RS68122B1 - Inhibitori cdk - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] OSNOV PRONALASKA

[0005] Ciklin-zavisne kinaze (CDK) su porodica protein kinaza koje su prvi put otkrivene na osnovu svoje uloge u regulaciji ćelijskog ciklusa. Od tada je utvrđeno da igraju ulogu u regulaciji brojnih drugih bioloških funkcija kao što su transkripcija, obrada iRNK i diferencijacija nervnih ćelija.

[0006] CDK su relativno mali proteini molekulske težine između oko 34-40 kDa. Sadrže gotovo isključivo kinazni domen i suštinski su neaktivni kada nisu u kompleksu sa regulatornim proteinima koji se nazivaju ciklini. Nivoi CDK ostaju relativno konstantni tokom ćelijskog ciklusa, a regulacija je prvenstveno posttranslaciona, najčešće putem vezivanja za cikline.

[0007] Kao i kod svih kinaza, aktivno mesto, ili mesto vezivanja za ATP, u CDK je procep između malog amino-terminalnog režnja i većeg karboksi-terminalnog režnja. Struktura humane CDK2 otkrila je da CDK imaju modifikovano mesto vezivanja za ATP koje može da se reguliše vezivanjem ciklina. Fosforilacija pomoću CDK-aktivirajuće kinaze (CAK) na Thr 161 na T-petlji povećava aktivnost kompleksa. U odsustvu ciklina, fleksibilna petlja koja se naziva aktivaciona petlja ili T-petlja blokira procep, pri čemu položaj nekoliko ključnih aminokiselinskih ostataka nije optimalan za vezivanje za ATP. U prisustvu ciklina, dve alfa spirale menjaju svoj položaj kako bi omogućile vezivanje za ATP. Jedna od njih, spirala L12, koja se u primarnoj sekvenci nalazi neposredno pre T-petlje, prelazi u beta nabranu strukturu i pomaže u preuređenju T-petlje, tako da ona više ne blokira aktivno mesto. Druga alfa spirala, nazvana spirala PSTAIRE, se preuređuje i pomaže u promeni položaja ključnih aminokiselinskih ostataka u aktivnom mestu.

[0008] Dakle, samo kompleks ciklin-CDK ima aktivnu kinaznu aktivnost, i većina poznatih kompleksa ciklin-CDK reguliše progresiju kroz ćelijski ciklus. CDK su sveprisutne kod svih poznatih eukariota, a njihova regulatorna funkcija u ćelijskom ciklusu je evolutivno očuvana. Na primer, ćelije kvasca mogu normalno da se razmnožavaju kada je njihov CDK gen zamenjen homolognim humanim genom. CDK ostvaruju svoju regulatornu funkciju fosforilacijom supstrata na određenim specifičnim ostacima serina i treonina, u konsenzusnoj sekvenci [S/T]PX[K/R], gde je S/T ciljni Ser ili Thr za fosforilaciju, P je prolin, X je bilo koja aminokiselina, K je lizin, a R je arginin.

[0009] [0005] U životinjskim ćelijama postoji najmanje devet različitih CDK, od kojih su četiri (CDK1, 2, 3 i 4) direktno uključene u regulaciju ćelijskog ciklusa. U ćelijama sisara, CDK1, zajedno sa svojim partnerima za vezivanje, ciklinima A2 i B1, može samostalno da pokrene ćelijski ciklus. Kompleksi ciklin-CDK iz ranije faze ćelijskog ciklusa mogu da doprinesu aktivaciji kompleksa ciklin-CDK u kasnijoj fazi.

[0010] Ista CDK može da formira komplekse sa različitim ciklinima kako bi regulisala različite faze ćelijskog ciklusa. Na primer, CDK2 može da formira kompleks sa ciklinom D ili E kako bi regulisala G1 fazu; formira kompleks sa ciklinom A ili E kako bi regulisala S fazu; i formira kompleks sa ciklinom A kako bi regulisala G2 fazu. Sa druge strane, CDK4 i CDK6 mogu da formiraju komplekse sa ciklinima D1, D2 i D3.

[0011] Visoko homologne ciklin-zavisne kinaze (CDK) CDK4 i CDK6 u kombinaciji sa ciklinom D su ključni regulatori prolaska kroz restrikcionu tačku R između G1 (rast) i S (replikacija DNK) faze ćelijskog ciklusa. CDK4/6 ostvaruju svoje dejstvo fosforilacijom proteina retinoblastoma (pRb). Nakon što se fosforiliše, pRb gubi svoj inhibitorni efekat na transkripciju gena koji podstiču ulazak u S fazu.

[0012] Nasuprot tome, specifična inhibicija aktivnosti CDK4/6 kinaze endogenim proteinskim modulatorom p16<INK4>ili inhibitorima malih molekula dovodi do hipofosforilisanog pRb i zaustavljanja ćelija na restrikcionoj tački G1. Kao primarni mehanizam regulacije restrikcione tačke G1, put koji regulišu ove kinaze je izmenjen u širokom spektru humanih tumora, i stoga inhibicija CDK4/CDK6 u ovim tumorima ostvaruje terapijsku korist sprečavanjem deobe ćelija.

[0013] U WO 2018/045957 A1 (JIANGSU HANSOH PHARMACEUTICAL GROUP CO., LTD.) opisan je inhibitor CDK4/6 određene formule, postupak njegove pripreme i njegova primena. Jedinjenja su opisana kao lekovi za sprečavanje i/ili lečenje kancera ili bolesti povezanih sa tumorima.

[0014] U EP 3444246 A1 (Shanghai Xunhe Pharmaceutical Technology Co., Ltd.) opisan je 2,4-disupstituisani pirimidinski derivat određene formule kao inhibitor CDK, a njegova farmaceutska kompozicija opisana je kao selektivni inhibitor CDK4/6 u sprečavanju ili lečenju bolesti povezanih sa CDK4/6.

[0015] U EP 3269715 A1 (Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd.) opisan je supstituisani 2H-pirazolni derivat određene formule, koji služi kao selektivni CDK4/6 inhibitor.

[0016] I dalje postoji potreba za obezbeđivanjem inhibitora CDK4/6 koji se mogu koristiti u lečenju poremećaja ćelijske proliferacije kao što je kancer.

[0018] IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0019] Ovde su opisana jedinjenja koja inhibiraju aktivnost ciklin-zavisne kinaze (CDK), npr. CDK2, CDK4 i/ili CDK6, i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0020] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje jedinjenje predstavljeno sledećom strukturnom formulom:

[0023]

[0025] ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Otkriveno je da jedinjenje A ne samo da aktivno inhibira CDK2, CDK4 i CDK6, već takođe pokazuje jaka antiproliferativna dejstva.

[0026] Takođe su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenje A, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0027] Ovde je takođe opisano, ali nije obuhvaćeno pronalaskom za koji se traži zaštita, jedinjenje A ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili farmaceutska kompozicija pronalaska, za upotrebu u postupku za lečenje kancera, gde je kancer karcinom bešike, dojke, debelog creva, bubrega, epidermisa, jetre, pluća, jednjaka, žučne kese, jajnika, pankreasa, želuca, grlića materice, štitne žlezde, nosa, glave i vrata, prostate ili kože; hematopoetski tumor limfoidne loze; hematopoetski tumor mijeloidne loze; folikularni kancer štitne žlezde; tumor mezenhimalnog porekla; tumor centralnog ili perifernog nervnog sistema; melanom; seminom; teratokarcinom; osteosarkom; kseroderma pigmentozum; keratoakantom; folikularni kancer štitne žlezde; ili Kapošijev sarkom.

[0028] Ovde je takođe opisano, ali nije obuhvaćeno pronalaskom za koji se traži zaštita, jedinjenje A ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili farmaceutska kompozicija pronalaska, za upotrebu u inhibiciji aktivnosti ciklin-zavisne kinaze (CDK) kod subjekta.

[0029] Takođe je ovde opisano, ali nije obuhvaćeno pronalaskom za koji se traži zaštita, jedinjenje A ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, ili farmaceutska kompozicija pronalaska, za upotrebu u terapiji.

[0030] [0019] Postupak za lečenja kancera može da se primeni kod subjekta kome je to potrebno, i sadrži davanje subjektu efikasne količine (1) jedinjenja opisanog ovde ili farmaceutski prihvatljive soli; ili (2) farmaceutski prihvatljive kompozicije koja sadrži jedinjenje opisano ovde ili farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog kancera, kancera dojke (kao što je uznapredovali ili metastatski, HER2/neu-negativni kancer dojke kod žena u postmenopauzi koji je pozitivan na hormonske receptore), kancera pluća, kancera prostate, glioblastoma, limfoma mantle ćelija, hronične mijeloidne leukemije i akutne mijeloidne leukemije.

[0031] Kancer može da se leči inhibicijom aktivnosti ciklin-zavisne kinaze (CDK), npr. CDK2, CDK4 i/ili CDK6.

[0032] Kancer može da bude karcinom bešike, dojke, debelog creva, bubrega, epidermisa, jetre, pluća, jednjaka, žučne kese, jajnika, pankreasa, želuca, grlića materice, štitne žlezde, nosa, glave i vrata, prostate ili kože; hematopoetski tumor limfoidne loze; hematopoetski tumor mijeloidne loze; folikularni kancer štitne žlezde; tumor mezenhimalnog porekla; tumor centralnog ili perifernog nervnog sistema; melanom; seminom; teratokarcinom; osteosarkom; kseroderma pigmentozum; keratoakantom; folikularni kancer štitne žlezde; ili Kapošijev sarkom.

[0033] Jedinjenja opisana ovde mogu da se primenjuju sa bilo kojim od drugih terapijskih agenasa kao što je ovde opisano, a koja takođe leče isti kancer.

[0035] DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0037] 1. Pregled

[0039] Ovde je opisano, ali nije obuhvaćeno pronalaskom za koji se traži zaštita, jedinjenje ovog pronalaska ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u terapiji, kao što je terapija kancera.

[0040] Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži jedinjenje ovog pronalaska ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

[0041] Ovde je opisano, ali nije obuhvaćeno pronalaskom za koji se traži zaštita, jedinjenje ovog pronalaska ili njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u lečenju kancera. Konkretno, ti kanceri mogu da budu bilo koji od kancera opisanih u nastavku, kao što su kolorektalni kancer, kancer dojke (uključujući ER<+>HER2<->uznapredovali, ili metastatski ili, rekurentni kancer dojke kod odrasle žene ili žene u postmenopauzi), kancer pluća, posebno nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer prostate, glioblastom, limfom mantle ćelija (MCL), hronična mijeloidna leukemija (CML) i akutna mijeloidna leukemija (AML).

[0042] [0026] Jedinjenja predmetnog pronalaska su korisna u postupku za lečenje kancera izabranog iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog kancera, kancera dojke (uključujući ER<+>HER2<->uznapredovali, ili metastatski ili, rekurentni kancer dojke kod odrasle žene ili žene u postmenopauzi), kancera pluća, posebno nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC), kancera prostate, glioblastoma, limfoma mantle ćelija, hronične mijeloidne leukemije i akutne mijeloidne leukemije kod sisara, koji sadrži primenu kod sisara kome je takvo lečenje potrebno efikasne količine jedinjenja predmetnog pronalaska ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0043] Ovde je opisana, ali nije obuhvaćena pronalaskom za koji se traži zaštita, farmaceutska formulacija za upotrebu u terapiji, koja sadrži jedinjenje ovog pronalaska ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens. Ovde je opisana, ali nije obuhvaćena pronalaskom za koji se traži zaštita, farmaceutska formulacija za lečenje kolorektalnog kancera, kancera dojke (uključujući ER<+>HER2<->uznapredovali, ili metastatski ili, rekurentni kancer dojke kod odrasle žene ili žene u postmenopauzi), kancera pluća, posebno nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC), kancera prostate, glioblastoma, limfoma mantle ćelija, hronične mijeloidne leukemije i akutne mijeloidne leukemije, koja sadrži jedinjenje predmetnog pronalaska ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

[0044] Indikacije za bolesti koje se mogu lečiti i potencijalni drugi terapijski agens koristan za kombinovanu terapiju detaljnije su opisani u odeljcima ispod.

[0045] Podrazumeva se da svaki ovde opisan primer izvođenja, uključujući i one opisane samo u jednom od odeljaka u nastavku ili samo u primerima, može da se kombinuje sa bilo kojim jednim ili više dodatnih primera izvođenja pronalaska, osim ako je to izričito odbačeno ili je na drugi način neprikladno/neprimenljivo.

