RU2425882C1 - Способ создания трансгенных линий клеток млекопитающего со стабильным и высоким уровнем экспрессии трансгенного белка - Google Patents
Способ создания трансгенных линий клеток млекопитающего со стабильным и высоким уровнем экспрессии трансгенного белка Download PDFInfo
- Publication number
- RU2425882C1 RU2425882C1 RU2009141231/10A RU2009141231A RU2425882C1 RU 2425882 C1 RU2425882 C1 RU 2425882C1 RU 2009141231/10 A RU2009141231/10 A RU 2009141231/10A RU 2009141231 A RU2009141231 A RU 2009141231A RU 2425882 C1 RU2425882 C1 RU 2425882C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- transgene
- pegfp
- expression
- cells
- gene
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 40
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title abstract 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 title description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims abstract description 14
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 22
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 9
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 3
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 3
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 102000008297 Nuclear Matrix-Associated Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010035916 Nuclear Matrix-Associated Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000000299 nuclear matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000055157 Complement C1 Inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 108700040183 Complement C1 Inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 101000757319 Homo sapiens Antithrombin-III Proteins 0.000 description 1
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229940126587 biotherapeutics Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000052834 human SERPINC1 Human genes 0.000 description 1
- 229960004336 human antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108091035233 repetitive DNA sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000053632 repetitive DNA sequence Human genes 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Клетки млекопитающего трансформируют экспрессирующим вектором, содержащим репортерный ген, цитомегаловирусный промотор и терминатор транскрипции, встраиваемый выше последовательности цитомегаловирусного промотора. Способ может быть использован для получения культур клеток млекопитающих с высоким и стабильным уровнем наработки целевого белка для крупномасштабного получения рекомбинантных белков, которые могут быть использованы в медицинских и исследовательских целях. 1 ил., 2 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к методам производства в биореакторах, основанных на культурах клеток и животных высших эукариот, лекарственных препаратов и биологических добавок нового поколения, таких как антитела и сложные белковые молекулы.
В биотехнологической промышленности все больше лекарственных препаратов и биологических добавок производятся в биореакторах, основанных на культурах клеток высших эукариот. Биореакторами для производства белков могут быть любые живые организмы - бактерии, грибы, растения, животные и клеточные культуры. В современном производстве наиболее широко используются бактерии и дрожжи, которые можно эффективно и экономично размножать в промышленных биотехнологических установках. Однако для нормального функционирования многих белков человека очень важны те изменения, которые происходят на посттрансляционном уровне: гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, карбоксилирование и некоторые другие преобразования. В настоящее время многие антитела к белкам, нарушающим правильное развитие клеток, используются для лечения болезней, связанных с такими нарушениями. Большая часть антител производится в культурах клеток. Поэтому для производства многих белков используют культуры клеток млекопитающих, в которых происходят правильные модификации белков. Однако невысокий уровень продуктивности, сложности в организации промышленного производства и высокая цена производства ограничивают распространение этого метода.
В течение последних 10 лет в качестве биореактора часто используют трансгенных животных, у которых чужой ген экспрессируется в клетках эпителия молочной железы, а его продукт секретируется в молоко. Этот ген может экспрессироваться только в молочной железе и только во время лактации, не оказывая побочных воздействий на организм трансгенного животного. Кроме этого, в молочной железе трансгенных животных выполняется большинство посттрансляционных модификаций рекомбинантных белков и происходит правильная укладка белков, необходимая для проявления их биологической активности. В настоящее время дано разрешение на производство первых двух продуктов, синтезируемых в молочной железе: человеческий антитромбин III, полученный из трансгенных коз (фирма GTC Biotherapeutics), и рекомбинантный С1 ингибитор (Pharming Group NV), продуцируемый трансгенными кроликами.
