigen. Pokazano je da funkciju vezivanja antigena antitela mogu obavljati fragmenti antitela pune dužine. Primeri fragmenata vezivanja obuhvaćenih izrazom „antitelo“ uključuju (i) Fab' ili Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CLi CH1 domena, ili monovalentno antitelo kao što je opisano u WO2007059782 (Genmab A/S); (ii) F(ab')2fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se u suštini sastoji od VHi CH1 domena; i (iv) Fv fragment koji se u suštini sastoji od VLi VHdomena jednog kraka antitela. Štaviše, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirana
1
odvojenim genima, mogu se spojiti, korišćenjem rekombinantnih postupaka, sintetičkim linkerom koji im omogućava da se naprave kao jedan proteinski lanac u kome se VLi VHregioni uparuju i formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančana antitela ili jednolančani Fv (scFv), videti na primer Bird et al., Science 242, 423‑426 (1988) and Huston et al., PNAS USA 85, 5879‑5883 (1988)). Takva jednolančana antitela su obuhvaćena izrazom antitelo, osim ako nije drugačije naznačeno ili jasno naznačeno kontekstom. Iako su takvi fragmenti generalno uključeni u značenje antitela, oni zajedno i svaki nezavisno predstavljaju jedinstvene karakteristike predmetnog pronalaska, pokazujući različita biološka svojstva i korisnost. Ovi i drugi korisni fragmenti antitela u kontekstu predmetnog pronalaska su dodatno razmatrani ovde. Takođe, treba razumeti da izraz antitelo, osim ako nije drugačije naznačeno, takođe uključuje poliklonska antitela, monoklonska antitela (mAb), himerna antitela i humanizovana antitela, i fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen (fragmenti koji vezuju antigen) obezbeđene bilo kojom poznatom tehnikom, kao što su enzimsko razlaganje, sinteza peptida i rekombinantne tehnike. Antitelo, kako je generisano, može posedovati bilo koji izotip.
Izraz „imunoglobulinski teški lanac“, „teški lanac imunoglobulina“ ili „teški lanac“, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan od lanaca imunoglobulina. Teški lanac se obično sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao CH) koji definiše izotip imunoglobulina. Konstantni region teškog lanca se obično sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Konstantni region teškog lanca može dalje da sadrži zglobni region. Izraz „imunoglobulin“, kako se ovde koristi, odnosi se na klasu strukturno srodnih glikoproteina koji se sastoje od dva para polipeptidnih lanaca, jednog para lakih (L) lanaca male molekulske težine i jednog para teških (H) lanaca, sva četiri potencijalno međusobno povezana disulfidnim vezama. Struktura imunoglobulina je dobro okarakterisana (videti, na primer, [14]). Unutar strukture imunoglobulina, dva teška lanca su međusobno povezana putem disulfidnih veza u takozvanom „zglobnom regionu“. Slično kao i teški lanci, svaki laki lanac se obično sastoji od nekoliko regiona; varijabilni region lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantni region lakog lanca (ovde skraćeno kao CL). Konstantni region lakog lanca se obično sastoji od jednog domena, CL. Štaviše, VH i VL regioni mogu biti dalje podeljeni na regione hipervarijabilnosti (ili hipervarijabilne regione koji mogu biti hipervarijabilni u sekvenci i/ili obliku strukturno definisanih petlji), takođe nazvani regioni koji određuju komplementarnost (CDR), ispresecani regionima koji su konzervativniji, nazvani okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se obično sastoji od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (videti [15]). CDR sekvence se mogu odrediti korišćenjem postupka koji je obezbedio IMGT [16]-[17].
Izraz „izotip“, kako se ovde koristi, odnosi se na klasu imunoglobulina (na primer, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM) ili bilo koji njen alotip, kao što su IgG1m(za) i IgG1m(f) [SEQ ID NO: 15]) koji je kodiran genima konstantnog regiona teškog lanca. Dakle, u jednoj realizaciji, antitelo sadrži teški lanac imunoglobulina klase IgG1 ili bilo koji njegov alotip. Dalje, svaki izotip teškog lanca može se kombinovati sa kapa (κ) ili lambda (λ) lakim lancem.
Izraz „himerno antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo pri čemu je varijabilni region izveden iz vrste koja nije ljudska (npr. izveden od glodara), a konstantni region je izveden iz druge vrste, kao što je ljudska. Himerna antitela mogu se generisati inženjeringom antitela. „Inženjering antitela“ je izraz koji se koristi generički za različite vrste modifikacija antitela i koji je proces dobro poznat stručnjaku. Konkretno, himerno antitelo može se generisati korišćenjem standardnih DNK tehnika kako je opisano u [18]. Dakle, himerno može biti genetski ili enzimski inženjerski rekombinantno antitelo. U okviru znanja stručnjaka je generisanje himernog antitela, i stoga se generisanje himernog antitela prema predmetnom pronalasku može izvršiti drugim postupcima u odnosu na one ovde opisane. Himerna monoklonska antitela za terapeutske primene razvijena su da bi se smanjila imunogenost antitela. Ona mogu obično da sadrže varijabilne regione koji nisu humani (npr. mišje), koji su specifični za antigen od interesa, i konstantne domene teškog i lakog lanca humanog antitela. izrazi „varijabilni region“ ili „varijabilni domeni“, kako se koriste u kontekstu himernih antitela, odnose se na region koji obuhvata CDR i okvirne regione i teškog i lakog lanca imunoglobulina.
Izraz „humanizovano antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na genetski modifikovano nehumano antitelo, koje sadrži konstantne domene humanih antitela i nehumane varijabilne domene modifikovane da sadrže visok nivo homologije sekvenci sa humanim varijabilnim domenima. Ovo se može postići kalemljenjem šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR) nehumanih antitela, koji zajedno formiraju mesto vezivanja antigena, na homologni humani akceptorski okvirni region (FR) (videti [19]-[20]). Da bi se u potpunosti rekonstruisao afinitet vezivanja i specifičnost roditeljskog antitela, može biti potrebna supstitucija ostataka okvira iz roditeljskog antitela (tj. nehumanog antitela) u humane okvirne regione (povratne mutacije). Modeliranje strukturne homologije može pomoći u identifikaciji ostataka aminokiselina u okvirnim regionima koji su važni za svojstva vezivanja antitela. Dakle, humanizovano antitelo može da sadrži nehumane CDR sekvence, prvenstveno humane okvirne regione koji opciono sadrže jednu ili više povratnih mutacija amino-kiselina u nehumanu amino-kiselinska sekvencu, i potpuno humane konstantne regione. Opciono, dodatne modifikacije amino-kiselina, koje nisu nužno povratne mutacije, mogu se primeniti da bi se dobilo humanizovano antitelo sa željenim karakteristikama, kao što su afinitet i biohemijska svojstva.
Humanizovano ili himerno antitelo prema bilo kom aspektu ili realizaciji predmetnog pronalaska može se nazvati „humanizovano ili himerno CD3 antitelo“, „humanizovano ili himerno antitelo pronalaska“, „CD3 antitelo“ ili „CD3 antitelo pronalaska“, što sve ima isto značenje i svrhu, osim ako kontekst ne protivreči drugačije.
Sekvenca amino-kiselina antitela nehumanog porekla razlikuje se od antitela humanog porekla, i stoga je nehumano antitelo potencijalno imunogeno kada se primenjuje na humane pacijente. Međutim, uprkos nehumanom poreklu antitela, njegovi CDR segmenti su odgovorni za sposobnost antitela da se veže za svoj ciljni antigen, a humanizacija ima za cilj da održi specifičnost i afinitet vezivanja antitela. Stoga se humanizacija nehumanih terapijskih antitela vrši kako bi se minimizirala njihova imunogenost kod ljudi, dok takva humanizovana antitela istovremeno održavaju specifičnost i afinitet vezivanja antitela nehumanog porekla.
Izraz „region vezivanja“, kako se ovde koristi, odnosi se na region antitela koji je sposoban da se veže za bilo koji molekul, kao što je polipeptid, npr. prisutan na ćeliji, bakteriji ili virionu.
Izraz „vezivanje“, kako se ovde koristi, odnosi se na vezivanje antitela za unapred određeni antigen ili cilj, pri čemu je vezivanje obično sa afinitetom koji odgovara KDod oko 10<-6>M ili manje, npr. 10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje, oko 10<-10>M ili manje, ili oko 10<-11>M ili čak manje kada se odredi, na primer, tehnologijom površinske plazmonske rezonance (SPR) u BIAcore 3000 instrumentu koji koristi antigen kao ligand i antitelo kao analit, i vezuje se za unapred određeni antigen sa afinitetom koji odgovara KDkoji je najmanje deset puta niži, kao što je najmanje 100 puta niži, na primer, najmanje 1.000 puta niži, kao što je najmanje 10.000 puta niži, na primer, najmanje 100.000 puta niži od njegovog afiniteta za vezivanje za nespecifični antigen (npr. BSA, kazein) koji nije unapred određeni antigen ili blisko srodni antigen. Stepen u kojem je afinitet niži zavisi od KDantitela,
1
tako da kada je KDantitela veoma nizak (to jest, antitelo je visoko specifično), onda stepen u kome je afinitet za antigen niži od afiniteta za nespecifični antigen može biti najmanje 10.000 puta. Izraz „KD“(M), kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu ravnoteže disocijacije određene interakcije antitelo-antigen.
Izraz „humani CD3“, kako se ovde koristi, odnosi se na humani protein klastera diferencijacije 3, koji je deo kompleksa proteina koreceptora T ćelija i sastoji se od četiri različita lanca. CD3 se, takođe, nalazi kod drugih vrsta, i stoga se izraz „CD3“ može ovde koristiti i nije ograničen na humani CD3, osim ako nije u suprotnosti sa kontekstom. Kod sisara, kompleks sadrži CD3γ (gama) lanac (humani CD3y lanac Swissprot P09693, ili CD3γ Swissprot Q95LI7 majmuna makaki rakojeda), CD3δ (delta) lanac (humani CD3δ Swissprot P04234, ili CD3δ Swissprot Q95LI8 majmuna makaki rakojeda), dva CD3ε (epsilon) lanca (humani CD3ε Swissprot P07766; ili CD3ε Swissprot Q95LI5 majmuna makaki rakojeda), rezus CD3ε (Swissprot G7NCB9) i CD3ζ-lanac (zeta) lanac (humani CD3ζ Swissprot P20963, CD3ζ Swissprot Q09TK0 majmuna makaki rakojeda). Ovi lanci se povezuju sa molekulom poznatim kao T ćelijski receptor (TCR) i generišu signal aktivacije u T limfocitima. Molekuli TCR i CD3 zajedno čine TCR kompleks.
Stručnjaku je poznato da sekvence amino-kiseline koje se nazivaju Swissprot brojevi uključuju signalni peptid koji se uklanja nakon translacije proteina. Stoga, proteini, kao što je CD3, prisutni na površini ćelija ne uključuju signalni peptid. Posebno, sekvence amino-kiseline navedene u Tabeli 1 ne sadrže takav signalni peptid. Takvi proteini kao što su navedeni u Tabeli 1 mogu se nazvati „zrelim proteinima“. Dakle, SEQ ID NO:14 prikazuje sekvencu aminokiselina zrelog humanog CD3δ (delta), SEQ ID NO:13 prikazuje sekvencu amino-kiselina zrelog humanog CD3ε (epsilon), SEQ ID NO:21 prikazuje sekvencu amino-kiselina zrelog CD3ε makaki rakojeda, a SEQ ID NO:22 prikazuje sekvenca amino-kiselina zrelog CD3ε rezusa. Stoga, izraz „zreo“, kako se ovde koristi, odnosi se na protein koji ne sadrži nikakvu signalnu ili lidersku sekvencu.
Dobro je poznato da se homologija sekvence signalnih peptida, dužina i položaj mesta cepanja značajno razlikuju između različitih proteina. Signalni peptidi mogu se odrediti različitim postupcima, npr. SEQ ID NO: 13 je određena prema aplikaciji SignalP (dostupnoj na http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).
U posebnoj realizaciji, humanizovano ili himerno antitelo predmetnog pronalaska vezuje se za epsilon lanac CD3, kao što je epsilon lanac humanog CD3 (SEQ ID NO: 13). U još jednoj posebnoj realizaciji, humanizovano ili himerno antitelo vezuje se za epitop unutar aminokiselina 1-27 N-terminalnog dela humanog CD3ε (epsilon) (SEQ ID NO: 13). U takvoj posebnoj realizaciji, antitelo može čak i dalje da unakrsno reaguje sa drugim vrstama primata koji nisu ljudi, kao što su makaki rakojed majmuni (CD3 epsilon makaki rakojeda SEQ ID NO:21) i/ili rezus majmuni (rezus CD3 epsilon SEQ ID NO:22).
Izraz „unakrsna reakcija“, kako se ovde koristi, odnosi se na sposobnost antitela, kao što je humanizovano ili himerno antitelo prema pronalasku, da se veže za svoju metu na različitim vrstama. Konkretno, humanizovano CD3 antitelo prikazano u primerima opisanim ovde, ima sposobnost da se veže i za humani CD3 (Primer 2), za CD3 makaki rakojeda (Primer 2) i za CD3 rezus makaki majmuna.
Antitelo prema predmetnom pronalasku koje sadrži CDR sekvence kako je ovde definisano, a koje dodatno sadrži okvirne regione, može da se razlikuje u sekvenci izvan CDR sekvenci, ali da i dalje zadržava punu sposobnost vezivanja u poređenju sa originalnim antitelom. Stoga se predmetni pronalazak, takođe, odnosi na antitela koja sadrže sekvencu amino-kiselina varijabilnog regiona, koja ima određeni identitet sekvence sa bilo kojom sekvencom ovde opisanom.
Izraz „identitet sekvence“, kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, odnosi se na procenat identiteta između dve sekvence kao funkciju broja identičnih pozicija koje dele sekvence (tj. % homologije = broj identičnih pozicija / ukupan broj pozicija x 100), uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, koje je potrebno uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat identiteta između dve nukleotidne ili sekvence amino-kiseline može se npr. odrediti korišćenjem algoritma E. Majersa i V. Milera [21]. Osim toga, procenat identiteta između dve sekvence amino-kiseline može se odrediti korišćenjem algoritma Nidlmana i Vunša [22]. Višestruka poravnanja se poželjno izvode korišćenjem Clustal W algoritma [23] (kao što se koristi npr. kod Vector NTI Advance<®>verzijea softvera 11.5; Invitrogen Inc.).
Dakle, u jednoj realizaciji, VH region ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili
1
najmanje 99% identiteta sekvenci amino-kiselina sa najmanje jednom sekvencom aminokiseline kako je navedeno u VH sekvencama izabranim iz grupe koja se sastoji od:
1. a) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:6;
2. b) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:8;
3. c) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:7; i
4. d) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:9.
U jednoj posebnoj realizaciji, VH region ima najmanje 96% identiteta sekvenci amino-kiselina sa najmanje jednom sekvencom amino-kiseline kako je navedeno u VH sekvencama izabranim iz grupe koja se sastoji od:
1. a) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:6;
2. b) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:8;
3. c) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:7; i
4. d) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:9.
U jednoj realizaciji, VL region ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identiteta sekvenci amino-kiselina sa najmanje jednom sekvencom amino-kiseline kako je navedeno u VL sekvencama izabranim iz grupe koja se sastoji od:
1. a) VL sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:10;
2. b) VL sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:11; i
3. c) VL sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:12.
U jednoj posebnoj realizaciji, VL region ima najmanje 95% identiteta sekvenci amino-kiselina sa najmanje jednom sekvencom amino-kiseline kako je navedeno u VL sekvencama izabranim iz grupe koja se sastoji od:
1. a) VL sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:10;
2. b) VL sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:11; i
3. c) VL sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:12.
U jednoj realizaciji, VH region je izabran iz grupe koja se sastoji od:
1. a) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:6;
2. b) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:8;
1
3. c) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:7; i
4. d) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:9.
U jednoj realizaciji, VL region je izabran iz grupe koja se sastoji od:
1. a) VL sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:10;
2. b) VL sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:11; i
3. c) VL sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:12.
U jednoj realizaciji, samo jedna od VH ili VL sekvenci je 100% identična jednoj od ovde opisanih sekvenci, dok druga može imati identitet sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identiteta sekvence amino-kiseline sa jednom od ovde opisanih sekvenci.
U jednoj posebnoj realizaciji, VH sekvenca ima najmanje 97% identiteta sekvenci aminokiselina sa najmanje jednom sekvencom amino-kiselina kako je navedeno u VH sekvencama izabranim iz grupe koja se sastoji od:
a) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:6;
b) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:7;
c) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:8; i
d) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:9;
i VL sekvenca ima najmanje 95% identiteta sekvenci amino-kiselina sa najmanje jednom sekvencom amino-kiselina kako je navedeno u VL sekvencama izabranim iz grupe koja se sastoji od:
i. VL sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 10;
ii. VL sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:11; i
iii. VL sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:12.
U jednoj realizaciji, VH i VL sekvence su izabrane iz grupe koja se sastoji od;
a) VH i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencama navedenim u SEQ ID NO:6 i 10, redom; 7 i 10, redom; 8 i 10, redom; 9 i 10, redom; 6 i 11, redom; 7 i 11, redom; 8 i 11, redom; 9 i 11, redom; 6 i 12, redom; 7 i 12, redom; 8 i 12, redom; i 9 i 12, redom;
1
b) VH i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencama navedenim u SEQ ID NO:6 i 10, redom; 7 i 10, redom; 8 i 10, redom; 9 i 10, redom; 6 i 11, redom; 7 i 11, redom; 8 i 11, redom; 9 i 11, redom; 6 i 12, redom; 7 i 12, redom; 8 i 12, redom; i 9 i 12, redom;
c) VH i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencama navedenim u SEQ ID NO:6 i 10, redom; 7 i 10, redom; 8 i 10, redom; 9 i 10, redom; 6 i 11, redom; 7 i 11, redom; 8 i 11, redom; 9 i 11, redom; 6 i 12, redom; 7 i 12, redom; 8 i 12, redom; i 9 i 12, redom;
d) VH i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencama navedenim u SEQ ID NO:6 i 10, redom; 7 i 10, redom; 8 i 10, redom; 9 i 10, redom; 6 i 11, redom; 7 i 11, redom; 8 i 11, redom; 9 i 11, redom; 6 i 12, redom; 7 i 12, redom; 8 i 12, redom; i 9 i 12, redom;
e) VH i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencama navedenim u SEQ ID NO:6 i 10, redom; 7 i 10, redom; 8 i 10, redom; 9 i 10, redom; 6 i 11, redom; 7 i 11, redom; 8 i 11, redom; 9 i 11, redom; 6 i 12, redom; 7 i 12, redom; 8 i 12, redom; i 9 i 12, redom;
f) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
g) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
h) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
i) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
j) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
k) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
1
l) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
m) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
n) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
o) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
p) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
q) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
r) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
s) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
t) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
u) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
v) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
1
x) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
y) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
z) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:6 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
aa) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ab VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ac) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ad) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ae) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
af) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ag) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
a) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
2
ai) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
aj) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ak) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
al) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
am) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
an) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ao) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ap) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
aq) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ar) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
kao) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
at) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:7 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ba) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bb) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bc) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bd) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
be) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bf) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bg) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bh) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bi) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bj) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bk) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bl) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bm) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bn) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bo) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bp) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bq) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
br) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bs) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
bt) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:8 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ca) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
2
cb) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
cc) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
cd) VH sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ce) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
cf) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
cg) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ch) VH sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
c) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
cj) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ck) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
cl) VH sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
cm) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
cn) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
ko) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
cp) VH sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
cq) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 90% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
cr) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 95% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12;
cs) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 97% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12; i
ct) VH sekvence koja ima najmanje 100% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:9 i VL sekvence koja ima najmanje 99% identiteta sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO:10, 11 ili 12.
U jednoj realizaciji, region vezivanja obuhvata VH i VL izabrane iz grupe koja se sastoji od:
a) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10;
b) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvece kao što je navedeno u SEQ ID NO:10;
c) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10;
d) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:11;
2
e) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12;
f) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:7 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10;
g) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:7 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:11;
h) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:7 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12;
i) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:11;
j) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12;
k) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:11; i
l) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12.
U posebnoj realizaciji, region vezivanja obuhvata VH sekvencu i VL sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od;
a) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10;
b) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i
c) VH sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10.
Humanizovano antitelo prema predmetnom pronalasku može se generisati poređenjem sekvenci amino-kiselina varijabilnog regiona teškog i lakog lanca sa bazom podataka sekvenci varijabilnog regiona humane germinativne linije kako bi se identifikovala humana sekvenca teškog i lakog lanca sa odgovarajućim stepenom homologije za upotrebu kao humani varijabilni okvirni regioni. Serija humanizovanih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca može se dizajnirati kalemljenjem, npr. mišjih, CDR na okvirne regione (identifikovane kao što je gore opisano) i, ukoliko je potrebno, povratnom mutacijom (mutacija jednog ili više humanih aminokiselinskih ostataka u okvirnim regionima nazad na nehumanu amino-kiselinu na specifičnoj
2
poziciji(ama)) na specifičnu mišju sekvencu identifikovanih ostataka koja može biti kritična za obnavljanje efikasnosti vezivanja antitela. Varijantne sekvence sa najmanjom učestalošću potencijalnih T ćelijskih epitopa mogu se zatim odabrati kako je određeno primenom in silico tehnologije; iTope<™>i TCED<™>([24], [25] i [26]).
Štaviše, humanizovana antitela prema predmetnom pronalasku mogu, takođe, biti „deimunizovana“. Deimunizacija može biti poželjna, jer unutar proteinske sekvence, kao što je humanizovano antitelo prema predmetnom pronalasku, prisustvo epitopa humanih T ćelija može povećati profil rizika imunogenosti jer imaju potencijal da aktiviraju T pomoćne ćelije. Takva aktivacija T pomoćnih ćelija može se izbeći deimunizacijom. Deimunizacija se može izvršiti uvođenjem mutacije u sekvencu amino-kiselina humanizovanog antitela kako bi se uklonili epitopi T ćelija bez značajnog smanjenja afiniteta vezivanja antitela.
Dakle, u jednoj realizaciji, humanizovano antitelo može biti proizvedeno postupkom koji obuhvata korake (i) upoređivanja nehumane kompletne varijabilne sekvence teškog lanca i/ili kompletne varijabilne sekvence lakog lanca sa bazom podataka humanih germinativnih sekvenci, (ii) odabira humane germinativne sekvence koja ima najveću homologiju sa nehumanom sekvencom da bi se dobila humanizovana sekvenca, (iii) optimizacije humanizovane sekvence povratnom mutacijom(ama) ukoliko je potrebno, i (iv) eksprimovanja sekvence u odgovarajućem ekspresionom sistemu.
Dakle, antitelo pune dužine prema predmetnom pronalasku može se proizvesti postupkom koji obuhvata korake (i) upoređivanja nehumane varijabilne sekvence teškog lanca i varijabilnih sekvenci lakog lanca sa bazom podataka humanih sekvenci germinativne linije, (ii) odabira humane sekvence germinativne linije koja ima najveću homologiju sa nehumanom sekvencom, (iii) kalemljenja nehumanih CDR u odabranu humanu germinativnu liniju da bi se dobile humanizovane sekvence, (iv) optimizacije humanizovanih sekvenci povratnom mutacijom(ama) ukoliko je potrebno, (v) identifikovanja konstantnih sekvenci teškog i lakog lanca i (vi) eksprimovanja kompletnih sekvenci teškog lanca i kompletnih sekvenci lakog lanca u odgovarajućim sistemima ekspresije. Antitelo pune dužine prema predmetnom pronalasku može se, dakle, proizvesti kao što je opisano u Primeru 1. U okviru znanja stručnjaka u tehnici je da proizvede antitelo pune dužine kada se polazi od CDR sekvenci ili sekvenci kompletnog varijabilnog regiona. Dakle, stručnjak u tehnici bi znao kako da generiše antitelo pune dužine prema predmetnom pronalasku.
2
Izraz „kompletne sekvence teškog lanca“, kako se ovde koristi, odnosi se na sekvencu koja se sastoji od varijabilnih sekvenci teškog lanca i konstantnih sekvenci teškog lanca.
Izraz „kompletne sekvence lakog lanca“, kako se ovde koristi, odnosi se na sekvencu koja se sastoji od varijabilnih sekvenci lakog lanca i konstantnih sekvenci lakog lanca.
Povratne mutacije mogu se uvesti standardnom DNK mutagenezom. Takve standardne tehnike za DNK mutagenezu opisane su u [18]. Alternativno, upotreba komercijalno dostupnih kompleta kao što je Quickchange<™>Komplet za usmerenu mutagenezu (Stratagene), ili željene povratne mutacije mogu se uvesti de novo sintezom DNK.
Dakle, u jednoj realizaciji, antitelo je humanizovano antitelo.
Himerna antitela mogu se generisati supstitucijom svih sekvenci konstantnog regiona nehumanog (kao što je mišje) antitela sa sekvencama konstantnog regiona humanog porekla. Na taj način, potpune sekvence varijabilnog regiona nehumanog porekla održavaju se u himernom antitelu. Dakle, himerno antitelo može biti proizvedeno postupkom koji obuhvata korak eksprimovanja nehumanog varijabilnog teškog lanca (SEQ ID NO:27), nehumanih varijabilnih sekvenci lakog lanca (SEQ ID NO:28), humanog konstantnog teškog lanca i humanog konstantnog lakog lanca u odgovarajućim sistemima ekspresije, i time generisanja himernog antitela pune dužine. Mogu se koristiti alternativni postupci. Takvi postupci proizvodnje himernog antitela su u okviru znanja stručnjaka u tehnici, i stoga bi stručnjak u tehnici znao kako da proizvede himerno antitelo.
Dakle, u jednoj realizaciji, antitelo je himerno antitelo.
U jednoj realizaciji, antitelo je antitelo pune dužine. Izraz „antitelo pune dužine“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo (npr. matično ili varijantno antitelo) koje sadrži sve konstantne i varijabilne domene teškog i lakog lanca koji odgovaraju onima koji se normalno nalaze u antitelu divljeg tipa tog izotipa.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži Fc region koji sadrži prvi i drugi teški lanac imunoglobulina.
2
Izraz „Fc region“, kako se ovde koristi, odnosi se na region koji obuhvata, u smeru od N- ka C-terminusu (kraju), najmanje jedan zglobni region, CH2 region i CH3 region. Fc region može dalje obuhvatati CH1 region na N-terminalnom kraju zglobnog regiona.
Izraz „zglobni region“, kako se ovde koristi, odnosi se na zglobni region teškog lanca imunoglobulina. Tako, na primer, zglobni region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 216-230 prema Eu numeraciji kako je navedeno kod Kabata.
Osim ako nije drugačije naznačeno ili nije u suprotnosti sa kontekstom, amino-kiseline sekvenci konstantnog regiona su ovde numerisane prema Eu indeksu numeracije (opisanom u [27]) i mogu se nazvati „prema Eu numeraciji kako je navedeno kod Kabata“, „Eu numeracija prema Kabatu“ ili „prema Eu sistemu numeracije“.
Izraz „CH1 region“ ili „CH1 domen“, kako se ovde koristi, odnosi se na CH1 region teškog lanca imunoglobulina. Tako, na primer, CH1 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 118-215 prema Eu sistemu numeracije. Međutim, CH1 region može biti i bilo koji od drugih podtipova kao što je ovde opisano.
Izraz „CH2 region“ ili „CH2 domen“, kako se ovde koristi, odnosi se na CH2 region teškog lanca imunoglobulina. Tako, na primer, CH2 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 231-340 prema Eu sistemu numeracije. Međutim, CH2 region može biti i bilo koji od drugih podtipova kao što je ovde opisano.
Izraz „CH3 region“ ili „CH3 domen“, kako se ovde koristi, odnosi se na CH3 region teškog lanca imunoglobulina. Tako, na primer, CH3 region humanog IgG1 antitela odgovara aminokiselinama 341-447 prema Eu sistemu numeracije. Međutim, CH3 region može biti i bilo koji od drugih podtipova kao što je ovde opisano.
U jednoj realizaciji, izotip teškog lanca imunoglobulina je izabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Teški lanac imunoglobulina može biti bilo koji alotip unutar svake od klasa imunoglobulina, kao što je IgG1m(f) (SEQ ID NO:15). Dakle, u jednoj posebnoj realizaciji, izotip teških lanaca imunoglobulina je IgG1 ili bilo koji njegov alotip, kao što je IgG1m(f) (SEQ ID NO:15).
2
Kada se cilja antigen CD3, koji je deo T ćelijskog receptora (TCR), poželjni su T ćelijski specifični mehanizmi ubijanja ćelija. Druge efektorske funkcije, npr. aktivacija komplementa, možda nisu poželjne, pa je stoga poželjno smanjenje efektorskih funkcija. Vezivanje C1q je prvi korak u kaskadi komplementa i stoga služi kao indikator kapaciteta antitela zavisne od komplementa (CDC). Ako se može izbeći vezivanje C1q za antitelo, može se izbeći i aktivacija kaskade komplementa.
Dakle, u jednoj realizaciji, antitelo sadrži Fc region koji je modifikovan tako da je vezivanje C1q za dato antitelo smanjeno u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 99% ili 100%, pri čemu se vezivanje C1q određuje ELISA testom.
Izraz „modifikovan“, kako se ovde koristi, odnosi se na sekvencu amino-kiselina Fc regiona koja nije identična sekvenci amino-kiselina Fc regiona divljeg tipa. Tj. ostaci amino-kiselina na specifičnim pozicijama Fc regiona divljeg tipa su supstituisani, obrisani ili umetnuti kako bi se izmenilo, na primer, mesto vezivanja za C1q, mesto vezivanja za druge efektorske molekule ili vezivanje za Fc receptore (FcR). Takva(e) modifikacija(e) sekvenca amino-kiselina može se pripremiti supstitucijom jedne ili više amino-kiselina konzervativnom amino-kiselinom ili se može pripremiti supstitucijom jedne ili više amino-kiselina alternativnom amino-kiselinom koja je fizički i/ili funkcionalno slična amino-kiselini prisutnoj u divljem tipu. Supstitucije se, takođe, mogu pripremiti supstitucijom nekonzervativnom amino-kiselinom.
