RS72404A - Mikroorganizam za genetsko terapeutsko lečenje proliferativnih oboljenja - Google Patents

Mikroorganizam za genetsko terapeutsko lečenje proliferativnih oboljenja

Info

Publication number
RS72404A
RS72404A YU72404A YUP72404A RS72404A RS 72404 A RS72404 A RS 72404A YU 72404 A YU72404 A YU 72404A YU P72404 A YUP72404 A YU P72404A RS 72404 A RS72404 A RS 72404A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
microorganism
tumor
component
expression
cells
Prior art date
Application number
YU72404A
Other languages
English (en)
Inventor
Werner Goebel
Ulf Rapp
Hans-Harald Sedlacek
Joachim Fensterle
Ivaylo Gentschev
Original Assignee
Zentaris Gmbh.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zentaris Gmbh. filed Critical Zentaris Gmbh.
Publication of RS72404A publication Critical patent/RS72404A/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/16—Exonucleases active with either ribo- or deoxyribonucleic acids and producing 3'-phosphomonoesters (3.16)
    • C12Y301/16001—Spleen exonuclease (3.1.16.1), i.e. 5->3 exoribonuclease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

Pronalazak se odnosi na obavijeni mikroorganizam u čiji genom su ubačene i mogu i mogu biti eksprimirane sledeće komponente: I) nukleotidna sekvenca koja kodira proizvod ekspresije, koji deluje direktno ili indirektno, antiproliferativno ili citotoksično, ili više različitih takvih proizvoda ekspresije, II) nukleotidna sekvenca koja kodira protein krvne plazme pod kontrolom aktivirajuće sekvence, koja se može aktivirati u mikroorganizmu, ili je konstitutivno aktivna, III) opcionalno, nukleotidna sekvenca koja kodira citospecifični ligand pod kontrolom aktivirajuće sekvence koja se može aktivirati u mikroorganizmu, ili je konstitutivno aktivna, IV) nukleotidna sekvenca za transportni sistem koji izaziva ekspresiju proizvoda ekspresije komponenata I) i II) kao i, opcionalno, III) na spoljnoj površini mikroorganizma ili sekreciju proizvoda ekspresije komponente I) i ekspresiju komponente II) kao i, opcionalno, III, i koja je, poželjno, konstitutivno aktivna, V) opcionalno, nukleotidna sekvenca za protein za lizu mikroorganizma u citosolu ćelija sisara i za intracelularno oslobađanje plazmida sa najmanje jednom ili više komponenti I) i VI sadržanih u liziranom mikroorganizmu, i VI) aktivirajuća sekvenca, koja se može aktivirati u mikroorganizmu, i/ili aktivirajuća sekvenca specifična za ćelije tkiva, ćelije tumora, funkcionalno specifična ili ne citospecifična, za ekspresiju komponente I), pri čemu svaka od komponenta I do VI, može biti jednostavno ili složeno, isto ili različito uređena.

