RU2333231C2 - Ультратонкое полимерное покрытие, способ его изготовления и ферментативный биосенсор на его основе - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к ультратонким полимерным покрытиям, широко используемым в современной технике. Описывается ультратонкое полимерное покрытие, состоящее из чередующихся слоев поликатионов и полианионов, между которыми находится один или несколько слоев полиэлектролитных капсул, содержащих молекулы фермента. Способ изготовления такого покрытия включает нанесение полиэлектролитных слоев на твердую подложку произвольной формы, а также размещение одного или нескольких слоев полиэлектролитных капсул, содержащих фермент, между полиэлектролитными слоями. Изобретение включает также применение указанного покрытия и способ его нанесения для создания нового типа ферментативного биосенсора, у которого молекулы фермента расположены в ячейках полиэлектролитного покрытия. Изобретение обеспечивает сохранение максимальной активности иммобилизованных в полимерном покрытии ферментов при одновременной защите их от окружающей среды, повышение содержания фермента на единицу площади и создание на их основе новых типов биосенсоров. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил.

Description

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к ультратонким полимерным покрытиям, образованным противоположно заряженными полиэлектролитами, технике их изготовления и применения. Эти покрытия наносятся на поверхность произвольной формы и соединяются с ней за счет физической сорбции, главным образом, посредством электростатических взаимодействий. Они широко используются в современной технике, например, в мембранных технологиях - для модификации проницаемости мембран и иммобилизации на их поверхности катализаторов, в том числе молекул ферментов; в биосенсорах - для иммобилизации молекул, обеспечивающих высокую чувствительность и избирательность сенсора.

Изобретение включает в себя использование покрытия указанного вида для создания нового типа ферментативного биосенсора, чувствительным элементом которого является указанное покрытие, содержащее молекулы фермента. Возможно также применение данного покрытия в химических процессах с использованием мембран.

Уровень техники.

Известно большое число пористых полимерных покрытий и методов их изготовления, в частности микропористое полимерное покрытие, состоящее из полипиррола и содержащее регулярно расположенные поры микронного размера (0,9 мкм) [1]. По геометрии строения и размеру пор последнее наиболее близко к предлагаемому изобретению. Однако по точности получения заданной толщины покрытия (шаг не менее 1 мкм), технологии изготовления (электрополимеризация пиррола и полистиролсульфоната), использованию удаляемых полисторольных ядер для формирования пор и, самое главное, по использованию для удаления ядер тетрагидрофурана, неблагоприятно воздействующего на белки, это покрытие не может быть применено для иммобилизации ферментов.

Известна другая молекулярная конструкция, на основе полиэлектролитных мультислоев, которая предназначена для доставки и контролируемого высвобождения различных химических соединений, а также для иммобилизации ферментов [2]. Это полиэлектролитные микрокапсулы диаметром от 0,5 до 10 мкм. Они представляют собой тонкую оболочку, образуемую несколькими, как правило, не более 10, слоями противоположно заряженных полиэлектролитов, внутри которой находится раствор с молекулами фермента. Внутри таких капсул молекулы фермента находятся в свободном состоянии, таком же, как состояние в растворе, сохраняя свою нативность. Как описано в работе [3], изготовление полиэлектролитных микрокапсул, содержащих ферменты, производится следующим образом. Смешивая растворы двух неорганических солей, в одном из которых находятся молекулы фермента, получают нерастворимую соль. Она выпадает в осадок в виде составных микросферолитов, захвативших в процессе формирования минеральных частиц молекулы фермента. Эти частицы - органо-минеральные ядра - служат подложками для последующего нанесения на них нескольких, как правило, не более 10, слоев поликатионов и полианионов упомянутым методом поочередной адсорбции. Для отделения частиц от раствора после нанесения очередного слоя полиэлектролита или после промывки применяют центрифугирование при 1500-2000 об/мин. На заключительном этапе минеральную часть ядер растворяют в воде в присутствии ЭДТА и получают капсулы, внутри которых находятся только молекулы фермента.

