RS89204A - Upotreba osteoprotegerina za lečenje i/ili prevenciju fibrozne bolesti - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu osteoprotegerina za lečenje i/ili prevencijufibroznih bolesti, posebno skleroderme.

Description

UPOTREBA OSTEOPROTEGERINA ZA LEČENJE I/ ILI PREVENCIJU

FIBROZNE BOLESTI

POLJE TEHNIKE

Ovaj pronalazak je iz oblasti fibroznih bolesti i poremećaja vezivnog tkiva. Preciznije, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu osteoprotegerina za lečenje i/ili prevenciju fibroznih bolesti, posebno skleroderme. Kombinacije osteoprotegerina sa interferonom, nekim antagonistom TNF ili nekim drugim anti-fibroznim agensom kao što je SARP-1 takođe spadaju u delokrug ovog pronalaska.

STANJE TEHNIKE

Fibroza je stanje koje je povezano sa prekomernom produkcijom kolagena npr. u unutrašnjim organima, uključujući bubrege, srce, pluća, želudac i zglobove.

Fibroza pluća je jedno od predominantnih fibroznih oboljenja. Idiopatsku fibrozu pluća (IPF) karakteriše hronična inflamacija alveolarnih zidova sa progresivnom fibrozom nepoznate etiologije. IPF ili kriptogeni fibrozirajući alveolitis, izaziva 50 do 60% slučajeva idiopatskog intersticijalnog oboljenja pluća.

Uobičajena intersticijalna pneumonija (UIP) - specifični histopatološki obrazac intersticijalne pneumonije, je klasični obrazac koji se nalazi pri biopsiji pluća kod IPF. Pri malom uvećanju, tkivo izgleda heterogeno sa površinama normalnog plućnog tkiva, intersticijalne inflamacije, fibiroze i tkiva u vidu saća koje se smenjuju. Intersticijalna inflamacija se sastoji od alveolarnog septalnog infiltrata limfocita, ćelija plazme i histiocita udruženih sa hiperplazijom pneumocita tipa II. Fibrozne zone se uglavnom sastoje od gustog acelularnog kolagena, iako se mogu videti rasuti fokusi proliferativnih fibroblasta (fibroblastni fokusi), koji predstavljaju mesta rane i aktivne bolesti, posebno na intraiaveoiarnim iokacijama. Površine u vidu saća se sastoje od vazdušnih prostora cistične fibroze koji su često presvučeni bronhionalnim epitetom i ispunjeni mukusom. Neutrofili mogu da se nakupljaju u mukusu. Često dolazi do hiperplazije glatkih mišića u oblastima zahvaćenim fibrozom i sa saćastim izgledom. Subpleuralna i paraseptalna distribucija kao i mrljast karakter i privremena heterogenost su karakteristike koje najviše pomažu identifikaciju UIP.

Identičan obrazac intersticijalne inflamacije i fibroze javlja se kod kolagenih vaskularnih poremećaja, (npr., RA, SLE, progresivna sistemska skleroza, mešovita bolest vezivnog tkiva, dijabetes mellitus), pneumokonioza (npr. azbestoza), povreda izazvane zračenjem i određenih bolesti pluća izazvanih lekovima (npr., nitrofurantoinom).

Klinički tok IPF je progresivan; srednje preživljavanje je 4 do 6 godina posle dijagnoze. Prednizon je uobičajeni lek koji se koristi u terapiji kod IPF. Odgovor na tretman je različit, ali kod pacijenata u ranijoj fazi bolesti u celularnijem stadijumu pre neko što dođe do predominantnog stvaranja ožiljaka, kako izgleda, postoji veća verovatnoća za poboljšanje stanja pri korišćenju kortikosteroida ili citotoksične terapije. Terapija podrške i palijativna terapija uključuje davanje 02u visokim koncentracijama kako bi se ublažila hipoksemija a ukoliko dođe do bakterijske infekcije daju se antibiotici. Transplantacija pluća je uspešna kod pacijenata u terminalnoj fazi bolesti pluća.

Fibroza pluća je u vezi sa akumulacijom vezivnog tkiva u jetri koje je rezultat disbalansa u proizvodnji i degradaciji ekstracelularne matrice sa naglašenim kolapsom i kondenzacijom prethodno postojećih vlakana.

Fibroza jetre je čest odgovor na hepatocelularnu nekrozu ili povredu koju može da izazove širok spektar različitih agenasa, npr., bilo koji proces koji remeti hepatičku homeostazu (posebno inflamacija, toksična povreda ili izmenjeni protok krvi kroz jetru) i infekcije jetre (virusne, bakterijske, gljivične i parazitske). Brojni poremećaji deponovanja koji su posledica urođenih metaboličkih grešaka često su udruženi sa fibrozom, uključujući i abnormalnosti lipida, (Gošeova bolest); poremećaje deponovanja glikogena (posebno tipovi III, IV, VI, IX, i X); nedostatak o^-antitripsina; deponovanje egzogenih supstanci, koje se viđa kod sindroma preopterećenja gvožđem (hematohromatoza) i poremećaji deponovanja bakra (Vilsonova bolest); akumulacija toksičnih metabolite (kao kod tirozinemije, fruktozemije i galaktozemije); i peroksizomalni poremećaji (Zelvegerov sindrom). Brojne hemikalije i tekovi izazivaju fibrozu, posebno alkohol, metotreksat, izonijazid, oksifenizatin, metildopa, hlorpromazin, tolbutamid i amiodaron. Poremećaji

hepatičke cirkulacije (npr, hronična insuficijenciju srca, Budd-Chiari sindrom, veno-

okluzivna bolest, tromboza portalnih vena) kao i hronična opstrukcija bilijarnog protoka mogu da dovedu do fibroze. Na kraju, hepatička fibroza je jedna autozomna recesivna mallformacija.

Normalna jetra se sastoji od hepatocita i sinusoida distribuiranih unutar ekstracelularne matrice sastavljene od kolagena (predominantno tipova I, III, i IV) i nekolagenih proteina, uključujući glikoproteine (npr. fibronektin, laminin) i nekoliko proteoglikana (npr. heparan sulfat, hondroitin sulfat, dermatan sulfat, hijaluronat). Fibroblasti koji se normalno nalaze samo u portalnim traktovima, mogu da proizvode kolagen, velike glikoproteine i proteoglikane.

Druge ćelije jetre (posebno hepatociti i Kupffeove ćelije koje deponuju masnoće i endotelijalne ćelije) takođe mogu da proizvode komponente ekstracelulalrnog matriksa. Ćelije koje deponuju masti, locirane ispod sinusoidnog endotela u Disseovom prostoru predstavljaju prekursore fibroblasta i one mogu da se proliferišu i proizvode višak ekstracelularne matrice. Razvoj fibroze usled aktivnog deponovanja kolagena je posledica povrede ćelija jetre, posebno nekroze i inflamatornih ćelija. Precizni faktori koji se oslobađaju iz ovih ćelija nisu poznati, ali verovatno je da u tome učestvuje jedan ili više citokina ili produkata peroksidacije lipida. Kupferove ćelije i aktivirani makrofagi produkuju inflamatorne citokine. Nekrotični fibroblasti se formiraju oko nekrotičnih ćelija jetre; povećana sinteza kolagena dovodi do stvaranja ožiljaka. Fibroza može da nastane iz aktivne fibrogeneze kao i usled oslabljene degradacije normalnog ili izmenjenog kolagena. Ćelije koje deponuju masti, Kupferove ćelije i endotelijalne ćelije su važne za klirens kolagena tipa I, nekoliko proteoglikana i denaturisane kolagene. Promena aktivnosti ovih ćelija može da modifikuje obim fibroze. Za histopatologa, fibrozno tkivo može da postane očiglednije od pasivnog kolapsa i kondenzacije prethodno postojećih vlakana.

To znači da povećana sinteza ili smanjena degradacija kolagena dovode do aktivnog deponovanja prekomernog vezivnog tkiva, što utiče na funkciju jetre: (1) Pericelularna fibroza oštećuje ishranu ćelija i dovodi do hepatocelulalrne atrofije. (2) Unutar Disseovih prostora, fibrozno tkivo se akumulira oko sinusoida i opstruira slobodan prolazak supstanci iz krvi u hepatocite. (3) Fibroza oko hepatičkih venula i portalnih traktova remeti hepatički protok krvi. Venski otpor u jetri se povećava od ogranaka portne vene do sinusoida i na kraju do hepatičkih vena. Sva ova tri puta mogu biti zahvaćena.

Fibrozne trake koje povezuju portaine traktove sa centralnim venama takođe stimulišu anastomotske kanale: Arterijska krv, koja zaobilazi normalne hepatocite prolazi do eferentniuh hepatičkih vena, što dalje oštećuje funkciju jetre i može da potencira hepatocelularnu nekrozu. Obim u kome su ovi procesi prisutni određuje izraženost disfunkcije jetre: npr. kod kongenitalne fibroze jetre, velike fibrozne trake pretežno zahvataju portaine regione a hepatički parenhim je obično pošteđen. Kongenitalna fibroza jetre se tako ispoljava kao portalna hipertenzija sa očuvanom hepatocelulalrnom funkcijom.

Skleroderma je bolest vezivnog tkiva koju karakteriše fibroza kože i unutrašnjih organa, što dovodi do prestanka rada organa i smrti (Black et al., 1998; Clements i Furst, 1996). Skleroderma ima čitav spektar manifestacija i različite terapijske implikacije. Ona obuhvata lokalizovanu sklerodermu, sistemsku sklerozu, poremećaje nalik na skelrodermu i Sineovu sklerodermu (Smith, 2000). Dok je lokalizovana skleroderma retko dermatološko oboljenje udruženo sa fibrozom čije su manifestacije ograničene na kožu, sistemska skleroza je multisistemsko oboljenje sa različitim rizikom za zahvatanje unutrašnjih organa i različitom zahvaćenošću kože. Sistemska skleroza može biti difuzna ili ograničena Ograničena sistemska skleroza se takođe naziva i KREST (kalcinoza, Ravnaudova disfunkcija ezofagusa, sklerodaktilija, teleangiektazije). Smatra se da su poremećaji nalik na skelrodermu u vezi sa izlaganjem industrijskom okruženju. Kod Sineove bolesti, postoji zahvaćenost unutrašnjih organa bez promena na koži.

Najvažnije manifestacije skleroderme a posebno sistemske skleroze uključuju neodgovarajuću, prekomernu sintezu kolagena i deponovanje, endotelijalnu disfunkciju, spazam, kolaps i obliteraciju usled fibroze.

Skleroderma je retka bolest sa stabilnom incidencom od približno 19 slučajeva na milion osoba. Uzrok skleroderme nije poznat. Medjutim, genetska predispozicija je važna. Abnormalnosti zahvataju autoimunitet i alteraciju endotelijalne ćelije i funkcije fibroblasta. Naravno, sistemska skleroza je verovatno najteža autoimuna bolest sa zabeleženim mortalitetom od 50% u roku od 5 godina posle dijagnoze. (Silman, 1991).

Što se tiče dijagnoze, važan klinički parametar je zadebljavanje kože proksimalno od metakarpofalangealnih zglobova. Ravnaudov fenomen je česta, skoro univerzalna komponenta skleroderme. On se dijagnostikuje na osnovu promene boje kože pri izlaganju hladnoći. Ishemija i zadebljavanje kože su simptomi Ravnaudove bolesti.

implicirano je da nekoiiko osnovnih bioloških procesa utiče na iniciranje, težinu i progresiju ove bolesti a tu spadaju vaskularna disfunkcija, aktivacija endotelijalnih ćelija i njihovo oštećenje, akumulacija leukocita, produkcija auto-antitela i što je ključno, nekontrolisani fibrotični odgovor koji može da dovede do smrti (Clements i Furst, 1996). Fibroblasti imaju ključnu ulogu u patogenezi ove bolesti. Primarni fibroblasti dobijeni od pacijenata sa sklerodermom ispoljavaju mnoga karakteristična svojstva ove bolesti in vivo, posebno povećanu sintezu ekstracelulalrnog matriksa i deponovanje, posebno

kolagena i fibronektina kao i izmenjenu produkciju faktora rasta i citokina kao što su TGF(3 i CTGF (Strehlow i Kom, 1998 i LeRoy, 1974).

Za skelrodermu nema kurativnog tretmana. Jedna inovativna ali visoko rizična terapija podrazumeva transplantaciju autolognih matičnih ćelija (Martini et al., 1999). Preciznije, trenutno nema terapije za sklerodermu koja bi bila usmerena na fibrozni proces. (Wigley i Boling, 2000).

Identifikacija gena udruženih sa rizikom od bolesti i progresijom skleroderme može da dovede do razvoja efektivnih strategija za intervencija u različitim stadijumima ove bolesti.

Osteoprotegerin (OPG) je prvi put identifikovan 1997. godine kao novi citokin koga luče fibroblasti. (Simonet et al., 1997). Humani OPG je protein 401 amino kiseline i on sadrži signalni peptid 21 amino kiseline, koji se čepa pre glutaminske kiseline 22 inicirajući zreli protein 380 amino kiselina. To znači da je OPG solubilni protein. On je član porodice TNF receptora (Morinaga et al., 1998, Yasuda et al., 1998), i on obuhvata četiri domena nalik na TNFR bogata cisteinom na svom N-terminalnom kraju. (Simonet et al., 1997). Pokazano je da OPG igra određenu ulogu u razvoju kostiju, a miševi kojima je nedostajao OPG gen imali su osteoporotičan fenotip i makroskopske skeletne abnormalnosti. (Min et al., 2000).

Osteoprotegerin, koga proizvode osteoblasti i stromalne ćelije koštane srži nema transmembranski domen i ponaša se kao sekretovani receptor mamac koji nema direktnu signalnu sposobnost. OPG deluje vezivanjem svog prirodnog liganda sa ligandom osteoprotegerina (OPGL), koji je takođe poznat kao RANKL (receptorski aktivator NF-kappaB liganda). Vezivanje OPG i OPGL sprečava da OPGL aktivira svoj srodnički receptor RANK, koji je osteoklastni receptor vitalan za diferencijaciju osteoklasta, aktivaciju i preživljavanje.