Description

MIKROORGANIZAM ZA GENETSKO TERAPEUTSKO
LEČENJE PROLIFERATIVNIH OBOLJENJA
Područje pronalaska
Pronalazak se odnosi na mikroorganizam sa stranim nukleotidnim sekvencama pomoću kojih se može vršiti ekspresija proizvoda ekspresije koji imaju " antiproliferativno ili citotoksično dejstvo, kao i na primenu takvih mikroorganizama za proizvodnju farmaceutskih kompozicija, na jedan plazmid kao i na postupak za proizvodnju takvog mikroorganizma i na primenu takvih mikroorganizama.
Pozadina pronalaska i stanje tehnike
Mikroorganizmi smanjene virulentnosti kao, na primer, genetski modifikovani virusi ili bakterije sa smanjenom virulentnošću, u okviru genske terapije sve više dobijaju na značaju kao nosioci stranih sekvenci nukleinske kiseline.
U okviru genske terapije strane nukleinske kiseline se uvode ili in vitro u ćelije tkiva, pa se te ćelije daju pacijentu, ili se ti mikroorganizmi ubrizgavaju pacijentu, u očekivanju da će mikroorganizmi kao sredstva za prenos gena preneti stranu nukleinsku kiselinu u željenu ćeliju tkiva.
Mikroorganizmi predstavljaju čestice. Nakon ubrizgavanja u organizam te čestice najčešće apsorbuje takozvani retikuloendotelijalni sistem. Da bi se u ciljanom tkivu i pored tog mehanizma eliminacije ipak postigla koncentracija mikroorganizama koji se koriste kao sredstva za prenos gena, mikroorganizmi su snabdeveni citospecifičnim ligandima. Do sada je i pored toga samo beznačajno mogla da se smanji eliminacija mikroorganizama od strane retikuloendotelijalnog sistema.
Bitan istraživački cilj genske terapije je terapija proliferativnih oboljenja - kao na primer, tumora, leukemija, hroničnih upala, autoimunih oboljenja i odbacivanja transplantiranih organa, čije lečenje , pored svih uspeha terapije lekovima, još uvek nije zadovolj avaj uće.
Na primer, i pored svih uspeha hirurgije, radioterapije, hemoterapije i imunoterapije u lečenju tumora do sada nije ostvareno izlečenje uznapredovalih tumora glave i vrata, centralnog nervnog sistema, timusa, pluća, gastrointestinalnog trakta, jetre, pankreasa, bubrega, kože, jajnika i prostate.
Razlozi ovog nedovoljnog uspeha terapije tumora su raznovrsni i još nisu potpuno poznati. Medju bitne razloge spadaju, medjutim, i) za sada (primarno) postojeća rezistencija tumorskih ćelija na koncentracije hemoterapije, zračenja ili imunoterapije, koje se mogu postići in vivo, ii) rezistencija na odgovarajući terapeutski preparat nastala kao reakcija na terapiju. Uzrok te indukovane, takozvane sekundarne rezistencije, je genetska varijabilnost tumorskih ćelija koja im omogućava da izbegnu dejstvo terapeutskih preparata time što razvijaju mehanizme rezinstencije, iii) farmakokinetički i/ili farmakodinamički nedostaci do sada raspoloživih terapeutskih preparata za lečenje tumora zbog kojih je koncentracija terapeutskog sredstva na mestu tumora, bez obzira da li se radi o primarnim tumorima, recidivima ili metastazama, apsolutno previše mala da bi tumor bio eliminisan. Medju te nedostatke terapeutskih preparata za lečenje tumora spadaju iv) previše velika zapremina rasporedjenosti, v) nedovoljna koncentracija na tumoru, odnosno na tumorskim ćelijama, vi) nedovoljna sposobnost penetracije u tumoru i/ili vii) toksično dejstvo na celi organizam koje ograničava povećanje doze radi veće koncentracije na tumoru.
U prošlosti se pokušavalo različitim postupcima da se na tumoru koncentrišu terapeutski preparati za lečenje tumora.
Ligandi, specifični za ćelije tumora, kao na primer antitela ili proizvodi njihovog cepanja, povezani sa citostaticima, sa citokinima antitumoralnog dejstva, sa citotoksičnim proteinima ili sa izotopima, doveli su, doduše, do koncentracije citotoksičnih aktivnih supstanci na tumoru u odnosu na normalno tkivo, ali ta koncentracija u najvećem broju slučajeva nije bila dovoljna za terapiju tumora (Pregled: Sedlacek et al., Contributions to Oncology 43: 1-145, 1992; Čarter, Nature Reviews Cancer 1: 118-129, 2001) .
Zbog toga su razvijeni sistemi amplifikacije uz čiju pomoć je mogla da se poveća koncentracija aktivne supstance na tumoru.
Cilj sistema amplifi kacije bio je da u tumor ubaci takve enzime, koji ostalom delu tela nisu bili opšte dostupni ili su bili strani, a koji su bili u stanju da u tumoru pretvaraju ili cepaju netoksičnu pripremnu fazu citostatika u citotoksički aktivan citostatik. Enzimi su uvodjeni u tumor ili davanjem citospecifičnih liganada za tumore vezanih za te enzime ( na primer, u obliku Antibodv-Derived Enzvme-mediated Prodrug-Therapv; ADEPT) ili davanjem gena za te enzime uz pomoć vektora, citospecifičnih za tumore ili nespecifičnih (Gene Derived Enzym-mediated Prodrug-Therapv; GDEPT) (Sedlacek et al . , Contributions to Oncology 43: 1-145, 1992; Sedlacek, Critical Reviews in Oncology/Hematology 37: 169-215, 2001; McCormick Nature Reviews Cancer 1: 130-141, 2001; Čarter, Nature Reviews Cancer 1: 18-129, 2001.
Dosadašnja klinička ispitivanja sa ADEPT-om ili GDEPT-om nisu, medjutim, dala zadovoljavajuće terapeutske rezultate. Kao bitni problemi pokazali su se i) imunogenost enzima stranog telu, ii) relativno mala stopa lokalizacije tumora od strane konjugovanog antitela i enzima (ADEPT), iii) tehničke teškoće da se iz humanizovanog antitela sa jednim humanim enzimom, uz podnošljive troškove, proizvede dovoljna količina fuzionisanih proteina, iv) nedostatak penetracije konjugovanog antitela i enzima ili genskih vektora u tumor, i v) previše niska stopa transdukcije in vivo, t.j. broj tumorskih ćelija jednog tumorskog čvora, u kojima je mogla da se vrši ekspresija gena za enzim, bio je previše mali za efikasnost terapije tumora.
Jedan drugi sistem amplifikacije zasniva se na indukciji imune reakcije protiv tumorskih ćelija u okviru koje dolazi do proliferacije ćelija ,koje stvaraju specifična antitela, i citotoksičnih ćelija. Radi indukcije imune reakcije daju se pogodno pripremljeni tumorski antigeni. Cilj je da se probije imunotolerancija protiv svog tumora i/ili rezistentnost tumora na imunu reakciju pacijenta, koje očito postoje kod pacijenata sa tumorom.
Tokom poslednjih decenija klinički su ispitane brojne tehničke varijante vakcinacije protiv tumora kombinovanjem različitih tumorskih antigena sa adjuvansima, medjutim ta ispitivanja nisu donela željeni proboj u terapiji tumora. Doduše, novi pokušaji, na primer, davanje kombinacija imunogenskih antigena specifičnih za tumor sa novim adjuvansima, ili dendritnih ćelija punih antigena specifičnih za tumor, ili nukleotidnih sekvenci koje kodiraju antigene specifične za tumor, dali su prve kliničke rezultate koji ulivaju nadu, ali se do sada ni tu ne vidi proboj u terapiji tumora.
Razvijena je jedna tehnika da se vrši ekspresija proizvoda ekspresije sekvenci nukleinske kiseline unetih u bakterije na membrani tih bakterija ili da ih te bakterije izluče. Osnovu te tehnike čini sistem hemolizina Escherichie coli HlyAS, koji predstavlja prototip tipa I sistema sekrecije gramnegativnih bakterija. Pomoću HlyAs-a razvijeni su vektori sekrecije koji omogućuju efikasno izbacivanje proteinskih antigena u Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica i Vibrio cholerae. Takvi vektori sekrecije sadrže cDNA bilo kog proteinskog antigena vezanog za nukleotidnu sekvencu za peptid HlyA-signala, za sekrecioni aparat hemolizina, hlyB i hlyD i hly-specifični promoter. Pomoću tog vektora sekrecije može da se vrši ekspresija proteina na površini tog bakteriona. Tako genetski modifikovane bakterije, kao vakcine, indukuju mnogo veću imunološku zaštitu nego bakterije u kojima protein, čiju ekspresiju vrši uvedena nukleinska kiselina, ostane unutar ćelije (Donner et al EP 1015023 A; Gentschev et al, Gene, 179: 133-140, 1996; Vaccine 19: 2621-2618, 2001; Hess et al PNAS 93: 1458-14 63,1996). Nedostatak tog sistema je, medjutim, što je zbog primene hly-specifičnog promotera izuzetno mala količina proteina eksprimiranog na spoljnoj površini bakteriona.
Razvijena je tehnika ubacivanja DNA plazmida u ćelije sisara pomoću nosećih bakterija kao što su Salmonella i Listeria monocytogenes. Do ekspresije gena, sadržanih u tim plazmidima, u ćelijama sisara može doći čak i kada su bili pod kontrolom eukariontičnog promotera. U klice Listeria monocytogenes uneti su plazmidi koji sadrže nukleotidnu sekvencu za bilo koji antigen pod kontrolom bilo kog eukariontičnog promotera. Uvodjenjem nukleotidnih sekvenci za specifični gen lize postignuto je da se klice Listeria monocytogenes rastvore u citosolu antigen prezentujuće ćelije, i da se oslobode njihovi plazmidi, što je zatim dovelo do ekspresije, procesuiranja i prezentacije proteina kodiranih plazmidom i do uočljivog povećanja imunogenosti tih proteina (Dietrich et al. Nat. Biotechnol 16: 181-185, 1998; Vaccine 19: 2506-2512, 2001) .
