RS67470B1 - Lipozomska kompozicija i farmaceutska kompozicija - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] OSNOV PRONALASKA

[0005] 1. Oblast pronalaska

[0007] Predmetni pronalazak odnosi se na lipozomsku kompoziciju koja pokazuje visoko zadržavanje u krvi.

[0009] 2. Opis stanja tehnike u vezi sa pronalaskom

[0011] Često je izučavano da se pomoću lipozomske kompozicije lek akumulira na mestu oboljenja poput kancera, i da mu biva izložen tokom dugog vremenskog perioda. U lipozomskoj kompoziciji kao farmaceutskoj kompoziciji, lek je inkapsuliran u lipozomu koji je sačinjen od lipidne membrane.

[0012] Patentni dokument 1 i Nepatentni dokument 1 objavljuju lipozom, gde je topotekan inkapsuliran u lipozomu koji sadrži sfingomijelin i holesterol.

[0013] Patentni dokument 2 objavljuje lipozom, gde je topotekan inkapsuliran u lipozomu koji sadrži dihidrosfingomijelin i holesterol.

[0014] Patentni dokument 3 objavljuje lipozomsku formulaciju kamptotecina prilagođenu za povećanje stabilnosti kamptotecina, koja uključuje (a) kamptotecin inkapsuliran u lipozomu, (b) prvi rastvor koji je spoljašnji u odnosu na lipozom i ima pH 4.5 ili manje od 4.5, i (c) drugi rastvor koji je unutrašnji u odnosu na lipozom. Objavljeno je takođe da lipozom sadrži dihidrosfingomijelin i holesterol.

[0015] Patentni dokument 4 objavljuje sistem za efikasno punjenje lipozoma amfifilnim lekom, koji uključuje podešavanje lipozomske suspenzije u prisustvu amonijum jedinjenja ili amonijum soli, razblaživanje suspenzije puferom ili solju, i obezbeđivanje amonijumskog gradijenta od unutrašnjosti ka spoljašnjosti između unutrašnje vodene faze i spoljašnje vodene faze i pH gradijenta tako da pH vrednost u unutrašnjosti lipozoma bude kiselija od pH vrednosti izvan lipozoma.

[0016] [0007] Patentni dokument 5 objavljuje lipozom, gde je topotekan inkapsuliran u prisustvu amonijum sulfata u lipozomu koji sadrži prečišćeni hidrogenisani sojin fosfolipid ili sfingomijelin, holesterol, i lipid derivatizovan hidrofilnim polimerom. A. Fritze et al., Biochimica et Biophysica Acta 1758 (2006) 1633 razmatraju postupak za daljinsko punjenje lipozoma doksorubicinom. WO 2013/059922 A1 odnosi se na lipidne nanočestice ograničene veličine, pri čemu lipidne nanočestice imaju prečnik od oko 10 do oko 100 nm. G. Haran et al., Biochimica et Biophysica Acta 1151 (1993) 201 razmatraju ostvarivanje punjenja vodenog kompartmenta lipozoma amfipatičnim slabim bazama, uz korišćenje gradijenta amonijum sulfata u lipozomima [(NH<4>)<2>SO<4>]<lip>. > [(NH<4>)<2>SO<4>]<med>. C.O. Noble et al., Cancer Chemother. Parmacol. 64 (2009) 741 razmatraju pripremanje lipozomskih i imunolipozomskih formulacija dva alkaloida vinke, vinkristina i vinblastina, uz korišćenje unutarlipozomskog trietilamonijum saharozaoktasulfata. J.A. Zasadzinski et al., Current Opinion in Colloid & Interface Science 16 (2011) 203 razmatraju postupke samoasambliranja muitikompartmentskih lipidnih struktura koje obezbeđuju poboljšano zadržavanje leka u fiziološkim okruženjima i postupke spoljašnjeg ciljanja i pokretanja oslobađanja leka putem zagrevanja zracima bliskim infracrvenim, zlatnih nanoljuštura prikačenih ili inkapsuliranih u dvoslojne vezikule. M.J.W. Johnson et al., Biochimica et Biophysica Acta 1768 (2007) 1121 razmatraju osobine zadržavanja leka i dužine prisustva u cirkulaciji za lipozomske nanočestice koje sadrže dihidrosfingomijelin.

[0018] Dokumenti stanja tehnike

[0020] Patentni dokumenti

[0022]

[0024] Patentni dokument 1: US7060828B2

[0025] Patentni dokument 2: US7811602B2

[0026] Patentni dokument 3: JP2008‑519045A

[0027] Patentni dokument 4: JP1990‑196713A (JP-H02‑196713A)

[0028] Patentni dokument 5: US6355268B2

[0030] Nepatentni dokument 1: AACR-EORTC međunarodna konferencija, San Francisko, Kalifornija, 22‑26. oktobar 2007, #C113 A pharmacokinetics study of a novel sphingomyelin/cholesterol liposomal topotecan and non-liposomal topotecan in rats, William C. Zamboni et al.

[0032] KRATAK OPIS PRONALASKA

[0034] [0010] Gore pomenuti Patentni dokumenti 1, 2 i 3 i Nepatentni dokument 1 objavljuju da se efikasnost leka poboljšava inkapsuliranjem topotekana u lipozom koji sadrži sfingomijelin ili dihidrosfingomijelin da bi se suzbilo curenje topotekana u krv i poboljšalo područje ispod krive koncentracije u krvi u odnosu na vreme (area under the blood concentration-time curve, AUC). Međutim, pošto kompozicija lipida koji sačinjavaju lipozom i kompozicija soli koje precipitiraju topotekan nisu bile optimizovane, poboljšanje AUC nije bilo dovoljno i prema tome, potrebno je dodatno poboljšanje AUC.

[0035] Pored toga, u slučaju kada topotekan curi iz unutrašnje vodene faze lipozoma u spoljašnju vodenu fazu i zatim biva izložen neutralnim uslovima, topotekan prelazi u svoje analoge. Specifično N-N bis adukt sa ekstremno niskom rastvorljivošću (topotekan-aminski dimer) ili slično može da formira precipitat u vidu kristala. Konačno, nastaje mnogo nerastvorljivih čestica koje odstupaju od standarda bezbednosti i kvaliteta koje su definisale Američka agencija za hranu i lekove (US Food and Drug Administration, FDA), Japanska agencija za farmaceutske proizvode i medicinske uređaje (Japan’s Pharmaceutical and Medical Device Agency, PMDA) i Evropska agencija za lekove (European Medicines Agency, EMEA), koje su, prema tome, nepoželjne. Da bi se suzbilo formiranje takvih nerastvorljivih čestica, u Patentnom dokumentu 3 vrednost pH spoljašnje vodene faze se postavlja na uslove kiselosti. Međutim, u slučaju kada je spoljašnja vodena faza u uslovima kiselosti, pokreće se razgradnja lipida koji sačinjavaju lipozom, što je nepovoljno za stabilnost lipozoma. U lipozom Patentnog dokumenta, pošto je neophodno da se spoljašnja vodena faza zakiseli, teško je dodati diacilfosfatidiletanolamin modifikovan metoksipolietilenom, koji podleže hidrolizi u kiseloj sredini, kako bi se poboljšalo zadržavanje u krvi.

[0036] Cilj predmetnog pronalaska je obezbeđivanje lipozomske kompozicije i farmaceutske kompozicije, koje pokazuju visoku AUC.

[0037] Kao rezultat obimnih studija za postizanje gore navedenog cilja, ovi izumitelji su ustanovili da je moguće obezbediti lipozomsku kompoziciju koja postiže gore navedeni cilj putem konfiguracije koja diacilfosfatidiletanolamin modifikovan hidrofilnim polimerom, dihidrosfingomijelin i holesterole koristi kao komponente lipozomske membrane, unutrašnja vodena faza istog sadrži amonijum sulfat, a molarni odnos sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi prema leku u čitavoj vodenoj fazi podešen je tako da iznosi 0.36 ili više. Predmetni pronalazak je izveden na osnovu ovih nalaza.

[0038] Predmetni pronalazak je, prema tome, izložen u priloženim patentnim zahtevima.

[0039] KRATAK OPIS CRTEŽA

[0041]

[0042] Sl. 1 prikazuje rezultate merenja telesne težine u testu efikasnosti leka, uz korišćenje mišjeg modela potkožne transplantacije A549.

[0043] Sl. 2 prikazuje rezultate merenja telesne težine u testu efikasnosti leka, uz korišćenje mišjeg modela potkožne transplantacije A549.

[0044] Sl. 3 prikazuje rezultate merenja zapremine tumora u testu efikasnosti leka, uz korišćenje mišjeg modela potkožne transplantacije A549.

[0045] Sl. 4 prikazuje rezultate merenja zapremine tumora u testu efikasnosti leka, uz korišćenje mišjeg modela potkožne transplantacije A549.

[0046] Sl. 5 prikazuje vrednost AUC za svaku količinu holesterola.

[0047] Sl. 6 prikazuje rezultetate merenja zavisnosti amonijum jona od stope oslobađanja.

[0049] OPIS POŽELJNIH PRIMERA IZVOĐENJA

[0051] Numerički raspon označen korišćenjem "do" u ovoj specifikaciji označava raspon koji uključuje numeričku vrednost opisanu pre i posle "do" kao minimalnu vrednost, odnosno maksimalnu vrednost.

[0052] Kada se u ovom tekstu govori o sadržaju komponente u kompoziciji, u slučaju kada postoji više supstanci koje odgovaraju komponenti u kompoziciji, sadržaj označava, ukoliko nije drugačije naznačeno, ukupnu količinu više supstanci koje postoje u kompoziciji.

[0053] Izraz "zadržavanje u krvi" označava odliku gde je lek, kada je u stanju inkapsuliranosti u lipozomu, prisutan u krvi subjekta kod kojeg je primenjena lipozomska kompozicija.

[0054] "Prosečna veličina čestice lipozoma" označava kumulantnu prosečnu veličinu čestica izmerenu korišćenjem postupka dinamičkog rasipanja svetlosti, ukoliko nije drugačije specifikovano. Primeri komercijalno dostupnih mernih uređaja koji koriste postupak dinamičkog rasipanja svetlosti uključuju analizator veličine čestica za koncentrovane sisteme FPAR‑1000 (proizvođač Otsuka Electronics Co., Ltd.), NANOTRAC UPA (proizvođač Nikkiso Co., Ltd.), i NANOSIZER (proizvođač Malvern Panalytical Ltd.). Moguće je izračunati i zapreminsku prosečnu veličinu čestica i numeričku prosečnu veličinu čestica lipozoma korišćenjem jednačine za konverziju, koja je specifična za merni uređaj svakog od proizvođača.

[0055] Da bi se izmerile čestice veličine oko 100 nm, raspodela čestica se ne može precizno zabeležiti postupkom statičkog rasipanja svetlosti ili slično, pa je poželjno merenje postupkom dinamičkog rasipanja svetlosti.

[0056] [0021] Termin "nerastvorljive čestice" je stavka koju su regulatorni organi poput PMDA, FDA, i EMEA postavili kao standard bezbednosti i kvaliteta u medicinskim kompozicijama za sistemsku primenu, kao što su formulacije za intravensko injektiranje. Na primer, u slučaju evaluacije farmaceutske kompozicije prvim postupkom (postupak brojanja čestica blokiranjem svetlosti), testnim postupkom za nerastvorljive čestice (Insoluble Particulate Test Method) Farmakopeje Japana <6.07> Injekcije u Japanu, potrebno je da broj nerastvorljivih čestica veličine 10 µm ili više, sadržanih u jednoj bočici leka kao proizvoda, koje pokazuju zapreminu manju od 100 mL bude 6000 ili manje, a broj nerastvorljivih čestica veličine 25 µm ili više bude 600 ili manje. Pored toga, u slučaju evaluacije farmaceutske kompozicije drugim postupkom (postupak brojanja čestica mikroskopom) potrebno je da broj nerastvorljivih čestica veličine 10 µm ili više bude 6000 ili manje, a broj nerastvorljivih čestica veličine 25 µm ili više bude 600 ili manje.

[0057] Nerastvorljive čestice definišu se samo po veličini čestica, bez obzira na komponente čestica. Na primer, u lipozomskoj kompoziciji, nerastvorljive čestice mogu biti agregati samih lipozoma, agregati i precipitati komponenti leka koje su iscurele iz unutrašnjosti lipozoma, ili agregati i precipitati komponenti spoljašnje vodene faze lipozoma. Posebno, prema opisu JP2008‑519045A i slično, poznato je da je lipozom sa inkapsuliranim topotekanom u predmetnom pronalasku precipitat nastao curenjem inkapsuliranog topotekana iz lipozoma, što je bilo praćeno razgradnjom u manje rastvorljiv proizvod razgradnje.

[0058] Kao postupak merenja nerastvorljivih čestica, postoje, na primer, postupak brojanja čestica blokiranjem svetlosti, koji vrši optičku detekciju nerastvorljivih čestica (koristi se brojač čestica, na primer, HIAC 9703+ proizvođača Beckman Coulter, Inc. ili Accusizer A2000 USP proizvođača Particle Sizing Systems, Inc.) i postupak brojanja čestica mikroskopom, kojim se vizuelno posmatra slika uvećana pomoću mikroskopa i broje nerastvorljive čestice.

