RS67370B1 - Humanizovani anti-vegf fab fragment antitela i njegova upotreba - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] TEHNIČKA OBLAST

[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast tumorske imunoterapije, posebno na humanizovane Fab fragmente anti-VEGF antitela.

[0007] POZADINA PRONALASKA

[0009] Razvoj vaskularnog sistema je osnova mnogih fizioloških i patoloških procesa. Vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) je grupa faktora rasta koji poseduju važne proangiogene aktivnosti koje promovišu mitozu i anti-apoptozu endotelnih ćelija, povećavaju vaskularnu propustljivost i podstiču migraciju ćelija. Ljudski VEGF gen je lokalizovan na hromozomu 6p21.3 i pripada supergenetskoj porodici VEGF/PDGF, koja kodira VEGF vezan disulfidnim vezama da formira dimer. Kod ljudi, VEGF porodica uključuje više članova sa različitim funkcijama: VEGF A (VEGF, sa raznim različitim varijantama spajanja), VEGFB, VEGFC, VEGFD, VEGFE, VEGFF i faktor rasta posteljice (PIGF). Nedavno je i vaskularni endotelni faktor rasta poreklom iz endokrinih žlezda (EG-VEGF) takođe uključen u ovu porodicu (Samson M et al., J Clin Endocrinol Metab.2004; 89(8):4078-4088). VEGF je široko rasprostranjen u humanim tkivima i organima, među kojima su eksprimirane ćelije pigmentnog epitela mrežnjače oka, vaskularne endotelne ćelije, nervne ćelije, itd. (Goel H L et al., Nat Rev Cancer. 2013; 13(12): 871). Postoje tri tipa VEGF receptora: VEGFR1, VEGFR2 i VEGFR3. Vezivanje VEGF za ekstracelularni domen receptora pokreće dimerizaciju receptora i promoviše autofosforilaciju tirozinskih ostataka u intracelularnom domenu, čime se aktiviraju nizvodni signali koji podstiču proliferaciju ćelija, migraciju, anti-apoptozu i povećanu vaskularnu propustljivost. VEGFR1 i VEGFR2 su uglavnom eksprimirani u vaskularnim endotelnim ćelijama, dok je VEGFR3 uglavnom eksprimiran u limfnim endotelnim ćelijama.

[0011] [0003] Potvrđeno je da VEGF igra važnu ulogu u regulaciji normalne i patološke angiogeneze (Melincovici C S et al., Rom J Morphol Embryol.2018; 59(2): 455-467). VEGF je prekomerno eksprimiran u raznim tumorima koji mogu da uzrokuju maligni ascites, a ekspresija VEGF u tumorima je u korelaciji sa sposobnošću migracije tumorskih ćelija. Koncentracija VEGF kod pacijenata sa solidnim tumorima sa lošijom stopom preživljavanja, kao što su gastrointestinalni karcinom, karcinomi jajnika, dojke i pluća, u pozitivnoj je korelaciji sa stadijumom bolesti (Sebastian, K et al., Oncologist. 2009; 14(12): 1242 -1251). Razvoj nekoliko lezija kod bolesti zadnjeg segmenta, kao što su makularna degeneracija povezana sa godinama (AMD), dijabetični makularni edem (DME), edem mrežnjače, degenerativna miopija i horoidalna neovaskularizacija (CNV), takođe su usko povezani sa nivoima ekspresije VEGF (Patel J R et al., Curr opin ophthalmol. 2016; 27(5 ): 387-392; Tan G S et al,. Lancet Diabetes Endo.2017; 5(2): 143-155; Mitchell P et al., Lancet.2018; 392(10153): 1147-1159).

[0013] [0004] Lekovi sa monoklonskim antitelima protiv VEGF inhibiraju širenje endotelnih ćelija i neovaskularizaciju inhibiranjem interakcije VEGF sa receptorima na površini endotelnih ćelija, VEGFR2 i VEGFR1, i naknadno blokiranjem nizvodnog signalnog puta. Lekovi sa antitelima ciljanim na VEGF koje je FDA odobrila za lečenje očnih bolesti uključuju Lucentis (Ranibizumab, odobren 2006.), EYLEA (Aflibercept, odobren 2004.) i Conbercept koji je takođe stavljen na tržište u Kini. Lucentis je Fab fragment anti-VEGFA antitela poreklom od ljudi koji se vezuje za sve aktivne oblike VEGFA i inhibira njegovo vezivanje za VEGFR1 i VEGFR2, čime inhibira proliferaciju i migraciju vaskularnih endotelnih ćelija i smanjuje vaskularnu propustljivost, čime se inhibira formiranje horoidalne neovaskularizacije. U poređenju sa antitelom pune dužine, antitela u obliku Fab fragmenata mogu lako da pređu mrežnjaču do subretinalnog prostora i stignu do ciljanog tkiva da se vežu za VEGF, čime se inhibira formiranje horoidalne neovaskularizacije. Fab fragmenti antitela koji ulaze u opšti sistem putem krvotoka eliminišu se za samo 0,09 dana ili oko 2 sata, minimizujući uticaj na fiziološke funkcije normalnog VEGF i smanjujući toksične efekte kao što su perforacija gastrointestinalnog trakta, hipertenzija i krvarenje (Ferrara, N et al., Retina.2006; 26(8): 859-870; Van Wijngaarden et al., Clin Exp Optom.2008; 91(5): 427-437). Studije su pokazale vezu između AMD i inflamatornog odgovora uzrokovanog efektima komplementa, a Fab fragment antitela, koji ne sadrži Fc deo, ne stimuliše kaskadu komplementa, čime se smanjuje rizik od endoftalmitisa i autoimunih inflamatornih odgovora (Ferrara, N et al., Retina. 2006; 26(8): 859-870). Lucentis je odobren za lečenje vlažne AMD, CNV, DME i edema mrežnjače. Bevacizumab je rekombinantno humanizovano monoklonsko antitelo koje je FDA odobrila za lečenje solidnih tumora kao što su metastatski karcinom debelog creva i karcinom pluća nemalih ćelija, a trenutno se koristi kao lek van indikacija za lečenje AMD. Aflibercept i Conbercept su humanizovani rekombinantni fuzioni proteini koji sadrže specifičan domen VEGFR koji se vezuje za ligande, i mogu da se vežu za VEGF sa specifičnim visokim afinitetom i da blokiraju vezivanje VEGF za receptore. Aflibercept ima veći afinitet za VEGF165 od Bevacizumaba i Lucentisa i pokazao je superiornu efikasnost u lečenju DME. Aflibercept je odobren za lečenje vlažne AMD, okluzije venske grane mrežnjače, okluzije centralne vene mrežnjače, CNV, DME i dijabetičke retinopatije. Conbercept je odobren u Kini za lečenje vlažne AMD.

[0015] Budući da se ovi lekovi primenjuju intravitrealno lokalno, česta primena je vrlo verovatno da će izazvati oštećenja od očnih i periokularnih infekcija. Stoga je potrebna optimizacija leka kako bi se poboljšala njegova efikasnost i smanjila učestalost primene kako bi se pacijentima donela veća terapijska korist.

[0017] CN104761643, CN102286101, CN1946422, WO2017/119436 i Kong Deok-Hoon et al., International Journal of Molecular Sciences, vol. 18, no.8, pgs 1-25 svi otkrivaju anti-VEGF antitela.

[0019] SAŽETAK

[0021] Predmetni pronalazak obezbeđuje nove humanizovane Fab fragmente anti-VEGF antitela prema zahtevima koji se mogu koristiti za lečenje očnih bolesti koje karakteriše horoidalna neovaskularizacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na pojavu makularne degeneracije povezane sa starenjem (AMD), dijabetičnog makularnog edema (DME), edema mrežnjače, degenerativne miopije i horoidalne neovaskularizacije (CNV).

[0023] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani Fab fragment anti-VEGF antitela, koji se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 36, i varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 37.

[0025] U nekim otelotvorenjima, navedeni Fab fragment anti-VEGF antitela obuhvata konstantni region teškog lanca CH1 i konstantni region lakog lanca, pri čemu je konstantni region teškog lanca CH1 konstantni region teškog lanca IgG1 sa sekvencom aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 40; i/ili konstantni region lakog lanca je konstantni region lakog lanca sa sekvencom aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 39.

[0026] U nekim otelotvorenjima, navedeni Fab fragment anti-VEGF antitela dalje obuhvata signalni peptid teškog lanca i signalni peptid lakog lanca, po mogućnosti navedeni signalni peptid teškog lanca je sekvenca aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 34, i/ili navedeni signalni peptid lakog lanca je sekvenca aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 35.

[0028] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat antitelo-lek, koji se sastoji od Fab fragmenta anti-VEGF antitela iz predmetnog pronalaska i dodatnog terapeutskog agensa, po mogućnosti navedeni Fab fragment anti-VEGF antitela je povezan sa navedenim dodatnim terapeutskim agensima putem linkera.

[0030] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira Fab fragment anti-VEGF antitela iz predmetnog pronalaska.

[0032] U nekim otelotvorenjima, navedena nukleinska kiselina obuhvata nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 45 i/ili nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 46. Po mogućnosti, navedena nukleinska kiselina dalje obuhvata nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 49 i/ili nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 48. Još poželjnije, navedena nukleinska kiselina obuhvata nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 41 i/ili nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 42.

