RU2400537C2 - Способ выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот - Google Patents
Способ выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот Download PDFInfo
- Publication number
- RU2400537C2 RU2400537C2 RU2008143757/10A RU2008143757A RU2400537C2 RU 2400537 C2 RU2400537 C2 RU 2400537C2 RU 2008143757/10 A RU2008143757/10 A RU 2008143757/10A RU 2008143757 A RU2008143757 A RU 2008143757A RU 2400537 C2 RU2400537 C2 RU 2400537C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- purification
- solution
- detonation nanodiamond
- isolation
- Prior art date
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 239000002113 nanodiamond Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000005474 detonation Methods 0.000 claims abstract description 25
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 8
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Substances [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 claims description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 12
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 5
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910002012 Aerosil® Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 3
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 3
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001354 calcination Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 2
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 2
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 241000214032 Hedysarum Species 0.000 description 1
- 241001187347 Hedysarum neglectum Species 0.000 description 1
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 244000293991 Papaver orientale Species 0.000 description 1
- 235000014370 Papaver orientale Nutrition 0.000 description 1
- 240000001090 Papaver somniferum Species 0.000 description 1
- 235000008753 Papaver somniferum Nutrition 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 235000017807 phytochemicals Nutrition 0.000 description 1
- 229930000223 plant secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии, а именно к способу выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) из образцов тканей растений, а также продуктов переработки растительного и животного происхождения. Возможно использование изобретения в медицине, биотехнологии, осуществлении санитарно-эпидемиологического контроля. Способ выделения и очистки ДНК основан на том, что образец подвергают лизису в буфере на основе анионного детергента (SDS), лизат подвергают очистке и дезоксирибонуклеиновую осаждают этанолом или изопропанолом. Очистку лизата проводят суспензией детонационного наноалмаза, избирательно сорбирующим примеси ненуклеиновой природы. Детонационный наноалмаз предварительно отжигают в температурном интервале 400-700°С в вакууме 10-2-10-3 Торр. Полученный раствор ДНК содержит как короткие, так и длинные фрагменты. Предлагаемый способ выделения и очистки ДНК позволяет избежать использования таких высокотоксичных соединений, как фенол и хлороформ. Предотвращается загрязнение полученной ДНК химически активными веществами. При случайном попадании детонационного наноалмаза в конечный раствор полимеразная цепная реакция не блокируется, при этом имеется возможность отделить нерастворимый осадок детонационного наноалмаза от раствора ДНК. 3 ил, 1 табл.
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии, а именно к способу выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот из образцов тканей растений, а также продуктов переработки растительного и животного происхождения. Возможно использование изобретения в медицине, биотехнологии, при осуществлении санитарно-эпидемиологического контроля.
Выделение и очистка дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из фрагментов органов растений и продуктов переработки сырья растительного и животного происхождения с целью проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) является одной из основных задач молекулярной биологии. В настоящее время используются следующие способы выделения ДНК.
Известен способ выделения ДНК из растительных тканей с использованием лизирующего буфера, последующей очисткой смесью хлороформа и изоамилового спирта и осаждением изопропанолом [1]. Способ заключается в том, что 100 мг фрагмента растения лизируют в 400 мкл буферного раствора (2% СТАВ, 1.4М NaCI, 20 мМ EDTA, 100 мМ TrisHCI), после добавления 10 мкл РНКазы инкубируют при 65°C в течение 60 мин. После этого проводят двукратную промывку лизата 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (92:8) с промежуточным центрифугированием и переносом супернатанта в чистую пробирку. Далее проводят осаждение ДНК в присутствии 350 мкл изопропанола, центрифугирование и удаление супернатанта. Осадок ДНК промывают 400 мкл 70% этанола, сушат в течение 60 мин при комнатной температуре.
Недостатком данного способа является продолжительность выделения ДНК (более 2 часов), необходимость использования высокотоксичных летучих веществ (хлороформа и изоамилового спирта), низкое качество ДНК при высоком содержании блокирующих ПЦР веществ (хлорофилла, танинов), многостадийность способа.
