RS75604A - Mikroorganizmi kao nosioci nukleotidnih sekvenci koje kodiraju ćelijske antigene za lečenje tumora - Google Patents

Mikroorganizmi kao nosioci nukleotidnih sekvenci koje kodiraju ćelijske antigene za lečenje tumora

Info

Publication number
RS75604A
RS75604A YU75604A YUP75604A RS75604A RS 75604 A RS75604 A RS 75604A YU 75604 A YU75604 A YU 75604A YU P75604 A YUP75604 A YU P75604A RS 75604 A RS75604 A RS 75604A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
tumor
microorganism
protein
cell
specific
Prior art date
Application number
YU75604A
Other languages
English (en)
Inventor
R. Ulf Rapp
Werner Goebel
Ivaylo Gentschev
Joachim Fensterle
Original Assignee
Zentaris Gmbh.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zentaris Gmbh. filed Critical Zentaris Gmbh.
Publication of RS75604A publication Critical patent/RS75604A/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001148—Regulators of development
    • A61K39/001149—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclin, CDC, CDK or INK-CCR
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001152—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001162—Kinases, e.g. Raf or Src
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001166—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/255—Salmonella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/42—Salmonella
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Abstract

Pronalazak se odnosi na mikroorganizam sa nukleotidnom sekvencom koja kodira ćelijski antigen, u čiji genom su ubačene i u njemu se mogu eksperimirati sledeće komponente: I) nukleotidna sekvenca koja kodira njamnje jedan epitop antigena tumorske ćelije i/ili nukleotidna sekvenca za najmanje jedan epitop antigena specifičnog za ćeliju tkiva od koje potiče tumor, II) opcionalno, nukleotidna sekvenca koja kodira protein koji stimuliše ćelije imunog sistema, IIIA) nukleotidna sekvenca za transportni sistem koji omogućava ekspresiju proizvoda ekspresije komponente I) i, opcionalno, II) na spoljnoj površini bakteriona i/ili sekreciju proizvoda ekspresije komponente I) i, opcionalno, komponente II), i/ili IIIB) nukleotidna sekvenca za protein za lizu mikroorganizama u citosolu ćelija sisara i za intracelularno oslobađanje plazmida sadržanih u liziranim mikroorganizmima, i IV) aktivirajuća sekvenca za ekspresiju jedne komponente ili više komponenti I) do IIIB) izabranih iz grupe koja se sastoji od (r)aktivirajuće sekvence, koja se može aktivirati u mikroorganizmu, specifične za ćeliju tkiva, i ne specifične za ćeliju¯, pri čemu svaka od komponenata I) do IV) može biti uređena jednostavno ili višestruko, isto ili različito, kao i primena takvog mikroorganizma za proizvodnju leka.

Description

MIKROORGANIZMI KAO NOSIOCI NUKLEOTIDNIH SEKVENCI KOJE
KODIRAJU ĆELIJSKE ANTIGENE ZA LEČENJE TUMORA
Oblast pronalaska
Pronalazak se odnosi na mikroorganizam sa stranim nukleotidnim sekvencama, na njegovu primenu kao leka, posebno vakcine, na plazmid sa stranim nukleotidnim sekvencama kao i na postupak za proizvodnju takvog mikroorganizma.
Pozadina pronalaska i stanje tehnike
Glavni uzrok što maligna tumorska oboljenja najčešće imaju smrtni ishod je nesposobnost odbrambenog sistema u telu da prepozna i uništi zloćudne ćelije raka. Rak u industrijskim zemljama spada medju najčešće bolesti sa smrtnim ishodom. Tako samo u Nemačkoj godišnje umire preko 210.000 ljudi od novonastalih maligniteta (izvor: WHO, brojke iz 1997), što odgovara godišnjoj stopi od preko 255 smrtnih slučajeva na 100.000 stanovnika.
Osnovu ovog pronalska čine novija saznanja o molekularnim mehanizmima koji dovode do novonastalih maligniteta. Već u vrlo ranom stadijumu nastanka raka dolazi do karakterističnih promena kontrole rasta ćelija i/ili diferencijacije ćelija (Ponten, Cancer Surv 32: 5-35., 1998). Važni učesnici u tim promenama su proteini transdukcije signala i kontrole ćelijskog ciklusa koji su identifikovani poslednjih godina i koji svi predstavljaju i tumorske antigene.
Tumorski antigeni grubo su podeljeni u tri klase (Pardoll, Nat Med 4: 525-531, 1998): i) neoantigeni specifični za tumor, koji se u ćeliji tumora nalaze u mutiranom i/ili preeksprimiranom obliku, kao na primer, EGF-R, HER-2, ii) embrionalni antigeni specifični za tumor, kao predstavnici porodice proteina MAGE ili CEA, iii) antigeni diferencijacije specifični za tkivo tumora, kao tirozinaza, Mart-l/melan-A i gplOO.
Za delotvornost vakcine protiv tumora od odlučujućeg značaja je delotvorna indukcija CD8+ T-ćelija, jer ćelije tumora najčešće ne prezentuju molekule MHC klase II, a tumorski antigeni, koji se nalaze intracelularno, su organičeni na MHC klasu I. Kod pacijenata sa tumorom prirodno postojeće populacije CD8+, citotoksičnih T-ćelija (CTL), očito nisu dovoljne da bi prepoznale i eliminisale ćelije tumora (Jaffee, Ann. N.Y.Acad.Sci. 886: 67-72, 1999). Pored toga tumor-specifične T-ćelije često usled različitih mehananizama (anergija, tolerancija, zbog toga neutralizacija) ne mogu dovoljno efikasno da napadnu tkivo tumora (Smyth et al., Nat Immunol 2: 293-299., 2001). Zbog toga uspešna vakcina protiv tumora mora da probije tu anergiju ili toleranciju i da indukuje dovoljan broj aktiviranih, specifičnih CTL kao i specifičnih antitela. Uloga specifičnih antigena pokazuje se kod uspešne primene monoklonalnih antitela (mAb) protiv tumorskih antigena grupe (a), kao već komercijalno dostupnog herceptina, mAb protiv HER-2 (Colomer et al., Cancer Invest 19: 49-56., 2001) .
