RU2425891C1 - Method of differentiation of strains of principal and nonprincipal causative plague agent and pseudotuberculosis agent by polymerase chain reaction - Google Patents
Method of differentiation of strains of principal and nonprincipal causative plague agent and pseudotuberculosis agent by polymerase chain reaction Download PDFInfo
- Publication number
- RU2425891C1 RU2425891C1 RU2010119796/10A RU2010119796A RU2425891C1 RU 2425891 C1 RU2425891 C1 RU 2425891C1 RU 2010119796/10 A RU2010119796/10 A RU 2010119796/10A RU 2010119796 A RU2010119796 A RU 2010119796A RU 2425891 C1 RU2425891 C1 RU 2425891C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strains
- plague
- pseudotuberculosis
- differentiation
- subspecies
- Prior art date
Links
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title claims abstract description 47
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 208000025087 Yersinia pseudotuberculosis infectious disease Diseases 0.000 title claims description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101150077793 ilvH gene Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 101150060643 ilvN gene Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 101150034433 terC gene Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 21
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 21
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 101150042317 hutG gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010048249 Yersinia infections Diseases 0.000 description 1
- 208000025079 Yersinia infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241001584856 Yersinia pestis CO92 Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 101150102216 lcrV gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 101150073640 ompF gene Proteins 0.000 description 1
- 101150015673 porin gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- -1 sodium thiolate Chemical class 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229910052714 tellurium Inorganic materials 0.000 description 1
- PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N tellurium atom Chemical compound [Te] PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы и дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов.The invention relates to the field of medical microbiology, in particular to subspecies differentiation of strains of the plague pathogen and differentiation of plague and pseudotuberculosis microbes.
Чума, возбудителем которой является вид бактерий Yersinia pestis, все еще представляет реальную угрозу для здоровья людей, связанную с существованием на различных континентах многочисленных активных природных очагов чумы, а также с возможностью использования возбудителя чумы в биотеррористических актах. Ежегодно в мире регистрируется достаточно большое количество случаев заболевания чумой, которые часто приводят к летальному исходу. Ввиду этого важное значение имеет разработка точных методов детекции Y.pestis и дифференциации этого возбудителя от других бактерий, в частности от близкородственной Yersinia pseudotuberculosis. Сам вид Y.pestis неоднороден по составу и делится на основной подвид - subspecies (ssp) pestis и группу неосновных подвидов: алтайский - ssp.altaica, кавказский - ssp.caucasica, улегейский - ssp.ulegeica, гиссарский - ssp.hissarica. Подвиды возбудителя чумы отличаются по вирулентности и эпидемической значимости. Штаммы основного подвида характеризуются высокой вирулентностью и имеют высокий эпидемический потенциал. Штаммы неосновных подвидов имеют избирательную вирулентность, эпидемически малозначимы и практически не вызывают заболеваний человека. В связи с этим наряду с необходимостью дифференциации возбудителя чумы и псевдотуберкулезного микроба не менее важное значение имеет и дифференциация подвидов Y.pestis, и, в частности, детекция среди них штаммов основного подвида. Разработка эффективных и надежных методов быстрой идентификации основного подвида Y.pestis среди близкородственных патогенных иерсиний имеет важное практическое значение.The plague, the causative agent of which is the species of bacteria Yersinia pestis, still poses a real threat to human health associated with the existence of numerous active natural foci of plague on various continents, as well as with the possibility of using the plague pathogen in bioterrorist acts. Annually in the world a rather large number of cases of plague are recorded, which often lead to death. In view of this, it is important to develop accurate methods for detecting Y. pestis and differentiating this pathogen from other bacteria, in particular, from closely related Yersinia pseudotuberculosis. The species Y. pestis itself is heterogeneous in composition and is divided into the main subspecies - subspecies (ssp) pestis and a group of non-main subspecies: Altai - ssp.altaica, Caucasian - ssp.caucasica, Ulegei - ssp.ulegeica, Hissar - ssp.hissarica. Subspecies of the plague pathogen differ in virulence and epidemic significance. The strains of the main subspecies are characterized by high virulence and have a high epidemic potential. Strains of minor subspecies have selective virulence, are epidemiologically insignificant and practically do not cause human diseases. In this regard, along with the need to differentiate the plague pathogen and the pseudotuberculosis microbe, the differentiation of Y. pestis subspecies, and, in particular, the detection of strains of the main subspecies among them, is no less important. The development of effective and reliable methods for the rapid identification of the main subspecies Y. pestis among closely related pathogenic Yersinia is of great practical importance.
В настоящее время дифференциацию штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов проводят с учетом различной экспрессии ряда биохимических признаков: ферментации моносахаридов - рамнозы, мелиобиозы, продукции изоцитратлиазы и других. Однако проявление фенотипических свойств возбудителя чумы зависит от условий культивирования штаммов, качества используемых сред, а также от выделения культур возбудителя в чистом виде, что значительно усложняет и увеличивает сроки проведения анализа.Currently, the differentiation of strains of the plague pathogen of the main and minor subspecies is carried out taking into account the different expression of a number of biochemical characteristics: fermentation of monosaccharides - rhamnose, meliobiosis, isocitratliase production and others. However, the manifestation of the phenotypic properties of the plague pathogen depends on the cultivation conditions of the strains, the quality of the media used, as well as on the isolation of the pathogen cultures in their pure form, which significantly complicates and increases the analysis time.
