RU2315103C1 - Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах - Google Patents
Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах Download PDFInfo
- Publication number
- RU2315103C1 RU2315103C1 RU2006121781/13A RU2006121781A RU2315103C1 RU 2315103 C1 RU2315103 C1 RU 2315103C1 RU 2006121781/13 A RU2006121781/13 A RU 2006121781/13A RU 2006121781 A RU2006121781 A RU 2006121781A RU 2315103 C1 RU2315103 C1 RU 2315103C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biocatalyst
- carrier
- protein
- immobilized
- activity
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 153
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 153
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 title claims abstract description 129
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 title claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 2
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 title 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 62
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 35
- 108010053512 phosphorylphosphatase Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000000495 cryogel Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 150000002903 organophosphorus compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 12
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 abstract description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 4
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 abstract 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 62
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 26
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 23
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 13
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 12
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 12
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 12
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 12
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 7
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 7
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical group OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- WYMSBXTXOHUIGT-UHFFFAOYSA-N paraoxon Chemical compound CCOP(=O)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WYMSBXTXOHUIGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960004623 paraoxon Drugs 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 4
- 229940088644 n,n-dimethylacrylamide Drugs 0.000 description 4
- YLGYACDQVQQZSW-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylprop-2-enamide Chemical compound CN(C)C(=O)C=C YLGYACDQVQQZSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000006996 Aryldialkylphosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108010008184 Aryldialkylphosphatase Proteins 0.000 description 3
- 102000004203 Phosphoric Triester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000754 Phosphoric Triester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 241000589539 Brevundimonas diminuta Species 0.000 description 2
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003926 acrylamides Chemical class 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 231100000313 clinical toxicology Toxicity 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N ethylenediaminetriacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCCN(CC(O)=O)CC(O)=O OUDSFQBUEBFSPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000447 pesticide residue Substances 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 206010053172 Fatal outcomes Diseases 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYPFDBRUNKHDGX-SOGSVHMOSA-N N1C2=CC=C1\C(=C1\C=CC(=N1)\C(=C1\C=C/C(/N1)=C(/C1=N/C(/CC1)=C2/C1=CC(O)=CC=C1)C1=CC(O)=CC=C1)\C1=CC(O)=CC=C1)C1=CC(O)=CC=C1 Chemical compound N1C2=CC=C1\C(=C1\C=CC(=N1)\C(=C1\C=C/C(/N1)=C(/C1=N/C(/CC1)=C2/C1=CC(O)=CC=C1)C1=CC(O)=CC=C1)\C1=CC(O)=CC=C1)C1=CC(O)=CC=C1 LYPFDBRUNKHDGX-SOGSVHMOSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- DYAHQFWOVKZOOW-UHFFFAOYSA-N Sarin Chemical compound CC(C)OP(C)(F)=O DYAHQFWOVKZOOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022833 Serum paraoxonase/lactonase 3 Human genes 0.000 description 1
- GRXKLBBBQUKJJZ-UHFFFAOYSA-N Soman Chemical compound CC(C)(C)C(C)OP(C)(F)=O GRXKLBBBQUKJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 231100000722 genetic damage Toxicity 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N isosorbide mononitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[C@@H]1CO[C@@H]2[C@@H](O)CO[C@@H]21 YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L nickel sulfate Chemical compound [Ni+2].[O-]S([O-])(=O)=O LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000363 nickel(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000744 organoheteryl group Chemical group 0.000 description 1
- RLBIQVVOMOPOHC-UHFFFAOYSA-N parathion-methyl Chemical group COP(=S)(OC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 RLBIQVVOMOPOHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 phosphoric acid triesters Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000009834 selective interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960002197 temoporfin Drugs 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для деструкции фосфорорганических соединений в проточных системах. Задачей предлагаемого изобретения является создание способа получения эффективного иммобилизованного биокатализатора для разложения ФОС в проточных системах и сам биокатализатор. На пористом носителе, представляющем собой криогель полимера, представляющего собой полиакриламид или его производные, поверхность которого модифицирована металл-хелатирующими лигандами и заряжена ионами двухвалентных металлов, иммобилизуют полипептид, содержащий полигистидиновую последовательность и проявляющий активность органофосфатгидролазы. Иммобилизацию пептида проводят пропуская его раствор через объем носителя. Способ экономически выгоден, биокатализатор может быть высушен, храниться в таком виде длительный период времени и регидратирован без существенных потерь активности, а также длительно использован в проточных системах. 2 н.п. ф-лы, 10 ил., 4 табл.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов, и может быть использовано для деструкции фосфорорганических соединений (ФОС) в проточных системах, в частности в различных системах очистки воды (муниципальных, сельскохозяйственных, индивидуальных пользователей и т.п.).
ФОС представляют собой эфиры ортофосфорной и алкилфосфоновых кислот, а также их производных, которые широко применяются в качестве пестицидов в сельском хозяйстве и инсектицидов в бытовых условиях, а также к их числу относятся наиболее токсичные боевые отравляющие вещества нервно-паралитического действия зоман, зарин и Vx [Kwong, T.C. Organophosphate pesticides: biochemistry and clinical toxicology. // Ther. Drug. Monit., 2002, V.24 (1), p.144-149; Юфит, С.С. Яды вокруг нас. Вызов человечеству. // М.: Классикс Стиль, 2002, 368 с.; Вредные вещества в промышленности. Справочник: Изд. 7-е. В трех томах. Т.III. Неорганические и элементоорганические соединения. Под ред. Н.В.Лазарева, И.Д.Гадаскиной: Л.: Химия, 1977, 608 с].