Humani OPG je čian porodice TNFR i to je gen sa jednom kopijom koji se sastoji od 5 eksona i obuhvata 29 kb genoma (Simonet et al., 1997). Rekombinantni OPG postoji u monomernim i dimernim oblicima očigledne molekularne težine od 55 odnosno 110 kDa, (Simonet et al., 1997). Zasecanje N-terminalnog domena cisteina 185 dovodi do inaktivacije, najverovatnije zbog disrupcije SS3 disulfidne veze domena nalik na TNFR, dok zasecanje C-terminalnog dela proteina amino kiseline 194 nije izmenilo biološku aktivnost. To znači da je N-terminalni domen OPG nalik na NFR dovoljan da bi se sprečila osteoklastogeneza (Simonet et al., 1997).

Prekomerna ekspresija OPG kod transgenih miševa dovodi do duboke osteopetroze koja je posledica skoro potpunog nedostatka osteoklasta. Suprotno tome, ablacija OPG gena izaziva tešku osteoporozu kod miševa. Ablacija OPGL ili RANK takođe izaziva duboku osteoporozu, što ukazuje na značajnu fiziološku ulogu ovih proteina u regulaciji resorpcije kosti. Sekreciju OPG i OPGL iz osteoblasta i stromalnih ćelija regulišu brojni hormoni i citokini, često na recipročan način. Relativni nivoi produkcije OPG i OPGL kako se veruje, definitivno diktiraju obim resorpcije kosti. Višak OPGL povećava resorpciju kosti dok višak OPG inhibira resorpciju. Primarni fibroblasti OPG blokiraju efekte praktično svih faktora koji stimulišu osteoklaste in vitro i in vivo. OPG takođe inhibira resorpciju kosti kod različitih bolesti na životinjskim modelima, uključujući i osteoporozu izazvanu ovarijektomijom, humeralnu hiperkalcemiju kod maligniteta i eksperimentalne metastaze na kostima. Stoga, OPG može da predstavlja efikasnu terapijsku opciju kod bolesti koje su udružene sa prekomernom aktivnošću osteoklasta (Kostenuik i Shalhoub, 2001).

Medjutim, još uvek nije utvrđeno da li osteoprotegerin ima veze sa fibroznim bolestima.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva na nalazu da administracija osteoprotegerina dovodi do značajnog ublažavanja bolesti na ustanovljenom životinjskom modelu fibroze pluća. Fibroza pluća je jedna od manifestacija skleroderme.

To znači da je primarni cilj ovog pronalaska upotreba osteoprotegerina za pripremu medikamenta za lečenje i/ili prevenciju fibroznih bolesti, posebno skleroderme. Drugi cilj ovog pronalaska je upotreba osteoprotegerina koga eksprimiraju ćelije ili nekog vektora ekspresije koji sadrži kodirajuću sekvencu osteoprotegerina, za pripremu medikamenta za lečenje i/ili prevenciju neke fibrozne bolesti, posebno sistemske skieroze. Farmaceutski sastavi koji sadrže osteoprotegerin i druge anti-fibrozne lekove, kao što je halofuginon i metode za lečenje koje podrazumevaju administraciju osteoprotegerina u ljudsko telo takođe spadaju u domen ovog pronalaska.

KRATAK OPIS CRTEŽA

SI. 1 Ekspresija OPG mRNK u normalnim (hečovane) i obolelim (horizontalno hečovane)

fibroblastima 6 pacijenata sa sklerodermom koja je utvrđena mikroerej analizom

gena sa filterom. Srednji nivo ekspresije je dat pod (a) dok je srednja vrednost

data pod (b).

SI. 2 PCR analiza mRNK OPG u stvarnom vremenu kod 9 pacijenata sa sklerodermom.

Rezultati su kod svakog pacijenta izraženi u vidu odnosa ekspresije mRNK OPG u fibroblastima sa lezijama/bez lezija.

SI. 3 Ekspresija OPG mRNK u biopsijama kože sa lezijama/bez lezija uzetim od 5

pacijenata sa sklerodermom određena je na osnovu PCR u stvarnom vremenu. Stubići označavaju srednju vrednost ekspresije kod svake grupe.

SI. 4 VVestem blot analiza ekspresije OPG u oštećenim i normalnim fibroblastima kože.

Fibroblasti sa lezijama(A1-A4) i normalni fibroblasti (N1-N4). Strelice na levoj strani gela pokazuju položaj nativnog OPG (jedan 55 kDa monomer) i njegov dimerni oblik (110 kDa). OPG Fc fuzioni protein (kupljen od R&D svstems) korišćen je kao pozitivna kontrola za ovo antitelo.

SI. 5 Efekat OPG na sintezu kolagena kod AG1518 humanih fibroblasta. AG1518 ćelije su bile potpuno netretirane ili prethodno tretirane sa 10, 20 ili 40 ng/ml OPG tokom 24 h, ili sa 40 ng OPG + anti OPG neutrališućim monoklonalnim antitelom (1 ng/ml) ili samo sa anti OPG neutrališućim monoklonim antitelom i potom sa 2 ng/ml TGFpl tokom 24 h. Sinteza kolagena je utvrđivana uz pomoć ELISA. Rezultati predstavljaju srednju vrednost tri određivanja + S.E.M.

SI. 6 Efekat transfekcije OPG na sintezu a2 kolagena tip 1 kod humanih primarnih fibroblasta (OBHC ćelije). Transfekcija OBHC ćelija je urađena sa pcDNA3.1/OPG (OPG) ili samo sa pcDNA3.1 (lažni) kako je opisano u metodama. Kolagen je u kondicioniranom medijumu meren 24 h posle tretmana TGF(31 uz pomoć ELISA. Rezultati predstavljaju srednju vrednost tri određivanja

+ S.E.M.

SI. 7A: Efekat OPG na promotersku aktivnost kolagena<g>2 tip 1 u fibroblastima mišjeg embriona. Izvršena je transfekcija fibroblasta mišjeg embriona (7iS3 ćelije) sa pGL3 vektorom koji sadrži 3.5 kb promotera kolagena 1a2 koji je povezan sa luciferazom cDNK. Posle transfekcije, ćelije su prenete u svež medijum i potom nisu tretirane (kontrola) ili su tretirane samo sa halofuginonom (10"<1>° M) (HF); TGFpl (5 ng/ml) (TGFpl); ili TGFpl (5 ng/ml) + HF (108 M) (HF+TGFp1) tokom 12 h korišćenjem rastućih koncentracija osteoprotegerina. Rezultati predstavljaju srednju vrednost tri merenja.<*>označava P<0.05 a<**>označava P<0.01.

SI. 7B pokazuje obim ekspresije datog gena pod CTGF promoterom posle inkubacije uz

korišćenje samog TGFp ili u kombinaciji sa različitim količinama OPG.

SI. 8 PCR analiza obrnute transkriptaze osteoprotegerina mRNK poslein vitrotretmana fibroblasta sa lezijama/bez lezija od pacijenata sa sklerodermom sa halofuginonom. Jedan % prebojenog agaroza - etidijum bromid gela pokazuje proizvode RT PCR reakcije za osteoprotergin (gore) i GAPDH (dole) na fibroblastima sa lezijama (sufiks A), i bez lezija (sufiks N).

SI. 9 Efekatin vivoadministracije osteoprotegerina na razvoj fibroze pluća kod miševa tretiranih bleomicinom. A: Promena telesne mase miševa posle tretmana osteoprotegerinom. Rezultati su izraženi kao srednja masa u g/grupi koja je merena svakoga dana posle intrateklane instilacije bleomicina. B: Mortalitet usled administracije bleomicina. Rezultati su izraženi kao procenat broja smrti po grupi

od 10 životinja.

SI. 10 Efekatin vivoadministracije osteoprotegerina na razvoj fibroze pluća kod miševa tretiranih bleomicinom. A: Obim fibroze u plućima meren 12 dana posle administracije bleomicina. Pluća su prebojavana trihromom. Rezultati su izraženi kao % reprezentativnog lobusa pluća zahvaćenog fibrozom za svaku životinju koja je preživela. B: Obim deponovanja kolagena u plućima meren 12 dana posle administracije bleomicina. Sadržaj hidroksiprolina je meren u reprezentativnom lobusu pluća koji je uzet od svake životinje koja je preživela.

OPIS OVOG PRONALASKA

U skladu sa ovim pronalaskom, DNK genska mikroarej tehnologija je korišćena za identifikaciju različitih eksprimiranih gena u fibrobalstima kože iz fibroznih lezija dobijenih od pacijenata sa sistemskom sklerozom (skleroderma) u poređenju sa fibrobalstima normalne kože istih pacijenata. Jedan gen, koji je bio konzistentno nizlazno regulisan kod fibrobalsta sa sklerodermom bio je osteoprotegerin (OPG), koji se takođe naziva inhibitorni faktor osteoklastogeneze. Abnormalni fiobroblasti su eksprimirali značajno niže nivoe OPG mRNK u poređenju sa normalnim fibrobalstima kod 7 od 9 testiranih pacijenata. Ovi rezultati su potvrđeni PCR analizom u stvarnom vremenu. Osim toga, RT-PCR analiza u stvarnom vremenu ukupne RNK izolovane iz celokupnih bioptičkih uzoraka abnormalne kože pacijenata sa sklerodermom ukazala je na niže nivoe OPG mRNK u poređenju sa klinički normalnim kontrolnim biopsijama usklađenim po pitanju starosti, pola i anatomskog mesta. OPG protein je takođe bio smanjen kod fibroblasta sa lezijama u odnosu na normalne fibroblaste izolovane od istih pacijenata.In vitro,OPG može da smanji sintezu kolagena posreduvanu sa TGFp posle transfekcije fibroblasta sa OPG cDNK ili posle tretmana rekombinantnim proteinom. Još jednain vitroaktivnost OPG je inhibicija ekspresije faktora rasta vezivnog tkiva (CTGF) koja je izazvana sa TGFp. CTGF normalno indukuje sintezu komponenata ekstracelularnog matriksa u fibroblastima.

Oviin vitropodatci su dalje potkrepljeniin vivopodatcima dobijenim na jednom ustanovljenom životinjskim modelu. Administracija osteoprotegerina smanjila je fibrozu pluća i umanjila deponovanje kolagena na modelu fibroze pluća izazvane bleomicinom.

Na histološkom nivou, pluća životinja tretiranih osteoprotegerinom liče na pluća netretiranih naivnih miševa.

Stoga, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu supstance za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju neke fibrozne bolesti, što je naznačeno time da je ta supstanca odabrana među grupom koja se sastoji od: a) Polipeptid koji sadrži SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; b) Polipeptid koji sadrži amino kiseline 22 do 401 SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; c) Polipeptid koji sadrži jedan, dva, tri ili četiri domena osteoprotegerina bogata cisteinom; d) Polipeptid koji sadrži amino kiseline 22 do 194 SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; e) Bilo kog muteina od (a) do (d), naznačen time da sekvenca amino kiselina ima najmanje 40 % ili 50 % ili 60 % ili 70 % ili 80 % ili 90 % identičnost u odnosu na najmanje jednu od sekvenci u (a) do (d); f) Mutein, bilo koji od (a) do (d) koga enkodira DNK sekvenca koja se hibridizuje u komplement DNK sekvence koja kodira sve od (a) do (d) pod umereno strogim uslovima ili pod veoma strogim uslovima; g) Mutein, bilo koji od (a) do (d) naznačen time da su sve promene sekvence amino kiselina konzervativne supstitucije amino kiselina u sekvencama amino kiselina u (a) do (d); h) So ili neki izoform, fuzionisani protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili cirkularno permutovani derivat bilo čega od (a) to (g).

Stručnjaku iz ove oblasti će biti jasno da, u skladu sa ovim pronalaskom, supstance koja stimuliše oslobađanje ili potencira aktivnost endogenog osteoprotegerina se može isto tako koristiti za lečenje i/ili prevenciju fibrozne bolesti, posebno skleroderme. Pomenuta supstanca može biti sam zreli osteoprotegerin ili bilo koji fragment osteoprotegerina koji se vezuje za OPGL i time sprečava da se OPGL vezuje za RANK i sprečava iniciranje signalizacije preko RANK. Takva supstanca može biti npr. neko antitelo usmereno na OPGL. Poznato je da se OPG vezuje za OPGL a data interakcija sprečava vezivanje OPGL za njegovu receptorsku RANK. Stoga će stručnjaku iz ove oblasti biti jasno da će bilo koja supstanca koja sprečava vezivanje OPGL za njegovu receptorsku RANK, ili bilo koji agens koji blokira aktivnost RANK ili signalizaciju imati istu aktivnost kao i osteoprotegerin u prevenciji i/ili tretmanu fibrozne bolesti, posebno skleroderme. Agens koji blokira vezivanje OPGL za RANK mogu biti na primer antagonistička antitela usmerena na OPGL. Agens koji blokira aktivnost RANK mogu takođe biti na primer antagonistička antitela usmerena na RANK. Dodatni agens koji blokira interakciju OPGL/RANK mogu biti na primer hemijska jedinjenja koja utiču na međusobno vezivanje ova dva proteina, ali isto tako i bilo koji drugi hemijski ili biološki inhibitor signalizacije preko RANK receptora.

