RS92704A

RS92704A - Molekuli prepoznavanja ćelijske površine koji sadrže imunoglobulinski domen

Info

Publication number: RS92704A
Application number: YU92704A
Authority: RS
Inventors: Andrew Robert Davids; Richard Joseph Fagan; Christopher Benjamin Phelps; Christine Power
Original assignee: Ares Trading S.A.
Priority date: 2002-04-30
Filing date: 2003-04-30
Publication date: 2006-12-15
Also published as: CA2483038A1; GB0209884D0; AU2003229961B2; EA200401453A1; MXPA04010674A; BR0309638A; AU2003229961A1; CN1665840A; EA007985B1; US20040204352A1; NO20044628L; JP2006502702A; EP1499640A2; WO2003093316A3; US7622555B2; KR20050008699A; WO2003093316A2; ZA200408453B; IL164777A0

Abstract

Ovaj protein se odnosi na jedan novi protein (INSP052), koji je ovde identifikovan kao molekul prepoznavanja na površini ćelije koji sadrži imunoglobulinski domen kao i na upotrebu ovih proteina i sekvenci nukleinskih kiselina iz kodirajućeg gena za dijagnozu, prevenciju i lečenje.

Description

MOLEKULI PREPOZNAVANJA NA POVRŠINI ĆELIJE KOJI SADRŽE DOMEN

IMUNOGLOBULINA

Ovaj pronalazak se odnosi na nove proteine (koji su nazvani INSP052 i INSP055), koji su ovde identifikovani kao molekuli prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina kao i na upotrebu ovih proteina i sekvenci nukleinske kiseline iz kodirajućih gena u dijagnozi, prevenciji i lečenju bolesti.

Sve publikacije patenti i patentni zahtevi koji su ovde citirani su u potpunosti navedeni u literaturi.

STANJE

Proces otkrivanja lekova trenutno prolazi kroz fundamentalnu revoluciju obzirom da na scenu stupa era funkcionalne genomike. Termin "funkcionalna genotnika" se odnosi na pristup koji koristi bioinformatičke alate za određivanje funkcije sekvenci proteina od interesa. Takvi alati postaju sve potrebniji kako se brzina kojom se prikupljaju podatci o sekvencama brzo nadmašuje sposobnost istraživačkih laboratorija sa odrede funkcije ovih sekvenci proteina, ovi alati brzo zamenjuju konvencionalne tehnike biohemijske karakterizacije. Naravno, napredni bioinformatički alati koji se koriste za identifikaciju ovog pronalaska su sada u stanju sa daju rezultate koji imaju visok stepen pouzdanosti.

Različite institucije i komercijalne organizacije ispituju podatke o sekvencama kako oni postaju dostupni i u hodu su napravljena značajna otkrića. Međutim i dalje ostaje stalna potreba da se identifikuju i okarakterišu drugi geni i polipeptidi koje oni kodiraju, što predstavlja cilj istraživanja i otkrivanje lekova.

Nedavno je podnosilac zahteva za ovaj pronalazak razvio izvanrednu alatku za procenu sekvenci nepoznatih funkcija. Ova alatka je sistem baze podataka koja je nazvana Biopendium baza podataka za pretraživanje i ona je predmet WO 01/69507. Ovaj sistem baze podataka se sastoji od integrisanih izvora podataka kreiranih uz pomoć zaštićene tehnologije i on sadrži informacije prikupljene ukupnim međusobnim poređenjem svih raspoloživih sekvenci proteina ili nukleinskih kiselina.

Cilj koji leži u osnovi integracije ovih podataka o sekvencama iz različitih izvora podataka je da se izvrši kombinacija što više podataka koji su u vezi sa samim sekvencama kao i sa informacijama relevantnim za svaku sekvencu, na jednom integralnom mestu. Svi raspoloživi podatci vezani za svaku sekvencu, uključujući i podatke o trodimenzionalnoj strukturi kodiranog proteina, ukoliko je raspoloživ, su zajedno integrisani kako bi se na najbolji način iskoristile informacije koje su poznate o svakoj sekvenci kako bi se tako omogućilo najedukovanije predviđanje na osnovu poređenja ovih sekvenci. Napomene koje su prikupljene u ovoj bazi podataka i koje prate svaku unetu sekvencu otkrivaju biološki relevantne podatke i informacije o sekvencama.

Ovaj izvor podataka je omogućio tačno predviđanje funkcije proteina samo na osnovu sekvence. Ukoliko se koristi konvencionalna tehnologija to je moguće samo kod proteina koji ispoljavaju visok nivo identiteta sekvenci (identitet veći od oko 20%-30%) u odnosu na druge proteine iz iste funkcionalne porodice. Tačno predviđanje nije moguće kod protina koji pokazuju nisku homolognost sekvenci u odnosu na njima srodne proteine čija je funkcija poznata.

PROTEINI KOJI SADRŽE SIGNALNE PEPTIDE

Sposobnost ćelija da formiraju i sekretuju ekstracelularne proteine je ključna u mnogim biološkim procesima. Ćelije vrše sekreciju enzima, faktora rasta, proteina ekstracelularne matrice i signalizacionih molekula. Do ovoga dolazi fuzijom sekretorne vezikule sa plazma membranom. U većini slučajeva, ali ne u svim, proteini su usmereni ka endoplazmatskom retikulumu i sekretornim vezikulama uz pomoć signalnog peptida. Signalni peptidi su cis-delujuće sekvence koje utiču na transport lanaca polipeptida iz citoplazme u odeljak vezan za plazmu kao što je to sekretorna vezikula. Polipeptidi koji su ciljani ka sekretornim vezikulama se sekretuju ili u ekstracelularnu matricu ili se zadržavaju u membrani plazme. Polipeptidi koju su zadržani u membrani plazme će imati jedan ili više transmembranskih domena. Primeri proteina koji sadrže signalne peptide koju igraju ključnu ulogu u funkcionisanju neke ćelije su citokini, hormoni, proteini ekstracelularne matrice, adhezioni molekuli, receptori, proteaze, i faktori rasta i diferencijacije.

MOLEKULI PREPOZNAVANJA NA POVRŠINI ĆELIJE KOJI SADRŽE DOMEN IMUNOGLOBULINA

Molekuli prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina kako se pokazalo igraju određenu ulogu u različitim fiziološkim funkcijama, a mnogi od njih mogu da igraju određenu ulogu u nekim procesima bolesti. Promena njihove aktivnosti predstavlja sredstvo da se promeni fenotip bolesti i kao takva, identifikacija novih molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina je veoma relevantna obzirom da oni mogu da igraju određenu ulogu u mnogim bolestima, posebno inflamatornim bolestima, onkološkim i kardiovaskularnim bolestima. Molekuli prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina učestvuju u čitavom spektru bioloških procesa, uključujući embriogenezu (Martin-Bermudo, M.D.et al,Development. 2000 127(12):2607-15; Chen, L.M.,et al,J Neurosci. 2000 20(10):3776-84; Zvveegman, S,et al,Exp Hematol. 2000 28(4):401-10; Darribere, T.,et al,Biol Cell. 2000 92(l):5-25), održavanje integriteta tkiva (Eckes, B.,et al.,J Cell Sci. 2000 113(Pt 13):2455-2462; Buckvvalter, J.A.,et al.,Instr Course Lect. 2000 49:481-9; Frenette, P.S.,et al.,.J Exp Med. 2000 191 (8): 1413-22; Delmas, V,et al,Dev Biol. 1999 216(2):491-506; Humphries, M.J,et al,Trends Pharmacol Sci. 2000 21(l):29-32; Miosge, N.,et al,Lab Invest. 1999 79(12): 1591-9; Nagaoka T,et al.Am J Pathol 2000 Jul 157:1 237-47; Nvvariaku FE,et al.J Trauma 1995 39(2): 285-8; Zhu X,et al.Zhonghua Zheng Xing Shao Shang Wai Ke Za Zhi 1999 15(1): 53-5), ekstravazaciju/inflamaciju leukocita (Lim, L.H.,et alAm J Respir Cell Mol Biol. 2000 22(6):693-701; Johnston, B.,et al,Mikrocirkulaciju. 2000 7(2):109-18; Mertens, A.V.,et al,Clin Exp Allergy. 1993 23(10):868-73; Chcialowski, A.,et al,Pol Merkuriusz Lek. 2000 7(43): 13-7; Rojas, A.I.,et al,Crit Rev Oral Biol Med. 1999 10(3):337-58; Marinova-Mutafchieva, L.,et al,Arthritis Rheum. 2000 43(3):638-44; Vijayan, K.V.,et al,J Clin Invest. 2000 105(6):793-802; Currie, A.J.,et al,.J Immunol. 2000 164(7):3878-86; Rowin, M.E.,et al,Inflammation. 2000 24(2): 157-73; Johnston, B.,et al,J Immunol. 2000 164(6):3337-44; Gerst, J.L,et al,J Neurosci Res. 2000 59(5):680-4; Kagavva, T.F.,et al,Proc Natl Acad Sci USA. 2000 97(5):2235-40; Hillan, K.J.,et al,Liver. 1999 19(6): 509-18; Panes, J, 1999 22(10):514-24; Arao, T.,et al,J Clin Endocrinol Metab. 2000 85(l):382-9; Souza, H.S,et al,Gut. 1999 45(6):856-63; Grunstein, M.M.,et al,Am J Phvsiol Lung Cell Mol Physiol. 2000 278(6):L1 154-63; Mertens, A.V.,et al,Clin Exp Allergy. 1993 23(10):868-73; Berends, C,et al,Clin Exp Allergy. 1993 23(11):926-33; Fernvik, E,et al,Inflammation. 2000 24(l):73-87; Bocchino, V,et al,J Allergy Clin Immunol. 2000 105(1 Pt l):65-70; Jones SC,et al,Gut 1995 36(5):724-30; Liu CM,et al,Ann Allergy Asthma Immunol 1998 81(2): 176-80; McMurray RW Semin Arthritis Rheum 1996 25(4):215-33; Takahashi H,et alEur J Immunol 1992 22(11): 2879-85; Carlos T,et alJ Heart Lung Transplant 1992 11(6): 1103-8; Fabrega E,et al,Transplantation 2000 69(4): 569-73; Zohrens G,et al,Hepatology 1993 18(4): 798-802; Montefort S,et alAm J Respir Crit Care Med 1994 149(5): 1149-52), onkogenezu (Orr, F.W.,et al,Cancer. 2000 88(S12):2912-2918; Zeller, W„et al,J Hematother Stem Cell Res. 1999 8(5):539-46; Okada, T.,et al,Clin Exp Metastasis. 1999 17(7):623-9; Mateo, V.,et al,Nat Med. 1999 5(11): 1277-84; Yamaguchi,K., et al,J Exp Clin Cancer Res. 200019(1):113-20; Maeshima, Y., et al,J Biol Chem. 2000 275(28):21340-8; Van Waes, C,et al,Int J Oncol. 2000 16(6): 1189-95; Damiano, J.S.,et al,Leuk Lymphoma. 2000 38(1-2):71-81; Seftor, R.E.,et al,Cancer Metastasis Rev. 1999 18(3):359-75; Shavv, L.M., J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1999 4(4):367-76; Weyant, M.J.,et al,Clin Cancer Res. 2000 6(3):949-56), angiogenezu (Koch AE,et alNature 1995 376 (6540): 517-9; Wagener C & Ergun S. Exp Cell Res 2000 261(1): 19-24; Ergun S,et alMol Cell 2000 5(2): 311-20), resorpciju kosti (Hartman GD, & Duggan ME. Expert Opin Investig Drugs 2000 9(6): 1281-91; Tanaka Y,et al.J Bone Miner Res 1995 10(10): 1462-9; Lark MW,et al.J Pharmacol Exp Ther 1999 291(2): 612-7; Raynal C,et alEndocrinologv 1996 137(6):2347-54; Ilvesaro JM,et alExp Cell Res 1998 242(1): 75-83), neurological dysfunction (Ossege LM,et al.Int Immunopharmacol 2001 1:1085-100; Bitsch A,et al,Stroke 1998 29:2129-35; ladecola C & Alexander M. Curr Opin Neurol 2001 14:89-94; Becker K,et alStroke 2001 32(1): 206-11; Relton JK,et alStroke 2001 32(1): 199-205; Hamada Y,et alJ Neurochem 1996 66:1525-31), trombogenezu (Wang, Y.G.,et al,J PhysioI (Lond). 2000 526(Pt l):57-68; Matsuno, H.,et al,Nippon Yakurigaku Zasshi. 2000 115(3):143-50; Eliceiri, B.P,et al,Cancer J Sci Am. 2000 6(Suppl 3):S245-9; von Beckerath, N.,et al,Blood. 2000 95(11):3297-301; Topol, E.J.,et al,Am Hcart J. 2000 139(6):927-33; Kroll, H.,et al,Thromb Haemost. 2000 83(3):392-6), i invaziju/adherenciju bakterijskih patogena za ćelije domaćina (Dersch P,et alEMBO J 1999 18(5): 1199-1213).

Detaljna karakterizacija strukture i funkcije nekoliko porodica molekula prepoznavanja na površini ćelija koji sadrže domen imunoglobulina dovela je do aktivnih programa brojnih farmaceutskih kompanija vezanih za razvoj modulatora koji bi se koristili za lečenje bolesti koje zahvataju inflamatornu, onkološku, neurološku, imunološku i kardiovaskularnu funkciju. Molekuli prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina učestvuju praktično u svim aspektima biologije od embriogeneze do apoptoze. Oni su od suštinskog značaja za strukturni integritet i homeostatsko funkcionisanje većine tkiva. Stoga nije iznenađujuće da defekti molekuli prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina izazivaju bolesti kao i da mnoge bolesti uključuju modulaciju funkcije molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina. Članovi ove porodice su opisani u donjoj Tabeli 1.

Porodica molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina zapravo sadrži nekoliko različitih porodica. Neke od ovih porodica imaju poseban farmaceutski značaj zbog traktabilnosti malih molekula. Tu spadaju:

l.Imunoglobulinski adhezioni molekuli predstavljaju protiv receptore za integrine i oni uključuju intracelulalrne adhezione molekule (ICAMs) i adhezione molekule vaskularnih ćelija (VCAMs). Članovi se sastoje od različitih brojeva globularnih ekstracelularnih domena nalik na imunoglobuline. Neki članovi ove porodice, na primer, PECAM-1 (CD31) i NCAM, posreduju homotipsku adheziju. Neki članovi ove porodice, na primer ICAM-1 i VCAM-1, posreduju adheziju preko interakcije sa integrinima. 2.Receptori faktora rasta na površini ćelije . Faktori rasta su ekstracelularni i da bi ispoljili biološke efekte oni stupaju u interakciju sa specifičnim, visoko afinitetnim receptorima koji su locirani na membranama plazme ciljnih ćelija. Molekularna karakterizacija jednog broja različitih receptora faktora rasta otkrila je da oni pripadaju različitim porodicama; receptori tirozin kinaze, sedam transmembranskih receptora udruženih sa G-proteinom, i receptori serin/treonin kinaze. Receptore tirozin kinaze karakteriše jedan ekstracelularni domen, jedan transmembranski domen i jedan intracelularni domen koji imaju aktivnost tirozin kinaze. VEGFR, PDGFR, FGFR, CSF-1R i c-KIT su primeri receptora rasta tirozin kinaze koji takođe sadrže imunoglobulinski domen u ekstracelulalrnom delu. Disregulacija funkcije faktora rasta dovodi do mnogih različitih fenotipova bolesti, uključujući između ostalog onkologiju (Bartucci Met al,(2001) Cancer Res. Sep 15;61(18):6747-54, Dias Set al,(2001) Proc Natl Acad Sci USA. Sep ll;98(19):10857-62, Djavan Bet al,(2001) World J Urol. 19(4):225-33), inflamaciju (Fiocchi C. (2001) J Clin Invest. Aug;108(4):523-6, Hodge Set al,(2001) Respirology. Sep;6(3):205-211, Fenwick SAet al,(2001) J Anat. Sep;199(Pt 3):231-40), neurološke bolesti (Cooper JDet al,(2001) Proc Natl Acad Sci U S A 98(18): 10439-44, Fahnestock Met al,(2001) Mol Cell Neurosci 18(2):210-20), i metabolizam (Vickers MHet al,(2001) endokrinologiju. 142(9):3964-73).

Molekuli prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina kako se pokazalo igraju određenu ulogu u različitim fiziološkim funkcijama, od kojih mnoge igraju određenu ulogu u procesima bolesti. Promena njihove aktivnosti predstavlja sredstvo za promenu fenotipa bolesti što znači daje identifikacija molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina veoma relevantna obzirom da oni mogu da igraju određenu ulogu u mnogim bolestima, posebno imunološkim, inflamatornim bolestima, ontologiji, kardiovaskularnim bolestima, bolestima centralnog nervnog sistema i infekcijama.

PRONALAZAK

Ovaj pronalazak se zasniva na otkriću da proteini INSP052 i INSP055 funkcionišu kao molekuli prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina. Primeri molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina su navedeni u Tabeli 1.

Prema jednom konceptu prvog aspekta ovog pronalaska, obezbeđen je polipeptid koji:

(i) obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiselina koje su navedene u SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 ekstracelularnom domenu INSP052; (ii) predstavlja njihov fragment koji ima aktivnost polipeptida prema (i), ili ima antigenu determinantu koja je zajednička sa polipeptidom prema (i); ili

(iii) predstavlja funkcionalni ekvivalent (i) ili (ii).

Termin "aktivnost polipeptida prema (i)", se odnosi na aktivnost molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrži domen imunoglobulina. Izraz aktivnost molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrži domen imunoglobulina se odnosi na polipeptide koji obuhvataju sekvencu amino kiselina ili strukturne karakteristike koje se mogu identifikovati kao konzervirane karakteristike unutar porodice molekula na površini ćelija koji sadrže domen imunoglobulina.

Polipeptid koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO:2 se u daljem tekstu naziva "INSP052 polipeptid eksona 1". Polipeptid koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO:4 se u daljem tekstu naziva "INSP052 polipeptid eksona 2". Polipeptid koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO:6 se u daljem tekstu naziva "INSP052 polipeptid eksona 3". Polipeptid koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO:8 se u daljem tekstu naziva "INSP052 polipeptid eksona 4". Polipeptid koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 10 se u daljem tekstu naziva "INSP052 polipeptid eksona 5". Polipeptid koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 12 se u daljem tekstu naziva "INSP052 polipeptid eksona 6". Polipeptid koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 14 se u daljem tekstu naziva "INSP052 polipeptid eksona 7". Kombinovanjem SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ IDNO:10, SEQ IDNO:12 i SEQ ID NO: 14 dobija se sekvenca navedena u SEQ ID NO: 16. Polipeptid koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 16 se u daljem tekstu naziva INSP052 polipeptid.

Termin "1NSP052 polipeptidni ekson" u smislu u kome je ovde korišćen uključuje polipeptide koji obuhvata ili se sastoji od INSP052 polipeptida eksona 1, INSP052 polipeptida eksona 2, INSP052 polipeptida eksona 3, INSP052 polipeptida eksona 4, INSP052 polipeptida eksona 5, INSP052 polipeptida eksona 6, INSP052 polipeptida eksona 7, INSP052 polipeptida i ekstracelularnog domena 1NSP052.

Prema jednom konceptu, polipeptid prema ovom konceptu se sastoji od sekvence amino kiselina navedenih u SEQ ID NO: 16 ili predstavlja njihov fragment ili funkcionalni ekvivalent. Prema drugom konceptu, taj polipeptid se sastoji od sekvence amino kiselina navedenih u SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ IDNO:12, ili SEQ1DN0:14, ili neke njihove varijante.

i) obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiselina ekstracelularnog domena

INSP052;

ii) predstavlja njihov fragment koji ima aktivnost polipeptida prema (i), ili ima

antigenu determinantu koja je zajednička sa polipeptidom prema (i); ili

iii) predstavlja funkcionalni ekvivalent (i) ili (ii).

Ekstracelularni domen INSP052 odgovara amino kiselinama 1-240 (videti odeljak sa Primerima). Videti takođe Sliku 7 f ekstracelularni domen INSP052.

Prema drugom konceptu prvog aspekta ovog pronalaska, obezbeđen je polipeptid koji:

(i) obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiselina koje su navedene u SEQ ID NO: 18, (ii) predstavlja njihov fragment koji ima aktivnost polipeptida (i), ili ima antigenu determinantu koja je zajednička sa polipeptidom (i); ili

(iii) predstavlja funkcionalni ekvivalent (i) ili (ii).

Izrazom "aktivnost polipeptida prema (i)", podrazumevamo aktivnost molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrži domen imunoglobulina.

Preferentno, polipeptid prema ovom konceptu se sastoji sekvence amino kiselina navedenih u SEQ ID NO: 18 ili predstavlja njihov fragment ili funkcionalni ekvivalent.

Polipeptid koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 18 se u daljem tekstu naziva "INSP055 polipeptid".

Prema drugom aspektu, ovaj pronalazak daje molekul purifikovane nukleinske kiseline koji enkodira polipeptid prvog aspekta ovog pronalaska.