Существует несколько основных схем получения стабильных трансгенных культур клеток и трансгенных животных. Для трансформации клеток (при получении клеточных культур) или для микроинъекции ДНК в оплодотворенную яйцеклетку (при получении трансгенных животных) используют линейную ДНК, содержащую генную конструкцию. Этот метод позволяет встраивать в геном большие фрагменты ДНК, по размерам превышающие 20 т.п.н., что имеет большое значение, так как для эффективной экспрессии многих генов помимо кодирующих участков необходимо присутствие интронов и протяженных 5'- и 3'- нетранслируемых областей. Однако данный метод имеет ряд недостатков. При получении трансгенов с помощью линейной ДНК обычно наблюдаются многокопийные тандемные интеграции конструкций в геном, что приводит к формированию районов, содержащих множественные повторы конструкции. Известно, что повторяющиеся последовательности ДНК часто формируют неактивный хроматин, негативное действие которого усиливается в ряду поколений. В результате, через несколько генераций после получения исходного трансгенного животного или линии клеток, может происходить затухание экспрессии трансгенов. Одновременно формирование на повторах трансгенов зоны гетерохроматина может негативно влиять на активность хозяйских генов, расположенных рядом, что с высокой степенью вероятности будет приводить к снижению выживаемости продуцента. Снижение выживаемости является особенно значимым негативным фактором в случае использования в качестве биореактора крупных трансгенных животных, стоимость получения которых крайне высока (от 20000 $ до 300000 $) и занимает несколько лет.
В последние годы появилась новая схема получения трансгенных животных и клеточных культур с помощью ретровирусов, в первую очередь лентивирусов. Одним из преимуществ ретровирусных векторов является значительное увеличение эффективности получения трансгенных клеточных линий и животных. При использовании ретровирусных векторов наблюдаются единичные или низкокопийные интеграции в транскрибируемые или содержащие активный хроматин области генома. В результате это позитивно сказывается на уровне транскрипции трансгена. Однако, с другой стороны, низкая копийность трансгена не позволяет получать значительный уровень экспрессии. Кроме того, даже при наличии только двух-трех копий трансгена часто наблюдается эффект ко-репрессии, что приводит к постепенному метилированию ДНК и модификациям гистонов, характерных для неактивного хроматина и, как следствие, репрессии трансгена (Yao et al., 2004 [4]). Нужно отметить, что емкость ретровирусных векторов составляет всего 7-9 т.п.н., что определяется размером вирусной частицы, в которую пакуется инфекционная ДНК. Таким образом, вирусный вектор позволяет использовать преимущественно только кДНК генов, которые экспрессируются намного менее эффективно, чем гены, содержащие интроны. Кроме этого, накладываются большие ограничения на размеры регуляторных элементов, которые можно использовать для увеличения уровня экспрессии трансгена.
Исследования по усовершенствованию трансгенных векторов ведутся во многих лабораториях и фирмах мира, прежде всего в Западной Европе и США. В последнее время работы по созданию новых векторов стали активно проводиться в Китае и Индии. В Российской Федерации пока не существует развитой биотехнологической промышленности и поэтому разработки таких векторов почти не проводятся. Исключением могут являться работы по заказу от иностранных биотехнологических компаний. Несомненным является тот факт, что усовершенствование векторов может на порядки сократить затраты на создание эффективного продуцента и промышленного производства самого продукта.
Основная проблема на пути достижения эффективной экспрессии белков в культуре клеток и молочных железах млекопитающих - это неустойчивая, низкая экспрессия трансгена при его интеграции в геном реципиента. Такая репрессия является следствием негативного влияния окружающего хроматина и регуляторных элементов, что в целом можно считать следствием защитной реакции генома на интеграцию чужеродной информации, экспрессию которой надо подавить. Таким образом, крайне актуальной задачей является использование в экспрессионных векторах регуляторных элементов, способных поддерживать эффективную работу гена, кодирующего целевой белок.
С целью увеличения эффективности трансформации и повышения стабильности экспрессии трансгена с начала 90-х годов широко используются последовательности ДНК, обычно А/Т-богатые, которые, как было показано в экспериментах in vitro, взаимодействуют с фракцией ядерного матрикса (MAR, matrix attachment region). Существующая модель предполагает, что MAR, взаимодействуя с белками ядерного скелета, снижает зависимость экспрессии генов, фланкированных MAR, от негативного эффекта окружающего хроматина.
Также для защиты транскрипции трансгена от репрессии и негативного эффекта окружающего генома применяются известные инсуляторы (Recillas-Targa et al., 2004 [3]; Kwaks and Otte, 2006 [2]). Так, в компании Invitrogen был применен куриный HS4 инсулятор (1.2 т.п.н.), найденный на границе β-глобинового домена. Обычно перед геном ставят две копии HS4 инсулятора. В некоторых случаях используют комбинации известных MAR и HS4 инсулятора либо мультимеризации его коровой последовательности (500 п.н.) (Recillas-Targa et al., 2004). Такие элементы увеличивали как эффективность получения трансгенов, так и уровень экспрессии самого трансгена. Однако далеко не во всех исследованных культурах клеток и организмах HS4 инсулятор эффективно работает.