Несмотря на очевидные достоинства полиэлектролитных капсул как контейнеров, предохраняющих содержащиеся в них ферменты от неблагоприятных внешних воздействий и в то же время обеспечивающих сохранение их функциональной активности, они имеют и недостатки. Один из основных - трудности манипулирования с этими объектами, в частности трудности прикрепления капсул к какой-либо поверхности с сохранением нативности фермента. Несмотря на наличие у капсул поверхностного заряда, использовать для их прикрепления, например к полиэлектролитному слою, метод поочередной адсорбции в его каноническом виде оказывается невозможно. Причина состоит в том, что образование солевых связей полимер-полимер происходит по механизму замещения, когда молекула полиэлектролита вытесняет низкомолекулярные противоионы. Это достаточно длительный процесс, занимающий минуты. В течение этого времени капсулы должны находиться вблизи адсорбирующей поверхности. Однако это оказывается невозможным, т.к. из-за относительно большой массы и размеров капсул силы электростатического притяжения в начальный период взаимодействия с заряженной поверхностью подложки оказываются меньше гравитационных сил и сил трения со стороны потоков раствора, омывающего капсулы. Использование же методов химической пришивки, путем образования ковалентных связей между стенками капсулы и подложкой включает использование достаточно «жестких» химических реагентов, что приводит к той или иной степени инактивации ферментов в зависимости от их структуры.

Известны ультратонкие полимерные покрытия толщиной от нескольких нанометров до сотен нанометров, получаемые поочередной адсорбцией слоев противоположно заряженных полиэлектролитов и предназначенные для использования в качестве покрытий твердых поверхностей произвольной формы [4]. Такие покрытия состоят как минимум из двух типов полимерных молекул. Если одним или несколькими слоями в таких многослойных полиэлектролитных покрытиях являются размещенные между слоями полиэлектролитов молекулы фермента, имеющие соответствующий электрический заряд, то такие многослойные полиэлектролитные структуры могут быть использованы в качестве чувствительных покрытий биосенсоров [5].

Метод поочередной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов [4], применяемый для изготовления такого покрытия, состоит в следующем. Твердую подложку с предварительно очищенной поверхностью погружают в раствор полиэлектролита с концентрацией 0,5-2 мг/мл и выдерживают в нем 15-20 мин. Часто в качестве такого полиэлектролита для нанесения первого слоя покрытия используют полиэтиленимин (ПЭИ), имеющий сетчатую структуру и хорошо адсорбирующийся на поверхностях различных материалов. После адсорбирования первого слоя, образец отмывают от несвязанных остатков полиэлектролита двух- или трехкратной промывкой в воде или водно-солевом растворе с концентрацией низкомолекулярной соли до 0,5 М. Затем таким же образом адсорбируют слой полиэлектролита с противоположным знаком заряда. Процедуру повторяют (используя те же или другие поликатионы и полианионы) столько раз, сколько слоев полиэлектролитов требуется нанести. Слой заряженного белка наносят таким же образом, как и слой полиэлектролита. Слои полимеров в сформированном покрытии связаны, в основном, электростатически, однако в зависимости от химического строения полимеров, имеется вклад и других взаимодействий, например, гидрофобных, и водородных связей.

Основными требованиями к сенсорным покрытиям являются сохранение максимальной активности иммобилизованных в полимерном покрытии ферментов и достижение их максимальной концентрации на единицу площади слоя, которое ведет к достижению максимальной чувствительности. Достоинством указанных покрытий является чрезвычайная простота их нанесения, возможность широкой вариабельности материала подложки, состава, последовательности и числа полиэлектролитных слоев.

Учитывая изложенное выше, мы выбрали в качестве прототипа ультратонкого покрытия полимерное покрытие, состоящее из чередующихся слоев поликатионов и полианионов, между которыми расположены один или несколько слоев заряженных ферментов [5] и способ изготовления такого покрытия, описанный в том же источнике, и наиболее близкий по набору признаков к заявляемому.

Недостатками указанного типа покрытий, в том числе для биосенсорных целей, являются тесный контакт молекул иммобилизованного фермента с окружающими слоями полиэлектролитной пленки и относительно невысокое содержание молекул иммобилизованного фермента на единицу площади покрытия. Следствием первого из упомянутых свойств является сильное электростатическое взаимодействие между молекулами полиэлектролита одного знака заряда и молекулами фермента, имеющими противоположный знак заряда, которое может приводить к частичной или полной инактивации фермента. Кроме того, при плотной упаковке молекул фермента в слое на один квадратный микрон поверхности приходится ~10⁴÷10⁵ молекул. Увеличить это количество, для повышения чувствительности, можно только увеличивая число слоев фермента в мультислойном покрытии.

