RS80704A - ANTI-αvβ6 ANTITELA - Google Patents

ANTI-αvβ6 ANTITELA

Info

Publication number
RS80704A
RS80704A YU80704A YUP80704A RS80704A RS 80704 A RS80704 A RS 80704A YU 80704 A YU80704 A YU 80704A YU P80704 A YUP80704 A YU P80704A RS 80704 A RS80704 A RS 80704A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
light chain
avp6
variable domain
Prior art date
Application number
YU80704A
Other languages
English (en)
Inventor
Shelia Violette
Paul Weinreb
Kenneth Simon
Dean Sheppard
Diane Leone
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.
The Regents Of The University Of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29586753&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS80704(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Ma Inc., The Regents Of The University Of California filed Critical Biogen Idec Ma Inc.
Publication of RS80704A publication Critical patent/RS80704A/sr
Publication of RS52488B publication Critical patent/RS52488B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1066—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G01N2800/205—Scaling palpular diseases, e.g. psoriasis, pytiriasis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Abstract

Monoklonska antitela koja se specifično vezuju za αvβ6. Uključeni su i postupci korišćenja ovih antitela za tretiranje sisara koji imaju oboljenja u kojima posreduje αvβ6, ili su pod rizikom da ih imaju, ili za dijagnostikovanje oboljenja u kojima posreduje αvβ6.

