RU2012105621A - Ферментация и очистка гепаросана к5 - Google Patents

Abstract

1. Способ получения по существу чистого гепаросана из E.coli К5, включающий:(а) культивирование клеток E.coli K5 в заданной среде, содержащей глюкозу в качестве основного источника углерода,(б) осуществление связывания гепаросана с твердофазным носителем с последующим элюированием и(в) осаждение гепаросана из элюата;при этом указанный по существу чистый гепаросан является по меньшей мере на 90% чистым.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование включает фазу периодического культивирования и фазу периодического культивирования с подпиткой, при этом(а) среда, применяемая на стадии периодического культивирования, содержит (на литр) примерно 20 г глюкозы, 10-300 мг тиамина, примерно 13,5 г КНРО, примерно 4,0 г (NH)HPOпримерно 1,4 г MgSO·7HO, примерно 1,7 г лимонной кислоты, и примерно 10,0 мл раствора микроэлементов, при этом раствор микроэлементов по существу состоит из (на 1 л 5М HCl) 10,0 г FeSO·7HO, 2,0 г CaCl, 2,2 г ZnSO·7HO, 0,5 г MnSO·4HO, 1,0 г CuSO·5HO, 0,1 г (NH)MoO·4HO и 0,02 г NaBO·10HO и при этом;(б) среда для подпитки, применяемая на стадии периодического культивирования с подпиткой, содержит (на литр): 250-1000 г глюкозы, 20 г MgSO, 0,15-0,5 г тиамина, и возможно 47 г KHPOи(в) при этом снабжение кислородом осуществляют путем барботирования воздуха с дополнительной подачей или без дополнительной подачи кислорода.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что содержание растворенного кислорода поддерживают на уровне примерно 20%.4. Способ по п.2, отличающийся тем, что температуру поддерживают на уровне примерно 37°С, а рН поддерживают на уровне примерно 7.5. Способ по п.4, отличающийся тем, что рН поддерживают путем добавления 29%-ным раствора аммиака.6. Способ по п.2, отличающийся тем, что среду, применяе�

Claims (18)

1. Способ получения по существу чистого гепаросана из E.coli К5, включающий:

(а) культивирование клеток E.coli K5 в заданной среде, содержащей глюкозу в качестве основного источника углерода,

(б) осуществление связывания гепаросана с твердофазным носителем с последующим элюированием и

(в) осаждение гепаросана из элюата;

при этом указанный по существу чистый гепаросан является по меньшей мере на 90% чистым.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование включает фазу периодического культивирования и фазу периодического культивирования с подпиткой, при этом

(а) среда, применяемая на стадии периодического культивирования, содержит (на литр) примерно 20 г глюкозы, 10-300 мг тиамина, примерно 13,5 г КН₂РО₄, примерно 4,0 г (NH₄)₂HPO₄ примерно 1,4 г MgSO₄·7H₂O, примерно 1,7 г лимонной кислоты, и примерно 10,0 мл раствора микроэлементов, при этом раствор микроэлементов по существу состоит из (на 1 л 5М HCl) 10,0 г FeSO₄·7H₂O, 2,0 г CaCl₂, 2,2 г ZnSO₄·7H₂O, 0,5 г MnSO₄·4H₂O, 1,0 г CuSO₄·5H₂O, 0,1 г (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O и 0,02 г Na₂B₄O₇·10H₂O и при этом;

(б) среда для подпитки, применяемая на стадии периодического культивирования с подпиткой, содержит (на литр): 250-1000 г глюкозы, 20 г MgSO₄, 0,15-0,5 г тиамина, и возможно 47 г KH₂PO₄ и

(в) при этом снабжение кислородом осуществляют путем барботирования воздуха с дополнительной подачей или без дополнительной подачи кислорода.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что содержание растворенного кислорода поддерживают на уровне примерно 20%.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что температуру поддерживают на уровне примерно 37°С, а рН поддерживают на уровне примерно 7.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что рН поддерживают путем добавления 29%-ным раствора аммиака.

6. Способ по п.2, отличающийся тем, что среду, применяемую на стадии периодического культивирования с подпиткой, подают со скоростью, определяемой по формуле:

$$Ms(t)=F(t)S_{F(t)}=\left(\frac{\mu }{Y_{\frac{X}{S}}}+m\right)X(t_0)V(t_0)\exp \left[\mu \left(t-t_0\right)\right]$$

,

где M_S представляет собой скорость потока источника углерода (г/ч), F - скорость подачи раствора для подпитки (л/ч); S_F представляет собой концентрацию источника углерода в подпитке (г/л); Х - концентрация клеток (г/л с.м.к.), m - удельный коэффициент поддержания (г/г DCW/ч), V - объем культуры (л); t₀ - время начала подпитки; t - время процесса; µ - удельная скорость роста (ч^-1) и Y_x/s - выход клеток па количество источника углерода (г/г).

7. Способ по п.2, отличающийся тем, что выход гепаросана составляет более 12 г/л супернатанта культуры.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что ферментацию проводят в течение менее 48 ч, без учета роста стартовой культуры.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия осуществления связывания и элюирования включает (I) удаление клеток, (II) смешивание анионной смолы с супернатантом культуры и удаление супернатанта, (III) промывку смолы с помощью 50 мМ хлорида натрия в натрий-ацетатном буфере при рН 4, (IV) элюирование 1 М хлорида натрия в натрий-ацетатном буфере при рН 4.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия осуществления связывания и элюирования включает (I) удаление клеток, (II) смешивание раствора хитозана с супернатантом культуры, (III) осаждение хитозана и выделение осадка; (III) промывку хитозана. (IV) элюирование гепаросаиа с помощью примерно 1 М раствора NaOH.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что осаждение гепаросана из элюата включает осаждение с помощью этанола.

12. Способ по п.1, дополнительно включающий депирогенизацию с помощью перекиси водорода.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный гепаросан содержит менее 1% ДНК и менее 2% белка.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный гепаросан имеет среднечисленный молекулярный вес примерно 58000 Да, средневесовой молекулярный вес 84000 Да и индекс полидисперсности (ИПД) примерно 1,4.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный гепаросан является по меньшей мере на 95% чистым.

16. Гепаросан, полученный с помощью способа по любому из пп.1-15.

17. Гепарин, изготовленный из гепаросана по п.16.

18. Применение гепаросана, полученного с помощью способа по любому из пп.1-15.