RS67476B1 - Genske terapije za lizozomne poremećaje - Google Patents

Genske terapije za lizozomne poremećaje

Info

Publication number
RS67476B1
RS67476B1 RS20251192A RSP20251192A RS67476B1 RS 67476 B1 RS67476 B1 RS 67476B1 RS 20251192 A RS20251192 A RS 20251192A RS P20251192 A RSP20251192 A RS P20251192A RS 67476 B1 RS67476 B1 RS 67476B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
raav
grn
vector
pr006a
protein
Prior art date
Application number
RS20251192A
Other languages
English (en)
Inventor
Asa Abeliovich
Laura Heckman
Li Chin Wong
Hsuan-Ni Lin
Franz Hefti
Herve Rhinn
Original Assignee
Prevail Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Prevail Therapeutics Inc filed Critical Prevail Therapeutics Inc
Publication of RS67476B1 publication Critical patent/RS67476B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/18—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with another compound as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.18)
    • C12Y114/18001—Tyrosinase (1.14.18.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14133—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)

Description

[0001] Opis
[0003] Oblast
[0005] Pronalazak se odnosi na oblast genske terapije i postupaka za upotrebu iste.
[0007] Pozadina
[0009] Gošeova bolest je retka urođena greška u metabolizmu glikosfingolipida usled nedostatka lizozomske kiseline β-glukocerebrozidaze (Gcaza, „GBA“).
[0010] Pacijenti boluju od simptoma i nalaza koji nisu vezani za CNS, uključujući hepatosplenomegaliju, insuficijenciju koštane srži koja vodi do pancitopenije, poremećaje i fibrozu pluća i koštane defekte. Dodatno tome, značajan broj pacijenata boluje od neuroloških manifestacija, uključujući defektivne sakadijske kretnje oka i pogleda, napade, kognitivne deficite, kašnjenje u razvoju i poremećaje kretanja, uključujući Parkinsonovu bolest. Postoji više terapijskih sredstava koja rešavaju periferne bolesti i principijelne kliničke manifestacije u hematopoičnoj koštanoj srži i unutrašnjim organima, uključujući terapije zamene enzima kako su opisane u nastavku, lekove malih molekula nalik pratiocima koji se vezuju za defektivnu Gcazu i poboljšavaju stabilnost i terapiju smanjenje supstrata koja smanjuje proizvodnju supstrata koji se nakupljaju u Gošeovoj bolesti, dovodeći do navedenih simptoma i nalaza. Međutim, drugi aspekti Gošeove bolesti (posebno oni koji utiču na skelet i mozak) deluju refraktorni prema lečenju.
[0012] Progranulin (PGRN) je dodatni protein koji je povezan s lizozomskom funkcijom. PGRN je kodiran od strane GRN gena. GRN haploinsuficijencija kod ljudi dovodi do približno 90 % rizika od razvijanja FTD-GRN (fronto-temporalne demencije s GRN mutacijom), neurodegenerativne bolesti karakterisane oštećenjem izvršne funkcije, promena u ponašanju i jezičkim teškoćama, praćenim atrofijom frontalnih i temporalnih režnjeva. Nisu dostupne terapije koje modifikuju bolest za pacijente s FTD-om.
[0014] Sažetak
[0015] Ovde je obezbeđen postupak za lečenje subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima fronto-temporalnu demenciju s GRN mutacijom, s tim da postupak sadrži primenjivanje na subjekta rekombinantnog adeno asociranog virusa (rAAV), koji sadrži: (i) rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži ekspresioni konstrukt koji sadrži promoter operativno povezan s transgenskim umetkom koji kodira PGRN protein, pri čemu transgenski umetak sadrži sekvencu nukleotida prema SEQ ID NO: 68; i (ii) AAV9 kapsidni protein. U nekim otelotvorenjima, rAAV se primenjuje na subjekta pri dozi u rasponu od oko 1 × 10<13>vektorskih genoma (vg) do oko 7 × 10<14>vg. U nekim otelotvorenjima, rAAV se primenjuje putem ubrizgavanja u cisternu magnu.
[0017] U nekim otelotvorenjima, promoter koji je operativno povezan s transgenskim umetkom koji kodira PGRN protein je promoter kokošijeg beta aktina (engl. chicken beta actin, CBA). U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor dodatno sadrži pojačivač citomegalovirusa (CMV). U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor dodatno sadrži posttranskripcioni regulatorni element mrmotskog virusa hepatitisa (Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element, WPRE). U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor dodatno sadrži poliA signalni rep goveđeg hormona rasta. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina sadrži dve sekvence invertovanih terminalnih ponavljajućih nizova (inverted terminal repeats, ITR) adeno asociranog virusa, koje se nalaze na bokovima ekspresionog konstrukta. U nekim otelotvorenjima, svaka sekvenca ITR je sekvenca AAV2 ITR divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor dodatno sadrži TRY region između 5' ITR i ekspresionog konstrukta, pri čemu TRY region sadrži SEQ ID NO: 28.
[0019] Ovde je obezbeđen postupak za lečenje subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima fronto-temporalnu demenciju s GRN mutacijom, s tim da postupak sadrži primenjivanje na subjekta rAAV-a, koji sadrži: (i) rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži, u 5' do 3' redosledu: (a) AAV2 ITR; (b) pojačivač CMV; (c) promoter CBA; (d) transgenski umetak koji kodira PGRN protein, pri čemu transgenski umetak sadrži sekvencu nukleotida prema SEQ ID NO: 68; (e) WPRE; (f) poliA signalni rep goveđeg hormona rasta; i (g) AAV2 ITR; i (ii) AAV9 kapsidni protein. U nekim otelotvorenjima, rAAV se primenjuje na subjekta pri dozi u rasponu od oko 1 × 10<13>vg do oko 7 × 10<14>vg. U nekim otelotvorenjima, rAAV se primenjuje putem ubrizgavanja u cisternu magnu.
[0020] U nekim otelotvorenjima, rAAV se primenjuje u formulaciji koja sadrži oko 20 mM Tris, pH 8,0, oko 1 mM MgCl2, oko 200 mM NaCl i oko 0,001 % tež./zapr. poloksamera 188.
[0022] Ovde je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja sadrži (i) rAAV koji sadrži: (a) rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži ekspresioni konstrukt koji sadrži promoter operativno povezan s transgenskim umetkom koji kodira PGRN protein, pri čemu transgenski umetak sadrži sekvencu nukleotida prema SEQ ID NO: 68; i (b) AAV9 kapsidni protein; i (ii) oko 20 mM Tris, pH 8,0, (iii) oko 1 mM MgCl2, (iv) oko 200 mM NaCl i (v) oko 0,001 % tež./zapr. poloksamera 188.
[0024] Ovde je obezbeđen rAAV koji sadrži: (a) rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži ekspresioni konstrukt koji sadrži promoter operativno povezan s transgenskim umetkom koji kodira PGRN protein, pri čemu transgenski umetak sadrži sekvencu nukleotida prema SEQ ID NO: 68; i (b) AAV9 kapsidni protein, za upotrebu u postupku lečenja fronto-temporalne demencije s GRN mutacijom kod subjekta.
[0026] Ovde je obezbeđen postupak kvantifikovanja nivoa PGRN proteina u uzorku kičmenomoždane tečnosti (engl. cerebrospinal fluid, CSF), s tim da postupak sadrži: (1) razređivanje uzorka CSF-a u master smeši koja sadrži ditiotreitol (DTT) i pufer za uzorke; (2) punjenje razređenog uzorka CSF-a, antiprogranulinskog antitela, sekundarnog antitela koje detektuje antiprogranulinsko antitelo, luminola i peroksida u bunariće kapilarne patrone; (3) punjenje kapilarne patrone u instrument za automatizovani imunotest zapadnog blota; (4) korišćenje instrumenta za imunotest zapadnog blota da bi se izračunao intenzitet signala, vršna površina, i odnos signala spram šuma; i (5) kvantifikovanje nivoa proteina progranulina u uzorku CSF-a kao vršne površine imunoreaktivnosti na antiprogranulinsko antitelo.
[0028] Sva otelotvorenja i obelodanjivanja opisana u nastavku nisu deo predmetnog pronalaska osim ako su obuhvaćena obimom priloženih patentnih zahteva.
[0029] Dodatno tome, referisanja na postupke lečenja terapijom, hirurgijom ili in vivo dijagnozom treba tumačiti kao referisanja na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u tim postupcima.
[0031] Kratak opis crteža
[0033] SL. 1 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo).
[0035] SL. 2 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) i LIMP2 (SCARB2) ili njegov deo.
[0036] Kodirajuće sekvence Gcaze i LIMP2 su odvojene unutrašnjim mestom vezivanja ribozoma (engl. internal ribosomal entry site, IRES).
[0038] SL.3 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) i LIMP2 (SCARB2) ili njegov deo. Ekspresije kodirajućih sekvenci Gcaze i LIMP2 su svaka pogonjene odvojenim promoterom.
[0040] SL. 4 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo), LIMP2 (SCARB2) ili njegov deo i interferentni RNK za α-Syn.
[0042] SL. 5 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo), prosapozin (npr., PSAP ili njegov deo) i interferentni RNK za α-Syn.
[0044] SL. 6 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) i prosapozin (npr., PSAP ili njegov deo). Kodirajuće sekvence Gcaze i prosapozina su odvojene unutrašnjim mestom vezivanja ribozoma (IRES).
[0046] SL. 7 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo). U ovom otelotvorenju, vektor sadrži element promotera CBA (CBA), koji se sastoji od četiri dela: pojačivača CMV (engl. CMV enhancer, CMVe), promotera CBA (engl. CBA promoter, CBAp), egzona 1 i introna (int) da bi konstitutivno eksprimirao kodon optimizovanu kodirajuću sekvencu ljudskog GBA1. Region 3' takođe sadrži WPRE regulatorni element praćen bGH poliA repom. Na 5' kraju promoterskog regiona su uključene tri mesta trakskripcijske regulatorne aktivacije: TATA, RBS i YY1. Bočni ITR-ovi omogućuju pravilno pakovanje međusekvenci. Ocenjene su dve varijante 5' ITR sekvence (umetnuti kvadrati); one imaju više razlika u nukleotidima unutar 20-nukleotidnog „D“ regiona AAV2 ITR divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor sadrži sekvencu nukleotida „D“ domena prikazanu na gornjoj liniji. U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor sadrži mutirani „D“ domen (npr., „S“ domen, s promenama nukleotida prikazanim na donjoj liniji).
[0048] SL. 8 je šema koja prikazuje vektor opisan na SL.6
[0050] SL. 9 prikazuje reprezentativne podatke za isporuku rAAV-a koji sadrži transgen koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) u CBE mišijem modelu Parkinsonove bolesti. Svakodnevna IP isporuka PBS vehikuluma, 25 mg/kg CBE, 37,5 mg/kg CBE ili 50 mg/kg CBE (s leva na desno) započeta u P8. Preživljavanje (gore levo) je proveravano dva puta dnevno i težina (gore desno) je proveravana svakodnevno. Sve grupe su počele sa n = 8. Ponašanje je procenjeno ukupnom pređenom udaljenošću u otvorenom polju (dole levo) u P23 i vremena do pada na rotirajućoj osovini (dole u sredini) u P24. Nivoi supstrata GCaze su analizirani u korteksu miševa u PBS i 25 mg/kg CBE lečenim grupama sa uskraćivanjem CBE (3. dan) i bez uskraćivanja CBE (1. dan). Agregatni nivoi GluSph i GalSph (dole desno) su prikazani pmol po mg vlažne težine tkiva. Predstavljene su srednje vrednosti. Kolone grešaka su SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001, nominalne pvrednosti za lečene grupe po linearnoj regresiji.
[0052] SL.10 je šema koja prikazuje dizajn ispitivanja za maksimalnu dozu rAAV-a u CBE mišijem modelu. Ukratko, rAAV je isporučen ICV ubrizgavanjem u P3 i svakodnevno CBE lečenje je započeto u P8. Ponašanje je procenjeno u testovima otvorenog polja i rotacione osovine u P24–25 i nivoi supstrata su mereni u P36 i P38.
[0054] SL. 11 prikazuje reprezentativne podatke za procenu za vreme života maksimalne doze rAAV-a u CBE mišijem modelu. U P3, miševi su lečeni ili ekscipijentom ili 8,8e9 vg rAAV-GBA1 putem ICV isporuke. Svakodnevna IP isporuka ili PBS-a ili 25 mg/kg CBE-a je započeta u P8. Na kraju ispitivanja, pola miševa je žrtvovano jedan dan nakon poslednje doze CBE-a u P36 (1. dan) dok je preostalih pola prošlo kroz 3 dana uskraćivanja CBE-a pre žrtvovanja u P38 (3. dan). Sve lečene grupe (ekscipijent PBS n = 8, rAAV-GBA1 PBS n = 7, ekscipijent CBE n = 8 i varijanta CBE n = 9) su svakodnevno vagane (gore levo) i težina u P36 je analizirana (gore desno). Ponašanje je procenjeno po ukupnoj pređenoj udaljenosti u otvorenom polju u P23 (dole levo) i vremenu pre pada na rotirajućoj osovini P24 (dole desno), ocenjeno za svaku životinju kao medijana iz 3 pokušaja. Zbog smrtonosnosti, u testovima ponašanja je n = 7 za ekscipijent CBE grupu, dok je za sve ostale grupe n = 8. Predstavljene su srednje vrednosti za sve životinje. Kolone grešaka su SEM. *p<0,05; ***p<0,001, nominalne p-vrednosti za lečene grupe po linearnoj regresiji u životinjama lečenim CBE-om.
[0056] SL. 12 prikazuje reprezentativne podatke za biohemijsku procenu maksimalne doze rAAV u CBE mišijem modelu. Korteks svih lečenih grupa (ekscipijent PBS n = 8, varijanta PBS n = 7, ekscipijent CBE n = 7 i varijanta CBE n = 9) je korišćen za merenje aktivnosti GCaze (gore levo), nivoa GluSph (gore desno), nivoa GluCer (dole levo) i vektorskih genoma (dole desno) u grupama pre (1. dan) ili posle (3. dan) uskraćivanja CBE-a. Biodistribucija je prikazana kao vektorski genomi po 1 µg genomskog DNK. Predstavljene su srednje vrednosti. Kolone grešaka su SEM. (*)p<0,1; **p<0,01; ***p<0,001, nominalne p-vrednosti za lečene grupe po linearnoj regresiji u životinjama lečenim CBE-om, s danima prikupljanja i korigovane po rodu kao kovarijante.
[0058] SL. 13 prikazuje reprezentativne podatke za bihevijoralne i biohemijske korelacije u CBE mišijem modelu nakon primene ekscipijent PBS, ekscipijent CBE i varijanta CBE lečenih grupa. U svim lečenim grupama, performanse na rotirajućoj osovini su bile u negativnoj korelaciji s akumulacijom GluCer (A, p = 0,0012 po linearnoj regresiji) i akumulacija GluSph je bila u negativnoj korelaciji s aktivnošću GCaze (B, p = 0,0086 po linearnoj regresiji).
[0060] SL.14 prikazuje reprezentativne podatke za biodistribuciju varijante u CBE mišijem modelu. Prisustvo vektorskih genoma je procenjeno u jetri, slezini, bubregu i polnim žlezdama (ekscipijent PBS n = 8, varijanta PBS n = 7, ekscipijent CBE n = 7 i varijanta CBE n = 9). Biodistribucija je prikazana kao vektorski genomi po 1 µg genomskog DNK. Prisustvo vektorskih genoma je kvantifikovano kvantitativnim PCR-om korišćenjem vektorske referentne standardne krivulje; koncentracija genomskog DNK je ocenjena A260 merenjem optičke gustoće. Predstavljene su srednje vrednosti. Kolone grešaka su SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001, nominalne p-vrednosti za lečene grupe po linearnoj regresiji u životinjama lečenim CBE-om, s danima prikupljanja i korigovane po rodu kao kovarijante.
[0062] SL. 15 prikazuje reprezentativne podatke za procenu raspona doze rAAV-a tokom života u rasponu u CBE mišijem modelu. Miševi su primili ekscipijent ili jednu od tri različite doze rAAV-GBA1 putem ICV isporuke u P3: 3,2e9 vg, 1,0e10 vg ili 3,2e10 vg. U P8, svakodnevno IP lečenje s 25 mg/kg CBE-a je započeto. Miševi koji su primali ekscipijent i CBE ili ekscipijent i PBS su služili kao kontrole. Sve lečene grupe su započele sa n = 10 (5 M/5 F) po grupi. Svi miševi su žrtvovani jedan dan nakon poslednje doze CBE-a (P38–P40). Sve lečene grupe su vagane dnevno i njihova težina je analizirana u P36. Motorički performansi su procenjeni vremenom do pada sa rotirajuće osovine u P24 i vremenom do prelaska preko sužene šipke u P30. Zbog rane smrtonosnosti, broj miševa koji su učestvovali u bihevijoralnim testovima je bio: ekscipijent PBS n = 10, ekscipijent CBE n = 9 i 3,2e9 vg rAAV-GBA1 CBE n = 6, 1,0e10 vg rAAV-GBA1 CBE n = 10, 3,2e10 vg rAAV-GBA1 CBE n = 7. Predstavljene su srednje vrednosti. Kolone grešaka su SEM; *p<0,05; **p<0,01 za nominalne p-vrednosti po linearnoj regresiji u grupama lečenim CBE-om, s korekcijom prema rodu kao kovarijablom.
[0064] SL. 16 prikazuje reprezentativne podatke za biohemijsku procenu raspona doze rAAV-a u CBE mišijem modelu. Korteks svih lečenih grupa (ekscipijent PBS n = 10, ekscipijent CBE n = 9, i 3,2e9 vg rAAV-GBA1 CBE n = 6, 1,0e10 vg rAAV-GBA1 CBE n = 10, 3,2e10 vg rAAV-GBA1 CBE n = 7) je korišćen za merenje aktivnosti GCaze, nivoa GluSph, nivoa GluCer i genomskih vektora. Aktivnost GCaze je prikazana kao ng GCaze po mg ukupnih proteina. Nivoi GluSph i GluCer su prikazani kao pmol po mg vlažne težine tkiva.
[0065] Biodistribucija je prikazana kao vektorski genomi po 1 µg genomskog DNK.
[0066] Prisustvo vektorskih genoma je kvantifikovano kvantitativnim PCR-om korišćenjem vektorske referentne standardne krivulje; koncentracija genomskog DNK je ocenjena A260 merenjem optičke gustoće. Prisustvo vektorskog genoma je takođe mereno u jetri (E). Predstavljene su srednje vrednosti. Kolone grešaka su SEM. **p<0,01; ***p<0,001 za nominalne p-vrednosti po linearnoj regresiji u grupama lečenim CBE-om, s korekcijom prema rodu kao kovarijablom.
[0067] SL. 17 prikazuje reprezentativne podatke za analizu sužene šipke u maksimalnoj dozi rAAV-GBA1 u genetskom mišijem modelu. Motoričke performanse u lečenim grupama (WT ekscipijent, n = 5), 4L/PS-NA ekscipijent (n = 6) i 4L/PS-NA rAAV-GBA1 (n = 5)) su testirane hodom po šipki 4 nedelje nakon primene rAAV-GBA1. Ukupan broj sklizavanja i vreme aktivnosti su prikazani kao ukupne vrednosti tokom 5 pokušaja na različitim šipkama. Brzina i broj sklizavanja po brzini su prikazani kao prosek tokom 5 pokušaja na različitim šipkama. Predstavljene su srednje vrednosti. Kolone grešaka su SEM.
[0069] SL. 18 prikazuje reprezentativne podatke za in vitro ekspresiju rAAV konstrukata koji kodiraju protein progranulin (PGRN). Levi panel prikazuje standardnu krivulju ELISA testa progranulina (PGRN). Donji panel prikazuje odgovor na dozu PGRN ekspresije meren ELISA testom u ćelijskim lizatima HEK293T ćelija transduciranih s rAAV-om. MOI = višestrukost infekcije (vektorskih genoma po ćeliji; engl. multiplicity of infection).
[0071] SL. 19 prikazuje reprezentativne podatke za in vitro ekspresiju rAAV konstrukta koji kodiraju GBA1 u kombinaciji sa prospazinom (PSAP), SCARB2 i/ili jednom ili više inhibitornih nukleinskih kiselina. Podaci ukazuju da je transfekcija HEK293 ćelija sa svakim od konstrukta dovela do prekomerne ekspresije transgena od interesa, relativno spram lažnih transfektovanih ćelija.
[0073] SL. 20 je šematski prikaz rAAV vektora koji sadrže „D“ region koji se nalazi na „spoljašnjosti“ ITR-a (npr., proksimalno spram terminusa ITR-a relativno spram transgenskog umetka ili ekspresionog konstrukta) (gore) i vektora rAAV divljeg tipa koji imaju ITR-ove na „unutrašnjosti“ vektora (npr., proksimalno spram transgenskog umetka vektora).
[0075] SL. 21 je šematski prikaz vektora koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira GBA2 ili njegov deo i interferentni RNK za α-Syn.
[0077] SL. 22 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) i galaktozilceramidazu (npr., GALC ili njegov deo). Ekspresije kodirajućih sekvenci Gcaze i galaktozilceramidaze su odvojene sekvencom samocepajućih peptida T2A.
[0078] SL. 23 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) i galaktozilceramidazu (npr., GALC ili njegov deo). Ekspresije kodirajućih sekvenci Gcaze i galaktozilceramidaze su odvojene sekvencom samocepajućih peptida T2A.
[0080] SL. 24 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo), katepsin B (npr., CTSB ili njegov deo) i interferentni RNK za α-Syn. Ekspresije kodirajućih sekvenci Gcaze i katepsina B su odvojene sekvencom samocepajućih peptida T2A.
[0082] SL. 25 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo), sfingomijelin fosfodiesterazu 1 (npr., SMPD1 ili njegov deo) i interferentni RNK za α-Syn.
[0084] SL. 26 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) i galaktozilceramidazu (npr., GALC ili njegov deo). Kodirajuće sekvence Gcaze i galaktozilceramidaze su odvojene unutrašnjim mestom vezivanja ribozoma (IRES).
[0086] SL. 27 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) i katepsin B (npr., CTSB ili njegov deo). Ekspresije kodirajućih sekvenci Gcaze i katepsina B su svaka pogonjene odvojenim promoterom.
[0088] SL. 28 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo), GCH1 (npr., GCH1 ili njegov deo) i interferentni RNK za α-Syn. Kodirajuće sekvence Gcaze i GCH1 su odvojene sekvencom samocepajućih peptida T2A.
[0090] SL. 29 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo), RAB7L1 (npr., RAB7L1 ili njegov deo) i interferentni RNK za α-Syn. Kodirajuće sekvence Gcaze i RAB7L1 su odvojene sekvencom samocepajućih peptida T2A.
[0092] SL. 30 je šema koja prikazuje jedan vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo), GCH1 (npr., GCH1 ili njegov deo) i interferentni RNK za α-Syn. Ekspresije kodirajućih sekvenci Gcaze i GCH1 su odvojene unutrašnjim mestom vezivanja ribozoma (IRES).
[0094] SL. 31 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira VPS35 (npr., VPS35 ili njegov deo) i interferentne RNK-ove za α-Syn i TMEM106B.
[0096] SL. 32 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo), IL-34 (npr., IL34 ili njegov deo) i interferentni RNK za α-Syn. Kodirajuće sekvence Gcaze i IL-34 su odvojene sekvencom samocepajućih peptida T2A.
[0098] SL. 33 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) i IL-34 (npr., IL34 ili njegov deo). Kodirajuće sekvence Gcaze i IL-34 su odvojene unutrašnjim mestom vezivanja ribozoma (IRES).
[0100] SL. 34 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) i TREM2 (npr., TREM2 ili njegov deo). Ekspresije kodirajućih sekvenci Gcaze i TREM2 su svaka pogonjene odvojenim promoterom.
[0102] SL.35 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) i IL-34 (npr., IL34 ili njegov deo). Ekspresije kodirajućih sekvenci Gcaze i IL-34 su svaka pogonjene odvojenim promoterom.
[0104] SL. 36A–SL. 36B prikazuju reprezentativne podatke za prekomernu ekspresiju TREM2 i GBA1 u HEK293 ćelijama relativno spram transduciranih ćelija, mereno qPCR i ELISA testom. SL.36A prikazuje podatke za prekomernu ekspresiju TREM2. SL.36B prikazuje podatke za prekomernu ekspresiju GBA1 iz istog konstrukta.
[0106] SL. 37 prikazuje reprezentativne podatke koji ukazuju na uspešno gašenje SNCA in vitro putem GFP reporterskog testa (gore) i α-Syn testa (dole).
[0108] SL.38 prikazuje reprezentativne podatke koji ukazuju na uspešno gašenje TMEM106B in vitro putem GFP reporterskog testa (gore) i α-Syn testa (dole).
[0109] SL. 39 je šema koja prikazuje jedno otelotvorenje vektora koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira PGRN.
[0111] SL. 40 prikazuje podatke za transdukciju HEK293 ćelija korišćenjem rAAV-ova koji imaju ITR-ove s divljim tipom (krugovi) ili alternativnim (npr., „spoljašnjim“; kvadrati) položajem „D“ sekvence. rAAV-ovi koji imaju ITR-ove postavljene na „spoljašnjost“ bili su u stanju transducirati ćelije jednako efikasno kao rAAV-ovi koji imaju ITR-ove divljeg tipa.
[0113] SL. 41 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo).
[0115] SL. 42 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo).
[0117] SL. 43 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) i interferentni RNK za α-Syn.
[0119] SL. 44 je šema koja prikazuje jedno otelotvorenje vektora koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira PGRN.
[0121] SL. 45 je šema koja prikazuje jedno otelotvorenje vektora koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira PGRN.
[0123] SL. 46 je šema koja prikazuje jedno otelotvorenje vektora koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira PGRN i interferentni RNK za mikrotubulima asocirani protein tau (MAPT).
[0125] SL. 47 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) i interferentni RNK za α-Syn.
[0127] SL. 48 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira PSAP.
[0129] SL. 49 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo).
[0130] SL. 50 je šema koja prikazuje vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo) i galaktozilceramidazu (npr., GALC ili njegov deo).
[0132] SL. 51 je šema koja prikazuje plazmid koji sadrži rAAV vektor koji uključuje ekspresioni konstrukt koji kodira Gcazu (npr., GBA1 ili njegov deo), prosapozin (npr., PSAP ili njegov deo) i interferentni RNK za α-Syn.
[0134] SL. 52A prikazuje da su linije neuronskih matičnih ćelija (engl. neuronal stem cell, NSC) derivirane iz iPSC-a od pacijenata s FTD-GRN mutacijama izlučile manje progranulina od NSC linija deriviranih iz zdravih kontrolnih subjekata.
[0135] Statistike su utvrđene korišćenjem nesparenog t-testa; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM.
[0137] SL. 52B prikazuje rezultate iz utvrđivanja raspona doze transdukcije PR006A u neuronskim kulturama nosača FTD-GRN mutacije. NSC-ovi su posejani pri jednakoj gustoći i diferencirani u neurone.7. dana, neuroni su transducirani s ekscipijentom ili naznačenim količinama PR006A tokom 72 časa. Ekspresija izlučenog progranulina je merena iz ćelijskog medijuma putem ELISA testa i normalizovana prema zapremini (n = 3–4; srednja vrednost ± SEM). Crna isprekidana linija predstavlja endogene nivoe izlučenog progranulina iz kontrolnih neurona (lečeni ekscipijentom). Izlučeni progranulin nije bio uočljiv u FTD-GRN neuronima lečenim ekscipijentom. Statistika je utvrđena korišćenjem ANOVA testa praćenog Tukejevim HSD testom i statističko upoređivanje svakog stanja s kontrolnim neuronima lečenim ekscipijentom je naznačeno na grafu, * = p < 0,05, *** = p < 0,001. LLOQ = niža granica kvantizacije (engl. lower limit of quantitation); MOI = višestrukost infekcije (engl. multiplicity of infection).
[0139] SL. 52C prikazuje da je PR006 lečenje neuronskih kultura spasilo defektivno sazrevanje ključne lizozomske proteaze, katepsina D, u FTD-GRN neuronskim kulturama. NSC-ovi su posejani u jednakim koncentracijama i diferencirani u neurone.7. dana, neuroni su transducirani s ekscipijentom ili PR006A pri MOI od 5,3 × 10<5>tokom 72 časa. Neuroni su lizirani i lizati su analizirani na ProteinSimple Western Jess sistemu s antikatepsin D (CTSD) primarnim antitelom. Trake koje odgovaraju i zrelom katepsinu D (matCTSD) i prokatepsinu D (proCTSD) su detektovane i površina ispod krivulje je kvantifikovana za svaku traku i normalizovana prema unutrašnjem signalu za normalizaciju ukupnih proteina. Utvrđen je odnos matCTSD/proCTSD u FTD-GRN neuronima lečenim ekscipijentom ili PR006A; y-osa prikazuje odnos matCTSD/proCTSD kao procenat odnosa kontrolnih neurona lečenih ekscipijentom (n=3; srednja vrednost ± SEM). Statistika je utvrđena korišćenjem sparenog t-testa, * = p < 0,05.
[0141] SL. 52D i SL.52F prikazuju da PR006A smanjuje TDP-43 patologiju u FTD-GRN neuronskim kulturama. NSC-ovi su posejani u jednakim koncentracijama i diferencirani u neurone. 7. dana, neuroni su transducirani s ekscipijentom ili PR006A pri MOI od 5,3 × 10<5>i prikupljeni 21 dan nakon transdukcije. SL.52D: Neuroni su lizirani i Triton-X nerastvorljiva proteinska frakcija je izolovana i analizirana na ProteinSimple Western Jess sistemu s anti-TDP-43 antitelom (#12892-AP-1). Detektovana je traka koja odgovara TDP-43 i površina ispod krivulje je kvantifikovana za svaku traku i normalizovana prema ukupnoj koncentraciji proteina u nerastvorljivoj frakciji. Y-osa prikazuje količinu nerastvorljivog TDP-43 kao procenat ekscipijentom lečenih nivoa normalizovanih odvojeno za svaku FTD-GRN ćelijsku liniju (n = 3; srednja vrednost ± SEM). SL.
[0142] 52D prikazuje da je PR006 lečenje smanjilo nerastvorljivi TDP-43, karakterističan znak FTD-GRN patologije, u FTD-GRN neuronskim kulturama. SL.52F:
[0143] Kvantifikacija nuklearnog TDP-43 signala iz imunofluorescencijskih slika neurona deriviranih iz iPSC-a lečenih s PR006A. Utvrđen je intenzitet TDP-43 signala po nukleusu u FTD-GRN neuronima lečenim s ekscipijentom ili PR006A; Y-osa prikazuje intenzitet TDP-43 signala po nukleusu kao procenat intenziteta TDP-43 signala kontrolnih neurona lečenih ekscipijentom (n = 145–306 ćelija; srednja vrednost ± SEM). TDP-43 je izmeren korišćenjem anti-TDP-43 antitela (#12892-AP-1) i površina nukleusa je utvrđena DAPI bojom. SL.52F prikazuje da je PR006 lečenje povećalo nivoe ekspresije TDP-43 u nukleusu u FTD-GRN neuronskim kulturama skoro na nivoe kontrolnog divljeg tipa. Statistika je utvrđena korišćenjem nesparenog t-testa, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001.
[0145] SL. 52E prikazuje da su NSC linije derivirane iz iPSC-a od pacijenata s FTD-GRN mutacijama eksprimirale manje progranulina nego NSC linije derivirane iz zdravih kontrolnih subjekata. Statistike su utvrđene korišćenjem nesparenog ttesta; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM.
[0147] SL. 52G je niz slika koje prikazuju da su linije neuronskih matičnih ćelija (NSC) iz ljudskih FTD-GRN i ljudskih kontrolnih ćelijskih linija uspešno diferencirane u neuronske kulture. Kontrolne i FTD-GRN NSC linije (FTD-GRN #1 i FTD-GRN #2) su diferencirane u neurone nakon perioda od 7 dana, kako je naznačeno ćelijskom morfologijom i imunoflorescentnim bojenjem za neuronske markere (NeuN [crveno]; MAP2 ili Tau kako je označeno na levoj strani [zeleno]). DAPI (plavo) je korišćeno za bojenje nukleusa.
[0149] SL. 53A–FIG. 53C su niz stubičastih grafikona koji prikazuju rezultate eksperimenata analize biodistribucije i ekspresije progranulina u CNS-u u ispitivanju na odraslim jedinkama s rasponom doza PR006A u mišijem modelu FTD-GRN. 4 meseca starim Grn KO miševima je dat PR006A ili ekscipijent putem ICV primene. Žrtvovani su 3 meseca nakon lečenja s ekscipijentom (crveno) ili s PR006A pri dozi od 1,1 × 10<9>vg (2,7 × 10<9>vg/g mozga), 1,1 × 10<10>vg
[0150] (2,7 × 10<10>vg/g mozga) ili 1,1 × 10<11>vg (2,7 × 10<11>vg/g mozga) (plavo) za biohemijske krajnje tačke u CNS-u. SL.53A: Prisustvo vektorskih genoma je procenjeno u cerebralnom korteksu i kičmenoj moždini i biodistribucija je prikazana kao vektorski genomi po µg gDNK na log skali (n = 8–10/grupi; srednja vrednost ± SEM). Prisustvo vektorskih genoma je kvantifikovano qPCR-om korišćenjem vektorske referentne standardne krivulje; Isprekidana linija (pri 50 vektorskih genom/µg gDNK) predstavlja prag za pozitivno prisustvo vektora. SL. 53B: Ekspresija RNK PR006A kodiranog GRN je procenjena kvantitativnim RT-PCR-om (qRT-PCR) u cerebralnom korteksu (n = 8–10/grupi; srednja vrednost ± SEM). Broj GRN kopija (specifičnih za našu kodonom optimizovanu PR006A sekvencu) je normalizovan na 1 µg ukupnog RNK i prikazan je na log skali. SL.53C: Nivoi proteina progranulina su mereni korišćenjem ELISA testa za progranulin specifičan za ljude u mozgu i kičmenoj moždini (n = 8–10/grupi; srednja vrednost ± SEM). Nivoi progranulina u tkivu su normalizovani prema ukupnoj koncentraciji proteina. Niža granica kvantizacije (engl. lower limit of quantitation, LLOQ) je naznačena isprekidanom sivom linijom. Za ELISA testove tkiva, vrednosti LLOQ (ng/mg) su utvrđene deljenjem testnih LLOQ (ng/ml) s prosekom ukupne koncentracije proteina iz svih uzoraka. Jednostavna linija koja odgovara boji lečene grupe navedenoj u legendi na x-osi bez stubova greške ukazuje da su sve životinje u toj grupi bile 0. Statistička analiza je sprovedena korišćenjem ANOVA testa praćenog Danetovim testom da bi se uporedili s grupom Grn KO miševa lečenih ekscipijentom; * = p < 0,05, ** = p < 0,01,
[0151] *** = p < 0,001, vg = vektorski genomi; LLOQ = niža granica kvantizacije (engl. lower limit of quantitation); SC = kičmena moždina (engl. spinal cord).
[0153] SL. 53D–SL. 53E su niz stubičastih grafikona koji prikazuju rezultate eksperimenata analize biodistribucije u perifernom tkivu i ekspresije progranulina u ispitivanju na odraslim jedinkama s rasponom doza PR006A u mišijem modelu FTD-GRN. 4 meseca starim Grn KO miševima je dat PR006A ili ekscipijent putem ICV primene. Žrtvovani su 3 meseca nakon lečenja s ekscipijentom (crveno) ili s PR006A pri dozi od 1,1 × 10<9>vg (2,7 × 10<9>vg/g mozga), 1,1 × 10<10>vg
[0154] (2,7 × 10<10>vg/g mozga) ili 1,1 × 10<11>vg (2,7 × 10<11>vg/g mozga) (plavo) za biohemijske krajnje tačke u jetri, srcu, plućima, bubregu, slezini i polnim žlezdama. SL. 53D: Procenjeno je prisustvo vektorskih genoma i biodistribucije je prikazana kao vektorski genomi po µg gDNK na log skali (n = 8–10/grupi; srednja vrednost ± SEM). Prisustvo vektorskih genoma je kvantifikovano qPCR-om korišćenjem vektorske referentne standardne krivulje; Isprekidana linija (pri 50 vektorskih genom/µg gDNK) predstavlja prag za pozitivno prisustvo vektora. SL. 53E: Nivoi proteina progranulina su mereni korišćenjem ELISA testa (n = 8– 10/grupi; srednja vrednost ± SEM). Nivoi progranulina u tkivu su normalizovani prema ukupnoj koncentraciji proteina. Jednostavna linija koja odgovara boji lečene grupe navedenoj u legendi na x-osi bez stubova greške ukazuje da su sve životinje u toj grupi bile 0. Statistička analiza je sprovedena korišćenjem ANOVA testa praćenog Danetovim testom da bi se uporedili s grupom Grn KO miševa lečenih ekscipijentom; * = p < 0,05, *** = p < 0,001, vg = vektorski genomi.