U kontekstu predmetnog pronalaska, amino-kiseline mogu biti opisane kao konzervativne ili nekonzervativne amino-kiseline i stoga mogu biti klasifikovane u skladu sa tim. Ostaci aminokiselina, takođe, mogu biti podeljeni u klase definisane alternativnim fizičkim i funkcionalnim svojstvima. Stoga se klase amino-kiselina mogu reflektovati u jednoj ili obe sledeće tabele:
Amino-kiselinski ostatak konzervativne klase
Alternativne fizičke i funkcionalne klasifikacije ostataka amino-kiselina
U kontekstu predmetnog pronalaska, supstitucija u antitelu, kao što je humanizovano ili himerno antitelo, označena je kao:
Originalna amino-kiselina - pozicija - supstituisana amino-kiselina;
Uz upućivanje na dobro prepoznatu nomenklaturu za amino-kiseline, koristi se troslovni ili jednoslovni kod, uključujući kodove Xaa i X, za označavanje bilo kog ostatka amino-kiseline. Shodno tome, oznaka „L234F“ ili „Leu234Phe“ znači da antitelo sadrži supstituciju leucina fenilalaninom u poziciji amino-kiseline 234.
Zamena amino-kiseline na datoj poziciji bilo kojom drugom amino-kiselinom naziva se:
Originalna amino-kiselina - pozicija; ili npr. „L234“.
Za modifikaciju gde originalna amino-kiselina(e) i/ili supstituisana amino-kiselina(e) mogu da
1
sadrže više od jedne, ali ne sve amino-kiseline, više od jedne amino-kiseline može biti odvojena sa ’,’ ili ’/’. Npr. supstitucija leucina za fenilalanin, arginin, lizin ili triptofan na poziciji 234 je: „Leu234Phe,Arg,Lys,Trp“ ili „Leu234Phe/Arg/Lys/Trp“ ili „L234F,R,K,W“ ili „L234F/R/K/W“ ili „L234 u F, R, K ili W“
Takva oznaka može se koristiti naizmenično u kontekstu pronalaska, ali ima isto značenje i svrhu.
Štaviše, izraz „supstitucija“ obuhvata supstituciju u bilo koju od ostalih devetnaest prirodnih amino-kiselina ili u druge amino-kiseline, kao što su neprirodne amino-kiseline. Na primer, supstitucija amino-kiseline L na poziciji 234 uključuje svaku od sledećih supstitucija: 234A, 234C, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234P i 234Y. Ovo je, inače, ekvivalentno oznaci 234X, pri čemu X označava bilo koju amino-kiselinu osim originalne amino-kiseline. Ove supstitucije mogu biti označene i kao L234A, L234C, itd., ili L234A,C, itd., ili L234A/C/itd. Isto važi po analogiji za svaku poziciju pomenutu ovde, da bi se ovde posebno uključila bilo koja od takvih supstitucija.
Antitelo prema predmetnom pronalasku može, takođe, da sadrži deleciju ostatka aminokiseline. Takva delecija može biti označena kao „del“ i uključuje, npr. pisanje kao L234del. Dakle, u takvim realizacijama, leucin na poziciji 234 je izbrisan iz sekvence amino-kiselina.
Izrazi „amino-kiselina“ i „amino-kiselinski ostatak“ mogu se ovde koristiti naizmenično.
Izraz „vezivanje C1q“, kako se ovde koristi, odnosi se na vezivanje C1q za antitelo, kada je dato antitelo vezano za svoj antigen. Izraz „vezano za svoj antigen“, kako se ovde koristi, odnosi se na vezivanje antitela za svoj antigen i in vivo i in vitro.
Izraz „smanjiti“, kako se ovde koristi kada se odnosi na vezivanje C1q, odnosi se na sposobnost antitela prema pronalasku da smanji, minimizira ili čak potpuno inhibira vezivanje C1q za antitelo u poređenju sa vezivanjem C1q za antitelo divljeg tipa.
Izraz „antitelo divljeg tipa“, kako se ovde koristi, u vezi sa upotrebom u uporednim testovima antitela prema predmetnom pronalasku, odnosi se na antitelo koje je identično antitelu koje se testira, osim što nije inertno. U ovom kontekstu, izraz „inertno“ se odnosi na modifikovani Fc
2
region koji ima smanjeno ili nikakvo vezivanje C1q kao što je određeno u Primeru 10, tj. gde je vezivanje C1q određeno ELISA testom; smanjenu ili nikakvu proliferaciju T ćelija posredovanu Fc kao što je određeno u Primeru 4, tj. proliferacija T ćelija se meri u funkcionalnom testu zasnovanom na perifernim mononuklearnim ćelijama krvi (PBMC); i/ili smanjenu ili nikakvu ekspresiju CD69 posredovanu Fc kao što je određeno u Primeru 3, tj. ekspresija CD69 Posredovana Fc je određena u funkcionalnom testu zasnovanom na PBMC. Dakle, antitelo divljeg tipa sadrži prirodno prisutne amino-kiseline u teškim lancima imunoglobulina, tj. antitelo koje ne sadrži nikakve modifikacije amino-kiselina koje mogu promeniti ili smanjiti sposobnost antitela da interaguje sa npr. C1q, Fc receptorima ili slično. Dakle, takvo antitelo divljeg tipa će ostati aktivirajuće antitelo koje je sposobno da se veže npr. C1q. Antitelo divljeg tipa i antitelo predmetnog pronalaska mogu da sadrže druge modifikacije amino-kiselina osim onih koje utiču na sposobnost antitela da indukuje efektorske funkcije, kako bi se antitelo učinilo bispecifičnim antitelom ili slično.
Izraz „ELISA“, kako se ovde koristi, odnosi se na imunosorbentni test povezan sa enzimima, koji koristi antitela i promenu boje za identifikaciju supstance. Prvo specifično antitelo se vezuje za površinu ploče. Time se dodaje protein iz uzorka, pri čemu se testira vezivanje za pomenuto prvo specifično antitelo. Dodaje se drugo antitelo koje se vezuje za antitelo iz uzorka. Drugo antitelo se povezuje sa enzimom, a u poslednjem koraku se dodaje supstanca koja sadrži supstrat enzima. Naknadna reakcija proizvodi detektabilan signal, najčešće promenu boje supstrata. Koncept ELISA testa je dobro poznat u tehnici i različiti načini izvođenja ELISA testa se smatraju delom metode za procenu antitela prema predmetnom pronalasku. Stoga, ovo tumačenje ne treba shvatiti kao ograničavajuće, jer se mogu izvoditi različiti oblici ELISA testova, kao što je opisano u Primeru 4.
Konkretno, sposobnost antitela prema predmetnom pronalasku da se veže za C1q može se odrediti ELISA testom koji obuhvata korake (i) nanošenja pomenutog antitela na ploču sa 96 ležišta, (ii) dodavanja 3% seruma, (iii) dodavanja anti-humanog C1q antitela, (iv) razvijanja ploče i (v) merenja OD405nm. Dakle, u jednoj realizaciji, antitelo sadrži Fc region, koji je modifikovan tako da je vezivanje C1q za dato antitelo smanjeno u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili 100%, pri čemu se vezivanje C1q određuje ELISA testom koji obuhvata korake (i) nanošenja datih antitela na ploču sa 96 ležišta, (ii) dodavanja 3% seruma, (iii) dodavanja anti-humanog C1q, (iv) razvijanja ploče i (v) merenja OD405nm. Dakle, u posebnoj realizaciji, vezivanje C1q je procenjeno kao što je opisano u Primeru 10.
Izrazi „Fc receptor“ ili „FcR“, kako se ovde koriste, odnose se na protein koji se nalazi na površini određenih ćelija. FcR se vezuju za Fc region antitela. Postoji nekoliko različitih vrsta FcR, koji su klasifikovani na osnovu tipa antitela koje prepoznaju. Npr. Fcy (gama) receptori se vezuju za antitela IgG klase.
Izrazi „Fcy receptor“, „Fc gama receptor“ ili „FcyR“, kako se ovde koriste, odnose se na grupu Fc receptora koji pripadaju superfamiliji imunoglobulina i najvažniji su Fc receptori za indukovanje fagocitoze opsonizovanih (obloženih) mikroba. Ova familija obuhvata nekoliko članova, FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32a), FcyRIIb (CD32b), FcyRIIIa (CD16a), FcyRIIIb (CD16b), koji se razlikuju po afinitetu prema antitelima zbog svoje različite molekularne strukture.
Posredovane Fc efektorske funkcije čine deo biološke aktivnosti molekula humanog imunoglobulina G (IgG). Primeri takvih efektorskih funkcija uključuju npr. ćelijski zavisnu citotoksičnost (ADCC) i komplement zavisnu citotoksičnost (CDC) koje se pokreću vezivanjem različitih efektorskih molekula za Fc region. U kontekstu predmetnog pronalaska, „vezivanje Fc“, „vezivanje Fc receptora“, „vezivanje FcR“ i „vezivanje Fc regiona antitela za FcR“ odnose se na vezivanje Fc regiona za Fc receptor (FcR) ili efektorski molekul. Izrazi „vezivanje FcyR“ i „vezivanje FcyRI“ odnose se na vezivanje za ili sa Fc regionom za Fc gama receptor i Fc gama receptor I, redom. Kada se CD3 antitelo veže za T ćelije, Fc region divljeg tipa CD3 antitela se vezuje za FcR prisutne na drugim ćelijama, npr. monocitima, što dovodi do nespecifične, aktivacije T ćelije posredovane Fc. Takva nespecifična, aktivacija T ćelija posredovana Fc može biti neželjena. T ćelije se takođe mogu aktivirati ciljanom, ili ciljnospecifičnom, aktivacijom T ćelija. Takva ciljana aktivacija T ćelija može biti veoma poželjna za lečenje niza indikacija, kao što je rak. Izraz „ciljana aktivacija T ćelija“, kako se ovde koristi, odnosi se na usmeravanje T ćelija na specifične ćelije, kao što su tumorske ćelije, upotrebom bispecifičnog antitela koje sadrži prvi region vezivanja koji vezuje specifični cilj, kao što je tumorska meta na tumorskoj ćeliji, i drugi region vezivanja koji vezuje specifični cilj T ćelija, kao što je CD3. Dakle, ciljanje T ćelija na specifične ćelije, npr. tumorske ćelije, može se olakšati upotrebom bispecifičnog antitela, pri čemu jedan od regiona vezivanja vezuje CD3 prisutan na T ćeliji, a drugi region vezivanja vezuje antigen specifičan za cilj, npr. na tumorskoj
4
ćeliji. Iako je nespecifična, aktivacija T ćelija posredovana Fc i dalje moguća i stoga takvu neželjenu nespecifičnu, aktivaciju T ćelija posredovanu Fc putem umrežavanja posredovanog Fc treba izbegavati i može se onemogućiti tako što se Fc region učini inertnim za takvu aktivnost. Time se sprečava interakcija između datog inertnog Fc regiona sa prisutnim Fc receptorima. Humanizovano antitelo predmetnog pronalaska pokazalo se inertnim kada je testirano u nekoliko različitih testova, tj. videti Primere 3 do 5. Još jedno testirano CD3 antitelo, huCLB-T3/4, koje sadrži modifikacije amino-kiselina u Fc regionu, takođe se pokazalo inertnim kada je testirano u različitim testovima, tj. videti Primere 7 do 10. Humanizovano CD3 antitelo koje sadrži supstitucije amino-kiselina L234F, L235E i D265A, kao što je opisano u primerima, pokazalo je niske nivoe eksprimovanja CD69 na T ćelijama (Primer 3), ukidanje proliferacije T ćelija posredovane Fc (Primer 4) i nespecifično ubijanje cilja kada je u obliku bispecifičnog antitela (Primer 5). Dakle, humanizovano antitelo predmetnog pronalaska pokazuje superiorne rezultate u nekoliko testova u poređenju sa antitelom divljeg tipa.
Antitelo prema predmetnom pronalasku može da sadrži modifikacije u Fc regionu. Kada antitelo sadrži takve modifikacije, ono može postati inertno ili neaktivirajuće antitelo. Izraz „inertnost“, „inertno“ ili „neaktivirajuće“, kako se ovde koristi, odnosi se na Fc region koji barem nije u stanju da se veže za bilo koji Fcy receptor, da indukuje umrežavanje FcR posredovano Fc ili da indukuje umrežavanje posredovano FcR ciljnih antigena preko dva Fc regiona pojedinačnih antitela, ili nije u stanju da se veže za C1q. Inertnost Fc regiona humanizovanog ili himernog CD3 antitela se povoljno testira korišćenjem antitela u monospecifičnom formatu, iako se inertni Fc region tako identifikovan može koristiti u bispecifičnim ili drugim humanizovanim ili himernim multispecifičnim CD3 antitelima.
Može se konstruisati nekoliko varijanti kako bi se Fc region antitela učinio neaktivnim za interakcije sa Fc gama receptorima i C1q za razvoj terapeutskog antitela. Primeri takvih varijanti su ovde opisani.
Dakle, u jednoj realizaciji, antitelo sadrži Fc region koji je modifikovan tako da dato antitelo posreduje smanjenu proliferaciju T ćelija posredovanu Fc u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100%, pri čemu se navedena proliferacija T ćelija meri funkcionalnim testom zasnovanim na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC).
Izraz „smanjiti“, kako se ovde koristi, odnosi se na smanjenje aktivnosti ili eksprimovanja u poređenju sa kontrolnim proteinom, kao što je antitelo. Konkretno, izraz „smanjiti“ kada se odnosi na proliferaciju T ćelija, odnosi se na sposobnost antitela prema predmetnom pronalasku da smanji, minimizira ili čak potpuno inhibira proliferaciju T ćelija u poređenju sa proliferacijom T ćelija vezanih antitelom divljeg tipa. Sposobnost antitela da smanji proliferaciju T ćelija može se proceniti funkcionalnim testom zasnovanim na PBMC, kao što je opisano u Primeru 4 i Primeru 8. U jednoj realizaciji, test se izvodi sa humanim PBMC. U drugoj realizaciji, test se izvodi sa PBMC makaki rakojeda. U još jednom realizaciji, test se izvodi sa PBMC rezus makakija. Pošto su antitela prema predmetnom pronalasku unakrsno reaktivna, test zasnovan na PBMC, kao što je ovde opisano, može se izvesti sa bilo kojom vrstom PBMC da bi se pokazalo smanjenje proliferacije T ćelija, sve dok se korišćene vrste PBMC nalaze unutar spektra unakrsne reaktivnosti antitela, npr. ljudi, makaki rakojed ili rezus majmuni.
Izraz „funkcionalni test zasnovan na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC)“, kako se ovde koristi, odnosi se na test koji se koristi za procenu funkcionalne karakteristike antitela predmetnog pronalaska, kao što je sposobnost datog antitela da utiče na proliferaciju T ćelija ili ekspresiju CD69, pri čemu su jedine prisutne ćelije mononuklearne ćelije periferne krvi. Dakle, u jednoj realizaciji, proliferacija T ćelija se meri postupkom, koji obuhvata korake inkubacije PBMC sa antitelom u rasponu od 1-1000 ng/ml na 37°C u 5% (vol/vol) CO2vlažnom inkubatoru tokom tri dana, dodavanje hemijskog jedinjenja, kao što je BrdU, koje je ugrađeno u DNK proliferirajućih ćelija, inkubacije tokom pet sati, peletiranja ćelija, sušenja ćelija, opciono skladištenja ćelija na 4°C, premazivanja ćelija na ELISA ploče, inkubacije sa anti-BrdU-peroksidazom tokom 90 minuta na sobnoj temperaturi, razvijanje oko 30 minuta sa 1 mg/mL 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonske kiseline), dodavanja 100 µL 2% oksalne kiseline da bi se zaustavila reakcija i merenje apsorbancije na 405 nm u odgovarajućem čitaču mikroploča.
Izraz „proliferacija“, kako se ovde koristi, odnosi se na rast ćelija u kontekstu ćelijske deobe.
Izraz „BrdU“, kako se ovde koristi, odnosi se na 5-bromo-2'-deoksiuridin, koji je homolog timidina. Kada se BrdU doda u ćelijsku kulturu tokom ograničenog vremenskog perioda (npr.
4 sata), biće ugrađen u DNK ćelija koje proliferišu. Nakon fiksiranja ćelija, detekcija ugrađenog BrdU može se izvršiti ELISA testom korišćenjem anti-BrdU-peroksidaze. Ugradnja BrdU je stoga mera proliferacije.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži Fc region koji je modifikovan tako da dato antitelo smanjuje ekspresiju CD69 posredovanu Fc za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100% u poređenju sa antitelom divljeg tipa, pri čemu je navedena ekspresija CD69 posredovana Fc određena funkcionalnim testom zasnovanim na PBMC.
Izraz „smanjiti“, kako se ovde koristi, odnosi se na smanjenje aktivnosti ili eksprimovanja u poređenju sa kontrolnim proteinom, kao što je antitelo. Konkretno, izraz „smanjiti“ kada se odnosi na nivo eksprimovanja markera aktivacije T ćelija CD69, odnosi se na smanjenje nivoa eksprimovanja CD69 u poređenju sa nivoom eksprimovanja CD69 kada je T ćelija vezana antitelom divljeg tipa, pod uslovom da oba regiona vezivanja antitela vezuju CD3. Sposobnost antitela da smanji ekspresiju CD69 može se proceniti funkcionalnim testom zasnovanim na PBMC, kao što je opisano u Primeru 3 i Primeru 7. Dakle, u jednoj realizaciji, ekspresija CD69 se meri postupkom koji obuhvata korake inkubacije PBMC sa antitelom u rasponu od 1-1000 ng/ml na 37°C u 5% (vol/vol) CO2vlažnom inkubatoru tokom 16-24 sata, ispiranja ćelija, bojenja ćelija na 4°C mišjim anti-humanim CD28-PE i mišjim anti-humanim CD69-APC antitelom i određivanja eksprimovanja CD69 na CD28 pozitivnim ćelijama protočnom citometrijom.
Izraz „CD69“, kako se ovde koristi, odnosi se na klaster diferencijacije 69, koji je humani transmembranski lektinski protein C-tipa kodiran od strane CD69 gen. Aktivacija T limfocita i prirodnih ćelija ubica (NK), i in vivo i in vitro, indukuje ekspresiju CD69. CD69 funkcioniše kao receptor za prenos signala uključen u događaje ćelijske aktivacije, uključujući proliferaciju, funkcioniše kao receptor za prenos signala u limfocitima, uključujući prirodne ćelije ubice i trombocite, i indukuje specifične gene.
Izraz „funkcionalni test zasnovan na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC)“, kako se ovde koristi, odnosi se na test koji se koristi za procenu funkcionalne karakteristike antitela predmetnog pronalaska, kao što je sposobnost datog antitela da utiče na proliferaciju T ćelija ili ekspresiju CD69, pri čemu su jedine prisutne ćelije mononuklearne ćelije periferne krvi. Funkcionalni test zasnovan na PBMC, kao što je opisano u Primerima 3, 4, 5 i 7, obuhvata korake (i) inkubacije PBMC sa antitelom na 37°C u 5% (vol/vol) CO2vlažnom inkubatoru tokom oko 16-24 sata, (ii) ispiranja ćelija, (iii) bojenja ćelija na 4°C mišjim anti-humanim CD28-PE i mišjim anti-humanim CD69-APC antitelom, i (iv) određivanje eksprimovanja CD69 na CD28 pozitivnim ćelijama protočnom citometrijom, kada se procenjuje ekspresija CD69. Dakle, u jednoj realizaciji, ekspresija CD69 može da se odredi kao što je opisano u Primeru 3, 4, 5 ili 7.
Dakle, amino-kiseline u Fc regionu koje igraju dominantnu ulogu u interakcijama sa C1q i Fc gama receptorima mogu biti modifikovane. Primeri pozicija amino-kiselina koje mogu biti modifikovane uključuju pozicije L234, L235 i P331. Nјihove kombinacije, kao što su L234F/L235E/P331S, mogu izazvati značajno smanjenje vezivanja za humane CD64, CD32A, CD16 i C1q.
Stoga, u jednoj realizaciji, amino-kiselina u najmanje jednoj poziciji koja odgovara L234, L235 i P331, može biti A, A i S, redom ([1], [28]). Takođe, supstitucije amino-kiselina L234F i L235E mogu rezultirati Fc regionima sa ukinutim interakcijama sa Fc gama receptorima i C1q ([29]-[30]). Stoga, u jednoj realizaciji, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 mogu biti F i E, redom. Supstitucija amino-kiseline D265A može smanjiti vezivanje za sve Fc gama receptore i sprečiti ADCC ([31]). Stoga, u jednoj realizaciji, amino-kiselina na poziciji koja odgovara D265 može biti A. Vezivanje za C1q može se ukinuti mutiranjem pozicija D270, K322, P329 i P331. Mutacija ovih pozicija u D270A ili K322A ili P329A ili P331A može učiniti antitelo deficitarnim u CDC aktivnosti ([32]). Stoga, u jednoj realizaciji, amino-kiseline u najmanje jednoj poziciji koja odgovara D270, K322, P329 i P331 mogu biti A, A, A i A, redom.
Alternativni pristup za minimiziranje interakcije Fc regiona sa Fc gama receptorima i C1q je uklanjanje mesta glikozilacije antitela. Mutacija pozicije N297 u npr. Q, A i E uklanja mesto glikozilacije koje je kritično za interakcije IgG-Fc gama receptora. Stoga, u jednoj realizaciji, amino-kiselina na poziciji koja odgovara N297 može biti G, Q, A ili E ([33]). Drugi alternativni pristup za minimiziranje interakcije Fc regiona sa Fc gama receptorima može se dobiti sledećim mutacijama; P238A, A327Q, P329A ili E233P/L234V/L235A/G236del ([31]).
Alternativno, smatra se da su podklase humanog IgG2 i IgG4 prirodno kompromitovane u svojim interakcijama sa C1q i Fc gama receptorima, iako su prijavljene interakcije sa Fcy receptorima (Fc gama receptori) ([34]-[35]). Mutacije koje ukidaju ove rezidualne interakcije mogu se napraviti u oba izotipa, što rezultira smanjenjem neželjenih sporednih efekata povezanih sa vezivanjem za FcR. Za IgG2, to uključuje L234A i G237A, a za IgG4, L235E. Stoga, u jednoj realizaciji, amino-kiselina na poziciji koja odgovara L234 i G237 u teškom lancu humanog IgG2 može biti A i A, redom. U jednoj realizaciji, amino-kiselina na poziciji koja odgovara L235 u teškom lancu humanog IgG4 može biti E.
Drugi pristupi za dalje minimiziranje interakcije sa Fc gama receptorima i C1q u IgG2 antitelima uključuju one opisane u [36] i [37].
Zglobni region antitela, takođe, može biti važan u pogledu interakcija sa Fc gama receptorima i komplementom ([38]-[39]). Shodno tome, mutacije ili delecija zglobnog regiona mogu uticati na efektorske funkcije antitela.
Izraz „unakrsno povezivanje“, kako se ovde koristi, odnosi se na indirektno premošćavanje Fab kraka antitela (monovalentno ili bivalentno) vezanih za ciljni antigen od strane ćelije koja nosi FcR putem vezivanja za Fc region antitela. Dakle, antitelo koje se vezuje za svoj ciljni antigen na ćelijama koje nose ciljni antigen može se umrežiti sa drugom ćelijom koja eksprimuje FcR.
Izraz „nespecifično ubijanje“, kako se ovde koristi, odnosi se na ubijanje ćelija citotoksičnom funkcijom T ćelija ili drugih efektorskih ćelija, putem aktivacije datih ćelija nezavisno od antigena tumora. Dakle, pod nespecifičnim ubijanjem se podrazumeva da ćelije koje nose cilj tumora mogu biti ubijene npr. citotoksičnim T ćelijama, a ne antitelom koje se vezuje za cilj tumora npr. indukcijom CDC.
Predmetni pronalazači su pokazali (videti Primere 3 do 5, 7 do 10) da se neaktivirajući Fc region može dobiti modifikovanjem jedne ili više od najmanje pet specifičnih pozicija amino-kiselina u Fc regionu.
Dakle, u jednoj realizaciji, antitelo sadrži prvi i drugi teški lanac imunoglobulina, pri čemu u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca imunoglobulina jedna ili više aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1, nisu L, L, D, N i P, redom.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu jedna ili više amino-kiselina na poziciji koja odgovara pozicijama L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1, nisu L, L, D, N i P, redom.
U drugoj realizaciji, u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca jedna ili više aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L, L i D, redom, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, redom.
Izraz „amino-kiselina koja odgovara pozicijama“, kako se ovde koristi, odnosi se na broj pozicije amino-kiseline u teškom lancu humanog IgG1. Osim ako nije drugačije naznačeno ili nije u suprotnosti sa kontekstom, amino-kiseline sekvenci konstantnog regiona su ovde numerisane prema Eu indeksu numeracije (opisano u [27]). Dakle, amino-kiselina ili segment u jednoj sekvenci koji „odgovara“ amino-kiselini ili segmentu u drugoj sekvenci je onaj koji se poravnava sa drugom amino-kiselinom ili segmentom korišćenjem standardnog programa za poravnavanje sekvenci kao što su ALIGN, ClustalW ili slično, obično na podrazumevanim podešavanjima i ima najmanje 50%, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% identiteta sa teškim lancem humanog IgG1. Smatra se dobro poznatim u tehnici kako poravnati sekvencu ili segment u sekvenci i time odrediti odgovarajuću poziciju u sekvenci sa pozicijom aminokiseline prema predmetnom pronalasku.
U kontekstu predmetnog pronalaska, amino-kiselina može biti definisana kao što je gore opisano.
Izraz „amino-kiselina nije“ ili slične reči kada se odnose na amino-kiseline u teškom lancu treba shvatiti kao da amino-kiselina jeste bilo koja druga amino-kiselina osim date specifične aminokiseline. Na primer, amino-kiselina na poziciji koja odgovara L234 u teškom lancu humanog IgG1 nije L, što znači da amino-kiselina može biti bilo koja druga prirodna ili neprirodna amino-kiselina osim L.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 nije D.
4
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca, amino-kiselina na poziciji koja odgovara D265 u teškom lancu humanog IgG1 nije D, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, redom.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovarajna poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 su hidrofobne ili polarne amino-kiseline.
Izraz „hidrofobni“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostatkom, odnosi se na amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datog prvog i drugog teškog lanca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe amino-kiselina koja se sastoji od: A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y.
Izraz „polarni“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostatkom, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u humanom teškom lancu je izabrana iz grupe koja se sastoji od: C, E, H, K, N, Q, R, S i T.
U drugoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je alifatična nenaelektrisana, aromatična ili kisela amino-kiselina.
Izraz „alifatični nenaelektrisani“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: A, G, I, L i V. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, G, I, L i V.
Izraz „aromatični“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: F, T i W. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: F, T i W.
Izraz „kiseli“, kako se ovde koristi u vezi sa ostacima amino-kiselina, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: D i E. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: D i E.
U posebnoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, E, F, G, I, L, T, V i W.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 nije D.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara D265 u teškom lancu humanog IgG1 nije D, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, redom.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je hidrofobna ili polarna amino-kiselina.
Izraz „hidrofobni“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostatkom, odnosi se na amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y. Dakle, u jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe amino-kiselina koja se sastoji od: A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y.
Izraz „polarni“, kako se ovde koristi u vezi sa ostacima amino-kiselina, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T. Dakle, u jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu čoveka je izabrana iz grupe koja se sastoji od: C, E, H, K, N, Q, R, S i T. U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe aminokiselina koja se sastoji od: A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju poziciji D265 u humanom teškom lancu su izabrane iz grupe koja se sastoji od: C, E, H, K, N, Q, R, S i T.
U drugoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je alifatična, nenaelektrisana, aromatična ili kisela amino-kiselina.
Izraz „alifatični nenaelektrisani“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: A, G, I, L i V. Dakle, u jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, G, I, L i V.
Izraz „aromatični“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: F, T i W. Dakle, u jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: F, T i W.
Izraz „kiseli“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: D i E. Dakle, u jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: D i E.
U posebnoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, E, F, G, I, L, T, V i W.
U daljoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji N297 u teškom lancu humanog IgG1 nije N.
4
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca, amino-kiselina na poziciji koja odgovara N297 u teškom lancu humanog IgG1 nije N, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji P331 u teškom lancu humanog IgG1 je P.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji N297 u teškom lancu humanog IgG1 nije N.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara N297 u teškom lancu humanog IgG1 nije N, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji P331 u teškom lancu humanog IgG1 je P.
U daljoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L i L, redom.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L i L, redom, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, redom.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od: A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su hidrofobne ili polarne amino-kiseline.
Izraz „hidrofobni“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostatkom, odnosi se na amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W i Y.
Izraz „polarni“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe amino-kiselina koja se sastoji od: C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T.
U posebnoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1, nisu L i L, redom.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L i L, redom, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, redom.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su hidrofobne ili polarne aminokiseline.
U jednoj realizaciji, u oba od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W i Y.
U jednoj realizaciji, u oba od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe amino-kiselina koje se sastoje od: C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T.
U posebnoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y.
4
U drugoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su alifatične, nenaelektrisane, aromatične ili kisele amino-kiseline.
Izraz „alifatični nenaelektrisani“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: A, G, I, L i V. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, G, I i V.
Izraz „aromatični“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: F, T i W. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: F, T i W.
Izraz „kiseli“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: D i E. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: D i E.
U posebnoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, D, E, F, G, I, T, V i W.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su F i E; ili A i A, redom.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su F i E; ili A i A,
4
redom, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, redom.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1, su F i E; ili A i A, redom.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su F i E; ili A i A, redom, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, redom.
U posebnoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su F i E, redom.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su F i E, redom.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, najmanje aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su A i A, redom.
U jednoj realizaciji, u oba od datih prvog i drugog teškog lanca, barem amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1, su A i A, redom.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L, L i D, redom.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L, L i D, redom, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, redom.
4
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su izabrane iz grupe koja se sastoji od: A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V i W, a amino-kiselina koja odgovara poziciji D265 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V i W.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su hidrofobne ili polarne amino-kiseline.
Izraz „hidrofobni“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostatkom, odnosi se na amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe amino-kiselina koja se sastoji od: A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W i Y.
Izraz „polarni“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe amino-kiselina koja se sastoji od: C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog je izabrana iz grupe koja se sastoji od: C, E, H, K, N, Q, R, S i T.
U posebnoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje
4
odgovaraju L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su hidrofobne ili polarne aminokiseline.
U jednoj realizaciji, u oba od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe amino-kiselina koja se sastoji od: A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W i Y, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W i Y.
U jednoj realizaciji, u oba od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe amino-kiselina koje se sastoje od: C, D, E, H, K, N, Q, R, S i T, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog je izabrana iz grupe koja se sastoji od: C, E, H, K, N, Q, R, S i T.
U posebnoj realizaciji, u oba od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y.
U drugoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su alifatične nenaelektrisane, aromatične ili kisele amino-kiseline.