Известен способ выделения и очистки ДНК, основанный на адсорбции нуклеиновых кислот на твердом сорбенте [2]. Образец смешивают с буферным раствором на основе хоатропного агента. Нуклеиновую кислоту сорбируют на стекловолокнистом сорбенте, предварительно обработанном 0,1-7% раствором плавиковой кислоты в течение 1-6 часов. В дальнейшем проводят отмывку сорбента от полимерных составляющих ненуклеиновой природы. Элюцию ДНК проводят буферным раствором или дистиллированной водой.
Недостатком данного способа является зависимость количества выделенной ДНК от объема сорбента (2,3 мкг ДНК на 1 мг сорбента), снижение выхода ДНК в результате необратимой адсорбции и потерей в результате отмывки сорбента.
Известен способ выделения и очистки ДНК, основанный на адсорбции нуклеиновых кислот на твердом сорбенте [3]. Нуклеиновую кислоту сорбируют на аэросиле (А-300) при нужной концентрации хаотропного агента путем добавления к пробе аэросила до конечной концентрации от 0,3 до 0,6%, смесь инкубируют 1-2 мин, аэросил с сорбированной НК осаждают центрифугированием, промывают 80%-ным изопропанолом. ДНК элюируют водой или буфером с низким содержанием солей.
Недостатком данного метода является трудоемкость, повреждение ДНК при большой концентрации, связанное с необходимостью проведения механического ресуспендирования сорбента во время отмывки ДНК, снижение выхода ДНК в результате необратимой адсорбции.
Из известных технических решений наиболее близким (прототипом) по назначению и технической сущности к заявляемому объекту является SDS-метод выделения ДНК [4] с использованием лизирующего буфера на основе додецилсульфата натрия (SDS). Примерно 2 см2 листьев растений положили в 1,5 мл пробирку, добавляли 400 мкл экстрактионного буфера ((200 мМ Tris-НС1, 250 мМ NaCl, 25 мМ EDTA, 0,5% SDS, рН 7,5) 10 мкл РНКазы и инкубировали 15 мин при температуре 65°C. Далее добавляли 200 мкл 5М ацетата калия, перемешивали и на 10 мин ставили в ледяную воду. После 15 мин центрифугирования при максимальном ускорении 500 мкл верхней фазы переносили в новую пробирку. Добавляли 400 мкл очистительного раствора (92% хлороформа и 8% изоамилового спирта), 1 мин центрифугировали при 12000 g. Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку и повторяли промывку раствором на основе хлороформа и изоамилового спирта. ДНК осаждали 500 мкл изопропанола, 10 мин центрифугировали при 12000 g. Надосадочную жидкость удаляли, осадок промывали в 70% этаноле. Этанол удаляют; осадок ДНК просушивают в течение 1 часа при комнатной температуре и растворяют в 100 мкл дистиллированной воды или ТЕ-буфера.
Прототип имеет следующие недостатки, устраняемые заявляемым изобретением.
Многостадийность метода, необходимость задействования 4-х пробирок в каждом выделении и, соответственно, 3-кратного переноса раствора ДНК, в результате чего происходит механическое повреждение молекул при прохождении через наконечник пипетки.
Необходимость работы с токсичными веществами - хлороформом и изоамиловым спиртом - наносит вред здоровью исследователя и налагает ограничение на широкое использование метода.
Часто невозможно полностью очистить ДНК от хлорофилла и других пигментов, в результате чего происходит ингибирование ПЦР, сокращается срок хранения выделенной ДНК.
