RU2425646C1 - Method and transplant for treatment of liver failure - Google Patents
Method and transplant for treatment of liver failure Download PDFInfo
- Publication number
- RU2425646C1 RU2425646C1 RU2010110063/14A RU2010110063A RU2425646C1 RU 2425646 C1 RU2425646 C1 RU 2425646C1 RU 2010110063/14 A RU2010110063/14 A RU 2010110063/14A RU 2010110063 A RU2010110063 A RU 2010110063A RU 2425646 C1 RU2425646 C1 RU 2425646C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- liver
- bone marrow
- gel
- allogeneic
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретения относится к медицине, трансплантологии, клеточной трансплантологии, могут быть использованы при коррекции и лечении печеночной недостаточности. Предлагаемые способ и трансплантат могут быть использованы в специализированных отделениях, занимающихся лечением и коррекцией печеночной недостаточности.The invention relates to medicine, transplantology, cell transplantology, can be used in the correction and treatment of liver failure. The proposed method and transplant can be used in specialized departments involved in the treatment and correction of liver failure.
Известен способ лечения печеночной недостаточности, основанный на использовании суспензии изолированных ксеногенных гепатоцитов в экстрокорпоральной системе «вспомогательная печень», через которую перфузируется кровь реципиента с пораженной печенью (Шумаков В.И. и соавторы. Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения искусственных органов // Тула. - Репрорникс. - 1998. - с.343-362).A known method of treating liver failure, based on the use of a suspension of isolated xenogenic hepatocytes in the extracorporeal system "auxiliary liver", through which the blood of the recipient with the affected liver is perfused (Shumakov V.I. et al. Essays on the physiological problems of transplantology and the use of artificial organs // Tula . - Reporters. - 1998. - p. 343-362).
Изолированные гепатоциты в таких системах, будучи ксеногенными, способны в организме больного лишь кратковременно осуществлять детоксикационные и синтетические функции. В то же время способность суспензии изолированных гепатоцитов выделять регуляторные пептиды, стимулирующие процессы регенерации в пораженной печени реципиента, пролонгирована до 0,5-8 часов (Шумаков В.И. и др. Лечение тяжелой печеночной недостаточности перфузией крови больного через взвесь криоконсервированных гепатоцитов // Хирургия. - 1990. - №2. - с.113-116).Isolated hepatocytes in such systems, being xenogenic, are capable of only briefly performing detoxification and synthetic functions in the patient’s body. At the same time, the ability of a suspension of isolated hepatocytes to secrete regulatory peptides that stimulate regeneration processes in the affected liver of the recipient is prolonged to 0.5-8 hours (Shumakov V.I. et al. Treatment of severe hepatic insufficiency by perfusion of the patient’s blood through a suspension of cryopreserved hepatocytes // Surgery. - 1990. - No. 2. - p.113-116).
Известен другой способ лечения печеночной недостаточности, в котором использовались микрофрагменты ткани печени, что позволило пролонгировать метаболическую активность гепатоцитов, содержащихся в микрофрагментах до 24-34 и даже до 48 часов (Соловьев В.В., Онищенко Н.А., Акатов B.C., Лежнев Э.И. Функциональная активность гепатоцитов в фрагментах печени in vitro: зависимость от размеров фрагментов и длительности их культивирования // Бюлл. Экспер. Биол. и Мед., - 1997. - №10. - с.406-408). Увеличение сроков метаболической активности гепатоцитов в составе микрофрагментов происходит за счет сохранения в них межклеточных контактов и естественного межклеточного геля, а так же из-за сохранения пространственной структуры ткани печени, в результате чего оптимизируются условия функционирования всех типов клеток, в том числе и гепатоцитов.There is another method for the treatment of liver failure, which used microfragments of liver tissue, which allowed to prolong the metabolic activity of hepatocytes contained in microfragments up to 24-34 and even up to 48 hours (Soloviev V.V., Onishchenko N.A., Akatov BC, Lezhnev EI Functional activity of hepatocytes in liver fragments in vitro: dependence on the size of the fragments and the duration of their cultivation // Bull. Expert. Biol. And Med., - 1997. - No. 10. - p. 40-408). An increase in the duration of the metabolic activity of hepatocytes in microfragments occurs due to the preservation of intercellular contacts and the natural intercellular gel in them, as well as due to the preservation of the spatial structure of the liver tissue, as a result of which the functioning conditions of all types of cells, including hepatocytes, are optimized.
Также известен способ лечения печеночной недостаточности, предполагающий для пролонгирования сроков выживания изолированных гепатоцитов в перфузионных биореакторах использовать изолированные гепатоциты с микроносителями (используют, например, цитодекс-3 при соотношении 1,6 г микроносителя на 1×109 клеток), которые предварительно покрывают коллагеном (Dimetriou A.A., Rozga J., Podesta L. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver // Scan. J.gastroenterol. - 1995. - 30. - Suppl. 208. - p.111-117; Chen S., Eguchi S. Watanabe Hepatic support strategies // Transplant. Proc. - 1996. - 28, №4. - р.2036-2038).Also known is a method of treating liver failure, which involves prolonging the survival of isolated hepatocytes in perfusion bioreactors using isolated hepatocytes with microcarriers (use, for example, cytodex-3 at a ratio of 1.6 g of microcarrier per 1 × 10 9 cells) that are pre-coated with collagen ( Dimetriou AA, Rozga J., Podesta L. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver // Scan. J. Gastroenterol. - 1995 .-- 30. - Suppl. 208. - p. 111-117; Chen S., Eguchi S Watanabe Hepatic support strategies // Transplant. Proc. - 1996. - 28, No. 4. - p. 2036-2038).
Также известен способ лечения печеночной недостаточности, предполагающий использующий новые экстракорпоральные системы, заполненные коллагеновым гелем с гепатоцитами (Naka S., Takeshita K., Yamamoto Т. Bioartificial liver support system using porcine hepatocytes entrapped in a three-dimensional hollow fiber module with collagen gel: an evaluation in the swine acute liver failure model // Artif. Organs. - 1999. - V.23. - P.822-828).A method for treating liver failure is also known, involving new extracorporeal systems filled with collagen gel with hepatocytes (Naka S., Takeshita K., Yamamoto T. Bioartificial liver support system using porcine hepatocytes entrapped in a three-dimensional hollow fiber module with collagen gel: an evaluation in the swine acute liver failure model // Artif. Organs. - 1999. - V.23. - P.822-828).
Также известен способ лечения и коррекции печеночной недостаточности путем внутримышечной имплантации пула изолированных гепатоцитов в микро- или макрокапсулах (Hunkeler D., Cherrington A., Prokop A., Rajotte R. Bioartificial Organs III. Tissue Sourcing, Immunoisolation, and Clinical Trials // Annals of the New York. Academy of Sciences. - N.Y., 2001. - V.944).Also known is a method of treating and correcting liver failure by intramuscular implantation of a pool of isolated hepatocytes in micro- or macrocapsules (Hunkeler D., Cherrington A., Prokop A., Rajotte R. Bioartificial Organs III. Tissue Sourcing, Immunoisolation, and Clinical Trials // Annals of the New York. Academy of Sciences. - NY, 2001. - V.944).
В качестве прототипа нами выбран известный способ лечения печеночной недостаточности, в котором использовались изолированные гепатоциты для вспомогательной поддержки печени и, соответственно, восполнения дезинтоксикационной и биорегуляторной функции поврежденной печени (Van de Kerkhove M.P., Hoekstra R., Chamuleau R.A., van Gulik T.M. Clinical application of bioartificial liver support systems // Ann. Surg. - 2004. - Vol.240. - P.216-230).As a prototype, we chose a well-known method of treating liver failure, in which isolated hepatocytes were used to support the liver and, accordingly, supplement the detoxification and bioregulatory function of the damaged liver (Van de Kerkhove MP, Hoekstra R., Chamuleau RA, van Gulik TM Clinical application of bioartificial liver support systems // Ann. Surg. - 2004. - Vol. 240. - P.216-230).
К недостаткам использования известных способов, в том числе и прототипа, предпологающих использование экстракорпорального биореактора с микрофрагментами ткани печени или изолированными гепатоцитами относятся:The disadvantages of using known methods, including the prototype, suggesting the use of an extracorporeal bioreactor with microfragments of liver tissue or isolated hepatocytes include:
- необходимость использования специальных измельчителей для получения фрагментов заданного размера, повышающих опасность инфицирования донорского материала;- the need to use special grinders to obtain fragments of a given size, increasing the risk of infection of donor material;
- необходимость использования перфузионных систем и включения в перфузионный контур дополнительных технических узлов для оксигенации и детоксикации крови (плазмы), поступающих к микрофрагментам ткани печени, что повышает экономическую себестоимость метода;- the need to use perfusion systems and the inclusion in the perfusion circuit of additional technical units for oxygenation and detoxification of blood (plasma) coming to microfragments of the liver tissue, which increases the economic cost of the method;
- необходимость использования в биореакторах микрофрагментов в смеси с частицами пористого биосовместимого носителя для предотвращения слипания микрофрагментов и обеспечения эффективного массопереноса;- the need to use microfragments in bioreactors mixed with particles of a porous biocompatible carrier to prevent microfragments from sticking together and to ensure effective mass transfer;
- использование частиц пористого носителя не создает условий для предотвращения отсроченной гибели гепатоцитов в микрофрагментах, т.к. при увеличении сроков культивирования микрофрагментов из-за низкой скорости пролиферации гепатоцитов начинает формироваться монослой из быстро прикрепляющихся и пролиферирующих стромальных клеток, окутывающих местные ткани печени и затрудняющих их функционирование;- the use of particles of a porous carrier does not create conditions for preventing the delayed death of hepatocytes in microfragments, because with an increase in the duration of cultivation of microfragments due to the low proliferation rate of hepatocytes, a monolayer begins to form from quickly adhering and proliferating stromal cells enveloping local liver tissues and hindering their functioning;
- необходимость использования ксеногенного материала, что повышает угрозу переноса опасных инфекций и служит фактором избыточной активации иммунной системы реципиента с сокращением срока функционирования этого материала;- the need to use xenogenic material, which increases the risk of transmission of dangerous infections and serves as a factor in excessive activation of the recipient's immune system with a reduction in the life of this material;
- раннее прекращение (через 1-2 дня) метаболических и регуляторных функций гепатоцитов;- early termination (after 1-2 days) of the metabolic and regulatory functions of hepatocytes;
- необходимость регулярно осуществлять сеансы подключения перфузионных систем «биоискусственная печень»;- the need to regularly carry out sessions connecting perfusion systems "bio-artificial liver";
- невозможность создания трехмерной структуры, сходной по архитектонике с тканью печени.- the impossibility of creating a three-dimensional structure similar in architectonics to liver tissue.