[0156] SL. 53F je stubičasti graf koji prikazuje rezultate eksperimenata analize nivoa progranulina u plazmi u ispitivanju na odraslim jedinkama s rasponom doza PR006A u mišijem modelu FTD-GRN.4 meseca starim Grn KO miševima je dat PR006A ili ekscipijent putem ICV primene. Žrtvovani su 3 meseca nakon lečenja s ekscipijentom (crveno) ili s PR006A pri dozi od 1,1 × 10<9>vg (2,7 × 10<9>vg/g mozga), 1,1 × 10<10>vg (2,7 × 10<10>vg/g mozga) ili 1,1 × 10<11>vg (2,7 × 10<11>vg/g mozga) (plavo) za biohemijske krajnje tačke u plazmi. Nivoi proteina progranulina su mereni korišćenjem ELISA testa za progranulin specifičan za ljude u plazmi (n = 8–10/grupi; srednja vrednost ± SEM). Nivoi u plazmi su prikazani na log skali. Niža granica kvantizacije (engl. lower limit of quantitation, LLOQ) je naznačena isprekidanom sivom linijom. Statistička analiza je sprovedena korišćenjem ANOVA testa praćenog Danetovim testom da bi se uporedili s grupom Grn KO miševa lečenih ekscipijentom; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. LLOQ = niža granica kvantizacije (engl. lower limit of quantitation), vg = vektorski genomi.
[0158] SL. 53G–SL.53H su niz stubičastih grafova koji prikazuju rezultate eksperimenata koji prikazuju smanjene lizozomne i neuropatološke defekte u ispitivanju na odraslim jedinkama raspona doze PR006A u mišijem modelu FTD-GRN. 4 meseca starim Grn KO miševima je dat PR006A ili ekscipijent putem ICV primene. Žrtvovani su 3 meseca nakon lečenja s ekscipijentom (crveno) ili s PR006A pri dozi od 1,1 × 10<9>vg (2,7 × 10<9>vg/g mozga), 1,1 × 10<10>vg
[0159] (2,7 × 10<10>vg/g mozga) ili 1,1 × 10<11>vg (2,7 × 10<11>vg/g mozga) (plavo).
[0160] Lipofuscinoza je analizirana putem dva nezavisna postupka: (1) ocenjivanje H&E bojom obojenih odeljaka mozga od strane patologa i (2) kvantifikacijom autofluorescencije lipofuscina iz IHC odeljaka. SL.53G: Nakupljanje lipofuscina (autofluorescentne granule lipofuscina) je polovično kvantitativno ocenjeno u H&E bojom obojenim odeljcima u različitim regionima mozga od strane zaslepljenog certificiranog patologa prema sledećoj šemi ocenjivanja: 0 = nije uočen lipofuscin; 1 = veoma male granule lipofuscina (< 2 µm) raspršene po regionu; 2 = povećana gustoća nakupljanja malih granula i/ili razvoj većih granula (> 2–3 µm);
[0161] 3 = multifokalne regije s velikom gustoćom granula lipofuscina vidljivim s niskom snagom objektiva; 4 = rasprostranjeno nakupljanje lipofuscina. Prikazane su ocene težine lipofuscina u moždanim regionima cerebralnog korteksa, hipokampusa i talamusa/hipotalamusa (n = 8–10/grupi). SL.53H: IHC analiza ubikvitina je izvedena i kvantifikovana u cerebralnom korteksu, hipokampusu i talamusu. Veličina imunoreaktivnih objekata iznad praga (veličina imunoreaktivnog objekta [µm2] je prikazana za ubikvitin (n = 8–10/grupi; srednja vrednost ± SEM). Statistika je utvrđena ANOVA testom praćenim Danetovim testom da bi se uporedili s grupom Grn KO miševa lečenih ekscipijentom, * = p < 0,05, ** = p < 0,01,
[0162] *** = p < 0,001, vg = vektorski genomi; WT = divlji tip (engl. wild type).
[0163] SL.53I–SL. 53K su niz stubičastih grafova koji prikazuju rezultate eksperimenata koji pokazuju smanjene neuroinflamatornih markera u ispitivanju na odraslim jedinkama s rasponom doza PR006A u mišijem modelu FTD-GRN.4 meseca starim Grn KO miševima je dat PR006A ili ekscipijent putem ICV primene. Žrtvovani su 3 meseca nakon lečenja s ekscipijentom (crveno) ili s PR006A pri dozi od 1,1 × 10<9>vg (2,7 × 10<9>vg/g mozga), 1,1 × 10<10>vg (2,7 × 10<10>vg/g mozga) ili 1,1 × 10<11>vg (2,7 × 10<11>vg/g mozga) (plavo). SL.53I: Ekspresija gena (nivoi mRNK) Tnf i Cd68 je merena qRT-PCR-om u somatosenzornom korteksu (srednja vrednost ± SEM; n = 8–10/grupi). Ekspresija gena je normalizovana prema opšteprisutnom genu Ppib. SL.53J–FIG.53K: IHC analiza Iba1 (SL.53J) i GFAP (SL. 53K) je izvedena i kvantifikovana u fiksiranim odeljcima mozga u cerebralnom korteksu, hipokampusu i talamusu. Procenat površine od interesa koju pokrivaju objekti iznad praga (imunoreaktivna površina [%]) je prikazan (srednja
[0164] vrednost ± SEM; n = 8–10/grupi). Statistika je utvrđena ANOVA testom s Danetovim podešavanjem upoređujući svaku grupu s grupom Grn KO miševa lečenih ekscipijentom, * = p < 0,05, *** = p < 0,001, vg = vektorski genomi; WT = divlji tip (engl. wild type).
[0166] SL. 53L–SL. 53N su niz stubičastih grafova koji prikazuju rezultate eksperimenata koji pokazuju smanjenu ekspresiju gena lizozomnih i imunih puteva u ispitivanju na odraslim jedinkama s rasponom doza PR006A u mišijem modelu FTD-GRN. 4 meseca starim Grn KO miševima je dat PR006A ili ekscipijent putem ICV primene. Žrtvovani su 3 meseca nakon lečenja s ekscipijentom (crveno) ili s PR006A pri dozi od 1,1 × 10<9>vg (2,7 × 10<9>vg/g mozga), 1,1 × 10<10>vg
[0167] (2,7 × 10<10>vg/g mozga) ili 1,1 × 10<11>vg (2,7 × 10<11>vg/g mozga) (plavo).
[0168] Sekvenciranje RNK je izvedeno u uzorcima cerebralnog korteksa iz ICV lečenih Grn KO miševa i WT C57BL/6J miševa iste starosti (sivo). Metodologija analize varijacije skupa gena (engl. gene set variation analysis, GSVA) je korišćena za upoređivanje nivoa ekspresije mRNK prethodno objavljenih genskih potpisa koji su disregulisani u Grn KO miševima lečenih ekscipijentom u poređenju s WT miševima. Prikazani podaci su ocene aktivnosti GSV A za probrane skupove gena iz dva objavljena istraživanja i jedan HALLMARK put. SL.53L: Ćelijska komponenta: Vakuola (GO:0005773), SL.53M: Lizozom i SL.53N: Sistem komplemenata (HALLMARK put) (medijana ± raspon; n = 8–10/grupi). Statistička analiza je sprovedena korišćenjem ANOVA testa praćenog Danetovim testom da bi se uporedili s grupom Grn KO miševa lečenih ekscipijentom uz istovremenu kontrolu za porodičnu stopu greške tipa I, *** = p < 0,001. GSVA = analiza varijacije skupa gena (engl. gene set variation analysis); vg = vektorski genomi; WT = divlji tip (engl. wild type).
[0170] SL. 54A je niz stubičastih grafova koji prikazuju rezultate eksperimenata analize biodistribucije transgena PR006A kvantifikovanih qPCR-om. Nivoi transgena su analizirani korišćenjem qPCR metodologija u NHP-ovima 182 dana nakon ICM ubrizgavanja ili ekscipijenta, niske doze PR006A (6,5 × 10<9>vg/g mozga) ili visoke doze PR006A (6,5 × 10<10>vg/g mozga). Svaki stub predstavlja prosek ± SEM 3 životinje po grupi; žuta linija ukazuje na nižu granicu kvantizacije pri 50 vg/µg DNK.
[0172] SL. 54B je niz stubičastih grafova koji prikazuje rezultate eksperimenata analize nivoa antilek antitela protiv ljudskog progranulina. Antitela protiv progranulina u NHP serumu i uzorcima CSF-a 29. dana i 182. dana nakon lečenja ili s ekscipijentom, niskom dozom PR006A (6,5 × 10<9>vg/g mozga) ili visokom dozom PR006A (6,5 × 10<10>vg/g mozga). Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM.
[0174] SL. 54C je niz stubičastih grafova koji prikazuju rezultate eksperimenata analize ekspresije transgena PR006A (GRN). Nivoi ekspresije GRN su utvrđeni u NHP korteksu, hipokampusu i ventralnom mezencefalonu prikupljeni 183. dana korišćenjem RT-qPCR-a. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM.
[0176] SL. 54D je stubičasti graf koji prikazuje rezultate eksperimenata analize nivoa progranulina u CSF-u kvantifikovanih Simple Western<™>(Jess) platformom. Nivoi progranulina su utvrđeni u NHP uzorcima CSF-a koji su prikupljeni 183. dana, utvrđeni Simple Western<™>(Jess) analizom. Uzorci CSF-a iz NHP-ova lečenih ekscipijentom, niskom dozom PR006A (6,5 × 10<9>vg/g težine mozga) ili visokom dozom PR006A (6,5 × 10<10>vg/g težine mozga). Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM; P-vrednost: *p < 0,05, prema analize jednosmernog odgovora zavisnog od doze korišćenjem Vilijamovog testa trenda.
[0177] SL.55 je graf koji prikazuje rezultate selektivnosti i specifičnosti za Western Jess test. Nivoi proteina progranulina u uzorcima CSF-u pacijenta s FTD-om su detektovani pri 58 kDa Jess testom. Grupa (A): heterozigotni pacijenti s FTD-om i grupe (B) i (C): porodični neprenosnici ili normalni pojedinci. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (engl. standard error of the mean, SEM). SEM vrednosti su prikazane kao vertikalni stubovi greške.
[0179] SL.56 je graf koji prikazuje nivoe progranulina u uzorcima CSF-a pacijenta s FTD-om detektovane ELISA testom. Grupa (A): heterozigotni pacijenti s FTD-om i grupe (B) i (C): porodični neprenosnici ili normalni pojedinci. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti (engl. standard error of the mean, SEM). SEM vrednosti su prikazane kao vertikalni stubovi greške.
[0181] SL. 57 je gel slika svakog uzorka CSF-a obrađenog u duplikatu u Jess automatizovanoj platformi za zapadnu blot analizu. Uzorci su analizirani u 4-strukom razređenju korišćenjem primarnog antitela Adipogen PG-359-7. Prva traka su standardi molekularne težina, a na desnoj strani je identifikacija trake korišćena za izračunavanje imunoreaktivnosti prijavljenih u primeru 14.
[0183] SL. 58A–SL. 58B su niz grafova koji prikazuju merenje nivoa ekspresije ljudskog PGRN-a. Nivoi ekspresije ljudskog PGRN-a su utvrđeni u uzorcima CSF-a neljudskih primata (engl. non-human primate, NHP) koji su prikupljeni 180. dana, korišćenjem Simple Western<™>(Jess) analize. CSF iz NHP-ova lečenih ekscipijentom („ekscipijent“), niskom dozom PR006A (6,5 × 10<9>vg/g težini mozga; „niska“) ili visokom dozom PR006 (6,5 × 10<10>vg/g težini mozga; „visoka“) su analizirani. Podaci su izraženi kao prosečna površine vršne imunoreaktivnosti (SL. 58A), ili višestrukost promene nad životinjama lečenim ekscipijentom (SL. 58B). Svaka tačka predstavlja jedan uzorak CSF-a iz jednog NHP-a (srednja vrednost tehničkog duplikata) i kvadrat predstavlja srednju vrednost /- standardna greška tri pojedinačna NHP-a.
[0185] SL.59A–SL. 59C su niz stubičastih grafova koji prikazuju rezultate eksperimenata analize biodistribucije i ekspresije progranulina u CNS-u u ispitivanju na zrelim jedinkama FTD-GRN mišijeg modela nakon lečenja s PR006A. Uzorci tkiva su prikupljeni iz 18 meseci starih Grn KO miševa 2 meseca nakon primanja ICV ekscipijenta (crveno) ili 9,7 × 10<10>vg (2,4 × 10<11>vg/g mozga) PR006A (plavo). SL. 59A: Prisustvo vektorskih genoma je procenjeno u cerebralnom korteksu i kičmenoj moždini (srednja vrednost ± SEM; n = 4/grupi). Biodistribucija je prikazana kao vektorski genomi po 1 µg gDNK na log skali. Prisustvo vektorskih genoma je kvantifikovano qPCR-om korišćenjem vektorske referentne standardne krivulje;
[0186] Isprekidana linija (pri 50 vektorskih genom/µg gDNK) predstavlja prag za pozitivno prisustvo vektora. SL.59B–SL.59C: Nivoi proteina progranulina su izmereni korišćenjem ELISA testa u tkivima CNS-a (mozga i kičmene moždine (SL.59B)) i CSF-a (SL.59C) (srednja vrednost ± SEM; n = 4/grupi). Nivo progranulina u tkivu su normalizovani prema ukupnoj koncentraciji proteina i nivoi progranulina u CSF-u su normalizovani prema zapremini tečnosti. Niža granica kvantizacije (engl. lower limit of quantitation, LLOQ) je naznačena isprekidanom sivom linijom. Za ELISA testove tkiva, vrednosti LLOQ (ng/mg) su utvrđene deljenjem testnih LLOQ (ng/ml) s prosekom ukupne koncentracije proteina iz svih uzoraka. Jednostavna crvena linija na x-osi bez stubova greške ukazuje da su sve životinje u toj grupi bile 0. Statističke analize su izvedene korišćenjem Kruskal-Valisovog testa; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, vg = vektorski genomi; LLOQ = niža granica kvantizacije (engl. lower limit of quantitation); SC = kičmena moždina (engl. spinal cord).
[0188] SL. 59D–SL. 59E su niz stubičastih grafikona i slika koji prikazuju rezultate eksperimenata koji pokazuju smanjene lizozomne i neuropatološke defekte u zrelim jedinkama mišijeg modela FTD-GRN nakon lečenja s PR006A. Uzorci tkiva su prikupljeni iz 18 meseci starih Grn KO miševa 2 meseca nakon primanja ICV ekscipijenta (crveno) ili 9,7 × 10<10>vg (2,4 × 10<11>vg/g mozga) PR006A (plavo). Lipofuscinoza je analizirana ocenjivanjem H&E bojom obojenih odeljaka mozga od strane patologa. SL.59D: Reprezentativne slike lipofuscina iz regiona talamusa/hipotalamusa u odeljku mozga. Bele strelice ukazuju na primere nakupljanja lipofuscina. Sažetak ocena težine lipofuscina u cerebralnom korteksu, hipokampusu i talamusu/hipotalamusu H&E bojom obojenih primeraka iz odeljaka mozga koji su ocenjeni na autoflorescentne granule lipofuscina. Nakupljanje lipofuscina je polovično kvantitativno ocenjeno od strane zaslepljenog certificiranog patologa prema sledećoj šemi ocenjivanja: 0 = nije uočen lipofuscin; 1 = veoma male granule lipofuscina (< 2 µm) raspršene po regionu; 2 = povećana gustoća nakupljanja malih granula i/ili razvoj većih granula (> 2–3 µm);
[0189] 3 = multifokalne regije s velikom gustoćom granula lipofuscina vidljivim s niskom snagom objektiva; 4 = rasprostranjeno nakupljanje lipofuscina. SL.59E: IHC analiza ubikvitina (n = 4/grupi) je izvedena i kvantifikovana u cerebralnom korteksu, hipokampusu i talamusu. Prikazana je pozitivna gustoća ćelija (cells/mm<2>) za svaki region (srednja vrednost ± SEM). Statistika je utvrđena korišćenjem t-testa, * = p < 0,05, ** = p < 0,01, vg = vektorski genomi.
[0191] SL.59F–FIG. 59I su niz stubičastih grafova koji prikazuju rezultate eksperimenata koji pokazuju smanjene markere neuroinflamacije u odraslim jedinkama mišijeg modela FTD-GRN nakon lečenja s PR006A. Uzorci tkiva su prikupljeni iz 18 meseci starih Grn KO miševa 2 meseca nakon primanja ICV ekscipijenta (crveno) ili 9,7 × 10<10>vg (2,4 × 10<11>vg/g mozga) PR006A (plavo). SL. 59F: Ekspresija gena Tnf i Cd68 je merena qRT-PCR-om u somatosenzornom korteksu (srednja vrednost ± SEM; n = 4/grupi). Ekspresija gena je normalizovana prema opšteprisutnom genu Ppib. (SL.59G) Proteinska ekspresija proinflamatornog citokina TNFα je merena u cerebralnom korteksu korišćenjem Mesoscale Discovery testa za mišije proinflamatorne citokine (srednja vrednost ± SEM; n = 4/grupi).
[0192] Cerebralni korteksi su homogenizovani i nivoi ekspresije proteina su normalizovani prema ukupnoj koncentraciji proteina u lizatima tkiva. SL.59H–SL.59I: IHC analiza Iba1 (SL.59H) i GFAP (SL.59I) je izvedena i kvantifikovana u fiksiranim odeljcima mozga. Prikazana je zbirka pozitivnih ćelijskih gustoća (ćelija/mm<2>) iz tri regiona mozga koja su analizirana (cerebralnog korteksa, hipokampusa i talamusa) (srednja vrednost ± SEM; n = 3–4/grupi). Statističke analize su izvedene korišćenjem t-testa, * = p < 0,05, vg = vektorski genomi.
[0194] SL. 60 je grafikon koji prikazuje krivulju odgovora na dozu HEK293T ćelija transduciranih s PR006A (n = 2; srednja vrednost ± SEM). Jednak broj ćelija je transduciran s promenljivim količinama PR006A. Nakon 72 časa, nivoi proteina progranulina u ćelijskom medijumu su izmereni korišćenjem ELISA testa.
[0196] SL. 61 je dijagram dizajna ispitivanja za maksimalnu dozu PR006A u zreloj jedinki mišijeg modela FTD-GRN.10 µl ekscipijenta (kontrola) ili PR006A pri dozi od 9,7 × 10<10>vg (2,4 × 10<11>vg/g mozga) je isporučeno ICV ubrizgavanjem dvema kohortama Grn KO miševa: (1) starim 16 meseci u vreme ubrizgavanja (n = 4–5/grupi; PRV-2018-027) i (2) starim 14 meseci u vreme ubrizgavanja (n = 1/grupi lečenoj ekscipijentom; n = 3/grupi lečenoj s PR006A; PRV-2019-002). Životinje su žrtvovane dva meseca nakon ubrizgavanja. Tkiva CNS-a i periferna tkiva su prikupljena da bi se analizirala biodistribucija PR006A (qPCR), ekspresija proteina progranulina (ELISA) i histopatologija (H&E). Ekspresija proinflamatornih markera, nakupljanja lipofuscina i nakupljanja ubikvitina su procenjene u mozgu.
[0198] SL. 62A–SL. 62B su stubičasti grafovi koji prikazuju rezultate za biodistribuciju u perifernom tkivu i ekspresiju progranulina u zreloj jedinki mišijeg modela FTD-GRN nakon lečenja s PR006A. Uzorci tkiva su prikupljeni iz 18 meseci starih Grn KO miševa 2 meseca nakon primanja ICV ekscipijenta (crveno) ili 9,7 × 10<10>vg (2,4 × 10<11>vg/g mozga) PR006A (plavo). SL.62A:
[0199] Prisustvo vektorskih genoma je procenjeno u jetri, srcu, plućima, bubregu, slezini i polnim žlezdama (srednja vrednost ± SEM; n = 4/grupi). Biodistribucija je prikazana kao vektorski genomi po µg gDNK na log skali. Prisustvo vektorskih genoma je kvantifikovano qPCR-om korišćenjem vektorskog referentnog standarda; SL. 62B: Nivoi proteina progranulina su izmereni korišćenjem ELISA testa (srednja vrednost ± SEM; n = 4/grupi). Nivoi progranulina u tkivu su normalizovani prema ukupnoj koncentraciji proteina. Jednostavna crvena linija na x-osi bez stubova greške ukazuje da su sve životinje u toj grupi bile 0.
[0200] Statističke analize su izvedene korišćenjem Kruskal-Valisovog testa;
[0201] * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, vg = vektorski genomi.
[0203] SL.63 je dijagram dizajna ispitivanja za raspon doze PR006A u odraslim jedinkama mišijeg modela FTD-GRN 10 µl ekscipijenta (kontrola) ili PR006A pri dozi 1,1 × 10<9>vg (2,7 × 10<9>vg/g mozga), 1,1 × 10<10>vg (2,7 × 10<10>vg/g mozga) ili
[0204] 1,1 × 10<11>vg (2,7 × 10<11>vg/g mozga) PR006A je isporučeno ICV ubrizgavanjem 4 meseca starim Grn KO miševima (n = 10/grupi). Životinje su žrtvovane tri meseca nakon ubrizgavanja, kada su miševi bili stari 7 meseci. Tkiva CNS-a i periferna tkiva su prikupljena da bi se analizirala biodistribucija PR006A (qPCR), ekspresija proteina progranulina (ELISA) i histopatologija (H&E). Ekspresija proinflamatornih markera, nakupljanje lipofuscina, nakupljanje ubikvitina i globalne promene ekspresije gena su procenjene u mozgu.
[0206] SL. 64 je šema koja prikazuje jedno otelotvorenje rekombinantnog adeno asociranog virusnog vektora (PR006A) koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira ljudski progranulin. „bp“ se odnosi na „bazne parove“. „kan“ se odnosi na gen koji prenosi rezistenciju na kanamicin. „GRN“ se odnosi na „progranulin“. „ITR“ se odnosi na sekvencu invertovanog terminalnog ponavljajućeg niza adeno asociranog virusa. „TRY“ se odnosi na sekvencu koja sadrži tri mesta transkripcione regulacione aktivacije: TATA, RBS i YY1. „CBAp“ se odnosi na promotera kokošijeg β-aktina. „CMVe“ se odnosi na pojačivača citomegalovirusa. „WPRE“ se odnosi na posttranskripcioni regulatorni element mrmotskog virusa hepatitisa. „bGH“ se odnosi na rep poli A signala goveđeg hormona rasta. „int“ se odnosi na intron. Sekvence nukleotida dva lanca PR006A su obezbeđeni u SEQ ID NO: 90 i 91.
[0208] Detaljni opis
[0210] Obelodanjivanje je delimično zasnovano na kompozicijama i postupcima za ekspresiju kombinacija određenih genskih produkta (npr., genski produkti povezani s bolešću CNS-a) kod subjekta. Genski produkt može da bude protein, fragment (npr., deo) proteina, interferentna nukleinska kiselina koja inhibira gen povezan s bolešću CNS-a, itd. Genski produkt može da bude protein ili fragment proteina kog kodira gen povezan s bolešću CNS-a. Genski produkt može da bude interferentna nukleinska kiselina (npr., shRNK, siRNK, miRNK, amiRNK itd.) koja inhibira gen povezan s bolešću CNS-a.
[0212] Gen povezan s bolešću CNS-a se odnosi na gen koji kodira genski produkt koji je genetski, biohemijski ili funkcionalno povezan s bolešću CNS-a, kao što je FTD (fronto-temporalna demencija) ili PD (Parkinsonova bolest, engl.
[0213] Parkinson's disease). Na primer, pojedinci s patogenom utacijom u GRN genu (koji kodira protein PGRN) imaju povećan rizik od razvijanja FTD-a u poređenju s pojedincima koji nemaju mutaciju u GRN. Slično tome, uočeno je da pojedinci koji imaju mutaciju u GBA1 genu (koji kodira protein Gcazu), imaju povećan rizik od razvijanja PD-a u poređenju s pojedincima koji nemaju mutaciju u GBA1. U drugom primeru, PD je povezan s nakupljanjima agregata proteina koji sadrže protein α-Sinekluein (engl. α-Synuclein, α-Syn); shodno tome, SNCA (koji kodira α-Syn) je gen povezan s PD-om. Ovde opisana ekspresiona kaseta može da kodira oblik divljeg tipa ili nemutirani oblik gena povezanog s bolešću CNS-a (ili njegove kodirajuće sekvence). Primeri gena povezanih s bolešću CNS-a su navedeni u Tabeli 1.
[0214] Tabela 1: Primeri gena povezanih s bolešću CNS-a
[0215]
[0216]
[0219] Dodatno uz pacijente s Gošeovom bolešću (koji imaju mutacije u oba hromozomna alela GBA1 gena), pacijenti s mutacijama u samo jednom alelu GBA1 su izloženi veoma povišenom riziku od Parkinsonove bolesti (PD). Težina simptoma PD-a, koji uključuju teškoće u koračanju, tremor pri mirovanju, ukočenost i često depresiju, teškoće u spavanju i kognitivno slabljenje, u korelaciji su sa stepenom smanjenja aktivnosti enzima. Tako pacijenti s Gošeovom bolešću imaju najteži tok bolesti, dok pacijenti sa jednom blagom mutacijom u GBA1 genu obično imaju dobroćudniji tok bolesti. Nosioci mutacije su takođe izloženi visokom riziku od poremećaja povezanih s PD-om, uključujući demenciju Levijevih tela, karakterisanu izvršnom disfunkcijom, psihozom i poremećajem kretanja nalik PD-u i višesistemskom atrofijom, s karakterističnim motoričkim i kognitivnim oštećenjima. Ne postoje terapije koje menjaju nezaustavljivi tok ovih poremećaja.
[0221] Deficiti u enzimima kao što je Gcaza (npr., genski
[0222] produkt GBA1 gena), kao i uobičajene varijante u mnogim genima impliciranim u lizozomnoj funkciji ili prenosu makromolekula u lizozome (npr., lizozomnog membranskog proteina 1 (LIMP), koji se takođe naziva SCARB2), su povezani s povećanim rizikom od PD-a i/ili rizikom od Gošeove bolesti (npr., neuronopatske Gošeove bolesti, kao što je Gošeova bolest tipa 2 ili Gošeova bolest tipa 3). Obelodanjivanje je delimično zasnovano na ekspresionim konstruktima (npr., vektorima) koji kodiraju jedan ili više gena, na primer Gcazu, GBA2, prosapozin, progranulin (PGRN), LIMP2, GALC, CTSB, SMPD1, GCH1, RAB7, VPS35, IL-34, TREM2, TMEM106B ili kombinaciju bilo kojih od prethodnih (ili njihovih delova), povezanih s bolestima centralnog nervnog sistema (CNS), na primer Gošeovom bolešću, PD-om, itd. Kombinacije ovde opisanih genskih produkta mogu da deluju zajedno (npr., sinergijski) da smanje jedan ili više znakova i simptoma bolesti CNS-a kada su eksprimirani u subjektu.
[0224] U nekim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira progranulin (npr., genski produkt PGRN gena). U nekim otelotvorenjima, izolovana nukleinska kiselina sadrži sekvencu koja kodira prozapozin koja je kodonski optimizovana (npr., kodonski optimizovana za ekspresiju u sisarskim ćelijama, na primer ljudskim ćelijama). U nekim otelotvorenjima, sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira progranulin (PGRN) kodira protein koji sadrži sekvencu amino kiselina kako je izložena u SEQ ID NO: 67 (npr., kako je izložena u NCBI referentnoj sekvenci NP_002078.1). U nekim otelotvorenjima, izolovana sekvenca nukleinskih kiselina sadrži sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 68. U nekim otelotvorenjima, ekspresioni konstrukt sadrži invertovane terminalne ponavljajuće nizove (engl. inverted terminal repeats, ITRs) adeno asociranog virusa (AAV), npr. ITR-ove AAV na bokovima sekvence nukleinskih kiselina koja kodira protein prosapozin.
[0226] U nekim otelotvorenjima, prvi genski produkt ili drugi genski produkt je progranulin ili njegov deo. U nekim otelotvorenjima, prvi genski produkt je progranulin i drugi genski produkt je odabran između GBA2, prosapozina, GABA1, LIMP2, GALC, CTSB, SMPD1, GCH1, RAB7, VPS35, IL-34, TREM2 i TMEM106B.
[0228] U nekim otelotvorenjima, ekspresioni konstrukt kodira (npr., dodatno uz drugi genski produkt) interferentnu nukleinsku kiselinu (npr., shRNK, miRNK, dsRNK itd.). U nekim otelotvorenjima, interferentna nukleinska kiselina inhibira ekspresiju α-Sinekluina (engl. α-Synuclein). U nekim otelotvorenjima, interferentna nukleinska kiselina koja cilja α-Sinuklein sadrži sekvencu izloženu u bilo kojoj SEQ ID NO: 20–25. U nekim otelotvorenima, interferentna nukleinska kiselina koja cilja α-Sinuklein se vezuje za (npr., hibridizuje sa) sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 20–25.
[0230] U nekim otelotvorenjima, interferentna nukleinska kiselina inhibira ekspresiju TMEM106B. U nekim otelotvorenjima, interferentna nukleinska kiselina koja cilja TMEM106B sadrži sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 64 ili 65. U nekim otelotvorenjima, interferentna nukleinska kiselina koja cilja TMEM106B se vezuje za (npr., hibridizuje sa) sekvencu izloženu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 64 ili 65.
[0232] U nekim otelotvorenjima, ekspresioni konstrukt dodatno sadrži jedan ili više promotera. U nekim otelotvorenjima, promoter je promoter kokošijeg beta aktina (engl. chicken beta actin, CBA), CAG promoter, CD68 promoter ili JeT promoter. U nekim otelotvorenjima, promoter je promoter RNK pol II (npr. ili promoter RNK pol III (npr., U6 itd.)).
[0234] U nekim otelotvorenjima, ekspresioni konstrukt dodatno sadrži unutrašnje mesto vezivanja ribozoma (IRES). U nekim otelotvorenjima, IRES se nalazi između prvog genskog produkta i drugog genskog produkta.
[0236] U nekim otelotvorenjima, ekspresioni konstrukt dodatno sadrži kodirajuću sekvencu samocepajućih peptida. U nekim otelotvorenjima, samocepajući peptid je peptid T2A.
[0238] U nekim otelotvorenjima, ekspresioni konstrukt sadrži dve sekvence invertovanog terminalnog ponavljajućeg niza (ITR) adeno asociranog virusa (AAV). U nekim otelotvorenjima, ITR sekvence se nalaze na bokovima prvog genskog produkta i drugog genskog produkta (npr., raspoređeni su kako sledi iz 5'-kraja do 3'-kraja: ITR-prvi genski produkt-drugi genski produkt-ITR). U nekim otelotvorenjima, jednoj od ITR sekvenci izolovane nukleinske kiseline nedostaje funkcionalno mesto terminalne rezolucije (engl. terminal resolution site, trs). Na primer, u nekim otelotvorenjima, jedan od ITR-ova je ΔITR.
[0240] U nekim aspektima, obelodanjivanje se odnosi na rAAV vektore koji sadrže ITR koji ima modifikovani „D“ region (npr., D sekvencu koja je modifikovana relativno spram AAV2 ITR-a, SEQ ID NO: 29). U nekim otelotvorenjima, ITR koji ima modifikovani D region je 5' ITR rAAV vektora. U nekim otelotvorenjima, modifikovani „D“ region sadrži „S“ sekvencu, na primer kako je izložena u SEQ ID NO: 26. U nekim otelotvorenjima, ITR koji ima modifikovani „D“ region je 3' ITR rAAV vektora. U nekim otelotvorenjima, modifikovani „D“ region sadrži 3' ITR u kom je „D“ region postavljen na 3' kraj ITR-a (npr., na spoljašnjosti ili terminalnom kraju ITR-a relativno spram transgenog umetka vektora). U nekim otelotvorenjima, modifikovani „D“ region sadrži sekvencu kako je izložena u SEQ ID NO: 26 ili 27.
[0242] U nekim otelotvorenjima, izolovana nukleinska kiselina (npr., rAAV vektor) sadrži TRY region. U nekim otelotvorenjima, TRY region sadrži sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 28.
[0244] U nekim otelotvorenjima, izolovana nukleinska kiselina opisana obelodanjivanjem sadrži ili se sastoji od ili kodira peptid koji ima, sekvencu izloženu u jednoj od SEQ ID NO: 1–91.
[0246] U nekim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu kako je opisana obelodanjivanjem. U nekim otelotvorenjima, vektor je plazmid ili virusni vektor. U nekim otelotvorenjima, virusni vektor je rekombinantni AAV (rAAV) vektor ili bakulovirusni vektor. U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor je jednolančani (npr., jednolančani DNK).
[0248] U nekim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu kako je opisana obelodanjivanjem ili vektor kako je opisan obelodanjivanjem.
[0249] U nekim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje rekombinantni adeno asocirani virus (rAAV) koji sadrži kapsidni protein i izolovanu nukleinsku kiselinu ili vektor kako je opisano obelodanjivanjem.
[0251] U nekim otelotvorenjima, kapsidni protein je u stanju da pređe krvnomoždanu barijeru, na primer AAV9 kapsidni protein ili AAVrh.10 kapsidni protein. U nekim otelotvorenjima, rAAV transducira neuronske ćelije i neneuronske ćelije centralnog nervnog sistema (CNS).
[0253] U nekim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za lečenje subjekta koji ima ili se sumnja da ima bolest centralnog nervnog sistema (CNS), s tim da postupak sadrži primenjivanje na subjekta kompozicije (npr., kompozicije koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu ili vektor ili rAAV) kako je opisano obelodanjivanjem. U nekim otelotvorenjima, bolest CNS-a je neurodegenerativna bolest, kao što je neurodegenerativna bolest navedena u Tabeli 12. U nekim otelotvorenjima, bolest CNS-a je sinukleinopatija, kao što je sinukleinopatija navedena u Tabeli 13. U nekim otelotvorenjima, bolest CNS-a je tauopatija, kao što je tauopatija navedena u Tabeli 14. U nekim otelotvorenjima, bolest CNS-a je bolest lizozomskog skladištenja, kao što je bolest lizozomskog skladištenja navedena u Tabeli 15. U nekim otelotvorenjima, bolest lizozomskog skladištenja je neuronopatska Gošeova bolest, kao što je Gošeova bolest tipa 2 ili Gošeova bolest tipa 3. Ova otelotvorenja nisu deo patentnih zahteva i prisutna su samo u ilustrativne svrhe.
[0255] U nekim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za lečenje subjekta koji ima ili se sumnja da ima fronto-temporalnu demenciju (FTD), FTD s tau mutacijom, FTD s C9orf72 mutacijom, ceroidnu lipofuscinozu, Parkinsonovu bolest, Alchajmerovu bolest, kortikobazalnu degeneraciju, motoričku neuronsku bolest ili Gošeovu bolest, s tim da postupak sadrži rAAV koji kodira progranulin (PGRN), pri čemu PGRN kodira sekvenca nukleinskih kiselina u SEQ ID NO:68; i pri čemu rAAV sadrži kapsidni protein koji ima AAV9 serotip. Ova otelotvorenja nisu deo patentnih zahteva i unapred su postavljena su samo u ilustrativne svrhe.
[0257] U nekim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za lečenje subjekta koji ima ili se sumnja da ima FTD s GRN mutacijom, s tim da postupak sadrži primenjivanje rAAV koji kodira progranulin (PGRN), pri čemu PGRN kodira sekvenca nukleinskih kiselina u SEQ ID NO:68; i pri čemu rAAV sadrži kapsidni protein koji ima AAV9 serotip. U nekim otelotvorenjima, rAAV se primenjuje na subjekta pri dozi u rasponu od oko 3,5 × 10<13>vektorskih genoma (vg), oko 7,0 × 10<13>vg ili oko 1,4 × 10<14>vg. U nekim otelotvorenjima, rAAV se primenjuje putem ubrizgavanja u cisternu magnu.
[0259] U nekim otelotvorenjima, kompozicija sadrži nukleinsku kiselinu (npr., rAAV genom, na primer kapsidiran AAV kapsidnim proteinima) koji kodira jedan ili više genskih produkta (npr., genski produkt povezan s bolešću CNS-a), na primer 2, 3, 4, 5 ili više genskih produkta opisanih u ovoj prijavi. U nekim otelotvorenjima, kompozicija sadrži dve ili više (npr., 2, 3, 4, 5 ili više) različitih nukleinskih kiselina (npr., dva ili više rAAV genoma, na primer odvojeno kapsidiranih AAV kapsidnim proteinima), od kojih svaka kodira jedan ili više različitih genskih produkta. U nekim otelotvorenjima, dve ili više različitih kompozicija se primenjuje na subjekta, od kojih svaka kompozicija sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju različite genske produkte. U nekim otelotvorenjima, različiti genski produkti su operativno povezani s istim tipom promotera (npr., istim promoterom). U nekim otelotvorenjima, različiti genski produkti su operativno povezani s različitim promoterima.
[0261] Izolovane nukleinske kiseline i vektori
[0263] Izolovana nukleinska kiselina može da bude DNK ili RNK.
[0265] Aspekti obelodanjivanja se odnose na izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira progranulin (npr., genski produkt PGRN gena). PGRN protein se odnosi na progranulin, koji je protein koji je uključen u razvoj, inflamaciju, proliferaciju ćelija i homeostazu proteina. Kod ljudi, PGRN gen se nalazi na hromozomu 17. U nekim otelotvorenjima, PGRN gen kodira peptid kog predstavlja NCBI referentna sekvenca NP_002078.1 (SEQ ID NO: 67). U nekim otelotvorenjima, izolovana sekvenca nukleinskih kiselina sadrži sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 68. U nekim otelotvorenjima, izolovana nukleinska kiselina sadrži sekvencu koja kodira PGRN koja je kodonski optimizovana. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina dodatno sadrži promoter kokošijeg β-aktina (CBA) i pojačivač citomegalovirusa (CMVe).
[0266] U nekim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira prvi genski produkt i drugi genski produkt, pri čemu je svaki genski produkt nezavisno odabran između genskih produkta ili njihovih delova izloženih u Tabeli 1.