[0059] U slučaju lipozomske farmaceutske kompozicije, posebno u slučaju injektabilne formulacije, poželjno je da, kako je definisano u testnom postupku za nerastvorljive čestice, Farmakopeje Japana <6.07> Injekcije, broj čestica veličine preko 10 µm, sadržanih u farmaceutskoj kompoziciji, u vreme upotrebe bude 6000 ili manje, i da broj čestica veličine preko 25 µm bude 600 ili manje.

[0060] [0025] U injektabilnoj formulaciji lipozomske farmaceutske kompozicije, smatra se da uzrok formiranja nerastvorljivih čestica može biti uglavnom agregiranje, koalescencija, i razgradnja komponenti lipozomske čestice, do čega dolazi tokom skladištenja, ali se ne ograničava na njih. Tendencija nastanka nerastvorljivih čestica zavisi od količine lipida koji su glavni materijal koji sačinjava lipozom. Na primer, u slučaju razmatranja farmaceutske kompozicije koja sadrži 2 mL lipozomske kompozicije sa koncentracijom lipida od 20 mmol/L i zatim u slučaju kada broj čestica veličine preko 10 µm iznosi 150 ili manje, i broj čestica veličine preko 25 µm iznosi 15 ili manje po 1 µmol lipida, moguće je zadovoljiti uslov da broj čestica veličine preko 10 µm, sadržanih u farmaceutskoj kompoziciji bude 6000 ili manje, i broj čestica veličine preko 25 µm bude 600 ili manje, što je standard definisan u testnom postupku za nerastvorljive čestice Farmakopeje Japana <6.07> Injekcije.

[0061] Isto tako, u lipozomskoj kompoziciji prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska, poželjno je da broj čestica veličine preko 10 µm bude 150 ili manje i da broj čestica veličine preko 25 µm bude 15 ili manje po 1 µmol lipida posle skladištenja u trajanju od 1 meseca na 5°C. Poželjnije je da broj čestica veličine preko 10 µm bude 75 ili manje i da broj čestica veličine preko 25 µm bude 7.5 ili manje po 1 µmol lipida posle skladištenja u trajanju od 1 meseca na 5°C. Još poželjnije je da broj čestica veličine preko 10 µm bude 25 ili manje i da broj čestica veličine preko 25 µm bude 2.5 ili manje po 1 µmol lipida posle skladištenja u trajanju od 1 meseca na 5°C.

[0062] Pored toga, često dolazi do porasta grubih čestica veličine preko 10 µm zbog propadanja tokom skladištenja, a poželjno je zadovoljiti gore navedeni broj čestica čak i posle skladištenja u trajanju od 3 meseca, i još je poželjnije zadovoljiti gore navedeni broj čestica čak i posle skladištenja u trajanju od 1 godine.

[0063] "Subjekt" je sisar koji je čovek, miš, majmun ili domaća životinja kojoj je potrebno preveniranje ili lečenje oboljenja ili slično, i poželjno je čovek kojem je potrebno preveniranje ili lečenje oboljenja ili slično.

[0064] U nastavku ovog teksta predmetni pronalazak će biti detaljno opisan.

[0065] Lipozomska kompozicija prema prvom primeru izvođenja predmetnog pronalaska je lipozomska kompozicija koja sadrži lipozome od kojih svaki ima unutrašnju vodenu fazu i vodeni rastvor koji čini spoljašnju vodenu fazu i u kojem su lipozomi dispergovani, pri čemu lipozom sadrži diacilfosfatidiletanolamin modifikovan hidrofilnim polimerom, dihidrosfingomijelin, i holesterole, gde svaki od lipozoma inkapsulira lek, pri čemu unutrašnja vodena faza sadrži amonijum sulfat, i molarni odnos sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi prema leku u čitavoj vodenoj fazi iznosi 0.36 ili više.

[0066] Pored toga, lipozomska kompozicija prema drugom primeru izvođenja predmetnog pronalaska je lipozomska kompozicija koja uključuje diacilfosfatidiletanolamin modifikovan hidrofilnim polimerom, dihidrosfingomijelin, i holesterole kao komponente lipozomske membrane, gde lipozomska kompozicija inkapsulira lek, njena unutrašnja vodena faza sadrži amonijum sulfat, i dihidrosfingomijelin je dihidrosfingomijelin koji sadrži dugolančanu alkil grupu sa 16 ugljenikovih atoma i dugolančanu alkil grupu sa 18 ugljenikovih atoma.

[0067] U predmetnom pronalasku, zadržavanje lipozoma u krvi poboljšano je korišćenjem diacilfosfatidiletanolamina modifikovanog hidrofilnim polimerom, dihidrosfingomijelina, i holesterola kao komponenti lipozomske membrane. Pored toga, uključivanjem amonijum sulfata u unutrašnju vodenu fazu suzbija se curenje leka iz lipozoma u krv i, prema tome, poboljšava AUC. Pored toga, postavljanjem molarnog odnosa sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi prema leku u čitavoj vodenoj fazi na 0.36 ili više, curenje leka iz lipozoma u krv je dodatno suzbijeno i, dakle, postignuta je viša vrednost AUC.

[0068] Kao rezultat gore navedenog, curenje leka iz unutrašnje vodene faze u spoljašnju vodenu fazu može da bude suzbijeno čak i tokom skladištenja na hladnom, i nastajanje nerastvorljivih čestica može da se suzbije čak i pod neutralnim uslovima. To znači, u lipozomskoj kompoziciji prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska, pH spoljašnje vodene faze može da se postavi na vrednost blizu neutralne (pH 7.4), i upotreba "diacilfosfatidiletanolamina modifikovanog hidrofilnim polimerom" koji podleže hidrolizi u uslovima kiselosti, postaje moguća kako bi se poboljšalo zadržavanje lipozoma u krvi.

[0070] (Lipozom)

[0072] Lipozom je zatvoreno vezikularno telo formirano od dvoslojne lipidne membrane koja koristi lipide, i unutar prostora zatvorene vezikule ima vodenu fazu (unutrašnja vodena faza). Unutrašnja vodena faza sadrži vodu i slično. Lipozom je obično prisutan u stanju dispergovanosti u vodenom rastvoru (spoljašnja vodena faza) izvan zatvorene vezikule. Lipozom može biti jednolamelaran (označava se još i kao jednoslojan lamelaran ili unilamelaran, i predstavlja strukturu koja ima jednu dvoslojnu membranu) ili višeslojan lamelaran (označava se i kao multilamelaran i predstavlja strukturu sličnu lukovici sa više dvoslojnih membrana, gde su pojedinačni slojevi odvojeni vodenim slojevima). U predmetnom pronalasku, jednolamelaran lipozom je sa stanovišta bezbednosti i stabilnosti poželjan u farmaceutskim primenama.

[0073] Lipozom nije posebno ograničen u smislu svoje forme sve dok je to lipozom koji može da inkapsulira lek. "Inkapsulirati" znači zadobiti formu u kojoj je lek sadržan u unutrašnjoj vodenoj fazi i samoj membrani u odnosu na lipozom. Na primer, lipozom može biti forma u kojoj je lek inkapsuliran unutar zatvorenog prostora formiranog membranom, forma u kojoj je lek inkapsuliran u samoj membrani, ili njihova kombinacija.

[0074] Prosečna veličina lipozomske čestice je obično 10 nm do 1000 nm, poželjno 20 nm do 500 nm, poželjnije 30 do 300 nm, još poželjnije 30 nm do 200 nm, još poželjnije 150 nm ili manje, na primer, 30 nm do 150 nm, i posebno poželjno 70 do 150 nm.

[0075] Lipozom je poželjno sferičnog oblika ili je morfološki blizak tome.

[0076] Komponente koje čine lipidni dvosloj lipozoma biraju se od lipida. Kao lipidi, mogu se koristiti oni koji se mogu rastvoriti u rastvaraču koji je mešavina organskog rastvarača rastvorljivog u vodi i organskog rastvarača na bazi estra.

[0077] Lipozom u predmetnom pronalasku sadrži diacilfosfatidiletanolamin modifikovan hidrofilnim polimerom, dihidrosfingomijelin, i holesterole, kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

[0078] Lipozom je zatvoreno vezikularno telo formirano od dvoslojne lipidne membrane koja koristi lipide, kako je gore opisano, i uopšteno, lipidi kao osnovni materijal za formiranje dvoslojne lipidne membrane uključuju fosfolipide koji imaju dva acil lanca, na primer, prirodne ili sintetske fosfolipide kao što su fosfatidilholin (lecitin), fosfatidil glicerol, fosfatidinska kiselina, fosfatidilholin, fosfatidil etanolamin, fosfatidil serin, fosfatidil inozitol, sfingomijelin, i kardiolipin, i njihove hidrogenisane proizvode (na primer, hidrogenisani sojin fosfatidilholin (hydrogenated soybean phosphatidylcholine, HSPC)).

[0079] U predmetnom pronalasku, dihidrosfingomijelin, koji je fosfolipid sa dva acil lanca, koristi se kao lipid koji će biti osnovni materijal za formiranje dvoslojne lipidne membrane.

[0080] Korišćenjem dihidrosfingomijelina, može se poboljšati zadržavanje lipozoma u krvi.

[0081] Korišćenjem dihidrosfingomijelina kao osnovnog materijala membrane lipozoma, moguće je poboljšati particione osobine lipozomske membrane da bi se sprečilo curenje inkapsuliranog leka. Pretpostavlja se da je to zato što amidne veze dihidrosfingomijelina imaju snažnu sposobnost povezivanja preko vodonika i snažnom međusobnom interakcijom mogu formirati jaku i visokoparticionu membranu. Pored toga, amidne veze dihidrosfingomijelina snažno interaguju sa hidroksilnim grupama holesterola koji se istovremeno koristi u ovom pronalasku, pri čemu se može formirati membrana sa visokim particionim svojstvima. Ova funkcija se ne može postići sa lipidima koji se uobičajeno koriste kao što su HSPC i lecitin koji imaju estarske veze.

[0082] Pored toga, pošto potpuno zasićeni dihidrosfingomijelin ima višu tačku topljenja i manju mobilnost formirane membrane u odnosu na sfingomijelin koji ima amidne veze, ali ima nezasićene veze u acil lancu, pretpostavlja se da dihidrosfingomijelin može da formira membranu sa višim particionim svojstvima u odnosu na sfingomijelin.

[0083] [0045] Dihidrosfingomijelin uopšteno ima dve dugolančane alkil grupe u molekulu i primeri dihidrosfingomijelina koji ima dve dugolančane alkil grupe uključuju dihidrosfingomijelin koji ima dve dugolančane alkil grupe sa 16 ugljenikovih atoma, dihidrosfingomijelin koji ima dugolančane alkil grupe sa 16 ugljenikovih atoma i dugolančanu alkil grupu sa 18 ugljenikovih atoma, i dihidrosfingomijelin koji ima dugolančanu alkil grupu sa 16 ugljenikovih atoma i dugolančanu alkil grupu sa 20 do 24 ugljenikova atoma.

[0084] Poželjno je da se kao dihidrosfingomijelin upotrebi sledeće jedinjenje koje ima dugolančanu akil grupu sa 16 ugljenikovih atoma i dugolančanu akil grupu sa 18 ugljenikovih atoma, u smislu sprečavanja curenja leka iz lipozoma. Ovo je zbog toga što tačka topljenja postaje viša sa porastom broja ugljenikovih atoma i, prema tome, može da se formira lipozomska membrana sa visokim particionim svojstvima.

[0087]

[0090] Kao dihidrosfingomijelin može se koristiti, na primer, dihidrosfingomijelin dobijen redukcijom prirodnog sfingomijelina opštim postupkom, ili se može koristiti dihidrosfingomijelin dobijen sintezom.

[0091] Uopšteno, pošto većina dihidrosfingomijelina poreklom iz prirodnih proizvoda kao što su kokošja jaja, obično ima dve dugolančane alkil grupe sa 16 ugljenikovih atoma, poželjno je koristiti dihidrosfingomijelin dobijen hemijskom sintezom, sa stanovišta da dihidrosfingomijelin koji ima dugolančanu alkil grupu sa 16 ugljenikovih atoma i dugolančanu alkil grupu sa 18 ugljenikovih atoma može da se dobije sa visokom čistoćom.

[0092] Procenat dihidrosfingomijelina u komponentama lipozomske membrane (ukupni lipidi koji čine lipozom) poželjno iznosi 30 do 80 mol%, poželjnije 40 do 70 mol%, i još poželjnije 50 do 60 mol%.

[0093] Primeri hidrofilnog polimera u diacilfosfatidiletanolaminu modifikovanom hidrofilnim polimerom uključuju polietilen glikole, poliglicerine, polipropilen glikole, polivinil alkohole, alternirajuće kopolimere stirena/anhidrida maleinske kiseline, polivinilpirolidone, i sintetske poliaminokiseline. Gore pomenuti hidrofilni polimeri mogu se koristiti sami ili u kombinaciji od dva ili više njih.