Izraz „alifatični nenaelektrisani“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostacima, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: A, G, I, L i V. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datog prvog i drugog teškog lanca, aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, G, I, L i V, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, G, I i V.
Izraz „aromatični“, kako se ovde koristi u vezi sa amino-kiselinskim ostacima, odnosi se na
4
bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: F, T i W. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: F, T i W.
Izraz „kiseli“, kako se ovde koristi u vezi sa ostacima amino-kiselina, odnosi se na bilo koji amino-kiselinski ostatak izabran iz grupe koja se sastoji od: D i E. Dakle, u jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: D i E.
U posebnoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, E, F, G, I, L, T, V i W, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, D, E, F, G, I, T, V i W.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L, L i D, redom.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 nisu L, L i D, redom, a aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, redom.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su alifatične, nenaelektrisane, aromatične ili kisele amino-kiseline.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, G, I, L i V, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234 i L235 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, G, I i V.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: D i E.
U posebnoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji D265 u teškom lancu humanog IgG1 je izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, E, F, G, I, L, T, V i W, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234 i L235 su svaka izabrana iz grupe koja se sastoji od: A, D, E, F, G, I, T, V i W.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A; ili A, A i A, redom.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A; ili A, A i A, redom, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, redom.
U jednoj realizaciji, u oba od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A; ili A, A i A, redom.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A; ili A, A i A, redom, a amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su N i P, redom.
U posebnoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline
1
na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su A, A i A, redom.
U jednoj realizaciji, u oba od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su A, A i A, redom.
U drugoj realizaciji, u najmanje jednom od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E, A, Q i S, redom.
U jednoj realizaciji, u oba od datih prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E, A, Q i S, redom.
U posebnoj realizaciji, antitelo sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8, VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10, i u najmanje jednom od teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom.
U drugoj realizaciji, antitelo sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8, VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12, i u najmanje jednom od teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom.
U drugoj realizaciji, antitelo sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6, VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10, i u najmanje jednom od teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom.
U drugoj realizaciji, antitelo sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6, VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12, i u najmanje jednom od teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom.
2
U drugoj realizaciji, antitelo sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9, VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10, i u najmanje jednom od teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom.
U drugoj realizaciji, antitelo sadrži VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9, VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12, i u najmanje jednom od teških lanaca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom.
U jednom aspektu, antitelo prema pronalasku sadrži humani IgLC2/IgLC3 konstantni domen lambda lakog lanca SEQ ID NO:31.
U jednom aspektu, antitela prema pronalasku mogu biti modifikovana u lakom lancu (LC) i/ili teškom lancu (HC) da bi se povećao nivo eksprimovanja i/ili prinos proizvodnje. U jednoj realizaciji, antitela prema pronalasku mogu biti modifikovana u lakom lancu (LC). Takve modifikacije su poznate u tehnici i mogu se izvršiti prema postupcima opisanim u npr. Zheng, L., Goddard, J.‑P., Baumann, U., & Reymond, J.‑L. (2004). Expression improvement and mechanistic study of the retro-Diels-Alderase catalytic antibody 10F11 by site-directed mutagenesis. Journal of Molecular Biology, 341(3), 807‑14. doi:10.1016/j.jmb.2004.06.014..
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji T41 u lambda lakom lancu SEQ ID NO: 10 nije T.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu je amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji T41 u lambda lakom lancu SEQ ID NO: 10 izabrana iz H, I, K, L, Q, R i V.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji T41 u lambda lakom lancu SEQ ID NO: 10 je H, K ili R, kao što je K.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F10 u lambda lakom lancu SEQ ID NO: 10 nije F, i pri čemu jedna ili više amino-kiselinskih pozicija koje odgovaraju pozicijama T41, K55 i L97 u lambda lakom lancu SEQ ID NO: 10 nisu T, K i L, redom.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama F10, T41, K55 i L97 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 nisu F, T, K i L, redom.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu je amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji T41 izabrana iz H, I, K, L, Q, R ili V, kao što je izabrana iz H, K i R, kao što je K, i pri čemu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama F10, T41, K55 i L97 u lambda lakom lancu SEQ ID NO: 10 su L, K, N i H, redom.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama R23 i A35 nisu R i A, redom.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu je amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji R23 izabrana iz A, G, H, K, Q, S i T, kao što su A i G, i pri čemu je aminokiselina na poziciji koja odgovara A35 izabrana iz I, L, M, P, V, G, F i W, kao što su I, L, M, P i V.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji R23 je A ili G, kao što je A, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji A35 je P.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama F10, R23, A35, R47, D71, A82, D83, S86, I87 i F89 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 nisu F, R, A, R, D, A, D, S, I i F, redom.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu je amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji R23 izabrana iz A, G, H, K, Q, S i T, kao što su A i G, pri čemu je aminokiselina na poziciji koja odgovara A35 izabrana iz I, L, M, P, V, G, F i W, kao što su I, L, M, P, i pri čemu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama F10, R47, D71, A82, D83, S86, I87 i F89 u lambda lakom lancu SEQ ID NO: 10 su L, T, G, P, E, A, E i Y, redom.
4
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu je amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji R23 A ili G, i pri čemu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama F10, A35, R47, D71, A82, D83, S86, I87 i F89 u lambda lakom lancu SEQ ID NO: 10 su L, P, T, G, P, E, A, E i Y, redom.
U jednom aspektu, antitela prema pronalasku mogu biti modifikovana u lakom lancu (LC) da bi se povećao afinitet antitela. Modifikacije koje dovode do povećanog afiniteta antitela su poznate u tehnici.
U jednom aspektu, antitela prema pronalasku mogu biti modifikovana u lakom lancu (LC) da bi se smanjio afinitet antitela. Ovo može biti korisno u nekim uslovima i dovesti do povećane efikasnosti. Posebno nizak afinitet CD3 kraka može imati uticaj na pokretljivost T ćelija u cirkulaciji i na mestu tumora, što dovodi do boljeg angažovanja T ćelija sa tumorskim ćelijama, v. Mølhøj et al, Molecular Immunology 44 (2007). Ovo može biti posebno korisno u bispecifičnim formatima, u kojima se CD3 antitela koriste kao jedan od vezivnih krakova. Modifikacije koje dovode do smanjenog afiniteta antitela su poznate u tehnici, videti, na primer, Webster et al. Int J Cancer Suppl.1988;3:13‑6.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu
(i) amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F10 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 nije F, ili
(ii) amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K55 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 nije K, ili
(iii) amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F10 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 nije F, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K55 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 nije K.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži konstantni laki lanac (LC), pri čemu
(i) amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F10 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 je L, ili
(ii) amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K55 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 je N, ili
(iii) amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F10 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 je L, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K55 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 je N.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama F10, T41, K55 i L97 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 nisu F, T, K i L, redom. Takve modifikacije služe i za povećanje nivoa eksprimovanja i za smanjenje afiniteta.
Antitelo sadrži laki lanac (LC), pri čemu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama F10, T41, K55 i L97 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 su L, K, N i H, redom. Takve modifikacije služe i za povećanje nivoa eksprimovanja i za smanjenje afiniteta.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži teški lanac (HC) i laki lanac (LC), pri čemu pozicije koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 SEQ ID NO:15 su F, E i A, redom, i pri čemu pozicija koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 SEQ ID NO:15 je L, i pri čemu (i) pozicije koje odgovaraju pozicijama F10, T41, K55 i L97 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 su L, K, N i H, redom, ili (ii) pozicija koja odgovara poziciji T41 u lambda lakom lancu SEQ ID NO:10 je K.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži teški lanac (HC) SEQ ID NO:25 i laki lanac (LC) SEQ ID NO:32.
U jednoj realizaciji, antitelo sadrži teški lanac (HC) SEQ ID NO:25 i laki lanac (LC) SEQ ID NO:33.
U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na multispecifično antitelo, koje sadrži najmanje prvi region vezivanja antitela prema bilo kom aspektu ili realizaciji opisanoj ovde, i jedan ili više regiona vezivanja koji se vezuju za jedan ili više različitih ciljeva od prvog regiona vezivanja. Takvo multispecifično antitelo može biti bispecifično antitelo.
Dakle, u jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvi region vezivanja antitela prema bilo kom aspektu ili realizaciji ovde opisanoj i drugi region vezivanja koji se vezuje za drugačiji cilj od prvog regiona vezivanja.
Izraz „multispecifično antitelo“ odnosi se na antitelo koje ima specifičnosti za najmanje dva različita, kao što su najmanje tri, obično nepreklapajuća, epitopa. Takvi epitopi mogu biti na istim ili različitim ciljevima. Ako su epitopi na različitim ciljevima, takvi ciljevi mogu biti na istoj ćeliji ili različitim ćelijama ili tipovima ćelija.
Izraz „bispecifično antitelo“ odnosi se na antitelo koje ima specifičnosti za najmanje dva različita, obično nepreklapajuća, epitopa. Takvi epitopi mogu biti na istim ili različitim ciljevima. Ako su epitopi na različitim ciljevima, takvi ciljevi mogu biti na istoj ćeliji ili različitim ćelijama ili tipovima ćelija.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi i drugi teški lanac.
Realizacije koja se odnose na modifikaciju Fc regiona i realizacije koja se odnose na specifične supstitucije amino-kiselina smatraju se delom bilo kog bispecifičnog antitela prema predmetnom pronalasku. Dakle, u jednoj realizaciji, najmanje jedan od prvog i drugog teškog lanca sadrži jednu ili više amino-kiselina modifikovanih kako je definisano u bilo kojoj ovde opisanoj realizaciji, kao što su one opisane u vezi sa obezbeđivanjem inertnog Fc regiona. U jednoj realizaciji, i prvi i drugi teški lanac sadrže jednu ili više amino-kiselina modifikovanih kako je definisano u bilo kojoj ovde opisanoj realizaciji, kao što su one opisane u vezi sa obezbeđivanjem inertnog Fc regiona. Shodno tome, bispecifično antitelo sadrži Fc region modifikovan prema bilo kom aspektu ili realizaciji ovde opisanoj; ili najmanje jedan od prvog i drugog teškog lanca sadrži jednu ili više amino-kiselina modifikovanih kako je definisano u bilo kom aspektu ili realizaciji ovde opisanoj.
Dakle, u jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da je vezivanje C1q za dato antitelo smanjeno u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili 100%, pri čemu se vezivanje C1q određuje ELISA testom.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da je vezivanje C1q za dato antitelo smanjeno u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili 100%, pri čemu se vezivanje C1q određuje ELISA testom.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da je vezivanje C1q za dato antitelo smanjeno u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili 100%, pri čemu se vezivanje C1q određuje ELISA testom.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da je vezivanje C1q za dato antitelo smanjeno u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili 100%, pri čemu se vezivanje C1q određuje ELISA testom.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da je vezivanje C1q za dato antitelo smanjeno u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili 100%, pri čemu se vezivanje C1q određuje ELISA testom.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da je vezivanje C1q za dato antitelo smanjeno u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili 100%, pri čemu se vezivanje C1q određuje ELISA testom.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da dato antitelo posreduje smanjenu proliferaciju T ćelija posredovanu Fc u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100%, pri čemu se data proliferacija T ćelija meri u funkcionalnom testu zasnovanom na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC).
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da dato antitelo posreduje smanjenu proliferaciju T ćelija posredovanu Fc u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100%, pri čemu se navedena proliferacija T ćelija meri u funkcionalnom testu zasnovanom na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC).
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da dato antitelo posreduje smanjenu proliferaciju T ćelija posredovanu Fc u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100%, pri čemu se navedena proliferacija T ćelija meri u funkcionalnom testu zasnovanom na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC).
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da dato antitelo posreduje smanjenu proliferaciju T ćelija posredovanu Fc u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100%, pri čemu se navedena proliferacija T ćelija meri u funkcionalnom testu zasnovanom na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC).
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da dato antitelo posreduje smanjenu proliferaciju T ćelija posredovanu Fc u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100%, pri čemu se navedena proliferacija T ćelija meri u funkcionalnom testu zasnovanom na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC).
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da dato antitelo posreduje smanjenu proliferaciju T ćelija posredovanu Fc u poređenju sa antitelom divljeg tipa za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100%, pri čemu se navedena proliferacija T ćelija meri u funkcionalnom testu zasnovanom na mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC).
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da dato antitelo smanjuje ekspresiju CD69 posredovanu Fc za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100% u poređenju sa antitelom divljeg tipa, pri čemu je data ekspresija CD69 posredovana Fc određena funkcionalnim testom zasnovanim na PBMC.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da dato antitelo smanjuje ekspresiju CD69 posredovanu Fc za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100% u poređenju sa antitelom divljeg tipa, pri čemu je data ekspresija CD69 posredovana Fc određena funkcionalnim testom zasnovanim na PBMC.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da dato antitelo smanjuje ekspresiju CD69 posredovanu Fc za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100% u poređenju sa antitelom divljeg tipa, pri čemu je data ekspresija CD69 posredovana Fc određena funkcionalnim testom zasnovanim na PBMC.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da dato antitelo smanjuje ekspresiju CD69 posredovanu Fc za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100% u poređenju sa antitelom divljeg tipa, pri čemu je data ekspresija CD69 posredovana Fc određena funkcionalnim testom zasnovanim na PBMC.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da dato antitelo smanjuje ekspresiju CD69 posredovanu Fc za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100% u poređenju sa antitelom divljeg tipa, pri čemu je data ekspresija CD69 posredovana Fc određena funkcionalnim testom zasnovanim na PBMC.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; i pri čemu je Fc region modifikovan tako da dato antitelo smanjuje ekspresiju CD69 posredovanu Fc za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 99% ili 100% u poređenju sa antitelom divljeg tipa, pri čemu je data ekspresija CD69 posredovana Fc određena funkcionalnim testom zasnovanim na PBMC.
U posebnoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i pri čemu su u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 F, E i A, redom.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; i pri čemu su u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 F, E i A, redom.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i pri čemu su u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 F, E i A, redom.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH
1
sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; i pri čemu su u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 F, E i A, redom.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i pri čemu su u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 F, E i A, redom.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; i pri čemu su u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 F, E i A, redom.
Primeri molekula bispecifičnih antitela koji se mogu koristiti obuhvataju (i) jedno antitelo koje ima dva kraka koja obuhvataju različite regione za vezivanje antigena, (ii) jednolančano antitelo koje ima specifičnost za dva različita epitopa, npr. preko dva scFv povezana u tandemu dodatnim peptidnim linkerom; (iii) antitelo sa dvostrukim varijabilnim domenom (DVD-Ig<™>), gde svaki laki lanac i teški lanac sadrže dva varijabilna domena u tandemu preko kratke peptidne veze ([40]); (iv) hemijski povezani bispecifični (Fab')2 fragment; (v) TandAb<®>, što je fuzija dva jednolančana dijatela što rezultira tetravalentnim bispecifičnim antitelom koje ima dva mesta vezivanja za svaki od ciljnih antigena; (vi) fleksitelo, što je kombinacija scFv sa dijatelom što rezultira multivalentnim molekulom; (vii) takozvani „dokiraj i zaključaj“ molekul (Dock-and-Lock<®>), zasnovano na „domenu dimerizacije i dokovanja“ u protein kinazi A, koji, kada se primeni na Fab, može dati trovalentni bispecifični vezujući protein koji se sastoji od dva identična Fab fragmenta povezana sa različitim Fab fragmentom; (viii) takozvani Scorpion molekul, koji sadrži, npr. dva scFv-a fuzionisana na oba kraja humanog Fab-kraka; i (ix) dijatelo.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo je dijatelo, unakrsno antitelo ili bispecifično antitelo dobijeno putem kontrolisane razmene Fab kraka, npr. DuoBody<®>(kao što je opisano u [41]).
2
Primeri različitih klasa bispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničeni na (i) molekule slične IgG sa komplementarnim CH3 domenima radi prisiljavanja heterodimerizacije; (ii) rekombinantne molekule slične IgG sa dvostrukim ciljanjem, pri čemu svaka od dve strane molekula sadrži Fab fragment ili deo Fab fragmenta najmanje dva različita antitela; (iii) IgG fuzione molekule, pri čemu su IgG antitela pune dužine fuzionisana sa dodatnim Fab fragmentom ili delovima Fab fragmenta; (iv) Fc fuzione molekule, pri čemu su Fv molekuli jednog lanca ili stabilizovana dijatela fuzionisani sa konstantnim domenima teškog lanca, Fcregionima ili njihovim delovima; (v) Fab fuzione molekule, pri čemu su različiti Fab-fragmenti fuzionisani zajedno, fuzionisani sa konstantnim domenima teškog lanca, Fc-regionima ili njihovim delovima; i (vi) antitela zasnovana na ScFv i dijatelima i teškim lancima (npr. antitela sa domenima, Nanobodies<®>) pri čemu su različiti jednolančani Fv molekuli ili različita diatela ili različita antitela teškog lanca (npr. domenska antitela, Nanobodies<®>) fuzionisani jedni sa drugima ili sa drugim proteinom ili molekulom nosačem fuzionisanim sa konstantnim domenima teškog lanca, Fc-regionima ili njihovim delovima.
Primeri molekula sličnih IgG sa komplementarnim CH3 domenima uključuju, ali nisu ograničeni na, Triomab<®>(Trion Pharma/Fresenius Biotech, [42]), Knobs-into-Holes (Genentech, [43]), CrossMAb (Roche, [44]) i elektrostatički upareni (Amgen, [45]-[46]; Chugai, [47]; Oncomed, [48]), LUZ-Y (Genentech), DIG-telo i PIG-telo (Pharmabcine), telo Strand Exchange Engineered Domain (SEEDbody) (EMD Serono, [49]), Biclonics (Merus), FcΔAdp (Regeneron, [50]), bispecifični IgG1 i IgG2 (Pfizer/Rinat, [51]), azimetrijski skelet (Zymeworks/Merck, [52]), mAb-Fv (Xencor, [53]), bivalentna bispecifična antitela (Roche) i DuoBody<®>molekuli (Genmab A/S, [41]).
Primeri rekombinantnih molekula sa dvostrukim ciljanjem sličnih IgG uključuju, ali nisu ograničeni na dvostruko ciljajuća (DT)-Ig (GSK/Domantis), dva u jednom antitela (Genentech), ukršteni Mabs (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star, [54]), Zybodies<™>(Zyngenia), pristupi sa zajedničkim lakim lancem (Crucell/Merus, [55]), κλ tela (NovImmune) i CovX-body<®>(CovX/Pfizer).
Primeri IgG fuzionih molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, dualno varijabilni domen (DVD)-Ig<™>(Abbott, [56]), dvodomenska antitela sa dvostrukom glavom (Unilever; Sanofi Aventis, [57]), IgG-slična bispecifična (ImClone/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) i BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec, [58]), scFv fuzija (Novartis), scFv fuzija (Changzhou Adam Biotech Inc, [59]) i TvAb (Roche, [59], [60]).
Primeri Fc fuzionih molekula uključuju, ali nisu ograničeni na ScFv/Fc fuzije (Akademska institucija), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), Dual Affinity Retargeting Technology (Fc-DART<™>) (MacroGenics, [62], [63]) i Dual(ScFv)2-Fab (Nacionalni istraživački centar za lečenje antitelima - Kina).
Primeri Fab fuzionih bispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničeni na F(ab)2 (Medarex/AMGEN), Dual-Action ili Bis-Fab (Genentech), Dock-and-Lock<®>(DNL) (ImmunoMedics), bivalentni bispecifični (Biotecnol) i Fab-Fv (UCB-Celltech).
Primeri antitela zasnovanih na ScFv, dijatelima i domenima uključuju, ali nisu ograničeni na, bispecifični T ćelijski pokretač (BiTE<®>) (Micromet, Tandem Diabody (Tandab) (Affimed), Dual Affinity Retargeting Technology (DART<™>) (MacroGenics), jednolančano dijatelo (Academic), antitela slična TCR (AIT, ReceptorLogics), fuzija humanog serumskog albumina ScFv (Merrimack) i COMBODY (Epigen Biotech), dual targeting nanobodies<®>(Ablynx), antitela sa dvostrukim ciljanjem samo na domen teškog lanca.
Dalje se razmatra da bilo koje monospecifično antitelo koje ispunjava uslove ispitivanja opisane ovde može formirati osnovu bispecifičnog antitela. Tj. bispecifično antitelo pri čemu jedan od regiona vezivanja vezuje CD3 može poticati od bilo kog monospecifičnog CD3 antitela testiranog u funkcionalnim ispitivanjima i koje ispunjava ovde navedene zahteve. Takvo bispecifično antitelo može se obezbediti postupcima opisanim u [41].
Dakle, u posebnoj realizaciji, svaki od datog prvog i drugog teškog lanca sadrži najmanje jedan zglobni region, CH2 i CH3 region, pri čemu je u datom prvom teškom lancu supstituisana najmanje jedna od amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od T366, L368, K370, D399, F405, Y407 i K409 u teškom lancu humanog IgG1, a u datom drugom teškom lancu je supstituisana najmanje jedna od amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od T366, L368, K370, D399, F405, Y407 i K409 u teškom lancu humanog IgG1, i pri čemu dati prvi i navedeni drugi teški lanci nisu supstituisani u istim pozicijama. U ovom kontekstu, izraz „supstituisan“ se odnosi na to da je amino-kiselina u specifičnoj poziciji amino-kiseline supstituisana drugom
4
prirodno ili neprirodno prisutnom amino-kiselinom. Dakle, „supstituisana“ amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji u teškom lancu humanog IgG1 znači da je amino-kiselina na određenoj poziciji drugačija od prirodno prisutne amino-kiseline u teškom lancu IgG1.
U jednoj realizaciji, u datom prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 nije K, L ili M, i opciono amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je F, a u datom drugom teškom lancu je supstituisana najmanje jedna od amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od: T366, L368, K370, D399, F405 i Y407 u teškom lancu humanog IgG1.
U jednoj realizaciji, u datom prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 nije K, L ili M, a u datom drugom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 nije F i opciono aminokiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je K.
U jednoj realizaciji, u datom prvom teškom lancu, amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 nije F, R i G, a u datom drugom teškom lancu aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju poziciji izabranoj iz grupe koja se sastoji od: T366, L368, K370, D399, Y407 i K409 u teškom lancu humanog IgG1 su supstituisane.
U jednoj realizaciji, amino-kiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 nije K, L ili M u datom prvom teškom lancu, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 nije F.
U daljoj realizaciji, amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u datom prvom teškom lancu, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u datom drugom teškom lancu, ili obrnuto.
Dakle, u jednoj realizaciji, amino-kiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u prvom teškom lancu, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u drugom teškom lancu.
U daljoj realizaciji, humanizovano ili himerno CD3 antitelo sadrži u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca jednu ili više inaktivirajućih supstitucija kao što je stavljeno na uvid javnosti u bilo kojoj od gore navedenih realizacija, kao što su L234F, L235E i D265A; i da amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 nije F. U jednoj realizaciji, humanizovano ili himerno CD3 antitelo sadrži u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca jednu ili više inaktivirajućih supstitucija kao što je stavljeno na uvid javnosti u bilo kojoj od gore navedenih realizacija, kao što su L234F, L235E i D265A; i dalju supstituciju na poziciji K409, kao što je K409R. Konkretno, u jednoj realizaciji, humanizovano ili himerno CD3 antitelo sadrži i u prvom i u drugom teškom lancu jednu ili više inaktivirajućih supstitucija kao što je stavljeno na uvid javnosti u bilo kojoj od gore navedenih realizacija, kao što su L234F, L235E i D265A; i supstituciju na poziciji F405, kao što je F405L. U jednoj realizaciji, humanizovano ili himerno CD3 antitelo sadrži i u prvom i u drugom teškom lancu jednu ili više inaktivirajućih supstitucija kao što je opisano u bilo kojoj od gore navedenih realizacija, kao što su L234F, L235E i D265A; i dalju supstituciju na poziciji K409, kao što je K409R. Takva antitela su korisna za generisanje bispecifičnog antitela.
Shodno tome, u daljoj realizaciji, u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca, aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom, amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u prvom teškom lancu, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u drugom teškom lancu.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E, A, N i P redom, amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u prvom teškom lancu, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u drugom teškom lancu.
U alternativnoj realizaciji, u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom, amino-kiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u prvom teškom lancu, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u drugom teškom lancu.
U jednoj realizaciji, u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E, A, N i P redom, amino-kiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u prvom teškom lancu, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u drugom teškom lancu.
U drugoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom, amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u prvom teškom lancu, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u drugom teškom lancu.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E, A, N i P redom, amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u prvom teškom lancu, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u drugom teškom lancu.
U alternativnoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom, amino-kiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u prvom teškom lancu, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u drugom teškom lancu.
U jednoj realizaciji, i u prvom i u drugom teškom lancu, amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju L234, L235, D265, N297 i P331 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E, A, N i P redom, amino-kiselina na poziciji koja odgovara K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R u prvom teškom lancu, a amino-kiselina na poziciji koja odgovara F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L u drugom teškom lancu.
Kao što je ovde opisano, regrutovanje T ćelija u specifične ciljne ćelije, kao što su ćelije raka ili tumora, obezbeđuje način ubijanja ciljnih ćelija. Pronalazači predmetnog pronalaska su pokazali da je bispecifično CD3xHER2 antitelo koje sadrži specifične amino-kiselinske supstitucije L234F, L235E i D265A u oba teška lanca, bilo u stanju da indukuje ubijanje AU565 ćelija kao što je opisano u Primeru 5. Ubijanje posredovano T ćelijama može se postići bispecifičnim antitelom koje cilja CD3 prvim regionom vezivanja i drugom ciljem drugim regionom vezivanja. Dakle, u jednoj realizaciji, prvi region vezivanja je u skladu sa bilo kojim realizacijama opisanim ovde za humanizovano ili himerno CD3 antitelo, a drugi region vezivanja vezuje drugačiji cilj od prvog regiona vezivanja. Treba razumeti da kada je antitelo bispecifično antitelo, najmanje jedna polovina antitela, tj. jedan od para teških i lakih lanaca antitela, je humanizovano ili himerno antitelo kao što je ovde opisano. Dakle, jedna polovina bispecifičnog antitela je humanizovano ili himerno antitelo koje vezuje CD3, a druga polovina može biti humanizovano, himerno, potpuno nehumano ili potpuno humano koje se vezuje za drugu metu. Dakle, u jednoj realizaciji, antitelo sadrži prvi i drugi teški lanac, prvi i drugi laki lanac, pri čemu su navedeni prvi teški i navedeni prvi laki lanci humanizovani ili himerni i povezani su preko disulfidnih mostova koji formiraju prvi region vezivanja; i navedeni drugi teški i laki lanci su potpuno humani i povezani su preko disulfidnih mostova koji formiraju drugi region vezivanja, pri čemu je navedeni prvi region vezivanja u skladu sa bilo kojim aspektom ili realizacijom ovde opisanim, a navedeni drugi region vezivanja vezuje se za drugu metu. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži prvi i drugi teški lanac, prvi i drugi laki lanac, pri čemu su dati prvi teški i navedeni prvi laki lanci humanizovani ili himerni i povezani su preko disulfidnih mostova koji formiraju prvi region vezivanja; i dati drugi teški i laki lanci su humanizovani ili himerni i povezani su preko disulfidnih mostova formirajući drugi region vezivanja, pri čemu je dati prvi region vezivanja u skladu sa bilo kojim aspektom ili realizacijom opisanim ovde, i dati drugi region vezivanja vezuje drugačiji epitop CD3 od datog prvog regiona vezivanja.
Dakle, u jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu su u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 F, E i A, redom; i pri čemu je u prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu su u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 F, E i A, redom; i pri čemu je u prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:8 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID
1
NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom
2
teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234,
4
L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:19 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:20; pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
U drugoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži prvi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:9 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:12; drugi region vezivanja koji obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29 i VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30; pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; i pri čemu u prvom teškom lancu aminokiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R.
Izraz „disulfidni mostovi“, kako se ovde koristi, odnosi se na kovalentnu vezu između dva cisteinska ostatka, tj. data interakcija može se, takođe, označiti kao Cys-Cys interakcija.
Izraz „cilj“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul za koji se vezuje region vezivanja antitela prema predmetnom pronalasku. Kada se koristi u kontekstu vezivanja antitela, izraz uključuje bilo koji antigen prema kome je usmereno stvoreno antitelo.
U jednoj posebnoj realizaciji, prvi teški i prvi laki lanci su humanizovani ili himerni i povezani su preko disulfidnih mostova koji formiraju prvi region vezivanja; a drugi teški i laki lanci su potpuno humani i povezani su preko disulfidnih mostova koji formiraju drugi region vezivanja, pri čemu je prvi region vezivanja u skladu sa bilo kojim aspektom ili realizacijom ovde opisanim, a drugi region vezivanja vezuje se za drugi cilj; i pri čemu u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom.
U jednoj posebnoj realizaciji, prvi teški i prvi laki lanci su humanizovani ili himerni i povezani su preko disulfidnih mostova formirajući prvi region vezivanja; a drugi teški i laki lanci su potpuno humani i povezani su preko disulfidnih mostova formirajući drugi region vezivanja, pri čemu je prvi region vezivanja u skladu sa bilo kojim aspektom ili realizacijom ovde opisanim, a drugi region vezivanja vezuje drugačiji epitop CD3 od prvog regiona vezivanja; i pri čemu u najmanje jednom od prvog i drugog teškog lanca amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom.
U jednoj posebnoj realizaciji, prvi teški i prvi laki lanci su humanizovani ili himerni i povezani su preko disulfidnih mostova formirajući prvi region vezivanja; a drugi teški i laki lanci su potpuno humani i povezani su preko disulfidnih mostova formirajući drugi region vezivanja, pri čemu je prvi region vezivanja u skladu sa bilo kojim aspektom ili realizacijom ovde opisanim, a drugi region vezivanja vezuje različit cilj; i pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom.
U jednoj posebnoj realizaciji, prvi teški i prvi laki lanci su humanizovani ili himerni i povezani su preko disulfidnih mostova formirajući prvi region vezivanja; a drugi teški i laki lanci su potpuno humani i povezani su preko disulfidnih mostova formirajući drugi region vezivanja, pri čemu je prvi region vezivanja u skladu sa bilo kojim aspektom ili realizacijom ovde opisanim, a drugi region vezivanja vezuje drugačiji epitop CD3 od prvog regiona vezivanja; i pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo sadrži drugi region vezivanja koji se vezuje za humani HER2 ili humani CD20.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži drugi region vezivanja koji se vezuje za humani CD20.