Description

ANTI- av3fiANTITELA
OBLAST PRONALASKA
Ovaj pronalazak se odnosi uopšteno na oblast molekularne biologije, a specifično na antitela na avp6integrine.
OSNOVA PRONALASKA
Integrini su superfamilija receptora sa ćelijske površine koja posreduje u adheziji ćelija-ćelija i ćelija-matriks. Ovi proteini su u stanju da pruže usidrenje, kao i signale za ćelijski rast, migraciju i diferencijaciju za vreme razvića i obnove tkiva. Integrini su takođe uključeni u ćelijsku dediferencijaciju i invaziju, naročito kad ćelije gube svoj specijalizovani oblik i postaju ćelije metastazirajućeg kancera.
Integrini su heterodimerni proteini, sastavljeni od dve nekovalentno spojene podjedinice, a i p. Vezivna specifičnost integrina je diktirana kombinacijom nekih 18 različitih a lanaca sa nekih 8 različitih P lanaca. avp6 integrin može da se veže za veći broj liganada, uključujući fibronektin, tenascin, vitronektin i za nedavno identifikovan peptid vezan za latenciju "LAP" (latencv associated peptide), peptid od 278 amino kiselina, sintetisan kao deo prekursora TGF-P proteina (Munger et al.,Cei! 96(3):319-328(1999)). LAP se odvaja od zrelog oblika TGF-P kao N-terminalni peptid za vreme sekrecije, ali ostaje nekovalentno vezan sa TGF-P, da bi ovaj ostao u latentnom stanju. Ovaj kompleks ne može da se veže za TGF-P receptor, pa prema tome nije biološki aktivan. avp6integrin može da se veže direktno za RGD motiv koji postoji unutar LAP, što dovodi do oslobađanja LAP i aktivacije TGF-p. Pošto vezivanje avp6 za LAP može da bude važno za konverziju TGF-P u aktivno stanje, blokiranje vezivanja može da dovede do inhibicije avP6-posredovane aktivacije TGF-P i za nju vezane fibrotične patologije.
PREGLED PRONALASKA
Ovaj pronalazak se zasniva na otkriću i karakterizaciji antitela na avp6visokog afiniteta, uključujući identifikaciju i analizu ključnih aminokiselinskih ostataka u regionima koji određuju komplementarnost (CDR) takvih antitela.
Ovaj pronalazak obuhvata monoklonsko antitelo koje (a) se specifično vezuje za avp6; (b) inhibira vezivanje avp6za njegov ligand kakav je LAP, fibronektin, vitronektin, i tenascin sa vrednošću IC50manjom od one 10D5 (International Patent Application Publication WO 99/07405); (c) blokira aktivaciju TGF-P; (d) sadrži određene aminokiselinske sekvence u CDR-ovima (npr., one prikazane na SI. 7A i 7B) koje obezbeđuju specifičnost vezivanja za avp6; (e) se specifično vezuje za p6podjedinicu; i/ili (f) prepoznaje avP6u procedurama imunobojenja, kao što je imunobojenje parafinskih preparata tkiva.
Otkriveno je da antitela koja se vezuju za avp6mogu da se grupišu u biofizički različite klase i podklase. Jedna klasa antitela ispoljava sposobnost da blokira vezivanje liganda (npr., LAP) za avP6(blokatori). Ova klasa antitela može dalje da sc podeli na podklase blokatora zavisnih od katjona i blokatora nezavisnih od katjona. Neki od blokatora zavisnih od katjona sadrže peptidnu sekvencu arginin-glicin-aspartat (RGD), dok blokatori nezavisni od katjona ne sadrže sekvencu RGD. Jedna druga klasa antitela ispoljava sposobnost da se veže za avPć, a da ne blokira vezivanje avP6za ligand (neblokatori).
Prema tome, u nekim izvođenjima ovog pronalska, neka antitela iz ovog pronalska su zavisna od dvovalentnih katjona za vezivanje za avP6, dok su druga nezavisna od dvovalentnih katjona. Tipični katjoni su Ca<2+>, Mg<2+>i Mn<2+>.
U nekim izvođenjima, antitelo sadrži iste polipeptidne sekvence teških i lakih lanaca kao antitelo koje proizvode hibridomi 6.1A8, 6.3G9, 6.8G6, 6.2B1, 6.2B10, 6.2A1, 6.2E5, 7.1G10, 7.7G5, ili 7.1C5.
U nekim izvođenjima, antitela sadrže težak lanac čiji se regioni koji određuju komplementarnost (CDR) 1, 2 i 3 sastoje uglavnom od (tj., sa izuzetkom od nekoliko konzervativnih varijacija) sekvenci iz SEQ ID Nos:l, 4 i 7, respektivno, i/ili lakog lanca čiji se CDR 1, 2 i 3 sastoje uglavnom od sekvenci iz SEQ ID NOs: 10, 13 i 15, respektivno.
U nekim izvođenjima, antitela sadrže težak lanac čiji se CDR 1, 2 i 3 uglavnom sastoje od sekvenci iz SEQ ID NOs: 3, 5 i 8, respektivno, i/ili lakog lanca čiji se CDR 1, 2 i 3 sastoje uglavnom od sekvenci iz SEQ ID NOs: 11, 14 i 17, respektivno.
U nekim izvođenjima, antitela sadrže težak lanac čiji se CDR 1, 2 i 3 uglavnom sastoje od sekvenci iz SEQ ID NOs: 3, 6 i 9, respektivno, i/ili lakog lanca čiji se CDR 1, 2 i 3 sastoje uglavnom od sekvenci iz SEQ ID NOs: 12, 14 i 18, respektivno.
U nekim izvođenjima, antitela sadrže težak lanac čiji se CDRs 1, 2 i 3 sastoje uglavnom od sekvenci iz SEQ ID NOs: 2, 46 i 47, respektivno, i/ili lakog lanca čiji se CDRs 1, 2 i 3 sastoje uglavnom od sekvenci iz SEQ ID NOs: 48, 13 i 16, respektivno.
U nekim izvođenjima, antitela sadrže težak lanac čiji se CDRs 1, 2 i 3 uglavnom sastoje od sekvenci iz SEQ ID NOs: 49, 51 i 53, respektivno, i/ili lakog lanca čiji se CDRs 1, 2 i 3 sastoje uglavnom od sekvenci iz SEQ ID NOs: 55, 57 i 59, respektivno.
U nekim izvođenjima, antitela sadrže težak lanac čiji se CDRs 1, 2 i 3 uglavnom sastoje od sekvenci iz SEQ ID NOs: 50, 52 i 54, respektivno, i/ili lakog lanca čiji se CDRs 1, 2 i 3 sastoje uglavnom od sekvenci iz SEQ ID NOs: 56, 58 i 60, respektivno.
U nekim izvođenjima, antitela sadrže sekvencu varijabilnog domena teškog lanca iz bilo kog od SEQ ID NOs: 19-36 i 61-62.
U nekim izvođenjima, antitela sadrže sekvence varijabilnih domena teškog i lakog lanca iz
(1) SEQIDNOs: 19 i 37; (2) SEQ ID NO: 20 ili 21 i SEQ ID NO: 38; (3) SEQIDNOs: 22 i 43; (4) SEQ ID NOs: 23 i 44; (5) SEQIDNOs: 24 i 45; (6) SEQ ID NO: 25 ili 26 i SEQ ID NO: 42; (7) SEQ ID NO: 27, 28, ili 29 i SEQ ID NO: 39; (8) SEQ ID NO: 34 ili 35 i SEQ ID NO: 40; (9) SEQIDNOs: 36 i 41;
(10) SEQ ID NOs: 61 i 63; ili
(11) SEQ IDNOs: 62 i 64,
respektivno.
U nekim izvođenjima, antitelo se specifično vezuje za avP6, ali ne inhibira vezivanje avp<5 za peptid vezan za latenciju (LAP). Bar neka od ovih antitela su sposobna da se vežu za avPo u presecima šarafinskih preparata tkiva i, prema tome, mogu da se koriste u dijagnostičke svrhe. Tipična antitela uključuju 6.2A1 i 6.2E5.
Ovaj pronalazak takođe obuhvata antitela koja se vezuju za isti epitop kao i sva gore opisana antitela.
Ovaj pronalazak takođe obuhvata kompozicije koje sadrže jedno ili više antitela iz ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim od ovih kompozicija, antitela su konjugovana sa citotoksičkim agensom (tj., agens koji that narušava vijabilnost i/ili funkcije ćelije) kao što je toksin ili radionuklid. Antitela u ovim kompozicijama mogu da budu antitela zavisna od katjona. kompozicije se mogu davati subjektu (npr., sisaru kao što je čovek) koji ima ili je pod rizikom da ima oboljenje u kome posreduje avpć, tako da se tretira oboljenje (npr., ublaži, olakša, smanji, spreči, odloži početak). Primeri takvih oboljenja uključuju, ali nisu ograničeni na: fibrozu (npr., skleroderma, stvaranje ožiljaka, fibroza jetre, fibroza pluća i fibroza bubrega); psorijaza; kancer (npr., kancer epitela; oralni, kancer kože, cerviksa, jajnika, farinksa, larinksa, ezofagusa, pluća, dojke, bubrega ili kolorektalni kancer); Alportov sindrom; akutne i hronične povrede pluća, jetre, bubrega i drugih unutrašnjih organa; i skleroza pluća, jetre, bubrega i drugih unutrašnjih organa. Rizik dobijanja takvih oboljenja može biti rezultat genetske predispozicije; određenog načina života kao što je pušenje i alkoholizam; izlaganje polutantima iz okoline, kao što je azbest; fiziološka stanja kao što je dijabetes, infekcija virusom hepatitisa (npr., infekcija virusom hepatitisa C), autoimuna oboljenja; i medicinski tretmani kao što je radijaciona terapija.
Ovaj pronalazak takođe obuhvata postupke detekcijeavPću uzorku tkiva iz sisara (npr., čoveka), koji sadrže dovođenja u kontakt uzorak tkiva sa antitelom iz pronalaska, kao što su 6.2A1 i 6.2E5.
Ovaj pronalazak takođe obuhvata ćelije hibridoma 6.1A8, 6.2B10, 6.3G9, 6.8G6, 6.2B1, 6.2A1, 6.2E5, 7.1G10, 7.7G5, i 7.1C5; izolovane nukleinske kiseline koje sadrže kodirajuću sekvencu za neku od SEQ LD NOs: 19-45 i 61-64; izolovane polipeptide koji sadrže aminokiselinsku sekvencu bilo koje iz SEQ ID NOs: 19-45 i 61-64.
Antitelo iz ovog pronalaska se odnosi na celo antitelo, npr., antitelo koje sadrži dva teška lanca i dva laka lanca, ili fragment celog antitela koji vezuje antigen, kao što je Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2fragment ili F(v) fragment. Antitelo iz ovog pronalaska može da bude mišje antitelo ili njegov homolog, ili potpuno humano antitelo. Antitelo iz ovog pronalaska takođe može da bude humanizovano antitelo, himerno antitelo ili jednolančano antitelo. Antitelo iz ovog pronalaska može biti bilo kog izotipa i podizotipa, na primer, IgA (npr., IgAl i IgA2), IgG (npr., IgGl, lgG2, IgG3 i IgG4), IgE, IgD, IgM, gde laki 'lanci imunoglobulina mogu biti kapa ili lambda tipa.
U nekim izvođenjima, antitelo iz pronalaska može da ima mutaciju (npr., deleciju, supstituciju ili adiciju) na jednoj ili više (npr., 2, 3, 4, 5, ili 6) određenih pozicija u teškom lancu, takvu daje efektorska funkcija antitela (npr., sposobnost antitela da se veže za Fc receptor ili faktor komplementa) izmenjena, a da sposobnost antitela da se veže za antigen nije time pogođena. U nekim drugim izvođenjima, antitelo iz ovog pronalaska može da ima mutaciju na aminokiselinskom ostatku koji je mesto za glikozilaciju takvu daje mesto za glikozilaciju eliminisano. Takvo antitelo može imati klinički povoljne, smanjene efektorske ili druge neželjene funkcije, a da zadrži svoju sposobnost vezivanja antigena. Mutacija mesta za glikozilaciju može takođe da bude povoljna za razvoj procesa (npr., ekspresija i prečišćavanje proteina). U još nekim drugim izvođenjima, teški ili laki lanci mogu da imaju mutacije koje povećavaju afinitet ili potentnost.
Nekoliko Fusion (Fuzija) #6 i Fusion #7 hibridoma je deponovano u American Type Culture Collection ("ATCC"; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA) prema budimpeštanskom ugovoru (Budapest Treatv). Klonovi hibridoma 6.1A8, 6.2B10, 6.3G9,
6.8G6, i 6.2B1 su deponovani 16. avgusta, 2001. i imaju depozitne brojeve ATCC PTA-3647, -3648, -3649, -3645, i -3646, respektivno. Klonovi hibridoma 6.2A1, 6.2E5, 7.1G10, 7.7G5, i 7.1C5 su deponovani 5. decembra, 2001. i imaju depozitne brojeve ATCC PTA-3896, -3897,
-3898, -3899, i -3900, respektivno. Videti Tabelu 1,infra.
Antitela iz pronalaska su korisna za tretiranje bilo kog klinički nepoželjnog stanja ili oboljenja (kao što je ovde diskutovano) koje je posredovano vezivanjem avp6za njegov ligand, kao što su LAP i fibronektin. Ova antitela mogu da budu potentnija, preko većeg afiniteta ili aviditeta i katjonske zavisnosti ili nezavisnosti vezivanja za ligand, nego prethodno poznata ctvp6 antitela.
Pored terapeutskih primena antitela iz pronalaska, posebno blokatora, neblokatorska klasa antitela može da se koristi u dijagnostičke svrhe, kao što su eseji zarobljavanja antigena (antigen capture assavs), enzimski imunoeseji (ELISA-e), imunohistohemija, i slično.
Ostale crte i prednosti pronalaska će biti jasne iz sledećeg detaljnog opisa, crteža i zahteva.
KRATAK OPTS CRTEŽA
SI. 1A i 1B su histogratni koji prikazuju rezultate eseja zarobljavanja ćelija (cell capture assay) kojima je određena sposobnost različitih monoklonskih antitela ("mAb") na ovP(,da vežu |3,rU'ansfektovane FDC-Pi ćelije (netransfektovane ćelije su kontrola).
SI. 2A je grafik koji prikazuje rezultate ELISA eseja kojima je određena sposobnost različitih prečišćenih "Fusion 6" monoklonskih antitela na avPeda vežu rastvorljive rekombinantne humane avp6("hsavP6"). Ova antitela su generisana imunizacijom Pć7- miševa rastvorljivim humanim skraćenim avP6- Brojevi u legendi su brojevi klonova. Za odgovarajuće nazive klonova, videti Tabelu 2.
SI. 2B je grafik koji prikazuje rezultate ELISA eseja kojima je određena sposobnost različitih prečišćenih "Fusion 7" monoklonskih antitela na avp6 da vežu rastvorljive rekombinantne hsavp6. Ova antitela su generisana imunizacijomfa- l-miševa Pć-transfektovanim NIH 3T3 ćelijama (Fusion #7).
SI. 3A-F su grafici koji prikazuju diferencijalnu zavisnost od katjona vezivanja različitih monoklonskih antitela na avPćda vežu hsctvPć-
SI. 4A i 4B su grafici koji prikazuju da Fusion #6 i Fusion #7 monoklonska antitela, respektivno, inhibiraju vezivanje biotina-hsavP6za LAP.
SI. 5A-E su grafici koji prikazuju da tipična monoklonska antitela iz pronalaska inhibiraju vezivanje p6-transfektovanih FDC-P1 ćelija za LAP. SI. 5A i 5B prikazuju rezultate sa Fusion #6 antitelima. SI. 5C-E prikazuju rezultate sa Fusion #7 antitelima.
SI. 6A i 6B su grafici koji prikazuju da Fusion #6 i Fusion #7 antitela, respektivno, inhibiraju aktivaciju TGF-P posredovanu avP6, pomoću testa sa reporterskim genom PAI-1 luciferaze za praćenje TGF-B aktivacije.
SI. 7A prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena teških lanaca avPćmonoklonskih antitela 6.1A8, 6.8G6 (subklonovi A i B), 7.7G5, 6.2B1, 6.3G9, 6.2B10 (subklonovi A i B), 6.2G2, 6.2A1, 6.4B4 (subklonovi A, B i C), 7.10H2, 7.9H5, 7.4A3 (subklonovi A i B), 7.1C5 (subklonovi A i B) i 7.1G10. Antitela 6.1A8, 6.8G6 i 7.7G5 su zavisna od katjona u vezivanju za avp6, dok su antitela 6.2B1, 6.2A1, 6.3G9, 6.2B10, 6.4B4, 7.1C5 i 7.1G10 nezavisna od katjona( infra).Brojevi u zagradama označavaju pozicije aminokiselinskih ostataka. CDR su u velikim okvirima, dok mali okviri u kojima su aminokiseline napisane kurzivom reprezentuju polimorfizam u različitim klonovima određenog antitela.
SI. 7B prikazuje aminokiselinske sekvence varijabilnih domena lakih lanaca avpb monoklonskih antitela 6.1 A8, 6.8G6, 6.4B4, 6.2A1, 7.1C5, 7.1G10, 6.2B10, 7.7G5, 6.2B1 i 6.3G9.
SI. 8 je tačkasti grafik koji pokazuje ekspresiju avPću presecima tkiva humanog kancera dojke i humanog skvamoznog karcinoma. Normalna humana tkiva pokazuju sasvim zanemarljive nivoe ekspresije avB6.
SI. 9A i 9B su grafici kvadratnih funkcija koji prikazuju afinitete vezivanja dva antitela na avp6u rastvoru, 6.8G6 i 6.3G9, respektivno, za rasvorljiv avP6-
SI. 10A i 10B su histogrami koji prikazuju sposobnost purifikovanih monoklonskih antitela da konkurišu biotinilovanim 6.3G9 i biotinilovanim 6.8G6, respektivno, za vezivanje za av<p>6.
SI. 11 je histogram koji pokazuje procenat obojenosti aktina iz glatkih mišića u bubrezima iz UUO životinja tretiranih monoklonskim antitelima av<p>6-
SI. 12 pokazuje ekspresiju avP6u tumorskim ćelijskim linijama FACS analizom (desna strana slike) i inhibiciju vezivanja tumorskih ćelijskih linija za LAP ligand pomoću mAb 6.3G9 i 6.4B4 (leva strana slike).
SI. 13 je histogram koji pokazuje inhibiciju vezivanja tri tumorske ćelijske linije za LAP ligand pomoću mAb na avp66.3G9, 6.8G6 i 6.4B4. Vezivanje mAb je upoređeno sa ukupnim vezivanjem bez dodavanja ispitivanih mAb (TB) i nespecifičnim vezivanjem za sam kontrolni BSA (NSB).
SI. 14A i 14B su grafici koji prikazuju efekte anti-ctvP6mAb 6.3G9 i 6.4B4, respektivno, tokom od 33 dana istraživanja na tumorima nastalim od subkutano implantiranih ćelija Detroit 562.
SI. 15A-C su grafici koji prikazuju efekte anti-ctvPemAb na plućnu fibrozu indukovanu bleomicinom. (A) Tretman antitelima pomoću 6.3G9 mAb je počet nultog dana u momentu davanja bleomicina i praćenje tokom perioda od 30 dana; (B) tretman antitelima pomoću 6.3G9 mAb je počet 15 dana posle tretmana bleomicinom i praćenje tokom perioda od 30 dana; (C) tretman antitelima pomoću 6.3G9, 6.8G6 i 6.4B4 mAb je počet 15 dana posle tretmana bleomicinom i praćenje tokom produženog perioda od 60 dana. Na obe SI. 15A i 15B, histogrami na levoj strani reprezentuju ug hidroksiprolina/pluća dok histogrami na desnoj strani pokazuju procentualno povećanje hidroksiprolina nad miševima tretiranim slanim rastvorom (bez bleomicina). Na SI. 15C, grafik pokazuje sadržaj hidroksiprolina/pluća.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Ovaj pronalazak predstavlja klase i podklase antitela koja su specifična za integrin avPć- Bar jedna klasa antitela (blokatori) je sposobna za blokiranje vezivanja av(36za LAP ili sprečavanje aktivacije TGF-P.
U nastavku su opisani različiti postupci pravljenja antitela iz ovog pronalaska. Postupci koji su poznati u struci, ali ovde nisu specifično opisani su takođe u okviru ovog pronalaska. Na primer, antitela iz ovog pronalaska mogu takođe da budu identifikovana pomoću biblioteke antitela na fagu, kao što su one opisane u Smith,Science228:1315-7
(1985); U.S. Patents 5,565,332, 5,733,743, 6,291,650 i 6,303,313. Dodatna antitela iz ovog pronalaska mogu se praviti kuplvanjem teških lanaca identifikovanih ovde sa nesrodnim lakim lancem, npr., lakim lancem identifikovanim tehnologijom eksprimiranja na fazima.
Hibridomska antitela koja nisu humanog porekla
Monoklonska antitela iz ovog pronalaska mogu da se proizvode dobro poznatom hibridomskom tehnologijom. Da bi se to uradilo, p6-/- životinje (npr., miševi, pacovi ili kunići) se imunizuju purifikovanim ili sirovim avp6preparatima, ćelijama transfektovanim cDNA konstruktima koji kodiraju ctv, Pćili oba antigena, ćelijama koje konstitutivno eksprimiraju avp6, i sličnim. Antigen se može dati kao prečišćeni protein, protein eksprimiran na ćelijama, proteinski fragment ili njegov peptid, ili kao gola DNK ili virusni vektori koji kodiraju protein, proteinski fragment ili peptid. Serumi imunizovanih životinja se zatim testiraju na prisustvo antitela na avp6. B ćelije se izoluju iz životinja koje su pozitivne na testu i hibridomi se prave sa ovim B ćelijama.