Celokupna dužina cDNK humanog osteoprotegerina je klonirana i prikazana kao SEQ ID NO: 1 na listi sekvenci koja je u prilogu. Odgovarajuća sekvenca amino kiselina je data kao SEQ ID NO: 2 na listi sekvenci koja je u prilogu. Ove sekvence su opisane na adresi www.ncbi.nlm.nih.gov pod AB_008821, kao i od strane Morinaga et al. (1998). Izoform ili polimorfni oblik osteoprotegerina opisali su Simonet et al. (1997). cDNK prema Simonet et ai. (1997) označena je kao SEQ iD NO: 3 na i isti sekvenci koja je u prilogu, a odgovarajuća sekvenca amino kiselina je data kao SEQ ID NO: 4. Obe sekvence se takođe mogu naći na www.ncbi.nlm.nih.gov pod U94332. Jedina razlika između proteina koje su našli Morinaga et al. i Simonet et al. odnosi se na poziciju amino kiseline 263, koja može biti aspartanska kiselina odnosno alanin.

Termin "osteoprotegerin", u smislu u kome je ovde korišćen, odnosi se na bilo koju supstancu razmatranu gore pod (a) do (h).

Termin "lečenje i/ili prevencija " u smislu u kome je ovde korišćen obuhvata svako slabljenje, smanjenje ili delimičnu, značajnu i potpunu prevenciju ili blokadu formiranja, razvoja i progresije bolesti ili formiranja, razvoja i progresije jednog ili više ili svih simptoma date bolesti.

Termin "fibrozna bolest" u smislu u kome je ovde korišćen odnosi se na bolesti koje obuhvataju fibrozu, koja može na primer da bude posledica hronične inflamacije ili oporavka ili reorganizacije tkiva. Fibroza može da zahvati bilo koji organ u ljudskom telu, kao što su npr. koža, pluća, pankreas, jetra ili bubrezi. To znači da se ovaj pronalazak takođe odnosi na lečenje i/ili prevenciju fibroznih bolesti kao što su ciroza jetre, intersticijalna fibroza pluća, Dipitrenova kontraktura, keloid ili druge abnormalnosti kod stvaranja ožiljaka ili kod rana, postoperativne adhezije i reaktivna fibroza kao i hronična srčana insuficijencija, posebno posle infarkta miokarda. Dalje u bolesti ili poremećaje koji se mogu lečiti osteoprotegerinom spadaju bolesti udružene sa zarastanjem rana, posebno zarastanje rana na plućima što uključuje hroničnu upalu pluća i na kraju fibrozu i stvaranje ožiljaka na površini pluća. U poremećaje koji podrazumevaju upalu pluća spadaju idiopatska fibroza pluća, sarkoidoza, bronhopulmonarna displazija, fibroproliferativni ARDS, kao i plućne manifestacije ili sistemske bolesti kao što je reumatoidni artritis. (Krein et al., 2001).

Fibroza generalno uključuje stvaranje ili proliferaciju vezivnog tkiva, koje zamenjuje funkcionalno specijalizovano tkivo datog organa. Stoga, prema jednom preferentnom konceptu ovog pronalaska, fibrozna bolest je bolest vezivnog tkiva.

Prema jednom preferentnom konceptu, ta fibrozna bolest je skleroderma.

Termin "skleroderma" u smislu u kome je ovde korišćen odnosi se na bolest koja se takođe naziva sistemska skleroza ili sistemska skleroderma. Ovi termini se koriste kao sinonimi u ovom zahtevu za patent. Sistemska skleroza je hronična bolest čiji uzrok nije poznat a koju karakterišu difuzna fibroza, degenerativne promene i vaskularne abnormalnosti na koži, zglobnim strukturama i unutrašnjim organima (posebno na ezofagusu, gastrointestinalnom traktu, plućima, srcu i bubrezima, na primer). Ona može biti lokalizovana ili mešovita, sistemska, ograničena ili difuzna.

Termin "skleroderma" se preferentno odnosi na lokalizovanu, sistemsku, ograničenu i difuznu sklerodermu kao i na sindrome koji se preklapaju.

Lokalizovana skleroderma primarno zahvata kožu ali takođe može da zahvati i mišiće i kosti ispod nje. Međutim, ona generalno ne zahvata unutrašnje organe. Lokalizovana skleroderma je relativno blaga i može biti povezana sa sistemskom sklerodermom po pitanju sličnih površinskih simptoma, kao što je izgled biopsije kože pod mikroskopom.

Sistemska skleroderma obuhvata nekoliko tipova simptoma ili grupa simptoma, kao što je CREST, ograničeni i difuzan. Ona se takođe može nazvati progresivnom sistemskom sklerozom ili porodičnom progresivnom sistemskom sklerozom. Sistemska skleroderma može da zahvati npr. kožu, krvne sudove i/ili unutrašnje organe. Kada zahvati kožu ona dovodi do otvrdnjavanja kože, najčešće kože ruku i/ili lica. Kada zahvati krvne sudove, ona može da izazove Ravnaudovu bolest. Najteži oblici sistemske skleroze zahvataju unutrašnje organe i mogu da izazovu invaliditet ili čak smrt. Između ostalog, sistemska skleroza obuhvata: sklerodermalnu bolest pluća, sklerodermalnu bubrežnu krizu, manifestacije na srcu, slabost mišića, uključujući zamor ili ograničeni CREST, gastrointestinalnu nepokretnost ili spazam kao i abnormalnosti centralnog, perifernog i autoimunog nervnog sistema. Što se tiče abnormalnosti nervnog sistema, najčešći su sindrom karpalnog tunela i zatim trigeminalna neuralgija.

Ograničena skleroderma može npr. da bude ograničena na ruke, iako lice i vrat mogu takođe da budu zahvaćeni.

Difuzna skleroderma uključuje zadebljavanje kože i javlja se takođe iznad ručnih zglobova (ili laktova). Postoji nekoliko pod-kategorija difuzne sistemske skleroze, kao što je "skleroderma bez skleroderme" kod koje postoji fibroza unutrašnjih organa ali bez otvrdnjavanja kože i porodična progresivna sistemska skleroza, redak oblik ove bolesti koja se javlja u porodicama.

Sindromima koji se preklapaju se nazivaju stanja kod kojih pacijenti sa sklerodermom takođe imaju i neku drugu autoimunu bolest (kao što su lupus, reumatoidni artritis, itd.), kao što je to naprimer difuzna skleroderma kod preklapanja sa lupusom. Simptomi skleroderme takođe mogu da budu deo mešovite bolesti vezivnog irviva (ivio i u], ni i icuiierenoncine uuicau ve^ivi iug iKiva ( u\* > i \- >).

Termin "osteoprotegerin" u smislu u kome je ovde korišćen, odnosi se na jedan protein koji obuhvata celu ili deo sekvence SEQ ID NO: 2 ili 4 (obe humane) iz liste sekvenci koja je priložena, kao i na soli, izoforme, muteine, aktivne frakcije, funkcionalne derivate i njihove cirkularno permutovane derivate. OPG drugih vrsta osim humanog kao što je OPG miševa ili pacova, može se koristiti u skladu sa ovim pronalaskom, sve dok postoji dovoljna identičnost između proteina koja će omogućiti da dati protein ispolji svoju biološku aktivnost bez izazivanja značajnijeg imunog odgovora kod čoveka.

Preferentno, termin "osteoprotegerin" se odnosi na zreli protein kome nedostaje signalni peptid. Taj signalni peptid obuhvata N-terminalni kraj 21 amino kiseline OPG kako je definisano u SEQ ID NO: 2 ili 4, tj. taj zreli protein obuhvata amino kiseline 22 do 401 iz SEQ ID NO: 2 ili 4. Termin "osteoprotegerin", u smislu u kome je ovde korišćen, takođe se odnosi na bilo koji fragment, deo, domen ili pod-domen SEQ ID NO: 2 ili 4 koji pokazuje željenu aktivnost kod skleroderme ili drugih fibroznih bolesti. Fragmenti proteina, izoformi, diferencijalno glikozilirane ili sijalilirane forme jednog ili više domena ovog proteina mogu se koristiti prema ovom pronalasku, sve dok ispoljavaju bilo kakav korisan efekat na fibroznu bolest, preferentno efekat koji je u najmanju ruku komparabilan sa onim koji ima protein celokupne dužine. Taj koristan efekat se može izmeriti u jednom odin vitroiliin vivotestova koji su opisani u primerima dole ili bilo kojim drugim esejom koji je adekvatan da bi se dokazao efektat na neku fibroznu bolest, posebno sklerodermu.

Na primer, osteoprotegerin obuhvata domen nalik na TNRF koji je bogat cisteinom na njegovom N-terminalnom delu, kako su opisali Simonet et al., 1997. Za jedan fragment koji obuhvata ovaj domen je pokazano da zadržava biološku aktivnost OPG uin vitrotestu. Stoga, preferentni OPG fragment obuhvata domen OPG nalik na TNFR, posebno fragment koji obuhvata amino kiseline 22 do 194 u okviru SEQ ID NO. 2 ili 4.

U skladu sa ovim pronalaskom, osteoprotegerin može biti protein koji se prirodno javlja, tj, nativni protein ili rekombinantni protein. Rekombinantna produkcija se može vršiti u eukariotskim ćelijama kao što su ćelije kvasca ili ćelije sisara, preferentno u CHO ćelijama, HEK ćelijama (humanim embrionskim bubrežnim ćelijama) ili u humanim fibroblastnim ćelijama ili ćelijskim lozama. On se takođe može proizvoditi u prokariotskim ćelijama kao što je E. coli.

Osteoprotegerin se, kako je opisano, javlja u monomernom i dimernom obliku (Simonet et al., 1997). Stoga, u skladu sa ovim pronalaskom, OPG može biti monomer, dimer ili multimer.

Preferentno, osteoprotegerin je glikoziliran na jednom ili više mesta. One takođe može biti i ne-glikoziliran u zavisnosti od datih potreba i izvora produkcije ili izolacije ovog proteina.

Termin "soli" se ovde odnosi i na soli karboksilnih grupa i na soli dobijena dodavanjem kiselina amino grupama molekula osteoprotegerina ili njihovim analozima. Soli karboksilne grupe se mogu dobijati na način koji je poznat o ovog struci a tu spadaju i neorganske soli. Na primer, natrijum, kalcijum, amonijum, soli gvožđa ili cinka i slično, kao i soli sa organskom osnovom kao što su one koje se formiraju na primer, sa aminima, kao što su trietanolamin, arginin ili lizin, piperidin, prokain i slično. U soli kojima su dodatne kiseline spadaju na primer, soli sa mineralnim kiselinama, kao što su na primer, hlorovodonična kiselina ili sumporna kiselina, i soli sa organskim kiselinama kao što su na primer, sirćetna kiselina ili oksalna kiselina. Naravno, svaka takva so mora da zadrži biološku aktivnost osteoprotegerina koja je relevantna za ovaj pronalazak, tj. mora da ima povoljan uticaj na fibrozne bolesti, posebno na sklerodermu.

Izoformi ili isprepletane varijante osteoprotegerina mogu se takođe koristiti prema ovom pronalasku, sve dok su u stanju da inhibiraju progresiju bolesti i/ili simptome te bolesti.

U smislu u kome je ovde korišćen termin "muteini" odnosi se na analoge osteoprotegerina, u kojima je jedan ili više ostataka prirodnog osteoprotegerina u amino kiselinama zamenjen različitim ostatcima amino kiselina ili je izbrisan ili su ostatci jedne ili više amino kiselina dodati i prirodnu sekvencu osteoprotegerina, koja preferentno ima u najmanju ruku istu aktivnost kao i divlji tip osteoprotegerina ili čak ima daleko snažniju aktivnost. Biološka aktivnost OPG se može npr. izmeriti određivanjem vezivanja OPG za njegov prirodni ligand OPGL. Eseji za procenu interakcija protein-protein su dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti. Primeri za takve eseje su eseji vezivanja tipa ELISA, eseji imuno-precipitacije ili merenje u bilo kom drugom pogodnom sistemu kao što je BlAcore sistem. Ovi muteini se pripremaju poznatom sintezom i/ili tehnikama mutageneze usmerenim ka određenom mestu ili uz pomoć bilo koje druge tehnike koja je za to pogodna.

Svaki takav mutein preferentno ima sekvencu amino kiseline koja je dovoljno duplikativna u odnosu na onu kod zrelog osteoprotegerina, tako da ima u najmanju ruku značajno sličnu aktivnost kao i osteoprotegerin. Aktivnost nekog mutanta osteoprotegerina se može dalje testirati uz pomoć eseja koji su objašnjeni u donjim prirnerima. Merenje obima sinteze kolagena u fibroblastima tretiranim sa OPG može biti pogodan test za procenu aktivnosti muteina osteoprotegerina, na primer.

Muteini u skladu sa ovim pronalaskom obuhvataju proteine koje kodira neka nukleinska kiselina, kao što je DNK ili RNK, koja se hibridizuje u DNA ili RNK, koja kodira osteoprotegerin, u skladu sa ovim pronalaskom, pod strogim uslovima. Termin "strogi uslovi" se odnosi na uslove hibridizacije i naknadnog ispiranja koje stručnjaci iz ove oblasti obično nazivaju "strogim". Videti Ausubel et al., Tekući protokoli u molekularnoj biologiji, gore, Interscience, N.Y., §§6.3 i 6.4 (1987, 1992), i Sambrook et al.(Sambrook, J. C, Fritsch, E. F., i Maniatis, T. (1989) Molekularno kloniranje: laboratorijski priručnik, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY).

Bez ograničenja, primeri strogih uslova obuhvataju uslove ispiranja 12-20°C ispod izračunate Trn datog hibrida koji se ispituje unpr., 2 x SSC i 0.5% SDS tokom 5 minuta, 2 x SSC i 0.1% SDS tokom 15 minuta; 0.1 x SSC i 0.5% SDS na 37°C tokom 30-60 minuta i potom 0.1 x SSC i 0.5% SDS na 68°C tokom 30-60 minuta. Stručnjaci iz ove oblasti takođe znaju da strogost uslova takođe zavisi od dužine DNK sekvenci, oligonukleotidnih proba (kao što su baze 10-40) ili mešovitih oligonukleotidnih proba. Ukoliko se koriste mešovite probe, poželjno je koristiti tetrametil amonijum hlorid (TMAC) umesto SSC. Videti Ausubel, gore.