U jednoj realizaciji, drugi region vezivanja može biti izveden iz monoklonskog CD20 antitela pune dužine, kao što je antitelo opisano u WO2004035607 (Genmab A/S), uključujući ofatumumab (2F2), 11B8 i 7D8; antitelo stavljeno na uvid javnosti u WO2005103081 (Genmab A/S), uključujući 2C6; AME-133; TRU-015; IMMU-106; okrelizumab (Gazyva<®>); tozitumomab (Bexxar<®>); i rituksimab (Rituxan<®>/ MabThera<®>).
U jednoj realizaciji, drugi region vezivanja može biti izveden iz monoklonskog CD20 antitela pune dužine, a to se antitelo vezuje za epitop na CD20, koji ne sadrži ili ne zahteva aminokiselinske ostatke alanin na poziciji 170 ili prolin na poziciji 172, ali koji sadrži ili zahteva amino-kiselinske ostatke asparagin na poziciji 163 i asparagin na poziciji 166.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži drugi region vezivanja koji se vezuje za humani CD20, pri čemu taj region vezivanja sadrži:
(i) VH CDR1 region SEQ ID NO:34, VH CDR2 region SEQ ID NO:35, VH CDR3 region SEQ ID NO:36, VL CDR1 region SEQ ID NO:37, VL CDR2 region DAS i VL CDR3 region SEQ ID NO:38,
(ii) VH CDR1 region SEQ ID NO: 41, VH CDR2 region SEQ ID NO: 42, VH CDR3 region SEQ ID NO: 43, VL CDR1 region SEQ ID NO: 44, VL CDR2 region DAS i VL CDR3 region SEQ ID NO: 45,
(iii) VH CDR1 region SEQ ID NO:48, VH CDR2 region SEQ ID NO:49, VH CDR3 region SEQ ID NO:50, VL CDR1 region SEQ ID NO:51, VL CDR2 region DAS i VL CDR3 region SEQ ID NO:52, ili
(iv) VH CDR1 region SEQ ID NO:55, VH CDR2 region SEQ ID NO:56, VH CDR3 region SEQ ID NO:57, VL CDR1 region SEQ ID NO:58, VL CDR2 region DAS i VL CDR3 region SEQ ID NO:59.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži drugi region vezivanja koji se vezuje za humani CD20, pri čemu taj region vezivanja sadrži:
(i) VH sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identiteta sekvenci amino-kiselina sa amino-kiselinskim sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:29, i VL sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identiteta sekvenci amino-kiselina sa amino-kiselinskim sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:30,
(ii) VH sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identiteta sekvenci amino-kiselina sa amino-kiselinskim sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:39, i VL sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identiteta sekvenci amino-kiselina sa amino-kiselinskim sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:40,
(iii) VH sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identiteta sekvenci amino-kiselina sa amino-kiselinskim sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:46, i VL sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identiteta sekvenci amino-kiselina sa amino-kiselinskim sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:47, ili
(iv) VH sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identiteta sekvenci amino-kiselina sa amino-kiselinskim sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:53, i VL sekvencu koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% ili najmanje 99% identiteta sekvenci amino-kiselina sa amino-kiselinskim sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:54.
U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo sadrži drugi region vezivanja koji se vezuje za humani CD20, pri čemu drugi region vezivanja sadrži:
(i) VH sekvencu SEQ ID NO: 29 i VL sekvencu SEQ ID NO:30,
(ii) VH sekvencu SEQ ID NO:39 i VL sekvencu SEQ ID NO:40,
(iii) VH sekvencu SEQ ID NO:46 i VL sekvencu SEQ ID NO:47, ili
(iv) VH sekvencu SEQ ID NO:53 i VL sekvencu SEQ ID NO:54.
Konstrukti nukleinske kiseline, ekspresioni vektori i ćelije domaćina
U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na konstrukt nukleinske kiseline koji kodira jednu ili više sekvenci navedenih u Tabeli 1. Stoga, predmetni pronalazak se odnosi na konstrukt nukleinske kiseline koji kodira bilo koju od sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 i 26.
U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na konstrukt nukleinske kiseline koji kodira sekvencu humanizovanog ili himernog CD3 antitela prema predmetnom pronalasku, na ekspresione vektore koji sadrže konstrukt nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku, na ćelije domaćina koje sadrže takve ekspresione vektore i na postupke proizvodnje takvog antitela kultivisanjem takvih ćelija domaćina pod odgovarajućim uslovima pri čemu se antitelo proizvodi i, opciono, izdvaja. Humanizovana CD3 antitela mogu se, takođe, označiti kao „huCD3“.
U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži (i) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu teškog lanca humanizovanog ili himernog antitela prema pronalasku, (ii) sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu lakog lanca humanizovanog ili himernog antitela prema pronalasku, ili (iii) oba i (i) i (ii). Dakle, ekspresioni vektor sadrži jedan ili više konstrukata nukleinskih kiselina ili sekvenci nukleinskih kiselina prema bilo kom aspektu ili realizaciji ovde opisanim.
U jednoj realizaciji, ekspresioni vektor predmetnog pronalaska sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira jednu ili više CDR sekvenci teškog i lakog lanca izabranih iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO.: 1, 2, 3, 4 i 5; i sekvence GTN.
U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira jednu ili više sekvenci amino-kiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 20, 27, 28, 29 i 30, ili bilo koje njihove kombinacije. U drugoj realizaciji, ekspresioni vektor sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira VH CDR3 sekvencu amino-kiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 3. U drugoj realizaciji, ekspresioni vektor sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira VH sekvencu aminokiselina izabranu iz SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 19, 27 i 29. U drugoj realizaciji, ekspresioni vektor sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira VL sekvencu amino-kiselina izabranu iz SEQ ID NO: 10, 11, 12, 20, 28 i 30. U drugoj realizaciji, ekspresioni vektor sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstantni region lakog lanca humanog antitela, teškog lanca humanog antitela ili oba. U drugoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu amino-kiselina prema SEQ ID NO: 15, 16, 23, 24, 25 i 26.
U posebnoj realizaciji, ekspresioni vektor sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira varijantu jedne ili više gore navedenih sekvenci amino-kiselina, pri čemu data varijanta ima najviše 25 modifikacija amino-kiselina, kao što je najviše 20, kao što je najviše 15, 14, 13, 12 ili 11 modifikacija amino-kiselina, kao što su 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 modifikacija aminokiseline, kao što su delecije ili insercije, poželjno supstitucije, kao što su konzervativne ili nekonzervativne supstitucije, ili najmanje 80% identiteta sa bilo kojom od navedenih sekvenci, kao što je najmanje 85% identiteta ili 90% identiteta ili 95% identiteta, kao što je 96% identiteta ili 97% identiteta ili 98% identiteta ili 99% identiteta sa bilo kojom od gore navedenih sekvenci amino-kiselina. Predmetni pronalazak se, takođe, odnosi na sekvence nukleinskih kiselina koje se razlikuju od gore datih sekvenci nukleinskih kiselina, ali koje zbog varijanse genetskog koda kodiraju istu sekvencu amino-kiselina kao antitelo predmetnog pronalaska. Npr. sekvenca nukleinskih kiselina može da varira, ali rezultira identičnim sekvencama amino-kiselina kao bilo koja sekvenca amino-kiselina ovde opisana. Dobro je poznato stručnjaku kako da identifikuje takve dalje sekvence nukleinskih kiselina na osnovu genetskog koda.
U daljoj realizaciji, ekspresioni vektor dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstantni region lakog lanca, teškog lanca ili i lakih i teških lanaca antitela, npr. humanog antitela.
Takvi ekspresioni vektori kao što je gore opisano mogu se koristiti za rekombinantnu proizvodnju antitela predmetnog pronalaska.
Ekspresioni vektor u kontekstu predmetnog pronalaska može biti bilo koji pogodan vektor, uključujući hromozomske, nehromozomske i sintetičke vektore nukleinskih kiselina (sekvenca nukleinskih kiselina koja sadrži odgovarajući skup elemenata za kontrolu ekspresije). Primeri takvih vektora uključuju derivate SV40, bakterijske plazmide, fagnu DNK, bakulovirus, plazmide kvasca, vektore izvedene iz kombinacija plazmida i fagne DNK i vektore virusnih nukleinskih kiselina (RNK ili DNK). U jednoj realizaciji, humanizovana ili himerna nukleinska kiselina koja kodira CD3 antitelo je sadržana u vektoru gole DNK ili RNK, uključujući, na primer, linearni element eksprimovanja (kao što je opisano na primer u [64]), kompaktni vektor nukleinskih kiselina (kao što je opisano na primer u [65] i/ili [66]), plazmidni vektor kao što su pBR322, pUC 19/18 ili pUC 118/119, „midge“ vektor nukleinskih kiselina minimalne veličine (kao što je opisano na primer u [67]), ili kao precipitovani konstrukt vektora nukleinskih kiselina, kao što je CaPO4<->precipitovani konstrukt (kao što je opisano na primer u [68], [69], [70] i [71]). Takvi vektori nukleinskih kiselina i njihova upotreba su dobro poznati u tehnici (videti, na primer, [72] i [73]).
U jednoj realizaciji, vektor je pogodan za eksprimovanje humanizovanog ili himernog CD3 antitela u bakterijskoj ćeliji. Primeri takvih vektora uključuju ekspresione vektore kao što su BlueScript (Stratagene), pIN vektori ([74]), pET vektori (Novagen, Madison WI) i slično.
Ekspresioni vektor može takođe ili alternativno da bude vektor pogodan za eksprimovanje u sistemu kvasca. Može se koristiti bilo koji vektor pogodan za eksprimovanje u sistemu kvasca. Pogodni vektori uključuju, na primer, vektore koji sadrže konstitutivne ili inducibilne promotere kao što su alfa faktor, alkohol oksidaza i PGH (pregledano u: [75] i [76]).
Konstrukt nukleinske kiseline i/ili vektor može, takođe, da sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu sekrecije/lokalizacije, koja može da usmeri polipeptid, kao što je nascentni polipeptidni lanac, u periplazmatski prostor ili u medijum za ćelijsku kulturu. Takve sekvence su poznate u tehnici i uključuju liderske ili signalne peptide sekrecije, sekvence usmerene na organele (npr. sekvence nuklearne lokalizacije, signali zadržavanja ER, sekvence mitohondrijalnog tranzita, sekvence hloroplastnog tranzita), sekvence membranske lokalizacije/sidra (npr. sekvence zaustavljanja prenosa, GPI sidrene sekvence) i slično koje su dobro poznate u tehnici.
U ekspresionom vektoru, humanizovane ili himerne nukleinske kiseline koje kodiraju antitela za CD3 mogu da sadrže ili budu povezane sa bilo kojim odgovarajućim promoterom, pojačivačem i drugim elementima koji olakšavaju ekspresiju. Primeri takvih elemenata uključuju jake promotere eksprimovanja (npr. promoter/pojačivač humanog CMV IE, kao i RSV, SV40, SL3-3, MMTV i HIV LTR promotere), efikasne poli (A) terminacione sekvence, mesto početka replikacije za plazmidni proizvod u E. koli, gen otpornosti na antibiotike kao selektivni marker i/ili pogodno mesto za kloniranje (npr. polilinker). Konstrukti nukleinske kiseline i/ili vektori mogu, takođe, da sadrže inducibilni promoter, za razliku od konstitutivnog promotera kao što je CMV IE (stručnjak će prepoznati da su takvi izrazi zapravo deskriptori stepena eksprimovanja gena pod određenim uslovima).
1
U jednoj realizaciji, humanizovani ili himerni ekspresioni vektor koji kodira CD3 antitelo je pozicioniran u i/ili isporučen ćeliji domaćinu ili životinji domaćinu putem virusnog vektora.
Takvi ekspresioni vektori mogu se koristiti za rekombinantnu proizvodnju humanizovanih ili himernih CD3 antitela.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži ekspresioni vektor prema pronalasku.
U jednom aspektu, humanizovana ili himerna CD3 antitela bilo kog aspekta ili realizacije opisane ovde su obezbeđena upotrebom rekombinantne eukariotske, rekombinantne prokariotske ili rekombinantne mikrobne ćelije domaćina koja proizvodi antitelo. Shodno tome, pronalazak obezbeđuje rekombinantnu eukariotsku, rekombinantnu prokariotsku ili rekombinantnu mikrobnu ćeliju domaćina, koja proizvodi humanizovano ili himerno CD3 antitelo ili imunoglobulin kako je ovde definisano. Primeri ćelija domaćina uključuju ćelije kvasca, bakterija i sisara, kao što su ćelije CHO ili HEK-293. Na primer, u jednoj realizaciji, ćelija domaćin sadrži sekvencu nukleinske kiseline stabilno integrisanu u ćelijski genom koja sadrži sekvencu koja kodira za ekspresiju humanizovanog ili himernog CD3 antitela opisanog ovde. U drugoj realizaciji, ćelija domaćin sadrži neintegrisanu sekvencu nukleinske kiseline, kao što je plazmid, kozmid, fagmid ili linearni ekspresioni element, koji sadrži sekvencu koja kodira za eksprimovanje humanizovanog ili himernog CD3 antitela opisanog ovde.
Izraz „rekombinantna ćelija domaćin“ (ili jednostavno „ćelija domaćin“), kako se ovde koristi, odnosi se na ćeliju u koju je uveden ekspresioni vektor ili konstrukt nukleinske kiseline ili sekvenca. Treba razumeti da se takvi izrazi odnose ne samo na određenu ćeliju, već i na potomstvo takve ćelije. Pošto se određene modifikacije mogu javiti u narednim generacijama zbog mutacije ili uticaja okoline, takvo potomstvo možda zapravo nije identično matičnoj ćeliji, ali je i dalje uključeno u obim izraza „ćelija domaćin“ kako se ovde koristi. Rekombinantne ćelije domaćini uključuju, na primer, eukariotske ćelije domaćina, kao što su CHO ćelije, HEK-293 ćelije, PER.C6, NS0 ćelije i limfocitne ćelije, i prokariotske ćelije kao što su E. coli i drugi eukariotski domaćini kao što su biljne ćelije i gljivice.
2
U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju humanizovanog ili himernog CD3 antitela pronalaska, pri čemu navedeni postupak obuhvata korake
a) kultivisanje ćelije domaćina prema predmetnom pronalasku kao što je gore opisano, i b) izdvajanje i/ili prečišćavanje antitela prema predmetnom pronalasku iz podloge za kultivaciju.
U daljem aspektu, nukleotidna sekvenca koja kodira sekvencu humanizovanog ili himernog CD3 antitela dodatno kodira drugi deo, kao što je terapeutski polipeptid. Primeri terapeutskih polipeptida su opisani na drugom mestu u ovom tekstu. U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju humanizovanog ili himernog fuzionog proteina CD3 antitela, pri čemu dati postupak obuhvata korake
a. kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji sadrži takvu nukleotidnu sekvencu, i
b. izdvajanje i/ili prečišćavanje humanizovanog ili himernog fuzionog proteina CD3 antitela iz podloge za kultivaciju.
Kompozicije
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema bilo kom od ovde opisanih aspekata i realizacija.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo kako je definisano u bilo kom od ovde opisanih aspekata i realizacija, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
Farmaceutske kompozicije mogu da budu formulisane sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima, kao i sa bilo kojim drugim poznatim adjuvansima i ekscipijensima u skladu sa konvencionalnim tehnikama kao što su one opisane u [77].
Farmaceutski prihvatljivi nosači ili razblaživači, kao i svi drugi poznati adjuvansi i ekscipijensi, trebalo bi da budu pogodni za humanizovano ili himerno antitelo predmetnog pronalaska i izabrani način administriranja. Pogodnost nosača i drugih komponenti farmaceutskih kompozicija određuje se na osnovu nedostatka značajnog negativnog uticaja na željena biološka svojstva izabranog jedinjenja ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska (npr. manji od značajnog uticaja (10% ili manje relativne inhibicije, 5% ili manje relativne inhibicije, itd.)) na vezivanje antigena.
Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može, takođe, da sadrži razblaživače, punila, soli, pufere, detergente (npr. nejonski detergent, kao što su Tween-20 ili Tween-80), stabilizatore (npr. šećere ili amino-kiseline bez proteina), konzervanse, fiksative tkiva, solubilizatore i/ili druge materijale pogodne za uključivanje u farmaceutsku kompoziciju.
Stvarni nivoi doziranja aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska mogu se menjati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapeutskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način primene, a da pritom nije toksična za pacijenta. Izabrani nivo doziranja zavisiće od različitih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost određenih kompozicija predmetnog pronalaska koje se koriste, ili njihovog amida, način primene, vreme primene, brzinu izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanje tretmana, druge lekove, jedinjenja i/ili materijale koji se koriste u kombinaciji sa određenim kompozicijama koje se koriste, starost, pol, težinu, stanje, opšte zdravstveno stanje i prethodnu medicinsku istoriju pacijenta koji se leči, i slične faktore dobro poznate u medicini.
Farmaceutska kompozicija se može administrirati bilo kojim pogodnim putem i načinom. Pogodni putevi primene humanizovanog ili himernog antitela predmetnog pronalaska in vivo i in vitro su dobro poznati u tehnici i mogu ih odabrati stručnjaci iz ove oblasti.
U jednoj realizaciji, farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska se primenjuje parenteralno.
Izrazi „parenteralna primena“ i „primenjeno parenteralno“, kako se ovde koriste, označavaju načine primene koji nisu enteralna i topikalna primena, obično injekcijom, i uključuju epidermalnu, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, intratendinoznu, transtrahealnu, potkožnu, supkutikularnu, intraartikularnu, supkapsularnu, subarahnoidalnu, intraspinalnu, intrakranijalnu, intratorakalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.
4
U jednoj realizaciji, ta farmaceutska kompozicija se daje intravenskom ili supkutanom injekcijom ili infuzijom.
Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sve pogodne rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijska i antifungalna sredstva, sredstva za izotoničnost, antioksidanse i sredstva za odlaganje apsorpcije i slično, koji su fiziološki kompatibilni sa humanizovanim ili himernim antitelom predmetnog pronalaska.
Primeri odgovarajućih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska uključuju vodu, fiziološki rastvor, fosfatno puferovani fiziološki rastvor, etanol, dekstrozu, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično) i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja, kao što su maslinovo ulje, kukuruzno ulje, ulje kikirikija, ulje pamučnog semena i susamovo ulje, koloidne rastvore karboksimetil celuloze, tragakant gumu i organske estre za injekcije, kao što je etil oleat, i/ili razne pufere. Drugi nosači su dobro poznati u farmaciji.
Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporalno pripremanje sterilnih rastvora ili disperzija za injekcije. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je poznata u tehnici. Osim ukoliko bilo koji konvencionalni medijum ili sredstvo nije kompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, njihova upotreba se razmatra u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska. Kada se pominje „aktivno jedinjenje“, podrazumeva se da se to odnosi i na humanizovano ili himerno antitelo prema predmetnom pronalasku.
Odgovarajuća fluidnost može se održati, na primer, upotrebom materijala za premaze, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata.
Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu, takođe, da sadrže farmaceutski prihvatljive antioksidanse, na primer (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; (2) antioksidanse rastvorljive u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol i slično; i (3) sredstva za helatiranje metala, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slično.
Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu, takođe, da sadrže sredstva za izotoničnost, kao što su šećeri, polialkoholi, kao što su manitol, sorbitol, glicerol ili natrijum hlorid u kompozicijama.
Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu, takođe, da sadrže jedan ili više adjuvanasa pogodnih za izabrani način administriranja, kao što su konzervansi, sredstva za kvašenje, emulgatori, disperziona sredstva, konzervansi ili puferi, koji mogu poboljšati rok trajanja ili efikasnost farmaceutske kompozicije. Humanizovano ili himerno antitelo predmetnog pronalaska može da se pripremi sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate, transdermalne flastere i mikroinkapsulirane sisteme za isporuku. Takvi nosači mogu da uključuju želatin, gliceril monostearat, gliceril distearat, biorazgradive, biokompatibilne polimere kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina, same ili sa voskom, ili druge materijale dobro poznate u tehnici. Postupci za pripremu takvih formulacija su generalno poznatti stručnjacima u tehnici (videti, npr. [78]).
U jednoj realizaciji, humanizovano ili himerno antitelo predmetnog pronalaska može biti formulisano tako da se obezbedi pravilna distribucija in vivo. Farmaceutski prihvatljivi nosači za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporalno pripremanje sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je poznata u tehnici. Osim ukoliko bilo koji konvencionalni medijum ili sredstvo nije kompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njihova upotreba u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska. Druga aktivna ili terapeutska jedinjenja, takođe, mogu biti uključena u kompozicije.
Farmaceutske kompozicije za injekcije obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti vodeni ili nevodeni rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično) i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i organske estre za injekcije, kao što je etil oleat.
Odgovarajuća fluidnost može se održavati, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole kao što su glicerol, manitol, sorbitol ili natrijum hlorid u kompoziciju. Produžena apsorpcija kompozicija za injekcije može se postići uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, monostearatnih soli i želatina. Sterilni rastvori za injekcije mogu se pripremiti ugradnjom aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka, npr. kao što je gore navedeno, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke, npr. od onih navedenih gore. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, primeri postupaka pripreme su vakuumsko sušenje i liofilizacija, koji daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora istog.
Sterilni rastvori za injekcije mogu se pripremiti ugradnjom aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka navedenih gore, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke iz onih navedenih gore. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, primeri postupaka pripreme su vakuumsko sušenje i liofilizacija, koji daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora istog.
Terapeutske primene
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na humanizovano ili himerno antitelo ili farmaceutska kompozicija pronalaska, kako je definisano u bilo kom aspektu ili realizaciji ovde opisanim, za upotrebu kao lek.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na humanizovano ili himerno antitelo ili farmaceutska kompozicija pronalaska, kako je definisano u bilo kom aspektu ili realizaciji ovde opisanim, za upotrebu u lečenju bolesti.
Humanizovano ili himerno antitelo ili farmaceutska kompozicija mogu se koristiti u lečenju bilo kog raka, pri čemu su poželjni efektorski mehanizmi citotoksičnih T ćelija. Na primer, humanizovano ili himerno antitelo može se administrirati na ćelije u kulturi, npr. in vitro ili ex vivo, ili humanim subjektima, npr. in vivo, za lečenje ili sprečavanje poremećaja kao što su rak, inflamatorni ili autoimuni poremećaji. Kako se ovde koristi, izraz „subjekat“ je obično čovek koji reaguje na humanizovano ili himerno antitelo ili farmaceutsku kompoziciju. Subjekti mogu, na primer, uključivati humane pacijente koji imaju poremećaje koji se mogu korigovati ili ublažiti moduliranjem ciljne funkcije ili dovođenjem do ubijanja ćelije, direktno ili indirektno.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje ili sprečavanje poremećaja, kao što je rak, pri čemu bi regrutovanje T ćelija doprinelo lečenju ili prevenciji, a postupak obuhvata primenu terapeutski efikasne količine humanizovanog ili himernog antitela, ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska, subjektu kome je to potrebno. Postupak obično uključuje davanje subjektu humanizovanog ili himernog antitela u količini efikasnoj za lečenje ili sprečavanje poremećaja.
U jednom posebnom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak lečenja raka koji obuhvata davanje humanizovanog ili himernog antitela ili farmaceutske kompozicije pronalaska kako je definisano u bilo kom aspektu i realizacijama ovde opisanim, subjektu kome je to potrebno.
U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu ili postupak kako je definisano u bilo kom aspektu ili realizacijama ovde opisanim, pri čemu je humanizovano ili himerno antitelo bispecifično antitelo koje se specifično vezuje i za CD3 i za cilj specifičan za rak, ili za cilj koji je prekomerno eksprimovan kod raka ili povezan sa rakom, kao što su HER2, CD19, EpCAM, EGFR, CD66e (ili CEA, CEACAM5), CD33, EphA2 ili MCSP (ili HMW-MAA) i pri čemu je bolest rak, kao što je rak dojke, rak prostate, nemikrocelularni rak pluća, rak bešike, rak jajnika, rak želuca, kolorektalni rak, rak jednjaka i skvamoznoćelijski karcinom glave i vrata, rak grlića materice, rak pankreasa, rak testisa, maligni melanom, rak mekog tkiva (npr. sinovijalni sarkom), indolentni ili agresivni oblik B-ćelijskog limfoma, hronična limfna leukemija ili akutna limfna leukemija.
Efikasne doze i režimi doziranja humanizovanog ili himernog antitela zavise od bolesti ili stanja koje se leči i mogu ih odrediti stručnjaci u tehnici.
Lekar koji je stručan u tehnici može lako odrediti i propisati efikasnu količinu potrebne farmaceutske kompozicije. Na primer, lekar bi mogao da započne sa dozama humanizovanog ili himernog antitela, koje se koristi u farmaceutskoj kompoziciji na nivoima nižim od onih potrebnih da bi se postigao željeni terapeutski efekat i postepeno povećava dozu dok se ne postigne željeni efekat. Generalno, odgovarajuća doza kompozicije predmetnog pronalaska biće ona količina humanizovanog ili himernog antitela koja je najniža doza efikasna za stvaranje terapeutskog efekta u skladu sa određenim režimom doziranja. Takva efikasna doza će generalno zavisiti od gore opisanih faktora.
Na primer, „efikasna količina“ za terapeutsku upotrebu može se meriti sposobnošću da stabilizuje progresiju bolesti. Sposobnost jedinjenja da inhibira rak može se, na primer, proceniti u sistemu životinjskog modela koji predviđa efikasnost kod humanih tumora. Alternativno, ovo svojstvo kompozicije može se proceniti ispitivanjem sposobnosti humanizovanog ili himernog antitela da inhibira rast ćelija ili da indukuje citotoksičnost putem... in vitro analize poznate stručnjaku. Terapeutski efikasna količina terapeutskog jedinjenja, tj. terapeutskog humanizovanog ili himernog antitela, ili farmaceutske kompozicije prema predmetnom pronalasku, može smanjiti veličinu tumora ili na drugi način ublažiti simptome kod subjekta. Prosečan stručnjak u tehnici bi bio u stanju da odredi takve količine na osnovu faktora kao što su veličina subjekta, težina simptoma subjekta i određeni sastav ili izabrani način primene.
Primeran, neograničavajući raspon za terapeutski efikasnu količinu humanizovanog ili himernog antitela pronalaska je oko 0,001-30 mg/kg, kao što je oko 0,001-20 mg/kg, kao što je oko 0,001-10 mg/kg, kao što je oko 0,001-5 mg/kg, na primer, oko 0,001-2 mg/kg, kao što je oko 0,001-1 mg/kg, na primer, oko 0,001, oko 0,01, oko 0,1, oko 1, oko 5, oko 8, oko 10, oko 12, oko 15, oko 18 mg/kg.
Administriranje može biti, npr. intravensko, intramuskularno, intraperitonealno ili supkutano, i na primer, davanje proksimalno od mesta cilja.
Dozni režimi u gorenavedenim postupcima lečenja i upotrebe se prilagođavaju kako bi se obezbedio optimalan željeni odgovor (npr. terapeutski odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti nekoliko podeljenih doza tokom vremena ili se doza može proporcionalno smanjiti ili povećati kako je naznačeno zahtevima terapeutske situacije.
U jednoj realizaciji, efikasnost lečenja se prati tokom terapije, npr. u unapred određenim vremenskim tačkama.
Po želji, efikasna dnevna doza farmaceutske kompozicije može se primeniti kao dve, tri, četiri, pet, šest ili više poddoza koje se primenjuju odvojeno u odgovarajućim intervalima tokom dana, opciono, u jediničnim doznim oblicima. U drugoj realizaciji, humanizovano ili himerno antitelo, ili farmaceutska kompozicija, primenjuje se sporom kontinuiranom infuzijom tokom dužeg perioda, kao što je duže od 24 sata, kako bi se minimizirali svi neželjeni sporedni efekti.
Iako je moguće da se humanizovano ili himerno antitelo predmetnog pronalaska primenjuje samostalno, poželjno je primenjivati humanizovano ili himerno antitelo kao farmaceutsku kompoziciju, kao što je gore opisano.
Efikasna doza humanizovanog ili himernog antitela pronalaska može se administrirati i u nedeljnom, dvonedeljnom ili tronedeljnom periodu doziranja. Period doziranja može biti ograničen na, npr.8 nedelja, 12 nedelja ili dok se ne uspostavi klinička progresija. Alternativno, efikasna doza humanizovanog ili himernog antitela pronalaska može se administrirati svake druge, treće ili četvrte nedelje.
U jednoj realizaciji, humanizovano ili himerno antitelo može se administrirati infuzijom u nedeljnoj dozi izračunatoj u mg/m<2>. Takve doze mogu, na primer, biti zasnovane na dozama mg/kg datim gore, prema sledećem: doza (mg/kg) x 70: 1,8. Takva administracija može se ponoviti, npr. 1 do 8 puta, kao što je 3 do 5 puta. Davanje se može vršiti kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 2 do 24 sata, kao što je od 2 do 12 sati. U jednoj realizaciji, humanizovano ili himerno antitelo može se administrirati sporom kontinuiranom infuzijom tokom dužeg perioda, kao što je više od 24 sata, kako bi se smanjili toksični neželjeni efekti.
U jednoj realizaciji, humanizovano ili himerno antitelo može se administrirati u nedeljnoj dozi izračunatoj kao fiksna doza do 8 puta, kao što je od 4 do 6 puta kada se daje jednom nedeljno. Takav režim se može ponoviti jednom ili više puta po potrebi, na primer, nakon 6 meseci ili 12 meseci. Takve fiksne doze mogu, na primer, biti zasnovane na dozama mg/kg datim gore, sa procenom telesne težine od 70 kg. Doza se može odrediti ili prilagoditi merenjem količine humanizovanog ili himernog antitela predmetnog pronalaska u krvi nakon primene, na primer, uzimanjem biološkog uzorka i korišćenjem anti-idiotipskih antitela koja ciljaju region vezivanja humanizovanih ili himernih antitela predmetnog pronalaska.
U jednoj realizaciji, humanizovano ili himerno antitelo može se administrirati putem terapije održavanja, kao što je, npr. jednom nedeljno u periodu od 6 meseci ili duže.
Humanizovano ili himerno antitelo se, takođe, može administrirati profilaktički kako bi se smanjio rizik od razvoja raka, odložio početak pojave događaja u progresiji raka i/ili smanjio rizik od ponovne pojave kada je rak u remisiji.
Parenteralne kompozicije mogu biti formulisane u obliku jedinične doze radi lakše primene i ujednačenosti doziranja. Oblik jedinične doze, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinične doze za subjekte koji se leče; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapeutski efekat u kombinaciji sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za oblike jedinične doze predmetnog pronalaska je diktirana i direktno zavisi od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapeutskog efekta koji treba postići, i (b) ograničenja svojstvenih umetnosti pravljenja takvog aktivnog jedinjenja za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.