В компании Millipore-Bioprocess были разработаны регуляторные элементы из промоторов генов «домашнего хозяйства», которые должны эффективно работать на всех стадиях развития и во всех клетках организма. Было показано, что такие элементы улучшают эффективность получения трансгенных культур клеток и делают более стабильным уровень экспрессии трансгенов. Однако размер таких элементов достаточно большой и может достигать 2.5 т.п.н., что снижает эффективность их использования. Кроме того, пока не известно, насколько эффективно действуют эти элементы в различных клеточных культурах и организмах.
Наконец, с помощью оригинальной тест-системы были обнаружены элементы размером от 500 п.н. до 2000 п.н., названные STAR, которые обладали способностью блокировать распространение гетерохроматина (Kwaks et al., 2003 [1]). Однако информация о дальнейшем исследовании найденных элементов для защиты трансгенов отсутствует.
Известны методы получения трансгенов: для трансформации клеток при получении клеточных культур используют линейную ДНК, содержащую генную конструкцию. Этот метод позволяет встраивать в геном большие фрагменты ДНК, по размерам превышающие 20 т.п.н. Однако при получении трансгенов с помощью линейной ДНК происходят многокопийные тандемные интеграции конструкций в геном, что приводит к формированию районов, содержащих множественные повторы конструкции. Такие повторяющиеся последовательности ДНК часто формируют неактивный хроматин, негативное действие которого усиливается в ряду поколений. В результате, через несколько генераций после получения трансгенной линии клеток, может происходить затухание экспрессии трансгенов. Одновременно формирование зоны гетерохроматина может негативно влиять на активность генов, расположенных рядом, что с высокой степенью вероятности будет приводить к снижению выживаемости продуцента. Существует схема получения трансгенных клеточных культур с помощью лентивирусных векторов (RU 2305708, опубл. 10.09.2007). Одним из преимуществ таких векторов является значительное увеличение эффективности получения трансгенных клеточных линий и животных. Однако при их использовании происходят единичные интеграции в транскрибируемые или содержащие активный хроматин области генома. Кроме этого в промоторной области самого вектора обычно встраивают активирующие регуляторные последовательности, которые повышают уровень экспрессии трансгена. В результате это позитивно сказывается на уровне наработки гетерологичного белка. Однако, с одной стороны, низкая копийность трансгена не позволяет получать значительный выход продукта. С другой стороны, даже при начальном высоком уровне экспрессии трансгена впоследствии наблюдается эффект ко-репрессии, вызванной транскрипцией из активных областей генома через трансгенную конструкцию, встроенную в геном, что приводит к постепенной репрессии трансгена. Таким образом, основная проблема на пути достижения эффективной экспрессии белков в культуре клеток - неустойчивая, низкая экспрессия трансгена при его интеграции в геном реципиента - остается нерешенной,
Крайне актуальной задачей является использование в экспрессирующих векторах регуляторных элементов, способных поддерживать эффективную работу гена, кодирующего целевой белок. К настоящему моменту не известен универсальный регуляторный элемент, который бы эффективно работал в разнообразных клеточных культурах, с разными типами промоторов и т.д. Описанные зарубежные аналоги созданы из инсуляторных регуляторных элементов (US 5610053, опубл. 11.03.1997) либо из активаторных элементов, способствующих открытию хроматина в точке интеграции трансгена (US 6949361, опубл. 27.09.2005). Однако способность некоторых инсуляторов взаимодействовать с ядерным матриксом не нужна для создания транскрипционно независимых доменов и для формирования барьера между активным и неактивным хроматином. В то же время часто репрессионные эффекты при встройке трансгена связаны с транскрипцией, проходящей через трансген. Инсуляторы и активаторные регуляторные элементы не способны останавливать такую транскрипцию. Таким образом, использование терминаторов транскрипции в экспрессионных векторах должно помочь в защите трансгена от негативных транскрипционных эффектов генома.
Экспрессирующие конструкции, включающие в себя ген зеленого флуоресцентного белка в плазмиде pEGFP - N 1 (Clontech), промотор транскрипции CMV млекопитающего (цитомегаловирусный промотор), часто используют для трансфекции клеток млекопитающих (RU 2234530, опубл. 20.08.2004). Однако все эти плазмиды обеспечивают экспрессию репортерного гена на высоком уровне только при кратковременном культивировании, а при длительном культивировании происходит быстрое затухание экспрессии трансгена.
Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание экспрессирующих векторов для культур клеток млекопитающих, в которых для поддержания высокого и стабильного уровня наработки целевого белка будут использованы терминатороы транскрипции, обрывающие геномные траснкрипты в местах встройки трансгена в геном.
Поставленная задача решается созданием трансгенных линий клеток млекопитающего, продуцирующих белок со стабильным и высоким уровнем экспрессии, включающим трансформацию клеток млекопитающего экспрессирующим вектором, содержащим репортерный ген, цитомегаловирусный промотор и терминатор транскрипции, встраиваемые выше последовательности цитомегаловирусного промотора.
Предлагаемое изобретение может быть использовано для конструирования трансгенных конструкций, содержащих эффективно работающие регуляторные элементы, в биотехнологии, молекулярной биологии и представляет интерес для крупномасштабного получения рекомбинантных белков, которые могут быть использованы в медицинских и исследовательских целях.
Сущность описываемого изобретения поясняется чертежом, на котором представлены схемы конструкций для тестирования ДНК-элементов в культурах клеток млекопитающих, где
А - контрольная pEGFP_N1, в которой тестируемые ДНК-элементы отсутствуют;
Б - контрольная 2xIns_pEGFP, в которой выше цитомегаловирусного промотора встроен инсулятор из β-глобинового локуса кур;
В, Г - конструкции SV-40_pEGFP и β_pEGFP с ДНК-элементами - терминаторами транскрипции, встроенными выше цитомегаловирусного промотора.
Пример 1. Конструирование рекомбинантных плазмид.
В качестве репортерного гена использовался ген зеленого флуоресцентного белка EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), находящийся под контролем цитомегаловирусного промотора. Известно, что данный промотор обеспечивает высокий уровень транскрипции целевого гена в большинстве известных культур клеток млекопитающих. Перед промотором гена помещались ДНК-элементы, способные терминировать транскрипцию (терминаторы).
Для оценки эффективности применения терминаторов транскрипции для поддержания стабильного и высокого уровня наработки целевого белка использовались следующие плазмиды (см. чертеж).
А) В качестве отрицательного контроля использовался коммерческий вектор pEGFP_N1 (Clontech), содержащий ген зеленого флуоресцентного белка EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), находящийся под контролем цитомегаловирусного промотора. Данная плазмида содержит ген устойчивости к неомицину, который использовался в качестве маркерного для последующего отбора рекомбинантных клеток.
Б) Для сравнения эффективности использования терминаторов транскрипции с известными на данный момент элементами, способными поддерживать транскрипцию гена на высоком уровне, была сконструирована плазмида 2xIns_pEGFP.
Для получения данной плазмиды в вектор pEGFP_N1 по сайту рестрикции Pci I, находящемуся перед геном EGFP выше цитомегаловирусного промотора на расстоянии 640 п.н. от точки старта транскрипции, встраивалась последовательность длиной 2427 п.н., содержащая две тандемные копии инсулятора из бета-глобинового локуса курицы. Данная последовательность была получена из коммерческой плазмиды рВС 1 (Invitrogen). Этот элемент в настоящее время широко используется для повышения уровня экспрессии целевого гена, так как считается, что он обладает способностью изолировать трансген от влияния окружающих цис-регуляторных последовательностей.
В) Плазмида SV-40_pEGFP, содержащая последовательность терминатора транскрипции вируса обезьян 40 (SV-40, simian virus 40) перед геном EGFP выше цитомегаловирусного промотора, была получена путем встраивания данного фрагмента ДНК длиной 868 п.н., по сайту рестрикции Pci I.
Г) Плазмида β_pEGFP, содержащая последовательность терминатора транскрипции из β-глобинового локуса человека перед геном EGFP выше цитомегаловирусного промотора, была получена путем встраивания данного фрагмента ДНК длиной 868 п.н. по сайту рестрикции Pci I.
Пример 2. Получение трансфицированных клеточных линий.
Анализ экспрессии репортерного гена проводился на культуре клеток яичников китайского хомячка (СНО-К1), как наиболее широко применяемой в биотехнологической практике для наработки целевых белков.