[0094] Među njima, sa stanovišta zadržavanja kompozicije u krvi, poželjni su polietilen glikoli, poliglicerini, i polipropilen glikoli su poželjni, a polietilen glikol (polyethylene glycol, PEG), poliglicerin (polyglycerin, PG), polipropilen glikol (polypropylene glycol, PPG) i njihovi derivati su poželjniji.

[0095] Polietilen glikol (PEG) i njegovi derivati su još poželjniji sa stanovišta prilagodljivosti i zadržavanja u krvi.

[0096] Primeri derivata polietilen glikola (PEG) uključuju metoksi polietilen glikole bez posebnog ograničenja.

[0097] Molekularna težina polietilen glikola nije posebno ograničena, ali iznosi 500 do 10000 daltona, poželjno 1000 do 7000 daltona, i poželjnije 2000 do 5000 daltona.

[0098] Broj ugljenikovih atoma u acil komponenti diacilfosfatidiletanolamina je poželjno 16 ili više, na primer, poželjno 16 ili više i 30 ili manje, poželjnije 16 ili više i 24 ili manje, i još poželjnije 20.

[0099] Primeri diacilfosfatidiletanolamina modifikovanog polietilen glikolom uključuju 1,2-distearoil‑3-fosfatidiletanolamin polietilen glikole kao što su 1,2-distearoil‑3-fosfatidiletanolamin-PEG2000 (proizvođač Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), 1,2-distearoil‑3-fosfatidiletanolamin-PEG5000 (proizvođač Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) i distearoil glicerol-PEG2000 (proizvođač Nippon Oil & Fats Co., Ltd.).

[0100] Procenat diacilfosfatidiletanolamina modifikovanog hidrofilnim polimerom u komponentama lipozomske membrane (ukupni lipidi koji čine lipozom) poželjno iznosi 1 do 15 mol% i poželjnije 2 do 10 mol%.

[0101] Primeri holesterola uključuju holesterol koji sadrži ciklopentahidrofenantren kao osnovni skelet i u kojem su ugljenikovi atomi delimično ili potpuno hidrogenisani, i njegove derivate. Na primer, poželjan je holesterol. U slučaju kada se prosečna veličina lipozomskih čestica smanjuje na 100 nm ili manje, zakrivljenost lipidne membrane postaje veća. Veća postaje i deformacija membrane aranžirane u lipozom. Da bi se popunila deformacija membrane izazvana lipidom, efikasno je dodati holesterol ili slično (efekat stabilizacije membrane).

[0102] U vezi sa lipozomom, očekuje se da dodavanje holesterola smanji fluidnost membrane lipozoma, na primer, popunjavanjem procepa u membrani lipozoma.

[0103] Procenat holesterola u komponentama lipozomske membrane (lipidi koji čine lipozom) je poželjno od 20 mol% do 50 mol%, poželjnije od 30 mol% do 45 mol%, i još poželjnije od 35 mol% do 43 mol%.

[0104] Pored gore navedenih komponenti, lipozomu se može dodati hidrofilni polimer ili slično za poboljšanje zadržavanja u krvi, masna kiselina, diacetil fosfat ili slično kao stabilizator membranske strukture, ili α-tokoferol ili slično kao antioksidans. U predmetnom pronalasku, poželjno je ne koristiti aditiv kao pomoćno sredstvo za dispergovanje, koji nije prepoznat za upotrebu u intravenskim injekcijama za medicinsku upotrebu, na primer, surfaktant.

[0105] (Lek)

[0107] Lipozomska kompozicija prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska sadrži lek.

[0108] Tip leka nije posebno ograničen, ali se mogu koristiti antikancerska sredstva čiji su primeri dati u nastavku. Specifični primeri antikancerskog sredstva uključuju:

[0110] antikancerska sredstva na bazi antraciklina kao što su doksorubicin, daunorubicin i epirubicin;

[0111] antikancerska sredstva na bazi cisplatina kao što su cisplatin i oksaliplatin; antikancerska sredstva na bazi taksana kao što su paklitaksel i docetaksel; antikancerska sredstva na bazi alkaloida vinke kao što su vinkristin i vinblastin; antikancerska sredstva na bazi bleomicina kao što je bleomicin;

[0112] antikancerska sredstva na bazi sirolimusa kao što je sirolimus;

[0113] antikancerska sredstva na bazi kamptotecina kao što su topotekan (označen i kao nogitekan), irinotekan, karenitecin (registrovani žig) (označen i kao BNP1350), eksatekan, lurtotekan, gimatekan (označen i kao ST1481) i verotekan (označen i kao CKD602);

[0114] metaboličke antagoniste kao što su metotreksat, fluorouracil, gemcitabin, citarabin i pemetreksed; i

[0115] lekove koji ciljaju molekule, kao što su imatinib (Gleevec (registrovani žig)), everolimus (Afinitol (R)), erlotinib (Tarceva (registrovani žig)), gefitinib (Iressa (registrovani žig)), sunitinib (Sutent (registrovani žig)), sorafenib (Nexavar (registrovani žig)), dasatinib (Splicel (registrovani žig)), tamivaroten (Amnolake (registrovani žig)), tretinoin (Besanoid (registrovani žig)), bortezomib (Velcade (registrovani žig)) i lapatinib (Tykerb (registrovani žig)).

[0117] Među gore navedenim lekovima, poželjan je topotekan (označen i kao nogitekan), doksorubicin, irinotekan, ili sunitinib, poželjniji je topotekan.

[0118] Lek može da se koristi u formi soli.

[0119] Primeri soli leka uključuju soli u baznoj grupi kao što je amino grupa, hidroksil grupa, i kiseloj grupi kao što je karboksilna grupa, koje su opšte poznate u struci.

[0120] [0067] Primeri soli u baznoj grupi uključuju soli sa mineralnim kiselinama kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, fosforna kiselina, borna kiselina, azotna kiselina i sumporna kiselina; soli sa organskim karboksilnim kiselinama kao što su mravlja kiselina, sirćetna kiselina, mlečna kiselina, limunska kiselina, oksalna kiselina, fumarna kiselina, maleinska kiselina, ćilibarna kiselina, jabučna kiselina, vinska kiselina, asparaginska kiselina, trihlorosirćetna kiselina i trifluorosirćetna kiselina; i soli sa sulfonskim kiselinama kao što su metansulfonska kiselina, benzensulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, mesitilensulfonska kiselina i naftalensulfonska kiselina.

[0121] Primeri soli u kiseloj grupi uključuju soli sa alkalnim metalima kao što su natrijum i kalijum; soli sa zemno-alkalnim metalima kao što su kalcijum i magnezijum; amonijum soli; i soli sa organskim bazama koje sadrže azot kao što su trimetilamin, trietilamin, tributilamin, piridin, N,N-dimetilanilin, N-metilpiperidin, N-metilmorfolin, dietilamin, dicikloheksilamin, prokain, dibenzilamin, N-benzil-β-fenetilamin, 1-efenamin, i N,N’-dibenziletilendiamin.

[0122] Sadržaj leka u lipozomskoj kompoziciji nije posebno ograničen, ali poželjno iznosi 0.025 do 20 mg/ml i poželjnije 0.25 do 10 mg/ml u odnosu na lipozomsku kompoziciju.

[0123] Količina leka inkapsuliranog u lipozomu u odnosu na lipid koji formira membranu lipozoma je u molarnom odnosu od poželjno 0.1 do 1.5 i poželjnije 0.2 do 0.3 sa stanovišta stope oslobađanja iz lipozoma, osmotskog pritiska unutar lipozoma, i oblika lipozoma po precipitiranom leku.

[0124] U slučaju kada je molarni odnos količine leka prema lipidu suviše nizak, područje lipozomske membrane u odnosu na jediničnu količinu leka je povećano, stopa oslobađanja leka iz lipozoma je povišena i prema tome, funkcija poboljšanja zadržavanja u krvi je ometena. Sa druge strane, u slučaju kada je molarni odnos količine leka prema lipidu suviše visok, osmotski pritisak unutar lipozoma je povišen povećanom količinom rastvorenog leka, što onda rezultuje destrukcijom lipozoma ili, u slučaju kada dolazi do precipitacije leka unutar lipozoma, precipitirana čvrsta supstanca raste do veličine koja dovodi do deformacije oblika lipozoma.

[0125] (Amonijum sulfat u unutrašnjoj vodenoj fazi)

[0127] [0072] Unutrašnja vodena faza lipozoma u predmetnom pronalasku sadrži amonijum sulfat. U lipozomskoj kompoziciji koja je prvi primer izvođenja predmetnog pronalaska, molarni odnos sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi prema leku u čitavoj vodenoj fazi iznosi 0.36 ili više i poželjno 0.4 ili više. Molarni odnos sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi prema leku u čitavoj vodenoj fazi iznosi poželjnije 0.4 ili više i 1.8 ili manje i još poželjnije 0.6 ili više i 1.8 ili manje. Podešavanjem molarnog odnosa sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi prema leku u čitavoj vodenoj fazi kako je opisano gore, moguće je suzbiti curenje leka iz lipozoma u krv. U slučaju kada je molarni odnos sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi prema leku u čitavoj vodenoj fazi suviše nizak, to dovodi do nepotpunog formiranja čvrstog oblika leka zbog sulfata, povišene koncentracije leka u rastvorenom stanju, što za rezultat ima povećanje propustljivosti lipozomske membrane u lipozomu i lako curenje leka iz lipozoma, tako da je efekat poboljšanja zadržavanja leka u krvi ometen. Pored toga, u slučaju kada je molarni odnos sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi prema leku u čitavoj vodenoj fazi suviše visok, osmotski pritisak unutar lipozoma će biti povišen, što za rezultat ima destrukciju strukture lipozoma, tako da će lek verovatno curiti iz lipozoma i, prema tome, efekat poboljšanja zadržavanja u krvi je ometen.

[0128] Pored toga, u predmetnom pronalasku, procenat sulfatnih jona sadržanih u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma prema sulfatnim jonima u čitavoj lipozomskoj kompoziciji (odnos sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi) poželjno iznosi najmanje 80% i poželjnije 90% ili više, i istovremeno procenat leka sadržanog u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma prema leku u čitavoj lipozomskoj kompoziciji (odnos leka u unutrašnjoj vodenoj fazi) poželjno iznosi najmanje 80% i poželjnije 90% ili više.

[0129] Koncentracija leka u lipozomu može se meriti, na primer, tečnom hromatografijom/detekcijom apsorpcije ultraljubičaste-vidljive svetlosti. Pored toga, koncentracija sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma može se meriti, na primer, jonskom hromatografijom.

[0131] (pH spoljašnje vodene faze)

[0133] Lipozomska kompozicija prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska može uključivati lipozom koji inkapsulira lek, i vodeni rastvarač (spoljašnja vodena faza) u kojem je lipozom dispergovan. Spoljašnja vodena faza poželjno ima neutralni pH i, specifično, pH oko 5.5 do 8.5.

[0134] U slučaju kada je curenje leka ekstremno suzbijeno, curenje leka na zahvaćenom području, posebno na mestu tumora, takođe može biti suzbijeno i, prema tome, moguće je da se ne dobije željena efikasnost.

[0135] Lipozomska kompozicija prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska ima iznenađujući mehanizam za suzbijanje curenja leka u krv, dostavljanje dovoljne količine leka na mesto tumora i brzo oslobađanje leka na mestu tumora.

[0136] Mesto tumora ima osobinu da je na njemu koncentracija amonijuma veća nego kod drugih organa kao što je krv (ciirani članak: Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 11 (2015) 1841‑1850). Lipozomska kompozicija prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska ispoljava izuzetno povećano oslobađanje leka u okruženje u kojem je pojačana razgradnja glutamina i, prema tome, visoka koncentracija amonijuma (5 mmol/L), kao što je tumor.

[0137] Lipozomska kompozicija prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska ima stopu oslobađanja leka od 20%/24 sata ili manju, na 37°C, iz lipozoma u plazmu koja ima koncentraciju amonijuma od 1 mmol/L ili manju, i stopu oslobađanja leka od 60%/24 sata ili višu, na 37°C, iz lipozoma u plazmu koja ima koncentraciju amonijuma od 4 do 6 mmol/L; i poželjnije stopu oslobađanja leka od 15%/24 sata ili manju, na 37°C, iz lipozoma u plazmu koja ima koncentraciju amonijuma od 1 mmol/L ili manju, i stopu oslobađanja leka od 70%/24 sata ili višu, na 37°C, iz lipozoma u plazmu koja ima koncentraciju amonijuma od 4 do 6 mmol/L.

[0138] (Postupak za proizvodnju lipozomske kompozicije)

[0140] Postupak za proizvodnju lipozomske kompozicije prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska nije posebno ograničen. Na primer, lipozomska kompozicija prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska može da se proizvede sledećim koracima:

[0142] (a) pripremanje uljane faze;

[0143] (b) pripremanje vodene faze;

[0144] (c) formiranje lipozomskih čestica emulgovanjem;

[0145] (d) regulacija veličine čestica ekstruderom;

[0146] (e) zamena tečnosti spoljašnje vodene faze lipozoma dijalizom;

[0147] (f) inkapsuliranje leka u lipozomske čestice daljinskim punjenjem; i

[0148] (g) uklanjanje leka iz spoljašnje vodene faze dijalizom.