Razvijene su varijante bakterija sa atenuiranom virulencijom koje se nastanjuju intracelularno. Na primer, takve varijante Listeria monocytogenes, Salmonella enterica sv., Tvphimurium i Typhi kao i BG već su korišćene kao žive vakcine protiv tifusa i tuberkoloze koje se dobro podnose. Te bakterije, uključujući njihove oslabljene mutante, generalno stimulišu imunitet i mogu izazvati dobru celularnu imunu reakciju.L. Monocytogenes,na primer, aktiviranjem Thl ćelija u posebnoj meri stimuliše proliferaciju citotoksičnih limfocita. Te bakterije šalju izlučene antigene direktno u citosol antigen prezentujućih ćelija (APC; makrofagen i dendritne ćelije) koje pak vrše ekspresiju molekula, koji učestvuju u stimulaciji, i izazivaju efikasnu stimulaciju T-ćelija. Listerije se delimično razgradjuju u fagosomalnim odeljcima i zbog toga, s jedne strane, antigeni, koje proizvode te noseće bakterije, mogu da budu prezentovani preko molekula MHC klase II i time dovedu do indukcije T-pomoćničkih ćelija. S druge strane, listerije nakon oslobadjanja iz fagosoma repliciraju u citozolu APC-a;
zbog toga se antigeni, koje proizvode i izlučuju te bakterije, najbolje prezentuju putem MHC klase I čime se indukuju reakcije CTL-a na te antigene. Pored toga je pokazano da se usled interakcije listerija sa mikrofagima, prirodnim ćelijama-ubicama (NK) i neutrofilnim granulocitima indukuje ekspresija takvih citokina (TNF-alpha, IFN-gamma, 11-2, IL-12; Unanue, Curr. Opin. Immunol, 9: 35-43, 1997; Mata and Patersin, J Immunol 163: 1449-14456, 1999) čije antitumoralno dejstvo je dokazano. Tako je davanjem L. Monocitogenesa transdukovanih radi ekspresije tumorskih antigena antigen-specifično usporen rast eksperimentalnih tumora (Pan et al., Nat Med 1: 471-477, 1995; Cancer Res 59: 5264-5269, 1999; Voest et al . , Natl Cancer Inst 87: 581-586, 1995; Beatty and Paterson, J Immunol 165: 5502-5508, 2000). Virulentno atenuirani sojevi Salmonella enterica, u koje su uvedene nukleotidne sekvence koje kodiraju antigene tumora, su kao bakterijski nosioci,
koji vrše ekspresiju antigena tumora, nakon oralnog davanja proizveli specifičnu zaštitu od različitih eksperimentalnih tumora (Medina et al., Eur J Immunol 30: 768-777, 2000; Zoller und Christ J Immunol 166: 3440-34450, 2001; Xiang et al., PNAS 97: 5492-5497, 2000).
Rekombinantni sojevi Salmonella bili su efikasni i kao profilaktična vakcina protiv virusnih infekcija (HPV; Benyacoub et al., Infect Immun 67: 3674-3679, 1999) kao i za terapeutsko lečenje mišjeg tumora imortalizovanog virusom tumora (HPV) (Revaz et al., Virology 279: 354-360, 2001).Za sistematsku terapiju tumora odabrani su sojevi Salmonella koji se nastanjuju u specifično odabranim tkivima tumora (Murray et al J Bacteriol 183: 5554-5564, 2001). U te sojeve Salmonella kao i u sojeve Escherichia coli ubačene su nukleotidne sekvence koje kodiraju odabrane enzime i te su noseče bakterije uspešno primenjene in vitro kao i in vivo u eksperimentalnim sistemima tumora (Pawelek et al Cancer Res 57: 4537-4544, 1997).
Inflamatorna tkiva i, posebno, tkiva tumora odlikuju se pojačanom angiogenezom čiji je tok u tumoru najčešće haotičan. U tim novonastalim sudovima mogu se koncentrisati rastvorijive kao i partikularne supstance, ukoliko poseduju malu zapreminu rasporedjenosti a time i relativno dugačko vreme poluraspada u krvi.Ta koncentracija (označena i kao pasivni Targeting) može se koristiti za terapeutske postupke (Sedlacek,Critical reviews in Oncology/Hematology 37: 169-215, 2001).
Tehnički problem pronalaska
U osnovi pronalaska nalazi se tehnički problem da se obezbedi farmaceutska kompozicija koja pokazuje veću efikasnost u lečenju proliferativnih oboljenja, naročito u terapiji tumora.
Osnovna koncepcija pronalaska kao i saznanja na kojima se
zasniva pronalazak
Radi rešavanja ovog tehničkog problema pronalazak predstavlja jedan «envelop» mikroorganizam u čiji genom su ubačene sledeće komponente koje se mogu eksprimirati: I) nukleotidna sekvenca koja kodira proizvod ekspresije, koji deluje direktno ili indirektno, antiproliferativno ili citotoksično, ili više takvih različitih proizvoda ekspresije, II) nukleotidna sekvenca koja kodira protein krvne plazme pod kontrolom aktivacijske sekvence, koja se može aktivirati u mikroorganizmu, ili koja je konstitutivno aktivna, III) opcionalno, nukleotidna sekvenca koja kodira citospecifični ligand pod kontrolom aktivacijske sekvence, koja se može aktivirati u mikroorganizmu, ili koja je konstitutivno aktivna, IV) nukleotidna sekvenca za transportni sistem koji izaziva ekspresiju proizvoda ekspresije komponenata I) i II) kao i, opcionalno, III) na spoljnoj površini mikroorganizma ili sekreciju proizvoda ekspresije komponente I) i ekspresiju komponente II) kao i, opcionalno, komponente III) i koja je, poželjno, konstitutivno aktivna, V) opcionalno, nukleotidna sekvenca za protein za lizu mikroorganizma u citosolu ćelija sisara i za intracelularno oslobadjanje plazmida sa najmanje jednom ili više komponenata I) i VI) sadržanih u liziranom mikroorganizmu, i VI) aktivacijska sekvenca za ekspresiju komponente I), koja se može aktivirati u mikroorganizmu,-i/ili aktivacijska sekvenca za ekspresiju komponente I), specifična za tkivo ćelije, specifična za tumorske ćelije, funkcionalno specifična ili nespecifična za ćelije, pri čemu je svaka komponenta od I) do VI) uredjena jednostavno ili složeno, istovetno ili različito.
U okviru pronalaska opisuju se prvenstveno «envelop» mikroorganizmi kao nosioci genetskih informacija kao i primena tih «envelop» mikroorganizama za profilaksu i terapiju proliferativnog obolenja. Pri tome se pronalazak zasniva na sledećim iskustvima i tehničkim razvojima.
Prema tome, predmet pronalaska su prvenstveno «envelop» mikroorganizmi kao nosioci nukleotidnih sekvenci za lečenje proliferativnih obolenja, pri čemu su u mikroorganizme ubačene sledeće komponente: I) najmanje jedna nukleotidna sekvenca koja kodira najmanje jedan proizvod ekspresije sa direktnim ili indirektnim antiproliferativnim ili citotoksičnim dejstvom, II) najmanje jedna nukleotidna sekvenca koja kodira najmanje jedan protein krvne plazme pod kontrolom najmanje jedne aktivacijske sekvence koja se može aktivirati u mikroorganizmu, III) po izboru, najmanje jedna nukleotidna sekvenca koja kodira najmanje jedan citospecifični ligand pod kontrolom najmanje jedne aktivacijske sekvence koja se može aktivirati u mikroorganizmu, IV) najmanje jedna nukleotidna sekvenca za najmanje jedan transportni sistem koji omogućava ekspresiju proizvoda ekspresije komponenata I), II) i III) na spoljnjoj površini mikroorganizma ili sekreciju komponenata I), II i III, V) po izboru, najmanje jedna nukleotidna sekvenca za najmanje jedan protein za lizu mikroorganizma u citozolu ćelija sisara i za intracelularno oslobadjanje plazmida sadržanih u liziranom mikroorganizmu, VI) najmanje jedna aktivacijska sekvenca koja se može aktivirati u mikroorganizmu ili najmanje jedna aktivacijska sekvenca za ekspresiju komponente I), specifična za ćelije tkiva, specifična za tumorske ćelije ili nespecifična za ćelije.
Poželjni oblici izvodjenja pronalaska
Komponenta I: Komponenta I) je najmanje jedna nukleotidna sekvenca koja kodira najmanje jedan proizvod ekspresije sa direktnim ili indirektnim antiproliferativnim ili citotoksičnim dejstvom. Proizvodi ekspresije u smislu pronalaska, koji direktno deluju antiproliferativno su, na primer, interferoni kao, na primer, IFN-alpha, IFN-gamma, IFN-(3, interleukini, koji zaustavljaju imune ćelije ili tumorske ćelije, kao, na primer, IL-10, IL-12, proapoptotični peptidi ili proteini kao, na primer, TNF-alpha, FAS-ligand, TNF- indukujući ligand u vezi sa apoptozom (TNF-related apoptosis inducing Ligand TRAIL), antitela ili fragmenti antitela koja zaustavljaju ili deluju citotoksično na imunu ćeliju, tumorsku ćeliju ili ćeliju tkiva od koje potiče tumor, kao na primer, antitela usmerena protiv i) antigena udruženog sa tumorom ili specifičnog za tumor, ii) antigena na limfocitima, kao na primer, protiv receptora T-ćelija, receptora B-ćelija, receptora za CD40-ligand, B7.1 ili B7.2, receptora za interleukin, kao na primer, IL-1,-2,-3,-4,-5,-6,-7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14,-15 ili -16, receptora za interferon ili receptora za hemokin, na primer, za RANTES, MCAF, MIP-alpha, MIP-p, IL-8, MGSA/Gro, NPA-2 ili IP10, iii) antigena specifičnog za tkivo, kao na primer, protiv antigena specifičnog za tkivo ćelija timusa, bubrega, mladeža, prostate, štitne žlezde, sluznice želuca, jajnika, grlića materice, sluznice mokraćne bešike, protein, koji deluje antiproliferativno, kao na primer, Retinblastomov protein (pRb = pllO) ili srodni proteini pl07 i pl30 ili mutanti tih proteina koji deluju antiproliferativno, protein p53 i analogni proteini ili mutanti tih proteina koji deluju antiproliferativno, protein p21 (WAF-1), protein p27, protein pl6, protein GAAD45, proteini sa antiproliferativnim dejstvom porodice Bcl2, kao na primer, bad ili bak, citotoksični proteini, kao na primer, perforin, granzim, onkostatin, «antisense RNA» ili ribozim specifičan za mRNA, koji učestvuje u rastu ili proliferaciji ćelije, na primer, specifičan za mRNA, koji kodira receptor, enzim koji prenosi signal, protein koji učestvuje u ćelijskom ciklusu, faktor transkripcije ili transportni protein. Proteini sa indirektnim antiproliferativnim dejstvom su, na primer, induktori akutnih upala i imunih reakcija, kao na primer hemokini kao RANTES (MCP-2), hemotaktični i aktivirajući faktor monocita (Monocvte chemotactic and activating faktor-MCAF), IL-8, inflamatorni protein 1 makrofaga (Macrophage