Humanizovano ili himerno antitelo može se, takođe, administrirati profilaktički kako bi se smanjio rizik od razvoja raka, odložio početak događaja u progresiji raka i/ili smanjio rizik od ponovne pojave kada je rak u remisiji. Ovo može biti posebno korisno kod pacijenata kod kojih je teško locirati tumor za koji se zna da je prisutan zbog drugih bioloških faktora.
Dijagnostičke primene
Humanizovano ili himerno antitelo pronalazaka može se, takođe, koristiti u dijagnostičke svrhe, korišćenjem kompozicije koja sadrži humanizovano ili himerno antitelo kao što je ovde
1
opisano. Shodno tome, pronalazak obezbeđuje dijagnostičke postupke i kompozicije koje koriste humanizovana ili himerna antitela opisana ovde. Takvi postupci i kompozicije mogu se koristiti isključivo u dijagnostičke svrhe, kao što je otkrivanje ili identifikacija bolesti, kao i za praćenje napretka terapijskih tretmana, praćenje progresije bolesti, procenu statusa nakon lečenja, praćenje ponovne pojave bolesti, procenu rizika od razvoja bolesti i slično.
U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak dijagnostikovanja bolesti koju karakteriše zahvaćenost ili akumulacija ćelija koje eksprimuju CD3, a koji obuhvata davanje humanizovanog ili himernog antitela prema pronalasku, kompozicije prema pronalasku ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku subjektu, opciono pri čemu je dato humanizovano ili himerno antitelo obeleženo detektabilnim sredstvom.
U jednom aspektu, humanizovano ili himerno antitelo predmetnog pronalaska se koristi ex vivo, kao što je dijagnostikovanje bolesti u kojoj ćelije koje eksprimuju specifični cilj od interesa i za koga se vezuje humanizovano ili himerno antitelo, ukazuju na bolest ili su uključene u patogenezu, detekcijom nivoa cilja ili nivoa ćelija koje eksprimuju cilj od interesa na svojoj ćelijskoj površini u uzorku uzetom od pacijenta. Ovo se može postići, na primer, kontaktiranjem uzorka koji se testira, opciono zajedno sa kontrolnim uzorkom, sa humanizovanim ili himernim antitelom prema pronalasku pod uslovima koji omogućavaju vezivanje antitela za cilj. Formiranje kompleksa se zatim može detektovati (npr. korišćenjem ELISA testa). Kada se koristi kontrolni uzorak zajedno sa test uzorkom, nivo humanizovanog ili himernog antitela ili kompleksa antitelo-cilj se analizira u oba uzorka i statistički značajno viši nivo humanizovanog ili himernog antitela ili kompleksa antitelo-cilj u test uzorku ukazuje na viši nivo cilja u test uzorku u poređenju sa kontrolnim uzorkom.
Primeri konvencionalnih imunoloških testova u kojima se mogu koristiti humanizovana ili himerna antitela predmetnog pronalaska uključuju, bez ograničenja, ELISA, RIA, FACS testove, testove plazmonske rezonance, hromatografske testove, imunohistohemiju tkiva, Western blot i/ili imunoprecipitaciju.
Shodno tome, u jednoj realizaciji, predmetni pronalazak se odnosi na postupak dijagnostikovanja bolesti koju karakteriše zahvaćenost ili akumulacija ćelija koje eksprimuju CD3, a koji obuhvata davanje antitela, bispecifičnog antitela, kompozicije ili farmaceutske
2
kompozicije prema bilo kom aspektu ili realizaciji ovde opisanim, subjektu, opciono pri čemu je antitelo obeleženo detektabilnom oznakom.
U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na postupak za detekciju prisustva cilja, ili ćelije koja eksprimuje cilj, u uzorku koji obuhvata:
• dovođenje uzorka u kontakt sa humanizovanim ili himernim antitelom pronalazaka pod uslovima koji omogućavaju vezivanje humanizovanog ili himernog antitela za cilj u uzorku; i
• analiziranje da li je formiran kompleks. Obično, uzorak je biološki uzorak.
U jednoj realizaciji, uzorak je uzorak tkiva za koji se zna ili se sumnja da sadrži specifični cilj i/ili ćelije koje eksprimuju metu. Na primer in situ detekcija eksprimovanja cilja može se postići uzimanjem histološkog uzorka od pacijenta i nanošenjem humanizovanog ili himernog antitela predmetnog pronalaska na takav uzorak. Humanizovano ili himerno antitelo može se obezbediti nanošenjem ili preklapanjem humanizovanog ili himernog antitela na uzorak, koji se zatim detektuje korišćenjem odgovarajućih sredstava. Tada je moguće utvrditi ne samo prisustvo cilja ili ćelija koje eksprimuju cilj, već i distribuciju cilja ili ćelija koje eksprimuju cilj u ispitivanom tkivu (npr. u kontekstu procene širenja ćelija raka). Koristeći ovaj pronalazak, stručnjaci će lako shvatiti da se bilo koja od široke palete histoloških metoda (kao što su postupci bojenja) može modifikovati kako bi se postigla takva in situ detekcija.
U gorenavedenim testovima, humanizovano ili himerno antitelo može biti obeleženo detektabilnom supstancom kako bi se omogućilo detektovanje vezanog antitela. Alternativno, vezano (primarno) specifično humanizovano ili himerno antitelo može biti detektovano antitelom koje je obeleženo detektabilnom supstancom i koje se vezuje za primarno specifično humanizovano ili himerno antitelo. Štaviše, u gorenavedenim testovima, može se koristiti dijagnostička kompozicija koji sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema bilo kom aspektu ili realizacijama ovde opisanim. Dakle, u jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na dijagnostičku kompoziciju, koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema bilo kom aspektu ili realizaciji ovde opisanim.
Nivo cilja u uzorku može se proceniti i kompetitivnim imunološkim testom korišćenjem ciljnih standarda obeleženih detektabilnom supstancom i neobeleženim humanizovanim ili himernim antitelom specifičnim za cilj. U ovoj vrsti testa, biološki uzorak, obeleženi ciljni standard(i) i humanizovano ili himerno antitelo specifično za cilj se kombinuju, i određuje se količina obeleženog ciljnog standarda vezanog za neobeleženo humanizovano ili himerno antitelo specifično za cilj. Količina cilja u biološkom uzorku je obrnuto proporcionalna količini obeleženog ciljnog standarda vezanog za humanizovano ili himerno antitelo specifično za cilj.
Pogodne oznake za ciljno specifično humanizovano ili himerno antitelo, sekundarno antitelo i/ili ciljni standard koji se koristi u in vitro dijagnostičkim tehnikama uključuju, bez ograničenja, različite enzime, protetske grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri odgovarajućih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu i acetilholinesterazu; primeri odgovarajućih kompleksa protetskih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri odgovarajućih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid i fikoeritrin; primer luminescentnog materijala uključuje luminol; a primeri odgovarajućeg radioaktivnog materijala uključuju<125>I,<131>I,<35>S, i<3>H.
U jednom aspektu, ciljno specifično humanizovano ili himerno antitelo pronalazaka se koristi u in vivo snimanju tkiva koja eksprimuju cilj, kao što su tumori. Za in vivo postupke, fragmenti antitela kao što su, npr. (Fab')2, Fab i Fab' fragmenti, posebno su povoljni zbog svoje brze kinetike distribucije.
In vivo snimanje se može izvršiti bilo kojom pogodnom tehnikom. Na primer, ciljno specifično humanizovano ili himerno antitelo (npr. antitelo ili fragment) obeleženo sa<99>Tc,<131>I,<111>U ili drugim izotopom koji emituje gama zrake, može se koristiti za snimanje akumulacije ili distribucije antitela specifičnih za cilj u tkivima koja eksprimuju cilj, kao što su tumori, pomoću gama scintilacione kamere (npr. Elscint Apex 409ECT uređaja), obično koristeći kolimator niske energije i visoke rezolucije ili kolimator niske energije za sve namene. Alternativno, obeležavanje sa<89>Zr,<76>Br,<18>F ili drugim radionuklidima koji emituju pozitrone može se koristiti za snimanje distribucije humanizovanih ili himernih antitela specifičnih za cilj, ili fragmenata antitela u tumorima korišćenjem pozitronske emisione tomografije (PET). Slike dobijene upotrebom takvih tehnika mogu se koristiti za procenu biodistribucije cilja kod pacijenta, sisara ili tkiva, na primer, u kontekstu korišćenja cilja kao biomarkera za prisustvo ćelija raka/tumora. Varijacije ove tehnike mogu uključivati upotrebu magnetne rezonance
4
(MRI) radi poboljšanja snimanja u odnosu na tehnike gama kamere. Konvencionalni postupci i principi imunoscintigrafije opisani su, npr. u [79], [80] i [81]. Štaviše, takve slike mogu takođe, ili alternativno, poslužiti kao osnova za hirurške tehnike za uklanjanje tumora. Dalje, takve in vivo tehnike snimanja mogu omogućiti identifikaciju i lokalizaciju tumora u situaciji kada je pacijent identifikovan kao da ima tumor (zbog prisustva drugih biomarkera, metastaza, itd.), ali tumor ne može biti identifikovan tradicionalnim analitičkim tehnikama. Svi ovi postupci su karakteristike predmetnog pronalaska.
The in vivo snimanje i druge dijagnostičke metode koje obezbeđuje predmetni pronalazak su posebno korisne u otkrivanju mikrometastaza kod humanog pacijenta (npr. pacijenta kome prethodno nije dijagnostikovan rak ili pacijenta u periodu oporavka/remisije od raka).
U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje in vivo postupak snimanja u kome je humanizovano ili himerno antitelo specifično za cilj predmetnog pronalaska konjugovano sa radio-neprozirnim sredstvom koje pospešuje detekciju, konjugovano humanizovano ili himerno antitelo se primenjuje na domaćina, kao što je injekcija u krvotok, i testira se prisustvo i lokacija obeleženog humanizovanog ili himernog antitela u domaćinu. Kroz ovu tehniku i bilo koju drugu dijagnostičku metodu koja je ovde data, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za skrining prisustva ćelija povezanih sa bolešću kod humanog pacijenta ili biološkog uzorka uzetog od humanog pacijenta i/ili za procenu distribucije humanizovanog ili himernog antitela specifičnog za cilj pre terapije ADC specifičnog za cilj.
Za dijagnostičko snimanje, radioizotopi mogu biti vezani za ciljno specifično humanizovano ili himerno antitelo direktno ili indirektno korišćenjem posredničke funkcionalne grupe. Korisne posredničke funkcionalne grupe uključuju helatore, kao što su etilendiamintetrasirćetna kiselina i dietilentriaminpentasirćetna kiselina (videti, na primer [82]).
Pored radioizotopa i radio-neprozirnih sredstava, dijagnostičke metode se mogu izvoditi korišćenjem antitela specifičnih za cilj koja su konjugovana sa bojama (kao što je biotinstreptavidin kompleks), kontrastnih sredstava, fluorescentnih jedinjenja ili molekula i sredstava za poboljšanje (npr. paramagnetnih jona) za magnetnu rezonancu (MRI) (videti, npr. [83], koji opisuje MRI tehnike i pripremu antitela konjugovanih sa sredstvom za poboljšanje MRI). Takva dijagnostička/detektorska sredstva mogu biti izabrana iz sredstava za upotrebu u MRI i fluorescentnih jedinjenja. Da bi se humanizovano ili himerno antitelo specifično za cilj opteretilo radioaktivnim metalima ili paramagnetnim jonima, može biti potrebno da se ono reaguje sa reagensom koji ima dugačak rep na koji je vezano mnoštvo helatnih grupa za vezivanje jona. Takav rep može biti polimer kao što je polilizin, polisaharid ili drugi derivatizovani ili derivatizabilni lanac koji ima viseće grupe za koje mogu biti vezane helatne grupe kao što su, npr. porfirini, poliamini, krunski etri, bistiosemikarbazoni, polioksimi i slične grupe za koje se zna da su korisne za ovu svrhu. Helati se mogu spojiti sa humanizovanim ili himernim antitelima specifičnim za cilj korišćenjem standardnih hemijskih postupaka.
Dakle, predmetni pronalazak obezbeđuje dijagnostičko humanizovano ili himerno antitelo specifično za cilj, pri čemu je humanizovano ili himerno antitelo specifično za cilj konjugovano sa kontrastnim sredstvom (kao što je za magnetnu rezonancu, kompjuterizovanu tomografiju ili ultrazvučno sredstvo za poboljšanje kontrasta) ili radionuklidom koji može biti, na primer, gama-, beta-, alfa-, Ožeov elektron- ili pozitron-emitujući izotop.
U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na dijagnostičku kompoziciju koja sadrži antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku.
U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na komplet za detekciju prisustva ciljnog antigena ili ćelije koja eksprimuje cilj, u uzorku, koji sadrži:
• ciljno specifično humanizovano ili himerno antitelo pronalazaka; i
• uputstva za upotrebu kompleta.
Dakle, u jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet za detekciju prisustva CD3 antigena, ili ćelije koja eksprimuje CD3, u uzorku, koji obuhvata sledeće korake:
a) kontaktiranje uzorka sa antitelom ili bispecifičnim antitelom prema pronalasku, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela ili bispecifičnog antitela i CD3; i
b) analizu da li je formiran kompleks.
U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet za dijagnostiku raka koji sadrži kontejner koji sadrži ciljno specifično humanizovano ili himerno antitelo i jedan ili više reagensa za detekciju vezivanja ciljno specifičnog humanizovanog ili himernog antitela za cilj. Reagensi mogu da uključuju, na primer, fluorescentne oznake, enzimske oznake ili druge oznake koje se mogu detektovati. Reagensi, takođe, mogu da uključuju sekundarna ili tercijarna antitela ili reagense za enzimske reakcije, pri čemu enzimsko otkrivanje proizvodi proizvod koji se može vizualizovati. U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje dijagnostički komplet koji sadrži jedno ili više ciljno specifičnih humanizovanih ili himernih antitela predmetnog pronalaska u obeleženom ili neobeleženom obliku u odgovarajućem kontejneru(ima), reagense za inkubacije za indirektni test i supstrate ili derivatizujuća sredstva za detekciju u takvom testu, u zavisnosti od prirode oznake. Takođe mogu biti uključeni kontrolni reagens(i) i uputstva za upotrebu.
Dijagnostički kompleti mogu se, takođe, isporučivati za upotrebu sa humanizovanim ili himernim antitelom specifičnim za cilj, kao što je obeleženo antitelo specifično za cilj, za detekciju prisustva cilja u uzorku tkiva ili domaćinu. U takvim dijagnostičkim kompletima, kao i u kompletima za terapeutsku upotrebu opisanim na drugom mestu ovde, humanizovano ili himerno antitelo specifično za ciljnu ćeliju obično može biti obezbeđeno u liofilizovanom obliku u kontejneru, bilo samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim antitelima specifičnim za ciljnu ćeliju ili peptid. Obično, farmaceutski prihvatljiv nosač (npr. inertni razblaživač) i/ili njegove komponente, kao što su Tris, fosfatni ili karbonatni pufer, stabilizatori, konzervansi, biocidi, inertni proteini, npr. serumski albumin ili slično, takođe su uključeni (obično u posebnom kontejneru za mešanje) i dodatni reagensi (takođe obično u posebnom kontejneru(ima)). U određenim kompletima, uključeno je i sekundarno antitelo sposobno da se veže za humanizovano ili himerno antitelo specifično za cilj, koje je obično prisutno u posebnom kontejneru. Drugo antitelo je obično konjugovano sa oznakom i formulisano na način sličan ciljno-specifičnom humanizovanom ili himernom antitelu predmetnog pronalaska. Korišćenjem postupaka opisanih gore i na drugim mestima ovde, ciljno-specifična humanizovana ili himerna antitela mogu se koristiti za definisanje podskupova ćelija raka/tumora i karakterizaciju takvih ćelija i srodnih tumorskih tkiva.
Antiidiotipska antitela
U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na anti-idiotipsko antitelo koje se vezuje za humanizovano ili himerno antitelo pronalaska kao što je ovde opisano.
Antiidiotipsko (Id) antitelo je antitelo koje prepoznaje jedinstvene determinante generalno povezane sa mestom vezivanja antigena antitela. Anti-Id antitelo može se pripremiti imunizacijom životinje iste vrste i genetskog tipa kao izvor monoklonskog CD3 antitela monoklonskim antitelom na koje se priprema anti-Id. Imunizovana životinja obično može da prepozna i odgovori na idiotipske determinante imunizujućeg antitela proizvodnjom antitela na ove idiotipske determinante (anti-Id antitelo). Takva antitela su opisana, na primer, u US 4,699,880. Takva antitela su dalje karakteristike predmetnog pronalaska.
Anti-Id antitelo se, takođe, može koristiti kao „imunogen“ za indukovanje imunog odgovora kod još jedne životinje, proizvodeći takozvano anti-anti-Id antitelo. Anti-anti-Id antitelo može biti epitopski identično originalnom monoklonskom antitelu, koje je indukovalo anti-Id antitelo. Stoga, korišćenjem antitela na idiotipske determinante monoklonskog antitela, moguće je identifikovati druge klonove koji eksprimuju antitela identične specifičnosti. Anti-Id antitela mogu se menjati (čime se proizvode varijante anti-Id antitela) i/ili derivatizovati bilo kojom pogodnom tehnikom, kao što su one opisane ovde na drugom mestu u vezi sa CD3-specifičnim antitelima. Na primer, monoklonsko anti-Id antitelo može se spojiti sa nosačem kao što je hemocijanin ključaonice prilepka (KLH) i koristiti za imunizaciju BALB/c miševa. Serumi od ovih miševa obično će sadržati anti-anti-Id antitela koja imaju svojstva vezivanja slična, ako ne i identična, originalnom/matičnom CD3 antitelu.
Sekvence
Tabela 1
1
11
12
1
14
CDR regioni su označeni prema IMGT definicijama.
Primeri
Primer 1 - Generisanje humanizovanih CD3 antitela i neaktivirajućih varijanti antitela
Humanizacija CD3 antitela
Humanizacija mišjeg CD3 antitela (US 8,236,308, ovde opisan kao IgG1-CD3) je izvršila kompanija Antitope (Kembridž, Velika Britanija) koristeći svoju poboljšanu verziju tehnologije humanizacije germinativne linije (CDR-kalemljenje) (EP 0 629 240). Korišćenjem ove tehnologije, dizajnirana su 4 različita VH lanca (SEQ ID NOs: 6, 7, 8 i 9) i 3 različita VL lanca (SEQ ID NOs: 10, 11 i 12). Kombinovanjem ova 4 VH sa 3 VL lanca, generisano je 12 različitih antitela. Humanizovane varijante su ovde opisane kao huCD3. Dakle, humanizovane varijante koje sadrže VH i VL prema pronalasku, opisane su kao, npr. IgG1-huCD3-H1L1, što znači da je navedena specifična varijanta IgG1 izotipa, humanizovani je CD3 i sadrži VH sekvencu
1
amino-kiselina nazvanu „H1“ i definisanu prema SEQ ID NO: 6, i VL sekvencu amino-kiselina nazvanu „L1“ i definisanu prema SEQ ID NO: 10. Dakle, H1 se odnosi na varijabilni region teškog lanca VH1, L1 se odnosi na varijabilni region lakog lanca VL1, i tako dalje.
Posebno, varijante IgG1-huCD3-H1L1 (humanizovani CD3 koji sadrži VH1 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:6 i VL1 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:10), IgG1-huCD3-H1L2 (humanizovani CD3 koji sadrži VH1 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:6 i VL2 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:11), IgG1-huCD3-H1L3 (humanizovani CD3 koji sadrži VH1 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:6 i VL3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12), IgG1-huCD3-H3L3 (humanizovani CD3 koji sadrži VH3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:8 i VL3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12), IgG1-huCD3-H4L1 (humanizovani CD3 koji sadrži VH4 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:9 i VL1 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:10), IgG1-huCD3-H3L1 (humanizovani CD3 koji sadrži VH3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:8 i VL1 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:10), IgG1-huCD3-H3L3 (humanizovani CD3 koji sadrži VH3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:8 i VL3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12) i IgG1-huCD3-H4L3 (humanizovani CD3 koji sadrži VH4 sekvencu navedenu u SEQ ID NO:9 i VL3 sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 12) su generisani i testirani u ovde opisanim primerima.
U nekim primerima, antitelo koje sadrži sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca huCLB-T3/4 (SEQ ID NOs: 17 i 18, redom) korišćeno je kao kontrolno antitelo (Labrijn et al., PNAS 2013, 110: 5145‑50) i za verifikaciju različitih kombinacija neaktivirajućih mutacija u Fc regionu (videti primere 8 do 10). huCBL-T3/4 je humanizovana verzija mišjeg CD3 antitela CLB-T3/4 (Parren et al., Res Immunol.1991, 142(9):749‑63). Obe sekvence (SEQ ID NOs:17 i 18) su klonirane u relevantne pcDNA3.3 (Invitrogen) ekspresione vektore i eksprimovane kotransfekcijom u HEK293F ćelijama. Dobijeno kontrolno antitelo je opisano kao IgG1-huCLB-T3/4.
U nekim primerima, antitelo koje sadrži sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca CD20 antitela 7D8 (SEQ ID NO: 29 odgovara VH sekvenci i SEQ ID NO:30 odgovara VL sekvenci) korišćeno je kao pozitivna kontrola. Kada se koristi u kontekstu pozitivne kontrole, naziva se „IgG1-CD20“.
Ova IgG1-CD3 (tj. himerno, roditeljsko CD3 antitelo), IgG1-huCD3 i IgG1-huCLB-T3/4
1
antitela su korišćena u monospecifičnom i bispecifičnom formatu, pri čemu su bispecifična antitela generisana kao što je opisano u daljem tekstu.
HER2 antitelo
U nekim od primera korišćeno je antitelo protiv HER2. VH i VL sekvence za ovo HER2-specifično antitelo (antitelo 169, SEQ ID NOs:19 i 20, redom) su opisane ranije (WO2012/143524 [Genmab]; Labrijn et al., PNAS 2013, 110: 5145-50). Antitelo je korišćeno i u monospecifičnom i u bispecifičnom formatu i nazvano je „IgG1-HER2“.
b12 antitelo
U nekim primerima, antitelo b12, antitelo specifično za gp120 (Barbas, CF. J Mol Biol.1993 Apr 5;230(3):812-23.) je korišćeno kao negativna kontrola i nazvano je „IgG1-b12“.
Eksprimovanje
Antitela su eksprimovana kao IgG1,κ ili IgG1,λ sa ili bez neaktivirajućih mutacija opisanih u daljem tekstu i sa mutacijom u CH3 domenu koja omogućava generisanje bispecifičnih antitela postupkom opisanim u nastavku: IgG1-HER2-K409R, IgG1-b12-K409R, IgG1-CD3-F405L. Smeše plazmidne DNK koje kodiraju i teški i laki lanac antitela su prolazno transfektovane u ćelije Freestyle HEK293F (Invitrogen, SAD) korišćenjem 293fectin-a (Invitrogen, SAD) u suštini onako kako je opisao proizvođač.
Prečišćavanje antitela
Supernatant kulture je filtriran preko filtera sa slepim krajem od 0,2 µm, napunjen na kolone od 5 mL MabSelect SuRe (GE Health Care) i eluiran sa 0,1 M natrijum citrata-NaOH, pH 3. Eluat je odmah neutralisan sa 2M Tris-HCl, pH 9 i dijalizovan preko noći do 12,6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 (B.Braun). Alternativno, nakon prečišćavanja, eluat je napunjen na HiPrep kolonu za desalinaciju i antitelo je zamenjeno u pufer od 12,6 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 (B.Braun). Nakon dijalize ili zamene pufera, uzorci su sterilno filtrirani preko filtera sa slepim krajem od 0,2 µm. Čistoća je određena sa SDS-PAGE, a koncentracija je merena apsorbancijom na 280 nm. Prečišćena antitela su čuvana na 2-8°C.
1
Generisanje bispecifičnih antitela
Bispecifična antitela su generisana in vitro korišćenjem DuoBody<®>platformske tehnologije, tj. razmene Fab-kraka indukovana 2-MEA kao što je opisano u WO 2011/147986 i Labrijn i dr. (Labrijn et al., PNAS 2013, 110: 5145-50; Gramer et al., MAbs 2013, 5: 962-973). Da bi se omogućila proizvodnja bispecifičnih antitela ovim postupkom, generisani su molekuli IgG1 koji nose jednu mutaciju u CH3 domenu: u jednom roditeljskom IgG1 antitelu mutacija F405L (tj. IgG1-CD3 antitelo), u drugom roditeljskom IgG1 antitelu mutacija K409R (tj. HER2 ili b12 antitela). Da bi se generisala bispecifična antitela, ova dva roditeljska antitela, svako antitelo u konačnoj koncentraciji od 0,5 mg/ml, inkubirana su sa 25 ili 75 mM 2-merkaptoetilamin-HCl (2-MEA) u ukupnoj zapremini od 500 µL TE na 31°C tokom 5 sati. Reakcija redukcije je zaustavljena kada je redukciono sredstvo 2-MEA uklonjeno korišćenjem PD-10 kolona (GE-healthcare, proizvod #17-0851-01), uravnoteženih sa 25 mL PBS. Pre odsoljavanja, uzorcima je dodato 2 mL PBS (B.Braun, proizvod #3623140) da bi se zapremina podesila na 2,5 mL. Eluiranje je obavljeno u 3,5 mL PBS. Uzorci su sakupljeni u Amicon Ultra centrifugalnim jedinicama (30 kD MWCO, Millipore, proizvod #UFC803096) i koncentrovani centrifugiranjem 8 minuta na 3000x g. Zapremine su podešene na 500 µL (kada je bilo potrebno) sa PBS i uzorci su sterilno filtrirani preko filtera od 0,2 µm (Millex-GV, proizvod #SLGV004SL). Bispecifični proizvodi su čuvani na 2-8 °C.
Na alternativni način, dajući isto bispecifično antitelo, da bi se generisala bispecifična antitela, 100 µg dva roditeljska antitela je pomešano i inkubirano sa 75 mM 2-merkaptoetilamin-HCl (2-MEA) u ukupnoj zapremini od 400 µL PBS (B.Braun, proizvod #3623140) na 31°C tokom 5 sati. Reakcija redukcije je zaustavljena kada je redukciono sredstvo 2-MEA uklonjeno korišćenjem Amicon Ultra 0.5 ml centrifugalnih jedinica (10 kD MWCO, Millipore, proizvod #UFC501096) i ispiranjem 4x sa 400 µl PBS centrifugiranjem 10 min na 13000x g. Uzorci su sakupljeni u novu epruvetu okretanjem filtera i centrifugiranjem 2 minuta na 1000 g. Zapremine su podešene na 200 µL (kada je bilo potrebno) sa PBS. Apsorbancija od 280 nm (A280) bispecifičnih proizvoda je merena da bi se odredila konačna koncentracija. HPLC katjonska hromatografija sa izmenom (HPLC-CEX) (kao što je opisano u WO 2013/060867) je izvršeno da bi se odredila količina bispecifičnog proizvoda. Uzorci su čuvani na temperaturi od 2-8 °C.
Generisana bispecifična antitela su u nastavku opisana kao „K409R IgG1 osnove (kičme)“ i „F405L IgG1 osnove (kičme)“.
1
Neaktivirajuće mutacije
Nekoliko varijanti antitela je generisano sa jednom ili više supstitucija amino-kiselina u Fc regionu. Neaktivirajući Fc region sprečava interakciju antitela sa Fc-receptorima prisutnim na krvnim ćelijama, kao što su monociti, ili sa C1q radi aktiviranja klasičnog puta komplementa. Smanjenje Fc aktivnosti je testirano kod varijanti antitela koje sadrže različite kombinacije supstitucija amino-kiselina u Fc regionu. Uvedeno je maksimalno pet supstitucija aminokiselina, koje uključuju mutacije N297Q, L234A, L235A, L234F, L235E, D265A i P331S. Supstitucije na jednoj ili više od ovih pet pozicija amino-kiselina su uvedene u K409R i/ili F405L IgG1 osnove (kičme). Generisane su sledeće varijante Fc regiona huCLB-T3/4 antitela: N297Q (odnosi se na N297Q supstituciju, nazvanu IgG1-huCLB-T3/4-N297Q), LFLE (odnosi se na L234F/L235E supstitucije, nazvane IgG1-huCLB-T3/4-LFLE), LALA (odnosi se na L234A/L235A supstitucije, nazvane IgG1-huCLB-T3/4-LALA), LFLENQ (odnosi se na L234F/L235E/N297Q supstitucije, nazvane IgG1-huCLB-T3/4-LFLENQ), LFLEDA (odnosi se na L234F/L235E/D265A supstitucije, nazvane IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA), DA (odnosi se na D265A supstituciju, nazvanu IgG1-huCLB-T3/4-DA), DAPS (odnosi se na D265A/P331S supstitucije, nazvane IgG1-huCLB-T3/4-DAPS), DANQ (odnosi se na D265A/N297Q supstitucije, nazvane IgG1-huCLB-T3/4-DANQ), LFLEPS (odnosi se na L234F/L235E/P331S supstitucije, nazvane IgG1-huCLB-T3/4-LFLEPS) i LFLEDANQPS (odnosi se na L234F/L235E/D265A/N297Q/P331S supstitucije, nazvane IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDANQPS).
Konkretno, kod varijanti IgG1-huCD3 antitela, kombinacija tri amino-kiselinske supstitucije, koja uključuje mutacije L234F, L235E i D265A i naziva se LFLEDA, uvedena je u K409R i F405L IgG1 osnove da bi se generisala antitela sa neaktivirajućim Fc regionom. Dobijena neaktivirajuća varijanta antitela naziva se sufiksom „-LFLEDA“.
Primer 2 - Vezivanje humanizovanih CD3 antitela i njihovih neaktivirajućih varijanti za humane i T ćelijske linije makaki rakojeda (cynomolgous) koje eksprimuju CD3
Vezivanje prečišćenih varijanti humanizovanih CD3 (huCD3) antitela i bispecifičnih (bs)IgG1-huCD3 x HER2 molekula sa ili bez LFLEDA mutacija u Fc regionu (videti Primer 1) za humanu T ćelijsku liniju Jurkat (klon E6-1, ATCC)<®>TIB-152<™>, LGC Standards GmbH, Vesel, Nemačka) ili T ćelijsku liniju makaki rakojeda HSC-F (kat. br. JCRB1164; Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japan) je analizirana FACS analizom. Pored neaktivirajućih
1
mutacija, LFLEDA, varijante antitela su sadržale mutacije F405L ili K409R kao što je opisano u Primeru 1.