Ферментативные биосенсоры представляют собой один из классов биосенсоров, в которых избирательность детектирования вещества определяется специфичностью фермент-субстратного узнавания. Фермент, специфически связываясь с детектируемыми молекулами субстрата, способствует их химическому превращению. При этом продуцируется низкомолекулярное сигнальное вещество, чаще всего ионы водорода. Выработанный химический сигнал преобразуется в электрический или оптический специальным элементом биосенсора, так называемым трансдьюсером. Наиболее известными представителями ферментативных биосенсоров являются глюкозный сенсор, использующий глюкозоксидазу, и сенсор на мочевину, использующий уреазу. В обоих случаях измерение концентрации субстрата сводится к измерению изменения концентрации ионов водорода или NH₄ ⁺ в окружающей среде. Множество предложенных конструкций указанных сенсоров отличаются друг от друга как типом и конструкцией трансдьюсера, так и строением чувствительного покрытия, определяющего специфичность узнавания биосенсором детектируемого вещества, и чувствительность устройства. Строение покрытия определяется, в свою очередь, способом иммобилизации молекул фермента. Различные варианты ковалентной пришивки ферментов, в частности с помощью глутарового альдегида, используются наиболее часто [6, 7].

В качестве прототипа ферментативного биосенсора мы выбрали биосенсор с ковалентно пришитыми молекулами фермента [6]. Недостатком такого способа иммобилизации является потеря ферментативной активности: от 20-30 до 80 и более процентов (в зависимости от типа фермента и конкретной реализации пришивания) [8, 9] и относительно малое количество молекул фермента на единицу поверхности трансдьюсера. В конечном счете, это приводит к снижению чувствительности всего сенсорного устройства.

Раскрытие изобретения.

Задачей изобретения является сохранение максимальной активности иммобилизованных в полимерном покрытии ферментов при одновременной защите их от неблагоприятных факторов окружающих растворов, а также повышение содержания фермента на единицу площади слоя. Другими задачами изобретения являются расширение арсенала полимерных покрытий и применение их для создания новых типов биосенсоров.

Поставленные задачи решаются тем, что в известном ультратонком полимерном покрытии, содержащем чередующиеся слои противоположно заряженных полиэлектролитов (толщиной 2-10 нм) не менее чем по одному виду поликатиона и полианиона и молекулы фермента, согласно изобретению между слоями полиэлектролитов размещен по меньшей мере один слой полиэлектролитных капсул диаметром 0,5-10 мкм, внутри которых находятся молекулы фермента. Таким образом, новое покрытие состоит из двух известных надмолекулярных элементов: слоев полиэлектролитов и заполненных ферментом полиэлектролитных капсул, которые вместе образуют единую полимерную ячеистую конструкцию. Ее ячейки образованы слоем полиэлектролитных микрокапсул, стенки которых состоят из m слоев (m=3-6) противоположно заряженных полиэлектролитов. Непосредственно на подложку нанесено n слоев (n=3-5) полиэлектролитов методом поочередной адсорбции - так называемый прекурсор. Поверх этих слоев расположен слой полиэлектролитных капсул, содержащих фермент. Поверх слоя капсул наслоено еще k слоев (k=3-6) полиэлектролитов. Они вместе с прекурсором скрепляют капсулы между собой и с «плоскими» слоями полиэлектролитов, образуя единую ячеистую конструкцию, которая по своему строению и свойствам отличается как от плоских пленок, так и от капсул. В отличие от плоских пленок новое покрытие содержит молекулы фермента в свободном состоянии, максимально сохраняя их активность. В отличие от капсул ферменты, принадлежащие покрытию, могут быть нанесены на поверхность любой формы, и механические манипуляции с ними значительно облегчены. Последнее особенно важно, например, для многократного использования ферментов в составе биосенсоров.

В соответствии с проведенными нами экспериментами и имеющимися литературными данными [3-5] полиэлектролитные мультислои, из которых образовано указанное ячеистое покрытие, хорошо проницаемы для веществ низкой и средней молекулярной массы (до примерно 1 кДа) и непроницаемы для веществ высокой молекулярной массы (от нескольких десятков кДа и выше). К последним относятся ферменты. При соприкосновении покрытия с раствором, содержащим детектируемое вещество невысокой молекулярной массы, это вещество легко проникает сквозь полиэлектролитные слои внутрь ячеек, содержащих молекулы фермента. Будучи субстратом данного фермента, вещество взаимодействует с ним, в результате чего образуются низкомолекулярный продукт или продукты, которые так же легко диффундируют сквозь стенки покрытия и приводят к появлению химического сигнала на поверхности того объекта, на которую было нанесено покрытие. Таким образом, обеспечивается стационарный режим работы ферментов внутри ячеек покрытия: постоянный приток субстрата и отток продукта(ов). При данной концентрации субстрата в среде вырабатывается сигнал постоянной величины.