Svaki takav mutein preferentno ima sekvencu amino kiseline koja je dovoljno duplikativna u odnosu na onu kod osteoprotegerina, tako da ima značajno sličnu ili čak bolju biološku aktivnost kao i osteoprotegerin.

Jedna lako merljiva aktivnost osteoprotegerina je njegova sposobnost da smanjuje sintezu kolagena. Sve dok ovaj mutein ima značajnu aktivnost smanjivanja kolagena može se smatrati da on ima aktivnost koja je značajno slična aktivnosti osteoprotegerin. To znači da se može odrediti da li neki dati mutein ima u najmanju ruju značajno istu aktivnost kao i osteoprotegerin na osnovu rutinskih eksperimenata koji podrazumevaju ispitivanje takvog muteina.

Prema jednom preferentnom konceptu, svaki takav mutein ima najmanje 40% identičnost ili homolognost sa sekvencom zrelog osteoprotegerina. Još preferentnije, on ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili, najpreferentnije, najmanje 90% identičnost ili homolognost u odnosu na njega.

Identičnost odražava odnos između dve ili više sekvence polipeptida ili dve ili više sekvenci polinukleotida, što se određuje poređenjem sekvenci. Generalno, identičnost se odnosi na preciznu korespondenciju nukleotida prema nukleotidu ili amino kiseiine prema amino kiselini, kod dva polinukleotida odnosno kod dve sekvence polipeptida, na celoj dužinu sekvenci koje se porede.

Kod sekvenci kod kojih ne postoji precizna korespodencija, može se odrediti "% identičnosti". Generalno, dve sekvence koje se porede se poravnavanju kako bi se dobila maksimalna korelacija između tih sekvenci. To može da uključuje i inserciju "praznina" u jednoj od sekvenci ili u obe sekvence kako bi se povećao stepen poravnanja. Procenat identičnosti se može odrediti ćelom dužinom svake sekvence koja se poredi (takozvano globalno poravnavanje), to je posebno pogodno kod sekvenci iste ili veoma slične dužine ili na manjim definisanim dužinama (takozvano lokalno poravnavanje), koje je pogodnije kod sekvenci nejednake dužine.

Metode za poređenje identičnosti i homolognosti dve ili više sekvenci su dobro poznate u ovoj stručnoj oblasti. Tako se na primer mogu koristiti programi koji postoje u okviru Paketa za analizu sekvence (Sequence Analvsis Package), verzija 9.1 (Devereux J et al, 1984), kao i programi BESTFIT i GAP, za određivanje % identičnosti između dva polinukleotida i % identičnosti i % homolognosti između dve sekvence polipeptida. BESTFIT koristi algoritam "lokalne homologije" koji su razvili Smith i VVaterman (1981) i on pronalazi najbolji pojedinačni region sličnosti između dve sekvence. Drugi programi za određivanje identičnosti i/ili sličnosti između sekvenci takođe su poznati u ovoj stručnoj oblasti, na primer programi iz porodice BLAST (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, mogu se naći na stranici NCBI na adresi www.ncbi.nlm.nih.gov) i FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

Muteini osteoprotegerina, koji se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom, ili nukleinske kiseline koje ih kodiraju, uključuju ograničenu grupu značajno odgovarajućih sekvenci kao što su supstitucioni peptidi ili polinukleotidi koje stručnjaci iz ove oblasti mogu rutinski dobiti bez eksperimentisanja na osnovu saznanja i uputstava koja su ovde predstavljena.

Preferentne promene muteina u skladu sa ovim pronalaskom su one koje su poznate kao "konzervativne" supstitucije. Konzervativne supstitucije amino kiselina polipeptida ili proteina osteoprotegerina mogu da obuhvataju sinonimne amino kiseline u okviru grupe koja ima dovoljno slična fizičko-hemijska svojstva da supstitucija između članova te grupe omogućava očuvanje biološke funkcije molekula (Grantham, 1974). Jasno je da se insercije i delecije amino kiselina mogu takođe izvršiti u gore pomenutim sekvencama bez menjanja njihove funkcije, posebno ukoliko te insercije ili delecije obuhvataju samo mali broj amino kiselina npr. manje od trideset, a preferentno manje od deset i ukoliko ne uklanjaju ili pomeraju amino kiseline koje su ključne za funkcionalni raspored, npr. ostatke cisteina. Proteini i muteini koji se proizvode takvim delecijama i/ili insercijama spadaju u domen ovog pronalaska.

Preferentno, sinonimne grupe amino kiselina su one koje su definisane u Tabeli I. još preferentnije, grupe sinonimnih amino kiselina su one definisane u Tabeli II; i najpreferentnije grupe sinonimnih amino kiselina su one definisane u Tabeli III.

Primeri proizvodnje supstitucija amino kiselina u proteinima koji se mogu koristiti za dobijanje muteina osteoprotegerina polipeptida ili proteina za upotrebu u okviru ovog pronalaska obuhvataju sve korake poznatih metoda kao što su oni dati u patentima SAD 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462, Mark et al; 5,116,943 Koths et al., 4,965,195 Namen et al; 4,879,111 Chong et al; i 5,017,691 Lee et al; i proteina supstituisanih lizinom prikazanih u patentu SAD br. 4,904,584 (Shaw et al).

Termin "fuzionisani protein" se odnosi na polipeptid koji sadrži osteoprotegerin ili njegov mutein, fuzionisan sa drugim proteinom koji npr. ima produženo vreme boravka u telesnim tečnostima. Fuzioni proteini koji obuhvataju celokupan ili funkcionalni deo osteoprotegerina fuzionisanog sa celim ili funkcionalnim delom proteina koji može da poboljša biološke aktivnosti molekula, kao što je na primer polu-život u ljudskom telu su prema ovom pronalasku preferentni. Prema jednom preferentnom konceptu fuzionisani protein obuhvata fuziju nekog imunoglobulina (Ig). Fuzioni proteini koji obuhvataju ceo ili deo osteoprotegerina fuzionisanog sa celim ili delom imunoglobulina su visoko preferentni. Oni mogu biti monomerni ili multimerni, hetero- ili homomultimerni. Prednost predstavlja to da fuzionisani protein obuhvata konstantni region imunoglobulina, posebno Fc deo imunoglobulina. Koncepti prema kojima imunoglobulini predstavljaju lgG1 ili lgG2 izotipove su dodatno poželjni prema ovom pronalasku. Preferentno, fuzija podrazumeva Fc fuziju.

Osteoprotegerin se stoga može fuzionisati sa drugim proteinom, polipeptidom ili slično npr. sa nekim imunoglobulinom ili njegovim fragmentom. Ta fuzija može biti direktna ili preko kratkog veznog peptida koji može biti toliko kratak da obuhvata samo ostatke 1 do 3 amino kiseline ili duži, na primer da obuhvata ostatke 13 amino kiselina. Navedeni vezni peptid može biti tripeptid čija je sekvenca E-F-M (Glu-Phe-Met), na primer ili sekvenca veznog peptida sa 13 Amino kiselina koja obuhvata Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met koje su uvedene između sekvence osteoprotegerina i sekvence imunoglobulina.

"Funkcionalni derivati" u smislu u kome su ovde korišćeni pokrivaju derivate osteoprotegerina i njihove muteine i fuzionisane proteine koji se mogu pripremiti iz funkcionalnih grupa koje se javljaju u vidu bočnih lanaca na ostatcima ili na N- ili C-terminalnim grupama na način koji je poznat u ovoj stručnoj oblasti, i oni su obuhvaćeni ovim pronalaskom sve dok su farmaceutski prihvatljivi, tj. dok ne uništavaju aktivnost proteina koja je u najmanju ruku značajno slična aktivnosti osteoprotegerina i ne prenose toksična svojstva na sastave koji ih sadrže. Stoga, prema jednom preferentnom konceptu takav funkcionalni derivat obuhvata najmanje jedan deo spojen sa jednom ili više funkcionalnih grupa, koje se javljaju u vidu jednog ili više bočnih lanaca na ostatcima amino kiselina.

U skladu sa ovim pronalaskom, bočni lanci polietilen glikola (PEG) predstavljaju visoko preferentne delove. Bočni lanci PEG mogu da maskiraju antigena mesta i produže boravak supstance sa kojom su povezani u telesnim tečnostima. Drugi derivati uključuju alifatične estre karboksilnih grupa, amide karboksilnih grupa reakcijom sa amonijakom ili sa primarnim ili sekundarnim aminima, N-acil derivati slobodnih amino grupa ostataka amino kiselina formiranih sa acilnim delovima (npr. alkanoilne ili karbociklične aroilne grupe) ili O-acil derivatima slobodnih hidroksilnih grupa (na primer one od serilnih ili treonilnih ostataka) formiranih sa acilnim delovima.

"Aktivne frakcije" osteoprotegerina i njegovih muteina i fuzionisanih proteina, pokrivaju sve fragmente ili prekursore polipeptidnog lanca samog molekula proteina ili zajedno sa udruženim molekulima ili ostatcima koji su sa njima povezani, npr. ostatcima šećera ili fosfata ili agregatima molekula proteina ili samim ostatcima šećera, pod uslovom da ta aktivna frakcija ima u najmanju ruku značajno sličnu aktivnost onoj koju ima osteoprotegerin.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu molekula neke nukleinske kiseline za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju skleroderme, što je naznačeno time da molekul te nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji sadrži neku sekvencu amino kiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od: a) Polipeptida koji sadrži SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; b) Polipeptida koji sadrži amino kiseline 22 do 401 iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; c) Polipeptida koji sadrži jedan, dva, tri ili četiri domena osteoprotegerina bogatih cisteinom; d) Polipeptida koji sadrži amino kiseline 22 do 194 iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; e) Muteina, bilo koga od (a) do (d), što je naznačeno time da sekvenca amino kiselina ima najmanje 40 % ili 50 % ili 60 % ili 70 % ili 80 % ili 90 %

identičnost u odnosu na najmanje jednu od sekvenci od (a) do (d);

f) Muteina, bilo kog od (a) do (d) koga enkodira DNK sekvenca koja se hibridizuje u komplement nativne DNK sekvence koja kodira bilo šta od (a) do (d) pod umereno

strogim uslovima ili pod veoma strogim uslovima;

g) Muteina, bilo kog od (a) do (d) naznačen time da su sve promene sekvence amino kiselina konzervativne supstitucije amino kiselina u sekvencama amino kiselina (a)

do (d);

h) Neki izoform, fuzionisani protein ili aktivnu frakcija bilo čega od (a)to(g).

Za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju fibroznih bolesti. Ovaj

pronalazak se preferentno odnosi na upotrebu navedenih molekula nukleinske kiseline za lečenje i/ili prevenciju bolesti vezivnog tkiva a posebno skleroderme.

U skladu sa ovim pronalaskom, osteoprotegerin se takođe može davati u ljudsko telo u vidu vektora koji obuhvata navedeni molekul nukleinske kiseline. Stoga se ovaj pronalazak takođe odnosi na upotrebu nekog vektora koji sadrži navedeni molekul nukleinske kiseline za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju skleroderme ili neke druge fibrozne bolesti, a preferentno taj vektor je neki ekspresivni vektor koji sadrži promoter koji je operativno vezan za celu ili deo kodirajuću sekvence osteoprotegerina. Prema još jednom preferentnom konceptu, taj vektor je vektor genske terapije. Vektori genske terapije su poznati u ovoj struci a većina od njih su vektori izvedeni iz virusa, kao što su adentovirusni ili lentivirusni vektori.

Prema ovom pronalasku, osteoprotegerin se takođe može unositi u ljudsko telo u obliku osteoprotegerina koji proizvodi ili vrši sekreciju ćelija. Stoga se ovaj pronalazak dalje odnosi na upotrebu osteoprotegerina koji vrši ekspresiju ćelija za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju skleroderme ili bilo koje druge fibrozne bolesti, tj. za ćelijsku terapiju u lečenju i/ili prevenciji skleroderme ili drugih fibroznih bolesti. Ta ćelija može biti ćelija koja prirodno proizvodi osteoprotegerin i/ili neka transfektovana ćelija koja proizvodi rekombinantni osteoprotegerin. Preferentne su ćelije koje vrše ekspresiju i sekreciju velikih količina ovog proteina, kao što su ćelije prekomerne ekspresije koje nose veliki broj kopija eskpresionog vektora koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira osteoprotegerin.

Obzirom da fibroblasti predstavljaju mehanizam za produkciju fibroze oni su najpogodnije ćelije za anti-fibroznu terapiju i terapiju skleroderme. Stoga se u skladu sa ovim pronalaskom, preferentno koristi osteoprotegerin koji vrši ekspresiju fibroblasta.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na neku ćeliju koja sadrži vektor koji sadrži neki molekul nukleinske kiseline koji kodira celokupan ili deo osteoprotegerina za pripremu medikamenta za lečenje i/ili prevenciju fibrozne bolesti, posebno skleroderme. Ćelija koja je genetski modifikovana da proizvodi polipeptid prema ovom pronalasku takođe spada u domen ovog pronalaska.

Upotreba vektora ekspresije za indukovanje i/ili pojačavanje endogene produkcije osteoprotegerina u ćeliji koja je normalno neaktivna ili koja eksprimira količine inhibitora koje nisu dovoljne je takođe razmotrena prema ovom pronalasku. To znači da se kod ovog pronalaska koristi tehnologija poznata kao endogena aktivacija gena (EGA) za produkciju željenog proteina.