[0150] Regulacija veličine čestica ekstruderom (d) može da se izvodi, ali ne mora.

[0152] <(a) Pripremanje uljane faze>

[0154] (a) U pripremanju uljane faze, pojedinačne komponente (diacilfosfatidiletanolamin modifikovan hidrofilnim polimerom, dihidrosfingomijelin i holesteroli) koje čine lipozom i organski rastvarač se pomešaju, i smeša se greje da se gore pomenute komponente rastvore, čime može da se proizvede uljana faza.

[0155] Iako organski rastvarač upotrebljen u uljanoj fazi nije posebno ograničen, može da se upotrebi, na primer, organski rastvarač rastvorljiv u vodi, koji je opciono pomešan sa vodom.

[0156] [0084] Primeri organskog rastvarača koji je rastvorljiv u vodi uključuju alkohole kao što su metanol, etanol, n-propanol, izopropanol, n-butanol, izobutanol i t-butanol; glikole kao što su glicerin, etilen glikol i propilen glikol; i polialkilen glikole kao što je polietilen glikol. Među njima, poželjni su alkoholi. Alkohol je poželjno bar jedan odabran od etanola, metanola, 2 propanola, ili t-butanola, poželjnije najmanje jedan odabran od etanola, 2-propanola, ili tbutanola, i još poželjnije etanol.

[0157] Koncentracija svake od komponenti koje čine lipozom nije posebno ograničena i može se na odgovarajući način podesiti.

[0159] <(b) Pripremanje vodene faze>

[0161] Kao vodena faza mogu se upotrebiti voda (destilovana voda, voda za injekcije, ili slično), fiziološki slani rastvor, različiti puferski rastvori ili vodeni rastvori šećera (saharoza ili slično), ili njihove mešavine (vodeni rastvarač). U predmetnom pronalasku, poželjno je kao vodenu fazu upotrebiti vodeni rastvor amonijum sulfata, u slučaju kada je lek inkapsuliran u lipozomske čestice daljinskim punjenjem koje će biti opisano kasnije.

[0162] Puferski rastvor nije ograničen na organske i neorganske puferske rastvore, i puferski rastvor koji ima puferišuće dejstvo oko pH bliskog onome telesne tečnosti pogodan je za upotrebu, a njegovi primeri uključuju rastvor fosfatnog pufera, rastvor Tris pufera, rastvor citratnog pufera, rastvor acetatnog pufera, i rastvor Good-ovog pufera. Unutrašnja vodena faza lipozoma može biti vodeni rastvor u kojem su lipozomi dispergovani u slučaju proizvodnje lipozoma, ili može biti voda, fiziološki slani rastvor, vodeni rastvor različitih puferskih rastvora ili šećera, ili njihova mešavina koja je novododata. Voda upotrebljena kao spoljašnja vodena faza ili unutrašnja vodena faza poželjno ne sadrži nečistoće (prašina, hemikalije ili slično).

[0163] Fiziološki slani rastvor odnosi se na rastvor neorganske soli podešen da bude izotoničan sa humanom telesnom tečnošću, i može imati još i funkciju pufera. Primeri fiziološkog slanog rastvora uključuju slani rastvor koji sadrži 0.9 w/v% (procenat mase/-zapremini) natrijum hlorida, PBS i Tris-puferisani fiziološki slani rastvor.

[0164] U predmetnom pronalasku, vodena faza uključuje i spoljašnju vodenu fazu i unutrašnju vodenu fazu.

[0165] Spoljašnja vodena faza u predmetnom pronalasku označava vodeni rastvor u kojem su lipozomi dispergovani. Na primer, u slučaju injekcije, rastvor koji zauzima spoljašnjost lipozoma u tečnoj disperziji lipozoma pakovanoj i uskladištenoj u bočici ili unapred napunjenom špricu, postaje spoljašnja vodena faza. Slično tome, za tečnost koja se disperguje u vreme upotrebe, u slučaju da se primenjuje pomoću priloženog disperzionog rastvora ili drugih rastvora, rastvor koji zauzima spoljašnjost lipozoma u tečnoj disperziji lipozoma postaje spoljašnja vodena faza.

[0166] Unutrašnja vodena faza u predmetnom pronalasku odnosi se na vodenu fazu u zatvorenim vezikulama razdvojenim dvoslojnim lipidnim membranama lipozoma.

[0167] <(c) Formiranje lipozomskih čestica emulgovanjem>

[0169] U koraku emulgovanja, uljana faza i vodena faza se mešaju da bi se pripremio vodeni rastvor koji sadrži lipide, koji se zatim mogu emulgovati uz mešanje. Uljana faza u kojoj je lipid rastvoren u organskom rastvaraču i vodena faza se spoje, mešaju i emulguju da bi se pripremila emulzija gde su uljana faza i vodena faza emulgovane po tipu O/W (oil-in-water type, tip ulje u vodi). Posle mešanja, lipozomi se formiraju uklanjanjem dela ili cele količine organskog rastvarača koji se iz uljane faze uklanja isparavanjem. Alternativno, deo ili sav organski rastvarač u uljanoj fazi isparava tokom mešanja-emulgovanja da bi se formirali lipozomi.

[0170] Kao postupak mešanja, za minijaturizaciju čestica koriste se ultrazvučni talasi ili mehaničko smicanje. Pored toga, može se izvršiti obrada ekstruderom ili obrada mikrofluidizerom, uz omogućavanje prolaska kroz filter koji ima određenu veličinu pora kako bi se ujednačila veličina čestica. Upotreba ekstrudera ili slično, može rezultovati razlaganjem sekundarno formiranih multivezikularnih lipozoma u univezikularne lipozome.

[0171] Korak emulgovanja nije ograničen sve dok je u pitanju korak emulgovanja, ali je to poželjno korak primene visokog smicanja i izvođenja mikropartikulacije korakom emulgovanja koji uključuje organski rastvarač. Visoka stopa smicanja definisana je u smislu periferne brzine lopatice za mešanje uređaja za emulgovanje i poželjno iznosi od 5 m/s do 32 m/s i posebno poželjno od 20 m/s do 30 m/s. Ako je potrebno, može se izvršiti isparavanje (desolvatacija) organskog rastvarača upotrebljenog u koraku emulgovanja, da bi se formirali lipozomi.

[0172] Temperatura tečnosti u koraku emulgovanja u slučaju proizvodnje lipozoma može se pogodno podesiti, ali je temperatura tečnosti u vreme mešanja uljane faze i vodene faze poželjno viša ili jednaka temperaturi faznog prelaza korišćenog lipida. Na primer, u slučaju kada se koristi lipid koji ima temperaturu faznog prelaza od 35°C do 40°C, temperatura tečnosti je poželjno podešena na 35°C do 70°C.

[0173] U koraku emulgovanja, organski rastvarač i voda mogu ispariti iz vodenog rastvora koji sadrži lipozome. Što se tiče isparavanja o kome se ovde govori, deo ili sav organski rastvarač poreklom iz uljane faze i voda poreklom iz vodene faze mogu biti prisilno uklonjeni kao korak isparavanja, ili deo ili sav organski rastvarač poreklom iz uljane faze i voda poreklom iz vodene faze mogu prirodno ispariti tokom mešanja-emulgovanja.

[0174] Postupak isparavanja nije posebno ograničen. Na primer, može se sprovesti bar jedan od koraka zagrevanja za isparavanje organskog rastvarača i vode, koraka nastavljanja stajanja ili sporog mešanja posle emulgovanja ili koraka izvođenja vakuumske degasifikacije.

[0175] <(d) Regulisanje veličine čestica ekstruderom>

[0177] Dobijeni lipozomi mogu se ujednačiti po veličini čestica korišćenjem dijalize, filtracije, ekstruzione obrade ili slično.

[0178] Ekstruziona obrada znači korak propuštanja lipozoma kroz filter koji ima fine pore radi primene fizičkog smicanja, čime se vrši mikropartikulacija lipozoma. U slučaju kada se lipozomi propuštaju, njihova brza mikropartikulacija može se postići inkubacijom tečne lipozomske disperzije i filtera na temperaturi višoj ili jednakoj temperaturi faznog prelaza membrane koja sačinjava lipozom.

[0179] Pored toga, regulacija veličine čestica ekstruderom može, ali i ne mora da se izvede.

[0180] <(e) Zamena tečnosti spoljašnje vodene faze lipozoma dijalizom>

[0182] U predmetnom pronalasku, u slučaju kada se lek inkapsulira u lipozomske čestice daljinskim punjenjem, tečnost spoljašnje vodene faze lipozoma može da se zameni dijalizom. Vodeni rastvor od 0.05% do 5% mase NaCl može se koristiti kao tečnost za dijalizu, što nije posebno ograničeno. Dijaliza lipozomske tečnosti korišćenjem gore pomenute tečnosti za dijalizu može obezbediti lipozome gde se amonijum sulfat prisutan u spoljašnjoj vodenoj fazi uklanja i spoljašnja vodena faza zamenjuje tečnošću za dijalizu.

[0184] <(f) Inkapsuliranje leka u lipozomske čestice postupkom daljinskog punjenja>

[0186] U predmetnom pronalasku, poželjno je inkapsulirati lek u lipozomske čestice postupkom daljinskog punjenja.

[0187] U predmetnom pronalasku, postupak daljinskog punjenja odnosi se na postupak proizvodnje praznog lipozoma u kome lek nije inkapsuliran i zatim dodavanja leka u spoljašnju tečnost lipozoma da bi se lek uveo u lipozom. Postupak daljinskog punjenja nije posebno ograničen, ali je poželjan postupak koji koristi amonijum so, a poželjniji je postupak koji koristi amonijum sulfat.

[0188] U postupku daljinskog punjenja, lek dodat u spoljašnju tečnost aktivno se prenosi u lipozome i inkorporiše u lipozome. Gradijent rastvorljivosti, jonski gradijent, pH gradijent ili slično koristi se kao pokretačka snaga. Na primer, postoji postupak uvođenja leka u lipozome korišćenjem jonskog gradijenta formiranog na membrani lipozoma. Na primer, postoji tehnika dodavanja leka u prethodno formirane lipozome, postupkom daljinskog punjenja uz korišćenje gradijenta koncentracije Na<+>/K<+>.

[0189] Među jonskim gradijentima, obično se koristi gradijent koncentracije protona. Na primer, postoji aspekt u kojem unutrašnji (unutrašnja vodena faza) pH lipozomske membrane ima pH gradijent niži od spoljašnjeg (spoljašnja vodena faza) pH. pH gradijent može se specifično formirati koncentracionim gradijentom amonijum jona ili slično.

[0191] <(g) Uklanjanje leka iz spoljašnje vodene faze dijalizom>

[0193] Tečnost lipozoma sa inkapsuliranim lekom može se izložiti dijalizi da bi se uklonio lek koji se ne nalazi u lipozomima. Na primer, izlaganjem tečnosti lipozoma sa inkapsuliranim lekom dijalizi, uz korišćenje prethodno određene koncentracije saharoza/histidinskog pufera kao tečnosti za dijalizu, lek prisutan u spoljašnjoj vodenoj fazi može da se ukloni da bi se dobila lipozomska kompozicija, gde je spoljašnja vodena faza zamenjena tečnošću za dijalizu.

[0195] <Sterilna filtracija>

[0197] Lipozomska kompozicija dobijena gore se poželjno podvrgava sterilnoj filtraciji. Što se tiče postupka filtracije, neželjene materijale iz vodenog rastvora koji sadrži lipozome moguće je ukloniti korišćenjem membrane od šupljih vlakana, membrane za reverznu osmozu, membranskog filtera ili slično. U predmetnom pronalasku, poželjno je filtrirati lipozomsku kompoziciju kroz filter koji ima veličinu pora kojom se može vršiti sterilizacija (poželjno filter za filtraciju-sterilizaciju od 0.2 µm).

[0198] Da bi se sprečio uticaj deformacije lipozoma na prosečnu veličinu čestica, korak sterilne filtracije i dole opisani korak aseptičnog punjenja se poželjno izvode na temperaturi nižoj ili jednakoj temperaturi faznog prelaza lipida koji sačinjavaju lipozom. Na primer, u slučaju kada je temperatura faznog prelaza lipida oko 50°C, korak sterilne filtracije i dole opisani korak aseptičnog punjenja se poželjno izvode na temperaturi od oko 0°C do 40°C, i preciznije od oko 5°C do 30°C.

[0200] <Aseptično punjenje>

[0202] Za medicinske primene vrši se poželjno aseptično punjenje lipozomskom kompozicijom dobijenom posle sterilne filtracije. Za aseptično punjenje mogu se primeniti poznati postupci. Lipozomska kompozicija pogodna za medicinske primene može se pripremiti aseptičnim punjenjem kontejnera lipozomskom kompozicijom.

[0204] (Farmaceutska kompozicija)

[0205] U vezi sa putem primene, lipozomska kompozicija prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska može da sadrži i najmanje jedno od sredstva za toničnost, stabilizera, antioksidansa ili sredstva za podešavanje pH vrednosti, koje je farmaceutski prihvatljivo. To jest, lipozomska kompozicija prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska može se obezbediti u vidu farmaceutske kompozicije.