Известно устройство для лечения печеночной недостаточности методом экстракорпорального подключения изолированных гепатоцитов (Dimetriou A.A., Rozga J., Podesta L. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver // Scan. J.Gastroenterol. - 1995. - 30. - Suppl.208. - p.111-117). Также известно устройство, предназначенное для лечения печеночной недостаточности, позволяюшее увеличивать сроки жизнеспособности изолированных гепатоцитов (Шумаков В.И. и соавторы. Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения искусственных органов // Тула. - Репрорникс. - 1998. - с.343-362).A device for the treatment of liver failure by extracorporeal connection of isolated hepatocytes (Dimetriou AA, Rozga J., Podesta L. Early clinical experience with a hybrid bioartificial liver // Scan. J. Gastroenterol. - 1995. - 30. - Suppl.208. - p.111-117). It is also known a device designed to treat liver failure, which allows to increase the viability of isolated hepatocytes (Shumakov V.I. et al. Essays on the physiological problems of transplantology and the use of artificial organs // Tula. - Reprorniks. - 1998. - p.343-362 )
В качестве прототипа предлагаемого трансплантата для лечения печеночной недостаточности нами выбрано интракорпоральный трансплантат (биомодуль) «вспомогательная печень» (Uyama S., Kaufman P., Kneser U., Vacanti J., Rodriges X. Hepatocyte transplantation using biodegradable matrices in ascorbic acid-deficient rats: comparsion with heterotropically transplanted liver grafts // Transplantation. - 2001. - Vol.7. - P.1-7).As a prototype of the proposed transplant for the treatment of liver failure, we chose the intracorporeal transplant (biomodule) “auxiliary liver” (Uyama S., Kaufman P., Kneser U., Vacanti J., Rodriges X. Hepatocyte transplantation using biodegradable matrices in ascorbic acid-deficient rats: comparsion with heterotropically transplanted liver grafts // Transplantation. - 2001. - Vol.7. - P.1-7).
К недостаткам использования известных устройств, в том числе и прототипа, предпологающих использование биомодулей с изолированными гепатоцитами относятся:The disadvantages of using known devices, including the prototype, suggesting the use of biomodules with isolated hepatocytes include:
- выраженная воспалительная реакция на трансплантат;- a pronounced inflammatory reaction to the graft;
- гибель большого количества изолированных гепатоцитов;- death of a large number of isolated hepatocytes;
- низкая плотность прикрепления клеток печени;- low density of attachment of liver cells;
- дороговизна матрикса-носителя.- the high cost of the matrix carrier.
Задачей изобретения является разработка способа, повышающего эффективность коррекции и лечения печеночной недостаточности за счет пролонгирования сроков выживания изолированных гепатоцитов и выполнения ими функциональной и органоспецифической активности путем трансплантации долгосрочно функционирующего интракорпорального трансплантата типа «вспомогательная печень».The objective of the invention is to develop a method that improves the correction and treatment of liver failure by prolonging the survival time of isolated hepatocytes and performing functional and organ-specific activity by transplanting a long-functioning intracorporeal auxiliary liver transplant.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретений, заключается в коррекции и лечении печеночной недостаточности путем обеспечения изолированными гепатоцитами детоксикационной функции, пролонгирования сроков их выживания с активизацией пролиферации за счет совместного интракорпорального введения с прогениторными клетками костного мозга, создания каркаса для размещения в пространстве ассоциаций образующихся клеток, создания условий для прорастания в этот каркас сосудов, диффузии питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки из крови сосудов печени и/или сосудов брыжейки и сосудов, проросших в каркас, к иммобилизированным печеночным клеткам и клеткам костного мозга; а также в профилактике осложнений, связанных с тромбообразованием и клеточной инфильтрацией в месте трансплантации трансплантата с клеточным материалом.The technical result achieved by the implementation of the invention consists in the correction and treatment of liver failure by providing detoxification function with isolated hepatocytes, prolonging their survival with the activation of proliferation due to joint intracorporeal administration with bone marrow progenitor cells, creating a framework for placement of the formed cells in the space of associations creating conditions for the growth of vessels in this framework, the diffusion of nutrients, oxygen and fa tori tissue differentiation of blood vessels of the liver and / or mesenteric vessels and vascular sprouting in frame to the immobilized cells and hepatic cells to bone marrow; as well as in the prevention of complications associated with thrombosis and cell infiltration at the site of transplantation of the graft with cellular material.
Достоинствами предложенных способа и трансплантата для лечения печеночной недостаточности, позволяющих, по существу, создать интракорпоральную систему «вспомогательная печень» для длительного поддержания в функциональном состоянии изолированных гепатоцитов являются:The advantages of the proposed method and transplant for the treatment of liver failure, allowing, in essence, to create an intracorporeal system "auxiliary liver" for long-term maintenance in a functional state of isolated hepatocytes are:
- отсутствие необходимости применения сложных перфузионных систем;- lack of need for complex perfusion systems;
- создание с помощью гетерогенного геля культуральных условий для пролиферации клеток и формирования «тканеподобной» структуры;- creating, using a heterogeneous gel, culture conditions for cell proliferation and the formation of a “tissue-like” structure;
- создание адекватных условий для диффузии оксигенированной межтканевой жидкости и прорастания сосудов через гель, что пролонгирует адекватные условия жизнеобеспечения посаженных клеток;- the creation of adequate conditions for the diffusion of oxygenated interstitial fluid and the germination of vessels through the gel, which prolongs the adequate living conditions of planted cells;
- использование аллогенных клеток, которые позволяют этой системе оказывать в организме длительное биорегуляторное воздействие.- the use of allogeneic cells that allow this system to exert a long bioregulatory effect in the body.
В предлагаемых изобретениях не используются ткани и/или клеточный материал эмбрионов человека. Использован клеточный материал взрослых доноров.The proposed inventions do not use tissue and / or cellular material of human embryos. Used cellular material of adult donors.
Этот способ способствует более быстрой интеграции трансплантата в систему кровообращения после трансплантации и поддержания метаболизма и жизнедеятельности клеток за счет доставки по вновь образованным и проросшим сосудам кислорода; создание адекватных условий для диффузии оксигенированной межтканевой жидкости, что пролонгирует адекватные условия жизнеобеспечения посаженных клеток. Использование антикоагулянтов и антиагрегантов сразу после трансплантации тормозит клеточную реакцию на трансплантат как инородное тело и препятствует тромбообразованию в месте трансплантации. Использование иммуносупрессантов препятствует отторжению трансплантата.This method contributes to a more rapid integration of the transplant into the circulatory system after transplantation and maintaining the metabolism and vital functions of the cells by delivering oxygen to the newly formed and sprouted vessels; creating adequate conditions for the diffusion of oxygenated interstitial fluid, which prolongs the adequate living conditions of planted cells. The use of anticoagulants and antiplatelet agents immediately after transplantation inhibits the cellular response to the transplant as a foreign body and prevents thrombosis at the transplant site. The use of immunosuppressants prevents graft rejection.
Сущность изобретений заключается в следующем.The invention consists in the following.
Для лечения печеночной недостаточности используют изолированные клетки печени донора. Осуществляют забор аллогенных прогениторных клеток костного мозга у донора. Затем осуществляют забор аллогенных клеток печени у донора. Выполняют посадку свежевыделенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга на гетерогенный биосовместимый биодеградируемый гель. Размеры пор гетерогенного геля варьируют от 30 до 500 мкм. Суммарная пористость гетерогенного геля составляет 50-98%. Суммарная концентрация клеток печени и костного мозга составляет 2×106 - 15×106 клеток на 1 см3 геля. При этом соотношение клеток костного мозга к клеткам печени от 1:1 до 1:4. Причем общий объем геля не менее 0,1 мл. Наименьший объем геля должен быть не менее 0,2 мм. Трансплантацию гетерогенного геля с аллогенными клетками печени и костного мозга производят в паренхиму поврежденной печени и/или в брыжейку тонкой кишки.For the treatment of liver failure, isolated donor liver cells are used. Allogeneic progenitor bone marrow cells are collected from the donor. Then carry out the collection of allogeneic liver cells from the donor. Freshly isolated liver cells and progenitor bone marrow cells are planted on a heterogeneous biocompatible biodegradable gel. The pore sizes of a heterogeneous gel vary from 30 to 500 microns. The total porosity of the heterogeneous gel is 50-98%. The total concentration of liver and bone marrow cells is 2 × 10 6 - 15 × 10 6 cells per 1 cm 3 of gel. The ratio of bone marrow cells to liver cells from 1: 1 to 1: 4. Moreover, the total volume of the gel is at least 0.1 ml. The smallest gel volume should be at least 0.2 mm. Transplantation of a heterogeneous gel with allogeneic cells of the liver and bone marrow is performed in the parenchyma of the damaged liver and / or in the mesentery of the small intestine.