Preferentno, molekul purifikovane nukleinske kiseline obuhvata ili se sastoji od sekvenci nukleinske kiseline koje su navedene u SEQ ID NO:l (enkodira INSP052 Polipeptid eksona 1), SEQ ID NO:3 (enkodira INSP052 polipeptid eksona 2), SEQ ID NO:5 (enkodira INSP052 polipeptid eksona 3), SEQ ID NO:7 (enkodira INSP052 polipeptid eksona 4), SEQ ID NO:9 (enkodira INSP052 polipeptid eksona 5), SEQ ID NO: 11 (enkodira INSP052 polipeptid eksona 6), SEQ ID NO: 13 (enkodira INSP052 polipeptid eksona 7), SEQ ID NO: 15 (enkodira INSP052 polipeptid), ili SEQ ID NO: 17 (enkodira INSP055 polipeptid), ili predstavlja suvišni ekvivalent ili fragment bilo koje od ovih sekvenci.

Kombinovanjem sekvenci navedenih u SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:l 1 i SEQ ID NO: 13 dobija se sekvenca navedena u SEQ IDNO:15.

Prema jednom konceptu drugog aspekta ovog pronalaska obezbeđen je molekul nukleinske kiseline koji enkodira polipeptid koji obuhvata ili se sastoji od ekstracelularnog domena INSP052. Preferentno, taj molekul nukleinske kiseline obuhvata ili se sastoji od sekvence nukleinske kiseline definisane na Slici 7 ili kodirajućem delu sekvence nukleinske kiseline definisanom na Slici 7.

U trećem aspektu, ovaj pronalazak daje molekul purifikovane nukleinske kiseline koji se hibridizuje pod veoma strogim uslovima sa molekulom nukleinske kiseline iz drugog aspekta ovog pronalaska.

U četvrtom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje vektor, kao što je vektor ekspresije , koji sadrži molekul nukleinske kiseline drugog i trećeg aspekta ovog pronalaska.

U petom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje transformaciju ćelija domaćina uz pomoć vektora iz četvrtog aspekta ovog pronalaska.

U šestom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ligand koji se specifično vezuje za i koji preferentno inhibira aktivnost polipeptida prvog aspekta ovog pronalaska.

Izrazom "aktivnost polipeptida iz ovog pronalaska" i sličnim izrazima, podrazumevamo aktivnost koja ja karakteristična za molekule prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina.

U sedmom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je efikasno za menjanje ekspresije prirodnog gena koji enkodira polipeptid iz prvog aspekta ovog pronalaska ili

reguliše aktivnost polipeptida iz prvog aspekta ovog pronalaska.

Jedinjenje iz sedmog aspekta ovog pronalaska može da povećava (agonizuje) ili smanjuje (antagonizuje) nivo ekspresije gena ili aktivnost polipeptida.

Važno je da identifikacija funkcije INSP052 i INSP055 polipeptida omogućava dizajniranje metoda skrininga koje mogu da identifikuju jedinjenja koja su delotvorna u tečenju i/ili dijagnozi bolesti. Ligandi i jedinjenja prema šestom i sedmom aspektu ovog pronalaska mogu se identifikovati uz pomoć takvih metoda. Ove metode su uključene u vidu različitih aspekata ovog pronalaska.

U sedmom aspektu, ovaj pronalazak daje polipeptid prvog aspekta ovog pronalaska, ili molekul nukleinske kiseline drugog ili trećeg aspekta ovog pronalaska, ili vektor četvrtog aspekta ovog pronalaska, ili ćeliju domaćina petog aspekta, ili ligand šestog aspekta ovog pronalaska, ili jedinjenje sedmog aspekta ovog pronalaska, za upotrebu u lečenju ili dijagnozi. Ovi molekuli se mogu takođe koristiti u proizvodnji medikamenta za lečenje bolesti u koje između ostalog spadaju ćelijski proliferativni poremećaji, autoimuni/inflamatorni poremećaji, kardiovaskularni poremećaji, neurološki i psihijatrijski poremećaji, razvojni poremećaji, genetski poremećaji, metabolički poremećaji, infekcije i druga patološka stanja. Ove bolesti preferentno obuhvataju neoplaziju, karcinom, tumor mozga, gliom, tumor kostiju, tumor pluća, tumor dojke, tumor prostate, tumor kolona, hemangiom, mijeloproliferativni poremećaj, leukemiju, hematološku bolest, neutropeniju, trombocitopeniju, poremećaje angiogeneze, dermatološku bolest, starenje, rane, opekotine, fibrozu, kardiovaskularnu bolest, restenozu, bolest srca, perifernu vaskularnu bolest, bolest koronarnih arterija, edem, tromboemboliju, dismenoreju, endometriozu, pre eklampsiju, bolest pluća, COPD, astmu, bolest kostiju, bolest bubrega, glomerulonefritis, bolest jetre, Kronovu bolest, gastritis, ulcerativni kolitis, ulcer, imuni poremećaj, autoimunu bolest, artritis, reumatoidni artritis, psorijazu, epidermolysis bullosa, sistemski lupus ervthematosus, ankilozirajući spondilitis, Lajmsku bolest, multiplu sklerozu, neurodegeneraciju, moždani udar, povredu mozga/kičmene moždine, Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, oboljenje motornih neurona, neuromišićnu bolest, HIV, AIDS, infekciju citomegalovirusom, gljivičnu infekciju, oftalmološki poremećaj, makularnu degeneraciju, glaukom, dijabetsku retinopatiju, povećan očni pritisak i druga stanja u kojima učestvuju molekuli prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina. Ovi delovi prvog, drugog, trećeg, četvrtog, šestog ili sedmog aspekta ovog pronalaska se mogu takođe koristiti u proizvodnji medikamenta za lečenje takvih bolesti.

U devetom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje metodu za dijagnostikovanje bolesti kod nekog pacijenta, koja uključuje procenu nivoa ekspresije prirodnog gena koji enkodira polipeptid prvog aspekta ovog pronalaska ili aktivnost polipeptida prvog aspekta ovog pronalaska u tkivu navedenog pacijenta i poređenje pomenutog nivoa ekspresije ili aktivnosti u odnosu na kontrolni nivo, što je naznačeno time da nivo koji se razlikuje od navedenog kontrolnog nivoa ukazuje na prisustvo bolesti. Takva metoda će se preferentno primenjivatiin vitro.Slične metode se mogu koristiti za praćenje terapije bolesti kod nekog pacijenta, što je naznačeno time da promena nivoa ekspresije ili aktivnosti nekog polipeptida ili molekula nukleinske kiseline tokom određenog vremenskog perioda u odnosu na kontrolni nivo ukazuje na regresiju bolesti.

Preferentna metoda za detekciju polipeptida iz prvog aspekta ovog pronalaska obuhvata korake: (a) dovođenje u kontakt liganda, kao što je neko antitelo, iz šestog aspekta ovog pronalaska sa biološkim uzorkom pod uslovima koji su pogodni za formiranje kompleksa ligand-polipeptid i (b) detekcija navedenog kompleksa.

Postoji jedan broj različitih metoda prema devetom aspektu ovog pronalaska, čega je stručni čitalac svestan, kao što je metoda hibridizacije nukleinske kiseline sa kratkim probama, analiza tačkaste mutacije, amplifikacija lančane reakcije polimeraze (PCR) i metode kod kojih se koriste antitela za detekciju aberantnih nivoa proteina. Slične metode se mogu koristiti kratkoročno ili dugoročno kako bi se omogućio terapijski tretman bolesti koja se prati kod datog pacijenta. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kitove koji su korisni za ove metode za dijagnostikovanje bolesti.

Preferentno, bolest dijagnostikovana metodom iz devetog aspekta ovog pronalaska je bolest u kojoj učestvuju molekuli prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina, kako je gore opisano.

U desetom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu polipeptida prvog aspekta ovog pronalaska kao molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina. Značaj Ig domena u receptorima na površini ćelije opisali su Lokker NA et al., u "Funkcionalni značaj receptorskih ekstracelularnih domena nalik na imunoglobilin faktora rasta izvedenog iz trombocita. Identifikacija mesta vezivanja PDGF i neutralizacija monoclonih antitela,"JBiol Chem1997 Dec 26;272(52):33037-44.

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu molekula nukleinske kiseline prema drugom ili trećem aspektu ovog pronalaska kako bi se eksprimirao protein koji ima aktivnost molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrži domen imunoglobulina. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje metodu za efektuaciju aktivnosti molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrži domen imunoglobulina, a navedena metoda koristi polipeptid iz prvog aspekta ovog pronalaska.

U jedanaestom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutski sastav koji se sastoji od polipeptida prvog aspekta ovog pronalaska ili molekula nukleinske kiseline drugog ili trećeg aspekta ovog pronalaska, ili vektor četvrtog aspekta ovog pronalaska, ili ćeliju domaćina petog aspekta of ovog pronalaska, ili ligand šestog aspekta ovog pronalaska, ili jedinjenje sedmog aspekta ovog pronalaska, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

U dvanaestom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid prvog aspekta ovog pronalaska, ili molekul nukleinske kiseline drugog ili trećeg aspekta ovog pronalaska, ili vektor četvrtog aspekta ovog pronalaska, ili ćeliju domaćina petog aspekta ovog pronalaska, ili ligand šestog aspekta ovog pronalaska, ili jedinjenje sedmog aspekta ovog pronalaska, za upotrebu u lečenju ili dijagnozi. Ovi molekuli se mogu takođe koristiti u proizvodnji medikamenta za lečenje bolesti u koje između ostalog spadaju ćelijski proliferativni poremećaji, autoimuni/inflamatorni poremećaji, kardiovaskularni poremećaji, neurološki i psihijatrijski poremećaji, razvojni poremećaji, genetski poremećaji, metabolički poremećaji, infekcije i druga patološka stanja. Ove bolesti preferentno obuhvataju neoplaziju, karcinom, tumor mozga, gliom, tumor kostiju, tumor pluća, tumor dojke, tumor prostate, tumor kolona, hemangiom, mijeloproliferativni poremećaj, leukemiju, hematološku bolest, neutropeniju, trombocitopeniju, poremećaje angiogeneze, dermatološku bolest, starenje, rane, opekotine, fibrozu, kardiovaskularnu bolest, restenozu, bolest srca, perifernu vaskularnu bolest, bolest koronarnih arterija, edem, tromboemboliju, dismenoreju, endometriozu, pre eklampsiju, bolest pluća, COPD, astmu bolest kostiju, bolest bubrega, glomerulonefritis, bolest jetre, Kronovu bolest, gastritis, ulcerativni kolitis, ulcer, imuni poremećaj, autoimunu bolest, artritis, reumatoidni artritis, psorijazu, epidermolvsis bullosa, sistemski lupus ervthematosus, ankilozirajući spondilitis, Lajmsku bolest, multiplu sklerozu, neurodegeneraciju, moždani udar, povredu mozga/kičmene moždine, Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, oboljenje motornih neurona, neuromišićnu bolest, HIV, AIDS, infekciju citomegalovirusom, gljivičnu infekciju, oftalmološki poremećaj, makularnu degeneraciju, glaukom, dijabetsku retinopatiju, povećan očni pritisak i druga stanja u kojima učestvuju molekuli ćelijskog prepoznavanja koji sadrže imunoglobulinski domen.

U trinaestom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje metodu za lečenje neke bolesti kod pacijenta koja podrazumeva administraciju polipeptida prvog aspekta ovog pronalaska datom pacijentu, ili molekul nukleinske kiseline drugog ili trećeg aspekta ovog pronalaska, ili vektor četvrtog aspekta ovog pronalaska, ili ćeliju domaćina petog aspekta ovog pronalaska, ili ligand šestog aspekta ovog pronalaska, ili jedinjenje sedmog aspekta ovog pronalaska.

Kod bolesti kod kojih se ekspresija prirodnog gena koji enkodira polipeptid prvog aspekta ovog pronalaska, ili kod kojih je aktivnost polipeptida prvog aspekta ovog pronalaska niža kod obolelih pacijenata u poređenju sa nivoom ekspresije ili aktivnosti kod zdravih pacijenata, dati polipeptid, molekul nukleinske kiseline, ligand ili jedinjenje koje se daje pacijentu treba da budu agonisti. Suprotno tome, kod bolesti kod kojih je ekspresija prirodnog gena ili aktivnost polipeptida viša kod obolelog pacijenta u poređenju sa nivoom ekspresije ili aktivnosti kod zdravog pacijenta, dati polipeptid, molekul nukleinske kiseline, ligand ili jedinjenje koje se daje pacijentu treba da bude antagonist. Primeri takvih antagonista uključuju antisens molekule nukleinske kiseline, ribozome i Ugande, kao što su antitela.

U četrnaestom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje transgene ili knockout ne-humane životinje koje su transformisane da eksprimiraju više, niže ili odsutne nivoe polipeptida prvog aspekta ovog pronalaska. Takve transgene životinje predstavljaju veoma korisne modele za ispitivanje bolesti i mogu se takođe koristiti kod režima skrininga radi identifikacije jedinjenja koja su delotvorna u lečenju ili dijagnozi takvih bolesti.

Preferentno, date bolesti su bolesti u kojima učestvuju molekuli prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina, kako je gore opisano.

Treba imati u vidu da obim zaštite kome se teži kod polipeptida i nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska ne obuhvata i nukleinske kiseline ili polipeptide koji su prisutni u njihovim prirodnim izvorima. Što znači da se polipeptidi i nukleinske kiseline kojima se bavi ovaj pronalazak mogu smatrati "izolovanim" ili "purifikovanim". Termini "izolovana" i "purifikovana" u smislu u kome su ovde korišćeni odnose se na nukleinsku kiselinu ili polipeptid odvojen od najmanje jedne komponente (npr., nukleinska kiselina ili polipeptid) koja je prisutna zajedno sa tom nukleinskom kiselinom ili polipeptidom u njihovom prirodnom izvoru. Tako će, na primer, polipeptid koji se nalazi u ekstraktu tkiva predstavljati "izolovan" ili "purifikovan" polipeptid, kao što je to slučaj i sa polipeptidom koji je sintetički ili rekombinantno proizveden. Prema jednom konceptu, nukleinska kiselina ili polipeptid koji se nalaze samo u prisustvu (ukoliko ih ima) rastvarača, pufera, jona ili bilo koje druge komponente koja je normalno prisustva i njihovom rastvoru.

Treba napomenuti da termini "izolovan" i "purifikovan" ne označavaju metodu kojoj su dobijeni polipeptid ili nukleinska kiselina ili nivo čistoće preparata. To znači da se takve izolovane ili purifikovane vrste mogu proizvoditi rekombinantno, izolacijom direktno iz ćelije ili tkiva od interesa ili se mogu proizvoditi sintetički na osnovu utvrđenih sekvenci.

Kratak prikaz standardnih tehnika i postupaka koji se mogu koristiti pri upotrebi ovog pronalaska je dole dat. Treba shvatiti da ovaj pronalazak nije ograničen na neku određenu metodologiju, protokole, ćelijske loze, vektore i reagense koji su opisani. Takođe treba shvatiti da terminologija koja je ovde korišćena za opisivanje različitih koncepata služi samo za opisivan je različitih koncepata i ona nema za cilj da ograniči domen ovog pronalaska. Obim ovog pronalaska je ograničen samo uslovima iz zahteva koji se nalaze u apendiksu.

U ovoj specifikaciji su korišćene standardne skraćenice za nukleotide i amino kiseline.

U praksi će se za ovaj pronalazak koristiti, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike molekularne biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK tehnologije i imunologije koje su poznate stručnjacima iz ove oblasti.

Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Primeri posebno pogodnih tekstova koje treba konsultovati su sledeći: Sambrook Molecular Cloning; A Laboratorv Manual, Second Edition (1989); DNK Cloning, Volumes I and II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Svnthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nukleic Acid Hvbridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzimi (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), posebno tomovi 154 & 155; Gene Transfer Vektors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.); and Handbook of Experimental Immunologv, Volumes I-IV (D.M. VVeirand C. C. Blackvvell eds. 1986).

U smislu u kome je ovde korišćen, termin "polipeptid" uključuje bilo koji peptid ili protein koji uključuje sve ili više amino kiselina koje su međusobno vezane peptidnim vezama ili modifikovanim peptidnim vezama, tj. peptidnim izosterima. Ovaj termin se odnosi kako na kratke lance (peptidi i oligopeptidi) tako i na duže lance (proteini).

Polipeptid iz ovog pronalaska može biti u obliku zrelog proteina ili može biti neki pre-, pro- ili prepro- protein koji se može aktivirati cepanjem pre-, pro- ili prepro- dela kako bi se proizveo aktivni zreli polipeptid. Kod takvih polipeptida, pre-, pro- ili prepro- sekvenca može biti liderska ili sekretorna sekvenca ili može biti sekvenca koja se koristi za purifikaciju sekvence zrelog polipeptida.

Polipeptid prvog aspekta ovog pronalaska može da predstavlja deo fuzionisanog proteina. Na primer, često je korisno uključiti jednu ili više dodatnih sekvenci amino kiselina koje mogu da uključuju sekretorne ili liderske sekvence, pro-sekvence, sekvence koje pomažu u purifikaciji, ili sekvence koje prenose veću stabilnost proteina, na primer tokom rekombinantne proizvodnje. Umesto toga ili uz to, zreli polipeptid se može fuzionisati sa drugim jcdinjenjem, kao što su jedinjenja za produžetak polu-života polipeptida (na primer, polietilen glikol ).

Polipeptidi mogu da sadrže druge amino kiseline osim 20 amino kiselina koje enkodiraju gene, modifikovane prirodnim procesom, kao što su tehnike post-translacione obrade ili hemijske modifikacije koje su dobro poznate u ovoj stručnoj oblasti. Među poznate modifikacije koje mogu biti uobičajene kod polipeptida iz ovog pronalaska spadaju glikozilacija, spajanje lipida, sulfacija, gama-karboksilacija, na primer ostataka glutaminske kiseline, hidroksilacija i ADP-ribozilacija. U druge potencijalne modifikacije spadaju acetilacija, acilacija, amidacija, kovalentno vezivanje flavina, kovalentno vezivanje hemskog dela, kovalentno vezivanje nukleotida ili derivata nukleotida, kovalentno vezivanje derivata lipida, kovalentno vezivanje fosfatidilinozitola, unakrsno vezivanje, ciklizacija, formiranje disuifidne veze, demetilacija, formiranje kovalentnih unakrsnih veza, formiranje cisteina, formiranje piroglutamata, formilaciju, formiranje GP1 ankera, jodinaciju, metilaciju, miristoilaciju, oksidaciju, proteolitičku obradu, forsforilaciju, prenilaciju, racemizaciju, selenoilaciju, dodavanje amino kiselina u proteine

posredovano sa transfer-RNK kao što je arginilacija i ubikvitacija.

Do modifikacija može da dođe bilo gde u polipeptidu, uključujući i osnovnu konstrukciju peptida, bočne lance amino kiselina i amino ili karboksilne terminalne krajeve. Zapravo, blokiranje amina ili karboksilnih terminusa u polipeptidu, ili oba, putem kovalentne modifikacije je često kod polipeptida koji se prirodno javljaju kao i kod sintetičkih polipeptida a takve modifikacije mogu biti prisutne u polipeptidima iz ovog pronalaska.

Modifikacije koje se javljaju u nekom polipeptidu su često u funkciji načina na koji je dati polipeptid napravljen. Kod polipeptida koji su napravljeni rekombinantno, prirodu u obim modifikacije će u velikog meri odrediti sposobnost post-translacione modifikacije posebno ćelija domaćina i modifiakcionih signala koji su prisutni u sekvenci amino kisleine datog polipeptida. Na primer, obrasci glikozilacije se razlikuju kod različitih tipova ćelija domaćina.

Polipeptidi iz ovog pronalaska se mogu pripremiti na bilo koji pogodan način. Takvi polipeptidi uključuju izolovane polipeptide koji se prirodno javljaju (na primer purifikovani iz ćelijske kulture), polipeptidi koji su rekombinantno proizvedeni (uključujući fuzione proteine), sintetički proizvedeni polipeptidi ili polipeptidi koji su proizvedeni kombinacijom ovih metoda.

Funkcionalno ekvivalentni polipeptidi prvog aspekta ovog pronalaska mogu biti polipeptidi koji su homologni sa INSP052 i INSP055 polipeptidima. Za dva polipeptida se kaže sa su "homologni", u značenju koje je ovde korišćeno, ukoliko sekvenca jednog polipeptida ima dovoljno visok stepen identičnosti ili sličnosti sa sekvencom drugog polipeptida. "Identičnost" označava daje bilo koji položaj na uporednoj sekvenci ostatka amino kiseline identičan kod sekvenci. "Sličnost" označava da je bilo koji položaj uporedne sekvence ostatka amino kiseline sličnog tipa kod sekvenci Stepen identičnosti i sličnosti se mogu lako izračunati (Computational Molecular Biologv, Lesk, A.M., ed., Oxford Universitv Press, Nevv York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nevv York, 1993; Computer Analvsis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., i Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nevv Jersev, 1994; Sequence Analvsis in Molecular Biologv, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analvsis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nevv York, 1991).