Линия клеток СНО-К1 культивировалась на среде DMEM, содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 35 мг/л L-пролина, а также коммерческий антибиотик Mycokill-AB (PAA Laboratories) в рабочей концентрации. Пересев клеток производился 1 раз в 5 дней при концентрации клеток 105 клеток на 1 см2, с разведением 1:20. Клетки культивировали при температуре 37°С, в атмосфере 5%-ного СО2 и высокой влажности.
1. Трансфекция клеток.
Данная культура клеток была трансфицирована полученными рекомбинантными плазмидами. Для более эффективной интеграции трансгенной конструкции в геном плазмиды были линеаризованы при помощи рестриктазы ApaLI. Трансфекция проводилась согласно следующему протоколу.
A) Клетки в количестве 70-80% от монослоя (8*104 клеток на 1 см2) промывались культуральной средой, не содержащей сыворотки.
Б) Подготавливалась трансфекционная смесь: 3-4 мкг линеаризованной плазмидной ДНК смешивались с 375 мкл культуральной среды, не содержащей сыворотки. В отдельной пробирке с таким же количеством аналогичной среды смешивался коммерческий трансфицирующий реагент Lipofectamine 2000, количество которого определялось соотношением 3 мкл реактива на 1 мкг плазмидной ДНК. После этого полученные растворы объединялись и инкубировались при комнатной температуре в течение 30-40 минут.
B) Полученная трансфекционная смесь наслаивалась на промытые клетки.
Г) Через 4-6 часов после начала трансфекции трансфекционная смесь заменялась на культуральную среду DMEM с сывороткой.
Анализ уровня экспрессии репортерного гена оценивался по интенсивности флуоресценции на вторые сутки после трансфекции (36-48 часов) при помощи проточной цитофлуориметрии. В качестве отрицательного контроля использовались нетрансфицированные клетки линии СНО-К1.
2. Цитофлуориметрический анализ.
Для проведения цитофлуориметрического анализа клетки промывали фосфатно-солевым буфером, трипсинизировали и снимали с чашек Петри. Затем дважды отмывали от трипсина и тщательно ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере. Полученную суспензию (106 клеток в 1 мл буфера) переносили в 5 мл круглодонные пробирки.
Напряжение каналов проточного цитофлуориметра подбиралось таким образом, чтобы аутофлуоресценция нетрансфицированных клеток не учитывалась при проведении измерений. Для этого напряжение в каналах FL1 (в котором и детектируется флуоресценция eGFP) и FL2 (который использовали в качестве контрольного пустого канала) изменяли так, чтобы в процессе измерений подавляющее большинство клеток, не содержащих ген eGFP, оказалось в области, не превышающей значение «10» на логарифмической шкале, отложенной для каналов FL1 и FL2.
После проведения калибровки все образцы измерялись при постоянных значениях напряжений по каналам FL1 и FL2. Так, если в клетках детектировалась флуоресценция eGFP, на логарифмической шкале по каналу FL1 фиксировалось появление клеток в области, превышающей значение «10», и все количественные значения уровня экспрессии гена измерялись именно в этой области.
3. Поддержание пулов трансфицированных клеток.
После проведения трансфекции полученные пулы культивировались согласно описанному выше протоколу.
Для того чтобы избавиться от клеток, не содержащих трансген, производилась селекция полученных пулов трансфицированных клеток при помощи коммерческого антибиотика Geneticin (Invitrogen), вводимого в концентрации 800 мкг/мл. Так как в результате подавления транскрипционной активности трансгена наработка продукта гена устойчивости к антибиотику с течением времени снижается, после 77 суток культивирования концентрация антибиотика была постепенно снижена до 200 мкг/мл.
4. Результаты анализа временного профиля экспрессии гена EGFP в пулах трансфицированных клеток.
Для определения степени подавления трансгена в пулах клеток, трансфицированных контрольными (pEGFP_N1 и 2xIns_pEGFP) и экспериментальной (SV-40_pEGFP, β_pEGFP) конструкциями, каждые 10-14 суток при помощи проточной цитофлуориметрии производился анализ уровня экспрессии репортерного гена.
Средний уровень экспрессии гена EGFP в пуле клеток в определенный момент времени оценивался по процентному содержанию клеток, характеризующихся значением интенсивности флуоресценции больше «10» по логарифмической шкале, то есть нарабатывающих значимое количество данного белка.