При 30%-ном заполнении ячеек ферментом количество фермента в одном слое капсул 5-микронного диаметра соответствует примерно 12-13 слоям фермента в соответствующей полиэлектролитной пленке. Это приводит к тому, что использование нового покрытия, например, в сенсорном устройстве повышает его чувствительность примерно на порядок за счет увеличения поверхностной концентрации фермента и, соответственно, величины вырабатываемого химического сигнала.

Поставленная задача решается также тем, что в известном способе изготовления ультратонкого полимерного покрытия, содержащего молекулы фермента, включающем нанесение методом поочередной адсорбции слоев противоположно заряженных полиэлектролитов на твердую подложку произвольной формы, согласно изобретению на нанесенные слои полиэлектролитов наносят накапыванием суспензию полиэлектролитных капсул, которые содержат внутри своих оболочек органоминеральные ядра; нанесенную суспензию подсушивают на воздухе при комнатной температуре; поверх слоя капсул наносят еще 4-6 слоев поликатионов и полианионов методом поочередной адсорбции и, наконец, удаляют (растворяют) минеральную часть ядер капсул погружением всего покрытия в раствор ЭДТА. В результате, изготовленное покрытие содержит только органические молекулы, а внутри ячеек находятся только молекулы фермента, окруженные растворителем.

В целом, технология изготовления ультратонкого ячеистого полимерного покрытия состоит в следующем. Методом поочередной адсорбции на заданную твердую поверхность наносят от 3 до 5 слоев противоположно заряженных полиэлектролитов - прекурсор. Поверх прекурсора накапывают суспензию полиэлектролитных капсул, причем эти капсулы содержат внутри своих оболочек не просто молекулы фермента, а органоминеральные ядра, что делает молекулы фермента, входящие в состав ядер, более устойчивыми к внешним факторам до завершения формирования покрытия. Внешним слоем капсул является полиэлектролит, имеющий знак заряда, противоположный заряду внешнего слоя прекурсора. Нанесенную суспензию подсушивают на воздухе при комнатной температуре. При этом образуются ионные связи между полиэлектролитами внешних слоев капсул и прекурсора, а также капсул между собой через избыточные молекулы полиэлектролита внешнего слоя прекурсора. Методом поочередной адсорбции наносят 4-6 слоев полиэлектролитов поверх слоя капсул, причем первый из этих слоев имеет тот же знак заряда, что и внешний слой прекурсора. Заключительной стадией является удаление (растворение) минеральной части ядер капсул погружением всего покрытия в раствор ЭДТА.

Поставленная задача решается также тем, что предложено использовать указанное покрытие в качестве хемочувствительного элемента, являющегося основой для ферментативного биосенсора. Использование нового хемочувствительного покрытия не только расширяет конструктивное разнообразие биосенсоров, но в отдельных случаях значительно сокращает время изготовления покрытия (сравни пример 2, требующий для осуществления примерно 4 часов, и работу [7], в которой иммобилизация того же фермента занимает более 17 часов). Положительным свойством нового биосенсора является, на наш взгляд, и то, что он может быть изготовлен в два этапа, разделенных во времени и в пространстве. Первый - это изготовление капсул, содержащих фермент внутри минерального ядра. Такой полуфабрикат может храниться в буферном растворе на холоду в течение нескольких месяцев. Учитывая высокую стоимость трансдьюсеров относительно стоимости капсулированного фермента, второй этап - изготовление собственно биосенсора - может быть выполнен тогда, когда сенсор с данным ферментом будет необходим пользователю. Однако наиболее перспективным представляется использование указанного покрытия в оптических сенсорах. Если в оболочку капсулы включается полиэлектролит с рН-чувствительной флуоресцентной меткой, то появляется возможность миниатюризации трансдьюсера вплоть до размеров единичной капсулы. Это, в свою очередь, открывает возможность построения сенсорных микросборок или микрочипов, с помощью которых можно проводить одновременно много анализов на одно вещество или анализ одного образца на наличие многих соединений - субстратов различных ферментов.