Ćelije (1x10<5>ćelija/ležište) su inkubirane u polistirenskim pločama sa okruglim dnom sa 96 ležišta (Greiner bio-one 650101) sa serijskim razblaženjima preparata antitela (raspon od 5 do 10.000 ng/ml u trostrukim razblaženjima) u 100 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida na 4°C tokom 30 minuta.
Nakon dvostrukog ispiranja u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, ćelije su inkubirane u 100 µL sa sekundarnim antitelom na 4°C tokom 30 minuta. Kao sekundarno antitelo, za sve eksperimente je korišćen R-fikoeritrinom (PE)-konjugovani kozji anti-humani IgG F(ab')2 (109-116-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) razblažen 1/100 u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu. Zatim, ćelije su dva puta isprane u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, resuspendovane u 150 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azidu i analizirane na FACS Cantoll-u (BD Biosciences). Krive vezivanja su analizirane korišćenjem nelinearne regresije (sigmoidna dozaodgovor sa promenljivim nagibom) korišćenjem softvera GraphPad Prism V5.04 (GraphPad Software, San Dijego, Kalifornija, SAD).
Slika 1A pokazuje da je vezivanje za Jurkat ćelije IgG1λ-huCD3 varijanti IgG1-huCD3-H1L1 (SEQ ID NOs: 6 i 10, redom), IgG1-huCD3-H1L2 (SEQ ID NOs: 6 i 11, redom), IgG1-huCD3-H1L3 (SEQ ID NOs: 6 i 12, redom), IgG1-huCD3-H3L3 (SEQ ID NOs: 8 i 12, redom) i IgG1-huCD3-H4L1 (SEQ ID NOs: 9 i 10, redom) sa Fc regionom divljeg tipa primećeno za sve varijante, i da je sposobnost vezivanja IgG1-CD3-LFLEDA (roditeljsko CD3 antitelo kao što je opisano u Primeru 1 sa neaktivirajućim LFLEDA mutacijama) i IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA sa neaktivirajućim LFLEDA mutacijama bila slična huCD3 varijantama sa Fc regionima divljeg tipa. Vezivanje IgG1-huCLB-T3/4, uključenog kao pozitivna kontrola, bilo je jako za Jurkat ćelije u poređenju sa IgG1-huCD3 varijantama. Nije primećeno vezivanje za negativno kontrolno antitelo IgG1-b12.
Slika 6A pokazuje da je vezivanje IgG1-CD3-LFLEDA (roditeljsko CD3 antitelo kao što je opisano u Primeru 1 sa neaktivirajućim LFLEDA mutacijama), IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H3L3-LFLEDA, IgG1-3huCD3-H1L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H1L3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H4L1-LFLEDA i IgG1-huCD3-H4L3-LFLEDA sa neaktivirajućim LFLEDA mutacijama za Jurkat ćelije bilo slično sposobnosti vezivanja za huCD3 varijante sa
11
Fc regionima divljeg tipa. Vezivanje IgG1-huCLB-T3/4, uključenog kao pozitivna kontrola, bilo je jače za Jurkat ćelije u poređenju sa IgG1-huCD3 varijantama pri niskim koncentracijama antitela, ali slično pri višim koncentracijama antitela. Generalno, humanizovane CD3 varijante su zadržale sposobnost vezivanja za CD3 kao IgG1-CD3 antitelo. Nije primećeno vezivanje za negativno kontrolno antitelo IgG1-b12.
Slike 1B pokazuje da se bispecifične varijante antitela bsIgG1 CD3 x HER2, bsIgG1 CD3 x b12-LFLEDA i bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, takođe, vezuju za Jurkat ćelije. Maksimalne vrednosti vezivanja za ova bispecifična antitela su veće od maksimalnih vrednosti vezivanja monospecifičnih antitela. Koncentracije EC50 bispecifičnih antitela bile su 6 do 10 puta veće. Ponovo, nije primećeno vezivanje za negativno kontrolno antitelo IgG1-b12.
Slika 6B pokazuje da se bispecifične neaktivirajuće varijante Fc antitela bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA i bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA, takođe, vezuju za Jurkat ćelije. Maksimalne vrednosti vezivanja za ova bispecifična antitela su veće od maksimalnih vrednosti vezivanja monospecifičnih antitela. Koncentracije EC50 bispecifičnih antitela bile su 4 do 10 puta veće. Monovalentno vezivanje omogućava akumulaciju većeg broja antitela na površini ćelije, što dovodi do većih vrednosti vezivanja za bispecifična antitela. Ponovo, nije primećeno vezivanje za negativno kontrolno antitelo IgG1-b12.
Slike 2A pokazuje da je vezivanje varijanti IgG1-huCD3 IgG1-huCD3-H1L1, IgG1-huCD3-H1L2, IgG1-huCD3-H1L3, IgG1-huCD3-H3L3 i IgG1-huCD3-H4L1 sa Fc regionom divljeg tipa i IgG1-CD3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA za T ćelijsku liniju makaki rakojeda HSC-F bilo slično. Nije primećeno vezivanje za kontrolno antitelo huCLB-T3/4, koje ne reaguje unakrsno sa CD3 makaki rakojeda, i za negativno kontrolno antitelo IgG1-b12.
Slika 7A pokazuje da je vezivanje varijanti IgG1-huCD3 IgG1-CD3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H3L3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H1L3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H4L1-LFLEDA i IgG1-huCD3-H4L3-LFLEDA za T ćelijsku liniju makaki rakojeda HSC-F bilo slično. Nije primećeno vezivanje za negativno kontrolno antitelo IgG1-b12.
Slike 2B pokazuje da se bispecifične varijante antitela bsIgG1 CD3 x HER2 i bsIgG1 huCD3-H3L1-LFLEDA, takođe, vezuju za HSC-F ćelije. Maksimalne vrednosti vezivanja za ova bispecifična antitela su veće od maksimalnih vrednosti vezivanja monospecifičnih anti-CD3 varijanti. Koncentracije EC50 bispecifičnih antitela bile su 10 do 12 puta veće od koncentracija monospecifičnih anti-CD3 antitela. Ponovo, nije primećeno vezivanje za negativno kontrolno antitelo IgG1-b12.
Slika 7B pokazuje da se bispecifične neaktivirajuće varijante Fc antitela bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA i bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA takođe vezuju za HSC-F ćelije. Maksimalne vrednosti vezivanja za ova bispecifična antitela su veće od maksimalnih vrednosti vezivanja monospecifičnih anti-CD3 varijanti. Koncentracije EC50 bispecifičnih antitela bile su 3 do 6 puta veće od koncentracija monospecifičnih anti-huCD3 antitela. Ponovo, nije primećeno vezivanje za negativno kontrolno antitelo IgG1-b12.
Primer 3 - Aktivacija T ćelija humanizovanim varijantama CD3 antitela
Ekspresija CD69 je rani marker aktivacije T ćelija. CD3 antitela mogu posredovati u umrežavanju T ćelija i imunih ćelija putem vezivanja CD3 koji eksprimuju T ćelije i Fc receptora koje eksprimuju imune ćelije za Fc region antitela, kao što je IgG1 Fc region. Ovo bi moglo dovesti do aktivacije T ćelija i indukcije CD69. Varijante antitela koje sadrže neaktivirajući Fc region (LFLEDA mutacije) ne vezuju Fc receptore. Stoga se očekivalo da neaktivirajuća CD3 antitela ne indukuju aktivaciju T ćelija i ekspresiju CD69, jer se neaktivirajući Fc region ne vezuje za imune ćelije koje eksprimuju Fc receptor i stoga ne može da umreži T ćelije i imune ćelije.
Ekspresija CD69 na T ćelijama je procenjena FACS analizom kako bi se utvrdila rana aktivacija T ćelija nakon inkubacije sa humanizovanim CD3 (huCD3) varijantama sa i bez LFLEDA mutacija u Fc regionu. Pored neaktivirajućih mutacija, LFLEDA varijante sadrže F405L ili K409R mutacije kao što je opisano u Primeru 1.
PBMC su izolovane iz pune krvi ili leukocitno-trombocitnog sloja (buffy coat) separacijom gradijentom gustine korišćenjem Leucosep epruveta (#227290; Greiner Bio-one, Alphen a/d Rijn, Holandija), isprane sa PBS i resuspendovane u medijumu za kultivaciju.
Serija varijanti huCD3 antitela u zavisnosti od doze, negativna kontrola (IgG1-b12) i pozitivne kontrole (IgE-huCD3 i roditeljski IgG1-CD3) pripremljene su u medijumu za kultivaciju (u rasponu od 0,1 do 1.000 ng/ml u 10-strukim razblaženjima) i dodate u ležišta ploče sa okruglim dnom od 96 ležišta koja sadrži humane ili PBMC makaki rakojeda. Nakon 16-24 sata inkubacije, ćelije su peletirane centrifugiranjem, a supernatant (koji sadrži citokine) je sakupljen i čuvan na -20°C. Ćelije su zatim isprane sa PBS/0,1% BSA/0,02% azida i obojene 30 minuta na 4°C sa mišjim anti-humanim CD28-PE (854.222.010; Sanquin, Amsterdam, Holandija; T ćelijski marker) i mišjim anti-humanim CD69-APC antitelom (340560; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), koja su unakrsno reaktivna sa CD28 i CD69 makaki rakojeda, redom. Nevezana antitela su uklonjena ispiranjem dva puta sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom. Ćelije su resuspendovane u 150 µL/baneru, a ekspresija CD69 na CD28 pozitivnim ćelijama je merena na FACS Canto II (BD Biosciences).
Slika 3 pokazuje da su IgG1-CD3 (kao što je opisano u Primeru 1) i humanizovane IgG1-huCD3 varijante sa Fc regionom divljeg tipa IgG1 indukovale slične nivoe eksprimovanja CD69 na T ćelijama iz humanog (Slika 3A) i makaki rakojed (Slika 3B) porekla. Neaktivirajuće (LFLEDA) IgG1-CD3-LFLEDA i IgG1-huCD3-H3L1 varijante su indukovale niske nivoe eksprimovanja CD69 u humanim T ćelijama. Neaktivirajuće IgG1-huCD3 varijante nisu indukovale ekspresiju CD69 u T ćelijama makaki rakojeda. Kontrolno antitelo IgG1-b12, takođe, nije indukovalo ekspresiju CD69 u humanim ili T ćelijama makaki rakojeda.
Slika 8 pokazuje da su neaktivirajuće (LFLEDA) varijante IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H3L3-LFLEDA, IgG1-3huCD3-H1L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H1L3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H4L1-LFLEDA i IgG1-huCD3-H4L3-LFLEDA indukovale niske nivoe eksprimovanja CD69 u humanim T ćelijama. Slike 8A i 8B pokazuju indukciju eksprimovanja CD69 na T ćelijama kod makaki rakojed majmuna. Manja aktivacija neaktivirajućim varijantama koja je primećena može biti posledica umrežavanja CD3 molekula putem dvovalentnog vezivanja CD3 antitela. Takvo objašnjenje je potkrepljeno zapažanjem da je aktivacija smanjena pri najvišoj koncentraciji pri čemu je vezivanje antitela monovalentno. Kontrolno antitelo IgG1-b12, takođe, nije indukovalo ekspresiju CD69 u humanim ili makaki rakojed T ćelijama.
11
Slike 8C i 8D pokazuju da neaktivirajuće varijante bispecifičnih antitela bsIgG1-huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA i bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA ne indukuju ekspresiju CD69 u T ćelijama od ljudi (Slika 8C) ili makaki rakojed majmuna (Slika 8D). Međutim, pri višim koncentracijama antitela primećena je izvesna indukcija eksprimovanja CD69.
Primer 4 - Proliferacija T ćelija indukovana humanizovanim varijantama CD3 antitela.
Efekat varijanti humanizovanih CD3 (huCD3) antitela (opisanih u Primeru 1) na proliferaciju humanih i makaki rakojed T ćelija procenjen je pomoću ELISA kompleta za ćelijsku proliferaciju Roche Applied Science-a (Cell Proliferation ELISA, BrdU komplet, #11647229001; Roche Applied Science, Manhajm, Nemačka), što je sprovedeno prema uputstvima proizvođača.
Humane ili PBMC makaki rakojeda, izolovane iz pune krvi ili leukocitno-trombocitnog sloja, inkubirane su u pločama za kultivaciju sa 96 ležišta sa serijama razblaženja (u rasponu od 0,1 do 1.000 ng/ml u 10-strukim razblaženjima) varijanti IgG1 huCD3 antitela. IgE-CD3 i IgG1-huCLB-T3/4 su uključeni kao pozitivne kontrole, a IgG1-b12 kao negativna kontrola. Nakon 3 dana inkubacije sa antitelima, BrdU (Roche Applied Science, Manhajm, Nemačka) je dodat u medijum i ploče su inkubirane 5 sati. Ćelije su zatim peletirane centrifugiranjem, a supernatant je sakupljen i čuvan na -20°C. Ploče su osušene i čuvane na 4°C dok nije izvršen ELISA test.
Ugradnja BrdU u DNK je određena ELISA metodom prema uputstvima proizvođača (Roche Applied Science). Ćelije su fiksirane na ploče, nakon čega su ploče inkubirane 90 minuta na sobnoj temperaturi sa anti-BrdU antitelom konjugovanim sa peroksidazom. Ploče su isprane sa PBST, a vezivanje je detektovano korišćenjem ABTS pufera (umesto TMB rastvora koji je priložen uz komplet). Razvoj boje je zaustavljen nakon 30 minuta dodavanjem 2% oksalne kiseline u ležišta. OD405 nm je zatim merena na EL808 ELISA-čitaču.
Slika 4 pokazuje da inkubacija PBMC sa parentalnim IgG1-CD3 i humanizovanim IgG1-huCD3 varijantama sa Fc regionom divljeg tipa IgG1 indukuje jaku proliferaciju humanih (Slika 4A) i makaki rakojed (Slika 4B) T ćelija, čak i pri veoma niskim koncentracijama antitela. Inkubacija sa neaktivirajućim LFLEDA varijantama IgG1-huCD3 antitela nije izazvala proliferaciju humanih T ćelija (Slike 4A i 9A) ili T ćelija makaki rakojeda (Slike 4B i 9B). Dakle, iako su neaktivirajuće varijante IgG1-huCD3 antitela indukovale niske nivoe eksprimovanja CD69 u humanim T ćelijama (kao što je prikazano u Primeru 3), ove neaktivirajuće IgG1-huCD3 varijante nisu izazvale proliferaciju humanih T ćelija.
Slike 9C i 9D pokazuju da neaktivirajuće varijante bispecifičnih antitela bsIgG1-huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA i bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA ne indukuju proliferaciju T ćelija izolovanih od ljudi (Slika 9C) ili makaki rakojed majmuna (Slika 9D).
Primer 5 - In vitro citotoksičnost posredovana T ćelijama izazvana humanizovanim varijantama CD3 antitela
Citotoksičnost T ćelija specifična za tumor može biti posredovana bispecifičnim antitelima koja se jednim krakom vezuju za CD3, a drugim krakom za cilj specifičan za tumor, kao što je HER2. Istovremeno vezivanje bispecifičnih antitela i za T ćelije i za tumorske ćelije dovešće do aktivacije T ćelija i citotoksičnosti specifične za tumorske ćelije. U ovom primeru, citotoksičnost posredovana T ćelijama protiv HER2-pozitivnih tumorskih ćelija procenjena je korišćenjem bispecifičnih antitela protiv CD3 (humanizovane varijante) i HER2.
Stoga su ćelije AU565 (ćelije karcinoma dojke kod ljudi) kultivisane u RPMI 1640 medijumu dopunjenom sa 10% (vol/vol) toplotno inaktiviranog CCS-a, 1,5 g/l natrijum bikarbonata (Lonza), 1 mM natrijum piruvata, 4,5 g/l glukoze (Sigma), 50 IU/ml penicilina i 50 µg/ml streptomicina. Ćelijska linija je održavana na 37°C u 5% (vol/vol) CO2vlažnom inkubatoru. Ćelije AU565 su kultivisane do skoro konfluentnosti, nakon čega su ćelije tripsinizirane, resuspendovane u medijumu za kultivaciju i propuštene kroz cediljku za ćelije da bi se dobila suspenzija jedne ćelije.5x10<4>ćelija je posejano u svako ležište ploče za kultivaciju sa 96 ležišta, a ćelije su inkubirane najmanje 3 sata na 37°C, 5% CO2kako bi se omogućilo prijanjanje na ploču.
Humane ili makaki rakojed PBMC su izolovane iz pune krvi ili leukocitno-trombocitnog sloja. Izolovane PBMC su isprane sa PBS, resuspendovane u medijumu za kultivaciju i dodate u
11
odnosu 1:1 tumorskim ćelijama AU565 u pločama sa 96 ležišta. Procenat T ćelija prisutnih u PBMC je meren FACS-analizom, koristeći mišje anti-humano CD3-PerCP (BD, #345766) antitelo (za bojenje T ćelija), koje je unakrsno reaktivno sa makaki rakojed CD3. Sadržaj T ćelija u populaciji korišćenih PBMC je obično bio 50 do 60%.
Serije razblaženja (konačne koncentracije u rasponu od 0,001 do 10.000 ng/ml) bispecifičnih varijanti antitela bsIgG1 CD3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1 CD3 x b12-LFLEDA, bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA i bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA su pripremljene u medijumu za kultivaciju i dodate na ploče. IgG1-HER2-LFLEDA i IgG1-b12 su uključeni kao kontrole. Pored neaktivirajućih mutacija, varijante LFLEDA antitela sadrže F405L ili K409R mutacije za pripremu u bispecifičnom formatu (videti Primer 1). Ploče su inkubirane 3 dana na 37°C, 5% CO2. Inkubacija ćelija sa 1 µM staurosporina (#S6942-200, Sigma) korišćena je kao referenca za 100% uništavanje tumorskih ćelija. Ploče su isprane dva puta sa PBS, i u svako ležište je dodato 150 µL podloge za kultivaciju koja sadrži 10% Alamar plave. Ploče su inkubirane 4 sata na 37°C, 5% CO2. Apsorbancija na 590 nm je merena (Envision, Perkin Elmer, Waltham, MA).
Bispecifične varijante antitela CD3xHER2-LFLEDA (bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2-LFLEDA i bsIgG1-CD3xHER2-LFLEDA) su izazvale ubijanje ćelija AU565 pri niskim koncentracijama korišćenjem humanih efektorskih ćelija (Slika 5A) ili efektorskih ćelija makaki rakojeda (Slika 5B). Bispecifično kontrolno antitelo CD3 huCLB-T3/4xHER2-LFLEDA, koje ne pokazuje unakrsnu reaktivnost sa CD3 kod makaki rakojeda, indukovalo je ubijanje ćelija AU565 samo kada su korišćene humane PBMC. (Slika 5A). Dakle, nije primećeno ubijanje ciljnih ćelija kada su efektorske ćelije makaki rakojeda korišćene u testu. (Slika 5B). Inkubacija sa monospecifičnim IGG1-b12 ili IgG1-HER2-LFLEDA ili bsIgG1-CD3xb12-LFLEDA antitelima nije izazvala nespecifično ubijanje ciljnih ćelija.
Bispecifične varijante antitela bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA i bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA izazvale su ubijanje ćelija AU565 pri niskim koncentracijama korišćenjem humanih efektorskih ćelija. (Slika 10A) ili efektorskih ćelija
11
makaki rakojeda (Slika 10B). Inkubacija sa monospecifičnim IgG1-b12 ili IgG1-HER2-LFLEDA antitelima nije izazvala nespecifično ubijanje ciljnih ćelija (Slika 10A i B). Dakle, humanizovane CD3 varijante koje sadrže neaktivirajući Fc region ne indukuju nespecifično ubijanje ciljnih ćelija, što ukazuje da se varijante koje sadrže neaktivirajući Fc region mogu koristiti za osiguravanje ciljane aktivacije T ćelija i time izbegavanje neciljane aktivacije T ćelija.
Primer 6 - Aktivacija rezus T ćelija humanizovanim varijantama CD3 antitela
Ekspresija CD69 na rezus T ćelijama je procenjena da bi se utvrdila rana aktivacija T ćelija nakon inkubacije sa varijantama humanizovanih CD3 (huCD3) antitela sa Fc regionom divljeg tipa IgG1. Izolacija rezus PBMC i procena eksprimovanja CD69 protočnom citometrijom je izvršena kao što je opisano u Primeru 3.
Slika 11 pokazuje da su humanizovane varijante CD3 antitela IgG1-huCD3-H1L1, IgG1-huCD3-H1L2, IgG1-huCD3-H1L3, IgG1-huCD3-H3L3 i IgG1-huCD3-H4L1 indukovale ekspresiju CD69 na T ćelijama rezus porekla do sličnih nivoa kao IgG1-CD3 (kao što je opisano u Primeru 1). Antitelo negativne kontrole IgG1-b12 nije indukovalo ekspresiju CD69 u rezus T ćelijama. Stoga, varijante huCD3 prema predmetnom pronalasku mogu se koristiti u eksperimentima koji uključuju CD3 rezus majmuna. Varijante huCD3 su unakrsno reaktivne sa CD3 rezus majmuna.
Primer 7 - Aktivacija T ćelija neaktivirajućim varijantama huCLB-T3/4
Ekspresija CD69 na T ćelijama je procenjena FACS analizom kako bi se utvrdila rana aktivacija T ćelija nakon inkubacije sa varijantama IgG1-huCLB-T3/4 sa mutacijama u Fc regionu (videti Primer 1).
PBMC su izolovane iz pune krvi ili leukocitno-trombocitnog sloja separacijom gradijentom gustine korišćenjem Leucosep epruveta (#227290; Greiner Bio-one, Alphen a/d Rijn, Holandija), isprane sa PBS i resuspendovane u medijumu za kultivaciju.
Serija odgovora na dozu varijanti IgG1-huCLB-T3/4, negativna kontrola (IgG1-huCLB-T3/4-Fab) i pozitivna kontrola (IgE-huCLB-T3/4) su pripremljene u medijumu za kultivaciju (u rasponu od 1 do 1000 ng/ml u trostrukim razblaženjima) i dodate u ležišta ploče sa okruglim
11
dnom od 96 ležišta koja sadrži PBMC. Nakon 16-24 sata inkubacije, ćelije su peletirane centrifugiranjem, a supernatant (koji sadrži citokine) je sakupljen i čuvan na -20°C. Ćelije su zatim isprane sa PBS/0,1% BSA/0,02% azida i obojene 30 minuta na 4°C sa mišjim antihumanim CD28-PE (854.222.010; Sanquin, Amsterdam, Holandija; T ćelijski marker) i mišjim anti-humanim CD69-APC antitelom (340560; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Nevezana antitela su uklonjena ispiranjem dva puta sa PBS/0,1% BSA/0,02% azidom. Ćelije su resuspendovane u 150 µL/baneru, a ekspresija CD69 na CD28 pozitivnim ćelijama je merena na FACS Canto II (BD Biosciences).
Slika 12A pokazuje da je ekspresija CD69 bila visoka na ćelijama koje su inkubirane sa IgE-huCLB-T3/4, IgG1-huCLB-T3/4, IgG1-huCLB-T3/4-DA i IgG1-huCLB-T3/4-DAPS. Inkubacija sa IgG1-huCLB-T3/4-N297Q indukovala je nešto niže nivoe eksprimovanja CD69 u poređenju sa divljim tipom IgG1-huCLB-T3/4, a inkubacija sa IgG1-huCLB-T3/4-LFLE i IgG1-huCLB-T3/4-LFLEPS indukovala je CD69 u manjoj meri. Inkubacija PBMC sa IgG1-CD3 Fab, IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA, IgG1-huCLB-T3/4-LFLENQ, IgG1-huCLB-T3/4-DANQ i IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDANQPS antitelima nije izazvala nikakvu ekspresiju CD69 na T ćelijama.
Slika 12B pokazuje da je ekspresija CD69 bila visoka na ćelijama koje su inkubirane sa IgE-huCLB-T3/4 i IgG1-huCLB-T3/4. Inkubacija sa IgG1-huCLB-T3/4-LALA izazvala je nešto niže nivoe eksprimovanja CD69 u poređenju sa divljim tipom IgG1-huCLB-T3/4, a inkubacija sa IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA i IgG1-b12 (negativna kontrola) nije izazvala nikakvu ekspresiju CD69 na T ćelijama.
Primer 8 - Proliferacija T ćelija neaktivirajućim varijantama huCLB-T3/4
Efekat varijanti huCLB-T3/4 (opisanih u Primeru 1) na proliferaciju T ćelija procenjen je pomoću ELISA kompleta za ćelijsku proliferaciju kompanije Roche Applied Science (Cell Proliferation ELISA, BrdU kit, #11647229001; Roche Applied Science, Manhajm, Nemačka), što je sprovedeno prema uputstvima proizvođača.
PBMC, izolovane iz pune krvi ili leukocitno-trombocitnog sloja, inkubirane su u pločama za kultivaciju sa 96 ležišta sa serijama razblaženja (u rasponu od 0,1 do 1000 ng/ml) IgG1-CD3 varijanti. IgE-CD3 i IgG1-CD3 su uključeni kao pozitivne kontrole, a IgG1-b12 (sa K409R
11
mutacijom za generisanje bispecifičnih antitela) kao negativna kontrola. Nakon 3 dana inkubacije sa antitelima, BrdU (Roche Applied Science, Manhajm, Nemačka) je dodat u medijum i ploče su inkubirane 5 sati. Ćelije su zatim peletirane centrifugiranjem, a supernatant je sakupljen i čuvan na -20°C. Ploče su osušene i čuvane na 4°C dok nije izvršen ELISA test.
Ugradnja BrdU u DNK je određena ELISA metodom prema uputstvima proizvođača (Cell Proliferation ELISA, BrdU kit, #11647229001; Roche Applied Science). Ćelije su fiksirane na ploče, nakon čega su ploče inkubirane 90 minuta na sobnoj temperaturi (RT) sa anti-BrdU antitelom konjugovanim sa peroksidazom. Ploče su isprane sa PBST-om, a vezivanje je detektovano korišćenjem ABTS pufera (umesto TMB rastvora koji je priložen uz komplet). Razvoj boje je zaustavljen nakon 30 minuta dodavanjem 2% oksalne kiseline u ležišta. OD405 nm je zatim izmerena na EL808 ELISA-čitaču.
Slika 13A pokazuje da inkubacija PBMC sa IgG1-huCLB-T3/4, IgG1-huCLB-T3/4-DA i IgG1-huCLB-T3/4-DAPS indukuje jaku proliferaciju T ćelija, čak i pri veoma niskim koncentracijama antitela. Inkubacija sa IgG1-huCLB-T3/4-N297Q indukuje proliferaciju zavisnu od doze, koja je bila uporediva sa pozitivnom kontrolom IgE-huCLB-T3/4. Inkubacija PBMC sa antitelima IgG1-huCLB-T3/4-Fab, IgG1-b12-N297Q, IgG1-huCLB-T3/4-LFLE, IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA, IgG1-huCLB-T3/4-LFLENQ, IgG1-huCLB-T3/4-LFLEPS, IgG1-huCLB-T3/4-DANQ i IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDANQPS nije izazvala proliferaciju T ćelija.
Slika 13B pokazuje da inkubacija PBMC sa IgG1-huCLB-T3/4 indukuje jaku proliferaciju T ćelija, čak i pri veoma niskim koncentracijama antitela. Inkubacija sa IgE-huCLB-T3/4 (pozitivna kontrola) i IgG1-huCLB-T3/4-LALA indukuje proliferaciju zavisnu od doze. Inkubacija PBMC sa IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA nije indukovala proliferaciju T ćelija.
Na osnovu rezultata iz primera 7 i 8, podskup mutanata koji su smatrani najmanje aktivirajućim, podvrgnut je daljoj analizi.
Primer 9 - In vitro citotoksičnost posredovana T ćelijama izazvana neaktivirajućim varijantama antitela huCLB-T3/4
11
Ćelije AU565 (humani karcinom dojke) su kultivisane u RPMI 1640 medijumu dopunjenom sa 10% (vol/vol) toplotno inaktiviranog CCS, 1,5 g/l natrijum bikarbonata (Lonza), 1 mM natrijum piruvata, 4,5 g/l glukoze (Sigma), 50 IU/ml penicilina i 50 µg/ml streptomicina. Ćelijska linija je održavana na 37°C u 5% (vol/vol) CO2vlažnom inkubatoru. AU565 ćelije su kultivisane skoro do konfluencije. Ćelije su tripsinizirane, resuspendovane u medijumu za kultivaciju i propuštene kroz cediljku za ćelije da bi se dobila suspenzija jedne ćelije. 5x10<4>ćelije su posejane u svako ležište ploče za kultivaciju sa 96 ležišta, a ćelije su inkubirane najmanje 3 sata na 37°C, 5% CO2kako bi se omogućilo prijanjanje na ploču.
Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz krvi zdravih dobrovoljaca korišćenjem Leucosep epruveta od 30 mL, prema protokolu proizvođača (Greiner Bio-one). Izolovane PBMC su isprane sa PBS, resuspendovane u medijumu za kultivaciju i dodate u odnosu 1:1 tumorskim ćelijama AU565 u pločama sa 96 ležišta. Procenat T ćelija prisutnih u PBMC je meren FACS-analizom, korišćenjem mišjeg anti-humanog CD3-PerCP (BD, #345766) antitela (za bojenje T ćelija). Sadržaj T ćelija u populaciji korišćenih PBMC je obično bio 50 do 60%.
Serije razblaženja (konačne koncentracije u rasponu od 0,004 do 1000 ng/ml) IgG1-b12, IgG1-huCLB-T3/4, IgG1-HER2 i bispecifičnih huCLB-T3/4xb12 i huCLB-T3/4xHER2 antitela eksprimiranih kao različite Fc-varijante, divlji tip, N297Q, LFLE, LALA, LFLENQ, LFLEDA, DANQ i LFLEDENQPS, pripremljene su u medijumu za kultivaciju i dodate na ploče. Ploče su inkubirane 3 dana na 37°C, 5% CO2. Inkubacija ćelija sa 1 µM staurosporina (#S6942-200, Sigma) korišćena je kao referenca za 100% uništavanje tumorskih ćelija. Nakon inkubacije, supernatanti su uklonjeni i čuvani na -20°C. Ploče su dva puta isprane sa PBS, a u svako ležište je dodato 150 µL podloge za kultivaciju koja sadrži 10% Alamar plavog. Ploče su inkubirane 4 sata na 37°C, 5% CO2. Apsorbancija na 590 nm je merena (Envision, Perkin Elmer, Waltham, MA).