Показателем эффективности использования встраиваемого перед геном ДНК-элемента для высокого уровня наработки белка служило отношение количества клеток, экспрессирующих EGFP, в пуле клеток, несущих конструкцию с данным элементом, к количеству экспрессирующих EGFP клеток с контрольной плазмидой (pEGFP_N1).
Результаты анализа временного профиля экспрессии гена EGFP в пулах трансфицированных клеток приведены в таблице 1.
| Таблица 1 | ||||||||||||
| Время культивирования, сут | 2 | 16 | 27 | 39 | 56 | 68 | 77 | 91 | 103 | 114 | 128 | |
| конструкция | 2xIns_pEGFP | 0,49 | 2,17 | 1,43 | 1,27 | 1,75 | 1,50 | 1,37 | 1,83 | 2,36 | 2,61 | 4,78 |
| SV-40_pEGFP | 0,69 | 2,24 | 1,36 | 1,42 | 1,66 | 1,22 | 1,21 | 1,78 | 1,32 | 1,99 | 3,16 | |
| β_peGFP | 0,73 | 2,86 | 1,43 | 1,74 | 1,77 | 1,39 | 1,61 | 2,56 | 1,06 | 2,13 | 5,83 | |
Результаты анализа уровня экспрессии EGFP на протяжении 128 суток культивирования тотальной популяции трансфицированных клеток (что соответствует примерно 30 пассажам) свидетельствуют о том, что использование последовательности терминатора транскрипции перед промотором целевого гена значительно повышает эффективность наработки белка в культуре клеток в ходе длительного культивирования - более чем в три раза в конце периода испытаний.
Пример 3. Получение и анализ стабильных клеточных линий.
Анализ разнородных клеточных пулов может приводить к отклонениям, связанным с тем, что трансген при липофекции многокопийно встраивается в разные участки генома, в результате чего клетки могут обладать разной жизнеспособностью, скоростью деления, устойчивостью к антибиотику и другими характеристиками, важными для эффективной экспрессии трансгена.
Поэтому на практике наработка рекомбинантных белков осуществляется путем отбора стабильных клеточных линий, полученных из одной трансфицированной клетки и, таким образом, характеризующихся однородным генотипом, что позволяет исключить влияние вышеописанных факторов и отобрать наиболее эффективный клон.
Индивидуальные клеточные клоны были получены из тотальных клеточных популяций методом лимитирующих разведений после 50 и 75 суток культивирования.
1. Получение индивидуальных клонов.
Культивируемые пулы снимались с планшетов и разводились в 10 мл культуральной среды. После этого концентрация клеток подсчитывалась при помощи камеры Гаряева и производились дополнительные разведения таким образом, чтобы концентрация клеток составляла 2-3 клетки на миллилитр среды. Полученная суспензия переносилась в 24-луночные планшеты по 1 мл на лунку.
После 2 недель культивирования на среде DMEM, содержащей антибиотик Geneticin в концентрации 800 мкг/мкл, производился цитофлуорометрический анализ выживших клонов. Дальнейшее поддержание полученных линий и анализ уровня экспрессии EGFP производились согласно методике, описанной для пулов трансфицированных клеток (см. пример 2).
2. Результаты анализа временного профиля экспрессии гена EGFP в индивидуальных клеточных клонах.
Основным количественным показателем экспрессионной активности репортерного гена в данном случае служила медиана распределения клеток по интенсивностям флуоресценции.
Исходно было получено 10 индивидуальных клонов с конструкцией pEGFP_N1, 17 индивидуальных клонов с конструкцией 2xIns_pEGFP и 10 клонов с конструкцией SV-40_pEGFP. Из них достаточно высоким уровнем экспрессии EGFP характеризовались 2 клона с конструкцией pEGFP_N1, 5 клонов с конструкцией 2xIns_pEGFP, 5 клонов с конструкцией SV-40_pEGFP и 6 клонов с конструкцией β_peGFP.
Необходимо отметить, что клоны с контрольной конструкцией исходно экспрессировали белок EGFP значительно слабее, чем клоны с конструкциями 2xIns_pEGFP, SV-40_pEGFP, β_peGFP (см. таблицу 2).