Već je poznato da su atenuirane intracelularne bakterije pogodne kao nosioci vakcina protiv odredjenih bakterijskih infekcija koje se pre svega mogu suzbiti takozvanim Thl imunim odgovorom (Hess and Kaufmann, FEMS Immunologv&Medical Microbiologv 23: 165-173, 1999). Ovaj odgovor odlikuju CTL kao i prisustvo specifičnih CD4+ T-ćelija (zvane i T-pomoćničke ćelije) koje luče IFN (Abbas et al., Nature 383: 787-793, 1996). Druge grupe su pokazale da rekombinantne bakterije mogu da štite od heterolognog tumora (Medina et al., Eur J Immunol 29:693-699., 1999; Pan et al., Cancer Res 59: 5264-5269., 1999); Woodlock et al., J Immunother 22: 251-259., 1999; Paglia et al., Eur J Immunol 27: 1570-1575., 1997; Pan et al., Nat Med 1: 471-477., 1995; Pan et al., Cancer Res 55: 4776-4779., 1995). Doduše, u ovim slučajevima životinje su imunizirane protiv surogata antigena i zatim su aplicirane ćelije tumora koje vrše ekspresiju tog antigena. Ti tumorski sistemi se, medjutim, ne mogu porediti sa kliničkim tumorima, jer u tim modelima nije postojala tolerancija za tumorski antigen.
Značajan broj različitih vakcina protiv tumora već je klinički ispitan. Do sada, medjutim, ni sa jednom vakcinom protiv tumora niti sa postupkom vakcinacije nije postignut proboj u lečenju tumorskih oboljenja. S obzirom na to i dalje postoji izuzetno velika potreba za novim postupcima terapije tumora.
Poznat je postupak da se vrši ekspresija proizvoda ekspresije sekvenci nukleinske kiseline, unetih u bakterije, na membrani ćelije tih bakterija ili da ih te bakterije izlučuju. Osnovu te tehnike čini sistem hemolizina Escherichia coli HlyAs, koji predstavlja prototip sistema sekrecije tipa I gram negativnih bakterija. Pomoću HlyAs razvijeni su vektori sekrecije koji omogućuju efikasno izbacivanje proteinskih antigena u Salmonella enterica, Yersinia enterocolitica i Vibrio cholerae. Takvi vektori sekrecije sadrže cDNA bilo kog proteinskog antigena vezanog za nukleotidnu sekvencu za signalni peptid HlyA, aparat za sekreciju hemolizina, hlyB i hlyD i hl-specifični promoter. Pomoću tog vektora sekrecije može se vršiti ekspresija proteina na površini tog bakteriona. Tako genetski modifikovane bakterije kao vakcine indukuju znatno veću imunološku zaštitu od bakterija u kojima protein,eksprimiran od ubačene nukleinske kiseline, ostane u ćeliji (Donner et al. EP 1015023A, Gentschev et al, Gene, 179: 133-140, 1996; Vaccine 19: 2621-2618, 2001; Hess et al PNAS 93: 1458-1463, 1996). Medjutim, nedostatak tog sistema je što je usled primene hly-specifičnog promotera izuzetno mala količina proteina eksprimiranog na spoljnoj površini bakteriona.
Razvijena je tehnika ubacivanja DNA plazmida u ćelije sisara preko nosećih bakterija kao Salmonella i Listeria monocytogenes. Geni sadržani u tim plazmidima eksprimirani su u ćelijama sisara čak i kada su bili pod kontrolom eukariontičnog promotera. U klice Listeria monocytogenes ubačeni su plazmidi koji sadrže nukleotidnu sekvencu za bilo koji antigen pod kontrolom bilo kog eukariontičnog promotera. Uvodjenjem nukleotidnih sekvenci za specifični gen lize postignuto je da se klice Listeria monocytogenes rastvore u citosolu antigen-prezentujućih ćelija, i da oslobode svoje plazmide što zatim dovodi do ekspresije, procesuiranja i prezentacije proteina, koje kodira plazmid, i izrazito povećava imunogenost tih proteina (Dietrich et al. Nat. Biotecjnol 16:181-185, 1998; Vaccine 19: 2506-2512, 2001) .
Razvijene su varijante viruletno atenuiranih bakterija koje se nastanjuju intracelularno. Na primer, takve varijante
Listeria monocvtogenes, Salmonella enterica sv. Tvphimurium i Typhi, kao i Mycobacterium bovis već su korišćene kao žive vakcine protiv tifusa i tuberkuloze, koje se dobro podnose. Te bakterije, uključujući njihove oslabljene mutante, generalno stimulišu imunitet i mogu da izazovu dobar celularni imuni odgovor. L.Monocytogenes, na primer, aktiviranjem TH1 ćelija posebno stimuliše proliferaciju citotoksičnih limfocita. Te bakterije šalju izlučene antigene direktno u citosol antigen-prezentujućih ćelija (APC; makrofagen i dendritne ćelije) koje za uzvrat vrše ekspresiju molekula, koji učestvuju u stimulaciji, i izazivaju efikasnu stimulaciju T-ćelija. Listerije se delom razgradjuju u odeljcima fagosoma, te antigeni proizvedeni od tih nosećih bakterija mogu, s jedne strane, da se prezentuju preko molekula MHC klase II i tako da dovedu do indukcije T-pomoćničkih ćelija. S druge strane, listerije se nakon oslobadjanja iz fagosoma ponovo replikuju u citosolu APC-a; zbog toga se antigeni, proizvedeni i izlučeni od tih bakterija, prvenstveno prezentuju putem MHC klase I čime se indukuju CTL-odgovori protiv tih antigena. Pored toga je pokazano da se interakcijom listerija sa mikrofagima, prirodnim ćelijama ubicama (NK) i neutrofilnim granulocitima indukuje ekspresija takvih citokina (TNF-alfa, IFN-gama, 11-2, IL-12; Unanue, Curr.Opin.Immunol, 9: 35-43, 1997; Mata and Paterson, J Immunol 163: 1449-14456, 1999) čije antitumorsko dejstvo je dokazano. Tako je davanjem L.monocytogenes transdukovanih radi ekspresije tumorskih antigena na način specifičan za antigene zaustavljen rast eksperimentalnih tumora ( Pan et al Nat Med 1: 471-477, 1995, Cancer Res 59: 5264-5269, 1999; Voest et al. Natl Cancer Inst 87: 581-586, 1995; Beatty and Paterson, J Immunol 165: 5502-5508, 2000).
SojeviSalmonella entericaatenuirane virulencije, u koje su ubačene nukleotidne sekvence koje kodiraju tumorske antigene, kao noseće bakterije koje vrše ekspresiju tumorskih antigena proizveli su nakon oralnog davanja specifičnu zaštitu od raznih eksperimentalnih tumora (Medina et al., Eur J Immunol 30:768-777, 2000, Zoller und Christ J Immunol 166: 3440-34450, 2001; Xiang et al., PNAS 97 : 5492-5497, 2000) .
Rekombinantni sojeviSalmonellabili su delotvorni i kao profilaktička vakcina protiv virusne infekcije (HPV)
(Benyacoub et al., Infect Immun 67: 3674-3679, 1999) kao i za terapeutsko lečenje mišjeg tumora imortalizovanog
virusom tumora (HPV) (Revaz et al., Virologv 279: 354-360, 2001).