Antitela koja luče hibridomi se ispituju na sposobnost da se specifično vezuju za avp6(npr., vezivanje za Pć-transfektovane ćelije, a ne za netransfektovane roditeljske ćelije) i na bilo koje druge željene karakteristike, npr., da li imaju željene CDR koncenzus sekvence, da li inhibiraju (ili ne inhibiraju u slučaju neblokatora) vezivanje između LAP i avp6 sa vrednošću IC50nižom od one poznatog anti-avP6 antitela 10D5, ili, da li inhibiraju TGF-P aktivaciju.
Ćelije hibridoma koje su pozitivne na testovima pretraživanja se gaje u hranljivom medijumu u uslovima koji omogućuju ćelijama da luče monoklonska antitela u medijum kulture. Supernatant iz podešene kulture hibridoma se zatim skuplja i antitela iz supernatanta se prečišćavaju. Alternativno, željeno antitelo se može proizvoditi injektiranjem ćelija hibridoma u peritonealnu šupljinu neimunizovane životinje (npr.. miša). Ćelije hibridoma
proliferuju u peritonealnu šupljinu, lučeći antitelo koje se akumulira kao ascitna tečnost. Antitelo se može zatim skupljati izvlačenjem ascites tečnosti iz peritonealne šupljine špricem.
Monoklonska antitela se takođe mogu dobijati izolovanjem cDNK koja kodira antitelo iz željenih hibridoma, transfektovanjem sisarskih ćelija domaćina (npr., CHO ili NSO ćelija) pomoću cDNK, gajenjem transfektovanih ćelija domaćina i skupljanjem antitela iz medijuma kulture.
Himema antitela
Monoklonska antitela iz ovog pronalaska se takođe mogu proizvoditi inženjeringom (npr., mišjeg, pacovskog ili kunićevog) srodnog antitela hibridoma. Na primer, srodno antitelo se može izmeniti tehnologijom rekombinantne DNK tako da se deo ili ceo zglob i/ili konstantni regioni teških i/ili lakih lanaca zamenjuju odgovarajućim komponentama antitela iz druge vrste (npr., humanim). Uopšteno, varijabilni domeni skrojenog antitela ostaju identični ili suštinski identični varijabilnim domenima srodnog antitela. Ovakvo skrojeno antitelo se zove himerno antitelo i ono je manje antigeno nego srodno antitelo kad se da jedinki vrste iz koje je zglob i/ili konstantni region izveden (npr., čovek). Postupci pravljenja himernih antitela su dobro poznati u struci.
Himerna antitela u okviru ovog pronalaska mogu da sadrže varijabilni domen teškog lanca koji ima sekvencu identičnu (ili suštinski identičnu) bilo kojoj iz SEQ ID NOs: 19-36 i/ili varijabilni domen lakog lanca koji ima sekvencu identičnu (ili suštinski identičnu) bilo kojoj iz SEQ ID NOs: 37-45.
Poželjni humani konstantni regioni uključuju one izvedene iz IgGl i IgG4.
Potpuno humana antitela
Monoklonska antitela iz ovog pronalaska uključuju i potpuno humana antitela. Ona se mogu dobijati korišćenjeminvirro-iniciranih humanih splenocita, kao stoje opisano u Boerner et al.,J. Immunol.147: 86-95 (1991), ili korišćenjem biblioteka antitela na fagu, kao što je opisano u, npr., U.S. Patent 6,300,064.
Neki drugi postupci za dobijanje potpuno humanih antitela uključuju upotrebu životinja koje imaju inaktivirane endogene Ig lokuse i koje su transgene za nepreuređene gene teških i lakih lanaca humanog antitela. Takve transgene životinje se mogu imunizovali pomoću avf3f, i hibridomi se onda prave iz B ćelija deriviranih iz njih. Ovi postupci su opisani u. npr.. raznim GenPharm/Medare.\ (Palo A lio. CA) publikacijama/ patentima koji sc odnose na transgene miševe koji imaju humane Ig minilokuse (npr., Lonberg U.S. Patent 5,789,650); raznim Abgenix (Fremont, CA) publikacijama/patentima koji se odnose na XENOMICE (npr., Kucherlapati U.S. Patents 6,075,181, 6,150,584 i 6,162,963; Green et al.,Nature Genetics7:13-21 (1994); i Mendez et al., 15(2):146-56 (1997)); i raznim Kirin (Japan) publikacijama/patentima koji se odnose na "transomične" miševe (npr., EP 843 961 i Tomizuka et al,Nature Genetics16:133-1443 (1997)).
Humanizovana antitela
Monoklonska antitela iz ovog pronalaska takođe uključuju humanizovane verzije srodnih antitela na avP6, izvedena iz drugih vrsta. Humanizovano antitelo je antitelo napravljeno tehnologijom rekombinantne DNK, u kojoj se neke ili sve aminokiseline humanog imunoglobulinskog lakog ili teškog lanca, koje nisu potrebne za vezivanje antigena (npr., konstantni regioni i okvirni regioni varijabilnih domena), koriste da zamene odgovarajuće aminokiseline iz lakog ili teškog lanca srodnog antitela koje nije humanog porekla. Kao primer, humanizovana verzija mišjeg antitela na dati antigen i na svom lakom i na teškom lancu ima (1) konstantne regione humanog antitela; (2) okvirne regione iz varijabilnih domena humanog antitela i (3) CDR iz mišjeg antitela. Kad je neophodno, jedan ili više ostataka u humanim okvirnim regionima mogu biti zamenjeni ostacima na odgovarajućim pozicijama u mišjem antitelu, tako da se sačuva afinitet za vezivanje humanizovanog antitela za antigen. Ova promena se nekad zove "povratna mutacija." Po pravilu, manja je verovatnoća da imuni odgovor u čoveku izazovu humanizovana antitela nego himerna humana antitela zato što imaju znatno manje komponenata koje nisu humanog porekla.
Postupci za pravljenje humanizovanih antitela su opisani u, npr., Winter EP 239 400; Jones et al.,Nature321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature332: 323-327 (1988); Verhoeven et al.,Science239: 1534-1536 (1988); Queen et al.,Proc. Nat. Acad. Sci.USA 86:10029 (1989); U.S. Patent 6,180,370 i Orlandi et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86: 3833
(1989). Obično, transplantacija mišjih (ili nekih drugih koji nisu humanog porekla) CDR na humano antitelo se postiže na sledeei način. cDNK koje kodiraju varijabilne domene teškog i lakog lanca se izoluju iz hibridoma. Sekvence DNK varijabilnih domena, uključujući CDR-ove, se određuju sekvenciranjem. DNK koje kodiraju CDR-ovi se prebacuju u odgovarajuće regione sekvence koja kodira varijabilni domen teškog ili lakog lanca humanog antitela pomoću usmerene mutageneze. Zatim se dodaju segmenti konstantnog regiona humanog gena željenog izotipa (npr., yl za CH i k za CL). Humanizovani geni teškog i lakog lanca se koeksprimiraju u sisarskim ćelijama domaćinima (npr., CHO ili NSO ćelije) da bi se napravilo rastvorljivo humanizovano antitelo. Da bi se olakšala proizvodnja antitela na velikoj skali, često je poželjno da se takva humanizovana antitela proizvode u bioreaktorima sa ćelijama koje eksprimiraju antitela, ili da se proizvode transgeni sisari (npr., koze, krave ili ovce) koji eksprimiraju antitela u mleku (videti, npr., U.S. Patent 5,827,690).
Ponekad, direktan prenos CDR-ova u okvir humnog antitela dovodi do gubitka
afiniteta nastalog antitela za vezivanje antigena. Ovo se dešava zbog toga što u nekim srodnim antitelima, određene aminokiseline unutar okvirnih regiona interaguju sa CDR-ovima i na taj način utiču na ukupan afinitet antitela za vezivanje antigena. U takvim slučajevima, kritično je da se uvedu "povratne mutacije"( supra)u okvirne regione akceptorskog antitela da bi se zadržala antigen-vezujuća aktivnost srodnog antitela.
Opšti pristup dobijanja povratnih mutacija je poznat u struci. Na primer, Queen et al.
( supra),Co et al,Proc. Nat. Acad. Sci.USA 88: 2869-2873 (1991) i WO 90/07861 (Protein Design Labs Inc.) opisuju pristup koji uključuje dva ključna koraka. Prvo, kompjuterskom analizom se odaberu humani V-okvirni regioni sa optimalnom homologijom proteinskih sekvenci V-okvirnog regiona srodnog mišjeg antitela. Zatim, tercijarna struktura mišjeg V regiona se modeluje kompjuterski da bi se vizuelizovali aminokiselinski ostaci okvira koji će verovatno da interaguju sa mišjim CDR-ovima, a zatim se ovi aminokiselinski ostaci miša superponiraju na homologni humani okvir.
U okviru ovog dvostepenog pristupa, postoji nekoliko kriterijuma za dizajniranje humanizovanih antitela. Prvi kriterijum je da se kao humani akceptor koristi okvir iz određenog humanog imunoglobulina koji je obično homologan sa donorom imunoglobulina koji nije čovek, ili da se koristi koncenzusni okvir iz mnogo humanih antitela. Drugi kriterijum je da se koristi donorska aminokiselina radije nego akceptorska, ako je humani akceptorski ostatak neuobičajen, a donorski ostatak tipičan za humane sekvence na tom mestu okvira. Treći kriterijum je da se koristi donorski okvirni aminokiselinski ostatak radije nego akceptorski na pozicijama odmah pored CDR-ova.
Može se koristiti i drugi pristup kao što je opisan u. npr., Tempest,Bioieclmologv9: 266-271 (1991). U ovom pristupu, okviri V regiona, izvedeni iz teških i lakih lanaca NEVVM i RJE1, respektivno, koriste se za presađivanje CDR bez radikalnog uvođenja mišjih ostataka. Prednost upotrebe ovog pristupa je u tome što su trodimenzione strukture varijabilnih regiona NEWM i REI poznate iz rentgenske kristalografije, tako da se specifične interakcije između CDR-ova i okvirnih ostataka V regiona mogu lako modelovati.
Druge grupe
Monoklonska antitela iz ovog pronalaska mogu da sadrže i druge grupe koje imaju željene funkcije. Na primer, antitela mogu da uključe toksinsku grupu (npr., tetanus toksoid ili ricin) ili radionuklid (npr.,<1H>In ili<90>Y) za ubijanje ćelija koje su meta antitela (videti, npr., U.S. Patent 6,307,026). Antitela mogu da sadrže grupu (npr., biotin, fluorescentne grupe, radioaktivne grupe, histidinsku oznaku ili oznake drugih peptida) za laku izolaciju ili detekciju. Antitelo može da sadrži i grupu koja može da produži njegov poluživot u serumu, na primer, polietilen glikolnu (PEG) grupu.
Bolesna stanja i životinjski modeli
Antitela iz pronalaska su korisna u tretmanu, uključujući sprečavanje, oboljenja posredovanih pomoću avP6. Na primer, ova antitela mogu da se koriste za lečenje fibroze (npr., fibroze pluća, akutne povrede pluća, fibroze bubrega, fibroze jetre, Alportovog sindroma i skleroderme) blokiranjem aktivacije TGF-P ili blokiranjem vezivanja avPćza bilo koje druge ligande, kao što je fibronektin, vitronektin i tenascin. Novina ovog pristupa uključuje: (1) on blokira aktivaciju TGF-P pre nego vezivanje TGF-B za njegov receptor, (2) može da inhibira TGF-P lokalno (tj., na mestima avP6pozitivne regulacije) pre nego sistemski i (3) on inhibira vezivanjeavPeza ligand. Osim za fibrozna oboljenja ili stanja, antitela iz pronalaska su korisna u lečenju kancera ili metastaza kancera (uključujući rast i invaziju tumora), posebno kancera epitela. Podskup kancera epitela je karcinom skvamoznih ćelija, npr., glave i vrata, oralni, dojke, pluća, prostate, cerviksa, farinksa, debelog creva, pankreasa i jajnika. Naše studije u kojima su korišćena nova avP6monoklonska antitela pokazala su da se avP6intenzivno eksprimira u mnogo epitelnih kancera, naročito na prednjoj ivici tumora. Nova antitela mogu da se koriste i u svim drugim oboljenjima u kojima posreduje avPć, uključujući psorijazu.
Treatmani iz ovog pronalaska su efektivni i u humanim i u životinjskim subjektima pogođenim ovim stanjima. Životinjski subjekti na koje je ovaj pronalazak primenjiv obuhvataju i domaće životinje i stoku, koji se gaje bilo kao kućni ljubimci, bilo u komercijalne svrhe. Primeri su psi, mačke, goveda, konji, ovce, svinje i koze.
Efikasnost antitela iz pronalaska može da se testira na različitim životinjskim modelima. Mišji modeli za fibrozu pluća uključuju fibroze pluća koje se mogu indukovatibleomicinom (Pittet et al., J. Clin. Invest.107(12): 1537-1544 (2001);i Munger et al., supra) izračenjem (Franko et al.,Rad. Res.140:347-355 (1994)). U miševima tretiranim bleomicinom, povećava se ekspresija av(36u epitelnim alveolarnim ćelijama pluća. Ali (36miševi bez p6($6knockout) su zaštićeni od oštećenja indukovanog bleomicinom i fibroze.
Mišji modeli za fibrozu bubrega uključuju COL4A3 -/- miševe (videti, npr., Cosgrove et al.,Amer. J. Path.157: 1649-1659 (2000), miševi sa oštećenjem indukovanim adriamicinom (Wang et al.,Kidney International58: 1797-1804 (2000); Deman et al.,NephrolDial Transplant 16:147-150 (2001)), db/db miševi (Zivadeh et al.,PNAS USA97:8015-8020 (2000)) i miševi sa unilateralnom opstrukcijom uretra (Fogo et al.,Lab Investigation81: 189A (2001) i Fogo et al.,Journal of the American Society of Nephrology12:819A (2001)). U svim ovim modelima, kod miševa se razvija oštećenje bubrega i fibroza koja može da progredira do otkazivanja bubrega. avP6je pozitivno regulisan u epitelnom sloju uzlaznih i silaznih tubula bubrega COL4A3 -/- miševa, miševa tretiranih adriamicinom i miševa koji podležu unilateralnoj opstrukciji uretera. Izgleda da se ekspresija avPćpovećava u raznim modelima oštećenja bubrega.
Sposobnost monoklonskih antitela na avP6da inhibiraju rast, napredovanje i metastaziranje tumora se može testirati u takvim životinjskim modelima kao što su standardniin vivomodeli rasta i metastaza tumora. Videti, npr., Rockwell et al,J. Natl. Cancer Inst.49:735 (1972);Guy et al., Mol. Cell Biol.12:954 (1992); Wyckoff et al.,Cancer Res.60:2504
(2000) i Oft et al.,Curr. Biol.8:1243 (1998). Važni avp6ligandi u kanceru mogu da uključe TGF-B, koji učestvuje u metastaziranju (za pregled videti Akhurst et al.,Trends in Cell Biology11: S44-S51 (2001)), fibronektin i vitronektin.
Efikasnost tretmana iz ovog pronalaska može se meriti brojnim dostupnim dijagnostičkim sredstvima, uključujući fizički pregled, analize krvi, merenja proteina u urinu, nivoe i nestajanje kreatinina, testove plućne funkcije, nivoe azota uree u krvnoj plazmi (BUN), posmatranje i procenu stvaranja ožiljaka ili fibroznih lezija, deponovanja vanćelijskog matriksa kao što je kolagen, aktin i fibronektin u glatkim mišićima, testove bubrežne funkcije, ultrazvuk, magnetnu rezonancu (MRI) i CT skeniranje.
Farmaceutske kompozicije
Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska sadrže jedno ili više antitela iz sadašnjeg pronalaska ili njihove farmaceutski prihvatljive derivate, sa bilokojim farmaceutski prihvatljivim nosačem po izboru. Termin "nosač", kao što se ovde koristi, uključuje poznate prihvatljive adjuvantc i nosače.
Prema ovom pronalasku, farmaceutske kompozicije mogu da budu u obliku sterilnih injektabilnih preparata, na primer, sterilne injektabilne vodene ili uljne suspenzije. Ova suspenzija se može formulisati u skladu sa tehnikama poznatim u struci, uz upotrebu pogodnih disperzionih agenasa, agenasa za kvašenje i suspenzionih agenasa.
Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska mogu se davati oralno, topično, intravenozno, subkutano, intraperitonealno, intramuskularno, intramedulamo, intra-artikularno, intrasinovijalno, intrasternalno, intratekalno, intrahepatično ili intrakranijalno, po želji, ili prosto lokalno, na mestima inflamacije ili rasta tumora. Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska se mogu davati i inhalacijom, uz upotrebu, npr., nebulizera, inhalatora sa suvim prahom ili inhalatora sa doziranjem.
Doziranje i brzina doziranja antitela iz ovog pronalaska, efektivni da postignu željene efekte, zavisiće od niza faktora, kao što su priroda oboljenja koje se leči, veličina subjekta, cilj tretmana, specifična farmaceutska kompozicija koja se koristi i procena lekara koji leči. Efektivni su nivoi doza od između oko 0,001 i oko 100 mg/kg telesne težine na dan, na primer, između oko 0,1 i oko 50 mg/kg telesne težine na dan, jedinjenja - aktivnog sastojka. Na primer, antitelo iz pronalaska će se davati u dozi iz opsega između oko 0,01 mg/kg telesne težine na dan i oko 20 mg/kg telesne težine na dan, npr., između oko 0,1 mg/kg telesne težine na dan i oko 10 mg/kg telesne težine na dan, a u intervalima od jedan do četrnaest dana. U jednom drugom obliku, antitelo se daje u dozi od oko 0,3 to 1 mg/kg telesne težine kad se daje intraperitonealno. U još jednom drugom obliku, antitelo se daje u dozi od oko 5 do 12,5 mg/kg telesne težine kad se daje intravenozno. U jednom izvođenju, kompozicija sa antitelima se daje u količini efektivnoj da obezbedi nivo antitela u plazmi od bar 1 mg/ml.
Dija<g>nostički postupci
Antitela iz ovog pronalaska se mogu koristiti za dijagnostikovanje obolelih stanja vezanih za poremećene nivoe ekspresije avp<3- Uzorak tkiva iz subjekta, kao što je biopsija tkiva, uzorak telesne tečnosti ili lavaž (npr., alveolarni lavaž), može da se testira pomoću eseja zarobljavanja antigena, ELISA, imunohistohemijskog eseja i slično, uz upotrebu antitela. Uzorak tkiva iz normalnog pojedinca se koristi kao kontrola.
U praktikovanju sadašnjeg pronalaska koriste se, ako nije naznačeno drukčije, konvencionalne tehnike ćelijske biologije, ćelijske kulture, molekularne biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK, hernije proteina i imunologije, koje su okvirima struke. Takve tehnike su opisane u literaturi. Videti, na primer,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd edition (Sambrook et al., Eds.), 1989;Oligonucleotide Synthesis,(MJ. Gait, Ed.), 1984; U.S. Patent 4,683,195 to Mullis et al.;Nucleic Acid Hybridization,(B.D. Hames i S.J. Higgins), 1984;Transcription and Translation,(B.D. Hames i SJ. Higgins), 1984;Culture of Animal Cells(R.I. Freshnev, Ed.), 1987;Immobilized Cells and Enzym. es,IRL Press, 1986;A Practical Guide to Molecular Cloning(B. Perbal), 1984;Methods in Enzymology,Volumes 154 i 155 (Wu et al., Eds.), Academic Press, New York;Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H. Miller i M.P. Calos, Eds.), 1987;Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker, Eds.), 1987;Handbook of Experiment Immunology,Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackvvell, Eds.), 1986;Manipulating the