inflammatorv protein-1- MIP-1-alpha,-|3) , aktivirajući protein neutrofila (Neutrophil activating Protein-2-NAP-2), interleukini kao IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, faktor inhibicije humane leukemije (Human Leukemia inhibitorv factor- LIF), IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, citokini kao GM-cSF, G-CSF, M-CSF, enzimi za aktivaciju ili razlaganje inaktivnih pripremnih faza citotoksične supstance u citotoksičnu supstancu, pri čemu su ti enzimi oksidoreduktaza, transferaza, hidrolaza ili liaza. Primeri takvih enzima su p-glukoronidaza, p-galaktosidaza, glukozna oksidaza, glikosidaza, alkoholna dehidrogenaza, laktoperoksidaza, urokinaza, aktivator tkivnog plazminogena karboksi peptidaze, citozin-deaminaza, deoksicitidin kina za,timidin kinaza, lipaza, kisela fosfataza, alkalna fosfataza, kinaza, purinukleosidfosforilaza, glukozna oksidaza, laktoperoksidaza, laktotoksidaza, penicilin-V-amidaza, penicilin-G-amidaza, Lizizim, (i-laktamaza, aminopeptidaza, karboksipeptidaza A, B ili G2, nitroreduktaza, citohrom-p450- oksidaza. Prema pronalsku, enzim može poticati od virusa, bakteriona, kvasca, mekušaca, insekata ili sisara. Najbolje je da se koriste enzimi koji potiču od čoveka. U smislu pronalaska prednost se daje i konstruktima nukleinske kiseline koji kodiraju proizvod fuzije citospecifičnog liganda sa enzimom i/ili proteini koji inhibiraju angiogenezu, na primer, inhibitor aktivatora plazmino-gena-1 (PAI-1); PAI-2 ilimPAI-3, angiostatin ili endostatin, interferon-alpha, -p, ili gamma, interleukin 12, pločasti faktor4, trombospondin-1 ili 2, TGF-p, TNF-alpha, inhibitor rasta vaskularnih endotelijalnih ćelija (Vascular endothelial cell growth inhibitor-VEGI). Komponenta I), u smisli pronalaska, može predstavljati jednu ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju jedan ili više istih ili različitih proteina koji direktno ili indirektno deluju antiproliferativno ili citotoksično. Prednost se daje kombinacijama proteina koji imaju aditivno ili sinergistično dejstvo. Aditivna ili sinergistična dejstva mogu se, na primer, očekivati kod sledećih kombinacija proteina sa različitim dejstvom: citotoksični proteini i proapoptotični proteini, enzimi i citotoksični i/ili proapoptotični proteini, antiangiogenetski proteini i citotoksični i/ili proapoptotični proteini, induktori upala i enzimi ili citotoksični, proapoptotični i/ili antiangiogenetični proteini.
Komponenta II: Komponenta II) je nukleotidna sekvenca koja kodira najmanje jedan protein krvne plazme pod kontrolom jedne aktivacijske sekvence koja se može aktivirati u mikroorganizmu. Prednost se daje humanim proteinima krvne plazme , i to onima koji imaju srednje vreme zadržavanja u krvi od više od 24 časa. Tu naročito spadaju, na primer, Albumin (Nukleotide 1-2258, Hinchliffe et al, EP 0248637-A, 9.12.1987), transferin (Nukleotide 1-2346, Uzan et al, Biochem Biophys Res Commun 119: 273-281 (1984); Yang et al, PNAS-USA, 81: 2752-2756 1984)), ceruloplazmin (Baranov et al, Chromosoma 96: 60-66 1987), haptoglobin (Nukleotidel - 1412, Raugei et al, Nucleis Acids Res 11: 5811-5819, 1983; Yang et al, PNAS-USA 80: 5875-5879, 1983; Brune et al, Nucleic Acids Res 12: 4531-4538, 1984), hemoglobin alfa (Nukleotide 1 - 576; Marotta et al, PNAS-USA 71: 2300-2304, 1974; Chang et al, PNAS-USA 74: 5145-5149, 1977), hemoglobin p (Nukleotide 1-626; Marotta et al, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 19: 165-175, 1976; Marotta et al, J Bil Chem 252: 5019-5031, 1977), alfa 2 makroglobulin (Nukleotide 1 - 4599; WO 9103557-A, 21.03.1991.). Ali, tu spadaju i drugi proteini krvne plazme kao, na primer, alfalni lipoprotein, lipoprotein alfa2, lipoprotein (31. Ekspresija najmanje jednog od tih proteina plazme od strane mikroorganizma, prema pronalsku, dovodi do toga da mikroorganizam nakon sistemskog davanja - naročito nakon ubrizgavanja u krvotok - biva u manjoj meri apsorbovan od strane fagocitnih ćelija i zbog toga može duže da se zadrži u krvi i da se koncentriše u sistemu tumorskih sudova ili u sudovima hronične upale.
Komponenta III): Komponenta III) je nukleotidna sekvenca koja kodira citospecifičan ligand pod kontrolom aktivacijske sekvence koja se može aktivirati u mikroorganizmu. Specifičnost tog liganda zavisi od vrste proliferativnog oboljenja, za koje se mikroorganizam koristi, kao i od ćelija ili od tkiva sa kojim komponenta I) treba da stupi u kontakt u mikroorganizmu da bi se postiglo terapeutsko dejstvo. Tako se, na primer, za tumorska oboljenja koriste ligandi specifični za tumorske ćelije, tj. za antigene asocirane sa tumorom ili specifične za tumor ili ćelije endotela tumora ili za ćelije tkiva iz kojih odredjeni tumor potiče, na primer za ćelije štitne žlezde, prostate, jajnika, timusa, bubrega, sluznice želuca, mladeža, cerviksa, mokraćne bešike; za hronične upale, celularna autoimuna oboljenja i odbijanja transplatiranih organa koriste se ili ligandi specifični za makrofage, dendritne ćelije, T-limfocite ili za aktivirane ćelije endotela. Takvi ligandi su, na primer, specifična antitela ili fragmenti tih antitela, koji vezuju antigene, faktori rasta, interleukini, citokini ili molekuli adhezije ćelija koji se selektivno vezuju za tumorske ćelije, ćelije leukemije, ćelije endotela tumora, ćelije tkiva, makrofage, dendritne ćelije, T-limfocite ili aktivirane ćelije endotela.
Komponenta IV): Komponenta IV) je nukleotidna sekvenca koja kodira transportni sistem koji omogućava ekspresuju proizvoda ekspresije komponenata I), II) i/ili III) na spoljnu površinu mikroorganizma. Pri tome se odredjena komponenta , prema izboru, može ili izlučiti ili eksprimirati na membrani mikroorganizma, tj. membranozno. Poželjno je da se komponente II) i III) eksprimiraju membranozno. Takvi transportni sistemi su, na primer, transportni signal hemolizina E. coli (Nukleotidne sekvence koje sadrže HlyA, HlyB i HlyD pod kontrolom hly-specifičnog promotera, Gentschev et al Gene, 179: 133-140, 1996) . Mogu se koristiti sledeći transportni signali: za sekreciju C-terminalni HlyA-transportni signal u prisustvu HlyB i HlyD proteina; za membranoznu ekspresiju C-terminalni HlyA-transportni signal u prisustvu HlyB-proteina; signal transporta hemolizina E.coli (nukleotidne sekvence koje sadrže HlyA, HlyB i HlyD pod kontrolom ne hly-specifičnog bakterijskog promotera); transportni signal za protein S-layer (Rsa A) caulobactera cresentus; za sekreciju i membranoznu ekspresiju C-terminalni RsaA-transportni signal (Umelo-Njaka et al Vaccine, 19: 1406-1415, 2001); transportni signal za TolC-protein Escherichie coli (TolC-protein opisali su Koronakis et al., Nature, 405: 914-919, 2000) i Gentschev et al, Trends in Microbiology, 10: 39-45, 2002); za membranoznu ekspresiju N-terminalni transportni signal.
Komponenta V): Komponenta V) je nukleotidna sekvenca koja kodira najmanje jedan protein lize, koji biva eksprimiran u citosolu ćelije sisara i vrši lizu mikroorganizma radi oslobadjanja plazmida u citosolu ćelije-domaćina. Takvi proteini lize (endolizini) su, na primer, proteini lize specifični za listerije, kao na primer, PLY551 (Loessner et al Mol Microbiol 16: 1231-41, 1995), holin specifičan za listerije koji je pod kontrolom listerijskog promotera. Poželjan oblik izvodjenja ovog pronalaska je kombinacija različitih komponenti V), na primer, kombinacija proteina lize sa holinom.
Komponenta VI): Komponenta VI) predstavlja bilo koju sekvencu aktivatora koja kontroliše ekspresiju komponente I). Za ekspresiju komponente I) na spoljnoj površini mikroorganizma jednu od aktivirajućih sekvenci,koje se mogu aktivirati u bakterionu, a koje su poznate stručnjaku, predstavlja komponenta VI). Takve aktivirajuće sekvence su, na primer, konstitutivno aktivni regioni promotera, kao region promotera sa ribozomalnim mestom vezivanja (Ribosomal binding site)(RBS) gena beta- laktamaze E-coli ili tetA gena (Busby and Ebright, Cell 79: 743-746, 1994), promoteri koji se mogu indukovati, poželjno promoteri koji postaju aktivni po prijemu u ćeliju. Medju ove poslednje spada actA promoter L.monocytogenesa (Dietrich et al. , Nat.Biotechnol. 16: 181-185, 1998) ili pagC promoter S. monocytogenesa (Bumann, Infect Immun 69: 7493-7500, 2001) . Prednost se daje aktivi rajućim sekvencama koje se posle oslobadjanja plazmida noseće bakterije u citosolu ciljne ćelije aktiviraju u toj ćeliji. Može se koristiti, na primer, CMV-Enhacer, CMV-Promoter, SV40-Promoter ili svaka druga, stručnjaku poznata, sekvenca promotera ili enhacera. Poželjne su, takodje, citospecifične ili funkcionalno-specifične aktivatorske sekvence. Izbor citospecifične ili funkcionalno-specifične aktivatorske sekvence zavisi od ćelije ili tkiva u kojima noseća bakterija ili plazmidi, koje oslobadja noseća bakterija, treba da vrše ekspresiju komponente I). Takve aktivirajuće sekvence su, na primer, aktivirajuće sekvence u vezi sa sa ćelijama tumora (medju njih spadaju aktivirajuće sekvence gena za midkine, GRP, TCF-4, MUC-1,TERT, MAY-MAX, surfaktantni protein, alfa-fetoprotein, CEA, tirozinaza, fibralni kiselinski protein (Fibrillary acid protein), EGR-1, GFAP, E2F1, bazni mijelin, alfa-laktalbumin, osteokalcin, Thyroglobulin i PSA(McCormick Nature Reviews Cancer 1: 130-141, 2001), aktivirajuće sekvence specifične za ćelije endotela (tu spadaju aktivirajuće sekvence gena za proteine, čiju ekspresiju prvenstveno vrše ćelije endotela (Sedlacek, Critical Reviews in Oncology/Hematology 37: 169-215, 2001) kao, na primer, VEGF, faktor von Willebrand, endotelijalni transporter glukoze-1 specifičan za mozak, endoglin, VEGF-receptori, naročito VEGF-R1, VEGF-R2 i VEGF-R3, TIE-2, PDECGF-receptori, B61, endotelin 1, endotelin B, receptori fosfata manoze r, VCAM-1 i PECAM-1), aktivirajuće sekvence gena za proteine, koji se prvenstveno eksprimiraju u ćelijama tkiva, iz kojih potiču pacijentove tumorske ćelije; tu spadaju proteini eksprimirani u ćelijama grudnog tkiva (na primer, MUC-1, alfa-laktalbumin), štitne žlezde (na primer, tiroglobulin), prostate (na primer, kalikrein 2, receptori androgena, PSA), jajnika, mladeža (na primer, tirozinaza) i bubrega), aktivirajuće sekvence gena za proteine koji se eksprimiraju u makrofagima, dendritnim ćelijama ili limfocitima, kao na primer, interleukini, citokini, hemokini, molekuli adhezije, interferoni, receptori za interleukine, citokine, hemokine, ili interferone, aktivirajuće sekvence koje se aktiviraju pri hipoksiji, kao na primer, aktivirajuća sekvenca za VEGF ili za eritropoietin.