Применение ультратонкого полимерного покрытия, в ячейках которого находится фермент, для детектирования соответствующего субстрата возможно различными способами и в различных конструкциях сенсоров. Так, например, указанное покрытие может быть нанесено на сферическую поверхность стеклянного шарика рН-электрода или на плоскую поверхность пластикового защитного слоя рН-чувствительного полевого транзистора или, наконец, модифицированное введением флуоресцентной метки покрытие может быть нанесено на плоскую кварцевую поверхность в оптическом биосенсоре. Во всех этих случаях заявляемое покрытие в ответ на появление детектируемого вещества - субстрата, обеспечивает выработку химического сигнала, который воспринимается тем или иным конкретным трансдьюсером и преобразуется в электрический либо оптический сигнал. Измеряя величину этого сигнала, определяют концентрацию субстрата.

Принцип действия биосенсора с указанным покрытием.

Рассмотрим принцип действия биосенсора на примере потенциометрического сенсора со стеклянным рН-электродом. Стеклянный электрод с чувствительным микроячеистым покрытием погружают в анализируемый раствор, содержащий молекулы субстрата. Последние легко проникают внутрь ячеек покрытия через ультратонкие полиэлектролитные слои покрытия. Фермент внутри ячеек и детектируемый субстрат образуют пару, в которой за счет специфического фермент-субстратного взаимодействия происходит отщепление одной или нескольких групп от молекул субстрата, что приводит к сдвигу рН раствора как внутри капсул, так и вне покрытия. Этот сдвиг регистрируется рН-электродом, а величина разности потенциалов между модифицированным рН-электродом и электродом сравнения зависит от концентрации субстрата в анализируемом растворе. Эта концентрация может быть определена путем построения калибровочной кривой.

Указанное изобретение иллюстрируется чертежами 1-3, где

на фигуре 1 изображена схема предлагаемого ультратонкого полимерного покрытия, на которой 1 - это полиэлектролитные слои, 2 - капсулы, 3 - молекулы фермента, 4 - подложка.

На фигуре 2 представлены фотографии модифицированного стеклянного электрода и участка его микроячеистого покрытия.

На фигуре 3 представлены калибровочные кривые уреазного биосенсора для мочевины в растворах с различной ионной силой и температурой. Т=25°С, величина ионной силы раствора: 1 - 0; 2 - 50 мМ; 3 - 100 мМ; 4 - 200 мМ; 6 - 500 мМ. 5 - 36°С, 100 мМ NaCl. Для всех кривых рН=6,0, среда трис-цитрат 1 мМ.

Примеры осуществления изобретения.

1. Ультратонкое полимерное покрытие содержит слои полиэтиленимина (поликатион), полистиролсульфоната (полианион, ПСС) и полиаллиламин гидрохлорида (поликатион, ПАГ), нанесенные на стеклянную подложку методом поочередной адсорбции. Полиэтиленимин благодаря своей сетчатой структуре обеспечивает сцепление покрытия с подложкой. Поверх этих трех слоев полиэлектролитов расположен слой полиэлектролитных капсул, стенки которых состоят из трех слоев: ПСС, ПАГ и ПСС. Внутри капсул помещены молекулы уреазы. Поверх слоя капсул с уреазой нанесены еще три слоя полиэлектролитов: ПАГ, ПСС и ПАГ. Таким образом, наружным слоем покрытия является слой ПАГ. Слой капсул образует в материале покрытия слой плотно расположенных заполненных ферментом ячеек, а их боковые стенки придают всей конструкции необходимую жесткость.

В водной среде данное покрытие хорошо проницаемо для низкомолекулярных ионов и для более крупных молекул, в частности для мочевины. Из водной среды, соприкасающейся с покрытием, молекулы мочевины проникают внутрь ячеек покрытия, содержащих уреазу, и там расщепляются на NH₄ ⁺ и НСО₃ ^-, которые легко выходят через полиэлектролитные стенки во внешнюю среду. Аммоний сдвигает рН среды в щелочную сторону. Уменьшение концентрации ионов водорода за счет беспрепятственной диффузии через полиэлектролитные слои хорошо передается на ту часть покрытия, которая соприкасается с поверхностью рН-электрода.

2. Способ изготовления покрытия.