[0047] 2. Definicije

[0049] Jedinjenja opisana ovde mogu da sadrže jedan ili više asimetričnih centara i stoga mogu da postoje u različitim stereoizomernim oblicima, npr. kao enantiomeri i/ili dijastereomeri. Na primer, jedinjenja opisana ovde mogu da budu u obliku pojedinačnog enantiomera, dijastereomera ili geometrijskog izomera, ili mogu da budu u obliku smeše stereoizomera, uključujući racemske smeše i smeše obogaćene jednim ili većim brojem stereoizomera.

[0050] [0031] Enantiomerne i dijastereomerne smeše mogu da se razdvoje na svoje sastavne enantiomere ili stereoizomere dobro poznatim metodama, kao što su hiralna gasna hromatografija, hiralna fazna tečna hromatografija visokih performansi, kristalizacija jedinjenja kao hiralnog kompleksa soli ili kristalizacija jedinjenja u hiralnom rastvaraču. Enantiomeri i dijastereomeri takođe mogu da se dobiju iz dijastereomerno ili enantiomerno čistih intermedijera, reagenasa i katalizatora dobro poznatim asimetričnim sintetičkim metodama. Videti, na primer, Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E.L. Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); i Wilen, S.H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p.268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972).

[0051] Kada je jedinjenje označeno nazivom ili strukturom koja ukazuje na jedan enantiomer, osim ako nije drugačije naznačeno, jedinjenje je optički čisto najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99,9% (takođe označeno kao „enantiomerno čisto“). Optička čistoća predstavlja težinu imenovanog ili prikazanog enantiomera u smeši podeljenu sa ukupnom težinom oba enantiomera u smeši.

[0052] Kada je stereohemija otkrivenog jedinjenja imenovana ili prikazana strukturom, a imenovana ili prikazana struktura obuhvata više od jednog stereoizomera (npr. kao u dijastereomernom paru), podrazumeva se da je uključen jedan od obuhvaćenih stereoizomera ili bilo koja smeša obuhvaćenih stereoizomera. Dalje se podrazumeva da je stereoizomerna čistoća imenovanih ili prikazanih stereoizomera najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99,9% po težini. Stereoizomerna čistoća u ovom slučaju se određuje deljenjem ukupne težine u smeši stereoizomera obuhvaćenih nazivom ili strukturom sa ukupnom težinom svih stereoizomera u smeši.

[0053] Kada je geometrijski izomer prikazan nazivom ili strukturom, podrazumeva se da je geometrijska izomerna čistoća imenovanog ili prikazanog geometrijskog izomera najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ili 99,9% čistoće po težini. Geometrijska izomerna čistoća se određuje deljenjem težine imenovanog ili prikazanog geometrijskog izomera u smeši sa ukupnom težinom oba geometrijska izomera u smeši.

[0054] Racemska smeša znači 50% jednog enantiomera i 50% odgovarajućeg enantiomera. Pronalazak obuhvata sve enantiomerno čiste, enantiomerno obogaćene, dijastereomerno čiste, dijastereomerno obogaćene i racemske smeše, kao i dijastereomerne smeše jedinjenja pronalaska.

[0055] Jedinjenja opisana ovde mogu takođe da uključuju sve izotope atoma koji se javljaju u intermedijerima ili finalnim jedinjenjima. Izotopi uključuju one atome koji imaju isti atomski broj, ali različite masene brojeve. Na primer, izotopi vodonika uključuju tricijum i deuterijum.

[0056] Treba napomenuti da se u sintetisanom jedinjenju javljaju izvesne varijacije prirodne zastupljenosti izotopa u zavisnosti od porekla hemijskih materija koje se koriste u sintezi. Stoga će preparat jedinjenja opisanog ovde inherentno sadržati male količine deuterisanih izotopologa. Koncentracija prirodno prisutnih stabilnih izotopa vodonika i ugljenika je, uprkos ovoj varijaciji, mala i zanemariva u poređenju sa stepenom stabilne izotopske supstitucije jedinjenja ovog pronalaska. Videti, na primer, Wada, E et al., Seikagaku, 1994, 66:15; Gannes, LZ et al., Comp Biochem Physiol Mol Integr Physiol, 1998, 119:725.

[0057] Jedinjenja opisana ovde mogu da postoje u različitim tautomernim oblicima. Termin „tautomeri“ ili „tautomerni“ odnosi se na dva ili više međusobno konvertibilnih jedinjenja/supstituenata koji nastaju usled najmanje jedne formalne migracije atoma vodonika i najmanje jedne promene valencije (npr. jednostruke veze u dvostruku vezu, trostruke veze u jednostruku vezu ili obrnuto). Primeri tautomerizacija uključuju tautomerizacije keto-u-enol, amid-uimid, laktam-u-laktim, enamin-u-imin i enamin-u-(drugačiji enamin). Predmetni navodi obuhvataju jedinjenja u obliku tautomera, što uključuje oblike koji nisu strukturno prikazani. Svi takvi izomerni oblici takvih jedinjenja su izričito uključeni. Ako je tautomer jedinjenja aromatičan, ovo jedinjenje je aromatično. Slično, ako je tautomer jedinjenja heteroaril, ovo jedinjenje je heteroaril.

[0058] U određenim slučajevima postoje tautomerni oblici otkrivenih jedinjenja, kao što su tautomerne strukture prikazane u nastavku:

[0061]

[0064] Podrazumeva se da su, kada je jedinjenje ovde predstavljeno strukturnom formulom ili označeno hemijskim nazivom, i svi ostali tautomerni oblici jedinjenja koji mogu da postoje obuhvaćeni tom strukturnom formulom.

[0065] Jedinjenja ovog pronalaska mogu da se koriste za lečenje u slobodnom obliku, ili gde je to prikladno, u obliku farmaceutski prihvatljive soli.

[0066] [0042] Termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na one soli koje su, u okviru zdrave medicinske procene, pogodne za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudi i nižih životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijske reakcije i slično, i u skladu sa razumnim odnosom koristi i rizika. Farmaceutski prihvatljive soli su dobro poznate u struci, na primer, Berge et al. detaljno opisuju farmaceutski prihvatljive soli u J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, uključeno ovde putem reference. Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja ovog pronalaska uključuju one izvedene iz odgovarajućih neorganskih i organskih kiselina i baza. Primeri farmaceutski prihvatljivih, kiselih adicionih soli su soli amino grupe, formirane sa neorganskim kiselinama, kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, fosforna kiselina, sumporna kiselina i perhlorna kiselina ili sa organskim kiselinama, kao što su sirćetna kiselina, oksalna kiselina, maleinska kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, ćilibarna kiselina ili malonska kiselina ili korišćenjem drugih postupaka poznatih u struci, kao što je jonska izmena. Ostale farmaceutski prihvatljive soli uključuju adipatne, alginatne, askorbatne, aspartatne, benzensulfonatne, benzoatne, bisulfatne, boratne, butiratne, kamforatne, kamforsulfonatne, citratne, ciklopentanpropionatne, diglukonatne, dodecil‑sulfatne, etansulfonatne, formijatne, fumaratne, glukoheptonatne, glicerofosfatne, glukonatne, hemisulfatne, heptanoatne, heksanoatne soli, hidrojodide, 2‑hidroksi-etansulfonatne, laktobionatne, laktatne, lauratne, lauril‑sulfatne, malatne, maleatne, malonatne, metansulfonatne, 2‑naftalensulfonatne, nikotinatne, nitratne, oleatne, oksalatne, palmitatne, pamoatne, pektinatne, persulfatne, 3‑fenilpropionatne, fosfatne, pikratne, pivalatne, propionatne, stearatne, sukcinatne, sulfatne, tartratne, tiocijanatne, p‑toluensulfonatne, undekanoatne, valeratne soli i slično. Soli izvedene iz odgovarajućih baza uključuju soli alkalnih metala, soli zemnoalkalnih metala, amonijuma i N<+>(C<1->

[0067] <4>alkil)<4>-

soli. Reprezentativne soli alkalnih ili zemnoalkalnih metala uključuju natrijum, litijum, kalijum, kalcijum, magnezijum i slično. Ostale farmaceutski prihvatljive soli uključuju soli formirane korišćenjem, gde je to prikladno, amonijumovih, kvaternernih amonijumovih i aminskih katjona i protivjona kao što su halogenid, hidroksid, karboksilat, sulfat, fosfat, nitrat, niži alkilsulfonat i arilsulfonat.

[0068] Takve farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli i uobičajena metodologija za njihovu pripremu dobro su poznate u struci. Videti, npr. Stahl et al., HANDBOOK OF

[0069] PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); Bighley et al., in "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology." Eds. Swarbrick and Boylan, Vol.13, Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong 1995, pp.453‑499; Berge et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66(1): 1977.

[0070] Termini „kompozicija“ i „formulacija“ se koriste kao sinonimi.

[0071] „Subjekt“ je sisar, poželjno čovek, ali može da bude i životinja kojoj je potrebno veterinarsko lečenje, npr. kućni ljubimci (npr. psi, mačke i slično), domaće životinje (npr. krave, ovce, svinje, konji i slično) i laboratorijske životinje (npr. pacovi, miševi, zamorci i slično).

[0072] [0047] Termin „primeniti“, „primenjivanje“ ili „primena“ se odnosi na postupke za uvođenje jedinjenja pronalaska, ili njegove kompozicije, u ili na subjekta. Ovi postupci (koji su ovde opisani, ali nisu obuhvaćeni pronalaskom za koji se traži zaštita) uključuju, ali nisu ograničeni na, intraartikularnu (u zglobove), intravensku, intramuskularnu, intratumorsku, intradermalnu, intraperitonealnu, potkožnu, oralnu, topikalnu, intratekalnu, inhalacionu, transdermalnu, rektalnu primenu, i slično. Tehnike primene koje mogu da se koriste sa ovde opisanim agensima i postupcima mogu se naći u npr. Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current ed.; Pergamon; i Remington’s, Pharmaceutical Sciences (current edition), Mack Publishing Co., Easton, Pa.

[0073] Termini „tretman“, „lečiti“ i „lečenje“ odnose se na preokretanje, ublažavanje ili inhibiranje napredovanja ovde opisane bolesti. Lečenje može da se primeni nakon što se razvije ili bude primećen jedan ili više znakova ili simptoma bolesti (tj., terapijski tretman). Lečenje može da se primeni u odsustvu znakova ili simptoma bolesti. Na primer, lečenje može da se primeni kod osetljivog subjekta pre pojave simptoma (tj., profilaktički tretman) (npr. u svetlu istorije simptoma i/ili u svetlu izloženosti patogenu). Lečenje se takođe može nastaviti nakon što se simptomi povuku, na primer, da bi se odložilo ili sprečilo njihovo ponovno javljanje.

[0074] Termini „stanje“, „bolest“ i „poremećaj“ koriste se kao sinonimi.

[0075] Uopšteno, efikasna količina jedinjenja koje je ovde opisano varira u zavisnosti od različitih faktora, kao što su dati lek ili jedinjenje, farmaceutska formulacija, način primene, vrsta bolesti ili poremećaja, identitet subjekta ili domaćina koji se leči i slično, ali stručnjak u ovoj oblasti ipak može rutinski da je odredi. Efikasnu količinu jedinjenja ovih navoda može lako da odredi stručnjak rutinskim postupcima poznatim u ovoj oblasti.

[0076] Termin „efikasna količina“ označava količinu koja, kada se primeni kod subjekta, dovodi do korisnih ili željenih rezultata, uključujući kliničke rezultate, npr. inhibira, suzbija ili smanjuje simptome stanja koje se leči kod subjekta u poređenju sa kontrolom. Na primer, efikasna količina može se dati u obliku jedinične doze (npr. od 1 mg do oko 50 g dnevno, npr. od 1 mg do oko 5 grama dnevno).

[0077] „Terapijski efikasna količina“ je količina koja je efikasna za detektabilno uništavanje ili inhibiciju rasta ili širenja ćelija kancera; veličine ili broja tumora; ili druge mere nivoa, stadijuma, progresije ili težine kancera. Tačna potrebna količina će varirati od subjekta do subjekta, u zavisnosti od vrste, starosti i opšteg stanja subjekta, težine bolesti, određenog antikancerskog agensa, njegovog načina primene, kombinovanog lečenja sa drugim terapijama i slično.

[0078] Opšti hemijski termini korišćeni u gornjim formulama imaju svoja uobičajena značenja.