[0206] Sredstvo za toničnost nije posebno ograničeno i njegovi primeri uključuju neorganske soli kao što su natrijum hlorid, kalijum hlorid, natrijum hidrogenfosfat, natrijum dihidrogenfosfat i kalijum dihidrogenfosfat; poliole kao što su glicerol, manitol i sorbitol; i šećere kao što su glukoza, fruktoza, laktoza i saharoza.

[0207] Stabilizer nije posebno ograničen i njegovi primeri uključuju šećere kao što su glicerol, manitol, sorbitol, laktoza i saharoza.

[0208] Antioksidans nije posebno ograničen i njegovi primeri uključuju askorbinsku kiselinu, urinsku kiselinu, homologe tokoferola (na primer, vitamin E, četiri izomera tokoferola α, β, γ i δ), cistein i etilendiamintetrasirćetnu kiselinu (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA). Stabilizeri i antioksidansi mogu se respektivno koristiti sami ili u kombinaciji od dva ili više njih.

[0209] Primeri sredstava za podešavanje pH uključuju natrijum hidroksid, limunsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, trietanolamin, natrijum hidrogen fosfat, natrijum dihidrogen fosfat i kalijum dihidrogen fosfat.

[0210] Lipozomska kompozicija prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska može sadržati organski rastvarač, kolagen, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, karboksivinil polimer, natrijum karboksimetil celulozu, natrijum poliakrilat, natrijum alginat, dekstran rastvorljiv u vodi, natrijum karboksimetil skrob, pektin, metil celulozu, etil celulozu, ksantanovu gumu, gumiarabiku, kazein, želatin, agar, diglicerol, propilen glikol, polietilen glikol, vazelin, parafin, stearil alkohol, stearinsku kiselinu, humani serumski albumin (human serum albumin, HSA), manitol, sorbitol, laktozu, fosfatom puferisani slani rastvor (phosphate buffered saline, PBS), natrijum hlorid, šećere, biorazgradivi polimer, medijum koji ne sadrži serum, od kojih je svaki farmaceutski prihvatljiv, ili aditiv koji je prihvatljiv kao farmaceutski aditiv.

[0211] [0116] Kontejner u koji se stavlja lipozomska kompozicija prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska nije posebno ograničen i poželjno je napravljen od materijala sa niskom propustljivošću za kiseonik. Primeri kontejnera uključuju plastični kontejner, stakleni kontejner i kesu napravljenu od laminatnog filma sa aluminijumskom folijom, filma od deponovanog aluminijuma, filma od deponovanog aluminijum oksida, filma od deponovanog silicijum oksida, polivinil alkohola, kopolimera etilen-vinil alkohola, polietilen tereftalata, polietilen naftalata, poliviniliden hlorida ili slično, kao slojem gasne barijere. Ako je potrebno, od svetlosti se može zaštititi tako što se kesa ili slično prilagode korišćenjem obojenog stakla, aluminijumske folije, filma od deponovanog aluminijuma ili slično.

[0212] U kontejneru koji je napunjen lipozomskom kompozicijom, da bi se sprečila oksidacija kiseonikom prisutnim u prostoru kontejnera, poželjno je da se gasovi u prostoru kontejnera i rastvoru leka zamene inertnim gasovima kao što je azot. Na primer, kroz rastvor za injekcije se propuštaju mehurići azota, pri čemu se punjenje kontejnera rastvorom za injekcije može izvršiti u atmosferi azota.

[0213] Put primene farmaceutske kompozicije prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska je poželjno parenteralna primena. Primeri parenteralne primene uključuju intravensku injekciju kao što je intravenska infuzija, intramuskularna injekcija, intraperitonealna injekcija, potkožna injekcija, intraokularna injekcija i intratekalna injekcija. Postupak primene farmaceutske kompozicije može biti, na primer, primena špricem ili intravenskom infuzijom.

[0214] Doziranje i učestalost primene farmaceutske kompozicije prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska mogu se podesiti na odgovarajući način u zavisnosti od vrste leka, stanja pacijenta i slično. Doza farmaceutske kompozicije može se generalno podesiti u opsegu od 0.01 mg/kg/dan do 100 mg/kg/dan u smislu količine leka koji je aktivni sastojak. Doza farmaceutske kompozicije može se podesiti u opsegu od 2 mg do 10 mg po dozi u smislu količine leka koji je aktivni sastojak, ali nije ograničena na ove doze.

[0215] Farmaceutska kompozicija prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska može se poželjno koristiti kao antikancersko sredstvo.

[0216] Tip kancera kod kojeg se primenjuje farmaceutska kompozicija prema primeru izvođenja predmetnog pronalaska nije posebno ograničen, i njegovi primeri uključuju kancer pluća (posebno sitnoćelijski kancer pluća), kancer ovarijuma, solidni tumor kod dece, kancer grlića materice, kancer dojke, kancer prostate, kancer endometrijuma, kancer želuca (adenokarcinom želuca), nesitnoćelijski kancer pluća, kancer pankreasa, karcinom pločastih ćelija grlića materice, kancer jednjaka, kancer mokraćne bešike, melanom kancer kolona, kancer bubrega, ne-Hodgkin-ov limfom, kancer urotela, multipli mijelom, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, akutnu limfocitnu leukemiju, leukemiju T ćelija kod odraslih, metastatski kancer koštane srži, sarkom, tumor mekog tkiva, hroničnu mijelomonocitnu leukemiju, Hodgkin-ov limfom, i limfom T ćelija kože.

[0217] Primeri

[0219] U nastavku, predmetni pronalazak će biti detaljno opisan uz pozivanje na Primere. Međutim, predmetni pronalazak nije ograničen na Primere.

[0220] SM predstavlja sfingomijelin (COATSOME NM‑10, proizvođač NOF Corporation).

[0221] DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta predstavlja dihidrosfingomijelin dobijen hidrogenizacijom SM poreklom iz kokošjeg jajeta (sintetski proizvod dobijen hidrogenizacijom COATSOME NM‑10 (proizvođač NOF Corporation)). Ovaj DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta je smeša koja sadrži DHSM koji ima dva alkil lanca sa16 ugljenikovih atoma, koji čini 70% do 80% od ukupnog DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta, i DHSM koji ima alkil lance različite dužine, koji čini ostatak.

[0222] Potpuno sintetski DHSM predstavlja dihidrosfingomijelin proizveden hemijskom sintezom tako da sadrži 98% ili više sledećeg jedinjenja koje ima dugolančanu alkil grupu sa 16 ugljenikovih atoma i dugolančanu alkil grupu sa 18 ugljenikovih atoma.

[0224]

[0227] SUNBRIGHT DSPE‑020CN (u nastavku označen kao DSPE-PEG, proizvođač NOF Corporation) koristi se kao PEG fosfolipid (označen kao PEG u tabeli).

[0228] Holesterol HP (proizvođač Nippon Fine Chemical Co., Ltd.) koristi se kao holesterol (u tabeli označen kao Hol).

[0230] <Uporedni Primeri 1 do 10>

[0232] (a) Pripremanje uljane faze

[0234] Za Uporedni primer 1, odmeri se 11.52 g SM, 4.32 g PEG fosfolipida, i 4.32 g holesterola. Za Uporedne primere 2 do 10, količine SM ili DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta, PEG fosfolipida, i holesterola menjaju se u odnose opisane u Tabeli 1. Lipid se meša sa 381 mL etanola i rastvara na 65°C da se pripremi uljana faza.

[0236] (b 1) Pripremanje vodene faze 1

[0237] 25.2 g amonijum sulfata rastvori se u 1118.5 g vode da se pripremi vodena faza 1.

[0238] (b2) Pripremanje vodene faze 2

[0240] 5.04 g amonijum sulfata rastvori se u 223.7 g vode da se pripremi vodena faza 2.

[0242] (c) Formiranje lipozomskih čestica emulgovanjem

[0244] Vodena faza 1 pripremljena u (b 1) greje se na 65°C, tome se doda čitava uljana faza pripremljena u (a) i zatim se ove faze mešaju preciznim disperzorom za emulgovanje na perifernoj brzini od 26 m/s tokom 60 minuta. Zatim, tome se doda vodena faza 2 na sobnoj temperaturi, što je praćeno nastavkom mešanja na perifernoj brzini od 0.1 m/s uz zagrevanje na 65°C da organski rastvarač i voda ispare. U slučaju kada se tečnost koncentriše na 600 mL, grejanje i mešanje se prekidaju i, prema tome, isparavanje se okončava.

[0246] (e) Zamena tečnosti spoljašnje vodene faze lipozoma dijalizom

[0248] Vodeni rastvor NaCl, 3.15% po masi, koristi se kao tečnost za dijalizu. Korišćenjem ove tečnosti za dijalizu, tečnost dobijena u (c) podvrgne se unakrsnoj filtraciji na sobnoj temperaturi da se ukloni amonijum sulfat prisutan u spoljašnjoj vodenoj fazi, kako bi se dobili lipozomi u kojima je spoljašnja vodena faza zamenjena tečnošću za dijalizu.

[0250] (f) Inkapsuliranje topotekana u lipozomske čestice daljinskim punjenjem

[0252] Voda za injekciju se doda topotekan hidrohloridu (proizvođač Biocompounds Pharmaceutical Inc.) do 5 mg/mL. Zatim, dok se tečnost dobro meša, rastvor HCl, 8 mol/L, doda se da se pH podesi na oko 3 da bi se topotekan rastvorio. U dobijeni rastvor topotekana dodaju se lipozomi u zapreminskom odnosu 1/1, što je praćeno grejanjem na 60°C u trajanju od 60 minuta.

[0254] (g) Uklanjanje topotekana iz spoljašnje vodene faze dijalizom

[0256] Pufer saharoza/histidin koji se sastoji od 9.4% po masi saharoze i 10 mmol/L histidina pripremi se kao tečnost za dijalizu. Korišćenjem tečnosti za dijalizu, tečnost dobijena u (f) podvrgne se unakrsnoj filtraciji na sobnoj temperaturi da se ukloni topotekan prisutan u spoljašnjoj vodenoj fazi kako bi se dobili lipozomi koji sadrže topotekan, gde je spoljašnja vodena faza zamenjena tečnošću za dijalizu.

[0257] Uporedni primeri 11 i 12

[0259] (a) Pripremanje uljane faze

[0261] Za Uporedni primer 11, odmeri se 0.517 g DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta i 0.233 g holesterola. Za Uporedni primer 12, količine SM i holesterola menjaju se u odnose opisane u Tabeli 1. U cilju obeležavanja lipozoma pomoću DiI (1,1’-dioktadecil‑3,3,3’,3’-tetrametilindokarbocijanin perhlorat), količina Dil, koja iznosi 0.2 mol% u odnosu na ukupne lipide, odmeri se i rastvori u etanolu. Etanol se doda u etanolni rastvor DiI da se dobije ukupna zapremina od 1.5 mL. Odmereni lipid i ovaj organski rastvarač se pomešaju i greju na 65°C da bi se lipid rastvorio, čime se pripremi uljana faza.

[0263] (b) Pripremanje vodene faze

[0265] 0.9 g amonijum sulfata i 2.16 g saharoze rastvori se u 13.5 g vode da se pripremi vodena faza.

[0267] (c) Pripremanje lipozomskih čestica mešanjem uljane faze i vodene faze

[0269] Vodena faza pripremljena u (b) greje se na 65°C i meša magnetnom mešalicom (3000 rpm). Cela uljana faza pripremljena u (a) greje se na 65°C na grejnoj ploči, i cela uljana faza se usisa špricem i greje 5 minuta na grejnoj ploči. Uljana faza se u kapima dodaje tokom 30 sekundi u zagrejanu vodenu fazu.

[0271] (d) Regulacija veličine čestica ekstruderom

[0273] Tečnost dobijena u (c) podvrgne se regulaciji veličine čestica sekvencijalnim propuštanjem kroz filter uz korišćenje ekstrudera (Mini Extruder, proizvođač Avanti Polar Lipids, Inc.) u uslovima grejanja na 70°C.

[0275] (e) Zamena tečnosti spoljašnje vodene faze lipozoma dijalizom

[0277] Vodeni rastvor NaCl, 0.09% po masi, upotrebljen je kao tečnost za dijalizu. Uz korišćenje ove tečnosti za dijalizu, tečnost dobijena u (c) ili (d) podvrgnuta je dijalizi na sobnoj temperaturi da se ukloni amonijum sulfat prisutan u spoljašnjoj vodenoj fazi, kako bi se dobili lipozomi u kojima je spoljašnja vodena faza zamenjena tečnošću za dijalizu.

[0279] (f) Inkapsuliranje topotekana u lipozomske čestice daljinskim punjenjem

[0280] Voda za injekciju doda se topotekan hidrohloridu (proizvođač Biocompounds Pharmaceutical Inc.) do 5 mg/mL. Zatim, dok se tečnost dobro meša, doda se rastvor HCl, 8 mol/L, da se pH podesi na oko 3 da bi se topotekan rastvorio. U dobijeni rastvor topotekana dodaju se lipozomi u zapreminskom odnosu 1/1, što je praćeno grejanjem na 60°C u trajanju od 120 minuta.