Mouse Embryo, 1986.
Ako nije drukčije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju značenja koja su opšte prihvaćena kod stručnjaka uobičajenog stepena znanja u struci kojoj ovaj pronalazak pripada. Primeri postupaka i materijala su opisani niže, Mada postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu takođe da se koriste u primeni ovog pronalaska. Sve publikacije i druge reference pominjane ovde su obuhvaćene referencama u celosti. U slučaju konflikta, sadašnja specifikacija, uključujući definicije, je važeća. Materijali, postupci i primeri su samo ilustrativni i nije predviđeno da ograničavaju. U ovoj specifikaciji, podrazumeva se da reč "obuhvata" ili njene varijacije kao što su "obuhvataju", "obuhvatajući", znače uključivanje navedene veličine ili grupe veličina, ali ne isključivanje bilo koje druge veličine ili grupe veličina.
Primeri
Sledeći primeri su namenjeni da ilustruju postupke i materijale iz sadašnjeg pronalaska. Pogodne modifikacije i adaptacije opisanih uslova i parametara koji se obično sreću u pravljenju antitela koje su očigledne stručnjacima su u okviru duha ili opsega sadašnjeg pronalaska.
U sledećim primerima, p6 -/- miševi su generisani kao što je opisano u Huang et al.,J. Cell Biol.133: 921 (1996). Rekombinantni humani LAP je kupljen od R & D Svstems (Minneapolis, MN). Antitelo 10D5 je kupljeno od Chemicon (Temecula, CA). L230 hibridom je kupljen od ATCC i izlučeno antitelo je prečišćeno iz supernatanta zasićenih kultura afinitetnom hromatografijom na imobilisanom proteinu A. Određivanje izotipa antitela je urađeno pomoću kompleta ISOSTRIP kit (Roche Diagnostics) prema instrukcijama proizvođača. Pć-transfektovana SW480 ćelijska linija je dobijena kao što je opisano u VVeinacker et al.,J. Biol. Chem.269: 6940-6948 (1994).
Primer 1: Generisanje P^- transfektovanih stabilnih ćelijskih linija
P6-transfektovane NIH 3T3 i FDC-P1 ćelije su dobijene elektroporacijom roditeljskih ćelijskih linija sa DNK konstruktom koji sadrži celokupnu mišju P6 cDNK i selektivni marker za neomicin. Stabilno transfektovane ćelije su odabrane tako što su 14 dana pasažirane u medijumu za kulturu koji sadrži G418, a zatim su aktivirane ćelije sortirane pomoću fluorescencije (FACS) da bi se izolovale ćelije sa maksimalnom ekspresijom površinskog I36. Transfektovane FDC-P1 ćelije su gajene u DMEM sa dodatkom 4 mM L-glutamina podešenog da sadrži 1,5 g/L natrijum bikarbonata, 4,5 g/l glukoze i 1,0 mM natrijum piruvata, 10% FBS, dodatkom 2,5% mišje IL-3 kulture i 1,5 mg/ml aktivnog G418. Transfektovane NIH 3T3 su gajene u DMEM obogaćenom 10%-nim FBS, 2 mM-nim L-glutaminom, penicillinom/streptomicinom i 1 mg/ml aktivnog G418.
Primer 2: Prečišćavanje humanog rastvorljivogaj ^ u
avP6protein je prečišćen uglavnom kao što je opisano u VVeinacker,supra.Gajena je CHO ćelijska linija koja eksprimira hsavp6 i dobijeni supernatant ja sakupljen centrifugiranjem. Integrin je prečišćen afinitetnom hromatografijom uz upotrebu antitela na avL230. Prečišćen L230 je unakrsno vezan za Sepharose 4B aktiviran CNBr-om (Sigma) u odnosu od 4,8 mg antitela/ml smole. avP6supernatant je stavljen na L230 afinitetnu kolonu, u koncentraciji od 0,5 mg antitela/ml smole i kolona je oprana sa 10 zapremina kolone svakog od (1) 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 M NaCl, 1 mM MgCl2; (2) 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM MgCl2i (3) 10 mM Na3P04, pH 7,0. HsavP6 je spran pomoću 100 mM glicina, pH 2,5, u 1:10 zapremini 1 M Na3P04, pH 8,0. Protein je dijalizovan uz nekoliko promena prema slanom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS) i uskladišten na -20°C.
Primer 3: Imunizacija [ 36 -/- miševa
p6-/- miševi su imunizovani intraperitonealnom (IP) injekcijom sa 25 p.g prečišćenog rekombinantnog humanog avP6, emulzifikovanog u kompletnom Freund-ovom adjuvantu (CFA) u odnosu zapremina 1:1 u ukupnoj zapremini od 200 u.1. Alternativno, Pe-/- miševi su imunizovani EP injekcijom sa 4 X IO<6>pe-transfektovanih NIH 3T3 ćelija, ponovo suspendovanih u 100 p.1 PBS, obogaćenog 1 mg/ml CaCb i 1 mg/ml MgCh, i istim miševima je data injekcija sa 100 ui CFA u mesto odmah pored prve. Dve nedelje i četiri nedelje posle prve imunizacije, miševima su na sličan način davani isti reagensi, osim što je umesto CFA korišćen nekompletan Freund-ov adjuvant. Miševi su iskrvavljeni 7 dana posle poslednjeg injektiranja i anti-Pćtitri su određivani preko vezivanja seruma za prečišćen rekombinantni humani avP6ili za Pć-transfektovane ćelije. U slučaju miševa imunizovanih prečišćenim rekombinantnim humanim avP6, miševi su ostavljeni 3 meseca i reimunizovani su istim antigenom pomešanim sa ImmunEasv (Qiagen). Tri dana pre izolovanja slezina za hibridomske fuzije, miševi su imunizovani sa 12,5 ug of prečišćenog rekombinantnog humanog avp6proteina i IP i intravenoznom injekcijom. Na dan fuzije, životinje su žrtvovane, a njihove slezine izvađene i usitnjene do suspenzija pojedinačnih ćelija. Splenociti su imortalizovani fuzijom sa ćelijskim fuzionim partnerom koji je selektovan lekom.
Primer 4: Pretraživanje hibridoma
Dve grupe antitela su generisane imunizacijom Po-/- miševa. Jedan skup antitela je generisan imunizacijom pomoću rastvorljivih humanih skraćenih avP6(Fusion #6). Drugi
skup antitela je generisan imunizacijom mišjim p6-transfektovanim NIH 3T3 ćelijama (Fusion #7). Pretraživanje za antitela na avPć je izvođeno pomoću funkcionalnih eseja zasnovanih i na celim ćelijama i besćelijskom vezivanju, kao što je opisano niže. Početna selekcija pozitivnih klonova je zasnovana na vezivanju sa prečišćenim hsavp6i Po-transfektovanim humanim i mišjim ćelijama (netransfektovane ćelije su bile kontrola). Odabrani klonovi su prošireni i u završnim kulturama ponovo je procenjivano vezivanje i za p6-transfektovane i za netransfektovane ćelije u esejima zarobljavanja ćelija (Primer 5b,infra)(reprezentativni primeri su pokazani na SI. 1A i 1B, gde su prefiksi "6." ili "7." u mAb imenima, koji označavaju Fuziju 6 i Fuziju 7, respektivno, izostavljeni; videti i Tabelu 2 niže). Neka antitela su se preferencijalno vezala za pVh'ansfektovane ćelije, dok su se druga vezala i za transfektovane i za netransfektovane ćelije, ukazujući da samo jedan podskup antitela ima preferenciju za po(SI. 1A i 1B). Dalja selekcija se zasnivala na sposobnosti antitela da
blokiraju vezivanje i biotinilovanih hsavP6i<p>6-transfektovanih mišjih ćelija za LAP. Selektovani klonovi su subklonirani pomoću FACS i odloženi zamrznuti do upotrebe.
Ispitivana je specifičnost vezivanja monoklonskih antitela za avP6, bazirana na njihovoj sposobnosti da vezuju pc-transfektovane ćelije a ne netransfektovane roditeljske ćelije. Dalje je potvrđeno da se monoklonska antitela specifično vezuju za avP6 a ne za druge ccvintegrine ili za nespecifične integrine (tj., ne-avintegrine koji se vezuju za ligande koji sadrže RGD) na osnovu odsustva njihovog vezivanja za ćelijske linije koje eksprimiraju avP3, avP8,015P1, avPiili a?p). Ove uključuju stabilno transfektovane ćelije, kao i netransfektovane JY, K562, SV/480, NIH3T3 i FDCP1 ćelijske linije.
Neka od antitela koja su deponovana sa ATCC su nabrojana dole, u Tabeli 1.
Primer 5: Eseji za pretraživanje i karakterizaciju
a. av3.fi ELISA
Mikrotitarska ploča sa 96 mesta (Corning COSTAR EASY-WASH) je obložena sa 50 ul/mesto 5 p.g/ml hsavP6na 4°C preko noći. Ploča je oprana puferom za pranje (0,1% TWEEN-20 u PBS) četiri puta u automatizovanom peraču ploča. Zatim je dodato 180 uVmesto 3% BSA u TBS i inkubirano je 1 hr na 25°C da bi se blokiralo nespecifično vezivanje. Ploča je oprana kao gore i dodati su rastvori (50 uLmesto), bilo supernatanta hibridoma (za eseje za pretraživanje), bilo prečišćenog antitela (za karakterizaciju), u TBS sa 1 mg/ml BSA, 1 mM CaCb, i 1 mM MgCb. Ploča je inkubirana 1 hr na 25°C, oprana, a zatim inkubirana 1 hr sa 50 pl/mesto kozjeg anti-mišjeg IgG+A+M antitela konjugovanog sa peroksidom (Cappel). Vezano antitelo je detektovano pomoću 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Vezivanje je određivano preko apsorbance merene na 450 nm.
b. Esej zarobljavanja ćelija
Mikrotitarska ploča sa 96 mesta je obložena sa 50 u.l/mesto sekundarnih antitela (magareća anti-mišja IgG (Jackson Immunoresearch); 5 p.g/ml je razblaženo u 50 mM natrijum bikarbonata, pH 9,2) na 4°C preko noći. Ploče su oprane dvaput sa 100 p.l/mesto reakcionog pufera (RPMI + 2% BSA), a zatim blokirane sa 100 u.l/mesto reakcionog pufera na 37°C 1 hr. Za FDC-P1 ćelije i p6-transfektovane FDC-P1 ćelije, ploče su blokirane anti-mišjim Ig (Jackson ImmunoResearch; 20 ug/ml) 10 min na sobnoj temperaturi da bi se smanjilo nespecifično vezivanje Fc receptora sekundarnim antitelom (izostavljeno za ostale tipove ćelija). Dok su ploče bile blokirane, ćelije su obojene 2 jaM fluorescentnom bojom (Calcein-AM, Molecular Probes) pri koncentraciji od 5 X IO<6>ćelija/ml. Ćelije su inkubirane 15 min sa bojom, u reakcionom puferu, uz blago mućkanje u vodenom kupatilu na 37°C, skupljene centrifugiranjem i ponovo suspendovane u reakcionom puferu pri koncentraciji od 5 X IO<6>ćelija/ml. Posle koraka blokiranja, pufer je izbačen trešenjem ploče i 25 u.l/mesto supernatanta ili prečišćenog antitela je dodato na ploču. Posle inkubacije od 15 min na 37°C, 25 p.l/mesto obeleženih ćelija je dodato i ploča je inkubirana 1 hr na 37°C. Ploča je oprana 3-5 puta reakcionim puferom (100 u.l/mesto) i registrovana je fluorescencija koju emituju zarobljene ćelije na ploči. Procenat vezivanja je određen upoređivanjem fluorescencije pre završnog stupnja pranja (tj., ukupnog dodatog broja ćelija) i one posle pranja (tj. vezanih ćelija).
c. FACS
Ćelije su pokupljene tripsinizacijom, oprane jednom u PBS, a zatim ponovo suspendovane u FACS puferu (IX PBS, 2% FBS, 0,1% NaN3, 1 mM CaCl2i 1 mM MgC12). 0,2 X 10<5>ćelija je zatim inkubirano na ledu 1 hr, u FACS puferu koji sadrži supernatant hibridoma u ukupnoj zapremini od 100 ul. Posle inkubacije, ćelije su oprane dvaput ledenim FACS puferom, ponovo suspendovane u 100 ul FACS pufera koji sadrži 5 ug/ml magarećeg anti-mišjeg IgG PE (Jackson ImmunoResearch) i inkubirane na ledu 30 min. Ćelije su onda oprane dvaput ledenim FACS puferom i ponovo suspendovane u 200 ul FACS pufera. Vezivanje PE obeleženih sekundarnih antitela je praćeno protočnom citometrijom.
d. Vezivanje biotin- hsavBfi za LAP
Mikrotitarske ploče sa 96 mesta (Corning COSTAR EASY-WASH) su obložene sa 0,3 ug/ml rekombinantnog humanog LAP (R&D Svstems, Cat. # 246-LP) razblaženog u PBS (50 u.l/mesto) na 4°C preko noći. Pošto je rastvor za oblaganje uklonjen, ploče su blokirane pomoću 180 p.l/mesro 3% BSA/TBS na 25°C 1 hr. U posebnoj ploči sa 96 mesta okruglog dna, 60 ul/mesto 2X matičnog rastvora (0,5 ug/ml (1,25 nM) biotin-avP6, 2 mM CaCh, i 2 mM MgCl2u TBS sa 1 mg/ml BSA) je kombinovano sa 60 u.l/mesto 2X matičnog rastvora bilo supernatanta hibridoma (za pretraživanje), bilo prečišćenog antitela (takođe u TBS sa 1 mg/ml BSA) i inkubirano na 25°C 1 hr. Posle pranja ploče obložene LAP-om puferom za pranje (0,1% TWEEN-20 u PBS) 4 puta u automatizovanom peraču ploča, 100 ul smese antitelo-avp6 je prebačeno na ploču i inkubirano 1 hr na 25°C. Ploča je oprana kao gore i inkubirana sa 50 uLmesto 1:1000 razblaženim konjugatom ekstravidin-peroksidaza rena (Sigma) u TBS (1 mg/ml BSA) 1 hr na 25°C. Vezan protein je detektovan pomoću TMB supstrata.
e. Adhezija pVFDC- Pl ćelija za LAP
Mikrotitarske ploče sa 96 mesta je obložena sa 50 u.l/mesto 0,5 u.g/ml rekombinantnog humanog LAP (R&D Svstems) razblaženog u 50 mM natrijum bikarbonata, pH 9,2 na 4°C preko noći. Ploča je oprana dvaput PBS-om (100 p.l/mesto) i blokirana pomoću T/o BSA u PBS (100 ul/mesto) 1 hr na 25°C. Ploča je oprana dvaput sa 100 ul/mesto reakcionog pufera (TBS kompletan plus 1 mM CaCl2i 1 mM MgC^). Dalje, pojedinačnim mestima ploče dodato je po 25 ul supernatanta hibridoma (ili prečišćenog antitela) i 25 ul p6-FDC-P1 ćelija (5X IO<6>ćelija/ml, obeleženih Calcein-om AM kao stoje opisano gore). Ploča je inkubirana na 25°C 1 hr, a zatim oprana 4-6 puta reakcionim puferom (100 ui/mesto). Registrovana je fluorescencija koju emituju ćelije zarobljene na ploči. Procenat vezivanja je određen upoređivanjem signala fluorescencije pre završnog stupnja pranja (tj., ukupnog dodatog broja ćelija) i onog posle pranja (tj. vezanih ćelija).
f. TGF- 3 bioesej
TGF-P bioesej koji se ovde koristi je varijacija eseja kokulture plućnih epitelnih ćelija kune (MLEC) sa PAI-1 luciferazom, opisane u Abe et al.,Anal. Biochem.216: 276-284
(1994), u kojoj su p,,-transfektovane ćelije gajene zajedno sa reporterskim ćelijama da bi se pratila aktivacija TGF-P pomoću avP6(Munger,supra).To je kvantitativan bioesej za TGF-P, zasnovan na njegovoj sposobnosti da indukuje ekspresiju inhibitora-1 plazminogenskog aktivatora (PAI-1). U ovom eseju, MLEC ćelije su stabilno transfektovane ekspresionim konstruktom koji sadrži skraćen PAI-1 promotor fuzionisan sa reporterskim genom za luciferazu svica. Izlaganje transfektovanih MLEC ćelija aktivnom TGF-P (0,2 do > 30 pM) rezultuje u povećanju aktivnosti luciferaze u ćelijskim lizatima, zavisnom od doze.
Da bi se uradio ovaj esej, TMLC (linija plućnih epitelnih ćelija kune Mv 1 Lu) ćelije su transfektovane konstruktom PAI-1-luciferaze. Transfektovane ćelije su gajene u DMEM + 10% FBS sa L-Gln, Pen/Strep i 200 ug/ml G418. SW480 ćelije transfektovane konstruktom integrina p6("pć-SW480" ili "SW480 p6" ćelije) su gajene u DMEM + 10% FBS sa L-Gln i Pen/Strep. Ćelije su odlepljene iz boca pomoću PBS + 5 mM EDTA, oprane u PBS + 0,5% BSA, prebrajane hemocitometrom i stavljene u ploče sa 96 mesta. SW480-P6ćelije su stavljene u pufer za pranje, u koncentraciji od 4 X IO<4>ćelija/mesto. Monoklonska antitela su razblažena u DMEM (bez seruma), dodata SV/480-P6 ćelijama i predinkubirana 20 min na sobnoj temperaturi. TMLC ćelije su zatim dodate u konc. 2 X IO4 ćelija/mesto u konačnu zapreminu od 100 ul. Ploče su inkubirane 20 hr u vlažnom inkubatoru, obogaćenom CO2. Supernatant je izbačen sa ploča i zamenjen sa 100 ul PBS + 1 mM Ca<2+>i 1 mM Mg<2+>. Ćelije u pločama su zatim lizirane i nivo aktivnosti luciferaze je detektovan reakcijom svetljenja Packard LUCLITE kit (#6016911) i TROPIX luminometrom za mikroploče.
Primer 6: Prečišćavanje antitela
Osam klonova hibridoma iz Fusion #6 (označenih prefiksom "6.") i četrnaest klonova hibridoma iz Fusion #7 (označenih prefiksom "7.") je odabrano za dalje gajenje na velikoj skali i karakterizaciju (Tabela 2).
Pripremljena je kultura malih dimenzija (150 ml) svakog od hibridoma i supernatant je prikupljen centrifugiranjem. Antitela su prečišćena iz ovh supernatanata afinitetnom hromatografijom Protein A. Za antitela izotipa IgG2a, supernatant je direktno stavljen na Protein A Sepharose 4 Fast Flo\v (Amersham Pharmacia Biotech, AB, Uppsala, Svveden)
(zapremina staložene sefaroze 1 ml). Kolona je oprana PBS-om i IgG frakcija je eluirana pomoću 25 mM fosforne kiseline, 100 mM NaCl, pH 2,8 u 1:20 zapremini 0,5 M Na3PO_i, pH 8,6. Za mišja IgGiantitela, supernatant je podešen na 1,5 M glicin, 3 M NaCl, pH 8,9 pred stavljanje na kolonu i kolona je oprana sa 25 mM Na3P04, 3 M NaCl, pH 8,6 pre eluiranja. Ove pripreme su korišćene za biohemijsku karakterizaciju///vilroopisanu ovde.
Za upotrebu u animalnim modelima, zapremina klonova hibridoma je povećana na 2L medijuma i gajena 4 nedelje u Lifecell Culture Bags-PL732 (Nexell, Cat. No. R4R2113). Antitela iz hibridoma su prečišćena prvo afinitetnom hromatografijom Protein A kao što je opisano gore, a zatim je usledio jonoizmenjivački stupanj na Q Sepharose (Amersham Pharmacia). Eluat iz hromatograskog stupnja Protein A je doteran do pH 8,6 dodatkom baze 2 M Tris, razblažen 10 puta vodom i stavljen na kolonu Q Sepharose (20 mg proteina/ml smole) kojaje uravnotežena u 10 mM Na^PC^, 25 mM NaCl, pH 8,6. Kolona je oprana sa 5 svojih zapremina pufera za uravnotežavanje i vezan protein je spran sa 25 mM NaaPCu, 150 mM NaCl, pH 7,2. Sprani proteini su sterilisani preko filtra (0,45 um) i odloženi na -70°C do upotrebe.
Primer 7: Karakterizacija prečišćenih antitela
Prečišćena antitela (Tabela 2,supra)su kvantitativno okarakterisana u odnosu na njihovu sposobnost da (1) vezuju hsavP6, (2) vezuju Pć-transfektovane SW480 i FDC-P1
ćelije, (3) inhibiraju vezivanje biotin-avP6za LAP, (4) inhibiraju vezivanje Pć-transfektovanih FDC-P1 ćelija za LAP i (5) blokiraju aktivaciju TGF-P posredovanu avP6-om u MLEC eseju( supra).Relativna potentnost u svakom od ovih eseja je upoređena sa onom poznatog antitela na avP6, 10D5 (Huang et al,J. Cell Sci.111: 2189 (1998)) i, u nekim slučajevima, antitelo na av, L230. Za karakterizaciju Fusion #7 antitela, Fusion #6 antitelo 6.8G6 je takođe korišćeno kao pozitivna kontrola.