[0268] Izolovana nukleinska kiselina ili vektor (npr., rAAV vektor) opisana obelodanjivanjem može da sadrži ili da se sastoji od sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1–91. Izolovana nukleinska kiselina ili vektor (npr., rAAV vektor) opisana obelodanjivanjem može da sadrži ili da se sastoji od sekvence koja je komplementarna (npr., komplement) sekvenci izloženoj u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1–91. Izolovana nukleinska kiselina ili vektor (npr., rAAV vektor) opisana obelodanjivanjem može da sadrži ili da se sastoji od sekvence koja je obrnuti komplement sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1–91. Izolovana nukleinska kiselina ili vektor (npr., rAAV vektor) opisana obelodanjivanjem može da sadrži ili da se sastoji od dela sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1–91. Deo može da sadrži najmanje 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ili 99 % sekvence izložene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1–91. Sekvenca nukleinskih kiselina opisana obelodanjivanjem može da bude sens lanac nukleinske kiseline (npr., lanac 5' do 3') ili, u kontekstu virusnih sekvenci, (+) lanac. Sekvenca nukleinskih kiselina opisana obelodanjivanjem može da bude antisensni lanac nukleinske kiseline (npr., lanac 3' do 5') ili, u kontekstu virusnih sekvenci, minus (-) lanac.
[0270] U nekim otelotvorenjima, genski produkt kodira kodirajući deo (npr., cDNK) gena koji se pojavljuje prirodno. U nekim otelotvorenjima, prvi genski produkt je protein (ili njegov deo) kog kodira PGRN gen. U nekim otelotvorenjima, genski produkt je protein (ili njegov deo) kog kodira drugi gen naveden u Tabeli 1, na primer SCARB2/LIMP2 gen ili PSAP gen. Međutim, stručnjak u predmetnoj oblasti prepoznaje da je redosled ekspresije prvog genskog produkta (npr., progranulin) i drugog genskog produkta (npr., LIMP2 itd.) može uopšteno da se obrne (npr., LIMP2 je prvi genski produkt i progranulin je drugi genski produkt).
[0272] U nekim otelotvorenjima, ekspresioni konstrukt je monocistroničan (npr., ekspresioni konstrukt kodira jedan fuzioni protein koji sadrži prvi genski produkt i drugi genski produkt). U nekim otelotvorenjima, ekspresioni konstrukt je policistroničan (npr., ekspresioni konstrukt kodira dva različita genska produkta, na primer različite proteine ili fragmente proteina).
[0274] Policistronični ekspresioni vektor može da sadrži jedan ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5 ili više) promotera. Može da se koristi bilo koji pogodni promoter, na primer, konstitutivni promoter, promoter koji se može inducirati, endogeni promoter, promoter specifičan za tkivo (npr., promoter specifičan za CNS), npr. u nekim otelotvorenjima, promoter je promoter kokošijeg beta-aktina (CBA promoter), CAG promoter (na primer kako je opisano u Alexopoulou i sar. (2008.) BMC Cell Biol.9:2; doi:
[0275] 10.1186/1471-2121-9-2), CD68 promoter ili JeT promoter (na primer kako je opisano u Tornøe i sar. (2002.) Gene 297(1–2):21–32). U nekim otelotvorenjima, promoter je operativno povezan sa sekvencom nukleinskih kiselina koja kodira prvi genski produkt, drugi genski produkt ili prvi genski produkt i drugi genski produkt. U nekim otelotvorenjima, ekspresiona kaseta sadrži jedan ili više dodatnih regulatornih sekvenci, uključujući, ali ne ograničeno na, sekvence koje vezuju faktor transkripcije, mesta deljenja introna, mesta dodavanja poli(A), sekvence pojačivača, mesta vezivanja represora ili bilo koju kombinaciju prethodnih.
[0277] U nekim otelotvorenjima, sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira prvi genski produkt i sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira drugi genski produkt su odvojene sekvencom nukleinskih kiselina koja kodira unutrašnje mesto vezivanja ribozoma (IRES). Primeri IRES mesta su opisani, na primer, u Mokrejs i sar.
[0278] (2006.) Nucleic Acids Res.34 (izdanje za bazu podataka):D125-30. U nekim otelotvorenjima, sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira prvi genski produkt i sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira drugi genski produkt su odvojene sekvencom nukleinskih kiselina koja kodira samocepajući peptid. Primeri samocepajućih peptida uključuju, ali nisu ograničeni na T2A, P2A, E2A, F2A, BmCPV 2A i BmIFV 2A i one koji su opisani u Liu i sar. (2017.) Sci Rep. 7: 2193. U nekim otelotvorenjima, samocepajući peptid je peptid T2A.
[0280] Patološki, poremećaji kao što je PD i Gošeova bolest su povezani s nakupljanjem agregata proteina većinski sačinjenih od proteina α-sinukleina (α-Syn). Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, ovde opisane izolovane nukleinske kiselina sadrže inhibitornu nukleinsku kiselinu koja smanjuje ili sprečava ekspresiju α-Syn proteina. Sekvenca koja kodira inhibitornu nukleinsku kiselinu može da bude postavljen u netranslatirani region (npr., intron, 5'UTR, 3'UTR itd.) ekspresionog vektora.
[0282] U nekim otelotvorenjima, inhibitorna nukleinska kiselina je postavljena u intron ekspresionog konstrukta, na primer u intron uzvodno od sekvence koja kodira prvi genski produkt. Inhibitorna nukleinska kiselina može da bude dvolančana RNK (dsRNK), siRNK, shRNK, mikro RNK (miRNK), veštačka miRNK (amiRNK) ili RNK aptamer. Uopšteno, inhibitorna nukleinska kiselina se vezuje za (npr., hibridizuje sa) između oko 6 i oko 30 (npr., bilo koji broj između 6 i 30, uključivo) uzastopnih nukleotida ciljnog RNK (npr., mRNK). U nekim otelotvorenjima, molekul inhibitorne nukleinske kiseline je miRNK ili amiRNK, na primer miRNK koji cilja SNCA (gen koji kodira protein α-Syn)
[0283] ili TMEM106B (npr. gen koji kodira protein TMEM106B). U nekim otelotvorenjima, miRNK ne sadrži nepodudarnosti s regionom SNCA mRNK u koji se hibriduzuje (npr., miRNK je „usavršen“). U nekim otelotvorenjima, inhibitorna nukleinska kiselina je shRNK (npr., shRNK koja cilja SNCA ili TMEM106B). U nekim otelotvorenjima, inhibitorna nukleinska kiselina je veštačka miRNK (amiRNK) koja uključuje miR-155 okvir i SNCA ili TMEM106B ciljajuću sekvencu.
[0285] Stručnjak u predmetnoj oblasti prepoznaje da, kada se referiše na sekvence nukleinskih kiselina koje sadrže ili kodiraju inhibitorne nukleinske kiseline (npr., dsRNK, siRNK, miRNK, amiRNK itd.) bilo koji od jednog ili više timidinskih (T) nukleotida ili uridinskih (U) nukleotida u ovde obezbeđenoj sekvenci može da se zameni bilo kojim drugim nukleotidom pogodnim za sparivanje baza (npr., putem Votson-Krikovog baznog para) s adenozinskim nukleotidom. Na primer, T može da se zameni s U i U može da se zameni s T.
[0287] Izolovana nukleinska kiselina, kako je ovde opisana, može da postoji samostalno ili kao deo vektora. Uopšteno, vektor može da bude plazmid, kozmid, fagemid, bakterijski veštački hromozom (engl. bacterial artificial chromosome, BAC) ili virusni vektor (npr., adenovirusni vektor, adeno asocirani virusni (AAV) vektor, retrovirusni vektor, bakulovirusni vektor itd.). U nekim otelotvorenjima, vektor je plazmid (npr., plazmid koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu kako je ovde opisana). U nekim otelotvorenjima, rAAV vektor je jednolančani (npr., jednolančani DNK). U nekim otelotvorenjima, vektor je rekombinantni AAV (rAAV) vektor. U nekim otelotvorenjima, vektor je bakulovirusni vektor (npr., Autographa californica nuklearni polihedrozni (AcNPV) vektor).
[0289] Tipično rAAV vektor (npr., rAAV genom) sadrži transgen (npr., ekspresioni konstrukt sadrži jedno ili više od sledećih: promoter, intron, sekvencu pojačivača, sekvencu koja kodira protein, sekvencu koja kodira inhibitorni RNK, sekvencu repa poli A itd.) s dve AAV sekvence invertovanog terminalnog ponavljajućeg niza (ITR). U nekim otelotvorenjima, transgen rAAV vektora sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu kako je opisana obelodanjivanjem. U nekim otelotvorenjima, svaka od dve ITR sekvence rAAV vektora je ITR pune dužine (npr., približno 145 bp po dužini i sadrži mesto funkcionalnog vezivanja Rep (engl. Rep binding site, RBS) i mesto terminalne rezolucije (engl. terminal resolution site, trs)). U nekim otelotvorenjima, jedan od ITR-ova rAAV vektora je zasečen (npr., skraćen ili nije pune dužine). U nekim otelotvorenjima, zasečenom ITR-u nedostaje funkcionalno mesto terminalne rezolucije (engl. terminal resolution site, trs) i koristi se za produkciju samokomplementarnih AAV vektora (scAAV vektori). U nekim otelotvorenjima, zasečeni ITR je ΔITR, na primer kako je opisano u McCarty i sar. (2003.) Gene Ther.10(26):2112–8.
[0291] Aspekti pronalaska se odnose na izolovane nukleinske kiseline (npr., rAAV vektor) koji sadrži ITR koji ima jednu ili više modifikaciju (npr., adicije, delecije, supstitucije itd. nukleinskih kiselina) relativno spram ITR AAV divljeg tipa, na primer relativno spram ITR AAV2 divljeg tipa (npr., SEQ ID NO: 29). ITR AAV2 divljeg tipa je prikazan na SL.20. Uopšteno, ITR divljeg tipa sadrži region od 125 nukleotida koji se samostalno anelira da bi formirao palindromsku dvolančanu strukturu ukosnice u obliku slova T koja se sastoji od dva unakrsna kraka (formirana sekvencama koje se nazivaju B/B' i C/C', respektivno), duži matični region (formiran sekvencama A/A') i jednolančani terminalni region koji se naziva „D“ region (SL.20). Uopšteno, „D“ region je ITR koji je postavljen između matičnog regiona formiranog A/A' sekvencama i umetka koji sadrži transgen rAAV vektora (npr., postavljen je u „unutrašnjosti“ ITR-a relativno spram terminusa ITR-a ili proksimalno spram transgenog umetka ili ekspresionog konstrukta rAAV vektora). U nekim otelotvorenjima, „D“ region sadrži sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 27. Zapaženo je da „D“ region igra važnu ulogu u enkapsidaciji rAAV vektora kapsidnim proteinima, na primer kako je otkriveno u Ling i sar. (2015.) J Mol Genet Med 9(3).
[0292] Obelodanjivanje je delimično zasnovano na iznenađujućem otkriću da se rAAV vektori koji sadrže „D“ region nalaze na „spoljašnjosti“ ITR-a (npr., proksimalno spram terminusa ITR-a relativno spram transgenog umetka ili ekspresionog konstrukta) efikasnije enkapsidiraju AAV kapsidnim proteinima nego rAAV vektori koji imaju ITR-ove s nemodifikovanim (npr., divljeg tipa) ITR-ove U nekim otelotvorenjima, rAAV vektori koji imaju modifikovanu „D“ sekvencu (npr., „D“ sekvencu u „spoljašnjem“ položaju) imaju smanjenu toksičnost relativno spram rAAV vektora koji imaju ITR sekvence divljeg tipa.
[0294] U nekim otelotvorenjima, modifikovana „D“ sekvenca sadrži najmanje jednu nukleotidnu supstituciju relativno spram „D“ sekvence divljeg tipa (npr., SEQ ID NO: 27). Modifikovana „D“ sekvenca može da ima najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 nukleotidnih supstitucija relativno spram „D“ sekvence divljeg tipa (npr., SEQ ID NO: 27). U nekim otelotvorenjima, modifikovana „D“ sekvenca sadrži najmanje 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ili 19 supstitucija nukleinskih kiselina relativno spram „D“ sekvence divljeg tipa (npr., SEQ ID NO: 27). U nekim otelotvorenjima, modifikovana „D“ sekvenca je između 10 % i oko 99 % (npr., 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ili 99 %) identična „D“ sekvenci divljeg tipa (npr., SEQ ID NO: 27). U nekim otelotvorenjima, modifikovana „D“ sekvenca sadrži sekvencu izloženu u SEQ ID NO: 26, koja se takođe naziva „S“ sekvenca, kako je opisana u Wang i sar. (1995.) J Mol Biol 250(5):573–80.
[0296] Izolovana nukleinska kiselina ili rAAV vektor kako je opisan obelodanjivanjem može dodatno da sadrži „TRY“ sekvencu, na primer kako je izložena u SEQ ID NO: 28 ili kako je opisana u Francois i sar., (2005.) J. Virol. 79(17):11082–11094. U nekim otelotvorenjima, TRY sekvenca je postavljena između ITR-a (npr.5’ ITR-a) i ekspresionog konstrukta (npr. umetka koji kodira transgen) izolovane nukleinske kiseline ili rAAV vektora.
[0298] U nekim aspektima, obelodanjivanje se odnosi na bakulovirusne vektore koji sadrže izolovanu nukleinsku kiselinu ili rAAV vektor kako je opisan obelodanjivanjem. U nekim otelotvorenjima, bakulovirusni vektor je Autographa californica nuklearni polihedrozni (AcNPV) vektor, na primer kako je opisan u Urabe i sar. (2002.) Hum Gene Ther 13(16):1935–43 i Smith i sar. (2009.) Mol Ther 17(11):1888–1896.
[0300] U nekim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu ili vektor kako je ovde opisan. Ćelija domaćin može da bude prokariotska ćelija ili eukariotska ćelija. Na primer, ćelija domaćin može da bude sisarska ćelija, bakterijska ćelija, ćelija kvasca, insektna ćelija itd. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je sisarska ćelija, na primer HEK293T ćelija. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je bakterijska ćelija, na primer ćelija E. coli.
[0302] Raavs
[0304] U nekim aspektima, obelodanjivanje se odnosi na rekombinantne AAV-ove (rAAV-ove) koji sadrže transgen koji kodira nukleinsku kiselinu kako je ovde opisana (npr., rAAV vektor kako je ovde opisan). Pojam „rAAV-ovi“ uopšteno se odnosi na virusne čestice koje sadrže rAAV vektor enkapsidiran jednim ili više AAV kapsidnih proteina. rAAV opisan obelodanjivanjem može da sadrži kapsidni protein koji ima serotip odabran između AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 i AAV10. U nekim otelotvorenjima, rAAV sadrži kapsidni protein iz neljudskog domaćina, na primer AAV kapsidni protein rezus makakija kao što je AAVrh.10, AAVrh.39 itd. U nekim otelotvorenjima, rAAV opisan obelodanjivanjem sadrži kapsidni protein koji je varijanta kapsidnog proteina divljeg tipa, kao što je varijanta kapsidnog proteina koja uključuje najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 (npr., 15, 2025, 50, 100 itd.) supstitucija amino kiselina (npr., mutacija) relativno spram AAV kapsidnog proteina divljeg tipa iz kog je derivirana. U nekim otelotvorenjima, AAV varijanta kapsidnog proteina je AAV1RX kapsidni protein, na primer kako je opisan u Albright i sar. Mol Ther.2018. feb 7;26(2):510–523. U nekim otelotvorenjima, varijanta kapsidnog proteina je AAV TM6 kapsidni protein, na primer kako je opisan u Rosario i sar. Mol Ther Methods Clin Dev.2016.; 3: 16026.
[0306] U nekim otelotvorenjima, rAAV-ovi opisani obelodanjivanje su se lako širili CNS-om, posebno kada su uvedeni u prostor CSF-a ili direktno u moždani parenhim. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, rAAV-ovi opisani obelodanjivanjem sadrže kapsidni protein koji je u stanju da prođe kroz krvno moždanu barijeru (engl. bloodbrain barrier, BBB). Na primer, u nekim otelotvorenjima, rAAV sadrži AAV9 ili AAVrh.10 serotip. Produkcija rAAV-ova je opisana, na primer, u Samulski i sar.
[0307] (1989.) J Virol.63(9):3822–8 i Wright (2009.) Hum Gene Ther.20(7): 698–706. U nekim otelotvorenjima, rAAV sadrži kapsidni protein koji specifično ili preferencijalno cilja mijeloidne ćelije, na primer mikroglijalne ćelije.
[0309] U nekim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje rAAV koji se naziva „PR006A“. PR006A je rAAV koji isporučuje funkcionalni ljudski GRN gen, što dovodi do povećane ekspresije funkcionalnog ljudskog PGRN. PR006A vektorski umetak sadrži element promotera kokošijeg β-aktina (CBA), koji sadrži 4 dela: pojačivač citomegalovirusa (CMV), CBA promoter, egzon 1 i intron (int) da bi konstitutivno eksprimirao kodonski optimizovanu kodirajuću sekvencu ljudskog GRN (SEQ ID NO:68).3' region takođe sadrži posttranskripcioni regulatorni element mrmotskog virusa hepatitisa (WPRE) praćen repom signala poliadenilacije goveđeg hormona rasta.
[0311] Tri dobro opisana mesta transkripcione regulatorne aktivacije su uključena u 5' kraj promoterskog regiona: TATA, RBS i YY1 (pogledajte, npr., Francois i sar., (2005) J. Virol.79(17):11082–11094). Bočni invertovani terminalni ponavljajući nizovi (ITR-ovi) omogućuju pravilno pakovanje međusekvenci. Kičma sadrži gen za prenos rezistencije na kanamicin kao i sekvencu za punjenje za sprečavanje obrnutog pakovanja. Šema koja prikazuje rAAV vektor je prikazana na SL.64. SEQ ID NO 90 obezbeđuje nukleotidnu sekvencu prvog lanca (u redosledu 5' do 3') PR006A vektora prikazanog na SL.64. SEQ ID NO 91 obezbeđuje nukleotidnu sekvencu drugog lanca (u redosledu 5' do 3') PR006A vektora prikazanog na SL.
[0312] 64. PR006A sadrži AAV9 kapsidne proteine.
[0314] U nekim otelotvorenjima, rAAV kako je opisan obelodanjivanjem (npr., koji sadrži rekombinantni rAAV genom enkapsidiran AAV kapsidnim proteinima da bi formirali rAAV kapsidnu česticu) se proizvodi u sistemu ekspresije bakulovirusnog vektora (engl. aculovirus vector expression system, BEVS).
[0315] Produkcija rAAV-ova korišćenjem BEVS-a je opisana, na primer u Urabe i sar. (2002.) Hum Gene Ther 13(16):1935–43, Smith i sar. (2009.) Mol Ther 17(11):1888–1896, Patentu SAD br.8,945,918, Patentu SAD br.9,879,282, i Međunarodnoj PCT publikaciji WO 2017/184879. Međutim, rAAV može da se proizvede bilo kojim pogodnim postupkom (npr., korišćenjem rekombinantnih rep i cap gena). U nekim otelotvorenjima, ovde otkriveni rAAV se proizvodi u HEK293 (ljudskim embrionskim bubrežnim; engl. human embryonic kidney) ćelijama.
[0317] Farmaceutske kompozicije
[0319] U nekim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže izolovanu nukleinsku kiselinu ili rAAV kako je ovde opisan i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se ovde koristi, pojam „farmaceutski prihvatljiv“ se odnosi na materijal, kao što je nosač ili razređivač, koji ne poništava biološko delovanje ili svojstva jedinjenja i relativno je netoksičan, npr., materijal može da se primeni na pojedinca bez uzrokovanja nepoželjnih bioloških efekata ili interakcije na štetan način sa bilo kojom od komponenti kompozicije u kojoj je sadržan.
[0321] Kako se ovde koristi, izraz „farmaceutski prihvatljiv nosač“ označava farmaceutski prihvatljiv materijal, kompozicija ili nosač, kao što je tečno ili čvrsto punilo, stabilizator, disperzioni agens, agens za suspendovanje, razblaživač, ekscipijens, agens za zgušnjavanje, rastvarač ili materijal za kapsuliranje, uključen u nošenje ili transport jedinjenja korisnog unutar pronalaska unutar pacijenta ili pacijentu tako da isto može da obavlja svoju predviđenu funkciju. Dodatni sastojci koji mogu da budu uključeni u farmaceutske kompozicije korišćene u praktikovanju pronalaska su poznati u predmetnoj oblasti i opisani, na primer u Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985., Easton, PA).
[0323] Kompozicije (npr., farmaceutske kompozicije) koje su ovde obezbeđene mogu da se primene bilo kojom rutom, uključujući enteralnu (npr., oralnu), parenteralnu, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intramedularnu, intratekalnu, subkutanu, intraventrikularnu, transdermalnu, interdermalnu, rektalnu, intravaginalnu, intraperitonealnu, topikalnu (kao što je putem prahova, masti, krema i/ili kapi), mukoznu, nazalnu, bukalnu, sublingvalnu; intratrahejskom instilacijom, bronhijalnom instilacijom i/ili inhalacijom; i/ili kao oralni sprej, nazalni sprej i/ili aerosol. Specifično razmotrene rute su oralna primena, intravenska primena (npr., sistemsko intravensko ubrizgavanje), regionalna primena putem krvnog i/ili limfnog snabdevanja i/ili direktna primena na pogođena mesta.
[0324] Uopšteno, najpogodnija ruta primene će zavisiti od raznih faktora, uključujući prirodu agensa (npr., njegove stabilnosti u okruženju gastrointestinalnog trakta) i/ili stanja subjekta (npr., da li je subjekt u stanju da toleriše oralnu primenu). U određenim otelotvorenjima, jedinjenje ili farmaceutska kompozicija koja je ovde opisana je pogodna za topikalnu primenu na oko subjekta.
[0326] U nekim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje gotovi lekoviti produkt PR006A koji sadrži PR006A rAAV opisan u prethodnome u vodenom rastvoru. U nekim otelotvorenjima, pufer konačne formulacije sadrži 20 mM Tris [pH 8,0], oko 1 mM MgCl2, oko 200 mM NaCl i oko 0,001 % [tež./zapr.] poloksamera 188. U nekim otelotvorenjima, gotovi lekoviti produkt i pufer konačne formulacije su pogodni za ubrizgavanje unutar cisterne magne (engl. intra-cisterna magna, ICM).
[0328] Postupci
[0330] Aspekti obelodanjivanja se odnose na kompozicije za ekspresiju jednog ili više genskih produkta povezanih s bolešću CNS-a kod subjekta za lečenje bolesti povezane s CNS-om. Jedan ili više genskih produkta povezanih s bolešću CNS-a mogu da budu kodirani jednom ili više izolovanih nukleinskih kiselina ili rAAV vektora. U nekim otelotvorenjima, na subjekta se primenjuje jedan vektor (npr., izolovana nukleinska kiselina, rAAV, itd.) koji kodira jedan ili više (1, 2, 3, 4, 5 ili više) genskih produkta. U nekim otelotvorenjima, na subjekta se primenjuje mnoštvo (npr., 2, 3, 4, 5 ili više) vektora (npr., izolovanih nukleinskih kiselina, rAAV-ova itd.), naznačenih time što svaki vektor kodira drugačiji genski produkt povezan s bolešću CNS-a.
[0332] Bolest povezana s CNS-om može da bude neurodegenerativna bolest, sinukleinopatija, tauopatija ili bolest lizozomskog skladištenja. Primeri neurodegenerativnih bolesti i gena povezanih s njima su navedeni u Tabeli 12.
[0334] „Sinukleinopatija“ se odnosi na bolest ili poremećaj karakterisan nakupljanjem alfa-sinukleina (genskog produkta SNCA) kod subjekta (npr., relativno spram zdravog subjekta, na primer subjekta koji nema sinukleinopatiju). Primeri sinukleinopatija i gena povezanih s njima su navedeni u Tabeli 13.
[0336] „Tauopatija“ se odnosi na bolest ili poremećaj karakterisan nakupljanjem abnormalnih tau proteina kod subjekta (npr., relativno spram zdravog subjekta koji nema tauopatiju). Primeri tauopatija i gena povezanih s njima su navedeni u Tabeli 14.
[0338] „Bolest lizozomskog skladištenja“ se odnosi na bolest karakterisanu abnormalnim gomilanjem toksičnih ćelijskih produkta u lizozomima subjekta. Primeri bolesti lizozomskog skladištenja i gena povezanih s njima su navedeni u Tabeli 15.
[0340] Kako se ovde koristi, „lečiti“ ili „lečenje“ se odnosi na (a) sprečavanje ili odgađanje pojave bolesti CNS-a; (b) smanjenje težine bolesti CNS-a; (c) smanjenje ili sprečavanje razvoja simptoma karakterističnih za bolest CNS-a; (d) i/ili sprečavanje pogoršanja simptoma karakterističnih za bolest CNS-a. Simptomi bolesti CNS-a mogu da uključuju, na primer, motoričku disfunkciju (npr., drhtanje, ukočenost, sporost kretanja, teškoća pri hodanju, paraliza), kognitivnu disfunkciju (npr., demenciju, depresiju, teskobu, psihozu), teškoću s pamćenjem, emocionalnu i bihevijoralnu disfunkciju.
[0342] Obelodanjivanje je delimično zasnovano na kompozicijama za ekspresiju jednog ili više genskih produkta povezanih s bolešću CNS-a kod subjekta za lečenje fronto-temporalne demencije (FTD) s GRN mutacijom. U nekim otelotvorenjima, subjekt ima Alchajmerovu bolest. U nekim otelotvorenjima, subjekt ima FTD i nema Alchajmerovu bolest. Subjekt ima FTD s GRN mutacijom (progranulina). U nekim otelotvorenjima, subjekt je heterozigotan na GRN mutaciju (npr.,
[0343] patogenu GRN mutaciju). U nekim otelotvorenjima, GRN mutacija je nulta mutacija (npr., nonsens mutacija, mutacija pomeranja okvira ili mutacija mesta deljenja ili potpuna ili delimična (egzonična) delecija gena). U nekim
[0344] otelotvorenjima, GRN mutacija je patogena mutacija s dokazanim funkcionalno kobnim efektom. U nekim otelotvorenjima, GRN mutacija je missens patogena mutacija. U nekim otelotvorenjima, GRN mutacija je navedena u Molgen FTD bazi podataka (molgen.ua.ac.be). U nekim otelotvorenjima, GRN mutacija proizvodi nizak nivo PGRN u plazmi (< 70 ng/ml) kod subjekta.
[0346] Subjekt ima FTD s GRN mutacijom.
[0348] U nekim otelotvorenjima, subjekt ima simptomatski FTD (npr., bihevijoralnu varijantu FTD-a (bvFTD), primarnu progresivnu afaziju (PPA)-FTD, FTD s kortikobazalnim sindromom ili kombinaciju simptoma).
[0349] Shodno tome, u nekim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za lečenje subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima FTD
[0350] s GRN mutacijom, s tim da postupak sadrži primenjivanje na subjekta kompozicije (npr., kompozicije koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu ili vektor ili rAAV) kako je opisana obelodanjivanjem.
[0352] U nekim otelotvorenjima, na subjekta koji ima Alchajmerovu bolest i FTD (npr. FTD s GRN mutacijom) se primenjuje rAAV koji kodira progranulin (PGRN) ili njegov deo. U nekim otelotvorenjima, na subjekta koji ima Alchajmerovu bolest i FTD (npr. FTD s GRN mutacijom) se primenjuje rAAV koji kodira PGRN ili njegov deo, pri čemu PGRN protein kodira kodonski optimizovana sekvenca nukleinskih kiselina ili sekvenca nukleinskih kiselina u SEQ ID NO:68. U nekim otelotvorenjima, PGRN protein sadrži sekvencu amino kiselina u SEQ ID NO:67 ili njen deo. U nekim otelotvorenjima, rAAV koji kodira PGRN sadrži kapsidni protein koji ima AAV9 serotip.
[0354] U nekim otelotvorenjima, kompozicija koja sadrži rAAV koji kodira PGRN za lečenje FTD-a (npr. FTD s GRN mutacijom) se primenjuje na subjekta pri dozi u rasponu od 1 × 10<12>vektorskih genoma (vg) do oko 1 × 10<15>vg ili od oko 1 × 10<13>vg do oko 7 × 10<14>vg ili od oko 1 × 10<13>vg do oko 5 × 10<14>vg ili od oko 2 × 10<13>vg do oko 2 × 10<14>vg ili od oko 3 × 10<13>vg do oko 2 × 10<14>vg ili od oko 3,5 × 10<13>vg do oko 1,4 × 10<14>vg. U nekim otelotvorenjima, kompozicija koja sadrži rAAV koji kodira PGRN za lečenje FTD-a (npr. FTD s GRN mutacijom) se primenjuje na subjekta pri dozi od oko 2 × 10<13>vg, oko 3 × 10<13>vg, oko
[0355] 4 × 10<13>vg, oko 5 × 10<13>vg, oko 6 × 10<13>vg, oko 7 × 10<13>vg, oko 8 × 10<13>vg, oko 9 × 10<13>vg, oko 1 × 10<14>vg ili oko 2 × 10<14>vg.
[0357] U nekim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za lečenje subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima FTD (npr. FTD s GRN mutacijom), s tim da postupak sadrži primenjivanje na subjekta kompozicije koja sadrži rAAV koji kodira PGRN, pri čemu se kompozicija primenjuje pri dozi od oko
[0358] 3,5 × 10<13>vektorskih genoma (vg), oko 7,0 × 10<13>vg ili oko 1,4 × 10<14>vg.
[0360] U nekim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za lečenje subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima FTD (npr. FTD s GRN mutacijom), s tim da postupak sadrži primenjivanje na subjekta kompozicije koja sadrži rAAV koji kodira PGRN, pri čemu se kompozicija primenjuje pri dozi od oko
[0361] 1 × 10<14>vektorskih genoma (vg), oko 2,0 × 10<14>vg ili oko 4,0 × 10<14>vg.
[0363] U nekim otelotvorenjima, kompozicija koja sadrži rAAV koji kodira PGRN za lečenje FTD-a (npr. FTD s GRN mutacijom) na subjekta kao jedne doze i kompozicija se na subjekta ne primenjuje naknadno.
[0365] U nekim otelotvorenjima, kompozicija koja sadrži rAAV se isporučuje putem jednog subokcipitalnog ubrizgavanja u cisternu magnu. U nekim otelotvorenjima, ubrizgavanje u cisternu magnu se izvodi pod radiografskim navođenjem.
[0367] U nekim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za lečenje simptoma subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima FTD
[0368] s GRN mutacijom, s tim da postupak sadrži primenjivanje na subjekta kompozicije koja sadrži rAAV koji kodira sekvencu za funkcionalni protein progranulin (PGRN), pri čemu protein PGRN kodira kodonski optimizovana sekvenca nukleinskih kiselina ili sekvenca nukleinskih kiselina u SEQ ID NO:68. U nekim otelotvorenjima, simptom FTD-a s GRN mutacijom može da bude promena ličnosti, oslabljenje izvršne funkcije, disinhibicija, apatija, spora produkcija govora, pogrešno korišćenje gramatike, multimodalna agnozija, semantička afazija ili oslabljeno razumevanje reči. U nekim otelotvorenjima, rAAV koji kodira PGRN sadrži kapsidni protein koji ima AAV9 serotip.
[0370] U nekim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za smanjenje nakupljanja lipofuscina u mozgu subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima FTD s GRN mutacijom, s tim da postupak sadrži primenjivanje na subjekta kompozicije koja sadrži rAAV koji kodira progranulin (PGRN), pri čemu protein PGRN kodira kodonski optimizovana sekvenca nukleinskih kiselina ili sekvenca nukleinskih kiselina u SEQ ID NO:68. U nekim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za smanjenje nakupljanja ubikvitina u mozgu subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima FTD s GRN mutacijom, s tim da postupak sadrži primenjivanje na subjekta kompozicije koja sadrži rAAV koji kodira progranulin (PGRN), pri čemu protein PGRN kodira kodonski optimizovana sekvenca nukleinskih kiselina ili sekvenca nukleinskih kiselina u SEQ ID NO:68. U nekim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za smanjenje ekspresije gena i/ili ekspresije proteina TNFα i/ili CD68 u mozgu subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima FTD s GRN mutacijom, s tim da postupak sadrži primenjivanje na subjekta kompozicije koja sadrži rAAV koji kodira progranulin (PGRN), pri čemu protein PGRN kodira kodonski optimizovana sekvenca nukleinskih kiselina ili sekvenca nukleinskih kiselina u SEQ ID NO:68. U nekim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za povećanje sazrevanja katepsina D u mozgu subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima FTD s GRN mutacijom, s tim da postupak sadrži primenjivanje na subjekta kompozicije koja sadrži rAAV koji kodira progranulin (PGRN), pri čemu protein PGRN kodira kodonski optimizovana sekvenca nukleinskih kiselina ili sekvenca nukleinskih kiselina u SEQ ID NO:68. U nekim aspektima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za povećanje nivoa nuklearnog TDP-43 (protein koji vezuje transaktivni responzivni DNK 43 kDa) proteina u mozgu subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima FTD
[0371] s GRN mutacijom, s tim da postupak sadrži primenjivanje na subjekta kompozicije koja sadrži rAAV koji kodira progranulin (PGRN), pri čemu protein PGRN kodira kodonski optimizovana sekvenca nukleinskih kiselina ili sekvenca nukleinskih kiselina u SEQ ID NO:68. U nekim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje postupak za smanjenje nivoa neurofilamentnog lakog lanca (engl. neurofilament light chain, NFL) u krvi ili CSF-a subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima FTD s GRN mutacijom, s tim da postupak sadrži primenjivanje na subjekta kompozicije koja sadrži rAAV koji kodira progranulin (PGRN), pri čemu protein PGRN kodira kodonski optimizovana sekvenca nukleinskih kiselina ili sekvenca nukleinskih kiselina u SEQ ID NO:68. U nekim otelotvorenjima, rAAV koji kodira PGRN sadrži kapsidni protein koji ima AAV9 serotip.
[0373] Subjekt je tipično sisar, poželjno čovek. U nekim otelotvorenjima, starost subjekt je između 1 meseca i 10 godina (npr., 1 mesec, 2 meseca, 3 meseca, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 12 meseci, 13 meseci, 14 meseci, 15 meseci, 16 meseci, 17 meseci, 18 meseci, 19 meseci, 20 meseci, 21 mesec, 22 meseca, 23 meseca, 24 meseca, 3 godine, 4 godine, 5 godina, 6 godina, 7 godina, 8 godina, 9 godina, 10 godina ili bilo koja starost između njih). U nekim otelotvorenjima, starost subjekta je između 2 godine i 20 godina. U nekim otelotvorenjima, starost subjekta je između 30 godina i 100 godina. U nekim otelotvorenjima, starost subjekta je veća od 55 godina.
[0375] U nekim otelotvorenjima, kompozicija se primenjuje direktno u CNS subjekta, na primer direktnim ubrizgavanjem u mozak i/ili kičmenu moždinu subjekta. Primeri modaliteta primene direktno u CNS uključuju, ali nisu ograničeni na, intracerebralno ubrizgavanje, intraventrikularno ubrizgavanje, intracisterno ubrizgavanje, intraparenhimsko ubrizgavanje, intrahekalno ubrizgavanje ili bilo koju kombinaciju prethodnih. U nekim otelotvorenjima, kompozicija se primenjuje na subjekta ubrizgavanjem unutar cisterne magne (engl. intra-cisterna magna, ICM). U nekim otelotvorenjima, direktno ubrizgavanje u CNS subjekta dovodi do ekspresije transgena (npr., ekspresije prvog genskog produkta, drugog genskog produkta i, ako je primenjivo, trećeg genskog produkta) u srednjem mozgu, strijatumu i/ili cerebralnom korteksu subjekta. U nekim otelotvorenjima, direktno ubrizgavanje u CNS dovodi do ekspresije transgena (npr., ekspresije prvog genskog produkta, drugog genskog produkta i, ako je primenjivo, trećeg genskog produkta) u kičmenoj moždini i/ili CSF-u subjekta
