RS67385B1 - Antitela koja se vezuju za citrulinisani histon 2a i/ili 4 - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] Oblast pronalaska

[0005] Pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove vezujuće fragmente usmerene protiv epitopa koji sadrže citrulin. Antitela ili njihovi vezujući fragmenti pronalaska mogu se koristiti u terapiji, na primer u lečenju ili prevenciji patologija povezanih sa neutrofilnom ekstracelularnom zamkom (NET -Neutrophil Extracellular Trap). Antitela ili njihovi vezujući fragmenti iz pronalaska mogu se koristiti u lečenju ili prevenciji patologija povezanih sa NET-om, kao što su sistemski eritematozni lupus (SLE), lupus, sepsa, vaskulitis, inflamatorni artritis, reumatoidni artritis i osteoartritis, psorijaza, Alchajmerova bolest, autoimuni hepatitis, juvenilni idiopatski artritis, Sjogrenova bolest, antifosfolipidni sindrom, Behčetova bolest, spondilitis, spondiloartropatija, multipla sistemska atrofija, Parkinsonova bolest, astma sa demencijom Levijevih tela, astma pogoršana alergijskim rinovirusom, alergijska astma, cistična fibroza, fibroza i idiopatska plućna fibroza, bolest suvog oka, uveitis, negranulomatozni uveitis, granulomatozni uveitis, dermatitis, atopijski dermatitis, HOBP, bronhitis ili druge patologije povezane sa NET-om, kao što su zarastanje rana kod dijabetesa, kancera, metastaze kancera i zdravlje transplantiranih organa in vivo ili ex vivo. Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije i postupke za lečenje ili sprečavanje patologija povezanih sa NET-om kao što su SLE, lupus, sepsa, vaskulitis, inflamatorni artritis, reumatoidni artritis i osteoartritis, psorijaza, Alchajmerova bolest, autoimuni hepatitis, juvenilni idiopatski artritis, Sjorgrenova bolest, antifosfolipidni sindrom, Behčetova bolest, spondilitis, spondiloartropatija, multipla sistemska atrofija, Parkinsonova bolest, astma sa demencijom Levijevih tela, astma pogoršana alergijskim rinovirusom, alergijska astma, cistična fibroza, fibroza i idiopatska plućna fibroza, bolest suvog oka, uveitis, negranulomatozni uveitis, granulomatozni uveitis, dermatitis, atopijski dermatitis, HOBP, bronhitis ili druge patologije povezane sa NET-om, kao što su zarastanje rana kod dijabetesa, kancera, metastaze kancera i zdravlje transplantiranih organa in vivo ili ex vivo.

[0007] Stanje tehnike pronalaska

[0009] Inflamatorna stanja, bilo hronične ili akutne prirode, predstavljaju značajan problem u zdravstvenoj industriji. Ukratko, hronična upala se smatra upalom dužeg trajanja (nedelje ili meseci) u kojoj se aktivna upala, uništavanje tkiva i pokušaji zarastanja odvijaju istovremeno. Iako hronična upala može uslediti nakon akutne upalne epizode, ona takođe može početi kao podmukli proces koji napreduje tokom vremena, na primer, kao rezultat perzistentne infekcije (npr., tuberkuloza, sifilis, gljivična infekcija) koja izaziva odloženu reakciju preosetljivosti, produženo izlaganje endogenim (npr., povišeni lipidi u plazmi) ili egzogenim (npr., silicijum dioksid, azbest, katran cigareta, hirurški šavovi) toksinima, ili autoimunim reakcijama protiv sopstvenih tkiva tela (npr., reumatoidni artritis, sistemski eritematozni lupus, vaskulitis, multipla skleroza, psorijaza).

[0011] [0003] Jedna od posledica upale je formiranje neutrofilnih ekstracelularnih zamki (NET). Poznato je i da NET izazivaju upalu. NET su strukture koje sadrže DNK i histone koje proizvode neutrofili kao deo odbrambenog mehanizma domaćina protiv patogena. Oni mogu da zarobe i ubiju razne bakterijske, gljivične, virusne i protozoalne patogene, a njihovo oslobađanje je jedna od prvih linija odbrane protiv patogena. Nakon aktivacije mikroorganizmima ili citokinima, histoni postaju hipercitrulinisani i jezgro neutrofila prolazi kroz proces dekondenzacije hromatina što dovodi do formiranja NET-ova putem NEToze, oblika smrti ćelija neutrofila.

[0013] NET-ovi igraju patološku ulogu u raznim bolestima, na primer izazivajući abnormalnu upalu. Stoga su NET-ovi uključeni u patologiju raznih inflamatornih stanja, kao što su sistemski eritematozni lupus (SLE), lupus, sepsa, vaskulitis, inflamatorni artritis, reumatoidni artritis i osteoartritis, psorijaza, Alchajmerova bolest, autoimuni hepatitis, juvenilni idiopatski artritis, Behčeova bolest, spondilitis, spondiloartropatija, multipla sistemska atrofija, Parkinsonova bolest, astma sa demencijom Levijevih tela, astma pogoršana alergijskim rinovirusom, cistična fibroza i idiopatska plućna fibroza.

[0015] Na primer, NET-ovi mogu izazvati izlaganje autoantigena ekstracelularnom prostoru i naknadnu proizvodnju patoloških autoantitela od subjekta. Osim toga, NET-ovi i ostaci NET-ova sadrže toksične histone, koji izazivaju vaskularno oštećenje i naknadno oštećenje i otkazivanje organa. Prema tome, kod takvih bolesti, ometanje formiranja NET-ova, i indukovanje čišćenja NET-ova i ostataka NET-a iz cirkulacije i tkiva, bi imalo terapeutske koristi.

[0017] Neutrofili se takođe sve više prepoznaju kao važan element u progresiji tumora. Pokazano je da imaju važne efekte u skoro svakoj fazi progresije tumora a brojne studije pokazuju da je njihovo prisustvo ključno za razvoj tumora. Studije su takođe implicirale NET-ove kao faktore koji pospešuju progresiju tumora i metastaze. Takođe je pokazano da neutrofili, kroz stvaranje NET-ova, pružaju skelu i stimulus za adheziju trombocita, obrazovanje tromba i koagulaciju u tumorima.

[0019] Dodatno, NET-ovi su povezani sa smanjenjem zdravlja organa nakon transplantacije. NET-ovi doprinose primarnoj disfunkciji transplantata, doprinoseći ranoj smrtnosti nakon transplantacije pluća. Pokazano je da NET-ovi igraju patogenu ulogu u transplantaciji čvrstih organa.

[0021] Stoga, identifikovanje terapijskih agenasa koji bi mogli da blokiraju formiranje NET-ova, očiste NET-ove i/ili spreče NETozu imalo bi kliničku korist kod inflamatornih bolesti kao što su inflamatorni artritis, reumatoidni artritis i osteoartritis, i drugih patologija povezanih sa NET-om kao što su sistemski eritematozni lupus (SLE), lupus, sepsa, vaskulitis, psorijaza, Alchajmerova bolest, autoimuni hepatitis, juvenilni idiopatski artritis, Sjogrenova bolest, antifosfolipidni sindrom, Behčetova bolest, spondilitis, spondiloartropatija, multipla sistemska atrofija, Parkinsonova bolest, astma sa demencijom Levijevih tela, astma pogoršana alergijskim rinovirusom, alergijska astma, cistična fibroza, fibroza i idiopatska plućna fibroza, bolest suvog oka, uveitis, negranulomatozni uveitis, granulomatozni uveitis, dermatitis, atopijski dermatitis, HOBP, bronhitis, zarastanje rana kod dijabetesa, kancer, metastaze kancera i zdravlje transplantiranih organa in vivo ili ex vivo.

[0023] I dalje postoji potreba za jedinjenjima za lečenje ili prevenciju patologija povezanih sa NET-om.

[0025] Antitela koja se vezuju za citrulisane epitope na deiminovanom humanom histonu 2A i histonu 4 opisana su u WO2009147201, WO2011070172 i WO2016092082. Pautner i dr.: (Antibody engineering & therapeutics, the annual meeting of the antibody society December 7‑10, 2015, San Diego, CA, USA; mAbs, tom 8, br. 3, 24 februar 2016 (2016‑02‑24), stanice 617‑652) izveštavaju o upotrebi humanizovanih IgG1 antitela koja se vezuju za N-kraj citrulisanog histona 2A i H4, kako bi se inhibiralo štetno oslobađanje NET-a u modelu mišjeg RA.

[0026] Suština pronalaska

[0028] Pronalazači predmetnog pronalaska su stvorili poboljšana antitela koja se vezuju za citrulisane epitope na amino-kraju histona 2A i/ili histona 4. Ova antitela se mogu koristiti za lečenje bolesti ili patologija povezanih sa citrulinacijom, kao što su patologije povezane sa NET-om i inflamatorna stanja.

[0030] Predmetni pronalazači su stvorili antitela koja pokazuju poboljšana svojstva u odnosu na terapeutska antitela objavljena u WO2009147201, WO2011070172 i WO2016092082. Pronalazači su otkrili, ubrzanim testiranjem stabilnosti i analizama masene spektrometrije, da izomerizacija određenih aminokiselinskih ostataka u regionu 1 koji određuje komplementarnost (CDR1) lakog lanca antitela objavljenih u WO2009147201, WO2011070172 i WO2016092082 dovodi do smanjenja afiniteta vezivanja antitela za testirane peptide izvedene iz histona tokom vremena. Pronalazači su zatim sproveli temeljnu analizu mutanata lakog lanca CDR1 kako bi rešili problem izomerizacije, pokušavajući da zadrže svojstva vezivanja antitela. Nekoliko pokušaja je rezultiralo antitelima sa smanjenim afinitetom vezivanja za ciljne peptide.

[0032] Konačno, pronalazači su uspešno identifikovali grupu mutacija u CDR1 lakog lanca koje su uklonile problem izomerizacije, uz očuvanje svojstava vezivanja originalnog antitela. Iznenađujuće, mutirana antitela su pokazala poboljšana svojstva u odnosu na originalna antitela i in vitro i in vivo.

[0034] Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje:

[0036] - Antitelo ili njegov vezujući fragment koji se specifično vezuje za citrulinirani epitop na deiminovanom humanom histonu 2A i/ili histonu 4, pri čemu antitelo ili njegov vezujući fragment sadrži:

[0038] a) VL CDR 1 od SEQ ID NO: 9 (QSLLDADGKTY); i

[0039] b) VH CDR 1 od SEQ ID NO: 1 (GYTFTNYG), VH CDR 2 od SEQ ID NO: 2 (INTYSGEA), VH CDR 3 od SEQ ID NO: 3 (LRGYTYQS FDEGGDY), VL CDR 2 od SEQ ID NO: 4 (LVS) i VL CDR 3 od SEQ ID NO: 5 (WQGTHFPYT).

[0041] Pronalazak takođe obezbeđuje:

[0043] - Polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov vezujući fragment, vektor za kloniranje ili ekspresiju koji sadrži navedeni polinukleotid ili ćelija domaćina koja sadrži navedeni vektor za kloniranje ili ekspresiju.

[0044] Pronalazak takođe obezbeđuje:

[0046] - Postupak za proizvodnju antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta koji se specifično vezuje za citrulinirani epitop na deiminovanom humanom histonu 2A i/ili histonu 4, koji obuhvata kultivaciju ćelije domaćina i izolovanje antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta iz navedene ćelije.

[0048] Pronalazak takođe obezbeđuje:

[0050] - Farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov vezujući fragment i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv razblaživač ili nosač.

[0052] Pronalazak takođe obezbeđuje:

[0054] - Antitelo ili njegov vezujući fragment, ili farmaceutsku kompoziciju kako je ovde definisana, za upotrebu u terapiji.

[0056] Pronalazak takođe obezbeđuje:

[0058] - Antitelo ili njegov vezujući fragment, ili farmaceutsku kompoziciju kako je ovde definisana, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije patologije povezane sa NET-om.

[0059] Kratak opis liste sekvenci

[0060] Nomenklatura antitela

[0061]

[0062] CDR = region koji određuje komplementarnost.

[0063] VH = varijabilni domen teškog lanca.

[0064] VL = varijabilni domen lakog lanca.

[0065] CH = konstantni domen teškog lanca.

[0066] CL = konstantni domen lakog lanca.

[0067] msVH22.101 = mišji VH terapijskog antitela.

[0068] msVL22.101 = mišji VH terapijskog antitela.

[0069] hVH22.101x = humanizovani VH terapijskog antitela, ’x’ se odnosi na teški lanac.

[0070] hVL22.101y = humanizovani VL terapijskog antitela, ’y’ se odnosi na laki lanac. hVH22.101(HC)x = optimizovani humanizovani VH terapijskog antitela, ’(HC)x’ se odnosi na teški lanac. hVL22.101(LC)y = optimizovani humanizovani VL terapijskog antitela, ’(LC)y’ se odnosi na laki lanac. hMQ22.101x/y = humanizovano terapeutsko antitelo, ’x’ se odnosi na teški lanac, ’y’ se odnosi na laki lanac.

[0071] hMQ22.101(HC)x/(LC)y = optimizovano humanizovano terapeutsko antitelo pronalaska, ’(HC)x’ se odnosi na teški lanac, ’(LC)y’ se odnosi na laki lanac.

[0074]

[0075] (nastavak)

[0076]

[0077] Kratak opis slika nacrta

[0079]

[0081] Slika 1 - Ubrzano testiranje stabilnosti hMQ22.101j/e i hMQ22.101f/g

[0083] Alikvoti od 0,75 ml (staklene epruvete) koji sadrže hMQ22.101j/e (12,5 mg/ml) ili hMQ22.1011f/g (3,31 mg/ml) u 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, čuvani su na 37°C svaki tokom 8 nedelja. Svake nedelje nekoliko uzoraka od 10 µl i 20 µl je uzimano iz svake staklene epruvete pod aseptičnim uslovima i čuvano na -80°C do dalje analize (ELISA i masena spektrometrija). Uzorci hMQ22.101j/e iz nedelje 0, 2, 4, 6 i 8, i uzorci hMQ22.101f/g iz nedelje 0, 3 i 6 podvrgnuti su interno validiranom CMC ELISA testu u kojem je procenjeno vezivanje za peptid izveden iz histona (SEQ ID NO: 18). Afinitet vezivanja antitela iz uzorka ubrzane stabilnosti iz nedelje 0 postavljen je na 100%, a sve ostale vrednosti afiniteta vezivanja uzoraka ubrzane stabilnosti (nedelja 2, 3, 4, 6 i 8) su ponovo izračunate kao procenat nedelje 0 (100%) i prikazano kao stubičasti grafikon.

[0085] Slika 2 - Analiza masene spektrometrije hMQ22.101x/y antitela

[0087] a) Analiza masene spektrometrije (MS) uzoraka ubrzane stabilnosti antitela hMQ22.101j/e. Alikvoti od 0,75 ml (staklene epruvete) koji sadrže hMQ22.101j/e (12,5 mg/ml) čuvani su na 37°C svaki tokom 8 nedelja. Svake nedelje uzorak je uziman iz svake staklene epruvete pod aseptičnim uslovima i čuvan na -80°C do MS analize. MS analiza je izvršena kao što je opisano u Primeru 2. Tabela prikazuje relativne nivoe izomerizacije aspartata (D) unutar CDR1 i blizu CDR2 hVL22.101e. b) Test vezivanja antigena sa humanizovanim antitelima, koja sadrže CDR1 mutiran aspartatom hVL22.101y. Generisana antitela hMQ22.101j/h, hMQ22.101j/i i hMQ22.101j/j sa mutacijom aspartata u CDR1 upoređena su sa antitelom hMQ22.101j/e koje sadrži aspartat korišćenjem interno validiranog CMC ELISA testa kao što je opisano u Primeru 1. Grafik prikazuje rezultate optičke gustine tri hVL22.101y CDR1 mutanta (CDR1 hVL22.101h = mutacija DS mesta u AS; CDR1 hVL22.1011 = mutacija DS mesta u ES; CDR1 hVL22.101j = mutacija DS mesta u SS).

[0088] c) MS analiza uzoraka ubrzane stabilnosti iz antitela hMQ22.101j/i. MS analiza je izvršena kao što je opisano u Primeru 2. Tabela prikazuje relativne nivoe izomerizacije aspartata (D) unutar CDR1 i blizu CDR2 hVL22.101i.