[0034] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor, koji se sastoji od nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska.

[0036] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina, koja se sastoji od nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska ili ekspresionog vektora iz predmetnog pronalaska.

[0038] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metodu za proizvodnju Fab fragmenta anti-VEGF antitela iz predmetnog pronalaska, koja se sastoji od kultivacije ćelije domaćina iz predmetnog pronalaska pod uslovima pogodnim za ekspresiju Fab fragmenta antitela, i prikupljanja eksprimiranog Fab fragmenta antitela iz medijuma kulture.

[0039] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju, koja se sastoji od Fab fragmenta anti-VEGF antitela iz predmetnog pronalaska, ili konjugata antitelo-lek iz predmetnog pronalaska, ili nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska, ili ekspresionog vektora iz predmetnog pronalaska, i farmaceutski prihvatljivog nosača.

[0041] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje Fab fragment anti-VEGF antitela iz predmetnog pronalaska ili konjugat antitelo-lek iz predmetnog pronalaska ili farmaceutsku kompoziciju iz predmetnog pronalaska, za upotrebu u lečenju makularne degeneracije povezane sa starenjem (AMD), dijabetičnog makularnog edema (DME), edema mrežnjače, degenerativne miopije, horoidalne neovaskularizacije (CNV).

[0043] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet, koji se sastoji od Fab fragmenta anti-VEGF antitela iz predmetnog pronalaska, ili konjugata antitelo-lek iz predmetnog pronalaska, ili farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska, po mogućnosti, dalje obuhvatajući uređaj za primenu.

[0045] KRATAK OPIS CRTEŽA

[0047] Predmetni pronalazak je ilustrovan u kombinaciji sa priloženim crtežima, na kojima:

[0049] Slika 1 pokazuje da zečje VEGF165 antitelo VEGF-R988 blokira vezivanje VEGF 165 za VEGFR2 protein.

[0051] Slika 2 pokazuje da zečje VEGF165 antitelo VEGF-R988 neutrališe efekat proliferacije VEGF 165-HUVEC.

[0053] Slika 3 pokazuje vezivanje humanizovanog antitela VEGF-H988 Fab za VEGF165, detektovano ELISA testom.

[0055] Slika 4 pokazuje unakrsno vezivanje humanizovanog antitela VEGF-H988 Fab sa mVEGF164, detektovano ELISA testom.

[0056] Slika 5 pokazuje da antitelo VEGF-H988 Fab blokira vezivanje VEGF165 za VEGFR2 protein, detektovano ELISA testom.

[0058] Slika 6 pokazuje efekat VEGF-H988 Fab u neutralisanju VEGF165 u različitim koncentracijama, u poređenju sa Lucentisom.

[0060] Slika 7 pokazuje efekat VEGF-H988 Fab u neutralisanju VEGF165 u različitim koncentracijama, u poređenju sa EYLEA.

[0062] Slika 8 pokazuje efekat VEGF-H988 Fab u neutralisanju VEGF165 u različitim koncentracijama, u poređenju sa Avastinom.

[0064] Slika 9 pokazuje efekat VEGF-H988 Fab u neutralisanju VEGF165 u različitim koncentracijama, u poređenju sa Conberceptom.

[0066] Slika 10 pokazuje efekat VEGF-H988 Fab u neutralisanju VEGF165 u različitim koncentracijama, u poređenju sa Brolucizumabom.

[0068] DETALJAN OPIS

[0070] Razni aspekti predmetnog pronalaska se odnose na izolovani Fab fragment anti-VEGF antitela prema zahtevima, konjugat antitelo-lek koji obuhvata navedeni Fab fragment antitela, nukleinsku kiselinu i ekspresioni vektor koji kodiraju navedeni Fab fragment antitela, i ćeliju domaćina koja sadrži navedenu nukleinsku kiselinu ili ekspresioni vektor, metodu za proizvodnju navedenog Fab fragmenta anti-VEGF antitela, farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata navedeni Fab fragment anti-VEGF antitela, i navedeni Fab fragment anti-VEGF antitela za upotrebu u lečenju bolesti povezanih sa angiogenezom. Svako pozivanje u opisu na metode lečenja odnosi se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove iz predmetnog pronalaska za upotrebu u metodama lečenja ljudi ili životinja terapijom.

[0072] Definicija

[0074] [0021] Ako nije drugačije navedeno, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju značenje koje razume stručnjak u oblasti kojoj pripada predmetni pronalazak. Za potrebe predmetnog pronalaska, sledeći termini su definisani da budu u skladu sa značenjima koja se uopšteno razumeju u struci.

[0076] Kada se koriste ovde i u priloženim zahtevima, jednina „jedan“, „jedna/jedno“, „drugi“ i „navedeni“ uključuju množinu objekta, osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije.

[0078] Termin „antitelo“ se odnosi na molekul imunoglobulina i odnosi se na bilo koji oblik antitela koji pokazuje željenu biološku aktivnost. To uključuje, ali nije ograničeno na, monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela i multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela), pa čak i fragmente antitela. Obično, strukture antitela pune dužine po mogućnosti obuhvataju četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, tipično međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca i konstantni region teškog lanca. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca i konstantni region lakog lanca. Pored ove tipične strukture antitela pune dužine, struktura takođe uključuje i druge derivativne oblike.

[0080] Navedeni varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca mogu se dalje podeliti na konzervativnije regione (nazvane okvirni regioni (FR)) i hipervarijabilne regione (nazvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR)) prepletene sa njima.

[0082] Termin „region koji određuje komplementarnost“ (CDR, npr. CDR1, CDR2 i CDR3) odnosi se na takve aminokiselinske ostatke u varijabilnom regionu antitela čije je prisustvo neophodno za vezivanje antigena. Svaki varijabilni region tipično ima tri CDR regiona identifikovana kao CDR1, CDR2 i CDR3. Svaki region koji određuje komplementarnost može da sadrži aminokiselinske ostatke iz „regiona koji određuje komplementarnost“ kako je definisano od strane Kabata (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.1991) i/ili one ostatke iz „visokovarijabilne petlje“ (Chothia i Lesk; J MolBiol 196: 901-917 (1987)).

[0084] Termin „okvirni“ ili „FR“ ostaci su oni ostaci unutar varijabilnog regiona koji nisu CDR ostaci kako je ovde definisano.

[0085] Svaki varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca tipično sadrži 3 CDR i do 4 FR, pri čemu su navedeni CDR i FR raspoređeni od amino kraja do karboksilnog kraja u sledećem redosledu, na primer: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4.

[0087] Region koji određuje komplementarnost (CDR) i region okvira (FR) datog antitela mogu se identifikovati korišćenjem Kabat sistema (Kabat et al: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, US Department of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No.91- 3242, 1991).

[0089] Termin „konstantni region“ se odnosi na takve aminokiselinske sekvence u lakim i teškim lancima antitela koje nisu direktno uključene u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije kao što je citotoksičnost zavisna od antitela.

[0091] Prema antigenskim razlikama aminokiselinske sekvence konstantnog regiona, teški lanac antitela može se klasifikovati u pet klasa: α, δ, ε, γ i µ. Kada formira kompletno antitelo sa lakim lancem, može se klasifikovati u pet klasa: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, od kojih se dalje mogu klasifikovati u potklase (izotipove), kao što su IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Na osnovu aminokiselinske sekvence svog konstantnog domena, laki lanac antitela može se klasifikovati u κ i λ.

[0093] „Antigen-vezujući fragment antitela“ obuhvata deo netaknutog molekula antitela koji zadržava barem deo specifičnosti vezivanja matičnog antitela i tipično uključuje barem deo antigen-vezujućeg regiona ili varijabilnog regiona (npr. jedan ili više CDR) matičnog antitela. Primeri antigen-vezujućih fragmenata uključuju, ali nisu ograničeni na, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fd fragment, Fd' fragment, molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv, di-scFv ili tri-scFv, dijatelo ili scFab), antitela sa jednim domenom. Fab fragment obično sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i konstantni region teškog lanca 1 (CH1), i varijabilni region lakog lanca (VL) i konstantni region lakog lanca (CL).

[0095] Termin „fragment antitela“ se odnosi na neintaktni molekul antitela koji zadržava barem neke od bioloških svojstava matičnog antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Fc fragment, pored onih opisanih gore kao „antigen-vezujući fragmenti“.

[0096] Termin „konjugat antitelo-lek“ ili „ADC“ odnosi se na vezujući protein, kao što je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji je hemijski povezan sa jednim ili više hemijskih lekova (takođe se ovde nazivaju agensi), koji mogu opciono biti terapeutski agens ili citotoksični agens. U preferiranom otelotvorenju, ADC uključuje antitelo, citotoksični ili terapeutski lek i linker koji omogućava da se lek poveže ili konjuguje sa antitelom. ADC obično imaju bilo koju vrednost od 1 do 8 lekova konjugovanih sa antitelom, uključujući 2, 4, 6 ili 8 supstanci za opterećenje lekom. Neograničavajući primeri lekova koji mogu biti uključeni u ADC su mitotički inhibitori, antitumorski antibiotici, imunomodulatori, vektori za gensku terapiju, alkilujući agensi, anti-angiogeni agensi, antimetaboliti, agensi koji sadrže bor, hemoterapijski zaštitni agensi, hormoni, antihormonski agensi, kortikosteroidi, fotoaktivni terapeutski agensi, oligonukleotidi, radionuklidni agensi, inhibitori topoizomeraze, inhibitori tirozin kinaze i radio-senzibilizatori.