Nekoliko kombinovanih tretmana se prema ovom provalsku smatra preferentnim. To znači da preferentno medikament iz ovog pronalaska obuhvata:

• Interferon, posebno interferon-p

• Antagoniste tumorske nekroze (TNF) posebno solubilne TNFR, kao što su solubilni p55 (TBPI) i/ili solubilni p75 (TBP II); • Neki drugi agens protiv skleroderme; • Neki agens protiv skleroderme koji je odabran iz grupe koja se sastoji od Halofuginona, ACE inhibitora, blokatora kalcijumovih kanala, inhibitora protonske pumpe, NSAID, COX-inhibitora, kortikosteroida, tetraciklina, pentoksifilina, bucilamina, inhibitora geranilgeranil transferaze, roterlina, inhibitora prolil-4-hidrokslaze, inhibitora c-proteinaze, inhibitora lizil-oksidaze, relaksina, halofuginona, prostaglandina, prostaciklina, endotelina-1, azotoksida, inhibitora angiotenzina II, antioksidanata ili SAPR-1.

SARP-1 je protein koji, kako se pokazalo, ima povoljan efekta kod fibroznih bolesti kao što je skleroderma (VVO02/46225). Fragmenti, Izoformi, aktivne frakcije, fuzionisani proteini ili funkcionalni derivati SARP-1, kako je opisano u WO02/46225, mogu se takođe koristiti u kombinaciji sa osteoprotegerinom, u skladu sa ovim pronalaskom.

Svi tretmani su planirani za istovremenu, sekvencijalnu ili zasebnu upotrebu.

Farmaceutski sastavi koji sadrže jednu ili više gore navedenih supstanci zajedno sa osteoprotegerinom spadaju u domen ovog pronalaska.

lako trenutno nema leka za sklerodermu, danas se koristi nekoliko agenasa ili tretmana za lečenje simptoma skleroderme. Takvi agensi protiv skleroderme koji se mogu koristiti kao kombinovana terapija prema ovom pronalasku su ukratko prikazani u npr. Leighton (2001) ili Wigley i Sule (2001), koji su u celosti obuhvaćeni u literature koja je ovde data.

Interferoni su pretežno poznati po inhibitornim efektima na virusnu replikaciju i ćelijsku proliferaciju. lnterferon-y, na primer, igra važnu ulogu u promovisanju imunog i inflamatornog odgovora. Smatra se da interferon p (IFN-p, interferon tipa I), igra antiinflamatornu ulogu.

Prema još jednom konceptu ovog pronalaska, osteoprotegerin se koristi u kombinaciji sa TNF antagonistom. TNF antagonisti vrše svoju aktivnost na nekoliko načina. Prvo, antagonisti mogu da se vezuju za ili sekvestriraju sam molekul TNF sa dovoljnim afinitetom i specifičnošću da bi delimično ili supstancijalno neutralisali TNF epitope ili epitope odgovorne za receptorsko vezivanje TNF (u daljem tekstu "sekvestracioni antagonisti"). Sekvestracioni antagonist može biti, na primer, neko antitelo usmereno protiv TNF.

Umesto toga, antagonisti TNF mogu da inhibiraju signalnu putanju TNF koju aktivira receptor na površini ćelije posle vezivanja TNF (u daljem tekstu "antagonisti signalizacije"). TNF antagonisti se lako identifikuju i procenjuju rutinskim pregledom kandidata radi utvrđivanja njihovog efekta na aktivnost nativnog TNF na osetljive ćelijske loze in vitro, na primer na humane B ćelije kod kojih TNF izaziva proliferaciju i sekreciju imunoglobulina. Ovaj esej sadrži formulaciju TNF sa različitim dilucijama kandidata antagonista, npr. od 0,1 do 100 puta veća molarna količina TNF od one korišćene u eseju i kontrole bez TNF ili samo sa antagonistom (Tucci et al., 1992).

Sekvestracioni antagonisti su preferentni antagonisti TNF koje treba koristiti prema ovom pronalasku. Među sekvestracionim antagonistima, preferentni su oni polipeptidi koji vezuju TNF sa visokim afinitetom i imaju nisku imunogenost. Solubilni molekuli TNF receptora i neutrališuća antitela su posebno preferentni. Na primer, solubilni oblici TNF-RI (p55) i TNF-RII (p75) su korisni za ovaj pronalazak. Zasečeni oblici receptora koji obuhvataju ekstracelularne domene receptora ili zasečene forme ovih receptora ili njihove funkcionalne delove predstavljaju posebno preferentne antagoniste prema ovom pronalasku. Zasečeni solubilni TNF tip-l i tip-ll receptori su opisani u EP914431, na primer.

Zasečeni oblici TNF receptora su solubilni i otkriveni su u urinu i serumu u vidu 30 kDa ili 40 kDa TNF inhibitornih vezujućih proteina koji se nazivaju TBPI odnosno TBPII. (Engelmann et al., 1990). Istovremena, sekvencijalna ili zasebna upotreba osteoprotegerina sa TNF antagonistom i/ili nekim interferonom je preferentna, prema ovom pronalasku.

Prema ovom pronalasku, TBPI i TBPII predstavljaju preferentne antagoniste TNF koje treba koristiti u kombinaciji sa osteoprotegerinom. Derivati, fragmenti, regioni i biološki aktivni delovi receptorskih molekula funkcionalno liče na receptorske molekule koji se takođe mogu koristiti u ovom pronalasku. Takvi biološki aktivni ekvivalenti ili derivati receptorskih molekula se odnose na deo polipeptida ili sekvencu koja kodira receptorski molekul koji je dovoljno veliki i sposoban da se vezuje za TNF sa takvim afinitetom da interakcija sa TNF receptorom vezanim za membranu biva inhibirana ili blokirana.

Prema još jednom preferentnom konceptu, humani solubilni TNF-RI (TBPI) predstavlja TNF antagonist koji treba koristiti prema ovom pronalasku. Prirodni i rekombinantni solubilni molekuli TNF receptora i metode njihove proizvodnje opisani su u evropskim patentima EP 308 378, EP 398 327 i EP 433 900.

lako bi blokiranje TNF-a moglo biti korisno u ranim stadijumima bolesti, bilo je reči i o tome da u kasnijim stadijumima sam TNF može da vrši povoljan uticaj na sklerodermu (Abraham et al., 2000). Stoga se ovaj pronalazak takođe odnosi na kombinaciju osteoprotegerina i TNF u lečenju ili prevenciji skleroderme, posebno u uznapredovalim stadijumima bolesti. TNF-a ili TNF-p se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži osteoprotegerin, opciono sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, rastvarača ili ekscipijenata za lečenje i/ili prevenciju fibrozne bolesti, posebno skleroderme. Takav farmaceutski sastav može takođe da sadrži neku od gore utvrđenih dodatnih komponenata a posebno interferon, TBP ili COX inhibitor.

Farmaceutski sastav prema ovom pronalasku može takođe da sadrži neki vektor koji prema ovom pronalasku uključuje molekul nukleinske kiseline ili osteoprotegerin koji vrši ekspresiju ćelija.

Aktivni sastojci ove farmaceutske formulacije tj. polipeptidi, nukleinske kiseline ili ćelije prema ovom pronalasku ili njihove kombinacije, kao i kombinacije supstanci koje su gore pomenute, mogu se davati nekom pojedincu na različite načine. Načini administracije mogu biti intradermalni, transdermalni (npr. kod formulacija sa sporim oslobađanjem), intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, subkutani ili epiduralni, lokalni i intranazalni. Mogu se koristiti i svi drugi terapijski efikasni načini administracije, na primer apsorpcija preko epitelijalnog ili endotelijalnog tkiva ili genska terapija kada se molekul DNK koji kodira aktivni agens daje pacijentu (npr. preko nekog vektora), što dovodi do ekspresije aktivnog agensa i njegove sekrecije in vivo. Osim toga, protein(i) prema ovom pronalasku mogu da se primenjuju zajedno sa drugim komponentama biološki aktivnih agenasa kao što su farmaceutski prihvatljivi surfaktanti, ekscipijenti, , rastvarači i nosači.

Definicija termina "farmaceutski prihvatljivi" ima za cilj da obuhvati sve nosače koji ne utiču na efektivnost biološke aktivnosti aktivnog sastojaka i koji nisu toksični za domaćina kome se daju. Na primer, kod parenteralne administracije, aktivni protein(i) se mogu formulisati u obliku jediničnih doza za injekcije u nosaču kao što je fiziološki rastvor, rastvor dekstroze, serumski albumin i Ringerov rastvor.

Kod parenteralne (npr. intravenske, subkutane, intramuskularne) administracije, aktivni protein(i) se mogu formulisati u vidu rastvora, suspenzija, emulzija ili liofilizovanog praha zajedno sa nekim farmaceutski prihvatljivim parenteralnim nosačem (npr. voda, fiziološki rastvor, rastvor dekstroze) i aditivima koji održavaju izotoničnost (npr. manitol) ili hemijsku stabilnost (npr. konzervansi i puferi). Ovakva formulacija se steriliše uz pomoć tehnika koje se uobičajeno koriste.

Biološka raspoloživost aktivnih proteina prema ovom pronalasku se takođe može ublažiti uz pomoć postupaka konjugacije koji povećavaju polu-život ovog molekula u ljudskom telu, na primer vezujući taj molekul za polietilenglikol, kako je opisano u PCT

Patentnom zahtevu WO 92/13095.

Terapijski delotvorna količina aktivnog proteina će biti u funkciji mnogih promenljivih, uključujući i tip receptora, afinitet supstance iz ovog pronalaska prema njenom receptom, bilo kakve rezidualne citotoksične aktivnosti koja iz toga proizilazi, načina administracije, kliničkog stanja pacijenta.

"Terapijski efektivna količina" je količina koja kada se primeni, supstanca iz ovog pronalaska dovodi do povoljnih efekata na razvoj ili progresiju bolestiin vivo.Doza koja će biti primenjena, kao pojedinačna ili višestruka doza kod nekog pojedinca će varirati u

zavisnosti od različitih faktora, uključujući i farmakokinetička svojstva OPG, način administracije, stanje pacijenta i karakteristike (pol, starost, telesna težina, zdravlje, veličina), obim simptoma, istovremene tretmane, učestalost tretmana i željeni efekat. Prilagođavanje i manipulisanje ustanovljenim dozama spadaju u delokrug stručnjaka iz ove oblasti koji su u svakom slučaju za to sposobni.

Potrebna doza polipeptida prema ovom pronalasku će varirati od oko 0,0001 do 100 mg/kg ili od oko 0.01 do 10 mg/kg ili od oko 0.1 do 5 mg/kg ili od oko 1 do 3 mg/kg, iako, kao je gore pomenuto to u velikoj meri zavisi od terapijskih potreba. Medikament iz ovog pronalaska se može primenjivati svakodnevno, svakog drugog dan ili tri puta nedeljno.

Dnevne doze se obično daju u podeljenim dozama ili u obliku sa produženim oslobađanjem koji je dovoljno efektivan da bi se postigli željeni rezultati. Druga ili naredne administracije se mogu bazirati na istim dozama kao i na manjim ili većim dozama od inicijalnih ili prethodnih doza datih nekom pojedincu. Druga ili naredna administracije se može obaviti tokom ili pre javljanja bolesti.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu lečenja i/ili prevencije fibroznih bolesti, posebno skleroderme, koja podrazumeva administraciju efektivne supstance prema ovom pronalasku pacijentu kome je ona potrebna, opciono zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Umesto toga, ili uz to opciono se prema ovom pronalasku mogu davati ćelije koje proizvode osteoprotegerin ili molekul nukleinske kiseline, koji mogu da se nalaze u ekspresivnom vektoru.

Vektor ekspresije se može davati sistemski. Vektor ekspresije se preferentno daje putem intramuskularnih injekcija. Naredni preferentni način administracije je inhalacija, posebno ukoliko bolest podrazumeva fibrozu pluća. Lokalna administracija vektora ekspresije prema ovom pronalasku uključuje OPG sekvence ili neki OPG polipeptid, i predstavlja preferentni način administracije posebno ukoliko je zahvaćena koža.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu za pripremu farmaceutskog sastava koja uključuje mešavinu efektivne količine osteoprotegerina sa nekim farmaceutski prihvatljivim nosačem, kao i na metodu za lečenje i/ili prevenciju artritisa koja podrazumeva administraciju efektivne inhibirajuće količine osteoprotegerina domaćinu kome je ona potrebna.

Sva literatura iz koje su ovde citirani podatci, uključujući članke ili apstrakte iz časopisa, objavljene ili neobjavljene patentne zahteve iz SAD ili drugih zemalja, izdate patente u SAD ili u inostranstvu kao i sve druge reference u celosti su ovde navedene, uključujući sve podatke, tabele, slike i tekstove date u navedenoj literaturi. Osim toga, celokupan sadržaj literature koja je citirana ovde takođe je uključen u reference.

Pozivanje na korake iz poznatih metoda, korake iz konvencionalnih metoda, poznate metode ili konvencionalne metode ne podrazumeva ni na koji način priznanje da je bilo koji aspekt, opis ili koncept ovog pronalaska otkriven, obrađen ili naznačen u relevantnoj stručnoj oblasti.

Prethodni opis specifičnih koncepata toliko otkriva u celini opštu prirodu ovog provalska da drugi, primenom znanja iz struke (uključujući i sadržaj literature koja je ovde citirana), lako mogu da modifikuju i/ili prilagode te specifične koncepte za različite primene, bez nepotrebnog eksperimentisanja i bez odstupanja od opšteg koncepta ovog provalska. Stoga, takve varijacije i modifikacije treba da budu u okviru značenja i opsega ekvivalenata otkrivenih koncepata, zasnovanih na učenju i smernicama koje su ovde predstavljene. Treba imati u vidu da fraze i terminologija koji su ovde korišćeni radi opisa nisu ograničavajući, tako da termine i fraze koji su korišćeni u ovoj specifikaciji stručnjak iz ove oblasti treba da tumači u kontekstu učenja i uputstava koja su ovde data, u kombinaciji sa saznanjima koje takav stručnjak iz ove oblasti već ima.

Pošto smo pisali ovaj pronalazak, lakše će se razumeti naredni primeri koji su dati u vidu ilustracije i nemaju za cilj da ograniče domen ovog pronalaska.