Сущность способа выделения и очистки ДНК заключается в том, что, в отличие от прототипа, очистку биологического раствора после лизиса образца в буфере на основе анионного детергента (например, додецил сульфата натрия - SDS) проводят суспензией предварительно отожженного в вакууме детонационного наноалмаза, являющегося гидрофильным сорбентом со слабым положительным зарядом и сильно развитой удельной поверхностью. В результате из раствора удаляются примеси, ингибирующие полимеразную цепную реакцию - пептиды, пигменты, танины, липиды. Последующее центрифугирование раствора позволяет разделить детонационный наноалмаз с адсорбированными примесями и супернатант, содержащий ДНК. Далее ДНК осаждают спиртом (изопропанолом или этанолом) и растворяют в дистиллированной воде.
Осуществление способа выделения и очистки ДНК достигается следующим образом.
Предварительно проводят подготовку суспензии 30 мг отожженного в течение 1-2 часа в вакууме (10-2 - 10-3 Торр) при температуре 300-700°C детонационного наноалмаза в 100 мкл буферного раствора (200 мМ Tris-HCl, 250 мМ NaCl, 25 мМ EDTA, 0,5% SDS, pH 7,5).
Лизис 50 мг образца тканей растений или продукта на основе сырья растительного или животного происхождения проводят в 400-500 мкл буферного раствора с добавлением 10 мкл рибонуклеазы в течение 15-20 мин при температуре 65°C в 1,5 мл пробирке. Полученный лизат центрифугируют при ускорении 12000 g в течение 2 мин. Надосадочную жидкость в объеме 300-400 мкл (в зависимости от влажности образца тканей) переносят в чистую 1,5 мл пробирку.
Очистку 300-400 мкл полученного биологического раствора проводят добавляя суспензию до конечной концентрации детонационного наноалмаза 5-10% и перемешивают в течение 1 мин. После этого добавляют 200 мкл 5М ацетата калия или натрия, перемешивают 1 мин и охлаждают до температуры 0°C в течение 10 мин.
Разделение смеси проводят центрифугированием в течение 5-10 мин при 12000 g. Супернатант, содержащий ДНК, переносят в чистую 1,5 мл пробирку. В результате из раствора удаляются примеси ингибирующие полимеразную цепную реакцию - пептиды, пигменты, танины, низкомолекулярные соединения.
Из подготовленного раствора ДНК осаждают 1 мл 96% этанола или 400 мкл изопропанола, центрифугируют 2-3 мин при ускорении 12000 g, надосадочную жидкость удаляют.
Осадок промывают в 70% этаноле, сушат в открытой пробирке 2 мин при температуре 65°C и растворяют в 100 мкл бидистиллированной воды.
Пример 1
Для выявления оптимальных условий предварительной подготовки сорбента проводят прокаливание 6 образцов детонационного наноалмаза (ТУ 84-112-87, производство ФНПЦ «Алтай») в вакууме (10-2 Toрр) при температуре от 300°C до 700°C в течение 1 часа.
Выделение ДНК производят из 6-и проб 50 мг живых тканей листа Allium sativum L. Предварительно проводят подготовку суспензии на каждую пробу 30 мг детонационного наноалмаза в 100 мкл буферного раствора (200 мМ Tris-HCl, 250 мМ NaCl, 25 мМ EDTA, 0,5% SDS, pH 7,5).
Лизис 6 одинаковых образцов тканей растений проводят в 400 мкл буферного раствора с добавлением 10 мкл РНКазы в течение 15 мин при температуре 65°C в 1,5 мл пробирках. Полученный лизат центрифугируют 2 мин при 12000 g. Надосадочную жидкость переносят в чистые 1,5 мл пробирки.
Очистку полученного биологического раствора проводят введением суспензии детонационного наноалмаза и затем перемешивают в течение 1 мин переворачиванием пробирок. Очистку проб проводят различно подготовленными детонационными наноалмазами в следующей комбинации:
проба №1 - предварительный отжиг наноалмазов при 300°C;
проба №2 - предварительный отжиг наноалмазов при 400°C;
проба №3 - предварительный отжиг наноалмазов при 500°C;
проба №4 - предварительный отжиг наноалмазов при 600°C;
проба №5 - предварительный отжиг наноалмазов при 700°C.