[0098] Termin „himerično antitelo“ se odnosi na antitelo u kojem je deo teškog lanca i/ili lakog lanca izveden iz specifičnog izvora ili vrste, a preostali deo je izveden iz drugog izvora ili vrste. „Himerično antitelo“ takođe može biti funkcionalni fragment kako je definisano gore. „Humanizovana antitela“ su podskup „himeričnih antitela“.

[0100] Termin „humanizovano antitelo“ ili „humanizovani antigen-vezujući fragment“ je ovde definisan kao antitelo ili fragment antitela koje je: (i) izvedeno iz nehumanog izvora (npr. transgenični miš koji nosi heterologni imuni sistem) i bazirano na humanoj germinativnoj sekvenci; ili (ii) himerično antitelo gde je varijabilni region nehumanog porekla, a konstantni region humanog porekla; ili (iii) CDR transplantat gde je CDR varijabilnog regiona nehumanog porekla, a jedan ili više regiona okvira varijabilnog regiona su humanog porekla i konstantni region, ako postoji, je humanog porekla. Cilj „humanizacije“ je da se eliminiše imunogenost antitela nehumanog porekla kod ljudi, dok se zadržava najveći mogući afinitet. Korisno je odabrati sekvencu humanog okvira koja je najsličnija sekvenci okvira antitela nehumanog izvora kao šablon za humanizaciju. U nekim slučajevima, može biti neophodno zameniti jednu ili više aminokiselina u sekvenci humanog okvira sa odgovarajućim ostacima u nehumanom konstruktu kako bi se izbegao gubitak afiniteta.

[0102] Termin „monoklonsko antitelo“ se odnosi na antitelo izvedeno iz suštinski homogene populacije antitela, tj. svako pojedinačno antitelo obuhvaćeno u populaciji je identično, osim mogućih mutacija (npr. prirodnih mutacija) koje mogu biti prisutne u vrlo malim količinama.

[0103] Termin „monoklonsko“ stoga ukazuje na prirodu dotičnog antitela, tj. nije mešavina nepovezanih antitela. Za razliku od preparata poliklonskih antitela, koji obično obuhvataju različita antitela protiv različitih epitopa, svako monoklonsko antitelo u preparatu monoklonskih antitela je usmereno protiv jednog epitopa na antigenu. Pored njihove specifičnosti, preparati monoklonskih antitela imaju prednost što obično nisu kontaminirani drugim antitelima. Termin „monoklonsko“ ne treba shvatiti kao zahtevanje proizvodnje navedenih antitela bilo kojom posebnom metodom.

[0105] Antitelo „specifično vezuje“ ciljni antigen kao što je ciljni peptidni antigen povezan sa tumorom (u ovom slučaju, VEGF), tj. vezuje navedeni antigen sa dovoljnim afinitetom da omogući da se navedeno antitelo koristi kao terapeutski agens, ciljajući ćeliju ili tkivo koje eksprimira navedeni antigen, i ne unakrsno reaguje značajno sa drugim proteinima, ili ne unakrsno reaguje značajno sa proteinima osim homologa i varijanti ciljnih proteina pomenutih gore (npr. mutantni oblici, varijante spajanja ili hidrolizom proteina skraćeni oblici).

[0107] Termin „afinitet vezivanja“ se odnosi na jačinu zbira nekovalentnih interakcija između pojedinačnih mesta vezivanja molekula i njegovih partnera za vezivanje. Ako nije drugačije navedeno, „afinitet vezivanja“, kada se koristi ovde, odnosi se na intrinzični afinitet vezivanja, koji odražava interakciju 1:1 između članova para za vezivanje (npr. antitelo i antigen). Kao što se ovde koristi, termin „KD“ se odnosi na konstantu disocijacije ravnoteže interakcije antitelo-antigen. Kao što se ovde koristi, termin „k<on>“ se odnosi na konstantu brzine kojom se antitelo vezuje za antigen. Kao što se ovde koristi, termin „k<off>“ se odnosi na konstantu brzine kojom se antitelo disocira iz kompleksa antitelo/antigen. „KD“, „konstanta brzine vezivanja k<on>“ i „konstanta brzine disocijacije k<off>“ se obično koriste za opisivanje afiniteta između molekula (npr. antitela) i njegovog partnera za vezivanje (npr. antigena). Afinitet, tj. stepen čvrstoće kojom se ligand vezuje za određeni protein. Na afinitet vezivanja utiču nekovalentne intermolekularne interakcije kao što su vodonične veze, elektrostatičke interakcije, hidrofobne i van der Valsove sile između dva molekula. Pored toga, na afinitet vezivanja između liganda i njegovog ciljnog molekula može uticati prisustvo drugih molekula. Afinitet se može analizirati konvencionalnim metodama poznatim u struci, uključujući ELISA test opisan ovde.

[0109] [0039] Termin „epitop“ uključuje bilo koji klaster proteinskih determinanti koji se specifično vezuje za antitelo ili T-ćelijski receptor. Klasteri epitopnih determinanti se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula (npr. aminokiselinskih ili šećernih bočnih lanaca, ili njihove kombinacije) i često imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naboja.

[0111] Termin „izolovano“ antitelo je antitelo koje je identifikovano i izolovano iz komponenti ćelije gde je antitelo eksprimirano. Izolovana antitela uključuju in situ antitela unutar rekombinantnih ćelija, gde barem jedna komponenta u prirodnom okruženju navedenog antitela nedostaje. Međutim, obično se izolovano antitelo priprema kroz barem jedan korak pročišćavanja.

[0113] „Identitet sekvence“ između dva polipeptida ili sekvenci nukleinskih kiselina ukazuje na broj ostataka koji su identični između navedenih sekvenci kao procenat ukupnog broja ostataka, i izračunava se na osnovu veličine manjeg od upoređenih molekula. Prilikom izračunavanja procenta identiteta, sekvence koje se poravnavaju se podudaraju na takav način da se proizvede maksimalno podudaranje između sekvenci, pri čemu se praznine u podudaranju (ako su prisutne) rešavaju specifičnim algoritmom. Preferirane metode kompjuterskog programa za određivanje identiteta između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničene na, GCG programske pakete uključujući GAP, BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410). Gore navedene procedure su javno dostupne od Međunarodnog centra za informacije o biotehnologiji (NCBI) i drugih izvora. Poznati Smit-Vatermanov algoritam se takođe može koristiti za određivanje identiteta.

[0115] Termin „Fc receptor“ ili „FcR“ se odnosi na receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Preferiraju se humani FcR prirodne sekvence, i po mogućnosti receptori koji se vezuju za IgG antitela (gamma receptori), koji uključuju FcγRI, FcγRII i FcγRIII izoforme, kao i varijante ovih receptora. Svi drugi FcR su uključeni u termin „FcR“. Termin takođe uključuje neonatalni receptor (FcRn), koji je odgovoran za transport majčinskog IgG do fetusa (Guyer et al, Journal of Immunology 117: 587 (1976) i Kim et al, Journal of Immunology 24: 249 (1994)).

[0117] Termin „neonatalni Fc receptor“, skraćeno kao „FcRn“, vezuje se za Fc region IgG antitela. Neonatalni Fc receptor (FcRn) igra važnu ulogu u metaboličkoj sudbini antitela sličnih IgG in vivo. FcRn funkcioniše tako što spašava IgG od puta lizozomalne degradacije, čime se smanjuje njegovo čišćenje u serumu i produžava njegov poluživot. Stoga, in vitro svojstva/karakteristike vezivanja FcRn za IgG su indikativna za njegova in vivo farmakokinetička svojstva u cirkulaciji.

[0118] Termin „efektorska funkcija“ se odnosi na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, koje se razlikuju od izotipa do izotipa. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju vezivanje C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), vezivanje Fc receptora, citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnu od antitela (ADCC), ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), sekreciju citokina, unos antigena posredovan imunim kompleksom od strane ćelija koje predstavljaju antigen, regulaciju receptora na površini ćelije (npr. B-ćelijski receptori) i aktivaciju B-ćelija.

[0120] Termin „efektorska ćelija“ se odnosi na leukocit koji eksprimira jedan ili više FcR i obavlja efektorske funkcije. U jednom aspektu, navedene efektorske ćelije eksprimiraju barem FcγRIII i obavljaju ADCC efektorske funkcije. Primeri humanih leukocita koji posreduju ADCC uključuju periferne mononuklearne ćelije krvi (PBMC), prirodne ćelije ubice (NK), monocite, citotoksične T ćelije i neutrofile. Efektorske ćelije se mogu izolovati iz prirodnih izvora, na primer, krvi. Efektorske ćelije su obično limfociti povezani sa efektorskom fazom i funkcionišu tako da proizvode citokine (T ćelije pomoćnici), ubijaju ćelije inficirane patogenima (citotoksične T ćelije) ili luče antitela (diferencirane B ćelije).