[0090] Slika 3 - Generisanje i analiza afiniteta hMQ22.101 mutanata izomerizacije

[0092] a) Tabela prikazuje sedamnaest CDR1-mutiranih domena hVL22.101(LC)y, koji su kreirani, kao i nemutirani CDR1 hVL22.101e i hVL22.101g.

[0093] b) Grafik koji prikazuje brzine disocijacije (kdis x E-07 (1/s)) mutanata izomerizacije na citrulinisani H2A-izvedeni peptid (SEQ ID NO: 18) i H4-izvedeni peptid (SEQ ID NO: 20) mereno pomoću Octet RED96 instrumenta. Niža brzina disocijacije ukazuje na veći afinitet antitela za antigen.

[0095] Slika 4- Ubrzano testiranje stabilnosti hMQ22.101 mutanata izomerizacije. Alikvoti od 0,4 ml (staklene epruvete) koji sadrže naznačena mutirana antitela (u rasponu od 2,06 do 4,29 mg/ml) čuvani su na 37°C svaki tokom 6 nedelja. Svake nedelje uzorak je vađen iz svake staklene epruvete pod aseptičnim uslovima i čuvan na -80°C do dalje analize. Uzorci iz nedelje 0, 3 i 6 podvrgnuti su interno validiranom CMC ELISA testu u kojem je procenjeno vezivanje za citrulinisani H2A-izvedeni peptid (SEQ ID NO: 18). Ponovo izračunati afinitet vezivanja antitela iz uzorka ubrzane stabilnosti iz nedelje 0 postavljen je na 100%, a sve ostale vrednosti afiniteta vezivanja uzoraka ubrzane stabilnosti su ponovo izračunate kao procenat od nedelje 0 (100%) i prikazane kao stubičasti grafikon. Preferirani teški lanci korišćeni u testovima ubrzane stabilnosti bili su hVH22.101f i hVH22.101HC9. Testirano je devet kombinacija teških lanaca i lakih lanaca sa CDR1 mutacijom. hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42, hMQ22.101HC9/LC21, hMQ22.101HC9/LC27 i hMQ22.101HC9/LC42 pokazali su najveću stabilnost nakon 6 nedelja.

[0097] Slika 5‑ Analiza masene spektrometrije mutanata izomerizacije hMQ22.101

[0099] Alikvoti od 0,4 ml (staklene epruvete) koji sadrže naznačena mutirana antitela (u rasponu od 2,06‑4,29 mg/ml) čuvani su na 37°C svaki tokom 6 nedelja. Svake nedelje uzorak je vađen iz svake staklene epruvete pod aseptičnim uslovima i čuvan na -80°C do dalje analize. Analiza masene spektrometrije (MS) VL CDR1-mutiranih hMQ22.101 antitela (mutanti izomerizacije) je izvršena kao što je opisano u Primeru 2, s tom razlikom što su korišćeni uzorci ubrzane stabilnosti iz nedelje 0 i 6 i upoređeni sa nivoima izomerizacije hMQ22.101j/e. Tabela prikazuje relativne nivoe izomerizacije aspartata (D) unutar CDR1 hVL22.101(LC)y. MS analiza mutanata izomerizacije hMQ22.101 pokazuje da je hMQ22.101f/LC41 pokazao najmanju izomerizaciju tokom vremena (0,5%) i stoga je bio najpoželjniji kandidat. Drugi poželjni kandidati bili su hMQ22.101f/LC42 i hMQ22.101HC9/LC42.

[0100] Slika 6 - Testovi agregacije i degradacije preferiranih mutanata izomerizacije hMQ22.101

[0101] Alikvoti od 0,4 ml (staklene epruvete) koji sadrže naznačena mutirana antitela (u rasponu od 2,06 do 4,29 mg/ml) čuvani su na 37°C svaki tokom 6 nedelja. Svake nedelje uzorak je vađen iz svake staklene epruvete pod aseptičnim uslovima i čuvan na -80°C do dalje analize. Uzorci stabilnosti iz nedelje 0 i 6 korišćeni su iz mutanata izomerizacije hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 i hMQ22.101HC9/LC42 za analizu agregacije i degradacije kao što je opisano u Primeru 10. Merenja su sprovedena na Agilent 1200 sistemu u kombinaciji sa Agilent Zorbax GF‑250 kolonom. Proteini su detektovani korišćenjem UV-svetla od 240 nm. Glavni vrh antitela je detektovan na približno 4,25 minuta. Ramena pre i posle glavnog vrha su kvantifikovana i predstavljaju meru procentualnog nivoa agregacije i razgradnje, tim redom. hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 i hMQ22.101HC9/LC42 pokazali su prihvatljive profile agregacije i razgradnje, što ukazuje da su prihvatljivi za dalji razvoj.

[0103] Slika 7 - Eksperimenti inhibicije NEToze korišćenjem preferiranih mutanata izomerizacije hMQ22.101f/LC41 i hMQ22.101f/LC42

[0105] Neutrofili zdravih dobrovoljaca (donor 154 i 155) su stimulisani tokom 4 sata kalcijum jonoforom A23187. Efekat antitela koja smanjuju ekstracelularnu zamku neutrofila (NET) testiran je dodavanjem antitela u koncentraciji od 25 µg/ml ili pufera za ispitivanje 15 minuta pre dodavanja A23187 ćelijama. Nakon 4 sata inkubacije na 37°C i 5% CO2, ćelije su isprane, a ekstracelularna DNK je potom digestirana pomoću S7 nukleaze. NET fragmenti su sakupljeni iz bunarića i kvantifikovani merenjem MPO aktivnosti u uzorku dodavanjem 50 µl 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin (TMB) supstrata u 50 µl sakupljenih NET-ova. Nakon inkubacije od 10 minuta na sobnoj temperaturi, dodato je 50 µl H2SO4, a optička gustina je izmerena na 450 nm. Pozadinski signali koji dolaze od neutrofila, koji nisu bili podvrgnuti tretmanu sa A23187, su oduzeti, a signali od neutrofila tretiranih A23187 nesrodnim antitelima su postavljeni na 100%. Signali iz svih ostalih tretiranih grupa su postavljeni kao procenat tretmana sa nesrodnim antitelima.

[0107] Slika 8 - Odgovor na dozu hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 i hMQ22.101f/g u modelu CAIA kod miša

[0109] Kandidatska antitela optimizovana za olovo sprečavaju pojavu upale. Model artritisa indukovanog antitelima protiv kolagena (CAIA) korišćen je za testiranje efikasnosti odgovora na dozu hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 ili hMQ22.101f/g. Grupe od 5 miševa tretirane su 0. dana i.p. injekcijom sa 2,8 mg antitela protiv kolagena-II. LPS (25 µg/mišu) je injektiran i.p. 3. dana, istovremeno sa hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 ili hMQ22.101f/g; svaki sa 6,25, 12,5 i 25 mg/kg, kontrolno antitelo koje nije upareno sa srodnim izotipom (MQR2.201 sa 25 mg/kg) ili bez antitela (placebo). Stepen otoka šapa je ocenjivan tokom 2 nedelje i prikazan na grafikonima kao „Prosečan rezultat artritisa/mišu“.

[0111] Slika 9 – inhibicija NET-a in vitro i vezivanje NET-ova pomoću hMQ22.101f/LC41. Neutrofili miševa koji su dobijeni iz koštane srži stimulisani su sa A23187 da bi se indukovalo oslobađanje NET-a in vitro. Oslobađanje NET-a je inhibirano pomoću hMQ22.101f/LC41, ali ne i sa MQR2.201 (Sl. A; Levi stubičasti grafikon, kvantifikacija kolokalizacije Hoechst-a (DNK) i citruliranog histona 3 (citH3), i desni stubičasti grafikon, kvantifikacija samo Hoechst-a). Pored toga, hMQ22.101f/LC41 se vezuje za izbačene NET-ove (žuta strelica), kao i za pre-NET-ove (bela strelica), što bi mogao biti prvi korak ka uklanjanju NET-a od strane makrofaga (Sl. B). Sytox zelena boja se koristi za detekciju DNK, uključujući NET-ove i pre-NET-ove, a anti-hIgG se koristi za detekciju NET-a i pre-NET-vezanog hMQ22.101f/LC4. Skala grafikona: 25 µm.

[0113] Slika 10‑ inhibicija NET-a in vivo i vezivanje NET-ova pomoću hMQ22.101f/LC41

[0115] Model mišjeg peritonealnog ćelijskog influksa indukovan pristanom korišćen je da bi se indukovalo formiranje NET-a in vivo. 50 mg/kg MQR2.201 ili hMQ22.101f/LC41 je primenjeno odmah nakon injekcije 500 µl pristanskog ulja, nakon čega je usledila druga injekcija od 50 mg/kg MQR2.201 ili hMQ22.101f/LC4112 sati kasnije. Nakon 24 sata, ćelije su sakupljene. Inhibicija oslobađanja NET-a in vivo je primećena kada su miševi tretirani sa hMQ22.101f/LC41, ali ne i sa MQR2.201.

[0117] (Sl. A) Reprezentativne slike. (Sl. B) Kvantifikacija NET-a pomoću Hoechst-a (DNK) i kolokalizovanog citruliranog histona 3 (citH3). (Sl. C) Vezivanje hMQ22.101f/LC41 za NET-ove, kao i za pre-NET-ove, što bi mogao biti prvi korak ka uklanjanju NET-ova od strane makrofaga. Sytox Green se koristi za detekciju DNK, uključujući NET-ove i pre-NET-ove, a anti-hIgG se koristi za detekciju NET‑ i hMQ22.101f/LC4 vezanog za NET. Skale: 50 µm (A) ili 25 µm (C).

[0119] Slika 11 - NET obogaćene hMQ22.101f/LC41 fagocituju makrofagi miša in vivo

[0121] Model mišjeg peritonealnog ćelijskog infuksa indukovan pristanom korišćen je da bi se indukovalo formiranje NET-a in vivo. 50 mg/kg MQR2.201 ili hMQ22.101f/LC41 je primenjeno odmah nakon injekcije 500 µl pristanskog ulja, nakon čega je usledila druga injekcija od 50 mg/kg MQR2.201 ili hMQ22.101f/LC41 12 sati kasnije. Posle 24 sata, ćelije su sakupljene i obojene sa Hoechst (DNK: plava), makrofagnim markerom anti-F4/80 (magenta), anti-NE (zelena), anti-citH3 (žuta) i anti-hIgG (cijan). NET čestice koje sadrže NE (plava strelica), citH3 (crvena strelica) i hMQ22.101f/LC41 (bela strelica) prisutne su u makrofagima (F4/80). Skala: 10 µm.

[0123] Slika 12- hMQ22.101j/e sprečava oštećenje tkiva posredovano NET-om i napredovanje bolesti kod hroničnih CIA miševa.

[0125] (A) Šematski pregled CIA modela RA kod miševa. Da bi se indukovao hronični artritis, miševima je dva puta (0. i 21. dan) ubrizgan CII. Terapeutski tretman je započet nakon početka bolesti (između 21. i 28. dana) kada je MAS bio ≥ 0,75. Tretman uključuje četiri injekcije (interval od 4 dana) sa režimima postupnog smanjenja doziranja MQR2.201 (50/50/50/50 mg/kg) ili hMQ22.101j/e (30/30/30/10, 50/50/50/15 ili 50/10/10/10 mg/kg). Miševi su eliminisani 14 dana nakon početka lečenja. (B) Prosečan skor artritisa (MAS) CIA miševa je procenjen tokom 14 dana (n = 10 miševa po grupi; MQR2.201 je korišćen za izračunavanje statističkih razlika). (C) Oštećenja kostiju desnog i levog zadnjeg kolena i skočnog zgloba analizirana su rendgenskim snimkom 14. dana nakon prve injekcije antitela (n = 10). Histološka analiza, korišćenjem H&E i SO bojenja, zglobova desnog i levog skočnog zgloba utvrdila je priliv inflamatornih ćelija (D), eroziju kostiju (E), eroziju hrskavice (F), smanjenje PG u hrskavici (G) i smrt hondrocita (H) 14. dana nakon prve injekcije antitela (n = 16‑20 skočnih zglobova miševa). (I) Reprezentativne imunofluorescentne i H&E slike oslobađanja NET-a u zglobovima desnih zadnjih šapa koje pokazuju citrulinisani histon 3 (citH3; crvena), DAPI (plava), neutrofilni marker Ly6G (zelena) i mijeloperoksidazu (MPO; žuta). DAPI je korišćen kao boja za nuklearnu i ekstracelularnu DNK. Razmere: 100 µm. Kvantifikacija Ly6G (J) i NET-ova (kolokalizacija citH3 i MPO) (K) u tibiotarzalnom zglobu, proksimalnom intertarzalnom zglobu, distalnom intertarzalnom zglobu i tarzometatarzalnom zglobu desnih zadnjih šapa miševa (n = 10). (L) Značajna korelacija makroskopskog rezultata (otok šape) i NET-ova po zglobu. (M) Značajna korelacija makroskopskog rezultata (otok šape) i neutrofila (Ly6G) po zglobu. Rezultati prikazani kao srednje vrednosti ± SEM. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001 korišćenjem dvosmerne ANOVA sa Danetovim testom višestrukih poređenja (B), neuparenim dvostranim Studentovim t-testom (C), dvostranim Man-Vitnijevim statističkim testom (D do H, J i K) ili Spirmanovim r-testom (L i M).

[0127] Slika 13- hMQ22.101j/e ne vezuje se za zdrave leukocite

[0129] PBMC i neutrofili su izolovani iz krvi zdravih dobrovoljaca. CD45 je korišćen za razlikovanje leukocita od eritrocita i trombocita, a CD3, CD11c, CD14, CD20, CD56 i CD66b su korišćeni za obeležavanje T ćelija, dendritičnih ćelija (DC-a), monocita, B ćelija, NK ćelija i neutrofila, tim redom. Nije utvrđeno vezivanje HiLyteTMFluor 488-konjugovanog hMQ22.101j/e za zdrave neaktivne T ćelije, B ćelije, monocite, NK ćelije, DC-e i neutrofile. Aktivirani neutrofili (5 µM A23187 tokom 45 minuta) su korišćeni kao pozitivna kontrola i pokazuju povećano vezivanje HiLyteTMFluor 488-konjugovanog hMQ22.101j/e. ****P<0,001 korišćenjem obične jednosmerne ANOVA sa Danetovim testom višestrukih poređenja.

[0131] Detaljan opis pronalaska

[0133] Treba razumeti da različite primene prikazanog pronalaska mogu biti prilagođene specifičnim potrebama u oblasti tehnke. Takođe treba razumeti da je terminologija koja se ovde koristi samo u svrhu opisivanja određenih izvođenja pronalaska.

[0135] Pored toga, kako se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, oblici u jednini uključuju reference u množini, osim ako sadržaj jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca na „antitelo“ uključuje „antitela“ i slično.

[0137] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela ili njihove vezujuće fragmente koji se specifično vezuju za citrulinirani epitop na deiminovanom humanog histonu 2A i/ili histonu 4. Deiminacija humanog histona 2A i 4 može se izvršiti enzimima kao što je peptidilarginin deiminaza (PAD), na primer PAD2 i PAD4. Antitela predmetnog pronalaska mogu se takođe specifično vezati za citrulinirani epitop na humanom histonu 3. Antitela predmetnog pronalaska mogu se specifično vezati za citrulinirani epitop na humanom histonu 2A i/ili histonu 4 i/ili histonu 3. Pronalazak se takođe odnosi na upotrebe takvih antitela ili njihovih vezujućih fragmenata, kao što su terapeutske upotrebe.

[0139] [0020] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela ili njihove vezujuće fragmente koji se specifično vezuju za citrulinirani epitop na deiminovanom humanom histonu 2A i/ili histonu 4 za upotrebu u lečenju ili prevenciji patologija povezanih sa NET-om. Antitela ili njihovi vezujući fragmenti pronalaska mogu se koristiti u lečenju ili prevenciji patologija povezanih sa NET-om, kao što su SLE, lupus, sepsa, vaskulitis, inflamatorni artritis, reumatoidni artritis i osteoartritis, psorijaza, Alchajmerova bolest, autoimuni hepatitis, juvenilni idiopatski artritis, Sjogrenova bolest, antifosfolipidni sindrom, Behčetova bolest, spondilitis, spondiloartropatija, multipla sistemska atrofija, Parkinsonova bolest, astma sa demencijom sa Levijevim telima, astma pogoršana alergijskim rinovirusom, alergijska astma, cistična fibroza, fibroza i idiopatska plućna fibroza, sindrom suvog oka, uveitis, negranulomatozni uveitis, granulomatozni uveitis, dermatitis, atopijski dermatitis, HOBP, bronhitis ili druge patologije povezane sa NET-om, kao što su zarastanje rana kod dijabetesa, kancera, metastaze kancera i zdravlje transplantiranih organa in vivo ili ex vivo.