В частном случае сразу после трансплантации назначают антикоагулянты в профилактической дозе. Доза составляет: гепарин 2500 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты, например, трентал из расчета 45 мг/м2 поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.In the particular case, immediately after transplantation, anticoagulants are prescribed in a prophylactic dose. The dose is: heparin 2500 ME every 12 hours for 7-10 days under the control of the blood coagulation system and antiplatelet agents, for example, trental at the rate of 45 mg / m 2 of the body surface every 12 hours for 30-90 days.
В частном случае сразу после трансплантации назначают иммуносупрессанты в профилактической дозе. Доза составляет: хорионический гонадотропин 500-5000 ME 1 раз в сутки в течение 30-90 дней.In a particular case, immediately after transplantation, immunosuppressants are prescribed in a prophylactic dose. The dose is: chorionic gonadotropin 500-5000 ME 1 time per day for 30-90 days.
Предлагаемый трансплантат для лечения печеночной недостаточности включает гетерогенный биосовместимый биодеградируемый гель и посаженные на него аллогенные клетки костного мозга и аллогенные клетки печени. Общий объем гетерогенного геля не менее 0,1 мл. Размеры пор гетерогенного геля 30-500 мкм, суммарная пористость 50-98%. Концентрация клеток печени и костного мозга 2×106 - 15×106 клеток на 1 см3 гетерогенного геля и соотношение клеток костного мозга к клеткам печени от 1:1 до 1:4.The proposed transplant for the treatment of liver failure includes a heterogeneous biocompatible biodegradable gel and allogeneic bone marrow cells and allogeneic liver cells placed on it. The total volume of the heterogeneous gel is at least 0.1 ml. The pore size of the heterogeneous gel is 30-500 microns, the total porosity is 50-98%. The concentration of liver and bone marrow cells is 2 × 10 6 - 15 × 10 6 cells per 1 cm 3 of heterogeneous gel and the ratio of bone marrow cells to liver cells is from 1: 1 to 1: 4.
Предлагаемые способ и трансплантат позволяют пролонгировано корригировать острую или хроническую печеночную недостаточность за счет прологнирования функционирования изолированных гепатоцитов. Трансплантация аллогенных клеток с последующим применением иммуносупресантов позволяет исключить осложнения, связанные с реакцией отторжения. Предлагаемая группа изобретений позволяет также:The proposed method and transplant allow prolonged correction of acute or chronic liver failure due to prolining the functioning of isolated hepatocytes. Transplantation of allogeneic cells with subsequent use of immunosuppressants eliminates complications associated with the rejection reaction. The proposed group of inventions also allows:
1. создавать условия для прикрепления изолированных клеток печени и клеток костного мозга на гетерогенный биосовместимый биодеградируемый гель, активизирует их пролиферацию, которая поддерживается диффузией в гель питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки из крови и плазмы, притекающей к гелю из сосудов печени или брыжейки;1. create conditions for the attachment of isolated liver cells and bone marrow cells to a heterogeneous biocompatible biodegradable gel, activates their proliferation, which is supported by diffusion into the gel of nutrients, oxygen and tissue differentiation factors from the blood and plasma flowing to the gel from the vessels of the liver or mesentery;
2. создать каркас, на основе гетерогенных биосовместимых биодеградируемых гелей, имитирующий пространственную структуру для прикрепления клеток донорской печени и прогениторных клеток костного мозга, а также условия для прорастания в этот каркас сосудов, питающих прикрепленные клетки;2. create a framework based on heterogeneous biocompatible biodegradable gels that simulates the spatial structure for attachment of donor liver cells and bone marrow progenitor cells, as well as the conditions for the growth of vessels supplying attached cells into this framework;
3. создать условия, препятствующие клеточной инфильтрации трансплантата и поддерживающие его клетки в жизнеспособном состоянии за счет использования антикоагулянтов и антиагрегантов;3. create conditions that impede cell transplant infiltration and maintain its cells in a viable state through the use of anticoagulants and antiplatelet agents;
4. создать условия, препятствующие отторжению трансплантата и поддерживающие его клетки в жизнеспособном состоянии за счет использования иммуносупрессантов.4. create conditions that prevent transplant rejection and maintain its cells in a viable state through the use of immunosuppressants.
Способ осуществляется следующим образом и включает в себя несколько последовательных этапов.The method is as follows and includes several sequential steps.
1) Выделение аллогенных прогениторных клеток костного мозга.1) Isolation of allogeneic bone marrow progenitor cells.
Выделение прогениторных клеток костного мозга у донора осуществляют по традиционной методике (Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановления терапии поврежденных органов // Вестник трансплантации и иск. органов 2002, 4, с.3-6; Шумаков В.И., Онищенко Н.А. и соавт. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций // Москва, Лавр. 2009. - с.61-67). Пунктируют подвздошную кость донора и забирают костный мозг в объеме 40-150 мл в стерильную емкость с раствором Хенкса, содержащим 200 мкг/мл гентамицина; 10,0 мкг/мл инсулина; 0,25 мкМ дексамезатона; 250 ед/мл гепарина. Суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, осадок клеток ресуспендируют в лизирующем растворе (114 мМ NH4Cl; 7,5 мМ KHCO3; 100 мкМ EDTA), в соотношении 1:4 от исходного объема аспирата, в течение 5-10 мин и центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный супернатант полностью удаляют отсасыванием. Добиваются полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводят трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, ресуспендируют в ростовой среде.Isolation of bone marrow progenitor cells from a donor is carried out according to a traditional technique (Shumakov V.I., Onishchenko N.A., Krasheninnikov M.E. et al. Bone marrow as a source of mesenchymal cells for restoration of therapy of damaged organs // Bulletin of transplantation and
2) Выделение аллогенных клеток печени.2) Isolation of allogeneic liver cells.
Производят резекцию 2-4×2-4×1-2 см ткани печени у доноров для получения клеток печени. Выделение аллогенных клеток печени осуществляют по традиционной методике (Seglen О. Preparation of isolated rat liver cells // Methods. Cell. Biol. 1976. - vol.13. - p.29-83; Fontaine M., Schloo B., Jenkins R., Uyama S., Hansen L., Vacanti J.P. Human hepatocyte isolation and transplantation into an athymic rat, using prevascularized cell polymer constructs // Pediatr. Surg. - 1995. - vol.30(1). - p.56-60; Hang H., Shi X., Gu G., Wu Y., Ding Y. A simple isolation and cryopreservation method for adult human hepatocytes // Int. J. Artif. Organs. 2009 Oct; 32(10):720-7; Lehec S.C., Hughes R.D., Mitry R.R., Graver M.A, Verma A., Wade J.J., Dhawan A. Experience of microbiological screening of human hepatocytes for clinical transplantation // Cell Transplant. 2009; 18(8):941-947).Resection of 2-4 × 2-4 × 1-2 cm of liver tissue from donors is performed to obtain liver cells. Isolation of allogenic liver cells is carried out according to a traditional method (Seglen O. Preparation of isolated rat liver cells // Methods. Cell. Biol. 1976. - vol.13. - p.29-83; Fontaine M., Schloo B., Jenkins R ., Uyama S., Hansen L., Vacanti JP Human hepatocyte isolation and transplantation into an athymic rat, using prevascularized cell polymer constructs // Pediatr. Surg. - 1995. - vol. 30 (1). - p. 56-60 ; Hang H., Shi X., Gu G., Wu Y., Ding Y. A simple isolation and cryopreservation method for adult human hepatocytes // Int. J. Artif. Organs. 2009 Oct; 32 (10): 720- 7; Lehec SC, Hughes RD, Mitry RR, Graver MA, Verma A., Wade JJ, Dhawan A. Experience of microbiological screening of human hepatocytes for clinical transplantation // Cell Transplant. 2009; 18 (8): 941-947) .