[0377] U nekim otelotvorenjima, direktno ubrizgavanje u CNS subjekta sadrži konvekciono unapređenu isporuku (engl. convection enhanced delivery, CED). Konvekciono unapređena isporuka je terapijska strategija koja uključuje hirurško izlaganje mozga i postavljanje katetera malog prečnika direktno u ciljni predeo mozga, praćeno infuzijom terapijskog agensa (npr., kompozicije ili rAAV-a kako je ovde opisan) direktno u mozak subjekta. CED je opisan, na primer, u Debinski i sar. (2009.) Expert Rev Neurother. 9(10):1519–27.
[0379] U nekim otelotvorenjima, kompozicija se primenjuje periferno na subjekta, na primer perifernim ubrizgavanjem. Primeri perifernog ubrizgavanja uključuju subkutano ubrizgavanje, intravensko ubrizgavanje, intraarterijsko ubrizgavanje, intraperitonealno ubrizgavanje ili bilo koju kombinaciju prethodnih. U nekim otelotvorenjima, periferno ubrizgavanje je intraarterijsko ubrizgavanje, na primer, ubrizgavanje u karotidnu arteriju subjekta.
[0381] U nekim otelotvorenjima, kompozicija (npr., kompozicija koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu ili vektor ili rAAV) kako je opisana obelodanjivanjem se primenjuje i periferno i direktno u CNS subjekta. Na primer, u nekim otelotvorenjima, na subjekta se primenjuje kompozicija intraarterijskim ubrizgavanjem (npr., ubrizgavanjem u karotidnu arteriju) i intraparenhimskim ubrizgavanjem (npr., intraparenhimskim ubrizgavanjem putem CED-a). U nekim otelotvorenjima, direktno ubrizgavanje u CNS i periferno ubrizgavanje su istovremeni (npr., dešavaju se u isto vreme). U nekim otelotvorenjima, direktno ubrizgavanje se dešava pre (npr., između 1 minute i 1 nedelje ili više pre) perifernog ubrizgavanja. U nekim otelotvorenjima, direktno ubrizgavanje se dešava nakon (npr., između 1 minute i 1 nedelje ili više nakon) perifernog ubrizgavanja.
[0383] U nekim otelotvorenjima, na subjekta se primenjuje sredstvo za imunosupresiju pre (npr., između 1 meseca i 1 minute pre) ili u isto vreme kao ovde opisana kompozicija. U nekim otelotvorenjima, sredstvo za imunosupresiju je kortikosteroid (npr., prednizon, budezonid itd.), mTOR inhibitor (npr., sirolimus, everolimus itd.), antitelo (npr., adalimumab, etanercept, natalizumab itd.) ili metotreksat.
[0385] Količina kompozicije (npr., kompozicija koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu ili vektor ili rAAV) kako je opisana obelodanjivanjem koja se primenjuje na subjekta će biti promenljiva zavisno od postupka primene. Na primer, u nekim otelotvorenjima, rAAV kako je ovde opisan se primenjuje na subjekta pri titru između oko 10<9>genomskih kopija (GC)/kg i oko 10<14>GC/kg (npr., oko 10<9>GC/kg, oko 10<10>GC/kg, oko 10<11>GC/kg, oko 10<12>GC/kg, oko 10<12>GC/kg ili oko
[0386] 10<14>GC/kg). U nekim otelotvorenjima, na subjekta se primenjuje veći titar (npr., > 10<12>genomskih kopija GC/kg rAAV) ubrizgavanjem u prostor CSF-a ili intraparenhimskim ubrizgavanjem. U nekim otelotvorenjima, rAAV kako je ovde opisan se primenjuje na subjekta pri dozi u rasponu od oko 1 × 10<10>vektorskih genoma (vg) do oko 1 × 10<17>vg intravenskim ubrizgavanjem. U nekim otelotvorenjima, rAAV kako je ovde opisan se primenjuje na subjekta pri dozi u rasponu od oko 1 × 10<10>vg do oko 1 × 10<16>vg po ubrizgavanju u cisternu magnu.
[0388] Kompozicija (npr., kompozicija koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu ili vektor ili rAAV) kako je opisana obelodanjivanjem može da se primeni na subjekta jedanput ili više puta (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 ili više puta). U nekim otelotvorenjima, kompozicija se primenjuje na subjekta neprekidno (npr., hronično), na primer, putem infuzione pumpe.
[0390] Primeri
[0392] Primer 1: rAAV vektori
[0394] AAV vektori se generišu korišćenjem ćelija, kao što su HEK293 ćelije za trostruku plazmidnu transfekciju. ITR sekvence su na bokovima ekspresionog konstrukta koji sadrži element promotera/pojačivača za svaki transgen od interesa, 3' poli A signal i posttranslacione signale, kao što je WPRE element. Više genskih produkta može biti eksprimirano istovremeno, kao što su GBA1 i LIMP2 i/ili prosapozin, fuzijom sekvenci proteina; ili korišćenjem 2A linkera peptida, kao što je T2A ili P2A, koji vodi 2 fragmenta peptida s dodanim amino kiselinama zbog sprečavanja stvaranja peptidne veze; ili korišćenjem IRES elementa; ili ekspresijom s 2 odvojene ekspresione kasete. Prisustvo kratke intronske sekvence koja je efikasno podeljena, uzvodno od eksprimiranog gena, može poboljšati nivoe ekspresije. shRNK-ovi i drugi regulatorni RNK-ovi potencijalno mogu da budu uključeni unutar ovih sekvenci. Primeri ekspresionih konstrukta opisanih obelodanjivanjem su prikazani na SL.1–8, 21–35, 39, 41–51 i 64 i u Tabeli 2 u nastavku.
[0396] Tabela 2
[0398]
[0399]
[0400]
[0403] Primer 2: Ćelijski zasnovani testovi virusne transdukcije u ćelije s deficitom GBA
[0405] Ćelije s deficitom GBA1 se dobijaju, na primer kao fibroblasti iz pacijenata s GD-om, monocita ili hES ćelija ili indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija (engl. induced pluripotent stem cells, iPSCs) deriviranih iz pacijenta. Ove ćelije nakupljaju substrate kao što su glukozilceramid i glukozilsfingozin (GlcCer i GlcSph). Lečenje kultivisanih ćelijskih linija divljeg tipa ili mutiranih ćelijski linija inhibitorima Gcaze, kao što je CBE, takođe se koristi za dobijanje ćelija s deficitom GBA.
[0407] Korišćenjem takvih ćelijskih modela, lizozomni defekti se kvantifikuju u pogledu nakupljanja agregata proteina, kao što je α-sinuklein s antitelom za ovaj protein ili fosfo-αSyn, praćeno dijagnostičkim slikanjem upotrebom fluorescentne mikroskopije. Dijagnostičko slikanje za lizozomne abnormalnosti putem ICC-a za markere proteina kao što su LAMP1, LAMP2, LIMP1, LIMP2 ili korišćenjem boja kao što je Lysotracker ili unosom kroz endocitni odeljak fluorescentnog dekstrana ili drugih markera se takođe izvodi. Dijagnostičko slikanje za nakupljanje markera autofagije zbog defektivne fuzije s lizozomom, kao što je za LC3, takođe može da se izvede. Izvođenje zapadnog blot testa i/ili ELISA testa se koristi da bi se kvantifikovalo abnormalno nakupljanje ovih markera. Takođe, nakupljanje substrata glikolipida i produkta GBA1 se meri korišćenjem standardnih pristupa.
[0409] Terapijske krajnje tačke (npr., smanjenje patologije povezane s PD-om) se mere u kontekstu ekspresije transdukcije AAV vektora, da bi se potvrdila i kvantifikovala aktivnost i funkcija. Gcaza se takođe kvantifikuje korišćenjem ELISA merenja proteina ili putem standardnih testova aktivnosti Gcaze.
[0411] Primer 3: In vivo testovi uz upotrebu mutiranih miševa
[0413] Ovaj primer opisuje in vivo testove AAV vektora uz upotrebu mutiranih miševa. In vivo ispitivanja AAV vektora kako je prethodno navedeno kod mutiranih miševa se izvode korišćenjem testova opisanih, na primer, u Liou i sar. (2006.) J. Biol. Chem.281(7): 4242–4253, Sun i sar. (2005.) J. Lipid Res.46:2102–2113, i Farfel-Becker i sar. (2011.) Dis. Model Mech.4(6):746–752.
[0415] Intratekalna ili intraventrikularna isporuka kontrolnog vehikuluma i AAV vektora (npr., pri dozi od 2 × 10<11>vg/mišu) se izvode korišćenjem koncentrovanih standarda AAV-a, na primer pri zapremini ubrizgavanja između 5–10 µl. Izvodi se intraparenhimska isporuka putem konvekciono unapređene isporuke.
[0417] Lečenje se započinje ili pre pojave simptoma ili nakon pojave. Krajnje tačke koje se mere su nakupljanje supstrata u CNS-u i CSF-u, nakupljanje enzima Gcaze putem ELISA testa i enzimske aktivnosti, motoričkih i kognitivnih krajnjih tačaka, lizozomne disfunkcije i nakupljanja monomera, protofibrila ili fibrila α-sinukleina.
[0419] Primer 4: Hemijski modeli bolesti
[0421] Primeri opisani u in vivo testovima AAV vektora koji koriste hemijski indukovani mišiji model Gošeove bolesti (npr., CBE mišiji model). In
[0422] vivo ispitivanja ovih AAV vektora se izvode u hemijski indukovanom mišijem modelu Gošeove bolesti Vardi i sar. (2016.) J Pathol.239(4):496–509.
[0424] Intratekalna ili intraventrikularna isporuka kontrolnog vehikuluma i AAV vektora (npr., pri dozi od 2 × 10<11>vg/mišu) se izvode korišćenjem koncentrovanih standarda AAV-a, na primer sa zapreminom ubrizgavanja između 5–10 µl. Izvodi se intraparenhimska isporuka putem konvekciono unapređene isporuke. Periferna isporuka se ostvaruje ubrizgavanjem u repnu venu.
[0426] Lečenje se započinje ili pre pojave simptoma ili nakon pojave. Krajnje tačke koje se mere su nakupljanje supstrata u CNS-u i CSF-u, nakupljanje enzima Gcaze putem ELISA testa i enzimske aktivnosti, motoričkih i kognitivnih krajnjih tačaka, lizozomne disfunkcije i nakupljanja monomera, protofibrila ili fibrila α-sinukleina.
[0428] Primer 5: Klinička ispitivanja u pacijentima s PD-om, LBD-om, Gošeovom bolešću
[0430] U nekim otelotvorenjima, pacijenti koji imaju određene oblike Gošeove bolesti (e.g., GD1) imaju povećan rizik od razvijanja Parkinsonove bolesti (PD) ili demencije Levijevih tela (engl. Lewy body dementia, LBD). Ovaj primer opisuje klinička ispitivanja za procenu bezbednosti i efikasnosti rAAV-ova kako su opisani obelodanjivanjem, kod pacijenata koji imaju Gošeovu bolest, PD i/ili LBD.
[0432] Klinička ispitivanja takvih vektora za lečenje Gošeove bolesti, PD-a i/ili LBD-a se izvode korišćenjem dizajna ispitivanja sličnog onome opisanom u Grabowski i sar. (1995.) Ann. Intern. Med.122(1):33–39.
[0434] Primer 6: Lečenje periferne bolesti
[0436] U nekim otelotvorenjima, pacijenti koji imaju određene oblike Gošeove bolesti pokazuju simptome periferne neuropatije, na primer, kako je opisana u Biegstraaten i sar. (2010.) Brain 133(10):2909–2919.
[0438] Ovaj primer opisuje in vivo testove AAV vektora kako su ovde opisani za lečenje periferne neuropatije povezane s Gošeovom bolešću (npr., Gošeovom bolešću tipa 1). Ukratko, na pacijente s Gošeovom bolešću tipa 1 za koje je utvrđeno da imaju znakove ili simptome periferne neuropatije se primenjuje rAAV kako je opisan obelodanjivanjem. U nekim otelotvorenjima, znakovi i simptomi periferne neuropatije kod subjekta se prate, na primer, korišćenjem postupaka opisanih u Biegstraaten i sar., nakon primene rAAV-a.
[0439] Nivoi transduciranih genskih produkta kako su opisani obelodanjivanjem prisutni kod pacijenata (npr., u serumu pacijenta, u perifernom tkivu (npr., tkivu jetre, tkivu slezine, itd.) pacijenta) se testiraju, na primer zapadnom blot analizom, enzimskim funkcionalnim testovima ili ispitivanjima dijagnostičkog slikanja.
[0441] Primer 7: Lečenje CNS oblika
[0443] Ovaj primer opisuje in vivo testove rAAV-ova kako su ovde opisani za lečenje CNS oblika Gošeove bolesti. Ukratko, na pacijente s Gošeovom bolešću za koje je utvrđeno da imaju CNS oblik Gošeove bolesti (npr., Gošeovu bolest tipa 2 ili tipa 3) se primenjuje rAAV kako je opisan obelodanjivanjem. Nivoi transduciranih genskih produkta kako su opisani obelodanjivanja prisutni u CNS-u pacijenata (npr., u serumu CNS-a pacijenta, u cerebrospinalnoj tečnosti (engle. cerebrospinal fluid, CSF) pacijenta ili u tkivu CNS-a pacijenta) se testiraju, na primer, zapadnom blot analizom, enzimskim funkcionalnim testovima ili ispitivanjima dijagnostičkog slikanja.
[0445] Primer 8: Genska terapija Parkinsonove bolesti kod subjekata koji imaju mutacije u GBA1
[0447] Ovaj primer opisuje primenu rekombinantnog adeno asociranog virusa (rAAV) koji kodira GBA1 na subjekta koji ima Parkinsonovu bolest karakterisanu mutacijom u GBA1genu.
[0449] rAAV-GBA1 vektorski umetak sadrži element CBA promotera (CBA), koji se sastoji od četiri dela: pojačivača CMV-a (CMVe), CBA promotera (CBAp), egzona 1 i introna (int) da bi konstitutivno eksprimirao kodonski optimizovanu kodirajuću sekvencu (CDS) ljudskog GBA1 (bordo).3' region takođe sadrži posttranskripcioni regulatorni element mrmotskog virusa hepatitisa (engl. Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element, WPRE) praćen repom poli A signala goveđeg hormona rasta (engl. bovine Growth Hormone poly A, bGH polyA). Bočni ITR-ovi omogućuju pravilno pakovanje međusekvenci. Ocenjene su dve varijante 5' ITR sekvence (SL.7, umetnuti kvadrat, donja sekvenca); ove varijante imaju više nukleotidnih razlika unutar „D“ regiona ITR-a od 20 nukleotida, za koji se veruje da utiče na efikasnost pakovanja i ekspresije. rAAV-GBA1 vektorski produkt sadrži sekvencu nukleotida „D“ domena prikazanu na SL.7 (umetnuti kvadrat, gornja sekvenca). Varijanta vektora koja sadrži „D“ domen (ovde nazvan „S“ domen, s promenama nukleotida prikazanim senčenjem), imala je slične performanse u pretkliničkim ispitivanjima. Kičma sadrži gen za prenos rezistencije na kanamicin kao i sekvencu za punjenje za sprečavanje obrnutog pakovanja. Šema koja prikazuje rAAV-GBA1 vektor je prikazana na SL.8. rAAV-GBA1 vektor se pakuje u rAAV korišćenjem kapsidnih proteina AAV9 serotipa.
[0451] rAAV-GBA1 se primenjuje na subjekta kao jedna doza putem fluoroskopijom navođenog subokcipitalnog ubrizgavanja u cisternu magnu (engl. intracisternal magna; ICM). Jedno otelotvorenje ispitivanja režima doziranja rAAV-GBA1 je kako sledi:
[0453] Jedna doza rAAV-GBA1 se primenjuje na pacijente (N = 12) pri jednom od dva nivoa doze (3e13 vg (niska doza); 1e14 vg (visoka doza) itd.) koji su utvrđeni na osnovu rezultata nekliničkih farmakoloških i toksikoloških ispitivanja.
[0455] Početna ispitivanja su sprovedena u hemijskom mišijem modelu koji uključuje svakodnevnu isporuku konduritol-b-epoksida (CBE), inhibitora GCaze, da bi se procenila efikasnost i bezbednost rAAV-GBA1 vektora i rAAV-GBA1 S-varijante konstrukta (kako je dodatno opisana u nastavku). Dodatno tome, početna ispitivanja su izvedena u genetskom mišijem modelu, koji nosi homozigotnu GBA1 mutaciju i ima delimični deficit sapozina (4L/PS-NA). Dodatna ispitivanja s rasponom doza u miševima i neljudskim primatima (engl. nonhuman primates, NHPs) se sprovode da bi se dodatno ocenila bezbednost i efikasnost vektora.
[0457] Dve blago različite verzije 5' invertovanih terminalnih ponavljajućih nizova (ITR) u AAV kičmi su testirane da bi se procenila mogućnost proizvodnje i ekspresija transgena (SL.7). „D“ domen od 20 bp unutar 5' ITR-a od 145 bp se smatra neophodnim za optimalnu produkciju virusnog vektora, ali je takođe prijavljeno da mutacije unutar „D“ domena povećavaju ekspresiju transgena u nekim slučajevima. Tako je, dodatno uz virusni vektor rAAV-GBA1, koji sadrži celoviti „D“ domen, drugi oblik vektora s mutiranim D domenom (ovde se naziva „S“ domen) takođe ocenjen. I rAAV-GBA1 i varijanta eksprimiraju isti transgen. Dok su oba vektora proizvela virus koji je bio efikasan in vivo, kako je detaljno opisano u nastavku, rAAV-GBA1, koji sadrži „D“ domen divljeg tipa, je odabran za dodatni razvoj.
[0459] Da bi se ustanovio CBE model deficita GCaze, mladi miševi su dozirani s CBE-om, specifičnim inhibitorom GCaze. Miševima je dat CBE putem svakodnevnog IP ubrizgavanja, počevši 8. postnatalnog dana (P8). Tri različite doze CBE-a (25 mg/kg, 37,5 mg/kg, 50 mg/kg) i PBS su testirani da bi se ustanovio model koji pokazuje bihevijoralni fenotip (SL.9). Više doze CBE-a su dovele do smrtonosnosti na način zavisan od doze. Svi miševi lečeni s 50 mg/kg CBE-a su uginuli do P23 i 5 od 8 miševa lečenih s 37,5 mg/kg CBE-a je uginulo do P27. Nije bilo smrtonosnosti kod miševa lečenih s 25 mg/kg CBE-a. Dok miševima kojima je ubrizgan CBE nisu pokazivali uopštene motoričke deficite u testu otvorenog polja (krećući se u istoj udaljenosti i sa istim ubrzanjem kao miševi kojima je dat PBS), miševi lečeni CBE-om jesu pokazali deficit motoričke koordinacije i balansa meren testom rotirajuće osovine.
[0461] Miševi koji su preživeli do kraja ispitivanja su žrtvovani na dan nakon poslednje doze CBE-a (P27, „1. dan“) ili tri dana nakon uskraćivanja CBE-a (P29, „3. dan“). Analiza lipida je izvedena na korteksu miševa kojima je dato 25 mg/kg CBE-a da bi se ocenilo nakupljanje substrata GCaze i u kohorti 1. dana i u kohorti 3. dana. Nivoi GluSph i GalSph (mereni agregatno u ovom primeru) su bili značajno nakupljeni u miševima lečenim CBE-om u poređenju s kontrolama lečenim PBS-om, što je dosledno s insufcijencijom GCaze.
[0463] Na osnovu prethodno opisanog ispitivanja, doza od 25 mg/kg CBE-a je odabrana pošto je proizvela bihevijoralne deficite bez uticaja na preživljavanje. Da bi se ostvarila rasprostranjena distribucija GBA1 u celom mozgu i ekspresija transgena tokom lečenja s CBE-om, rAAV-GBA1 ili ekscipijent se isporučivao intracerebroventrikularnim (ICV) ubrizgavanjem 3. postnatalnog dana (P3) praćeno svakodnevnim IP lečenjem s CBE-om ili PBS-om započetim u P8 (SL.10).
[0465] Miševi lečeni CBE-om koji su primili rAAV-GBA1 su imali statistički značajno bolje performanse na rotirajućoj osovini nego oni koji su primili ekscipijent (SL.11). Miševi u grupama lečenim varijantom nisu se razlikovali od miševa lečenih ekscipijentom u pogledu drugih bihevijoralnih mera, kao što je ukupna udaljenost pređena tokom testiranja (SL.11).
[0467] Nakon završetka ispitivanja tokom života, pola miševa je žrtvovano dana nakon poslednje doze CBE-a (P36, „1. dan“) ili nakon tri dana uskraćivanja CBE-a (P38, „3. dan“) radi biohemijske analize (SL.12). Korišćenjem fluorometrijskog enzimskog testa izvedenog u biološkom triplikatu, procenjena je aktivnost GCaze u korteksu. Aktivnost GCaze je bila povećana kod miševa koji su lečeni s rAAV-GBA1, do je lečenje s CBE-om smanjilo aktivnost GCaze. Dodatno tome, miševi koji su primili i CBE i rAAV-GBA1 su imali nivoe aktivnosti GCaze koji su bili slični onima u grupi lečenoj PBS-om, što ukazuje da je isporuka rAAV-GBA1 u stanju da savlada inhibiciju aktivnosti GCaze indukovanu lečenjem s CBE-om. Analiza lipida je izvedena na motoričkom korteksu miševa da bi se pregledali nivoi substrata GluCer i GluSph. Lipidi nakupljeni u mozgovima miševa kojima je dat CBE kao i onih lečenih s rAAV-GBA1 značajno su smanjili nakupljanje substrata.
[0469] Nivoi lipida su bili u negativnoj korelaciji s aktivnošću GCaze i s performansama na rotirajućoj osovini u svim lečenim grupama. Povećana aktivnost GCaze nakon primene rAAV-GBA1 bila je povezana sa smanjenjem substrata i unapređenom motoričkom funkcijom (SL.13). Kao što je prikazano na SL. 14, preliminarna biodistribucija je procenjena prisustvom vektorskih genoma, merenim qPCR-om (s prisustvom > 100 vektorskih genoma po 1 µg genomskog DNK definisanim kao pozitivnim). Miševi koji su primili rAAV-GBA1, i sa CBE-om i bez njega, bili su pozitivni na rAAV-GBA1 vektorske genome u korteksu, što ukazuje da ICV isporuka dovodi do isporuke rAAV-GBA1 u korteks. Dodatno tome, vektorski genomi su detektovani u jetri, nekoliko ih je detektovano u slezini i nisu detektovani u srcu, bubrezima ili polnim žlezdama. Za sve mere, nije bilo statistički značajne razlike između grupe 1. dana i grupe 3. dana.
[0471] Veće ispitivanje u CBE modelu dodatno je istražilo efikasne doze rAAV-GBA1 u CBE modelu. Korišćenjem modela doze od 25 mg/kg CBE-a, ekscipijent ili rAAV-GBA1 je isporučen putem ICV u P3, i svakodnevno IP lečenje PBS-om ili CBE-om je započeto u P8. S obzirom na sličnost između grupa s uskraćivanjem CBE-a i bez njega zapaženim u prethodnim ispitivanjima, svi miševi su žrtvovani jedan dan nakon konačne doze CBE-a (P38–40). Procenjeni su efekti tri različite doze rAAV-GBA1, što je dovelo do sledećih pet grupa, s 10 miševa (5M/5F) po grupi:
[0473] Ekscipijent ICV PBS IP
[0475] Ekscipijent ICV 25 mg/kg CBE IP
[0477] 3,2e9 vg (2,13e10 vg/g mozga) rAAV-GBA1 ICV 25 mg/kg CBE IP
[0478] 1,0e10 vg (6,67e10 vg/g mozga) rAAV-GBA1 ICV 25 mg/kg CBE IP
[0479] 3,2e10 vg (2,13e11 vg/g mozga) rAAV-GBA1 ICV 25 mg/kg CBE IP.
[0480] Najviša doza rAAV-GBA1 je spasila neuspeh u dobijanju na težini povezan s lečenjem s CBE-om u P37. Dodatno tome, ova doza je dovela do statistički značajnog povećanja u performansama na rotirajućoj osovini i suženoj šipki u poređenju s ekscipijent CBE lečenom grupom (SL.15). Smrtonosnost je zapažena u više grupa, uključujući grupu lečenu ekscipijentom i grupu lečenu s rAAV-GBA1 (ekscipijent PBS: 0; Ekscipijent 25 mg/kg CBE: 1; 3,2e9 vg rAAV-GBA1 25 mg/kg CBE: 4; 1,0e10 vg rAAV-GBA1 25 mg/kg CBE: 0; 3,2e10 vg rAAV-GBA1 25 mg/kg CBE: 3).
[0482] Po završetku ispitivanja za vreme života, miševi su žrtvovani radi biohemijske analize (SL.16). Aktivnost GCaze u korteksu je procenjena u biološkim triplikatima putem fluorometrijskog testa. Miševi lečeni CBE-om pokazali su smanjenu aktivnost GCaze, dok su miševi koji su primili višu dozu rAAV-GBA1 pokazali statistički značajno povećanje aktivnosti GCaze u poređenju s lečenjem CBE-om. Miševi lečeni CBE-om takođe su imali nakupljanje GluCer i GluSph, koji su oba spašeni primenjivanjem visoke doze rAAV-GBA1.
[0484] Dodatno uz ustanovljene hemijske CBE modele, rAAV-GBA1 je takođe ocenjen u 4L/PS-NA genetskom modelu, koji je homozigotan spram V394L GD mutacije u Gba1 i takođe ima delimični deficit sapozina, što utiče na lokalizaciju i aktivnost GCaze. Ovi miševi pokazuju deficite motoričke snage, koordinacije i balansa, što pokazuju njihove performanse u testovima hodanja šipkom, rotirajuće osovine i vešanja sa žice. Tipično je životni vek ovih miševa manji od 22 nedelje. U početnom ispitivanju, 3 µl maksimalnog titra virusa je isporučeno putem ICV-a u P23, s konačnom dozom od 2,4e10 vg (6,0e10 vg/g mozga). Sa 6 miševa po grupi, lečene grupe su bile:
[0486] WT ekscipijent ICV
[0488] 4L/PS-NA ekscipijent ICV
[0490] 4L/PS-NA 2,4e10 vg (6,0e10 vg/g mozga) rAAV-GBA1 ICV
[0491] Motoričke performanse prema testu hodanja po šipki su procenjene 4 nedelje nakon isporuke rAAV-GBA1. Grupa mutiranih miševa koji su primili rAAV-GBA1 pokazala je trend ka manjim ukupnim brojem sklizavanja i manjim brojem sklizavanja po brzini u poređenju s mutiranim miševima lečenim ekscipijentom, obnavljajući motoričku funkciju na nivoe blizu WT (SL.17). Pošto motorički fenotipovi postaju teži kako miševi stare, njihove performanse u ovom i drugim bihevijoralnim testovima se procenjuje u kasnijim vremenskim tačkama. Po završetku ispitivanja za vreme života, procenjeni su nivoi lipida, aktivnost GCaze i biodistribucija u ovim miševima.
[0493] Trenutno se korišćenjem CBE modela testiraju dodatne niže doze rAAV-GBA1, koje odgovaraju 0,03 ×, 0,1 × i 1 × predloženoj visokoj kliničkoj dozi faze 1. Svaka grupa uključuje 10 miševa (5M/5F) po grupi:
[0495] Ekscipijent ICV
[0497] Ekscipijent ICV 25 mg/kg CBE IP
[0499] 3,2e8 vg (2,13e9 vg/g mozga) rAAV-GBA1 ICV 25 mg/kg CBE IP
[0500] 1,0e9 vg (6,67e9 vg/g mozga) rAAV-GBA1 ICV 25 mg/kg CBE IP
[0501] 1,0e10 vg (6,67e10 vg/g mozga) rAAV-GBA1 ICV 25 mg/kg CBE IP.
[0502] Dodatno uz motoričke fenotipove, procenjeni su nivoi lipida i aktivnost GCaze u korteksu. Takođe su izvedeni tok lečenja i analize.
[0504] Veće ispitivanje s rasponom doza je započeto da bi se ocenili podaci o efikasnosti i bezbednosti. 10 4L/PS-NA miševa (5M/5F po grupi) je ubrizgano 10 µl rAAV-GBA1. Korišćenjem alometrijskog izračuna težine mozga, doze se u korelaciji s 0,15 ×, 1,5 ×, 4,4 × i 14,5 × predloženom visokom kliničkom dozom faze 1. Grupe ubrizgavanja se sastoje od:
[0506] WT ekscipijent ICV
[0508] 4L/PS-NA ekscipijent ICV
[0510] 4L/PS-NA 4,3e9 vg (1,1e10 vg/g mozga) rAAV-GBA1 ICV
[0511] 4L/PS-NA 4,3e10 vg (1,1e11 vg/g mozga) rAAV-GBA1 ICV
[0512] 4L/PS-NA 1,3e11 vg (3,2e11 vg/g mozga) rAAV-GBA1 ICV
[0513] 4L/PS-NA 4,3e11 vg (1,1e12 vg/g mozga) rAAV-GBA1 ICV.
[0514] Primer 9: In vitro analiza rAAV vektora
[0516] rAAV konstrukti su testirani in vitro i in vivo. SL.18 prikazuje reprezentativne podatke za in vitro ekspresiju rAAV konstrukta koji kodiraju protein progranulina (PGRN). Levi panel prikazuje standardnu krivulju ELISA testa progranulina (PGRN). Donji panel prikazuje odgovor na dozu PGRN ekspresije meren ELISA testom u ćelijskim lizatima HEK293T ćelija transduciranih s rAAV-om. MOI = višestrukost infekcije (vektorskih genoma po ćeliji; engl. multiplicity of infection).
[0518] Izvedeno je pilot ispitivanje da bi se procenila in vitro aktivnost rAAV vektora koji kodiraju prosapozin (PSAP) i SCARB2, samih ili u kombinaciji s GBA1 i/ili jednim ili više inhibitornih RNK-ova. Jedan konstrukt koji kodira PSAP i progranulin (PGRN) je takođe testiran. Testirani vektori uključuju one prikazane u Tabeli 3. „Opt“ se odnosi na sekvencu nukleinskih kiselina koja je kodonski optimizovana za ekspresiju u sisarskim ćelijama (npr., ljudskim ćelijama). SL.19 prikazuje reprezentativne podatke koji ukazuju da je transfekcija HEK293 ćelija sa svakim od konstrukta dovela do prekomerne ekspresije odgovarajućeg genskog produkta u poređenju s lažno transfektovanim ćelijama.
[0520] Izvedeno je pilot ispitivanje da bi se procenila in vitro aktivnost rAAV vektora koji kodiraju TREM2, samih ili u kombinaciji s jednim ili više inhibitornih RNK-ova. Testirani vektori uključuju one prikazane u Tabeli 3. „Opt“ se odnosi na sekvencu nukleinskih kiselina koja je kodonski optimizovana za ekspresiju u sisarskim ćelijama (npr., ljudskim ćelijama). SL.36A–36B prikazuju reprezentativne podatke koji ukazuju da je transfekcija HEK293 ćelija sa svakim od konstrukta dovela do prekomerne ekspresije odgovarajućeg genskog produkta u poređenju s lažno transfektovanim ćelijama.
[0522] Tabela 3:
[0525]
[0528] Primer 10: Testiranje SNCA i TMEM106B shRNK konstrukta
[0529] HEK293 ćelije
[0531] Ćelijska linija ljudskih embrionskim bubrežnih ćelija 293 (HEK293) je korišćena u ovom ispitivanju (#85120602, Sigma-Aldrich). HEK293 ćelije su održavane u medijumu za kulturu (D-MEM [#11995065, Thermo Fisher Scientific] nadopunjenom 10 % fetalnim goveđim serumom [FBS] [#10082147, Thermo Fisher Scientific]) koji sadrži 100 jedinica/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina (#15140122, Thermo Fisher Scientific).
[0533] Transfekcija plazmida
[0535] Transfekcija plazmida je izvedena korišćenjem reagensa za transfekciju Lipofectamine 2000 (#11668019, Thermo Fisher Scientific) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, HEK293 ćelije (#12022001, Sigma-Aldrich) su postavljene na ploču pri gustoći od 3 × 10<5>ćelija/ml u medijumu za kulturu bez antibiotika. Sledećeg dana, plazmid i reagens Lipofectamine 2000 su kombinovani u rastvoru Opti-MEM (#31985062, Thermo Fisher Scientific). Nakon 5 minuta, smeše su dodate u kulturu HEK293. Nakon 72 časa, ćelije su prikupljene radi ekstracije RNK ili proteina ili podvrgnute analizama dijagnostičkog slikanja. Za analize dijagnostičkog slikanja, ploče su unapred prevučene s 0,01 % rastvorom poli-L-lizina (P8920, Sigma-Aldrich) pre postavljanja ćelija u ploče.
[0537] Analiza ekspresije gena kvantitativnim PCR-om u stvarnom vremenu (qRT-PCR)
[0539] Relativni nivoi ekspresije gena su utvrđeni kvantitativnim PCR-om u stvarnom vremenu (qRT-PCR) korišćenjem Power SYBR Green Cells-to-CT kompleta (#4402955, Thermo Fisher Scientific) prema uputstvima proizvođača.
[0540] Kandidatski plazmidi su prolazno transfektovani u HEK293 ćelije postavljene u ploče s 48 bunarića (7,5 ×10<4>ćelija/bunariću) korišćenjem reagensa za transfekciju Lipofectamine 2000 (0,5 µg plazmida i 1,5 µl reagensa u 50 µl rastvora Opti-MEM). Nakon 72 časa, RNK je ekstrahovana iz ćelija i korišćena za reverznu transkripciju da bi se sintetizovao cDNK prema uputstvima proizvođača. Za analizu kvantitativnog PCR-a, 2~5 µl cDNK produkta je pojačano u duplikatima korišćenjem parova prajmera specifičnih za gen (250 nM konačne koncentracije) s Power SYBR Green PCR Master smešom (#4367659, Thermo Fisher Scientific). Sekvence prajmera za SNCA, TMEM106B, i GAPDH gene su bile: 5'- AAG AGG GTG TTC TCT ATG TAG GC -3' (SEQ ID NO: 71), 5'- GCT CCT CCA ACA TTT GTC ACT T -3' (SEQ ID NO: 72) za SNCA, 5'-ACA CAG TAC CTA CCG TTA TAG CA-3' (SEQ ID NO: 73), 5'-TGT TGT CAC AGT AAC TTG CAT CA-3' (SEQ ID NO: 74) za TMEM106B i 5'- CTG GGC TAC ACT GAG CAC C -3' (SEQ ID NO: 75), 5'- AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG -3' (SEQ ID NO: 76) za GAPDH. Kvantitativni PCR je izveden u QuantStudio 3 sistemu za PCR u stvarnom vremenu (Thermo Fisher Scientific). Nivoi ekspresije su normalizovani prema opšteprisutnom genu GAPDH i izračunati korišćenjem komparativnog CT postupka.
[0542] Analiza dijagnostičkog slikanja fluorescencije
[0544] EGFP reporterski plazmidi, koji sadrže 3'-UTR ljudskog SNCA gena nizvodno od EGFP kodirajućeg regiona, korišćeni su za
[0545] validaciju SNCA i TMEM106B nokdaun plazmida. EGFP reporterski plazmidi i kandidatski nokaut plazmidi su istovremeno transfektovani u HEK293 ćelije postavljene poli-L-lizinom prevučene ploče s 96 bunarića
[0546] (3,0 × 10<4>ćelija/bunariću) korišćenjem reagensa za transfekciju Lipofectamine 2000 (0,04 µg reporterskog plazmida, 0,06 µg nokdaun plazmida i 0,3 µl reagensa u 10 µl rastvora Opti-MEM). Nakon 72 časa, intenziteti fluorescencije EGFP signala su izmereni pri ekscitaciji od 488 nm/emisiji 512 nm korišćenjem Varioskan LUX multimodalnog čitača (Thermo Fisher Scientific). Ćelije su fiksirane s 4 % PFA na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta i inkubirane s D-PBS-om koji sadrži 40 µg/ml 7-aminoaktinomicina D (7-AAD) tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja s D-PBS-om, intenziteti fluorescencije 7-AAD signala su izmereni pri ekscitaciji od 546 nm/emisiji 647 nm korišćenjem Varioskan čitača da bi se kvantifikovao broj ćelija. Normalizovani EGFP signal po nivoima 7-AAD signala su upoređeni s kontrolnim nokdaun uzorcima.
[0548] Enzimom povezani imunosorbentni test (ELISA)
[0550] Reporterski plazmidi α-sinukleina, koji sadrže 3'-UTR
[0551] ljudskog SNCA gena ili TMEM106B gena nizvodno od SNCA kodirajućeg regiona, su korišćeni za validaciju nokdaun plazmida na nivou proteina. Nivoi proteina αsinukleina su utvrđeni ELISA testom (#KHB0061, Thermo Fisher Scientific) korišćenjem lizata ekstrahovanih iz HEK293 ćelija. Kandidatski plazmidi su prolazno transfektovani u HEK293 ćelije postavljene u ploče s 48 bunarića
[0552] (7,5 ×10<4>ćelija/bunariću) korišćenjem reagensa za transfekciju Lipofectamine 2000 (0,1 µg reporterskog plazmida, 0,15 µg nokdaun plazmida i 0,75 µl reagensa u 25 µl rastvora Opti-MEM). Nakon 72 časa, ćelije su lizirane u puferu testa radioimunoprecipitacije (RIPA) (#89900, Thermo Fisher Scientific) nadopunjenom koktelom inhibitora proteaze (#P8340, Sigma-Aldrich) i podvrgnute sonikaciji tokom nekoliko sekundi. Nakon inkubacije na ledu tokom 30 min, lizati su centrifugirani pri 20.000 × g na 4 °C tokom 15 min i supernatant je prikupljen. Kvantifikovani su nivoi proteina. Ploče su očitane u Varioskan čitaču ploča na 450 nm i koncentracije su izračunate korišćenjem softvera SoftMax Pro 5. Izmerene koncentracije proteina su normalizovane prema ukupnoj koncentraciji proteina utvrđenoj testom bicinhoninske kiseline (#23225, Thermo Fisher Scientific).
[0554] SL.37 i Tabela 4 prikazuju reprezentativne podatke koji ukazuju na uspešno gašenje SNCA in vitro putem GFP reporterskog testa (gore) i α-Syn testa (dole). SL.38 i Tabela 5 prikazuju reprezentativne podatke koji ukazuju na uspešno gašenje TMEM106B in vitro putem GFP reporterskog testa (gore) i α-Syn testa (dole).
[0555] Tabela 4
[0558]
[0560] Tabela 5:
[0563]
[0565] Primer 11: Postavljanje „D“ sekvence ITR-a i transdukcija ćelija Istražen je efekat postavljanja „D“ sekvence ITR-a na transdukciju ćelija rAAV vektora. HEK293 ćelije su transducirane sa rAAV-ovima koji kodiraju Gcazu, koji imaju 1) ITR-ove divljeg tipa (npr., „D“ sekvence proksimalno spram transgenog umetka i distalno spram terminusa ITR-a) ili 2) ITR-ove s
[0566] „D“ sekvencom koja se nalazi na „spoljašnjosti“ vektora (npr., „D“ sekvenca se nalazi proksimalno spram terminusa ITR-a i distalno spram transgenog umetka), kako je prikazano na SL.20. Iznenađujuće, podaci ukazuju da rAAV-ovi koji imaju „D“ sekvencu koja se nalazi u „spoljašnjem“ položaju zadržavaju sposobnost da budu pakovane i efikasno transduciraju ćelije (SL.40).
[0568] Primer 12: In vitro testiranje rAAV-ova progranulina
[0570] SL. 39 je šema koja prikazuje jedno otelotvorenje vektora koji sadrži ekspresioni konstrukt koji kodira PGRN. Progranulin se prekomerno eksprimira u CNS-u glodara s deficitom GRN, bilo heterozigotnim ili homozigotnim za deleciju GRN-a, putem ubrizgavanja rAAV vektora koji kodira PGRN (npr., kodonski optimizovani PGRN), bilo intraparenhimnim ili intratekalnim ubrizgavanjem, kao što je u cisternu magnu.
[0572] Miševi se ubrizgavaju s 2 meseca ili 6 meseci starosti i sazrevaju 6 meseci ili 12 meseci i analiziraju se na jedno ili više od sledećeg: spašavanje nivoa ekspresije GRN-a na nivoima RNK i proteina, bihevijoralnih testova (npr., poboljšano kretanje), testova preživljavanja (npr., poboljšano preživljavanje), mikroglije i inflamatornih markera, glioze, neuronskog gubitka, lipofuscinoze i/ili lizozomnih markera nakupljanja, kao što je LAMP1. Testovi na miševima s deficitom PGRN-a su opisani, na primer, u Arrant i sar. (2017.) Brain 140: 1477– 1465; Arrant i sar. (2018.) J. Neuroscience 38(9):2341–2358; i Amado i sar.