Unošenje komponenata I) do VI) u mikroorganizme vrši se molekularno-biološkim metodama koje su poznate stručnjaku. Kada se, na primer, bakterije koriste kao nosilac, stručnjaku je poznato kako se komponente ubacuju u pogodne plazmide i ti plazmidi uvode u bakterije.
Prema ovom pronalasku ti se mikroorganizmi daju pacijentu radi profilakse ili terapije proliferativnog oboljenja, kao na primer, tumora, leukemije, hronične upale, autoimunog oboljenja ili odbacivanja transplatiranog organa. Radi lečenja takvog oboljenja mikroorganizmi prema pronalsku se daju u pogodnom preparatu lokalno ili sistemski, na primer, u krvotok, u šupljinu tela, u organ, u zglob ili u vezivno tkivo. Da bi se kod sistemskog davanja, naročito kod davanja u krvotok, smanjila neželjena apsorpcija mikroorganizama od strane takozvanog retikuloendotelijalnog sistema veća od dejstva komponente II) i da bi se produžilo vreme zadržavanja mikroorganizama u krvi, mikroorganizmi se mogu suspendovati u rastvoru supstanci koje poseduju dugačko vreme zadržavanja u krvi. Sa suspenzijom se povezuje i inkubacija. Suspenzija i inkubacija mikroorganizama može se vršiti, na primer, u krvnoj plazmi i krvnom serumu. Najbolje je, medjutim, da se suspenzija i inkubacija vrše u rastvorima supstanci koje imaju dugačko vreme zadržavanja u krvi. Medju te supstance spadaju, na primer, albumin, transferin, prealbumin, hemoglobin, haptoglobin, lipoprotein alfa-1, lipoprotein alfa-2, lipoprotein (3-1, makroglobulin alfa-2, polietilenski glikol (PEG), konjugati PEG-a sa prirodnim ili sintetičkim polimerima, kao na primer, polietileniminima, dekstranima, pol igelinima, hidroksieti1-škrobom.
Usled suspenzije i inkubacije u takvom rastvoru dolazi do adsorpcije supstanci na površini mikroorganizama prema pronalasku. Sloj tih supstanci može se naneti na mikroorganizme i konjugacijom. Metode konjugacije navedene su u Sedlacek et al Contributions to Oncologv 32: 1-132, 1998 .
Nanošenje slojeva adsorpcijom vrši se, na primer, suspenzijom mikroorganizama u rastvoru koji, poželjno, sadrži 0,1 do 50% supstanci za oblaganje tokom perioda od, poželjno, 10 minuta do 24 časa i pri temperaturi od 4° C.
Prema pronalsku poželjno je da se kao organizmi koriste bakterije čija je virulentnost smanjena. Takodje se prvenstveno biraju bakterije iz grupe koja obuhvata Escherichiu coli, Salmonellu enterica, Yersiniu enterocolitica, Vibrio cholerae, Listeriu monocvtogenes, Shigellu.
Mikroorganizmi su u okviru pronalaska takodje membranske opne, takozvani «duhovi» živih odnosno postojećih mikroorganizama. Takve membranske opne proizvode se, na primer, prema EPA 0540525.
Predmet pronalska su farmakološki preparati koji sadrže mikroorganizme prema pronalsku kao i primena tih farmakoloških preparata radi profilakse i/ili terapije proliferativnog oboljenja. Proliferativno oboljenje u smislu ovog pronalska je oboljenje sa prekomernom ili nekontrolisanom proliferacijom ćelija, na primer, tumorsko oboljenje kao karcinom ili sarkom, leukemija, hronična upala, autoimuno oboljenje ili odbacivanje organa-transplanta. Radi profilakse ili terapije oboljenja mikroorganizmi prema pronalsku se pacijentu daju u farmakološkom preparatu lokalno ili sistemski, u preporučenmoj dozi od 100 klica do 100 miliona klica.
Pod terminom «envelop» misli se da na spoljnoj strani membrane mikroorganizma može biti smešten veći broj istih ili različitih molekula (eksprimiranih i/ili izlučenih prema jednoj ili više karakteristika I) do III)), kao što je već napred opisano, pri čemu geometrijski stepen pokrivenosti može biti izmedju 0,001 i 1, a naročito izmedju 0,1 i 1. Geometrijski stepen pokrivenosti može se izračunati iz količnika ukupne površine svih molekula, u radijalnoj (odnosi se na središte mikroorganizma) projekciji na površinu mikroorganizma i površine mikroorganizma. Po pravilu se, da bi bilo jednostavnije, prihvata okrugla površina mikroorganizma, a izračunava se iz zapremine mikroorganizma. Karakteristika «envelop» je u datom slučaju fakultativna.
Primeri izvodjenja:
Primer 1: Konstrukcija soja bakterija za membranoznu
ekspresiju humanog albumina i beta-glukuronidaze
U ovom primeru biće opisan put soja bakterija St21-bglu. Ovaj atenuirani sojSalmonella typhi Ty21a(dozvoljeni nosilac za ljudsku upotrebu) pomoću Hly mašinerije za sekreciju E.coli vrši ekspresiju membranoznih fuzionih proteina humane beta-glukuronidaze i HlyA kao i humanog albumina i HlyA. Konstrukcija se zasniva na već objavljenim plazmidima pMOhlyl (Gentschev et al. , Behring Inst Mitt 57-66, 1994) i pGP704 (Miller and Mekalanos, J Bacteriol 170: 2575-2583, 1998). Taj soj putem pasivnog ciljanja
(Bermudes et al., Adv Exp Med Biol 465: 57-63, 2000)
omogućava koncentraciju beta-glucuronidaze na tumoru a time i cepanje pro-lekova, koje može aktivirati beta-glukuronidaza, ograničeno na tkivo tumora.
Membranozna ekspresija se u salmonelama može izvršiti putem fuzije proteina sa C-krajem proteina sekrecije HlyA' u prisustvu proteina HlyB, ali u odsustvu potpuno funkcionalnog proteina HlyD. Doduše, HlyD ne srne da nedostaje u potpunosti, jer se inače neće uspostaviti veza izmedju mašinerije za sekreciju i TolC-proteina spoljne membrane (Spreng et al., Mol.Microbiol. 31: 1596-1598, 1999). U tim primerima navedena je jedna od mogućih modifikacija proteina HlyD radi membranozne ekspresije.Zbog toga se prvo konstruiše vektor pMOhly DD, u kome se ne proizvodi funkcionalni protein HlyD. U tom cilju endonukleaze Dralll i Apal iz vektora pMOhlyl uklanjaju jedan deo hlyD-gena. Nakon restrikcionog rastvaranja 3' - 5' eksonukleaza rastvara krajeve, dok veliki fragment veličine 10923 bps biva prespojen. Zatim se u tom vektoru gen beta-glukoronidaze in-Frame klonira u hlyA gen. Za to se cDNA iz bglu (GenBank Accession (Gb): M15182) iz jedne cDNA-banke reakcijom lanca polimeraze (PCR) obogaćuje sledećim primerima:
bglu 5': ArGCAT TGCAGGGCGGGATGCTGTACC
bglu 3': ArGCA rAAGTAAACGGGCTGTTTTCCAAAC.
Područja komplementarna sa cDNA beta-glukuronidaze su podvučena, informacija o generisanom Nsil-mestu prikazana je kursivom (ovakav prikaz zadržava se i u daljem tekstu; oligonukleotidne sekvence predstavljene su ovde, kao i u daljem tekstu, kao 5' - 3'). Primeri su izabrani tako da se gen obogaćuje bez signalne sekvence. Proizvod (1899 bps) se subklonira pomoću pogodnog «PCR Cloning Kit-a» i zatim se preko Nsil -digestije ekstrahuje~1890 bps fragment. Posle toga se Nsil-fragment klonira u Nsil-sečeni vektor pMOhlv DD. Iz toga se dobija vektor pMO Ddbglu (Slika 1) .
(Kada se fragment Nsil klonira u Nsil-sečeni vektor pMOhlvl, nastaje plazrnid pMO bglu, koji omogućava izlučivanje fuzionisanog proteina). U drugom delu se proizvodi vektor integracije za hromozomalnu integraciju fuzije Albumin-HlyA. U prvom koraku proizvodi se vektor pMOhly alb. Taj vektor, koji se bazira na pMOhlyl, nosilac je fuzije cFNA albumina sa HlyA-genom. Radi kloniranja se cDNA gena albumina (Gb:A06977) iz cDNA-banke, koja se može kupiti, obogaćuje uz pomoć PCR-a i sledećih Primera koji generišu Nsil:
Fragment veličine 1830 bps biva subkloniran i zatim sečen sa Nsil. Sada se 1824 bps-fragment vezuje u Nsil rastvoreni pMohlyl. Gotov plazrnid pMOhly alb tako eksprimira HlyB, HlyD i jedan fuzionisani protein albumina i HlyA. Za eksperimente o dužini zadržavanja Nsil-fragment se alternativno može ubaciti i u vektor pMO DD, taj vektor nosi naziv pMO Ddalb. U daljem postupku se modifikacija već opisane strategije kloniranja koristi za integraciju u hromozomu Salmonelle (Miller and Mekalanos, J Bacteriol 170: 2575-2583, 1998). Prvo je aroA-gen Salmonelle kloniran u vektor pUC18 (PCR sa sledećim Primerima:
«Blunt»-kloniranje 181 bps-fragmenta u HincII - interface pUC18). Zatim je digestijom HincII i nakon toga prespajanjem uklonjen jedan fragment veličine 341 bps koji se nalazi u aroA. Taj vektor je nazvan pUC18 aroA'. Zatim se fuzionisani gen alb-hlyA zajedno sa promoterskom