[0079] [0054] Kako se ovde koristi, „h“ se odnosi na sat ili sate, „min“ se odnosi na minut ili minute, „Cdk“ ili „CDK“ se odnosi na ciklin zavisnu kinazu, „pRb“ se odnosi na protein retinoblastoma, „MCL“ se odnosi na limfom mantle ćelija, „AML“ se odnosi na akutnu mijeloidnu leukemiju, „CML“ se odnosi na hroničnu mijeloidnu leukemiju, „Boc“ se odnosi na N-tert-butoksikarbonil, „EA“ se odnosi na etil acetat, „DCM“ se odnosi na dihlorometanom, „DMSO“ se odnosi na dimetilsulfoksid, „DMA“ se odnosi na dimetilacetamid, „THF“ se odnosi na tetrahidrofuran, „MtBE“ se odnosi na metil terc-butil etar, „TEA“ se odnosi na trietilamin, „FBS“ se odnosi na fetalni goveđi serum, „PBS“ se odnosi na fosfatno puferovani fiziološki rastvor, „BSA“ se odnosi na goveđi serumski albumin, „RT “ se odnosi na sobnu temperaturu, „mpk“ se odnosi na miligrame po kilogramu, „po“ se odnosi na per os (oralno), „qd“ označava doziranje jednom dnevno, „HPLC“ označava tečnu hromatografiju pod visokim pritiskom, „q2d“ označava jednu dozu na svaka 2 dana, „q2dx10“ označava jednu dozu na svaka 2 dana puta 10, „VSMC“ se odnosi na ćelije glatkih mišića krvnih sudova, a „XRD“ se odnosi na rendgensku difrakciju.

[0081] 3. Jedinjenja

[0083] Predmetno otkriće dalje uključuje izotopski obeležena jedinjenja pronalaska. „Izotopski “ ili „radioaktivno-obeleženo“ jedinjenje je jedinjenje pronalaska u kome je jedan ili više atoma zamenjeno ili supstituisano atomom koji ima atomsku masu ili maseni broj različit od atomske mase ili masenog broja koji se tipično nalazi u prirodi (tj. koji je prirodno prisutan). Pogodni radionuklidi koji mogu da se ugrade u jedinjenja ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na<2>H (takođe se označava kao D od deuterijum),<3>H (takođe se označava kao T od tricijum),<11>C,<13>C,<14>C,<13>N,<15>N,<15>O,<17>O,<18>O,<18>F,<35>S,<36>Kl,<82>Br,<75>Br,<76>Br,<77>Br,<123>I,<124>I,<125>I i<131>I. Radionuklid koji je ugrađen u predmetna radioaktivno obeležena jedinjenja zavisiće od specifične primene tog radioaktivno obeleženog jedinjenja.

[0084] Sintetički postupci za ugradnju radio-izotopa u organska jedinjenja su dobro poznati u struci, a stručnjak u ovoj oblasti će lako prepoznati postupke koji mogu da se primene na jedinjenja pronalaska.

[0085] [0057] Obeleženo jedinjenje pronalaska može da se koristi u skrining testu za identifikaciju/evaluaciju jedinjenja. Na primer, novosintetizovano ili identifikovano jedinjenje (tj. ispitivano jedinjenje) koje je obeleženo može da se proceni na osnovu njegove sposobnosti da se veže za CDK posmatranjem varijacije njegove koncentracije pri kontaktu sa CDK, praćenjem obeležavanja. Na primer, ispitivano jedinjenje (obeleženo) može da se proceni na osnovu njegove sposobnosti da smanji vezivanje drugog jedinjenja za koje je poznato da se vezuje za CDK (tj. standardno jedinjenje). Prema tome, sposobnost ispitivanog jedinjenja da stupi u kompeticiju sa standardnim jedinjenjem za vezivanje za CDK direktno je u korelaciji sa njegovim afinitetom vezivanja. Nasuprot tome, u nekim drugim skrining testovima, standardno jedinjenje je obeleženo, a ispitivana jedinjenja nisu obeležena. Shodno tome, koncentracija obeleženog standardnog jedinjenja se prati kako bi se procenila kompeticija između standardnog jedinjenja i ispitivanog jedinjenja, i tako se utvrđuje relativni afinitet vezivanja ispitivanog jedinjenja.

[0086] U jednom primeru izvođenja, u jedinjenju ili farmaceutski prihvatljivoj soli, jedan ili više atoma vodonika su zamenjeni deuterijumom.

[0088] 4. Bolesti koje mogu da se leče i postupak za lečenje koji su ovde opisani, ali nisu obuhvaćeni pronalaskom za koji se traži zaštita

[0090] Određena jedinjenja predmetnog pronalaska su selektivni inhibitori CDK2, CDK4 i/ili CDK6 i stoga su korisna u lečenju bolesti ili poremećaja koje karakteriše abnormalna ćelijska proliferacija koja može da bude inhibirana smanjenom aktivnošću kompleksa CDK-ciklini koji obuhvataju CDK2, CDK4 i/ili CDK6.

[0091] U određenim primerima izvođenja, jedinjenja pronalaska selektivno inhibiraju CDK4/6 u odnosu na CDK2, sa odnosom vrednosti IC<50>za ovu drugu (CDK2) u odnosu na prvu (CDK4/6) od najmanje oko 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 800, 1000, 2000 ili više.

[0092] U određenim primerima izvođenja, jedinjenja pronalaska selektivno inhibiraju CDK4 u odnosu na CDK6, sa odnosom vrednosti IC<50>za ovu drugu (CDK6) u odnosu na prvu (CDK4) od najmanje oko 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50 ili više.

[0093] U određenim primerima izvođenja, jedinjenja pronalaska selektivno inhibiraju CDK2 u odnosu na CDK4, sa odnosom vrednosti IC<50>za ovu drugu (CDK4) u odnosu na prvu (CDK2) od najmanje oko 2, 5, 10, 15, 20, 40, 50, 60, 80, 100 ili više.

[0094] U određenim primerima izvođenja, jedinjenja pronalaska inhibiraju CDK2/4/6 sa sličnim vrednostima IC<50>, npr. vrednostima IC<50>u opsegu od 10, 5, 3 ili 2 puta. Takva jedinjenja pronalaska su korisna za lečenje kancera sa amplifikacijom ili pojačanom ekspresijom ciklina D1 ili E1 ili E2.

[0095] CDK2 je katalitička podjedinica kompleksa CDK-ciklin čija je aktivnost ograničena na G1-S fazu ćelijskog ciklusa, gde ćelije proizvode proteine neophodne za mitozu i repliciraju svoju DNK. CDK2 je u kompleksu sa ciklinom E ili A. Ciklin E se vezuje za CDK2 u G1 fazi, što je neophodno za prelaz iz G1 u S fazu. S druge strane, vezivanje CDK2 sa ciklinom A je neophodno za napredovanje kroz S fazu.

[0096] [0065] Dok je CDK2 uglavnom neesencijalna u ćelijskom ciklusu kod ćelija koje normalno funkcionišu, ona je ključna za abnormalne procese rasta ćelija kancera. Prekomerna ekspresija ciklina E javlja se u mnogim tumorskim ćelijama, što dovodi do toga da ćelije postanu zavisne od CDK2 i ciklina E. Abnormalna aktivnost ciklina E primećena je kod kancera dojke, pluća, kolorektalnog kancera, kancera želuca i kostiju, kao i kod leukemije i limfoma. Slično tome, abnormalna ekspresija ciklina A2 povezana je sa hromozomskom nestabilnošću i proliferacijom tumora, dok inhibicija dovodi do smanjenog rasta tumora. Stoga, CDK2 i njeni ciklinski partneri za vezivanje predstavljaju moguće terapijske ciljeve za nove terapije protiv kancera. Pretklinički modeli su pokazali preliminarni uspeh u ograničavanju rasta tumora, a takođe je primećeno da smanjuju neželjene efekte postojećih lekova za hemoterapiju.

[0097] Na primer, Caldon et al. (Mol Cancer Ther 11(7):1488‑1499, 2012) je izvestio da je ciklin E2 uključen u nekoliko genskih potpisa koji predviđaju progresiju bolesti kod kancera dojke otpornog na tamoksifen ili metastatskog kancera dojke, a visoka ekspresija CycE2 je karakteristična za luminalne B i HER2 podtipove kancera dojke i snažno je prediktivna za kraće preživljavanje bez udaljenih metastaza nakon endokrine terapije. Dalje, ćelije kancera dojke otporne na tamoksifen (MCF-7 TAMR) prekomerno su eksprimirale ciklin E2; a ekspresija ciklina E1 ili E2 u ćelijama kancera dojke T-47D dovela je do akutne rezistencije na antiestrogene, što sugeriše da prekomerna ekspresija ciklina E doprinosi rezistenciji na antiestrogene ćelija otpornih na tamoksifen. Proliferacija ćelija otpornih na tamoksifen je inhibirana RNAi-posredovanim smanjenjem ekspresije ciklina E1, ciklina E2 ili CDK2. Pored toga, ektopična ekspresija ciklina E1 ili E2 je takođe smanjila osetljivost na inhibiciju CDK4, ali ne i CDK2. Dalje, inhibicija CDK2 u ćelijama sa prekomernom ekspresijom E-ciklina i ćelijama rezistentnim na tamoksifen obnovila je osetljivost na tamoksifen ili na inhibiciju CDK4.

[0098] Ovi podaci pokazuju da je prekomerna ekspresija ciklina E2 potencijalni mehanizam rezistencije i na endokrinu terapiju i na inhibiciju CDK4, a inhibitori CDK2 mogu zauzvrat da prevaziđu takvu rezistenciju i mogu da budu korisni kao komponenta kombinovanih terapija kod endokrino-otpornih bolesti, jer efikasno inhibiraju ćelije koje prekomerno eksprimiraju ciklin E1 i E2 i poboljšavaju efikasnost drugih terapeutika. Slično tome, očekuje se da će predmetna jedinjenja sa snažnim inhibitornim dejstvom na CDK2 i CDK4 biti efikasna protiv ćelija kancera koje su osetljive, kao i onih koje su rezistentne na endokrinu terapiju ili inhibiciju CDK4.

[0099] Stoga, u određenim primerima izvođenja, jedinjenja ovog pronalaska mogu da imaju snažne inhibitorne efekte i na CDK2 i na CDK4 (npr. na nivou vrednosti IC<50>od nezavisno <10 nM, <5 nM, <1 nM), i stoga mogu da budu efikasna u lečenju kancera dojke otpornog na tamoksifen ili metastatskog kancera dojke, kao što su kancer dojke otporan na tamoksifen ili metastatski kancer dojke sa prekomernom ekspresijom CycE.

[0100] Vrednosti IC<50>jedinjenja pronalaska u odnosu na CDK2/4/6 mogu da se mere korišćenjem, na primer, postupaka opisanih u primerima 1-3 (uključenih ovde putem reference).

[0101] Konkretno, jedinjenja ovog pronalaska mogu da budu korisna u lečenju kancera. Jedinjenja ovog pronalaska su takođe korisna u lečenju hroničnih inflamatornih bolesti kao što su artritis i cistična fibroza.

[0102] Dakle, jedinjenja ovog pronalaska mogu da se koriste u postupku za lečenje kancera, posebno kancera opisanih ovde, kod sisara, koji sadrži primenu kod sisara kome je potrebno takvo lečenje efikasne količine jedinjenja ovog pronalaska.

[0103] Ovde je opisano, ali nije obuhvaćeno pronalaskom za koji se traži zaštita, jedinjenje ovog pronalaska za upotrebu u lečenju kancera, posebno kancera opisanih ovde.

[0104] Prema bilo kom od gore navedenih povezanih aspekata pronalaska, CDK4 i CDK6 mogu da moduliraju svoje efekte na ćelijski ciklus delimično putem fosforilacije pRb. Stoga, određena jedinjenja ovog pronalaska mogu da inhibiraju fosforilaciju pRb inhibiranjem aktivnosti CDK4/6, i time inhibiraju proliferaciju ćelija i/ili rast tumora, kod bilo koje vrste kancera kod koje ćelije proliferišu i sadrže funkcionalni, intaktni Rb1 gen koji kodira pRb.

[0105] Dakle, jedinjenja pronalaska su korisna u lečenju pRb<+>kancera, kao što su kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer pluća, kancer prostate, hronična mijeloidna leukemija, akutna mijeloidna leukemija (Fry et al., Mol. Cancer Ther.3(11):1427, 2004), limfom mantle ćelija (Marzec et al., Blood 108(5):1744, 2006), kancer jajnika (Kim et al., Cancer Research 54:605, 1994), kancer pankreasa (Schutte et al., Cancer Research 57:3126, 1997), maligni melanom i metastatski maligni melanom (Maelandsmo et al., British Journal of Cancer 73:909, 1996) kod sisara. Očekuje se da će jedinjenja ovog pronalaska biti korisna i u lečenju rabdomiosarkoma (Saab et al., Mol. Cancer. Ther.5(5):1299, 2006) i multiplog mijeloma (Baughn et al., Cancer Res. 66(15):7661, 2006), uključujući relaps refraktornog multiplog mijeloma, kod sisara (npr. čoveka).