Ежегодное применение ФОС в объеме сотен тысяч тонн [Gold R.S., Wales M.E., Grimsley, J.K. Green solution for chemical problems. // Disarm. Technol., 2000, V.23, p.263-286] для нужд сельского хозяйства, а также низкие скорости разложения ФОС в условиях окружающей среды приводят к накоплению этих веществ и обнаружению их в почвах, грунтовых и речных водах, продуктах питания, табачных и хлопчатобумажных изделиях, домашней пыли [Obendorf S.K., Lemley A.T., Hedge A., Kline A.A., Tan К., Dokuchaeva Т. Distribution of pesticide residues within homes in central New York state. // Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2006, V.50 (1), p.31-44; Lemley A., Hedge A., Obendorf S.K., Hong S., Kim J., Muss T.M., Varner C.J., Selected pesticide residues in house dust from farmers homes in central New York state. // Bull. Environ. Contamin. Toxicol., 2002, V.69 (2), p.155-163]. Токсичное воздействие ФОС на живые организмы может быть острым или кумулятивным, проявляющимся в различного рода расстройствах нервной системы, вплоть до развития паралича со смертельным исходом [Kwong Т.С. Organophosphate pesticides: biochemistry and clinical toxicology. // Ther. Drug. Monk., 2002, V.24 (1), p.144-149]. Также ФОС являются сильными мутагенами, вызывающими появление множественных хромосомных аберраций и развитию канцерогенеза [Hong M.S., Hong S.J., Barhoumi R., Burghardt R.C., Donnelly K.C., Wild J.R., Venkatraj V., Tiffany-Castiglioni E., Neurotoxicity induced in differentiated SK-N-SH-SY5Y human neuroblastoma cells by organophosphorus compounds. // Toxic. Appl. Pharmac., 2003, V.186 (2), p.110-118; Webster L.R., McKenzie G.H., Moriarty H.T., Organophosphate-based pesticides and genetic damage implicated in bladder cancer. // Cancer Genetics Cytogen., 2002, V.133, p.112-117]. В связи с этим эффективные и неагрессивные для человека и окружающей среды способы элиминирования угрозы любых контактов с ФОС представляют собой большой практический интерес.
Органофосфатгидролаза (ОРН) (арилдиалкилфосфатаза, параоксоназа, фосфотриэстераза, ЕС 3.1.8.1) - фермент, катализирующий гидролиз Р-O, P-F и P-S связей в триэфирах фосфорной кислоты [Ефременко Е.Н., Сергеева B.C. Органофосфатгидролаза - фермент, катализирующий деградацию фосфорсодержащих отравляющих веществ и пестицидов. // Известия АН Сер. Хим., 2001, C.1743-1749].
Принципиальная схема реакции, катализируемой ОРН, выглядит следующим образом.
где Х = О, S и F (R3 в этом случае отсутствует)
Y = О, S
Скорости ферментативного гидролиза ряда ФОС в 10-100 раз выше химического щелочного гидролиза, а продукты гидролиза либо не токсичны, либо относятся к существенно менее токсичному классу соединений. Поскольку ФОС преимущественно накапливаются в сточных промышленных и сельскохозяйственных водах, то наибольший интерес привлекают системы, в которых ФОС могут разлагаться непосредственно в протоке.
Для получения стабильной формы ОРН, которая может быть использована многократно для гидролиза ФОС, проводят иммобилизацию фермента различными способами.
Одной из главных характеристик любого способа получения биокатализатора на основе иммобилизованного фермента является количество белка, которое может быть иммобилизовано на единице носителя (на 1 г, мл, см2).
Основной характеристикой любого иммобилизованного фермента является его удельная каталитическая активность (ед/мг иммобилизованного белка). За единицу ферментативной активности принимают количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкмоль субстрата за одну минуту при 25°С.
Сравнение активности ферментов, гидролизующих ФОС и иммобилизованных разными способами, как правило, проводится по параоксону как самому широко распространенному субстрату, определение продуктов гидролиза которого легко осуществимо спектрофотометрическим методом (λ=405 нм).
Определение отношения каталитической константы (kcat) к константе Михаэлиса (Km), отражающей сродство фермента к субстрату, проводится для установления каталитической эффективности действия биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов.
Период полуинактивации - это период времени, в течение которого иммобилизованный фермент теряет 50% своей исходной каталитической активности, является одной из важнейших характеристик биокатализаторов, и, как правило, определяется для условий его хранения и эксплуатации.
Эти основные характеристики способов получения биокатализаторов и самих биокатализаторов используются для их сравнительного анализа.
Известен способ получения биокатализатора для гидролиза ФОС на основе ОРН, иммобилизованной методом физической адсорбции на трифенилметилагарозе [Caldwell S.R., Raushel F.M. Detoxification of organophosphate pesticides using an immobilized phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. // Biotechnol. Bioeng., 1991, V.37, p.103-109], согласно которому к 2 мл суспензии трифенилметилагарозы в 125 мМ CHES-буфере (рН 9,0) добавляют предварительно очищенный препарат ОРН и аккуратно, чтобы не повредить носитель, перемешивают в течение как минимум 10 мин. После этого суспензию помещают в колонный реактор и промывают 30 мл 125 мМ CHES-буфера (рН 9,0). Общее время получения биокатализатора составляет 70 мин, способ позволяет максимально ввести 1,84 мг белка/мл носителя. Использование такого биокатализатора в проточном реакторе для гидролиза ФОС при скорости протока 11,5 мл/ч (удельная нагрузка на носитель 585,7 л/ч·м2) и концентрации субстрата 0,17 мМ обеспечивает максимальную активность иммобилизованного фермента, которая, согласно расчетам, сделанным на основе данных, приводимых авторами способа, составляет 6,30 ед/мг белка. Период полуинактивации этого биокатализатора при его использовании для детоксикации ФОС в проточной системе составляет 95 мин при 55°С.
Несмотря на простоту иммобилизации фермента методом адсорбции, сам способ обладает рядом существенных недостатков, которые заключаются в том, что адсорбированный фермент быстро смывается с поверхности носителя, а сам носитель, по признанию авторов, принципиально не может быть использован при скоростях протока выше 70 мл/ч из-за его деформации, к тому же носитель дорог и его применение на практике, согласно экономическим расчетам авторов, не целесообразно. К тому же высокое сродство носителя к гидрофобному субстрату, обнаруженное авторами этого способа, приводит к тому, что большая часть субстрата связывается с носителем и остается не гидролизованной.
Существует ряд способов получения биокатализаторов для гидролиза ФОС в проточных системах, основанных на ковалентной иммобилизации ОРН на различных носителях.
Известен способ получения биокатализатора путем иммобилизации ОРН на поверхности гранул пористого стекла (70-400 мкм в диаметре), которую предварительно этерефицируют при 0°С в течение 2-3 ч и последовательно обрабатывают гидразином и азотистой кислотой (в течение 1-1,5 ч) с целью получения азидных групп на поверхности стекла. Иммобилизацию белка проводят также при 0°С в течение 30 мин [Munnecke D. Properties of an immobilized pesticide-hydrolyzing enzyme. // Appl. Environ. Microbiol., 1977, V.33 (3), p.503-507]. Общее время получения биокатализатора составляет 210-300 мин. Способ позволяет вводить до 0,19 мг белка на 1 г носителя. Использование такого биокатализатора в проточном реакторе для гидролиза ФОС при скорости протока 210 мл/ч (удельная нагрузка на носитель 1190 л/ч·м2) и концентрации субстрата 21 мкМ обеспечивает максимальную активность иммобилизованного фермента, которая, согласно расчетам, сделанным на основе данных, приводимых авторами способа, составляет 0,92 ед/мг белка. Период полуинактивации этого биокатализатора при его использовании для детоксикации ФОС в периодических и непрерывных условиях в проточной системе составляет соответственно 38 и 280 сут.