Homologni polipeptidi stoga obuhvataju prirodne biološke varijante (na primer, alelične varijante ili geografske varijacije unutar vrsta iz kojih su polipeptidi izvedeni) i mutante (kao što su mutanti koji sadrže supstitucije amino kiselina, insercije ili delecije) INSP052 i INSP055 polipeptida. Takvi mutanti mogu da obuhvataju polipeptide kod kojih su ostatci jedne ili više amino kiselina zamenjeni konzerviranim ili ne-konzervisani ostatak amino kiseline (preferentno a konzervisani ostatak amino kiseline) a takav supstitucionisani ostatak amino kiseline može da bude ili ne bude enkodiran genetskim kodom. Takve tipične supstitucije su između Ala, Val, Leu i lle; između Ser i Thr; između kiselih ostataka Asp i Glu; između Asn i Gln; između bazičnih ostataka Lys i Arg; ili između aromatičnih ostataka Phe i Tvr. Posebno su preferentne varijante kod kojih je nekoliko, tj. između 5 i 10, 1 i 5, 1 i 3, 1 i 2 ili samo 1 amino kiselina supstitucionisana, obrisana ili dodata u bilo kojoj kombinaciji. Posebno su preferentne tihe supstitucije, dodavanja ili delecije, koje ne menjaju svojstva i aktivnosti proteina. U tom smislu su takođe posebno preferentne konzervativne supstitucije. U takve mutante takođe spadaju polipeptidi kod kojih ostatci jedne ili više amino kiselina uključuju supstituentnu grupu.

Tipično se identičnost veća od 30% i između dva polipeptida smatra oznakom funkcionalne ekvivalentnosti. Preferentno, funkcionalno ekvivalentni polipeptidi prvog aspekta ovog pronalaska imaju određeni stepen identičnosti sekvence sa 1NSP052 i INSP055 polipeptidima, ili sa njihovim aktivnim fragmentima, veći od 80%. Preferentniji polipeptidi imaju stepen identičnosti veći od 85%, 90%, 95%, 98% odnosno 99%,.

Funkcionalno ekvivalentni polipeptidi prvog aspekta ovog pronalaska mogu takođe biti polipeptidi koji su identifikovani uz pomoć jedne ili više tehnika strukturnog poređenja. Na primer, Inpharmatica Genome Threader™ tehnologija koja čini jedan aspekt alata za pretraživanja i koja je korišćena za formiranje Biopendium baze podataka za pretraživanje može da se koristi (videti naredni Međunarodni patentni zahtev br. PCT/GBO1/01105, objavljen kao WO 01/69507) radi identifikacije polipeptida čija funkcija trenutno nije poznata koji su iako imaju nisku identičnost sekvence u poređenju sa polipeptidima INSP052 i INSP055 predviđeni da budu molekuli prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže domen imunoglobulina, a navedena metoda koristi polipeptid prvog aspekta ovog pronalaska, tako što ima značajnu zajedničku strukturni homologiju sa sekvencom polipeptida INSP052 i INSP055. Termin "značajna strukturna homologija" označava da Inpharmatica Genome Threader™ predviđa da dva proteina imaju istu strukturnu homologju sa pouzdanošću od najmanje 10% a preferentnije najmanje 20%, 30%, 40%>, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% i iznad toga.

Polipeptidi prvog aspekta ovog pronalaska takođe obuhvataju fragmente polipeptida INSP052 i INSP055 i fragmente funkcionalnih ekvivalenata peptida INSP052 i INSP055 pod uslovom da ti fragmenti zadržavaju aktivnost molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrži domen imunoglobulina ili imaju antigenu determinantu koja je zajednička sa polipeptidima INSP052 i INSP055.

U smislu u kome je ovde korišćen, termin "fragment" se odnosi na polipeptid koji ima sekvencu amino kiselina koja je delimično ali ne u celini ista kao deo sekvence amino kiselina polipeptida 1NSP052 i INSP055 ili jednog od njihovih funkcionalnih ekvivalenata. Ti fragmenti treba da obuhvataju najmanje n konsekutivnih amino kiselina iz date sekvence ii u zavisnosti od određene sekvence, nje preferentno 7 ili veće (na primer, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ili veće). Mali fragmenti mogu da formiraju neku antigenu determinantu.

Takvi fragmenti mogu biti "samostalni", tj. da ne predstavljaju deo niti su fuzionisani sa drugim amino kiselinama ili polipeptidima, ili mogu da budu uključeni u neki veći polipeptid čineći njegov deo ili region. U poređenju sa nekim većim polipeptidom, fragment ovog pronalaska najpreferentnije formira jedan kontinuirani region. Na primer, određeni preferentni koncepti se odnose na fragment koji ima pre - i/ili pro- polipeptidni region fuzionisan sa amino terminusom datog fragmenta i/ili jedan dodatni region fuzionisan sa karboksilinim krajem datog fragmenta. Međutim, nekoliko fragmenata može biti uključenu ujedan veći polipeptid.

Polipeptidi iz ovog pronalaska ili njihovi imunogeni fragmenti (koji obuhvataju najmanje jednu antigenu varijantu) mogu se koristiti za dobijanje liganda, kao što su poliklona ili monoklona antitela, koja su imunospecifična za polipeptide. Takva antitela se mogu koristiti za izolaciju ili identifikaciju klona koji eksprimiraju polipeptide iz ovog pronalaska ili purifikaciju polipeptida afinitetnom hromatografijom . Ova antitela se mogu takođe, između ostalog, koristiti kao dijagnostička ili terapeutska sredstva, što će stručnom čitaocu biti jasno.

Termin "imunospecifičan" označava da ova antitela imaju značajno veći afinitet ka polipeptidima iz ovog pronalaska u odnosu na njihov afinitet prema drugim srodnim polipeptidima iz prethodnog rada. U smislu u kome je ovde korišćen, termin "antitelo" se odnosi na intaktne molekule kao i na njihove fragmente, kao što su Fab, F(ab')2 i Fv, koji mogu da se vezuju sa datim antigenim determinantama. Takva antitela se stoga vezuju za polipeptide prvog aspekta ovog pronalaska.

Izrazom "značajno veći afinitet" označavamo da postoji merljivo povećanje afiniteta prema polipeptidu iz ovog pronalaska u poređenju sa afinitetom ka poznatim molekulima prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže imunoglobulinski domen.

Preferentno, afinitet je najmanje 1.5-struko, 2-struko, 5-struko 10-struko, 100-struko, 10<3->struko, 10<4->struko, 10<3->struko ili 10<6->struko veći ka polipeptidu iz ovog pronalaska nego ka poznatim molekulima prepoznavanja na površini ćelije koji sadrže imunoglobulinski domen.

Ukoliko se žele poliklona antitela, odabrani sisar, kao što su miš, zec, koza ili konj se mogu imunizovati polipeptidom iz prvog aspekta ovog pronalaska. Polipeptid korišćen za imunizaciju životinje se može izvesti tehnologijom rekombinantne DNK ili se može hemijski sintetizovati. Ukoliko je potrebno, polipeptid se može konjugovati sa proteinom nosačem. Uobičajeno korišćeni nosači sa kojima se polipeptidi mogu hemijski spajati uključuju goveđi albumin iz seruma, tiroglobulin i kevhole limpet hemocijanin. Spojeni polipeptid se tada koristi za imunizaciju životinje. Serum imunizovane životinje se uzima i tretiran prema poznatim postupcima, na primer uz pomoć imunoafinitetne hromatografije.

Monoklona antitela na polipeptide prvog aspekta ovog pronalaska stručnjak iz ove oblasti takođe može lako da proizvede. Opšta metodologija za proizvodnju monoklonih antitela uz pomoć tehnologije hibriodoma je dobro poznata (videti, na primer, Kohlcr, G. and Milstein, C, Nature 256: 495-497 (1975); Kozboret al.,Immunology Today 4: 72 (1983); Coleet al.,77-96 in Monoklona antitela and i terapija karcinoma, Alan R. Liss, Inc.

(1985).

Paneli monoklonih antitela proizvedenih protiv polipeptida prvog aspekta ovog pronalaska mogu se podvrgnuti skriningu radi utvrđivanja različitih svojstava tj., izotipa, epitopa, afiniteta, itd. Monoklona antitela su posebno korisna za purifikaciju individualnih polipeptida protiv kojih su ona usmerena. Umesto toga, geni koje enkodiraju monoklona antitela od interesa mogu se izolovati iz hibridima, na primer tehnikama PCR koje su poznate u ovoj struci, i oni se mogu klonirati i eksprimirati u odgovarajućim vektorima.

Himerna antitela, u kojima su ne-humani varijabilni regioni spojeni ili fuzionisani sa humanim konstantnim regionima (videti, na primer, Liuet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987)), mogu takođe biti od koristi.

Ovo antitelo se može modifikovati kako bi postalo manje imunogeno kod neke osobe, na primer humanizacijom (videti Joneset al.,Nature, 321, 522 (1986); Verhoevenet al.,Science, 239,1534 (1988); Kabatć?/ al, J.Immunol., 147,1709 (1991); Queen et al.,Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 10029 (1989); Gormanet al,Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 34181 (1991); and Hodgsonet al,Bio/Technology, 9, 421 (1991)). Termin "humanizovano antitelo", u smislu u kome je ovde korišćen, odnosi se na molekule antitela u kojima su CDR amino kiseline i odabrane druge amino kiseline u različitim domenima teških /ili lakih lanaca ne-humanog donatorskog antitela supstitucionisani na mestu ekvivalentnih amino kiselina u humanom antitelu. Ovo humanizovano antitelo stoga blisko podseća na humano antitelo ali ima sposobnost vezivanja donatorskog antitela.

Prema jednoj daljoj alternativi, ovo antitelo može biti neko "bisferično" antitelo, što je antitelo koje ima dva različita domena vezivanja antigena a svaki od tih domena je usmeren protiv različitog epitopa.

Tehnologija prikazivanja faga se može koristiti za selekciju gena koji enkodiraju antitela sa aktivnostima vezivanja prema polipeptidima iz ovog pronalaska bilo iz repertoara PCR amplifikovanih V-gena Iimfocita ljudi koji su ispitivani radi utvrđivanja prisustva relevantnih antitela ili iz naivnih biblioteka (McCaffertv, J.et al,(1990), Nature 348, 552-554; Marks, J.et al,(1992) Biotechnology 10, 779-783). Afinitet ovih antitela se takođe može popraviti mešanjem lanca (Clackson, T.et al,(1991) Nature 352, 624-628).

Antitela dobijcna gore navedenim tehnikama, bilo poliklona ili monoklona, imaju različitu namenu jer se mogu koristiti kao reagensi u imunoesejima, radioimunoesejima (RIA) ili imunosorbentnim esejima vezanim za enzime (ELISA). Kod ovih primena, antitela mogu biti obeležena nekim analitički detektabilnim reagensom kao što je radioizotop, fluorescentni molekul ili neki enzim.

Preferentni molekuli nukleinske kiseline iz drugog i trećeg aspekta ovog pronalaska su oni koji enkodiraju sekvence peptida navedene u SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 i/ili SEQ ID NO: 16, ili SEQ ID NO: 18, i funkcionalno ekvivalentni polipeptidi. Ovi molekuli nukleinske kiseline se mogu koristiti u metodama i primenama koje su ovde opisane. Molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska preferentno obuhvataju najmanje n konsekutivnih nukleotida iz sekvence koja je ovde prikazana, što je naznačeno time da je u zavisnosti od određene sekvence n jednako 10 ili više (na primer, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 ili više).

Molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska takođe uključuju sekvence koje su komplementarne sa molekulima nukleinske kiseline koji su gore opisani (na primer, na

primer za antisens ili probe).

Molekuli nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu biti u obliku of RNK, kao što je mRNK, ili u obliku DNK, uključujući na primer cDNK, sintetičku DNK ili genomsku DNK. Takvi molekuli nukleinske kiseline mogu se dobiti kloniranjem, hemijskim sintetičkim tehnikama ili njihovim kombinovanjem. Molekuli nukleinske kiseline se mogu pripremiti, na primer, hemijskom sintezom uz korišćenje tehnika kao što su hemijska sinteza fosforamidita solidne faze iz genomske ili cDNK biblioteka ili separacijom iz organizma. RNK molekuli se generalno mogu dobitiin vitroili in vivo transkripcijom DNK sekvence.

Molekuli nukleinske kiseline mogu imati dvostruki ili jednostruki lanac. DNK sa jednostrukim lancem može biti kodirajući lanac koji je takođe poznat kao sens lanac, ili može biti ne-kodirajući lanac koji se takođe naziva anti-sens lanac.

Termin "molekul nukleinske kiseline" takođe uključuje analoge DNK i RNK, kao što su oni koji sadrže modifikovane osnovne strukture i peptide nukleinske kiseline (PNA). Termin "PNA", u smislu u kome je ovde korišćen, odnosi se na antisens molekule ili na neki antigenski agens koji uključuju jedan oligonukleotid sa najmanje pet nukelotida koju su po dužini vezani za osnovnom strukturom ostataka aminokiselina, koji se preferentno završava Užinom. Ovaj terminalni lizin prenosi solubilnost na ovaj sastav. PNAs mogu biti pegilirati kako bi se produžio njihov vek u ćeliji, gde se one preferentno vezuju komplementarno za DNK i RNK jednostrukog lanca i zaustavljaju eiongaciju transkripta (Nielsen, P.E.et al.(1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63).

Ovi molekuli takođe mogu da imaju različitu sekvencu koja, usled degenerisanosti genetskog koda, enkodira polipeptid sa SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ IDNO:8, SEQ IDNO:10, SEQIDNO:12, SEQ IDNO:14 i/ili SEQ IDNO:16, ili SEQ ID NO: 18. Takvi molekuli mogu između ostalog da obuhvataju, kodirajuće sekvence za zam zreli polipeptid; kodirajuće sekvence za zreli polipeptid i dodatne kodirajuće sekvence, kao što su one koje kodiraju neku lidersku ili sekretornu sekvencu, kao što je pro-, pre- ili prepro- polipeptidna sekvenca; kodirajuće sekvence zrelog polipeptida, sa ili bez gore pomenute dodatne kodirajuće sekvence, zajedno sa drugom, dodatnom, ne-kodirajućim sekvencom, uključujući nekodirajuće 5' i 3' sekvence, kao što su transkribovane, netranslatirane sekvence koje igraju određenu ulogu u transkripciji (uključujući terminacione signale), vezivanje ribozoma i stabilnost mRNK. Molekuli nukleinske kiseline mogu takođe da uključuju dodatne sekvence koje enkodiraju dodatne amino kiseline, kao što su one koje obezbeđuju dodatne funkcionalnosti.

Molekuli nukleinske kiseline drugog i trećeg aspekta ovog pronalaska mogu takođe da enkodiraju fragmente ili funkcionalne ekvivalente polipeptida i fragmente iz prvog aspekta ovog pronalaska. Takav molekul nukleinske kiseline može biti neka njegova varijanta koja se prirodno javlja, kao što je alelna varijanta koja se prirodno javlja ili taj molekul može predstavljati neku varijantu za koju nije poznato da li se prirodno javlja. Takve varijante molekula nukleinske kiseline koje se ne javljaju prirodno mogu se formirati tehnikama mutageneze, uključujući i one koje se primenjuju kod molekula nukleinske kiseline, ćelija ili organizama.

U ove vrste varijanti spadaju varijante koje se razlikuju od gore pomenutih molekula nukleinske kiseline po supstitucijama, delacijama i insercijama nukeotida. Te supstitucije, delecije ili insercije mogu da obuhvate jedan ili više nukleotida. Te varijante mogu biti izmenjene u kodirajućim ili nekodirajućim regionima ili u oba ova regiona. Izmene kodirajućih regiona modu da dovedu do konzervativnih ili nekonzervativnih supstitucija, delecija ili insercija amino kiselina.

Molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska se takođe mogu podvrgnuti inžinjeringu uz pomoć metoda koje su generalno poznate u ovoj struci, iz različitih razloga, uključujući modifikaciju kloniranja, obradu i/ili ekspresiju genskog produkta (polipeptida). Mešanje DNK nasumičnom fragmentacijom i PCR preraspoređivanjem genskih fragmenata i sintetičkih oligonukeotida obuhvaćeni su kao tehnike koje se mogu koristiti za inžinjering određene sekvence nukleotida. Mutageneza usmerena na određeno mesto se može koristiti za inserciju novih restriktivnih mesta, promenu obrasca glikozilacije, promenu preference kodona, proizvodnju isprepletanih varijanti, uvođenje mutacija, i tako dalje.

Molekuli nukleinske kiseline koji enkodiraju polipeptid prvog aspekta ovog pronalaska mogu se vezivati sa heterolognom sekvencom tako da takav kombinovani molekul nukleinske kiseline enkodira neki fuzioni protein. Takvi kombinovani molekuli nukleinske kiseline uključeni su u drugi ili treći aspekt ovog pronalaska. Na primer, da bi se ispitale biblioteke peptida po pitanju inhibitora aktivnosti polipeptida, mogla bi biti korisna ekspresija fuzionog proteina uz pomoć takvog kombinovanog molekula nukleinske kiseline, koga može da prepozna neko komercijalno dostupno antitelo. Fuzioni protein se takođe može podvrgnuti inžinjeringu kako bi sadržao mesto cepanja locirano između sekvence polipeptida iz ovog pronalaska i sekvence nekog heterolognog proteina tako da taj polipeptid može da se čepa i purifikuje na udaljenosti od heterolognog proteina.

Molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska takođe uključuju antisens molekule koji su delimično komplementarni sa molekulima nukleinske kiseline koja enkodira polipeptide iz ovog pronalaska i koja se stoga hibridizuje da bi enkodirala molekule nukleinske kiseline (hibridizacija). Takvi antisens molekuli, kao što su oligonukleotidi, mogu se tako dizajnirati da prepoznaju, specifično vezuju i sprečavaju transkripciju ciljane nukleinske kiseline koja enkodira polipeptid iz ovog pronalaska, što će biti poznato stručnjacima iz ove oblasti (videti, na primer, Cohen, J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem 56, 560 (1991); Leeet al,Nukleinske kiseline Res 6, 3073 (1979);Cooney et al,Science 241, 456 (1988);Dervan et al,Science 251, 1360 (1991).

Termin "hibridizacija" u smislu u kome je ovde korišćen odnosi se na međusobnu asocijaciju putem vodonične veze. Tipično, jedan molekul će biti fiksiran za solidnu potporu a drugi će biti slobodan u rastvoru. Tada se ova dva molekula mogu dovesti u međusoban kontakt pod uslovima koji idu u prilog vezivanju preko vodonika. U faktore koji utiču na ovo vezivanje spadaju: tip i zapremina rastvarača, temperatura reakcije, vreme hibridizacije; mešanje; agensi za blokiranje nespecifičnog spajanja molekula tečne faze sa solidnom podlogom. (Denhardtov reagens ili BLOTTO); koncentracije molekula, upotrebe jedinjenja za povećanje brzine povezivanja molekula (dekstran sulfat ili polietilen glikol); i strogosti uslova ispiranja posle hibridizacije (videti Sambrooket al. [ gore]).

Inhibicija hibridizacije nekog potpuno komplementarnog molekula prema ciljanom molekulu se može ispitati uz korišćenje eseja hibridizacije, koji je poznat u ovoj stručnoj oblasti, (videti, na primer, Sambrooket al [ gore]).Značajno homologni molekul će tada biti u kompeticiji za i inhibiraće vezivanje potpuno homolognog molekula za ciljani molekul pod različito strogim uslovima, kao što su naveli Wahl, G.M. and S.L. Berger (1987; Methods Enzvmol. 152:399-407) i Kimmel, A.R. (1987; Methods Enzvmol. 152:507-511).

"Strogost" se odnosi na uslove reakcije hibridizacije koji pogoduju povezivanju veoma sličnih molekula u odnosu na povezivanje molekula koji se razlikuju. Veoma strogi uslovi hibridizacije se definišu kao inkubacija preko noći na 42°C u rastvori koji se sastoji od 50% formamida, 5XSSC (150mM NaCl, 15mM trinatrijum citrata), 50mM natrijum

fosfata (pH7.6), 5x Denhardtovog rastvora, 10% dekstran sulfat sulfata, i 20 mikrograma/ml denaturisane, DNK sperme lososa, posle čega sledi ispiranje filtera u 0.1X SSC na približno 65°C. Uslovi niske strogosti podrazumevaju sprovođenje reakcije hibridizacije na 35°C (videti Sambrooket al. [ gore]).Preferentno se za hibridizaciju koriste veoma strogi uslovi.

Preferentni koncepti ovog aspekta ovog pronalaska su molekuli nukleinske kiseline koji su najmanje 70% identični duž cele njihove dužine sa molekulom nukleinske kiseline koji enkodira INSP052 ili INSP055 polipeptide (SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:13 i/ili SEQ ID NO:15, ili SEQ ID NO: 17) ili molekulima nukleinske kiseline koji su značajno komplementarni sa takvim molekulima nukleinske kiseline. Preferentno, molekul nukleinske kiseline prema ovom aspektu ovog pronalaska obuhvata neki region koji je najmanje 80% identičan duž cele svoje dužine sa kodirajućom sekvencom za SEQ ID NO:2 datom u SEQ ID NO:l, kodirajućom sekvencom za SEQ ID NO:4 datom u SEQ ID NO:3, kodirajućom sekvencom za SEQ ID NO:6 datom u SEQ ID NO:5, kodirajućom sekvencom za SEQ ID NO:8 datom u SEQ ID NO:7, kodirajućom sekvencom za SEQ ID NO: 10 datom u SEQ ID NO:9, kodirajućom sekvencom za SEQ ID NO:12 datom u SEQ ID NO:ll, kodirajućom sekvencom za SEQ ID NO: 14 datom u SEQ ID NO: 13, kodirajućom sekvencom za SEQ ID NO: 16 datom u SEQ ID NO: 15, kodirajućom sekvencom za SEQ ID NO: 18 datom u SEQ ID NO: 17 ili predstavlja molekul nukleinske kiseline koji je komplementaran sa njima. U tom smislu su posebno preferentni molekuli nukleinske kiseline sa najmanje 90%), a preferentno najmanje 95%, a preferentnije 98% ili 99% identičnošću duž njihove cele dužine. Preferentni koncepti u ovom smislu su molekuli nukleinske kiseline koji enkodiraju polipeptide koji zadržavaju suštinski istu biološki funkciju ili aktivnost kao i polipeptidi INSP052 i INSP055.