После двух с половиной месяцев культивирования уровень экспрессии EGFP в стабильных клеточных клонах с конструкциями pEGFP_N1 и 2xIns_pEGFP снизился приблизительно в 10 раз. При этом экспрессионная активность клонов, содержащих конструкции SV-40_pEGFP и β_peGFP, составила в среднем около 75% от исходной.
| Таблица 2 | ||||
| Исходная активность (медиана распределения) | Активность через два месяца культивирования (медиана распределения) | Снижение экспрессионной активности | Среднее значение | |
| pEGFP_N1 #6 | 23,71 | 2,35 | 0,1 | 0,10 |
| pEGFP_N1 #8 | 16,11 | 1,70 | 0,11 | |
| 2xIns_pEGFP #1 | 69,78 | 9,73 | 0,14 | 0,13 |
| 2xIns_pEGFP #6 | 116,52 | 3,59 | 0,03 | |
| 2xIns_pEGFP #8 | 103,66 | 16,60 | 0,16 | |
| 2xIns_pEGFP #12 | 33,08 | 5,99 | 0,18 | |
| 2xIns_pEGFP #14 | 77,74 | 10,55 | 0,14 | |
| SV-40_pEGFP #2 | 67,93 | 13,10 | 0,19 | 0,76 |
| SV-40_pEGFP #3 | 339,82 | 82,79 | 0,24 | |
| SV-40_pEGFP #4 | 50,25 | 134,45 | 2,68 | |
| SV-40_pEGFP #7 | 7,04 | 2,37 | 0,34 | |
| SV-40_pEGFP #11 | 3,31 | 1,24 | 0,37 | |
| β_pEGFP #1 | 78,44 | 15,54 | 0,2 | 1,76 |
| β_pEGFP #3 | 79,86 | 19,63 | 0,25 | |
| β_pEGFP #4 | 76,35 | 14,46 | 0,19 | |
| β_pEGFP #5 | 2,19 | 13,34 | 6,09 | |
| β_pEGFP #10 | 15,75 | 56,74 | 3,6 | |
| β_pEGFP #11 | 11,34 | 2,41 | 0,21 | |
Таким образом, последовательности терминаторов транскрипции, обрывающие геномные транскрипты и изолирующие трансген от транскрипционных сигналов, обладают способностью поддерживать уровень транскрипции трансгена на стабильно высоком уровне на протяжении достаточно долгого времени. Полученные результаты демонстрируют, что терминатор является более эффективным по сравнению с инсулятором в поддержании стабильного уровня экспрессии трансгена в клонах, что свидетельствует о возможности использования терминатора в экспрессирующих векторах для защиты трансгена от негативного влияния генома.
Источники информации
1. Kwaks Т. H.J., Bamett P., Hemrika W. et al. Identification of anti-repressor elements that confer high and stable protein production in mammalian cells. Nature Biotechnology, 2003, 21; 553-558.
2. Kwaks T.H.J. and Otte A.P. Employing epigenetics to augment the expression of therapeutic proteins in mammalian cells. Trends in Biotechnology, 2006, 24:137-142.
3. Recillas-Targa F., Valadez-Graham V., Farrell С.М. Prospects and implications of using chromatin insulators in gene therapy and transgenesis. BioEssays, 2004, 26:796-807.
4. Yao S., Sukonnik Т., Kean T., Bharadwaj R.R., Pasceri P., Ellis J. Retrovirus Silencing, Variegation, Extinction, and Memory Are Controlled by a Dynamic Interplay of Multiple Epigenetic Modifications. Mol Ther. 10:27-36.