Этот способ получения и биокатализатор обладают рядом существенных недостатков, основными из которых являются крайне низкое количество иммобилизуемого белка и, как следствие, очень низкая активность биокатализатора.
Известен способ, который предлагает использование для иммобилизации ОРН носителя в виде нейлоновой трубки длиной 3 м и внутренним диаметром 1,6 мм (таким образом, рабочий объем реактора - 6,03 см3), внутреннюю поверхность которой активируют глутаровым альдегидом (12,5% раствор в 0,1 М боратном буфере, рН 8,5) при 0°С в течение 30 мин и далее промывают 50 мл того же буфера в течение 30 мин [Caldwell S.R., Raushel F.M., Detoxification oforganophosphate pesticides using a nylon based Immobilized phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta.// Appl. Biochem. Biotechnol., 1991, V.37, p.59-72]. Иммобилизацию фермента осуществляют путем пропускания раствора частично очищенного препарата ОРН (степень чистоты не указана) в замкнутом цикле через носитель со скоростью 2,5 мл/мин при 0°С в течение 4 ч. Далее носитель отмывают 150 мл раствора 50 мМ триэтаноламина (рН 9,0). Общее время получения биокатализатора составляет 470 мин, способ позволяет максимально ввести 0,036 мг белка/мл носителя. Использование такого биокатализатора в проточном реакторе для гидролиза ФОС при скорости протока 210 мл/ч (удельная нагрузка на носитель 1857 л/ч·м2) и концентрации субстрата 2 мМ обеспечивает максимальную активность иммобилизованного фермента, которая согласно расчетам, сделанным на основе данных, приводимых авторами способа, составляет 12,0 ед/мг белка. Период полуинактивации этого биокатализатора при его использовании для детоксикации ФОС не известен и из-за недостатка данных, приводимых авторами, не может быть определен.
Несмотря на достаточно высокую активность биокатализатора, получаемого согласно этому способу, сам способ характеризуется существенными недостатками, не позволяющими использовать его на практике: необходимо применение высокотоксичного сшивающего агента для активации носителя в виде растворов достаточно высокой концентрации (12,5%); процедура получения биокатализатора длительна и необходимо соблюдение постоянного низкотемпературного режима проведения процесса (0°С); ковалентная иммобилизация фермента приводит к существенной его инактивации (каталитическая эффективность действия фермента снижается в 160 раз в результате иммобилизации по сравнению с растворимой формой) и делает невозможной регенерацию биокатализатора.
Существует ряд способов получения биокатализаторов для детоксикации ФОС в проточной системе, основанных на иммобилизации ОРН за счет аффинных взаимодействий между носителем и генетически модифицированным ферментом, при этом генетическая модификация ОРН заключается во введении в структуру молекулы белка дополнительных аминокислотных последовательностей, через которые реализуется специфическая связь белка с носителем. Поскольку после генетической модификации белок имеет полную аминокислотную последовательность, отличную от аминокислотной последовательности ОРН, то принято называть такой белок не ОРН, а полипептидом со свойствами ОРН.
Известен способ получения биокатализатора на основе иммобилизованного на CF11-целлюлозе полипептида со свойствами ОРН, содержащего целлюлозосвязывающий домен на N-конце молекулы белка (CBD-OPH) [Richins R. D., Mulchandani A., Chen W. Expression, immobilization and enzymatic characterization of cellulose-binding domain-organophosphorus hydrolase fusion enzymes. // Biotech. & Bioeng., 2000, V.69 (6), p.591-596]. Согласно этому способу 30 мл целлюлозной матрицы промывают 60 мл 50 мМ фосфатно-цитратного буфера (рН 8,0), содержащего 100 мкМ CoCl2, 50 мМ NaCl и 0,1% Triton-X100, после чего инкубируют носитель с CBD-OPH в течение 30-60 мин при комнатной температуре при перемешивании на горизонтальном шейкере при 60 об/мин в том же буфере. Далее отмывают носитель от несвязавшегося фермента тем же буфером (120 мл). К биокатализатору добавляют азид натрия до концентрации 0,02%, чтобы предотвратить его микробную контаминацию. Общее время получения биокатализатора составляет 270 мин, способ позволяет максимально ввести 0,5 мг белка/мл носителя. Использование такого биокатализатора в проточном реакторе для гидролиза ФОС при скорости протока 100 мл/ч (удельная нагрузка на носитель 1273 л/ч·м2) и концентрации субстрата 2 мМ обеспечивает максимальную активность иммобилизованного фермента, которая согласно расчетам, сделанным на основе данных, приводимых авторами способа, составляет 3,0 ед/мг белка. Период полуинактивации этого биокатализатора при его использовании для детоксикации ФОС согласно данным авторов составляет 100 сут.
Несмотря на простоту способа иммобилизации, биокатализатор не может быть использован на практике, так как носитель подвержен микробной биодеградации и требует постоянного дополнительного введения в проточный реактор антимикробных веществ, которые необходимо вводить в состав вод, содержащих ФОС и подлежащих обработке. К тому же часть ФОС сорбируется целлюлозным носителем, а при скорости протока выше 100 мл/ч происходит деформация носителя, и эффективность действия биокатализатора снижается.
Согласно другому способу получения биокатализатора для детоксикации ФОС в проточных системах осуществляется иммобилизация полипептида со свойствами ОРН, представляющего собой ОРН, у которой на N-конец белковой молекулы генетически введены и последовательно соединены гексагистидиновая последовательность (His6), зеленый флуоресцирующий белок (GFP) и энтерокиназный сайт рестрикции (ЕК). Сокращенно этот полипептид обозначается как His6-GFP-EK-OPH [Wu C.-F., Cha H.J., Valdes J.J., Bentley W.E. GFP-visualized immobilized enzymes: degradation of paraoxon by organophosphorus hydrolase in a packed column. // Biotechn. & Bioeng., 2002, V.77 (2), p.212-218]. В качестве носителя используется HiTrap, представляющий собой 6%-ную агарозу, обработанную высокими концентрациями сшивающего агента (тип агента не указан). Поверхность носителя активируется остатками иминодиуксусной кислоты, далее через 1 мл HiTrap пропускают 0,5 мл 0,1 М раствор сульфата никеля, после чего носитель промывают 5 мл дистиллированной воды и уравновешивают 20 мМ Na-фосфатным буфером, содержащим 500 мМ NaCl и 0,5 мМ имидазола (рН 8,5). На носитель наносят препарат белка, прокачивая раствор His6-GFP-EK-OPH (200 мл) через колонку с носителем со скоростью 2 мл/мин, после чего носитель промывают 10 мл того же буфера. Общее время получения биокатализатора составляет 105-110 мин, способ позволяет максимально ввести 0,284 мг белка/мл носителя. Использование такого биокатализатора в проточном реакторе для гидролиза ФОС при скорости протока 120 мл/ч (удельная нагрузка на носитель 1528 л/ч·м2) и концентрации субстрата 0,05 мМ обеспечивает максимальную активность иммобилизованного фермента, которая согласно расчетам, сделанным на основе данных, приводимых авторами способа, составляет 0,059 ед/мг белка. Период полуинактивации этого биокатализатора при его использовании для детоксикации ФОС не известен и из-за недостатка данных, приводимых авторами, не может быть определен.