Первой процедурой в изготовлении ячеистого покрытия является изготовление органоминеральных ядер, содержащих уреазу, поверх которых нанесены 3 слоя полиэлектролитов: ПСС, ПАГ и ПСС. Они изготавливаются следующим образом. К 0,33 М раствору хлористого кальция, содержащего 1-3 мг/мл уреазы, добавляют при непрерывном помешивании равный объем 0,33 М раствора Na₂СО₃. Образующуюся взвесь микрочастиц карбоната кальция с захваченными молекулами белка отстаивают и затем дважды промывают раствором 0,1 М NaCl с рН 6,5. Затем промытый осадок заливают раствором 1 мг/мл ПСС в 0,5 М NaCl, переводят в суспензию на ультразвуковой ванне (время обработки не более 10 сек) и ставят на шейкер на 15 мин. После адсорбции полимера на поверхности микрочастиц суспензию центрифугируют 40-60 сек при 1500 об/мин. Надосадочный раствор сливают, а оставшийся осадок заливают 0,1 М NaCl, переводят его в суспензию, как описано выше, встряхивают 2 мин и снова центрифугируют. Эту процедуру промывки повторяют три раза с целью удаления несвязанных остатков полиэлектролита. Промытый осадок заливают раствором ПАГ 1 мг/мл 1 в 0,5 М NaCl. Наслаивание ПАГ на микрочастицы производят таким же образом, как и ПСС. После трехкратной промывки в 0,1 М NaCl адсорбируют последний слой ПСС так, как описано выше. Затем производят финальную трехкратную промывку микрочастиц, причем последний раз суспензию не центрифугируют.

Второй процедурой в изготовлении заявляемого покрытия является нанесение на заданную подложку всех имеющихся компонентов покрытия. Вначале на эту подложку методом поочередной адсорбции наносят последовательно 3 слоя полиэлектролитов: ПЭИ, ПСС и ПАГ. Для этого подложку погружают в водный раствор каждого из этих полиэлектролитов концентрацией 0,5-1 мг/мл в 0,5 М NaCl на 15 мин. После адсорбирования очередного слоя, кроме последнего, ПАГ, подложку с адсорбированными слоями дважды промывают в растворе 0,1 М NaCl для удаления остатков несвязанного полиэлектролита. После адсорбирования последнего слоя - ПАГ, подложку извлекают из раствора и без промывания наносят на нее накапыванием определенное количество суспензии капсулированных органоминеральных ядер, изготовленных ранее. Налитую суспензию подсушивают до полного испарения свободной воды при комнатной температуре. Подложку с капсулами однократно промывают в 0,1 М NaCl и затем наносят поверх слоя капсул три слоя полиэлектролитов: ПАГ, ПСС и ПАГ согласно процедуре, описанной выше. На заключительном этапе вся конструкция, т.е. подложка с покрытием, погружается в 0,2 М раствор ЭДТА и выдерживается в нем до полного растворения минеральной части ядер. Затем производят двукратное промывание и покрытие готово.

3. Ферментативный биосенсор.

На поверхность стеклянного шарика рН-электрода, выбранного в качестве трансдьюсера, наносят по методу изготовления покрытия, описанному в примере 2, полиэлектролитное покрытие, описанное в примере 1, в ячейках которого находятся молекулы уреазы. Модифицированный таким образом рН-электрод становится чувствительным к присутствию мочевины в среде, куда он погружается. Внешний вид модифицированного электрода и микрофотография участка его микроячеистого покрытия показаны на фигуре 2. Расщепление мочевины уреазой приводит к защелачиванию среды, которое изменяет разность потенциалов между модифицированным стеклянным электродом и хлорсеребряным электродом сравнения. Величина этого изменения пропорциональна степени защелачивания раствора и отражает содержание в растворе мочевины. Электрический сигнал с модифицированного электрода поступает на измерительную систему, которая вместе с модифицированным стеклянным электродом и электродом сравнения образует потенциометрический биосенсор. Он может измерять концентрацию мочевины в пределах 0,2-20 мМ (линейный участок калибровочной кривой) при буферности среды до 2 мМ трис-цитрата или трис-HCl и в диапазоне рН от 6,0 до 7,8. Калибровочные кривые для модифицированного электрода в модельных растворах с разной ионной силой представлены на фигуре 3.

Список литературы

1. Cassagenau Т., Caruso F. Semiconducting polymer inverse opals prepared by electropolymerization. Adv. Mater. (2002), v.14, p.34-38.