[0122] „Imune ćelije“ uključuju ćelije koje imaju hematopoetsko poreklo i igraju ulogu u imunom odgovoru. Imune ćelije uključuju: limfocite, kao što su B ćelije i T ćelije; prirodne ćelije ubice; i mijeloidne ćelije, kao što su monociti, makrofagi, eozinofili, mastociti, bazofili i granulociti.

[0124] „Citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela“ ili „ADCC“ se odnosi na oblik citotoksičnosti u kojem sekretovani Ig vezuje Fcγ receptore predstavljene na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. NK ćelije, neutrofili i makrofagi) omogućava ovim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vežu za ciljne ćelije koje nose antigene i naknadno ubijaju navedene ciljne ćelije koristeći, na primer, citotoksin. Da bi se procenila ADCC aktivnost ciljnog antitela, mogu se izvesti in vitro ADCC testovi, kao što su in vitro ADCC testovi dokumentovani u američkom patentu br.5,500,362 ili 5,821,337 ili američkom patentu br. 6,737,056 (Presta). Korisne efektorske ćelije za upotrebu u takvim testovima uključuju PBMC i NK ćelije.

[0125] „Citotoksičnost zavisna od komplementa“ ili

se odnosi na lizu ciljnih ćelija u prisustvu komplementa. Klasični put za aktivaciju komplementa započinje vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) za antitelo (odgovarajuće potklase) koje se vezuje za svoj odgovarajući antigen. Da bi se procenila aktivacija komplementa, može se izvesti CDC test, kao što je CDC test naveden u Gazzano-Santoro et al., J. Immunol Methods 202: 163 (1996). Na primer, u američkom patentu br. 6,194,551 B1 i WO1999/51642, opisane su varijante polipeptida sa izmenjenim aminokiselinskim sekvencama Fc regiona (polipeptidi sa varijantnim Fc regionom) i varijante polipeptida sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem C1q.

[0127] „Humane endotelne ćelije pupčane vene (HUVEC)“ su izolovane iz vena pupčane vrpce i generalno se koriste za fiziološke i farmakološke studije, npr. za transport makromolekula, koagulaciju krvi, angiogenezu i fibrinolizu. Posebno, mogu se koristiti kao model za istraživanja u pogledu angiogeneze i drugih studija u vezi sa signalnim putem zavisnim od VEGF (povezani endotelni faktori rasta).

[0129] Sekvenca aminokiselina antitela iz predmetnog pronalaska

[0131] Ovo otkriće je koristilo rekombinantni humani VEGF165 protein za imunizaciju zeca, a zatim su dobijeni klonovi antitela VEGF165-R988 koji se specifično vezuju za rekombinantni humani VEGF165 protein, metodom skrininga biblioteke za prikaz faga. Nukleotidna sekvenca koja kodira varijabilne regione teškog i lakog lanca VEGF165-R988 scFv antitela je zatim umetnuta putem PCR u pSTEP2 vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region teškog lanca zečjeg IgG1 ili konstantni region lakog lanca zečje kape, i kultivisana radi ekspresije. Antitela visoke čistoće su pročišćena korišćenjem protein A kolone za pročišćavanje. ELISA test je pokazao da zečje antitelo VEGF165-R988 može efikasno da inhibira vezivanje VEGF165 proteina za VEGFR2 protein, i VEGF 165-R988 može efikasno da neutrališe sposobnost VEGF165 da promoviše proliferaciju HUVEC.

[0133] [0051] Zatim, korišćenjem klasične metode za humanizovanu CDR transplantaciju, humanizovani varijabilni region lakog lanca ili teškog lanca čija je sekvenca bliža sekvenci varijabilnog regiona zečjeg lakog lanca ili teškog lanca, odabran je kao šablon, a sekvence humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i varijabilnog regiona teškog lanca (VH) dobijene su umetanjem svakog od tri CDR (tabela 1) zečjeg antitela lakog ili teškog lanca u varijabilne regione navedenog humanog antitela. Pošto su ključna mesta zečjeg regiona okvira od suštinskog značaja za održavanje stabilnosti CDR aktivnosti, ključna mesta su reverzno mutirana na odgovarajuću sekvencu zečjeg antitela. VEGF-H988-10 ekspresioni vektor lakog lanca/teškog lanca dobijen je sintezom celog gena, transfektovan u HEK-293 ćelije i kultivisan radi ekspresije, a supernatant kulture je pročišćen korišćenjem protein A kolone za pročišćavanje kako bi se dobila antitela VEGF-H988-10 visoke čistoće. Da bi se poboljšao afinitet VEGF-H988-10 antitela, konstruisane su SDM biblioteke CDR regiona varijabilnih regiona teškog i lakog lanca (uključujući LCDR1, LCDR3, HCDR2 i HCDR3). Gore navedene četiri mutantne biblioteke su konstruisane u scFv obliku i klonirane su u fagni vektor kao scFvgIII fuzioni protein; za svaki CDR, klonovi CDR koji imaju optimalnu sposobnost vezivanja za rastvorljivi antigen VEGF su skriningovani, i na kraju je dobijen VEGF-H988 Fab fragment antitela sa optimizovanim CDR afinitetom i stabilnošću.

[0135] U poređenju sa antitelom pune dužine, antitela u obliku Fab fragmenata imaju jaču probojnost i manje su toksična u smislu perforacije gastrointestinalnog trakta, hipertenzije i krvarenja, i ne stimulišu reakciju kaskade komplementa, čime se smanjuje rizik od endoftalmitisa i autoimunih inflamatornih reakcija.

[0137] Nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska

[0139] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na molekule nukleinske kiseline koje kodiraju Fab fragment antitela iz predmetnog pronalaska. Sekvence molekula nukleinske kiseline uključuju, ali nisu ograničene na, SEQ ID NO: 2-3, 4-7, 16-17, 20-21, 41-49 i 52-53.

[0141] [0054] Molekuli nukleinske kiseline nisu ograničeni na sekvence ovde navedene, već uključuju i njihove varijante. Varijante se mogu opisati s obzirom na njihova fizička svojstva u hibridizaciji. Stručnjacima u relevantnoj oblasti biće poznato da se, korišćenjem tehnika hibridizacije nukleinske kiseline, nukleinske kiseline mogu koristiti za identifikaciju njihovih komplemenata, kao i njihovih ekvivalenata ili homologa. Takođe će biti jasno da se hibridizacija može javiti sa manje od 100% komplementarnosti. Međutim, s obzirom na odgovarajući izbor uslova, tehnike hibridizacije se mogu koristiti za razlikovanje navedenih DNK sekvenci na osnovu strukturne relevantnosti DNK sekvence za određenu sondu. Za smernice o takvim uslovima videti Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 i Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., &Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons.

[0143] Rekombinantni vektori i ekspresija

[0145] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje rekombinantne konstrukte koji se sastoje od jedne ili više nukleotidnih sekvenci iz predmetnog pronalaska. Rekombinantni konstrukt iz predmetnog pronalaska je izgrađen umetanjem molekula nukleinske kiseline koji kodira antitelo iz predmetnog pronalaska u vektor kao što je plazmid, fagemid, fag ili viralni vektor.

[0147] Ovde navedena antitela mogu se pripremiti rekombinantnom ekspresijom nukleotidnih sekvenci koje kodiraju lake i teške lance ili njihove delove u ćeliji domaćinu. Da bi se rekombinantno eksprimiralo antitelo, ćelija domaćina može biti transfektovana sa jednim ili više rekombinantnih ekspresionih vektora koji nose nukleotidne sekvence koje kodiraju lake i/ili teške lance ili njihove delove, tako da se navedeni laki i teški lanci eksprimiraju u navedenoj ćeliji domaćinu. Standardne metodologije rekombinantne DNK se koriste za pripremu i/ili dobijanje nukleinskih kiselina koje kodiraju teške i lake lance, za inkorporiranje ovih nukleinskih kiselina u rekombinantne ekspresione vektore i za uvođenje navedenih vektora u ćelije domaćine, npr. Sambrook, Fritsch i Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y, (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) i one dokumentovane u američkom patentu br.4,816,397 autora Boss et al.

[0149] Pogodne ćelije domaćini su prokariotske i eukariotske ćelije. Primeri prokariotskih ćelija domaćina su bakterije, a primeri eukariotskih ćelija domaćina su kvasac, ćelije insekata ili sisara. Treba razumeti da je dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatorne sekvence, određen nizom faktora, kao što su izbor ćelije domaćina, nivo ekspresije željenog proteina i da li je ekspresija konstitutivna ili induktivna.

[0151] Bakterijska ekspresija

[0153] [0058] Umetanjem strukturne DNK sekvence koja kodira željeno antitelo zajedno sa odgovarajućim signalima za početak i prekid translacije i funkcionalnim promoterima u operativni okvir čitanja, konstruiše se ekspresioni vektor za upotrebu u bakterijama. Vektor će sadržati jedan ili više markera za fenotipsku selekciju i poreklo replikacije kako bi se obezbedilo održavanje vektora i omogućila amplifikacija u domaćinu po potrebi. Pogodni prokariotski domaćini za transformaciju uključuju višestruke vrste E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, kao i Pseudomonas, Streptomyces i Staphylococcus.