Подход, лежащий в основе этого способа иммобилизации фермента на носителе, состоит в образовании множественных координационных связей между заряженной ионами металлов поверхностью носителя, активированной металл-хелатирующими лигандами, и атомами азота имидазольных колец в полигистидиновой последовательности полипептида His6-GFP-EK-OPH. Такая иммобилизация фермента за счет координационных связей имеет ряд существенных преимуществ перед физической и ковалентной иммобилизацией, так как, с одной стороны, гарантирует высокую прочность связи фермента с носителем без применения сшивающих агентов, а с другой - сохраняет возможность регенерации биокатализатора за счет мягкого удаления инактивированного белка с поверхности носителя при его обработке имидазолом и последующим нанесением новой порции активного фермента.
Несмотря на очевидные преимущества этого подхода к получению биокатализаторов известный способ и биокатализатор обладают рядом недостатков, исключающих возможность их использования на практике: способ позволяет иммобилизовать только очень низкие концентрация белка, и, как следствие этого, биокатализатор обладает крайне низкой активностью и способен эффективно гидролизовать лишь невысокие концентрации ФОС (0,05 мМ). Скорости протока, при которых действие биокатализатора остается эффективным, не превышают 100 мл/ч, что в 5-8 раз ниже тех, которые требуются на практике в проточных системах для детоксикации ФОС в составе речных, сточных вод и т.д. Следует отметить также, что согласно характеристикам самого носителя, максимальная скорость протока, при которой он может быть использован, составляет всего 240 мл/ч, дальнейшее увеличение скорости протока приводит к его разрушению.
Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по способу получения биокатализатора для гидролиза ФОС в проточных системах за счет координационной иммобилизации полипептида со свойствами ОРН на пористом носителе, поверхность которого модифицирована металл-хелатирующими лигандами, принято за прототип.
Задачей предлагаемого изобретения является получение на основе иммобилизованного полипептида со свойствами ОРН эффективного биокатализатора, предназначенного для гидролиза ФОС в проточных системах.
Поставленная задача решается тем, что на пористом носителе, представляющем собой криогель синтетического полимера взятого из ряда полиакриламид и его аналоги, полученные при полимеризации мономеров, представляющих собой различные производные акриламида (например, поли-N,N-диметилакриламид, полиоксиэтилметакрилат, поли-N,N-изопропилакриламид, поли-2-оксиэтилпропилакриламид), поверхность которого модифицирована металл-хелатирующими лигандами и заряжена ионами двухвалентных металлов, иммобилизуют полипептид, содержащий полигистидиновую последовательность и проявляющий активность органофосфатгидролазы, путем пропускания его раствора через объем носителя с последующей отмывкой носителя от несвязавшегося белка.
Заявляемый способ предлагает в качестве носителей для иммобилизации белка использовать криогели синтетических полимеров [Lozinsky V.I., Galaev I.Yu., Plieva F.M., Savina I.N., Jungvid H., Mattiasson В. Polymeric cryogels as promising materials of biotechnological interest. // Trends Biotechol., 2003, V.21, p.445-451], которые получаются в результате структурирования полимеров или полимеризации мономеров при низких температурах. Замораживание растворов полимеров или мономеров с добавлением сшивающих агентов позволяет получить монолит с трехмерной структурой, для которой характерно наличие большого количества пор размером 10-100 мкм, которые превышают размеры пор, образующиеся при обычной полимеризации [Plieva F.M., Savina I.N., Deraz S., Andersson J., Galaev I.Yu., Mattiasson В., Characterization of supermacroporous monolithic polyacrylamide based matrices designed for chromatography of bioparticles. // J.Chromatog. B, 2004, V.807 (1), p.129-137]. При этом носитель представляет собой единый монолит, а не отдельные гранулы, что снижает диффузионные проблемы при использовании носителя в колоночном реакторе. Большой размер пор, с одной стороны, позволяет увеличивать скорость потока жидкости через носитель, а с другой - образует значительную поверхность, достаточную для модификации лигандами и необходимую для проведения эффективной иммобилизации белков. Поверхность криогелей полимеров легко модифицируется с помощью различных металл-хелатирующих лигандов (иминодиуксусной кислотой, IDA; N,N,N'-трис-(карбоксиметил)-этилендиамином, TED; нитрилотриуксусной кислотой, NTA), которые могут быть «заряжены» различными ионами металлов [Efremenko E., Votchitseva Yu., Plieva F., Galaev I., Mattiasson В. Purification of His6-organophosphate hydrolase using monolithic supermacroporous polyacrylamide cryogels developed for immobilized metal affinity chromatography. // Appl. Microbiol. Biotechnol., 2006, V.70 (5), p.558-563]. Большой размер пор в структуре криогелей полимеров обеспечивает использование клеточных экстрактов, содержащих целевые белки для непосредственного нанесения на носитель и проведения иммобилизации белка без дополнительных стадий очистки [Arvidsson P., Plieva F.M., Lozinsky V.I., Galaev I.Yu., Mattiason В. Direct chromatographic capture of enzyme from crude homogenate using immobilized metal affinity chromatography on a continuous supermacroporous adsorbent. // J. Chromatog. A, 2003, V.986, p.275-290]. За счет высокоселективного взаимодействия носителя с белком, содержащим полигистидиновую последовательность, возможно одновременно проводить выделение, очистку и иммобилизацию целевого белка.