Dva eksperimenta su sprovedena korišćenjem PBMC ćelija od različitih donora. U prvom eksperimentu testirane su Fc-varijante N297Q, LFLE, LFLENQ, LFLEDA, DANQ i LFLEDANQPS. (Slika 14A-G). U drugom eksperimentu testirane su Fc-varijante LFLEDA i LALA (Slika 15A-C). Antitela sa Fc-domenima divljeg tipa su uključena u oba eksperimenta kao referenca. Inkubacija sa monospecifičnim IgG1-huCLB-T3/4 ili bispecifičnim huCLB-T3/4xb12 antitelima divljeg tipa izazvala je nespecifično ubijanje ciljnih ćelija. (Slike 14A-
12
G i 15A-C). Monospecifične varijante IgG1-huCLB-T3/4 i bsIgG1-huCLB-T3/4xb12 N297Q ( Slika 14A-G) i LALA (Slika 15A-C) i dalje su izazvali nespecifično ubijanje ciljnih ćelija, mada u manjoj meri nego antitelo divljeg tipa testirano u istom eksperimentu. Nespecifično ubijanje ciljnih ćelija nije izazvano nijednim od drugih testiranih IgG1-huCLB-T3/4 ili bsIgG1-huCLB-T3/4xb12 antitela sa neaktivirajućim mutacijama. (Slike 14A-G i 15A-C).
Sva bispecifična huCLB-T3/4xHER2 antitela su indukovala ubijanje ćelija AU565 zavisno od doze sa najmanje uporedivom efikasnošću u poređenju sa divljim tipom bispecifičnog huCLB-T3/4xHER2 antitela bez neaktivirajućih mutacija. (Slike 14A-G i 15A-C). Maksimalno ubijanje se dogodilo pri veoma niskim koncentracijama.
Divlji tip ili neaktivirajuće varijante monospecifičnih b12 ili HER2 antitela nisu izazvali citotoksičnost. (Slike 14A-G i 15A-C), što je bilo kako se i očekivalo.
Primer 10 - Evaluacija vezivanja C1q za neaktivirajuće varijante antitela huCLB-T3/4
Interakcija C1q sa antitelima vezanim za ciljnu ćeliju je prvi korak u klasičnom putu aktivacije komplementa. Pošto divlji tip IgG1 sadrži mesto interakcije za C1q, procenjena je interakcija C1q sa ovim neaktivirajućim varijantama IgG1 pomoću ELISA testa.
Serije razblaženja (raspon 7-30.000 ng/ml u 4-strukim razblaženjima) IgG1-huCLB-T3/4, bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2 i IgG1-CD20 (pozitivna kontrola) i neaktivirajuće varijante antitela kao što je gore opisano u Primeru 1, nanesene su na Microlon ELISA ploče sa 96 ležišta (Greiner, Nemačka) preko noći na 4°C. Ploče su isprane i blokirane PBS dopunjenim sa 0,025% Tween 20 i 0,1% želatina. Sa ispiranjem između inkubacija, ploče su sekvencijalno inkubirane sa 3% objedinjenog humanog seruma (Sanquin, proizvod br. M0008) tokom 1 sata na 37°C, sa 100 µL/ležištu zečjeg anti-humanog antitela C1q (DAKO, proizvod br. A0136, 1/4,000) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, i sa 100 µL/ležište svinjskog antitela protiv zečjeg IgG-HRP (DAKO, P0399, 1:10,000) kao antitela za detekciju tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Detekcija je izvršena dodavanjem 1 mg/mL 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonske kiseline) (ABTS; Roche, Manhajm, Nemačka) tokom oko 30 minuta. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µL 2% oksalne kiseline. Apsorbancija je merena na 405 nm u čitaču mikroploča (Biotek, Winooski, VT). Log transformisani podaci analizirani su uklapanjem sigmoidnih krivih doza-odgovor sa promenljivim nagibom korišćenjem softvera GraphPad Prism.
Slika 16A pokazuje da su antitela sa Fc regionima divljeg tipa IgG1, IgG1-CD20 i IgG1-huCLB-T3/4 pokazala vezivanje za C1q. Nije detektovano vezivanje za C1q ni na jednoj od procenjenih varijanti antitela sa neaktivirajućim mutacijama (N297Q, LFLE, LFLENQ, LFLEDA, DA, DAPS, DANQ, LFLEPS, LFLEDANQPS, LALA).
Slika 16B pokazuje da je antitelo sa divljim tipom IgG1 Fc rejgona bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2 pokazalo vezivanje za C1q. Nije detektovano vezivanje za C1q ni na jednoj od procenjenih varijanti antitela sa neaktivirajućim mutacijama (N297Q, LFLE, LFLENQ, LFLEDA, DA, DAPS, DANQ, LFLEPS, LFLEDANQPS, LALA).
Slika 16C i Slika 16D pokazuju da su antitela sa Fc regionima divljeg tipa IgG1, IgG1-CD20, IgG1-huCLB-T3/4 i bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2 pokazala vezivanje za C1q. Nije detektovano vezivanje za C1q na varijantama antitela sa neaktivirajućim mutacijama (LFLEDA i LALA).
Primer 11 - Farmakokinetička (FK) analiza neaktivirajućih varijanti antitela
Miševi u ovoj studiji su smešteni u barijernu jedinicu Centralnog laboratorijskog objekta za životinje (Utreht, Holandija) i držani su u kavezima sa filterskim vrhom, sa vodom i hranom koje su im davane ad libitum. Sve eksperimente je odobrio etički komitet za životinje Univerziteta u Utrehtu. Miševima C.B-17 SCID starosti 7-10 nedelja (C.B‑17/Icr-Prkdc<Scid>/IcrIcoCrl, Charles-River) intravenozno je ubrizgano 100 µg antitela divljeg tipa (IgG1-huCLB-T3/4, IgG1-HER2 ili bsIgG-huCLB-T3/4xHER2) ili njihovih neaktivirajućih varijanti (LALA, LFLEDA, LFLENQ, DANQ ili LFLEDANQPS) koristeći 3 miša po grupi. Uzorci krvi od 50 µL su prikupljeni iz vene safene nakon 10 minuta, 4 sata, 1 dana, 2 dana, 7 dana, 14 dana i 21 dana nakon primene antitela. Krv je sakupljena u bočice koje sadrže heparin i centrifugirana 5 minuta na 10.000 x g. Plazma je čuvana na -20°C do određivanja koncentracije antitela.
Koncentracije humanog IgG su određene korišćenjem ukupnog hIgG sendvič ELISA testa. Za ovaj test, mišji mAb anti-humani IgG-kapa klon MH16 (#M1268, CLB Sanquin, Holandija), presvučen na Microlon ELISA ploče sa 96-ležišta (Greiner, Nemačka) u koncentraciji od 2 µg/mL je korišćen kao antitelo za hvatanje. Nakon blokiranja ploča sa PBS dopunjenim sa 0,2% goveđeg serumskog albumina, dodati su uzorci, serijski razblaženi ELISA puferom (PBS dopunjen sa 0,05% Tween 20 i 0,2% goveđeg serumskog albumina) i inkubirani na mućkalici za ploče tokom 1 sata na sobnoj temperaturi (RT). Ploče su potom inkubirane sa kozjim antihumanim IgG imunoglobulinom (#109-035-098, Jackson, West Grace, PA) i razvijene sa 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonskom kiselinom) (ABTS; Roche, Mannheim, Nemačka). Reakcija je zaustavljena posle 30 minuta dodavanjem 2% oksalne kiseline u ležišta. Apsorbancija je merena u čitaču mikroploča (Biotek, Winooski, VT) na 405 nm.
Brzine klirensa plazme (ml/dan/kg) su izračunate na osnovu površine ispod krive (AUC), prema sledećoj jednačini:
Analiza podataka je izvršena korišćenjem softvera Graphpad prism.
Slika 17A pokazuje da su koncentracije humanog IgG u plazmi bile niže za varijante antitela N297Q, DANQ, LFLENQ i LFLEDANQPS u poređenju sa antitelima divljeg tipa, što ukazuje na brži klirens. Koncentracije humanog IgG u plazmi za varijante antitela LFLEDA i LALA bile su slične onima kod antitela divljeg tipa.
Slika 17B pokazuje da su stope klirensa iz plazme varijanti antitela N297Q, DANQ i LFLENQ bile 2 do 3 puta veće od stope klirensa antitela divljeg tipa. Stopa klirensa varijante antitela LFLEDANQPS bila je 3-5 puta veća od stope klirensa antitela divljeg tipa. Stope klirensa iz plazme varijanti antitela LFLEDA i LALA bile su slične onima kod antitela divljeg tipa.
Primer 12 - In vitro procena imunogenosti IgG1-LFLEDA skeleta
Da bi se utvrdio potencijal za kliničku imunogenost IgG1-LFLEDA-K409R osnovne linije, Antitopov EpiScreen<™>Platforma je primenjena na IgG1-HER2-LFLEDA. Ukratko, PBMC su izolovane iz kohorte od 50 zdravih donora sa HLA tipom koji predstavljaju evropsku i severnoameričku populaciju. Nakon deplecije CD8+ T ćelija, preparati PBMC su pojedinačno zamrznuti i čuvani. Odmrznute PBMC su potom kultivisane i inkubirane sa IgG1-HER2-LFLEDA-K409R ili jednim od kontrolnih uzoraka (IgG1-HER2 ili IgG1-HER2-LFLE-K409R) tokom 5 do 8 dana. Sposobnost uzoraka da indukuju odgovore CD4+ T ćelija procenjena je
12
merenjem ćelijske proliferacije ([3]<H>]-inkorporacija timidina) i proizvodnjom IL-2 (ELISpot test). Donori koji su pokazali odgovore sa indeksom stimulacije (SI; signal/bazalni signal) ≥1,9 u oba testa smatrani su pozitivnim.
EpiSkrin<™>analiza je pokazala da su za IgG1-HER2-LFLEDA, 4 donora (8%) pokazala pozitivne CD4+ T ćelijske odgovore, što je bilo uporedivo sa 4 (8%) i 3 (6%) pozitivnih odgovora za IgG1-HER2 i IgG1-HER2-LFLE, redom. (Slika 18). Dakle, IgG1-HER2-LFLEDA-K409R (kao i IgG1-HER2 i IgG1-HER2-LFLE-K409R) je pokazao nizak potencijal za imunogenost sa učestalošću odgovora ispod 10%. Pozitivna kontrola, humanizovani A33 (npr. [84]), korišćena je kao kliničko referentno kontrolno antitelo koje pokazuje visoke nivoe imunogenosti u klinici i rutinski indukuje 20-30% T ćelijskih odgovora u EpiScreen testu.
Primer 13 - Generisanje mutanata za optimizaciju proizvodnje humanizovanih CD3 antitela
Generisanje huCD3-L1 mutantnih plazmida
Nekoliko IgG1-huCD3-L1 LC mutanata je generisano kako bi se poboljšali nivoi eksprimovanja IgG1-huCD3-H1L1 u testovima tranzientne transfekcije, videti Tabelu 2. Izbor ostataka je zasnovan na poređenjima sa sekvencama germinativne linije ili skriningu na prisustvo retkih ostataka u huCD3-L1 u kombinaciji sa kristalnim strukturama homolognih antitela. Odabrane sekvence su sintetizovane u GeneArt (Life Technologies, Nemačka). p33L kodira konstantni domen humanog IgLC2/IgLC3 lambda lakog lanca SEQ ID NO:31. p33G1f kodira konstantni region teškog lanca IgG1m(f) SEQ ID NO:15.
Tranzientna ekspresija u ćelijama Expi293F
Za jedno antitelo, plazmidi koji kodiraju teški lanac (HC) i laki lanac (LC) su tranzientno transfektovani u Freestyle Expi293F ćelije (Life technologies, SAD) korišćenjem ExpiFectamine 293 (Life technologies). Ukupno 1,5 µg HC kodirajućeg plazmida i 1,5 µg LC kodirajućeg plazmida (Tabela 2) su razblaženi u 150 µL Opti-MEM (Gibco, SAD). Da bi se pripremila smeša za transfekciju, 8 µL ExpiFectamine 293 je razblaženo u 150 µL Opti-MEM i inkubirano 5 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim, rastvori DNA/Opti-MEM i ExpiFectamine 293/Opti-MEM su pomešani, inkubirani 20 minuta na sobnoj temperaturi i dodati u 2,55 mL Expi293 ekspresionog medijuma koji sadrži 7,5×10<6>ćelija Expi293F i 50 U/mL Pen-Strep. Ćelije su inkubirane na 37°C, 8% CO2i mućkane na 200 obrtaja u minuti. Da bi se pojačala ekspresija, 21 sat nakon transfekcije, dodato je 15 µL mešavine pojačivača 1 i 150 µL mešavine pojačivača 2. Ćelije su inkubirane 4 dana, nakon čega je sakupljen supernatant. Supernatanti su centrifugirani na 3.000x g i filter je sterilisan preko filtera od 0,2 µm. Nivoi eksprimovanja IgG su mereni na Octet RED (ForteBio, SAD) korišćenjem senzora protiv humanog IgG (ForteBio, SAD).
Analiza koncentracije IgG
Za sve navedene mutante, nivoi eksprimovanja IgG su mereni pojedinačno ili u kombinaciji. Slika 20 prikazuje izmereni nivo eksprimovanja IgG u supernatantu za panel eksprimovanih
12
antitela navedenih u Tabeli 2. Antitelo IgG1-huCD3-H1L1 je eksprimovano do 72 µg/mL. Četvorostruko povećanje eksprimovanja IgG je primećeno za mutant IgG1-huCD3-H1L1-LT41K (295 µg/mL). Slični nivoi eksprimovanja su primećeni za mutant IgG1-huCD3-H1L1-LLKNH (311 µg/mL), uključujući mutaciju T41K između ostalih mutacija. Ostale mutacije u ovim konstruktima nisu pokazale poboljšanje eksprimovanja kada su testirane pojedinačno (IgG1-huCD3-H1L1-LF10L, IgG1-huCD3-H1L1-LK55N, IgG1-huCD3-H1L1-LL97H) u poređenju sa IgG1-huCD3-H1L1.
Drugi set mutacija koje pojačavaju ekspresiju primećen je za kombinaciju R23A i A35P. Dok IgG1-huCD3-H1L1-LLTGPEAEY format bez R23A i A35P nije pokazao povećanje eksprimovanja (83 µg/mL), IgG1-huCD3-H1L1-LLAPTGPEAEY koji sadrži dodatne mutacije R23A i A35P je pokazao trostruko povećanje eksprimovanja (237 µg/mL). Pojedinačno, R23A ili A35P nisu pokazali pojačane nivoe eksprimovanja (56 i 81 µg/mL, redom).
Primer 14 - Vezivanje varijanti huCD3-H1L1-LFLEDA za Jurkat ćelije
Testirani su očigledni afiniteti vezivanja varijanti huCD3-H1L1-LFLEDA za ćelije Jurkat. IgG1-CD3-hmAb286 je objavljen u US2012038219 korišćen je kao referentno antitelo.
Jurkat ćelije (DSMZ, Braunzvik, Nemačka) su odmrznute na 37°C i jednom isprane u 30 mL PBS-a i centrifugirane 10 minuta na 300xg na 4°C. Ćelijski talog je resuspendovan u 25 mL PBS/0,1% BSA/0,02% azida do konačne koncentracije od 0,8×10<6>ćelija/ml. 100 µl ove ćelijske suspenzije (0,8×10<5>ćelija/ležište) je prebačeno u polistirenske ploče sa okruglim dnom sa 96 ležišta (Greiner Bio-one, Alphen a/d Rijn, Holandija) i inkubirano sa serijskim razblaženjima preparata supernatanta (raspon od 3 do 10.000 ng/ml u trostrukim razblaženjima) u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu na 4°C tokom 30 minuta. Nakon tri ispiranja u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, Jurkat ćelije su inkubirane u 50 µL sa sekundarnim antitelom na 4°C tokom 30 minuta. Kao sekundarno antitelo, za sve eksperimente je korišćen R-fikoeritrinski (PE)-konjugovani kozji anti-humani IgG F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) razblažen 1/200 u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu. Zatim, ćelije Jurkat su dva puta isprane u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, resuspendovane u 150 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane na FACS Cantoll-u (BD Biosciences). Krive vezivanja su analizirane korišćenjem nelinearne regresije (sigmoidna doza-odgovor sa promenljivim nagibom) korišćenjem GraphPad Prism V5.04 softvera (GraphPad Software, San Dijego, Kalifornija, SAD).
12
Slika 21 prikazuje krive vezivanja, a Tabela 3 prikazuje EC50vrednosti IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA mutanata. T41K mutacija nije imala uticaja na afinitet vezivanja, dok su K55N i LKNH mutanti pokazali 5 puta niži prividni afinitet u poređenju sa divljim tipom IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA. Afinitet referentnog antitela IgG1-CD3-hmAb286-LFLEDA bio je niži u poređenju sa IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA i bio je sličan varijantama IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA koje sadrže K55N mutaciju.
Tabela 3
Primer 15 - Vezivanje bispecifičnih huCD3 x HER2 afinitetnih varijanti na T ćelije
Vezivanje prečišćenih afinitetnih varijanti bispecifičnih (bs)IgG1-huCD3 x HER2 molekula sa ili bez LFLEDA mutacija u Fc regionu za humane T ćelije izolovane iz leukocitnotrombocitnog sloja (donorski broj: N001814268806, kupljen od Sanquin-a, Amsterdam, Holandija) analizirano je FACS analizom. T ćelije su izolovane putem StemSep<™>Kompleta za obogaćivanje humanih T ćelija (Stem Cell Technologies, Vankuver, Kanada) prema uputstvima dobavljača. Mutacije Herceptin-LbH1 su identifikovane na osnovu objavljenih podataka od strane Bostrom et al. (85, 86) i imale su niži afinitet prema HER2 u poređenju sa Herceptin-om (trastuzumab).
Da bi se procenilo vezivanje, izolovane T ćelije (1×10<5>ćelija/ležište) su inkubirane u polistirenskim pločama sa okruglim dnom sa 96 ležišta (Greiner bio-one 650101) sa serijskim
12
razblaženjima preparata antitela (raspon od 6,4 do 10.000 ng/ml u 5-strukim razblaženjima) u 100 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida na 4°C tokom 30 minuta. Nakon dvostrukog ispiranja u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, T ćelije su inkubirane u 50 µL sa sekundarnim antitelom na 4°C tokom 30 minuta. Kao sekundarno antitelo, za sve eksperimente je korišćen R-fikoeritrinski (PE)-konjugovani kozji anti-humani IgG F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) razblažen 1/200 u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu. Zatim, T ćelije su dva puta isprane u PBS/0,1% BSA/0,02% azidu, resuspendovane u 100 µL PBS/0,1% BSA/0,02% azida i analizirane na FACS Cantoll-u (BD Biosciences). Krive vezivanja su analizirane korišćenjem nelinearne regresije (sigmoidna doza-odgovor sa promenljivim nagibom) korišćenjem GraphPad Prism V5.04 softvera (GraphPad Software, San Dijego, Kalifornija, SAD).
Rezultati krivih vezivanja su prikazani na Slici 22, a EC50vrednosti su prikazane u Tabeli 4. Kao što se može videti, maksimalna razlika između EC50vrednosti CD3 varijanti je faktor 2.
Tabela 4
Primer 16 - In vitro Citotoksičnost posredovana T ćelijama izazvana varijantama afiniteta huCD3 antitela
U ovom primeru, citotoksičnost posredovana T ćelijama protiv HER2-pozitivnih tumorskih ćelija procenjena je korišćenjem bispecifičnih antitela sa različitim afinitetom prema huCD3 i HER2. Bispecifična antitela su pripremljena kao što je gore opisano i sadržala su mutaciju
12
F405L u CD3 grupi i mutaciju K409R u HER2 grupi. U ovom testu korišćene su ćelije A431 i AU565 (humani karcinom dojke) sa različitim nivoima eksprimovanja HER2. Broj kopija HER2 je ~20.000 za ćelije A431 i ~1.000.000 za ćelije AU565. Ćelije AU565 su kultivisane u RPMI 1640 medijumu sa HEPES-om i L-glutaminom (Lonza, Bazel, Švajcarska) dopunjenim sa 10% (vol/vol) goveđeg seruma sa gvožđem (Life Technologies, Nemačka), 1,5 g/L natrijum bikarbonata (Lonza, Nemačka), 1 mM natrijum piruvata (Lonza, Nemačka), 4,5 g/L glukoze (Sigma), 50 IU/mL penicilina i 50 µg/mL streptomicina (Lonza, Bazel, Švajcarska). Ćelije A431 (ATCC, epidermoidni karcinom) su kultivisane u RPMI 1640 medijumu sa HEPES-om i L-glutaminom (Lonza, Bazel, Švajcarska) dopunjenim sa 10% (vol/vol) goveđeg seruma sa gvožđem (Life Technologies, Nemačka), 50 IU/mL penicilina i 50 µg/mL streptomicina (Lonza, Bazel, Švajcarska). Ćelijske linije su održavane na 37°C u inkubatoru sa 5% (vol/vol) CO2vlažnim inkubatorom. Ćelije AU565 i A431 su kultivisane skoro do konfluencije, nakon čega su ćelije tripsinizirane, resuspendovane u medijumu za kultivaciju i propuštene kroz cediljku za ćelije da bi se dobila suspenzija od jedne ćelije. Ćelije AU565 i A431 su posejane 3×10<4>i 1,6×10<4>ćelija/ležište, redom u pločama za kultivaciju sa 96 ležišta, i inkubirane najmanje 3 sata na 37°C, 5% CO2 kako bi se omogućilo prijanjanje na ploču.
Humane T ćelije su izolovane iz leukocitno-trombocitnog sloja kao što je dato u Primeru 15. Izolovane T ćelije su isprane sa PBS, resuspendovane u medijumu za kultivaciju (RPMI 1640, 10% serum) i dodate u odnosu 1:3 prema AU565 ili odnosu 1:10 prema A431 ćelijama u pločama sa 96 ležišta.
Serija razblaženja (konačne koncentracije u rasponu od 0,1 do 10.000 ng/mL) varijanti bispecifičnih antitela bsIgG1-huCD3/Herceptin-LFLEDA, bsIgG1-huCD3/Herceptin-LbH1--LFLEDA, bsIgG2-H1-HL1-hu bisIgG1-huCD3-LK55N/Herceptin-LbH1--LFLEDA, bsIgG1-huCD3-LK55N/HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-hmAb286/Herceptin-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-hmAb286/Herceptin-LbH1--LFLEDA, bsIgG1-CD3-hmAb286/HER2-LFLEDA i bsIgG1-huCD3-H1L1/b12-LFLEDA je pripremljena u medijumu za kultivaciju i dodata na ploče. Ploče su inkubirane 3 dana na 37°C, 5% CO2. Inkubacija ćelija sa 1 µM staurosporina (Sigma) korišćena je kao referenca za 100% uništavanje ćelija tumora. Ploče su isprane dva puta sa PBS, i u svako ležište je dodato 150 µL medijuma za kultivaciju koji sadrži 10% Alamar plavog (Life Technologies, Nemačka). Ploče su inkubirane 4 sata na 37°C, 5% CO2. Izmerena je apsorbancija na 590 nm (Envision, Perkin Elmer, Waltham, MA).
12
Slika 23 prikazuje vitalnost ćelija A431 (slika 23A) i ćelija AU565 (slika 23B) tretiranih varijantama afiniteta za CD3 i HER2. Niži afinitet za HER2 u kombinaciji sa visokim i niskim afinitetom za CD3 rezultira nižom efikasnošću u obe ćelijske linije (prikazano kao otvoreni simboli na oba grafikona). Bispecifična antitela sa sličnim visokim afinitetom za HER2 (Herceptin i HER2) u kombinaciji sa CD3 krakom divljeg tipa huCD3-H1L1, huCD3-LK55N ili CD3-hmAb286 pokazala su sličnu efikasnost na ćelijama A431. Varijacija afiniteta u CD3 kraku nije imala uticaja na efikasnost na ćelijama A431. Bispecifična antitela sa sličnim visokim afinitetom prema HER2 (Herceptin i HER2) u kombinaciji sa CD3-hmAb286 CD3 grupom, huCD3-LK55N grupom i huCD3-H1L1 grupom divljeg tipa pokazala su sličnu efikasnost na AU565 ćelijama, pri čemu je CD3 hmAb286 CD3 grupa pokazala relativno veću efikasnost. Niži afinitet vezivanja za CD3 grupu bio je korisniji u AU565 ćelijama koje su imale veću ekspresiju HER2 u poređenju sa ćelijama A431.
Primer 17 - In vivo efekat ubijanja tumora huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA i huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA kod NOD-SCID miševa
In vivo antitumorska efikasnost bispecifičnog CD3xHER2 antitela bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA procenjena je u potkožnom modelu ksenografta NCI-N87. U ovom modelu, humane, nestimulisane PBMC, kao izvor humanih T ćelija, inokulirane su sa tumorskim ćelijama, analogno modelu koji su opisali Brischwein et al., (Mol. Immunol. 43 (2006), 1129‑1143). U ovim eksperimentima korišćene su ženke NOD-SCID (NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl) miševa stare od šest do jedanaest nedelja. Humane PBMC od zdravih donora su izolovane iz leukocitno-trombocitnog sloja kao što je opisano u Primeru 15. Na dan 0, smeša koja sadrži 5×10<6>ćelija i PBMC i NCI-N87 ćelija su inokulirane potkožno u 200 µL u desni bok svakog miša. U roku od jednog sata od injekcije, miševi su nasumično raspoređeni u sedam različitih grupa za tretman (n=4 po donoru). Svakoj grupi je intravenozno (i.v.) ubrizgana jedna doza (bispecifičnog) antitela. Grupe za tretman su prikazane u Tabeli 5. Rast tumora je procenjivan dva puta nedeljno pomoću kalipera (PLEXX) do krajnje zapremine tumora od 1500 mm3.<3>, dok se na tumorima nisu pojavile ulceracije ili do kraja studije.
Rezultati su prikazani na slici 24. Kao što se može videti na slici 24A, huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA je efikasno smanjio veličinu tumora pri sve tri testirane koncentracije. Slika 24B prikazuje veličinu tumora 29 dana nakon inokulacije tumora. Formiranje tumora je značajno
1
inhibirano (p<0,0001, Tukijev test višestrukog poređenja) kod miševa tretiranih sa bsIgG1-huCD3-H1L1xHER2-LFLEDA u dozama od 0,05 mg/kg, 0,5 mg/kg i 5 mg/kg u poređenju sa kontrolnom grupom koja je primala PBS, dok tretman sa 0,005 mg/kg nije uticao na formiranje tumora. Tretman sa 5 mg/kg kontrolnog antitela bsIgG1-huCD3-H1L1xb12-LFLEDA nije inhibirao stvaranje tumora, dok je tretman sa bsIgG1-b12xHER2-LFLEDA izgleda izazvao izvesnu inhibiciju rasta tumora u poređenju sa PBS kontrolom, ali to nije bilo značajno prema jednosmernoj ANOVA, Tukijevom testu višestrukog poređenja.
Tabela 5
The in vivo antitumorska efikasnost bispecifičnog CD20 x CD3 antitela huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA procenjena je u potkožnom Raji ksenograft modelu. U ovom modelu, humane, nestimulisane PBMC, kao izvor humanih T ćelija, koinokulirane su sa tumorskim ćelijama, analogno modelu koji je opisao Brischwein et al., (Mol. Immunol. 43 (2006), 1129‑1143). Korišćene su ženke NOD-SCID (NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl) miševa starih od šest do jedanaest nedelja. Humani PBMC od zdravih donora su izolovani iz bufastog premaza, isprani i resuspendovani sa PBS-0,1%BSA. Na dan 0, smeša koja sadrži 5×10<6>ćelija i PBMC i Raji ćelija su inokulirane supkutano u 200 µL u desni bok svakog miša. U roku od jednog sata od injekcije, miševi su razvrstani u sedam grupa (n=4 po donoru) i svakoj grupi je intravenozno (i.v.) ubrizgana jedna doza (bispecifičnog) antitela. Grupe za tretman su prikazane u Tabeli 6. Rast tumora je procenjivan dva puta nedeljno pomoću kalipera (PLEXX) do krajnje zapremine tumora od 1500 mm<3>, dok se na tumorima nisu pojavile ulceracije ili do kraja studije.
Rezultati su prikazani na slici 25. Kao što se može videti na slici 25A, huCD3-H1L1xCD20-
1 1
LFLEDA je efikasno smanjio veličinu tumora pri dve veće testirane doze (0,5 mg/kg i 0,05 mg/kg) huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA.
Na slici 25B, veličina tumora pojedinačnih miševa je prikazana poslednjeg dana kada su grupe bile intaktne (dan 21). Formiranje tumora je značajno inhibirano kod miševa tretiranih sa huCD3-H1L1xCD20-LFLEDA u dozama od 0,05 mg/kg i 0,5 mg/kg u poređenju sa kontrolnom grupom sa PBS (p-vrednosti su bile p<0,05 i p < 0,01, redom, kada su procenjene pomoću jednosmerne Anova, Tukijevog testa višestrukog poređenja). Tretman sa 0,005 mg/kg nije uticao na formiranje tumora. Tretman sa 0,5 mg/kg i 0,05 kontrolnog antitela b12 x CD20 (bsIgG1-b12xCD20-LFLEDA) nije značajno inhibirao formiranje tumora u poređenju sa PBS kontrolom (jednosmerna Anova, Tukijev test višestrukog poređenja).