[0106] U međuvremenu, Zhang et al. (Nature dx.doi.org/10.1038/nature25015, 2017) su utvrdili da inhibicija CDK4/6 in vivo može da dovede do smanjenja fosforilacije i time povećanja razgradnje kulin 3<SPOP>E3 ligaze (putem APC/C<Cdh1>), što zauzvrat dovodi do povećanja nivoa PD-L1 na površini ćelija tumora i smanjenja broja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) u tumorima miševa i u uzorcima primarnog kancera prostate kod ljudi. Drugim rečima, inhibicija CDK4/6 in vivo povećava nivoe proteina PD-L1 i doprinosi povećanoj rezistenciji na terapiju imunoloških kontrolnih tačaka usmerenu na PD-1 (protein programirane ćelijske smrti 1) i PD-L1 (ligand za PD-1). S druge strane, kombinovanje lečenja inhibitorima CDK4/6 sa imunoterapijom protiv PD-1 poboljšava regresiju tumora i dramatično poboljšava ukupne stope preživljavanja kod mišjih modela tumora.

[0107] Stoga, jedinjenja pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa inhibitorima imunoloških kontrolnih tačaka PD-1/PD-L1 u cilju poboljšanja terapijske efikasnosti kod humanih kancera.

[0108] Inhibitori PD-1 i PD-L1 koji mogu da se koriste sa jedinjenjima ovog pronalaska poznati su u struci. Inhibitori PD-1 uključuju monoklonska antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente specifične za PD-1. Primeri inhibitora PD-1 uključuju pembrolizumab (Keytruda), nivolumab (Opdivo) i cemiplimab (Libtayo). Inhibitori PD-L1 uključuju monoklonska antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente specifične za PD-L1. Primeri inhibitora PD-L1 uključuju atezolizumab (Tecentriq), avelumab (Bavencio) i durvalumab (Imfinzi).

[0109] Dodatni imunološki inhibitori kontrolnih tačaka koji mogu da se koriste sa jedinjenjima ovog pronalaska za poboljšanje terapijske efikasnosti kod humanih kancera uključuju monoklonska antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente specifične za CTLA-4, kao što je ipilimumab (Yervoy).

[0110] Sledeći imunološki inhibitori kontrolnih tačaka koji mogu da se koriste sa jedinjenjima ovog pronalaska za poboljšanje terapijske efikasnosti kod humanih kancera uključuju bispecifična monoklonska antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente specifične za PD-1 i PD-L1, ili kombinaciju monoklonskih antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata specifičnih za PD-1 i PD-L1, ili PD-1 i CTLA-4, itd.

[0111] Jedinjenja pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa inhibitorom Tyr kinaze, npr. inhibitorima receptorske Tyr kinaze (RTK), u cilju poboljšanja terapijske efikasnosti kod humanih kancera. Primeri inhibitora Tyr kinaze uključuju inhibitore ALK (kao što su krizotinib, ceritinib, alektinib, brigatinib), inhibitore Bcr-Abl (kao što su bosutinib, dasatinib, imatinib, nilotinib, ponatinib), inhibitor BTK (kao što je ibrutinib), inhibitor c-Met (kao što je krizotinib, kabozantinib), inhibitor EGFR (kao što su gefitinib, erlotinib, lapatinib, vandetanib, afatinib, osimertinib), inhibitor JAK (kao što su ruksolitinib, tofacitinib), inhibitor MEK1/2 (kao što je trametinib), inhibitor PDGFR (kao što su aksitinib, gefitinib, imatinib, lenvatinib, nintedanib, pazopanib, regorafenib, sorafenib, sunitinib), inhibitor RET (kao što je vandetanib), inhibitore porodice kinaza Src (kao što su bosutinib, dasatinib, ponatinib, vandetanib) i inhibitore porodice VEGFR (kao što su aksitinib, lenvatinib, nintedanib, regorafenib, pazopanib, sorafenib, sunitinib).

[0112] Dodatni pogodni inhibitori kinaze koji se mogu koristiti u kombinaciji sa predmetnim jedinjenjima, kao i indikacije kancera koji mogu da se leče, opisani su u Bhullar et al., Molecular Cancer 17:48, 2018 (uključeno ovde referencom u celosti).

[0113] [0082] Dalji dodatni inhibitori RTK uključuju monoklonska antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente, uključujući anti-EGFR mAB kao što je cetuksimab (efikasan u lečenju, npr. kancera pluća, kolorektalnog kancera i kancera glave i vrata) i anti-HER2 mAB kao što je trastuzumab (efikasan u lečenju, na primer, kancera dojke).

[0114] Jedinjenja pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa antagonistom signalizacije hormonskih receptora, kao što su oni prethodno opisani za lečenje kancera dojke.

[0115] Kanceri koji mogu da se leče jedinjenjima ovog pronalaska uključuju: ne-Hočkinov limfom; maligni mezoteliom; nesitnoćelijski kancer pluća; holangiokarcinom; sarkom mekog tkiva; glioblastom; (rekurentni) tumor mozga; metastaze u mozgu nastale usled kancera dojke pozitivnog na hormonske receptore, nesitnoćelijski kancer pluća, melanom (uključujući melanom pozitivan na ekspresiju ciklina D1); (rekurentni ili perzistentni) kancer endometrijuma; (rekurentni ili metastatski) karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC); hepatocelularni karcinom; karcinom skvamoznih ćelija jednjaka (SCC); adenokarcinom jednjaka (ADC); karcinom bubrežnih ćelija i urotelni kancer.

[0116] Kanceri koji mogu da se leče uključuju: karcinom bešike, dojke, debelog creva, bubrega, epidermisa, jetre, pluća (uključujući SCLC i NSCLC), jednjaka, žučne kese, jajnika, pankreasa, želuca, grlića materice, štitne žlezde, nosa, glave i vrata, prostate ili kože; hematopoetski tumor limfoidne loze; hematopoetski tumor mijeloidne loze; folikularni kancer štitne žlezde; tumor mezenhimalnog porekla; tumor centralnog ili perifernog nervnog sistema; melanom; familijarni melanom; seminom; teratokarcinom; osteosarkom; kserodermu pigmentozum; keratoakantom; folikularni kancer štitne žlezde; Kapošijev sarkom, skvamozni kancer, sarkom; ili tumor mezenhimalnog porekla.

[0117] Hematopoetski tumor limfoidne loze može da bude leukemija, akutna limfocitna leukemija, hronična limfocitna leukemija, B-ćelijski limfom, T-ćelijski limfom, multipli mijelom, Hočkinov limfom, ne-Hočkinov limfom, limfom vlasastih ćelija ili Burketov limfom.

[0118] Tumor centralnog ili perifernog nervnog sistema može da bude astrocitom, neuroblastom, gliom ili švanom.

[0119] Kancer može da bude sitnoćelijski kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, kancer pankreasa, kancer dojke, multiformni glioblastom, T-ćelijska ALL i limfom mantle ćelija.

[0120] Kancer može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od: kolorektalnog kancera, limfoma mantle ćelija, kancera dojke (uključujući uznapredovali ili metastatski ili rekurentni kancer dojke), kancera pankreasa, kancera jajnika, glioblastoma, akutne mijeloidne leukemije i kancera pluća, posebno NSCLC.

[0121] Kancer može da bude NSCLC, kancer pankreasa, kancer jajnika ili metastatski kancer dojke, a lečenje sadrži primenu kod sisara kome je to potrebno terapijski efikasne kombinacije jedinjenja ovog pronalaska i gemcitabina HCl.

[0122] Kancer može da bude NSCLC, kancer pankreasa, kancer jajnika ili metastatski kancer dojke, pri čemu lek koji sadrži jedinjenje ovog pronalaska takođe sadrži gemcitabin HCl, ili se primenjuje istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno sa gemcitabinom HCl.

[0123] Jedinjenja ovog pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim agensima za lečenje NSCLC, kancera pankreasa, kancera jajnika i metastatskog kancera dojke. Na primer, jedinjenje ovog pronalaska može da se koristi u istovremenoj, odvojenoj ili sekvencijalnoj kombinaciji sa gemcitabinom HCl u lečenju NSCLC, kancera pankreasa, kancera jajnika ili metastatskog kancera dojke.

[0124] Kancer može da bude izabran iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog kancera, glioblastoma, akutne mijeloidne leukemije i kancera pluća.

[0125] Kancer može da bude glioblastom ili astrocitom, a u lečenju se koristi terapijski efikasna kombinacija jedinjenja pronalaska i temozolomida. Jedinjenje pronalaska može da se primenjuje istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno sa temozolomidom.

[0127] Lečenje kancera dojke

[0129] Jedinjenja pronalaska mogu da se koriste za lečenje kancera dojke.

[0130] Kancer dojke predstavlja značajan zdravstveni problem širom sveta i sam je uzrokovao ~7% svih smrtnih slučajeva povezanih sa kancerom u SAD 2016. godine. Od svih kancera dojke, oko 75% je dijagnostikovano kao kancer dojke pozitivan na hormonske receptore (HR<+>), koji eksprimira estrogenski receptor (ER) i/ili progesteronski receptor (PgR), i tipično je zavisan od ER signalnog puta u pogledu rasta i preživljavanja. To jest, HR<+>kanceri dojke koriste biološke funkcije ER puta kako bi podstakli rast, razvoj i progresiju kancera dojke. Sa druge strane, oslanjanje HR<+>kancera dojke na ER signalizaciju učinilo je takav kancer dojke terapijskim ciljem za agense za endokrinu terapiju koji deluju na estrogenski signalni put, kao što su inhibitori aromataze (AI; uključujući letrozol, anastrozol i egzemestan), selektivni modulatori ER (tamoksifen) i selektivni nishodni regulatori ER (fulvestrant) itd.

[0131] [0097] Iako endokrina terapija čini osnovu lečenja HR<+>kancera dojke, efikasnost endokrine terapije je ograničena visokim stopama prethodno postojeće de novo rezistencije i rezistencije stečene tokom lečenja, zbog prisustva alternativnog puta preživljavanja ili puta „bekstva“. Put ER i mnogi poznati putevi bekstva deluju preko puta ciklin D-CDK4/6-inhibitora CDK4 (INK4)-retinoblastoma (Rb) kako bi podstakli rast tumora. Stoga delovanje i na ER put i na put ciklin D-CDK4/6-INK4-Rb u kombinaciji obično dovodi do opsežnije inhibicije rasta tumora i sprečava aktivaciju puteva bekstva, sprečavajući razvoj rezistencije na endokrinu terapiju. Videti Sammons et al., Current Cancer Drug Targets 17:637‑649, 2017.

[0132] Kancer dojke može da bude pRb+ kancer dojke. Kancer dojke može da bude pozitivan na hormonske receptore (HR) (npr. pozitivan na receptor za estrogen (ER<+>), pozitivan na receptor za progesteron (PR<+>), ili ER<+>PR<+>), HER2/neu-negativan kancer, uključujući HR<+>HER2<->ili ER<+>HER2-, uznapredovali ili metastatski ili rekurentni kancer dojke. HR<+>HER2<->ili ER<+>HER2<->uznapredovali ili metastatski ili rekurentni kancer dojke može da bude kod odrasle žene ili žene u postmenopauzi.

[0133] Jedinjenja pronalaska mogu da se koriste sama ili sa inhibitorom aromataze (koji inhibira proizvodnju estrogena), za lečenje HR-pozitivnog, HER2-negativnog uznapredovalog ili metastatskog ili rekurentnog kancera dojke. Inhibitor aromataze može privremeno da inaktivira aromatazu (kao što je anastrozol (ARIMIDEX<®>) i letrozol (FEMARA<®>)). Inhibitor aromataze može trajno da inaktivira aromatazu (kao što je egzemestan (AROMASIN<®>)).

[0134] Jedno ili više jedinjenja pronalaska mogu da se koriste sa jedinjenjem koje ometa sposobnost estrogena da stimuliše rast ćelija kancera dojke, kao što je selektivni modulator receptora estrogena (SERM) koji se vezuje za receptor estrogena kako bi sprečio vezivanje estrogena, kao što je tamoksifen (NOLVADEX<®>) i toremifen (FARESTON<®>). Tamoksifen se koristi više od 30 godina za lečenje HR<+>kancera dojke.

[0135] Jedno ili više jedinjenja ovog pronalaska mogu da se koriste sa čistim antiestrogenom bez agonističkog dejstva na estrogene receptore, kao što je fulvestrant (FASLODEX<®>).

[0136] HR-pozitivan, HER2-negativan uznapredovali ili metastatski ili rekurentni kancer dojke može da predstavlja kancer dojke kod žene u postmenopauzi. HR-pozitivan, HER2-negativan uznapredovali ili metastatski ili rekurentni kancer dojke može da bude u progresiji nakon primene terapije koja menja nivo hormona pacijentkinje (npr. estrogena i/ili progesterona), ili može da dođe do pogoršanja nakon lečenja drugom hormonskom terapijom.