[0155] Bakterijski vektor može biti, na primer, baziran na fagu, plazmidu ili fagemidu. Ovi vektori mogu sadržati markere selekcije i bakterijska porekla replikacije, koji su izvedeni iz komercijalno dostupnih plazmida koji obično sadrže elemente dobro poznatog vektora za kloniranje pBR322 (ATCC 37017). Nakon transformacije odgovarajućeg soja domaćina i uzgajanja soja domaćina do odgovarajuće ćelijske gustine, odabrani promotor se derepresuje/indukuje odgovarajućom metodom (na primer, promenom temperature ili hemijskom indukcijom), a ćelije se kultivišu dodatno vreme. Ćelije se obično prikupljaju centrifugiranjem, razbijaju fizičkim ili hemijskim metodama, a dobijeni sirovi ekstrakt se zadržava za dalje pročišćavanje.

[0157] U bakterijskom sistemu, raznovrsni ekspresioni vektori mogu se povoljno odabrati u skladu sa namenjenom upotrebom eksprimovanog proteina. Na primer, kada se veliki broj takvih proteina treba proizvesti za proizvodnju antitela ili za skrining peptidne biblioteke, na primer, može biti potreban vektor koji usmerava ekspresiju fuzionog proteinskog proizvoda na visokom nivou radi lakog pročišćavanja.

[0159] Ekspresija i pročišćavanje kod sisara

[0161] [0061] Preferirane regulatorne sekvence za ekspresiju u ćelijama domaćina sisara uključuju viralne elemente koji usmeravaju ekspresiju proteina na visokom nivou u ćelijama sisara, kao što su promoteri i/ili pojačivači izvedeni iz citomegalovirusa (CMV) (npr. CMV promotor/pojačivač), promoteri i/ili pojačivači simian virusa 40 (SV40) (npr. SV40 promotor/pojačivač), promoteri i/ili pojačivači adenovirusa (npr. adenovirusni glavni kasni promotor (AdMLP)) i promoteri i/ili pojačivači polioma virusa. Za dalji opis virusnih regulatornih elemenata i njihovih sekvenci, videti, na primer, američki patent br. 5,168,062 autora Stinski, američki patent br.4,510,245 autora Bell et al. i američki patent br.4,968,615 autora Schaffner et al. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe može da uključuje poreklo replikacije i marker selekcije (videti, na primer, američki patent br.4,399,216, američki patent br. 4,634,665 i američki patent br. 5,179,017 autora Axel et al). Pogodni markeri selekcije uključuju gene koji daju otpornost na lekove kao što su G418, higromicin ili metotreksat ćelijama domaćinima u koje je vektor uveden. Na primer, gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) daje otpornost na metotreksat, dok gen neo daje otpornost na G418.

[0163] Transfekcija ekspresionog vektora u ćelije domaćine može se izvršiti korišćenjem standardnih tehnika kao što su elektroporacija, taloženje kalcijum fosfata i DEAE-dekstran transfekcija.

[0165] Pogodne ćelije domaćina sisara za ekspresiju ovde navedenih antitela uključuju CHO ćelije (ćelije jajnika kineskog hrčka) [uključujući dhfr-CHO ćelije, kao što je opisano u Urlaub i Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, gde se koriste DHFR selekcioni markeri, kako je opisano, na primer, u R.J. Kaufman i P.A. Sharp (1982) Mol. Biol.159:601-621], NSO mijelomske ćelije, COS ćelije i SP2 ćelije.

[0167] Antitela iz predmetnog pronalaska mogu se oporaviti i pročistiti iz rekombinantne ćelijske kulture poznatim metodama, uključujući ali ne ograničavajući se na, taloženje amonijum sulfatom ili etanolom, ekstrakciju kiselinom, hromatografiju afiniteta protein A, hromatografiju afiniteta protein G, hromatografiju anjonske ili katjonske razmene, fosfoceluloznu hromatografiju, hromatografiju hidrofobne interakcije, hromatografiju afiniteta, hidroksiapatitnu hromatografiju i lektinsku hromatografiju. Tečna hromatografija visokih performansi („HPLC“) takođe se može koristiti za pročišćavanje. Vodeti, na primer, Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), na primer, poglavlja 1, 4, 6, 8, 9 i 10, od kojih je svako ovde inkorporirano referencom u celini.

[0169] Karakteristike i funkcije antitela iz predmetnog pronalaska

[0171] Izvršena je analiza karakteristika i analiza funkcije humanizovanog antitela VEGF-H988 Fab iz predmetnog pronalaska. Analize su pokazale da antitelo iz predmetnog pronalaska ima sledeće prednosti:

[0173] (1) Sposobnost vezivanja VEGF-H988 Fab za VEGF165 protein je slična onoj kod Lucentisa;

[0174] (2) Afinitet vezivanja VEGF-H988 Fab za VEGF165 protein je bolji od onog kod Lucentisa; što je oko 3,75 puta veći od Lucentisa;

[0176] (3) VEGF165-H988 Fab se specifično vezuje za rekombinantni humani VEGF165 protein i nema unakrsno vezivanje sa rekombinantnim mišjim mVEGF 164 proteinom;

[0178] (4) VEGF165-H988 Fab može efikasno da inhibira vezivanje VEGFR2 proteina za VEGF165 protein, a njegova inhibitorna sposobnost je izrazito bolja od Lucentisa;

[0180] (5) Neutrališuća aktivnost VEGF-H988 Fab je jača od Lucentisa pri različitim koncentracijama rekombinantnog humanog VEGF 165; njegova neutrališuća aktivnost je jača od EYLEA pri visokim koncentracijama VEGF 165; njegova neutrališuća aktivnost je jača od Bevacizumaba i Brolucizumaba pri različitim koncentracijama VEGF 165, ali uporediva sa aktivnošću Conbercepta.

[0182] Upotrebe

[0184] Antitela iz ovog pronalaska mogu se koristiti za lečenje bolesti povezanih sa angiogenezom, uključujući očne bolesti koje karakteriše horoidalna neovaskularizacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na pojavu makularne degeneracije povezane sa starenjem (AMD), dijabetičnog makularnog edema (DME), edema mrežnjače, degenerativne miopije i horoidalne neovaskularizacije (CNV).

[0186] Farmaceutske kompozicije

[0188] Antitela iz predmetnog pronalaska mogu se pripremiti sa najmanje jednim drugim agensom (npr. stabilnim jedinjenjem) kako bi se formirale farmaceutske kompozicije koje se sastoje od antitela iz predmetnog pronalaska i jednog ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razređivača ili ekscipijenasa. Opciono, farmaceutske kompozicije mogu da sadrže dodatne terapeutske agense.

[0190] Kompleti

[0191] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutsko pakovanje i komplet koji se sastoje od jedne ili više posuda, pri čemu navedene posude sadrže gore navedene farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska. Uz takve posude mogu da budu specifikacije u obliku propisanom od strane državne agencije koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili distribuciju leka ili biološkog proizvoda, koje odražavaju odobrenje za primenu na ljudima od strane agencije u kojoj se navedeni proizvod proizvodi, koristi ili distribuira.

[0193] Priprema i skladištenje

[0195] Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska mogu se pripremiti na način poznat u struci, na primer konvencionalnim metodama mešanja, rastvaranja, granulacije, pripreme pastila, mlevenja, emulzifikacije, inkapsulacije, ugradnje ili liofilizacije.

[0197] Nakon što su već pripremljene farmaceutske kompozicije koje se sastoje od jedinjenja iz predmetnog pronalaska formulisane u prihvatljivom nosaču, mogu se staviti u odgovarajuće posude i označiti za lečenje naznačenog stanja. Takvo označavanje bi uključivalo količinu, učestalost i puteve primene leka.

[0199] Kombinacije

[0201] Farmaceutske kompozicije koje se sastoje od antitela iz predmetnog pronalaska opisanih gore takođe se kombinuju sa jednim ili više drugih terapeutskih agenasa, kao što su antineoplastični agensi, pri čemu rezultujuća kombinacija ne uzrokuje neprihvatljive neželjene efekte.

[0203] Sledeći primeri olakšavaju bolje razumevanje predmetnog pronalaska, ali nemaju nameru da ograniče predmetni pronalazak. Eksperimentalne metode u sledećim primerima, osim ako nije drugačije naznačeno, sve su konvencionalne metode. Eksperimentalni materijali korišćeni u sledećim primerima, osim ako nije drugačije naznačeno, kupljeni su od konvencionalnih distributera biohemijskih reagenasa.

[0205] PRIMERI

[0206] Primer 1: Skrining zečjih antitela koja blokiraju vezivanje VEGF165 za VEGFR2 korišćenjem biblioteke antitela za prikaz faga

[0208] 1.1 Imunizacija zečeva

[0210] Rekombinantni humani VEGF165 protein (Sino Biological, Inc, Cat. 11066-HNAH) korišćen je za imunizaciju zečeva. Sekvenca aminokiselina ekstracelularnog regiona Met1-Arg191 humanog VEGF165 proteina (UniProt P15692-4) je SEQ ID NO: 1.