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje proces za detekciju molekula nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, koji se sastoji iz sledećih koraka: (a) dovođenja u kontakt nukleinske probe prema ovom pronalasku sa biološkim uzorkom pod uslovima hibridizacije kako bi se formirali dupleksi i (b) detekciju svih takvih dupleksa koji su formirani.

U skladu da donjom dodatnom diskusijom u vezi sa esejima koji se mogu koristiti prema ovom pronalasku, molekul nukleinske kiseline kako je gore opisano može se koristiti kao hibridizacija probe za RNK, cDNK ili genomsku DNK, kako bi se izolovale cDNK potpune dužine i genomski klonovi koji enkodiraju polipeptide INSP052 i INSP055 i da bi se izolovala cDNK i genomski klonovi homolognih ili ortolognih gena sa veoma sličnom sekvencom onoj koju imaju geni koji enkodiraju ovaj polipeptid.

U tom smislu, se između ostalih mogu koristiti sledeće tehnike koje su poznate u ovoj oblasti i o njima će biti reči kasnije u vezi sa ilustracijama. Metode sekvencioniranja i analize DNK su dobro poznate i generalno dostupne u ovoj stručnoj oblasti i mogu se naravno koristiti za praktičnu realizaciju mnogih koncepata ovog pronalaska o kojima je ovde bilo reči. U tim metodama se mogu koristiti takvi enzimi kao stoje Klenovv fragment DNK polimeraze I, Sequenase (US Biochemical Corp, Cleveland, OH), Taq polimcraze (Perkin Elmer), termostabilna T7 polimeraza (Amersham, Chicago, IL), ili kombinacije polimeraza i proof-reading eksonukleaza kao što su koje se nalaze u Sistemu za amplifikaciju ELONGAZE koji prodaje Gibco/BRL (Gaithersburg, MD). Preferentno, proces sekvencioniranja može da bude automatizovan kada se koriste aparati kao što je Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), Peltier Thermal Cvcler (PTC200; MJ Research, VVatertovvn, MA) i ABI Catalvst i 373 i 377 DNK Sekvenceri (Perkin Elmer).

Jedna metoda za izolaciju molekula nukleinske kiseline koji enkodira polipeptid sa ekvivalentnom funkcijom u odnosu na polipeptide INSP052 i fNSP055 je proba genomske ili cDNK biblioteke sa prirodnom ili veštački dizajniranom probom uz korišćenje standardnih postupaka koji su priznati u ovoj stručnoj oblasti, (videti, na primer, "Current Protocols in Molecular Biologv", Ausubelet al.(eds). Greene Publishing Association and John Wiley Interscience, Nevv York, 1989,1992). Probe koje se sastoje od najmanje 15, preferentno najmanje 30, a još preferentnije najmanje 50, uzastopnih baza koje odgovaraju ili su komplementarne sa sekvencom nukleinske kiseline iz odgovarajućeg enkodirajućeg gena (SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 ili SEQ ID NO: 17) su posebno korisne probe. Takve probe mogu biti obeležene nekim analitički detektabilnim reagensom kako bi se olakšala njihova identifikacija. U korisne reagense, između ostalog spadaju, radioizotopi, fluorescentne boje i enzimu koji mogu da katalizuju formiranje nekog detektabilnog proizvoda. Uz pomoć ovih proba, stručnjak iz ove oblasti će moći da izoluje komplementarne kopije genomske cDNK ili RNK poli nukleotida koji enkodiraju proteine od interesa iz humanih izvora, sisara ili iz drugih životinjskih izvora kao i sa izvrši skrining takvih izvora radi utvrđivanja odgovarajuće sekvence, na primer kod drugih članova porodice, tip i/ili subtip.

U mnogim slučajevima će izolovane sekvence cDNK biti nekompletne zato što će određeni region koji enkodira polipeptid biti skraćen, normalno na 5' kraju. Postoji nekoliko metoda za dobijanje cDNKs potpune dužine ili za produžavanje kratkih cDNKs. Takva sekvenca može biti produžena korišćenjem parcijalne sekvence nukeotida i primenom različitih metoda koje su poznate u struci za detekciju uzlazne sekvence kao što su promoterski i regulacioni elementi. Na primer, jedna metoda koja se može koristiti je zasnovana na metodi Brze amplifikacije završetaka cDNK (RACE; videti, na primer, Frohmanet al,PNAS USA 85, 8998-9002, 1988). Najnovije modifikacije ove tehnike koje su koristili na primer MarathonTM technology (Clontech Laboratories Inc.), značajno su pojednostavile traženje dužih cDNK. Nešto različita tehnika koje se naziva PCR "restriktivnog mesta", koristi univerzalne prajmere da bi dobila nepoznate sekvence nukleinske kiseline u blizinu poznatog lokusa (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322). Obrnuta PCR se takođe može koristiti za amplifikaciju ili produžetak sekvence uz pomoć divergentnih prajmera zasnovanih na nekom poznatom regionu (Triglia, T.et al.(1988) Nukleinske kiseline Res. 16:8186). Još jedna metoda koja se može koristiti je kaptivna PCR koja podrazumeva PCR amplifikaciju fragmenata DNK koji se nalaze pored poznate sekvence u humanom i veštačkom hromozomu DNK kvasca. (Lagerstrom, M.et al.(1991) PCR Methods Applic, 1, 111-119). Još jedna metoda koja se može koristiti za dobijanje nepoznatih sekvenci je ona koju su razvili Parker, J.D.et al.(1991); Nukleinske kiseline Res. 19:3055-3060). Osim toga, mogu se koristiti PCR, ugnježdeni prajmeri i PromoterFinderTM biblioteke da bi se ispitala genomska DNK (Clontech, Palo Alto, CA). Ovim procesom se izbegava potreba za pretraživanjem biblioteka i on je koristan za nalaženje spojeva intron/ekson.

Pri traženju cDNK potpune dužine, poželjno je koristiti biblioteke koje su odabrane po veličini kako bi se obuhvatile veće cDNKs. Takođe su preferentne i nasumične biblioteke zato što one sadrže više sekvenci koje sadrže 5' regione gena. Korišćenje nasumično prajmirane biblioteke može biti posebno korisno u situacijama u kojima neka oligo d(T) biblioteka ne daje cDNK potpune dužine. Genomske biblioteke mogu biti korisne za produžavanje sekvence na 5' netranskribovane regulatorne regione.

Prema jednom konceptu of ovog pronalaska, molekuli nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu se koristiti za lokalizaciju hromozoma. Kod ove tehnike je molekul nukleinske specifično ciljan i on može da se hibridizuje sa posebnom lokacijom na individualnom humanom hromozomu. Mapiranje relevantne sekvence hromozoma prema ovom pronalasku predstavlja važan korak za konfirmativnu korelaciju tih sekvenci sa bolešću koja je udružena sa nekim genom. Pošto se neka sekvenca mapira na preciznoj lokaciji hromozoma, fizički položaj te sekvence na hromozomu se može dovesti u korelaciju sa podatcima iz genetske mape. Takvi podatci se nalaze na primer u V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (dostupno on-line preko medicinske biblioteke Univerziteta Johns Hopkins). Odnos između gena i bolesti koje su mapirane na istom hromozomskom regionu se tada identifikuje preko analize veze (ko-nasleđivanje fizički susednih gena). To pruža vredne informacije istraživačima koji traže gene različitih bolesti uz pomoć pozicionog kloniranja ili nekih drugih tehnika otkrivanja gena. Pošto se određena bolesti ili sindrom okvirno lokalizuju genetskim povezivanjem sa određenim genomskim regionom, svako mapiranje sekvence iz te oblasti može da prikazuje udružene ili regulatorne gene za dalje istraživanje. Molekul nukleinske kiseline se može takođe upotrebiti za detekciju razlika u lokaciji hromozoma zbog translokacije, inverzije, itd. Kod normalnih osoba, nosioca ili obolelih osoba.

Molekuli nukleinske kiseline iz ovog pronalaska su takođe vredni za lokalizaciju tkiva. Takve tehnike omogućavaju određivanje obrasca ekspresije polipeptida u tkivima uz pomoć detekcije mRNK koje ih enkodiraju. Ove tehnike obuhvatajuin situtehnike hibridizacija i tehnike amplifikacije nukleotida, kao što je PCR. Rezultati ovih studija ukazuju na normalne funkcije polipeptida u organizmu. Osim toga, komparativne studije normalnih obrazaca ekspresije mRNK u odnosu na mRNK koje enkodira gen mutant omogućavaju važan uvid u ulogu mutantnih polipeptida kod bolesti. Takva neadekvatna ekspresija može biti temporalne, prostorne ili kvantitativne prirode.

Pristupi umirivanju gena se mogu takođe primeniti za silaznu regulaciju endogene ekspresije gena koji enkodira polipeptid iz ovog pronalaska. RNK interferencija (RNKi)

(Elbashir, SMet al.,Nature 2001, 411, 494-498) je jedna od metoda post-transkripcionog umirivanja gena sa specifičnom sekvencom koja se može koristiti. Kratki nukleotidi dsRNK oligonukleotida su sintetisaniin vitroi uvedeni u ćeliju. Sekvenca specifičnog vezivanja ovih nukleotida dsRNK inicira degradaciju ciljne mRNK, preko smanjenja ili ablacije ekspresije ciljanog proteina.

Efikasnost pristupa sa umirivanjem gena koji su gore procenjivani se mogu proceniti merenjem ekspresije polipeptida (na primer, uz pomoć VVestern blot metode), a na nivou RNK korišćenjem metodologija na bazi TaqMan.

Vektori iz ovog pronalaska obuhvataju molekule nukleinske kiseline iz ovog pronalaska a to mogu biti vektori kloniranja ili vektori ekspresije. Ćelije domaćini iz ovog pronalaska, koje mogu biti transformisane, fransficirane ili transdukovane vektorima iz ovog pronalaska mogu biti prokariotske ili eukariotske.

Polipeptidi ovog pronalaska mogu se pripremiti u rekombinantnom obliku ekspresijom njihovih enkodirajućih molekula u vektorima koji se nalaze unutar ćelija domaćina. Takve metode ekspresije su dobro poznate stručnjacima iz ove oblasti a mnoge od njih su detaljno opisali Sambrooket al { gore)i Fernandez & Hoeffler (1998, eds. "Gene expression svstems. Using nature for the art of expression". Academic Press, San Diego, London, Boston, Nevv York, Sydney, Tokyo, Toronto).

Generalno, može se koristiti svaki sistem ili vektor koji je pogodan za održavanje, propagaciju ili ekspresiju molekula nukleinske kiseline radi produkcije polipeptida kod odgovarajućeg domaćina. Odgovarajuće sekvence nukeotida se mogu ubaciti u sistem ekspresije bilo kojom od mnogih različitih rutinskih tehnika koje postoje, kao što su, na primer, one koje su opisali Sambrooket al, { gore).Generalno, enkodirajući gen se može staviti pod kontrolu kontrolnog elementa kao što je promoter, mesto vezivanja ribozoma (za bakterijsku ekspresiju) i opciono, operator, tako da DNK sekvence koja enkodira željeni polipeptid biva transkribovana u RNK u transformisanoj ćeliji domaćinu.

Primeri pogodnih sistema ekspresije obuhvataju, na primer, hromozomski, epozomalni i sistem izveden iz virusa, uključujući, na primer, vektore izvedene iz: bakterijskih plazmida, bakteriofaga, transpozona, epizoma kvasca, elemenata insercije, hromozomskih elemenata kvasca, virusa kao što su bakulovirusis, papova virusi kao što je SV40, vaccinia virusi, adenovirusi, virusi kokošijih boginja, pseudorabies virusi i retrovirusi, ili njihove kombinacije, kao što su one izvedene iz plazmidnih i bakteriofagnih genetskih elemenata, uključujući kozmide i fagemide. Humani veštački hromozomi (HACs) mogu se takođe koristiti za prenošenje velikih fragmenata DNK koji mogu da se nalaze ili eksprimiraju u plazmidu.

Posebno pogodni ekspresivni sistemi obuhvataju mikroorganizme kao što su bakterije transformisane rekombinantnim bakteriofagima, plazmidni ili kozmidni DNK vektori ekspresije; kvasac transformisan vektorom ekspresije kvasca; sistemi ćelija insekata inficirani virusnim vektorima ekspresije (na primer, bakulovirus); sistemi biljnih ćelija transformisani virusnim vektorima ekspresije (na primer, mozaički virus karfiola, CaMV; mozaički virus duvana, TMV) ili bakterijskim vektorima ekspresije (na primer, Ti ili pBR322 plazmidi); ili životinjskim ćelijskim sistemima. Translacioni sistemi bez ćelija se takođe mogu koristiti za proizvodnju polipeptida iz ovog pronalaska.

Uvođenje molekula nukleinske kiseline koji enkodiraju polipeptid iz ovog pronalaska u ćelije domaćine se takođe može izvršiti uz pomoć metoda koje su opisane u mnogim standardnim laboratorijskim priručnicima, kao što su Davišet al.,Bazične metode u molekularnoj biologiji (1986) i Sambrooket al.,[ gore\.U posebno pogodne metode spadaju transfekcija kalcijum fosfata, transfekcija posredovana DEAE-dekstran sulfatom, transfekcija, mikroinjekcija, katjonska transfekcija posredovana lipidima, elektroporacija, transdukcija, unošenje otarka, balistička introdukcija ili infekcija (videti Sambrooket al.,1989[ gore] ;Ausubelet al,1991[ gore] ;Spector, Goldman & Leimvald, 1998). Kod eukariotskih ćelija, sistemi ekspresije mogu biti prolazni (na primer, epizomalni) ili trajni (hromozomska integracija) prema potrebama datog sistema.

Enkodirajući molekul nukleinske kiseline može da obuhvata ili ne obuhvata sekvencu koja enkodira neku kontrolnu sekvencu, kao što je signalni peptid ili liderska sekvenca, po želji, na primer, za sekreciju translatiranog polipeptida u lumen endoplazmatičnog retikuluma u periplazmičnom prostoru ili u ekstracelulalrnom okruženju. Ovi signali mogu biti endogeni u odnosu na polipeptid ili to mogu biti heterologni signali. Liderske sekvence se mogu ukloniti uz pomoć bakterijskog domaćina pri post-translacionoj obradi.

Osim kontrolne sekvence, može biti poželjno dodavanje regulatome sekvence koja omogućava regulaciju ekspresije polipeptida prema rastu ćelije domaćina. Primeri regulatome sekvence su oni koji izazivaju povećanje ili smanjenje genske ekspresije u vidu odgovora na hemijske ili fizičke stimulanse, uključujući i prisustvo regulatornih jedinjenja ili različite temperature ili metaboličke uslove. Regulatome sekvence predstavljaju one netranslatirane regione vektora , kao što su pojačivači, promoteri i 5' i 3' netranslatirani regioni. Oni stupaju u interakcije sa proteinima ćelija domaćina kako bi izvršili transkripciju i translaciju. Takve regulatome sekvence mogu da se razlikuju po pitanju jačine i specifičnosti. U zavisnosti od korišćenog sistema vektora i domaćina, može se koristiti bilo koji broj pogodnih elemenata transkripcije i translacije, uključujući konstitutivne i inducibilne promotere. Na primer, pri kloniranju u bakterijskim sistemima, se mogu koristiti na primer inducibilni promoteri kao što je promoter hibrida lacZ Bluescript fagemida (Stratagene, LaJolla, CA) ili pSportl™ plazmid (Gibco BRL) i slično. Promoteri bakulovirusnog poliedrina se mogu koristiti u ćelijama insekata. Promoteri ili pojačivači izvedeni iz genoma biljnih ćelija (na primer, heat shock, RUBISCO and storage protein geni) ili iz biljnih virusa (na primer, virusni promoteri ili liderske sekvence) mogu se klonirati u određenom vektoru. Kod ćelijskih sistema sisara, preferentni su promoteri iz gena sisara ili virusa sisara. Ukoliko je neophodno dobiti ćelijsku lozu koja sadrži višestruke kopije određene sekvence mogu se koristiti vektori zasnovani na SV40 ili EBV sa nekim odgovarajućim selektabilnim markerom.

Vektor ekspresije je tako konstruisan da je kodirajuća sekvenca određene nukleinske kiseline locirana u vektoru sa odgovarajućom regulatornom sekvencom, pozicioniranjem i orijentacijom kodirajuće sekvence u odnosu na regulatornu sekvencu tako da kodirajuća sekvenca transkribuje pod "kontrolom" regulatome sekvence, tj., RNK polimeraze koja se vezuje sa molekulom DNK na kontrolnoj sekvenci transkribuje kodirajuće sekvence. U nekim slučajevima to može biti neophodno za modifikovanje sekvence tako da ona može da se spaja sa kontrolnom sekvencom sa odgovarajućom orijentacijom, tj. da održava ram čitanja.

Kontrolna sekvenca i druge regulatome sekvence mogu da se vežu sa sekvencom koja kodira nukleinsku kiselinu pre insercije u vektor. Umesto toga, kodirajuće sekvence se mogu klonirati direktno u nekom vektoru ekspresije koji već sadrži kontrolnu sekvencu i odgovarajuće mesto restrikcije.

Za dugoročnu produkciju rekombinantnog polipeptida sa visokom produkcijom referentna je stabilna ekspresija. Na primer, ćelijske loze koje stabilno eksprimiraju polipeptid od interesa mogu se transformisati uz pomoć vektora ekspresije koji mogu da sadrže virusno poreklo elemenata replikacije i/ili endogene ekspresije kao i selektabilni markerski gen na istom ili zasebnom vektoru. Posle introdukcije vektora, ćelije se mogu ostaviti da rastu 1-2 dana u obogaćenom medijumu pre nego što se prebace u selektivne medijume. Svrha ovog selektabilnog markera je da prenosi rezistentnost na selekciju, a njegovo prisustvo omogućava rast i oporavak ćelija koje uspešno eksprimiraju uvedenu sekvencu. Rezistentni klonovi stabilno transformisanih ćelija mogu se proliferovati uz pomoć tehnike kulture tkiva koje su odgovarajuće za dati tip ćelija.

Ćelijske loze sisara koje postoje kao domaćini za ekspresiju su poznate u ovoj stručnoj oblasti i obuhvataju mnoge imortalizovane ćelijske loze koje se mogu nabaviti od American Tip Culture Collcction (ATCC) u koje između ostalog spadaju ćelije ovarijuma

kineskih kunića (CHO), HeLa, ćelije bubrega beba kunića (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), Cl27, 3T3, BHK, HEK 293, ćelije Bovvesovog melanoma i humanog hepatocelularnog karcinoma (na primer Hep G2) ako ijedan broj drugih ćelijskih loza.

Kod sistema bakulovirusa, materijali za sisteme ekspresije bakulovirusa/ćelije insekta se mogu nabaviti u vidu kita, između ostalog, Invitrogen, San Diego CA (the "MaxBac" kit). Ove tehnike koje su generalno poznate stručnjacima iz ove oblasti u potpunosti su opisali Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). U posebno pogodne ćelije domaćine za upotrebu kod ovog sistema spadaju ćelije insekata kao što su ćelije Drosophilc S2 and Spodoptere Sf9.

Postoji mnogo biljnih ćelijskih kultura i genetičkih ekspresionih sistema cele biljke koji su poznati u ovoj stručnoj oblasti. U primere pogodnih biljnih ćelijskih genetičkih eksprsionih sistema spadaju oni koji su opisani u US 5,693,506; US 5,659,122; i US 5,608,143. Dodatne primere genetičke ekspresije u biljnim ćelijskim kulturama opisao je Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863 (1991).

Posebno se mogu koristiti sve biljke iz kojih se mogu izolovati protoplasti i kultivisati kako bi se dobile cele regenerisane biljke, tako da se dobijaju cele biljke koje sadrže preneti gen. Praktično se mogu regenerisati sve biljke iz kultivisanih ćelija ili tkiva, uključujući između ostalog i važne vrste kao što su šećerna trska, šećerna repa, voće i drugo drveće i povrće.

U primere posebno referentnih bakterijskih ćelija domaćina spadaju ćelije streptokoka, stafilokoka, E. coli, Streptomyces i Bacillus subtilisa.

Primeri posebno pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju god gljivica obuhvataju ćelije kvasca (na primer, S. cerevisiae) i ćelije Aspergillusa.

Bilo koji selekcioni sistemi koji su poznati u ovoj stručnoj oblasti mogu se koristiti za dobijanje transformisanih ćelijskih loza. Primeri obuhvataju gene herpes simplex virusa timidin kinaze (VVigler, M.et al.(1977) Cell 11:223-32) i adenin fosforibosiltransferaze (Lowy, I.et a!.(1980) Cell 22:817-23) koji se mogu koristiti kod tk- odnosno aprtfc ćelija,.