PRIMERI

Metode

Uzorci pacijenata

I |-7nrri nanr hinncsiip v/plirinp H\/a mm<3>M7<p>ti <?n "?a kr>7P sa Ip7iiarpa i knž<p>hp.7 — _~T. w. r —„.„^„.j^ .w..w,..v . _! lezija (obično sa kože nadlaktice) devet pacijenata usklađenih po pitanju starosti i pola sa difuznom kutanom sistemskom sklerozom (SSc). Svi pacijenti su ispunili kriterijume Američkog koledža za reumatologiju po pitanju dijagnoze SSc.

Kulture fibroblasta.

Fibroblasti su dobijeni biopsijom izin vitrokulture kako je prethodno opisano (Abraham et al., 1991). Ukratko, biopsije su isečene na delove i stavljene u sterilne plastične posude ili bočice. Posle 15 minuta sušenja na sobnoj temperaturi delovi bioptičkog uzorka su prionuli za plastičnu posudu sa kulturom tkiva a potom su kultivisani na podlozi za rast fibroblasta (FGM) koja se sastojala Eagleove podloge koju je modifikovao Dulbecco (DMEM) koja sadrži 10% fetalnog seruma goveda (FCS), 2 mM L-glutamina, 1 mM natrijum piruvata, 100 jedinica po ml penicilina, 100 ug po ml streptomicina, 50 ug po ml gentamicina i 2.5 jag po ml amfotericina B. Posle 2-3 nedelje inkubacije u ovlaženoj atmosferi sa 5% CO2u vazduhu, narasli fibroblasti su odvojeni kratkom tripsinacijom i rekultiv/sani u FGM bez gentamicina i amfotericina B. U eksperimentima su fibroblasti korišćeni između 2 i 5 prolaska. Fenotip fibroblasta je potvrđen na osnovu njihove tipične morfologije u jednoslojnim i trodimenzionalnim kulturama kolagen gela.

Izolacija RNK

Ukupna RNK je izolovana iz konfluentnih fibroblasta skleroderme pri ranom prolasku uz pomoć Trizola (Life Technologies) prema protokolu proizvođača. Finalna peleta RNK je ponovo suspendovana u sterilnom DEPC tretiranog vodom u koncentraciji od 1ug/jal čuvanog na -80 °C.

Sinteza cDNK probe

Dva u.g ukupne RNK je pomešano sa 1.3 uJ prajmera specifičnih za citokine (R&D svstems kat. br. GAC11) i potom inkubirano na 70 C tokom 2 min u ependorf epruveti od 0.5 ml. Epruvete su ohlađene do 50 °C tokom 2 min a posle tog vremena je dodata reakciona mešavina koja je sadržala 2 jJ 5X reakcionog pufera (250 mM Tris-HCI pH 8.3, 375 mM KCI i 15 mM MgCI2), 1 jil 10X dNTP mešavine (5 mM dGTP, 5mM dCTP i 5mM dTTP), 3.5 |al of a<32>P-dATP (3000Ci/mmol, Amersham kat. br. PB10204), 0.5 jal DTT (100 mM) i 1 ul superskripta II (Life Technologies). Reakciona mešavina je kratko mešana pipetiranjem i inkubacijom na 50 C tokom 25 min. Reakcija je prekinuta dodavanjem 1 jal 0.1 M EDTA pH 8.0 koji je sadržao 1 mg/ml glikogena). Obeležena cDNK je potom purifikovana da bi se eliminisali neinkorporirani deoksinukleotidi uz pomoć Chromaspin-200 DEPC-H20 kolone (Clontech) prema instrukcijama proizvođača. cDNK koje su sadržale frakcije identifikovane su Czerenkovim prebrojavanjem. Maksimalna frakcija (obično frakcija 2 od ukupno dobijenih 6) je tretirana sa 0.1 volumenom 1 M NaOH koja je sadržala 1 mM EDTA tokom 20 min na 70 C radi hidrolize RNK, a potom je neutralisana jednakim volumenom 1 M NaH2P04koji je uključivao 2.5 u.g humane Cot-1 DNK (Life Technologies) tokom 20 min na 70 °C. Termički tretirana neutralisana cDNK proba je potom direktno dodata u hibridizacionu mešavinu.

Hibridizaciia u genske filterske mikroereje

Genski filterski mikroereji (humani erej ekspresije citokina, R&D svstems kat br. GA001) su prehibridizovani na 68 °C tokom 2 h u 5 ml rastvora za Ekspres hibridizaciju (Clontech) koji je sadržao 0.5 ug/ml DNK iz sperme lososa (Life technologies) u cilindričnim bočicama, u Hybaid peći za hibridizaciju. (MWG Biotech). Posle ovog vremena rastvor za prehibridizaciju je zamenjen svežim rastvorom za hibridizaciju koji je sadržao preparat cDNK probe sa specifičnom aktivnošću između 0.25 do 1 x 10<6>cpm/ml. Hibridizacija je trajala 16-20 h na 68 C. Posle hibridizacije, filteri su isprani 4 puta sa 2X SSC/1% SDS na 68 C 20 minuta po ispiranju i dva puta sa 0.1X SSC/0.5% SDS 15 min po ispiranju. Filteri su potom zatvoreni u Šaran wrap™ i izloženi pregledu vizualizacije fosfora K-tipa pri čuvanju (Biorad) tokom različitog vremenskog perioda (4 h do 4 dana) na sobnoj temperaturi.

Analiza slike

Ekrani sa slikom su skenirani pri rezoluciji od 50 nm uz pomoć Biorad Personal FX fosfoimidžera. Dobijeni 16 bitni digitalni fajl je konvertovan u TIF format a slika je analizirana uz pomoć Arravvision softvera (Imaging Research Inc.) Za svaki uzorak smo merili intenzitet piksela 384 gena su naneta u duplikatu na filter. Osnovni signal je substrahovan i dobijen je prosečan intenzitet piksela za svaki par mrlja na ereju (= nivo ekspresije).

Potvrda rezultata mikroereja na odabranim genima uz pomoć RT- PCR.

l^/-Jo c-tii /*» i i ly i nA D M I/' i -7 o»i s-\\s r\r* i \~rr\rVso /-> i i /-\ r-> + «-iV\rr-\ i i + i q tro noL'riK/-> \ ion i i-tuCucu i Liy ur\upi ici \ i >i f\u- ovar\uy uz.ui r\a pauijci rici uui i iuiv jOu ai ior\i luuvai i uz_pomoć oligo dT prajmera (Promega) u 20 u.1 reakcione zapremine koja je sadržala 5 mM MgCI2, 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 0.1 % Triton X-100, po 1 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 0.5 jedinica rekombinantnog RNasin inhibitora ribonukleaze (Promega) i 15 jedinica AMV obrnute transkriptaze (Promega). Reakciona mešavina je inkubirana na 42 C tokom 60 min, zagrevana na 95 C tokom 5 min i potom razblažena do 200 jul sterilnom vodom. Razblaženja reakcije obrnute transkriptaze su potom podvrgnuta PCR analizi u stvarnom vremenu na aparatu Tagman (PE Applied Biosistems 7700) uz korišćenje

specifičnih parova prajmera namenjenih za osteoprotegerin uz pomoć Primer Express softvera (PE Applied Biosistems) na bazi broja za pristup bazi podataka koji je dao proizvođač genskog filtera: osteoprotegerin-112F 5' CTG CGC GCT CGT GTT TCT (SEQ ID NO: 5) i osteoprotegerin-185R 5' AAT GAA GGT ACT TTG GAG GAA ACG (SEQ ID NO: 6). Rezultati su normalizovani prema ekspresiji uvek prisutnih gena gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) u svakom uzorku i izraženi su u vidu promena koje su određene tako što je vrednost ekspresije kod abnormalnih uzoraka pacijenata podeljena sa odgovarajućim vrednošću kod normalnih uzoraka pacijenata.

Kloniranje cele cDNK kodirajuće sekvence humanog osteoprotegerina.

Celokupna dužina cDNK kodirajuće sekvence OPG je potom klonirana uz pomoć PCR obrnute transkriptaze uz korišćenje sledećih primera zasnovanih na sekvenci cDNK koja je postajala u EMBL bazi podataka (broj pristupa U94332): OPG F 5' CGG

GAT CCGCCA CCA TGA ACA AGT TGC TGT GCT (SEQ ID NO: 7) i OPG R 5' AAG

CTC GAG TTA TAA GCA GCT TAT TTT na 50 pmole svaka u 50 |al reakcione mešavine koja je sadržala 0.3 mM dNTPs, 1 mM MgS04, 5 ul normalnih humanih dermalnih (gornji sloj kože) fibroblastnih cDNK templata (pripremljenih kako je gore opisano) 5 ul pufera za amplifikaciju 10XPfx(Life Technologies) i 1 jal PlatinumPfxDNA polimeraze (Life Technologies). Reakciona mešavina je zagrevana na 94 C tokom 2 min i potom je prošla kroz 35 ciklusa PCR i to: 94 °C 15 s, 55 C tokom 30 s i 68 C tokom 1 min. Proizvodi amplifikacije su analizirani na 1 % agaroznim gelovima u 1 X TAE puferu (Life Technologies) a PCR proizvodi koji migriraju pri predviđenoj molekularnoj masi (1205 bp) su očišćeni od gela uz pomoć VVizard PCR kita za purifikaciju (Promega).

Sto ng DNK purifikovane od gela je digestirano sa restriktivnim enzimima BamHI i Xhol (Pharmacia), prema uslovima proizvođača, repurifikovano kako je gore opisano i potom je izvršena ligacija sa BamHI/Xhol digestovanim plazmidom pcDNK3.1(+)

(Invitrogen) uz pomoć T4 DNK ligaze (New England Biolabs) prema standardnim molekularno-biološkim tehnikama. Produkti ligacije su transforrmisani u sojE. coliTOP10 F' (Invitrogen) uz pomoć elektroforacije uz korišćenje Biorad Gene Pulser. Plazmid DNK je izolovan iz 5 ml kultura odgajenih iz dobijenih kolonija i podvrgnut je automatskoj analizi sekvenci na Applied Biosvstems 3700 sekvenceru uz korišćenje T7 i pcDNA3.1AS primera (Invitrogen) da bi se potvrdila sekvenca OPG.

Detekcija osteoprotegerina u ekstraktima proteina izolovanih iz dermalnih

fibroblasta uzetih sa kože sa lezijama i bez lezija.

Slabo prolazni fibroblasti sa lezijama i normalni fibroblasti dobijeni od pacijenata sa sklerodermom i kontrolnih Ispitanika, kultivisani kako je gore opisano ubrani su tretiranjem pojedinačnih slojeva ćelija sa PBS koji je sadržao 1 mM EDTA tokom 5 min na 37 C. Odvojene ćelije su dobijene centrifugiranje, resuspendovane u 50 ul PBS i tretirane sa 50\ x\uzorka pufera (20% SDS, 0.2% bromofenol plava, 50% glicerol, 1M Tris pH 6.8), smrznute na - 80 °C i potom otopljene. Sadržaj proteina je određen uz pomoć BCA kita (Pierce) prema protokolu proizvođača. Približno 10 ug proteina je tretirano sa 0.1 zapremine DTT (0.1M) i obrađeno na 4 -12% SDS poliakrillamid gelovima (Novex) prema instrukcijama proizvođača. Proteinske trake su potom prenete na membrane nitroceluloze uz pomoć Novex vvetblot aparata na 30 V tokom 1 h. Membrane su potom preko noći blokirane na 4 C u PBS koji je nsadržao 5% mleka u prahu bez masti a potom su isprane u PBST. Membrane su inkubirane sa primarnim antitelom (R&D svstems, anti OPG monoklono antitelo, kat br. MAB8051) u dozi od 0.5 ug/ml u PBST/1% BSA tokom 1 h na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Posle ovog vremena membrane su dobro isprane sa PBST pre inkubacije sa sekundarnim antitelom (anti-miška peroksidaza rena, Sigma) u razblaženju od 1/3000,u PBST/1% BSA. Membrane su na kraju dobro isprane pre razvijanja i vizuelizacije, uz pomoć ECL reagensa i Hvperfilm™ od Amershama.

ELISA za merenje kolagena tip I u ćelijskoj kulturi supernatanata fibroblasta

tretiranih sa rekombinantnim OPG ili posle transfekcije OPG / pcDNA3. 1 vektora

Sinteza kolagena je merenain vitrou kulturi humanih fibroblasta uz korišćenje capture ELISA sistema kako su opisali Shi-wen et al., (Shi-Wen et al., 1997). Ukratko, AG1518 humani dermaini fibrobiasti (kupijeni od ATCC) su održavani u DMEM medijumu koji je sadržao 5% FCS i 2 mM glutamina (Life Technologies). Ćelije su urbane tripsinizacijom i zasejane pri konfluenciji od 70% u 48 otvora na pločicama za ćelijsku kulturu (Falcon) na podlozi koja je sadržala 5 % seruma, potom su prebačene u medijum bez seruma 8 h kasnije. Posle 24 h, medijum je uklonjen i zamenjen svežim medijumom bez seruma koji je sadržao 50 uM L-askorbata (Wako Pure Chemical Industries) i sve veće koncentracije humanog rekombinantnog osteoprotegerina (OPG-Fc, kupljenog od R&D svstems). Šesnaest sati kasnije, u medijum je dodat TGF(31

(PeproTech) do finalne koncentracije od 2 ng/ml, a posle dodatnih 24 sata medijum je ponovo dobijen, centrifugiran kako bi se uklonili ostatci ćelija, razblažen i podvrgnut ELISA radi određivanja kolagena tip I kako je dole opisano.