Выделение аллогенных клеток печени производят из резецированного участка печени путем 3-кратной отмывки кусочка печени от крови и измельчения его на холоде (t=4°С) в чашке Петри, с 3-кратной отмывкой образовавшейся взвеси буферным раствором без кальция [1000 мл дистиллированной воды, 8,3 г NaCl, 0,5 г KCl, 2,38 г HEPES, pH 7,4, 37°С] в течение 7 минут. После этого мелкие кусочки печени инкубируются 3 раза раствором коллагеназы [1000 мл дистиллированной воды, 8,3 г NaCl, 0,5 г KCl, 0,7 г CaCl2, 2,38 г HEPES, 7,5 мг ингибитор трипсина и 500 мг коллагеназы Тип IV-S (>125 CDU/mg), pH 7,3; 37°С] в течение 6-8 минут с последующей заменой ферментного раствора с использованием центрифугирования 500 об/мин в течение 1 минуты при t=37°C. Полученный материал переносят на сито с ячейками 200 мкм и фильтруют промыванием питательной средой William's E с 10% фетальной бычьей сыворотки, после чего суспензию отдельных клеток и небольших агрегатов переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 500 об/мин при 4°С в течение 1 минуты. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в такой же свежей среде и опять центрифугируют. Процедуру повторяют 3 раза. Жизнеспособность клеток оценивают методом окрашивания трипановым синим. Добиваются получения количества клеток в пределах от 3,0×108 до 4,0×108 гепатоцитов на 12-15 г веса ткани печени. Клеточная суспензия должна содержать: гепатоциты, непаренхиматозные клетки печени, которые определяют при световой микроскопии. Разделение паренхиматозных и непаренхиматозных клеток не выполняют. Взвесь клеток печени концентрируют в 1-2 мл физ. р-ра.Allogeneic liver cells are isolated from the resected liver by 3 times washing a piece of the liver from the blood and grinding it in the cold (t = 4 ° C) in a Petri dish, with 3 times washing the suspension formed with a buffer solution without calcium [1000 ml of distilled water , 8.3 g of NaCl, 0.5 g of KCl, 2.38 g of HEPES, pH 7.4, 37 ° C] for 7 minutes. After that, small pieces of the liver are incubated 3 times with a collagenase solution [1000 ml of distilled water, 8.3 g NaCl, 0.5 g KCl, 0.7 g CaCl 2 , 2.38 g HEPES, 7.5 mg trypsin inhibitor and 500 mg collagenase Type IV-S (> 125 CDU / mg), pH 7.3; 37 ° C] for 6-8 minutes, followed by replacement of the enzyme solution using centrifugation at 500 rpm for 1 minute at t = 37 ° C. The resulting material was transferred to a sieve with 200 μm cells and filtered by washing with William's E nutrient medium with 10% fetal bovine serum, after which a suspension of individual cells and small aggregates was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 500 rpm at 4 ° C for 1 minute . The supernatant is removed, the precipitate is resuspended in the same fresh medium and centrifuged again. The procedure is repeated 3 times. Cell viability is evaluated by trypan blue staining. Achieve the number of cells in the range from 3.0 × 10 8 to 4.0 × 10 8 hepatocytes per 12-15 g of liver tissue weight. The cell suspension should contain: hepatocytes, non-parenchymal liver cells, which are determined by light microscopy. Separation of parenchymal and non-parenchymal cells is not performed. A suspension of liver cells is concentrated in 1-2 ml of physical. solution
3) Посадка (иммобилизация) аллогенных клеток печени и аллогенных клеток костного мозга на гетерогенный гель.3) Landing (immobilization) of allogeneic liver cells and allogeneic bone marrow cells on a heterogeneous gel.
Посадку (иммобилизацию) клеточного материала осуществляют по традиционной методике (Mooney D.J., Sano K., Kaufinann P.M., Majahod K., Schloo В., Vacanti J.P., Langer R. Long-term engraftment of hepatocytes transplanted о biodegradable polymer sponges // J. Biomed. Mater. Res. - 1997. - Vol.5. - P.413-420).Planting (immobilization) of cellular material is carried out according to a traditional technique (Mooney DJ, Sano K., Kaufinann PM, Majahod K., Schloo B., Vacanti JP, Langer R. Long-term engraftment of hepatocytes transplanted about biodegradable polymer sponges // J. Biomed. Mater. Res. - 1997. - Vol.5. - P.413-420).
Аллогенные клетки печени и аллогенные прогениторные клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде [William's E с заменой аргинина на орнитин, с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулиноподобного фактора роста-I, аскорбиновой кислоты, линолеивой и линоливой жирных кислот] в концентрации 2,0-4,0×106 клеток печени/мл и 2,0-4,0×106 прогениторных клеток клеток костного мозга/мл. Суммарную клеточную суспензию в концентрации 2×106-15×106 на 1 см3 аккуратно смешивали с гетерогенным гель в соотношении 1:1, до равномерной консистенции, набирали в шприц и хранили до введения в печень и/или брыжейку при 4°С не более 5 часов.Allogeneic liver cells and allogeneic bone marrow progenitor cells were resuspended in growth medium [William's E with the replacement of arginine with ornithine, supplemented with fetal bovine serum, hepatocyte growth factor, epidermal growth factor, cholera toxin β-subunit, dexamezatone, ethanolamine, sodium selenite, glucose , insulin, insulin-like growth factor-I, ascorbic acid, linoleic and linoleic fatty acids] at a concentration of 2.0-4.0 × 10 6 liver cells / ml and 2.0-4.0 × 10 6 progenitor cells of bone marrow cells / ml The total cell suspension at a concentration of 2 × 10 6 -15 × 10 6 per 1 cm 3 was carefully mixed with a heterogeneous gel in a ratio of 1: 1, until a uniform consistency, was drawn into a syringe and stored until introduction into the liver and / or mesentery at 4 ° C no more than 5 hours.
В качестве гетерогенного геля может быть использован, например, биоматериал, «СфероГЕЛЬ», изготовленный на основе коллагена сельскохозяйственных животных (70%) и коллагенсодержащего экстракта (30%), имеющего вид плотного желеобразного вещества.As a heterogeneous gel can be used, for example, biomaterial, "SphereGEL", made on the basis of collagen of farm animals (70%) and collagen-containing extract (30%), which looks like a dense jelly-like substance.
Гетерогенные гели используют как элемент экстракорпоральных систем, для инкапсуляции различных типов клеток (β-клетки, гепатоциты, генетически измененные клетки, стволовые клетки) и факторов роста и др. (Shoichet M.S., Li R.H., White M.L. et al. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose // Biotechnol. Bioeng. - 1996. - V.50. - P.374-381.; Naka S., Takeshita K., Yamamoto T. Bioartificial liver support system using porcine hepatocytes entrapped in a three-dimensional hollow fiber module with collagen gel: an evaluation in the swine acute liver failure model // Artif. Organs. - 1999. - V.23. - P.822-828; Tan W., Desai M.S., Desai T.A. Microfluidic patterning of cells in extracellular matrix biopolymers: effect of channel size, cell type, and matrix composition on pattern integrity // Tissue Engineering. - 2003. - V.9. - №2. - P.255-268; Hedberg L.E., Kroese-Deutman H.C., Shih C.K. et al. Effect of varied release kinetics of the osteogenic thrombin peptide TP508 from biodegradable polymeric scaffolds on bone formation in vivo II g]. Biomed. Mater. Res. - V.72A. - №4. - 2005. - P.343-353; Allemann F., Mizuno S. et al. Effect of hyaluronan on engeneered articular cartilage extracellular matrix gene expression in 3-dimensional collagen scaffolds // J. Biomed. Mater. Res. - 2001. - V.55. - P.13-19; Houweling D.A., Lankhorst A.J., Gispen W.H. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery // Exp. Neurol. - 1998. - V.153. - №1. - P.49-59; Marchand R., Woerly S., Bertrand L. et al. Evaluation of two cross-linked collagen gels implanted in the transected spinal cord // Brain Res. Bull. - 1993. - V.30. - №3-4. - P.415-422; Marchant R., Hiltner A., Hamlin C. et al. In vivo biocompatibility studies. 1. The cage implant system and biodegradable hydrogel // J. Biomed. Mater. Res. - 1983. - V.17. - P.301-325; Motoyuki S., Kazuhiro I., Akiyoshi S. et al. Long-term culture of primary rat hepatocytes with high albumin secretion using membrane-supported collagen sandwich // Cytotechnology. - 1993. - V.11. - №3. - P.213-218).Heterogeneous gels are used as an element of extracorporeal systems to encapsulate various types of cells (β-cells, hepatocytes, genetically modified cells, stem cells) and growth factors, etc. (Shoichet MS, Li RH, White ML et al. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose // Biotechnol. Bioeng. - 1996. - V.50. - P.374-381 .; Naka S., Takeshita K., Yamamoto T. Bioartificial liver support system using porcine hepatocytes entrapped in a three-dimensional hollow fiber module with collagen gel: an evaluation in the swine acute liver failure model // Artif. Organs. - 1999. - V.23. - P.822-828; Tan W., Desai MS , Desai TA Microfluidic patterning of cells in extracellular matrix biopolymers: effect of channel size, cell type, and matrix composition on pa ttern integrity // Tissue Engineering. - 2003. - V.9. - No. 2. - P.255-268; Hedberg LE, Kroese-Deutman HC, Shih CK et al. Effect of varied release kinetics of the osteogenic thrombin peptide TP508 from biodegradable polymeric scaffolds on bone formation in vivo II g]. Biomed. Mater. Res. - V.72A. - No. 4. - 2005. - P.343-353; Allemann F., Mizuno S. et al. Effect of hyaluronan on engeneered articular cartilage extracellular matrix gene expression in 3-dimensional collagen scaffolds // J. Biomed. Mater. Res. - 2001. - V.55. - P.13-19; Houweling D.A., Lankhorst A.J., Gispen W.H. Collagen containing neurotrophin-3 (NT-3) attracts regrowing injured corticospinal axons in the adult rat spinal cord and promotes partial functional recovery // Exp. Neurol. - 1998. - V.153. - No. 1. - P. 49-59; Marchand R., Woerly S., Bertrand L. et al. Evaluation of two cross-linked collagen gels implanted in the transected spinal cord // Brain Res. Bull. - 1993. - V.30. - No. 3-4. - P. 415-422; Marchant R., Hiltner A., Hamlin C. et al. In vivo biocompatibility studies. 1. The cage implant system and biodegradable hydrogel // J. Biomed. Mater. Res. - 1983 .-- V.17. - P.301-325; Motoyuki S., Kazuhiro I., Akiyoshi S. et al. Long-term culture of primary rat hepatocytes with high albumin secretion using membrane-supported collagen sandwich // Cytotechnology. - 1993. - V.11. -
Гель «СфероГЕЛЬ» имеет следующие характеристики:Gel "SpheroGEL" has the following characteristics:
Разнородная система гидрогеля содержит коллаген в форме микрочастиц (~35-300 µm) в коллагеновом растворе.The heterogeneous hydrogel system contains collagen in the form of microparticles (~ 35-300 µm) in a collagen solution.