[0141] Mete antitela ili njihovih vezujućih fragmenata pronalaska

[0143] Citrulin je aminokiselina koja se ne ugrađuje u proteine tokom normalne translacije, međutim, može se generisati posttranslacionom modifikacijom ostatka arginina pomoću enzima kao što je PAD; (EC 3.5.3.15). Kod sisara (ljudi, miševi i pacovi), do sada je identifikovano pet PAD izotipova (PAD1 -PAD6; ’PAD4’ and ’PAD5’ se koriste za isti izotip), svaki kodiran različitim genom.

[0145] Citrulinacija histona 2A i/ili histona 4 povezana je sa formiranjem NET-ova. Nizvodni patološki efekti formiranja NET-ova mogu biti brojni. Na primer, može doći do izlaganja autoantigenu u ekstracelularnom prostoru i naknadne proizvodnje patoloških autoantitela od strane subjekta. Histoni izvedeni iz NET-a mogu biti toksični za vaskularni zid i organe, što dovodi do oštećenja krvnih sudova i otkazivanja organa. NET-ovi mogu dovesti do formiranja autoantigen/autoantitelo imunskih kompleksa, koji pojačavaju dalje upale, na primer u bubregu kod pacijenata sa SLE. NET-ovi su takođe uključeni u metastaze u progresiji kancera.

[0147] Antitela ili njihovi vezujući fragmenti prema ovom pronalasku se specifično vezuju za citrulinirani epitop na deiminovanom humanom histonu 2A i/ili histonu 4. Antitela ovog pronalaska se takođe mogu specifično vezati za citrulinirani epitop na deiminovanom humanom histonu H3. U specifičnom izvođenju, antitela ili njihovi vezujući fragmenti prema pronalasku se specifično vezuju za citrulinirani epitop na deiminovanom humanom histonu 2A i/ili histonu 4, pri čemu epitop sadrži peptid izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21 i 22. Antitela ili njihovi vezujući fragmenti mogu se takođe vezati za epitope koji sadrže peptide SEQ ID NO: 53 ili 54.

[0149] Antitela ili njihovi vezujući fragmenti prema pronalasku se specifično vezuju za citrulinirani epitop na deiminovanom humanom histonu 2A i/ili histonu 4. Antitela prema pronalasku se takođe mogu specifično vezati za citrulinirani epitop na deiminovanom humanom histonu H3. U specifičnom izvođenju, antitela ili njihovi vezujući fragmenti prema pronalasku se specifično vezuju za citrulinirani epitop na deiminovanom humanom histonu 2A i/ili histonu 4, pri čemu epitop sadrži peptid izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21 i 22. Antitela ili njihovi vezujući fragmenti se takođe mogu vezati za epitope koji sadrže peptide SEQ ID NO: 53 ili 54.

[0151] Antitela ili njihovi vezujući fragmenti

[0153] Termin "antitela", "antitelo" ili "njegov vezujući fragment", kako se ovde koristi, odnosi se na strukturu, poželjno proteinsku ili polipeptidnu strukturu, sposobnu za specifično vezivanje za ciljni molekul koji se često naziva "antigen".

[0155] Molekul antitela, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo ili njegov vezujući fragment. Termin "antitelo", kako se ovde koristi, generalno se odnosi na intaktna (cela) antitela, tj. ona koja sadrže elemente dva teška lanca i dva laka lanca. Antitelo može da sadrži dodatne vezujuće domene, na primer, kao što je molekul DVD-Ig, kako je otkriveno u WO 2007/024715, ili takozvani (FabFv)2Fc opisan u WO2011/030107. Dakle, "antitelo", kako se ovde koristi, uključuje mono-, bi-, tri- ili tetravalentna antitela pune dužine.

[0157] [0026] Vezujući fragmenti antitela uključuju jednolančana antitela (tj. teški lanac i laki lanac pune dužine); Fab, modifikovani Fab, Fab’, modifikovani Fab’, F(ab’)2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, scFv, mono-, bi, tri- ili tetravalentna antitela, BisscFv, diatela, tritela, triatela, tetratela i fragmenti koji se vezuju za epitope bilo kog od gore navedenih (videti na primer Holliger P i Hudson PJ, 2005, Nat. Biotechnol., 23,: 1126‑1136; Adair JR i Lawson ADG, 2005, Drug Design Reviews - Online, 2, 209‑217). Postupci za kreiranje i proizvodnju ovih fragmenata antitela su dobro poznati u oblasti tehnike (videti na primer Verma R et al., 1998, J. Immunol. Methods, 216, 165‑181). Fab-Fv format je prvi put otkriven u WO2009/040562, a njegove verzije stabilizovane disulfidom, Fab-dsFv, prvi put je otkriven u WO2010/035012. Drugi fragmenti antitela za upotrebu u ovom pronalasku uključuju Fab i Fab’ fragmente. Multivalentna antitela mogu sadržati više specifičnosti, npr. bispecifična ili mogu biti monospecifična.

[0159] Antitelo ili njegov vezujući fragment može biti izabran iz grupe koja se sastoji od jednolančanih antitela, jednolančanih varijabilnih fragmenata (scFv), varijabilnih fragmenata (Fv), fragmenata regiona za vezivanje antigena (Fab), rekombinantnih antitela, monoklonskih antitela, fuzionih proteina koji sadrže domen za vezivanje antigena nativnog antitela, diatela, tritela i njihovih aktivnih komponenti ili fragmenata.

[0161] IgG1 (npr. IgG1/kapa) antitela koja imaju teški i laki lanac IgG1 mogu se povoljno koristiti u pronalasku. Međutim, pronalazak obuhvata i druge izotipove humanih antitela, uključujući IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD i IgE u kombinaciji sa kapa ili lambda lakim lancem. Takođe, sva antitela životinjskog porekla različitih izotipova mogu se koristiti u pronalasku. Antitela mogu biti antitela pune veličine ili fragmenti antitela koji vezuju antigen, uključujući Fab, F(ab’)2 ili jednolančane Fv fragmente.

[0163] Termin: "specifično se vezuje za citrulin" ili "specifično se vezuje za citrulinirani epitop" u ovom kontekstu znači da se antitelo ili njegov vezujući fragment vezuje za strukturu kao što je peptid koji sadrži ostatak citrulina, dok se antitelo ili njegov vezujući fragment vezuje manje snažno ili poželjno uopšte ne vezuje za istu strukturu koja sadrži ostatak arginina umesto ostatka citrulina. Termin peptid treba tumačiti kao strukturu koja je sposobna da prezentuje ostatak citrulina u ispravnom kontekstu za imunoreaktivnost sa antitelima ili njihovim vezujućim fragmentima kao što je ovde opisano, poželjno u istom kontekstu kao što se pojavljuje u humanom ili životinjskom telu, poželjno u kontekstu nativnog polipeptida.

[0165] Antitela ili njihovi vezujući fragmenti pronalaska se specifično vezuju za citrulinirani epitop na deiminovanom humanom histonu 2A i/ili histonu 4. Vezivanje antitela ili njihovih vezujućih fragmenata za citrulinirani epitop na deiminovanom humanom histonu 2A i/ili histonu 4 blokira formiranje NET-a. Citrulinacija histona je povezana sa formiranjem NET-ova.

[0167] Blokiranje formiranja NET-a može biti potpuno ili delimično. Na primer, antitelo ili njegov vezujući fragment pronalaska može smanjiti formiranje NET-a sa 10 na 50%, najmanje 50% ili najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 99%. Blokiranje NET-a može se meriti bilo kojim pogodnim sredstvima, na primer merenjem NEToze in vitro (Kraaij Tet al., 2016, Autoimmun. Rev.15, 577‑584).

[0169] Termini "aktivnost vezivanja" i "afinitet vezivanja" se odnose na tendenciju molekula antitela da se veže ili ne veže za metu. Afinitet vezivanja može se kvantifikovati određivanjem konstante disocijacije (Kd) za antitelo i njegovu metu. Slično, specifičnost vezivanja antitela za njegovu metu može se definisati u smislu uporednih konstanti disocijacije (Kd) antitela za njegovu metu u poređenju sa konstantom disocijacije u odnosu na antitelo i drugi, neciljni molekul.

[0171] Tipično, Kd za antitelo u odnosu na cilj biće 2 puta, poželjno 5 puta, još poželjnije 10 puta manji od Kd u odnosu na drugi, neciljni molekul, kao što je nepovezani materijal ili prateći materijal u okruženju. Poželjnije, Kd će biti 50 puta manji, još poželjnije 100 puta manji, a još poželjnije 200 puta manji.

[0172] Vrednost ove konstante disocijacije može se direktno odrediti dobro poznatim postupcima, a može se izračunati čak i za složene smeše postupcima kao što su, na primer, one navedene u Caceci MS i Cacheris WP (1984, Byte, 9, 340‑362). Na primer, Kd se može utvrditi korišćenjem testa vezivanja sa dvostrukim nitroceluloznim filterom, kao što je onaj koji su otkrili Wong I i Lohman TM (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5428‑5432) ili na primer, korišćenjem Octet površinske plazmonske rezonance.

[0174] Jedan postupak za procenu afiniteta vezivanja za deiminovani humani histon 2A i/ili histon 4 je ELISA. Drugi standardni testovi za procenu sposobnosti vezivanja liganda, kao što su antitela prema ciljevima, poznati su u oblasti tehnike, uključujući na primer, Western blot-ove, RIA i analizu protočne citometrije. Kinetika vezivanja (npr., afinitet vezivanja) antitela takođe se može proceniti standardnim testovima poznatim u oblasti tehnike, kao što je površinska plazmonska rezonanca, na primer Biacore™ sistemskom analizom.

[0176] Poželjno je da antitelo pronalaska ima afinitet vezivanja za deiminovani humani histon 2A i/ili histon 4 od 1 nM ili manje. Poželjno je da antitelo ovog pronalaska ima afinitet vezivanja za deiminovani humani histon 2A i/ili histon 4, i/ili deiminovani humani histon H3 od 0,5 nM ili manje, 0,1 nM ili manje, 50 pM ili manje, 10 pM ili manje, 5 pM ili manje, 2 pM ili manje ili 1 pM ili manje.

[0178] Antitelo ili njegov vezujući fragment može takođe biti fuzioni protein koji sadrži antigen vezujući domen prirodnog antitela.

[0180] Poželjno je da antitelo ili njegov vezujući fragment pronalaska bude monoklonsko antitelo. Monoklonska antitela su molekuli imunoglobulina koji su identični jedni drugima i imaju jedinstvenu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Monoklonska antitela (mAt) predmetnog pronalaska mogu se proizvesti različitim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskih antitela, na primer one opisane u „Monoclonal Antibodies: a manual of techniques“ (Zola H, 1987, CRC Press) i u „Monoclonal Hybridoma Antibodies: techniques and applications“ (Hurrell JGR, 1982 CRC Press).

[0182] Antitelo ili njegov vezujući fragment ovog pronalaska sadrži vezujući domen. Vezujući domen će generalno obuhvatati 6 CDR-ova, tri iz teškog lanca i tri iz lakog lanca. U jednom izvođenju, CDR-ovi su u okviru i zajedno formiraju varijabilni region ili domen. Dakle, u jednom izvođenju antitelo ili vezujući fragment sadrži vezujući domen specifičan za antigen koji obuhvata varijabilni region ili domen lakog lanca i varijabilni region ili domen teškog lanca.

[0184] Ostaci u varijabilnim domenima antitela su konvencionalno numerisani prema IMGT (http://www.imgt.org). Ovaj sistem je naveden u Lefranc MP (1997, J, Immunol. Today, 18, 509). Ovaj sistem numeracije se koristi u ovoj specifikaciji, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0186] Oznake IMGT ostataka ne odgovaraju uvek direktno linearnom numerisanju ostataka aminokiselina. Stvarna linearna sekvenca aminokiselina može da sadrži manje ili dodatne aminokiseline nego u strogom IMGT numerisanju, što odgovara skraćivanju ili umetanju u strukturnu komponentu, bilo da je u pitanju okvir ili CDR, osnovne strukture varijabilnog domena. Ispravno IMGT numerisanje ostataka može se odrediti za dato antitelo poravnavanjem ostataka homologije u sekvenci antitela sa "standardnom" IMGT numerisanom sekvencom.

[0188] CDR-ovi varijabilnog domena teškog lanca nalaze se na ostacima 27‑38 (CDR1 VH), ostacima 56‑65 (CDR2 VH) i ostacima 105‑117 (CDR3 VH) prema IMGT sistemu numeracije.

[0190] CDR-ovi varijabilnog domena lakog lanca nalaze se na ostacima 27-38 (CDR1 VL), ostacima 56-65 (CDR2 VL) i ostacima 105-117 (CDR3 VL) prema IMGT sistemu numeracije.

[0191] Antitela ili njihovi vezujući fragmenti predmetnog pronalaska su ovde opisani primarnom aminokiselinskom sekvencom njihovih CDR regiona. Antitela ili njihovi vezujući fragmenti predmetnog pronalaska su ovde opisani primarnom aminokiselinskom sekvencom njihovih teških i lakih lanaca.

[0193] Predmetni pronalazak se zasniva na otkriću da modifikovani CDR1 VL antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta koji se specifično vezuje za citrulinirani epitop na deiminovanom humanom histonu 2A i/ili histonu 4 pruža poboljšana svojstva antitelu ili njegovom vezujućem fragmentu u odnosu na antitelo ili njegov vezujući fragment koji sadrži nemodifikovanu verziju CDR1 VL. Nemodifikovani CDR1 VL antitela korišćenog za izvođenje pronalaska sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence QSLLDSDGKTY (SEQ ID NO: 36) ili QSLVDSDGKTY (SEQ ID NO: 37). Različiti modifikovani CDR1 VL lanca su ovde identifikovani kao SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 ili 10. Modifikovani CDR1 VL lanca antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta pronalaska sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 9 (QSLLDADGKTY). Modifikovani CDR1 VL lanca antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta pronalaska pokazuje smanjenu izomerizaciju, u poređenju sa nemodifikovanim CDR1 SEQ ID NO: 36 ili 37, ali ima poboljšana svojstva vezivanja u poređenju sa nemodifikovanim CDR1. [0046] Aminokiselinske sekvence CDR-ova za VH antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta pronalaska su prikazane u u SEQ ID NO: 1, 2 i 3. CDR-ovi 2 i 3 za VL su prikazani u SEQ ID NO: 4 i 5.

[0195] Aminokiselinske sekvence VH i VL antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta pronalaska su prikazane u SEQ ID NO: 11 i 16. CDR-ovi za VH su prikazani u SEQ ID NO: 1, 2 i 3. CDR-ovi za VL su prikazani u SEQ ID NO: 9, 4 i 5.

[0197] Aminokiselinske sekvence VH i VL antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta pronalaska su prikazane su u SEQ ID NO: 12 i 16. CDR-ovi za VH su prikazani u SEQ ID NO: 1, 2 i 3. CDR-ovi za VL su prikazani u SEQ ID NO: 9, 4 i 5.

[0199] U jednom izvođenju predmetnog pronalaska, antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 11, aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 16, aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 23 ili 56 i aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 24.

[0201] U jednom izvođenju predmetnog pronalaska, antitelo pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 12, aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 16, aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 23 ili 56 i aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 24.

[0203] Polinukleotidi, vektori i ćelije domaćina

[0205] Predmetni pronalazak takođe obuhvata polinukleotide, vektore i ekspresione vektore koji kodiraju antitelo ili njegove ovde opisane vezujuće fragmente.

[0207] Pronalazak se takođe odnosi na polinukleotide koji kodiraju antitela pronalaska. Dakle, polinukleotid pronalaska može kodirati bilo koje antitelo ili fragment kao što je ovde opisano. Termini "molekul nukleinske kiseline" i "polinukleotid" se ovde koriste naizmenično i odnose se na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, bilo dezoksiribonukleotide ili ribonukleotide, ili njihove analoge. Neograničavajući primeri polinukleotida uključuju gen, fragment gena, informacionu RNK (iRNK), cDNK, genomsku DNK, rekombinantne polinukleotide, plazmide, vektore, izolovanu DNK bilo koje sekvence, izolovanu RNK bilo koje sekvence, sonde nukleinskih kiselina i prajmere. Polinukleotid pronalaska može biti obezbeđen u izolovanom ili prečišćenom obliku.