sekvencom, koja se nalazi na pMOhlv, klonira u vektor pU18aroA'. U tu svrhu se vektor pMOhly alb rastvara sa AacII i Swal i zatim obradjuje sa 3'-5'-egzonukleazom. Blunt fragment veličine 3506 bps se izdvaja i vezuje u PUC18ariA' rastvoren sa HincII. Iz toga nastaje vektor pUCaro-alb. Sada se fragment alb-hlyA, sa čije se strane nalazi aroA, sa svim aktivatorskim sekvencama iz vektora pUCaro-alb klonira u vektor pGP704. U tu svrhu se pUC aro-alb rastvara sa Hindlll i zatim obradjuje sa 5'-3' egzonukleazom (Blunt). Zatim se vrši digestija sa EcoRI i 4497 bps-fragment se vezuje u vektor pGP704 rastvoren sa EcoRI/EcorV (Blunt) (EcoRI/RV-fragment: 6387 bps). Dobija se vektor integracije pGParo-alb (slika 2) . Taj vektor se transformiše u soj E.coli SMlOlpir. Taj soj omogućava vektoru da replicira, jer stvara p-protein neophodan za replikaciju. Vektor se sada preko konjugacije prenosi u soj akceptoraSalmonella typhi Ty21akoji ne dozvoljava replikaciju vektora. Zbog toga se selekcijom Tetraciklina odabiraju samo bakterije koje su hromozomalno integrisale vektor. Provera citoplazmatske proizvodnje albmumina vrši se Western-Blot analizom bakterijskog lizata. Taj soj, St21-alb, doduše, vrši ekspresiju fuzije alb-hlyA, ali je u tom obliku ne može ni izlučiti niti eksprimirati membranozno.Za membranoznu ekspresiju dodatno mora postojati plazrnid sa funkcionalnim HlyB (kao pMO Ddbglu) ili fnkcionalnim HlyB i HlyD (kao pMO bglu).
U ovom primeru koristi se plazrnid pMO Ddbglu sa sojem St21-alb. Iz toga se dobija soj St21-alb pMO Ddbglu koji pomoću Hly-sistema sekrecije membranozno eksprimira kako humani albumin tako i humanu beta-glukuronidazu. Taj soj se tada može koristiti za Prp-Drug-konverziju u smislu patenta.
Primer 2: Konstrukcija soja bakterija obavijenog fuzijom Albumin-HlyA za davanje genetske informacije o humanoj beta-glukuronidazi.
Soj bakterija prikazan u ovom primeru treba pomoću pasivnog ciljanja da na ćelije tumora isporučuje DNA koje kodiraju humanu beta-glukuronidazu, koje zatim treba da budu eksprimirane u ćelijama tumora. Da bi se održao soj, kojim se posebno jednostavno rukuje, u ovom primeru se za membranoznu ekspresiju albumina koristi blago modifikovani soj kao u primeru 1. Pri tome treba da bude hromozomalno integrisan kako gen, koji kodira albumin-HlyA, tako i informacija za HlyB. Tako ovaj soj vrši ekspresiju konstruktivno membranoznog albumina.
U te svrhe gore opisani vektor pMOhlv alb biva rastvoren od strane BsrBI i EcoRI i zatim obradjen sa 5'-3' egzonukleazom. Ta digestija proizvodi fragment veličine 5815 bps sa Blunt-krajevima, koji sadrži kompletnu prokariotičnu aktivirajuću sekvencu i gene hlyC, alb-hlyA i hlyB, ali ne hlyD. Taj se fragment sada može ubaciti «Blunt» u HincII-interface gore opisanog vektora pUC18aroA'.Iz toga se dobija vektor pUCaro-alb-B. Digestijom EcoRI-NruI 6548 bps-fragment ponovo se može ubaciti u vektor pGP704 rastvoren sa EcoRI-EcoRV (Slika 3). Dalji postupak (Replikacija i integracija u S. typhi Ty21a) odgovara gore prikazanoj strategiji. Dobijeni soj St21-alb-B vrši ekspresiju konstitutivno membranozno fuzionisanog proteina albumina-HlyA. Kada se transficira vektor, koji kodira HlyD, izdvaja se fuzionisani protein Albumin-HlyA. Plazrnid DNA, koji kodira isporuku beta-glukoronidaze, bazira se na komercijalnom vektoru pCMVbeta (Clonthech). Za konstrukciju se prvo mora koristiti fuzija bglu-gena sa signalom sekrecije. U ovom primeru biće korišćen signalni peptid tPA precursor-molekula. Taj signalni peptid dozvoljava posebno efikasnu proizvodnju i sekreciju fuzionisanih proteina. Za kloniranje fuzije u prvom koraku se 5' UTR iz tPA cDNA (Gb EO2027) do kraja opsega, koji kodira signalni peptid, obogaćuje sledećim primerima preko PCR (Amplifi kacija sa polimerazom koja generiše «Blunt»):
Nastali 166 bp-fragment vezuje se u komercijalni vektor pCDNA3 (invitrogen) rastvoren u Hindlll, obradjen 5'-3' egzonukleazom. Ligacija se vrši u «Forward»-orijentaciji. Tako se područje, koje kodira tPA-signalnii sekvencu, preko Notl-digestije kompletno može iseči iz nastalog plazmida pCDNAtp. Taj 237 bps-fragment se sada vezuje sa 3760 bps-fragmentom vektora pCMVbeta posle Noti-digestije (sadrži vektor Backbone). Nastali plazrnid pCMVtp (3972 bps) sada se može koristiti za ekspresiju heterolognih fuzionisanih proteina. Za generisanje plazmida pCMV bglu jedan bps fragment bglu (Gb M15182)-gena (bez sekvence signalnog peptida) sa sledećim primerima, koji generišu Spel, obogaćuje se iz pogodne cDNA-banke:
Nakon Spel-digestije 1899 bps fragment se vezuje u Spel-rastvoreni vektor pCMVtp. Nastali plazrnid pCMVtp bglu sada kodira N-terminalnu fuziju tPA-signalnog peptida sa područjem maturnog proteina beta-glukuronidaze. Nakon utvrdjivanja tačnog položaja plazrnid pCMVtp bglu (slika 4) se transformiše u soj St21-alb-B. Taj soj sada putem pasivnog ciljanja dozvoljava isporuku DNA u tkivo tumora a zatim ekspresija DNA transficiranim ćelijama tumora dozvoljava konverziju pogodnih pro-lekova.
Primer 3: Konstrukcija soja, obavijenog fuzijom Albumin-Tolc, sa membranoznom ekspresijom ekstracelularnog područja FAS i isporuka enzima koji konvertuje Pro-lek
Soj, prikazan u ovom primeru, objedinjuje osobine pokazane u primeru 23 sa ciljnim «Targeting-om» na (tumorskim) ćelijama koje eksprimira Fas-ligand (FasL).Sa ovim sojem mogu se ciljano napasti tumorske ćelije, koje vrše ekspresiju FasL-a, kao na primer, u odredjenim tumorima dojke[ Herrnring et al.,Histochem Cell Biol 113: 189-194, 2000). Ekspresija FasL-a od strane tumorskih ćelija istaknuta je kao potencijalni mehanizam za «Immune-Escape», jer te ćelije mogu da eliminišu limfocite koji aktivno napadaju i eksprimir a j u Fas (Muschen et al., J Mol Med 78: 312-325, 2000). Sa ovim, ovde prikazanim, sojem ćelije tumora, koje su vrlo problematične za terapiju, mogu se ciljano napasti i zatim eliminisati mehanizmom nezavisnim od apoptoze. Noseći soj zasniva se u ovom primeru na fuziji albumina sa TolC-proteinom E. Coli. Time se postiže membranozna ekspresija albumina. Membranozna ekspresija ekstracelularnog područja Fas-a vrši se preko plazmida pMOhlvDD, a za isporuku koristi se gore opisani plazrnid pCMV-bglu. Prvi korak obuhvata generisanje nosećeg soja koji vrši ekspresiju TolC-albumina. U tu svrhu prvo se generiše gen za fuzionisani protein, pa se zatim taj gen , prema gornjim primerima, sukcesivnim kloniranjem u pUCaroA' i pGP704 integriše u genom Salmonelle. TolC-gen za E.coli zajedno sa prirodnim promoterom nalazi se u plazmidu pBRtolc. On je pomoću sledećih primera, koji generišu Sali, obogaćen iz vektora pAX629 (sadrži tolC gen, područje u vektoru odgovara Gb X54049 Pos. 18-1914): 1701 bps-fragment je nakon cepanja povezan sa Sali invers u SalI-mesto preseka vektora pBR322 (Gb J01749), čime je prekinut tet-gen. Zbog poznate kristalne strukture TolC-a (Koronakis et al., Nature 405:914-919, 2000) unošenje heterolognih DNA u singularni KpnI-interface u tolC-genu dozvoljava ekspresiju kodiranog heterolognog fuzionisanog proteina u ekstracelularnoj petlji na spoljnoj membrani. Radi ekspresije albumina , gen albumina iz cDNA (Gb A06977) obogaćuje se sledećim primerima, koji generišu KpnI:
Nakon KpnI-digestije fragmenta 1770 bps DNA se može ubaciti u KpnI-sečeni vektor pBRtolC. Rever zna orijentacija (u frame prema tolC-u) tada daje vektor pBRtolC-alb. Sada se gen za fuziju tolC-albumin može preko EcoRV i PshAI (fragment 3970 bps) vezati obrnutom orijentacijom u HincII-interface vektora pUCaroA'. Nastali vektor pUCaro-alb-tol (7596 bps) sada se linearizuje pomoću Hindlll, obradjuje 5'-3' egzonukleazom i zatim rastvara sa EcoRI. Tada se 4961 bps-fragment ubacuje u vektor pGP704, rastvoren sa EcoRI - EcoRV (Slika 5). Posle konjugacije (prema primeru 1) dobija se soj St21-tol-alb. Sada plazrnid za membranoznu ekspresiju Fas (CD95)-HlyA fuzionisanog proteina pomoću HlyB-komponente E.coli tip I postaje mašinerija za sekreciju. U tu svrhu se prvo odeljak Fas-gena (Gb:M67454), koji kodira ekstracelularno područje, obogaćuje sledećim primerima koji generišu Nsil:
477 bps-fragment se rastvara sa Nsil i ubacuje u Nsil-rastvoreni vektor pMOhly DDb in Frame kao HlyA-gen. Nastali vektor pMO DD-fas (Slika 6) tako nakon transformacije u soj Salmonelle proizvodi membranozni Fas-fragment koji se, uz pogodno savijanje, može vezati za ćelije koje eksprimiraju FasL. Tako se te Salmonelle mogu koncentrisati na ćelijama, koje vrše ekspresiju FasL, kao na primer ćelijama tumora.
Radi ubijanja FasL-tumorskih ćelija sada se u Salmonelle transficira i plazrnid pCMV bglu (Primer 2). Time se tada, kao u gornjem primeru, nakon ekspresije beta-glukuronidaze od strane tumorskih ćelija omogućuje terapija tumora sa Prolekom. Veća efikasnost ovog primera u odnosu na prethodni primer odlučujuće zavisi od korektnog savijanja ekstracelularnog područja Fas-a. Umesto Fas-a, sa istim sastavom kao što je ovde opisano, mogu se koristiti i FasL-specifični Fab-fragmenti monoklonalnih antitela (koji se u bakteriji mogu korektno savijati). Ovaj primer pokazuje da je uz pomoć ove tehnike, primenom pogodnih specifičnih Fab-fragmenata, moguće konstruisanje sojeva sa skoro bilo
kojom specifičnošću ćelija.