Большей эффективностью и быстротой получения результатов отличается метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на использовании генетических особенностей штаммов различных бактерий. Для проведения ПЦР не обязательно выделение чистых культур возбудителя, поскольку метод отличается высокой чувствительностью и позволяет проводить определение видовой и подвидовой принадлежности бактерии при наличии небольшого количества клеток в материале исследуемого образца.The method of polymerase chain reaction (PCR), based on the use of genetic characteristics of strains of various bacteria, is more effective and quick in obtaining results. For PCR, it is not necessary to isolate pure cultures of the pathogen, since the method is highly sensitive and allows the determination of the species and subspecies of the bacterium in the presence of a small number of cells in the material of the test sample.
До настоящего времени метод ПЦР использовали для детекции возбудителя чумы, а также для дифференциации его от возбудителя псевдотуберкулеза, но практически не применяли его для дифференциации основного и неосновных подвидов Y.pestis. При этом для детекции возбудителя чумы в ПЦР использовали нуклеотидные последовательности различных генов caf, pla, lcrV, 3a, irp-2 (Neubauer Н. et al., 2000; Rahalison L. et al., 2000; Hongwei Z.J.L., 2000; Балахонов С.В. с соавт.2000; Гаранина С.Б. с соавт., 2001; Сучков И.Ю. с соавт., 2001; Radnedge L. et al., 2001; Савостина Е.П., 2004; Kuske C.R. et al., 2006; Куклев B.E. с соавт. 2006).To date, the PCR method has been used to detect the plague pathogen, as well as to differentiate it from the causative agent of pseudotuberculosis, but practically did not use it to differentiate the main and minor subspecies of Y. pestis. Moreover, to detect the plague pathogen in PCR, the nucleotide sequences of various genes caf, pla, lcrV, 3a, irp-2 were used (Neubauer N. et al., 2000; Rahalison L. et al., 2000; Hongwei ZJL, 2000; Balakhonov C .V. et al. 2000; Garanina SB, et al., 2001; Suchkov I.Yu. et al., 2001; Radnedge L. et al., 2001; Savostina E.P., 2004; Kuske CR et al., 2006; Kuklev BE et al. 2006).
Так, известен способ детекции бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных для человека видов иерсиний методом полимеразной цепной реакции (патент RU 2354700, опубликован 10.05.2009 г.) на основе использования последовательности участка гена ompF порина. Этот способ позволяет разделять виды патогенных иерсиний - возбудителей чумы, псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза на видовом уровне, но он не предусматривает проведения идентификации штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов.Thus, a known method for detecting bacteria of the genus Yersinia and differentiating pathogenic for humans species of yersinia by the polymerase chain reaction (patent RU 2354700, published May 10, 2009) based on the use of the sequence of the ompF porin gene region. This method allows you to separate the types of pathogenic Yersinia - causative agents of plague, pseudotuberculosis, intestinal yersiniosis at the species level, but it does not provide for the identification of strains of Y. pestis main and minor subspecies.
Известен другой способ быстрой детекции и дифференциации Y.pestis и Y.pseudotuberculosis (DE 10124342 (A1), опубликован 28.11.2002 г.), который предусматривает двухэтапную детекцию ДНК возбудителей чумы и псевдотуберкулеза: методом ПЦР и методом гибридизации со специфическими зондами, что повышает надежность и эффективность способа. Однако этот способ также не позволяет дифференцировать штаммы Y.pestis основного и неосновных подвидов.There is another method for the rapid detection and differentiation of Y. pestis and Y. pseudotuberculosis (DE 10124342 (A1), published November 28, 2002), which provides for two-stage DNA detection of plague and pseudotuberculosis pathogens: PCR and hybridization with specific probes, which increases reliability and efficiency of the method. However, this method also does not allow to differentiate Y. pestis strains of the main and non-main subspecies.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба (RU 2332464, опубликован 27.08.2008 г.), который основан на использовании вариабельности нуклеотидной последовательности участка хромосомы hutG - YP01967. Однако недостаток способа заключается в том, что участок hutG - YP01967 расположен в нестабильной области генома Y.pestis, которая может часто утрачиваться у штаммов основного подвида, что делает невозможной дифференциацию таких штаммов с помощью предложенного метода. Кроме того, этот способ сложен в интерпретации, требует использования большой группы референтных штаммов, а также имеет некоторые погрешности, поскольку не позволяет избежать совпадения размеров ПЦР фрагментов у некоторых штаммов основного и неосновных подвидов, что требует проведения дополнительных исследований (например, секвенирования) для определения подвидовой принадлежности штамма. Другие публикации об использовании метода ПЦР для дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов в литературе отсутствуют, как отсутствуют и данные об участках генома Y.pestis, применение которых позволило бы быстро и эффективно провести такую дифференциацию.Closest to the proposed invention in terms of essential features is a method for differentiation of plague and pseudotuberculosis microbes with simultaneous intraspecific differentiation of plague microbe strains (RU 2332464, published August 27, 2008), which is based on the use of the nucleotide sequence variability of the hutG chromosome - YP01967. However, the disadvantage of this method is that the hutG - YP01967 region is located in the unstable region of the Y. pestis genome, which can often be lost in strains of the main subspecies, which makes it impossible to differentiate such strains using the proposed method. In addition, this method is difficult to interpret, requires the use of a large group of reference strains, and also has some errors, since it does not avoid the coincidence of the sizes of PCR fragments in some strains of the main and minor subspecies, which requires additional studies (for example, sequencing) to determine subspecies of strain. Other publications on the use of the PCR method for the differentiation of strains of the causative agent of the plague of the main and minor subspecies are absent in the literature, as there are no data on parts of the Y. pestis genome, the use of which would allow such a differentiation to be quickly and effectively.