[0282] (g) Uklanjanje topotekana iz spoljašnje vodene faze dijalizom

[0284] Pufer saharoza/histidin koji se sastoji od 9.4% po masi saharoze i 10 mmol/L histidina pripremi se kao tečnost za dijalizu. Korišćenjem ove tečnosti za dijalizu, tečnost dobijena u (f) podvrgne se dijalizi na sobnoj temperaturi da se ukloni topotekan prisutan u spoljašnjoj vodenoj fazi, kako bi se dobili lipozomi koji sadrže topotekan, gde je spoljašnja vodena faza zamenjena tečnošću za dijalizu.

[0286] <Primeri 1 do 8>

[0288] (a) Pripremanje uljane faze

[0290] Za primer 1, odmeri se 11.52 g DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta, 4.32 g PEG fosfolipida (SUNBRIGHT DSPE‑020CN, proizvođač NOF Corporation, ovde kasnije označen kao DSPE-PEG) i 4.32 g holesterola. Za primere 2 do 8, količine DHSM, DSPE-PEG i holesterola menjaju se u odnose opisane u Tabeli 2. Lipid se pomeša sa 381 mL etanola i rastvori na 65°C da se pripremi uljana faza.

[0292] (b1) Pripremanje vodene faze 1

[0294] 25.2 g amonijum sulfata rastvori se u 1118.5 g vode da se pripremi vodena faza 1.

[0295] (b2) Pripremanje vodene faze 2

[0297] 5.04 g amonijum sulfata rastvori se u 223.7 g vode da se pripremi vodena faza 2.

[0299] (c) Formiranje lipozomskih čestica emulgovanjem

[0301] [0145] Vodena fazae 1 pripremljena u (b 1) greje se na 65°C, doda joj se cela uljana faza pripremljena u (a) i zatim se ove faze mešaju u preciznom disperzoru za emulgovanje, pri perifernoj brzini od 26 m/s u trajanju od 60 minuta. Zatim se tome doda vodena faza 2 na sobnoj temperaturi, što je praćeno nastavkom mešanja pri perifernoj brzini od 0.1 m/s uz grejanje na 65°C kako bi organski rastvarač i voda isparili. U slučaju kada se tečnost koncentriše na 600 mL, grejanje i mešanje se prekidaju i prema tome, isparavanje se okončava.

[0303] (e) Zamena tečnosti spoljašnje vodene faze lipozoma dijalizom

[0305] Vodeni rastvor NaCl, 3.15% po masi, upotrebljen je kao tečnost za dijalizu. Uz korišćenje ove tečnosti za dijalizu, tečnost dobijena u (c) podvrgnuta je unakrsnoj filtraciji na sobnoj temperaturi da se ukloni amonijum sulfat prisutan u spoljašnjoj vodenoj fazi, kako bi se dobili lipozomi, gde je spoljašnja vodena faza zamenjena tečnošću za dijalizu.

[0307] (f) Inkapsuliranje topotekana u lipozomske čestice daljinskim punjenjem

[0309] Voda za injekciju doda se topotekan hidrohloridu (proizvođač Biocompounds Pharmaceutical Inc.) do 5 mg/mL. Zatim, dok se tečnost dobro meša, doda se rastvor HCl, 8 mol/L, da se pH podesi na oko 3 da bi se topotekan rastvorio. U dobijeni rastvor topotekana dodaju se lipozomi u zapreminskom odnosu 1/1, što je praćeno grejanjem na 60°C u trajanju od 60 minuta.

[0311] (g) Uklanjanje topotekana iz spoljašnje vodene faze dijalizom

[0313] Pufer saharoza/histidin koji se sastoji od 9.4% po masi saharoze i 10 mmol/L histidina pripremi se kao tečnost za dijalizu. Korišćenjem ove tečnosti za dijalizu, tečnost dobijena u (f) podvrgne se unakrsnoj filtraciji na sobnoj temperaturi da se ukloni topotekan prisutan u spoljašnjoj vodenoj fazi kako bi se dobili lipozomi koji sadrže topotekan, gde je spoljašnja vodena faza zamenjena tečnošću za dijalizu.

[0315] <Primeri 9 i 10>

[0317] (a) Pripremanje uljane faze

[0319] Za primer 9, odmeri se 0.412 g DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta, 0.153 g DSPE-PEG, i 0.153 g holesterola. Za primer 10, količine DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta, DSPE-PEG, i holesterola promene se u odnose opisane u Tabeli 2. Da bi se lipozomi obeležili pmoću DiI, količina DiI, koja je iznosila 0.2 mol% u odnosu na ukupne lipide, odmeri se i rastvori u etanolu. Etanol se doda dobijenom rastvoru DiI-etanola da se dobije ukupna zapremina od 11.25 mL i tome se doda još i 3.75 mL etil acetata. Odmereni lipid i ovaj organski rastvarač se mešaju i greju na 60°C da se lipid rastvori, čime se pripremi uljana faza.

[0320] (b) Pripremanje vodene faze

[0322] 0.9 g amonijum sulfata rastvori se u 40 g vode da se pripremi vodena faza.

[0324] (c) Formiranje lipozomskih čestica emulgovanjem

[0326] Vodena faza pripremljena u (b) zagreje se na 70°C, doda joj se cela uljana faza pripremljena u (a) (zapreminski odnos: vodena faza/uljana faza = 8/3), i zatim se ove faze mešaju korišćenjem uređaja za emulgovanje (Excel Auto homogenizer ED‑3, proizvođač Nippon Seiki Seisakusho Co., Ltd.) na 3000 rpm (rotation per minute, obrtaja u minutu: 1/60s<‑1>) tokom 30 minuta. Ovo je praćeno kontinuiranim mešanjem na 300 rpm uz grejanje na 65°C da organski rastvarač i voda ispare. U slučaju kada se tečnost koncentruje do 15 g, grejanje i mešanje se prekidaju i, prema tome, isparavanje se okončava.

[0328] (d) Regulacija veličine čestica ekstruderom

[0330] Tečnost dobijena u (c) izlaže se regulaciji veličine čestica sekvencijalnim propuštanjem kroz filter uz korišćenje ekstrudera (Mini Extruder, proizvođač Avanti Polar Lipids, Inc.) u uslovima grejanja na 70°C.

[0332] (e) Zamena tečnosti spoljašnje vodene faze lipozoma dijalizom

[0334] Vodeni rastvor NaCl, 0.09% po masi, upotrebi se kao tečnost za dijalizu. Uz korišćenje tečnosti za dijalizu, tečnost dobijena u (c) ili (d) podvrgne se dijalizi na sobnoj temperaturi da se ukloni amonijum sulfat prisutan u spoljašnjoj vodenoj fazi, kako bi se dobili lipozomi, gde je spoljašnja vodena faza zamenjena tečnošću za dijalizu.

[0336] (f) Inkapsuliranje topotekana u lipozomske čestice daljinskim punjenjem

[0338] Voda za injekciju doda se topotekan hidrohloridu (proizvođač Biocompounds Pharmaceutical Inc.) do 5 mg/mL. Zatim, dok se tečnost dobro meša, doda se rastvor HCl, 8 mol/L, da se pH podesi na oko 3, kako bi se topotekan rastvorio. Lipozomi se dodaju u dobijeni rastvor topotekana u zapreminskom odnosu 1/1, što je praćeno grejanjem na 60°C u trajanju od 120 minuta.

[0340] (g) Uklanjanje topotekana iz spoljašnje vodene faze dijalizom

[0341] Pufer saharoza/histidin koji se sastoji od 9.4% po masi saharoze i 10 mmol/L histidina pripremi se kao tečnost za dijalizu. Korišćenjem ove tečnosti za dijalizu, tečnost dobijena u (f) podvrgne se dijalizi na sobnoj temperaturi da se ukloni topotekan prisutan u spoljašnjoj vodenoj fazi kako bi se dobili lipozomi koji sadrže topotekan, gde je spoljašnja vodena faza zamenjena tečnošću za dijalizu.

[0343] [Merenje i evaluacija fizičkih svojstava]

[0345] <Prosečna veličina čestica>

[0347] U predmetnom pronalasku, prosečna veličina čestica odnosi se na kumulantnu prosečnu veličinu čestica merenu postupkom dinamičkog rasipanja svetlosti. Prosečna veličina čestica u svakom od Primera i Uporednih primera, opisana u tabeli, je kumulantna prosečna veličina čestica izmerena postupkom dinamičkog rasipanja svetlosti uz korišćenje analizatora veličine čestica za koncentrovane sisteme FPAR‑1000AS (proizvođač Otsuka Electronics Co., Ltd.) sa autosemplerom.

[0348] Rezultati merenja prikazani su u Tabelama 1 i 2.

[0350] <Merenje koncentracije topotekana>

[0352] Uzorak je meren sistemom za tečnu hromatografiju visokih performansi (high performance liquid chromatography, HPLC) Nexera-i LC‑2040C (proizvođač Shimadzu Corporation) za kvantifikovanje koncentracije topotekana. Rezultati su prikazani u Tabelama 1 i 2. Specifičan korak merenja je kako sledi.

[0353] U lipozomima iz Tabela 1 i 2, procenat leka sadržanog u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma prema leku u čitavoj lipozomskoj kompoziciji bio je najmanje 95%, osim za Uporedni primer 10 gde je procenat leka sadržanog u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma prema leku u čitavoj lipozomskoj kompoziciji bio 59%.

[0355] Merenje količine topotekana u lipozomskoj formulaciji

[0357] Pripremljena lipozomska tečnost rastvori se u metanolu i filtrira da se dobije uzorački rastvor. Topotekan hidrohlorid se razblaži da se pripremi standardni rastvor za kalibracionu krivu. Korišćenjem na taj način pripremljenog uzoračkog rastvora i standardnog rastvora za kalibracionu krivu, količina topotekana u lipozomskoj formulaciji se meri tečnom hromatografijom/detekcijom apsorpcije ultraljubičaste-vidljive svetlosti.

[0358] Koncentracija topotekana u unutrašnjoj vodenoj fazi izračunava se oduzimanjem koncentracije topotekana u spoljašnjoj vodenoj fazi od koncentracije topotekana u čitavoj vodenoj fazi. Koncentracija topotekana u svakoj vodenoj fazi meri se na sledeći način.

[0360] (Koncentracija topotekana u čitavoj vodenoj fazi)

[0362] Odmeri se 50 µL tečne lipozomske disperzije i doda joj se 950 µL metanola, što je praćeno mešanjem pomoću vorteksa u trajanju od 1 minuta. Odmeri se 100 µL tečnosti i doda joj se 900 µL Milli-Q vode, što je praćeno mešanjem pomoću vorteksa u trajanju od 1 minuta da se pripremi uzorak za HPLC analizu.

[0364] (Koncentracija topotekana u spoljašnjoj vodenoj fazi)

[0366] Odmeri se 50 µL tečne lipozomske disperzije i zatim se razblaži dodavanjem 450 µl vodenog rastvora saharoze/10 mM histidina, 9.4 tež.%. U 100 µL razblažene tečnosti doda se 200 µL PBS, što se zatim meša izvrtanjem. Tečna disperzija se ultracentrifugira (200000g, 20°C, 60 minuta), i supernatant se koristi kao uzorak za HPLC analizu. Ultracentrifugiranje se vrši uz korišćenje Hitachi himac CP80WX.

[0368] a) Pripremanje standardnog rastvora za kalibracionu krivu

[0369] Oko 20 mg topotekan hidrohlorida se odmeri i rastvori u 20 mL 10% po masi vodenog rastvora metanola. Ovoj tečnosti se doda Milli-Q voda da se pripremi rastvor koji ima koncentraciju topotekan hidrohlorida od 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 50.0, ili 100.0 ppm, što se zatim koristi kao standardni rastvor za kalibracionu krivu.

[0370] b) Pripremanje uzoračkog rastvora

[0372] (1) Odmeri se oko 50 µL uzorka (rastvor lipozomske formulacije) pomoću MICROMAN (registrovani žig), i tome se doda oko 950 µL metanola odmerenog pomoću MICROMAN. Posle oko 1 minuta šejkiranja, vizuelno se potvrdi da je rastvor bistar.

[0373] (2) 100 µL gornjeg rastvora (1) odmeri se pomoću MICROMAN i doda mu se oko 900 µL Milli-Q vode odmerene mikropipetom. Ova tečnost se drži na šejkeru oko 1 minut, izloži delovanju ultrazvuka oko 1 minut i drži na šejkeru još oko 10 sekundi.

[0374] (3) Rastvor dobijen filtriranjem gornjeg rastvora (2) kroz DISMIC (registrovani žig) filter (prečnik pora: 0.45 µm) koristi se kao uzorački rastvor.

[0375] c) Merenje

[0377] Merenje se vrši pod sledećim uslovima, tečnom hromatografijom/detekcijom apsorpcije UV-vid..