Sinteza kolagena je takođe merena u primarnim humanim fibroblastima (OBHC ćelije) posle transfekcije sa OPG cDNK (pcDNA3.1-OPG) ili posle lažne transfekcije (pcDNA3.1 vektor sam) na sledeći način: OBHC ćelije su ubrane tripsinizacijom i stavljene na pločice sa konfluencijom od 50% u 48 otvora na pločicama u kompletnom medijumu. Izvršena je transfekcija plazmida u OBHC ćelije uz pomoć Fugene V reagensa za transfekciju (Roche) prema instrukcijama proizvođača. Pet sati posle transfekcije, medijum je zamenjen svežim medijumom bez seruma koji je sadržao L-askorbat preko noći, a potom je tretiran sa TGFpi (10 ng/ml) tokom 24 h kako je gore opisano.

MaxiSorp pločice (Nunc) su premazane tokom noći na 4°C sa 5ng/ml kozjim anti-humanim tip-l kolagenom (Southern Biotechnologv Associates. Inc.) u PBS (pH 7.4). Rastvor antitela je tada uklonjen a pločice su blokirane sa PBS-1% BSA tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Pločice su potom isprane 4 puta PBS/0.05% Tween 20 (PBST). Trostruki uzorci 100 u.l kondicioniranih medijuma su testirani. Uzorci su inkubirani tokom 2 h na sobnoj temperaturi (ST) zatim isprani 4X sa PBST. Uzorci su potom inkubirani sa razblaženjem od 1:2000 biotinilanim kozjim anti-humanim tip-l kolagen antitelom (Southern Biotechnologv Associates. Inc.) tokom 1 h na ST zatim su isprani 4X sa PBST. Uzorci su potom inkubirani sa razblaženjem 1/4000 HRP-streptavidin konjugiranog antitela (Zymed) tokom 1 h na ST uz mućkanje. Na kraju su uzorci isprani 4X sa PBST. OPD supstrat (Sigma kat. br. P9187) je dodat i ostavljen tokom 10 minuta da bi se razvila boja. Reakcija je zaustavljena sa 20% H2S04a mešavina i pločice su pročitani na 496 nm na Victor<2>multilabel brojaču (VVallac). Rezultati su normalizovani za brojeve ćelija uz pomoć CyQuant kita za esej proliferacije ćelija (C-7026) koga proizvodi Molecular Probes.

Esej CTGF- SEAP promotera

Jedan CTGF-SEAP promoter-reporter plazmid je konstruisan uz pomoć PCR izvršene sa oligonukleotidima 5'-ATCTCGAGGGCCACTCGTCCCTTGTCC (SEQ ID NO: 9) i 5'-ATAAGCTTGGAGTCGCACTGGCTGTCTCC (SEQ ID NO: 10) kako bi se amplifikovao humani CTGF (faktor rasta vezivnog tkiva) genski promoterski region (788 bp). Produkt amplifikacije očišćen od gela je subkloniran u pSEAP2-bazični (Clontech).

NIH 3T3 fibroblasti (ATCC) su zasejani u T-75 bočice I izvršena je ko-transfekcija sa 5 ug CTGF-SEAP i 1 ?g pcDNA3.1 (Invitrogen) plazmidima. Selekcija ćelija je izvršena na 800 ug/ml G 418 (Sigma).

Ustanovljeni su klonovi sa stabilno integrisanim CTGF-SEAP promoter-reporter, klonovi su analizirani i izabran je najsenzitivniji na osnovu razvijanja eseja zasnovanog na ćelijama.

Ćelije iz ovog klona (CTGF-SEAP) su stavljene na pločice i to 10,000 ćelija po otvoru na pločicama sa 96 otvora u DMEM koji je sadržao 0,5% FCS. Narednog dana je dodat svež medijum sa ili bez različitih koncentracija TGFp i OPG (osteoprotegerin) a ćelije su inkubirane tokom dodatna 72 sata pre prikupljanja supernatanata za SEAP esej.

Ekspresija SEAP je merena prema protokolu proizvođača (Clontech kit).

tn vivostudije

Fibroza pluća je indukovana kod mužjaka miševa (20-25 g) intratrahealnom administracijom bleomicina (0.075 IU) u fiziološkom rastvoru 1. dana. Miševi su podeljeni u tri odvojene grupe sa po 10 životinja. Jedna grupa je primila subkutane (s.c) injekcije OPG u dozi od 5 mg/kg (u fiziološkom rastvoru ) na dan. Druga grupa je primila OPG (0.5 mg/kg) s.c. dnevno. Treća grupa je primala fiziološki rastvor (s.c.) svakodnevno. Četvrta grupa je uključivala netretirane nedirnute miševe usklađene po pitanju starosti I pola. Telesna masa je merena svakodnevno a svi miševi su žrtvovani 12. dana. Individualni režnjevi pluća su izolovani radi određivanja hidroksiprolina (Smith et al., 1994), ili su fiksirani u formalinu i ukalupljeni u parafinu radi histološkog pregleda. Preseci pluća su prebojeni sa tri-hrom ili picro sirius crvenom radi utvrđivanja kolagena (Bancroft i Stevens) I sačinjen je skor obima fibroze pluća.

Semi- kvantitativna PCR analiza obrnute transkriptaze mRNK OPG u

fibroblastima pacijenata sa sklerodermom tretiranih halofuginonomin vitro .

Fibroblasti sa lezijama/bez lezija su održavani u kulturi na način koji je gore opisan. Pojedinačni slojevi ćelija (70% konfluent) su tretirani halofuginonom (10~<8>M)

(Collgard Pharmaceuticals) tokom 12 h. Posle perioda tretmana, ćelije su prikupljene a ukupna RNK je izolovana uz korišćenje Trizol metode. Jedan ug ukupne RNK je potom podvrgnut PCR analizi obrnute transkriptaze kako je gore opisano uz korišćenje PCR primera specifičnih za osteoprotegerin (OPG 740 F 5' ACG CCT AAC TGG CTT AGT

GT (SEQ ID NO: 11) iOPG 1280R 5' CTG ATT GGA CCT GGT TAC CT SEQ ID NO: 12). Posle 30 ciklusa PCR, proizvodi reakcije su ispitivani na1% agaroznim gelovima prebojenom etidijum bromidom, fotografisanim i analiziranim uz pomoć Kodak 1D Digital Science softvera. PCR produkti koji migriraju na predviđenoj molekularnoj težini su potom verifikovani kao osteoprotegerin direktnim sekvencioniranjem DNK ekstrahovane iz gela. Radi kontrole genomske DNK kontaminacije, PCR reakcije su urađene na reakcionim mešavinama obrnute transkriptaze koje su sadržale odgovarajuću RNK ali ne i obrnutu transkriptazu. Reakcije obrnute transkriptaze su takođe amplifikovane sa GAPDH specifičnim PCR prajmerima u vidu pozitivne kontrole za integritet i kvantitet unete RNK u inicijalnu reakciju.

Promoterska aktivnost tip I kolagena g. 2 .

Fibroblasti mišjeg embriona (nS3 ćelije) su održavani u DMEM-F12 medijumu koji je sadržao 2% FCS i 2 mM glutamina. Ćelije su ubrane tripsinizacijom i stavljene na pločice u 50% konfluent u 48 otvora sa pločicama sa ćelijskom kulturom. Narednog dana je izvršena transfekcija ćelija u medijumu bez seruma sa pGL3 vektorom (Promega) koji sadrži 3.5 kb promotera of kolagen 1ot2 povezanog sa luciferazom cDNK (dobijenom Ijubaznošću Dr. Davida Abrahama iz Royal Free Hospital, London, Engleska) uz korišćenje Fugene V reagensa (Roche) prema instrukcijama proizvođača. Posle 5 h transfekcije ćelije su prenete na svežu podlogu koja sadrži 2% FCS i tretirane su samo halofuginonom (10"<1>° M), samo sa TGFpl (5 ng/ml) ili HF (10<8>M) + TGFpl (5 ng/ml) tokom 12 h u prisustvu 0, 1, 10 ili 100 ng/ml rekombinantnog humanog osteoprotegerina. Posle perioda tretmana, ćelije su prenete u kompletan medijum koji je sadržao 2 % FCS i 2 mM glutamina a aktivnost luciferaze je merena 48 h kasnije u svakom otvoru, uz pomoć sistema Bright-Glo eseja nabavljenog od Promege. Rezultati su izraženi u vidu jedinica relativne luminiscencije i normalizovani su prema brojućelija/otvoru određenogu paralelnom eksperimentuuzpomoćCyquant kita (MolecularneProbe).

Primer 1:mRNK osteoprotegerina se značajno silazno reguliše kod

fibroblasta sa lezijama u odnosu na fibroblaste bez lezija

Mikroerej analiza sa genskim filterom je izvršena na uzorcima normalnih i abnormalnih fibroblasta dobijenih od 6 pacijenata sa sklerodermom. Srednji nivo eskpresije osteoprotegerina (OPG) je prikazan na SI. 1a a za svakog pacijenta na SI.. 1b.

Rezultati dobijeni na mikroerejima su dalje potvrđeni uz pomoć PCR analize u stvarnom vremenu RNK uzoraka izolovanih od 9 pacijenata uz korišćenje PCR prajmera specifičnih za OPG. Rezultati su prikazani na SI. 2 i izraženi su kao promena nivoa ekspresije (sa lezijama podeljeni sa onima bez lezija). Kod 7 od 9 ispitivanih pacijenata, OPG je silazno regulisan najmanje dvostruko u fibrobalstima sa lezijama u odnosu na fibroblaste bez lezija izolovane od istog pacijenta.

Mala je verovatnoća da su razlike u ekspresiji primećene između fibrobalsta sa lezijama i fibrobalsta bez lezija od istih pacijenata rezultat razlika u uslovima kulture između ove dve populacije obzirom da se ekspresija mRNK OPG u primarnim kulturama normalnih humanih dermalnih fibrobalsta ne menja značajno pri prolasku ćelija (podatci nisu prikazani). Osim toga RT-PCR analiza u stvarnom vremenu ukupne RNK izolovane iz celokupnih bioptičkih uzoraka abnormalne kože pacijenata sa sklerodermom ukazala je na niže nivoe mRNK osteoprotegerina u poređenju sa kožom normalnog kliničkog izgleda sa odgovarajućeg anatomskog mesta istih pacijenata (Slika 3).

Primer 2:OPG je silazno regulisan na nivou protein a u fibroblastima sa

lezijama prema fibroblastima bez lezija pacijenata sa sklerodermom

Da bi se odredilo da li silazna regulacija mRNK osteoprotegerina odražava promenu proteina osteoprotegerina, sadržaj OPG u fibroblastima iz oštećene I normalne kože sa anatomski usklađenog mesta Ispitanika koji su usklađeni po pitanju pola I starosti određivan je VVestern Blot analizom uz korišćenje anti-humanih monoklonih antitela osteoprotegerina. Rezultati su prikazani na Slici 4. Monomeri I dimeri osteoprotegrina su bili jasno detektabilni kod 3/4 normalnih fibroblasta a ekspresija je bila slaba u 1 normalnom uzorku. Kod abnormalnih fibroblasta monomerna traka je bila slabo vidljiva kod sva četiri testirana uzorka. Rekombinantno eksprimiran OPG-Fc fuzioni protein je služio kao pozitivna kontrola za prebojavanje.

Primer3:Kloniranje humanog OPG

Da bi se okarakterisala OPG aktivnostin vitroiin vivopotpuna sekvenca kodirajanja cDNK je klonirana uz pomoć PCR sa obrnutom transkriptazom uz korišćenje primera na bazi objavljene sekvence OPG, koja je bočno postavila predviđene kodone početka i završetka. Analiza sekvence dobijenih OPG cDNK klonova (u pcDNA3.1) otkrila je 100% identičnost na nivou nukleotida sa sekvencom OPG koju su objavili Morinaga et al., (Morianga et al., 1998) ali koja se razlikovala za 1 amino kiselinu od sekvence koju su objavili Simonet et al. (1997) (videti SEQ ID NO: 2 i 4).

Primer 4:Uticaj na sintezu OPG tip I kolagena u ćelijskim lozama humanih

dermalnih fibroblasta

Fibroblasti kultivisani u prisustvu L-askorbata vrše sekreciju kolagena u podlogu za kulturu što omogućava detekciju kolagena uz pomoć ELISA. Humani fibroblasti uzlazno regulišu sintezu kolagena u okviru odgovora na stimulaciju profibrotičnim citokinom TGFpi. Stoga smo mi testirali efekat rekombinantnog osteoprotegerina (osteoprotegerin-Fc fuzioni protein) na sintezu kolagena indukovanu sa TGFpi u AG1518C fibroblastima. Osteoprotegerin dodat u kulture fibroblasta pre tretmana sa TGFpl tretmana mogao je da inhibira povećanje sinteze kolagena posredovano sa TGFpl na dozno zavistan način (Slika 5). Kada je eksperiment vršen u prisustvu neutrališućih anti OPG monoklonih antitela nije bilo nikakvog uticaja na sintezu. Slično tome, administracija samog anti OPG bez rekombinantnog OPG nije imala nikakav uticaj na sintezu kolagena što ukazuje da je smanjenje sinteze kolagena koje je zabeleženo predstavljalo specifični efekat OPG.

Zabeležen je sličan efekat na sintezu kolagena pri transfekciji primarnih humanih fibroblasta (OBHC) plazmidom koji sadrži celokupnu kodirajuću sekvencu OPG (pcDNA3.1/OPG). Kod OBHC kod kojih je izvršena transfekcija sa OPG plazmidom, nije zabeleženo nikakvo povećanje sinteze kolagena u vidu odgovora na stimulaciju TGFpi, nasuprot modelu (pcDNA3.1 prazan vektor) koji je podvrgnut transfekciji sa OBHC (Slika 6).

Primer 5:OPG tretman značajno smanjuje aktivnost bazalnog tip 1

kolagena alfa 2 prcmotera kao i indukovanog sa TGFpl u fibrobiastoma iz mišjeg

embriona

Da bi se procenilo da li je smanjenje sinteze kolagena uz pomoć OPG bilo posledica efekta na aktivnost promotera kolagena ispitali smo efekat OPG tretmana na fibroblaste mišjeg embriona koji su prethodno podvrgnuti transfekciji sa nekim plazmidom koji je sadržao reporter gen cDNK, luciferazu, pod kontrolom nekog 3.5 kb regiona tip I kolagen a2 promotera. Stimulacija promotera kolagena na ovom modelu dovodi do transkripcione aktivacije gena luciferase čija se aktivnost može izmeriti u prisustvu supstrata luciferina svitaca uz pomoć luminiscentnog eseja.