Использование полипептида, содержащего полигистидиновую последовательность на N- или С-конце молекулы и проявляющего свойства ОРН, при этом не содержащего дополнительных аминокислотных последовательностей между самим белком (ОРН) и вводимой аффинной последовательностью, гарантирует широкий рН-профиль каталитической активности иммобилизуемого фермента и его широкую субстратную специфичность [Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н., Алиев Т.К., Варфоломеев С.Д. Свойства гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы. // Биохимия, 2006, Т.71 (2), с.216-222; Гудков Д.А., Вотчицева Ю.А., Ефременко Е.Н. Гидролиз параоксона, катализируемый органофосфатгидролазой, содержащей полигистидиновую последовательность на С-конце молекулы белка. // Вестник МГУ, сер. Химия, 2006, Т.47 (1), с.15-19].
Заявляемый способ получения биокатализатора на основе иммобилизованной ОРН осуществляется следующим образом: на пористом носителе, представляющем собой криогель полимера, полученного при полимеризации мономеров, представляющих собой различные производные акриламида (например, поли-N,N-диметилакриламид, полиоксиэтилметакрилат, поли-N,N-изопропилакриламид, поли-2- оксиэтилпропилакриламид), поверхность которого модифицирована металл-хелатирующими лигандами и заряжена ионами двухвалентных металлов, иммобилизуют полипептид, содержащий полигистидиновую последовательность и проявляющий активность органофосфатгидролазы, путем пропускания его раствора через объем носителя и последующей отмывки не связавшегося белка таким образом, что конечная концентрация компонентов в биокатализаторе составляют (мас.% по сух. веществам):
| Белок | до 0,25 |
| Нерастворимый носитель | 6,0-20,0 |
| Вода (буферный раствор) | Остальное до 100%. |
Общее время получения биокатализатора составляет не более 20 мин, способ позволяет вводить до 2,5 мг белка/мл носителя. Использование такого биокатализатора в проточном реакторе для гидролиза ФОС при скорости протока 720 мл/ч (удельная нагрузка на носитель 9167 л/ч·м2) и концентрации субстрата 2 мМ обеспечивает максимальную активность биокатализатора, которая составляет 48,5 ед/мг иммобилизованного белка. Способ позволяет совместить процесс выделения, очистки и иммобилизации целевого белка на носителе.
Способ получения биокатализатора значительно стабилизирует фермент и позволяет осуществлять высушивание и регидратацию препарата иммобилизованного фермента с сохранением его каталитической активности до 94%, а также длительно хранить его. Это новое свойство (высушивание и регидратация), являющееся существенным отличием биокатализатора, предлагаемого в данном изобретении, от известных аналогов, является результатом комбинирования его компонентов, которое ранее известно не было.
Вторым объектом изобретения является биокатализатор на основе иммобилизованного полипептида с активностью ОРН, который предназначен для детоксикации ФОС в проточных системах, получен по заявляемому способу, и катализирующий гидролиз фосфорорганических соединений в интервале рН 6,5-12,5 и при температуре до 65°С, характеризующийся тем, что обладает высокой стабильностью (период полуинактивации при эксплуатации до 175 сут и при хранении - до 570 сут).
Существенными техническими результатами заявляемого изобретения является высокая концентрация иммобилизованного белка в расчете на 1 мл носителя и высокая каталитическая активность иммобилизованного белка, непродолжительность процесса получения биокатализатора, возможность регенерации биокатализатора (как минимум 20 раз), длительная его эксплуатация для детоксикации ФОС в проточных системах (период полуинактивации до 175 сут) и высокая стабильность при хранении (период полуинактивации до 570 сут).
Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.
Пример 1. Получение биокатализатора на основе иммобилизованного полипептида, содержащего гексагистидиновую последовательность (His6) на N-конце белка и проявляющего активность ОРН (His6-OPH), при использовании криогеля полиакриламида в качестве нерастворимого носителя
Через криогель полиакриламида (5 мл), поверхность которого модифицирована остатками иминодиуксусной кислоты в качестве металл-хелатирующего лиганда, пропускают 5 мл 0,1 М раствора ионов Со2+ со скоростью 300 мл/ч, чтобы зарядить носитель ионами металла, после чего носитель промывают 15 мл 50 мМ К-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 300 мМ NaCl, со скоростью 300 мл/ч. Далее через носитель пропускают раствор, содержащий очищенный фермент His6-OPH (1 мг/мл) в 50 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 300 мМ NaCl, со скоростью 180 мл/ч. Отмывают носитель от несвязавшегося белка тем же буфером (10 мл), дополнительно содержащим 10 мМ имидазола, со скоростью 180 мл/ч. Общее время получения биокатализатора составляет 15 мин. Таким образом, состав полученного биокатализатора следующий (мас.% по сух. веществам): белок - 0,2%, носитель - 10%, буферный раствор - остальное до 100%. Способ позволяет ввести 2 мг белка/мл носителя. Использование такого биокатализатора в проточном реакторе для гидролиза ФОС при скорости протока 720 мл/ч (удельная нагрузка на носитель 9167 л/ч·м2) и концентрации субстрата 2 мМ обеспечивает максимальную активность иммобилизованного фермента, которая составляет 48,5 ед/мг белка. Период полуинактивации биокатализатора при его использовании в этих условиях составляет 175 сут.
Биокатализатор с иммобилизованным ферментом может быть высушен под вакуумом (1 мБар) при 25°С в течение 24 ч до остаточной влажности 4%. Период полуинактивации биокатализатора при хранении во влажном и высушенном состоянии при 4°С составляет соответственно 420 и 570 сут.
Пример 2. Получение биокатализатора на основе иммобилизованного полипептида, содержащего гексагистидиновую последовательность (His6) на С-конце белка и проявляющего активность ОРН (OPH-His6), при использовании криогеля полиоксиэтилметакрилата в качестве нерастворимого носителя.
Через криогель полиоксгэтилметакрилата (5 мл), поверхность которого модифицирована остатками N,N,N'-трис-(карбоксиметил)-этилендиамина в качестве металл-хелатирующего лиганда, пропускают 5 мл 0,1 М раствора ионов Ni2+ со скоростью 300 мл/ч, чтобы зарядить носитель ионами металла, после чего носитель промывают 15 мл 50 мМ К-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащим 300 мМ NaCl, со скоростью 300 мл/ч. Далее через носитель со скоростью 180 мл/ч пропускают клеточный гомогенат, который получают после дезинтеграции клеток Е.coli, являющихся продуцентами OPH-His6, в 50 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 300 мМ NaCl, и который содержит 1 мг/мл целевого фермента. Отмывают носитель от несвязавшегося белка тем же буфером (10 мл), дополнительно содержащим 10 мМ имидазола, со скоростью 180 мл/ч. Общее время получения биокатализатора составляет 20 мин. Таким образом, состав полученного биокатализатора следующий (мас.% по сух. веществам): белок - 0,2%, носитель - 12%, буферный раствор - остальное до 100%. Способ позволяет ввести 2 мг белка/мл носителя. Использование такого биокатализатора в проточном реакторе для гидролиза ФОС при скорости протока 480 мл/ч (удельная нагрузка на носитель 6111 л/ч·м2) и концентрации субстрата 0,5 мМ обеспечивает максимальную активность иммобилизованного фермента, которая составляет 30 ед/мг белка. Период полуинактивации биокатализатора при его использовании в этих условиях составляет 162 сут.