[0378] Talasna dužina merenja: 382 nm, kolona: Shiseido CAPCELLPAK C18 ACR 3µm_3.0mm*75mm;[0379] Temperatura kolone: konstantna temperatura oko 40°C;[0380] Mobilne faze A i B su, obe, smeša voda/metanol/trifluorosirćetna kiselina, i nanošenje mobilnih faza se vrši promenom odnosa mešanja mobilnih faza A i B da bi se kontrolisao koncentracioni gradijent.;[0381] Stopa protoka: 1.0 mL/minutu, zapremina injektiranja: 10 µL, temperatura autosemplera: konstantna temperatura oko 25°C.;[0383] <Merenje koncentracije sulfatnih jona>;[0385] Uzorak se meri uređajem za jonsku hromatografiju 883 Basic IC plus (proizvođač Metrohm AG) da bi se kvantifikovala koncentracija sulfatnih jona. Rezultati merenja molarnog odnosa sulfatnih jona prema topotekanu prikazani su u Tabelama 1 i 2. U lipozomima iz Tabela 1 i 2, procenat sulfatnih jona sadržanih u unutrašnjoj fazi lipozoma prema sulfatnim jonima u čitavoj lipozomskoj kompoziciji bio je najmanje 90%.;[0386] Koncentracija sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi izračunava se oduzimanjem koncentracije sulfatnih jona u spoljašnjoj vodenoj fazi od koncentracije sulfatnih jona u čitavoj vodenoj fazi.;[0387] Koncentracija sulfatnih jona u svakoj od vodenih faza meri se na sledeći način.;[0389] (Koncentracija sulfatnih jona u čitavoj vodenoj fazi);[0391] Odmeri se 50 µL tečne lipozomske disperzije i doda joj se 950 µL metanola, posle čega sledi mešanje uz ultrasonifikaciju tokom 15 sekundi. Odmeri se 90 µL tečnosti i doda joj se 810 µL vode za injekciju (proizvođač Hikari Pharmaceutical Co., Ltd.) posle čega sledi mešanje uz ultrasonifikaciju u trajanju od 30 sekundi. Rezultujućem rastvoru doda se 900 µL etil acetata, što se zatim dobro šejkira da se lipidi ekstrahuju u etilacetatnu fazu. Odmeri se odgovarajuća količina tečnosti vodene faze i koristi za analizu jonskom hromatografijom.;[0393] (Koncentracija sulfatnih jona u spoljašnjoj vodenoj fazi);[0394] Odmeri se 100 µL tečne lipozomske disperzije i zatim se razblaži dodavanjem 900 µL 5% rastvora glukoze (proizvođač Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).450 µL rezultujuće tečnosti tretira se ultrafiltracijom i filtrat se koristi kao uzorak za analizu jonskom hromatografijom.;[0395] Uslovi centrifugiranja bili su 7400g, 5°C i 30 minuta. Za centrifugiranje korišćen je Hitachi himac CF15RXII.;[0397] <Merenje AUC>;[0399] Od miševa kod kojih su primenjeni pripremljeni lipozomi koji sadrže topotekan (doza: 1 mg/kg u smislu količine leka) uzima se krv na 0.25, 2, 6, i 24 sata posle primene. Krv se centrifugira na 800×g, 10 minuta da se sakupi plazma. Koncentracija topotekana se kvantifikuje u sakupljenoj plazmi korišćenjem tečne hromatografije/masene spektrometrije/masene spektrometrije (liquid chromatography/mass spectrometry/mass spectrometry, LC/MS/MS). Korišćenjem softvera za farmakokinetičku analizu WinNonlin (registrovani žig) (može se nabaviti od Certara, L.P.) područje ispod krive koncentracija u krvi u odnosu na vreme (AUC) do beskonačnog vremena, posle jedne primene, izračunava se iz tako dobijene tranzicije koncentracije topotekana. Jedinica AUC je vreme×ng/mL (u tabeli izraženo kao h*ng/mL). Pored toga, izračunato je da AUC lipozoma opisana u [AACR-EORTC međunarodna konferencija, San Francisko, Kalifornija, 22‑26. oktobar 2007, #C113 A pharmacokinetics study of a novel sphingomyelin/cholesterol liposomal topotecan and nonliposomal topotecan in rats, William C. Zamboni et al.] iznosi 68152 sata×ng/mL.

[0400]

[0401]

[0402] Kao što se može videti iz rezultata u Tabelama 1 i 2, u Primerima 1 do 10 lipozomske kompozicije koja uključuje diacilfosfatidiletanolamin modifikovan hidrofilnim polimerom, dihidrosfingomijelin i holesterol kao komponente lipozomske membrane, gde unutrašnja vodena faza sadrži amonijum sulfat, i molarni odnos sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi prema leku u čitavoj vodenoj fazi iznosi 0.36 ili više, pokazano je da izmerena vrednost AUC iznosi 200000 ili više i, prema tome, visoko zadržavanje u krvi može da se postigne. Sa druge strane, u Uporednim primerima 1 do 8 u kojima se ne koristi dihidrosfingomijelin, Uporednim primerima 9 i 10 u kojima molarni odnos sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi prema leku u čitavoj vodenoj fazi iznosi manje od 0.36, i Uporednim primerima 11 i 12 u kojima se ne koristi diacilfosfatidiletanolamin modifikovan hidrofilnim polimerom, pokazano je da je izmerena vrednost AUC manja od 200000, što je inferiorno u odnosu na Primere 1 do 10.

[0403] <Test efikasnosti leka uz korišćenje mišjeg modela potkožne transplantacije A549>

[0405] 1×10<7>A549 ćelija humane ćelijske linije kancera pluća, transplantira se potkožno u desni bok Balb/c/nu/nu miševa (ženke, starosti 6 nedelja). Od Dana 15 posle transplantacije, kod životinja se primenjuju lipozomi koji sadrže topotekan, pripremljeni u Primeru 10 (4 mg/kg i 2 mg/kg u smislu količine leka, na bazi dva puta nedeljno) i lipozomi koji sadrže topotekan pripremljeni u Uporednom primeru 12 (4 mg/kg i 2 mg/kg u smislu količine leka, na bazi dva puta nedeljno). Pored toga, kod životinja se primenjuje fiziološki slani rastvor kao negativna kontrola. Pored toga, kod životinja se primenjuje vodeni rastvor topotekana (2 mg/kg u smislu količine leka) kao uporedna kontrola. Telesna težina i zapremina tumora životinja mere se dva puta dnevno od početka doziranja. Rezultati merenja telesne težine prikazani su na Sl. 1 i 2, i rezultati merenja zapremine tumora prikazani su na Sl.3 i 4.

[0406] Iz rezultata sa Sl. 3 i 4, pokazano je da lipozomi koji sadrže topotekan, pripremljeni u Primeru 10, pokazuju veću efikasnost leka u poređenju sa rastvorom topotekana pripremljenim u Uporednom primeru 12, i efekat je zavisan od doze.

[0408] <Primeri 11 do 16 i Uporedni primeri 13 do 16>

[0410] [0179] Lipozomi koji sadrže topotekan pripremljeni su na isti način kao u Primeru 1, osim što su za Primere 11 do 16, količine DHSM, DSPE-PEG, i holesterola promenjene tako da su dodata količina holesterola i dodata količina DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta u podešavanju uljane faze postale odnosi opisani u Tabeli 3. Na primer, za Primer 11, lipozomi koji sadrže topotekan proizvedeni su na isti način kao u Primeru 1, osim što su dodata količina holesterola i dodata količina DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta u podešavanju uljane faze promenjene u 3.6 g holesterola i 12.9 g DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta.

[0411] Za Uporedne primere 13 do 16, količine SM, DSPE-PEG, i holesterola promenjene su u odnose opisane u Tabeli 3.

[0412] Slično tome, rezultati merenja veličine čestica, koncentracije topotekana u čitavoj vodenoj fazi, koncentracije sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi i AUC prikazani su u Tabeli 3. Pored toga, vrednost AUC za svaku količinu holesterola prikazana je na Sl.5.

[0413] U lipozomima iz Tabele 3, procenat leka sadržanog u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma prema leku u čitavoj lipozomskoj kompoziciji iznosio je najmanje 98%, osim za Uporedni primer 13 gde je procenat leka sadržanog u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma prema leku u čitavoj lipozomskoj kompoziciji bio 68%.

[0414] U lipozomima iz Tabele 3, procenat sulfatnih jona sadržanih u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma prema sulfatnim jonima u čitavoj lipozomskoj kompoziciji bio je najmanje 90% osim za Uporedni primer 13 gde je procenat sulfatnih jona sadržanih u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma prema sulfatnim jonima u čitavoj lipozomskoj kompoziciji bio 71%.

[0415]

[0416] Iz rezultata Primera 11 do 16 i Uporednih primera 1, 2, 4, 7 i 13 do 16, može se videti da predmetni pronalazak postiže zadovoljavajuću AUC za lipozome sa DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta pri većem procentu prisustva holesterola nego za SM lipozome. Pored toga, kod lipozoma sa DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta predmetnog pronalaska, može se videti da AUC više zadovoljava, posebno u slučaju kada je procenat holesterola u rasponu od 35 do 43 mol%.

[0418] <Primeri 17 do 24 i Uporedni primeri 17 do 24>

[0420] <Pripremanje tečne lipozomske disperzije>

[0422] Lipozomi koji sadrže topotekan pripremljeni su na isti način kao u Primeru 1, osim što je za Primere 17 do 24 i Uporedne primere 17 do 24 količina svakog dodatog lipida pri podešavanju uljane faze postavljena kao što je prikazano u Tabeli 4, lek koji treba da se inkapsulira u čestice lipozoma daljinskim punjenjem postavljen je kao što je prikazano u Tabeli 4, a lekovi osim topotekana inkapsulirani su postupkom opisanim u odeljku <Inkapsuliranje svakog od antikancerskih lekova u čestice lipozoma daljinskim punjenjem> datim u nastavku. Pored toga, odnos lipida u kompoziciji u svakom od Primera 17 do 24 i Uporednih primera 17 do 24 prikazan je u Tabeli 5.

[0424] [Tabela 4]

[0426]

[0428] [Tabela 5]

[0430]

[0431]

[0433] <Inkapsuliranje svakog od antikancerskih sredstava u lipozomske čestice pomoću daljinskog punjenja>

[0435] Inkapsuliranje doksorubicina (Primeri 19 i 20 i Uporedni primeri 19 i 20): Voda za injekciju se doda doksorubicin hidrohloridu (proizvođač Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) do 4 mg/mL. Zatim, dok se tečnost dobro meša, doda se rastvor HCl, 8 mol/L, da se pH podesi na oko 3 da bi se doksorubicin hidrohlorid rastvorio. Lipozomi se dodaju u dobijeni rastvor doksorubicina u zapreminskom odnosu 1/1, i zatim se tečna disperzija čiji je pH podešen na 7.0 greje na 62°C, 60 minuta.

[0436] Inkapsuliranje sunitiniba (Primeri 21 i 22 i Uporedni primeri 21 i 22): Voda za injekciju se doda sunitinib malatu (proizvođač Toronto Research Chemicals Inc.) do 5 mg/mL. Zatim, dok se tečnost dobro meša, doda se rastvor HCl, 8 mol/L, da se pH podesi na oko 3 da bi se sunitinib malat rastvorio. Lipozomi se dodaju u dobijeni rastvor sunitiniba u zapreminskom odnosu 1/1, što je praćeno grejanjem na 62°C, 60 minuta.

[0437] Inkapsliranje irinotekana (Primeri 23 i 24 i Uporedni primeri 23 i 24): Voda za injekciju se doda irinotekan hidrohloridu (proizvođač Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) do 4 mg/mL. Zatim, dok se tečnost dobro meša, doda se rastvor HCl, 8 mol/L, da se pH podesi na oko 3 da bi se irinotekan hidrohlorid rastvorio. Lipozomi se dodaju u dobijeni rastvor irinotekana u zapreminskom odnosu 1/1, što je praćeno grejanjem na 62°C, 60 minuta.

[0438] AUC u Primerima 17 do 22 i Uporednim primerima 17 do 22 mere se na isti način kao što je opisano gore u prikazanim Primerima. Rezultati su prikazani u Tabeli 6.

[0440] [Tabela 6]

[0442]

[0443]

[0445] Iz rezultata Primera 17 do 22 i Uporednih primera 17 do 22, čak i u slučaju kada se koriste lekovi topotekan ili sunitinib, lipozomi koji koriste DHSM pokazali su poboljšano zadržavanje u krvi u poređenju sa SM lipozomima i HSPC lipozomima. Pored toga, utvrđeno je da lipozomi koji koriste potpuno sintetski DHSM sa čistoćom od 98% ili više DHSM sa alkil lancem sa 16 ugljenikovih atoma i alkil lancem sa 18 ugljenikovih atoma kao DHSM, mogu da poboljšaju zadržavanje u krvi u poređenju sa lipozomima koji koriste DHSM poreklom iz kokošjeg jajeta.

[0446] U Primerima 17 do 24 i Uporednim primerima 17 do 18 i 21 do 24 merene su veličina čestica, koncentracija topotekana, koncentracija sulfatnih jona i stopa oslobađanja. Rezultati su prikazani u Tabeli 7. Veličina čestica, koncentracija topotekana i koncentracija sulfatnih jona merene su na isti način kao što je gore opisano u predmetnim Primerima.