Takođe se može koristiti antimetabolička, antibiotska ili herbicidna rezistencija kao osnova za ovu selekciju; na primer, dihidrofolat reduktaza (DHFR) koja prenosi rezistentnost na metotreksat (VVigler, M.et al.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); npt, koji prenosi rezistentnost na aminoglikozide neomicin i G-418 (Colbere-Garapin,F. e/a/(1981) J.Mol. Biol. 150:1-14) i als ili pat, koji prenose rezistentnost na hlorsulfuron odnosno fosfinotricin acetiltransferazu. Opisani su i drugi selektabilni geni a njihovi primeri će biti jasni stručnjacima iz ove oblasti.

Iako prisustvo ili odsustvo ekspresije markerskog gena ukazuje daje takođe prisutan i gen od interesa, možda će biti potrebno da se potvrdi njegovo prisustvo i ekspresija. Na primer, ukoliko je relevantna sekvenca ubačena unutar sekvence markerskog gena, transformisane ćelije koje sadrže odgovarajuću sekvencu će moći da se identifikuju na osnovu odsustva funkcije markerskog gena. Umesto toga, markerski gen se može plasirati u tandemu sa sekvencom koja enkodira polipeptid iz ovog pronalaska pod kontrolom jednog promotera. Ekspresija markerskog gena u vidu odgovora na indukciju ili selekciju obično takođe ukazuje na ekspresiju tandemskog gena.

Umesto toga, ćelije domaćini koje sadrže neku sekvencu nukleinske kiseline koje enkodiraju polipeptid iz ovog pronalaska i koje eksprimiraju navedeni polipeptid mogu se identifikovati uz pomoć različitih postupaka koji su poznati stručnjacima iz ove oblasti. U te postupke između ostalog spadaju DNK-DNK ili DNK-RNK hibridizacije i proteinski bioeseji, na primer, fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija (FACS) ili tehnike imunoeseja (kao što su enzim-povezani imunosorbentni esej [ELISA] i radioimunoesej [RIA]), koji uključuju tehnologije zasnovane na membrani, rastvoru i čipu za detekciju i/ili kvantifikaciju nukleinske kiseline ili proteina (videti Hampton, R.et al.(1990) Serological Methods, a Laboratorv Manual, APS Press, St Paul, MN) and Maddox, D.E.et al. (1983) J. Exp. Med,158, 1211-1216).

Čitav spektar različitih obeleživača i tehnika konjugacije je poznat stručnjacima iz ove oblasti i one se mogu se koristiti u različitim esejima nukleinskih kiselina i amino kiselina. Sredstva za proizvodnju obeleženih hibridizacionih ili PCR proba za detekciju sekvence koja je u vezi sa molekulima nukleinske kiseline koja enkodira polipeptide iz ovog pronalaska uključuje oligoobeležavanje, nick translaciju, end-obeležavanje ili PCR amplifikaciju uz pomoć obeleženog polinukleotida. Umesto toga, sekvenca koja enkodira polipeptid iz ovog pronalaska se može klonirati u vektor za proizvodnju neke mRNK probe. Takvi vektori su poznati u ovoj stručnoj oblasti, i oni su komercijalno dostupni i mogu se koristiti za sintezi RNK probain vitrododavanjem odgovarajuće RNK polimeraze kao što je T7, T3 ili SP6 i obeleženih nukleotida. Ov i postupci se mogu sprovesti uz korišćenje različitih komercijalno dostupnih kitova (Pharmacia & Upjohn, (Kalamazoo,

MI); Promega (Madison WI); i U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH)).

Pogodni reporterski molekuli ili obeleživači koji se mogu se koristiti za olakšavanje detekcije obuhvataju radionuklide, enzime i fluorescentne, hemiluminiscentne ili hromogene agense kao i supstrate, kofaktore, inhibitore, magnetne čestice i slično.

Molekuli nukleinske kiseline prema ovom pronalasku mogu se takođe koristiti za stvaranje transgenih životinja, posebno glodara. Takve transgene životinje čine još jedan aspekt ovog pronalaska. To se može uraditi lokalno, modifikacijom somatskih ćelija ili terapijom germinalne loze kako bi se uključile nasledne modifikacije. Takve transgene životinje mogu biti posebno korisne za dobijanje životinjskog modela za molekule leka koji su efektivni kao modulatori polipeptida iz ovog pronalaska.

Polipeptid se može dobiti i purifikovati iz rekombinantnih ćelijskih kultura korišćenjem dobro poznatih metoda uključujući precipitaciju amonijum sulfata ili etanola, ekstrakciju kiseline, hromatografiju sa izmenom anjona ili katjona, hromatografiju sa fosfocelulozom, hromatografiju sa hidrofobnom interakcijom, afinitetnu hromatografiju, hromatografiju sa hidroksilapatitom and hromatografiju sa lectinom. Visoko efikasna tečna hromatografija je posebno korisna za purifikaciju. Dobro poznate tehnike za refolding proteina mogu se koristiti za regeneraciju aktivne konformacije kada je polipeptid denaturisan tokom izolacije ili purifikacije.

Specijalizovani vektorski sastojci se mogu takođe koristiti za olakšavanje purifikacije proteina, po želji, spajanjem sekvence koja enkodira polipeptide iz ovog pronalaska sa sekvencom nukeotida koji enkodira polipeptidni domen što će olakšati purifikaciju solubilnih proteina. Primeri takvih domena koji olakšavaju purifikaciju uključuju peptide za helaciju metala kao što su moduli histidin-triptofan koji omogućavaju purifikaciju na imobilisanim metalima, domeni proteina A koji omogućavaju purifikaciju na imobilizovanom imunoglobulinu u domen koji je korišćen kod FLAGS ekstenzionog/afinitetnog sistema purifikacije (Immunex Corp., Seattle, WA). Inkluzione sekvence linkera koja može da se čepa kao što su one specifične za Faktor XA ili enterokinazu (Invitrogen, San Diego, CA) između domena purifikacije i polipeptida iz ovog pronalaska mogu se koristiti za olakšavanje purifikacije. Jedan takav vektor ekspresije omogućava ekspresiju fuzionog proteina koji sadrži polipeptid iz ovog pronalaska fuzionisan sa nekoliko ostataka histidina ispred mesta cepanja tioredoksina ili enterokinaze. Ovi ostatci histidina olakšavaju purifikaciju uz pomoć IMAC (afinitetna hromatografija sa imobilisanim jonom metala koju su opisali Porath, J.et al.(1992), Prot. Exp. Purif. 3: 263-281) dok mesto cepanja tioreduksina ili enterokinaze obezbeđuje sredstvo za purifikaciju polipeptida iz fuzionog proteina. Diskusija o vektorima koji sadrže fuzione proteine se nalazi u KrolI, D.J.et al.(1993; DNK Cell Biol. 12:441-453).

Ukoliko polipeptid treba eksprimiratri radi upotrebe u esejima za skrining, generalno je poželjnije da se on proizvodi na površini ćelije domaćina u kojoj se eksprimira. U tom slučaju se ćelije domaćini mogu ubrati pre korišćenja za esej za skrining, na primer upotrebom tehnika kao to su sortiranje fluorescentno aktiviranih ćelija (FACS) ili i tehnike imunoafiniteta. Ukoliko se polipeptid sckretuje u mcdijum, taj medijum se može izolovati kako bi se dobio i purifikovao eksprimirani polipeptid. Ukoliko se polipeptid proizvodi intracelulamo, te ćelije se prvo moraju lizirati pre dobijanja polipeptida.

Polipeptid iz ovog pronalaska se može koristiti za ispitivanje biblioteka jedinjenja u bilo kojoj varijanti tehnika za ispitivanje lekova. Takva jedinjenja mogu da aktiviraju (agonišu) ili inhibiraju (antagonišu) nivo ekspresije gena ili aktivnost polipeptida ovog iz pronalaska i tako formiraju još jedna aspekt ovog pronalaska. Preferentna jedinjenja su efikasna za menjanje ekspresije prirodnog gena koji enkodira polipeptid iz prvog aspekta ovog pronalaska ili za regulaciju aktivnosti polipeptida iz prvog aspekta ovog pronalaska.

Agonistička ili antagonistička jedinjenja mogu biti izolovana iz, na primer, ćelija, preparata koji ne sadrže ćelije, hemijskih biblioteka ili prirodnih mešavina proizvoda. Ovi agonisti ili antagonisti mogu biti prirodni ili modifikovani supstrati, Ugandi, enzimi, receptori ili strukturni ili funkcionalni mimetici. Radi odgovarajućeg pregleda takvih tehnika skrininga videti videti Coliganet ah,Tekući protokoli u imunologiji 1(2): Poglavlje 5 (1991).

Jedinjenja koja će najverovatnije biti dobri antagonisti su molekuli koji se vezuju za polipeptid iz ovog pronalaska ne izazivajući biološke efekte polipeptida pri vezivanju za njega. U potencijalne antagoniste spadaju mali organski molekuli, peptidi, polipeptidi i antitela koja se vezuju za polipeptid iz ovog pronalaska i time inhibiraju ili gase njegovu aktivnost. Na taj način, vezivanje polipeptida za normalne molekule ćelijskog vezivanja može biti inhibirano, tako da se sprečava normalna biološka aktivnost polipeptida.

Polipeptid iz ovog pronalaska koji je korišćen kod takve tehnike skrininga može biti slobodan u rastvoru, fiksiran za solidnu podlogu, može da se nalazi na površini ćelije ili da bude lociran intracelulamo. Generalno, takvi postupci skrininga mogu da uključe upotrebu odgovarajućih ćelija ili ćelijskih membrana koje eksprimiraju polipeptid koje su dovedene u kontakt sa ispitivanim jedinjenjem kako bi se pratilo vezivanje ili stimulacija ili inhibicija funkcionalnog odgovora. Funkcionalni odgovor ćelija koje su dovedene u kontakt sa ispitivanim jedinjenjem i potom poređene sa kontrolnim ćelijama koje nisu dovođene u kontakt sa ispitivanim jedinjenjem. Takvim esejom se može proceniti da li ispitivano jedinjenje dovodi do signala generisanog aktivacijom datog polipeptida uz pomoć odgovarajućeg sistema za detekciju. Inhibitori aktivacije se generalno ispituju u eseju u prisustvu nekog poznatog agonista i prsati se efekat tog agonista na aktivaciju u prisustvu ispitivanog jedinjenja.

Preferentna metoda za identifikaciju nekog agonističkog ili antagonističkog jedinjenja polipeptida iz ovog pronalaska uključuje: (a) dovođenje u kontakt ćelije koja na svojoj površini eksprimira polipeptid prema prvom aspektu ovog pronalaska, a polipeptid je udružen sa drugom komponentom koja može da obezbedi detektabilni signal u vidu odgovora na vezivanje jedinjenja sa polipeptidom, a to jedinjenje treba podvrgnuti skriningu pod uslovima koji omogućavaju vezivanje za taj polipeptid, i (b) određivanje da li se to jedinjenje vezuje za i aktivira ili inhibira polipeptid, merenjem nivoa signala dobijenog interakcijom datog jedinjenja sa polipeptidom.

Još jedna preferentna metoda za identifikaciju agonista ili antagonista polipeptida iz se sastoji od: (a) dovođenje u kontakt ćelije koja na svojoj površini eksprimira polipeptid a taj polipeptid je udružen sa drugom komponentom koja može da obezbedi detektabilni signal u vidu odgovora na vezivanje jedinjenja za polipeptid, a jedinjenje treba podvrgnuti skriningu pod uslovima koji omogućavaju vezivanje za dati polipeptid; i (b) određivanja da li se to jedinjenje vezuje za i aktivira ili inhibira polipeptid poređenjem nivoa signala koji je dobijen interakcijom datog jedinjenja sa polipeptidom sa nivoom signala u odsustvu datog jedinjenja.

Prema narednom preferentnom konceptu, opšte metode koje su gore opisane mogu takođe da uključuju sprovođenje indentifikacije agonista ili antagonista u prisustvu obeleženog ili neobeleženog liganda za dati polipeptid.

Prema drugom konceptu metode za identifikaciju agonista ili antagonista polipeptida iz ovog pronalaska uključuju: određivanje inhibicije vezivanja liganda za ćelije koje na svojoj površini imaju polipeptid iz ovog pronalaska ili za ćelijske membrane koje sadrže takav polipeptid u prisustvu jedinjenja kandidata pod ulovima koji omogućavaju vezivanje za dati polipeptid i određivanje količine liganda vezanog za dati polipeptid. Jedinjenje koje je u stanju da izazove smanjenje vezivanja liganda se smatra agonistom ili antagonistom. Poželjno je da je taj ligand obeležen.

Još preferentnije je da se metoda skrininga jedinjenja koje je agonist ili antagonist nekog polipeptida sastoji od sledećih koraka: (a) inkubacija obeleženog liganda s ćelom ćelijom koja eksprimira polipeptid prema ovom pronalasku na površini ćelije ili ćelijska membrana koja sadrži polipeptid iz ovog pronalaska, (b) merenje količine obeleženog liganda vezanog za celu ćeliju ili ćelijsku membranu; (c) dodavanje jedinjenja kandidata u mešavinu obeleženog liganda i cele ćelije ili ćelijske membrane iz koraka (a) i omogućavanje da ta mešavina postigne ravnotežu. (d) merenje količine obeleženog liganda vezanog za celu ćeliju ili ćelijsku membranu posle koraka (c); i (e) poređenje razlike u obeleženom Ugandu koji je obeležen u koraku (b) i (d), tako da se jedinjenje koje izaziva smanjenje vezivanja u koraku (d) smatra agonistom ili antagonistom.

U nekim konceptima koji su gore opisani se mogu koristiti jednostavni eseji vezivanja u kojima se utvrđuje prianjanje ispitivanog jedinjenja za površinu na kojoj se nalazi polipeptid uz pomoć obeleživača koji je direktno ili indirektno udružen sa ispitivanim jedinjenjem ili uz pomoć eseja koji podrazumeva kompeticiju sa obeleženim kompetitorom. Prema drugom konceptu, mogu se koristiti kompetitivni eseji za skrining lekova kod kojih su neutrališuća antitela koja mogu da vezuju polipeptid u specifičnoj kompeticiji sa ispitivanim jedinjenjem za vezivanje. Na taj način se antitela mogu koristiti za detekciju prisustva bilo kog ispitivanog jedinjenja koje ima specifičan afinitet za vezivanje polipeptida.

Stručnjaci iz ove oblasti će moći da sačine eseje za identifikaciju modulatora polipeptida iz ovog pronalaska. U tom smisla su od interesa je rad koji su objavili Lokker NA et al J Biol

Chem 1997 Dec 26;272(52):33037-44 koji sadrži primer jednog eseja za identifikaciju antagonista (u ovom slučaju to su neutrališuća antitela).

Eseji mogu takođe biti dizajnirani tako da detektuju efekat dodatog ispitivanog jedinjenja na produkciju mRNK koja enkodira polipeptid u ćelijama. Na primer, neka vrsta ELISA eseja se može konstruisati za merenje nivoa polipeptida koji su sekretovani ili udruženi sa ćelijama korišćenjem monoklonalnih ili poliklonalnih antitala uz pomoć standardnih metoda koje su poznate u ovoj stručnoj oblasti, i on se može koristiti za traženje jedinjenja koja mogu da inhibiraju ili pojačaju produkciju polipeptida iz adekvatno manipulisanih ćelija ili tkiva. Formiranje vezujućih kompleksa izumeđu polipeptida i jedinjenja koje se ispituje se tada može izmeriti.

Metode eseja koje su takođe uključene u delokrug ovog pronalaska su one koje podrazumevaju upotrebu gena i polipeptida iz ovog pronalaska u esejima prekomerne ekspresija ili ablacije. Takvi eseji podrazumevaju manipulaciju na nivou fiziologije manipulisanih ćelija. Na primer, takvi eksperimenti otkrivaju detalje vezane za signalizacione i metaboličke puteve u kojima učestuvuju posebni geni/polipeptidi, oni daju informacije o identitetu polipeptida sa kojima ispitivani polipeptidi stupaju u interakciju i ukazuju na metode uz pomoć kojih se regulišu srodni geni i proteini.

Još jedna od tehnika za skrining lekova koja se može koristiti omogućava veliki propusni skrining jedinjenja koja imaju pogodan afinitet vezivanja za polipeptid od interesa, (videti Međunarodni patentni zahtev V7O84/03564). Kod te metode se veliki broj različitih malih ispitivanih jedinjenja sintetizuje na solidnom supstratu, koji se potom može podvrgnuti reakciji sa polipeptidom iz ovog pronalaska i isprati. Jedan od načina za imobilizaciju polipeptida je upotreba ne-neutrališućih antitela. Vezani polipeptid se tada može detektovati uz pomoć metoda koje su dobro poznate u ovoj stručnoj oblasti. Purifikovan polipeptid se takođe može direktno naneti na pločice koje će se koristiti za gore pomenute tehnika skrininga leka.

Polipeptidi iz ovog pronalaska mogu se koristiti za identifikaciju receptora vezanih za membranu ili solubilnih receptora, uz pomoć standardnih tehnika vezivanja receptora koje su poznate u ovoj stručnoj oblasti, kao što su eseji vezivanja liganda ili eseji unakrsnog povezivanja u kojima se polipeptid obeležava nekim radioaktivnim izotopom, hemijski modifikuje ili se fuzioniše sa sekvencom peptida koja olakšava njegovu detekciju ili purifikaciju i inkubira sa izvorom putativnog receptora (na primer, sastav ćelija, ćelijskih membrana, ćelijskih supernatanata, ekstrakata tkiva ili telesnih tečnosti). Efikasnost vezivanja se može izmeriti uz pomoć biofizičkih tehnika kao što su rezonanca površinskog plazmona i spektroskopija. Eseji vezivanja se mogu koristiti za purifikaciju i kloniranje receptora, ali oni takođe mogu da identifikuju agoniste i antagoniste polipeptida, koji su u kompeticiji za vezivanje polipeptida za njegov receptor. Standardne metode za sprovođenje eseja skrininga su dobro objašnjene u ovoj stručnoj oblasti.

Ovaj pronalazak takođe uključuje kit za skrining koji je koristan u metodama za identifikaciju agonista, antagonista, liganda, receptora, supstrata i enzima koji su gore opisani.

Ovaj pronalazak uključuje agoniste, antagoniste, Ugande, receptore, supstrate i enzime kao i druga jedinjenja koja modulišu aktivnost ili antigenost polipeptida iz ovog pronalaska koji je otkriven metodama koje su gore opisane.

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske sastave koji se sastoje od polipeptida, nukleinske kiseline, liganda ili jedinjenja iz ovog pronalaska u kombinaciji sa pogodnim farmaceutskim nosačem. Ovi sastavi mogu biti pogodni kao terapijski ili dijagnostički reagensi, kao vakcine ili drugi imunogeni sastavi kako je dole detaljno izneto.

Prema terminologiji koja je ovde korišćena, sastav koji sadrži polipeptid, nukleinsku kiselinu, ligand ili jedinjenje [X] je "u značajnoj meri bez" onečišćenja [u daljem tekstu, Y] kada je najmanje 85% težine ukupnog sastava X+Y predstavlja X. Preferentno, X čini najmanje oko 90% težine ukupnog sastava X+Y a još preferentnije najmanje oko 95%, 98% ili čak 99% težine.

Ovi farmaceutski sastavi treba preferentno da sadrže terapijski efikasnu količinu polipeptida, molekula nukleinske kiseline, liganda ili jedinjenja iz ovog pronalaska. Termin "terapijski efikasna količina" u smislu u kome je ovde korišćen odnosu se na količinu terapijskog agensa koja je potrebna za lečenje, ublažavanje ili prevenciju ciljane bolesti ili stanja ili za ispoljavanje detektabilnog terapijskog ili preventivnog efekta. Kod bilo kog jedinjenja, terapijski efektivna doza se može inicijalno proceniti bilo u esejima sa ćelijskom kulturom, na primer neoplastičnih ćelija ili na životinjskim modelima, obično na miševima, zečevima, psima ili svinjama. Životinjski modeli se takođe mogu koristiti za određivanje odgovarajućeg opsega koncentracija i načina davanja kod ljudi.

Precizna efektivna količina kod ljudi će zavisiti od težine bolesti, opšteg stanja ispitanika, starosti, težine i pola ispitanika, kao i načina ishrane, vremena i učestalosti administracije, kombinacije lekova, senzitivnih reakcija i tolerancije/odgovora na terapiju. Ta količina se može odrediti rutinskim eksperimentima i zasnovana je na proceni kliničara. Generalno, efektivna doza će se kretati u opsegu od 0.01 mg/kg do 50 mg/kg, preferentno 0.05 mg/kg do 10 mg/kg. Formulacije se mogu davati individualno pacijentima ili se mogu davati u kombinaciji sa drugim agensima, lekovima ili hormonima.

Farmaceutski sastav može takođe da sadrži neki farmaceutski prihvatljiv nosač, za administraciju terapijskog agensa. U takve nosače spadaju antitela i drugi polipeptidi, geni i drugi terapijski agensi kao što su lipozomi, pod uslovom da taj nosač sam ne izaziva produkciju antitela koja su štetna za pojedinca koji prima datu formulaciju i da on može pr5imenjivati bez nepotrebne toksičnosti. Pogodni nosači mogu biti veliki makromolekuli koji se sporo metabolišu kao što su proteini, polisaharidi, polilaktatne kiseline, poliglikolne kiseline, polimerne amino kiseline, kopolimeri amino kiselina i neaktivne čestice virusa.