[0212] Detaljna metoda je bila: Rekombinantni humani VEGF165 protein je pomešan sa Frojndovim adjuvansom, zečevi su potkožno imunizovani mešavinom 4 puta u intervalima od 3 nedelje, 2 nedelje i 2 nedelje respektivno, u dozi od 500 µg svaki put. Od četvrte imunizacije, krv je sakupljana 4 dana nakon imunizacije putem medijalnog kantusnog pleksusa oka. Titar seruma zečjeg anti-VEGF165 je izmeren ELISA testom korišćenjem obloženog rekombinantnog humanog VEGF 165 proteina. Titar seruma iz pete imunizacije dostigao je 1:250000, a zečevi su pojačano tretirani intravenski sa 25 µg rekombinantnog humanog VEGF 165 proteina 9 nedelja nakon pete imunizacije. 7 dana kasnije, miševi su usmrćeni i tkivo slezine je uklonjeno i zamrznuto u tečnom azotu.

[0214] 1.2 Skrining biblioteke antitela za prikaz faga

[0216] RNK je ekstrahovana iz tkiva zečje slezine korišćenjem TriPure Isolation reagensa (Roche, kat. br. 11 667 165 001), a cDNK su dobijene reverznom transkripcijom RNK korišćenjem kompleta za reverznu transkripciju (Invitrogen kat. br. 18080-051). 10 parova prajmera je dizajnirano da pojača sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca zečjeg antitela i 4 para prajmera su dizajnirana da pojačaju sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (Barbas C F et al., CSHL Press.2004). Sekvence koje kodiraju varijabilne regione lakog i teškog lanca zečjeg antitela sastavljene su u nukleotidnu sekvencu koja kodira scFv PCR metodom sa preklapajućom ekstenzijom, pri čemu su varijabilni regioni lakog i teškog lanca povezani (Jones S T et al., Bio/technology. 1991; 9(1): 88) sledećim linkerom:

[0217] Zatim su enzimski ligirane u fagni vektor pComb3x (Sino Biological, Inc.) pomoću restrikcione endonukleaze Sfi I (Fermentas), i elektrotransformisane su u X-Blue kompetentne ćelije kako bi se konstruisala zečja scFv biblioteka antitela za prikaz faga. Rekombinantni humani VEGF165 protein je nanet na ELISA ploču, a biblioteka faga obogaćena anti-VEGF165 pozitivnim antitelima je skriningovana prema procesu sortiranja fagnih antitela (O'Brien, PM, & Aitken, R. (Eds.), Springer Science & Business Media. 2002; ISBN: 9780896037113). Pojedinačne kolonije faga odabrane su iz obogaćene biblioteke radi ekspresije, a njihovo vezivanje za rekombinantni humani VEGF165 protein detektovano je ELISA testom. Klon antitela koji se specifično vezuje za rekombinantni humani VEGF165 je odabran i poslat kompaniji za sekvenciranje radi dobijanja nukleotidne sekvence (SEQ ID NO: 3) VEGF165-R988 scFv antitela.

[0219] 1.3 Proizvodnja zečjih antitela koja ciljaju VEGF165

[0221] Nukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region teškog lanca VEGF165-R988 scFv antitela je PCR amplifikovana i umetnuta u pSTEP2 vektor digestovan enzimima Sca I Kpn I (Fermentas), koji sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju signalni peptid teškog lanca (SEQ ID NO: 43) i konstantni region teškog lanca zečjeg IgG1 (SEQ ID NO: 6) pomoću infusion metode, čime je dobijen ekspresioni vektor teškog lanca (SEQ ID NO: 52). Nukleotidna sekvenca koja kodira varijabilni region lakog lanca VEGF 165-R988 scFv antitela je PCR amplifikovana i umetnuta u pSTEP2 vektor digestovan enzimima Sca I BamH I (Fermentas), koji sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju signalni peptid lakog lanca (SEQ ID NO: 44) i konstantni region kappa lakog lanca kod zeca (SEQ ID NO: 7) pomoću in-fusion metode, čime je dobijen ekspresioni vektor lakog lanca (SEQ ID NO: 53). Rekombinantni plazmidi su ekstrahovani, i transfektovani u HEK-293 ćelije i kultivisani radi ekspresije 7 dana, a supernatant kulture je pročišćen protein A kolonom za pročišćavanje kako bi se dobila antitela visoke čistoće.

[0223] Prajmeri za amplifikaciju varijabilnog regiona teškog lanca:

[0226]

[0227] Prajmeri za amplifikaciju varijabilnog regiona lakog lanca:

[0230]

[0233] 1.4 Analiza funkcije zečjih antitela koja ciljaju VEGF165

[0235] 1.4.1 Zečje antitelo blokira vezivanje VEGF165 za VEGFR2-his

[0237] VEGF165 protein (SinoBiological, Inc.) u koncentraciji od 1 µg/mL je nanet na ploču sa 96 bunarčića u količini od 100 µL/bunarčić preko noći na 4°C. Ploča je oprana sledećeg dana i blokirana na sobnoj temperaturi 1 sat. 100 µL 5 µg/mL VEGFR2-biotin proteina (SinoBiological, Inc.) i antitela VEGF-R988 u različitim koncentracijama su dodati i koinkubirani. Ploča je oprana kako bi se uklonila nevezana antitela, inkubirana sa Streptavidin/HRP (Beijing ZSGB-Bio Co., Ltd.) i zatim ponovljeno oprana, a rastvor hromogenog supstrata je dodat za razvoj boje. OD<450>je izmeren nakon što je razvoj boje završen. Uzimajući koncentraciju zečjeg antitela koje cilja VEGF 165 kao horizontalnu koordinatu i stopu inhibicije PI% kao vertikalnu koordinatu, softver graphPad Prism 6.0 je korišćen za analizu podataka i generisanje grafikona krive. Stopa inhibicije (%) = (OD<blank>-OD<sample>)/ OD<blank>× 100%, gde OD<blank>označava OD vrednost bunarčića sa dodatim samo VEGFR2-biotinom ali bez zečjeg antitela, a OD<sample>označava OD vrednost bunarčića sa dodatim i VEGFR2-biotinom i zečjim antitelima.

[0239] Kao što je prikazano na slici 1, antitelo VEGF-R988 može efikasno da se veže za obloženi VEGF165 protein, i inhibira vezivanje VEGFR165 proteina za VEGFR2 protein.

[0241] 1.4.2 Zečje antitelo inhibira efekat proliferacije HUVEC indukovan VEGF165

[0243] Efekat navedenog zečjeg antitela koje neutrališe proliferaciju endotelnih ćelija pupčane vene indukovanu VEGF 165 je detektovan korišćenjem WST-8 metode. Humane endotelne ćelije pupčane vene HUVEC su inokulisane na ploču sa 96 bunarčića u količini od 4×10<3>ćelija/bunarčić, kultivisane u M199 medijumu koji sadrži 10% FBS i 5% L-Gln tokom 4 sata,

[0244] Tabela 1: CDR sekvence VEGF-R988 lakog i teškog lanca

[0247]

[0250] 2.2 Humanizacija zečjeg antitela VEGF-R988 transplantacijom CDR

[0252] Humanizacija zečjeg antitela je izvršena korišćenjem klasične metode humanizacije transplantacijom CDR. Varijabilni region humanog antitela lakog ili teškog lanca, čija je sekvenca bliža sekvenci varijabilnog regiona zečjeg lakog ili teškog lanca, odabran je kao šablon, i svaki od tri CDR (tabela 1) iz zečjeg lakog ili teškog lanca je umetnut u varijabilne regione humanog antitela kako bi se dobile sekvence humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca (VL) ili varijabilnog regiona teškog lanca (VH) respektivno. Humani šablon za varijabilni region lakog lanca VEGF-R988 je IGKV1-27*01, koji je 65,30% homologan lakom lancu VEGF-R988, a humani šablon za varijabilni region teškog lanca je IGHV4-4*08, koji je 53,20% homologan teškom lancu VEGF-R988.

[0254] 2.3 Reverzne mutacije u okvirnom regionu humanizovanog varijabilnog regiona

[0256] [0087] Budući da su neke ključne aminokiseline u okvirnom regionu izvedenom od zeca od suštinskog značaja za održavanje CDR aktivnosti, ključne aminokiseline su reverzno mutirane na odgovarajuće aminokiselinske sekvence zečjeg antitela, sledeća mesta su reverzno mutirana: u lakom lancu, pozicija 1 je reverzno mutirana u E, pozicija 2 je reverzno mutirana u L, pozicija 4 je reverzno mutirana u L, i pozicija 63 je reverzno mutirana u K; dok su u teškom lancu, pozicija 3 je reverzno mutirana u V, pozicija 37 je reverzno mutirana u V, pozicija 47 je reverzno mutirana u Y, pozicija 78 je reverzno mutirana u V, pozicija 79 je reverzno mutirana u D, i pozicija 91 je reverzno mutirana u F; sva gore navedena mesta su numerisana pozivajući se na Kabat šemu numeracije. Humanizovano antitelo VEGF-H988-10 je dobijeno CDR humanizovanom transplantacijom i reverznim mutacijama okvirnog regiona.