[0137] Jedno ili više jedinjenja pronalaska mogu da se koriste kod pacijentkinje koja se podvrgava ablaciji jajnika ili je već bila podvrgnuta ablaciji jajnika. Ablacija jajnika može da se izvrši ooforektomijom ili radioterapijom.

[0138] [0104] Jedno ili više jedinjenja ovog pronalaska mogu da se koriste sa jedinjenjem koje privremeno suzbija funkciju jajnika (npr. proizvodnju estrogena i/ili progesterona). Takvo jedinjenje uključuje agoniste gonadotropin-oslobađajućeg hormona (GnRH) ili agoniste oslobađajućeg hormona luteinizujućeg hormona (LH-RH), uključujući goserelin (ZOLADEX<®>) i leuprolid (LUPRON<®>).

[0139] Jedno ili više jedinjenja pronalaska mogu da se koriste sa jedinjenjem koje inhibira CYP3A4, kao što su ritonavir, indinavir, nelfinavir, sakvinavir, klaritromicin, telitromicin, hloramfenikol, ketokonazol, itrakonazol, posakonazol, vorikonazol, nefazodon, kobicistat, amiodaron, aprepitant, verapamil, diltiazem, eritromicin, flukonazol, mikonazol, bergamotin, cimetidin, ciprofloksacin, ciklosporin, donedaron, fluvoksamin, imatinib, valerijana, buprenorfin, kafestol, cilostazol, fosaprepitant, gabapentin, lomitapid, orfenadrin, ranitidin, ranolazin, takrolimus, tikagrelor, valproinska kiselina, amlodipin, kanabidiol, ditiokarbamat, mifepriston, norfloksacin, delavirdin, gestoden, mibefradil, karambola, gujina trava, niacinamid, ginkgo biloba, piperin, izoniazid i kvercetin.

[0140] Jedno ili više jedinjenja pronalaska mogu da se koriste sa inhibitorom IGF-1/IGF-2, kao što je monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment protiv IGF-1/IGF-2. Primeri antitela uključuju ksentuzumab, humanizovano IgG1 mAb.

[0141] Jedno ili više jedinjenja ovog pronalaska mogu da se koriste sa jedinjenjem koje inhibira PI3K. Veruje se da inhibicija PI3K smanjuje nivoe ciklina D1 i drugih G1-S ciklina, ukida fosforilaciju pRb i inhibira aktivaciju transkripcionih programa S-faze. Reprezentativni inhibitori PI3K za upotrebu sa jedinjenjima ovog pronalaska uključuju idelalisib, kopanlisib, duvelisib, taselisib, perifozin, buparlisib, alpelisib, umbralisib, kopanlisib, daktolisib i vokstalisib.

[0142] Sisar koji se leči može da bude čovek, kao što je odrasla žena koja ima kancer dojke (npr. žena u postmenopauzi ili odrasla žena sa kancerom dojke pozitivnim na hormonske receptore (HR), negativnim na receptor humanog epidermalnog faktora rasta 2 (HER2), uznapredovalim ili metastatskim ili rekurentnim kancerom dojke, koji je progredovao nakon terapije koja menja nivo hormona kod pacijentkinje).

[0143] Pored toga, određena jedinjenja predmetnog pronalaska pokazuju povoljno svojstvo da mogu da prođu kroz krvno-moždanu barijeru. Takva jedinjenja su stoga sposobna da prodru u mozak i samim tim su korisna u lečenju primarnih i metastatskih tumora mozga, gde ćelije proliferišu i sadrže funkcionalan, intaktan Rb1 gen. Primeri takvih pRb<+>tumora mozga uključuju glioblastom, kao i meduloblastom i astrocitom (Lee et al., Science 235:1394, 1987).

[0144] [0110] Temozolomid je citotoksični agens za alkilovanje DNK koji se koristi za lečenje tumora mozga, uključujući glioblastom i astrocitom (Friedman et al., Clin. Cancer Res. 6(7):2585‑2597, 2000) uključujući metastaze na mozgu od melanoma, kancera dojke i NSCLC (Siena et al., Annals of Oncology, doi:10.1093/annonc/mdp343, 2009). Temozolomid interaguje sa DNK uzrokujući hemijsku modifikaciju/oštećenje (Marchesi et al., Pharmacol. Res. 56(4):275‑287, 2007). Jedinjenja ovog pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa temozolomidom za lečenje primarnih i metastatskih pRb<+>tumora mozga kao što su glioblastom i astrocitom, na primer, gde takve metastaze potiču od melanoma, kancera dojke ili NSCLC.

[0146] 5. Farmaceutske kompozicije

[0148] Pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže bilo koje od ovde opisanih jedinjenja, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa.

[0149] „Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens“ i „farmaceutski prihvatljiv nosač“ odnose se na supstancu koja pomaže u formulaciji i/ili primeni aktivnog agensa kod subjekta i/ili njenoj apsorpciji, i može da bude uključena u kompozicije ovog otkrića bez izazivanja značajnog negativnog toksikološkog efekta na subjekta. Neograničavajući primeri farmaceutski prihvatljivih nosača i ekscipijenasa uključuju vodu, NaCl, fiziološki rastvor, laktatni Ringerov rastvor, rastvor saharoze, rastvor glukoze, vezivna sredstva, punioce, dezintegrante, lubrikanse, premaze, zaslađivače, arome, rastvore soli (kao što je Ringerov rastvor), alkohole, ulja, želatine, ugljene hidrate kao što su laktoza, amiloza ili skrob, estre masnih kiselina, hidroksimetilcelulozu, polivinil pirolidin i boje, i slično. Takvi preparati mogu da se sterilišu i, po želji, pomešaju sa pomoćnim sredstvima kao što su lubrikansi, konzervansi, stabilizatori, sredstva za kvašenje, emulgatori, soli za regulisanje osmotskog pritiska, puferi, boje i/ili aromatične supstance i slično koji ne ispoljavaju štetnu reakciju sa ovde datim jedinjenjima, niti ometaju njihovu aktivnost. Stručnjak u ovoj oblasti će prepoznati da su i drugi farmaceutski nosači i ekscipijensi pogodni za upotrebu sa opisanim jedinjenjima.

[0150] Ove kompozicije opciono dalje sadrže jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa. Alternativno, jedinjenje pronalaska može da se primeni kod pacijenta kome je to potrebno u kombinaciji sa primenom jednog ili više drugih terapijskih režima (npr. Gleevec ili drugi inhibitori kinaze, interferon, transplantacija koštane srži, inhibitori farnezil transferaze, bisfosfonati, talidomid, vakcine protiv kancera, hormonska terapija, antitela, zračenje, itd.). Na primer, dodatni terapijski agensi za zajedničku primenu ili uključivanje u farmaceutsku kompoziciju sa jedinjenjem ovog pronalaska mogu da budu jedan ili više drugih antikancerskih agenasa.

[0151] [0114] Kao što je ovde opisano, kompozicije ovog pronalaska sadrže jedinjenje pronalaska zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, koji, kako se ovde koristi, uključuje sve rastvarače, razblaživače ili druge vehikulume, pomoćna sredstva za dispergovanje ili suspendovanje, površinski aktivna sredstva, izotonična sredstva, sredstva za zgušnjavanje ili emulgatore, konzervanse, čvrsta vezivna sredstva, lubrikanse i slično, kako je pogodno za određeni željeni dozni oblik. Remington’s Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975) otkriva različite nosače koji se koriste u formulisanju farmaceutskih kompozicija i poznate tehnike za njihovu pripremu. Osim ukoliko je bilo koji konvencionalni nosač nekompatibilan sa jedinjenjima pronalaska, u smislu stvaranja bilo kakvog neželjenog biološkog efekta ili na drugi način štetne interakcije sa bilo kojom drugom komponentom/komponentama farmaceutske kompozicije, smatra se da je njegova upotreba obuhvaćena ovim pronalaskom. Neki primeri materija koje mogu da posluže kao farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, šećere kao što su laktoza, glukoza i saharoza; skrobove kao što su kukuruzni skrob i skrob krompira; celulozu i njene derivate kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celulozni acetat; praškasti tragakant; slad; želatin; talk; ekscipijense kao što su kakao puter i voskovi za supozitorije; ulja kao što su ulje kikirikija, ulje pamučnog semena; ulje šafranike; susamovo ulje; maslinovo ulje; kukuruzno ulje i sojino ulje; glikole; kao što je propilen glikol; estre kao što su etil oleat i etil laurat; agar; puferska sredstva kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; alginsku kiselinu; vodu bez pirogena; izotonični fiziološki rastvor; Ringerov rastvor; etil alkohol i fosfatno puferisane rastvore, kao i druge netoksične kompatibilne lubrikanse kao što su natrijum-lauril-sulfat i magnezijum-stearat, dok u kompoziciji takođe mogu da budu prisutna sredstva za bojenje, sredstva za oslobađanje, sredstva za premazivanje, zaslađivači, sredstva za poboljšanje ukusa i mirisa, konzervansi i antioksidanti.

[0152] 6. Formulacije

[0154] Ovaj pronalazak takođe obuhvata klasu kompozicija koje sadrže aktivna jedinjenja ovog pronalaska u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i/ili razblaživača i/ili adjuvanasa (zajednički ovde nazvani „nosači“) i, po želji, drugim aktivnim sastojcima.

[0155] U određenim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju, pogodnu za lečenje kancera, posebno ovde opisanih kancera, koja sadrži jedinjenje ovog pronalaska ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0156] [0117] U određenim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju, pogodnu za lečenje kancera izabranog iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog kancera, limfoma mantle ćelija, kancera dojke (uključujući ER<+>HER2<->uznapredovali ili metastatski ili rekurentni kancer dojke kod odrasle žene ili žene u postmenopauzi), glioblastoma, akutne mijeloidne leukemije i kancera pluća, posebno NSCLC, koja sadrži jedinjenje ovog pronalaska ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0157] U određenim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju, pogodnu za lečenje glioblastoma ili astrocitoma, koja sadrži jedinjenje pronalaska i temozolomid, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0158] U određenim primerima izvođenja, pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži jedinjenje pronalaska ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i temozolomid, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijensom.

[0159] U određenim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju, pogodnu za lečenje NSCLC, kancera pankreasa, kancera jajnika ili metastatskog kancera dojke (uključujući ER<+>HER2<->uznapredovali ili metastatski ili rekurentni kancer dojke kod odrasle žene ili žene u postmenopauzi), koja sadrži jedinjenje pronalaska i gemcitabin HCl, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0160] U određenim primerima izvođenja, pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži jedinjenje pronalaska ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i gemcitabin HCl, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijensom.

[0161] Aktivna jedinjenja ovog pronalaska mogu da se primenjuju bilo kojim pogodnim putem, poželjno u obliku farmaceutske kompozicije prilagođene takvom putu, i u dozi koja je efikasna za predviđeno lečenje. Jedinjenja i kompozicije ovog pronalaska mogu da se, na primer, primenjuju oralno, mukozno, topikalno, rektalno, preko pluća, na primer putem spreja za inhalaciju, ili parenteralno, uključujući intravaskularne, intravenske, intraperitonealne, subkutane, intramuskularne, intrasternalne i infuzione tehnike, u doznim jedinicama formulacija koje sadrže konvencionalne farmaceutski prihvatljive nosače, adjuvanse i vehikulume.

[0162] Farmaceutski aktivna jedinjenja ovog pronalaska mogu da se obrađuju u skladu sa konvencionalnim farmaceutskim postupcima da bi se proizveli lekovi za primenu kod pacijenata, uključujući ljude i druge sisare.

[0163] Za oralnu primenu, farmaceutska kompozicija može da bude u obliku, na primer, tablete, kapsule, suspenzije ili tečnosti. Farmaceutska kompozicija je poželjno napravljena u obliku dozne jedinice koja sadrži određenu količinu aktivnog sastojka.

[0164] Primeri takvih doznih jedinica su tablete ili kapsule. Na primer, odgovarajuća dnevna doza za čoveka ili drugog sisara može da varira u zavisnosti od stanja pacijenta i drugih faktora, ali, još jednom, može da se odredi korišćenjem rutinskih postupaka.

[0165] Količina jedinjenja koja se primenjuje i režim doziranja za lečenje bolesnog stanja jedinjenjima i/ili kompozicijama ovog pronalaska zavise od različitih faktora, uključujući starost, težinu, pol i medicinsko stanje subjekta, vrstu bolesti, težinu bolesti, način i učestalost primene i konkretno jedinjenje koje se koristi. Stoga, režim doziranja može značajno da varira, ali može rutinski da se odredi korišćenjem standardnih postupaka. Kao što je prethodno pomenuto, dnevna doza može da se daje u jednoj primeni ili može da se podeli na 2, 3, 4 ili više primena.