Za to se mogu koristiti farmaceutski prihvatljive soli na primer, soli mineralnih kiselina kap što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati, sulfati i slično, kao i soli organskih kiselina kao što su acetati, propionati, malonati, benzoati, i slično. Detaljna diskusija o farmaceutski prihvatljivim nosačima se nalazi su Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., NJ. 1991).

Farmaceutski prihvatljiv nosači u terapeutskim sastavima mogu takođe da sadrže tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, glicerol i etanol. Isto tako. U takvim sastavima mogu biti prisutne i pomoćne supstance kao što su ovlaživači ili emulzifiaktori, pH puferi i slično. Takvi nosači omogućavaju da se farmaceutski sastavi formulišu u vidu tableta, pilula, dražeja, kapsula, tečnosti, gelova, sirupa, mešavina, suspenzija za ingcstiju.

Pošto se formulišu, sastavi iz ovog pronalaska se mogu davati direktno ispitaniku. Ispitanici koje treba tretirati mogu da budu životinje, a posebno ljudi.

Farmaceutski sastavi korišćeni u ovom pronalasku mogu se davati na bezbroj načina, u koje između ostalog spadaju oralni, intravenski, intramuskularni, intraarterijski, intramedularni, intratekalni, intraventrikularni, transdcrmalni ili transkutani (na primer, videti VVO98/20734), subkutani, intraperitonealni, intranazalni, enterični, površinski, sublingvalni, intravaginalni ili rektalni. Takođe se mogu koristiti genski pištolji ili hiposprejevi za administraciju farmaceutskih sastava iz ovog pronalaska. Tipično, ovi terapijski sastavi mogu da se pripreme u oblicima za injekcije, u vidu tečni rastvora ili suspenzija, solidnih oblika za rastvaranje ili suspenzija i tečnim nosačima pre

ubrizgavanja.

Direktno davanje ovih sastava će se generalno vršiti uz pomoć injekcija, subkutano, intraperitonealno, intravenski ili intramuskularno, ili se mogu davati u intrasticijalne prostore u tkivu. Ovi sastavi se mogu davati u leziju. Doze koje se koriste u tretmanu mogu biti pojedinačne ili višestruke.

Ukoliko je aktivnost polipeptida ovog pronalaska viša kod neke određene bolesti, u takvim slučajevima postoji nekoliko pristupa. Jedan od pristupa uključuje administraciju inhibitorskog jedinjenja (antagonista) kod takvog ispitanika, kako je gore opisano, zajedno sa nekim farmaceutski prihvatljivim nosačem u količini koja je efektivna za inhibiranje funkcije datog polipeptida, na primer blokiranjem vezivanja liganda, supstrata, enzima i receptora ili inhibicijom drugog signala što dovodi do ublažavanja abnormalnog stanja. Preferentno su takvi antagonisti antitela. Još preferentnije, takva antitela su himerna i/ili humanizovana kako bi se na minimum svela njihova imunogenost, kako je ranije opisano.

Prema još jednom pristupu mogu se davati solubilni oblici polipeptida koji zadržava afinitet ka vezivanju za ligand, supstrat, enzimi i receptor u pitanju. Tipično, polipeptid se može davati u vidu fragmenata koji zadržavaju relevantne delove.

Kod jednog alternativnog pristupa, ekspresija gena koji enkodira polipeptid može se inhibirati uz pomoć tehnika koje blokiraju ekspresiju, kao što je upotreba antisens molekula nukleinske kiseline (kako je gore opisano), bilo interno dobijenih ili zasebno primenjenih. Modifikacije ekspresije gena se mogu postići dizajniranjem komplementarne sekvence ili antisens molekula (DNK, RNK, ili PNA) u odnosu na kontrolu, 5' ili regulatornih regiona (signalna sekvenca, promoteri, pojačivači i introni) gena koji enkodira polipeptid. Slično tome, inhibicija se može postići upotrebom metodologije bazičnog sparivanja "trostrukog heliksa". Sparivanje Trostrukog heliksa je korisno zato što dovodi do inhibicije sposobnosti dvostrukog heliksa da se dovoljno otvara za vezivanje polimeraza, faktora transkripcije ili regulatornih molekula. U literaturi su opisana najnovija terapijska dostignuća pri korišćenju trostruke DNK (Gee, J.E.et al.(1994) In: Huber, B.E. and B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY). Komplementarna sekvenca ili antisens molekul mogu takođe biti tako dizajnirani da blokiraju translaciju mRNK sprečavanjem transkripta sa se vezuje za ribozome. Takvi oligonukleotidi se mogu davati ili se mogu dobijatiin situin vivo ekspresijom.

Osim toga, ekspresija polipeptida iz ovog pronalaska se može sprečiti upotrebom ribozoma specifičnog za njegovu enkodirajuću mRNK. sequence. Ribozomi su katalitički aktivne RNK koje mogu biti prirodne ili sintetičke (videti na primer Usman, N,et al.,Curr. Opin. Struct. Biol (1996) 6(4), 527-33). Sintetički ribozom se može tako dizajnirati sa specifično čepa mRNK na odabranim mestima i time sprečava translaciju mRNK u funkcionalni polipeptid. Ribozom se može sintetisati prirodnim riboznim fosfatnim osnovnim strukturama u prirodnim bazama, koje se normalno nalaze u molekulima RNK. Umesto toga ribozom se može sintetisati uz pomoć osnovnih struktura koje nisu prirodne, na primer, 2'-0-metil RNK, da bi se obezbedila zaštita od degradacije ribonukleaze i one mogu da sadrže modifikovane baze.

Molekuli RNK mogu biti modifikovani tako da povećavaju intracelularnu stabilnost i polu-život. U moguće modifikacije između ostalog spada dodavanje bočnih sekvenci na 5' i/ili 3' kraju molekula ili upotreba fosforotioata ili 2' O-metila pre nego fosfodiesteraznih veza unutar osnovne strukture molekula. Ovaj koncept je inherentan u proizvodnji PNA i može se proširiti na sve ove molekule uključivanjem ne-tradicionalnih baza kao što su inozin, heozin i butozin, kao i acetil-, metil-, tio- i slično modifikovanih formi adenina, citidina, guanina, timina i uridina koje endogene nukleaze ne prepoznaju tako lako.

Za lečenje abnormalnih stanja koja su u vezi sa nedovoljnom ekspresijom polipeptida iz ovog pronalaska i njegovom aktivnošću, takođe postoji nekoliko pristupa. Jedan od pristupa obuhvata administraciju terapijski efikasne količina nekog jedinjenja koje aktivira taj polipeptid tj., nekog agonista kako je gore opisano, za ublažavanje abnormalnog stanja. Umesto toga se može davati neka terapijska količina polipeptida u kombinaciji sa pogodnim farmaceutskim kako bi se obnovila relevantna fiziološka ravnoteža polipeptida.

Genska terapija se može koristiti za sprovođenje endogene proizvodnje polipeptida uz pomoć relevantnih ćelija kod ispitanika. Genska terapija se koristi za lečenje trajno neadekvatne proizvodnje polipeptida zamenom defektnog gena ispravnim terapijskim genom.

Genska terapija iz ovog pronalaska može da se odvija vivo iliex vivo. Ex vivogenska terapija iziskuje izolaciju i purifikaciju ćelija pacijenta, uvođenje terapijskog gena i uvođenje genetski izmenjenih ćelija nazad u pacijenta. Nasuprot tome, kod in vivo genske terapije nisu potrebne izolacija i purifikacija ćelija pacijenta.

Ovaj terapeutski gen je tipično "pakovan" za administraciju pacijentu. Nosači za davanje gena mogu biti ne-virusni, kao što su lipozomi ili virusi sa deficijentnom replikacijom kao što je adenovirus kako su opisali Berkner, K.L., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992) ili vektori udruženi sa adenovirusima (AAV) kako su opisali Muzvczka, N., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129 (1992) i SAD Patent br. 5,252,479. Na primer, molekul nukleinske kiseline koji enkodira polipeptid iz ovog pronalaska može se podvrgnuti inžinjeringu radi ekspresije u nekom retrovirusnom vektoru sa defektnom replikacijom. Ovaj ekspresioni konstrukt može potom biti izolovan u uveden u pakovanu ćeliju transdukovanu retrovirusnim plazmidnim vektorom koji sadrži RNK koja enkodira polipeptid, tako da ta pakovana ćelija sama proizvodi infektivne virusne čestice koje sadrže gen od interesa.. Ove produktivne ćelije se mogu administrirati ispitaniku radi ćelijskog inžinjeringa in vivo i ekspresije polipeptida in vivo (videti Poglavlje 20, Genska terapija i drugi terapijski pristupi zasnovani na molekularnoj genetici, (i reference koje su ovde citirane) u Humana molekularna genetika (1996), T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd).

Još jedan pristup je administracija "gole DNK" kod koje je terapijski gen direktno ubrizgan u krvotok ili mišićno tkivo.

U situacijama u kojima su polipeptidi ili molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska agensi koji izazivaju bolest, ovaj pronalazak obezbeđuje da se oni mogu koristiti kao vektori u vakcinama kako bi inicirali antitela protiv agensa koji izaziva bolest. Vakcine prema ovom pronalasku mogu biti profilaktičke (ie. za sprečavanje infekcije) ili terapeutske (tj. Za lečenje bolesti posle infekcije). Takve vakcine sadrže antigene za imunizaciju, imunogen(e), polipeptid(e), protein(e) ili nukleinsku kiselinu, obično u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačima kako je gore opisano, u koje spadaju bilo koji nosači koji sami ne izazivaju produkciju antitela koja su štetna za osobu koja prima taj sastav. Osim toga, ovi nosači mogu da funkcionišu kao imunostimulacioni agensi ("adjuvanti"). Takođe, taj antigen ili imunogen se može konjugovati sa bakterijskim toksoidom, kao što je toksoid iz difterije, tetanusa, kolere, II. pvlori, i drugih patogena.

Obzirom da se polipeptidi mogu razgrađivati u želucu, vakcine koje se sastoje polipeptida se preferentno daju parenteralno (na primer, subkutano, intramuskularno, intravenski ili intradermalnim injekcijama). Formulacije pogodne za paranteralnu administraciju uključuju vodene i ne-vodene sterilne rastvore za injekcije koji mogu da sadrže antioksidante, pufere, bakteriostatike i rastvorene materije koji ovu formulaciju čine izotočničnom u odnosu na krv primaoca kao i vodene i ne-vodene suspenzije koje mogu

da sadrže agense za suspendovanje ili agense za zgušnjavanje.

Formulacije vakcine iz ovog pronalaska se mogu pakovati u vidu jediničnih doza ili u kontejnerima koji sadrže više doza. Na primer, zatvorene ampule i bočice se mogu čuvati u zamrzavanjem osušenom stanju koje iziskuje samo dodavanje sterilne tečnosti neposredno pre upotrebe. Doziranje će zavisiti od specifične aktivnosti vakcine i može se lako odrediti rutinskim eksperimentima.

Genetsko davanje antitela koja se vezuju za polipeptide iz ovog pronalaska može se takođe primenjivati, na primer, kako je opisano u Međunarodnom patentnom zahtevu VVO98/55607.

Tehnologija koja se naziva ubrizgavanje mlaza (jet injection) (videti, na primer, www.powderject.com) može takođe biti korisna u formulaciji vakcine.

Jedan broj pogodnih metoda za vakcinaciju kao i sistema za davanje vakcina opisan je u Međunarodnom patentnom zahtevu VVO00/29428.

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu molekula nukleinske kiseline prema ovom pronalasku u vidu dijagnostičkih reagensa. Detekcija nekog mutiranog oblika gena koga karakterišu molekuli nukleinske kiseline iz ovog pronalaska koji je udružen sa nekom disfunkcijom predstavlja dijagnostičko sredstvo koje može da pomogne ili odredi dijagnozu neke bolesti ili osetljivosti na bolest, koja je rezultat nedovoljne ekspresije, prekomerne ekspresije ili izmenejne prostorne ili temporalne ekspresije datog gena. Osobe koje nose mutaqcije mogu se otkriti na nivou DNK uz pomoć različitih tehnika.

Molekuli nukleinske kiseline za dijagnozu se mogu dobiti iz ćelija ispitanika, kao na primer iz krvi, urina, pljuvačke, biopsije tkiva ili materijala dobijenog autopsijom. Genomska DNK se može koristiti direktno za detekciju ili se može amplifikovati enzimatski uz pomoć PCR, lančane reakcije ligaze (LCR), amplifikacijom pomeranja lanca (SDA), ili drugim tehnikama amplifikacije (videti Saikiet al,Nature, 324, 163-166

(1986); Bej,et al,Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26, 301-334 (1991); Birkenmeveret al,J. Virol. Meth, 35, 117-126 (1991); Van Brunt, J, Bio/Technology, 8, 291-294 (1990)) pre analize.

Prema jednom konceptu ovaj aspekt pronalaska obezbeđuje metodu za dijagnostikovanje bolesti kod nekog pacijenta, koja uključuje procenu nivoa ekspresije prirodnog gena koji enkodira polipeptid prema ovom pronalasku pri poređenju pomenutog nivoa ekspresije sa kontrolnim nivoom, stoje naznačeno time da neki nivo koji se razlikuje od navedenog kontrolnog nivoa ukazuje na bolest. Ova metoda se može sastojati od sledećih koraka: a) dovođenja u kontakt uzorka tkiva pacijenta sa probom nukleinske kiseline pod strogim uslovima koji omogućavaju formiranje hibridnog kompleksa između molekula nukleinske kiseline ovog pronalaska i probe; b) dovođenje u kontakt kontrolnog uzorka i navedene probe pod istim uslovima koji su korišćeni u koraku a); c) i detekcije prisustva hibridnih kompleksa u navedenim uzorcima;

što je naznačeno time detekcija nivoa hibridnih kompleksa u uzorku pacijenta koji se

razlikuju od nivoa tog hibridnog kompleksa u kontrolnom uzroku ukazuje na bolest.

Naredni aspekt ovog pronalaska podrazumeva dijagnostičku metodu koja se sastoji od sledećih koraka: a) dobijanje uzroka tkiva od pacijenta koji se testira na datu bolest; b) izolovanje molekula nukleinske kiseline prema ovom pronalasku iz navedenog uzorka tkiva; i c) Dijagnostikovanje date bolesti kod pacijenta detekcijom prisustva neke mutacije u molekulu nukleinske kiseline koji je udružen sa bolešću.

Da bi se pomogla detekcija molekula nukleinske kiseline kod gore opisanih metoda, može se uključiti i korak amplifikacije, na primer uz pomoć PCR.

Delecije i insercije se mogu detektovati na osnovu promene veličine amplifikovanog proizvoda u poređenju sa normalnim genotipom. Tačkaste mutacije se mogu identifikovati uz pomoć hibridizacije amplifikovane DNK sa obeleženom RNK iz ovog pronalaska ili umesto toga, sa obeleženom antisens sekvencom DNK iz ovog pronalaska. Savršeno usklađena sekvenca se može razlikovati od neusklađenih dupleksa digestijom RNaze ili procenom razlika u temperaturama topljenja. Prisustvo ili odsustvo određene mutacije kod pacijenta se može otkriti dovođenjem u kontakt DNK sa probom nukleinske kiseline koja se hibridizuje sa DNK pod strogim uslovima kako bi formirala hibridni molekul dvostrukog lanca, a taj hibridni molekul dvostrukog lanca ima jedan nehibridizovani deo lanca probe nukleinske kiseline na bilo kom delu koji odgovara mutaciji koja je udružena sa bolešću i on otkriva prisustvo ili odsustvo nekog nehibridizovanog dela probnog lanca što ukazuje na prisustvo ili odsustvo mutacije koja je udružena sa bolešću u odgovarajućem delu lanca DNK.

Takve dijagnostičke mere su posebno korisne za prenatalno ili čak neonatalna ispitivanja.

Tačkaste mutacije i druge razlike u sekvencama između referentnog gena i gena "mutanta" se mogu identifikovati drugim dobro poznatim tehnikama, kao što je direktno sekvencioniranje DNK ili konformacioni polimorfizam sa jednim lancem (videti Oritaet al.,Genomics, 5, 874-879 (1989)). Na primer, prajmer za sekvencioniranje se može koristiti sa PCR produktom dvostrukog lanca PCR produkt ili sa templatnim molekulom jednostrukog lanca dobijenim modifikovanom PCR. Određivanje sekvence se vrši uz pomoć konvencionalnih postupaka sa radioobeleženim nukleotidima ili postupcima automatskog sekvencioniranja sa fluorescentnim markerima. Klonirani segmenti DNK se takođe mogu koristiti za detekciju specifičnih segmenata DNK. Senzitivnost ove metode se u velikoj meri povećava kada se ona kombinuje sa PCR. Takođe, tačkaste mutacije i druge varijacije sekvenci , kao što su polimorfizmi, mogu se detektovati kako je gore opisano, na primer, upotrebom oligonukeotida specifičnih za alele kod PCR amplifikacije sekvence koja se razlikuje u pojedinačnim nukleotidima.

Razlike DNK sekvence se mogu takođe detektovati alteracijama u elektroforetičkoj mobilnosti fragmenata DNK u gelovima, sa ili bez agenasa za denaturaciju ili direktnim sekvencioniranjem DNK (na primer, Myerset al.,Science (1985) 230:1242). Promene sekvenci na specifičnim lokacijama se takođe mogu otkriti esejima sa zaštitom nukeaze, kao što je zaštita RNaze and SI ili metoda hemijskog cepanja (videti Cottonet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401).

Osim konvencionalne gel elektroforeze i sekvencioniranja DNK, mutacije kao što su mikrodelecije, aneuploidije, translokacije, inverzije, takođe mogu da se detektujuin situanalizom (videti, na primer, Kelleret al.,DNK Probes, 2nd Ed., Stockton Press, Nevv York, N.Y., USA (1993)), to jest, DNK ili RNK sekvence u ćelijama mogu da se analiziraju radi utvrđivanja mutacija bez potrebe za njihovom izolacijom i/ili imobilizacijom na membrani. Fluorescentnain situhibridizacija (FISH) je trenutno metoda koja se najčešće koristi i pojavile su se brojni revijski članci o FISH (videti, na primer,Trachuck et al.,Science, 250, 559-562 (1990), and Trasket al.,Trends, Genet., 7, 149-154

(1991)).

Prema drugom konceptu ovog pronalaska, erej oligonukleotidnih proba koji se sastoji od molekula nukleinske kiseline prema ovom pronalasku može se tako konstruisati da sprovodi efikasni skrining genetskih varijacija, mutacija i polimorfizama. Metode erej tehnologije su dobro poznate i imaju opštu primenu i mogu se koristiti za rešavanje različitih pitanja u molekularnoj genetici uključujući ekspresiju gena, genetsko povezivanje i genetsku varijabilnosti (videti na primer: M.Cheeet al.,Science (1996), Vol 274, pp 610-613).

Prema jednom konceptu, ovaj erej je pripremljen i koristi se prema metodama koje su opisane u PCT zahtevu VV095/11995 (Cheeet al) ;Lockhart, D. J.et al.(1996) Nat. Biotech. 14: 1675-1680); and Schena, M.et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619). Oligonukleotidni parovi mogu da se kreću od dva pa do preko milion. Oligomeri se sintetišu na određenim površinama na supstratu uz pomoć hemijskih procesa vođenih svetlošću. Taj supstrat može biti papir, najlon ili neki drugi tip membrane, filter, čip, staklena pločica ili bilo koja druga solidna podloga. Prema drugom aspektu, neki oligonukleotid se može sintetisati na površini supstrata uz pomoć postupka hemijskog sparivanja i ink jet aparata za aplikaciju, kako je opisano u PCT zahtevu VV095/251116 (Baldeschvveileret al).Prema još jednom aspektu, "mrežast" erej analogan tačkastom (ili erej u sa prorezom) blot mogu se koristiti za raspoređivanje i povezivanje fragmenata cDNK ili oligonukleotida za površinu supstrata korišćenjem vakum sistema i postupaka termičkog, UV, mehaničkog ili hemijskog vezivanja. Erej, poput onih koji su gore opisani, se može ručno proizvesti ili uz pomoć odgovarajućih instrumenata (slot blot ili dot blot aparata), materjala (bilo koja odgovarajuća solidna podloga), i mašina (uključujući i robotizovane instrumente), i on može da sadrži 8, 24, 96, 384, 1536 ili 6144 oligonukleotida ili bilo koji drugi broj između dva i preko milion što ga čini efikasnim za upotrebu kao komercijalno dostupnog instrumenta.

Osim metoda o kojima je gore bilo reči, bolesti se mogu dijagnostikovati metodama koje se sastoje od određivanja, iz uzorka izvedenog od ispitanika, abnormalno smanjenog ili povišenog nivoa polipeptida ili mRNK. Smanjena ili povećana ekspresija se može izmeriti na nivou RNK korišćenjem bilo koje metode koja je dobro poznata u ovoj stručnoj oblasti za kvantifikaciju polinukleotida kao što je na primer, amplifikacija nukleinske kiseline, recimo PCR, RT-PCR, zaštita RNKse, Northern blotting i druge metode hibridizacije.