[0258] 2.4 Proizvodnja humanizovanog monoklonskog antitela VEGF-H988-10 i modifikacija afiniteta CDR

[0260] VEGF-H988-10 varijabilni region teškog lanca (SEQ ID NO: 20) dobijen je metodom sinteze celog gena, a zatim je umetnut, pomoću in-fusion metode, i umetnuta u pSTEP2 vektor digestovan enzimima Sca I Nhe I (Fermentas), koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira signalni peptid teškog lanca (SEQ ID NO: 43) i nukleotidnu sekvencu koja kodira humani IgG1 konstantni region (SEQ ID NO: 47), kako bi se dobio ekspresioni vektor VEGF-H988-10 teškog lanca (SEQ ID NO: 16). VEGF-H988-10 varijabilni region lakog lanca (SEQ ID NO: 21) dobijen je metodom sinteze celog gena, a zatim je umetnut, pomoću in-fusion metode, i umetnuta u pSTEP2 vektor digestovan enzimima Sca I BsiW I (Fermentas), koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira signalni peptid lakog lanca (SEQ ID NO: 44) i nukleotidnu sekvencu koja kodira humani kappa konstantni region (SEQ ID NO: 48), kako bi se dobio ekspresioni vektor VEGF-H988-10 lakog lanca (SEQ ID NO: 17). Plazmidi su ekstrahovani i transfektovani u HEK-293 ćelije, ćelije su kultivisane 7 dana. Supernatant kulture je pročišćen protein A kolonom za pročišćavanje kako bi se dobila antitela visoke čistoće.

[0262] Prajmeri za sintezu celog gena varijabilnog regiona teškog lanca

[0264]

[0266]

[0267]

[0269] Prajmeri za sintezu celog gena varijabilnog regiona lakog lanca

[0270]

[0271]

[0272]

[0275] Da bi se poboljšao afinitet VEGF-H988-10, konstruisane su SDM biblioteke CDR regiona varijabilnih regiona teškog i lakog lanca (uključujući tri biblioteke zasićenih mutacija LCDR1, LCDR3, i HCDR2); U isto vreme, da bi se poboljšala hemijska stabilnost antitela, aminokiselinski ostaci sposobni da prođu deaminaciju ili izomerizaciju treba da budu modifikovani u drugi aminokiselinski ostatak. Deaminacija asparagina se može javiti, na primer, u NG, NS, NA, NT, itd., što dovodi do generisanja izoaspartičnih ostataka, što utiče na stabilnost ili biološku funkciju antitela. Varijabilni region VEGF-H988 HCDR3 ima mesto podložno deaminaciji, pa su konstruisane SDM biblioteke kako bi se poboljšala hemijska stabilnost i biološka funkcija antitela. Gore navedene četiri mutantne biblioteke su konstruisane u scFv obliku i klonirane su u fagni vektor kao scFv-gIII fuzioni protein; za svaki CDR, klonovi CDR koji imaju optimalnu sposobnost vezivanja za rastvorljivi antigen VEGF su skriningovani, i na kraju je dobijeno antitelo VEGF-H988 sa optimizovanim CDR afinitetom i stabilnošću. Sekvence VEGF-H988 CDR lakog i teškog lanca su prikazane u tabeli 2.

[0277] Tabela 2: CDR sekvence VEGF-H988 lakog i teškog lanca

[0280]

[0281]

[0284] 2.5 Proizvodnja humanizovanih VEGF-H988 Fab fragmenata

[0286] Nukleotidna sekvenca (SEQ ID NO: 42) koja kodira gore navedeni VEGF-H988 Fab laki lanac i signalni peptid, koji sadrži sledeće nukleotidne sekvence koje kodiraju signalni peptid lakog lanca (SEQ ID NO: 44), humanizovani varijabilni region lakog lanca antitela (SEQ ID NO: 46) i humani kappa konstantni region lakog lanca antitela (SEQ ID NO: 48) povezane u nizu, je PCR amplifikovana i umetnuta u samorazvijeni pGS vektor (Kpn I Xba I) pomoću in-fusion metode, a ispravni plazmidi verifikovani su sekvenciranjem. Nukleotidna sekvenca (SEQ ID NO: 41) koja kodira VEGF-H988 Fab teški lanac i signalni peptid, koji sadrži sledeće nukleotidne sekvence koje kodiraju signalni peptid teškog lanca (SEQ ID NO: 43), humanizovani varijabilni region teškog lanca antitela (SEQ ID NO: 45) i humani IgG1 konstantni region teškog lanca (SEQ ID NO: 49) povezane u nizu, je PCR amplifikovana i umetnuta u pGS vektor (Nhe I+Not I), koji je prethodno verifikovan da sadrži ispravan laki lanac, pomoću in-fusion metode, a ispravni vektori koji eksprimiraju i laki i teški lanac VEGF-R988 Fab verifikovani su sekvenciranjem. Ovi ekspresioni vektori su eukariotski ekspresioni vektori koji sadrže GS gene kao selekcioni marker i ekspresione elemente lakog i teškog lanca antitela. Ovi ekspresioni vektori su transfektovani u CHO-K1-GS-deficijentne ćelije i VEGF-H988 Fab ćelijske linije visoke ekspresije su dobijene MSX skriningom. Klonovi sa visokom ekspresijom antitela su odabrani ELISA testom, a ćelijske linije visoke ekspresije su odabrane uzimajući u obzir i status rasta ćelija i ključne karakteristike kvaliteta za lekove sa antitelima. Kultura bez seruma u suspenziji korišćena je za kultivaciju CHO ćelijske linije koja proizvodi VEGF-H988 Fab kako bi se dobili VEGF-H988 Fab fragmenti visoke čistoće i kvaliteta.

[0288] Primer 3: Analiza karakteristika humanizovanih VEGF-H988 Fab fragmenata

[0290] 3.1 Analiza karakteristika vezivanja VEGF-H988 Fab fragmenata za VEGF165

[0292] 3.1.1 VEGF-H988 Fab fragmenti se specifično vezuju za VEGF165

[0293] Rekombinantni humani VEGF165 protein (SinoBiological, Inc.) u različitim koncentracijama (0,15 ng/mL, 0,46 ng/mL, 1,37 ng/mL, 4,12 ng/mL, 12,35 ng/mL, 37,04 ng/mL, 111,11 ng/mL, 333,33 ng/mL, 1000 ng/mL i 3000 ng/mL) je nanet na ploču sa 96 bunarčića preko noći na 4°C u količini od 100 µL/bunarčić. Ploča je oprana sledećeg dana i blokirana na sobnoj temperaturi 1 sat. Nakon inkubacije sa 100 µL 1 µg/mL VEGF165-H988 Fab fragmenata, Lucentisa (Norvatis) ili negativne kontrole H7N9-R1 Fab fragmenata (Sino Biological, Inc.) respektivno, ploča je oprana kako bi se uklonila nevezana antitela, zatim je inkubirana sa kozjim F(ab')2 anti-humanim IgG F(ab')2/HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) i ponovo višestruko oprana, a rastvor hromogenog supstrata je dodat za razvoj boje. OD<450>je izmeren nakon što je razvoj boje završen. Uzimajući koncentraciju rekombinantnog humanog VEGF165 proteina kao horizontalnu koordinatu i vrednost OD<450>kao vertikalnu koordinatu, softver graphPad Prism 6.0 je korišćen za prilagođavanje „S“ krive i analiziranje vezivanja fragmenata antitela za rekombinantni humani VEGF 165 protein.

[0295] Rezultati prikazani na slici 3 demonstriraju da je EC<50>vrednost humanizovanih VEGF165-H988 Fab fragmenata koji se specifično vezuju za rekombinantni humani VEGF 165 18,75 ng/mL, R<2>= 0,993; EC<50>vrednost Lucentisovog vezivanja za rekombinantni humani VEGF165 je 12,87 ng/mL, R<2>= 0,989. Ovo ukazuje da je sposobnost VEGF165-H988 Fab vezivanja za rekombinantni humani VEGF165 protein slična onoj kod Lucentisa. Negativna kontrola H7N9-R1 Fab fragmenti nemaju sposobnost vezivanja za rekombinantni humani VEGF 165 protein.

[0297] 3.1.2 Test afiniteta vezivanja VEGF-H988 Fab fragmenata za VEGF165 protein

[0299] Afiniteti VEGF165-H988 Fab fragmenata i Lucentisa su izmereni na više koncentracija korišćenjem streptavidinom obloženog senzora i imobilizovanog biotinom obeleženog VEGF165 proteina.

[0301] [0096] Rekombinantni humani VEGF165 protein je prvo obeležen biotinom u molarnom odnosu 1:2 na sledeći način: pufer rekombinantnog VEGF165 proteina (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0) je zamenjen sa PBS putem ultrafiltracije u 5000 MW ultrafiltracionoj centrifugalnoj epruveti, i dobijeno je 567,57 µg proteina kako je izmereno UV kvantifikacijom, a dobijeni proteini su pomešani sa 20 mM biotin rastvorom u molarnom odnosu 1:2 za inkubaciju tokom 30 min na sobnoj temperaturi u mraku, zatim ponovo filtrirani u 5000 MW ultrafiltracionoj centrifugalnoj epruveti kako bi se uklonio neobeleženi biotin. Nakon UV kvantifikacije, biotinom obeleženi proteini su dobijeni dodavanjem jednakog volumena glicerola i finalne koncentracije 0,1% BSA. Koncentracija VEGF165 proteina je bila 2,08 mg/mL, detektovano UV zračenjem.