Tehnički problem pronalaska
U osnovi pronalaska je tehnički problem da se ponudi lek koji, posebno u profilaksi i terapiji tumora, predstavlja poboljšanu vakcinu koja probija imunu toleranciju prema tumorima.
Osnovna koncepcija pronalaska
Radi rešavanja ovog tehničkog problema pronalazak predstavlja mikroorganizam sa nukleotidnom sekvencom koja kodira ćelijski antigen u čiji genom se mogu ubaciti i u njemu eksprimirati sledeće komponente: I) nukleotidna sekvenca koja kodira najmanje jedan epitop jednog ili više antigena tumorske ćelije i/ili nukleotidna sekvenca za najmanje jedan epitop jednog ili više antigena specifičnih za ćeliju tkiva iz koje potiče tumor, II), opcionalno, nukleotidna sekvenca koja kodira protein koji stimuliše ćelije imunog sistema, IIIA) nukleotidna sekvenca za transportni sistem koji omogućuje ekspresiju proizvoda ekspresije komponente I) i, opcionalno, II) na spoljnoj površini bakteriona i/ili sekreciju proizvoda ekspresije komponente I) i, opcionalno, komponente II), i/ili IIIB) nukleotidna sekvenca za protein za lizu mikroorganizama u citosolu ćelija sisara i za intracelularno oslobadjanje plazmida sadržanih u liziranim mikroorganizmima, i IV) aktivirajuća sekvenca za ekspresiju jedne komponente ili više komponenata I) do IIIB) odabranih iz grupe koja se sastoji od «aktivirajuća sekvenca koja se može aktivirati u mikroorganizmu, specifična za ćeliju tkiva i ne specifična za ćeliju», pri čemu svaka od komponenti I) do IV) može biti uredjena jednostavno ili složeno, isto ili različito, kao i primena takvog mikroorganizma za proizvodnju leka.
Prema tome, predmet pronalaska su mikroorganizmi, koji predstavljaju nosioce nukleotidnih sekvenci koje kodiraju ćelijske antigene, koji pak bivaju eksprimirani ili izlučeni na spoljnoj membrani mikroorganizama, i primena tih mikroorganizama za proboj imunotolerancije protiv tumora, i nove vakcine protiv tumora koje sadrže mikroorganizme kao nosioce nukleotidnih sekvenci koje kodiraju ćelijske antigene normalnih ćelija i/ili tumorskih ćelija. Pronalaskom se, konačno, aktivira imuna reakcija usmerena protiv tumora. Mikroorganizmi prema pronalsku pojedinačno sadže sledeće komponente: I) najmanje jednu nukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje jedan epitop najmanje jednog antigena najmanje jednog ćelijskog proteina tumorske ćelije i/ili, po izboru, najmanje jedna nukleotidna sekvenca za najmanje jedan epitop najmanje jednog antigena specifičnog za ćeliju tkiva iz koga potiče tumor, II) po izboru, najmanje jedna nukleotidna sekvenca za najmanje jedan protein koji stimuliše ćelije imunog sistema, IIIA) najmanje jedna nukleotidna sekvenca za transportni sistem za membranoznu ekspresiju ili za sekreciju ćelijskog antigena, koji kodira komponenta I) i za sekreciju proteina za imunu stimulaciju, koji kodira komponenta II), IIIB) po izboru, nukleotidna sekvenca za lizin koji vrši lizu mikroorganizma u citosolu, tako da se plazmidi sadržani u mikroorganizmu oslobadjaju u citosolu, IV) najmanje jedna nukleotidna sekvenca za aktivirajuću sekvencu za ekspresiju komponenti I) i II) koja se može aktivirati u mikroorganizmu ili nespecifično za ćeliju, specifično za tumorsku ćeliju ili specifično za ćeliju tkiva ili funkcionalno-specifično.
Poželjni oblici izvodjenja
U daljem tekstu opisuju se pojedinačne komponente mikroorganizma prema pronalasku.
Komponenta I)
Komponenta I) predstavlja najmanje jednu nukleotidnu sekvencu za najmanje jedan epitop najmanje jednog antigena najmanje jednog ćelijskog proteina ili najmanje jednog onkogeno mutiranog ćelijskog proteina tumorske ćelije. Onkogena mutacija ćelijskog proteina može izazvati gubitak ili dobitak njegovih prvobitnih ćelijskih funkcija. Nadalje, taj ćelijski protein može biti izabran iz grupe koja se sastoji od « receptorskih molekula ili njihovih delova, i to ekstracelularnih, transmembranskih ili intracelularnih delova receptora; adhezionih molekula ili njihovih delova i to ekstracelularnih, transmebranskih ili intracelularnih delova adhezionih molekula; proteina signalne transdukcije; proteina kontrole ćelijskog ciklusa; proteina diferencijacije; embrionalnih proteina; i proteina indukovanih virusom«. Takvi ćelijski antigeni u ćeliji preuzimaju regulaciju rasta i deobe ćelije i bivaju prezentovani na ćelijskoj membrani normalnih ćelija, na pr. putem MHC molekula klase I. U tumorskim ćelijama su ti antigeni često preeksprimirani ili specifično mutirani. Posledica takvih mutacija može biti ograničenje funkcije onkogenih supresora ili aktiviranje protoonkogena onkogenima i one mogu same ili zajedno sa preekspresijama značajno učestvovati u rastu tumora. Takvi ćelijski antigeni bivaju prezentovani na membrani tumorskih ćelija i, prema tome, predstavljaju antigene na tumorskim ćelijama, ali ne izazivaju imunu reakciju koja utiče na tumorsku bolest pacijenta. Rapp (US-5, 156,841) već je opisao primenu onkoproteina, t.j. proizvoda ekspresije onkogena kao imunogena za vakcine protiv tumora. Na ovaj deo literature izričito se poziva.