[0166] U terapijske svrhe, aktivna jedinjenja ovog pronalaska se obično kombinuju sa jednim ili više adjuvanasa, ekscipijenasa ili nosača koji odgovaraju naznačenom načinu primene. Ako se primenjuju peroralno, jedinjenja mogu da se pomešaju sa laktozom, saharozom, skrobnim prahom, celuloznim estrima alkanoinske kiseline, celuloznim alkil estrima, talkom, stearinskom kiselinom, magnezijum stearatom, magnezijum oksidom, natrijumovim i kalcijumovim solima fosforne i sumporne kiseline, želatinom, akacijevom gumom, natrijum alginatom, polivinilpirolidonom i/ili polivinil alkoholom, a zatim tabletiraju ili inkapsuliraju za pogodnu primenu. Takve kapsule ili tablete mogu da sadrže formulaciju sa kontrolisanim oslobađanjem koja može da bude obezbeđena u vidu disperzije aktivnog jedinjenja u hidroksipropilmetil celulozi.

[0167] U slučaju kožnih oboljenja, može da bude poželjno primeniti topikalni preparat jedinjenja ovog pronalaska na pogođeno područje dva do četiri puta dnevno. Formulacije pogodne za topikalnu primenu uključuju tečne ili polutečne preparate pogodne za penetraciju kroz kožu (npr. linimenti, losioni, masti, kreme ili paste) i kapi pogodne za primenu u oko, uho ili nos. Za topikalnu primenu, aktivni sastojak može da čini od 0,001% do 10% tež./tež, npr. od 1% do 2% po težini formulacije, mada može da čini čak 10% tež./tež, ali poželjno ne više od 5% tež./tež, a još poželjnije od 0,1% do 1% formulacije.

[0168] Jedinjenja ovog pronalaska mogu da se primenjuju i transdermalnim uređajem. Transdermalna primena se poželjno ostvaruje pomoću flastera, bilo tipa rezervoara i porozne membrane ili tipa čvrste matrice. U oba slučaja, aktivni agens se kontinuirano isporučuje iz rezervoara ili mikrokapsula kroz membranu u adheziv propustljiv za aktivni agens, koji je u kontaktu sa kožom ili sluzokožom primaoca. Ukoliko se aktivni agens apsorbuje kroz kožu, kod primaoca se primenjuje kontrolisani i unapred određeni protok aktivnog agensa. U slučaju mikrokapsula, sredstvo za inkapsuliranje može takođe da ima funkciju membrane. Uljana faza emulzija ovog pronalaska može da bude sačinjena od poznatih sastojaka pripremljenih na poznat način.

[0169] [0130] Iako faza može da sadrži samo emulgator, može da sadrži smešu najmanje jednog emulgatora sa mašću ili uljem ili sa oba sastojka, i mašću i uljem. Poželjno je da se hidrofilni emulgator uključi zajedno sa lipofilnim emulgatorom koji deluje kao stabilizator. Takođe je poželjno da se uključe i ulje i mast. Zajedno, emulgator(i) sa ili bez jednog ili više stabilizatora čine takozvani emulgujući vosak, a vosak zajedno sa uljem i mašću čini takozvanu emulgujuću bazu masti koja formira uljanu dispergovanu fazu kremastih formulacija. Emulgatori i stabilizatori emulzije pogodni za upotrebu u formulaciji ovog pronalaska uključuju Tween 60, Span 80, cetostearil alkohol, miristil alkohol, gliceril monostearat, natrijum lauril sulfat, gliceril distearat, sam ili sa voskom, ili druge materijale dobro poznate u struci.

[0170] Izbor odgovarajućih ulja ili masti za formulaciju zasniva se na postizanju željenih kozmetičkih svojstava, budući da je rastvorljivost aktivnog jedinjenja u većini ulja koja će se verovatno koristiti u farmaceutskim emulzionim formulacijama veoma niska. Stoga, krema bi poželjno trebalo da bude nemasna, da ne ostavlja mrlje i da može da se pere, sa odgovarajućom konzistencijom kako bi se izbeglo curenje iz tuba ili drugih posuda. Mogu da se koriste ravnolančani ili razgranati, mono -ili dibazni alkil estri kao što su di-izoadipat, izocetil stearat, propilen glikol diestar kokosovih masnih kiselina, izopropil miristat, decil oleat, izopropil palmitat, butil stearat, 2-etilheksil palmitat ili mešavina estara razgranatog lanca. Ovi estri mogu da se koriste sami, ili u kombinaciji, u zavisnosti od potrebnih svojstava.

[0171] Alternativno, mogu da se koriste lipidi visoke tačke topljenja kao što su beli meki parafin i/ili tečni parafin ili druga mineralna ulja.

[0172] Formulacije pogodne za topikalnu primenu u oko takođe uključuju kapi za oči u kojima su aktivni sastojci rastvoreni ili suspendovani u odgovarajućem nosaču, posebno vodenom rastvaraču za aktivne sastojke.

[0173] Aktivni sastojci su poželjno prisutni u takvim formulacijama u koncentraciji od 0,5 do 20%, poželjno od 0,5 do 10%, a posebno oko 1,5% tež./tež.

[0174] [0135] Formulacije za parenteralnu primenu mogu da budu u obliku vodenih ili nevodenih izotoničnih sterilnih rastvora ili suspenzija za injekcije. Ovi rastvori i suspenzije mogu da se pripreme od sterilnih praškova ili granula korišćenjem jednog ili više nosača ili razblaživača koji su navedeni za upotrebu u formulacijama za oralnu primenu ili korišćenjem drugih pogodnih sredstava za dispergovanje ili kvašenje i sredstava za suspendovanje. Jedinjenja mogu da se rastvore u vodi, polietilen glikolu, propilen glikolu, etanolu, kukuruznom ulju, ulju pamučnog semena, ulju kikirikija, susamovom ulju, benzil alkoholu, natrijum hloridu, tragakantovoj gumi i/ili različitim puferima. Drugi adjuvansi i načini primene su dobro i široko poznati u farmaceutskoj struci. Aktivni sastojak takođe može da se primenjuje injekcijom kao kompozicija sa pogodnim nosačima, uključujući fiziološki rastvor, dekstrozu ili vodu, uz primenu ciklodekstrina (tj. Captisol), solubilizacije pomoću kosolventa (tj. propilen glikol) ili micelarne solubilizacije (tj. Tween 80).

[0175] Sterilni preparat za injekcije može takođe da bude sterilni rastvor ili suspenzija za injekcije u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču, na primer kao rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim vehikulumima i rastvaračima koji mogu da se koriste su voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, sterilna, fiksna ulja se konvencionalno koriste kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U tu svrhu može da se koristi bilo koje blago fiksno ulje, uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Dodatno, masne kiseline kao što je oleinska kiselina nalaze upotrebu u pripremi injektabilnih preparata.

[0176] Za primenu putem pluća, farmaceutska kompozicija može da se primenjuje u obliku aerosola ili pomoću inhalatora koji sadrži aerosol suvog praška.

[0177] Supozitorije za rektalnu primenu leka mogu da se pripreme mešanjem leka sa odgovarajućim neiritativnim ekscipijensom kao što su kakao puter i polietilen glikoli koji su čvrsti na običnim temperaturama, ali tečni na rektalnoj temperaturi, usled čega se u rektumu otapaju i oslobađaju lek.

[0178] Farmaceutske kompozicije mogu da budu podvrgnute konvencionalnim farmaceutskim postupcima kao što je sterilizacija i/ili mogu da sadrže konvencionalne adjuvanse, kao što su konzervansi, stabilizatori, sredstva za kvašenje, emulgatori, puferi itd. Tablete i pilule mogu dodatno da se pripreme sa enteričnim oblogama. Takve kompozicije mogu takođe da sadrže adjuvanse, kao što su sredstva za kvašenje, zaslađivanje, davanje arome i mirisa. Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska sadrže jedinjenje ovde opisanih formula ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; dodatni agens odabran od agenasa za inhibiciju kinaze (mali molekul, polipeptid, antitelo, itd.), imunosupresora, antikancerskog agensa, antivirusnog agensa, antiinflamatornog agensa, antifungalnog agensa, antibiotika ili jedinjenja protiv vaskularne hiperproliferacije; i bilo koji farmaceutski prihvatljiv nosač, adjuvans ili vehikulum.

[0179] Alternativne kompozicije ovog pronalaska sadrže jedinjenje ovde opisanih formula ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; i farmaceutski prihvatljiv nosač, adjuvans ili vehikulum. Takve kompozicije mogu opciono da sadrže jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa, uključujući, na primer, agense koji inhibiraju kinazu (mali molekul, polipeptid, antitelo, itd.), imunosupresore, antikancerske agense, antivirusne agense, antiinflamatorne agense, antifungalne agense, antibiotike ili jedinjenja protiv vaskularne hiperproliferacije.

[0180] [0141] Termin „farmaceutski prihvatljiv nosač ili adjuvans“ odnosi se na nosač ili adjuvans koji može da se primeni kod pacijenta, zajedno sa jedinjenjem ovog pronalaska, a koji ne poništava njegovu farmakološku aktivnost i nije toksičan kada se primenjuje u dozama dovoljnim da isporuče terapijsku količinu jedinjenja. Farmaceutski prihvatljivi nosači, adjuvansi i vehikulumi koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, jonske izmenjivače, aluminijum oksid, aluminijum stearat, lecitin, samoemulgirajuće sisteme za isporuku lekova (SEDDS) kao što je d-atokoferol polietilenglikol 1000 sukcinat, surfaktante koji se koriste u farmaceutskim doznim oblicima kao što su Tweens ili druge slične polimerne matrice za isporuku, serumske proteine, kao što je humani serumski albumin, puferske supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, delimične gliceridne smeše zasićenih biljnih masnih kiselina, vodu, soli ili elektrolite, kao što su protamin sulfat, dinatrijum hidrogenfosfat, kalijum hidrogenfosfat, natrijum hlorid, cinkove soli, koloidni silicijum dioksid, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, supstance na bazi celuloze, polietilen glikol, natrijum karboksimetilceluloza, poliakrilate, voskove, polietilen-polioksipropilenblok polimere, polietilen glikol i lanolin. Ciklodekstrini kao što su u-, P- i y-ciklodekstrin, ili hemijski modifikovani derivati kao što su hidroksialkilciklodekstrini, uključujući 2 i 3-hidroksipropilciklodekstrine, ili drugi rastvorljivi derivati takođe se mogu povoljno koristiti za poboljšanje isporuke jedinjenja ovde opisanih formula.

[0181] Farmaceutske kompozicije mogu se oralno primenjivati u bilo kom oralno prihvatljivom doznom obliku, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kapsule, tablete, emulzije i vodene suspenzije, disperzije i rastvore. U slučaju tableta za oralnu upotrebu, nosači koji se obično koriste uključuju laktozu i kukuruzni skrob. Takođe se obično dodaju lubrikansi, kao što je magnezijum stearat. Za oralnu primenu u obliku kapsula, korisni razblaživači uključuju laktozu i sušeni kukuruzni skrob. Kada se vodene suspenzije i/ili emulzije primenjuju oralno, aktivni sastojak može da bude suspendovan ili rastvoren u uljanoj fazi u kombinaciji sa emulgatorima i/ili sredstvima za suspendovanje.

[0182] Po želji, mogu se dodati određeni zaslađivači, arome i/ili boje. Farmaceutske kompozicije mogu da sadrže formulacije koje koriste tehnike lipozoma ili mikroinkapsulacije, čiji su različiti primeri poznati u struci.

[0183] Farmaceutske kompozicije mogu da se primenjuju putem nazalnog aerosola ili inhalacijom. Takve kompozicije se pripremaju prema tehnikama dobro poznatim u oblasti farmaceutske formulacije i mogu da se pripreme kao rastvori u fiziološkom rastvoru, korišćenjem benzil alkohola ili drugih odgovarajućih konzervanasa, promotera apsorpcije za poboljšanje biodostupnosti, fluorougljenika i/ili drugih sredstava za rastvaranje ili dispergovanje, čiji su primeri takođe dobro poznati u struci.