Početni eksperiment sa vezivanjem (Primer 5a,supra),sproveden u prisustvu 1 mM Ca<2+>i 1 mM Mg<2+>, ukazao je da se većina prečišćenih antitela vezuje za hsavP6(SI. 2A i 2B). Neočekivano je, međutim, što nije primećeno nikakvo vezivanje za 10D5 i klonove 7.2F5 i 7.10D7. Sledeći eksperiment je utvrdio daje vezivanje 10D5 (SI. 3E), 7.2F5 i 7.10D7 bilo vrlo slabo podržano od strane Ca<2+>/Mg<2+>, a mnogo više pomoću 1 mM MnCb- Od novih klonova, tri (6.1A8 (SI. 3A), 7.7G5 i 6.8G6 (SI. 3C)) su pokazala potrebu za dvovalentnim katjonima, mada nije primećena nikakva razlika između stanja Ca<2+>/Mg<2+>i stanja sa vezanim Mn<2+>.
Ostali klonovi nisu pokazali potrebu za dvovalentnim katjonima, tj. mogli su da vežu antigen u prisustvu 10 mM EDTA (SI. 3B, 3D i 3F). FACS analiza vezivanja antitela za p6-transfektovane NIH 3T3 ćelije ili SW480 ćelije je otkrila slično ponašanje, uz izuzetak da se 10D5, u ovom ontekstu, vezao ekvivalentno u Ca2+/Mg2+ i Mn<2+>stanju. Zahtevi za vezivanje rastvorljivog avPćmogu da se razlikuju od onih za vezivanje avPćeksprimiranog na površini ćelije zbog razlike u konformaciji proteina ili efekata aviditeta.
Ovi rezultati sugerišu da postoje bar tri različite klase Pć-blokirajućih antitela u ovoj grupi. Jedna od klasa (10D5) pravi razliku između uslova sa Ca<2+>/Mg<2+>i Mn<2T>. Druga klasa (koja uključuje 6.1A8, 7.7G5 i 6.SG6) zahteva kaljon, ali ne pravi razliku između Ca<2+>/Mg<2>' i Mn<2+.>Poslednja klasa (koja uključuje anti-avantitela L230, 6.2B10, 6.3G9 (SI. 3B) i 6.2B1 (SI. 3D), 7.IC5 i 7.1G 10) je nezavisna od katjona.
Zatim je procenjena sposobnost prečišćenih antitela da inhibiraju avpt)-LAP interakciju. U eseju bez ćelija\/, Pi imcra5d, supra,antitela 6.1A8, 6.213 1, 6.3G9 i 6.SG6 sti pokazala vrednosti IC50manje nego one 10D5 (SI. 4A; Tabela 3). 6.2B10 je pokazao veću IC50, ali je još uvek u potpunosti inhibirao (SI. 4A). 6.4B4 je ispoljio samo delimičnu inhibiciju, dok 6.6B5 i 6.8B4 uopšte nisu inhibirali (SI. 4A). Koristeći isti esejski sistem, antitela 7.1C5, 7.1G10, 7.2A1, 7.4A3, 7.7G5, 7.9G8, 7.9H5 i 7.10H2 su pokazala vrednosti IC50niže nego one 10D5 (SI. 4B; Tabela 3). Antitela 7.2F5, 7.2H2 i 7.8H12 su ispoljila skoro identične ili veće vrednosti IC50ali su još uvek u potpunosti inhibirali (SI. 4B).
U ćelijskom eseju opisanom u Primeru 5e,supra,uočena je slična tendencija, uz izuzetke 6.1A8, 6.2B10 i 7.9D4, koja su mnogo manje potentna sa ćelijama nego sa prečišćenim proteinom (SI. 5A-E; Tabela 3).
Zbirno, ovi rezultati ukazuju na to da smo uspešno napravili antitela koja specifično inhibiraju interakciju i humanog i mišjeg av(36 sa LAP. Neka od ovih antitela, vezanih za avp6sa visokim afinitetom (fenomenološke Kd □ 0,3 nM, što je određeno protočnom citometrijom), inhibiraju vezivanje p6-transfektovane ćelije za LAP sa IC500.05 nM (8 ng/mL) i sprečavaju aktivaciju TGF-pi posredovanu avP6-om sa IC500.58 nM (87 ng/mL).
Konačno, ocenjena je sposobnost prečišćenih antitela da blokiraju aktivaciju TGF-P 1 posredovanu avp6-om pomoću testa sa reporterskim genom PAI-1 luciferaze (Primer 5f,supra).još jednom, 6.3G9, 6.8G6, 6.2B1, 7.1G10 i 7.7G5 su bili sposobni da inhibiraju aktivaciju TGF-pi posredovanu avP6-om sa vrednostima IC50manjim nego 10D5, dok su ostala antitela, izgleda, znatno manje potentna u ovom testu (SI. 6A i 6B; Tabela 3). Prema tome, sposobnost za blokiranje interakcije avP6sa LAP korelira sa sposobnošću za inhibiranje aktivacije TGF-Pin vitro.
Sledeće, afiniteti u rastvoru 6.3G9 i 6.8G6 za rastvorljiv av06su određeni pomoću kinetičkog testa isključenja (KinExA). Niz razblaženja rastvorljivog integnna (1 X 10" -8 M to 2,4 X IO"<12>M) je inkubirano sa 1X10~<10>M antitela 3 h. Ovi uzorci su zatim propušteni kroz polimetilmetakrilatne kuglice prevučene integrinom koristeći instrument KinExA (Sapidvnelnstruments, Inc., Boise, Idaho). U slučaju 6.8G6, lmM CaCl2 i lmM MgCh su bili uključeni u inkubaciju i reakcione pufere. Količine vezanih i slobodnih antitela su određene pomoću anti-mišjeg sekundarnog antitela obeleženog Cy5-om. Fitovanje na kvadratnu funkciju je rađeno pomoću softvera KinExA da bi se dobila konstanta disocijacije (ICj) za svaku interakciju. Kjkoje su određene ovim postupkom su bile 15.6 pM za 6.3G9 i 22.8 pM za 6.8G6 (SI. 9A i 9B). Prema tome, oba ova antitela imajuvrlo visok afinitet za civpV
Zatim smo identifikovali klase antitela na avp6koja prepoznaju "aktivirana" stanja integrina. Postoje dva potencijalna aktivirana stanja avpV U prvom stanju, aktivirani integrin se definiše kao onaj koji ima veći afinitet za svoj ligand. Antitela specifična za ovo aktivirano stanje pokazuju povećano vezivanje za integrin u prisustvu aktivirajućeg katjona kao što je 1 mM MnCl2. Poređenje stepena vezivanja u 1 mM MnCl2i u 1 mM MgCl2(neaktivirajući katjon) protočnom citometrijom ukazalo je na to da neka od antitela na avP6opisana ovde, uključujući 6.1A8 i 6.6B5, pokazuju značajno povećanje vezivanja u prisustvu MnCl2.
U drugom aktiviranom stanju avP6, integrin može da aktivira latentni TGF-P kao što je opisano gore. Dobijena je ćelijska linija koja eksprimira odsečeni avPć(SW480(P6-770T)). Ćelijska linija je bila sposobna da veže LAP, ali nije mogla da aktivira TGF-P u testu sa TMLC luciferazom (Munger et al.,supra).Antitela koja se vezuju za SW480 ćelije transfektovane celim Pć, ali ne i za 770T ćelije transfektovane skraćenim Pć, su, dakle, specifične za oblik dvPćkoji je sposoban da aktivira TGF-p. Antitela 7.8B3 i 7.8C9 ispunjavaju ovaj kriterijum.
Primer 8: Mapiranje epitopa pomoću kompeticije antitela
Testirana je sposobnost prečišćenih monoklonskih antitela da kompetiraju sa 6.8G6 za vezivanje za biotinilovani av<p>6u ELISA formatu. U ovom testu, 6.8G6 je obložen na ELISA ploči i dodata je smesa kompetirajućih antitela i biotinilovanih avPću puferu sa 1 mM svakog od Ca<2f>i Mg<2+>. Vezani integrin je detektovan pomoću konjugata ekstravidin-HRP i ocenjena je sposobnost kompetirajućih antitela da blokiraju vezivanje. Pokazano je da su svi konsenzus blokatori (Tabela 2) osim 6.2B10 (slab blokator) sposobni da kompetiraju sa 6.8G6 do različitih stepena (Tabela 4). Ovi podaci potvrđuju da se konsenzus blokatori vezuju za iste ili preklapajuće epitope kao 6.SG6.
Testirana je sposobnost prečišćenih monoklonskih antitela da kompetiraju sa biotinilovanim 6.3G9 ili biotinilovanim 6.8G6 za vezivanje za avp6u ELISA. U ovom testu, neobeleženi avPs je prevučen na ELISA ploči i dodata je smesa kompetirajućih antitela i biotinilovanih antitela u puferu sa 1 mM svakog od Ca<2+>i Mg<2+>. Vezano biotinilovano antitelo je detektovano pomoću konjugata neutravidin-HRP. Podaci su pokazali da najpotentnija blokirajuća antitela (npr., 6.2B1, 7.1C5, i 7.1G10) kompetiraju i sa 6.3G9 i sa 6.8G6 za vezivanje za avp6(Tabela 4.1, i SL. 1OA i 1OB). Antitela 6.1A8 i 7.7G5 su pokazala manju kompeticiju, verovatno zbog njihovog manjeg afiniteta za avPe. Nijedno od neblokirajućih antitela, ni antitelo na avL230 ne pokazuje nikakvu kompeticiju sa 6.3G9, ni sa 6.8G6 u ovom testu. Ovi rezultati ukazuju na to da se blokirajuća antitela specifična za avP6vezuju za iste ili preklapajuće epitope na o.vp(,.
Primer 9: CDR sekvence
cDNK nekih od prečišćenih monoklonskih antitela je izolovana i sekvencirana standardnim tehnikama kao stoje opisano u Coligan et al. (eds),Current Protocols in Immunology,Wiley, Media, PA (2001). Izvedene aminokiselinske sekvence su prikazane na SI. 7A i 7B.
Aminokiselinske sekvence CDR-ova teškog lanca antitela visokog afiniteta 6.8G6, 6.1A8, 6.2B1, 6.3G9 i 6.2A1 i onih neblokatora 6.2G2 su upoređene na sledeći način (isprekidanje linije pokazuju praznine).
U SEQ ID N0:7, masno "R" (dvanaesti ostatak) ukazuje daje on podložan polimorfizmu i da može biti, na primer, Q.
Aminokiselinske sekvence CDR-ova lakog lanca ova četiri antitela visokog afiniteta 6.8G6, 6.1A8, 6.2B1, 6.3G9 i 6.2A1 i onih neblokatora 6.2G2 su upoređene na sledeći način.
Kao što je pokazano na SI. 7A i 7B, izgleda da mAb koja spadaju u klasu zavisnih od dvovalentnih katjona (npr., 6.1A8 i 6.8G6) sadrže vrlo slične aminokiselinske sekvence unutar CDR-ova, dok mAb nezavisna od dvovalentnih katjona (npr., 6.2B1 i 6.3G9) sadrže drugi skup motiva u svojim CDR-ovima.
Potentnost i specifičnost monoklonskih antitela na avP6mogu da budu diktirana finim razlikama među aminokiselinskim ostacima. U slučaju 6.1A8 i 6.8G6, aminokiselinske sekvence varijabilnih domena su vrlo slične, sa 10 aminokiselinskih razlika u teškom lancu, od kojih su tri konzervativne i 11 aminokiselinskih razlika u lakom lancu. Ipak, aktivnost ovih antitela se razlikuje 100 puta uin vitrotestovima. Aminokiselinske razlike su raspršene kroz ceo varijabilni domen polipeptidnih lanaca i ovi ostaci mogu da funkcionišu samostalno ili sinergistički sa ostacima na istom lancu ili na partnerskom lancu da utiči na potentnost antitela. U teškom lancu, sedam ostataka je locirano tako daje verovatno da su u bliskom susedstvu ili imaju aktivnu ulogu u vezivanju za avP6-
Motiv RGD je nađen u velikom broju proteina (liganada) koji vezuju integrin. Pokazano je da ovaj motiv posreduje u njihovoj interakciji sa integrinima tako što direktno dodiruje vezivni džep na integrinu. Zato što je sam RGD prilično čest među proteinima koji vezuju integrin, bočni ostaci izvan motiva moraju da igraju ulogu u dodeljivanju specifičnosti vezivanja interakciji integrin-ligand. U6.1A8 i6.8G6,jedan takav bočni ostatak je na poziciji 101 u teškom lancu, unutar CDR3. Ovaj aminokiselinski ostatak je bočno od motiva RGD i može biti smešten na mestu prepoznavanja antigena, doprinoseći potentnosti i specifičnosti vezivanja.
Drugi različiti ostaci unutar istih CDR-ova teškog lanca 6.1A8 i 6.8G6 uključuju one na pozicijama 33 (CDR!); pozicijama 52. 57 i 65 (CDR2) i poziciji 1 15 (CDR3). Još jedna razlika u teškom lancu leži na poziciji 4 u okviru 1, koji je blizu N-terminusa. Kristalografski modeli predviđaju da se ovaj ostatak pakuje blizu CDR-ova antitela i može da igra važnu ulogu u vezivanju otvpV Tri preostale razlike između 6.1 A8 i 6.8G6 su konzervativne razlike na pozicijama 20 (okvir 1), 44 (okvir 2) i 82 (okvir 3).
Aminokiselinske sekvence antitela nezavisnih od katjona su takođe visoko homologne. One se mogu podeliti u dve klase: one koje kompetiraju sa antitelom koje sadrži RGD, 6.8G6 (tj., 6.2B1, 6.3G9, 7.10H2, 7.9H5, 7.1C5, 7.1G10 i 7.4A3) i one koje ne kompetiraju (tj., 6.2A1, 6.2B10 i 6.4B4). Klasa koja kompetira sa 6.8G6 sadrži motiv FXY u CDR3 teškog lanca, dok ga nekompetirajuća klasa ne sadrži. Ova razlika sugeriše daje motiv FXY važan za posredovanje vezivanje za avPćnezavisno od katjona. Pored toga, ova klasa antitela, koja sadrži FXY, verovatno se vezuje za epitop na avPćkoji se preklapa sa, ali je ipak različit od, džepa koji vezuje RGD. Antitela 6.2B10 i 6.4B4 ne sadrže motiv FXY i slabi su blokatori avP6- Pokazano je da se vezuju za deo sličan I-domenu avPći definišu jedan drugi epitop za koji se vezuju antitela na avP6- Zanimljivo je da monoklonsko antitelo 6.2A1 pripada klasi nezavisnoj od katjona, ali ne sadrži sekvencu RGD, kao ostala mAb nezavisna od katjona.
Monoklonsko antitelo 7.7G5 pripada klasi zavisnoj od katjona. Međutim, sekvenca lakog lanca 7.7G5 je visoko homologna sa antitelom nezavisnim od katjona 6.2B10, koje vezuje I-domen. Težak lanac 7.7G5 je takođe sličan antitelima u CDR1. Ipak, njegovi CDR2 i CDR3 su sličniji onima iz klase zavisnih od katjona. Ova opservacija sugeriše da specifični CDR-ovi dodaju specifičnosti antitela. Ovo pogotovo važi za CDR3 teškog lanca, verovatno zbog visokog stepena varijabilnosti unutar ovog dela antitela. U stvari, dva od tri antitela zavisna od katjona i sedam od devet antitela nezavisnih od katjona sadrže CDR3 sekvence teškog lanca koje po svoj prilici igraju važnu ulogu u prepoznavanju avPe- Treba primetiti, u 7.7G5 nedostaje motiv RGD, ali sadrži motiv XGD u svom CDR2 teškog lanca. Ovaj motiv XGD može da funkcioniše na sličan način RGD-u i doprinosi afinitetu/specifičnosti vezivanja za7.7G5.
Gornja posmatranja sekvenci i zaključci izvedenih iz njih pružaju osnovu za racionalan dizajn specifičnih varijabilnih regiona aminokiselinskih sekvenci koje doprinose specifičnim osobinama vezivanja.
Primer 10: Diagnostička antitela
Antitela koja mogu da detektuju ekspresiju avP6u presecima parafinskih preparata tkiva, ili u drugim uzorcima tkiva, mogu da budu korisna u diagnostici. Ove dijagnostičke alatke mogu se koristiti da, npr., u presecima tkiva detektuju pozitivno regulisan avp6kao indiciju kancera ili fibroze.
Da bismo identifikovali antitela koja detektuju av36u parafinskim preparatima tkiva, prvo smo u skupu antitela potražili ona koja vezuju podjedinicu 06, prečišćenu HPLC-om. Antitela koja vezuju ovu podjedinicu verovatno prepoznaju epitope od linearnih peptida i zato se očekivalo daje za njih veća verovatnoća da uspeju u parafinskim preparatima tkiva. Vezivanje za prečišćenu 06podjedinicu je sprovođeno pomoću ELISA formata, identičnog onom opisanom za merenje vezivanja za avPć( supra),osim što je korišćen prečišćen 06integrin umesto avPćproteina, imobilisan na ploči. Ovim postupkom je identifikovan veliki broj Fusion 6 antitela sposobnih da vezuju i prečišćen avp6protein i prečišćenu Pćpodjedinicu. Videti Tabelu 5,infra,gde je prefiks "6." u nazivu klona izostavljen.
Kao što je pokazano gore, neka antitela se vezuju za prečišćenu 06podjedinicu. Velika je verovatnoća da će se ona vezati za denaturisan av06i tako biti korisna za detektovanje av06 u presecima parafinskih preparata tkiva. Druga antitela se vezuju za rastvorljiv av06, ali ne za 06podjedinicu. Oba tipa antitela su korišćena za bojenje parafinskih preparata denaturisanih 06-transfektovanih SW480 ćelija i netransfektovanih roditeljskih ćelija i podaci su prikazani u Tabeli 6.
Za bojenje parafinskih preparata tkiva ili ćelija, uzorci (na pločicama) su prvo de-parafinisani inkubacijom u sledećim rastvorima: (1) ksilen, 5 min, dvaput; (2) 100% etanol, 2 min, dvaput; (3) 95% etanol, 2 min, dvaput; (4) 50% etanol, 2 min, jednom; i (5) destilovana voda, 2 min, jednom. Pločice su zatim inkubirane u rastvoru 200 ml metanola i 3 ml 30% H2O215 min da bi se blokirala endogena peroksidaza. Pločice su isprane dvaput u PBS, svaki put po 2 min. Parafinski preseci na pločicama su zatim demaskirani pepsinom (Zymed 00-3009) 5 min na 37°C. Pločice su opet isprane dvaput PBS-om, 2 min svaki put. Zatim su pločice blokirane avidinom, a zatim biotinom (Vector SP-2001; Vector Laboratories, Burlingame, CA), svaka po 10 min na sobnoj temperaturi, uz pranje između svake dve inkubacije, kao što je opisano gore. Posle blokiranja, rastvor je oceđen sa pločica, primarno antitelo (supernatant kulture hibridoma), rastvoreno u PBS/0,1% BSA, je naneto na pločice i inkubirano preko noći na 4"C.
Sledećeg dana, pločice su isprane PBS-om, kao što je opisano gore. U međuvremenu, rastvor kompleksa avidin-biotin sa peroksidazom rena (reagens ABC) je pripremljen na sledeći način: 1 ml PBS je pomešan sa 20 ul rastvora A (1:50) i 20 pl rastvora B (1:50) od Vector Kit PK-6102 i smesa je inkubirana 30 min na sobnoj temperaturi pre upotrebe. Za ovo vreme, pločice su inkubirane 30 min na sobnoj temperaturi sa anti-mišjim biotinilovanim antitelom (1:200) od Vector Kit sa 15 u l/ml normalnog seruma. Pločice su zatim isprane dvaput PBS-om, svaki put po 2 min. Zatim je gore opisan reagens ABC nanet na pločice i inkubiran 30 min na sobnoj temperaturi. Pločice su ponovo isprane kao što je opisano gore. Zatim su supstrat (Vector SK-4100) i 100 ul DAB (3,3'-diaminobenzidin) naneseni na pločice i inkubirani 5 min na sobnoj temperaturi. DAB je napravljen na sledeći način: u 5 ml H2O dodati 2 kapi matičnog rastvora pufera (Buffer Stock Solution), dobro promešati; zatim dodati 4 kapi matičnog rastvora (DAB Stock solution), dobro promešati, a zatim dodati 2 kapi rastvora H2O2, dobro promešati. Zatim su pločice ispirane pod mlazom vode 2 min. Dalje, DAB signal je pojačan za sve pločice na sledeći način: ispirati parafmske preseke u 0,05 M natrijum bikarbonatu, pH 9,6, 10 min; upiti višak pufera; dodavati stimulativnog rasvtora DAB (DAB Enhancing Solution= 15 sekundi, a zatim brzo ispirati vodom 1 min da bi se zaustavila reakcija. Pločice su zatim bojene Mayer-ovim Hematoxylin-om (nuklearna kontrastna boja) 1 min. Pločice ispirane pod mlazom vode 1 min, a zatim potopljene u PBS 1 min, tako da hematoksilin poplavi. Pločice su zatim opet ispirane pod mlazom vode 1 min i dehidrisane i razbistrene na sledeći način: potopiti u (1) 95% etanol 1 min, dvaput; (2) 100%> etanol 1 min, dvaput i (3) ksilen 2 min, dvaput. Zatim su na pločice stavljena pokrovna stakla.
Rezultati sugerišu da Fusion 6 antitela 1A1, 2C4, 3B2, 3B11, 5D6, 5G9, 5H3, 6D12, 7C7, 9B5, 9B7, 9D11, 9F5, 10E4, 10H11, 6H8, 7A5, 7G9, 9A3, 2A1, 2E5, 4E4, 4H4, 8B4, 2G2 i 4E6, koja se sva vezuju za prečišćenu (36podjedinicu (Tabela 5), zaista intenzivno boje parafmske preparate p6-transfektovanih SW480 ćelija, dok njihove netransfektovane roditeljske ćelije ne boje (Tabela 6).
Primer 11: Dijagnoza kancera