Физико-химические, механические и технологические свойства «СфероГЕЛЬ» делают этот биополимер весьма привлекательным для разработки временных каркасов для гибридных биоискусственных органов, т.к. обладает следующими свойствами (Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И. Полиоксиалканоаты - биоразрушаемые полимеры для медицины: Монография. 2-е изд., дополн. и переработ. - Красноярск, Платина, 2006. - 288 с.):The physico-chemical, mechanical and technological properties of SpheroGEL make this biopolymer very attractive for developing temporary frameworks for hybrid bio-artificial organs, as possesses the following properties (Volova T.G., Sevastyanov V.I., Shishatskaya E.I. Polyoxyalkanoates - biodegradable polymers for medicine: Monograph. 2nd ed., supplemented and processed. - Krasnoyarsk, Platinum, 2006. - 288 from.):
- многофункциональностью (выполняет одновременно функции каркаса, подложки и питательной среды для клеточных культур);- multifunctionality (simultaneously performs the functions of the frame, substrate and nutrient medium for cell cultures);
- механической прочностью и эластичностью, достаточной для хирургических манипуляций;- mechanical strength and elasticity sufficient for surgical procedures;
- биосовместимостью на белковом и клеточным уровнях;- biocompatibility at the protein and cellular levels;
- способностью стимулировать пролиферацию и дифференцировку клеток;- the ability to stimulate cell proliferation and differentiation;
- пористостью (размер микропор 100-400 мкм), обеспечивающей процессы неоваскуляризации;- porosity (micropore size 100-400 microns), providing neovascularization processes;
- возможностью стерилизации стандартными способами без изменения их медико-технических свойств;- the possibility of sterilization by standard methods without changing their medical and technical properties;
- способностью к биодеградации (от 3-4 недель до 6-9 месяцев).- ability to biodegradation (from 3-4 weeks to 6-9 months).
Используемые гели были в шприце одноразового использования объемом 2,0 мл, которые были помещены в двойную хирургическую стерильную упаковку. Изделие «СТЕРИЛЬНО» (стерилизуется радиационным методом).The gels used were in a 2.0 ml single-use syringe that was placed in a double surgical sterile packaging. The product is "STERILE" (sterilized by the radiation method).
4) Трансплантация гетерогенного биосовместимого биодеградируемого геля, с иммобилизированными аллогенными клетками печени и прогениторными клетками костного мозга в организм.4) Transplantation of a heterogeneous biocompatible biodegradable gel, with immobilized allogeneic liver cells and bone marrow progenitor cells into the body.
Трансплантацию гетерогенных гелей с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными прогениторными клетками костного мозга осуществляют пациентам с печеночной недостаточностью в паренхиму печени и/или в брыжейку тонкой кишки. Для чего использовали гель с иммобилизированными клетками, которые хранились в шприце. Причем при трансплантации в паренхиму печени осуществляют, по меньшей мере, одну инъекцию геля с иммобилизированными на нем клетками. При трансплантации в брыжейку тонкой кишки осуществляют, по меньшей мере, одну инъекцию геля с иммобилизированными на нем клетками. При трансплантации в паренхиму печени и брыжейку тонкой кишки осуществляют соответственно, по меньшей мере, по одной инъекции геля с иммобилизированными на нем клетками в каждую из указанных областей.Transplantation of heterogeneous gels with immobilized allogeneic liver cells and allogeneic bone marrow progenitor cells is performed in patients with hepatic insufficiency in the liver parenchyma and / or small intestine mesentery. What was used gel with immobilized cells that were stored in a syringe. Moreover, at transplantation into the liver parenchyma, at least one injection of a gel with cells immobilized on it is carried out. During transplantation into the mesentery of the small intestine, at least one injection of a gel with cells immobilized on it is carried out. When transplanting into the liver parenchyma and mesentery of the small intestine, respectively, at least one gel injection with cells immobilized on it is carried out in each of these areas.
5) Использование антикоагулянтов и антиагрегантов.5) The use of anticoagulants and antiplatelet agents.
После трансплантации гетерогенных биосовместимых биодеградируемых гелей с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными прогениторными клетками костного мозга пациентам назначают антикоагулянты в профилактической дозе, например: гепарин 5000 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты, например трентал, из расчета 45 мг/м2 поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.After transplantation of heterogeneous biocompatible biodegradable gels with immobilized allogeneic liver cells and allogeneic bone marrow progenitor cells, patients are prescribed anticoagulants in a prophylactic dose, for example:
6) Использование иммуносупрессантов.6) The use of immunosuppressants.
После трансплантации гетерогенных биосовместимых биодеградируемых гелей с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными прогениторными клетками костного мозга пациентам назначают иммуносупрессанты в профилактической дозе, например: хорионический гонадотропин 500-5000 ME 1 раз в сутки в течение 30-90 дней.After transplantation of heterogeneous biocompatible biodegradable gels with immobilized allogeneic liver cells and allogeneic bone marrow progenitor cells, immunosuppressants are prescribed to patients in a prophylactic dose, for example: chorionic gonadotropin 500-5000 ME once a day for 30-90 days.
Предложенный трансплантат для лечения печеночной недостаточности состоит из гетерогенного биосовместимого биодеградируемого геля и посаженых на него аллогенных прогениторных клеток костного мозга и аллогенных клеток печени.The proposed transplant for the treatment of liver failure consists of a heterogeneous biocompatible biodegradable gel and allogeneic bone marrow progenitor cells and allogeneic liver cells placed on it.
Для доказательства возможности достижения заявленных назначений и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.To prove the possibility of achieving the declared appointments and achieving the specified technical result, we present the following data.
Пример осуществления предлагаемого способа с использованием предлагаемого трансплантата в эксперименте.An example implementation of the proposed method using the proposed graft in the experiment.
Моделирование хронической печеночной недостаточности у животных (крысы) осуществляли по признанной и адекватной модели (Фишер А. Физиология и экспериментальная патология печени // А.Фишер. - Будапешт, 1961, - 230 с.; Колпащикова И.Ф. Влияние трансплантации клеток тимуса, костного мозга и селезенки на восстановительные процессы в патологически измененной печени // Бюл. эксперим. биол. и мед., - 1979, №10. - С.477-480; Колпащикова И.Ф. Общие и местные изменения в организме при экспериментальном повреждении печени и ее регенерация // Автореф. докт. дисс. - 1982, Казань. - 41 с.) путем введения 60%-ного раствора CCL4, первое введение 0,5 мл на 100 г массы, последующие по 0,3 мл на 100 г массы тела. Курс введения 6 недель с частотой - 2 введения в неделю.Modeling of chronic liver failure in animals (rats) was carried out according to a recognized and adequate model (Fisher A. Physiology and experimental liver pathology // A. Fisher. - Budapest, 1961, - 230 s .; Kolpashchikova IF, Effect of thymus cell transplantation, bone marrow and spleen for restoration processes in a pathologically altered liver // Bull. experimental biol. and honey., 1979, No. 10. - P.477-480; Kolpashchikova IF General and local changes in the body during experimental damage liver and its regeneration // Author. Doctoral diss. - 1982, Kaz Hb -. 41) by introducing a 60% solution of CCL 4, the first administration of 0.5 ml per 100 g of body weight, further 0.3 ml per 100 g body weight.. The course of administration is 6 weeks with a frequency of 2 injections per week.
Моделирование острой печеночной недостаточности у животных (собаки) осуществляли путем резекции 45-50% ткани печени, также являющейся признанной и адекватной моделью острой печеночной недостаточности (Demetriou A., Reisher A., Sanchez J. Et al. Transplantation of microcarrier-attached hepatocytes into 90% partially hepatomized rats // Hepatology. - 1988. - Vol.8. - P.1006-1009; Чикотеев С.П., Плеханов А.Н. Печеночная недостаточность // в кн. Печеночная недостаточность. Иркутск. - 2002. - 260 с.; Michalopoulos G.K. Liver regeneration: Molecular mechanisms of growth control // FASEB J. - 1990. - Vol.l04. - P.176; Bowling WM, Kennedy SC, Cai SR, Duncan JR, Gao C, Flye MW. Portal branch occlusion safely facilitates in vivo retroviral vector transduction of rat liver // Hum. Gen. Ther. - 1996 - vol.7(17). - p.2113-2121).Modeling of acute liver failure in animals (dogs) was carried out by resection of 45-50% of liver tissue, which is also a recognized and adequate model of acute liver failure (Demetriou A., Reisher A., Sanchez J. Et al. Transplantation of microcarrier-attached hepatocytes into 90% partially hepatomized rats // Hepatology. - 1988. - Vol.8. - P.1006-1009; Chikoteev SP, Plekhanov AN Liver failure // in the book Liver failure. Irkutsk. - 2002. - 260 p .; Michalopoulos GK Liver regeneration: Molecular mechanisms of growth control // FASEB J. - 1990. - Vol.l04. - P.176; Bowling WM, Kennedy SC, Cai SR, Duncan JR, Gao C, Flye MW .Portal branch occlusion safely facilitates in vivo retroviral vector tra nsduction of rat liver // Hum. Gen. Ther. - 1996 - vol. 7 (17). - p. 213-2121).