[0447] U lipozomima iz Tabele 7, procenat leka sadržanog u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma u odnosu na lek u čitavoj lipozomskoj kompoziciji bio je najmanje 95%.

[0448] U lipozomima iz Tabele 7, procenat sulfatnih jona sadržanih u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma u odnosu na sulfatne jone u čitavoj lipozomskoj kompoziciji bio je najmanje 95%.

[0449] Formulacija lipozoma je razblažena 20 puta u svakoj koncentraciji PBS pufera koji sadrži amonijum hlorid, i zatim je merena stopa oslobađanja posle inkubacije u trajanju od 4 sata. Stopa oslobađanja je definisana kao procenat koncentracije API koji je procurio u spoljašnju vodenu fazu podeljen sa početnom koncentracijom API u čitavoj vodenoj fazi.

[0450] Za svaku koncentraciju PBS pufera koji sadrži amonijum hlorid,

[0452] u Primerima 17 i 18 i Uporednim primerima 17 i 18 (evaluacija lipozoma sa inkapsuliranim topotekanom), korišćen je PBS pufer u kojem je rastvoreno 4.8 mmol/L amonijum hlorida,

[0453] u Primerima 19 i 20 i Uporednim primerima 19 i 20 (evaluacija lipozoma sa inkapsuliranim doksorubicinom), korišćen je PBS pufer u kojem je rastvoreno 200 mmol/L amonijum hlorida,

[0454] u Primerima 21 i 22 i Uporednim primerima 21 i 22 (evaluacija lipozoma sa inkapsuliranim sunitinibom), korišćen je PBS pufer u kojem je rastvoreno 100 mmol/L amonijum hlorida, i

[0455] u Primerima 23 i 24 i Uporednim primerima 23 i 24 (evaluacija lipozoma sa inkapsuliranim irinotekanom), korišćen je PBS pufer u kojem je rastvoreno 4.8 mmol/L amonijum hlorida.

[0457] [Tabela 7]

[0459]

[0461] [0196] Prema rezultatima Primera 17 do 24 i Uporednih primera 17, 18 i 21 do 24, stopa oslobađanja za lipozome koji koriste DHSM niža je nego za SM lipozome i HSPC lipozome, bez obzira na to koje se sredstvo koristi, od čega se može očekivati poboljšanje zadržavanja u krvi. Pored toga, u slučaju kada je DHSM potpuno sintetski DHSM čistoće od 98% ili više, sa alkil lancem sa 16 ugljenikovih atoma i alkil lancem sa 18 ugljenikovih atoma, stopa oslobađanja je znatno smanjena za lipozom sa inkapsuliranim topotekanom, lipozom sa inkapsuliranim doksorubicinom i lipozom sa inkapsuliranim irinotekanom, i prema tome, utvrđeno je da je upotreba takvog potpuno sintetskog DHSM poželjna za suzbijanje curenja leka u krv.

[0463] <Merenje nerastvorljivih čestica>

[0465] Za svaki od Primera 2, 3 i 4, jedan mesec posle skladištenja na 5°C mereni su uzorci u uređaju za merenje potopljenih čestica (HACH ULTRA) i meren je broj čestica od preko 10 µm i broj čestica od preko 25 µm, sadržanih po bočici formulacije (2 mL) (ovde u nastavku, ako nije drugačije specifikovano, čestice veće od 10 µm označene su kao čestice veličine preko 10 µm, i čestice veće od 25 µm označene su kao čestice veličine preko 25 µm). Koncentracija lipida u Primerima 2, 3 i 4 bila je 23 mmol/L, i broj čestica po 1 µmol lipida za čestice od preko 10 µm bio je 0.7 za Primer 2, 1.1 za Primer 3, i 0.3 za Primer 4. Pored toga, broj čestica po 1 µmol lipida za čestice od preko 25 µm bio je 0.09 za Primer 2, 0.5 za Primer 3, i 0 za Primer 4. Poznato je da se u slučaju curenja i izlaganja neutralnom okruženju, lipozomi sa inkapsuliranim topotekanom razlažu u slabo rastvorljive dimere, čime postaju nerastvorljive čestice. Iznenađujući je rezultat da je stvaranje nerastvorljivih čestica takođe smanjeno jer je curenje izuzetno dobro suzbijeno predmetnim pronalaskom.

[0466] Za Uporedni primer 8, nerastvorljive čestice u 1 bočici formulacije (2 mL) merene su i u uzorku posle mesec dana na 5°C. U pogledu broja čestica po 1 µmol lipida, broj čestica većih od 10 µm bio je 251, što je znatno preko 150, a broj čestica većih od 25 µm bio je 17, što je znatno preko 15.

[0468] <Zavisnost amonijum jona i stope oslobađanja>

[0470] [0199] Stopa oslobađanja je izračunata kao procenat koncentracije iscurelog leka (koncentracija leka u spoljašnjoj vodenoj fazi) u odnosu na koncentraciju leka u čitavoj vodenoj fazi. Za DHSM lipozome sa inkapsuliranim topotekanom pripremljene u Primeru 17 i HSPC lipozome sa inkapsuliranim doksorubicinom (Doxil (registrovani žig) 20MG, dostupan od Janssen Pharma, Inc.) stopa oslobađanja za lipozome merena je u plazmi bez dodavanja amonijum hlorida (proizvođač LAMPIRE Biological Laboratories, Inc., mišja plazma, naziv proizvoda: Control and Donor Mouse Plasma in Na Hep, kataloški br. 7315511) i plazmi u kojoj je rastvoreno 5 mmol/L amonijum hlorida. Rezultati su prikazani na Sl. 6. U tumorskom okruženju, razgradnja glutamina je pojačana i kao rezultat toga stvara se velika količina amonijuma, za koju je saopštena pojava od približno 5 mmol/L amonijuma (citirani članak: Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 11 (2015) 1841-1850).

[0471] Doxil (registrovani žig) 20 MG je lipozom sa inkapsuliranim doksorubicinom sastavljen od HSPC. Doxil (registrovani žig) pokazuje veoma malo curenja u okruženje koje imitira krv, ali je utvrđeno da se praktično ne oslobađa čak ni u okruženju sa visokim sadržajem amonijuma koje imitira tumorsko okruženje.

[0472] Sa druge strane, lipozom koji sadrži topotekan, a koji je opisan u Primeru 17 predmetnog pronalaska, pokazuje veoma malo curenja u okruženju koje imitira krv, što rezultira visokim zadržavanjem u krvi, dok pokazuje veoma visoko oslobađanje od 86% u okruženju sa visokim sadržajem amonijuma, koje imitira tumorsko okruženje, a ne curi u krv, što dovodi do očekivanog rezultata da se pomoću lipozoma velika količina leka dostavlja tumoru i da se lek koji lipozom nosi oslobađa u velikim količinama u tumoru. Rezultati su prikazani na Sl.6.

[0473] Pored toga, tumor dobijen stvarnom transplantacijom ćelijske linije humanog kancera ovarijuma ES-2 potkožno u BALB/c nude miša izolovan je i stavljen na filter za centrifugiranje sa veličinom pora od 5 µm, posle čega je usledilo centrifugiranje na 400g tokom 10 minuta da bi se dobila tumorska intersticijalna tečnost. Lipozomi sa topotekanom (30 ng u smislu količine leka) predmetnog pronalaska pripremljeni u Primeru 17 i HSPC lipozomi sa inkapsuliranim doksorubicinom (Doxil (registrovani žig) 20MG, dostupan od Janssen Pharma, Inc.) (30 ng u smislu količine leka) su respektivno dodati u 30 µL tumorske intersticijalne tečnosti, posle čega je usledila inkubacija. Stopa oslobađanja u slučaju inkubacije na 37°C tokom 24 sata bila je 85% u Primeru 17 i 6% u HSPC lipozomima sa inkapsuliranim doksorubicinom, što pokazuje da je razlika u oslobađanju primećena kao što se i očekivalo u tumorskoj intersticijalnoj tečnosti sakupljenoj iz stvarnog tumorskog okruženja.

Claims (19)

1. PATENTNI ZAHTEVI

1. Lipozomska kompozicija, naznačena time, što sadrži: lipozome od kojih svaki ima unutrašnju vodenu fazu i vodeni rastvor koji čini spoljašnju vodenu fazu, a u kojoj su lipozomi dispergovani, pri čemu lipozom sadrži

diacilfosfatidiletanolamin modifikovan hidrofilnim polimerom;

dihidrosfingomijelin; i

holesterole;

pri čemu svaki od lipozoma inkapsulira lek,

pri čemu unutrašnja vodena faza sadrži amonijum sulfat,

i molarni odnos sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi prema leku u čitavoj vodenoj fazi iznosi 0.36 ili više.

2. Lipozomska kompozicija prema patentnom zahtevu 1,

naznačena time, što je lek antikancerski lek.

3. Lipozomska kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2,

naznačena time, što je lek antikancersko sredstvo na bazi antraciklina, antikancersko sredstvo na bazi cisplatina, antikancersko sredstvo na bazi taksana, antikancersko sredstvo na bazi alkaloida vinke, antikancersko sredstvo na bazi bleomicina, antikancersko sredstvo na bazi sirolimusa, antikancersko sredstvo na bazi kamptotecina, metabolički antagonisti ili lekovi koji ciljaju molekule.

4. Lipozomska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 3,

naznačena time, što je lek topotekan ili njegova so, doksorubicin ili njegova so, irinotekan ili njegova so, ili sunitinib ili njegova so.

5. Lipozomska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 4,

naznačena time, što je molarni odnos sulfatnih jona u unutrašnjoj vodenoj fazi prema leku sadržanom u čitavoj vodenoj fazi 0.6 ili više i 1.8 ili manje.

6. Lipozomska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 5,

naznačena time, što je diacilfosfatidiletanolamin modifikovan hidrofilnim polimerom diacilfosfatidiletanolamin modifikovan polietilen glikolom ili metoksi polietilen glikolom.

7. Lipozomska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6, naznačena time, što procenat diacilfosfatidiletanolamina modifikovanog hidrofilnim polimerom u komponentama lipozoma iznosi 2 do 10 mol%.

8. Lipozomska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 7, naznačena time, što procenat holesterola u komponentama lipozoma iznosi 35 do 43 mol%.

9. Lipozomska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 8, naznačena time, što lipozom ima veličinu čestica od 30 nm do 150 nm,

mereno postupkom dinamičkog rasipanja svetlosti.

10. Lipozomska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 9, naznačena time, što spoljašnja vodena faza ima pH od 5.5 do 8.5.

11. Lipozomska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 10, naznačena time, što je dihidrosfingomijelin onaj dihidrosfingomijelin koji sadrži dugolančanu alkil grupu sa 16 ugljenikovih atoma i dugolančanu alkil grupu sa 18 ugljenikovih atoma, i lek je topotekan ili njegova so.

12. Lipozomska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11, naznačena time, što procenat sulfatnih jona sadržanih u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma prema sulfatnim jonima u čitavoj lipozomskoj kompoziciji iznosi najmanje 80%, i procenat leka sadržanog u unutrašnjoj vodenoj fazi lipozoma prema leku u čitavoj lipozomskoj kompoziciji iznosi najmanje 80%.

13. Lipozomska kompozicija prema patentnom zahtevu 11,

naznačena time, što stopa oslobađanja leka iz lipozoma u plazmu koja ima koncentraciju amonijuma od 1 mmol/L ili manju iznosi 20%/24 sata ili manje na 37°C, i stopa oslobađanja leka iz lipozoma u plazmu koja ima koncentraciju amonijuma od 4 do 6 mmol/L iznosi 60%/24 sata ili više na 37°C.

14. Lipozomska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 13, naznačena time, što broj nerastvorljivih čestica od preko 10 µm sadržanih u 1 µmol lipida lipozomske kompozicije posle 1 meseca skladištenja na 5°C iznosi 150 ili manje, i broj nerastvorljivih čestica od preko 25 µm sadržanih u 1 µmol lipida lipozomske kompozicije iznosi 15 ili manje.

15. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži:

lipozomsku kompoziciju prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 14.

16. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 15 za upotrebu kao antikancersko sredstvo.

17. Lipozomska kompozicija, naznačena time, što sadrži: lipozome od kojih svaki ima unutrašnju vodenu fazu i vodeni rastvor koji čini spoljašnju vodenu fazu, a u kojoj su lipozomi dispergovani,

pri čemu lipozom sadrži

diacilfosfatidiletanolamin modifikovan hidrofilnim polimerom;

dihidrosfingomijelin; i

holesterole;

pri čemu svaki od lipozoma inkapsulira lek,

pri čemu unutrašnja vodena faza istog sadrži amonijum sulfat,

i dihidrosfingomijelin je dihidrosfingomijelin koji sadrži dugolančanu alkil grupu sa 16 ugljenikovih atoma i dugolančanu alkil grupu sa 18 ugljenikovih atoma.

18. Lipozomska kompozicija prema patentnom zahtevu 17,

naznačena time, što procenat dihidrosfingomijelina u komponentama lipozoma iznosi 40 do 70 mol%.

19. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži:

lipozomsku kompoziciju prema patentnom zahtevu 17 ili 18.