[0573] (2018.) doi:https://doi.org/10.1101/30869.
[0575] Primer 13: In vitro i in vivo testiranje rAAV-a progranulina
[0577] In vitro i in vivo testovi su izvedeni da bi se analizirali efekti rAAV konstrukta (PR006 (takođe se naziva PR006A); pogledajte SL.64) koji kodira protein progranulin (PGRN). PR006 sadrži kapsid koji ima AAV9 serotip.
[0579] Neklinička in vitro ispitivanja
[0581] Ekspresija progranulina derivirana iz PR006A u HEK293T ćelijama Istražena je sposobnost PR006A da indukuje produkciju proteina progranulina u ćelijskom kontekstu. HEK293T ćelije su transducirane s PR006A u rasponu višestrukosti infekcije (MOI) u rasponu od 2,1 × 10<5>do 3,3 × 10<6>vektorskih genoma (vg)/ćeliji. Transdukcija PR006A je dovela do robusnog, od doze zavisnog povećanja ekspresije i izlučivanja u ćelijski medijum proteina progranulina (SL.60). Značajno niži nivoi proteina progranulina, koji oslikavaju ekspresiju deriviranu iz endogenog ljudskog GRN gena, su detektovani u negativnoj kontrolnoj grupi lečenoj samim ekscipijentom (namenjenim kliničkim vehikulumom).
[0583] Efikasnost u FTD-GRN neuronima deriviranim iz iPSC-a
[0585] Izveden je test za analizu efikasnosti rAAV konstrukta in vitro u ljudskim neuronskim kulturama FTD-GRN (frontotemporalne demencije s GRN mutacijom). Ćelijske kulture su dobijene iz Repozitorija ljudskih ćelija i podataka (engl. Human Cell and Data Repository, NHCDR) Nacionalnog instituta za neurološke bolesti i moždane udare (engl. National Institute of Neurological Disorders and Stroke, NINDS): Materijali ND50015 (FTD-GRN, M1L), ND50060 (FTD-GRN, R493X) i ND38555 (kontrola, divlji tip) (pogledajte Tabelu 6).
[0587] Tabela 6: Sažetak karakteristika iPSC ćelijske linije
[0589]
[0592] Da bi se ustanovio ćelijski model koji je patološki relevantan spram FTD-GRN-a, iPSC-ovi iz svake linije su diferencirani u neuronske ćelije korišćenjem protokola u dva koraka. U prvom koraku, iPSC-ovi su diferencirani u linije proliferativnih neuronskih matičnih ćelija (engl. neuronal stem cell, NSC), kojima je nedostajala ekspresija markera pluripotencije (tj. Oct4 i SSEA1) i koji su dobili ekspresiju markera neuronskih matičnih ćelija (tj. SOX2, Nestin, SOX1 i PAX6), kako je detektovano imunofluorescencijskim obeležavanjem.
[0594] Kontrolne i FTD-GRN NSC linije su posejane pri jednakoj gustoći i, 48 časova kasnije, ekspresija progranulina je izmerena enzimom povezanim imunosorbentnim testom (ELISA) u ćelijskim lizatima (intracelularni progranulin) (SL. 52E) i ćelijskom medijumu (izlučeni progranulin) (SL.52A). Ekspresija progranulina je normalizovana prema ukupnoj koncentraciji proteina da bi se uračunale razlike u broju ćelija (n = 3; srednja vrednost ± SEM). NSC linije s heterozigotnim GRN mutacijama su imale značajno niže nivoe intracelularnog i izlučenog progranulina u poređenju s kontrolnim NSC-ovima, s ekspresijom FTD-GRN NSC-ova od ~25–50 % endogenih nivoa progranulina. Ovo je sugerisalo da ovaj FTD-GRN ćelijski model potvrđuje klinički deficit progranulina zapažen kod pacijenata s FTD-GRN-om, koji eksprimiraju jednu trećinu do jedne polovine normalnih nivoa progranulina u plazmi (Finch i sar., Brain 132, 583–591 (2009.); Ghidoni i sar., Neurology 71, 1235–1239, (2008.); Sleegers i sar., Ann Neurol 65, 603–609 (2009.)).
[0596] NSC-ovi iz svih ćelijskih linija su diferencirani u neuronske kulture. Nakon što je ustanovljeno da NSC-ovi derivirani iz iPSC-a pokazuju smanjenu ekspresiju progranulina, linije su diferencirane u neurone da bi se generisao klinički reprezentativan tip ćelije za neklinička ispitivanja efikasnosti PR006A. NSC-ovi su posejani u medijum za diferencijaciju, terminalno diferencirani u postmitotične neurone tokom perioda od 7 dana i zatim procenjeni na ekspresiju neuronskih markera (tj., MAP2, NeuN, Tau, Tuj1, NF-H) putem imunofluorescencije (SL.52G). I kontrolne i FTD-GRN NSC ćelijske linije izvedene iz iPSC-a su se efikasno diferencirale u neurone korišćenjem ovog protokola.
[0598] FTD-GRN neuronske kulture derivirane iz iPSC-a su korišćene za ocenu efikasnosti PR006A in vitro. FTD-GRN neuroni su lečeni ekscipijentom ili s PR006A pri MOI-ovima od 2,7 × 10<5>, 5,3 × 10<5>ili 1,1 × 10<6>vg/ćeliji. Transdukcija PR006 je dovela do robusne, od doze zavisne ekspresije izlučenog progranulina, kako je izmereno ELISA testom, u svim ćelijskim linijama (SL.52B). Ekscipijentom lečeni kontrolni i FTD-GRN neuroni su procenjeni na endogene nivoe progranulina. Kontrolni neuroni su eksprimirali endogeni izlučeni progranulin, dok u FTD-GRN neuronima nije detektovan izlučeni progranulin (SL.52B). Analiza linearne regresije je potvrdila značajnu korelaciju između doze PR006A i nivoa progranulina u obe FTD-GRN ćelijske linije (p = 3,5 × 10<-13>). Ovi rezultati pokazuju da lečenje s PR006A dovodi do povišenog izlučivanja progranulina u FTD-GRN neuronskom modelu.
[0600] Poznato je da progranulin stimuliše sazrevanje lizozomne proteaze katepsina D (CTSD), čiji je gubitak funkcije takođe impliciran u poremećajima lizozomnog skladištenja i neurodegeneraciji. CTSD je eksprimiran kao neaktivni pro-protein pune dužine (proCTSD) koji prolazi proteolitičku obradu u enzimski aktivnu zrelu proteazu (matCTSD). Prijavljeno je da progranulin deluje kao molekularni pratilac koji se vezuje za proCTSD da bi unapredio njegovo sazrevanje u matCTSD proteazu. U FTD-GRN neuronskim kulturama, transdukcija PR006 je spasila defektivno sazrevanje katepsina D (SL.52C). Kontrolni, FTD-GRN #1, i FTD-GRN #2 neuroni su transducirani s PR006A ili ekscipijentom. MOI od 5,3 × 10<5>PR006A je korišćen za eksperimente efikasnosti pošto je obnovio nivoe progranulina na najmanje 2-struko onih u kontrolnim ćelijama (SL.52B). Za ocenu efikasnosti, nivoi ekspresije proCTSD i matCTSD su izmereni u ćelijskim lizatima korišćenjem automatizovane Simple Western<™>(Jess) platforme (SL. 52C). Ekscipijentom lečeni FTD-GRN neuroni su imali niži udeo matCTSD spram proCTSD u poređenju s ekscipijentom lečenim kontrolnim neuronima; Lečenje s PR006A značajno je povećalo udeo u obe FTD-GRN neuronske linije (SL.52C). U kontrolnim neuronima, odnos matCTSD spram proCTSD nije značajno promenjen lečenjem s PR006A. Ovin nalazi pokazuju da PR006A obnavlja lizozomnom funkcijom povezani fenotip u FTD-GRN neuronima.
[0602] U normalnim neuronima, TDP-43 (transaktivni responzivni DNK vezujući protein 43 kDa) protein je lokalizovan u nukleusu. U post-mortem mozgovima pacijenata s FTD-GRN-om, zapaženo je nakupljanje TDP-43 u citoplazmi neurona i nakupljanje TDP-43 u nukleusu je smanjeno. FTD neuroni imaju smanjenu količinu TDP-43 u nukleusu, što dovodi do nakupljanja i nizvodne toksičnosti u neuronima. Pošto Grn KO ne ponavljaju u potpunosti ovu TDP-43 patologiju, neuroni derivirani iz indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija (iPSC) su koristan FTD-GRN model za izučavanje biologije TDP-43. Smanjeno nakupljanje TDP-43 u nukleusu i povećano nakupljanje nerastvorljivog TDP-43 su prijavljeni u neuronima deriviranim iz iPSC-a od pacijenata s FTD-GRN-om, relativno spram kontrolnih neurona koji ne nose GRN mutaciju, kako je opisano u Valdez i sar. (Human Molecular Genetics 26, 4861–4872 (2017.)). PR006A transdukcija neuronskih kultura iz obe linije nosača FTD-GRN mutacije je poništila abnormalnosti TDP-43, dovodeći do smanjenja nerastvorljivog TDP-43 (mereno korišćenjem Simple Western<™>(Jess) platforme (SL.52D)) i povećane lokalizacije TDP-43 (mereno korišćenjem imunofluorescencije (SL.52F)).
[0604] U sažetku, PR006 transdukcija je obnovila defektivno sazrevanje u lizozomnom enzimu, katepsinu D i poboljšala patologiju abnormalnog TDP-43 u FTD-GRN neuronima.
[0606] Neklinička in vivo ispitivanja
[0608] Efikasnost i biodistribucija u sazrelim Grn nokaut miševima
[0609] Efikasnost PR006A in vivo i maksimalna doza PR006A su ocenjeni u Grn nokaut (KO) mišijem modelu. U Grn KO mišijem modelu korišćenom u ispitivanjima (B6(Cg)-Grn<tm1.1Aidi>/J (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), egzoni 1–4 se brišu iz ciljanog progranulin (Grn) gena (Yin i sar., J Exp Med 207, 117– 128 (2010.)). Ove životinje imaju potpuni gubitak progranulina, pokazuju fenotipe zavisne od starosti, uključujući lizozomske promene, nakupljanje neuronskog lipofuscina, nakupljanje ubikvitina, mikrogliozu i neuroinflamaciju i stoga imaju široku upotrebu u modeliranju FTD-GRN-a. Uloženi su svi mogući napori za eliminaciju pristrasnosti u ispitivanju; miševi su raspoređeni u lečene grupe koje su balansirane prema rodu i telesnoj težini i zaslepljena procena eksperimentalnih krajnjih tačaka je sprovedena od strane kvalifikovanog osoblja.
[0611] U početnim ispitivanjima, PR006A je isporučen zrelim Grn KO miševima pri dozi od 9,7 × 10<10>vg (2,4 × 10<11>vg/g mozga), što je bila najviša ostvariva doza u vreme ispitivanja zbog ograničenja zapremine ubrizgavanja i fizičkog titra virusnog lota korišćenog u ispitivanju. Korišćeni su zreli miševi, pošto se mnogi fenotipovi povezani s FTD-GRN-om, uključujući inflamaciju i mikrogliozu CNS-a razvijaju na način zavisan od starosti, s pojavom najistaknutijih manifestacija fenotipova između 12–24 meseca starosti.
[0612] U ispitivanjima sa zrelim Grn KO miševima, PR006A je primenjen jednim intracerebroventrikularnim (ICV) ubrizgavanjem. 10 µl ekscipijenta (namenjenog kliničkog vehikuluma; 20 mM Tris pH 8,0, 200 mM NaCl i 1 mM MgCl2 0,001 % Pluronic F68) ili 9,7 × 10<10>vg PR006A (2,4 × 10<11>vg/g mozga [na osnovu težine mozga odraslog miša od 400 mg]) je isporučeno ICV ubrizgavanjem dvema kohortama zrelih Grn KO miševa: (1) starim 16 meseci u vreme ubrizgavanja (n = 4/grupi; PRV-2018-027; SL.61) i (2) starim 14 meseci u vreme ubrizgavanja (planirano n = 3/grupi; PRV-2019-002; SL.61). Životinje su žrtvovane dva meseca nakon ubrizgavanja.
[0614] U ispitivanju PRV-2018-027, jedna doza PR006A je isporučena miševima starim 16 meseci, sa sledećim lečenim grupama:
[0617]
[0620] Zbog nepredviđenih otklona u ispitivanju (grešaka u genotipizaciji i prevremenog gubitka životinja), ispitivanje PRV-2019-002 (kohorta stara 14 meseci) je uključila samo 1 miša u ekscipijentom lečenoj grupi umesto planiranih n = 3. Nizak broj uzoraka je statističku analizu učinio nemogućom i stoga je to ispitivanje isključeno iz daljnjeg razmatranja. Međutim, nalazi iz ispitivanja su bili uporedivi s onima iz ispitivanja PRV-2018-027.
[0622] Biodistribucija i ekspresija progranulina: Biodistribucija je utvrđena merenjem prisustva vektorskog genoma korišćenjem qPCR testa koji ispunjava trenutne standarde Centra za ocenu bioloških sredstava i istraživanja (engl.
[0623] Center for Biologics Evaluation and Research, CBER) / Ureda za tkiva i napredne terapije (engl. Office of Tissues and Advanced Therapies, OTAT) Američke uprave za hranu i lekove (engl. U.S. Food and Drug Administration) za osetljivost PCR-a (s prisustvom > 50 vektorskih genoma po 1 µg genomskog DNK definisanim kao pozitivnim). Svi miševi koji su primili PR006A su bili pozitivni na vektorske genome u cerebralnom korteksu i kičmenoj moždini, što ukazuje da ICV primena uspešno dovodi do transdukcije PR006A u mozgu i CNS-u (SL.59A). ICV PR006A je doveo do značajnih nivoa ljudskog proteina progranulina u CNS-u (mozgu, kičmenoj moždini) Grn KO miševa, dok, kako je i očekivano, ljudski progranulin nije bilo moguće detektovati u miševima koji su primili ekscipijent (SL.59B). Pošto je progranulin primarno izlučeni protein, ekspresija u CSF-u može se smatrati surogatom produkcije proteina unutar mozga i predstavlja potencijalnu translacionu krajnju tačku za pacijente s FTD-GRN-om koji imaju smanjene nivoe progranulina u CSF-u. Uspešno smo detektovali ljudski progranulin u CSF-u miševa lečenih s PR006A, ali zbog malog obima uzoraka i tehničkih ograničenja dobijanja dovoljne zapremine CSF-a kod miševa, merenja nivoa progranulina u CSF-u su bili ispod niže granice kvantifikacije (LLOQ) testa (SL.59C).
[0625] ICV primena je takođe dovela do širokog prisustva vektorskog genoma i nivoa proteina progranulina u perifernim tkivima, uključujući jetru, srce, pluća, bubreg, slezinu i polne žlezde (SL.62A–SL. 62B). Dodatno tome, značajni nivoi ljudskog progranulina mogli su se detektovati u PR006A-lečenim Grn KO miševima. Kao što je očekivano, ljudski progranulin nije detektovan u ekscipijentom lečenim Grn KO miševima.
[0627] Nakupljanje lipofuscina: Nakupljanje neuronskih lipofuscina, elektronski gustog, autoflorescentnog materijala koji se nakuplja progresivno tokom vremena u lizozomi postmitotičkih ćelija i indikator je lizozomne disfunkcije, i karakterističan je starosno zavisni fenotip Grn KO miševa. Nakupljanje lipofuscina je procenjeno korišćenjem dva nezavisna postupka u susednim odeljcima mozga: (1) u više kliničkom pristupu, nakupljanje lipofuscina u mozgu je ocenjeno od strane zaslepljenog patologa na skali od 0 (nije zapažen lipofuscin) do 4 (rasprostranjeno nakupljanje lipofuscina) i (2) u više kvantitativnom pristupu, autoflorescencija lipofuscina je detektovana imunohistohemijom (IHC) i automatski kvantifikovana. Grn KO miševi su pokazali značajnu lipofuscinozu u celom mozgu i ICV lečenje s PR006A je smanjilo ocenu težine lipofuscina u cerebralnom korteksu, hipokampusu i talamusu (SL.59D). Kvantizacija nakupljanja lipofuscina iz IHC slika je takođe detektovala smanjenu lipofuscinozu s lečenjem s PR006A u sva tri regiona mozga. Pošto su ubikvitin pozitivne inkluzije definišuća patološka karateristika pacijenata s FTD-GRN-om koje se takođe nakupljaju u Grn KO mišijem modelu na starosno zavisan način, IHC je izveden i kvantifikovan u regionima mozga od interesa (cerebralnom korteksu, hipokampusu, talamusu) da bi se procenilo nakupljanje ubikvitina. Lečenje s PR006A značajno je smanjilo nakupljanje ubikvitina u Grn KO miševima (SL.59E). Ovi nalazi sugerišu da PR006A poboljšava lizozomnu disfunkciju u Grn KO mišijem modelu FTD-GRN-a.
[0629] Neuroinflamacija: Hronična inflamacija CNS-a je patološka karakteristika mozga pacijenata s FTD-GRN-om koja se ponavlja u Grn KO miševima na starosno zavisan način. Progranulin ima antiinflamatorne efekte u mišijim modelima FTD-GRN i gubitak progranulina dovodi do regulacije naviše proinflamatornih citokina, uključujući TNFα. U ovom ispitivanju, lečenje s PR006A je suzbilo nivoe inflamatornih markera u zrelim Grn KO miševima. ICV PR006A je smanjio ekspresiju gena proinflamatornog citokina Tnf (TNFα) i Cd68 (CD68), markera mikroglije, u cerebralnom korteksu (SL.59F). Nivoi proteina TNFα su takođe smanjeni u uzorcima cerebralnog korteksa iz PR006A-lečenih Grn KO miševa korišćenjem Mesoscale Discovery mišijeg proinflamatornog testa citokina (SL.59G). Da bi se dodatno ocenila neuroinflamacija, imunohistohemija (IHC) je izvedena za Iba1, marker mikroglioze i GFAP, marker astrocitoze i kvantifikovana u regionima mozga od interesa (cerebralnom korteksu, hipokampusu, talamusu). Lečenje s PR006A je dovelo do trenda ka smanjenoj mikrogliozi (Iba1) ali nije uticalo na astrocitozu (GFAP) u Grn KO miševima (SL.59H; SL.59I). Uzeti zajedno, ovi rezultati ukazuju da lečenje s PR006A smanjuje neuroinflamaciju u zrelim jedinkama Grn KO mišijeg modela FTD-GRN-a.
[0631] Histopatologija: kroz histopatalošku analizu, od strane zaslepljenog certifikovanog patologa, bojenja mozga, torakalne kičmene moždine, jetre, srca, slezine, pluća i bubrega svih miševa iz ovih ispitivanja hematoksilinom i eozinom (H&E) nisu otkriveni neželjeni događaji povezani s lečenjem s PR006A. Primena PR006A na Grn KO miševe je dovela do smanjene incidencije i/ili težine nalaza koji su karakteristični za model, uključujući smanjenje u ocenama frekvencije i/ili težine neuronske nekroze u meduli i ponsu. Dodatno tome, došlo je do smanjenja i u incidenciji i u težini aksonske degradacije u torakalnoj kičmenoj moždini s lečenjem s PR006A. Ovi nalazi su detaljno razmotreni u odeljku Toksikologija u nastavku.
[0633] Zaključak: ICV PR006A pri dozi od 9,7 × 10<10>vg (2,4 × 10<11>vg/g mozga) je doveo do širokog prisustva vektorskog genom u celom mozgu i perifernim tkivima u zrelim Grn KO miševima. Lečenje s PR006A je povećalo globalnu ekspresiju progranulina. Dodatno tome, PR006A je smanjio nakupljanje lipofuscina i ubikvitina u mozgu, patologije za koje je poznato da se pojavljuju i u Grn KO mišijem modelu i pacijentima s FTD-GRN-om. PR006A je takođe smanjio ekspresiju proinflamatornih citokina i aktivaciju imunih ćelija u cerebralnom korteksu, fenotipove koji su indikativni za hroničnu inflamaciju CNS-a.
[0635] Efikasnost raspona doza u odraslim Grn nokaut miševima
[0637] Da bi se dodatno procenile efikasne doze PR006A, izvedeno je veće ispitivanje s rasponom doza u odraslim Grn KO miševima. U PRV-2019-004, 10 µl ekscipijenta (namenjenog kliničkog vehikuluma; 20 mM Tris pH 8,0, 200 mM NaCl i 1 mM MgCl2 0,001 % Pluronic F68) ili PR006A je isporučeno putem ICV-a životinjama starim 4 meseca. Ovi odrasli miševi su korišćeni umesto zrelih Grn KO miševa jer potonji nisu bili dostupni u dovoljnom broju za sprovođenje ispitivanja s rasponom doza. Dok odrasli Grn KO miševi imaju blaži fenotip od zrelih miševa, i dalje pokazuju lizozomne defekte i neuroinflamatorne promene i stoga su pogodni za ocenu raspona efikasne doze PR006A. Da bi se ocenila efikasnost PR006A u širokom rasponu virusnih doza, PR006A je primenjen pri 1,1 × 10<11>vg
[0638] (2,7 × 10<11>vg/g mozga), najvišoj ostvarivoj dozi u vreme ispitivanja zbog ograničenja zapremine ubrizgavanja i fizičkog titra virusnog lota korišćenog u ispitivanju, srednjoj dozi od 1,1 × 10<10>vg (2,7 × 10<10>vg/g mozga) ili niskoj dozi od 1,1 × 10<9>vg (2,7 × 10<9>vg/g mozga), s punom log razlikom koja obuhvata svaku dozu. Detalji eksperimentalnog dizajna su dati na SL.63.
[0640] Testirane su tri doze PR006A, s 10 miševa (4M/6F) po grupi:
[0643]
[0644] Starosno spareni miševi istog pozadinskog soja kao Grn KO miševi s Grn alelima divljeg tipa (engl. wild type, WT) (C57BL/6J miševi stari 7 meseci) služili su kao kontrola za odabrane krajnje tačke efikasnosti u ovom ispitivanju.
[0647]
[0650] Biodistribucija i ekspresija progranulina: Biodistribucija je utvrđena merenjem prisustva vektorskog genoma korišćenjem qPCR testa koji ispunjava trenutne standarde CBER/OTAT Američke uprave za hranu i lekove (engl. U.S. Food and Drug Administration) za osetljivost PCR-a (s prisustvom > 50 vektorskih genoma po µg genomskog DNK definisanim kao pozitivnim). Miševi koji su primili PR006A su bili pozitivni na vektorske genome u cerebralnom korteksu i kičmenoj moždini na način zavisan od doze, što ukazuje da ICV primena uspešno dovodi do transdukcije PR006A u CNS-u (SL.53A). qRT-PCR analiza PR006A-kodiranog GRN otkrila je da je ICV doziranje PR006A dovelo do dozno zavisne indukcije ekspresije ljudskog GRN mRNK u cerebralnom korteksu (SL.53B). Lečenje s PR006A je povećalo nivoe ljudskog proteina progranulina u mozgu i kičmenoj moždini (SL.53C). U moždanom tkivu, nivoi ljudskog progranulina su detektovani i kvantifikovani pri najvišoj dozi PR006A; pri nižim dozama, nivoi progranulina su bili ispod granice detekcije testa zbog visokog pozadinskog šuma u mozgu. Međutim, na osnovu log-struke razlike između doza, proporcionalna procena očekivanih nivoa progranulina pri nižim dozama bi bila znatno ispod niže granice kvantizacije (LLOQ) testa u moždanom tkivu. Nivo endogenog mišijeg progranulina je izmeren u starosno i sojno sparenim miševima s Grn alelima divljeg tipa (WT); i u cerebralnom korteksu i u kičmenoj moždini, nivoi ljudskog progranulina u PR006A-lečenim Grn KO miševima nisu prelazili nivo endogenog progranulina u WT miševima pri bilo kojoj dozi. Pošto su za merenje ljudskog i mišijeg progranulina korišćeni različiti testovi za detekciju koji koriste antiprogranulinska antitela koja nisu unakrsno reaktivna između vrsta, apsolutni brojevi se ne mogu s tačnošću uporediti.
[0651] Primena PR006A je takođe dovela do širokog prisustva vektorskog genoma i nivoa proteina progranulina u perifernim tkivima, uključujući jetru, srce, pluća, bubreg, slezinu i polne žlezde (SL.53D; SL.53E).
[0653] U plazmi, značajni nivoi ljudskog progranulina su detektovani u PR006A-lečenim Grn KO miševima pri svim nivoima doze (SL.53F). U skladu s očekivanjima, ljudski progranulin nije detektovan u ekscipijentom lečenim Grn KO miševima. Nivoi ljudskog progranulina u životinjama lečenim srednjom dozom PR006A bili su u istom rasponu kao nivoi mišijeg progranulina izmereni u miševima s Grn alelima divljeg tipa (WT). Pošto su za merenje ljudskog i mišijeg progranulina korišćeni različiti testovi za detekciju koji koriste antiprogranulinska antitela koja nisu unakrsno reaktivna između vrsta, apsolutni brojevi se ne mogu s tačnošću uporediti.
[0655] Nakupljanje lipofuscina: Nakupljanje lipofuscina je procenjeno korišćenjem dva nezavisna postupka u susednim odeljcima mozga: (1) u više kliničkom pristupu, nakupljanje lipofuscina u mozgu je ocenjeno od strane zaslepljenog patologa na skali od 0 (nije zapažen lipofuscin) do 4 (rasprostranjeno nakupljanje lipofuscina) i (2) u više kvantitativnom pristupu, autoflorescencija lipofuscina je detektovana imunohistohemijom (IHC) i automatski kvantifikovana. Grn KO miševi su pokazali lipfuscinozu u celom mozgu, dok miševi divljeg tipa (WT) nisu imali lipofuscin u mozgu koji se može detektovati (SL. 53G). ICV primena PR006A je dovela do dozno zavisnog smanjenja ocena težine intracelularnog nakupljanja lipofuscina u mozgovima Grn KO miševa (SL.53G). Efikasnost PR006A u pogledu smanjenja lipofuscinoze najlakše bi se mogla kvantifikovati u regionima mozga koji pokazuju najrobusniji fenotip lipofuscinoze Grn KO mišijeg modela FTD-GRN-a, uključujući hipokampus i talamus. Dodatno uz ocenjivanje lipofuscina od strane patologa, IHC izveden u regionima mozga od interesa (tj., cerebralnom korteksu, hipokampusu, talamusu) da bi se kvantitativno procenila lipofuscinoza je detektovao dozno zavisno smanjenje količine nakupljanja lipofuscina u moždanim regionima cerebralnog korteksa i talamusa, uz pojavu značajnih smanjenja pri srednjim i visokim dozama PR006A. IHC je takođe izveden da bi se procenilo nakupljanje ubikvitina u mozgu, dodatna FTD-GRN-om povezana patologija koja se pojavljuje u Grn KO miševima. U poređenju s miševima divljeg tipa (WT), Grn KO miševi su pokazali povećanje ubikvitina u celom mozgu (SL.
[0656] 53H). PR006A je značajno smanjio veličinu imunoreaktivnog objekta ubikvitina skoro na nivoe divljeg tipa (WT) pri sve tri doze (SL.53H).
[0658] Neuroinflamacija: Lečenje s PR006A je suzbilo nivoe inflamatornih markera u mozgu odraslih Grn KO miševa. ICV PR006A je smanjio ekspresiju gena proinflamatornog citokina Tnf (TNFα) i Cd68 (CD68), markera mikroglije, u korteksu u rasponu doza od 2,7 × 10<9>vg/g mozga do 2,7 × 10<11>vg/g mozga (SL.
[0659] 53I). U skladu s objavljenim podacima, zapazili smo povećanje u ekspresiji gena ovih neuroinflamatornih markera u ekscipijentom lečenim Grn KO miševima u poređenju sa starosno sparenim miševima s Grn alelima divljeg tipa (SL.53I). U kontrastu s 18 meseci starim zrelim Grn KO miševima iz PRV-2018-027 i abnormalnostima TNFα prijavljenim u literaturi, nije bilo robusnog povećanja u nivoima TNFα proteina u cerebralnom korteksu kod 7 meseci starih odraslih ekscipijentom lečenih Grn KO miševa; dodatno tome, nisu zapažene značajne promene s PR006A u Grn KO miševima. Ovi nalazi su dosledni prethodno objavljenim nalazima da se robusni neuroinflamatorni fenotipovi ne pojavljuju u Grn KO mišijem modelu do 12–24 meseci starosti. Imunohistohemija (IHC) je izvedena i kvantifikovana u moždanim regionima od interesa (cerebralnom korteksu, hipokampusu i talamusu) da bi se dodatno ocenila neuronska inflamacija bojenjem za Iba1, marker mikroglioze i GFAP, marker astrocitoze. Došlo je do značajnog povećanja mikroglioze (Iba1) i astrocitoze (GFAP) u celom mozgu u Grn KO miševima u poređenju s miševima divljeg tipa (WT) (SL.53J–SL. 53K). Lečenje s PR006A značajno je smanjilo mikrogliozu (Iba1) pri sve tri doze (SL. 53J). Trend ka smanjenoj astrocitozi (GFAP) je zapažen pri srednjoj dozi PR006A i značajno smanjenje astrocitoze (GFAP) je zapaženo pri visokoj dozi PR006A u moždanom regionu talamusa (SL.53K).
[0661] Dok se mnogi fenotipovi Grn KO mišijeg modela pojavljuju kasnije u životu, u ispitivanjima je prijavljeno da Grn KO miševi pokazuju rasprostranjene promene u ekspresiji gena već sa 4 meseca starosti, uključujući promene u lizozomnim i imunim putevima. Stoga, dodatno uz ciljanu qRT-PCR analizu opisanu u prethodnome, korišćen je transkriptomijski pristup za ocenu promena u nivoima mRNK, koji može da se proceni globalno uz osetljive tehnologije visoke propusnosti (sekvenciranje RNK) i zahtevaju minimalnu količinu uzorkovanog materijala. Izveli smo sekvenciranje RNK na cerebralnim korteksima i koristili analizu varijacije skupa gena (GSVA) (Hanzelmann i sar., BMC Bioinformatics 14, 7 (2013.)) da bismo utvrdili koji su putevi ekspresije gena promenjeni u 7 meseci starim ekscipijentom
[0662] lečenim Grn KO miševima, u poređenju sa starosno sparenim miševima divljeg tipa (WT) istog soja. Potvridili smo deficijencije u lizozomnim i imuno povezanim putevima u miševima kojima nedostaje Grn, kao što je prijavljeno u prethodno objavljenim ispitivanjima. Značajne promene su prijavljene u podskupu GO TERM (GO:0005773) „Vakuola“ genima (sadrže 4 gena za koje je prijavljeno da su disregulisani u Grn KO miševima opisanim u Lui i sar (Cell 165, 921–935 (2016.))), skupa „Lizozomnih gena“ (podskupa 25 lizozomima povezanih gena za koje je pokazano da su disregulisani u Grn KO miševima opisanim u Evers i sar. (Cell Reports 20, 2565– 2574 (2017.))) i seta gena „Komplemenata“ iz HALLMARK baze podataka analize obogaćivanja skupa gena (sadrži gene koji kodiraju komponente sistema komplemenata, dela urođenog imunog sistema). Zatim smo izmerili i uporedili nivoe aktivnosti tih skupova gena s lečenjem s PR006A (SL.53L–FIG.53N). Lečenje s PR006A na dozno zavisan način je poništilo deficijencije skupa gena zapažene u Grn KO miševima.
[0664] histopatologija: Iscrpna histopataloška analiza izvedena od strane zaslepljenog certifikovanog patologa na bojenju mozga, torakalne kičmene moždine, jetre, srca, slezine, pluća, bubrega i polnih žlezda svih miševa iz ovih ispitivanja hematoksilinom i eozinom (H&E) nisu otkriveni neželjeni događaji povezani s lečenjem s PR006A. Detalji analiza toksičnosti su obezbeđeni u odeljku u nastavku.
[0666] Zaključak: ICV PR006A pri dozama u rasponu od 2,7 × 10<9>vg/g mozga do 2,7 × 10<11>vg/g mozga doveli su do širokog prisustva vektorskog genoma u celom mozgu i perifernim tkivima na dozno zavisan način. Lečenje s PR006A takođe je dovelo do produkcije mRNK i proteina progranulina u CNS-u. Jasan odnos doze i odgovora između PR006A i smanjene lipofuscinoze, očitanje lizozomne disfunkcije, zapaženo je u više moždanih regiona. Robusno i statistički značajno smanjenje lipofuscinoze je zapaženo pri srednjem i najvišem nivou doze PR006A. Sve doze PR006A su smanjile nakupljanje ubikvitina u mozgu. Počevši s najnižom dozom od 2,7 × 10<9>vg/g mozga, PR006A je smanjio ekspresiju proinflamatornih markera u mozgu na nivou RNK i na nivou proteina.
[0667] Sažetak: Neklinička in Vivo ispitivanja
[0669] PR006A je efektivno transducirao Grn KO miševe, dovodeći do robusne, dozno zavisne distribucije transgena i produkcije mRNK i proteina progranulina u CNS-u. PR006A je dozno zavisno poništio abnormalnosti ekspresije gena u lizozomnim i neuroinflamatornim putevima. PR006A je smanjio mnoge fenotipove koji se pojavljuju u mozgu ovog FTD-GRN mišijeg modela, uključujući lipofuscinozu, nakupljanje ubikvitina i mikrogliozu. U ispitivanju s rasponom doza, najniža doza od 2,7 × 10<9>vg/g mozga PR006A značajno je suzbila ekspresiju inflamatornih markera u cerebralnom korteksu. Srednja doza od 2,7 × 10<10>vg/g mozga PR006A poboljšala je i lizozomne defekte (npr., lipofuscinozu) i neuroinflamaciju, na robustan i statistički značajan način. Visoka doza od 2,7 × 10<11>vg/g mozga PR006A dodatno je povećala ekspresiju progranulina bez naznaka toksičnosti
[0671] Tabela 7: Sažetak biodistribucije
[0673]
[0676] Bezbednosna farmakologija
[0678] U svim ovim ispitivanjima, nije bilo neželjenih događaja koji bi se mogli pripisati testnom artiklu. Bezbednosni nalazi iz analiza za vreme života i histopatoloških analiza životinja u PRV-2018-027, PRV-2019-002 i PRV-2019-004 se razmatraju u odeljku u nastavku.
[0680] Toksičnost jedne doze
[0681] Niz nekliničkih ispitivanja s PR006A je sprovedeno, u istraživanju bezbednosnih krajnjih tačaka kod miševa i majmuna. Tri ispitivanja su izvedena u Grn KO mišijem modelu, naznačenom time što su krajnje tačke uključivale neuropatološke ocene i procenjivale zaštitnu aktivnost kao i potencijalnu toksičnost nastalu primenom PR006A putem intracerebroventrikularnog (ICV) ubrizgavanja; ICM primena je tehnički teža kod miševa. Ovi mišiji modeli su reprezentativni za FTD-GRN, u kom pacijenti imaju mutaciju u GRN genu koja dovodi do smanjenih nivoa progranulina. U majmunima rakojedima, neuropatologija je takođe izvedena kao deo pilot ispitivanja u kom je PR006A ubrizgan u cisternu magnu (ICM).
[0682] Sprovedeno je GLP ispitivanje na majmunima rakojedima, u kom je PR006A isporučen u ICM i majmuni su žrtvovani 7. dana, 30. dana ili 183. dana. GLP ispitivanje je uključivalo iscrpnu listu kliničkih krajnjih tačaka dodatno uz ocene anatomske patologije na punoj listi tkiva. U svrhu podrške primene u jednoj dozi u klinici, sprovedene su sledeća ispitivanja s jednom dozom.
[0684] Maksimalna doza PR006A u zreloj jedinki FTD-GRN mišijeg model (PRV-2018-027 and PRV-2019-002)
[0686] Kao deo ovih ispitivanja efikasnosti u Grn KO miševima, neuropatološka ocenjivanja su sprovedena na miševima ICV lečenim miševima ili s ekscipijentom ili s PR006A. Grn KO miševi imaju potpuni gubitak progranulina i naširoko su korišćeni kao modeli FTD-GRN-a zbog starosno zavisnih fenotipova, koji uključuju lizozomne promene, neuronsko nakupljanje lipofuscina, mikrogliozu i neuroinflamaciju. Aspekti farmakoloških delova ispitivanja su sažeti u odeljcima u prethodnome, dok su toksikologijom povezane krajnje tačke koje su procenjene u ovom ispitivanju sažete u nastavku. Dva ispitivanja PR006A su sprovedena na zrelom Grn KO mišijem modelu. U prvom ispitivanju (PRV-2018-027), 9 Grn KO miševa mešovitog roda starih 16 meseci je primilo ICV primenu ili PR006A ili ekscipijenta. Životinje su žrtvovane 9 nedelja nakon primene. U ovo istraživanje je uključena grupa s jednom dozom PR006A: 10 µl nerazređenog virusa, za ukupnu dozu od 9,7 × 10<10>vg
[0687] (2,4 × 10<11>vg/g mozga) i kontrolna grupa je lečena s 10 µl ekscipijenta.
[0689] Tabela 8: Dizajn ispitivanja PRV-2018-027
[0690]
[0693] Razne post-mortem krajnje tačke, kao što je biodistribucija, lizozomne promene i inflamatorni markeri, ocenjeni su kao deo protokola ovog ispitivanja (pogledajte prethodni odeljak). Životinje su takođe pregledane na preživljavanje dvaput dnevno i telesna težina je merena jednom dnevno. Nakon eutanazije 2 meseca nakon lečenja, ciljna tkiva su prikuplja, fiksirana uranjanjem u ohlađeni 4 % paraformaldehid i skladištena na 4 °C. Tkiva iz 8 životinja koje su dovršile ispitivanje su izrezana, obrađena i ugrađena u parafinske blokove. Razedeljena su na ~5 µm, obojena hematoksilinom i eozinom (H&E) i pregledana od strane certifikovanog veterinarskog patologa.
[0695] Tokom ovog ispitivanja, 1 miš iz lečene grupe je prevremeno uginuo; nisu zabeležene abnormalnosti kod uginule životinje tokom nekropsije i stoga nije poznat uzrok smrti. Nisu uočene druge smrti ili abnormalnosti. Sve lečene grupe su imale sličan tok u pogledu telesnih težina, bez prisustva značajnih razlika.
[0697] U histopatološkom pregledu, nije bilo neželjenih nalaza povezanih s PR006A. Nakupljanje lipofuscina u mozgu je bilo rasprostranjeno, dosljedno očekivanim nalazima u Grn KO mišu. U životinjama lečenim s PR006A, došlo je do smanjenja ocene težine nakupljanja lipofuscina u svim regionima mozga.
[0698] Delovalo je da morfološke promene takođe pokazuju blago smanjenje ocena frekvencije i/ili težine, posebno u pogledu neuronske nekroze u meduli i ponsu, s lečenjem s PR006A. Međutim, ovi trendovi u morfološkim promenama nisu bili jednako dosledni kao ocene lipofuscina.