1) Осуществляли по традиционной методике выделение аллогенных прогениторных клеток костного мозга.1) Allogenic progenitor cells of the bone marrow were isolated by a traditional technique.
Получали клеточный аспират из костномозгового канала большеберцовых костей (крысы) или плечевых костей (собаки) путем промывания полости фосфатно-буферным раствором, содержащим 50 ед/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина с помощью иглы 18G, насаженной на шприц. Суспензию клеток центрифугировали, осадок клеток ресуспендировали в лизирующем растворе при комнатной температуре в течение 3 мин и снова центрифугировали 3-5 мин при 1500 об/мин. Гемолизированный супернатант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок, содержащий прогениторные клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде. Интерфазу с мононуклеарными клетками собирали с поверхности эритроидного осадка и ресуспендировали в лизирующем растворе, в соотношении 1:4, в течение 5-8 мин и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный супернатант полностью удаляли. Добивались полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводили дважды или трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, в количестве 60-150×106 клеток объединяли с осадком клеток, полученным из плазмы, и далее ресуспендировали в ростовой среде для стимуляции роста клеток.A cell aspirate was obtained from the medullary canal of the tibia (rat) or the humerus (dog) by washing the cavity with a phosphate-buffered solution containing 50 units / ml of heparin and 0.25 mg / l of gentamicin using an 18G needle attached to a syringe. The cell suspension was centrifuged, the cell pellet was resuspended in a lysis solution at room temperature for 3 minutes, and again centrifuged for 3-5 minutes at 1500 rpm. The hemolyzed supernatant was completely removed by suction, and the cell pellet containing bone marrow progenitor cells was resuspended in growth medium. Interphase with mononuclear cells was collected from the surface of the erythroid sediment and resuspended in a lysis solution, in the ratio 1: 4, for 5-8 minutes and centrifuged for 5 minutes at 1500 rpm at room temperature. The hemolyzed supernatant was completely removed. A complete lysis of erythrocytes was achieved, for which the lysis procedure was carried out twice or thrice, followed by washing the cells by centrifugation. The cell pellet, free of erythroid and platelet forms, in the amount of 60-150 × 10 6 cells was combined with a cell pellet obtained from plasma, and then resuspended in growth medium to stimulate cell growth.
2) Выделение аллогенных клеток печени осуществляли по традиционной методике.2) Isolation of allogeneic liver cells was carried out according to the traditional method.
Выделение аллогенных клеток печени из резецированного участка печени (4×4×2 см у собак и 1×1×0,5 см у крыс) производилось путем 3-кратной отмывки от крови и измельчения его на холоде (t=4°С), с 3-кратной отмывкой образовавшейся взвеси буферным раствором без кальция в течение 7 минут. После этого мелкие кусочки печени были проинкубированы 3 раза раствором коллагеназы в течение 6-8 минут с последующей заменой ферментного раствора с использованием центрифугирования 500 об/мин в течение 1 минуты при t=37°C. Полученный материал переносился на сито с ячейками 200 мкм и фильтровался промыванием питательной средой William's E с 10% фетальной бычьей сыворотки, после чего суспензию клеток центрифугировали при 500 об/мин при 4°С в течение 1 минуты. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в такой же свежей среде и опять центрифугировали. Процедуру повторяли 3 раза. Жизнеспособность клеток, колебавшаяся в пределах от 83 до 95% оценивали методом окрашивания трипановым синим. Количество клеток колебалось в пределах от 3,0×108 до 4,0×108 гепатоцитов на 15 г веса ткани печени. Клеточная суспензия содержала: гепатоциты ~95÷98%, и ~5÷2% непаренхиматозных клеток печени, которые были определены при световой микроскопии. Разделение паренхиматозных и непаренхиматозных клеток не выполнялось. Взвесь клеток печени концентрировали в 1-2 мл физиологического раствора.Allogeneic liver cells were isolated from the resected liver area (4 × 4 × 2 cm in dogs and 1 × 1 × 0.5 cm in rats) by washing 3 times from blood and grinding it in the cold (t = 4 ° С), with 3-fold washing of the resulting suspension with a buffer solution without calcium for 7 minutes. After that, small pieces of the liver were incubated 3 times with a collagenase solution for 6-8 minutes, followed by replacement of the enzyme solution using centrifugation at 500 rpm for 1 minute at t = 37 ° C. The resulting material was transferred to a sieve with 200 μm cells and filtered by washing with William's E nutrient medium with 10% fetal bovine serum, after which the cell suspension was centrifuged at 500 rpm at 4 ° C for 1 minute. The supernatant was removed, the pellet was resuspended in the same fresh medium and centrifuged again. The procedure was repeated 3 times. Cell viability, ranging from 83 to 95%, was evaluated by trypan blue staining. The number of cells ranged from 3.0 × 10 8 to 4.0 × 10 8 hepatocytes per 15 g of liver tissue weight. The cell suspension contained: hepatocytes ~ 95 ÷ 98%, and ~ 5 ÷ 2% non-parenchymal liver cells, which were determined by light microscopy. Separation of parenchymal and non-parenchymal cells was not performed. A suspension of liver cells was concentrated in 1-2 ml of saline.
3) Посадка (иммобилизация) аллогенных клеток печени и аллогенных клеток костного мозга на гетерогенный гель.3) Landing (immobilization) of allogeneic liver cells and allogeneic bone marrow cells on a heterogeneous gel.
Посадку (иммобилизацию) аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга на гель также осуществляли по традиционной методике.Landing (immobilization) of allogeneic liver cells and bone marrow progenitor cells on a gel was also carried out by a traditional method.
В качестве гетерогенного геля может быть использован, например, биоматериал «СфероГЕЛЬ», изготовленный на основе коллагена сельскохозяйственных животных (70%) и коллагенсодержащего экстракта (30%), имеющего вид плотного желеобразного вещества. С размерами пор ~100-400 µм, временем полной резорбции ~ от 3-4 недель до 6-9 месяцев.As a heterogeneous gel, for example, the SphereGEL biomaterial made on the basis of farm animal collagen (70%) and collagen-containing extract (30%), which has the form of a dense jelly-like substance, can be used. With pore sizes of ~ 100-400 μm, a complete resorption time of ~ 3-4 weeks to 6-9 months.
Аллогенные клетки печени и аллогенные прогениторные клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде [William's E с заменой аргинина на орнитин, с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулиноподобного фактора роста-I, аскорбиновой кислоты, линолеивой и линоливой жирных кислот] в концентрации 2,0-4,0×106 клеток печени/мл и 2,0-4,0×106 прогениторных клеток клеток костного мозга/мл. Суммарную клеточную суспензию в концентрации 2×106-15×106 на 1 см3 аккуратно смешивали с гетерогенным гелем в соотношении 1:1, до равномерной консистенции, набирали в шприц и хранили до введения в печень и/или брыжейку при 4°С не более 5 часов.Allogeneic liver cells and allogeneic bone marrow progenitor cells were resuspended in growth medium [William's E with the replacement of arginine with ornithine, supplemented with fetal bovine serum, hepatocyte growth factor, epidermal growth factor, cholera toxin β-subunit, dexamezatone, ethanolamine, sodium selenite, glucose , insulin, insulin-like growth factor-I, ascorbic acid, linoleic and linoleic fatty acids] at a concentration of 2.0-4.0 × 10 6 liver cells / ml and 2.0-4.0 × 10 6 progenitor cells of bone marrow cells / ml The total cell suspension at a concentration of 2 × 10 6 -15 × 10 6 per 1 cm 3 was carefully mixed with a heterogeneous gel in a ratio of 1: 1, until a uniform consistency, filled into a syringe and stored until introduction into the liver and / or mesentery at 4 ° C no more than 5 hours.
4) Трансплантацию гелей с иммобилизированными аллогенными клетками печени и прогениторными клетками костного мозга в организм животным:4) Transplantation of gels with immobilized allogeneic liver cells and progenitor cells of the bone marrow into the body of an animal:
A) собакам осуществляли в паренхиму печени на 3-4 сутки после моделирования печеночной недостаточности путем резекции 50% ткани печени;A) dogs were injected into the liver parenchyma 3-4 days after modeling liver failure by resection of 50% of the liver tissue;
Б) собакам осуществляли в брыжейку тонкой кишки на 3-4 сутки после моделирования печеночной недостаточности путем резекции 50% ткани печени;B) dogs were injected into the mesentery of the small intestine for 3-4 days after modeling liver failure by resection of 50% of liver tissue;
B) собакам осуществляли в паренхиму печени и в брыжейку тонкой кишки на 3-4 сутки после моделирования печеночной недостаточности путем резекции 50% ткани печени;B) the dogs were injected into the liver parenchyma and into the mesentery of the small intestine for 3-4 days after modeling liver failure by resection of 50% of the liver tissue;
Г) крысам в паренхиму печени на 42-44 сутки после моделирования хронической печеночной недостаточности путем путем введения 60%-ного раствора CCl4 (первое введение 0,5 мл на 100 г массы, последующие по 0,3 мл на 100 г массы тела частотой - 2 введения в неделю).D) rats in the liver parenchyma on days 42-44 after modeling chronic liver failure by introducing a 60% solution of CCl 4 (the first injection of 0.5 ml per 100 g of weight, followed by 0.3 ml per 100 g of body weight with a frequency - 2 introductions per week).