Claims (19)

1) Mikroorganizam, u čiji genom se mogu ubaciti i u njemu eksprimirati sledeće komponente: I) nukleotidna sekvenca koja kodira proizvod ekspresije koji deluje direktno ili indirektno, antiproliferativno ili citotoksično, ili više takvih različitih proizvoda ekspresije, II) nukleotidna sekvenca koja kodira protein krvne plazme pod kontrolom aktivirajuće sekvence, koja se može aktivirati u mikroorganizmu, ili koja je konstitutivno aktivna, III) opcionalno, nukleotidna sekvenca koja kodira citospecifični ligand pod kontrolom aktivirajuće sekvence, koja se može aktivirati u mikroorganizmu, ili je konstitutivno aktivna, IV) nukleotidna sekvenca za transportni sistem koji izaziva ekspresiju proizvoda ekspresije komponenata I) i II) kao i opcionalno III) na spoljnoj površini mikroorganizma ili sekreciju proizvoda ekspresije komponente I) i ekspresiju komponente II) kao i opcionalno komponente III) i koja je, poželjno, konstitutivno aktivna, V) opcionalno, nukleotidna sekvenca za protein za lizu mikroorganizma u citosolu ćelija sisara i za intracelularno oslobadjanje plazmida sa najmanje jednom ili više komponenata I) i IV) sadržanih u liziranom mikroorganizmu, i VI) aktivirajuća sekvenca, koja se može aktivirati u mikroorganizmu, i/ili aktivirajuća sekvenca za ekspresiju komponente I) specifična za ćelije tkiva, specifična za tumorske ćelije, funkcionalno specifična ili ne citospecifična, pri čemu svaka od komponenti I) do IV) može biti jednostavno ili složeno, isto ili različito uredjena.
2) Mikroorganizam prema zahtevu 1, pri čemu je mikroorganizam virus, bakterion ili jednoćelijski parazit.
3) Mikroorganizam prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je virulentnost mikroorganizma smanjena.
4) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1 do 3, pri čemu je mikroorganizam gram-pozitivni ili gram-negativni bakterion.
5) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1 do 4 izabran iz grupe koja se sastoji od «Escherichie coli, Salmonelle, Yersiniae enterocolitica, Vibrio cholerae, Listerie monocvtogenes i Shigelle».
6) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1 do 5, pri čemu je mikroorganizam omotač (envelop) jednog bakteriona.
7) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1 do 6, kod koga komponenta I) kodira najmanje jedan protein izabran iz grupe koja se sastoji od «Interferona, interleukina, proapoptičkih proteina; antitela ili fragmenata antitela, koje zaustavlja ili je citotoksično za imunu ćeliju, za ćeliju tumora ili za ćelije tkiva iz kojih potiče tumor; proteina koji deluju antiproliferativno; citotoksičnih proteina; induktora upale, naročito interleukina, citokina ili hemokina; viralnih, bakterijskih enzima, enzima koji potiču od mekušca, od sisara ili od čoveka, za aktivaciju cepanja inaktivne pred-faze citostatika u citostatik; proizvoda fuzije citospecifičnog liganda i enzima; i inhibitora angiogeneze».
8) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1 do 7, pri čemu komponenta II) kodira najmanje jedan protein krvne plazme izabran iz grupe koja se sastoji od « albumina, transferina, haptoglobina, hemoglobina, alfalnog lipoproteina, alpha2- lipoproteina, (31-lipoproteina i alpha2- makroglobulina».
9) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1 do 8, pri čemu komponenta III) kodira najmanje jedan ligand specifičan za ciljni organizam koji je izabran iz grupe koja se sastoji od »tumorskih ćelija; ćelija endotela tumora; ćelija tkiva iz kojih potiče tumor; aktiviranih ćelija endotela; makrofaga; dendritnih ćelija; i limfocita».
10) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1 do 9, pri čemu komponenta III) kodira najmanje jedan ligand specifičan za jednu vrstu ćelija tkiva iz tkiva izabranog iz grupe koja se sastoji od «štitne žlezde, timusa, sluznice želuca, bubrega, jajnika, prostate, cerviksa, sluznice mokraćne bešike i mladeža».
11) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1 do 10, pri čemu komponenta IV) kodira transportni signal hemolizina Escherichie coli, S-Layer (Rsa A) protein Caulobactera crescentus, i/ili tolC-protein Escherichie coli.
12) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1 do 11, pri čemu komponenta V) kodira protein lize gram-pozitivnih bakterija, proteine lize Listerie monocytogenes, PLY551 Listerie monocytogenes i/ili holin Listerie monocytogenes.
13) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1 do 12, za koji je vezana supstanca koja ima dugačko vreme zadržavanja u krvi, a posebno najmanje jedna sustanca izabrana iz grupe koja se sastoji od «albumina, transferina, prealbumina, hemoglobina, haptoglobina, alpha-l-lipoproteina, alpha-2-lipoproteina, B-l-lipoproteina, alpha-2-makroglobulina, polietilenglukola (PEG), konjugata PEG-a sa prirodnim ili sintetičkim polimerima, kao na primer, sa polietilenskim iminima, dekstranima, poligelinima, hidroksietil-skrobom i mešavinama tih materija», pri čemu se vezivanje tih supstancu vrši fizisorpcijom, hemisorpcijom ili kovalentno.
14) Plazrnid ili vektor ekspresije koji sadrži komponente I), II), IV) i VI) kao i, opcionalno, jedna ili više od komponenti III) i V).
15) Postupak za proizvodnju organizma prema jednom od zahteva 1 do 13, u kome se proizvodi plazrnid prema zahtevu 14 i sa tim plazmidom transformiše mikroorganizam.
16) Primena mikroorganizma prema jednom od zahteva 1 do 13 za proizvodnju farmaceutske kompozicije.
17) Primena mikroorganizma za proizvodnju farmaceutske kompozicije za profilaksu i/ili terapiju oboljenja čiji je uzrok nekontrolisana deoba ćelija, naročito tumorskog oboljenja, na primer, karcinoma prostate, karcinoma jajnika, karcinoma dojke, karcinoma želuca, tumora bubrega, tumora štitne žlezde, melanoma, tumora cerviksa, tumora mokraćne bešike, tumora pljuvačne žlezde i/ili tumora limfne žlezde, leukemije, upale, odbijanja organa i/ili autoimunog obolj enj a.
18) Primena prema zahtevu 17 radi odstranjivanja tumora kao i zdravog tkiva od koga potiče tumor.
19) Postupak za proizvodnju farmaceutske kompozicije prema jednom od zahteva 16 do 18, u kome se obavijeni mikroorganizam prema jednom od zahteva 1 do 13 priprema u fiziološki delotvornoj dozi sa jednom ili više fiziološki podnošljivih nosećih supstanci za oralno, i.m., i.v. ili i.p. davanje.
YU72404A 2002-02-14 2003-02-13 Mikroorganizam za genetsko terapeutsko lečenje proliferativnih oboljenja RS72404A (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10206325A DE10206325A1 (de) 2002-02-14 2002-02-14 Ummantelter Mikroorganismus
PCT/DE2003/000470 WO2003068954A2 (de) 2002-02-14 2003-02-13 Mikroorganismus zur gentherapeutischen behandlung proliferativer erkrankungen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS72404A true RS72404A (sr) 2006-12-15