[0209] [0053] Sekvenca nukleinske kiseline koja "kodira" odabrani polipeptid je molekul nukleinske kiseline koji se transkribuje (u slučaju DNK) i tranlatira (u slučaju iRNK) u polipeptid in vivo kada se stavi pod kontrolu odgovarajućih regulatornih sekvenci. Granice kodirajuće sekvence su određene startnim kodonom na 5’ (amino) kraju i stop kodonom translacije na 3’ (karboksi) kraju. Za potrebe ovog pronalaska, takve sekvence nukleinskih kiselina mogu da uključuju, ali nisu ograničene na, cDNK iz virusne, prokariotske ili eukariotske iRNK, genomske sekvence iz virusne ili prokariotske DNK ili RNK, pa čak i sintetičke sekvence DNK. Sekvenca za terminaciju transkripcije može biti locirana 3’ u odnosu na kodirajuću sekvencu. U jednom izvođenju, polinukleotid pronalaska sadrži sekvencu koja kodira VH ili VL aminokiselinsku sekvencu kao što je gore opisano. Polinukleotid može kodirati VH ili VL sekvencu specifičnog antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisano.

[0211] Antitelo ili njegov vezujući fragment pronalaska može se stoga proizvesti iz ili isporučiti u obliku polinukleotida, koji ga kodira i sposoban je da ga ekspresuje. Tamo gde antitelo sadrži dva ili više lanaca, polinukleotid pronalaska može kodirati jedan ili više lanaca antitela. Na primer, polinukleotid pronalaska može kodirati laki lanac antitela, teški lanac antitela ili oba. Mogu se obezbediti dva polinukleotida, od kojih jedan kodira laki lanac antitela, a drugi kodira odgovarajući teški lanac antitela. Takav polinukleotid ili par polinukleotida mogu se eksprimovati zajedno tako da se generiše antitelo pronalaska.

[0213] Polinukleotidi pronalaska mogu se sintetizovati prema postupcima dobro poznatim u oblasti tehnike, kao što je opisano na primer u Sambrook J et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual; Cold Spring Harbor: New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[0215] Molekuli nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska mogu biti obezbeđeni u obliku ekspresione kasete, koja uključuje kontrolne sekvence operativno povezane sa umetnutom sekvencom, čime se omogućava ekspresija antitela ovog pronalaska in vivo. Ove ekspresione kasete se, zauzvrat, obično nalaze unutar vektora (npr. plazmida ili rekombinantnih virusnih vektora). Takva ekspresiona kaseta može se direktno primeniti domaćinu. Alternativno, vektor koji sadrži polinukleotid ovog pronalaska može se primeniti domaćinu. Poželjno je da se polinukleotid priprema i/ili primenjuje korišćenjem genetskog vektora. Pogodan vektor može biti bilo koji vektor koji je sposoban da nosi dovoljnu količinu genetičkih informacija i da omogući ekspresiju polipeptida pronalaska.

[0217] Predmetni pronalazak stoga uključuje ekspresione vektore koji sadrže takve polinukleotidne sekvence. Takvi ekspresioni vektori se rutinski konstruišu u oblasti molekularne biologije i mogu, na primer, uključivati upotrebu plazmidne DNK i odgovarajućih inicijatora, promotora, pojačivača i drugih elemenata, kao što su, na primer, signali za poliadenilaciju, koji mogu biti neophodni i koji su pozicionirani u ispravnoj orijentaciji, kako bi se omogućila ekspresija peptida predmetnog pronalaska. Drugi pogodni vektori bi bili očigledni stručnjacima u ovoj oblasti tehnike. Kao dalji primer u tom pogledu, pozivamo se na Sambrook J et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual; Cold Spring Harbor: New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[0219] Stručnjak u ovoj oblasti može koristiti ovde opisane sekvence da bi klonirao ili generisao cDNK ili genomske sekvence, na primer, kao što je opisano u dole navedenim primerima. Kloniranje ovih sekvenci u odgovarajući eukariotski vektor ekspresije, kao što je pcDNA3 (Invitrogen), ili njegovi derivati, i naknadna transfekcija ćelija sisara (kao što su CHO ćelije) sa kombinacijama odgovarajućih vektora koji sadrže lake i teške lance, dovodi do ekspresije i lučenja ovde opisanih antitela.

[0221] Stručnjak u ovoj oblasti može takođe napraviti analoge antitela ili njihovih vezujućih fragmenata kao što je ovde opisano korišćenjem specifičnih vezujućih domena sekvenci antitela i njihovom ekspresijom u drugom kontekstu, kao što je polipeptid, kao što je fuzioni protein. Ovo je dobro poznato u oblasti tehnike.

[0222] Pronalazak takođe uključuje ćelije koje su modifikovane da eksprimuju antitelo pronalaska. Takve ćelije uključuju prolazne, ili poželjno stabilne ćelijske linije viših eukariotskih ćelija, kao što su ćelije sisara ili ćelije insekata, niže eukariotske ćelije, kao što su ćelije kvasca ili prokariotske ćelije, kao što su bakterijske ćelije. Posebni primeri ćelija, koje se mogu modifikovati umetanjem vektora ili ekspresionih kaseta koje kodiraju antitelo ovog pronalaska, uključuju ćelije sisara HEK293, CHO, HeLa, NS0 i COS. Poželjno je da izabrana ćelijska linija bude ona koja je ne samo stabilna, već i omogućava zrelu glikozilaciju.

[0224] Takve ćelijske linije pronalaska mogu se kultivisati korišćenjem rutinskih postupaka za proizvodnju antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta pronalaska, ili se mogu koristiti terapeutski ili profilaktički za isporuku antitela ili njihovih vezujućih fragmenata pronalaska subjektu. Alternativno, polinukleotidi, ekspresione kasete ili vektori pronalaska mogu se primeniti u ćeliju subjekta ex vivo, a ćelija se zatim može vratiti u telo subjekta.

[0226] Predmetni pronalazak takođe obuhvata postupak za proizvodnju antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta koji se specifično vezuje za citrulinisani epitop na deiminovanom humanom histonu 2A i/ili histonu 4, koji obuhvata kultivaciju ćelije domaćina kao što je ovde opisano i izolovanje antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta iz pomenute ćelije.

[0228] Farmaceutske kompozicije

[0230] Pronalazak obuhvata farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela ili njihove vezujuće fragmente pronalaska. Pronalazak obuhvata farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela ili njihove vezujuće fragmente pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0232] Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" obuhvata sve rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije i slično koja su fiziološki kompatibilna. Poželjno je da je nosač pogodan za parenteralnu, npr. intravenoznu, intraokularnu, intramuskularnu, potkožnu, intradermalnu ili intraperitonealnu primenu (npr. injekcijom ili infuzijom). U određenim izvođenjima, farmaceutski prihvatljiv nosač obuhvata najmanje jedan nosač izabran iz grupe koja se sastoji od rastvora ko-rastvarača, lipozoma, micela, tečnih kristala, nanokristala, nanočestica, emulzija, mikročestica, mikrosfera, nanosfera, nanokapsula, polimera ili polimernih nosača, surfaktanta, suspendujućih sredstava, sredstava za kompleksiranje kao što su ciklodekstrini ili adsorbujući molekuli kao što je albumin, površinski aktivne čestice i helatne sredstava. U daljim izvođenjima, polisaharid obuhvata hijaluronsku kiselinu i njene derivate, dekstran i njegove derivate, celulozu i njene derivate (npr. metilcelulozu, hidroksi-propil celulozu, hidroksipropilmetilcelulozu, karboksimetilcelulozu, celulozni acetat ftalat, celulozni acetat sukcinat, celulozni acetat butirat, hidroksipropilmetil-celulozni ftalat), hitozan i njegove derivate, [b]-glukan, arabinoksilane, karagenane, pektin, glikogen, fukoidan, hondrotin, dermatan, heparan, heparin, pentosan, keratan, alginat, ciklodekstrine i soli i derivate, uključujući njihove estre i sulfate.

[0234] Poželjni farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju vodene nosače ili razblaživače. Primeri pogodnih vodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama pronalaska uključuju vodu, puferovanu vodu i fiziološki rastvor. Primeri drugih nosača uključuju etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično) i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i organske estre za injekcije, kao što je etil oleat. Pravilna fluidnost može se održati, na primer, upotrebom materijala za premaze, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključiti u kompoziciju izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole, kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid.

[0235] Farmaceutska kompozicija pronalaska takođe može da sadrži farmaceutski prihvatljiv antioksidans. Ovakve kompozicije mogu takođe da sadrže adjuvanse, kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, emulgatori i sredstva za disperziju. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se osigurati i postupcima sterilizacije, gore navedenim, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava, na primer, parabena, hlorobutanola, fenol sorbinske kiseline i slično. Takođe može biti poželjno u kompozicije uključiti izotonična sredstva, kao što su šećeri, natrijum hlorid i slično. Pored toga, produžena apsorpcija farmaceutskog oblika za injekcije može se postići uključivanjem sredstava koja odlažu apsorpciju, kao što su aluminijum monostearat i želatin.

[0237] Terapeutske kompozicije obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Farmaceutska kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka.

[0239] Sterilni rastvori za injekcije mogu se pripremiti ugradnjom aktivnog sredstva (npr. antitela) u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka navedenih gore, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog sredstva u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih navedenih gore. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, poželjni postupci pripreme su vakuumsko sušenje i liofilizacija (liofilizacija), što daje prah aktivnog sredstva plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0241] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu da sadrže dodatne aktivne sastojke, kao i antitelo pronalaska. Kao što je gore pomenuto, kompozicije pronalaska mogu da sadrže jedno ili više antitela pronalaska. Takođe mogu da sadrže dodatne terapeutske ili profilaktičke aktivne agense.

[0243] U zavisnosti od načina primene, antitelo ili njegov vezujući fragment mogu biti obloženi materijalom koji štiti antitelo od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu inaktivirati ili denaturisati antitelo.

[0245] U poželjnom izvođenju, farmaceutska kompozicija prema pronalasku je u obliku izabranom iz grupe koja se sastoji od vodenog rastvora, gela, hidrogela, filma, paste, kreme, spreja, masti ili omotača.

[0247] U daljim izvođenjima, farmaceutske kompozicije opisane ovde mogu se primenjivati putem kao što su intravenozni, potkožni, intraokularni, intramuskularni, intraartikularni, intradermalni, intraperitonealni, spinalni ili drugim parenteralnim putevima primene, na primer injekcijom ili infuzijom. Primena može biti rektalna, oralna, okularna, lokalna, epidermalna ili mukoznim putem. Primena može biti lokalna, uključujući peritumoralnu, jukstatumoralnu, intratumoralnu, do ivice resekcije tumora, intralezionalno, perilezionalno, intrašupljinskom infuzijom, intravezikularnom primenom ili inhalacijom. U preferiranom izvođenju, farmaceutska kompozicija se primenjuje intravenozno ili subkutano.

[0249] Takođe su opisani kompleti koji sadrže antitela ili druge kompozicije pronalaska i uputstva za upotrebu. Komplet može dalje da sadrži jedan ili više dodatnih reagensa, kao što je dodatno terapeutsko ili profilaktičko sredstvo, kao što je ovde objašnjeno.

[0251] Terapeutska upotreba antitela i njihovih vezujućih fragmenata pronalaska

[0253] [0074] Antitela ili njihovi vezujući fragmenti u skladu sa ovim pronalaskom mogu se koristiti u terapiji. U terapeutskim primenama, antitela ili kompozicije se primenjuju kod subjekta koji već pati od poremećaja ili stanja, u količini dovoljnoj da izleči, ublaži ili delimično zaustavi stanje ili jedan ili više njegovih simptoma. Takav terapeutski tretman može dovesti do smanjenja ozbiljnosti simptoma bolesti ili povećanja učestalosti ili trajanja perioda bez simptoma. Količina adekvatna za postizanje ovoga definiše se kao "terapeutski efikasna količina". Efikasne količine za datu svrhu zavisiće od ozbiljnosti bolesti ili povrede, kao i od težine i opšteg stanja subjekta. Kako se ovde koristi, termin "subjekat" obuhvata bilo kog čoveka.

[0255] U određenim izvođenjima, antitelo ili njegov vezujući fragment pronalaska mogu biti povezani (direktno ili indirektno) sa drugim ostatkom. Drugi ostatak može biti terapeutsko sredstvo kao što je lek. Drugi ostatak može biti detektabilna oznaka. Drugi ostatak može biti vezujući ostatak, kao što je antitelo ili domen vezivanja polipeptida specifičan za terapeutsku metu. Antitelo ili njegov vezujući fragment pronalaska može biti bispecifično antitelo.

[0257] Terapeutski agens ili detektabilna oznaka mogu biti direktno vezani, na primer hemijskom konjugacijom, za antitelo ili njegov vezujući fragment pronalaska. Postupci konjugacije agenasa ili oznaka za antitelo su poznate u oblasti tehnike. Na primer, karbodiimidna konjugacija (Bauminger S i Wilchek M, 1980, Methods Enzymol., 70, 151‑159) može se koristiti za konjugaciju različitih sredstava, uključujući doksorubicin, sa antitelima ili peptidima. Karbodiimid rastvorljiv u vodi, 1-etil‑3‑(3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC), je posebno koristan za konjugaciju funkcionalnog ostatka sa vezujućim ostatkom.

[0259] Mogu se koristiti i drugi postupci za konjugaciju dela sa antitelima. Na primer, može se koristiti oksidacija natrijum perjodatom praćena redukcionom alkilacijom odgovarajućih reaktanata, kao i umrežavanje glutaraldehidom. Međutim, prepoznato je da, bez obzira na to koji je postupak proizvodnje konjugata pronalaska izabran, mora se utvrditi da antitelo održava svoju sposobnost ciljanja i da funkcionalni deo održava svoju relevantnu funkciju.

[0261] Terapeutski agens povezan sa antitelom može da sadrži polipeptid ili polinukleotid koji kodira polipeptid koji je od terapeutske koristi. Primeri takvih polipeptida uključuju antiproliferativne ili antiinflamatorne citokine.

[0263] Antitelo može biti povezano sa detektabilnom oznakom. Pod "detektabilnom oznakom" se podrazumeva da je antitelo povezano sa delom koji, kada se nalazi na ciljnom mestu nakon primene antitela pacijentu, može biti detektovan, obično neinvazivno, spolja i sa mesta lociranja cilja. Stoga, antitelo može biti korisno u snimanju i dijagnozi.

[0265] Tipično, oznaka je ili sadrži radioaktivni atom koji je koristan u snimanju. Pogodni radioaktivni atomi uključuju 99mTc i 123I za scintigrafske studije. Druge oznake uključuju, na primer, oznake spina za magnetnu rezonancu (MRI) kao što su ponovo 123I, 1311, 111In, 19F, 13C, 15N, 170, gadolinijum, mangan ili gvožđe. Jasno je da dovoljna količina odgovarajućih atomskih izotopa mora biti povezana sa antitelom da bi molekul bio lako detektovan.

[0267] Radio- ili druge oznake mogu se ugraditi na poznate načine. Na primer, antitelo, ili njegov fragment, može se biosintetizovati ili se može sintetizovati hemijskom sintezom aminokiselina korišćenjem odgovarajućih prekursora aminokiselina koji uključuju, na primer, fluor-19 umesto vodonika. Oznake kao što su 99mTc, 123I, 186Rh, 188Rh i 111In mogu se, na primer, vezati preko ostataka cisteina u polipeptidima. Itrijum-90 se može vezati preko ostatka lizina. Poželjno je da detektabilna oznaka sadrži radioaktivni atom, kao što je, na primer, tehnecijum-99m ili jod-123. Alternativno, detektabilna oznaka može biti izabrana iz grupe koja obuhvata: jod-123; jod-131; indijum-111; fluor-19; ugljenik-13; azot-15; kiseonik-17; gadolinijum; mangan; gvožđe.

[0269] [0082] U jednom izvođenju, antitelo pronalaska je sposobno da se selektivno veže za direktno ili indirektno citotoksični ostatak ili za detektabilnu oznaku. Dakle, u ovom izvođenju, antitelo je povezano sa ostatkom koji se selektivno vezuje za dalje jedinjenje ili komponentu koja je citotoksična ili lako detektabilna.