[0303] Zatim su afiniteti VEGF165-H988 Fab fragmenata i Lucentisa u različitim koncentracijama za biotinilizovane rekombinantne humane VEGF165 proteine izmereni, a dobijene KD vrednosti su bile konačni afiniteti.

[0305] Rezultati prikazani u tabeli 3 demonstriraju da je vrednost afiniteta vezivanja KD VEGF-H988 Frab fragmenata sa rekombinantnim humanim VEGF165 proteinom bila 1,54E-10 (M), vrednost konstante vezivanja k<on>bila je 2,74E 05 (1/Ms), a vrednost konstante disocijacije k<dis>bila je 4,21E-05 (1/s); vrednost afiniteta vezivanja KD Lucentisa sa VEGF165 proteinom bila je 5,78E -11 (M), sa vrednošću konstante vezivanja k<on>od 5,36E+04 (1/Ms) i vrednošću konstante disocijacije k<dis>od 3,10E-05 (1/s), kao što je prikazano u tabeli 3. Rezultati su pokazali da je afinitet VEGF-H988 Fab fragmenata bio jači od afiniteta Lucentisa, što je bilo oko 3,75 puta jače od Lucentisa. Stoga, VEGF-H988 Fab fragmenti imaju jaču sposobnost vezivanja za VEGF165 protein od Lucentisa.

[0307] Tabela 3: Afiniteti vezivanja VEGF-H988-48-IgG1(Fab-N103G) i Lucentisa sa rekombinantnim proteinom VEGF165

[0310]

[0313] 3.1.3 Određivanje unakrsne reaktivnosti vrste VEGF 165-H988 Fab fragmenata

[0315] [0099] Rekombinantni humani VEGF165 proteini ili rekombinantni mišji mVEGF 164 proteini (Sino Biological., Inc.) su razblaženi na 0,1 µg/mL, 1 µg/mL i 10 µg/mL, respektivno, i naneti na ploču sa 96 bunarčića preko noći na 4°C u količini od 100 µL/bunarčić. Ploča je oprana sledećeg dana, blokirana na sobnoj temperaturi 1 sat.100 µL VEGF165-H988 Fab fragmenata, Lucentisa ili negativne kontrole H7N9-R-Fab je dodato respektivno u koncentraciji od 2 µg/mL i inkubirano 1 sat. Ploča je oprana kako bi se uklonila nevezana antitela. Ploča je inkubirana sa kozjim F(ab')2 anti-humanim IgG F(ab')2/HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) i zatim ponovo višestruko oprana, a rastvor hromogenog supstrata je dodat za razvoj boje. OD<450>je izmeren nakon što je razvoj boje završen. Uzimajući koncentraciju proteina kao horizontalnu koordinatu i vrednost OD<450>kao vertikalnu koordinatu, softver graphPad Prism 6.0 je korišćen za generisanje stubičastog grafikona.

[0317] Rezultati prikazani na slici 4 demonstriraju da se VEGF165-H988 Fab fragmenti specifično vezuju za rekombinantni humani VEGF165 protein i pokazuju unakrsno vezivanje sa rekombinantnim mišjim mVEGF 164 proteinom; dok Lucentis ne pokazuje unakrsno vezivanje sa rekombinantnim mišjim mVEGF164 proteinom.

[0319] 3.2 Svojstva blokiranja receptora VEGF-H988 Fab fragmenata

[0321] VEGF165 protein u koncentraciji od 1 µg/mL je nanet na ploču sa 96 bunarčića u količini od 100 µL/bunarčić preko noći na 4°C. Ploča je oprana sledećeg dana i blokirana na sobnoj temperaturi 1 sat. 100 µL 2 µg/mL VEGFR2-his proteina (SinoBiological, Inc.) je dodato u svaki bunarčić i različite koncentracije humanizovanih VEGF-H988 Fab fragmenata, Lucentisa ili negativne kontrole H7N9-R1-Fab (SinoBiological, Inc.) su dodate respektivno i ko-inkubirane. Ploča je oprana kako bi se uklonila nevezana antitela. Ploča je inkubirana sa C-his-R023/HRP i zatim pono višestruko oprana, a rastvor hromogenog supstrata je dodat za razvoj boje. OD<450>je izmeren nakon što je razvoj boje završen, sa svakom grupom testiranom u duplikatu. Uzimajući koncentraciju antitela kao horizontalnu koordinatu i stopu inhibicije PI% kao vertikalnu koordinatu, softver graphPad Prism 6.0 je korišćen za analizu podataka i generisanje grafikona krive za izračunavanje IC50 vrednosti. Stopa inhibicije (%) = (OD<blank>-OD<sample>)/ OD<blank>× 100%, gde OD<blank>označava vrednost bunarčića sa samo dodatim VEGFR2-his ali bez dodatog humanizovanog antitela, a OD<sample>označava OD vrednost bunarčića sa dodatim i VEGFR2-his i humanizovanim antitelima.

[0323] Kao što je prikazano na slici 5, VEGFR2 protein može efikasno da se veže za obloženi VEGF165 protein, i VEGF-H988 Fab fragmenti mogu efikasno da inhibiraju vezivanje VEGFR2 proteina za VEGFR165 protein, sa izrazito superiornom inhibitornom sposobnošću od Lucentisa, a negativna kontrola nije pokazala inhibitorni efekat.

[0324]

[0325] VEGF165 povećavala, VEGF-H988 Fab je održavao visoku maksimalnu stopu neutralizacije, dok su EYLEA i Avastin pokazali smanjenu aktivnost.

[0327] Tabela 4: EC<50>i maksimalna stopa neutralizacije VEGF-H988 Fab koji neutrališe VEGF-165

[0329]

[0330]

[0332] Lista sekvenci

[0333]

[0334]

[0335]

[0336]

[0337]

[0338]

[0339]

[0340]

[0341]

[0342]

[0343]

[0344]

[0345]

[0346]

[0347]

[0348]

[0349]

[0350]

[0351]

[0352]

[0353]

[0354]

[0355]

[0356]

[0357]

[0358]

[0359]

[0360]

Claims (12)

1. Patentni zahtevi

1. Izolovani Fab fragment anti-VEGF antitela, koji se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca sa sekvencom aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 36, i varijabilnog regiona lakog lanca sa sekvencom aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 37.

2. Fab fragment anti-VEGF antitela prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je konstantni region teškog lanca CH1 konstantni region teškog lanca IgG1 sa sekvencom aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 40; i/ili konstantni region lakog lanca je konstantni region lakog lanca sa sekvencom aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 39.

3. Fab fragment anti-VEGF antitela prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koji se dalje sastoji od

signalnog peptida teškog lanca i signalnog peptida lakog lanca, po mogućnosti navedeni signalni peptid teškog lanca je sekvenca aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 34, i/ili navedeni signalni peptid lakog lanca je sekvenca aminokiselina kao što je navedeno u SEQ ID NO: 35.

4. Konjugat antitelo-lek, koji se sastoji od Fab fragmenta anti-VEGF antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 i dodatnog terapeutskog agensa, po mogućnosti navedeni Fab fragment anti-VEGF antitela je povezan sa dodatnim terapeutskim agensom putem linkera.

5. Nukleinska kiselina koja kodira Fab fragment anti-VEGF antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3.

6. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 5, koja se sastoji od nukleotidne sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 45 i/ili nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 46; po mogućnosti, koja se dalje sastoji od nukleotidne sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 49 i/ili nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 48; još poželjnije, koja se sastoji od nukleotidne sekvence kao

što je navedeno u SEQ ID NO: 41 i/ili nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 42.

7. Ekspresioni vektor, koji se sastoji od nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 5 ili 6.

8. Ćelija domaćin koja se sastoji od nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 5 ili 6, ili ekspresionog vektora prema patentnom zahtevu 7.

9. Metod za proizvodnju Fab fragmenta anti-VEGF antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, koji se sastoji od kultivisanja ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 8 pod uslovima pogodnim za ekspresiju Fab fragmenta antitela, i prikupljanja izraženih Fab fragmenata antitela iz medijuma kulture.

10. Farmaceutska kompozicija, koja se sastoji od Fab fragmenta anti-VEGF antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, ili konjugata antitelo-lek prema patentnom zahtevu 4, ili nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 5 ili 6, ili ekspresionog vektora prema patentnom zahtevu 7, i farmaceutski prihvatljivog nosača.

11. Kompozicija koja se sastoji od Fab fragmenta anti-VEGF antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, ili konjugata antitelo-lek prema patentnom zahtevu 4, ili farmaceutske kompozicije prema patentnom zahtevu 10 za upotrebu u lečenju makularne degeneracije povezane sa starenjem (AMD), dijabetičnog makularnog edema (DME), edema mrežnjače, degenerativne miopije, horoidalne neovaskularizacije (CNV).

12. Komplet, koji se sastoji od Fab fragmenta anti-VEGF antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 ili konjugata antitelo-lek prema patentnom zahtevu 4 ili farmaceutske kompozicije prema patentnom zahtevu 10, po mogućnosti koji se dalje sastoji od uređaja za primenu.