[0184] 7. Kompleti za lečenje

[0186] Komplet može da bude obezbeđen za praktično i efikasno sprovođenje postupaka ili upotreba opisanih ovde. Generalno, farmaceutsko pakovanje ili komplet sadrži jednu ili više posuda napunjenih jednim ili većim brojem sastojaka farmaceutskih kompozicija pronalaska. Takvi kompleti su posebno pogodni za isporuku čvrstih oralnih oblika kao što su tablete ili kapsule. Takav komplet poželjno uključuje određeni broj doznih jedinica, a može takođe da sadrži karticu sa dozama orijentisanim po redosledu njihove predviđene upotrebe. Po želji, može da se obezbedi podsetnik, na primer u obliku brojeva, slova ili drugih oznaka ili sa kalendarskim umetkom, koji označava dane u rasporedu lečenja u kojima se doze mogu primenjivati. Opciono, uz takvu/takve posudu/posude može da bude dato obaveštenje u obliku koji je propisala vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih proizvoda, a koje odražava odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za primenu kod ljudi.

[0187] Sledeći reprezentativni primeri sadrže važne dodatne informacije, primere i smernice koje se mogu prilagoditi praktikovanju ovog pronalaska u njegovim različitim primerima izvođenja i ekvivalentima. Ovi primeri su namenjeni da pomognu u ilustrovanju pronalaska i nisu namenjeni da ograniče njegov obim, niti bi trebalo da se tumače kao takvi. Zaista, različite modifikacije pronalaska i mnogi njegovi dodatni primeri izvođenja, pored onih koja su ovde prikazani i opisani, postaće očigledni stručnjacima u ovoj oblasti nakon pregleda ovog dokumenta, uključujući primere koji slede i ovde navedene reference na naučnu i patentnu literaturu.

[0188] Sadržaj citiranih referenci je ovde uključen putem reference kako bi se ilustrovalo stanje tehnike.

[0189] Pored toga, za potrebe ovog pronalaska, hemijski elementi su identifikovani u skladu sa Periodnim sistemom elemenata, CAS verzija, Priručnik za hemiju i fiziku, 75. izdanje, unutrašnja strana korica. Pored toga, opšti principi organske hemije, kao i specifične funkcionalne grupe i reaktivnost, opisani su u "Organic Chemistry," Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, i "Organic Chemistry," Morrison & Boyd (3d Ed), čiji je celokupni sadržaj ovde uključen putem reference.

[0191] 8. Šeme sinteze

[0193] [0149] Jedinjenja formule I mogu da pripreme stručnjaci u ovoj oblasti primenom tehnika i postupaka priznatih u struci. Konkretnije, jedinjenja formule I mogu da se pripreme kao što je navedeno na šemama, u postupcima i primerima navedenim u nastavku. Stručnjaku u ovoj oblasti će biti jasno da se pojedinačni koraci na sledećim šemama mogu menjati da bi se dobila jedinjenja formule I. Reagensi i polazni materijali su lako dostupni stručnjaku u ovoj oblasti. Svi supstituenti su, osim ako nije drugačije naznačeno, kao što je prethodno definisano.

[0195] PRIMERI

[0197] Primeri sinteze

[0199] Opis opreme

[0201] <1>H NMR spektri su snimljeni na spektrometru Bruker Ascend 400. Hemijski pomaci su izraženi u milionitim delovima (ppm, δ jedinice). Konstante sprezanja su u jedinicama herca (Hz). Obrasci razdvajanja opisuju prividne multiplicitete i označeni su kao s (singlet), d (dublet), t (triplet), q (kvartet), quint (kvintet), m (multiplet), br (široki).

[0202] Analitički maseni spektri (MS) niske rezolucije snimljeni su na Waters ACQUITY UPLC sa SQ detektorima korišćenjem Waters CORTECS C18+, 2,7 µm 4,6 × 30 mm postupkom elucije gradijentom.

[0204] Rastvarač A: 0,1% mravlja kiselina (FA) u vodi

[0205] Rastvarač B: 0,1% FA u acetonitrilu

[0206] 5% ACN do 95% ACN za 1,0 min, zadržavanje 1,0 min,

[0207] Ukupno 2,5 min; Brzina protoka: 1,8 ml/min; Temperatura kolone 40 stepeni.

[0209] Intermedijer

[0211]

[0212]

[0215] Korak 1

[0217] U rastvor 4-benziloksipiridina (185 mg, 998 µmol) u DCM (10 ml) dodat je amino 2,4,6-trimetilbenzensulfonat (236 mg, 1,1 mmol) na 25 °C. Reakciona smeša je mešana na 25 °C tokom 14 sati. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi željeni proizvod (400 mg) kao bezbojno ulje. LC-MS: m/z 202 [M+H]<+>.

[0219] Korak 2

[0221] U rastvor gore navedenog proizvoda (187 mg, 487 µmol) u DMF-u (10 ml) dodat je Cs<2>CО<3>(192 mg, 1,4 mmol) i but-3-in-2-on (94 mg, 1,4 mmol). Reakciona smeša je mešana na 25 °C tokom 12 sati. Reakciona smeša je ugašena vodom (50 ml) i ekstrahovana sa DCM (2 × 25 ml). Organski sloj je ispran slanim rastvorom (20 ml), osušen preko anhidrovanog Na<2>SO<4>i koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (eluiranje sa PE/EA = 10/1) da bi se dobio željeni proizvod (90 mg, prinos 35%) kao žuta čvrsta supstanca. LC-MS: m/z 267 [M+H]<+>.

[0222] Korak 3

[0224] [0155] U rastvor metil(trifenil)fosfonijum bromida (241 mg, 675 µmol) u THF-u (10 ml) ukapan je butillitijum (43,3 mg, 675 µmol) pod N<2>na -20 °C. Reakcija je mešana na -20 °C tokom 1 sata. Zatim je rastvor 1-(5-benziloksipirazolo[1,5-a] piridin-3-il) etanona (90 mg, 338 µmol) u THF-u (15 ml) ukapan na -20 °C. Reakciona smeša je mešana na 10 °C tokom 3 sata. Reakciona smeša je ugašena sa MeOH (3 ml) i koncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen preparativnom HPLC (eluiranjem sa PE: EA = 1/1) da bi se dobio sirovi željeni proizvod (41 mg) kao žuta čvrsta supstanca. LC-MS: m/z 265 [M+H]<+>.

[0226] Korak 4

[0228] U rastvor 5-benziloksi-3-izopropenil-pirazolo[1,5-a] piridina (600 mg, 2,3 mmol) u metanolu (50 mL) dodat je Pd/C (60 mg). Reakciona smeša je mešana na 30 °C pod H<2>tokom 48 sati. Reakciona smeša je filtrirana i koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio željeni proizvod (380 mg) kao žuta čvrsta supstanca. LC-MS: m/z 177 [M+H]<+>.

[0230] Korak 5

[0232] U rastvor 3-izopropilpirazolo[1,5-a] piridin-5-ola (650 mg, 3,7 mmol) i DIPEA (410 mg, 4,1 mmol) u DCM-u (15 ml) dodat je Tf<2>O (1,1 g, 4,1 mmol) pod N<2>na 0 °C. Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 2 sata. Reakciona smeša je isprana slanim rastvorom (15 ml) i osušena preko Na<2>SO<4>. Organski sloj je filtriran, a filtrat je koncentrovan da bi se dobio željeni proizvod (1,1 g) kao bezbojno ulje. LC-MS: m/z 309 [M+H]<+>.

[0234] Korak 6

[0236] U rastvor (3-izopropilpirazolo[1,5-a]piridin-5-il) trifluorometansulfonata (1,1 g, 3,4 mmol) i 4,4,5,5-tetrametil-2-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)-1,3,2-dioksaborolana (1,3 g, 5,1 mmol) u dioksanu (10 ml) dodat je Pd(dppf)Cl<2>(249 mg, 340 µmol) i KOAc (1,0 g, 10,2 mmol). Reakciona smeša je mešana na 110 °C tokom 2 sata pod N<2>. Smeša je filtrirana, a filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobio sirovi željeni proizvod (950 mg) kao tamna čvrsta supstanca. LC-MS: m/z 287 [M+H]<+>.

[0238] Korak 7

[0240] U rastvor 3-izopropil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)pirazolo[1,5-a]piridina (950 mg, 3,3 mmol) i 2,4-dihloro-5-fluoro-pirimidina (665 mg, 4,0 mmol) u H<2>O (1 ml) i 1,4-dioksanu (15 ml) dodat je Na<2>CО<3>(1,2 g, 10 mmol) i Pd(dppf)Cl<2>(242 mg, 332 µmol). Smeša je mešana pod N<2>na 110 °C tokom 6 sati. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, a ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (PE/EA sa EA 0-50%) da bi se dobio željeni proizvod (650 mg, prinos 67%) kao žuta čvrsta supstanca. LC-MS: m/z 291 [M+H]<+>.

[0241]

[0244] U rastvor 3-izopropil-5-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il)pirazolo[1,5-a]piridina (3,5 g, 12,2 mmol) i 2,4-dihloropirimidina (2,7 g, 18,4 mmol) u vodi (3 ml) i 1,4-dioksana (60 ml) dodat je Pd(dppf)Cl<2>(0,9 g, 1,2 mmol) i Na<2>CО<3>(1,52 g, 14 mmol). Reakciona smeša je mešana pod N<2>na 110 °C tokom 6 sati. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom, a ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (PE sa EA 0-50%) da bi se dobio željeni proizvod (2,1 g, prinos 62%) kao žuta čvrsta supstanca. LC-MS: m/z 273 [M+H]<+>.

[0247]

[0250] Korak 1

[0252] U smešu piperidin-2,4-diona (2,1 g, 18,5 mmol) i N-metilmetanamina (3,4 g, 74,2 mmol) u DCM-u (36 ml) i THF-u (18 ml) dodata je CH<3>COOH (10 ml), dobijena smeša je mešana u atmosferi azota na 25 °C tokom 3 sata. Ovoj smeši je dodat natrijum triacetoksiborohidrid (7,8 g, 37,1 mmol), dobijena smeša je mešana u atmosferi azota na 25 °C tokom 12 sati. Reakcija je ugašena vodom (50 ml) i koncentrovana u vakuumu da bi se uklonili DCM i THF. Smeša je ekstrahovana sa DCM (3 × 100 ml). Organski rastvor je ispran slanim rastvorom (20 ml). Organska faza je osušena preko Na<2>SO<4>, filtrirana i koncentrovana pod sniženim pritiskom da bi se dobio željeni proizvod (2,6 g), koji je korišćen u sledećem koraku bez ikakvog prečišćavanja. LC-MS: m/z 141,2 [M+H]<+>.

[0254] Korak 2

[0255] U smešu 4-(dimetilamino)-2,3-dihidro-1H-piridin-6-ona (1,0 g, 7,1 mmol) u metanolu (15 ml) dodat je natrijum borohidrid (539 mg, 14,2 mmol), dobijena smeša je mešana u atmosferi azota na 25 °C tokom 12 sati. Reakcija je ugašena zasićenim vodenim rastvorom NH<4>Cl (10 ml), a zatim koncentrovana u vakuumu da bi se uklonio MeOH. Vodeni rastvor je prečišćen pomoću reverznofazne kolone (C18, 40 g) eluiranjem sa (MeCN/voda (0,1% NH<4>OH) = 1/10) da bi se dobio željeni proizvod (0,3 g, prinos 32%) kao svetlo žuta čvrsta supstanca. LC-MS: m/z 143,2 [M+H]<+>.

[0257] Korak 3

[0259] U smešu 4-(dimetilamino)piperidin-2-ona (270 mg, 1,9 mmol), 5-jodopiridin-2-amina (1,0 g, 4,7 mmol) i kalijum fosfata (1,2 g, 5,7 mmol) u dioksanu (26 ml) dodat je (1S,25)-N1,N2-dimetilcikloheksan-1,2-diamin (162 mg, 1,1 mmol) i CuI (108 mg, 569 µmol), dobijena smeša je mešana u atmosferi azota na 110 °C tokom 12 sati. Reakcija je filtrirana. Filtrat je koncentrovan u vakuumu da bi se dobio ostatak, koji je prečišćen pomoću reverzno-fazne kolone (C18, 20 g) eluiranjem sa (MeCN/voda (0,1% NH<4>OH) = 1/10) da bi se dobio željeni proizvod (272 mg, prinos 61%) kao svetložuta čvrsta supstanca. LC-MS: m/z 235,2 [M+H]<+>.