[0271] Antitelo ili vezujući fragment predmetnog pronalaska, ili kompozicija koja sadrži pomenuto antitelo ili fragment, može se primenjivati jednim ili više načina primene koristeći jednu ili više različitih postupaka poznatih u oblasti tehnike. Kao što će stručnjak u ovoj oblasti razumeti, način i/ili način primene će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. Poželjni načini primene antitela ili kompozicija ovog pronalaska uključuju intravenozne, potkožne, intraokularne, intramuskularne, intradermalne, intraperitonealne, spinalne ili druge parenteralne načine primene, na primer injekcijom ili infuzijom. Fraza "parenteralna primena", kako se ovde koristi, označava načine primene koji nisu enteralna i lokalna primena, obično injekcijom. Primena može biti rektalna, oralna, okularna, lokalna, epidermalna ili mukoznim putem. Primena može biti lokalna, uključujući peritumoralnu, jukstatumoralnu, intratumoralnu, do ivice resekcije tumora, intralezionalno, perilezionalno, intrašupljinskom infuzijom, intravezikulskom primenom ili inhalacijom. U poželjnom obliku, farmaceutska kompozicija se primenjuje intravenozno ili potkožno.

[0273] Odgovarajuću dozu antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta pronalaska može odrediti vešt lekar. Stvarni nivoi doziranja aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska mogu se menjati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapeutskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način primene, a da pritom nije toksična za pacijenta. Izabrani nivo doze zavisiće od različitih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost određenog korišćenog antitela, način primene, vreme primene, brzinu izlučivanja antitela, trajanje tretmana, druge lekove, jedinjenja i/ili materijale koji se koriste u kombinaciji sa određenim korišćenim kompozicijama, starost, pol, težinu, stanje, opšte zdravstveno stanje i prethodnu medicinsku istoriju pacijenta koji se leči, i slične faktore dobro poznate u medicinskoj struci.

[0275] Odgovarajuća doza antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta pronalaska može biti, na primer, u opsegu od oko 0,1 mg/kg do oko 100 mg/kg telesne mase pacijenta koji se leči. Na primer, odgovarajuća doza može biti od oko 1mg/kg do oko 50 mg/kg telesne mase nedeljno, od oko 100 mg/kg do oko 25 mg/kg telesne mase nedeljno ili od oko 10 mg/kg do oko 12,5 mg/kg telesne mase nedeljno.

[0277] Odgovarajuća doza može biti od oko 1 mg/kg do oko 50 mg/kg telesne mase dnevno, od oko 100 mg/kg do oko 25 mg/kg telesne mase dnevno ili od oko 10 mg/kg do oko 12,5 mg/kg telesne mase dnevno.

[0279] Režimi doziranja mogu se prilagoditi kako bi se postigao optimalan željeni odgovor (npr. terapeutski odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti nekoliko podeljenih doza tokom vremena ili se doza može proporcionalno smanjiti ili povećati kako je naznačeno zahtevima terapeutske situacije. Posebno je povoljno formulisati parenteralne kompozicije u obliku jedinične doze radi lakše primene i ujednačenosti doziranja. Oblik jedinične doze, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinstvene doze za subjekte koji se leče; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapeutski efekat u kombinaciji sa potrebnim farmaceutskim nosačem.

[0281] [0088] Antitela se mogu primeniti u jednoj dozi ili u više doza. Višestruke doze se mogu primeniti istim ili različitim putevima i na ista ili različita mesta. Alternativno, antitela se mogu primeniti kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebna ređa primena. Doziranje i učestalost mogu varirati u zavisnosti od poluživota antitela kod pacijenta i željenog trajanja lečenja. Doziranje i učestalost primene takođe mogu da variraju u zavisnosti od toga da li je tretman profilaktički ili terapeutski. U profilaktičkim primenama, relativno niska doza može se primenjivati u relativno retkim intervalima tokom dužeg vremenskog perioda. U terapeutskim primenama, relativno visoka doza može se primenjivati, na primer dok pacijent ne pokaže delimično ili potpuno poboljšanje simptoma bolesti.

[0283] Kombinovana primena dva ili više sredstva može se postići na više različitih načina. U jednom izvođenju, antitelo ili njegov vezujući fragment i drugo sredstvo mogu se primenjivati zajedno u jednoj kompoziciji. U drugom izvođenju, antitelo i drugo sredstvo mogu se primenjivati u odvojenim kompozicijama kao deo kombinovane terapije. Na primer, antitelo ili njegov vezujući fragment može se primenjivati pre, posle ili istovremeno sa drugim sredstvom.

[0285] Bolesti koje se leče

[0287] Antitela ili njihovi vezujući fragmenti predmetnog pronalaska, ili farmaceutske kompozicije kako je ovde definisano, posebno su pogodne za upotrebu u lečenju ili prevenciji patologija povezanih sa citrulinacijom, kao što su patologije povezane sa NET-om i inflamatorna stanja.

[0289] Predmetni pronalazak takođe obuhvata postupak lečenja pacijenta koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta kako je ovde definisano ili farmaceutske kompozicije kako je ovde definisano pacijentu, opciono za lečenje ili sprečavanje patologija povezanih sa citrulinacijom, kao što su patologije povezane sa NET-om i inflamatorna stanja.

[0291] Predmetni pronalazak takođe obuhvata antitelo ili njegov vezujući fragment kako je ovde definisano ili farmaceutsku kompoziciju kako je ovde definisana za upotrebu u proizvodnji leka za sprečavanje ili lečenje patologija povezanih sa citrulinacijom, kao što su patologije povezane sa NET-om i inflamatorna stanja.

[0293] Predmetni pronalazak takođe obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov vezujući fragment predmetnog pronalaska za lečenje ili sprečavanje patologija povezanih sa citrulinacijom, kao što su patologije povezane sa NET-om i inflamatorna stanja.

[0295] Patologija povezana sa citrulinacijom može se definisati kao bilo koja bolest ili stanje gde je citrulinacija povezana sa patološkim stanjem bolesti ili stanja. Da li citrulinacija igra ulogu u patogenezi bolesti, stručnjak može lako utvrditi koristeći rutinske testove dostupne u oblasti tehnike. Na primer, ove bolesti mogu biti okarakterisane prisustvom abnormalnog nivoa citruliniranih proteina u pogođenom ili tkivu povezanom sa bolešću. To se može postići imunološkim testom kao što je Western blot ili ELISA, gde se pogođeno tkivo koristi kao antigen, a citrulinacija tog antigena može se detektovati pomoću anti-citrulinskog antitela, kao što je ovde opisano. Alternativno, stručnjak u oblasti tehnike može koristiti primene Proteomika kao što je analiza masene spektrometrije da bi uporedio nivo i vrstu citrulinacije u obolelom i zdravom tkivu pogođenih pacijenata.

[0297] Patologije povezane sa NET-om mogu se smatrati patologijama povezanim sa citrulinacijom. Patologije povezane sa NET-om mogu se definisati kao bolest ili stanje gde je formiranje NET-ova i NETosis povezano sa patološkim stanjem bolesti ili stanja. Da li formiranje NET-a i NETosis igraju ulogu u patogenezi bolesti, stručnjak može lako utvrditi koristeći rutinske testove dostupne u oblasti tehnike. Na primer, ove bolesti mogu se karakterisati prisustvom NET-ova u relevantnim tkivima.

[0299] Pronalazak se stoga odnosi na antitela ili njihove vezujuće fragmente za upotrebu u lečenju ili prevenciji patologija povezanih sa NET-om.

[0300] Pronalazak se stoga odnosi na postupak lečenja pacijenta kome je to potrebno terapeutski efikasnom količinom antitela ili njegovih vezujućih fragmenata predmetnog pronalaska, pri čemu pacijent pati od patologije povezane sa NET-om.

[0302] Primeri patologija povezanih sa NET-om uključuju inflamatorna stanja ili bolesti, očne inflamatorne bolesti, autoimune bolesti, kancer i zdravlje organa nakon transplantacije.

[0304] "Inflamatorna stanja" ili inflamatorne bolesti" odnose se na bilo koje od brojnih stanja ili bolesti koje karakterišu vaskularne promene: edem i infiltracija neutrofila (npr. akutne inflamatorne reakcije); infiltracija tkiva mononuklearnim ćelijama; uništavanje tkiva inflamatornim ćelijama, ćelijama vezivnog tkiva i njihovim ćelijskim proizvodima; i pokušaji reparacije zamenom vezivnog tkiva (npr. hronične inflamatorne reakcije). Takve bolesti su, na primer, inflamatorni artritis, uključujući reumatoidni artritis i osteoartritis, SLE, lupus, sepsa, vaskulitis, multipla skleroza, psorijatični artritis, psorijaza, Alchajmerova bolest, autoimuni hepatitis, juvenilni idiopatski artritis, spondiloartropatija, multipla sistemska atrofija, Parkinsonova bolest, demencija sa Levijevim telima, idiopatska plućna fibroza, bolest suvog oka, uveitis, negranulomatozni uveitis, granulomatozni uveitis, dermatitis, atopijski dermatitis i plućne bolesti kao što su HOBP i bronhitis. Negranulomatozni uveitis može biti povezan sa dominantnom upalom neutrofila, granulomatozni uveitis može biti povezan sa dominantnom upalom makrofaga.

[0306] NET igraju ulogu u patologiji autoimunih bolesti, uključujući reumatoidni artritis, SLE i vaskulitis. Put kojim terapeutsko antitelo ili njegov vezujući fragment poboljšava bolest je verovatno putem inhibicije NET-a, uklanjanja ostataka NET-a, uključujući toksične histone i druge auto-antigene iz tkiva i cirkulacije, uklanjanja ostataka NET-a i toksičnih histona iz tkiva i cirkulacije. Za mnoge od nekoliko autoimunih bolesti pokazano je da se patologija poboljšava u modelima sa nokautom PAD-a ili kod životinja divljeg tipa tretiranih inhibitorom PAD-a, što znači da postoji jaka korelacija sa količinom NET-a i težinom bolesti.

[0307] Stoga, inflamatorna stanja ili bolesti i autoimune bolesti mogu se lečiti antitelima i njihovim vezujućim fragmentima prema predmetnom pronalasku.

[0309] U poželjnom izvođenju, bolesti koje se leče su patologije povezane sa NET-om, kao što su SLE, lupus, sepsa, vaskulitis, inflamatorni artritis, reumatoidni artritis i osteoartritis, psorijaza, Alchajmerova bolest, autoimuni hepatitis, juvenilni idiopatski artritis, Sjogrenova bolest, antifosfolipidni sindrom, Behčeova bolest, spondilitis, spondiloartropatija, multipla sistemska atrofija, Parkinsonova bolest, astma sa Levijevim telima i demencijom, astma pogoršana alergijskim rinovirusom, alergijska astma, cistična fibroza, fibroza i idiopatska plućna fibroza, sindrom suvog oka, uveitis, negranulomatozni uveitis, granulomatozni uveitis, dermatitis, atopijski dermatitis, HOBP, bronhitis ili druge patologije povezane sa NET-om, kao što su zarastanje rana kod dijabetesa, kancer, metastaze kancera i zdravlje transplantiranih organa in vivo ili ex vivo.

[0311] U poželjnom izvođenju, bolesti koje se leče su inflamatorna stanja kao što su SLE, lupus, sepsa, vaskulitis, inflamatorni artritis, reumatoidni artritis i osteoartritis, psorijaza, Alchajmerova bolest, autoimuni hepatitis, juvenilni idiopatski artritis, Sjogrenova bolest, antifosfolipidni sindrom, Behčeova bolest, spondilitis, spondiloartropatija, multipla sistemska atrofija, Parkinsonova bolest, astma sa Levijevim telima i demencijom, astma pogoršana alergijskim rinovirusom, alergijska astma, cistična fibroza, fibroza, idiopatska plućna fibroza, suvi bolest oka, uveitis, negranulomatozni uveitis, granulomatozni uveitis, dermatitis, atopijski dermatitis, HOBP, bronhitis.

[0312] Primeri

[0314] Primer 1: Ubrzano testiranje stabilnosti hMQ22.101j/e i hMQ22.101f/g.

[0316] Alikvoti od 0,75 ml (staklene epruvete) koji sadrže hMQ22.101j/e (12,5 mg/ml) ili hMQ22.101f/g (3,31 mg/ml) u 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, čuvani su na 37°C svaki tokom 8 nedelja. Svake nedelje, nekoliko uzoraka od 10 µl i 20 µl je uzimano iz svake staklene epruvete pod aseptičnim uslovima i čuvano na -80°C do dalje analize (ELISA i masena spektrometrija).

[0318] Uzorci hMQ22.101j/e iz nedelje 0, 2, 4, 6 i 8, i uzorci hMQ22.101f/g iz nedelje 0, 3 i 6 podvrgnuti su interno validiranom CMC ELISA testu. ELISA ploče sa 96 bunarića su obložene neutravidinom (0,1 µg/bunariću) inkubacijom preko noći na 4°C. Bunarići su isprani 5 puta sa PBS-Tween20 (PBS-T) i blokirani inkubacijom od 2 sata sa PBS-T 1% goveđeg serumskog albumina (BSA) na sobnoj temperaturi (ST). Nakon još 5 ispiranja sa PBS-T, bunarići su inkubirani 1 sat na RT sa peptidom izvedenim iz histona (SEQ ID NO 18: SGXGKQGGKARA), koji sadrži citrulin (X) na poziciji 3 i C-terminalni biotin (40 ng/bunariću) u PBS-T 0,2% BSA. Nakon još 5 ispiranja sa PBS-T, kalibraciona kriva je napravljena od referentne serije hMQ22.101j/e ili hMQ22.101f/g dodavanjem u bunariće počevši od 1350 ng/bunariću i dalje razblaživanjem u odnosu 1:1 dok se ne postigne koncentracija od 0,66 ng/ml u PBS-T 0,2% BSA. Uzorci kontrole kvaliteta (QC) napravljeni od iste referentne serije hMQ22.101j/e ili hMQ22.101f/g sa višom (HQC, 250 ng/ml), srednjom (MQC, 50 ng/ml), nižom (LQC 3,75 ng/ml) i donjom granicom kontrole kvaliteta (LLQC, 1,25 ng/ml) su razblaženi u PBS-T 0,2% BSA i takođe dodati na ploču. Ovi QC uzorci su korišćeni za validaciju rezultata ELISA testa.

[0320] Konačno, uzorci za ubrzanu stabilnost koji su inkubirani 0, 2, 3, 4, 6 i 8 nedelja na 37°C dodati su na istu ploču u koncentraciji od 40 ng/ml u PBS-T 0,2% BSA i inkubirani 2 sata na sobnoj temperaturi. Bunarići su isprani 5 puta sa PBS-T i inkubirani sa zečjim anti-humanim HRP antitelom (1:12.000 u PBS-T 0,2% BSA) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, nakon čega su usledila 3 ispiranja sa PBS-T i 3 ispiranja sa PBS. Bunarići su inkubirani 10 minuta sa TMB supstratom pre nego što je reakcija zaustavljena sa 2 M H<2>SO<4>, nakon čega je optička gustina merena na talasnoj dužini od 450 nm. Sigmoidna kalibraciona kriva je nacrtana i uklopljena korišćenjem vrednosti iz serijski razblaženog referentnog antitela. Koncentracije QC uzoraka i uzoraka za ubrzanu stabilnost ponovo su izračunate korišćenjem jednačine iz sigmoidne uklopljene krive. Preračunata koncentracija antitela iz uzorka ubrzane stabilnosti iz 0. nedelje postavljena je na 100%, a sve ostale preračunate koncentracije ubrzane stabilnosti (2., 3., 4., 6. i 8. nedelja) izračunate su kao procenat od 0. nedelje (100%) i prikazane u trakastom grafikonu (Slika 1, gornji panel, za hMQ22.101j/e, Slika 1, donji panel, za hMQ22.101f/g).

[0322] Testiranje ubrzane stabilnosti pokazalo je da se afinitet vezivanja hMQ22.101j/e i hMQ22.101f/g za peptid koji sadrži citrulin, izveden iz histona, smanjivao tokom vremena.

[0324] Primer 2: Analiza uzoraka ubrzane stabilnosti hMQ22.101j/e pomoću masene spektrometrije.

[0326] Istražen je uzrok smanjenja afiniteta vezivanja hMQ22.101j/e antitela tokom vremena. hMQ22.101j/e ima nekoliko potencijalnih mesta za izomerizaciju aspartata u ili blizu VL CDR regiona (CDR1 i CDR2). Cilj ovog primera bio je da se utvrdi osetljivost ostataka aspartata na izomerizaciju pomoću mapiranja peptida zasnovanog na tečnoj hromatografiji (LC) - masenoj spektrometriji (MS).