Биокатализатор с иммобилизованным ферментом может быть высушен, как указано в Примере 1. Период полуинактивации биокатализатора при его хранении во влажном и высушенном состоянии при 4°С составляет соответственно 410 и 520 сут.
Пример 3. Получение биокатализатора на основе иммобилизованного полипептида, содержащего двенадиатигистидиновую последовательность (His12) на N-конце белка и проявляющего активность ОРН (His12-OPH), при использовании криогеля поли-N,N-диметилакриламида в качестве нерастворимого носителя.
Через криогель поли-N,N-диметилакриламида (5 мл), поверхность которого модифицирована остатками нитрилотриуксусной кислоты в качестве металл-хелатирующего лиганда, пропускают 5 мл 0,1 М раствора ионов Cu2+ со скоростью 300 мл/ч, чтобы зарядить носитель ионами металла, после чего носитель промывают 15 мл 50 мМ К-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащим 300 мМ NaCl, со скоростью 300 мл/ч. Далее через носитель со скоростью 180 мл/ч пропускают супернатант с концентрацией His12-OPH 1 мг/мл, полученный после дезинтеграции клеток E.coli, являющихся продуцентами His12-OPH, в 50 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 300 мМ NaCl, и последующего центрифугирования полученного гомогената (20 мин, 10000 g). Отмывают носитель от несвязавшегося белка тем же буфером (10 мл), дополнительно содержащим 10 мМ имидазола, со скоростью 180 мл/ч. Общее время получения биокатализатора составляет 20 мин. Таким образом, состав полученного биокатализатора следующий (мас.% по сух. веществам): белок - 0,25%, носитель - 20%, буферный раствор - остальное до 100%. Способ позволяет ввести 2,5 мг белка/мл носителя. Использование такого биокатализатора в проточном реакторе для гидролиза ФОС при скорости протока 500 мл/ч (удельная нагрузка на носитель 6366 л/ч·м2) и концентрации субстрата 1 мМ обеспечивает максимальную активность иммобилизованного фермента, которая составляет 20 ед/мг белка. Период полуинактивации биокатализатора при его использовании в этих условиях составляет 165 сут.
Биокатализатор с иммобилизованным ферментом может быть высушен, как указано в Примере 1. Период полуинактивации биокатализатора при хранении во влажном и высушенном состоянии при 4°С составляет соответственно 360 и 500 сут.
Пример 4. Получение биокатализатора на основе иммобилизованного полипептида, содержащего гексагистидиновую последовательность (His6) на N-конце белка и проявляющего активность ОРН (His6-OPH), при использовании криогеля поли-N,N-изопропилакриламида в качестве нерастворимого носителя.
Через криогель поли-N,N-изопропилакриламида (5 мл), поверхность которого модифицирована остатками иминодиуксусной кислоты в качестве металл-хелатирующего лиганда, пропускают 5 мл 0,1 М раствора ионов Со2+ со скоростью 300 мл/ч, чтобы зарядить носитель ионами металла, после чего носитель промывают 15 мл 50 мМ К-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащим 300 мМ NaCl, со скоростью 300 мл/ч. Далее через носитель со скоростью 180 мл/ч пропускают супернатант с концентрацией His6-OPH 1 мг/мл, полученный после дезинтеграции клеток E.coli, являющихся продуцентами His6-OPH, в 50 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 300 мМ NaCl, и последующего центрифугирования полученного гомогената (20 мин, 10000 g). Отмывают носитель от несвязавшегося белка тем же буфером (10 мл), дополнительно содержащим 10 мМ имидазола, со скоростью 180 мл/ч. Общее время получения биокатализатора составляет 20 мин. Таким образом, состав полученного биокатализатора следующий (мас.% по сух. веществам): белок - 0,21%, носитель - 6%, буферный раствор - остальное до 100%. Способ позволяет ввести 2,1 мг белка/мл носителя. Использование такого биокатализатора в проточном реакторе для гидролиза ФОС при скорости протока 630 мл/ч (удельная нагрузка на носитель 8021 л/ч·м2) и концентрации субстрата 1,2 мМ обеспечивает максимальную активность иммобилизованного фермента, которая составляет 36 ед/мг белка. Период полуинактивации биокатализатора при его использовании в этих условиях составляет 160 сут.
Биокатализатор с иммобилизованным ферментом может быть высушен, как указано в Примере 1. Период полуинактивации биокатализатора при хранении во влажном и высушенном состоянии при 4°С составляет соответственно 410 и 500 сут.
Пример 5. Получение биокптализатора на основе иммобилизованного полипептида, содержащего гексагистидиновую последовательность (His6) на N-конце белка и проявляющего активность ОРН (His6-OPH), при использовании криогеля поли-2-оксиэтилпропилакриламида в качестве нерастворимого носителя.
Через криогель поли-2-оксиэтилпропилакриламида (5 мл), поверхность которого модифицирована остатками иминодиуксусной кислоты в качестве металл-хелатирующего лиганда, пропускают 5 мл 0,1 М раствора ионов Cu2+ со скоростью 300 мл/ч, чтобы зарядить носитель ионами металла, после чего носитель промывают 15 мл 50 мМ К-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащим 300 мМ NaCl, со скоростью 300 мл/ч. Далее через носитель со скоростью 180 мл/ч пропускают супернатант с концентрацией His6-OPH 1 мг/мл, полученный после дезинтеграции клеток Е.coli, являющихся продуцентами His6-OPH, в 50 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 300 мМ NaCl, и последующего центрифугирования полученного гомогената (20 мин, 10000 g). Отмывают носитель от несвязавшегося белка тем же буфером (10 мл), дополнительно содержащим 10 мМ имидазола, со скоростью 180 мл/ч. Общее время получения биокатализатора составляет 20 мин. Таким образом, состав полученного биокатализатора следующий (мас.% по сух. веществам): белок - 0,24%, носитель - 12%, буферный раствор - остальное до 100%. Способ позволяет ввести 2,4 мг белка/мл носителя. Использование такого биокатализатора в проточном реакторе для гидролиза ФОС при скорости протока 480 мл/ч (удельная нагрузка на носитель 6111 л/ч·м2) и концентрации субстрата 1 мМ обеспечивает максимальную активность иммобилизованного фермента, которая составляет 27 ед/мг белка. Период полуинактивации биокатализатора при его использовании в этих условиях составляет 156 сут.