Claims (1)
- Способ создания трансгенных линий клеток млекопитающего, продуцирующих белок со стабильным и высоким уровнем экспрессии, включающий трансформацию клеток млекопитающего экспрессирующим вектором, содержащим репортерный ген, цитомегаловирусный промотор и терминатор транскрипции, встраиваемый выше последовательности цитомегаловирусного промотора.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009141231/10A RU2425882C1 (ru) | 2009-11-10 | 2009-11-10 | Способ создания трансгенных линий клеток млекопитающего со стабильным и высоким уровнем экспрессии трансгенного белка |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009141231/10A RU2425882C1 (ru) | 2009-11-10 | 2009-11-10 | Способ создания трансгенных линий клеток млекопитающего со стабильным и высоким уровнем экспрессии трансгенного белка |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009141231A RU2009141231A (ru) | 2011-05-20 |
| RU2425882C1 true RU2425882C1 (ru) | 2011-08-10 |
Family
ID=44733317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009141231/10A RU2425882C1 (ru) | 2009-11-10 | 2009-11-10 | Способ создания трансгенных линий клеток млекопитающего со стабильным и высоким уровнем экспрессии трансгенного белка |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2425882C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2707543C2 (ru) * | 2014-05-19 | 2019-11-27 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Способ отбора долгосрочно продуцирующей клетки с применением ацилирования гистонов в качестве маркеров |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5610053A (en) * | 1993-04-07 | 1997-03-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | DNA sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from cis-acting regulatory sequences in mammalian cells |
| RU2305708C2 (ru) * | 2001-10-02 | 2007-09-10 | Энститю Клейтон Де Ля Решерш | Рекомбинантный лентивирусный вектор, клетка-хозяин, трансдуцированная лентивирусным вектором, способ ее трансдукции и применение |
-
2009
- 2009-11-10 RU RU2009141231/10A patent/RU2425882C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5610053A (en) * | 1993-04-07 | 1997-03-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | DNA sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from cis-acting regulatory sequences in mammalian cells |
| RU2305708C2 (ru) * | 2001-10-02 | 2007-09-10 | Энститю Клейтон Де Ля Решерш | Рекомбинантный лентивирусный вектор, клетка-хозяин, трансдуцированная лентивирусным вектором, способ ее трансдукции и применение |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2707543C2 (ru) * | 2014-05-19 | 2019-11-27 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Способ отбора долгосрочно продуцирующей клетки с применением ацилирования гистонов в качестве маркеров |
| US11332797B2 (en) | 2014-05-19 | 2022-05-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the selection of a long-term producing cell using histone acylation as markers |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009141231A (ru) | 2011-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4550115B2 (ja) | ＣｐＧ含量を変化させることにより遺伝子発現を調整する方法 | |
| US8809045B2 (en) | Human artificial chromosome (HAC) vector and human cell medicine comprising same | |
| CN114174520A (zh) | 用于选择性基因调节的组合物和方法 | |
| JP5835636B2 (ja) | 抗体高生産性細胞の樹立のための発現ベクター及び抗体高生産性細胞 | |
| JP6956416B2 (ja) | トランスポゾン系、それを含むキット及びそれらの使用 | |
| CN107043774B (zh) | 一种嵌合强启动子及其用途 | |
| Jones et al. | Regulation of adenovirus transcription by an E1a gene in microinjected Xenopus laevis oocytes | |
| BRPI0711207A2 (pt) | vetor alvo para intregação em sìtios-especificos, método de sìtio-especìfico que integra um polinucleotìdeo codificando uma proteina de interesse em um genoma de uma célula eucariótia, célula eucariótica isolada , kit para uso no sìtio-especìfico que integra um polinucleotideo dentro de um genoma de uma celula in vitro e kit para uso em produzir uma proteìna em célula | |
| CN102639699A (zh) | Dna构建体以及用其制备重组cho细胞的方法 | |
| EP3152326B1 (en) | Low-leakage cellular biosensor system | |
| RU2425882C1 (ru) | Способ создания трансгенных линий клеток млекопитающего со стабильным и высоким уровнем экспрессии трансгенного белка | |
| JP6469371B2 (ja) | 人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法 | |
| CN104232676A (zh) | 一种获得微环dna的亲本质粒及其应用 | |
| EP3196303A1 (en) | Inflammation reporter system | |
| JP4491808B1 (ja) | 高発現細胞の効率的な選別に有用な薬剤選択マーカー遺伝子発現カセット | |
| Gasanov et al. | The use of transcription terminators to generate transgenic lines of Chinese hamster ovary cells (CHO) with stable and high level of reporter gene expression | |
| Gao et al. | Transfection and expression of exogenous gene in laying hens oviduct in vitro and in vivo | |
| Choi et al. | Tetracycline‐inducible gene expression in nuclear transfer embryos derived from porcine fetal fibroblasts transformed with retrovirus vectors | |
| CN107881174B (zh) | 一种翻译水平基因表达调控的方法及应用 | |
| CN106609283A (zh) | 一种利用转座子进行多基因同时操作的方法 | |
| US20160002643A1 (en) | Compositions And Methods To Enhance Protein Expression | |
| CN121241135A (zh) | 转座子、载体和基因工程化细胞 | |
| Makoto et al. | Novel and Efficient Plasmid Transfection Protocols for Functional Analysis of Genetic Elements in Human Cardiac Fibroblasts | |
| Kumari et al. | Transgenic animals in biotechnology | |
| US20140050748A1 (en) | Mutant cd83 promoter and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20170503 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171111 |