2. Radtchenko I.L., Sukhorukov G.B., Mohwald H. A novel method for encapsulation of poorly water-soluble drugs: precipitation in polyelectrolyte multilayer shells. Int. J. Pharm. (2002). 242(1-2), p.219-223.

3. Sukhorukov G.B., VolodkinD.V., Gunter A., Petrov A.I., Shenoy D.B., Mohwald H. Porous calcium carbonate microparticles as templates for fabrication of polymeric microcapsules filled with bioactive compounds. J. Mater. Chem., (2004), v.14, p.2073-2081.

4. Decher G., Hong J-D. One- or multi-layered layer elements applied to supports and their production. U.S. Patent №5208111 (May 4, 1993).

5. Lvov Yu, M., Sukhorukov G. В. Protein architecture: assembly of ordered films by means of alternated adsorption of oppositely charged macromolecules. Membr. Cell. Biol. (1997). v.11(3): 277-303.

6. Бубряк О.А., Солдаткин А.П., Стародуб Н.Ф., Ельская А.В., Шульга А.А., Стриха В.И. Изучение оптимальных условий работы биосенсора на основе уреазы и рН-чувствительных полевых транзисторов. Определение мочевины в растворе. Укр. Биохим. Журн. (1993), т.65(1), с.110-113.

7. Thavarungkui P., Asawatreratanakui P., Kanatharana P., Duenjumroon J., Chaibundit C. A flow-through enzyme reactor system for urea determination in blood serum using conductometric measurement. ScienceAsia (1999), v.25, p.157-163.

8. Godjevagrova Т., Gabrovska К. Immobilization ofurease onto chemically modified acrylonitrile copolymer membranes. J.Biothech. (2003), v.103(2), p.107-111.

9. Wang P., Dai S., Waezsada S.D., Tsao A.Y., Davison B.H. Enzyme stabilization by covalent binding in nanoporous sol-gel glass for nonaqueous biocatalysis. Biotech. Bioeng. (2001), v.74, p.249-255.

Claims (7)

1. Ультратонкое полимерное покрытие, включающее чередующиеся слои противоположно заряженных полиэлектролитов с не менее чем по одному виду поликатиона и полианиона, и молекулы фермента, отличающееся тем, что между слоями полиэлектролитов размещен, по меньшей мере, один слой полиэлектролитных капсул диаметром 0,5-10 мкм, внутри которых находятся молекулы фермента, при этом слои полиэлектролитов и заполненных ферментом полиэлектролитных капсул образуют вместе единую полимерную ячеистую конструкцию, устойчивую в водно-солевой среде.

2. Способ изготовления ультратонкого полимерного покрытия, содержащего молекулы фермента по п.1, включающий стадию нанесения на твердую подложку произвольной формы слоев противоположно заряженных полиэлектролитов с последующим нанесением на слои полиэлектролитов суспензии полиэлектролитных капсул, содержащих внутри оболочек органо-минеральные ядра на основе фермента, подсушиванием на воздухе при комнатной температуре, нанесением поверх слоя капсул еще 4-6 слоев противоположно заряженных полиэлектролитов с не менее чем по одному виду поликатиона и полианиона, методом поочередной адсорбции и удалением минеральной части ядер капсул погружением всего покрытия в раствор ЭДТА.

3. Способ изготовления ультратонкого полимерного покрытия по п.2, отличающийся тем, что непосредственно на твердую подложку наносят три слоя полиэлектролитов в последовательности: полиэтиленимин, полистиролсульфонат (ПСС), полиаллиламин гидрохлорид (ПАГ) с последующим нанесением поверх последнего из этих слоев слоя капсул, имеющих оболочку также из трех слоев: ПСС-ПАГ-ПСС и ядро, состоящее из соосажденных фермента и СаСО₃.

4. Ферментативный биосенсор, включающий трансдьюсер и хемочувствительный элемент, отличающийся тем, что хемочувствительный элемент содержит ультратонкое полимерное покрытие по п.1.

5. Ферментативный биосенсор по п.4, отличающийся тем, что трансдьюсером является стеклянный рН-электрод.

6. Ферментативный биосенсор по п.4, отличающийся тем, что трансдьюсером является рН-чувствительный полевой транзистор.

7. Ферментативный биосенсор по п.4, отличающийся тем, что трансдьюсером являются стенки ячеек чувствительного покрытия, имеющие в своем составе один или несколько слоев флуоресцентно-меченого полиэлектролита.

Images