Перед трансплантацией животных (собаки) наркотизировали: смесью препаратов осуществляли путем внутримышечного введения смеси препаратов: Калипсол (5% 10 мг/кг), Дроперидол (1,5 мг/кг), Атропин (0,1% - 0,02 мг/кг), Димедрол 1% - 0,5 мл. После чего, в операционной, осуществляли вводный наркоз путем внутривенного введения 1% Пропофола из расчета 7 мг/кг. Операцию проводили под интубационным наркозом. Поддержание анестезии проводили 1% Пропофолом 0,5 мг/кг/ч и Калипсолом 2 мг/кг. У крыс осуществляли анестезиологическое пособие из расчета на 100 гр массы тела при этом вводили внутримышечно: Калипсол 10% - 2 мл, Ксилазин 2% - 1 мл, Атропин 0,2 мл.Before transplantation, animals (dogs) were anesthetized: a mixture of drugs was administered by intramuscular injection of a mixture of drugs: Calipsol (5% 10 mg / kg), Droperidol (1.5 mg / kg), Atropine (0.1% - 0.02 mg / kg ), Diphenhydramine 1% - 0.5 ml. Then, in the operating room, introductory anesthesia was carried out by intravenous administration of 1% Propofol at the rate of 7 mg / kg. The operation was performed under intubation anesthesia. Maintenance of anesthesia was carried out with 1% Propofol 0.5 mg / kg / h and
Суммарный клеточный материал, содержащий аллогенные клетки печени и костного мозга в концентрации 2×106-15×106 на см3 и соотношении 1:1, иммобилизированные на гетерогенном геле СферооГЕЛЬ, трансплантировали в паренхиму печени и/или в брыжейку тонкой кишки животных.The total cellular material containing allogeneic cells of the liver and bone marrow at a concentration of 2 × 10 6 -15 × 10 6 per cm 3 and a ratio of 1: 1, immobilized on a heterogeneous SpheroGEL gel, was transplanted into the liver parenchyma and / or animal mesentery.
Брюшную полость ушивали послойно наглухо. Для профилактики инфекционных осложнений интраоперационно животным назначали внутривенно Офлоксацин - 40 мл; Метронидазол - 30 мл; Дитилин 5% - 20 мг/кг/ч. Проводили контроль показателей биохимии, коагулограммы, общего анализа крови на 1, 3, 9, 14, 18 сутки после операции.The abdominal cavity was sutured in layers tightly. For the prevention of infectious complications intraoperatively, animals were prescribed intravenously Ofloxacin - 40 ml; Metronidazole - 30 ml;
5) Использование антикоагулянтов и антиагрерантов.5) The use of anticoagulants and antiplatelet agents.
В частном случае для профилактики клеточной инфильтрации трансплантата клетками крови сразу после трансплантации геля с иммобилизированными аллогенными клетками печени и аллогенными прогениторными клетками костного мозга ежедневно назначали антикоагулянты в профилактической дозе, например: гепарин 2500 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты, например трентал, из расчета 45 мг/м2 поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.In a particular case, for the prevention of cell transplant infiltration with blood cells immediately after gel transplantation with immobilized allogeneic liver cells and allogeneic bone marrow progenitor cells, anticoagulants were prescribed daily in a prophylactic dose, for example: heparin 2500 ME every 12 hours for 7-10 days under the control of the coagulation system blood and antiplatelet agents, such as trental, at the rate of 45 mg / m 2 body surface every 12 hours for 30-90 days.
6) Использование иммуносупрессантов.6) The use of immunosuppressants.
В частном случае для профилактики отторжения сразу после трансплантации геля с иммобилизированными аллогенными клетками печени и алогенными прогениторными клетками костного мозга ежедневно назначали иммуносупрессанты в профилактической дозе, например: хорионический гонадотропин 500-5000 МЕ 1 раз в сутки в течение 30-90 дней.In a particular case, to prevent rejection immediately after transplantation of a gel with immobilized allogeneic liver cells and halogen progenitor bone marrow cells, immunosuppressants were prescribed daily in a prophylactic dose, for example: chorionic gonadotropin 500-5000 IU once a day for 30-90 days.
Всего нами проведено 19 экспериментов, при этом коррекция острой печеночной недостаточности по предложенному способу была проведена в 3 экспериментах и хронической печеночной недостаточности - в 16 экспериментах.In total, we conducted 19 experiments, while the correction of acute liver failure by the proposed method was carried out in 3 experiments and chronic liver failure in 16 experiments.
На фиг.1 представлена динамика синтетической функции печени (фибриноген) при острой печеночной недостаточности. Проведенные исследования показали, что после резекции 50% печени минимальная синтетическая функция печени отмечалась в период первых 3 дней после резекции. По сравнению с исходом показатели фибриногена уменьшились в 2,4 раза, что указывает на значительные функциональные нарушения печеночных клеток. После чего отмечается постепенное возвращение этих показателей к исходным 18 суткам после моделирования печеночной недостаточности. В эксперименте после трансплантации гетерогенного геля с посаженными на него аллогенными прогениторными клетками костного мозга и аллогенными клетками печени по предложенному способу динамика синтетической функции печени была сходной с контрольной группой. Однако с момента трансплантации (3 сутки после моделирования печеночной недостаточности) аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, посаженных на гетерогенный гель, отмечается более быстрое восстановление до исходных показателей синтетической функции печени, например к 5 суткам трансплантации этот показатель был меньше исходных на 6,1%, а в контрольной группе на 37,6%.Figure 1 presents the dynamics of the synthetic function of the liver (fibrinogen) in acute liver failure. Studies have shown that after resection of 50% of the liver, the minimum synthetic function of the liver was observed during the first 3 days after resection. Compared to the outcome, fibrinogen counts decreased by 2.4 times, which indicates significant functional impairment of liver cells. After which there is a gradual return of these indicators to the initial 18 days after modeling liver failure. In the experiment, after transplantation of a heterogeneous gel with allogeneic bone marrow progenitor cells and allogeneic liver cells placed on it according to the proposed method, the dynamics of the synthetic function of the liver was similar to the control group. However, from the moment of transplantation (3 days after modeling liver failure) of allogeneic liver cells and progenitor cells of the bone marrow planted on a heterogeneous gel, there is a more rapid recovery to the initial indicators of the synthetic function of the liver, for example, by 5 days of transplantation this indicator was less than the initial by 6, 1%, and in the control group by 37.6%.
На фиг.2 представлена динамика синтетической функции печени (АЧТВ) при острой печеночной недостаточности. Проведенные исследования показали, что после резекции 50% печени синтетическая функция печени на 1 день после резекции снизилась, что проявилось в виде увеличения АЧТВ на 41%. По сравнению с исходом на 3 день после резекции показатели АЧТВ увеличились в 1,4 раза, что указывает на значительные функциональные нарушения печеночных клеток. После чего отмечается постепенное (причем в исследуемой группе, практически к 5 суткам после трансплантации) возвращение этих показателей к исходным, а в контрольной группе на исследуемом сроке (18 дней после операции) этот показатель (АЧТВ) так и не достиг исходного. Это произошло только к 28-32 суткам после операции.Figure 2 presents the dynamics of the synthetic function of the liver (APTT) in acute liver failure. Studies have shown that after resection of 50% of the liver, synthetic liver function decreased 1 day after resection, which was manifested as an increase in APTT by 41%. Compared with the outcome on the 3rd day after resection, the APTT values increased 1.4 times, which indicates significant functional impairment of the liver cells. After which a gradual (and in the study group, almost 5 days after transplantation) return of these parameters to the initial ones is noted, and in the control group at the study period (18 days after surgery) this parameter (APTT) did not reach the initial one. This happened only to 28-32 days after surgery.
Из представленных данных следует, что до момента трансплантации аллогенных клеток печени и прогениторных клеток костного мозга, посаженных на гетерогенный гель, динамика показателей, характеризующих синтетическую функцию печени, была сходной в обеих группах (контрольная, эксперимент), однако в исследуемой группе (эксперимент) восстановление синтетической функции печени (по протромбиновому индексу т AT III) происходило быстрее, и эти показатели были более приближены к исходным.From the presented data it follows that until the transplantation of allogeneic liver cells and progenitor cells of the bone marrow planted on a heterogeneous gel, the dynamics of indicators characterizing the synthetic function of the liver was similar in both groups (control, experiment), however, in the study group (experiment), recovery the synthetic function of the liver (according to the prothrombin index t AT III) was faster, and these indicators were more close to the original.
На фиг.3 через 90 дней в контрольной группе (без лечения по предложенному способу) выявлено формирование фиброзной ткани в области гетерогенного геля (1), лимфоидно-клеточная инфильтрация (2), полнокровие мелких сосудов (3). Окр. по Массону, ув. 400.Figure 3 after 90 days in the control group (without treatment by the proposed method) revealed the formation of fibrous tissue in the area of a heterogeneous gel (1), lymphoid cell infiltration (2), plethora of small vessels (3). Okr. according to Masson, SW. 400.