[0328] [0108] Pre digestije, 50 µg svakog uzorka sa ubrzanom stabilizacijom (nedelja 0, 4 i 8) podvrgnuto je odstranjivanju soli, redukciji ditiotreitolom i alkilaciji korišćenjem jodoacetamida. Nakon redukcije i alkilacije, uzorci su vareni 18 sati na 37°C korišćenjem modifikovanog tripsina sekvencionog stepena (Promega) u odnosu enzim/protein od 1/50 (mas/mas). Ostaci nakon digestije su čuvani na -20°C do LC-MS analize. Tripsin je serinska proteaza koja specifično cepa na C-kraju arginina ili lizina. Analiza triptičnih digesta je sprovedena korišćenjem tečne hromatografije sa obrnutom fazom (RPLC) u kombinaciji sa UV i masenom spektrometrijskom detekcijom (RPLC-UV-MS). Podaci su prikupljeni korišćenjem Agilent Technologies 1290 UHPLC sistema povezanog sa Agilent Technologies 6540 Q-TOF opremljenim Jetstream izvorom elektrosprej jonizacije (ESI). Uzorci su razdvojeni na RPLC koloni (AdvanceBio Peptide Map C18, 250 mm L, 2,1 mm ID, 2,7 µm dp, Agilent Technologies) koristeći vodu, trifluorosirćetnu kiselinu i acetonitril kao sastojke mobilne faze pre UV 214 nm i MS(/MS) detekcije. Količina od približno 4,5 µg je dodata na kolonu. MS sistem je radio u režimu proširenog dinamičkog opsega (2 GHz) sa rezolucijom od 20.000 za masu 922,009798 i sa visokom tačnošću mase (tipično < 10 ppm) bez korišćenja referentnih masa. Snimana su dva spektra u sekundi, a opseg akvizicije je bio 100‑3000 amu u MS i MS/MS režimu. MS/MS podaci su prikupljeni u režimu zavisnom od podataka. Energija sudara je optimizovana za peptidne fragmente. Sva MS merenja su izvršena u režimu pozitivne jonizacije.

[0330] Izmereni signali su upareni sa sekvencom korišćenjem BioConfirm algoritma ugrađenog u Agilent MassHunter softver. Tolerancija mase za uparivanje eksperimentalnih podataka sa sekvencom je podešena na 20 ppm. Specifikovani enzim je bio tripsin (C-terminalno razlaganje na lizinu ili argininu) i dozvoljeno je 0‑2 propuštena razlaganja. Površine maksimuma iz ekstrahovanih jonskih hromatograma dobijenih sa tačnošću mase od 20 ppm korišćene su za kvantifikaciju modifikacija. S obzirom na skoro potpunu pokrivenost sekvence, pokrivena su sva kandidatska mesta za izomerizaciju aspartata u hCDR regionima. Izvršena je ručna integracija ovih peptida. Kada je prisutan, peptid koji sadrži izoaspartat eluira se neposredno pre peptida koji sadrži aspartat. Relativni nivoi izomerizacije su zatim izračunati u svakom slučaju.

[0332] Relativni nivoi izomerizacije aspartata (D) VL CDR1 hMQ22.101j/e su se povećavali tokom vremena (Slika 2A). Mesta izomerizacije testirana u CDR1 i CDR2 VL su prikazana na Slici 2A.

[0333] Izomerizacija VL CDR1 smatrana je uzrokom gubitka afiniteta vezivanja antitela tokom vremena.

[0334] Primer 3: Proizvodnja tri VL CDR1 antitela hMQ22.101 sa mutacijom aspartata.

[0336] Zatim je ispitano da li delecija mesta izomerizacije koje nije germinativna linija u CDR1 VL sprečava izomerizaciju. DNK tri hVL22.101y domena, uključujući po jednu mutaciju aspartata u CDR1 na poziciji aminokiseline 31 (L:Asp31), sintetizovana je pomoću GeneArt-a. L:Asp31 je mutiran u alanin, glutamin ili serin na osnovu sličnosti aminokiselina kao što su 1) veličina, 2) polaritet i 3) naelektrisanje. Ovi VL domeni sa mutacijom aspartata klonirani su u vektor ekspresije sisara koji kodira humani laki lanac pune dužine. Nakon toga, ove konstrukcije lakih lanaca (hVL22.101h, hVL22.101i i hVL22.101j) sve u kombinaciji sa konstrukcijom humanog teškog lanca pune dužine (hVH22.101j) korišćene su za prolaznu transfekciju HEK293 ćelija za proizvodnju hMQ22.101j/h, hMQ22.101j/i i hMQ22.101j/j, respektivno. Antitela pune veličine su prečišćena iz supernatanata kulture korišćenjem MabSelect SuRe afinitetnih kolona, a zatim je pufer zamenjen sa 25 mM Tris-HCl, pH 8,0 korišćenjem kolona za desoljenje, obe na Akta-FPLC sistemu. Zatim, antitela su polirana pomoću jonoizmenjivačkih spin kolona da bi se uklonili proteini ćelija domaćina i rezidualna smola izvedena iz proteina A, nakon čega je usledio korak uklanjanja endotoksina korišćenjem smole za uklanjanje endotoksina visokog kapaciteta. Konačno, antitela su koncentrovana pomoću MicroSep Advance centrifugalnog uređaja (10K MWCO).

[0338] Primer 4: Test vezivanja antigena sa VL CDR1 antitelima hMQ22.101 sa mutacijom aspartata.

[0340] [0112] Generisana VL CDR1 antitela hMQ22.101j/h, hMQ22.101j/i i hMQ22.101j/j sa mutacijom aspartata upoređena su sa antitelom hMQ22.101j/e koje sadrži aspartat korišćenjem interno validiranog CMC ELISA testa kao što je opisano u Primeru 1. Ovde je hMQ22.101j/e referentna serija korišćena za kalibracionu krivu na 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80 i 100 ng/ml i odvojeni obogaćeni QC uzorci na 10, 20, 60 i 80 ng/ml. hMQ22.101j/h, hMQ22.101j/i, hMQ22.101j/j i hMQ22.101j/e su testirani na 10, 20, 30, 40, 80 i 100 ng/ml, a krive odgovora na dozu su prikazane grafikonima (Slika 2B).

[0342] Slika 2B prikazuje rezultate optičke gustine tri VL CDR1 mutanta (CDR1 hVL22.101h = mutacija DS mesta u AS; CDR1 hVL22.101i = mutacija DS mesta u ES; CDR1 hVL22.101j = mutacija DS mesta u SS). Najbolji rezultati optičke gustine postignuti su pomoću hMQ22.101j/i antitela.

[0344] Primer 5: Test ubrzane stabilnosti praćen analizom VL CDR1 aspartatom mutiranog hMQ22.101j/i pomoću masene spektrometrije.

[0346] Alikvot od 0,75 ml (staklene epruvete) koji sadrži hMQ22.101j/i (12,5 mg/ml) u 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, čuvani su na 37°C svaki tokom 4 nedelje. Svake nedelje, nekoliko uzoraka od 10 µl i 20 µl je uzimano iz svake staklene epruvete pod aseptičnim uslovima i čuvano na -80°C do dalje analize (masena spektrometrija).

[0348] Analiza masene spektrometrije je izvršena identično metodama opisanim u Primeru 2, s tom razlikom što su korišćeni samo uzorci ubrzane stabilnosti iz nedelje 0 i 4. Procenti izomerizacije za hMQ22.101j/i upoređeni su sa onima iz izomerizacije koja sadrži antitelo hMQ22.101j/e (Slika 2C).

[0350] Podaci masene spektrometrije za antitelo hMQ22.101j/i (Slika 2C) pokazali su da se izomerizacija u CDR1 VL i dalje malo povećavala tokom vremena, međutim, delecija mesta izomerizacije DS koji nije germinativna linija u CDR1 VL je u velikoj meri rešila problem izomerizacije.

[0352] Međutim, hMQ22.101j/i je imao manji afinitet za cilj (SEQ ID NO: 18) u poređenju sa hMQ22.101j/e, stoga nije bio pogodan kandidat za terapijsko antitelo.

[0354] Primer 6: Proizvodnja drugih mutanata izomerizacije hMQ22.101.

[0356] Zatim je sprovedena sveobuhvatna analiza mutacija mesta izomerizacije u CDR1 VL, kako bi se ispitalo da li je moguće ukloniti izomerizaciju CDR1 uz očuvanje afiniteta mutiranog antitela za njegovu metu. Kreirano je sedamnaest mutiranih CDR1 domena hVL22.101. Ovih sedamnaest VL CDR1-mutiranih sekvenci, kao i sekvence nemutiranih CDR1 hVL22.101e i hVL22.101g, prikazane su na Slici 3A.

[0358] DNK sedamnaest mutiranih VL CDR1 domena hVL22.101 i četiri varijante VH domena hVH22.101 sintetizovane su pomoću GeneArt-a. Svi mutirani VL i VH domeni klonirani su u vektore ekspresije sisara koji kodiraju humane lake i teške lance pune dužine, tim redom. Sedamnaest mutiranih lakih lanaca (hVL22.101LC16, hVL22.101LC17, hVL22.101LC19, hVL22.101LC20, hVL22.101LC21, hVL22.101LC22, hVL22.101LC23, hVL22.101LC24, hVL22.101LC25, hVL22.101LC26, hVL22.101LC27, hVL22.101LC37, hVL22.101LC38, hVL22.101LC39, hVL22.101LC40, hVL22.101LC41 i hVL22.101LC42) su kombinovani sa nevarijantnim teškim lancem hVH22.101j ili sa četiri varijantna teška lanca ( hVH22.101HC7, hVH22.101HC8, hVH22.101HC9, hVH22.101HC10). Dakle, sve moguće kombinacije lakog lanca (hVL22.101e, hVL22.101LC16, hVL22.101LC17, hVL22.101LC19, hVL22.101LC20, hVL22.101LC21, hVL22.101LC22, hVL22.101LC23, hVL22.101LC24, hVL22.101LC25, hVL22.101LC26, hVL22.101LC27, hVL22.101LC37, hVL22.101LC38, hVL22.101LC39, hVL22.101LC40, hVL22.101LC41 i hVL22.101LC42) i teškog lanca (hVH22.101j, Konstrukti hVH22.101HC7, hVH22.101HC8, hVH22.101HC9, hVH22.101HC10) su korišćeni za prolaznu transfekciju HEK293 ćelija radi proizvodnje antitela pune veličine (mutanti izomerizacije). Antitela su prečišćena, uklonjena je so, polirana i koncentrovana kao što je opisano u Primeru 3.

[0359] Primer 7: Analiza brzine disocijacije hMQ22.101 mutanata izomerizacije.

[0361] Off-rate skrining brzine izomerizaciono mutiranih antitela izvršen je na instrumentu Octet RED96 (Pall ForteBio). Sva merenja su izvršena na 30°C. Streptavidin (SA) biosenzori su prvo isprani 50 sekundi sa PBS-om.1 µg/ml N-terminalnih histonskih 2A (SEQ ID NO: 18) i histonskih 4 (SEQ ID NO: 20) peptida, koji sadrže i citrulin na poziciji 3 i biotin na C-terminusu, imobilizovani su na SA biosenzorima 200 sekundi, isprani PBS-om 50 sekundi, a višak reaktivnih molekula streptavidina blokiran je EZ-link biocitinom 200 sekundi. Nakon dva dodatna koraka pranja od 50 sekundi u PBS-u, antitelima u koncentraciji od 72 nM razblaženim u PBS-u je ostavljeno da se vežu za biosenzore 200 sekundi. Senzori su potom stavljeni u PBS na 4000 sekundi kako bi se izmerile njihove brzine disocijacije.

[0363] Pozadinski signali generisani nepresvučenim biosenzorima, koji su bili izloženi različitim antitelima, kao i signali sa presvučenih biosenzora koji nisu bili izloženi različitim antitelima, oduzeti su pre nego što su krive disocijacije za svako antitelo nacrtane. Konstante brzine disocijacije histona 2A i histona 4 (kdis x E‑07 (1/s)) za svako antitelo izračunate su primenom modela interakcije 1:1 (lokalno uklapanje, puno) koristeći ForteBio softver za analizu podataka 8.1.

[0365] Rezultati su prikazani na Slici 3B. Manji brojevi ukazuju na sporiju brzinu disocijacije, što znači sporije oslobađanje antigena. 1xE‑071/s je minimalna vrednost, koju detektuje Octet, što znači da skoro da nema merenja brzine disocijacije.

[0367] Nekoliko hMQ22.101 mutanata izomerizacije pokazalo je brzinu disocijacije od 1xE‑07 1/s. Preferirani teški lanci: hVH22.101j i hVH22.101HC9. Preferirani laki lanci: hVL22.101LC17, hVL22.101LC21, hVL22.101LC27, hVL22.101LC41 i hVL22.101LC42.

[0369] Primer 8: Ubrzano testiranje stabilnosti 9 najboljih hMQ22.101 mutanata izomerizacije.

[0371] Alikvoti od 0,4 ml (staklene epruvete) od sledećih odabranih mutiranih antitela (opseg od 2,06‑4,29 mg/ml) u 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, čuvani su na 37°C svaki tokom 6 nedelja.

[0374]

[0377] Svake nedelje, nekoliko uzoraka od 10 µl i 20 µl je uzimano iz svake staklene epruvete pod aseptičnim uslovima i čuvano na -80°C do dalje analize (ELISA i MS analiza). Uzorci antitela iz nedelje 0, 3 i 6 podvrgnuti su interno validiranom CMC ELISA testu kao što je opisano u Primeru 1, s tom razlikom što je za kalibracionu krivu korišćena samo referentna serija hMQ22.101f/g, a za uzorke kontrole kvaliteta sa HQC, MQC, LQC i LLQC su korišćeni QC uzorci sa dodanim HQC, MQC, LQC i LLQC.

[0379] [0127] Rezultati su prikazani na Slici 4. 5 mutanata sa najboljim rezultatima u izomerizaciji (hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42, hMQ22.101HC9/LC21, hMQ22.101HC9/LC27, hMQ22.101HC9/LC42, uokvireno) korišćeno je za procenu izomerizacije u nedelji 0 i 6 putem MS analize.

[0381] Primer 9: Analiza 5 najboljih mutanata hMQ22.101 u izomerizaciji pomoću masene spektrometrije.

[0383] Uzorci sa ubrzanom stabilizacijom na 37°C od 5 antitela, koji su se najbolje pokazali u testu ubrzane stabilnosti (Primer 5), dalje su analizirani na nivoe izomerizacije u CDR1 VL pomoću MS analize.

[0386]

[0389] MS analiza je sprovedena identično metodama opisanim u Primeru 2, s tom razlikom što su korišćeni samo uzorci ubrzane stabilnosti iz nedelje 0 i 6. Procenti izomerizacije su upoređeni sa procentima iz antitela hMQ22.101j/e (Slika 5). hMQ22.101f/LC41 nije pokazao gotovo nikakvu izomerizaciju (0,5%) tokom vremena i smatrao se preferiranim kandidatom. Druga najbolja antitela bila su hMQ22.101f/LC42 i hMQ22.101HC9/LC42. Preferirano drugo najbolje antitelo bilo je hMQ22.101f/LC42, jer je HC lanac f humaniji od HC9, a razlika u izomerizaciji između nedelje 0 i 6 je manja (1,9% naspram 2,6%).

[0391] Primer 10: Analiza agregacije i degradacije 3 najbolje izomerizaciona mutanta hMQ22.101.

[0393] Uzorci 3 antitela sa ubrzanom stabilizacijom na 37°C, koji su pokazali manju izomerizaciju u svom CDR1 VL (Primer 6), dalje su analizirani u pogledu njihovih nivoa agregacije i razgradnje.

[0396]

[0399] Merenja su sprovedena na Agilent 1200 sistemu, opremljenom kvaternarnom pumpom G1311A, degazerom G1322A, automatskim uzorkovačem G1329A, termostatom G1330B, kolonskom pećnicom G1316A i VWD detektorom G1314B (Agilent Technologies) u kombinaciji sa Agilent Zorbax GF‑250, 4 µm, 9,4 x 250 mm kolonom. Ubrizgano je 10 µl antitela i rađeno 10 minuta pri brzini protoka od 2 ml/min, koristeći mobilnu fazu koja se sastoji od 200 mM NaH<2>PO<4>u H<2>O, pH 7,0. Proteini su detektovani korišćenjem UV-svetla od 240 nm. Glavni vrh antitela je detektovan na približno 4,25 minuta. Ramena pre i posle glavnog vrha su kvantifikovana i predstavljaju meru nivoa agregacije i razgradnje, respektivno. Rezultati su prikazani na Slici 6.