Primeri za ćelijske antigene i njihove onkogene mutacije su prema pronalsku i) receptori, kao na primerHer-2/novi, receptor androgena, receptor estrogena, receptor midkina, EGF-receptor, ERBB2, ERBB4, TRAIL-receptor, FAS, receptor TNFalfa; ii) proteini koji transdukuju proteine i njihove onkogene mutacije, kao na primer c-Raf (Raf-1), A-Raf, B-Raf, Ras, Bcl-2, Bcl-X, Bcl-W, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1, Al, Bax, BAD, Bak, Bcl-Xs, Bid, Bik, Hrk, Bcr/abl, Myb, C-Met, IAP1, IA02, XIAP, ML-IAP LIVIN, Survivin, ARAF-1; iii) proteini kontrole ćelijskog ciklusa i njihove onkogene mutacije, kao na primer Ciklin-D (1-3), - E, -A, -B, -H,Cdk-1, -2, -4, -6, 7, Cdc25C, P16, pl5, p21, p27, pl8, pRb,pl07, pl30, E2F (1-5), GAAD45, MDM2, PCNA, ARF, PTEN, APC, BRCA, P53 i homolozi; iv) faktori transkripcije i njihove onkogene mutacije, kao na primer C-Myc, NFkB, c-Jun, ATF-2, Spi; v) embrionalni proteini, kao na primer karcinoembrionalni antigen, alfa-fetoprotein, Mage, PSCA; vi) antigeni diferencijacije, kao na primer Mart, GplOO, tirozinaze, GRP, TCF-4; vii) viralni antigeni, kao na primer antigeni sledećih virusa: HPV, HCV, HPV, EBV, CMV,
HSV.
Komponenta I), alternativno ili dodatno, može da predstavlja najmanje jednu nukleotidnu sekvencu za najmanje jedan antigen specifičan za normalnu ćeliju tkiva od koje potiče tumor. Takvi specifični antigeni su, na primer i) receptori, kao na primer receptori androgena, receptori estrogena, receptor laktoferina; ii) antigeni diferencijacije, kao na primer bazični mielin, alfa-laktalbumin, GFAP, PSA, protein fibrilarne kiseline (fibrillary acid Protein), tirozinaza, EGR-1, MUCI.
Komponenta II)
Komponenta II) predstavlja najmanje jednu nukleotidnu sekvencu za najmanje jedan protein koji stimuliše ćelije imunog sistema. Izborom proteina može se pojačati imuna reakcija na proizvod ekspresije komponente I) i/ili pospešiti aktivacija Th2 ćelija (za humoralnu imunu reakciju). Proteini, koji stimulišu imunost, su na primer i) citokini kao M-CSF,GM-CSF, G-CSF; ii) interferoni kao IFN-alfa, - beta, - gama; iii) interleukini kao IL-1, -2, - 3, -4, -5, -6, -7, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, humani inflamatorski faktor leukemije (Human Leukemia inhibitory factor -LIF); iv) hemokini kao Rantes, monocitni hemotaktički i aktivirajući faktor (Monocyte chemotactic and activating factor-MCAF) , inflamatorni protein-1 makrofaga (Macrophage inflammatory protein-1 - MIP-1-alpha, -|3) , protein 2 aktivator neutrofila (Neutrophil activating Protein-2 - NAP-2), IL-8.
Komponenta IIIA)
Komponenta IIIA) je najmanje jedna nukleotidna sekvenca koja kodira najmanje jedan transportni sistem koji omogućuje ekspresiju proizvoda ekspresije komponente I) i opcionalno, II) na spoljnu površinu mikroorganizma. Pri tome se komponenta , po izboru, može ili sekretovati ili eksprimirati na membrani mikroorganizma, t.j. membranozno. Takvi transportni sistemi su, na primer i) transportni signal hemolizina E. Coli (nukleotidne sekvence koje sadrže HlyA, HlyB i HlyD pod kontrolom hly-specifičnog promotera); treba koristiti sledeće transportne signale: za sekreciju - C-terminalni HlyA-transportni signal uz prisustvo HlyB i HlyD proteina; za membranoznu ekspresiju - C-terminalni HlyA-transportni signal, uz prisustvo HlyB-proteina; ii) transportni signal hemolizina E.
(nukleotidne sekvence koje sadrže HlyA, HlyB i HlyD pod kontrolom bakterijskog promotera koji nije ne-specifičan); iii) transportni sistem za protein S-sloja (Rsa A) Caulobacter cresecentusa; treba koristiti sledeće transportne signale: za sekreciju i membranoznu ekspresiju
- C-terminalni RsaA-transportni signal; iv) transportni signal za TolC-protein Escherichia coli; treba koristiti sledeće transportne signale: za membranoznu ekspresiju - N-terminalni transportni signal TolC-a ( integralni membranski protein TolC E.coli je multifunkcionalni protein spoljne membrane E.coli, koji stvara pore, i koji pored funkcija kao na primer apsorbcije Colicina El (Morona
et al., J Bacteriol 153: 693-699., 1983) i sekrecije Colicina V (Fath et al., J Bacteriol 173: 7549-7556., 1991) služi i kao receptor za U3-fagen (Austin et al. , J Bacteriol 172: 5312-5325., 1990); taj protein se ne nalazi samo u E. Coli, već i u velikom broju gramnegativnih bakterija (Wiener, Structure Fold Des 8: R171-175., 2000); lokalizacija u spoljnoj membrani i široka rasprostranjenost čine da je TolC idealan kandidat za prezentaciju heterolognih antigena, na primer radi izazivanja imunog odgovora.
Komponenta IIIB)
Komponenta IIIB) je nukleotidna sekvenca koja kodira najmanje jedan protein lize koji biva eksprimiran u citosolu ćelije sisara i koji vrši lizu mikroorganizma radi oslobadjanja plazmida u citosolu ćelije-domačina. Takvi proteini lize (endolizini) su, na primer, proteini lize specifični za listerije kao na pr. PLY551 (Loessner et al, Mol Microbiol 16: 1231-41, 1995) i/ili holin specifičan za listeriju pod kontrolom listerijskog promotera.
Poželjni oblik izvodjenja ovog pronalska je kombinacija različitih komponenti IIIB), na primer kombinacija proteina lize sa holinom.
Komponente IIIA i/ili IIIB mogu da budu konstitutivno aktivne.
Komponenta IV)
Komponenta IV) predstavlja najmanje jednu nukleotidnu sekvencu za najmanje jednu aktivirajuću sekvencu za ekspresiju komponente I) i, opcionalno, II) .
Ukoliko je ekspresija membranozna na spoljnoj površini mikroorganizma, tada je poželjno da se izabere aktivirajuća sekvenca koja se može aktivirati u mikroorganizmu. Takve aktivirajuće sekvence su, na primer: i) konstitutivno aktivni promoterski regioni, kao promoterski region sa ribosomalnim mestom vezivanja («Ribosomal binding site» - RBS) gena beta-laktamaze E. Coli ili tetA gena (Busby andEbright, Cell 79: 743-746., 1994), ii) promotori koji se mogu indukovati , najbolje promotori koji postaju aktivni nakon prijema u ćeliju. Medju ove spada actA promoter L. Monocytogenes (Dietrich et al., Nat.Biotechnol. 16: 181-185, 1998) ili pagC promoter S. typhimurium-a (Bumann, Infect Immun 69: 7493-7500., 2001).