Биокатализатор с иммобилизованным ферментом может быть высушен, как указано в Примере 1. Период полуинактивации биокатализатора при хранении во влажном и высушенном состоянии при 4°С составляет соответственно 400 и 510 сут.
Пример 6. Свойства биокатализатора, полученного согласно заявляемому способу.
Константы каталитической эффективности действия биокатализатора, полученного, согласно заявляемому способу, представлены в Таблице 1. Биокатализатор способен осуществлять высокоэффективный гидролиз различных ФОС.
На Фиг.1 представлены рН-зависимость каталитической активности биокатализатора, полученного на основе иммобилизации полипептидов со свойствами ОРН с генетически введенными полигистидиновыми последовательностями различной длины. Диапазон рН, при котором полученный биокатализатор проявляет высокую каталитическую активность, практически не зависит от того, какой длины полигистидиновая последовательность присутствует в структуре белка.
На Фиг.2 приведена зависимость активности полученного биокатализатора от температуры, а на Фиг.3 приведена зависимость остаточной активности биокатализатора от температур, при воздействии которых на биокатализатор проводилась его термоинактивация. Данные подтверждают высокую стабильность биокатализатора вне зависимости от исходных условий его получения.
На Фиг.4 приведена зависимость степени конверсии субстрата от скорости протока, которая свидетельствует о том, что в широком интервале скоростей протока наблюдается постоянная высокая степень гидролиза субстрата под действием биокатализатора, полученного согласно заявляемому способу.
На Фиг.5 показана пористая структура макропористого биокатализатора, получаемого согласно заявляемому способу. Имеющийся у носителя размер пор, с одной стороны, не создает диффузионных ограничений потоку субстрата, а с другой - обладает достаточно высокой площадью внутренней поверхности, чтобы связывать большое количество белка.
На Фиг.6 приведены фотографии, иллюстрирующие процесс высушивания и последующую регидратацию биокатализатора. Данные операции приводят к 7-8% потерям активности биокатализатора (Таблица 2).
На Фиг.7 показана операционная стабильность биокатализатора при его использовании для дстоксикации ФОС в проточной системе, свидетельствующая о том, что биокатализатор, полученный согласно заявляемому способу, может быть использован для гидролиза ФОС не менее 6 мес.
На Фиг.8 и 9 приведены данные, иллюстрирующие высокую стабильность биокатализаторов, полученных согласно заявляемому способу, при их хранении в сухом и влажном состоянии.
В Таблице 3 и Таблице 4 приведены данные, иллюстрирующие возможность многократного использования носителя путем его регенерации за счет повторного нанесения активного белка без замены металла, а также с его заменой и последующим повторным нанесением белка.
Таким образом, предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом обладает рядом существенных преимуществ.
- Способ получения биокатализатора позволяет увеличить концентрацию иммобилизованного белка на единице носителя (мг/мл) в 1,25-8,8 раз (Примеры 1-5).
- Биокатализатор, полученный согласно заявляемому способу, имеет каталитическую активность в 1,7-822 раз выше по сравнению с прототипом (Примеры 1-3).
- Применение разнообразных макропористых криогелей (Примеры 1-5) позволяет использовать высокие скорости протока (до 720 мл/ч).
- Способ получения биокатализатора позволяет проводить его высушивание без значительных потерь активности (Пример 6), что существенно расширяет возможности применения биокатализатора и является новым свойством биокатализатора, отличающим его от всех известных аналогов и прототипа.
- Высокая стабильность как самих используемых криогелей, так и иммобилизованных на них ферментов позволяет длительно хранить и использовать полученный биокатализатор (Примеры 1-6). Период полуинактивации биокатализатора при эксплуатации в 1,75-4,6 раз больше, чем у известных аналогов и прототипа.
- Способ получения биокатализатора (Примеры 2-5) позволяет получать биокатализатор путем иммобилизации полипептида со свойствами ОРН на носителе без какой-либо его предварительной очистки, в частности непосредственно из клеточного гомогената, полученного после дезинтеграции биомассы клеток, что является невозможным для всех известных аналогов и прототипа.
- Способ получения биокатализатора (Пример 6) позволяет проводить быструю и простую в исполнении, многократную (как минимум 20 раз) реактивацию биокатализатора.
Таблица 1
Каталитическая эффективность действия биокатализаторов, полученных по заявляемому способу (Примеры 1-3), при гидролизе различных субстратов в 0,1 М карбонатном буфере, рН 10,5 и температуре 25°С.
| Биокатализатор | kcat эфф/Km эфф, М-1с-1 | ||
| Параоксон | Паратион | Метил-паратион | |
| Пример 1 | 2,7·106 | 2,5·105 | 6,9·104 |
| Пример 2 | 4,3·105 | 1,9·105 | 6,0·104 |
| Пример 3 | 9,1·105 | 2,1·105 | 6,2·104 |
Таблица 2
Активность биокатализаторов, полученных согласно заявляемому способу, до и после процедуры высушивания и последующей регидратации. Условия определения активности: 1 мМ параоксон, 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,5, 25°С, скорость протока 360 мл/ч.
| Характеристики биокатализатора | Пример 1 | Пример 2 | Пример 3 |
| Активность биокатализатора, ед/мг | |||
| - до высушивания | 48,0 | 30,0 | 20,0 |
| - после высушивания и регидратации | 45,1 | 28,0 | 18,4 |
| Остаточная активность, % | 94 | 93,3 | 92,0 |
Таблица 3
Количество иммобилизуемого белка (мг/мл) на носителе при проведении регенерации биокатализатора, полученного по заявляемому способу, без дополнительной зарядки носителя ионами металла.
| Биокатализатор | 1-ая регенерация | 2-ая регенерация | 3-я регенерация | 4-ая регенерация |
| Пример 1 | 2,00 | 2,00 | 2,00 | 1,5 |
| Пример 2 | 2,00 | 1,98 | 1,95 | 1,78 |
| Пример 3 | 2,49 | 2,44 | 2,42 | 2,10 |
Таблица 4
Количество иммобилизуемого белка (мг/мл) на носителе при проведении регенерации биокатализатора, полученного по заявляемому способу, после предварительного элюирования ионов металла с носителя 20 мМ раствором ЭДТА и проведением новой зарядки носителя ионами металла.
| Биокатализатор | 1-ая регенерация | 2-ая регенерация | 15-ая регенерация | 20-ая регенерация |
| Пример 1 | 2,00 | 2,00 | 2,00 | 1,90 |
| Пример 2 | 2,00 | 2,00 | 1,96 | 1,82 |
| Пример 3 | 2,49 | 2,44 | 2,44 | 2,34 |
Claims (2)
1. Способ получения биокатализатора для детоксикации фосфорорганических соединений в проточных системах, отличающийся тем, что на пористом носителе, представляющем собой криогель полимера, полученного при полимеризации мономеров, представляющих собой акриламид или его производные, поверхность которого модифицирована металл-хелатирующими лигандами и заряжена ионами двухвалентных металлов, иммобилизуют полипептид, содержащий полигистидиновую последовательность и проявляющий активность органофосфатгидролазы, путем пропускания его раствора через объем носителя.