[0401] hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 i hMQ22.101HC9/LC42 pokazali su prihvatljive profile agregacije i degradacije, što ukazuje da su prihvatljivi za dalji razvoj.

[0403] Primer 11: Analiza fragmentacije najboljih mutanata izomerizacije hMQ22.101.

[0405] [0133] Analiza intaktnih uzoraka mAb je izvršena korišćenjem tečne hromatografije sa obrnutom fazom (RP-HPLC) u kombinaciji sa UV i maseno-spektrometrijskom (MS) detekcijom (RP-HPLC-UV-MS). Podaci su prikupljeni korišćenjem Agilent Technologies 1290 UHPLC sistema povezanog sa Agilent Technologies 6540 Q-TOF opremljenim Jetstream izvorom elektrosprej jonizacije (ESI). Uzorci su razdvojeni na RPLC koloni (Zorbax 300 SB-C8, 100 mm L, 2,1 mm ID, 1,8 µm dp, Agilent Technologies) koristeći 0,1% TFA u vodi kao mobilnu fazu A i 0,1% TFA u acetonitrilu kao mobilnu fazu B. Gradijent od 15%B do 80%B primenjen je tokom 65 minuta. Približno 5 µg je naneto na kolonu. MS sistem je radio u režimu visoke rezolucije (4 GHz) sa naponom fragmentora od 350 V i podešavanjem Quad AMU od 300. Jedan spektar je snimljen u sekundi sa opsegom akvizicije od 300‑3200 amu u pozitivnom MS režimu. Sirovi spektri su dekonvoluirani korišćenjem algoritma maksimalne entropije ugrađenog u Agilent Technologies MassHunter softver sa dodatkom BioConfirm. Izmerena molekulska masa (MW) upoređena je sa teorijskom MW određenom punom sekvencom, uzimajući u obzir potencijalno skraćivanje lizina na C-kraju i N-glikozilaciju.

[0407] Korišćenjem RP-HPLC-UV-MS analize primećeno je povećanje fragmentacije i za uzorke hMQ22.101f/LC41 i hMQ22.101j/e inkubirane 6 nedelja na 37°C u poređenju sa nestresiranim uzorcima. Količina fragmentacije bila je slična profilima fragmentacije primećenim za druga terapeutska antitela koja se koriste u kliničkim studijama i prihvatljiva je.

[0409] Primer 12: Test ekstracelularne zamke humanih neutrofila.

[0411] Puna krv je sakupljena u epruvete sa natrijum heparinom (Beckton Dickinson) od 2 različita zdrava donora.30 ml krvi po donoru je pomešano sa 15 ml 6% dekstrana u 0,9% NaCl i inkubirano 60 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije bila su vidljiva dva bistra sloja, donji sloj koji sadrži većinu eritrocita i gornji sloj koji sadrži neutrofile. Gornji sloj je sakupljen i centrifugiran 10 minuta na 300 g na sobnoj temperaturi. Talog je resuspendovan u 25 ml PBS-a, a neutrofili su izolovani centrifugiranjem u gradijentu gustine sa Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare), nakon čega je usledio korak lize eritrocita u trajanju od 10 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su brojane pomoću protočnog citometra Guava EasyCyte.900.000 neutrofila po bunariću je posejano u ploče za kulturu tkiva sa 24 bunarića (Greiner bio-one) u puferu za ispitivanje ekstracelularne hvatke neutrofila (NET) (medijum RPMI 1640 koji sadrži glutamaks (Life Technologies)) dopunjenom sa 1% toplotno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma i 1 mM CaCl<2>. Neutrofili su stimulisani tokom 4 sata kalcijum jonoforom A23187 (Molecular Probes). Efekat antitela koja smanjuju NET testiran je dodavanjem jednog od sledećih antitela u koncentraciji od 25 µg/ml (hMQ22.101f/g, hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 i izotipsko kontrolno antitelo MQR2.201) ili pufera za ispitivanje 15 minuta pre A23187 ćelijama. Nakon 4 sata inkubacije na 37°C i 5% CO2, ćelije su veoma delikatno isprane dva puta koristeći NETassay pufer. Ekstracelularna DNK je potom digestirana sa S7 nukleazom (7,5U/0,5 ml) tokom 15 minuta na 37°C, nakon čega je dodato 10 µl 500 mM EDTA da bi se zaustavilo dalje varenje. NET su sakupljene iz bunara i centrifugirane 5 minuta na 20g kako bi se uklonile netaknute ćelije. Količina NET-ova je kvantifikovana merenjem MPO aktivnosti u uzorku dodavanjem 50 µl 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) supstrata u 50 µl sakupljenih NET-ova. Nakon inkubacije od 10 minuta na sobnoj temperaturi, dodato je 50 µl H<2>SO<4>i optička gustina je izmerena na 450 nm. Pozadinski signali koji dolaze od neutrofila, koji nisu bili podvrgnuti tretmanu A23187, su oduzeti, a signali od neutrofila tretiranih A23187 MQR2.201 su postavljeni na 100%. Signali iz svih ostalih grupa tretiranih antitelima su upoređeni sa grupom tretiranom A23187 MQR2.201 (Slika 7).

[0413] Iznenađujuće, razvojni kandidat hMQ22.101f/LC41 nadmašuje hMQ22.101f/LC42 i hMQ22.101f/g pri koncentraciji od 25 μg/ml (n=2). Ne samo da je mutirano antitelo izomerizacije zadržalo svojstva nemutiranog antitela, već ih je i poboljšalo.

[0414] Primer 13: Eksperimentalni model inflamacije na miševima

[0416] Cilj studije bio je testiranje raspona odgovora na dozu sa određenim razvojnim kandidatom hMQ22.101f/LC41 ili hMQ22.101f/LC42 (gde su problemi sa izomerizacijom uklonjeni), u poređenju sa ranijim kandidatom hMQ22.101f/g i izotipski usklađenim kontrolnim antitelom MQR2.201 u modelu artritisa izazvanog antitelima kolagena (CAIA) na miševima. Kvantifikovan je otok šape i skočnog zgloba.

[0418] Komercijalno dostupan CAIA model miša od ModiQuest Research B.V. (kat. br.: MQ18.101) korišćen je prema specifikacijama proizvođača za indukovanje artritisa kod miševa. U tu svrhu, 2,8 mg mešavine antitela protiv kolagena-II je ubrizgano i.p. miševima DBA/J1. Tri dana kasnije, miševi su primili još jednu i.p. injekciju koja sadrži 25 μg LPS-a radi sinhronizacije upale između miševa. Istovremeno sa LPS-om, miševi su primili tACPA hMQ22.101f/g, hMQ22.101f/LC41 ili hMQ22.101f/LC42 (6,25, 12,5 i 25 mg/kg), nesrodno izotipski podudarno kontrolno antitelo MQR2.201 (25 mg/kg) ili placebo (fiziološki rastvor soli od 0,9% NaCl). Tipično, upala u prednjim i zadnjim šapama postajala je vidljiva već 2 dana nakon injekcije LPS-a (tj.5. dan). Stepen otoka u šapama je makroskopski ocenjivan od 0. dana, tokom vremenskog perioda od 13 dana. Maksimalni stepen otoka je 8 (podeljeno na 4 šape). Za sistem bodovanja pogledajte tabelu ispod.

[0421]

[0424] Rezultati su prikazani na Slici 8. Miševi koji su tretirani terapeutskim antitelom pokazali su značajno smanjenu upalu u šapama na način zavisan od doze, u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelom ili fiziološkim rastvorom soli. Oba optimizovana vodeća antitela, hMQ22.101f/LC41 i hMQ22.101f/LC42 (gde su problemi sa izomerizacijom uklonjeni), sprečila su upalu čak i više od prethodnog vodećeg kandidata hMQ22101f/g, što je jasno prikazano pri dozi od 25 mg/kg (Slika 8, gornji panel). Nisu primećeni neželjeni efekti. Pri najnižoj dozi od 6,25 mg/kg (Slika 8, donji panel), hMQ22.101f/LC41 je nadmašio sva ostala antitela, sa vrednostima p Studentovog t-testa na 13. dan od p<0,001, p<0,05 i p=0,46 za hMQ22.101f/LC41, hMQ22.101f/LC42 i hMQ22.101f/g, respektivno, u poređenju sa grupom tretiranom placebom.

[0426] Primer 14: Dalja karakterizacija kandidata za razvoj hMQ22.101f/LC41 u in vitro NET testu kod miša

[0427] Da bi se dodatno potvrdila ideja da je hMQ22.101f/LC41 snažan inhibitor formiranja NET-a, proučavano je vezivanje hMQ22.101f/LC41 za NET-ove i pre-NET-ove kod miša, kao i inhibicija formiranja NET-a kod miša, kao što je navedeno u nastavku. Pre-NET-ovi su definisani kao neutrofili sa amorfnom dekondenzovanom nukleusnom strukturom koja sadrži citrulinisani hromatin koji se i dalje pojavljuje intracelularno, sa kolabiranom nuklearnom membranom.

[0429] [0141] Cilj ove studije bio je da se testira da li je označeni kandidat za razvoj hMQ22.101f/LC41 sposoban da inhibira formiranje NET-ova kod miševa. Neutrofili su izolovani iz koštane srži miševa C57BL/6J negativnom selekcijom korišćenjem kompleta za obogaćivanje neutrofila za miševe EasySep™ (Stemcell Technologies) prema uputstvima proizvođača. Čistoća izolovanih neutrofila je proverena protočnom citometrijom korišćenjem antitela na Ly6G (Biolegend) i bila je iznad 90%. Izolovani neutrofili koštane srži su podešeni na koncentraciju od 2 × 10<6>ćelija/ml u HBSS-u koji sadrži kalcijum i magnezijum. Ukupno 100 μl ćelijske suspenzije je dodato u svaki bunarčić komore sa 8 bunarića (Thermo Fisher Scientific). 25 μg/ml hMQ22.101f/LC41, MQR2.201 ili bez antitela je inkubirano sa ćelijama tokom 15 minuta pre dodavanja 150 μl HBSS-a koji sadrži 1 μg/ml A23187 ili kontrolnog nosača ćelijama. Komora je inkubirana 3 sata na 37°C i 5% CO<2>. Nakon toga, 2% (v/v) paraformaldehida (Merck) je dodato u svaki bunaric i preparati su inkubirani 12 sati na 4°C. Uzorci su blokirani sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FCS; Biochrome) u PBS-u tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Primarno zečje anti-citH3 antitelo (Abcam, ab5103; 1:200), ili TRITC-konjugovano kozje anti-humano IgG (Jackson Immunoresearch, 109‑025‑003; 1:100) su dodato u 10% FCS u PBS-u tokom 12 sati na 4°C. Slajdovi su isprani tri puta sa PBS-om, a sekundarno Cy5-konjugovano kozje anti-zečje IgG antitelo (Jackson ImmunoResearch, 111‑175‑144; 1:400) je dodato tokom 1,5 sata na sobnoj temperaturi u mraku. Slajdovi su ponovo isprani tri puta sa PBS-om. Rastvor za bojenje koji sadrži 2,5 μM Hoechst-a u PBS-u je dodat tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja sa PBS-om, uzorci su ugrađeni u medijum za montiranje (BIOZOL). Slajdovi su analizirani na BZ-X710 mikroskopu (Keyence), a NET i pre-NET su kvantifikovani pomoću Fiji softvera za obradu slika (Slika 9A).

[0430] Reprezentativne slike koje prikazuju vezivanje hMQ22.101f/LC41 (hIgG; crveno) za NET-ove (žuta strelica) i pre-NET-ove (bela strelica) prikazane su na Slici 9B.

[0432] In vitro tretman neutrofila izvedenih iz koštane srži miša sa hMQ22.101f/LC41 rezultirao je smanjenom ekstruzijom NET-a izazvane A23187 u poređenju sa neutrofilima izvedenim iz koštane srži miša tretiranim MQR2.201 (Sl.9A). Pored toga, hMQ22.101f/LC41 se vezuje za izbačene NET-ove miša (Sl.9B; žuta strelica) i pre-NET-ove (Sl 9B; bela strelica), što bi mogao biti prvi korak ka uklanjanju NET-a od strane makrofaga.

[0434] Primer 15: Dalja karakterizacija kandidata za razvoj hMQ22.101f/LC41 u in vivo testu NET/makrofaga kod miša korišćenjem korišćenjem modela peritonitisa izazvanog pristanom na miševima

[0436] Sposobnost kandidata za razvoj hMQ22.101f/LC41 da inhibira formiranje NET in vivo testirana je korišćenjem modela peritonealnog ćelijskog influksa indukovanog pristanom kod miša, koji su prethodno opisali Kienhefer i dr. (JCI Insight 2017; 2(1): e92920).

[0438] Ukratko, 50 mg/kg MQR2.201 ili hMQ22.101f/LC41 je primenjeno odmah nakon injekcije 500 μl pristanskog ulja (Sigma-Aldrich), nakon čega je usledila druga injekcija od 50 mg/kg MQR2.201 ili hMQ22.101f/LC41 12 sati kasnije. Nakon ukupno 24 sata, inflamatorne ćelije su izolovane iz peritoneuma, podešene na 1 × 106 ćelija/ml i prebačene ili na pločice protočne komore ili na pločice citospinom za analizu putem imunofluorescentne mikroskopije. Slajdovi su potom blokirani sa PBS 10% FCS i inkubirani sa zečjim anti-citH3 (Abcam, ab5103; 1:200), zečjim anti-NE (Abcam, ab21595; 1:200), AF488-konjugovanim pacovskim anti-mišjim F4/80 (Biolegend, 123120; 1:200) ili TRITC-konjugovanim kozjim antihumanim IgG (Jackson Immunoresearch, 109‑025‑003; 1:100). Slajdovi su isprani tri puta sa PBS-om i dodato je sekundarno Cy5-konjugovano kozje anti-zečje IgG antitelo (Jackson ImmunoResearch, 111‑175‑144; 1:400) tokom 1,5 sata na sobnoj temperaturi u mraku. Slajdovi su ponovo isprani tri puta sa PBS-om. Dodat je rastvor za bojenje koji sadrži 2,5 μM Hoechsta u PBS-u tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon pranja sa PBS, uzorci su ugrađeni u medijum za montiranje (BIOZOL). Slajdovi su analizirani na BZ-X710 mikroskopu (Keyence) (Slika 10A i C), a NET i pre-NET kvantifikovani pomoću Fiji softvera za obradu slika (Slika 10B). Slika 10C prikazuje vezivanje hMQ22.101f/LC41 za NET i pre-NET. Slika 11 prikazuje apsorpciju NET obogaćenih hMQ22.101f/LC41 od strane makrofaga.

[0439] Smanjeni NET filamenti, koji sadrže DNK i citrulinisani histon 3 (citH3), primećeni su u peritonealnim ćelijama miševa tretiranih hMQ22.101f/LC41 u poređenju sa peritonealnim ćelijama miševa tretiranih MQR2.201 (Sl.10A). Kvantifikacija NET (kolokalizacija citH3 i DNK (Hoechst)) potvrdila je ovo zapažanje (Sl. 10B). Kolokalizacija DNK i citH3 je obeležje formiranja NET-a. Osim toga, hMQ22.101f/LC41 se vezuje za izbačene mišje NET-ove, kao i za mišje pre-NET-ove (Sl. 10C), što bi mogao biti prvi korak ka uklanjanju NET-a od strane makrofaga. Zaista, F4/80-pozitivni makrofagi su primećeni među ćelijskim infiltratima, koji su sadržali fagocitovani hMQ22.101f/LC41 u kombinaciji sa citH3 ili neutrofilnom elastazom (Sl.11).

[0441] Primer 16: CIA model RA kod miša

[0443] Da bi se ispitala efikasnost tACPA na oštećenje tkiva izazvano NET-om, korišćene su različite strategije smanjenog tACPA u modelu RA kod miša sa hroničnim kolagenom indukovanim artritisom (CIA).