[0700] U torakalnoj kičmenoj moždini, došlo je do aksonalne degeneracije i, veoma retko (1 od 4 životinje u svakoj grupi) je zapažena minimalna neuronska nekroza. Takođe je došlo do malog smanjenja incidencije i težine aksonalne degeneracije kod životinja lečenih s PR006A.
[0701] Sledeći nalazi, koji su, pretpostavlja se, povezani s Grn homozigotnim nokaut mišem, deluju da imaju smanjenu incidenciju i/ili težinu kod životinja lečenih s PR006A: proširene tubule u meduli bubrega, glomerulopatija u bubregu, strani materijal u plućima (karakterisan kao linearne, nećelijske, tamno roze strukture, obično unutar disajnih puteva i često povezane sa stranim telima džinovskih ćelija i/ili makrofaga). Za definitivnije zaključke bi bila potrebna veća kohorta životinja.
[0703] Svi ostali zapaženi histopatološki nalazi su smatrani slučajnima i/ili su bili slične incidencije i težine kod ekscipijentom i testnim artiklom lečenih životinja i stoga su smatrani nepovezanim s primenom PR006A.
[0705] U drugom ispitivanju (PRV-2019-002), 5 Grn KO miševa mešovitog roda starih 14 meseci je primilo ICV primenu ili PR006A ili ekscipijenta. Životinje su žrtvovane 8 nedelja nakon primene. U ovo istraživanje je uključena grupa s jednom dozom PR006A: 10 µl nerazređenog virusa, za ukupnu dozu od 9,7 × 10<10>vg (2,4 × 10<11>vg/g mozga) i kontrolna grupa je lečena s 10 µl ekscipijenta.
[0707] Tabela 9: Dizajn ispitivanja PRV-2019-002
[0709]
[0712] Životinje su analizirane na identičan način kao u ispitivanju PRV-2018-027. Životinje su pregledane na preživljavanje dvaput dnevno i telesna težina je merena jednom dnevno. Nakon eutanazije 2 meseca nakon lečenja, ciljna tkiva su prikuplja, fiksirana uranjanjem u ohlađeni 4 % paraformaldehid i skladištena na 4 °C do ocenjivanja.
[0714] U CNS-u, nalazi dosledni onima prethodno zapaženim kod Grn KO miša su zapaženi u mozgu (Yin i sar., J Exp Med 207(1):117–128 (2010.)).
[0715] Tačnije, došlo je do rasprostranjenog povećanja nakupljanja lipofuscina u celom mozgu. U retkim slučajevima zapažena je i minimalna neuronska nekroza (u jednoj prerano uginuloj nelečenoj životinji i jednoj životinji lečenoj ekscipijentom).
[0717] Zbog malog broja uzoraka nije bilo moguće pokazati dosledan trend u nalazima povezanim s lečenjem. Nije bilo dosledne razlike u odgovoru između testnog artikla (PR006A) i ekscipijenta.
[0719] Za tkiva koja nisu deo CNS-a, nalazi koji su smatrani doslednima fenotipu Grn KO miševima su zapaženi u bubregu (tubularna dilatacija i infiltrati mononukleusnih inflamatornih ćelija) i jetri (vakuolacija Kupfer ćelija / ćelija sinusoidne sluzokože i mikrogranulom Kupfer ćelija) (Yin i sar., J Exp Med 207(1):117–128 (2010.)).
[0721] Utvrđen je nalaz „glomerulopatije“ zapažene kod svih životinja koje su podvrgnute hirurškom zahvatu i uključene u ispitivanje. Iako objavljeni izveštaji ovog nalaza kao promene povezane sa standardnim, neupitnim, Grn nokaut miševima nisu pronađeni, jedno ispitivanje je pokazalo da miševi sa deficitom progranulina lečeni ishranom koja uključuje hiperhomocisteinemiju razvijaju zadebljanje glomerulane bazalne membrane i gubitak podocitnih stopalnih nastavaka (Fu i sar., Hypertension 69(2):259–266 (2017.)).
[0723] Svi drugi nalazi su bili dosledni onima uobičajeno zapaženim u laboratorijskim miševima. Zbog malog broja uzoraka, nije bilo moguće pokazati jasnu razliku povezanu s lečenjem.
[0725] Raspon doza PR006A kod odraslog FTD-GRN mišijeg modela (PRV-2019-004)
[0727] Da bi se dodatno procenila bezbednost PR006A, izvedeno je veće ispitivanje s rasponom doza na odraslim Grn KO miševima. Ukupno 40 miševa mešovitog roda je podeljeno u 4 grupe i na njih je primenjen ili ekscipijent ili jedna od tri doze PR006A jednim unilateralnim ICV ubrizgavanjem u levu hemisferu; sve životinje, nezavisno od grupe lečenja, primilo je ukupnu zapreminu doze od 10 µl. Miševi su lečeni s 4 meseca starosti i eutanizirani 3 meseca nakon lečenja.
[0728] Dodatna kontrolna grupa divljeg tipa (WT), koja je uključivala nelečene C57BL/6J miševe (istog pozadinskog soja) sazrele na približno 7 meseci, takođe su eutanizirani i podvrgnuti sličnoj nekropsiji.
[0730] Ispitivanje je sprovedeno prema dizajnu ispitivanja u nastavku:
[0732] Tabela 10: Dizajn ispitivanja PRV-2019-004
[0734]
[0737] Tokom ispitivanja, životinje su proverene na preživljavanje dvaput dnevno i vagane jednom nedeljno. Miševi su eutanizirani 3 meseca nakon lečenja i razne post-morten ocene su sprovedene da bi se procenila efikasnost PR006A (pogledajte prethodni odeljak). Dodatno tome, odeljci obojeni za H&E iz mozga, torakalne kičmene moždine, jetre, srca, slezine, pluća, bubrega i polnih žlezda su ocenjeni od strane certifikovanog patologa.
[0739] U histopataloškom pregledu, nije bilo neželjenih nalaza povezanih s PR006A u bilo kom od miševa nezavisno od grupe lečenja.
[0741] Bilo je nalaza doslednih s fenotipom Grn KO mišijeg modela, kao što je nakupljanje intracelularnog lipofuscina u raznim regionima mozga: cerebralnom korteksu, cerebralnim nukleusima, hipokampusu, talamusu/hipotalamusu, cerebelumu i moždanom stablu (posebno ponsu i meduli). Jasni znakovi morfoloških promena u H&E obojenim odeljcima (vakuolacija neurona i glioza) nisu zapaženi. Nakupljanje pigmenta lipofuscina može da prethodi morfološkim promenama koje se mogu lako detektovati i stoga služi kao adekvatan biomarker efikasnosti. Dok su sve Grn homozigotne KO grupe pokazale nakupljanje lipofuscina, bilo je razlika u težini ovog nalaza između lečenih grupa. Frekvencija viših ocena za nakupljanje lipofuscina je bila najveća za grupe životinja lečene ekscipijentom (grupa 1). Od životinja lečenih s PR006A, frekvencija viših ocena je zapažena u grupi 4 (niska doza PR006A; 2,7 × 10<9>vg/g mozga), praćeno grupom 3 (srednja doza PR006A; 2,7 × 10<10>vg/g mozga). Najniže ocene težine su zapažene u grupi 2 (visoka doza PR006A; 2,7 × 10<11>vg/g mozga). Ovi nalazi pokazuju dozno zavisno smanjenje ocena težine intracelularnog nakupljanja lipofuscina u mozgovima Grn homozigotnih nokaut miševa. Svi ostali histopatološki nalazi su smatrani slučajnima i/ili su bili slične incidencije i težine kod ekscipijentom i testnim artiklom lečenih životinja i stoga su smatrani nepovezanim s primenom PR006A.
[0743] GLP ispitivanje jedne doze na majmunima (PRV-2018-028)
[0744] Dizajn ispitivanja
[0746] Svrha ovog GLP ispitivanja je bila da se proceni toksičnost i biodistribucija testnog artikla PR006A kada primeni jedanput intracerebroventrikularnim ubrizgavanjem kod majmuna rakojeda s 6-dnevnim, 29-dnevnim ili 182-dnevnim periodom praćenja nakon primene; životinje su žrtvovane 7. dana, 30. dana ili 183. dana ispitivanja. Ispitivanje je dizajnirano da se ocene 2 nivoa doze: najviša doza je maksimalna zamisliva doza ostvariva s 1,2 ml zapremine (najveća zapremina za koju je postojalo iskustvo u primeni) nerazređenog PR006A i niža doza koja je ekvivalentna jednoj log jedinici nižoj od visoke doze. Doze su jednake niskoj dozi od 4,8 × 10<11>vg i visokoj dozi od 4,8 × 10<12>vg; s procenjenom težinom mozga od 74 g kod majmuna rakojeda, NHP vrste korišćene u ovom ispitivanju, to znači približno 6,5 × 10<9>vg/g mozga i 6,5 × 10<10>vg/g mozga. Ispitivanje takođe uključuje kontrolnu granu u kojoj životinje primaju 1,2 ml samog ekscipijenta (20 mM Tris pH 8,0, 200 mM NaCl i 1 mM MgCl2 0,001 % [tež./zapr.] Pluronic F68). Ispitivanje je koristilo i mužjake i ženke majmuna rakojeda. Grupa 7. dana je uključivala 1 ženku na najvišoj dozi i bila je dizajnirana kao izviđač za ranu toksičnost; preostale dve vremenske tačke (30. dan i 183. dan) su uključivale 2 mužjaka i 1 ženku na svakoj od doza. Dodatno uz uzorke iz više moždanih regiona, prikupljeni su uzorci perifernih tkiva za qPCR analizu. Svi uzorci koji su bili pozitivni u qPCR-u su analizirani na ekspresiju transgena. Tabelarni sažetak dizajna ovog ispitivanja je obezbeđen u Tabeli 11.
[0747]
[0748]
[0749]
[0752] NHP-ovi majmuna rakojeda su procenjeni višestrukim opsrevacijama i merenjima za vreme života, uključujući mortalitet/morbiditet (svakodnevno), kliničke opservacije (svakodnevno), telesnu težinu (osnovnu vrednost i nedeljno nakon toga), vizuelni pregled unosa hrane (svakodnevno), neurološke opservacije (osnovne vrednosti i tokom 2. i 26. nedelje) i elektrokardiografska (EKG) merenja (osnovne vrednosti i tokom 2. i 26. nedelje).
[0754] Analiza neutralizirajućih antitela (nAb) spram AAV9 kapsida je izvedena u osnovnoj vrednosti i pri žrtvovanju 7., 30. ili 183. dana. Klinička patologija, koja se sastojala od hematologije, koagulacije, kliničke hemije i urinalize je izvedena dvaput u osnovnoj vrednosti (nalazi krvi; jednom za urinalizu) i jednom tokom 1. i 13. nedelje faze doziranja.
[0756] Životinje su eutanizirane i tkiva su prikupljena 7., 30. ili 183. dana. Tkiva navedena u Tabeli 11, ako su prisutna, su prikupljena od svih životinja, izvagana (ako je primenjivo) i podeljena na replikate. Jedan replikat je konzerviran u 10 % neutralno puferovanom formalinu (osim kada su za optimalno fiksiranje potrebna posebna sredstva za fiksiranje) za histopatološko ocenjivanje (sve životinje).
[0757] Dodatni replikati su prikupljeni za qPCR i analizu ekspresije transgena.
[0759] Bezbednost i toksikologija
[0761] Nije bilo neplaniranih smrti i sve su životinje preživele do planirane nekropsije. Nije bilo neželjenih kliničkih opservacija povezanih s PR006A, promena telesne težine, oftalmičkih opservacija ili nalaza fizičkih ili neuroloških pregleda; grubi makroskopski pregled prilikom nekropsije nije pokazao lekom povezane abnormalnosti u bilo kojoj od kohorti. Dodatno tome, nije bilo promena intervala PR, trajanja QRS, korigovanog intervala QT (QTc) ili broja otkucaja srca povezanih s PR006A zapaženih u mužjacima ili kombinovanim polovima na koje je primenjeno 6,5 × 10<9>ili 6,5 × 10<10>vg/g mozga. Nisu zapaženi abnormalni oblici talasa EKG-a niti aritmije tokom kvalitativne procene EKG-ova.
[0763] Biodistribucija
[0765] Analiza biodistribucije transgena PR006A je izvedena korišćenjem testa zasnovanog na qPCR-u.183. dana je u grupi visoke doze (6,5 × 10<10>vg/g mozga) došlo do rasprostranjene transdukcije kroz celi CNS i periferiju, s tim da su sva pregledana tkiva bila pozitivna na prisustvo vektora s granicom od 50 vg/µg DNK, nižom granicom kvantizacije za qPCR test. Podaci iz odabranih reprezentativnih regiona iz 183. dana su prikazani na SL.54A; Podaci za 30. dan nisu prikazani. 30. dana su u grupi visoke doze (6,5 × 10<10>vg/g mozga) sva pregledana tkiva CNS-a bila pozitivna na transdukciju, uz izuzetak putamena. Tkiva iz životinja lečenih niskom dozom (6,5 × 10<9>vg/g mozga) su bila pozitivna u CNS-u 183. dana, ali su od perifernih tkiva bila pozitivna samo tkiva slezine i jetre. Dodatno tome, jedna ženka NHP lečena visokom dozom PR006A je bila pozitivna u jajnicima 7. dana, a mužjaci lečeni visokom dozom su bili pozitivni u testisima 30. dana i 183. dana. Transdukcija PR006A je bila najrobusnija u jetri i tkivima nervnog sistema i dosledno niža u drugim pregledanim perifernim organima. U mozgu, vektor transdukcije se stabilizovao 183. dana, u poređenju s 30. danom, pokazujući robusnu i trajnu transdukciju transgena.
[0766] U NHP-ovima koji su primali ICM primenu PR006A, došlo je do značajnog alogenog imunog odgovora na transgeni produkt, progranulin, s antiprogranulin antitelima detektovanim u uzorcima seruma i CSF-a prikupljenim 30. dana i 183. dana nakon lečenja. imuni odgovor ukazuje da je protein ljudskog progranulina bio eksprimiran u NHP-ovima. Nivoi antilek antitela (engl. antidrug antibody, ADA) su utvrđeni ustanovljenim tehnologijama imunog testiranja. Podaci su ilustrovani na SL.54B.
[0768] Ekspresija PR006A (GRN) je izmerena na nivou mRNK korišćenjem testa zanovanog na RT-qPCR-u i na nivou proteina korišćenjem Simple Western<™>(Jess) analize. Podudarno s nivoima transdukcije PR006A, ekspresija transgena je zapažena merenjima mRNK korišćenjem RT-qPCR-a u odabranim regionima mozga (SL.54C), jetri, polnim žlezdama, kičmenoj moždini i DRG-u prikupljenim 183. dana.
[0770] Ekspresija transgena je bila merljiva u mozgu i jetri pri obe doze PR006A i nivoi ekspresije su bili i zavisni od doze i trajni. U polnim žlezdama, ekspresija je kod mužjaka bila merljiva samo pri visokoj dozi; kod ženki je pri obe doze ekspresija bila merljiva 7. i 30. dana, ali ne i 183. dana.
[0772] Da bi se potvrdilo da se ljudski progranulin proizvodi u lečenim NHP-ovima, nivoi proteina u CSF-u su ocenjeni na Simple Western<™>(Jess) platformi. Detalji ovog postupka su obezbeđeni u primeru 14. Postupak je bio kvalifikovan merenjem nivoa progranulina u uzorcima CSF-a iz pacijenata s FTD-GRN-om i ustanovljavanjem da su približno pola nivoa izmerenih u uzorcima CSF-a iz zdravih ljudskih kontrola i iz pacijenata s FTD-om bez GRN mutacije. Rezultati iz CSF-a ukazuju da su nivoi progranulina bili povišeni na način zavisan od doze kod životinja lečenih niskom dozom kao i onih lečenih visokom dozom PR006A (SL. 54D). Ovi rezultati ukazuju da efektivna i široka transdukcija PR006A u NHP-ovima nakon ICM primene dovodi do povećanih nivoa progranulina.
[0774] Merenja proteina progranulina su bila fokusirana na CSF, pošto Simple Western<™>(Jess) test nije pogodan za merenje nivoa progranulina u moždanom tkivu zbog visokog nivoa pozadinskih traka. Trenutno dostupni testovi ne mere na pouzdan način nivoe ljudskog progranulina deriviranog iz transgena u NHP tkivima zbog visokog nivoa nespecifičnog pozadinskog šuma. Uopšteno se veruje da nivoi u CSF-u oslikavaju relevantne koncentracije u mozgu i od posebne su vrednosti za kliničke studije kao tranlsacioni biomarkeri.
[0776] Sažetak
[0778] Nije bilo neželjenih bezbednosnih nalaza ili zabrinutosti za toksičnost u bilo kom od nekliničkih ispitivanja, uključujući malo pilot ispitivanje koje nije bilo prema GLP-u na NHP-ovima i GLP ispitivanje na NHP-ovima do 183. dana, koje bi sprečile početak kliničkog ispitivanja. Patološki nalazi u GLP ispitivanju su bili dosledno minimalni po težini, s niskim brojem pogođenih ćelija u obe dozne grupe. Nije bilo drugih neželjenih nalaza tokom života ili post-mortem vezanih za PR006A.
[0780] Ispitivanje faze 1/2 na ljudskim subjektima s FTD-GRN-om
[0782] Ljudski subjekti (n = 15) će biti uključeni u otvoreno ispitivanje PR006 rekombinantnog AAV-a. Kriteriji za uključivanje subjekta sadrže: 30–80 godina starosti (uključivo), ima patogenu GRN mutaciju, nalazi se u simptomatskoj fazi bolesti i ima stabilno korišćenje pozadinskih lekova pre doziranja ispitivanog produkta. Svaki subjekt će primiti ispitivani produkt kao jedno ICM (intra-cisterna magna) ubrizgavanje. Ispitivanje će uključivati očitanje biomarkera u trajanju od 3 meseca, kliničko očitanje u trajanju od 12 meseci i bezbednosnu i kliničku kontrolu u trajanju od 5 godina. Ispitivanje će analizirati: (1) bezbednost i podnošljivost: (2) ključne biomarkere, uključujući: progranulin, NfL (neurofilamentni laki lanca) i volumetrijski MR (dijagnostičko slikanje magnetnom rezonansom); i (3) Efikasnost: CDR plus NACC FTLD (klinička ocena demencije (engl. clinical dementia rating) plus frontalna temporalna lobularna demencija Nacionalnog Alchajmer centra za koordinaciju (engl. National Alzheimer's Coordinating Center Frontal Temporal Lobar Dementia)); mere ponašanja, kognicije, jezika, funkcije, i QoL (kvaliteta života (engl. quality of life)).
[0784] Tabela 12: Primeri neurodegenerativnih bolesti
[0786]
[0787]
[0789] Tabela 13: Primeri sinukleinopatija
[0792]
[0794] Tabela 14: Primeri tauopatija
[0796]
[0797]
[0799] Tabela 15: Primeri bolesti lizozomnog skladištenja
[0800]
[0801]
[0804] Primer 14: Automatizovani test zapadnog blota za detekciju progranulina u cerebrospinalnoj tečnosti
[0806] Svrha ovog eksperimenta je bila da se kvantifikuju nivoi proteina progranulina (PGRN) u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) korišćenjem ProteinSimple (San Jose, CA) Jess platforme automatizovanog zapadnog blota. Ovaj postupak testiranja može da se koristi za analiziranje uzoraka CSF-a neljudskog primata (engl. non-human primate, NHP). Da bi se utvrdili nivoi ekspresije proteina ljudskog progranulina, transgeni produkt PR006A, uzorci CSF-a iz subjekata, neljudskih primata, analizirani su na Simple Western<™>(Jess) platformi korišćenjem antitela koje specifično detektuje protein ljudskog progranulina. Simple Western<™>platforma je automatizovana platforma za imunotest zapadnog blota zasnovana na kapilarima, naznačena time što se svi koraci, uključujući odvajanje proteina, imunosondiranje, ispiranje i detekciju putem hemioluminescencije dešavaju na kapilarnoj patroni. Uzorci (pri 4-strukom razređenju) i primarno antitelo za ljudski progranulin (Adipogen PG-359-7, pri 10-strukom razređenju), dodatno uz sekundarna antitela i sve pufere koje proizvodi ProteinSimple, napunjeni su u prilagođenu patronu koja je obrađena na Jess platformi. Polovično kvantitativna analiza podataka se dešavala automatski nakon završetka svakog ciklusa, naznačeno time što su parametri kao što je intenzitet signala, vršna površina i odnos signala spram šuma izračunati korišćenjem Jess instrumenta. Za svaki pojedinačni uzorak, nivo progranulina je izmeren kao vršna površina imunoreaktivnosti na antitelo. Sve analize su izvedene sa zaslepljenim uzorcima.
[0808] Ovde opisani test je izveden na uzorcima CSF-a iz neljudskih primata u ispitivanju na životinjama. Uzorci CSF-a su testirani na prisustvo i nivoe proteina progranulina da bi se ispitala efikasnost genske terapije korišćenjem rAAV konstrukta (PR006; pogledajte SL.64) koji kodira protein progranulin (PGRN). U ovom ispitivanju ili ekscipijent ili PR006 su isporučeni pri niskoj dozi PR006 (1,8 × 10<10>vg/g težine mozga) ili visokoj dozi PR006 (1,8 × 10<11>vg/g težine mozga) ubrizgavanjem unutar cisterne magne (engl. intra-cisterna magna, ICM) NHP životinja. Svaka grupa se sastojala od 3 životinje. Devet NHP životinja je žrtvovano 180. dana nakon infekcije (Tabela 16) i uzorci CSF-a su analizirani korišćenjem testa zasnovanog na Jessu.
[0810] Tabela 16: Sažetak NHP životinja s grupisanjem i doziranjem
[0813]
[0815] Tabela 17: Materijal za automatizovani test zapadnog blota
[0816]
[0819] U izvođenju ovog postupka su praćene sledeće procedure:
[0820] Pripremanje standardnih rastvora:
[0822] 1. Pripremite 400 mM DTT rastvora dodavanjem 40 µl vode u providnu epruvetu u EZ Standard Pack modulu za odvajanje. Nežno promešajte.
[0824] 2. Da biste pripremili master smešu, dodajte 20 µl 10 × pufera za uzorak i 20 µl 400 mM DTT u EZ roze epruvetu za master smešu. Nežno promešajte.
[0826] 3. Da biste pripremili biotinilizovanu gradaciju, pipetirajte 20 µl vode u EZ providnu epruvetu za biotinilizovanu gradaciju s roze peletom. Nežno promešajte.
[0828] 4. Pripremite smešu luminola i peroksida dodavanjem jednake količine oba. Za jedan ciklus, dodajte 200 µl luminola u 200 µl peroksida.
[0830] 5. Pripremite razređenje primarnog antitela (10 struko razređenje) mešanjem 25 µl primarnog antitela i 225 µl razređivača antitela 2.
[0832] Pripremanje uzoraka:
[0834] 1. Uzorci su razređeni u 0,1 × puferu uzorka. Pripremite 0,1 × pufer uzorka dodavanjem 10 µl 10 × pufera uzorka u 990 µl vode.
[0835] 2. Razredite uzorke prema potrebi. Na primer, NHP uzroci CSF-a su razređeni 4-struko pre dodavanja u master smešu. Dodajte 5 µl NHP CSF-a u 15 µl 0,1 × pufera uzorka.
[0837] 3. Pripremite uzorke dodavanjem 1 × master smeše u 4 × uzorka. Da biste obradili tehničke duplikate, pripremite ukupno 15 µl uzorka plus master smeše po uzorku. Na primer, dodajte 3 µl master smeše u 12 µl razređenog uzorka. Nežno promešajte.
[0839] 4. Prokuvajte uzorke na 95 °C tokom 5 minuta.
[0841] 5. Nakratko centrifugirajte uzorke korišćenjem stone mini centrifuge. Vrtložno promešajte pre punjenja uzorka.
[0843] Napunite reagense i uzorke u patronu:
[0845] 1. Pipetirajte sve uzorke prema mapi patrone.
[0847] a. Pipetirajte 15 µl smeše luminol+peroksid u svaki bunarić u traci E.
[0848] b. Pipetirajte 10 µl streptavidina u prvi bunarić u traci D.
[0850] c. Pipetirajte 10 µl sekundarnog antitela u preostalih 24 bunarića u traci D.
[0852] d. Pipetirajte 10 µl razređenja antitela u prvi bunarić u traci C.
[0853] e. Pipetirajte 10 µl razređenja primarnog antitela u preostalih 24 bunarića u traci C.
[0855] f. Pipetirajte 10 µl razređivača antitela u sve bunariće u traci B.
[0856] g. Pipetirajte 10 µl pripremljene EZ gradacije u prvi bunarić u traci A.
[0857] h. Pipetirajte 5 µl rastvora uzorka i master smeše u trake za duplikate u traci A.
[0859] 2. Centrifugirajte patronu na sobnoj temperaturi pri 2500 o/min tokom 5 minuta.
[0860] Napunite kapilare i patronu u instrument:
[0862] 1. Napunite kapilare u utor. Proverite da li je svetlo postalo plavo.
[0863] 2. Napunite centrifugiranu patronu u instrument.
[0865] 3. Pritisnite dugme za početak nakon što plavo svetlo na instrumentu prestane treperiti.
[0867] Pogodnost sistema testiranja je smatrana prihvatljivom ako je procent CV-a (koeficijenta varijacije) za duplikate bio ≤ 30 %.
[0869] Pre nego je test korišćen za detektovanje progranulina u NHP uzorcima CSF-a, test je proveren kako sledi. Kvalifikacija Jess testova je uključivala procenu linearnost, selektivnosti i specifičnosti razređenja. Normalni uzorci CSF-a od kompanije BioIVT su korišćeni za utvrđivanje linearnosti razređenja u Jess testovima. Uzroci CSF-a iz pacijenata sa fronto-temporalnom demencijom (FTD) s mutacijom PGRN-a (dobijeni iz Nacionalnog centralizovanog repozitorija za Alchajmerovu bolest i povezane demencije (engl. National Centralized Repository for Alzheimer's Disease and Related Dementias, NCRAD; Indianapolis, Indiana)) su korišćeni za utvrđivanje selektivnosti i specifičnosti Jess testa.
[0871] Tabela 18: Sažetak rezultata
[0873]
[0874]
[0877] Rezultati i diskusija
[0879] Linearnost razređenja
[0881] Linearnost razređenja proteina PGRN detektovana Jessom je testirana u uzorcima CSF-a iz komercijalno dostupnih (BioIVT) normalnih pojedinaca.
[0882] Endogeni nivoi PGRN-a u uzorcima CSF-a su izmereni da bi se utvrdila linearnost razređenja. Dva pojedinca su testirana u 2-strukom serijskom razređenju u rasponu od 2 do 64 strukog razređenja.
[0884] Tabela 19 prijavljuje vršnu površinu proteina PGRN pri 58 kDa detektovanu Jessom i % razlika svakog razređenja iz 16-strukog razređenja.
[0885] Rezultati unutar raspona linearnosti su ispisani podebljanim znakovima (unutar 100 ± 30 % razlike). Ustanovljeno je da je linearnost razređenja unutar 4 do 16 strukog razređenja.
[0887] Tabela 19: Linearnost razređenja u uzorcima CSF-a
[0889]
[0890]
[0893] U sažetku, sve testirane matrice su imale prihvatljiv linearni raspon koji je ispunio kriterije za prihvatanje % razlike koji je 0 ± 30 %, iako je veličina raspona i količina razređenja bila promenljiva između matrica. Ustanovljeno je da je MRD linearnosti uzorka 4-struko razređenje. Ustanovljeno je da je linearnost razređenja unutar 4- do 16-strukog razređenja. Sažetak MRD-a i raspona linearnog razređenja koji ispunjavaju kriterijume za prihvatanje za CSF je prikazan u Tabeli 20.
[0895] Tabela 20: MRD i raspon linearnog razređenja CSF-a
[0898]
[0901] Selektivnost i specifičnost
[0903] Selektivnost i specifičnost proteina PGRN detektovanog Jessom su testirane u uzorcima CSF-a iz PR006 FTD pacijenata iz NCRAD-a. Prikupljene su tri grupe (grupa A, B i C) uzoraka CSF-a iz heterozigotnih FTD pacijenata (grupa A), familijarnih neprenosnika (grupa B ili C) i normalnih pojedinaca (grupa B ili C). Analizirano je šest uzoraka za svaku grupu. Grupe uzoraka navedene u Tabeli 16 Informacije o uzorku CSF-a pacijenta s FTD-om
[0905] Uzorci CSF-a su 4-struko razređeni u 0,1 × puferu uzorka obezbeđenom od strane ProteinSimple i testirani u tehničkim duplikatima.
[0906] Duplikati uzoraka sa rezultatom %CV većim od 20 % su ponovo analizirani. Rezultati s %CV manjim od 20 % su prijavljeni u Tabeli 22. Tabela 22 prijavljuje vršnu površinu proteina PGRN pri 58 kDa detektovanu Jessom i %CV između duplikata. Rezultati su pokazali oko dvostruko više nivoe PGRN-a u grupi B i C u poređenju s grupom A, što ukazuje na selektivnost i specifičnost za Jess test u određenim nivoima PGRN-a za uzorke CSF-a (SL.55).
[0908] Tabela 21: Informacije o uzorku CSF-a pacijenta s FTD-om
[0910]
[0911]
[0913] Tabela 22: Rezultati selektivnosti i specifičnosti
[0914]
[0915] Uzorci CSF-a iz ispitivanja na pacijentima s FTD-om (Tabela 21) takođe su analizirani kompletom za ELISA test ljudskog PGRN-a (Adipogen, AG-45A-0018YEK-KI01). Rezultati iz ELISA testa (SL.56) su pokazali slične trendove u nivoima PGRN-a između grupa kao Jess i pokazali su da je Jess test pogodan za upotrebu u proceni nivoa PGRN-a u uzorcima CSF-a.
[0917] U zaključku, utvrđeno je da je ProteinSimple Automated Western Jess test pogodan za upotrebu u proceni nivoa PGRN-a u NHP uzorcima CSF-a.
[0919] Jess podaci za NHP uzorke CSF-a su prikazani u Tabeli 23. Svaki uzorak predstavlja prosek između dva tehnička replikata. Vršna površina za traku od 58 kD u traci uzorka je prijavljena. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost vršne površine tehničkog replikata i podešena za višestrukost razređenja.
[0921] Tabela 23: Jess podaci za NHP uzorke CSF-a
[0924]
[0927] Cilj ovog testa je bio da se potvrdi nivo ekspresije proteina progranulina (PGRN) nakon transdukcije PR006 u tkivima regiona od interesa iz NHP ispitivanja. To je učinjeno korišćenjem automatizovane platforme zapadnog blota, u kom je protein progranulina detektovan korišćenjem monoklonalnog antitela. Ekspresija progranulina je bila merljiva u CSF-u i u kontroli i u NHP-u lečenom s PR006; test ne pravi razliku između endogenog proteina progranulina i PR006A-indukovanog proteina progranulina
[0929] Ova prijava se referiše na sledeće dokumente: Međunarodna PCT publikacija prijave br. WO 2019/070893; Međunarodna PCT publikacija prijave br. WO 2019/070891; Privremene prijave SAD serijskih brojeva 62/567,296, podnesene 3. oktobra 2017. pod naslovom „GENE THERAPIES FO LYSOSOMAL DISORDERS“; 62/567,311, podnesene 3. oktobra 2017. pod naslovom „GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS“; 62/567,319, podnesene 3. oktobra 2017. pod naslovom „GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL
[0930] DISORDERS“; 62/567,301, podnesene 3. oktobra 2018. pod naslovom „GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS“; 62/567,310, podnesene 3. oktobra 2017. pod naslovom „GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL
[0931] DISORDERS“; 62/567,303, podnesene 3. oktobra 2017. pod naslovom „GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS“; i 62/567,305, podnesene 3. oktobra 2017. pod naslovom „GENE THERAPIES FOR LYSOSOMAL DISORDERS“;
[0933] Iako je ovde opisano i ilustrovano više otelotvorenja predmetnog pronalaska, osoba s uobičajenim znanjem u predmetnoj oblasti će lako zamisliti razna druga sredstva i/ili strukture za izvođenje funkcija i/ili dobijanje rezultata i/ili jedne ili više ovde opisanih prednosti i svaka takva varijacija i/ili modifikacija smatra se sadržanom u obimu predmetnog pronalaska. Uopštenije, stručnjaci u predmetnoj oblasti će ceniti da su svi parametri, dimenzije, materijali i konfiguracije koje su ovde opisane namenjene da budu primerne i da će stvarni parametri, dimenzije, materijali i/ili konfiguracije zavisiti od specifične primene ili primena za koje/koja se predmetni pronalazak koristi. Stručnjaci u predmetnoj oblasti će prepoznati ili će biti u stanju uvideti, koristeći ništa više do rutinske eksperimentacije, mnoge ekvivalente specifičnih otelotvorenja pronalaska koja su ovde opisana. Stoga treba razumeti da su prethodno navedena otelotvorenja predstavljana samo u svrhu primera i da, unutar obima priloženih patentnih zahteva i njihovih ekvivalenata, pronalazak može da se praktikuje drugačije nego što je specifično opisano i navedeno u patentnim zahtevima. Predmetni pronalazak je usmeren na svaku pojedinu karakteristiku, sistem, artikal, materijal i/ili postupak koji je ovde opisan. Dodatno tome, sve kombinacije dve ili više takvih karakteristika, sistema, artikala, materijala i/ili postupaka, ako takve karakteristike, sistemi, artikli, materijali i/ili postupci nisu međusobno nedosledne, su uključene u obim predmetnog pronalaska.
[0935] Neodređeni oblici, kako se ovde koriste u specifikaciji i patentnim zahtevima, osim ako je jasno naznačeno drugačije, treba tumačiti u značenju „najmanje jedan“.
[0937] Fraza „i/ili“, kako se koristi ovde u specifikaciji i u patentnim zahtevima, treba da se razume u značenju „bilo koji ili oba“ tako povezana elementa, tj. elementa koji su sastavno prisutni u nekim slučajevima i rastavno prisutni u drugim slučajevima. Drugi elementi mogu opciono da budu prisutni, osim elemenata koji su specifično identifikovani klauzom „i/ili“, bilo da su povezani ili da su nepovezani sa onim elementima koji su specifično identifikovani, osim ako je jasno naznačeno suprotno. Tako, kao neograničavajući primer, referisanje na „A i/ili B“, kada se koristi zajedno sa neisključivim izrazima kao što je „koji sadrži“ može da se odnosi, u jednom otelotvorenju, na A bez B (opciono uključujući elemente osim B); u drugom otelotvorenju, na B bez B (opciono uključujući elemente osim A); u opet drugom otelotvorenju, na oba A i B (opciono uključujući druge elemente); itd.
[0939] Kako se koristi ovde u specifikaciji i u patentnim zahtevima „ili“ treba da se razume tako da ima isto značenje kao „i/ili“ kao što je u prethodnome definisano. Na primer, u razdvajanju stavki u listi, „ili“ ili „i/ili“ će se tumačiti kao uključivo, tj. uključivanje najmanje jednog, ali takođe uključujući više od jednog, od broja ili liste elemenata i opciono, dodatnih elemenata koji nisu navedeni u listi. Samo izrazi naznačeni suprotno, kao što je „samo jedan od“ ili „tačno jedan od“ ili, kada se koristi u patentnim zahtevima, „koji se sastoji od“ će se odnositi na uključivanje tačno jednog elementa određenog broja ili liste elemenata. Uopšteno, izraz „ili“, kako se ovde koristi, tumačiće se samo tako da naznačuje isključive alternative (tj. „jedan ili drugi, ali ne oba“) kada mu prethode izrazi isključivosti, kao što je „bilo koji od“, „jedan od“, „samo jedan od“ ili „tačno jedan od“.
[0941] Kako se koristi ovde u specifikaciji i u patentnim zahtevima, fraza „najmanje jedan“, u referisanju na listu jednog ili više elemenata, treba da se razume tako da znači najmanje jedan element odabran od bilo kojeg jednog ili više elemenata u listi elemenata, ali ne nužno uključujući najmanje jedan od svakog pojedinog elementa specifično navedenog unutar liste elemenata i ne isključujući bilo koje kombinacije elemenata u listi elemenata. Ova definicija takođe dozvoljava da opciono mogu da budu prisutni elementi osim elemenata specifično identifikovanih unutar liste elemenata na koje se fraza „najmanje jedan“ odnosi, bilo da su povezani ili nisu povezani sa onim elementima koji su specifično identifikovani. Tako, kao neograničavajući primer, „najmanje jedan od A i B“ (ili, ekvivalentno, „najmanje jedan od A i/ili B“) može da se odnosi, u jednom otelotvorenju, na najmanje jedan, opciono uključujući više od jednog A, bez prisustva B (i opciono uključujući elemente osim B); u drugom otelotvorenju, na najmanje jedan, opciono uključujući više od jednog B, bez prisustva A (i opciono uključujući elemente osim A); u opet drugom otelotvorenju, na najmanje jedan, opciono uključujući više od jednog A i najmanje jedan, opciono uključujući više od jednog B (i opciono uključujući druge elemente); itd.
[0943] Upotreba rednih brojeva, kao što je „prvi“, „drugi“, „treći“ itd., u patentnim zahtevima tako da modifikuju element patentnog zahteva sama po sebi ne označava bilo kakav prioritet, prednost ili redosled jednog elementa patentnog zahteva nad drugim ili vremenski raspored u kom se radnje postupka izvode, već se koriste samo kao oznake za razlikovanje jednog elementa patentnog zahteva koji ima određeno ime od drugog elementa koji ima isto ime (ako se ne koristi redni broj) da bi se razlikovali elementi patentnog zahteva.
[0945] Takođe treba razumeti da, osim ako je jasno naznačeno suprotno, u bilo kom postupku koji je ovde deo patentnog zahteva koji uključuje više od jednog koraka ili radnji postupka nije nužno ograničen na redosled u kom su koraci ili radnje postupka navedeni.
[0947] ______________________