После этого добавляют 200 мкл 5М ацетата натрия и охлаждают до температуры 0°C в течение 10 мин.
Разделение смеси проводят центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g. Супернатант, содержащий ДНК, переносят в чистую 1,5 мл пробирку. Из раствора ДНК осаждают 400 мкл изопропанола.
Осадок промывают в 70% этаноле и растворяют в 100 мкл бидистиллированной воды.
В итоге было получено 6 образцов раствора ДНК, качество которых проверяют спектрофотометрически, результаты измерений представлены в таблице 1.
Соотношение угасания на длинах волн ДНК и белка (OD260/OD280) для очень чистой ДНК имеет диапазон от 1,7-1,8 и выше. Таким образом, максимальное выделение ДНК (OD260/OD280=2,1) получают при прокаливании детонационного наноалмаза при 500°C в течение 1 часа, наилучшее качество - при прокаливании детонационного наноалмаза в температурном интервале от 400 до 700°C в течение 1 часа.
Пример 2
Для оценки качества ДНК проводят выделение из засушенных и хранившихся в течение 5 лет листьев Hedysarum neglectum Ledeb. с подготовкой 6 образцов детонационного наноалмаза аналогично примеру 1, за исключением того, что лизис проводят в течение 40 мин. В результате получают 6 образцов ДНК в зависимости от температуры подготовки детонационного алмаза. Длину полученных фрагментов ДНК оценивают постановкой электрофореза в 1% агарозном геле в течение 3 ч при напряжении 2,5 В/см, используя для оценки длины эталона 100 bp (базовых пар нуклеотидов) маркер молекулярного веса. После окрашивания геля раствором бромида этидия ДНК фотографируют в УФ-излучении 312 нм (Фиг.1). Выявляют стабильность длины фрагментов выделенной ДНК вне зависимости от условий подготовки детонационного наноалмаза. Наибольшее содержание ДНК выявляют по свечению для образца №3, что соответствует температуре подготовки детонационного наноалмаза 500°C.
Пример 3
Для подбора RAPD-праймеров и выявления видоспецифичных маркеров проводят выделение ДНК из 30 мг листьев Papaver somniferum L. и Papaver orientale Bieb.
Лизис двух образцов тканей разных видов растений проводят в 500 мкл буферного раствора с добавлением 10 мкл РНКазы в течение 30 мин при температуре 65°C в 1,5 мл пробирках. Полученный лизат центрифугируют 2 мин при 12000 g. Надосадочную жидкость переносят в чистые 1,5 мл пробирки.
Очистку полученного биологического раствора, проводят введением в каждую пробу суспензии 100 мкл буфера и 30 мг детонационного наноалмаза предварительно отожженного при 450°C в течение 2 часов в вакууме (10-3 Toрр). После этого добавляют 200 мкл 5М ацетата натрия и охлаждают в морозильной камере в течение 10 мин.
Разделение смеси проводят центрифугированием в течение 5 мин при 12000 g. Супернатант, содержащий ДНК, переносят в чистую 1,5 мл пробирку. Из раствора ДНК осаждают 800 мкл 96% этанола. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, и после сушки осадок ДНК растворяют в 100 мкл бидистиллированной воды.
Амплификацию проводили с коммерческими RAPD-праймеами. Амплифицированную ДНК разгоняют на агарозном 1,5% геле при 5 В/см в течение 2,5 часов параллельно с маркером молекулярного веса. Гель окрашивают раствором бромида этидия и визуализируют в УФ-излучении (Фиг.2). По фотографии геля выявляют различия в паттернах образцов S и O, что соответствует различию геномов двух видов.
Данный пример подтверждает возможность использования выделенной с помощью разработанного метода ДНК для решения задач типификации и молекулярной систематики растений с помощью RAPD-метода.