Ukoliko plazmidi bivaju oslobodjeni od mikroorganizma nakon njegove lize u citosolu ćelije, aktivirajuća sekvenca nije specifična za ćeliju, za ćeliju tkiva, za ćelijski ciklus ili funkcionalno specifična. Poželjno je da se izaberu aktivirajuće sekvence koje se posebno aktiviraju u makrofagima, dendritnim ćelijama i limfocitima.
Mikroorganizmi u smislu ovog pronalaska su virusi, bakterije ili jednoćelijski paraziti koji se obično koriste za prenos nukleotidnih sekvenci stranih mikroorganizmu.
U jednoj posebnoj izvedbi ovog pronalaska mikroorganizmi predstavljaju gram-pozitivne ili gram-negativne bakterije, najbolje, bakterije kao na primer Escherichia coli, Salmonella, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes, Shigella.
Poželjno je da se koriste viruletno atenuirane bakterije.
Komponente prema pronalsku unose se u mikroorganizam metodama koje su poznate stručnjaku. Ukoliko mikroorganizmi predstavljaju bakterije, komponente se ubacuju u plazmide, a plazmidi se prenose u bakterije. Tehnike i plazmidi pogodni za to su dovoljno poznati stručnjaku.
Predmet pronalaska su lekovi koji sadrže mikroorganizme prema pronalasku ili pak membranske opne tih mikroorganizama. Te membranske opne proizvode se, na primer, metodom koja je opisana u prijavi patenta br. EP-A-0 540 525. Takvi lekovi su, na primer, suspenzije mikroorganizama prema pronalasku u rastvorima koji su poznati farmaceutima i pogodni za injekcije.
Sledeći predmet pronalaska je davanje leka koji sadrži mikroorganizme prema pronalasku. Lek se daje lokalno ili sistemski, na primer u epiderm, potkožno, intramuskularno, u jednu telesnu šupljinu, u organ,, u tumor ili u krvotok.
Poseban predmet ovog pronalaska je peroralno ili rektalno davanje leka prema pronalsku radi profilakse i/ili terapije proliferativnog oboljenja. Lek se može dati jedanput ili više puta. Prilikom svakog davanja mikroorganizmi prema pronalsku daju se u opsegu od 10 do 10<*>9. Ukoliko davanje te količine mikroorganizama prema pronalsku ne izazove dovoljnu imunu reakciju, treba povećati količinu koju treba ubri zgati. ;Nakon davanja mikroorganizama prema pronalsku probija se tolerancija za ćeliju, koja prezentuje komponentu I), na primer za tumorsku ćeliju ili za ćeliju tkiva iz koga potiče tumor i izaziva se citotoksična imuna reakcija usmerena protiv tumora i/ili protiv ćelija njegovog tkiva. ;Zavisno od izbora komponente I) ova citotoksična imuna reakcija usmerena je ili isključivo protiv tumora ili i protiv tumorskih ćelija uključujući ćelije tkiva od koga potiču tumorske ćelije. ;Prema tome, predmet pronalaska je davanje leka prema pronalsku radi profilakse ili terapije proliferativnog oboljenja. Medju proliferativna oboljenja ubrajuju se tumorska oboljenja, leukemije, oboljenja izazvana virusima, hronične upale, odbijanje transplantiranih organa i auto imuna oboljenja. ;U jednom posebnom izvodjenju ovog pronalska, u kome komponenta I) predstavlja najmanje jedan ćelijski antigen čiju ekspresiju vrši tumorska ćelija i ćelije tkiva od kojih potiče tumor, lek prema pronalasku se daje radi profilakse ili terapije tumora štitne žlezde, dojke, želuca, bubrega, jajnika, mladeža, prostate, cerviksa ili mokraćne bešike. ;U daljem tekstu pronalazak se objašnjava pomoću primera koji predstavljaju samo oblike izvodjenja. ;Primer 1: Indukcija imunog odgovora u BxB miševima imunizacijom sa Salmonellama koje vrše ekspresiju c-Raf-a ;Raf je normalna citosolna serin/treonin kinaza (PSK) koja zajedno sa drugim proteinima signalnih kaskada kontroliše rast i preživljavanje ćelija (Kerkhoff and Rapp, Oncogene 17: 1457-1462., 1998; Troppmair and Rapp, Recent Results Cancer Res 143: 245-249., 1997). Vezivanje faktora rasta za odgovarajući receptor vodi u normalnim slučajevima putem aktivacije Ras-a, zatim aktivacije Raf-a preko više koraka fosforili zacije preko PSK i tirozin kinaze MEK i PSK ERK do aktivacije mašinerije za replikaciju u jezgru ćelije (Kerkhoff and Rapp, Oncogene 17: 1457-1462., 1998). Prva karika tog lanca, mali G-protein Ras, nalazi se u cea. 30% svih ljudskih tumora u izmenjenom obliku (Zachos and Spandidos, Crit Rev Oncol Hematol 26: 65-75., 1997). Raf je efektor Rasa i u velikom broju ljudskih tumora je prekomerno eksprimiran (Naumann etal.,Recent Results Cancer Res 143: 237-244., 1997). ;Za test sa mišjim modelom koriste se transgeni miševi koji vrše povećanu ekspresiju potpunog molekula ili konstitutivno aktivnog domena kinaze (BxB) (Kerkhoff et al., Cell Growth DIFFER 11: 185-190., 2000). Tako ti miševi nakon cea. pola godine spontano razvijaju tumore pluća. Radi generisanja vakcine humani c-Raf cDNA kloniran je pomoću PCR «in-frame» sa HlyA u plazmid pMOhly 1 (Slika 1). Zatim je plazmid pMO-Raf transficiran u atenuirane Salmonelle (S. typhi murium SL7207), koje nose defekt u aromatičnoj razmeni materija (Hoiseth and Stocker, Nature 291: 238-239, 1981).U imunoblotingu pomoću antitela usmerenih protiv c-Raf-a, u bakterijskom lizatu kao i u supernatantu kulture SL7207-bakterija transficiranih sa pMOhy-Raf-om dokazano je prisustvo c-Raf HlyAs proteina fuzij e. ;Sada su BxB transgeni miševi stari od 7-10 nedelja oralno imunizirani Salmonellama (Doza 5 x 10<A>9), pri čemu je vakcinacija ponovljena 2 puta u razmaku od 5 dana. 4 5 dana posle poslednje imunizacije izvršena je intravenozna dodatna vakcinacija sa 5x10<*>5 Salmonellama. Radi kontrole, miševima su intramuskularno dati goli DNA koji kodiraju c-Raf.