Family

ID=27674670

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YU72404A RS72404A (sr) 2002-02-14 2003-02-13 Mikroorganizam za genetsko terapeutsko lečenje proliferativnih oboljenja

Country Status (19)

Country Link
US (1) US20050244374A1 (sr)
EP (1) EP1474519A2 (sr)
JP (1) JP2005517405A (sr)
KR (1) KR20040103941A (sr)
CN (1) CN1646693A (sr)
AU (1) AU2003206663B2 (sr)
BR (1) BRPI0307722A2 (sr)
CA (1) CA2513198A1 (sr)
DE (2) DE10206325A1 (sr)
HR (1) HRP20040832A2 (sr)
IL (1) IL163553A0 (sr)
MX (1) MXPA04007934A (sr)
NO (1) NO20043800L (sr)
NZ (1) NZ535310A (sr)
PL (1) PL372901A1 (sr)
RS (1) RS72404A (sr)
RU (1) RU2004127459A (sr)
WO (1) WO2003068954A2 (sr)
ZA (1) ZA200407358B (sr)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2572756C (en) * 2004-06-29 2016-01-26 Anticancer, Inc. Cancer selective auxotrophs
TWI838389B (zh) 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
EA202190315A1 (ru) 2018-07-19 2021-04-16 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Химерные антигенные рецепторы со специфичностью к bcma и их применение
WO2020172462A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-27 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Tumor-navigating, self-eradicating, trail-armed salmonella for precision cancer therapy

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19720761A1 (de) * 1997-05-07 1998-11-12 Schering Ag Verfahren zur Synthese und Sekretion von zur Kontrazeption geeigneter Proteine oder Proteinfragmente durch attenuierte Salmonellen oder einen anderen Gram-negativen attenuierten Impfstamm zur Erzeugung einer oralen Vakzinierung

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003068954A2 (de) 2003-08-21
BRPI0307722A2 (pt) 2017-07-04
MXPA04007934A (es) 2005-11-23
US20050244374A1 (en) 2005-11-03
DE10206325A1 (de) 2003-09-04
WO2003068954A3 (de) 2003-10-16
IL163553A0 (en) 2005-12-18
PL372901A1 (en) 2005-08-08
WO2003068954A8 (de) 2005-10-13
HRP20040832A2 (en) 2004-12-31
EP1474519A2 (de) 2004-11-10
ZA200407358B (en) 2005-11-18
NO20043800L (no) 2004-11-08
NZ535310A (en) 2008-04-30
AU2003206663A1 (en) 2003-09-04
JP2005517405A (ja) 2005-06-16
AU2003206663B2 (en) 2007-11-01
DE10390506D2 (de) 2005-01-13
AU2003206663B9 (en) 2003-09-04
RU2004127459A (ru) 2005-05-10
CN1646693A (zh) 2005-07-27
KR20040103941A (ko) 2004-12-09
CA2513198A1 (en) 2003-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20260048139A1 (en) Therapeutic agents comprising nucleic acids and car-modified immune cells, and uses thereof
US11104916B2 (en) Compositions and methods for alphavirus vaccination
Li et al. Messenger RNA-based therapeutics and vaccines: what’s beyond COVID-19?
JP2004500042A (ja) エフェクター分子の腫瘍標的送達のための組成物および方法
KR20190046713A (ko) 별개의 세포 아형 활성의 선택적 조정 방법
AU2014255733A1 (en) Enhanced adoptive cell therapy
Walker et al. Intracellular delivery of biologic therapeutics by bacterial secretion systems
CN107002090B (zh) 异源多肽表达盒
US11648306B2 (en) Non-integrative listeria-based vaccine and method for inducing antitumor immune response
CN106520778A (zh) 改造的白介素12及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途
Wu et al. Functional nucleic acid-based immunomodulation for T cell-mediated cancer therapy
CN116179495A (zh) 转基因免疫细胞及其应用
US20090011036A1 (en) Drug containing hollow protein nanoparticles of particle-forming protein, fused with disease-treating target-cell-substance
RS72404A (sr) Mikroorganizam za genetsko terapeutsko lečenje proliferativnih oboljenja
WO2022250811A2 (en) Nanoparticles for antigen-specific cell programming and uses thereof
EP1478750B1 (en) Gene expression by positive feedback activation of a cell type-specific promoter
HK1078899A (en) Enveloped microorganism
Barnes et al. Current strategies in gene therapy for ovarian cancer
US12537071B1 (en) Bacteria having boolean control pathways expressing therapeutic proteins including immunotherapeutic cytotoxins
CN121406679A (zh) 一种表达重组焦亡蛋白的重组质粒、工程菌株及其制备方法、肿瘤疫苗
Hegardt NO, Immunosuppression and Tumor Immmunotherapy