Claims (14)

1. PATENTNI ZAHTEVI
1. Rekombinantni adeno asocirani virus (rAAV) koji sadrži:
(i) rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži ekspresioni konstrukt koji sadrži promoter operativno povezan s transgenskim umetkom koji kodira protein progranulin (PGRN), pri čemu transgenski umetak sadrži sekvencu nukleotida prema SEQ ID NO: 68; i
(ii) AAV9 kapsidni protein,
za upotrebu u lečenju subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima frontotemporalnu demenciju s GRN mutacijom.
2. rAAV za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačenu time što se rAAV primenjuje na subjekta u dozi u rasponu od oko 1 × 10<13>vektorskih genoma (vg) do oko 7 × 10<14>vg.
3. rAAV za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačenu time što se rAAV primenjuje ubrizgavanjem u cisternu magnu.
4. rAAV za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1–3, naznačenu time što promoter jeste promoter kokošijeg beta aktina (CBA).
5. rAAV za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1–4, naznačen time što rAAV vektor dodatno sadrži pojačivač citomegalovirusa (CMV).
6. rAAV za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1–5, naznačen time što rAAV vektor dodatno sadrži posttranskripcioni regulatorni element mrmotskog virusa hepatitisa (WPRE).
7. rAAV za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1–6, naznačen time što rAAV vektor dodatno sadrži rep poliA signala goveđeg hormona rasta.
8. rAAV za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1–7, naznačen time što nukleinska kiselina sadrži dve sekvence invertovanih terminalnih ponavljajućih nizova (ITR) adeno asociranih virusa na bokovima ekspresionog konstrukta, poželjno, pri čemu svaka ITR sekvenca jeste AAV2 ITR sekvenca divljeg tipa.
9. rAAV za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1–8, naznačen time što rAAV vektor dodatno sadrži TRY region između 5' ITR i ekspresionog vektora, pri čemu TRY region sadrži SEQ ID NO: 28.
10. rAAV koji sadrži:
(i) rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži, u 5' do 3' redosledu:
(a) AAV2 ITR;
(b) pojačivač CMV;
(c) promoter CBA;
(d) transgenski umetak koji kodira PGRN protein, pri čemu transgenski umetak sadrži sekvencu nukleotida prema SEQ ID NO: 68;
(e) WPRE;
(f) poliA signalni rep goveđeg hormona rasta; i
(g) AAV2 ITR; i
(ii) AAV9 kapsidni protein,
za upotrebu u lečenju subjekta koji ima ili za kog se sumnja da ima frontotemporalnu demenciju s GRN mutacijom.
11. rAAV za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačenu time što se rAAV primenjuje na subjekta u dozi u rasponu od oko 1 × 10<13>vg do oko
7 × 10<14>vg.
12. rAAV za upotrebu prema patentnom zahtevu 10 ili 11, naznačenu time što se rAAV primenjuje ubrizgavanjem u cisternu magnu.
13. rAAV za upotrebu prema bilo kom patentnom zahtevu 1–12, naznačenu time što se primenjuje u formulaciji koja sadrži oko 20 mM Tris, pH 8,0, oko 1 mM MgCl2, oko 200 mM NaCl i oko 0,001 % tež./zapr. poloksamera 188.
14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži
(i) rAAV koji sadrži:
(a) rAAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži ekspresioni konstrukt koji sadrži promoter operativno povezan s transgenskim umetkom koji kodira PGRN protein, pri čemu transgenski umetak sadrži sekvencu nukleotida prema SEQ ID NO: 68; i
(b) AAV9 kapsidni protein; i
(ii) oko 20 mM Tris, pH 8,0,
(iii) oko 1 mM MgCl2,
(iv) oko 200 mM NaCl i
(v) oko 0,001 % tež./zapr. poloksamera 188.
______________________
RS20251192A 2019-04-10 2020-04-10 Genske terapije za lizozomne poremećaje RS67476B1 (sr)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962831846P 2019-04-10 2019-04-10
US201962934450P 2019-11-12 2019-11-12
US201962954089P 2019-12-27 2019-12-27
US202062960471P 2020-01-13 2020-01-13
US202062988665P 2020-03-12 2020-03-12
EP20724262.9A EP3953377B1 (en) 2019-04-10 2020-04-10 Gene therapies for lysosomal disorders
PCT/US2020/027764 WO2020210698A1 (en) 2019-04-10 2020-04-10 Gene therapies for lysosomal disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67476B1 true RS67476B1 (sr) 2025-12-31