5-7 dana nakon poslednje imunizacije uzeti su uzorci seruma, i pomoću Western-Blota analizirana je reakcija antitela. U te svrhe je serum razredjen 1:200 hibridizovan protiv membrana sa separisanim proteinom i blotovanim proteinom c-Raf transficiranih ili ne transficiranih bakterija. Dokazivanje vezanih serumskih antitela izvršeno je pomoću antitela specifičnih za Ig miša. Nasuprot kontrolnih miševa u miševima imunizovanim sa pMohly-Raf transficiranim SL7207 indukovana su c-Raf specifična antitela izotopa IgG. Time je pokazano da imunizacija sa opisanim Salmonellama može da probije autotoleranciju i da indukuje CD4+ T ćelije koje su neophodne za promenu izotopa antitela u IgG.
Radi analize odgovora CD8+ T ćelija C57BL-6 miševi su imunizovani prema istom protokolu. 7 dana nakon poslednje imunizacije izolovane su ćelije slezine i one su stimulisane sa EL-4 ćelijama koje vrše hiperekspresiju Raf-a. 1 sat nakon početka stimulacije vezikularni transport blokiran je Brefeldinom A, a nakon 4 sata su ćelije obojene sa CD8 i IFN-g specifičnim antitelima i analizirane metodom protočne citometrije (Mittrucker et al., Infect Immun 70: 199-203., 2002). Samo u jednom mišu imunizovanom sa pMO-Raf-om detektovan je Raf-specifični odgovor antitela.
Da bi se dokazala tumoricidna aktivnost imunizovani i ne imunizovani BxB miševi stari 10, 12 i 14 meseci su ubijeni i izmerena je plućna masa. Plućna masa je direktna mera za veličinu tumora. U grupi, koja je imunizovana sa SL-pMO-Raf-om, posle 14 meseci su se mnogo češće mogli naći miševi sa smanjenom plućnom masom nego u kontrolnim grupama uključujući onu grupu, koja je imunizovana sa golom DNA koja kodira c-Raf (SL-pCMV-raf). Rast tumora kod ne tretiranih životinja obično nije reverzibilan (Kerkhoff et al., Cell Growth Differ 11:185-190., 2000). Ovi podaci, prema tome, pokazuju da je u ovom eksperimentu vakcinacija sa SL-pMO-Raf-om zaštitila životinje od nastanka tumora i da je ovde opisani pronalazak pogodan kao vakcina protiv tumora.
Ovi eksperimenti takodje pokazuju da se pomoću nosećeg sistema prikazanog u ovom pronalsku u principu može probiti autotolerancija i u c-Raf tolerantnim životinjama indukovati c-Raf specifičan odgovor antitela i odgovor T ćelij a.
Istim eksperimentalnim sistemom mogu kao vakcine da se proizvedu Salmonelle koje vrše ekspresiju izoforma C-Raf-a (kao, na primer, B-Raf i A-Raf), mutiranog C-Raf-a, B-Raf-a ili A-Raf-a, ili kombinacija epitopa normalnih i/ili mutiranih C-Rafa, B-Rafa ili A-Rafa. Primeri mutacije , sa kojom dolazi i do gubitka aktivnosti Raf-a, su mutacije domena koji vezuje Ras, domena kinaze i/ili mesta fos forilacij e.
Primer 2: Indukcija imunog odgovora u BALB/c miševima imunizacijom sa Salmonellama koje vrše ekspresiju PSA
Postojanje antigena specifičnih za tkivo, posebno onih koji u većoj meri bivaju sintetizovani i eksprimirani od tumorskih ćelija, pored dijagnostičke primenj1jivosti tih markera predstavlja i moguću početnu tačku za terapeutske prilaze. Za karcinom prostate do sada su identifi kovana tri antigena vredna pomena: PSA (antigen specifičan za prostatu), PSMA (membranski entigen specifičan za prostatu) i PSCA (antigen matične ćelije prostate). Dok PSA već u ranim oblicima tumora postoji u hipereksprimiranom obliku (Watt et al., Proc Natl Acad Sci U S A 83: 3166-3170., 1986; Wang et al., Prostate 2: 89-96., 1981) i time doprinosi dijagnostici karcinoma (Labrie et al., J Urol 147:846-851; discussion 851-842., 1992), ekspresija PSCA je najčešće povećana tek u lokalno uznapredovanom, dediferenciranom i metastaziranom stadijumu tumora (Gu et al., Oncogene 19: 1288-1296., 2000); Reiter et al., Proc Natl Acad Sci U S A 95: 1735-1740., 1998). Specifičnost organa čini kako PSA tako i PSCA potencijalnim ciljanim antigenom u razvoju imunoterapija protiv karcinoma prostate (Reiter et al., Proc Natl Acad Sci U S A 95: 1735-1740., 1998; Hodge et al., Int J Cancer 63: 231-237., 1995; Armbruster, Clin Chem 39: 181-195., 1993).
U ovom eksperimentu trebalo je pokazati da li Salmonelle, koje luče PSA, na osnovu vektora pMOHLY 1 mogu da indukuju imuni odgovor u BALB/c miševima. Radi toga su prvo putem lančane reakcije polimeraze (PCR)dva Nsil interface uvedena u c-DNA sekvencu PSA da bi se omogućila «in-frame» insercija amplificiranog fragmenta u ciljani vektor. Za amplifikaciju je izabran fragment od 645 parova baza (bp). Kao primer služili su 5'-GTGGATTG-GTGATGCATCCCTCATC-3' i 5'-CAGGGCACATGCATCACTGCCCCA-3'. PCR proizvod je prvo kloniran «blunt-end» u vektor pUC18 i kasnije preko Nsil interfacea ligiran sa ciljanim vektorom pMohlvl. Korektna insercija kontrolisana je putem restriktivne digestije i potvrdjena sekvenciranjem (Slika 2).
Sada se sa tim sojem Salmoneli e BALB/c miševi imunizuju nazalno dozom od 1x107, tri puta u razmaku od 3 nedelje. Imuni odgovor dokazuje se WESTERN-Blot analizama i intracelularnom bojenjem citokina.