avPć se normalno eksprimira neznatno ili malo u zdravim odraslim tkivima. Međutim, av06ekspresija jc pozitivno regulisana u povredama, llbrozi i kanceru (videti, npr., Thomas et al.J. Invest. Dermatolog)/11 7: 67-73 (2001); Brunton et al.,Neoplasia3: 215-226 (2001);Agrez et ai., //;/../. Cancer 8 1: 90-97 (1 999); Breuss, J. Cell .Sc/ence 108: 2241 -225 1(1 995)). Prema tome, antitela koja se specifično vezuju za avp\„ eksprimiranom na parafinskim preparatima tkiva, mogu da se koriste u standardnim imunohislnhcmijskim tehnikama za
detektovanje ekspresije avPćza dijagnostikovanje fibroze, kancera i bilo kojih drugih oboljenja kod kojih je avP6 pozitivno regulisan.
Kao stoje opisano gore, određena antitela iz sadašnjeg pronalaska se vezuju za Pointegrin prečišćen HPLC-om i za parafmske preparate p6-transfektovanih ćelija i fiksiranih. Pokazano je i da se ova antitela vezuju za reprezentativna skvamozna tkiva i tkiva kancera dojke u imunobojenju. Videti, npr., SI. 8, gde je monoklonsko antitelo 6.2A1 korišćeno da se pokaže relativno bojenje parafinskih preparata i skvamoznih karcinoma i karcinoma dojke. Dakle, ova nova antitela su korisna kao dijagnostičko sredstvo.
Primer 12: Efekti blokirajućih anti- avPo mAb u Alport miševima
Kolagen 4A3 (COL4A3) nokaut (Alport) miševi se standardno koriste kaoin vivomodel za fibrozu bubrega i za testiranje terapijskih efekata farmakoloških agenasa( supra).Testirali smo mAb 6.8G6 (zavisna od katjona) i 6.3G9 (nezavisna od katjona) u Alport miševima da bismo utvrdili da li će inhibirati fibrozu normalno nađenu kod sedam nedelja starih Alport miševa. Kao što je pokazano gore, nađeno je da ova dva antitela inhibiraju vezivanje avPćza LAP i aktivaciju TGF-13 u bioeseju. Antitelo 1E6 je korišćeno kao negativna kontrola.
Tri nedelje starim Alport miševima su 3 puta nedeljno date intraperitonealne injekcije sa jednim od sledećih antitela: (1) 6.8G6, 4mg/kg (7 miševa); (2) 6.3G9, 4 mg/kg (4 miša) i (3) 1E6, lmg/kg (6 miševa). Injekcije su nastavljene 4 nedelje. Miševi su zatim žrtvovani i njihovi bubrezi izvađeni.
Preseci parafinskih preparata bubrega su pripremljeni kao što je opisano gore, a zatim obojeni da bi se detektovao aktin iz glatkih mišića, marker za mioblaste i taloženje matriksa u fibrozi bubrega. Našli smo značajno smanjenje bojenja aktina iz glatkih mišića i u intersticijalnim i u glomerularnim regionima bubrega Alport miševa tretiranih mAb 6.8G6 ili 6.3G9, u poređenju sa miševima tretiranim pomoću 1E6.
SI. 11A i 11B pokazuju tačkasti grafik bojenja aktina iz glatkih mišića u glomerularnim i intersticijalnim regionima Alport bubrega. Obojenost aktina iz glatkih mišića bubrega u Alport miševima tretiranim pomoću 6.SG6 i 6.3G9 je znatno smanjeno u poređenju sa miševima tretiranim pomoću 1 E6. koji su negativna kontrola.
Primer 13: Efektivnost anti-avPomAb u sprečavanju unilateralne ureterske nefroskleroze,
indukovane opstrukcijom
Koristili smo jedan drugi mišji model za renalnu fibroznu progresiju da testiramo antifibrotičku efikanost 6.8G6 i 6.3G9. U ovom mišjem modelu, ureter životinje se podvezuje, što izaziva unilateralnu uretarsku opstrukciju (UUO). UUO izaziva progresivnu nefrosklerozu bez skoro terminalnog otkazivanja bubrega u miševima zato što neozleđeni bubreg može da održi relativno normalnu renalnu funkciju. Dok opstruisani bubreg podleže brzoj globalnoj fibrozi, neopstruisani bubreg podleže adaptivnoj hipertrofiji.
Ova studija je kvantifikovala morfometrički uticaj anti avPć tretmana na renalnu fibrozu indukovanu UUO. Korišćeni su muški, 8-12 nedelja stari C57BL miševi, bez virusnog antigena, teški 25,5±0,2 g (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Miševima je dozvoljeno da se prilagode sedam dana pre početka studije. Bio im je omogućenad libitumpristup ozračenoj standardnoj mišjoj hrani (chow) i sterilnoj vodi kroz ceo period akomodacije i eksperimenta. Telesna težina je merena.u određenim intervalima kao deo praćenja zdravlja životinja. Rezultati su pokazali da su miševi koji nisu operisani (upareni po starosti) dobili oko 10% telesne težine tokom dvonedeljnog perioda istraživanja. UUO miševi su izgubili oko 9% telesne težine do drugog dana, ali su postepeno povratili izgubljenu telesnu težinu do 14. dana. Ovakav profil promene težine se javljao bez obzira na terapijski tretman.
Da bi se indukovala renalna fibroza, levi uretar je aseptički izolovan putem laparotomije levo od središnje linije pod ketamimksilazinskom (100:10 mg/kg s.c.) anestezijom. Dve čvrste, okluzivne 6-0 svilene ligature su stavljene na uretru u nivou nižeg pola bubrega i the uretra je isečena između ligatura. Abdominalni zid je zatvoren 4-0 Vicrvlom, a koža je zatvorena 4-0 najlonom. Životinje su ostavljene da se oporave na termoforu i dato im je 0,05 mg/kg s.c. buprenorfina dvaput dnevno 0. i 1. dana. Prilagođena je procedura iz Ma et al.,Kidney Int.53 (4): 937-944 (1998).
Miševi su zatim podeljeni u sledeće eksperimentalne groupe:
Svim životinjama, osim onih iz Grupe 5, su date doze dvaput nedeljno počev od dana pred operaciju.
Životinje su zatim eutanazirane ugljen dioksidom 10. dana posle podvezivanja i disecirane. U UUO miševima, renalni pelvis i uretar su bili znatno otečeni i napunjeni fluidom iznad opstruktivne ligature. Stepen otečenosti i količina preostale mase renalnog tkiva varirala je među tretiranim grupama. Grupa 2 je pokazala otprilike polovinu otečenosti negativne kontrolne grupe. Ligirani bubrezi su bili bledi. Kontralateralni bubrezi su jarko crveni i uvećani za oko jednu trećinu.
Dalje, oba bubrega (levi ligiran, desni neligiran) životinja su uklonjena i prepolovljena transverzalno kroz centar renalnog pelvisa. Jedna polovina svakog bubrega je stavljena u 10% neutralni puferisani formalin zbog bojenja fiksiranog tkiva. Druga polovina svakog bubrega je stavljena u 15% saharozu, a zatim u 30% saharozu, zbog imunohistohemijskog bojenja.
Preseci bubrega fiksirani u formalinu su imunobojeni na miofibroblaste (aktin glatkih mišića), markere fibroze. Snimci su urađeni pod standardizovanim uslovima osvetljenja i ekspozicije digitalne kamere, korigovani za pozadinu i kalibrisani na standardne udaljenosti. Uzeti su snimci susednih polja koja pokrivaju ceo presek levog bubrega svake životinje, za kvantifikaciju.
Aktin glatkih mišića je izražen kao procenat ukupne površine tkiva unutar merenih polja. Ona su uključila sva kortikalna i medularna tkiva iz preseka osim renalne papile.
Kao zaključak, miševi tretirani antitelima 6.3G9 i 6.8G6 pokazuju značajno smanjenje fibroze.
Primer 14: Efektivnost blokiiajućih anti- ayp6 mAbs u odnosu na plućnu fibrozu indukovanu
bleomicinom kod miševa
Plućna fibroza kod miševa indukovana bleomicinom je ustanovljena kaoin vivomodel za fibrozu pluća i koristi se za testiranje terapijskih efekata farmakoloških agenasa. Upala je obično vidljiva 5-15 dana posle tretmana bleomicinom. U miševima soja 129, stepen pulmonarne fibroze progresivno raste i do 60 dana posle tretmana bleomicinom. Akumulacija matriksa obično postaje primetna oko 15. dana. U ovom primeru, mAb 6.3G9 je injektirano intraperitonealno, u koncentraciji od 4 mg/kg/doza, u miševe sa plućnom fibrozom indukovanom bleomicinom počev od 0-tog ili 15-og dana, tri puta nedeljno. Plućna fibroza je indukovana 0-tog davanjem jedne intratrahealne doze bleomicina u koncentraciji od 0,03 jedinica/kg u 50 ul sterilnog slanog rastvora. Životinje su žrtvovane 30-og dana i procenjen je stepen plućne fibroze. Antitelo 1E6 je korišćeno kao negativna kontrola.
Izvađena su pluća iz svake životinje i meren je sadržaj hidroksiprolina kao indeks taloženja plućnog kolagena, kao što je opisano u Munger et al.,supra.Kao što je pokazano na SI. 15A, tretman pomoću 6.3G9 počev od 0-tog dana znatno je inhibirao povećanje sadržaja hidroksiprolina u plućima, indukovanog bleomicinom. Važno je daje tretman pomoću 6.3G9 bio bar isto toliko efektivan kad je počeo 15 dana posle davanja bleomicina, u vreme kad je taloženje plućnog kolagena već počelo.
Ispitali smo i efekte 6.3G9, 6.8G6 zavisnog od katjona i neblokirajućeg antitela 6.4B4 u inhibiranju ozbiljnijih nivoa plućne fibroze u produženom protokolu fibroze indukovane bleomicinom (u trajanju od 60 dana). Da bismo to uradili, počeli smo tretmane antitelom 15 dana posle davanja bleomicina (dan 15). Pluća su zatim izvađena 60-og dana da bi se odredio sadržaj hidroksiprolina. Kao što je pokazano na SI. 15C, tretman pomoću 6.8G6 je značajno inhibirao fibrozu indukovanu bleomicinom (više od 70% smanjen sadržaj hidroksiprolina u poređenju sa životinjama tretiranim bleomicinom i slanim rastvorom). Tretman pomoću 6.3G9 je pokazao i tendenciju prema zaštiti, ali ovi rezultati nisu dostigli statističku značajnost (SI. 15C).
Kao zaključak, blokirajuća anti-avPćmAb, i zavisna i nezavisna od katjona, redukuju plućnu fibrozu u miševima tretiranim bleomicinom. Staviše, ova intervencija je bila efektivna čak i kad je tretman antitelom započet tek posle početka fibroze.
Primer 15: Pozitivna regulacija ayp6u lezijama humane psorijaze
Da bi se utvrdilo da li je otvPr, uključen u psorijazu, ekspresija avPćje ispitana na biopsijama povređene i nepovređene kože pet pacijenata sa psorijazom i četiri normalne osobe. Imunobojenjem mAb 6.2A1. našli smo značajno povećanje ekspresije avPou psorijatičnim lezijama u poređenju sa nepovređenom kožom psorijatičnih pacijenata i normalnih kontrola. Prema tome, pozitivna regulacija avPću psorijatičnim lezijama sugeriše i dijagnostičke i terapijske implikacije za upotrebu antitela na avPć-
Primer 16: Pozitivna re<g>ulacija ayPr, u mišjoj i humanoj jetri sa oboljenjem žučnog kanala
Kao stoje ranije diskutovano, pretpostavlja se da se u povredi tkiva dešava ekspresija a\/p(,- U ovoj studiji, ispitana je ekspresi ja uvpr, u mišjoj i humanoj jetri oštećenoj obol jenjem žučnog kanala.
Hepatička povreda u miševima je indukovana ligacijom žučnog kanala. Videti, npr., George et al.,PNAS96:12719-24 (1999); George et al,AmJPathol 156:115-24(2000). Korišćenjem mAb 6.2G2, našli smo daje ekspresija avB6značajno povišena 9-og, 14-og i 16-og dana posle ligaciježučnog kanala.
Slično, preseci humane jetre pacijenata sa oboljenjem žučnog kanala imaju povećanu ekspresiju civP6, što je određeno imunohistohemijom pomoću mAb 6.2G2. Povišena ekspresija avpćje viđena, na primer, u uzorcima jetre 44-godišnjeg muškarca sa akutnom holestazom, 59-godišnjeg muškarca sa akutnom opstrukcijom žučnog kanala posle transplantacije, 22-godišnjeg muškarca sa žučnom atrezijom i 24- muškarca sa hroničnom opstrukcijom žučnog kanala.
Da sumiramo, nova antitela na avPćsu korisno dijagnostičko i terapijsko sredstvo za oboljenja jetre.
Primer 17: Pozitivna regulacija qypr, u različitim humanim kancerima
Integrin avP6 se normalno eksprimira neznatno ili malo u zdravim odraslim tkivima. U nizu humanih tumorskih tkiva, ekspresija avP6 je određena pomoću antitela 6.2A1 i postupaka koji su uopšteno opisani ovde. Rezultati pokazuju daje ekspresija avPćintegrina bila značajno povećana u nekoliko kancera humanog epitela. Treba primetiti, imunohistologija je pokazala daje avPć bio naročito jako eksprimiran na ivicama tumorskih ostrvaca u mnogim od epitelnih kancera. da bi se dalje ispitivala ekspresija avp6u ćelijama epitelnih kancera, Detroit 562 ćelije (karcinom farinksa) i SCC-14 ćelije (karcinom skvamoznih ćelija jezika), kao i SW480p6ćelije( supra),su bojene pomoću 6.3G9 i 6.4B4 i analizirane protočnom citometrijom.
Desna strana SI. 12 pokazuje ekspresiju avp6na različitim tumorskim ćelijskim linijama kao što je naznačeno vezivanjem 6.3G9 u sortiranju aktiviranih ćelija fluorescencijom (FACS). Pik punom linijom predstavlja vezivanje 6.3G9, dok otvoren pik predstavlja fon vezivanja samog sekundarnog mAb. Linijski grafik na levoj strani SI. 12 pokazuje inhibiciju vezivanja tumorskih ćelijskih linija za LAP ligand povećanjem koncentracije 6.3G9 ili 6.4B4. 6.4B4je značajno manje potentan inhibitor vezivanja avP&za LAP, u poređenju sa 6.3G9 (> 10 puta 1C50za Detroit 562, > 30 puta IC50za SVV480B6 i > 100 puta IC50 za SCC-14). Ovo je u saglasnosti sa prethodnim ///vitrorezultatima koji ukazuju na to daje 6.3G9 potentno blokirajuće mAb, a 6.4B4je slabo blokirajuće mAb. Ovi podaci su u saglasnosti i sa zanemarlji\om inhibitornom aktivnošću 6.4B4 u modelu detroitskog transplantata (SI. 14B). SI. 13 dalje pokazuje relativnu inhibiciju vezivanja tumorskih ćelijskih linija za LAP različitim mAbs na avp6-I 6.3G9 i 6.8G6 su pokazali ekvivalentnu inhibitornu aktivnost (što je konzistentno sa svim prethodnim podacima), dok je 6.4B4 značajno manje potentan inhibitor vezivanja a.v<p>6za LAP.
Primer 18: Efekti blokirajućih mAb na ayP<s u modelu humanog tumorskog transplantata
Imunodeficijentne životinje (npr., goli (nude) miševi i SCID miševi), kojima su transplantirani humani tumorski transplantati, su ustanovljene kao koristanin vivomodel sistem za testiranje terapijskih efekata anti-kanceroznih agenasa (videti, npr., van Weerden et al.,Prostate43(4): 263-71 (2000); Bankert et al.,Front Biosci7: c44-62 (2002)). Prema tome, blokirajuća anti-ctvPć monoklonska antitela na sadašnjeg pronalaska mogu se testiratiin vivou transplantatskom modelu za njihovu sposobnost da inhibiraju rast tumora. U ovom eksperimentu, testirali smo sposobnost nekih od ovih novih antitela na avPeda inhibiraju rast tumora u ženkama golih miševa bez timusa kojima je transplantiran kancerozan humani faringealni (ćelijska linija Detroit 562) transplantat.
Da bi se to uradilo, ćelije Detroit 562 (ATCC) su stavljenein vitrou minimalni esencijalni medijum (Eagle) sa 2 mM L-glutamina i Earle-ovim BSS podešenim da sadrži 1,5 g/L natrijum bikarbonata, 0,1 mM neesencijalnih aminokiselina i 1,0 mM natrijum piruvata i 10% fetalnog goveđeg seruma, bez antibiotika. Golim miševima je implantirano oko 5X10<6>ćelija/0,2 ml medijuma (bez seruma) subkutano u desni bok. Tri do četiri dana kasnije, početo je merenje veličine tumora i nastavljeno je dok tumori nisu dostigli oko 5 mm (dužine) sa 5 mm (širine). Miševi su randomizirani i 1. dana su im intraperitonealno injektirana ispitivana antitela ili kontrolni rastvori, a zatim su dobijali po tri injekcije nedeljno u periodu od 33 dana. Ispitivana antitela i kontrolni rastvori su bili: (1) 6.3G9, 1 mg/kg, 10 miševa; (2) 6.3G9, 4 mg/kg, 10 miševa; (3) 6.3G9, 10 mg/kg, 10 miševa; (4) 6.4B4, 1 mg/kg, 10 miševa;
(5) 6.4B4, 4 mg/kg, 10 miševa; (6) 6.4B4, 10 mg/kg, 10 miševa i (7) nosač kao kontrola
(PBS), 0,2 ml/miš, 30 miševa. Pored toga, cis-platina je injektirana u 10 miševa subkutano, u dozi od 2 mg/kg, kao hemoterapijska kontrola. Injekcije cis-platine su date 1. dana, a zatim na svaka 2 dana, ukupno šest tretmana. Na kraju perioda od 33 dana, izmerene su težine životinja i veličine tumora, ekspresija o.vpf, je određena imunohistološki i izmereni su nivoi anti-avPr, u serumu.
Imunohistološko bojenje je pokazalo da su implantirane tumorske ćelije jako ekspnmiraleo.vp()'/'vivo.Podaci o težini tumora su dalje pokazali da su blokirajuća mAb 6.3G9 efektivno inhibirala rast tumora u sve tri testirane koncentracije (SI. 14A). Nasuprot tome, slabo blokirajuća mAb 6.4B4 nisu inhibirala rast tumora (SI. 14B).
Da sumiramo, blokirajuća antitela su inhibirala rast tumora do 40-50% u tretiranim miševima. Nasuprot tome, slabo blokirajuće antitelo na avp6nije inhibiralo rast tumora.
Primer 19: Internalizacija ayp6antitela
Antitela koja su internalizovana od strane ćelija pružaju prednost za određene kliničke indikacije kao stoje kancer, zato što se tada antitela mogu konjugovati sa toksinima, radioaktivnim jedinjenjima ili drugim anti-kanceroznim agensima da selektivno ciljaju i inhibiraju rat kanceroznih ćelija. Sposobnost antitela na avP6da budu internalizovana je proučavana u SV/480P6( supra)i SCC-14 ćelijama.
Ćelije su podeljene 1:5 i stavljene na staklene pločice sa po 4 odeljka za inkubaciju preko noći na 37°C, 5% C02. Sledećeg dana, mAb 6.8G6, 6.1A8, 6.3G9, 7.1C5, 6.4B4, 10D5 i 8B3 su razblažena do konačne koncentracije od 20 ug/mL. mAb ili sam medijum je dodat u odgovarajuća mesta. Vreme internalizacije je praćeno od 0 h do 48 h. Vremenske tačke koje su bile uključene su 0, 5, 10 i 30 min i 1, 4, 24 i 48 h. Sekundarno antitelo (anti-mišje-Alexa 594) je dodato kao negativna kontrola. Internalizacija je prekinuta u svakoj vremenskoj tačci uklanjanjem antitela i pranjem ćelijskog sloja puferom. Aglutinin iz pšeničnih klica (Wheat Germ Agglutinin-Alexa-488) je dodavan 20 min na 18°C da bi se obojila spoljna ivica ćelija zelenom fluorescencijom. Pošto su ćelije oprane, rastvor Cytofix/Cytoperm je dodavan 20 min na 18°C da bi se ćelije fiksirale i permeabilizovale. Ćelije su ponovo oprane i sekundarno anti-mišje-Alexa 594 (crvena fluorescencija) je dodavano 20 min na 18°C da bi se obeležila granica ili internalizovalo mišje avPeantitelo. Ćelije su zatim oprane i fiksirane dodatkom 2% paraformaldehida i ispitane konfokalnom mikroskopijom. Snimci su napravljeni Leitz Plan-Apochromatic 63x (1,32 numerička apertura, uljna imerzija) objektiv (Leica) sa 2x digitalnim uveličanjem. Svaki snimak predstavlja jedan optički presek iz srednjeg preseka ćelije, u kojem je nađena internalizacija pod svim uslovima. U jedru nije nađeno bojenje.
Internalizacija je uočena kod mAb zavisnih od katjona (mimetici liganda koji sadrže RGD) kao što su 6.SG6 i 6.1 A8. Kod mAb nezavisnih od katjona, kao što su 6.3G9, 7.1C5, i 6.4B4 nije nađena internalizacija.