Tabela 6
Spisak literature/referenci
[1] Xu et al., 2000, Cell Immunol. 200(1):16‑26
[2] Herold et al., 2005, Diabetes, 54(6):1763‑9
[3] Staerz, et.al., 1985, Nature 314:628‑631
[4] Muller and Kontermann, 2010, BioDrugs 24: 89‑98
[5] Lum and Thakur, 2011, BioDrugs 25: 365‑379
[6] Linke et al., 2010, MAbs 2: 129‑136
[7] Ruf et al., 2010, Br J Clin Pharmacol 69: 617‑625
[8] Bokemeyer et al., 2009, J Clin Oncol (Meeting Abstracts), 3036
[9] Heiss et al., 2010, Int J Cancer 127: 2209‑2221
1 2
[10] Jones et al., 2009, Lancet Oncol 10:1179‑1187
[11] Kiewe et al., 2006, Clin Cancer Res 12:3085‑3091
[12] WO 2012/162067
[13] WO 2008/119567
[14] Fundamental Immunology Ch. 7, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)
[15] Lefranc MP, et al., 2003, Dev Comp Immunol. Jan;27(1):55‑77
[16] Brochet, X. et al., 2008, Nucl.Acids Res.36, W503‑508
[17] Giudicelli, V., Brochet, X, Lefranc, M.‑P., 2011, Cold Spring Harb Protoc. Jun 1;2011(6)
[18] Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ch.15
[19] WO92/22653
[20] EP 0629 240
[21] E. Meyers and W. Miller, 1988, Comput. Appl. Biosci 4, 11‑17
[22] Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48, 444‑453
[23] Clustal W algorithm, Thompson, 1994
[24] T cell Epitope Database from e.g. http://www.iedb.org/
[25] Perry et al., 2008 Drugs R D 9 (6):385‑396
[26] Bryson et al., 2010, Biodrugs 24 (1):1‑8
[27] Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of proteins of immunological interest.5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91‑3242, pp 662,680,689
[28] Oganesyan et al., 2008, Acta Cryst. (D64):700‑4
[29] Canfield et al., 1991, J. Exp.Med. (173):1483‑91
[30] Duncan et al., 1988, Nature (332):738‑40
[31] Shields et al., 2001, J. Biol. Chem. (276):6591‑604
[32] Idusogie EE, et al., 2000, J Immunol. 164: 4178‑84
[33] Leabman et al., 2013, MAbs; 5(6):896‑903
[34] Parren et al., 1992, J. Clin Invest.90: 1537‑1546
[35] Bruhns et al,.2009, Blood 113: 3716‑3725
[36] WO 2011/066501
[37] Lightle, S., et al., 2010, Protein Science (19):753‑62
[38] Brekke et al., 2006, J Immunol 177:1129‑1138
[39] Dall’Acqua WF, et al., 2006, J Immunol 177:1129‑1138
1
[40] Wu et al., 2010, Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg
[41] WO 2011/131746
[42] WO 2002/020039
[43] WO 98/050431
[44] WO 2011/117329
[45] EP 1870 459
[46] WO 2009/089004
[47] US 201000155133
[48] WO 2010/129304
[49] WO 2007/110205
[50] WO 2010/015792
[51] WO 2011/143545
[52] WO 2012/058768
[53] WO 2011/028952
[54] WO 2008/003116
[55] US 7,262,028
[56] US 7,612,181
[57] WO 2010/0226923
[58] US 7,951,918
[59] CN 102250246
[60] WO 2012/025525
[61] WO 2012/025530
[62] WO 2008/157379
[63] WO 2010/080538
[64] Sykes and Johnston, 1997, Nat Biotech 17, 355‑59
[65] US 6,077,835
[66] WO 2000/70087
[67] Schakowski et al., 2001, Mol Ther 3, 793‑800
[68] WO 2000/46147
[69] Benvenisty and Reshef, 1986, PNAS USA 83, 9551‑55
[70] Wigler et al., 1978, Cell 14, 725
[71] Coraro and Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7, 603
1 4
[72] US 5,589,466
[73] US 5,973,972
[74] Van Heeke & Schuster, 1989, J Biol Chem 264, 5503‑5509
[75] F. Ausubel et al., 1987, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York
[76] Grant et al., 1987, Methods in Enzymol 153, 516‑544
[77] Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995
[78] Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
[79] Srivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy, Plenum Press 1988
[80] Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Gennaro et al., (eds.), pp.624‑652, Mack Publishing Co., 1990 [81] Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in Biotechnology And Pharmacy 227‑49, Pezzuto et al., (eds.), Chapman & Hall 1993
[82] US 5,057,313
[83]US 6,331,175
[84]Ritter G, et al.; 2001, Cancer Res., 61:6851‑9
[85]Bostrom et al, Science. 2009; 323(5921):1610‑4
[86]Bostrom et al, PLosOne. 2011; 6(4)e17887
1

Claims (2)

Patentni zahtevi
1. Bispecifično antitelo koje sadrži (i) prvi teški lanac i prvi laki lanac povezane preko disulfidnih mostova koji formiraju prvi region vezivanja koji se vezuje za humani CD3 i (ii) drugi teški lanac i drugi laki lanac povezane preko disulfidnih mostova koji formiraju drugi region vezivanja koji se vezuje za humani CD20;
pri čemu prvi teški lanac obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:6, a prvi laki lanac obuhvata VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; i drugi teški lanac obuhvata VH sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:29, a drugi laki lanac obuhvata VL sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:30;
pri čemu prvi i drugi teški lanac sadrže modifikovane konstantne regione IgG1, pri čemu i u prvom i u drugom teškom lancu amino-kiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama L234, L235 i D265 u teškom lancu humanog IgG1 su F, E i A, redom; pri čemu u prvom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji F405 u teškom lancu humanog IgG1 je L, a u drugom teškom lancu amino-kiselina na poziciji koja odgovara poziciji K409 u teškom lancu humanog IgG1 je R;
pri čemu su date pozicije amino-kiselina u skladu sa EU numeracijom.
2. Bispecifično antitelo prema zahtevu 1, pri čemu prvi teški lanac sadrži sekvencu aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO:25, a drugi teški lanac sadrži sekvencu aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO:26.
RS20250910A 2014-01-09 2015-01-08 Humanizovana ili himerna cd3 antitela RS67220B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2014/050340 WO2014108483A1 (en) 2013-01-10 2014-01-09 Inert format
DKPA201400009 2014-01-09
PCT/EP2014/064326 WO2015001085A1 (en) 2013-07-05 2014-07-04 Humanized or chimeric cd3 antibodies
EP23174159.6A EP4249515B1 (en) 2014-01-09 2015-01-08 Humanized or chimeric cd3 antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67220B1 true RS67220B1 (sr) 2025-10-31

Family

ID=52143134

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200307A RS60131B1 (sr) 2013-07-05 2014-07-04 Humanizovana ili himerna anti-cd3 antitela
RS20250910A RS67220B1 (sr) 2014-01-09 2015-01-08 Humanizovana ili himerna cd3 antitela

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200307A RS60131B1 (sr) 2013-07-05 2014-07-04 Humanizovana ili himerna anti-cd3 antitela

Country Status (32)

Country Link
US (5) US10465006B2 (sr)
EP (5) EP3016681B1 (sr)
JP (7) JP6546162B2 (sr)
KR (4) KR102363220B1 (sr)
CN (5) CN113248615B (sr)
AU (4) AU2014286116A1 (sr)
BR (1) BR122023002590B1 (sr)
CA (1) CA2915575A1 (sr)
CY (1) CY1122840T1 (sr)
DK (2) DK3016681T5 (sr)
EA (1) EA201690167A1 (sr)
ES (3) ES2776706T3 (sr)
FI (2) FI4249515T3 (sr)
FR (1) FR25C1054I1 (sr)
HR (2) HRP20200382T1 (sr)
HU (3) HUE048722T2 (sr)
IL (4) IL311371B2 (sr)
LT (3) LT3016681T (sr)
ME (1) ME03675B (sr)
MX (2) MX373245B (sr)
NL (1) NL301352I2 (sr)
NO (1) NO2025057I1 (sr)
NZ (1) NZ715896A (sr)
PL (2) PL3016681T3 (sr)
PT (2) PT3016681T (sr)
RS (2) RS60131B1 (sr)
SG (2) SG11201510739TA (sr)
SI (2) SI3016681T1 (sr)
SM (2) SMT202000287T1 (sr)
UA (1) UA119646C2 (sr)
WO (2) WO2015001085A1 (sr)
ZA (1) ZA201800385B (sr)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3434767T (pt) 2010-11-30 2026-01-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapêutico indutor de citotoxicidade
CN104736174B (zh) 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
ME03675B (me) 2013-07-05 2020-10-20 Genmab As Humanizovana ili himerna anтi-cd3 antiтela
CN105722859B (zh) 2013-07-25 2021-05-07 西托姆克斯治疗公司 多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法
TWI701042B (zh) * 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
AU2015244814B2 (en) * 2014-04-07 2020-12-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Immunoactivating antigen-binding molecule
MX2016014434A (es) 2014-05-13 2017-02-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union a antigeno redirigida a celulas t para celulas que tienen funcion de inmunosupresion.
CA2955947A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
KR102614189B1 (ko) 2014-11-17 2023-12-18 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Cd3xcd20 이특이적 항체를 이용한 종양의 치료 방법
PT3221356T (pt) 2014-11-20 2020-10-29 Hoffmann La Roche Moléculas de ligação ao antigénio biespecíficas ativadoras das células t contra folr1 e cd3
DK3221357T3 (da) 2014-11-20 2020-08-10 Hoffmann La Roche Fælles letkæder og fremgangsmåder til anvendelse
US10544220B2 (en) 2015-01-08 2020-01-28 Genmab A/S Bispecific antibodies against CD3 and CD20
WO2016161010A2 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to fc gamma receptors
TWI703159B (zh) * 2015-04-13 2020-09-01 美商輝瑞股份有限公司 Bcma特異性治療性抗體及其用途
IL256562B2 (en) 2015-07-15 2024-07-01 Genmab As Human CD3 antibodies or chimeras
AU2016325630B2 (en) 2015-09-23 2022-11-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Optimized anti-CD3 bispecific antibodies and uses thereof
WO2017077382A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Orionis Biosciences Nv Bi-functional chimeric proteins and uses thereof
WO2017086419A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 液性免疫応答の増強方法
WO2017086367A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
CN105296421B (zh) * 2015-11-24 2019-01-29 高岱清 一种双特异性抗体活化的t细胞及制备方法与应用
IL313608A (en) 2015-12-09 2024-08-01 Hoffmann La Roche Antibody against CD20 type II to reduce the formation of antibodies against drugs
CN116769054A (zh) 2016-02-05 2023-09-19 奥里尼斯生物科学私人有限公司 双特异性信号传导剂及其用途
JP7015244B2 (ja) * 2016-03-22 2022-02-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト プロテアーゼ活性化ｔ細胞二重特異性分子
WO2017162587A1 (en) * 2016-03-22 2017-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Protease-activated t cell bispecific molecules
WO2018220099A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
RU2769282C2 (ru) 2016-06-20 2022-03-30 Кимаб Лимитед Анти-PD-L1 и IL-2 цитокины
WO2018011421A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Genmab A/S Multispecific antibodies against cd40 and cd137
WO2018106945A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CN110573172A (zh) 2017-02-06 2019-12-13 奥里尼斯生物科学有限公司 靶向的工程化干扰素及其用途
DK3592769T3 (da) 2017-03-09 2024-08-12 Genmab As Antistoffer mod pd-l1
WO2018183929A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
CN118894936A (zh) * 2017-05-08 2024-11-05 阿迪马布有限责任公司 抗cd3结合结构域和包含它们的抗体以及它们的产生及使用方法
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
AR112257A1 (es) 2017-06-21 2019-10-09 Gilead Sciences Inc Anticuerpos multiespecíficos dirigidos al vih-1 gp120 y cd3 humana, composiciones que los comprende, ácido nucleico, vector y célula huésped relacionados, método para producirlos, método para detectar células que expresan gp120 y cd3, kit de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo que se une a gp120 y método para producirlos
SG11202000198QA (en) 2017-08-04 2020-02-27 Genmab As Binding agents binding to pd-l1 and cd137 and use thereof
WO2019034580A1 (en) 2017-08-14 2019-02-21 Morphosys Ag HUMANIZED ANTIBODIES FOR CD3
US20190100587A1 (en) * 2017-10-02 2019-04-04 Covagen Ag IgG1 Fc MUTANTS WITH ABLATED EFFECTOR FUNCTIONS
EP3694885A1 (en) 2017-10-14 2020-08-19 CytomX Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
KR101973060B1 (ko) * 2017-10-20 2019-04-26 주식회사 녹십자 항-cd3 항체 및 이를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물
CN107860925B (zh) * 2017-11-03 2019-07-12 合肥瀚科迈博生物技术有限公司 用于检测血清中HuA21抗体的ELISA检测试剂盒
CN109971725B (zh) * 2017-12-28 2024-02-02 上海细胞治疗研究院 抗体修饰的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
JP7337079B2 (ja) * 2018-02-15 2023-09-01 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型ｃｄ３結合ドメイン、及び疾患の治療のための併用療法におけるその使用
SG11202008399QA (en) 2018-03-12 2020-09-29 Genmab As Antibodies
CN120399075A (zh) * 2018-03-14 2025-08-01 诺维莫尼公司 抗-CD3ε抗体及其应用方法
KR102602329B1 (ko) * 2018-05-23 2023-11-16 화이자 인코포레이티드 Cd3에 특이적인 항체 및 이의 용도
CA3101271A1 (en) * 2018-05-24 2019-11-28 Janssen Biotech, Inc. Anti-cd3 antibodies and uses thereof
WO2019246312A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
CA3110513A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for cd3/c20 bispecific antibodies
JP7611820B2 (ja) 2018-10-11 2025-01-10 インヒブルクス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド Ｄｌｌ３シングルドメイン抗体およびその治療用組成物
CN120623346A (zh) 2018-10-11 2025-09-12 因荷布瑞克斯生物科学公司 Pd-1单结构域抗体及其治疗组合物
JP2022504802A (ja) 2018-10-11 2022-01-13 インヒブルクス インコーポレイテッド ５ｔ４シングルドメイン抗体およびその治療組成物
CN113166261A (zh) 2018-10-11 2021-07-23 印希比股份有限公司 B7h3单域抗体及其治疗性组合物
EP3883635A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
WO2020052692A2 (en) * 2018-12-04 2020-03-19 Novartis Ag Binding molecules against cd3 and uses thereof
JP7489407B2 (ja) 2019-05-21 2024-05-23 ノバルティス アーゲー Ｃｄ１９結合分子及びその使用
WO2021048423A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 Genmab A/S Bispecific antibodies binding to 5t4 and cd3 for use in treatment of cancer
TWI841790B (zh) * 2019-09-30 2024-05-11 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 靶向cd3的抗體、雙特異性抗體及其用途
CN115666704B (zh) 2019-12-13 2025-09-26 比特比德科有限责任公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
PH12022551598A1 (en) 2019-12-23 2023-11-20 Denali Therapeutics Inc Progranulin variants
WO2021141996A1 (en) * 2020-01-06 2021-07-15 Cytomx Therapeutics, Inc. Single- and multi-chain polypeptides that bind specifically to cd3 epsilon
JP7789002B2 (ja) 2020-01-29 2025-12-19 インヒブルクス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド Ｃｄ２８シングルドメイン抗体ならびにその多価および多重特異性の構築物
WO2021167952A2 (en) * 2020-02-20 2021-08-26 The Feinstein Institutes For Medical Research Agonist antibodies against endoglin and uses thereof
MX2022009936A (es) 2020-03-18 2022-09-12 Genmab As Anticuerpos que se unen al dominio v-set que contiene el inhibidor de activacion de celulas t 1 (b7h4).
CN113563473A (zh) * 2020-04-29 2021-10-29 三生国健药业（上海）股份有限公司 四价双特异性抗体、其制备方法和用途
MX2022013797A (es) 2020-05-08 2022-11-30 Genmab As Anticuerpos biespecificos contra cd3 y cd20.
CN116249714A (zh) 2020-05-27 2023-06-09 詹森生物科技公司 包含cd3抗原结合结构域的蛋白质及其用途
JP7518286B2 (ja) 2020-08-25 2024-07-17 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｈｉｖを標的とする多重特異性抗原結合分子及び使用方法
IL300835A (en) 2020-09-02 2023-04-01 Genmab As Antibody therapy
US20240034812A1 (en) 2020-09-10 2024-02-01 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
KR20230066040A (ko) 2020-09-10 2023-05-12 젠맵 에이/에스 만성 림프구성 백혈병을 치료하기 위한 cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체
CN116782933A (zh) 2020-09-10 2023-09-19 健玛保 用于治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
EP4210745A1 (en) 2020-09-10 2023-07-19 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma
CA3190376A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
CA3189883A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
JP2023547329A (ja) 2020-10-02 2023-11-10 ジェンマブ エー／エス Ｒｏｒ２へと結合することができる抗体ならびにｒｏｒ２およびｃｄ３に結合する二重特異性抗体
KR102671734B1 (ko) * 2021-04-13 2024-06-04 건국대학교 글로컬산학협력단 개과 동물의 CD3ε 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편
CA3213632A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
TW202244059A (zh) 2021-04-30 2022-11-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
WO2022234146A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Genmab A/S PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING BISPECIFIC ANTIBODIES BINDING TO B7H4 and CD3
CN115558023A (zh) * 2021-07-02 2023-01-03 安源医药科技（上海）有限公司 抗cd3抗体及其用途
EP4413039A1 (en) 2021-10-08 2024-08-14 Genmab A/S Antibodies binding to cd30 and cd3
CN118647402A (zh) 2022-01-28 2024-09-13 健玛保 用于治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
MX2024008833A (es) 2022-01-28 2024-07-25 Genmab As Anticuerpo biespecifico contra cumulo de diferenciacion 3 (cd3) y cumulo de diferenciacion 20 (cd20) en terapia combinada para tratar linfoma difuso de celulas b grandes.
MX2024011468A (es) 2022-03-23 2024-09-25 Hoffmann La Roche Tratamiento conjunto de un anticuerpo biespecifico anti-cd20/anti-cd3 y quimioterapia.
US20250304689A1 (en) 2022-04-13 2025-10-02 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
WO2023198727A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and methods of use
EP4523697A4 (en) * 2022-05-09 2026-01-07 Hangzhou Viromab Biotech Co Ltd THERAPEUTIC AGENT COMPRISING A MULTISPECIFIC ANTIBODY AND ITS USE IN TUMOR THERAPY
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer
EP4612179A1 (en) 2022-11-02 2025-09-10 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating richter's syndrome
WO2024102948A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 Celgene Corporation Fc receptor-homolog 5 (fcrh5) specific binding molecules and bispecific t-cell engaging antibodies including same and related methods
AR132290A1 (es) 2023-04-05 2025-06-11 Genmab As Composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos que se unen a cd30 y cd3
CN121311504A (zh) 2023-04-13 2026-01-09 金麦安博股份有限公司 用针对cd3和cd20的双特异性抗体治疗淋巴瘤的方法
EP4695308A1 (en) * 2023-09-14 2026-02-18 Invitrogen BioServices India Private Limited Engineered antibodies and uses thereof
EP4590715A1 (en) 2023-09-21 2025-07-30 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use
EP4590714A1 (en) 2023-09-21 2025-07-30 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use
WO2025116732A1 (en) * 2023-12-01 2025-06-05 Rijksuniversiteit Groningen Methods and kits for detecting proliferating cells
WO2025199352A2 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies specific for solute carrier family 34 member 2 (slc34a2)
WO2025240670A2 (en) 2024-05-15 2025-11-20 Abalytics Oncology, Inc. Anti-pd-1 antibodies and related binding molecules and methods and uses thereof

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
ATE299938T1 (de) 1997-05-02 2005-08-15 Genentech Inc Ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
WO2000046147A2 (en) 1999-02-03 2000-08-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
DE10043437A1 (de) 2000-09-04 2002-03-28 Horst Lindhofer Verwendung von trifunktionellen bispezifischen und trispezifischen Antikörpern zur Behandlung von malignem Aszites
DK2314629T4 (da) 2002-07-18 2023-02-06 Merus Nv Rekombinant produktion af blandinger af antistoffer
BRPI0315295C1 (pt) * 2002-10-17 2021-05-25 Genmab As anticorpo monoclonal humano isolado, célula hospedeira procariótica, composição farmacêutica, molécula biespecífica, usos de um anticorpo, métodos in vitro de detectar a presença de antígeno de cd20 ou uma célula que expressa cd20 em uma amostra, kit, e, vetor de expressão
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
US7850962B2 (en) 2004-04-20 2010-12-14 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
US7741568B2 (en) 2005-01-13 2010-06-22 The Wiremold Company Downward facing receptacle assembly for cable raceway
AU2006210724A1 (en) * 2005-02-03 2006-08-10 Antitope Limited Human antibodies and proteins
JP5142707B2 (ja) 2005-02-08 2013-02-13 一般財団法人化学及血清療法研究所 抗体の改良方法
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
NZ612578A (en) 2005-08-19 2014-11-28 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobin and uses thereof
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1940881B1 (en) * 2005-10-11 2016-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
CA2631184A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
CA2646508A1 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
AT503902B1 (de) 2006-07-05 2008-06-15 F Star Biotech Forsch & Entw Verfahren zur manipulation von immunglobulinen
RS53008B2 (sr) 2007-04-03 2022-12-30 Amgen Res Munich Gmbh Interspecijski specifičan cd3-epsilon vezujući domen
MX2009010611A (es) * 2007-04-03 2010-03-26 Micromet Ag Enlazadores biespecificos, especificos para especies.
EP2158221B1 (en) 2007-06-21 2018-08-29 MacroGenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
WO2010015792A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Argenta Discovery Limited Nitrogen containing heterocyclic compounds useful as bifunctional modulators of m3 receptors and beta-2 receptors
DE102008039957A1 (de) 2008-08-27 2010-03-04 Continental Automotive Gmbh Verfahren zur Ermittlung eines Unfallschwerekriteriums mittels eines Beschleunigungssignals und eines Körperschallsignals
JP5397668B2 (ja) 2008-09-02 2014-01-22 ソニー株式会社 記憶素子および記憶装置
FR2935974B1 (fr) 2008-09-15 2010-10-08 Centre Nat Rech Scient Derives de metalloporphyrines, nanoparticules les comprenant
EP2352765B1 (en) * 2008-10-01 2018-01-03 Amgen Research (Munich) GmbH Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
JP2012505654A (ja) * 2008-10-14 2012-03-08 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗体をヒト化及び親和性成熟する方法
DK2786762T3 (da) 2008-12-19 2019-05-06 Macrogenics Inc Kovalente diabodies og anvendelser deraf
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
US8961967B2 (en) 2009-11-30 2015-02-24 Janssen Biotech, Inc. Antibody Fc mutants with ablated effector functions
US8786135B2 (en) 2010-03-25 2014-07-22 Mitsubishi Electric Research Laboratories, Inc. Wireless energy transfer with anisotropic metamaterials
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
TWI653333B (zh) * 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
HRP20241208T1 (hr) 2010-04-20 2024-11-22 Genmab A/S Heterodimerni proteini koji sadrže fc fragment protutijela i postupci za njihovu proizvodnju
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP2576621B1 (en) 2010-05-27 2019-04-10 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
EP2593475B1 (en) * 2010-07-14 2016-03-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-addl monoclonal antibody and uses thereof
TW201208703A (en) * 2010-08-17 2012-03-01 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated CD20 antibody with an anti-VEGF antibody
CN103068847B (zh) 2010-08-24 2019-05-07 罗切格利卡特公司 可活化的双特异性抗体
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
ES2758994T3 (es) 2010-11-05 2020-05-07 Zymeworks Inc Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
PT3434767T (pt) * 2010-11-30 2026-01-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapêutico indutor de citotoxicidade
EP2678358B1 (en) * 2011-02-23 2015-07-22 F.Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against human il33r and uses thereof
AU2012245116A1 (en) 2011-04-20 2013-11-07 Genmab A/S Bispecific antibodies against HER2 and CD3
KR102060389B1 (ko) 2011-05-21 2019-12-31 마크로제닉스, 인크. 사람 및 비-사람 cd3에 결합할 수 있는 cd3-결합 분자
CN102250246A (zh) 2011-06-10 2011-11-23 常州亚当生物技术有限公司 抗VEGF/PDGFRβ双特异性抗体及其应用
SG11201401422VA (en) 2011-10-27 2014-09-26 Genmab As Production of heterodimeric proteins
DK2807188T3 (da) * 2012-01-27 2019-10-07 Prothena Biosciences Ltd Humaniserede antistoffer, der genkender alpha-synuclein
CN104736174B (zh) 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
ME03675B (me) 2013-07-05 2020-10-20 Genmab As Humanizovana ili himerna anтi-cd3 antiтela
WO2015006749A2 (en) * 2013-07-12 2015-01-15 Zymeworks Inc. Bispecific cd3 and cd19 antigen binding contructs
IL263466B2 (en) * 2013-12-17 2023-10-01 Genentech Inc Anti-CD3 antibodies and methods of using them
US10544220B2 (en) * 2015-01-08 2020-01-28 Genmab A/S Bispecific antibodies against CD3 and CD20
IL256562B2 (en) 2015-07-15 2024-07-01 Genmab As Human CD3 antibodies or chimeras
CH713600A2 (de) 2017-03-21 2018-09-28 Digi Sens Ag Vorrichtung und Verfahren zum Messen einer Last.
WO2019034580A1 (en) * 2017-08-14 2019-02-21 Morphosys Ag HUMANIZED ANTIBODIES FOR CD3
CA3189883A1 (en) * 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating follicular lymphoma
CN116782933A (zh) * 2020-09-10 2023-09-19 健玛保 用于治疗弥漫性大b细胞淋巴瘤的联合疗法中的针对cd3和cd20的双特异性抗体
KR20230066040A (ko) * 2020-09-10 2023-05-12 젠맵 에이/에스 만성 림프구성 백혈병을 치료하기 위한 cd3 및 cd20에 대한 이중특이적 항체
US20240034812A1 (en) * 2020-09-10 2024-02-01 Genmab A/S Bispecific antibody against cd3 and cd20 in combination therapy for treating diffuse large b-cell lymphoma

Also Published As

Publication number Publication date
EP3693385A1 (en) 2020-08-12
NZ715896A (en) 2022-02-25
MX373245B (es) 2020-05-11
IL311371B1 (en) 2024-05-01
JP2020005635A (ja) 2020-01-16
US11613575B2 (en) 2023-03-28
AU2022203851B2 (en) 2025-07-24
LT3016681T (lt) 2020-03-25
IL276530A (en) 2020-09-30
JP7208129B2 (ja) 2023-01-18
WO2015104346A1 (en) 2015-07-16
JP7757247B2 (ja) 2025-10-21
LTPA2025538I1 (sr) 2025-12-29
EP3091998A1 (en) 2016-11-16
EP4249515A2 (en) 2023-09-27
EP3016681A1 (en) 2016-05-11
KR102813816B1 (ko) 2025-05-29
HUE048722T2 (hu) 2020-08-28
SG11201510739TA (en) 2016-01-28
KR102363220B1 (ko) 2022-02-15
SMT202500322T1 (it) 2025-11-10
IL276530B (en) 2022-03-01
DK3016681T5 (da) 2020-05-04
CA2915575A1 (en) 2015-01-08
KR20160027177A (ko) 2016-03-09
US20230374131A1 (en) 2023-11-23
CN105722529A (zh) 2016-06-29
EP3016681B1 (en) 2019-12-18
FR25C1054I1 (fr) 2026-01-16
MX2015017487A (es) 2016-03-21
LT4249515T (lt) 2025-08-25
AU2014286116A1 (en) 2016-02-04
JP7389833B2 (ja) 2023-11-30
RS60131B1 (sr) 2020-05-29
ES2776706T3 (es) 2020-07-31
IL290613A (en) 2022-04-01
CN106255507A (zh) 2016-12-21
EP3091998B1 (en) 2025-08-20
JP7104000B2 (ja) 2022-07-20
HUS2500051I1 (hu) 2025-12-28
IL290613B2 (en) 2024-11-01
PL3016681T3 (pl) 2020-06-15
ES3038421T3 (en) 2025-10-13
KR20250078622A (ko) 2025-06-02
ME03675B (me) 2020-10-20
KR20230073341A (ko) 2023-05-25
CN118063621A (zh) 2024-05-24
CN106255507B (zh) 2025-05-02
AU2022203851A1 (en) 2022-06-23
HK1231369A1 (en) 2017-12-22
AU2020202792A1 (en) 2020-05-21
JP6546162B2 (ja) 2019-07-17
US10407501B2 (en) 2019-09-10
AU2020202792B2 (en) 2022-06-23
UA119646C2 (uk) 2019-07-25
CN113248615A (zh) 2021-08-13
BR112015032986A2 (pt) 2017-08-22
SG10201800982QA (en) 2018-03-28
HUE072527T2 (hu) 2025-11-28
IL311371B2 (en) 2024-09-01
JP2016529882A (ja) 2016-09-29
JP2022163009A (ja) 2022-10-25
DK4249515T3 (en) 2025-09-15
JP7851903B2 (ja) 2026-04-27
KR20220025210A (ko) 2022-03-03
FIC20250036I1 (fi) 2025-12-09
HRP20251127T1 (hr) 2025-11-21
JP2022101539A (ja) 2022-07-06
IL290613B1 (en) 2024-07-01
HRP20200382T1 (hr) 2020-06-12
EA201690167A1 (ru) 2016-06-30
EP4249515A3 (en) 2023-11-15
KR102531517B1 (ko) 2023-05-12
JP2017505121A (ja) 2017-02-16
US10465006B2 (en) 2019-11-05
JP2020048564A (ja) 2020-04-02
JP6619342B2 (ja) 2019-12-11
WO2015001085A1 (en) 2015-01-08
SI4249515T1 (sl) 2025-11-28
US20160333095A1 (en) 2016-11-17
CY1122840T1 (el) 2021-05-05
CN120365424A (zh) 2025-07-25
US20200199229A1 (en) 2020-06-25
ZA201800385B (en) 2019-09-25
CN113248615B (zh) 2025-07-04
ES3052034T3 (en) 2025-12-30
IL243127B (en) 2020-08-31
EP4631978A2 (en) 2025-10-15
US20200123255A1 (en) 2020-04-23
PT4249515T (pt) 2025-09-08
JP2024026114A (ja) 2024-02-28
PL4249515T3 (pl) 2025-12-22
NL301352I2 (nl) 2025-12-16
SI3016681T1 (sl) 2020-04-30
SMT202000287T1 (it) 2020-07-08
BR122023002590B1 (pt) 2023-12-05
AU2020202792B9 (en) 2022-07-07
EP4631978A3 (en) 2025-12-24
EP4249515B1 (en) 2025-06-18
PT3016681T (pt) 2020-03-26
DK3016681T3 (da) 2020-03-09
NO2025057I1 (no) 2025-12-11
IL311371A (en) 2024-04-01
CN105722529B (zh) 2021-06-08
AU2025256200A1 (en) 2025-11-13
MX2020004503A (es) 2020-08-13
US20160168247A1 (en) 2016-06-16
FI4249515T3 (fi) 2025-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7389833B2 (ja) ヒト化またはキメラｃｄ３抗体
HK40092168A (en) Humanized or chimeric cd3 antibodies
HK40092168B (en) Humanized or chimeric cd3 antibodies
HK40035360A (en) Humanized or chimeric cd3 antibodies
HK1224574B (en) Humanized or chimeric cd3 antibodies
HK1224574A1 (en) Humanized or chimeric cd3 antibodies
HK1231369B (en) Humanized or chimeric cd3 antibodies