На фиг.4 через 180 дней в контрольной группе (без лечения по предложенному способу) выявлена лимфоидно-клеточная воспалительная инфильтрация (4) и фиброзная ткань (5). Окр. по Массону, ув. 200.4 after 180 days in the control group (without treatment by the proposed method) revealed lymphoid cell inflammatory infiltration (4) and fibrous tissue (5). Okr. according to Masson, SW. 200.
На фиг.5 через 90 дней в контрольной группе (с лечением по предложенному способу) выявлена значительно менее выраженная воспалительная реакция на гетерогенный гель, определяются пролиферирующие гепатоциты (6). Окр. Гематоксилин-эозин, ув. 200.In Fig. 5, after 90 days in the control group (with treatment according to the proposed method), a significantly less pronounced inflammatory reaction to a heterogeneous gel was detected, proliferating hepatocytes were determined (6). Okr. Hematoxylin-eosin, SW. 200.
На фиг.6 через 180 дней в контрольной группе (с лечением по предложенному способу) выявлены жизнеспособные пролиферирующие гепатоциты (7). Окр. Гематоксилин-эозин, ув. 400.In Fig.6 after 180 days in the control group (with treatment by the proposed method) revealed viable proliferating hepatocytes (7). Okr. Hematoxylin-eosin, SW. 400.
Во всех случаях был достигнут желаемый результат, а именно была получена и адекватно корригирована печеночная недостаточность. Способ позволяет улучшить результаты лечения печеночной недостаточности путем обеспечения изолированными аллогенными гепатоцитами детоксикационной и биорегуляторной функций, пролонгирования сроков их выживания с активизацией пролиферации за счет совместного интракорпорального введения с аллогенными прогениторными клетками костного мозга, создания каркаса для размещения в пространстве ассоциаций образующихся клеток, создания условий для прорастания в этот каркас сосудов, диффузии питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки из крови сосудов печени и/или сосудов брыжейки, проросших в каркас, к иммобилизованным печеночным клеткам и клеткам костного мозга; обеспечивает профилактику осложнений, связанных с использованием трансплантата с клетками. Кроме того, использование иммуносупрессивной терапии позволяет избегать отторжения, способствует длительной их жизнеспособности, что в свою очередь позволяет поддерживать гомеостаз.In all cases, the desired result was achieved, namely, liver failure was obtained and adequately corrected. The method allows to improve the results of treatment of liver failure by providing detoxification and bioregulatory functions by isolated allogeneic hepatocytes, prolonging their survival with activation of proliferation due to joint intracorporeal administration with allogeneic progenitor bone marrow cells, creating a skeleton for placement in the space of associations of formed cells, creating conditions for germination into this vessel frame, diffusion of nutrients, oxygen and tissue factors differentiation from blood vessels of the liver and / or vessels of the mesentery sprouted into the skeleton, to immobilized liver cells and bone marrow cells; provides prevention of complications associated with the use of a graft with cells. In addition, the use of immunosuppressive therapy avoids rejection, contributes to their long viability, which in turn allows you to maintain homeostasis.
Таким образом, приведенные данные четко свидетельствуют о том, что коррекция печеночной недостаточности происходит значительно быстрее и адекватнее при применении предлагаемого способа коррекции печеночной недостаточности. Кроме того, нами доказано длительное выживание клеток печени и появление вновь образованных сосудов в устройстве спустя 90 и 180 дней после трансплантации животному гетерогенного геля с аллогенными клетками печени и аллогенными прогениторными клетками костного мозга.Thus, the above data clearly indicate that the correction of liver failure occurs much faster and more adequately when using the proposed method for the correction of liver failure. In addition, we have proved the long-term survival of liver cells and the appearance of newly formed vessels in the device 90 and 180 days after transplantation of a heterogeneous gel animal with allogeneic liver cells and allogeneic bone marrow progenitor cells.
Учитывая вышеизложенное, экстраполяция результатов проведенных экспериментов в клинику правомерна, предложенный метод и трансплантат, обеспечивая пролонгирование жезнедеятельности изолированных гепатоцитов, могут быть использованы для коррекции печеночной недостаточности.Given the above, extrapolating the results of the experiments to the clinic is legitimate, the proposed method and transplant, providing prolongation of the malfunctioning of isolated hepatocytes, can be used to correct liver failure.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010110063/14A RU2425646C1 (en) | 2010-03-18 | 2010-03-18 | Method and transplant for treatment of liver failure |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010110063/14A RU2425646C1 (en) | 2010-03-18 | 2010-03-18 | Method and transplant for treatment of liver failure |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2425646C1 true RU2425646C1 (en) | 2011-08-10 |
Family
ID=44754428
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010110063/14A RU2425646C1 (en) | 2010-03-18 | 2010-03-18 | Method and transplant for treatment of liver failure |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2425646C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2513593C2 (en) * | 2012-06-19 | 2014-04-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Bioartificial system |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2299073C1 (en) * | 2005-11-11 | 2007-05-20 | ЗАО "РеМеТэкс" | Biotransplant and method for treating chronic cardiac failure (variants) |
| RU2301677C1 (en) * | 2005-12-09 | 2007-06-27 | ЗАО "РеМеТэкс" | Biotransplant for treatment of degenerative and traumatic disease of cartilage tissue and method for its preparing |
| RU2368384C2 (en) * | 2007-08-24 | 2009-09-27 | Федеральное государственное учреждение "Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Biotransplant, treatment method of chronic liver diseases and treatment method of liver cirrhosis and portal hypertension |
-
2010
- 2010-03-18 RU RU2010110063/14A patent/RU2425646C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2299073C1 (en) * | 2005-11-11 | 2007-05-20 | ЗАО "РеМеТэкс" | Biotransplant and method for treating chronic cardiac failure (variants) |
| RU2301677C1 (en) * | 2005-12-09 | 2007-06-27 | ЗАО "РеМеТэкс" | Biotransplant for treatment of degenerative and traumatic disease of cartilage tissue and method for its preparing |
| RU2368384C2 (en) * | 2007-08-24 | 2009-09-27 | Федеральное государственное учреждение "Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Biotransplant, treatment method of chronic liver diseases and treatment method of liver cirrhosis and portal hypertension |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ВОЛОВА Т.Г. Материалы для медицины, клеточной и тканевой инженерии. - Красноярск: ИПК СФУ, 2009, с.148, 149, 228, 229, 235-237. TOKAI Н. et al. Efficacy and limitation of bone marrow transplantation in the treatment of acute and subacute liver failure in rats. Hepatol Res. 2009 Nov; 39(11):1137-43. Epub 2009 Jul 10 (Abstract). * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2513593C2 (en) * | 2012-06-19 | 2014-04-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Bioartificial system |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yao et al. | Biomimetic injectable HUVEC‐adipocytes/collagen/alginate microsphere co‐cultures for adipose tissue engineering | |
| RU2425645C1 (en) | Method and transplant for treatment of liver failure | |
| RU2539918C1 (en) | Method for preparing tissue-specific matrix for tissue engineering of parenchymal organ | |
| CN110306289A (en) | A nanofiber electrospun membrane containing axitinib and its preparation method and application | |
| RU2425646C1 (en) | Method and transplant for treatment of liver failure | |
| RU2586952C1 (en) | Method of treating hepatic failure | |
| RU2425648C1 (en) | Method and transplant for treatment of liver failure | |
| KR101952762B1 (en) | A microencapsulated composition combine with collagen and alginate for encapsulating stem cells and a method thereof | |
| RU2425647C1 (en) | Method and transplant for treatment of liver failure | |
| JF Patzer et al. | Clinical safety evaluation of excorp medical, inc. Bioartificial liver support system (BLSS) | |
| RU137198U1 (en) | CELLULAR IMPLANT FOR TREATMENT OF LIVER DISEASES AND Pancreas | |
| NL2035750B1 (en) | Glycogen for supporting tissue viability | |
| RU2819284C2 (en) | Method of producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects of subject | |
| RU2618989C1 (en) | Treatment method of live failure | |
| KR20050120712A (en) | Cellular preparation | |
| RU2744732C1 (en) | Biocomposite spheroid for bone repair and method of its preparation | |
| RU2818176C1 (en) | Method for producing tissue-engineered periosteum from cell spheroids for repairing bone defects in patients | |
| RU2335538C2 (en) | Organization of cells similar to tissue and macroscopical designs similar to tissue obtained by means of culture of macromass of cells and method of macromass culture | |
| Sodian et al. | Application of stereolithography for scaffold fabrication for tissue engineering of heart valves | |
| Koball et al. | REMOVAL OF ALBUMIN BOUND TOXINS WITH THE MARSSYSTEM SHOWS PROTECTIVE EFFECTS ON HEPATOCYTES | |
| Livingston et al. | Osteogenic activity of human mesenchymal stem cells in vivo on calcium phosphate ceramics | |
| Donini et al. | TEMPORARY NEUROLOGICAL IMPROVEMENT AFTER BIOARTIFICIAL LIVER TREATMENT FOR ACUTE ON CHRONIC LIVER FAILURE | |
| Peszynski et al. | Removal of Albumin Bound Drugs in Albumin Dialysis (Mars)-a New Liver Support System | |
| Jockenhoevel et al. | TISSUE ENGINEERING: EVALUTATION OF DIFFERENT BIODEGRADABLE SCAFFOLDS | |
| CN119868659A (en) | Artificial remodelling large omentum |