[0445] Da bi se indukovao hronični artritis, goveđi kolagen II je razblažen do koncentracije od 2 mg/ml u 0,05 M sirćetne kiseline i emulgovan u jednakim zapreminama Frojndovog kompletnog adjuvansa. Na dan 0, mužjaci miševa DBA/J1 stari 10-12 nedelja imunizovani su intradermalno u osnovi repa sa 100 μg goveđeg CII. Na dan 21, miševi su primili i.p. buster injekcije od 50 μg goveđeg CII rastvorenog u PBS-u, a početak artritisa se javio nekoliko dana kasnije (Sl.12A). Miševi su smatrani da imaju artritis kada su primećene značajne promene crvenila i/ili otoka na prstima ili u drugim delovima šapa. Upala zglobova u svakoj šapi je ocenjena kao što je gore opisano (CAIA mišji model RA). Terapeutski tretman je započet rano nakon početka bolesti (između 21-28 dana) kada je srednji rezultat artritisa (MAS) bio ≥ 0,75 na proizvoljnoj skali od 0-8 (0-2 po šapi). Terapeutska primena sa četiri ponovljene intravenske injekcije u razmaku od četiri dana sa naznačenim dozama hMQ22.101j/e (50/10/10/10, 30/30/30/10 i 50/50/50/15 mg/kg) smanjila je MAS 14. dana za 38%, 52% i 81%, respektivno, u poređenju sa 50/50/50/50 mg/kg MQR2.201 (Sl. 12B). Miševi su evidentirani 14. dana nakon početka lečenja. Zglobovi skočnog i zgloba kolena su sakupljeni i čuvani u formalinu za histološku analizu. Važno je napomenuti da su svi tretmani hMQ22.101j/e sprečili razvoj bolesti tokom prvih 8 dana, nakon čega je MAS počeo da raste, verovatno zbog razvoja antitela protiv leka kod ovih miševa. Samo tretman sa 50/50/50/15 mg/kg hMQ22.101j/e je potpuno stabilizovao bolest ukupno 14 dana, ne prelazeći MAS od 0,75.

[0447] Radi daljeg proučavanja efekta tACPA na oštećenje kostiju, izvršena je rendgenska analiza kolena i skočnih zglobova svih zadnjih šapa iz režima lečenja hMQ22.101j/e i MQR2.201. U skladu sa primećenim MAS, svi tretmani hMQ22.101j/e suzbili su oštećenje kostiju i u skočnim zglobovima i u kolenima (Sl. 12C). Da bi se dobio dalji uvid u zaštitni efekat tACPA, izvršena je histološka analiza skočnih zglobova korišćenjem H&E i bojenja safraninom O (SO). U poređenju sa miševima tretiranim MQR2.201, hMQ22.101j/e je inhibirao priliv inflamatornih ćelija (Sl.12D). Osim toga, u poređenju sa miševima tretiranim MQR2.201, hMQ22.101j/e je značajno smanjio eroziju kostiju i hrskavice, kao i smanjenje proteoglikana hrskavice i smrt hondrocita (Sl 12E do H). Ovi podaci ukazuju da tACPA snažno ublažava simptome artritisa, uključujući oštećenje zglobova.

[0449] [0149] Zatim smo ispitali prisustvo neutrofila i NET-ova u šapama CIA miševa koji su primili 50/50/50/15 mg/kg hMQ22.101j/e ili 50/50/50/50 mg/kg MQR2.201. Mišji neutrofilni marker Ly6G, citrulinisani histon 3 (citH3) i mijeloperoksidaza (MPO) su demonstrirani kod životinja tretiranih MQR2.201, dok su ovi markeri bili gotovo odsutni kod miševa tretiranih hMQ22.101j/e (Sl.12I). DAPI je korišćen kao boja za nuklearnu i ekstracelularnu DNK (Sl.12I). Kvantifikacija neutrofila (Ly6G) i NET-ova (kolokalizacija citH3 i MPO) izvršena je analizom višestrukih zglobova desne zadnje šape svake životinje, uključujući tibiotarzalni zglob, proksimalni intertarzalni zglob, distalni intertarzalni zglob i tarzometatarzalni zglob. U poređenju sa miševima tretiranim MQR2.201, smanjena količina i neutrofila (Sl.12J) i NET-ova (Sl.12K) primećena je u zglobovima miševa tretiranih hMQ22.101j/e. Otkrili smo da je količina NET-ova u zglobu značajno korelirana sa makroskopskim otokom šape (Sl.12L; r = 0,6120, P = 0,0041). Slično tome, primećena je značajna korelacija između otoka šape i prisustva neutrofila u zglobu (Sl. 12M; r = 0,8729, P < 0,0001). Zajedno, ovi podaci ukazuju da tretman tACPA rezultira eradikacijom NET-ova u upaljenom tkivu in vivo, čime se sprečava teško uništavanje kostiju i tkiva. Primer 17: hMQ22.101j/e se ne vezuje za zdrave leukocite

[0450] Krv zdravih dobrovoljaca (ZDV), sakupljena u epruvete sa litijum-heparinom, dobijena je iz banke krvi Sanquin u Najmegenu, Holandija. Svi davaoci krvi dali su informisani pristanak. Centrifugiranje sa gradijentom gustine fikola je izvršeno da bi se odvojile mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i neutrofili. PBMC su sakupljene i isprane tri puta sa RPMI 1640 dopunjenim sa 10% (v/v) toplotno inaktiviranog fetalnog telećeg seruma (FCS) i 50 U/ml penicilina-streptomicina (u daljem tekstu RPMI 10%) da bi se uklonili trombociti. Suspenzija neutrofila/eritrocita je pomešana sa 6% (mas/v) dekstranom u 0,9% NaCl i inkubirana 25 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, neutrofili su sakupljeni, izloženi amonijum-hlorid-kalijum (ACK) puferu tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi radi lize preostalih eritrocita i isprani dva puta sa RPMI 10%.

[0451] PBMC i neutrofili su zasejani na ploču sa 96 bunarića sa V-dnom, pri gustini od 2x10<5>ćelija/bunariću u FACS puferu. Ćelije su inkubirane sa Human Trustain FcX (1:50 razblažen u FACS puferu) tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi da bi se blokirali Fc receptori. Nakon toga, PBMC su inkubirane 45 minuta na sobnoj temperaturi sa mešavinom antitela koja sadrži 6,25 μg/ml HiLyteTMFluor 488-konjugovanog hMQ22.101j/e, 0,17 μg/ml anti-CD3, 1 μg/ml anti-CD11c, 0,33 μg/ml anti-CD14, 0,17 μg/ml anti-CD20, 83 ng/ml anti-CD45 i 0,17 μg/ml anti-CD56, dok su neutrofili inkubirani sa mešavinom antitela koja sadrži 6,25 μg/ml HiLyteTMFluor 488-konjugovanog hMQ22.101j/e, 83 ng/ml anti-CD45 i 83 ng/ml anti-CD66b. Kao pozitivna kontrola za vezivanje hMQ22.101j/e konjugovanog sa HiLyteTMFluor 488, neutrofili su stimulisani 45 minuta sa 5 μM A23187 pre blokiranja Fc receptora. Nakon inkubacije antitela, PBMC i neutrofili su fiksirani sa 4% formaldehidom tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi, isprani FACS puferom i analizirani pomoću CytoFLEX protočnog citometra. hMQ22.101j/e konjugovan sa HiLyteTMFluor 488 nije se vezao za zdrave mirujuće T ćelije, B ćelije, monocite, prirodne ćelije ubice (NK), dendritične ćelije (DC) ili neutrofile, ali se jeste vezao za aktivirane neutrofile (Slika 13). Uporedivi rezultati su očekivani za hMQ22.101f/LC41 antitelo.

[0452] Popis lista sekvenci

[0453]

[0454] SEQ ID NO: 1‑ CDR1 od msVH22.101 i hVH22.101(HC)x

[0455] GYTFTNYG SEQ ID NO: 2‑ CDR2 od msVH22.101 i hVH22.101(HC)x

[0456] INTYSGEA SEQ ID NO: 3‑ CDR3 od msVH22.101 i hVH22.101(HC)x

[0457] LRGYTYQSFDEGGDY SEQ ID NO: 4‑ CDR2 od msVL22.101 i hVL22.101(LC)y

[0458] LVS

[0459] SEQ ID NO: 5‑ CDR3 od msVL22.101 i hVL22.101(LC)y

[0460] WQGTHFPYT SEQ ID NO: 6‑ CDR1 od hVL22.101LC17

[0461] QSLLDTDGKTY SEQ ID NO: 7‑ CDR1 od hVL22.101LC21

[0462] QSLLDSDAKTY SEQ ID NO: 8‑ CDR1 od hVL22.101LC27

[0463] QSLLDTDAKTY SEQ ID NO: 9‑ CDR1 od hVL22.101LC41

[0464] QSLLDADGKTY SEQ ID NO: 10‑ CDR1 od hVL22.101LC42

[0465] QSLLDNDGKTY SEQ ID NO: 11‑ hVH22.101f

[0467]

[0470] SEQ ID NO: 18‑ SEQ ID NO 1 iz WO2016092082 (korišćen u Primeru 1/7) iz histona 2A SGXGKQGGKARA

[0471] Gde X je citrulin

[0472] SEQ ID NO: 19‑ SEQ ID NO 2 iz WO2016092082, (korišćen u Primeru 7) iz histona 4 SGXGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR

[0473] Gde X je citrulin

[0474] SEQ ID NO: 20‑ Skraćena SEQ ID NO 2 iz WO2016092082 (korišćen u Primeru 7) iz histona 4 SGXGKGGKGLGK

[0475] Gde X je citrulin

[0476] SEQ ID NO: 21‑ Peptid br 4 (humani histon 2A) (SEQ ID NO 24 iz WO2011070172) QFPVGXVHRLLR

[0477] Gde X je citrulin

[0478] SEQ ID NO: 22‑ Peptid br 6 (humani histon 2A) (SEQ ID NO 26 iz WO2011070172) VHRLLXKGNYSE

[0479] Gde X je citrulin

[0480] SEQ ID NO: 23‑ Konstantni domen humanog teškog lanca IgG1

[0481] SEQ ID NO: 30‑ msVL22.101

[0483]

[0485] QSLLDSDGKTY SEQ ID NO: 37‑ CDR1 od hVL22.101e

[0486] QSLVDSDGKTY SEQ ID NO: 38‑ CDR1 od hVL22.101h

[0487] QSLVASDGKTY SEQ ID NO: 39‑ CDR1 od hVL22.101i

[0488] QSLVESDGKTY SEQ ID NO: 40‑ CDR1 od hVL22.101j

[0489] QSLVSSDGKTY SEQ ID NO: 41‑ CDR1 od hVL22.101LC16 QSLLESDGKTY SEQ ID NO: 42‑ CDR1 od hVL22.101LC19 QSLLDSEGKTY SEQ ID NO: 43‑ CDR1 od hVL22.101LC20 QSLLDSSGKTY SEQ ID NO: 44‑ CDR1 od hVL22.101LC22 QSLLESEGKTY SEQ ID NO: 45‑ CDR1 of hVL22.101LC23 QSLLESSGKTY

[0490] SEQ ID NO: 46‑ CDR1 od hVL22.101LC24

[0491] QSLLESDAKTY SEQ ID NO: 47‑ CDR1 od hVL22.101LC25

[0492] QSLLDTEGKTY SEQ ID NO: 48‑ CDR1 od hVL22.101LC26

[0493] QSLLDTSGKTY SEQ ID NO: 49‑ CDR1 od hVL22.101LC37

[0494] QSLLDSAGKTY SEQ ID NO: 50‑ CDR1 od hVL22.101LC38

[0495] QSLLESAGKTY SEQ ID NO: 51‑ CDR1 od hVL22.101LC39

[0496] QSLLDAEGKTY SEQ ID NO: 52‑ CDR1 od hVL22.101LC40

[0497] QSLLDNEGKTY SEQ ID NO: 53‑ msFibβ XG (SEQ ID NO 37 iz WO2011070172) EPTDSLDAXGHRPVDRR

[0498] Gde X je citrulin

[0499] SEQ ID NO: 54‑ msVim XS/XL (SEQ ID NO 38 iz WO2011070172) YVTXSSAVXLXSSVP

[0500] Gde X je citrulin

[0501] SEQ ID NO: 55‑ Region oko CDR2 od msVL22.101 i hVL22.101(LC)y LVSKLDS SEQ ID NO: 56‑ Konstantni domen teškog lanca hCH22.101f

[0503]

[0505] Citryll B.V.

[0506] Zastupaju,

Claims (15)

1. Patentni zahtevi

1. Antitelo ili njegov vezujući fragment koji se specifično vezuje za citrulinisani epitop na deiminovanom humanom histonu 2A i/ili histonu 4, pri čemu antitelo ili njegov vezujući fragment sadrži:

a) VL CDR 1 SEQ ID NO: 9 (QSLLDADGKTY); i

b) VH CDR 1 SEQ ID NO: 1 (GYTFTNYG), VH CDR 2 SEQ ID NO: 2 (INTYSGEA), VH CDR 3 SEQ ID NO: 3 (LRGYTYQS FDEGGDY), VL CDR 2 SEQ ID NO: 4 (LVS) i VL CDR 3 SEQ ID NO: 5 (WQGTHFPYT).

2. Antitelo ili njegov vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo ili njegov vezujući fragment sadrži:

a) VL CDR1 SEQ ID NO: 9;

b) VL CDR2 SEQ ID NO:4 i VL CDR3 SEQ ID NO:5; i

c) aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 11 ili 12.

3. Antitelo ili njegov vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde antitelo ili njegov vezujući fragment sadrži:

a) aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 11 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 16;

ili

b) aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca navedenu u SEQ ID NO: 12 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca navedenu u SEQ ID NO: 16.

4. Antitelo ili njegov vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, izabran iz grupe koja se sastoji od rekombinantnih antitela, jednolančanih antitela, jednolančanih varijabilnih fragmenata (scFv), varijabilnih fragmenata (Fv), fragmenata regiona za vezivanje antigena (Fab), diatela i triatela.

5. Antitelo ili njegov vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koje je antitelo pune dužine, opciono koje sadrži Fc region izabran iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 regiona.

6. Antitelo ili njegov vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, koje sadrži konstantni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 23 ili 56, i/ili konstantni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 24.

7. Antitelo ili njegov vezujući fragment prema patentom zahtevu 6, gde antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 11, aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 16, aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 23 ili 56 i aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 24.

8. Antitelo ili njegov vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva konjugovan sa dodatnim ostatkom.

9. Polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, vektor za kloniranje ili ekspresiju koji sadrži navedeni polinukleotid, ili ćelija domaćina koja sadrži navedeni vektor za kloniranje ili ekspresiju.

10. Postupak za proizvodnju antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta koji se specifično vezuje za citrulinirani epitop na deimininovanom humanom histonu 2A i/ili histonu 4, koji obuhvata kultivaciju ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 9 i izolovanje antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta iz navedene ćelije.

11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv razblaživač ili nosač, i opciono dodatno sadrži drugi aktivni sastojak.

12. Antitelo ili njegov vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11, za upotrebu u terapiji.

13. Antitelo ili njegov vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11, za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja patologije povezane sa NET.

14. Antitelo, vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je patologija povezana sa NET-om sistemski eritematozni lupus (SLE), lupus, sepsa, vaskulitis, inflamatorni artritis, reumatoidni artritis i osteoartritis, psorijaza, Alchajmerova bolest, autoimuni hepatitis, juvenilni idiopatski artritis, Sjogrenova bolest, antifosfolipidni sindrom, Behčetova bolest, spondilitis, spondiloartropatija, multipla sistemska atrofija, Parkinsonova bolest, astma sa demencijom Levijevih tela, astma pogoršana alergijskim rinovirusom, alergijska astma, cistična fibroza, fibroza i idiopatska plućna fibroza, bolest suvog oka, uveitis, negranulomatozni uveitis, granulomatozni uveitis, dermatitis, atopijski dermatitis, HOBP, bronhitis ili druga patologija povezana sa NET-om, kao što je zarastanje rana kod dijabetesa, kancer, metastaze kancera i zdravlje transplantiranih organa in vivo ili ex vivo.

15. Antitelo, vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 12 do 14, gde je antitelo, njegov vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija formulisano za primenu parenteralnim putem primene kao što je intravenski, potkožni, intraokularni, intramuskularni, intradermalni, intraperitonealni, spinalni put ili injekcijom ili infuzijom; ili drugim putem primene kao što je rektalni, oralni, očni, topikalni, epidermalni, mukozni, lokalni, peritumoralni, jukstatumoralni, intratumoralni, do ivice resekcije tumora, intralezionalni, perilezionalni, infuzijom u šupljinu, intravezikularna primena ili inhalacija.