2. Биокатализатор для детоксикации фосфорорганических соединений в проточных системах на основе иммобилизованного полипептида, содержащего полигистидиновую последовательность и проявляющего свойства органофосфатгидролазы, полученный способом по п.1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006121781/13A RU2315103C1 (ru) | 2006-06-21 | 2006-06-21 | Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006121781/13A RU2315103C1 (ru) | 2006-06-21 | 2006-06-21 | Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2315103C1 true RU2315103C1 (ru) | 2008-01-20 |
Family
ID=39108652
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006121781/13A RU2315103C1 (ru) | 2006-06-21 | 2006-06-21 | Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2315103C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2408724C2 (ru) * | 2009-02-11 | 2011-01-10 | Государственное учебно-научное учреждение Химический факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова | СПОСОБ БИОРАЗЛОЖЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В СОСТАВЕ РЕАКЦИОННЫХ МАСС, ПОЛУЧАЕМЫХ ПОСЛЕ ХИМИЧЕСКОГО УНИЧТОЖЕНИЯ ВЕЩЕСТВА ТИПА Vx |
| RU2451077C1 (ru) * | 2011-01-12 | 2012-05-20 | Химический Факультет Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Способ ферментативного гидролиза фосфорорганических соединений в почвогрунте |
| RU2615176C1 (ru) * | 2015-12-24 | 2017-04-04 | Елена Николаевна Ефременко | Криосформированный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6469145B1 (en) * | 2000-06-26 | 2002-10-22 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | One-step purification process for organophosphorus hydrolase enzyme |
-
2006
- 2006-06-21 RU RU2006121781/13A patent/RU2315103C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6469145B1 (en) * | 2000-06-26 | 2002-10-22 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | One-step purification process for organophosphorus hydrolase enzyme |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MANSEE АН et. all. Detoxification of the organophosphate nerve agent coumaphos using organophosphorus hydrolase immobilized on cellulose materials. J Ind Microbiol Biotechnol, 2005, Dec; 32(11-12), p.554-600, PMID: 16292554 [PubMed - indexed for MEDLINE]. ЕФРЕМЕНКО E.H. и др. Органофосфатгидролаза - фермент, катализирующий деградацию фосфорсодержащих отравляющих веществ и пестицидов, Известия Академии наук. Серия химическая, 2001, N10, с.1743-1749. * |
| WU C.-F., et. al. GFP-visualized immobilized enzymes: degradation of paraoxon by organophosphorus hydrolase in a packed column, Biotechn. & Bioeng., 2002, v.77 (2), p.212-218. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2408724C2 (ru) * | 2009-02-11 | 2011-01-10 | Государственное учебно-научное учреждение Химический факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова | СПОСОБ БИОРАЗЛОЖЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В СОСТАВЕ РЕАКЦИОННЫХ МАСС, ПОЛУЧАЕМЫХ ПОСЛЕ ХИМИЧЕСКОГО УНИЧТОЖЕНИЯ ВЕЩЕСТВА ТИПА Vx |
| RU2451077C1 (ru) * | 2011-01-12 | 2012-05-20 | Химический Факультет Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Способ ферментативного гидролиза фосфорорганических соединений в почвогрунте |
| RU2615176C1 (ru) * | 2015-12-24 | 2017-04-04 | Елена Николаевна Ефременко | Криосформированный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Krishnamoorthi et al. | Immobilized enzyme technology: potentiality and prospects | |
| Bayramoğlu et al. | Immobilization of Candida rugosa lipase onto spacer-arm attached poly (GMA-HEMA-EGDMA) microspheres | |
| Stark | Biochemical aspects of reactions on solid supports | |
| Ferreira et al. | Influence of different silica derivatives in the immobilization and stabilization of a Bacillus licheniformis protease (Subtilisin Carlsberg) | |
| Homaei et al. | Cysteine enhances activity and stability of immobilized papain | |
| US3556945A (en) | Enzyme stabilization | |
| Nilsson et al. | [3] Tresyl chloride-activated supports for enzyme immobilization | |
| JP6150238B2 (ja) | タンパク質、ポリペプチド、またはオリゴペプチドの固定化のための複合担体、その調製方法、および適用 | |
| Srivastava et al. | Immobilization of acid phosphatase from Vigna aconitifolia seeds on chitosan beads and its characterization | |
| CN104114700A (zh) | 一种可生物降解的固定化酶及其制备方法 | |
| Arica et al. | Reversible immobilization of lipase on phenylalanine containing hydrogel membranes | |
| Akgöl et al. | Reversible immobilization of urease onto Procion Brown MX-5BR-Ni (II) attached polyamide hollow-fibre membranes | |
| JPWO2001074420A1 (ja) | ハイモビリティーグループタンパクの吸着材および体液浄化カラム | |
| Milani et al. | Enhancing organophosphorus hydrolase stability by immobilization on chitosan beads containing glutaraldehyde | |
| Reddy et al. | Immobilized nucleases | |
| US20050136522A1 (en) | Catalytic surfaces for active protection from toxins | |
| Klein et al. | Immobilized enzymes in clinical medicine: an emerging approach to new drug therapies | |
| RU2315103C1 (ru) | Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах | |
| Jaiswal et al. | Efficacious bioremediation of pesticide-contaminated water using immobilized organophosphorus acid anhydrolase–FL variant (OPAA-FL) enzyme in a lab-scale bioreactor | |
| Xie et al. | Entrapment of methyl parathion hydrolase in cross-linked poly (γ-glutamic acid)/gelatin hydrogel | |
| Kashirskaya et al. | The mechanisms and time factor of the enzyme structure of a paleosoil | |
| Munnecke | Properties of an immobilized pesticide-hydrolyzing enzyme | |
| Suckling | Immobilized enzymes | |
| Chen et al. | Development of the reversible PGA immobilization by using the immobilized metal ion affinity membrane | |
| Smiley et al. | Immobilized enzymes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100622 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20110620 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160622 |