Tehnike eseja koje se mogu koristiti za određivanje nivoa polipeptida iz ovog pronalaska u uzorku izvedenom od domaćina su dobro poznate stručnjacima iz ove oblasti i o njima je gore bilo reči nešto detaljnije (uključujući radioimunoeseje, eseje kompetitivnog vezivanja, VVestern Blot analizu i ELISA eseje). Ovaj aspekt pronalaska obezbeđuje dijagnostičku metodu koja obuhvata korake: (a) dovođenje u kontakt liganda kako je gore opisano sa biološkim uzorkom pod uslovima pogodnim za formiranje kompleksa ligand-polipeptid i (b) detekciju navedenog kompleksa.

Protokoli kao što su ELISA, RIA, i FACS za merenje nivoa polipeptida mogu dodatno da obezbede osnovu ja dijagnostikovanje izmenjenih ili abnormalnih nivoa ekspresije polipeptida. Normalne iii standardne vrednosti ekspresije polipeptida su ustanovljene kombinovanjem telesnih tečnosti u ćelijskim ekstraktima uzetim od normalnih ispitanika sisara, preferentno ljudi, sa antitelom na polipeptid pod uslovima pogodnim za formiranje kompleksa. Količina standardnog formiranog kompleksa se može kvantifikovati različitim metodama, kap što su fotometrijska sredstva.

Antitela koja se specifično vezuju za polipeptid iz ovog pronalaska mogu se koristiti za dijagnozu stanja ili bolesti koje karakteriše ekspresija datog polipeptida, ili u esejima za praćenje pacijenta koji se tretira polipeptidima, molekulima nukleinske kiseline, ligandima i drugim jedinjenjima iz ovog pronalaska. Antitela korisna za dijagnostičke svrhe mogu se pripremiti na isti način kao i ona koja su fore opisana za terapijske svrhe. Dijagnostički eseji za polipeptid uključuju metode koje koriste određeno antitelo i obeleživač za detekciju polipeptida u telesnim tečnostima ljudi ili ekstraktima ćelija ili tkiva. Ova antitela mogu se koristiti sa ili bez modifikacije i mogu se obeležavati spajanjem, bilo kovalentnim ili nekovalentnim, sa reporterskim molekulom. Mogu se koristiti brojni različiti reporterski molekuli koji su poznati u ovoj stručnoj oblasti, od kojih je nekolicina gore opisana.

Količine polipeptida eksprimiranog kod ispitanika, kontrolnog uzorka ili uzorka bolesti dobijenog biopsijom tkiva se porede sa standardnim vrednostima. Odstupanje između standardnih vrednosti i vrednosti kod ispitanike daje parametre za dijagnozu bolesti. Dijagnostički eseji se mogu koristiti za razlikovanje odsustva i prisustva viška ekspresije polipeptida kao i za praćenje regulacije nivoa polipeptida tokom terapijske intervencije. Takvi eseji se takođe mogu koristiti za procenu efikasnosti nekog određenog terapijskog režima u studijama na životinjama, kliničkim studijama ili pri praćenju lečenja nekog pacijenta.

Dijagnostički kit iz ovog pronalaska može da uključuje:

(a) molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaska;

(b) polipeptid iz ovog pronalaska; ili

(c) ligand iz ovog pronalaska.

Prema jednom aspektu ovog pronalaska, dijagnostički kit može da se sastoji od prvog kontejnera koji sadrži probu nukleinske kiseline koja se hibridizuje pod strogim uslovima sa molekulom nukleinske kiseline prema ovom pronalasku; drugi kontejner koji sadrži prajmere korisne za amplifikaciju molekula nukleinske kiseline; i uputstva za upotrebu probe i prajmera za lakše dijagnostikovanje bolesti. Ovaj kit takođe može da sadrži treći kontejner u kome se nalazi agens za digestiju nehibridizovane RNK.

Prema jednom alternativnom aspektu ovog pronalaska, dijagnostički kit može da sadrži neki erej molekula nukleinske kiseline, od kojih najmanje jedan može biti molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku.

Radi detekcije polipeptida prema ovom pronalasku, dijagnostički kit može da sadrži jedno ili više antitela koja se vezuju za polipeptid prema ovom pronalasku i reagens korisan za detekciju reakcije vezivanja između antitela i polipeptida.

Takvi kitovi će biti korisni za dijagnozu bolesti ili osetljivosti na bolesti, u koje između ostalog spadaju bolesti kao što su ćelijski proliferativni poremećaji, autoimuni/inflamatorni poremećaji, kardiovaskularni poremećaji, neurološki i psihijatrijski poremećaji, razvojni poremećaji, genetski poremećaji, metabolički poremećaji, infekcije i druga patološka stanja. Ove bolesti preferentno obuhvataju neoplaziju, karcinom, tumor mozga, gliom, tumor kostiju, tumor pluća, tumor dojke, tumor prostate, tumor kolona, hemangiom, mijeloproliferativni poremećaj, leukemija, hematološka bolest, neutropenija, trombocitopenija, poremećaji angiogeneze, dermatološku bolest, starenje, rane, opekotine, fibroza, kardiovaskularna bolest, restenoza, bolest srca, periferna vaskularna bolest, bolest koronarnih arterija, edem, tromboembolija, dismenoreja, endometrioza, preeklampsija, bolest pluća, COPD, astma, bolest kostiju, bolest bubrega, glomerulonefritis, bolest jetre, Kronova bolest, gastritis, ulcerativni kolitis, ulcer, imuni poremećaj, autoimuna bolest, artritis, reumatoidni artritis, psorijaza, epidermolvsis bullosa, sistemski lupus ervthematosus, ankilozirajući spondilitis, Lajmska bolest, multipla skleroza, neurodegeneracija, moždani udar, povreda mozga/kičmene moždine, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, oboljenje motornih neurona, neuromišićna bolest, HIV, AIDS, infekcija citomegalovirusom, gljivična infekcija, oftalmološki poremećaj, makularna degeneracija, glaukom, dijabetska retinopatija, povećan očni pritisak i druga stanja kod kojih učestvuju molekuli ćelijskog prepoznavanja koji sadrže imunoglobulinski domen.

Različiti aspekti i koncepti ovog pronalaska će sada biti detaljnije opisani kroz primere, uz poseban osvrt na polipeptide INSP052 i INSP055.

Treba imati u vidu da se modifikacije pojedinosti mogu izvršiti bez odstupanja od domena ovog pronalaska.

Kratak opis slika

Slika 1: Rezultati dobijeni uz pomoć BLAST u odnosu na NCBI ne-redundantne baze podataka uz pomoć sekvence polipeptida INSP052 potpune dužine.

Slika 2: Poređenje dobijeno uz pomoć BLAST između sekvence polipeptida INSP052 ukupne dužine and najbliže srodne sekvence bilijarnog glikoproteina H (mišjeg).

Slika 3: Rezultati dobijeni uz pomoć BLAST u odnosu na NCBI ne-reduntantnu bazu podataka uz pomoć sekvence polipeptida INSP055 cele dužine .

Slika 4: Poređenje dobijeno uz pomoć BLAST između sekvence polipeptida INSP055 cele dužine i najbliže srodne sekvence , bilijarnog glikoproteina H (mišji).

Slika 5: Predviđena sekvenca nukeotida INSP052 sa translacijom. Podvučena sekvenca označava predviđeni signalni peptid. Uokvirena sekvencp označava predviđeni transmembranski domen.

Slika 6: Organizacija INSP052 kodirajućeg eksona u genomskoj DNK.

Donja = INSP052.cDNK, 1251 bp. Top = chrl 1 .genomska_DNK. Sekvenca koja enkodira putativni ekstracelularni domen je podvučena. Kodoni Start i Stop su dati masnim slovima.

Slika 7: Sekvenca nukeotida i translacija kloniranog INSP052 ekstracelularnog domena

Slika 8: Mapa pENTR-INSP052-EC-6HIS

Slika 9: Mapa pEAK12d-INSP052-EC-6HIS

PRIMERI

Primer 1 INSP052 i INSP055

Sekvenca polipeptida izvedenog kombinacijom SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 16 što predstavlja translaciju uzastopnih eksona iz INSP052 koja je izvedena iz humane genomske sekvence. Sekvenca polinukleotida i polipetda SEQ ID NO 17 i SEQ ID 18 koji predstavljaju INSP055 su sekvence polinukleotida i polipeptida miševa koje su ortolozi u odnosu na INSP052. Postojanje mišjeg ortologa ide u prilog modelu gena za humanu sekvencu INSP052.

Sekvenca polipeptida INSP052 i INSP055 koju predstavljaju sekvence SEQ ID NO 16 odnosno SEQ ID NO 18, kako se predviđa sadrže sekvencu signalnog peptida i domen transmembranskog širenja.

Sekvenca polipeptida izvedena kombinacijom SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 16 koja predstavlja translaciju konsekutivnih eksona iz INSP052, je korišćena kao BLAST Zadatak u odnosu na NCBI bazu podataka neredundantnmih sekvenci. Prvih deset podudarnosti je prikazano na Slici 1, koje su sve proteini koji sadrže domen imunoglobulina.

Slika 2 prikazuje poređenje podudarnosti INSP052 Zadatak sekvence sa sekvencom poznatog proteina najveće podudarnosti, bilijarnog glikoproteina H (mišji).

Sekvenca polipeptida INSP055, je korišćena za BLAST ispitivanje u odnosu na NCBI bazu podataka nereduntantne sekvence. Prvih deset podudarnosti je prikazano na Slici 3. Slici 4 pokazuje poređenje podudarnosti sekvence ispitivane na rNSP055 sa sekvencom poznatog proteina najviše podudarnosti, bilijarnog glikoproteina H (mišji).

Oznake eksprimiranih sekvenci (ESTs) koje predstavljaju transkripte INSP052 i INSP055 kod ljudi i miševa potiču iz sledećih cDNK biblioteka cDNK: mozak, uključujući cerebelum , korteks, hipokampus, hipotalamus, produženu moždinu; unutrašnje uho i dojku. Transkripti su takođe predstavljeni sa ESTs iz lezija oligodendroglioma, glioblastoma i multiple skleroze. To ukazuje da INSP052 može da se klonira iz gore navedenih tkiva i može da bude udružen sa oboljenjima gore pomenutih tkiva. Shodno tome, polipeptidi, antitela i drugi delovi koji su ovde opisani mogu da se koriste u lečenju bolesti koja zahvata jedno od gore pomenutih tkiva.

Primer 2 Kloniranje ekstracelularnog domena 1NSP052 sklapanjem eksona

1NSP052 potpune dužine enkodira membranski protein tipa 1416 amino kiselina, povezan sa VEGF7PDGF receptorima, koji pripadaju superporodici imunoglobulina. Predviđena sekvenca nukeotida, koja počinje od inicirajućeg ATG kodona do poli A kraka je duga 2025 nukleotida (Slika 5). Kodirajuće sekvence (eds) obuhvataju 7 eksona (Slika 6). Putativna signalna sekvenca (koja enkodira amino kiseline 1-33) je locirana na eksonu 1. Sekvenca koja enkodira predviđeni transmembranski (TM) domen (amino kiselina 241 do 263) je locirana na granici ekosna 3-4.

Ekstracelularni (EC) domen koji enkodira amino kiseline 1-240 kloniran je sklapanjem eksona iz genomske DNK. Pregled metode sklapanja eksona ukratko je dat dole: - Individualni eksoni 1, 2 i 3 su amplifikovani iz genomske DNK uz pomoć PCR. Obrnuti primer eksona 3 je takođe sadržao preklapanje 1 1 baza sa 5' sekvencom eksona 4. - Eksoni purifikovani gelom su pomešani i sprovedena je druga PCR reakcija kako bi se amplifikovala rcasamblirana DNK. - PCR produkt potpune dužine koji odgovara 1NSP052 EC domenu je purifikovan gelom i subkloniran sekvencijalno u pDONR 201 (Gatevvav ulazni vektor) i pEAK12d (vektor ekspresije ) iz pomoć Invitrogen Gatevvav™ metode.

E PCR amplifikaciia eksona koji enkodiraju ekstracelularni domen INSP052 iz

genomske DNK.

PCR prajmeri su kreirani za amplifikaciju eksona 1, 2 i 3 individualno (table 1). Naredni prajmer za ekson 1 (INSP052-BlP-eksonlF) takođe sadri parcijalnu sekvencu Gatevvav attBl mesta (5' GCAGGCTTC ) i Kozak sekvencu (5' GCCACC). Obrnuti prajmer za ekson 1 (INSP052 -eksoniR) se preklapa u 18 baza sa eksonom 2 na njegovom 5' kraju. Naredni prajmer za ekson 2 (INSP052 -ekson2F) ima preklapanje od 18 bp sa eksonom ekson 1 na njegovom 5' kraju. Obrnuti prajmer za ekson 2 (INSP052 -ekson2R ) ima preklapanje od 18 baza sa eksonom 3 na njegovom 5' kraju. Naredni prajmer za ekson 3 (INSP052 -ekson3F) sadrži preklapanje od 17 bp sa eksonom 2 na njegovom 5' kraju. Obrnuti prajmer za ekson 3 (INSP052 -ekson3R) ima preklapanje od 11 baza sa eksonom 4 na njegovom 5' kraju.

Radi amplifikacije eksona 1 INSP052, primenjena je PCR reakcija na finalnoj zapremini od 50 jal sa sadržajem od 1.5 ul humane genomske DNK ( 0.1 ug/ul, Novagen kat. br. 69237). 2 ul 5 mM dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech), 6 ul INSP052-BlP-eksonlF (10 uM), 6 ul of 1NSP052 -eksonlR , 5 ul 10X Pvvo pufera u 0.5 ul Pvvo polimeraze (5 U/ul) (Roche, kat. br. 1 644 955). Uslovi PCR su bili 94 °C tokom 2 min; 35 ciklusa od 94 °C tokom 30 s, 60 °C tokom 30 s i 72 °C tokom 1 min; dodatni ciklus elongacije od 72 °C tokom 5 min; ijedan ciklus zadržavanja od °C. Proizvodi reakcije su stavljeni na 1.5 % agarozni gel (IX TAE) a PCR proizvodi odgovarajuće veličine(l 18 bp) su purifikovani od gela korišćenjem Qiaquick Gel Extraction Kita (Qiagen kat. br. 28704) i eluirani u 50 ul eluacionog pufera (OJagen).

Ekson 2 je amplifikovan u istim uslovima reakcije sa prajmerima INSP052 -ekson2F i INSP052 -ekson2R. PCR produkti od 378 bp su purifikovani od gela kako je gore navedeno.

Ekson 3 je amplifikovan korišćenjem istih reakcionih uslova sa prajmerima 1NSP052 - ekson3F i INSP052 -ekson3R. PCR produkti sa 321 bp su purifikovani od gela kako je gore navedeno.

2. Asemblacija eksona fNSP052 koji enkodiraju ekstracelularni domen

Eksoni 1, 2 i 3-4 su reasemblirani u PCR reakciji koja sadrži 5 jal svakog eksona koji je purifikovan od gela, 2 ul 5 mM dNTPs, 6 ul lNSP052-BlP-ekson 1F (10 uM), 6 ul INSP052-5HIS-R (10 uM), 5 ul 10X Pfu pufer, 14.5 ul H20 i 0.5 ul Pfu polimeraze (3 U/ul; Promega kat. br. M774B). Uslovi reakcije su bili sledeći: 94 °C, 4 min; 10 ciklusa na 94°C tokom 30 s, 48 °C tokom 30 s i 70 °C tokom 2 min; 25 ciklusa na 94 °C tokom 30 s, 52 °C, tokom 30 s i 70°C tokom 2 min ; i dodatni korak produžavanja na 70 °C tokom 10 min; i ciklus zadržavanja na 4 °C. Proizvodi reakcije su analizirani na 1.5 % agaroznom gelu (IX TAE). PCR proizvodi odgovarajuće veličine (750 bp) su purifikovani od gela uz pomoć Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen kat. br. 28704) i eluirani u 50 ul eluacionog pufera (OJagen). Dobijeni proizvod (INSP052 EC ORF) sadrži ORF iz INSP052 EC domena na bočnom 5' kraju uz attB 1 mesto i Kozak sekvencu, a na 3' kraju sekvencu koja enkodira 5HIS oznaku.

3. Subkloniranie 1NSP052 EC domena ORF u pDONR201

AttBl i attB2 mesta rekombinacije dodata su na 5' i 3' kraj INSP052 EC domena sekvence ukupne dužine u PCR reakciju koja sadrži 2 ul INSP052 EC ORF purifikovanog od gela, 2 ul 5 mM dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech), 6 ul GCP-Forvvard (10 uM), 6 ul GCP-Reverse (10 uM) , 5 ul of 10X Vent pufer i 0.5 ul Vent DNK polimeraze (2 U/ul) (Nevv England Biolabs, kat. br. M0254S) u finalnu zapreminu od 50 ul. Uslovi PCR su bili 94 °C tokom 2 min; 30 ciklusa od 94 °C tokom 30 sec; 55 °C tokom 30 sec i 72 °C tokom 1 min; dodatni korak elongacije od 72 °C tokom 3 min i ciklus zadržavanja od 4 °C. Proizvodi reakcije su analizirani na 1.5 % agaroznom gelu (IX TAE) a proizvodi PCR odgovarajuće veličine (808 bp) su purifikovani od gela uz pomoć Qiaquick Gel Extraction Kit (OJagen kat. br. 28704) i eluirani u 50 ul eluacionog pufera (OJagen). Purifikovan produkt PCR (Gatevvav-modifikovan 1NSP052 EC domen) je tada prenet u pDONR201 uz pomoć BP klonaze na sledeći način: 5 ul of Gatevvav-modifikovanog 1NSP052 EC domena je inkubirano sa mešavinom 1.5 ul pDONR201 (0.1 ug/u.1), 2 ul BP pufera i 1.5 ul of BP enzima klonaze (Invitrogen) na ST tokom 1 h. Reakcija je zaustavljena dodavanjem proteinaze K (2 ug) i inkubirana na 37°C tokom dodatnih 10 min. Podjednaka količina ove reakcije (I ul) je transformisana u 20 ulE. coliDH10B ćelija (razblaženih za 1/5 u H2O) elektroporacijom uz pomoć Biorad Genskog Pulsera. Ćelije podvrgnute elektroporaciji su razblažene dodavanjem 1 ml SOC medijuma i inkubirane tokom 1 h na 37 °C. Transformanti su aplatirani na pločice sa LB-kanamicinom i inkubirane preko noći na 37 °C. Plazmid mini prep DNK je izolovana iz dobijenih 1-10 kolonija korišćenjem Oiaprep Turbo 9600 robotičkog sistema(OJagen) i podvrgnuta DNK sekvencioniranju sa pENTR-Fl i pENTR-Rl prajmerima za sekvencioniranje uz pomoć BigDveTerminator sistema (Applied Biosvstems kat. br. 4390246) prema uputstvima proizvođača. Reakcije sekvencioniranja su purifikovane uz pomoć Dye-Ex kolona (OJagen) ili Montage SEQ 96 pločica za čišćenje (Millipore kat. br. LSKS09624) i potom analizirane na Applied Biosvstems 3700 sekvenceru.

4. Subkloniranje INSP052 EC domena ORF vektora ekspresije pEAK12d

Plazmidni eluat (1.5 ul) iz nekog pDONR201 klona koji sadrži ispravnu sekvencu 1NSP052 EC domena (plazmid ID # 13497) je tada upotrebljen u rekombinacionoj reakciji koja sadrži 1.5 ul pEAK12d (0.1 ug/ul), 2 ul LR pufera i 1.5 ul of LR klonaze (Invitrogen) u finalnoj zapremini od 10 ul. Ova mešavina je inkubirana na ST tokom 1 h, zaustavljena dodavanjem proteinaze K (2 ug) i inkubirana na 37°C tokom dodatnih 10 min. Podjednaka količina ove reakcije je upotrebljena (1 ul) za transformisanjeE. coliDH10B ćelija elektroporacijom kako je gore opisano. Ćelije podvrgnute elektroporaciji su razblažene dodavanjem of 1 ml SOC medijuma i inkubirane tokom 1 h na 37 °C. Transformanti su aplatirani za pločice sa LB-ampicilinom i inkubirane preko noći na 37 °C. Mini prep DNK je pripremljena iz 4 kolonije uz pomoć Qiaprep Turbo 9600 robotičkog sistema (OJagen) i eluirana u 50 ul eluacionog pufera. Dva ul svakog miniprep je potom podvrgnuto PCR sa ukupnim volumenom reakcije od 50 p.1 koja je sadržala 2 (al 5mM dNTPs, 6 ul 10 uM pEAK12-F, 6 ul 10 uM pEAK12-R, 5 ul 10X AmpliTaq™ pufera i 0.5 ul AmpliTaq™

(Applied Biosystems kat. br. N808-0155). Uslovi cikliranja su bili sledeći: 94 °C tokom 2 min; 30 ciklusa od 94 °C tokom 30 sec, 55°C tokom 30 sec, i 72 °C tokom 1 min; 1 ciklus, 72 °C tokom 3 min. Uzorci su potom održavani na 4 °C (ciklus zadržavanja) pre dalje analize.

Plazmidna mini prep DNK je izolovana iz kolonija koje su dale produkt PCR očekivane veličine (1074 bp) i potom podvrgnuta sekvencioniranju DNK sa pEAK12-F i pEAK12-R prajmerima za sekvencioniranje.