Claims (17)

1) Mikroorganizam sa nukleotidnom sekvencom koja kodira ćelijski antigen u čiji genom se mogu ubaciti i u njemu eksprimirati sledeće komponente: I) nukleotidna sekvenca koja kodira najmanje jedan epitop jednog ili više antigena jedne tumorske ćelije i/ili nukleotidna sekvenca za najmanje jedan epitop jednog ili više antigena specifičnih za ćeliju tkiva od koje potiče tumor, II) opcionalno, nukleotidna sekvenca koja kodira protein koji stimuliše ćelije imunog sistema, IIIA) nukleotidna sekvenca za transportni sistem koji omogućava ekspresiju proizvoda ekspresije komponenti I) i, opcionalno, II) na spoljnoj površini bakteriona i/ili sekreciju proizvoda ekspresije komponente I) i, opcionalno, komponente II), i/ili IIIB) nukleotidna sekvenca za protein za lizu mikroorganizama u citosolu ćelija sisara i za intracelularno oslobadjanje plazmida sadržanih u liziranim mikroorganizmima, i III) aktivirajuća sekvenca za ekspresiju jedne ili više komponenti I) do IIIB) izabrana iz grupe koja se sastoji od « aktivirajuće sekvence, koja se može aktivirati u mikroorganizmu, specifične za ćeliju tkiva i ne specifične za ćeliju», pri čemu svaka od komponenti I) do IV) može biti uredjena jednostavno ili višestruko, isto ili različito.
2) Mikroorganizam prema zahtevu 1), pri čemu je mikroorganizam virus, bakterion, naročito gram-pozitivni ili gram-negativni bakterion, prvenstveno izabran iz grupe koja se sastoji od «Escherichia coli, Salmonella, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes i Shigella», ili jednoćelijski parazit, pri čemu je najbolje da je virulentnost mikroorganizma oslabljena.
3) Mikroorganizam prema zahtevu 1), pri čemu je mikroorganizam opna jednog bakteriona.
4) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1) do 3), pri čemu je komponenta I) nukleotidna sekvenca koja kodira jedan epitop ili više epitopa jednog ili više antigena jednog ili više proteina, opcionalno mutiranih, jedne tumorske ćelije, pri čemu je taj protein prvenstveno izabran iz grupe koja se sastoji od «ekstracelularnog, transmembranskog ili intracelularnog dela jednog receptora; ekstracelularnog, transmembranskog ili intracelularnog dela jednog adhezionog molekula; proteina koji transdukuje signal; proteina koji kontroliše deobu ćelija; faktora transkripcije; proteina diferencijacije; embrionalnog proteina; i viralnog proteina», pri čemu je najbolje da je protein proizvod onkogenog gena ili proizvod supresorskog gena»,naročito c-Raf, A-Raf, B-Raf ili homologni protein c-Rafa, A-Rafa ili B-Rafa.
5) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1) do 3), pri čemu je komponenta I) nukleotidna sekvenca koja kodira antigen koji je specifičan za ćeliju tkiva, naročito izabranu iz grupe koja se sastoji od « štitne žlezde, timusa, pljuvačne žlezde, limfne žlezde, timusa, sluzokože želuca, bubrega, jajnika, prostate, cerviksa, sluzokože mokraćne bešike i mladeža» od koje potiče tumor.
6) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1) do 5), sa jednom komponentom I) prema zahtevu 4) i jednom komponentom I) prema zahtevu 5).
7) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1) do 6), pri čemu komponenta II) kodira najmanje jedan citokin, interleukin, interferon i/ili hemokin.
8) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1) do 7), pri čemu komponenta IIIA) kodira transportni signal hemolizina Escherichia coli, protein S-sloja (Rsa A) Caulobacter crescentusa ili TolC protein Escherichie coli .
9) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1) do 8), pri čemu komponenta IIIB) kodira protein lize gram-pozitivnih bakterija, protein lize Listeriae monocytogenes, PLY551 Listeriae monocytogenes i/ili holin Listeriae monocytogenes.
10) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1) do 9), pri čemu komponenta IV) kodira aktivirajuću sekvencu, koja se može aktivirati u mikroorganizmu, a posebno kodira aktivirajuću sekvencu specifičnu za tumorsku ćeliju, specifičnu za ćeliju tkiva, specifičnu za makrofage, specifičnu za dendrite, specifičnu za limfocite, aktivirajuću sekvencu funkcionalno-specifičnu ili aktivirajuću sekvencu koja se može aktivirati ne specifično za ćeliju.
11) Mikroorganizam prema jednom od zahteva 1) do 10), kod koga komponenta I) kodira najmanje dva različita proteina.
12) Primena mikroorganizma prema jednom od zahteva 1) do 11) za proizvodnju leka, naročito za profilaksu i/ili terapiju obolenja prouzrokovanog nekontrolisanom deobom ćelija ili infekcijom, prvenstveno tumorskog obolenja, naročito karcinoma prostate, karcinoma jajnika, karcinoma dojke, karcinoma želuca, tumora bubrega, tumora štitne žlezde, melanoma, tumora cerviksa, tumora mokraćne bešike, tumora pljuvačne žlezde ili tumora limfne žlezde, leukemije, virusne ili bakterijske infekcije, hronične upale , odbacivanja organa i/ili autoimunih oboljenja.
13) Primena prema zahtevu 12) za uklanjanje tumora kao i zdravog tkiva od koga potiče tumor.
14) Primena prema zahtevu 12) ili 13), pri čemu je lek pripremljen za lokalno, parenteralno, oralno ili rektalno davanje.
15) Postupak za proizvodnju leka prema jednom od zahteva 12) do 15), pri čemu se mikroorganizam prema jednom od zahteva 1) do 11) priprema u fiziološki efikasnoj dozi sa jednom ili više fiziološki podnošljivom nosećom supstancom za oralno, i.m., i.v., i.p., rektalno ili lokalno davanje.
16) Plazmid ili vektor ekspresije koji sadrži komponente I) do IV) prema zahtevu 1).
17) Postupak za proizvodnju organizma prema jednom od zahteva 1) do 11), pri čemu se proizvodi plazmid ili vektor ekspresije prema zahtevu 16) i sa tim plazmidom ili vektorom ekspresije transformiše mikroorganizam.