Tretman sa OPG u dozi od 1 ng/ml do 100 ng/ml mogao je značajno da smanji bazalni nivo kolagenske promoterske aktivnosti (Slika 7A, kontrola). Posle stimulacije TGFpi došlo je do najmanje dvostrukog povećanja kolagenske promoterske aktivnosti (Slika 7A, TGFpi). Ona je mogla značajno da se smanji ukoliko su ćelije istovremeno tretirane sa OPG u dozi od 100 ng/ml (P< 0.05).

Zabeleženo je da je biljni alkaloid halofuginon specifičan inhibitor sinteze kolagena tip I (Granot et al., 1993). Kada su fibroblasti tretirani niskim koncentracijama halofuginona (10"<1>° M) zabeležili smo dozno zavisno smanjenje kolagenske promoterske aktivnosti sa povećanjem koncentracija osteoprotegerina (sa1 ng/ml na 100 ng/ml) što je bilo visoko značajno kada su te4stirane najviše doze OPG (100 ng/ml, P< 0.01) (Slika 7A, HF). Halofuginon može da inhibira kolagensku promotersku aktivnost indukovanu sa TGFpi (McGaha et al 2002). OPG je takođe mogao da potencira efekte halofuginona inhibicijom povećanja kolagenske promoterske aktivnosti indukovane sa TGFpl na dozno zavistan način. Ovaj efekat je bio visoko značajan pri dozi od 100 ng/ml OPG (P< 0.01) kada se koncentracija kolagenske promoterske aktivnosti skoro vratila na bazalne nivoe (Slika 7, HF+TGFpi).

Primer 6:OPG deluje protiv transaktivacije faktora rasta vezivnog tkiva

posredovane sa TGFp

Faktor rasta vezivnog tkiva (CTGF) jedan protein od 38-kD bogat cisteinom stimuliše produkciju elemenata ekstracelularne matrice uz pomoć fibroblasta. Prekomerna ekspresija CTGF je kako je zabeleženo nađena kod mnogih fibroznih humanih tkiva , uključujući pluća, kožu, jetru, bubrege i krvne sudove. In vitro, TGFp aktivira CTGF gensku transkripciju u fibrobalstima ljudskih pluća. Jedan promoter-reporter CTGF je konstruisan sa sekretovanorn alkainom fosfatazom (SEAP) kao reporterom, čija ekspresija je merena u kondicioniranom medijumu umesto u ekstraktu ćelija.

Ćelijski ekspresivni CTGF-SEAP reporterski geni su inkubirani sa TGFp i 0.46, 1.4 ili 4.6 ug/ml OPG. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na SI. 7B. Inkubacija sa OPG je dovela do ekspresije CTGF indukovane sa TGFp što je takođe ukazalo na anti-fibroznu aktivnost OPG.

Primer 7:Ekspresija mRNK OPG u fibroblastima pacijenata sa

sklerodermom tretiranih halofuginonom

Mehanizam koji omogućava da halofuginon silazno reguliše sintezu kolagena u fibroblastima još uvek nije potpuno razjašnjen. Iz tog razloga smo ispitivali efekat halofuginon na ekspresiju OPG mRNK u sparenim fibrobalstima sa lezijama /bez lezija dobijenim od pacijenata sa sklerodermom uz pomoć PCR obrnute transkriptaze.

Ekspresija mRNK OPG je visoko uzlazno regulisana (najmanje 3 puta) u fibroblastima sa lezijama i fibroblastima bez lezija u svim ispitivanim uzrocima (3 normalna I 2 abnormalna) pri merenju 12 h posle tretmana sa 10~<8>M halofuginona (Slika 8). Interesantno, u eksperimentima sa genskom filterskom mikroerej analizom, OPG je bio jedan od gena sa najvišom uzlaznom regulacijom pri tretmanu fibroblasta sa halofuginonom (podatci nisu prikazani).

Primer 8:OPG administracijain vivoštiti miševe od fibroze pluća izazvane

bleomicinom

Administracija jedne intratekalne injekcije bleomicina je kod C57BL/6 miševa dovela do brze indukcije fibroze pluća u roku od 14 dana, koju je karakterisalo povećano deponovanje kolagena u plućnom intersticijumu (Hattori et al., 2000). Da bi se odredilo da li administracija OPG može da ima zaštitni efekat protiv razvoje fibroze ili na smanjenje težine bolesti, ispitivali smo efekat svakodnevnih injekcija OPG kod miševa tretiranih bleomicinom.

Bleomicin je primenjen u vidu pojedinačne intratekalne instilacije kod 3 grupe sa po 10 miševa. OPG je primenjivan u vidu subkutanih injekcija čije davanje je započeto jedan dan posle tretmana bleomicinom. Jedna grupa je dobila visoku dozu (5 mg/kg) do dok je druga grupa dobila nižu dozu (0.5 mg/kg). Kontrolni miševi su svakodnevno dobijali fiziološki rastvor s.c. Radi poređenja, u studiju je uključena četvrta grupa miševa koja je uključivala potpuno netretirane miševe usklađene po pitanju starosti i pola (naivni miševi).

Životinje tretirane bleomicinom su se odmah razbolele. To je dovelo do brzog gubitka telesne mase i smrti, nasuprot netretiranim životinjama koje su i dalje bile

raspoložene i zdrave i normalno su dobijale na težini (Slika 9A). Miševi tretirani sa niskim dozama OPG pokazivale su gubitak težine koji se mogao uporediti sa onim kod kontrolnh životinja. Kod ove grupe se takođe javio povećan mortalitet (Slika 9B). Miševi koji su primali visokje doze OPG prošli su daleko bolje uz opadanje telesne mase samo tokom prvih 5 dana tretmana. Ovo je takođe ukazivalo na nizak mortalitet kod ove grupe (<10%).

Svi preživeli miševi su žrtvovani 12 dana posle tretmana bleomicinom. Histološka analiza pluća otkrila je da je kod životinja tretiranih visokim dozama OPG daleko manja površina pluća bila zahvaćena fibrozom u poređenju sa životinjama kod kojih su fibrozne lezije pokrivale približno 70% površine pluća (SI. 10A). Miševi tretirani visokim dozama OPG su takođe ispoljili značajno niži sadržaj hidroksiprolina u plućima (P<0.05) u odnosu na kontrolne miševe i on se mogao uporediti sa onim zabeleženim kod netretiranih miševa (naivna grupa, SI. 10 B)). Smanjen sadržaj hidroksiprolina je takođe zabeležen kod miševa tretiranih sa niskim dozama OPG, iako nije dostigla statistički značajan nivo zbog malog broja preživelih miševa u ovoj grupi. Sadržaj hidroksiprolina je merilo deponovanja kolagena. Ovi rezultati ukazuju da tretman sa OPG efektivno dovodi do smanjenja deponovanja kolagena u plućima.

Claims (25)

1. Upotreba supstance za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju neke fibrozne bolesti, što je naznačeno time je ta supstanca odabrana iz grupe koja se sastoji od: a) Polipeptida koji sadrži SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; b) Polipeptida koji sadrži amino kiseline 22 do 401 iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; c) Polipeptida koji sadrži jedan, dva, tri ili četiri domena osteoprotegerina bogatih cisteinom d) Polipeptida koji sadrži amino kiseline 22 do 194 iz SEQ ID NO. 2 ili SEQ ID NO: 4; e) Muteina, bilo koga od (a) do (d), što je naznačeno time da sekvenca amino kiselina ima najmanje 40 % ili 50 % ili 60 % ili 70 % ili 80 % ili 90 % identičnost u odnosu na najmanje jednu od sekvenci u (a) do (d); f) Muteina, bilo kog od (a) do (d) koga kodira DNK sekvenca koja se hibridizuje u komplement DNK sekvence koja kodira bilo šta od (a) do (d) pod umereno strogim uslovima ili pod veoma strogim uslovima; g) Muteina, bilo kog od (a) do (d) što je naznačeno time da su sve promene sekvence amino kiselina konzervativne supstitucije amino kiselina u sekvencama amino kiselina od (a) do (d); h) Bilo koja so ili neki izoform, fuzionisani protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili cirkularno permutovani derivat bilo čega od (a) to (g).

2. Upotreba prema zahtevu 1, što je naznačeno time da je fibrozna bolest vezivnog tkiva.

3. Upotreba prema zahtevu 1 ili 2, što je naznačeno time da je fibrozna bolest skleroderma.

4. Upotreba prema bilo kom od prethodnih zahteva, što je naznačeno time da je data supstanca neki monomer ili dimer.

5. Upotreba prema bilo kom od prethodnih zahteva, što je naznačeno time da je data supstanca glikozilirana na jednom ili više mesta.

6. Upotreba prema bilo kom od prethodnih zahteva, što je naznačeno time da fuzionisani protein obuhvata fuziju imunoglobulina (Ig).

7. Upotreba prema zahtevu 6, što je naznačeno time da je fuzija Ig fuzija Fc .

8. Upotreba prema bilo kom od prethodnih zahteva, što je naznačeno time da funkcionalni derivat uključuje najmanje jedan deo spojen sa jednom ili više funkcionalnih grupa koje se javljaju kao jedan ili više bočnih lanaca ostataka amino kiselina.

9. Upotreba prema zahtevu 8, što je naznačeno time da je dati deo polietilenski deo.

10. Upotreba molekula nukleinske kiseline za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju neke fibrozne bolesti, što je naznačeno time da taj molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji sadrži jednu sekvencu amino kiselinine koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od: a) Polipeptida koji sadrži SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; b) Polipeptida koji sadrži amino kiseline 22 do 401 iz SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 4; c) Polipeptida koji sadrži jedan, dva, tri ili četiri domena osteoprotegerina bogatih cisteinom; d) Polipeptida koji sadrži amino kiseline 22 do 194 iz SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO. 4; e) Bilo kog muteina od (a) do (d), naznačenog time da sekvenca amino kiselina ima najmanje 40 % ili 50 % ili 60 % ili 70 % ili 80 % ili 90 % identičnost uodnosu na najmanjejednuod sekvenci u(a)do (d);f) Bilo kog muteina od (a) do (d) koga enkodira DNK sekvenca koja se hibridizuje u komplement sekvence nativne DNK koja kodira bilo šta od (a) do (d) pod umereno strogim uslovima ili pod veoma strogim uslovima; g) Bilo kog muteina od (a) do (d) što je naznačeno time da su sve promene sekvence amino kiselina konzervativne supstitucije amino kiselina u sekvencama amino kiselina od (a) do (d); h) Neki izoform, fuzionisani protein ili aktivna frakcija bilo čega od (a) do (g).

11. Upotreba prema zahtevu 10, što je naznačeno time da je fibrozna bolest vezivnog tkiva.

12. Upotreba prema zahtevu 10 ili 11, što je naznačeno time da je fibrozna bolest skleroderma.

13. Prema bilo kom zahtevu od 10 do 12, što je naznačeno time da molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu vektora ekspresije.

14. Upotreba prema zahtevu 13, što je naznačeno time da je sekvenca vektora sekvenca vektora genske terapije.

15. Upotreba nekog vektora za indukciju i/ili pojačanje endogene produkcije polipeptida prema zahtevu 1 u nekoj ćeliji za pripremu medikamenta za lečenje i/ili prevenciju neke fibrozne bolesti, posebno skleroderme.

16. Upotreba ćelije koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema bilo kom zahtevu od 10 do 15 za pripremu medikamenta za lečenje i/ili prevenciju fibrozne bolesti, posebno skleroderma.

17. Upotreba ćelije koja vrši ekspresiju supstance prema zahtevu 1 do 9 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju neke fibrozne bolesti, posebno skleroderme.

18. Upotreba genetski modifikovane ćelije za proizvodnju polipeptida prema zahtevima 1 do 9 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju neke fibrozne bolesti, posebno skleroderme.

19. Upotreba prema bilo kom od prethodnih zahteva, što je naznačeno time da taj medikament takođe sadrži interferon, za istovremenu, sekvencijalnu ili zasebnu upotrebu.

20. Upotreba prema zahtevu 19, što je naznačeno time da je taj interferon-(3.

21. Upotreba prema bilo kom od prethodnih zahteva, što je naznačeno time da dati medikament takođe sadrži antagonist faktora tumorske nekroze (TNF) istovremenu , sekvencijalnu ili zasebnu upotrebu.

22. Upotreba prema zahtevu 21, što je naznačeno time da je dati TNF antagonist TBPI i/ili TBPII.

23. Upotreba prema bilo kom od prethodnih zahteva, što je naznačeno time da dati medikament takođe sadrži neki agens protiv skleroderme za istovremenu, sekvencijalnu ili zasebnu upotrebu.

24. Upotreba prema zahtevu 25, što je naznačeno time je dati agens protiv skleroderme odabran iz grupe koja se sastoji od halofuginona, ACE inhibitora, blokatora kalcijumovih kanala, inhibitora protonske pumpe, NSAID, COX-inhibitora, kortikosteroida, tetraciklina, pentoksifilina, bucilamina, inhibitora geranilgeranil transferaze, roterlina, inhibitora prolil-4-hidrokslaze, inhibitora c-proteinaze, inhibitora lizil-oksidaze, relaksina, halofuginona, prostaglandina, prostaciklina, endotelin-1, azotoksida, inhibitora angiotenzina II, antioksidanata ili SARP-1.

25. Metoda za lečenje i/ili prevenciju fibrozne bolesti, posebno skleroderme, koja obuhvata administraciju efikasne količine supstance pacijentima kojima je ona potrebna prema bilo kom zahtevu od 1 do 24, opciono zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.