Claims (59)

1. Monoklonsko antitelo koje (a) se specifično vezuje za avp6i (b) inhibira vezivanje avp6 za peptid vezan za latenciju (LAP) sa vrednošću IC50 nižom od one 10D5.
2. Antitelo prema zahtevu 1, gde se antitelo sastoji od istih polipeptidnih sekvenci teškog i lakog lanca kao antitelo koje je proizveo hibridom 6.1A8 (ATCC pristupni broj PTA-3647).
3. Antitelo prema zahtevu 1, gde se antitelo sastoji od istih polipeptidnih sekvenci teškog i lakog lanca kao antitelo koje je proizveo hibridom 6.3G9 (ATCC pristupni broj PTA-3649).
4. Antitelo prema zahtevu 1, gde se antitelo sastoji od istih polipeptidnih sekvenci teškog i lakog lanca kao antitelo koje je proizveo hibridom 6.8G6 (ATCC pristupni broj PTA-3645) .
5. Antitelo prema zahtevu 1, gde se antitelo sastoji od istih polipeptidnih sekvenci teškog i lakog lanca kao antitelo koje je proizveo hibridom 6.2B1 (ATCC pristupni broj PTA-3646) .
6. Antitelo prema zahtevu 1, gde se antitelo sastoji od istih polipeptidnih sekvenci teškog i lakog lanca kao antitelo koje je proizveo hibridom 7.1G10 (ATCC pristupni broj PTA-3898).
7. Antitelo prema zahtevu 1, gde se antitelo sastoji od istih polipeptidnih sekvenci teškog i lakog lanca kao antitelo koje je proizveo hibridom 7.7G5 (ATCC pristupni broj PTA-3899) .
8. Antitelo prema zahtevu 1, gde se antitelo sastoji od istih polipeptidnih sekvenci teškog i lakog lanca kao antitelo koje je proizveo hibridom 7.1C5 (ATCC pristupni broj PTA-3900) .
9. Antitelo prema zahtevu 1, gde je vezivanje između antitela i avPćzavisno od dvovalentnih katjona.
10. Antitelo prema zahtevu 1, gde je dvovalentni katjon Ca<2+>, Mg<2+>ili Mn<2+>.
11. Antitelo prema zahtevu 1, gde jc vezivanje između antitela i avPć nezavisno od dvovalentnih katjona.
12. Antitelo na avp6čiji se regioni koji određuju komplementarnost teških lanaca (CDR) 1, 2 i 3 sastoje suštinski od sekvenci SEQ ID NOs: 1, 4 i 7, respektivno, i čiji se CDR-ovi lakih lanaca po izboru suštinski sastoje od sekvenci SEQ ED NOs: 10, 13 i 15, respektivno.
13. Antitelo na avp&čiji se regioni koji određuju komplementarnost teških lanaca (CDR) 1, 2 i 3 sastoje suštinski od sekvenci SEQ ID NOs: 3, 5 i 8, respektivno, i čiji se CDR-ovi lakih lanaca po izboru suštinski sastoje od sekvenci SEQ ID NOs: 11, 14 i 17, respektivno.
14. Antitelo na avp6čiji se regioni koji određuju komplementarnost teških lanaca (CDR) 1, 2 i 3 sastoje suštinski od sekvenci SEQ ID NOs: 3, 6 i 9, respektivno, i čiji se CDR-ovi lakih lanaca po izboru suštinski sastoje od sekvenci SEQ ID NOs: 12, 14 i 18, respektivno.
15. Antitelo na avP6čiji se regioni koji određuju komplementarnost teških lanaca (CDR) 1, 2 i 3 sastoje suštinski od sekvenci SEQ ID NOs: 2, 46 i 47, respektivno, i čiji se CDR-ovi lakih lanaca po izboru suštinski sastoje od sekvenci SEQ ID NOs: 48, 13 i 16, respektivno.
16. Antitelo naGvPečiji se regioni koji određuju komplementarnost teških lanaca (CDR) 1, 2 i 3 sastoje suštinski od sekvenci SEQ ID NOs: 49, 51, i 53, respektivno, i čiji se CDR-ovi lakih lanaca po izboru suštinski sastoje od sekvenci SEQ ID NOs: 55, 57 i 59, respektivno.
17. Antitelo na avp6čiji se regioni koji određuju komplementarnost teških lanaca (CDR) 1, 2 i 3 sastoje suštinski od sekvenci SEQ ID NOs: 50, 52, i 54, respektivno, i čiji se CDR-ovi lakih lanaca po izboru suštinski sastoje od sekvenci SEQ ID NOs: 56, 58 i 60, respektivno.
18. Antitelo na avp6koje kao sekvencu varijabilnog domena teškog lanca sadrži bilo koju od SEQ ED NOs: 19-36 i 61-62.
19. Antitelo na avp6koje kao sekvencu varijabilnog domena teškog lanca sadrži SEQ ED NO: 19, a kao sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ED NO: 37.
20. Antitelo na avp6koje kao sekvencu varijabilnog domena teškog lanca sadrži SEQ ED NO:20 ili 21, a kao sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ED NO: 38.
21. Antitelo na avp6koje kao sekvencu varijabilnog domena teškog lanca sadrži SEQ ED NO:22, a kao sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ED NO: 43.
22. Antitelo na avp6koje kao sekvencu varijabilnog domena teškog lanca sadrži SEQ ED NO: 23, a kao sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ED NO: 44.
23. Antitelo na avp6koje kao sekvencu varijabilnog domena teškog lanca sadrži SEQ ED NO: 24, a kao sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 45.
24. Antitelo na avp6koje kao sekvencu varijabilnog domena teškog lanca sadrži SEQ ID NO: 25 ili 26, a kao sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 42.
25. Antitelo na avP6koje kao sekvencu varijabilnog domena teškog lanca sadrži SEQ ED NO: 27, 28, ili 29, a kao sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 39.
26. Antitelo na avp6koje kao sekvencu varijabilnog domena teškog lanca sadrži SEQ ID NO: 34 ili 35, a kao sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 40.
27. Antitelo na av06koje kao sekvencu varijabilnog domena teškog lanca sadrži SEQ ED NO: 36, a kao sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ED NO: 41.
28. Antitelo na av36koje kao sekvencu varijabilnog domena teškog lanca sadrži SEQ ED NO: 61, a kao sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 63.
29. Antitelo na avp6koje kao sekvencu varijabilnog domena teškog lanca sadrži SEQ ED NO: 62, a kao sekvencu varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 64.
30. Monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za ctvPs, ali ne inhibira vezivanje avPćza peptid vezan za latenciju (LAP).
31. Antitelo prema zahtevu 30, gde se antitelo sastoji od istih polipeptidnih sekvenci teškog i lakog lanca kao antitelo koje je proizveo hibridom 6.2A1 (ATCC pristupni broj PTA-3896).
32. Antitelo prema zahtevu 30, gde se antitelo sastoji od istih polipeptidnih sekvenci teškog i lakog lanca kao antitelo koje je proizveo hibridom 6.2E5 (ATCC pristupni broj PTA-3897).
33. Kompozicija za sprečavanje ili lečenje oboljenja u kojem posreduje o^Pe kod sisara, koja sadrži antitelo iz bilo kog od zahteva 1-32, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
34. Kompozicija prema zahtevu 33, gde je antitelo konjugovano sa citotoksičkim agensom.
35. Kompozicija prema zahtevu 33, gde je antitelo zavisno od katjona.
36. Postupak za tretiranje subjekta koji ima ili je pod rizikom da ima oboljenje u kojem posreduje avp6, koji se sastoji od davanja subjektu kompozicije iz zahteva 32, čime se ublažava oboljenje ili odlaže njegov početak.
37. Postupak prema zahtevu 36, gde je subjekt čovek.
38. Postupak prema zahtevu 36, gde je oboljenje fibroza.
39. Postupak prema zahtevu 38, gde je fibroza sklerodcrma, stvaranje ožiljaka, fibroza jetre, fibroza bubrega ili fibroza pluća.
40. Postupak prema zahtevu 36, gde je oboljenje psorijaza.
41. Postupak prema zahtevu 36, gde je oboljenje kancer.
42. Postupak prema zahtevu 41, gde je kancer epitelni kancer.
43. Postupak prema zahtevu 41, gde je kancer oralan, kancer kože, cerviksa, jajnika, farinksa, larinksa, ezofagusa, pluća, dojke, bubrega ili kolorektalni kancer.
44. Postupak prema zahtevu 36, gde je oboljenje Alport-ov sindrom.
45. Postupak detektovanja ct^Pe u uzorku tkiva sisara, koji se sastoji od dovođenja u kontakt uzorka tkiva sa antitelom iz zahteva 1 ili 30.
46. Postupak prema zahtevu 45, gde je antitelo odabrano iz grupe koju čine 6.2A1 (ATCC pristupni broj PTA 3896) i 6.2E5 (ATCC pristupni broj PTA 3897).
47. Ćelija hibridoma 6.1A8 (ATCC pristupni broj PTA-3647).
48. Ćelija hibridoma 6.2B10 (ATCC pristupni broj PTA-3648).
49. Ćelija hibridoma 6.3G9 (ATCC pristupni broj PTA-3649).
50. Ćelija hibridoma 6.8G6 (ATCC pristupni broj PTA-3645).
51. Ćelija hibridoma 6.2B1 (ATCC pristupni broj PTA-3646).
52. Ćelija hibridoma 6.2A1 (ATCC pristupni broj PTA-3896).
53. Ćelija hibridoma 6.2E5 (ATCC pristupni broj PTA-3897).
54. Ćelija hibridoma 7.1G10 (ATCC pristupni broj PTA-3898).
55. Ćelija hibridoma 7.7G5 (ATCC pristupni broj PTA-3899).
56. Ćelija hibridoma 7.1C5 (ATCC pristupni broj PTA-3900).
57. Izolovana nukleinska kiselina koja sadrži kodirajuću sekvencu za bilo koju od SEQ IDNOs: 19-45 i 61-64.
58. Izolovan polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NOs: 19-45 i 61-64.
59. Monoklonsko antitelo koje se sastoji od istih polipeptidnih sekvenci teškog i lakog lanca kao antitelo koje je proizveo hibridom 6.2B10 (ATCC pristupni broj PTA-3648).
YU80704A 2002-03-13 2003-03-13 ANTI-ALFAvBETA6 ANTITELA RS52488B (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36499102P 2002-03-13 2002-03-13
US42628602P 2002-11-13 2002-11-13
PCT/US2003/008048 WO2003100033A2 (en) 2002-03-13 2003-03-13 ANTI-αvβ6 ANTIBODIES