YU75604A 2002-02-28 2003-02-13 Mikroorganizmi kao nosioci nukleotidnih sekvenci koje kodiraju ćelijske antigene za lečenje tumora RS75604A (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10208653A DE10208653A1 (de) 2002-02-28 2002-02-28 Mikroorganismus als Träger von Nukleotidsequenzen kodierend für Zellantigene zur Behandlung von Tumoren
PCT/DE2003/000471 WO2003072789A2 (de) 2002-02-28 2003-02-13 Mikroorganismen als träger von nukleotidsequenzen kodierend für zellantigene zur behandlung von tumoren

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS75604A true RS75604A (sr) 2006-12-15

Family

ID=27762489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YU75604A RS75604A (sr) 2002-02-28 2003-02-13 Mikroorganizmi kao nosioci nukleotidnih sekvenci koje kodiraju ćelijske antigene za lečenje tumora

Country Status (19)

Country Link
US (1) US20060105423A1 (sr)
EP (1) EP1478756A2 (sr)
JP (1) JP2005518795A (sr)
KR (1) KR20040104464A (sr)
CN (1) CN1650014A (sr)
AU (1) AU2003206664A1 (sr)
BR (1) BRPI0308119A2 (sr)
CA (1) CA2513190A1 (sr)
DE (1) DE10208653A1 (sr)
HR (1) HRP20040785A2 (sr)
IL (1) IL163672A0 (sr)
MX (1) MXPA04008287A (sr)
NO (1) NO20043926L (sr)
NZ (1) NZ535312A (sr)
PL (1) PL372370A1 (sr)
RS (1) RS75604A (sr)
RU (1) RU2319741C2 (sr)
WO (1) WO2003072789A2 (sr)
ZA (1) ZA200407528B (sr)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8221739B2 (en) * 2004-04-29 2012-07-17 Botanic Oil Innovations, Inc. Method of cancer treatment
DK2119450T3 (da) 2005-11-29 2013-05-06 Actogenix Nv Induktion af mucosal tolerance over for pankreatisk ø-beta-celle-autoantigener
KR100818144B1 (ko) * 2006-02-15 2008-03-31 고려대학교 산학협력단 인터페론감마를 발현하는 살모넬라 균주 및 이를 함유하는항암 치료용 조성물
US20100129406A1 (en) * 2006-09-01 2010-05-27 Anza Therapeutics, Inc. Holin-enhanced vaccines and reagents, and methods of use thereof
EP1921149A1 (en) 2006-11-13 2008-05-14 AEterna Zentaris GmbH Microorganisms as carriers of nucleotide sequences coding for antigens and protein toxins, process of manufacturing and uses thereof
CN103933563B (zh) 2007-01-25 2016-09-28 英特瑞克斯顿阿克图比奥帝克斯有限公司 使用遗传修饰的乳杆菌通过抗原的粘膜递送治疗免疫疾病
KR101104077B1 (ko) 2008-10-14 2012-01-11 건국대학교 산학협력단 Ｅｇｒ－１의 발현을 증가시키는 활성을 갖는 신규한 엔터로박테리아속에 속하는 신규균주 및 그 균주를 포함하는 조성물의 항암제로서의 용도
KR101346620B1 (ko) * 2011-11-30 2014-01-06 전남대학교산학협력단 신규 박테리아 용해 단백질 및 그의 용도
RU2551238C9 (ru) * 2013-08-02 2016-04-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Медико-генетический научный центр" Российской академии медицинских наук Способ индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли колоректального рака и средство для его осуществления
US11576936B2 (en) 2016-12-07 2023-02-14 Salspera, Llc Methods of synergistic treatment of cancer
CN111936166B (zh) * 2018-02-09 2024-10-22 国家科学与技术研究理事会(Conicet) 用于药物递送的免疫调节和免疫刺激多肽
WO2020232389A1 (en) * 2019-05-16 2020-11-19 City Of Hope Compositions and methods for targeting tumor-associated extracellular matrix components to improve drug delivery

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU1445193C (ru) * 1987-04-22 1996-03-20 Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pGA 23 - ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ ПРОДУКТ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pTNF 311Δ,-/,, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pTNF 311Δ,-/,, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА
RU1438241C (ru) * 1987-04-22 1996-03-20 Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН Рекомбинантная плазмидная днк ртnf 33, кодирующая полипептид со свойствами фактора некроза опухоли человека, и штамм бактерий escherichia coli - продуцент полипептида со свойствами фактора некроза опухоли человека
RU1438240C (ru) * 1987-04-22 1996-03-20 Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РТNF 22, СОДЕРЖАЩАЯ ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИЙ ГЕН ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА - ПРОМЕЖУТОЧНАЯ ПЛАЗМИДА ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pTNF 31, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА
US5156841A (en) * 1988-08-26 1992-10-20 United States Of America Anti-tumor vaccine
ZA941645B (en) * 1994-03-09 1995-01-13 South To South Co Operation In Antibodies specifically reactive against human prostate specific antigen.
US6051237A (en) * 1994-11-08 2000-04-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Specific immunotherapy of cancer using a live recombinant bacterial vaccine vector
JP3976685B2 (ja) * 2000-11-22 2007-09-19 ユニバーシティ オブ メリーランド， ボルチモア タンパク質分泌のためのＣｌｙＡ溶血素の使用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20040104464A (ko) 2004-12-10
HRP20040785A2 (en) 2004-12-31
AU2003206664A1 (en) 2003-09-09
US20060105423A1 (en) 2006-05-18
NO20043926L (no) 2004-09-20
RU2004128929A (ru) 2005-04-10
DE10208653A1 (de) 2003-09-18
JP2005518795A (ja) 2005-06-30
NZ535312A (en) 2008-03-28
EP1478756A2 (de) 2004-11-24
PL372370A1 (en) 2005-07-25
BRPI0308119A2 (pt) 2016-06-28
WO2003072789A3 (de) 2004-02-12
CA2513190A1 (en) 2003-09-04
CN1650014A (zh) 2005-08-03
MXPA04008287A (es) 2006-04-27
RU2319741C2 (ru) 2008-03-20
ZA200407528B (en) 2006-06-28
WO2003072789A2 (de) 2003-09-04
IL163672A0 (en) 2005-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK1789559T3 (en) Methods to construct vaccines with no antibiotic resistance
TWI728968B (zh) 包含肽袖珍基因表現系統之以李斯特菌屬為主的組成物及其使用方法
CN108350411B (zh) 口服肿瘤疫苗
AU2016281958A1 (en) Manufacturing device and process for personalized delivery vector-based immunotherapy
KR20180026670A (ko) 맞춤형 전달 벡터-기반의 면역 요법 및 이의 용도
AU2017211387A1 (en) Personalized delivery vector-based immunotherapy and uses thereof
RS75604A (sr) Mikroorganizmi kao nosioci nukleotidnih sekvenci koje kodiraju ćelijske antigene za lečenje tumora
JP6213969B2 (ja) 免疫原性ポリペプチド表層発現ビフィズス菌
JP6810877B2 (ja) 経口腫瘍ワクチンと免疫抑制阻害剤との併用によるがん治療
CA3109430A1 (en) Neoantigen targeting dna vaccine for combination therapy
JP2012039877A (ja) ユビキチン融合遺伝子およびそれを用いたｄｎａワクチン
JP2006096663A (ja) 癌遺伝子ワクチン
AU2003206663A1 (en) Microorganism for genetic therapeutic treatment of proliferative diseases
EP3397275B1 (en) Nucleic acid molecules encoding for chimeric cspg4 proteins and therapeutic uses thereof
HK1079237A (en) Microorganisms as carriers of nucleotide sequences coding for cell antigens used for the treatment of tumors
US20050031649A1 (en) Recombinant fusion proteins comprising BCG heat shock protein 65 and the epitope of MUC1