Family

ID=70554180

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20251192A RS67476B1 (sr) 2019-04-10 2020-04-10 Genske terapije za lizozomne poremećaje

Country Status (20)

Country Link
US (2) US11999974B2 (sr)
EP (2) EP3953377B1 (sr)
JP (1) JP7571044B2 (sr)
KR (1) KR20210150486A (sr)
CN (1) CN114174324A (sr)
AU (2) AU2020273182B2 (sr)
BR (1) BR112021020183A2 (sr)
CA (1) CA3136004A1 (sr)
DK (1) DK3953377T3 (sr)
ES (1) ES3055985T3 (sr)
FI (1) FI3953377T3 (sr)
HR (1) HRP20251506T1 (sr)
IL (1) IL286903A (sr)
LT (1) LT3953377T (sr)
MX (1) MX2021011958A (sr)
PL (1) PL3953377T3 (sr)
PT (1) PT3953377T (sr)
RS (1) RS67476B1 (sr)
SI (1) SI3953377T1 (sr)
WO (1) WO2020210698A1 (sr)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3051839A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
CN112501208A (zh) 2017-10-03 2021-03-16 普利维尔治疗公司 用于溶酶体障碍的基因疗法
BR112020006661A2 (pt) 2017-10-03 2020-10-13 Prevail Therapeutics, Inc. terapias de genes para distúrbios lipossomais
CA3136004A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
AU2021325891A1 (en) * 2020-08-10 2023-04-06 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for neurodegenerative disorders
EP4511482A4 (en) * 2022-04-19 2026-03-18 Shanghai Vitalgen Biopharma Co Ltd Recombinant AAV vectors for the treatment of neurodegenerative disorders
AU2023378899A1 (en) * 2022-11-13 2025-06-26 Alexion Pharma International Operations Limited Gene therapy for frontotemporal dementia
WO2024178352A2 (en) * 2023-02-24 2024-08-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bmp synthase activators and inhibitors
WO2025251041A1 (en) * 2024-05-31 2025-12-04 Bluerock Therapeutics Lp METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING PROGRANULIN DEFICIENCIES USING iPSC-DERIVED CELLS

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6538119B2 (en) 1997-11-18 2003-03-25 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US7056502B2 (en) 2000-04-28 2006-06-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with AAV5 capsids and AAV5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
JP2004516016A (ja) 2000-09-18 2004-06-03 ジェンザイム・コーポレイション ハイブリッドユビキチンプロモーターを含む発現ベクター
US20030133924A1 (en) 2001-12-21 2003-07-17 Novazyme Pharmaceuticals, Inc. Highly phosphorylated acid beta-glucocerebrosidase and methods of treating gaucher's disease
AU2003221733A1 (en) 2002-04-17 2003-11-03 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav vectors
WO2006036465A2 (en) 2004-09-03 2006-04-06 University Of Florida Compositions and methods for treating cystic fibrosis
US8486635B2 (en) 2006-05-30 2013-07-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting and treating dementia
EP2687223B2 (en) 2006-05-30 2024-11-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting and treating dementia
HUE031156T2 (en) 2006-06-07 2017-06-28 Genzyme Corp Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis and other spinal cord disorders
WO2008024998A2 (en) 2006-08-24 2008-02-28 Virovek, Inc. Expression in insect cells of genes with overlapping open reading frames, methods and compositions therefor
US20090176729A1 (en) 2007-12-14 2009-07-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method of treating neurodegenerative disease
WO2009089635A1 (en) 2008-01-16 2009-07-23 Neurodyn, Inc. Treating neurodegenerative diseases with progranulin (pgrn)
US9265843B2 (en) 2008-03-27 2016-02-23 The Ohio State University Treatment of metabolic-related disorders using hypothalamic gene transfer of BDNF and compositions therefor
HRP20250897T1 (hr) 2009-05-02 2025-09-26 Genzyme Corporation Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje
JP6312436B2 (ja) 2010-11-16 2018-04-18 ニューロダイン ライフ サイエンシズ インコーポレイテッドＮｅｕｒｏｄｙｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． ネプリライシンの発現および活性を増大させるための方法および医薬組成物
AU2013337354A1 (en) 2012-11-05 2015-05-21 Genzyme Corporation Compositions and methods for treating proteinopathies
CN115120746A (zh) 2013-05-15 2022-09-30 明尼苏达大学董事会 腺相关病毒介导的基因向中枢神经系统转移
MA40460A (fr) 2014-08-11 2016-02-18 Shire Human Genetic Therapies Ciblage lysosomial et utilisation correspondante
US10900053B2 (en) 2014-11-21 2021-01-26 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Genome-modified recombinant adeno-associated virus vectors
CA2985235A1 (en) 2015-05-07 2016-11-10 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Glucocerebrosidase gene therapy for parkinson's disease
EP3411484B1 (en) 2016-02-05 2023-10-04 Emory University Injection of single-stranded or self-complementary adeno-associated virus 9 into the cerebrospinal fluid
US20190328906A1 (en) 2016-03-02 2019-10-31 The Children's Hospital Of Philadelphia Therapy for frontotemporal dementia
JP7496667B2 (ja) 2016-04-21 2024-06-07 ビロベク，インコーポレイテッド 昆虫細胞中でのａａｖ生成、方法およびその組成物
AU2018346104B2 (en) 2017-10-03 2023-07-27 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
CN112501208A (zh) 2017-10-03 2021-03-16 普利维尔治疗公司 用于溶酶体障碍的基因疗法
BR112020006661A2 (pt) 2017-10-03 2020-10-13 Prevail Therapeutics, Inc. terapias de genes para distúrbios lipossomais
BR112020008033A2 (pt) 2017-10-23 2020-10-27 Prevail Therapeutics, Inc. terapias gênicas para doença neurodegenerativa
WO2019094253A1 (en) * 2017-11-08 2019-05-16 Avexis Inc. Means and method for preparing viral vectors and uses of same
CA3136004A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
WO2020210615A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
JP7664848B2 (ja) 2019-04-10 2025-04-18 プリベイル セラピューティクス，インコーポレーテッド リソソーム障害のための遺伝子療法
AU2021325891A1 (en) 2020-08-10 2023-04-06 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for neurodegenerative disorders

Also Published As

Publication number Publication date
FI3953377T3 (fi) 2025-11-26
JP7571044B2 (ja) 2024-10-22
US12516298B2 (en) 2026-01-06
IL286903A (en) 2021-10-31
AU2020273182B2 (en) 2025-11-20
ES3055985T3 (en) 2026-02-17
US11999974B2 (en) 2024-06-04
CN114174324A (zh) 2022-03-11
PT3953377T (pt) 2025-11-27
AU2020273182A1 (en) 2021-12-02
JP2022526823A (ja) 2022-05-26
MX2021011958A (es) 2021-12-15
WO2020210698A1 (en) 2020-10-15
LT3953377T (lt) 2025-12-10
KR20210150486A (ko) 2021-12-10
BR112021020183A2 (pt) 2022-03-03
EP3953377A1 (en) 2022-02-16
EP3953377B1 (en) 2025-09-17
AU2026201184A1 (en) 2026-03-26
JP2025016496A (ja) 2025-02-04
HRP20251506T1 (hr) 2026-01-02
SI3953377T1 (sl) 2026-01-30
US20240287471A1 (en) 2024-08-29
EP4707400A3 (en) 2026-05-06
EP4707400A2 (en) 2026-03-11
DK3953377T3 (da) 2025-12-01
CA3136004A1 (en) 2020-10-15
PL3953377T3 (pl) 2026-02-16
US20200332265A1 (en) 2020-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12570963B2 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
JP7571044B2 (ja) リソソーム障害のための遺伝子療法
US20230346979A1 (en) Gene therapies for neurodegenerative disorders
EP3601324B1 (en) Mecp2 expression cassettes
EP3692151A1 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
AU2020272974A1 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
US20220211871A1 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
JP7855045B2 (ja) リソソーム障害のための遺伝子療法
EA046777B1 (ru) Генная терапия лизосомальных нарушений
EA049748B1 (ru) Виды генной терапии нейродегенеративных нарушений
EP3952923A1 (en) Gene therapies for lysosomal disorders