Пример 4
Выделение ДНК производят из свежевысушенных листьев Hedysamm theinum Krasnob, аналогично примеру 3, полученную ДНК используют для амплификации ITS 1-фрагмента в термальном цикл ере BioRad с помощью ПЦР-набора «Медиген». Использовали праймеры:
ITS-1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'),
ITS-2 (5'-GCTGCGTTCTTCАТСGATGC-3').
Амплифицированную ДНК разгоняют на агарозном 1,5% геле при 5 В/см в течение 2,5 часов параллельно с маркером молекулярного веса и контрольной пробой. Гель окрашивают раствором бромида этидия и визуализируют в УФ-излучении (Фиг.3). Выявляют амплифицированный участок ДНК (паттерны №1 и №3) длиной около 700 bp. Впоследствии амплифицированный участок очищают из геля с использованием набора NucleoSpin и секвенируют. Расшифрованная последовательность амплифицированного участка сравнивают с сиквенсом ITS 1-фрагментом других видов рода Hedysarum, взятых из свободно доступных Интернет-баз данных. Таким образом, нуклеотидная последовательность ДНК, в случае выделения указанным способом, не нарушается и молекула ДНК не модифицируется. Данный пример подтверждает возможность использования полученной с помощью разработанного метода ДНК для расшифровки ее последовательности методом секвенирования.
Предлагаемый способ выделения и очистки ДНК позволяет избежать использования таких высокотоксичных соединений как фенол и хлороформ. Полученный таким способом раствор ДНК содержит как короткие, так и длинные фрагменты. Предотвращается загрязнение полученной ДНК химически активными веществами. Благодаря характерной черной окраске детонационного наноалмаза облегчается процесс разделения фракций - после центрифугирования отчетливо видна граница разделения фаз. При случайном попадании детонационного наноалмаза в конечный раствор полимеразная цепная реакция не блокируется, при этом имеется возможность отделить нерастворимый осадок детонационного наноалмаза от раствора ДНК. Ввиду постоянства размеров наночастиц детонационного наноалмаза, вне зависимости от условий синтеза сохраняется стабильность величины адсорбционной емкости очистительной суспензии.
Литература
1. Doyle J.J. and J.L.Doyle. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. // Phytochemical Bulletin, 1987. - T.19. - P.11-15.
2. Патент РФ №2272072, кл. C12N 15/10, опубл. 20.03.2006.
3. Патент РФ №2119954, кл. C12N 15/10, С07Н 21/00, С07Н 21/02, С07Н 21/04, опубл. 10.10.1998.
4. Фризен Н. Молекулярные методы, используемые в систематике растений. - Барнаул: Азбука, 2007. - 64 с.
Claims (1)
- Способ выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот, заключающийся в том, что после лизиса образца в буфере на основе анионного детергента проводят очистку раствора и ДНК осаждают спиртом, отличающийся тем, что для очистки раствора используют суспензию детонационного наноалмаза до конечной концентрации от 5 до 10% при рН 7,5, предварительно отожженного при температуре от +400° до +700°С в вакууме от 10-2 до 10-3 Торр, затем добавляют ацетат калия или натрия, перемешивают, охлаждают смесь при 0°С, центрифугируют и разделяют детонационный наноалмаз, сорбирующий вещества ненуклеиновой природы, и супернатант, содержащий ДНК.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008143757/10A RU2400537C2 (ru) | 2008-11-05 | 2008-11-05 | Способ выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008143757/10A RU2400537C2 (ru) | 2008-11-05 | 2008-11-05 | Способ выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008143757A RU2008143757A (ru) | 2010-05-10 |
| RU2400537C2 true RU2400537C2 (ru) | 2010-09-27 |
Family