CsCl gradient purifikovanog maxi-prep DNK plazmida pEAK12d-INSP052EC-6HIS (plazmid ID # 13495) je pripremljen uz 500 ml kulture klona čija je sekvenca verifikovana (Sambrook J. et al., u Molekularno kloniranje, Laboratorijski priručnik, 2. izdanje, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), resuspendovan do koncentracije od 1 ug/ul u sterilnoj vodi i čuvan na -20 C.

Podvučena sekvenca = Kozak sekvenca

Masnim slovima = Kodon za zaustavljanje

Sekvenca kurzivom= His oznaka

Dvostruko podvučeno = preklapanje sa susednim eksonom

Primer 3: Ekspresija kloniranog His- ciljanog INSP052- 6His- Vl u ćelijama sisara

( plazmid No. 13495)

Humane embrionske ćelije bubrega 293 koje eksprimiraju nuklearni antigen Epstein-Barr virusa (HEK293-EBNA, Invitrogen^ su održavane u suspenziji u Ex-cell VPRO medijuma bez ćelija (zaliha za zasejavanje, podloga za održavanje, JRH). Šesnaest do 20 sati pre transfekcije (Dan-1), ćelije su zasejane u 2x T225 bočicama (50 ml po bočici u DMEM / F12 (1:1) koje su sadržale 2% FBS podloge za zasejavanje (JRH) pri gustini od 2x10<5>ćelija/ ml). Narednog dana ( 0 dan transfekcije) došlo je do transfekcije uz pomoć JetPEI™ reagensa (2ul/ug plazmida DNK, PolvPlus-transfekcija). Kod svake bočice je izvršena ko-transfekcija 113 ug cDNK (plazmid br. 13495) sa 2.3ugGFP (fluorescentni reporter gen). Transfekciona mešavina je tada dodata u 2xT225 bočice i inkubirana na 37°C (5%CO"2) tokom 6 dana. Da bi se povećale naše šanse sa dobijemo više materijala, ovaj postupak smo ponovili u dve dodatne bočice kako bi dobili ukupno 200 ml. Pozitivna transfekcija je potvrđena uz pomoć kvalitativnog fluorescentnog ispitivanja je obavljeno 1. dana i 6. dana (Axiovert 10 Zeiss).

Šestog dana (dan ubiranja), supernatanti (200ml) iz ove četiri bočice su objedinjeni i centrifugirani (4°C, 400g) i stavljeni u posudu koja je imala jedinstvenu identifikacionu oznaku.

Jedan alikvot (500ul) je zadržan za QC 6His-označenog proteina (interna biološka obrada za QC).

Proces purifikacije

Ukupno 200 ml uzorka podloge za kulturu koji je sadržao rekombinantni protein sa C-terminalnom 6His oznakom je razblažen do finalne zapremine od 200 ml hladnim puferom A (50 mM NaH2P04; 600 mM NaCl; 8.7 % (vv/v) glicerol, pH 7.5). Taj uzorak je filtriran preko sterilnog filtrera od 0.22 um (Millipore, 500 ml filterska jedinica) i čuvan na 4°C u sterilnoj bočici od 250 ml za medijum (Nalgene).

Purifikacija je izvršena na 4°C na radnoj stanici VISION (Applied Biosvstems) koja je bila povezana sa instrumentom za automatsko unošenje uzoraka (Labomatic). Postupak purifikacije se sastojao iz dva sekvencionalna koraka, afinitetne hromatografije za metale na Poros 20 MC (Applied Biosvstems) koloni koja je bila naelektrisana Ni jonima (4.6 x 50 mm, 0.83 ml), posle čega je sledila gel filtracija na Sephadex G-25 medijumu (Amersham Pharmacia) na koloni (1,0 x 10 cm).

Kod prvog hromatografskog koraka, afinitetna kolona za metale je regenerisana sa 30 zapremina kolone EDTA rastvora (100 mM EDTA; 1 M NaCl; pH 8.0), ponovo naelekrisana Ni jonima ispiranjem sa 15 zapremina kolone 100 mM NiS04rastvora, isprana sa 10 zapremina kolone pufera A, zatim 7 zapremina kolone pufera B (50 mM NaH2P04; 600 mM NaCl; 8.7 % (vv/v) glicerola, 400 mM; imidazol, pH 7.5), i na kraju uravnotežena sa 15 zapremina kolone pufera A koji je sadržao 15 mM imidazola. Ovaj uzorka je prenet uz pomoć Labomatic instrumenta za unošenje uzoraka u petlju za uzorka od 200 ml i potom je nanet na Ni afinitetnu kolonu za metale pri brzini protoka od 10 ml/min. Kolona je isprana sa 12 zapremina kolone pufera A, zatim sa 28 zapremina kolone pufera A koji je sadržao 20 mM imidazola. Tokom ispiranja sa 20 mM imidazola labavo spojeni kontaminirajući proteini su eluirani sa kolone. Rekombinantni His-obeleženi protein je na kraju eluiran sa 10 zapremina kolone pufera B pri brzini protoka od 2 ml/min, a eluirani protein je prikupljen u frakciji od 1.6 ml.

Pri drugom hromatografskom koraku, Sephadex G-25 gel-filtraciona kolona je regenersiana sa 2 ml pufera D (1.137 M NaCl; 2.7 mM KC1; 1.5 mM KH2P04; 8 mM Na2HP04; pH 7.2), i potom uravnotežena sa 4 zapremine kolone pufera C (137 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 1.5 mM KH2P04; 8 mM Na2HP04; 20 % (vv/v) glicerol; pH 7.4). Pik frakcije eluirane iz Ni-kolone je automatski preko instrumenta za unošenje uzoraka na VISIONu unet u Sephadex G-25 kolonu a protein je eluiran puferom C pri brzini protoka od 2 ml/min. Desalinizovan uzorak je dobijen u frakciji od 2.2 ml. Ta frakcija je filtrirana preko sterilnog centrifugacionog filtera od 0.22 um (Millipore), zamrznuta i čuvana na -80C. Jedan alikvot tog uzorka je analiziran na SDS-PAGE (4-12 % NuPAGE gel; Novex) coomassie prebojavanjem i VVestern blot metodom sa anti-His antitelima.

Coomassie prebojavanje. NuPAGE gel je prebojen u 0.1 % coomassie plavog R250 rastvora za prebojavanje (30 % metanol, 10 % sirćetna kiselina) na sobnoj temperaturi tokom 1 h a potom oslobođen boje u 20 % metanolu, 7.5 % sirćetnoj kiselini sve dok pozadina nije postala čista a trake proteina jasno vidljive.

VVestern blot. Posle elektroforeze proteini su elektrotransferisani iz gela na nitroceluloznu membranu na 290 mA tokom 1 sata na 4°C. Ova membrana je blokirana sa 5 % mlečnim prahom u puferu E (137 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 1.5 mM KH2P04; 8 mM Na2HP04; 0.1 % Tvveen 20, pH 7.4) tokom 1 h na sobnoj temperaturi, i potom inkubirana sa mešavinom 2 zečja poliklona anti-His antitela (G-18 i H-15, po 0.2ug/ml od svakog; Santa Cruz) u 2.5 % mlečnom prahu u puferu E preko noći na 4°C. Posle još jednog sata inkubacije na sobnoj temperaturi, membrana je isprana puferom E (3 x 10 min), i potom inkubirana sekundarnim anti-zečjim antitelom konjugiranim sa HRP (DAKO, HRP 0399) razblaženim 1/3000 u puferu E koji sadrži 2.5 % mlečnog praha tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja sa puferom E (3 x 10 minuta), membrana je razvijana sa ECL kitom (Amersham Pharmacia) tokom 1 min. Ta membrana je potom izložena Hvperfilmu (Amersham Pharmacia), film je razvijen a VVestern blot slika je vizuelno analizirana. Proteinski esej. Koncentracija proteina je određena uz pomoć BCA kita za esej proteina (Pierce) sa goveđim serumskim albuminom kao standardom. 890 ug purifikovanog proteina je dobijeno iz 200 ml medijuma za kulturu.

Claims

1. Neki polipeptid koji: (i) obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiselina koje su navedene u SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, ekstracelularnom domenu INSP052 kako je defmisano na Slici 7; (ii) predstavlja njihov fragment koji ima aktivnost polipeptida prema (i), ili ima antigenu determinantu koja je zajednička sa polipeptidom prema (i); ili (iii) predstavlja funkcionalni ekvivalent (i) ili (ii).

2. Polipeptid prema zahtevu 1 koji obuhvata ili se sastoji od sekvence amino kiselina koje su navedene u SEQ ID NO: 16.

3. Polipeptid prema zahtevu 2 koji se sastoji od sekvenci amino kiselina koje su navedene u SEQ IDNO:16.

4. Polipeptid koji je funkcionalno ekvivalentan prema zahtevu 1 (iii), za koga je karakteristično da je homologan sa sekvencama amino kiselina koje su navedene u SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16 i ima aktivnost molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrži domen imunoglobulina.

5. Polipeptid koji predstavlja fragment ili funkcionalni ekvivalent prema nekom od prethodnih zahteva, koji ima identičnost sekvence veću od 84% sa sekvencama amino kiselina navedenim u SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16, ili sa nekim njihovim aktivnim fragmentom, preferentno identičnosti sekvence veću od 85%, 90%, 95%, 98% ili 99%.

6. Polipeptid koji je funkcionalno ekvivalentan sekvencama koje su navedene u nekom od prethodnih zahteva, koji ispoljava značajnu strukturnu homologiju sa polipeptidom koji ima sekvence amino kiselina koje su navedene u SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, ili SEQ ID NO: 16.

7. Polipeptid koji predstavlja fragment sekvenci amino kiselina koje su navedene u nekom od prethodnih zahteva i ima antigenu determinantu koja je zajednička sa polipeptidom iz zahteva 1 (i) koji se sastoji od 7 ili više (na primer, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ili više) ostataka amino kiselina iz sekvenci amino kiselina navedenih u SEQ ID NO: 16.

8. Purifikovan molekul nukleinske kiseline koji enkodira neki polipeptid prema nekom od prethodnih zahteva.

9. Purifikovan molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 8, koji obuhvata sekvence nukleinskih kiselina koje su navedene u SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, ili SEQ ID NO: 15 ili predstavlja njihov suvišni ekvivalent ili fragment.

10. Purifikovan molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 9 koji se sastoji od sekvenci nukleinskih kiselina koje su navedene u SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, ili SEQ ID NO: 15 ili predstavlja njihov suvišni ekvivalent ili fragment.

11. Purifikovan molekul nukleinske kiseline koji se hibridizuje pod veoma strogim uslovima sa molekulom nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva od 8 do 10.

12. Vektor koji obuhvata molekul nukleinskih kiselina koje su navedene u bilo kom od zahteva od 8 do 11.

13. Ćelija domaćin transformisana nekim vektorom prema zahtevu 12.

14. Ligand koji se specifično vezuje za, i koji preferentno inhibira aktivnost polipeptida prema bilo kom od zahteva od 1 do 7.

15. Ligand prema zahtevu 14, koje predstavlja neko antitelo.

16. Jedinjenje koje povećava ili smanjuje nivoe ekspresije ili aktivnosti polipeptida prema bilo kom od zahteva od 1 do 7.

17. Jedinjenje prema zahtevu 16 koje se vezuje za polipeptid prema bilo kom od zahteva od 1 do 7 ne izazivajući bilo kakve biološke efekte tog polipeptida.

18. Jedinjenje prema zahtevu 17, koje predstavlja prirodni ili modifikovani supstrat, ligand, enzim, receptor ili strukturni ili funkcionalni mimetic.

19. Polipeptid prema bilo kom od zahteva od 1 do 7, molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva od 8 do 11, vektor prema zahtevu 12, ćelija domaćin prema zahtevu 13, ligand prema zahtevu 14 ili zahtevu 15, ili jedinjenje prema bilo kom od zahteva od 16 do 18, za upotrebu u lečenju ili dijagnozi bolesti.

20. Metoda za dijagnostikovanje bolesti kod nekog pacijenta, koja uključuje procenu nivoa ekspresije prirodnog gena koji enkodira polipeptid prema bilo kom od zahteva od 1 do 7, ili procenu aktivnosti polipeptida prema bilo kom od zahteva od 1 do 7, u tkivu navedenog pacijenta i poređenje pomenutog nivoa ekspresije ili aktivnosti u odnosu na kontrolni nivo, što je naznačeno time da nivo koji se razlikuje od navedenog kontrolnog nivoa ukazuje na bolest.

21. Metoda prema zahtevu 20 koja se sprovodiin vitro.

22. Metoda prema zahtevu 20 ili zahtevu 21, koja obuhvata korake: (a) dovođenje u kontakt ligand prema zahtevu 14 ili zahtevu 15 sa biološkim uzorkom pod uslovima pogodnim za formiranje kompleksa ligand-polipeptid i (b) detekcija navedenog kompleksa.

23. Metoda prema zahtevu 20 ili zahtevu 21, koja se sastoji od sledećih koraka: a) dovođenje u kontakt uzorka tkiva pacijenta sa probom nukleinske kiseline pod strogim uslovima koji omogućavaju formiranje hibridnog kompleksa između molekula nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva od 8 to 11 i probe; b) oblaganje kontrolnog uzorka navedenom probom pod istim uslovima koji su korišćeni u koraku a); i c) detekciju prisustva hibridnih kompleksa u navedenim uzorcima; što je naznačeno time da detekcija nivoa hibridnih kompleksa u nekom uzorku dobijenom od pacijenta koji se razlikuje od nivoa hibridnog kompleksa u kontrolnom uzorku ukazuje na bolest.

24. Metoda prema zahtevu 21 ili zahtevu 22, koja se sastoji od: a) dovođenja u kontakt uzorka nukleinske kiseline iz tkiva pacijenta sa prajmerom nukleinske kiseline pod strogim uslovima koji omogućavaju formiranje hibridnog kompleksa između molekula nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva od 8 do 11 i prajmera; b) dovođenja u kontakt kontrolnog uzorka sa navedenim prajmerom pod istim uslovima koji su korišćeni u koraku a); i c) Amplifikacija uzorka nukleinske kiseline; i d) Detekcije nivoa amplifikovane nukleinske kiseline u uzorcima pacijenta i u kontrolnim uzorcima; što je naznačeno time da detekcija nivoa amplifikovane nukleinske kiseline u uzorku dobijenom od pacijenta koji se značajno razlikuje od nivoa amplifikovane nukleinske kiseline u kontrolnom uzorku ukazuje na bolest.

25. Metoda prema zahtevu 21 ili zahtevu 22 koja se sastoji od: a) Dobijanja uzorka tkiva od pacijenta koji se ispituje radi utvrđivanja određene bolesti; b) Izolacije molekula nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva od 8 do 11 iz navedenog uzorka tkiva; i c) Dijagnoze bolesti kod pacijenta na osnovu detekcije prisustva neke mutacije koja je udružena sa bolešću u molekulu nukleinske kiseline u vodu indukcije bolesti.

26. Metoda iz zahteva 25, koja se sastoji od amplifikacije molekula nukleinske kiseline kako bi se formirao amplifikovani produkt i detektovalo prisustvo ili odsustvo neke mutacije u amplifikovanom produktu.

27. Metoda iz zahteva 25 ili zahteva 26, što je naznačeno time daje prisustvo ili odsustvo date mutacije kod pacijenta detektovano dovođenjem u kontakt navedenog molekula nukleinske kiseline sa probom nukleinske kiseline koja se hibridizuje sa navedenim molekulom nukleinske kiseline pod strogim uslovima kako bi formirala hibridni molekul dvostrukog lanca, a taj hibridni molekul dvostrukog lanca ima jedan nehibridizovan deo lanca probe nukleinske kiseline na bilo kom delu koji odgovara mutaciji koja je udružena sa datom bolešću, a detekcija prisustva ili odsustva nehibridizovanog dela lanca probe predstavlja indikator prisustva ili odsustva mutacije udružene sa bolešću.

28. Metoda prema bilo kom od zahteva od 20 do 27, što je naznačeno time da je navedena bolest zapravo poremećaj ćelijske proliferacije, neki autoimuni/inflamatorni poremećaj, kardiovaskularni poremećaj, neurološki poremećaj, psihijatrijski poremećaj, razvojni poremećaj, genetski poremećaj, metabolički poremećaj, infekcija ili neko drugo patološko stanje.

29. Upotreba polipeptida prema bilo kom od zahteva od 1 do 7 kao molekula prepoznavanja na površini ćelije koji sadrži imunoglobulinski domen.

30. Farmaceutski sastav koji se sastoji od polipeptida prema bilo kom od zahteva od 1 do 7, molekula nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva od 8 do 11, vektora prema zahtevu 12, ćelija domaćin prema zahtevu 13, liganda prema zahtevu 14 ili zahtevu 15, ili jedinjenja prema bilo kom od zahteva od 16 do 18.

31. Formulacija vakcine koja se sastoji od polipeptida prema bilo kom od zahteva od 1 do 7 ili molekula nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva od 8 do 11.

32. Polipeptid prema bilo kom od zahteva od 1 do 7, molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva od 10 do 11, vektor prema zahtevu 12, ćelija domaćin prema zahtevu 13, ligand prema zahtevu 14 ili zahtevu 15, ili jedinjenje prema bilo kom od zahteva od 16 do 18 ili farmaceutski sastav iz zahteva 30, za upotrebu u proizvodnji medikamenta za lečenje neke bolesti odabrane u grupi koja se sastoji od: ćelijskih proliferativnih poremećaja, autoimunih/inflamatornih poremećaja, kardiovaskularnih poremećaja, neuroloških i psihijatrijskih poremećaja, razvojnih poremećaja, genetskih poremećaja, metaboličkih poremećaja, infekcija i drugih patoloških stanja.

33. Metoda za lečenje neke bolesti kod pacijenta, koja podrazumeva administraciju datom pacijentu polipeptida prema bilo kom od zahteva od 1 do 7, molekula nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva od 8 do 11, vektora prema zahtevu 12, ćelija domaćina prema zahtevu 13, liganda prema zahtevu 14 ili zahtevu 15, ili jedinjenja prema bilo kom od zahteva od 16 do 18 ili nekog farmaceutskog sastava iz zahteva 30.

34. Metoda prema zahtevu 33, što je naznačeno time da, kod bolesti kod kojih je ekspresija prirodnog gena ili aktivnost polipeptida niža kod obolelog pacijenta u poređenju sa nivoom ekspresije ili aktivnosti kod zdravog pacijenta, dati polipeptid, molekul nukleinske kiseline, vektor, ligand, jedinjenje ili sastav koji se daju pacijentu predstavljaju agoniste.

35. Metoda prema zahtevu 33, što je naznačeno time da, kod bolesti kod kojih je ekspresija prirodnog gena ili aktivnost polipeptida viša kod obolelog pacijenta u poređenju sa nivoom ekspresije ili aktivnosti kod zdravog pacijenta, polipeptid, molekul nukleinske kiseline, vektor, ligand, jedinjenje ili sastav koji se daju pacijentu predstavljaju antagoniste.

36. Metoda praćenja kurativnog tretmana bolesti kod pacijenta, koja se sastoji od praćenja tokom nekog vremenskog perioda, nivoa ekspresije ili aktivnosti polipeptida prema bilo kom od zahteva od 1 do 7, ili nivoa ekspresije molekula nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva od 8 do 11 u tkivu navedenog pacijenta, što je naznačeno time da promena navedenog nivoa ekspresije ili aktivnosti tokom tog vremenskog perioda u odnosu na kontrolni nivo ukazuje na regresiju navedene bolesti.

37. Metoda za identifikaciju jedinjenja koje je efektivno u lečenju i/ili dijagnozi bolesti, koja se sastoji od dovođenja u kontakt polipeptida prema bilo kom od zahteva od 1 do 7, ili molekula nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva od 8 do 11 sa jednim ili više jedinjenja za koje se sumnja da imaju afinitet vezivanja prema navedenom polipeptidu ili molekulu nukleinske kiseline, i selekciju jedinjenja koje se specifično vezuje za navedeni molekul nukleinske kiseline ili polipeptid.

38. Kit koristan za dijagnostikovanje bolesti koji se sastoji od prvog kontejnera koji sadrži probu nukleinske kiseline koja se hibridizuje pod strogim uslovima sa molekulom nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva od 8 do 11; drugog kontejnera koji sadrži prajmere korisne za amplifikaciju navedenog molekula nukleinske kiseline i uputstva za upotrebu probe i prajmera kako bi se olakšalo dijagnostikovanje bolesti.

39. Kit iz zahteva 38, koji se sastoji od trećeg kontejnera u kome se nalazi agens za digestiju nehibridizovane RNK.

40. Kit koji se sastoji ereja molekula nukleinske kiseline, od kojih je najmanje jedan molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva od 8 do 11.

41. Kit koji se sastoji od jednog ili više antitela koja se vezuju za polipeptide koji su navedeni u bilo kom od zahteva od 1 do 7, i reagensa koji je koristan za detekciju reakcije vezivanja između navedenih antitela i navedenog polipeptida.

42. Transgena ili knockout ne-humana životinja koja je transformisana da eksprimira više, niže ili odsutne nivoe polipeptida prema bilo kom od zahteva od 1 do 7.

43. Metoda traženje jedinjenja efektivnog za lečenje neke bolesti, dovođenjem u kontakt neke ne-humane transgene životinje prema zahtevu 42 sa jedinjenjem kandidatom i određivanje efekta tog jedinjenja na bolest kod te životinje.