[0261] Primer sinteze 1 (nije obuhvaćen pronalaskom za koji se traži zaštita)

[0263]

[0266]

[0269] [0165] U smešu 1-(6-amino-3-piridil)-4-(dimetilamino)piperidin-2-ona (30 mg, 128 µmol) i 5-(2-hloropirimidin-4-il)-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]piridina (38,4 mg, 140,8 µmol) u dioksanu (5 ml) dodat je cezijum karbonat (125,1 mg, 384,1 µmol), tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum(0) (11,7 mg, 12,8 µmol) i RuPhos (11,9 mg, 25,6 µmol). Dobijena smeša je mešana u atmosferi azota na 110 °C tokom 4 sata. Reakciona smeša je ekstrahovana sa EA (20 ml). Organska faza je isprana vodom (3 × 20 ml), slanim rastvorom (3 × 20 ml) i osušena preko Na<2>SO<4>. Smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom i prečišćena pomoću fleš hromatografije na koloni (DCM/MeOH = 10:1) da bi se dobio željeni proizvod (23,8 mg, prinos 39%) kao žuta čvrsta supstanca. LC-MS: m/z 471,2 [M+H]<+>.

[0271] Primeri sinteze 2 i 3 (Primer sinteze 2 nije obuhvaćen pronalaskom za koji se traži zaštita)

[0273]

[0276]

[0279] N-[5-[4-(dimetilamino)-1-piperidil]-2-piridil]-4-(3-izopropilpirazolo[1,5-a]piridin-5-il)pirimidin-2-amin (210 mg, 459,9 µmol) je razdvojen hiralnom SFC metodom sa mobilnom fazom (heksan/EtOH/DEA = 60/40/0,1) (talasna dužina: UV 214 nm, kolona: CHIRALCEL OD-H 5,0 cm I.D. × 25 cm L, brzina protoka: 60 ml/min) da bi se dobio primer sinteze 2 (44,2 mg, prinos 21%) kao žuta čvrsta supstanca (LC-MS: m/z 471,2 [M+H]<+>. enantiomerni višak >99%) i primer sinteze 3 (41 mg, prinos 19%) kao žuta čvrsta supstanca (LC-MS: m/z 471,2 [M H]<+>. enantiomerni višak = 97%).

[0281] Biološki primer 1. Test za inhibiciju CDK4/ciklinD1

[0283] [0168] Analiza enzima CDK4 za određivanje IC<50>je izvršena na sledeći način. Tehnologija detekcije mikrofluidne kinaze (Caliper) korišćena je za praćenje fosforilacije peptidnog supstrata pomoću CDK4/ciklinD1. Ukupna zapremina reakcije bila je 15 µl, i u nju je bio uključen pufer A (100 mM HEPES (pH 7,5), 0,1% BSA, 0,01% Triton X-100, 1 mM DTT, 10 mM MgCl<2>, 10 µM natrijum ortovanadata, 10 µM beta-glicerofosfata), 200 µM ATP, 1 nM CDK4/ciklinD1 (Thermofisher, PR8064A), 1 µM FL-34 (5-FAM-RRRFRPASPLRGPPK) i ispitivano jedinjenje u odgovarajućim razblaženjima u DMSO. Sve komponente su dodate na ploču sa 384 bunarčića (Corning, 4514) i inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reakcija je prekinuta dodatkom 15 µl pufera za zaustavljanje reakcije (180 mM HEPES (pH 7,5), 20 mM EDTA, reagens Coating-3 (PerkinElmer, 760050)). Ploča je zatim postavljena na čitač Caliper EZ Reader (EZ Reader II, PerkinElmer, HD-4HYSG2772), a reakcione smeše, uključujući supstrat i proizvod, su usisane u mikrofluidni čip radi razdvajanja i detekcije. Vrednosti IC<50>ispitivanog jedinjenja određene su fitovanjem krivih inhibicije pomoću 4-parametarskog sigmoidnog modela doza-odgovor korišćenjem softvera Xlfit5/GraphPad Prism 5.

[0285] Biološki primer 2. Test za inhibiciju CDK6/ciklinD3

[0287] Analiza enzima CDK6 za određivanje IC<50>je izvršena na sledeći način. Tehnologija detekcije mikrofluidne kinaze (Caliper) je korišćena za praćenje fosforilacije peptidnog supstrata pomoću CDK6/ciklinD3. Ukupna zapremina reakcije je 15 µl, i u nju je uključen pufer A (100 mM HEPES (pH 7,5), 0,1% BSA, 0,01% Triton X-100, 1 mM DTT, 10 mM MgCl<2>, 10 µM natrijum ortovanadata, 10 µM beta-glicerofosfata), 300 µM ATP, 2 nM CDK6/ciklinD3 (Carna, 04-107), 1 µM FL-34 (5-FAM-RRRFRPASPLRGPPK) i ispitivano jedinjenje u odgovarajućim razblaženjima u DMSO. Sve komponente su dodate na ploču sa 384 bunarčića (Corning, 4514) i inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reakcija je prekinuta dodatkom 15 µl pufera za zaustavljanje reakcije (180 mM HEPES (pH 7,5), 20 mM EDTA, reagens Coating-3 (PerkinElmer, 760050)). Ploča je zatim postavljena na čitač Caliper EZ Reader (EZ Reader II, PerkinElmer, HD-4HYSG2772), a reakcione smeše, uključujući supstrat i proizvod, su usisane u mikrofluidni čip radi razdvajanja i detekcije. Vrednosti IC<50>ispitivanog jedinjenja određene su fitovanjem krivih inhibicije pomoću 4-parametarskog sigmoidnog modela doza-odgovor korišćenjem softvera Xlfit5/GraphPad Prism 5.

[0289] Biološki primer 3. Test za inhibiciju CDK2/ciklinEl

[0291] [0170] Analiza enzima CDK2 za određivanje IC<50>je izvršena na sledeći način. Tehnologija detekcije mikrofluidne kinaze (Caliper) korišćena je za praćenje fosforilacije peptidnog supstrata pomoću CDK2/ciklinE1. Ukupna zapremina reakcije bila je 15 µl, i u nju je bio uključen pufer A (100 mM HEPES (pH 7,5), 0,1% BSA, 0,01% Triton X-100, 1 mM DTT, 10 mM MgCl<2>, 10 µM natrijum ortovanadata, 10 µM beta-glicerofosfata), 100 µM ATP, 5 nM CDK2/ciklinE1 (SignalChem, C29-18G), 5 µM FL-18 (5-FAM-QSPKKG-NH2) i ispitivano jedinjenje u odgovarajućim razblaženjima u DMSO. Sve komponente su dodate na ploču sa 384 bunarčića (Corning, 4514) i inkubirane na sobnoj temperaturi 3 sata. Reakcija je prekinuta dodatkom 15 µl pufera za zaustavljanje reakcije (180 mM HEPES (pH 7,5), 20 mM EDTA, reagens Coating-3 (PerkinElmer, 760050)). Ploča je postavljena na čitač Caliper EZ Reader (EZ Reader II, PerkinElmer, HD-4HYSG2772), a reakcione smeše, uključujući supstrat i proizvod, su usisane u mikrofluidni čip radi razdvajanja i detekcije. Vrednosti IC<50>ispitivanog jedinjenja određene su fitovanjem krivih inhibicije pomoću 4-parametarskog sigmoidnog modela doza-odgovor korišćenjem softvera Xlfit5/GraphPad Prism 5.

[0292] Vrednosti IC<50>svakog primera jedinjenja u odnosu na CDK2, CDK4 i CDK6 date su u primerima sinteze ispod. Vrednosti IC<50>su označene kao „A“, „B“, „C“ i „D“ za vrednosti manje ili jednake 10 nM; manje ili jednake 100 nM; manje ili jednake 1 µM; i veće od 1 µM, redom.

[0294] Biološki primer 4. Antiproliferativni test u ćeliji T47D

[0296] T47D je ćelijska linija humanog kancera dojke koja se često koristi u biomedicinskim istraživanjima koja uključuju hormonsku ekspresiju kod kancerskih ćelija. Ćelije T47D se razlikuju od drugih humanih ćelija kancera dojke po tome što njihovi progesteronski receptori (PR) nisu regulisani estradiolom, hormonom koji je obilno zastupljen u samim ćelijama. Ćelije T47D su korišćene u studijama uticaja progesterona na kancer dojke i odgovarajuće transkripcione regulacije izazvane uvedenim lekovima. Primećeno je da su ćelije izuzetno rezistentne na estrogene i antiestrogene.

[0297] Ćelije kancera dojke T47D iz Američke kolekcije tipova kultura (ATCC, HTB-133) su zasejane u koncentraciji od 3000 ćelija/bunarčiću na ploče sa 96 bunarčića i inkubirane su u medijumu RPMI 1640 (Gibco, 31800105) sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Biowest, FB-1058) na 37 °C, 5% CO<2>. Nakon inkubacije preko noći, početne vrednosti uzoraka sa jedne ploče su izmerene korišćenjem reagensa Cyquant (Invitrogen, C35011) prema preporukama proizvođača. Ćelije su inkubirane sa reagensom za detekciju 1 sat na 37 °C, a zatim je fluorescencija merena ekscitacijom na 485 nm i emisijom na 535 nm korišćenjem Spectra Max M5 (Molecular Devices, HD-4HYSG3196). Ostale ploče su tretirane jedinjenjima u dozama od deset različitih koncentracija u rasponu od 10 µM do 0,51 nM, primenom šeme trostrukog razblaženja. Šestog dana nakon dodavanja jedinjenja, dodat je reagens Cyquant i fluorescencija je merena pomoću uređaja Spectra Max M5. Vrednosti IC<50>antiproliferativne aktivnosti ispitivanog jedinjenja određene su na osnovu krive očitavanja vijabilnosti umanjene za početnu vrednost korišćenjem softvera Xlfit5/GraphPad Prism 5.

[0299] Biološki primer 5. Inhibicija fosforilacije proteina retinoblastoma (pRb) u ćeliji T47D

[0301] [0174] Ćelije kancera dojke T47D iz Američke kolekcije tipova kultura (ATCC, HTB-133) su zasejane u koncentraciji od 40.000 ćelija/bunarčiću na ploče sa 96 bunarčića i inkubirane su u medijumu RPMI 1640 (Gibco, 31800105) sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Biowest, FB-1058). Ćelije su zatim ostavljene da adheriraju preko noći na 37 °C, 5% CO<2>. Sledećeg dana, jedinjenja su titrirana prema šemi trostrukog razblaženja, a najviša ispitivana koncentracija jedinjenja bila je 10 µM. Nakon 24 sata inkubacije sa jedinjenjima, ćelije su lizirane u ledeno hladnom puferu za lizu koji sadrži koktel inhibitora fosfataze i 1 mM PMSF. Ćelijski lizati (50 µl/bunarčiću) su zatim prebačeni na ELISA ploče (pRb Ser807/811 ELISA komplet, Cell Signaling, 13152 ili pRb Ser780 ELISA komplet, Cell Signaling, 13016)). Ploče su inkubirane preko noći na 4 °C, uz konstantno mućkanje malom brzinom. Nakon inkubacije, ploče su isprane prema preporukama proizvođača, a zatim je u svaki bunarčić dodato 100 µL rekonstituisanog detekcionog antitela i inkubirano 1 sat na 37 °C. Nakon inkubacije, ploče su isprane, a zatim je u svaki bunarčić dodato 100 µl rekonstituisanog HRP-vezanog sekundarnog antitela i inkubirano 30 minuta na 37 °C. Nakon inkubacije, ploče su isprane. Zatim je u svaki bunarčić dodato 100 µl TMB supstrata i inkubirano 10 minuta na 37 °C ili 30 minuta na 25 °C. Konačno, u svaki bunarčić je dodato 100 µL STOP rastvora i blago mešano nekoliko sekundi. Ploče su očitane na čitaču ploča Envision (PerkinElmer, 2104-0010) upotrebom režima luminescencije za 96 bunarčića. Vrednosti IC<50>su izračunate korišćenjem 4-parametarskog sigmoidnog modela dozaodgovor softvera Xlfit5/GraphPad Prism 5.

[0302] Podaci o ćelijama dobijeni iz bioloških primera 4 i 5 navedeni su u tabeli A ispod. Vrednosti IC<50>su označene kao

za vrednosti manje ili jednake 100 nM;

za vrednosti manje ili jednake 500 nM;

za vrednosti manje ili jednake 1 µM; i

za vrednosti veće od 1 µM, redom.

[0304] Tabela A

[0305] Primer sinteze IC<50>CDK4 IC<50>CDK6 IC<50>CDK2 IC<50>T47D IC<50>Fosfo T47D Ser807

[0307]

Claims (5)

1. Patentni zahtevi

1. Jedinjenje predstavljeno sledećom strukturnom formulom:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Jedinjenje prema zahtevu 1, koje je predstavljeno sledećom strukturnom formulom:

3. Jedinjenje prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, gde jedinjenje ima optičku čistoću od 90% ili više.

4. Jedinjenje prema zahtevu 3, gde jedinjenje ima optičku čistoću od 99% ili više.

5. Farmaceutska kompozicija koja sadrži efikasnu količinu jedinjenja prema bilo kom od zahteva 1-4 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5