ID=42673515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008143757/10A RU2400537C2 (ru) | 2008-11-05 | 2008-11-05 | Способ выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2400537C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2569510C2 (ru) * | 2013-04-17 | 2015-11-27 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравохранения Российской Федерации | Сорбент, представляющий собой наноалмазный материал (варианты), способы получения и использования. |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2001122054A (ru) * | 2001-08-06 | 2004-06-10 | Петр Иванович Белобров | Способ выделения белка из белоксодержащей массы |
-
2008
- 2008-11-05 RU RU2008143757/10A patent/RU2400537C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2001122054A (ru) * | 2001-08-06 | 2004-06-10 | Петр Иванович Белобров | Способ выделения белка из белоксодержащей массы |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| БОНДАРЬ B.C. и др. Применение наноалмазов для разделения и очистки белка. - Физика твердого тела, 2004, т,46, №6, стр.737-739. PURTOV K.V. ЕТ AL.: "Nanodiamond sorbents: new carriers for column chromatography of proteins", Doklady biochemistry and biophysics, 2008, v.419, p.72-74. PURTOV K.V. ET AL.: "The interaction of linear and ring forms of DNA molecules with nanodiamonds synthesized by detonation", Nanotechnology, 2008, v.19, 325101 (3pp), doi: 10.1088/0957-4484/19/32/325101, найдено в интернет <URL: stacks.iop.org/Nano/19/325101, 20.11.2009. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2569510C2 (ru) * | 2013-04-17 | 2015-11-27 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравохранения Российской Федерации | Сорбент, представляющий собой наноалмазный материал (варианты), способы получения и использования. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2008143757A (ru) | 2010-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Agbagwa et al. | A protocol for high-quality genomic DNA extraction from legumes | |
| Štorchová et al. | An improved method of DNA isolation from plants collected in the field and conserved in saturated NaCl/CTAB solution | |
| JP3943597B2 (ja) | 核酸物質の単離及び増幅 | |
| KR101218469B1 (ko) | 정제된 ｒｎａ를 분리하기 위한 방법 | |
| Cawthorn et al. | Comparative study of different methods for the extraction of DNA from fish species commercially available in South Africa | |
| CN102812118B (zh) | 分离和纯化核酸的方法 | |
| Amita et al. | Qualitative evaluation of mycobacterial DNA extraction protocols for polymerase chain reaction | |
| JPH09505724A (ja) | 核酸精製用組成物及び方法 | |
| JP2002534120A (ja) | 生体材料からのｄｎａの単離方法 | |
| US20120171728A1 (en) | Process for amplifying dna using tetratethylene glycol, kit of parts therefor and use thereof | |
| WO2015159979A1 (ja) | 短鎖核酸の回収方法 | |
| George | Simple and efficient method for functional RNA extraction from tropical medicinal plants rich in secondary metabolites | |
| JP5924888B2 (ja) | 核酸抽出方法、核酸抽出試薬キットおよび核酸抽出用試薬 | |
| CN110628762A (zh) | 一种基于纳米磁珠的核酸提取方法及应用 | |
| Nihad et al. | Comparative assessment of quick and cost-efficient quality DNA extraction methods from rice leaves. | |
| CN108588243A (zh) | 快速鉴别外来生物福寿螺的特异性引物、多重pcr检测试剂盒及其检测方法 | |
| RU2400537C2 (ru) | Способ выделения и очистки дезоксирибонуклеиновых кислот | |
| EP2951314B1 (en) | Solid medium for the storage of biological material | |
| Kamba et al. | A new simple and efficient DNA extraction protocol for orchid without liquid nitrogen and phenol | |
| Demirel et al. | Purification of phycocyanin from isolated and identified hot spring cyanobacteria | |
| CN105255857A (zh) | 一种茶树dna的提取方法 | |
| Ince et al. | The MAGi DNA extraction method for fresh tissues and dry seeds | |
| RU2672378C1 (ru) | Способ выделения ДНК из растений, пригодный для постановки ПЦР | |
| CN113430292A (zh) | 用于检测猕猴桃软腐病病原菌葡萄座腔菌的引物组及应用 | |
| Chattopadhyay et al. | Purification of quality DNA from citrus plant using iron oxide nanoparticle as solid based support |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171106 |