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS80704A true RS80704A (sr) 2006-12-15
RS52488B RS52488B (sr) 2013-02-28

Family

ID=29586753

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YU80704A RS52488B (sr) 2002-03-13 2003-03-13 ANTI-ALFAvBETA6 ANTITELA

Country Status (23)

Country Link
US (4) US7465449B2 (sr)
EP (4) EP2287199B1 (sr)
JP (6) JP4473117B2 (sr)
KR (1) KR101098109B1 (sr)
CN (4) CN1646160A (sr)
AR (1) AR038970A1 (sr)
AU (1) AU2003261071C1 (sr)
BR (1) BRPI0308585B8 (sr)
CA (1) CA2478833C (sr)
CL (8) CL2010000787A1 (sr)
EA (1) EA011853B1 (sr)
ES (1) ES2389037T3 (sr)
HK (1) HK1213007A1 (sr)
IL (4) IL164021A0 (sr)
IS (1) IS7443A (sr)
ME (1) ME00804B (sr)
MX (1) MXPA04008870A (sr)
MY (2) MY154009A (sr)
NO (1) NO334834B1 (sr)
NZ (2) NZ535425A (sr)
PL (1) PL216223B1 (sr)
RS (1) RS52488B (sr)
WO (1) WO2003100033A2 (sr)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA04008870A (es) 2002-03-13 2005-06-17 Biogen Idec Inc Anticuerpos anti-avb6.
WO2003087340A2 (en) * 2002-04-12 2003-10-23 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
CA2434668A1 (en) 2003-07-04 2005-01-04 Laurence Mulard Novel approach to design glycopeptides based on o-specific polysaccharide of shigella flexneri serotype 2a
CN102875681A (zh) * 2005-07-08 2013-01-16 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗-αvβ6抗体及其用途
AU2012258386B2 (en) * 2005-07-08 2014-08-07 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
EP1974213A4 (en) * 2006-01-17 2009-03-25 Biosite Inc HIGHLY SENSITIVE SECRETAGOGIN ASSAYS AND ITS USE IN DIAGNOSIS AND / OR FORECASTING
CN101563105B (zh) * 2006-07-10 2013-01-23 拜奥根Idec马萨诸塞公司 用于抑制smad4-缺陷癌症的组合物和方法
EP2064244B1 (en) * 2006-08-03 2019-06-05 MedImmune Limited ANTIBODIES DIRECTED TO alphaVbeta6 AND USES THEREOF
CA2665885A1 (en) * 2006-10-19 2008-12-04 The Regents Of The University Of California Treatment and prevention of chronic asthma using antagonists of integrin .alpha.nu.beta.6
US9163091B2 (en) * 2007-05-30 2015-10-20 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
WO2008150841A1 (en) * 2007-05-30 2008-12-11 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
US20110064744A1 (en) * 2007-05-30 2011-03-17 Sabbadini Roger A Prevention and treatment of pain using antibodies to lysophosphatidic acid
US8470321B2 (en) 2007-11-16 2013-06-25 The Rockefeller University Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
AU2009245792B2 (en) 2008-05-07 2012-11-01 Coimmune, Inc. Humanized antibodies against human interferon-alpha
EP2279209A2 (en) * 2008-05-09 2011-02-02 Ablynx NV Amino acid sequences directed against integrins and uses thereof
WO2009139915A2 (en) 2008-05-15 2009-11-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Novel targets for regulation of angiogenesis
BRPI0919377A2 (pt) * 2008-09-26 2016-09-27 Dana Farber Cancer Inst Inc anticorpo isolado ou um fragmento ligante de antígeno do memso, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica, método de produzir o referido anticorpo ou fragmento, uso dos mesmos, e composição compreendendo o referido anticorpo ou fragmento
AU2010285265B2 (en) 2009-08-19 2015-05-21 Merck Patent Gmbh Antibodies for the detection of integrin complexes in FFPE material
WO2011119524A1 (en) * 2010-03-22 2011-09-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Novel targets for regulation of angiogenesis
EA028899B1 (ru) 2010-04-30 2018-01-31 Алексион Фармасьютикалз, Инк. АНТИ-C5a-АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИТЕЛ
AU2012244673A1 (en) 2011-04-21 2013-11-28 Seattle Genetics, Inc. Novel binder-drug conjugates (ADCs) and their use
WO2012154983A2 (en) 2011-05-10 2012-11-15 Biocare Medical, Llc Systems and methods for anti-pax8 antibodies
KR102084806B1 (ko) * 2012-02-17 2020-03-04 시애틀 지네틱스, 인크. 인테그린 αvβ6에 대한 항체 및 암을 치료하기 위한 그의 용도
US10316103B1 (en) 2012-03-30 2019-06-11 Biocare Medical, Llc Systems and methods for anti-Uroplakin III antibodies
DK2900265T3 (en) 2012-09-27 2018-08-20 Biocare Medical Llc Anti-Uroplakin II Antibodies, Systems and Methods
CN104704119B (zh) * 2012-10-03 2017-09-05 凯奥目生物科学株式会社 在体内具有抗肿瘤活性的抗人Dlk‑1抗体
KR101645905B1 (ko) 2012-10-12 2016-08-04 스피로즌 살 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
WO2014100220A2 (en) 2012-12-18 2014-06-26 Biocare Medical, Llc Antibody cocktail systems and methods for classification of histologic subtypes in lung cancer
DK2962113T3 (da) 2013-02-28 2019-07-01 Biocare Medical Llc Systemer og fremgangsmåder med anti-p40-antistoffer
EP2968585B1 (en) 2013-03-13 2018-07-18 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2014144466A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
US10035860B2 (en) 2013-03-15 2018-07-31 Biogen Ma Inc. Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof
GB201305668D0 (en) 2013-03-28 2013-05-15 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Avs6 Integrin Antagonists
CN105814079B (zh) 2013-08-30 2021-02-09 伊缪诺金公司 用于检测叶酸受体1的抗体和测定
KR102150616B1 (ko) 2013-09-12 2020-09-03 삼성전자주식회사 c-Met 표적 화합물-생체활성 물질 접합체 및 그 용도
EP3052523B1 (en) * 2013-10-01 2021-03-10 Medimmune Limited Methods of treating and diagnosing alpha-v-beta-6 overexpressing cancer
ES2765423T3 (es) 2013-10-03 2020-06-09 Biocare Medical Llc Sistemas y procedimientos de anticuerpos anti-SOX10
CN104721225A (zh) 2013-12-19 2015-06-24 高露洁-棕榄公司 口腔护理组合物
CN106163568B (zh) 2013-12-23 2021-03-23 拜耳制药股份公司 含纺锤体驱动蛋白（ksp）的抗体药物偶联物（adc）
US20170008955A1 (en) * 2014-02-03 2017-01-12 Cnj Holdings, Inc. Humanized beta-amyloid binding molecules and uses thereof
TWI742423B (zh) 2014-05-29 2021-10-11 美商宏觀基因股份有限公司 特異性結合多種癌症抗原的三特異性結合分子和其使用方法
WO2016037644A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201417002D0 (en) 2014-09-26 2014-11-12 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Novel compound
EP3310440A1 (de) 2015-06-22 2018-04-25 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Binder-wirkstoff-konjugate (adcs) und binder-prodrug-konjugate (apdcs) mit enzymatisch spaltbaren gruppen
HK1246717A1 (zh) 2015-06-23 2018-09-14 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ksp抑制剂的靶向缀合物
EP3334453A4 (en) * 2015-08-13 2019-02-06 New York University ANTIBODY-BASED SPECIFIC MOLECULES AND THEIR USES IN THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF TAUOPATHY, FOR TAU'S SPECIFIC ASP421 EPITOP
KR102700777B1 (ko) 2015-09-17 2024-08-29 이뮤노젠 아이엔씨 항-folr1 면역접합체를 포함하는 치료제 조합
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
US20190144547A1 (en) * 2015-11-23 2019-05-16 Merck Patent Gmbh Anti-alpha-v integrin antibody for the treatment of fibrosis and/or fibrotic disorders
GB201604681D0 (en) 2016-03-21 2016-05-04 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Chemical Compounds
GB201604680D0 (en) 2016-03-21 2016-05-04 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Chemical Compounds
JP7251981B2 (ja) 2016-03-24 2023-04-04 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 酵素開裂基を有する細胞毒性活性剤のプロドラッグ
JP7022707B2 (ja) 2016-06-15 2022-02-18 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤および抗ｃｄ１２３抗体を含む特異的抗体－薬物－コンジュゲート（ａｄｃ）
WO2018017797A1 (en) * 2016-07-22 2018-01-25 Georgia State Universtiy Research Foundation Monoclonal antibodies to b virus and their use for identification of b virus specific reactive peptides
JP2019534882A (ja) 2016-10-11 2019-12-05 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ 免疫介在性療法薬を有する抗体−薬物コンジュゲート
MX2019005401A (es) 2016-11-08 2019-08-05 Reata Pharmaceuticals Inc Metodos para tratar el sindrome de alport con bardoxolona metilo o analogos de la misma.
CA3046489A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CA3045931A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an integrin inhibitor
US12059472B2 (en) 2016-12-21 2024-08-13 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
EP3558387B1 (de) 2016-12-21 2021-10-20 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Spezifische antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) mit ksp-inhibitoren
PE20191235A1 (es) 2016-12-21 2019-09-11 Bayer Pharma AG Conjugados de ligando-farmaco (adcs) con grupos escindibles enzimaticamente
GB201720989D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Chemical compounds
AU2019267166C1 (en) 2018-05-11 2023-11-30 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Furin inhibitors
JP2021524449A (ja) 2018-05-23 2021-09-13 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム 分子アジュバント
US20230033021A1 (en) 2018-06-20 2023-02-02 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an integrin inhibitor
CN116726361A (zh) 2018-11-19 2023-09-12 比奥拉治疗股份有限公司 用生物治疗剂治疗疾病的方法和装置
EA202192400A1 (ru) * 2019-04-08 2022-01-25 Биоген Ма Инк. Антитела против интегрина и их применение
GB201908536D0 (en) 2019-06-13 2019-07-31 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Compounds
EP4065167A4 (en) * 2019-11-26 2024-03-27 Children's Hospital Medical Center CELA-1 INHIBITION FOR THE TREATMENT OF LUNG DISEASE
TWI884192B (zh) 2019-12-05 2025-05-21 美商西健公司 抗αＶβ６抗體及抗體-藥物結合物
WO2021119482A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
US20230372528A1 (en) 2020-10-16 2023-11-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycoconjugates
WO2022164816A1 (en) * 2021-01-26 2022-08-04 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating and preventing disease associated with avb8 integrin
CA3205921A1 (en) 2021-02-03 2022-08-11 Sheng CUI Formulation of furin inhibitor for inhalation
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
WO2022078524A2 (en) 2021-11-03 2022-04-21 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Specific conjugation of an antibody
WO2023194895A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Pyrrol derivatives as inhibitors of apolipoprotein l-1
WO2024263932A2 (en) 2023-06-23 2024-12-26 Mythic Therapeutics, Inc. Itgb6-binding proteins and uses thereof
WO2025064435A1 (en) 2023-09-19 2025-03-27 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs directed to integrin αvβ6
WO2025163120A1 (en) 2024-02-01 2025-08-07 Adcytherix Sas ANTIBODY-DRUG CONJUGATES COMPRISING AN ANTI-INTEGRIN ΑVβ6 BINDING ANTIBODY
WO2026012032A1 (en) * 2024-07-10 2026-01-15 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Antibodies against integrin and uses thereof

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US5223493A (en) 1984-12-28 1993-06-29 Alcon Laboratories, Inc. Anti-inflammatory compounds for ophthalmic use
US4732863A (en) * 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
NZ222509A (en) 1986-11-19 1993-03-26 Oncogen Hybridoma cell line producing antibodies binding to tumour-associated mucin antigen
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5804381A (en) * 1996-10-03 1998-09-08 Cornell Research Foundation Isolated nucleic acid molecule encoding an esophageal cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
GB9009549D0 (en) * 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Recombinant antibody and method
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
US5962643A (en) 1991-07-11 1999-10-05 The Regents Of The University Of California Integrin β subunit and uses thereof
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US6307026B1 (en) 1992-12-10 2001-10-23 Celltech Limited Humanized antibodies directed against A33 antigen
US5420120A (en) 1993-12-17 1995-05-30 Alcon Laboratories, Inc. Anti-inflammatory glucocorticoid compounds for topical ophthalmic use
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6417324B1 (en) * 2000-04-21 2002-07-09 Tripep Ab Synthetic peptides that bind to the hepatitis B virus core and e antigens
DK0719859T3 (da) * 1994-12-20 2003-10-20 Merck Patent Gmbh Anti-alfa V-integrin monoklonalt antistof
US5696267A (en) 1995-05-02 1997-12-09 Schering Corporation Substituted oximes, hydrazones and olefins as neurokinin antagonists
US5719156A (en) 1995-05-02 1998-02-17 Schering Corporation Piperazino derivatives as neurokinin antagonists
US5795894A (en) 1995-05-02 1998-08-18 Schering Corporation Piperazino derivatives as neurokinn antagonists
US5688960A (en) 1995-05-02 1997-11-18 Schering Corporation Substituted oximes, hydrazones and olefins useful as neurokinin antagonists
US5654316A (en) 1995-06-06 1997-08-05 Schering Corporation Piperidine derivatives as neurokinin antagonists
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
CZ45498A3 (cs) 1995-08-17 1999-01-13 Protein Design Labs, Inc. Použití antiselektinových protilátek pro výrobu farmaceutických kompozic určených pro prevenci mnohačetného selhání orgánů v důsledku vícečetného úrazu a pro prevenci akutního poškození orgánů po aplikaci mimotělního krevního objehu
WO1997008320A1 (en) 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
EP0773288A3 (en) 1995-08-29 1997-07-09 Kirin Brewery Chimera animal and its method of manufacture
US5691362A (en) 1996-06-05 1997-11-25 Schering-Plough Corporation Substituted benzene-fused hetero- and carbocyclics as nuerokinin antagonists
EP1378525A3 (en) * 1996-06-07 2004-01-14 Neorx Corporation Humanized antibodies that bind to the antigen bound by antibody NR-LU-13 and their use in pretargeting methods
AU6721696A (en) 1996-07-15 1998-03-06 Human Genome Sciences, Inc. Cd44-like protein
US5789422A (en) 1996-10-28 1998-08-04 Schering Corporation Substituted arylalkylamines as neurokinin antagonists
US5783579A (en) 1996-12-20 1998-07-21 Schering Corporation Spiro-substituted azacyclic-substituted piperazino derivatives as neurokinin antagonists
US20020004482A1 (en) 1997-08-08 2002-01-10 Xiaozhu Huang Treatment of acute lung injury and fibrosis with antagonists of avbeta6
ATE322508T1 (de) 1998-01-23 2006-04-15 Merck Patent Gmbh Verwendung des antikörpers 271.14d9.f8 (dsm acc2331) um die bindung zwischen alphavbeta6- integrin und fibronectin in vitro zu hemmen
CA2355874A1 (en) 1998-12-19 2000-06-29 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung .alpha.v.beta.6 integrin inhibitors
US7288390B2 (en) 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7163681B2 (en) 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7776315B2 (en) 2000-10-31 2010-08-17 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Pharmaceutical compositions based on anticholinergics and additional active ingredients
DE10063173A1 (de) 2000-12-18 2002-06-20 Merck Patent Gmbh Harnstoff- und Urethanderivate
MXPA03009390A (es) 2001-04-13 2004-01-29 Biogen Inc Anticuerpos para integrina vla-1.
DE10118550A1 (de) 2001-04-14 2002-10-17 Merck Patent Gmbh Liganden des Integrins alpha¶nu¶beta¶6¶
GB2380127A (en) 2001-09-26 2003-04-02 Isis Innovation Treatment of chronic joint inflammation
AR038605A1 (es) 2002-02-25 2005-01-19 Elan Pharm Inc Uso de agentes para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de inflamacion y composiciones para dicho tratamiento
MXPA04008870A (es) 2002-03-13 2005-06-17 Biogen Idec Inc Anticuerpos anti-avb6.
WO2003087340A2 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
EP1511738A4 (en) 2002-05-17 2007-05-09 Scios Inc TREATMENT OF FIBROPROLIFERATIVE DISEASES USING TGF BETA INHIBITORS
AU2003298783B2 (en) 2002-11-26 2010-11-04 Abbvie Biotherapeutics Inc. Chimeric and humanized antibodies to alpha5beta1 integrin that modulate angiogenesis
US20040253311A1 (en) 2002-12-18 2004-12-16 Roger Berlin Multi-layer tablet comprising non-steroidal anti-inflammatory drugs, decongestants and non-sedating antihist amines
RU2388472C2 (ru) 2003-10-01 2010-05-10 Мерк Патент Гмбх Антагонисты альфаvбета3 и альфаvбета6 интегринов в качестве антифибротических агентов
JP4628365B2 (ja) 2003-11-04 2011-02-09 ニツポネツクス・インコーポレーテツド 免疫組織化学的方法
CN102875681A (zh) 2005-07-08 2013-01-16 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗-αvβ6抗体及其用途
CN101563105B (zh) 2006-07-10 2013-01-23 拜奥根Idec马萨诸塞公司 用于抑制smad4-缺陷癌症的组合物和方法
CA2665885A1 (en) 2006-10-19 2008-12-04 The Regents Of The University Of California Treatment and prevention of chronic asthma using antagonists of integrin .alpha.nu.beta.6
GB0803192D0 (en) 2008-02-22 2008-04-02 Mubio Products Bv SCLC biomarker panel
EP2706358A3 (en) 2008-12-23 2014-05-07 Merck Patent GmbH Biomarkers for inhibitors with anti-angiogenic activity
US20140045915A1 (en) 2010-08-31 2014-02-13 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
ES2875535T3 (es) 2012-03-29 2021-11-10 Biogen Ma Inc Biomarcadores para su uso en aplicaciones de terapia de integrina

Also Published As

Publication number Publication date
HK1213007A1 (zh) 2016-06-24
IS7443A (is) 2004-09-09
US20120251532A1 (en) 2012-10-04
EP2287199A3 (en) 2011-05-25
BRPI0308585B1 (pt) 2019-10-15
AU2003261071A1 (en) 2003-12-12
EP2287198A3 (en) 2011-05-25
US20150140609A1 (en) 2015-05-21
CL2010000788A1 (es) 2011-02-18
IL225633A0 (en) 2014-03-31
AR038970A1 (es) 2005-02-02
JP2015091807A (ja) 2015-05-14
PL372662A1 (pl) 2005-07-25
MY154009A (en) 2015-04-30
AU2003261071B2 (en) 2008-05-15
IL225633B (en) 2021-12-01
HK1074381A1 (en) 2005-11-11
EA200401198A1 (ru) 2005-04-28
CN102924598B (zh) 2014-12-31
NZ535425A (en) 2008-05-30
NZ563951A (en) 2009-04-30
KR20040095281A (ko) 2004-11-12
JP2009100763A (ja) 2009-05-14
KR101098109B1 (ko) 2011-12-26
US20090186036A1 (en) 2009-07-23
EP1490110A2 (en) 2004-12-29
JP2005528099A (ja) 2005-09-22
CL2010000791A1 (es) 2011-02-18
BR0308585A (pt) 2005-02-01
IL164021A0 (en) 2005-12-18
US8153126B2 (en) 2012-04-10
CN102659946A (zh) 2012-09-12
CL2010000790A1 (es) 2011-02-18
EP2336185A1 (en) 2011-06-22
US9745376B2 (en) 2017-08-29
WO2003100033A2 (en) 2003-12-04
CN1646160A (zh) 2005-07-27
CL2010000792A1 (es) 2011-02-18
IL164021A (en) 2013-04-30
EP2287198A2 (en) 2011-02-23
NO20044347L (no) 2004-12-13
JP4473117B2 (ja) 2010-06-02
CL2010000786A1 (es) 2011-02-18
CA2478833C (en) 2015-11-10
WO2003100033A3 (en) 2004-07-15
ME00804B (me) 2012-03-20
RS52488B (sr) 2013-02-28
MXPA04008870A (es) 2005-06-17
MY147019A (en) 2012-10-15
CN104805090A (zh) 2015-07-29
JP2013014592A (ja) 2013-01-24
EP2287199B1 (en) 2017-08-02
EP2287199A2 (en) 2011-02-23
CL2010000789A1 (es) 2011-02-18
US20050255102A1 (en) 2005-11-17
NO334834B1 (no) 2014-06-16
US7465449B2 (en) 2008-12-16
BRPI0308585B8 (pt) 2021-05-25
AU2003261071C1 (en) 2008-12-11
JP2012228269A (ja) 2012-11-22
EP1490110B1 (en) 2012-06-13
EP1490110A4 (en) 2006-12-27
CA2478833A1 (en) 2003-12-04
CL2010000785A1 (es) 2011-02-18
PL216223B1 (pl) 2014-03-31
EA011853B1 (ru) 2009-06-30
CL2010000787A1 (es) 2011-02-11
ES2389037T3 (es) 2012-10-22
JP5616932B2 (ja) 2014-10-29
CN102924598A (zh) 2013-02-13
JP2015126743A (ja) 2015-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101098109B1 (ko) 항αｖβ6 항체
CN100509851C (zh) 抗αvβ6抗体
HK1154610A (en) Anti-alpha v beta 6 antibodies
HK1154609A (en) Anti-alpha v beta 6 antibodies
HK1159134A (en) Anti-alpha v beta 6 antibodies
HK1074381B (en) Anti-alpha v beta 6 antibodies
HK1154610B (en) Anti-alpha v beta 6 antibodies