Задачей изобретения является разработка простого в интерпретации, надежного и быстрого способа дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновного подвидов и штаммов возбудителя псевдотуберкулеза методом ПЦР.The objective of the invention is to develop an easy-to-interpret, reliable and quick way to differentiate strains of the plague pathogen of the main and minor subspecies and strains of the causative agent of pseudotuberculosis by PCR.
Технический результат заключается в повышении эффективности дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов с одновременной дифференциацией штаммов возбудителя псевдотуберкулеза.The technical result consists in increasing the efficiency of differentiation of strains of the plague pathogen of the main and minor subspecies with simultaneous differentiation of strains of the causative agent of pseudotuberculosis.
Заявляемый способ основан на использовании в качестве ДНК-мишеней хромосомных генов жизнеобеспечения terC, ilvN и inv, кодирующих соответственно белок резистентности к теллурию, ацетолактатсинтазу и инвазин-адгезин.The inventive method is based on the use of terC, ilvN and inv chromosomal life support genes as target DNAs, encoding respectively the tellurium resistance protein, acetolactate synthase and invasin-adhesin.
Технический результат достигается способом дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции, который предусматривает выделение ДНК штамма, проведение полимеразной цепной реакции с амплификацией фрагментов генов terC, ilvN и inv исследуемого штамма, при этом праймеры на эти гены имеют следующие последовательности:The technical result is achieved by the method of differentiation of strains of the plague pathogen of the main and minor subspecies and the causative agent of pseudotuberculosis by the method of polymerase chain reaction, which involves the isolation of the DNA of the strain, the polymerase chain reaction with amplification of fragments of terC, ilvN and inv genes of the studied strain, while the primers for these genes have the following sequences:
89-S - AATCAAATCTCGCCCAGC,89-S - AATCAAATCTCGCCCAGC,
89-As - GCTGCGTATCATTTCACC;89-As - GCTGCGTATCATTTCACC;
45-S - AGTGGTCTGCTTCTCTGG,45-S - AGTGGTCTGCTTCTCTGG,
45-As - CGGCATACACAGAATACC,45-As - CGGCATACACAGAATACC,
inv839 - TACCTGCACTCCCACAAC,inv839 - TACCTGCACTCCCACAAC,
inv1007 - CCCATACGCTGATCTACC,inv1007 - CCCATACGCTGATCTACC,
и определение размеров амплифицированных фрагментов с последующей дифференциацией исследуемых штаммов, которую проводят путем сравнения размеров полученных фрагментов генов terC, ilvN и inv с аналогичными фрагментами у типичных штаммов возбудителей чумы основного и неосновных подвидов.and determining the sizes of amplified fragments, followed by differentiation of the studied strains, which is carried out by comparing the sizes of the obtained terC, ilvN, and inv genes fragments with similar fragments in typical strains of the plague pathogens of the main and non-main subspecies.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Выделение ДНК исследуемого штамма чумного микроба проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-11 групп патогенности».DNA isolation of the studied strain of plague microbe is carried out according to the standard method in accordance with MU 1.3.1794-03 “Organization of work during PCR studies of material infected with microorganisms of 1-11 pathogenicity groups”.
Полимеразную цепную реакцию осуществляют по стандартной методике (МУ 1.3.1794-03) с применением вышеуказанных праймеров на гены terC, ilvN и inv. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для амплификации в ПЦР фрагментов terC, ilvN и inv, рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей этих генов у штаммов чумного микроба Y. pestis CO92, KIM, Antiqua, Nepal516, Angola, 91001, Pestoides F и Y. pseudotuberculosis IP31758, представленных в базе данных NCBI GenBank. С помощью рассчитанных праймеров проводят в ПЦР амплификацию фрагментов генов terC, ilvN и inv и определяют размеры полученных фрагментов генов. Праймеры на гены terC, ilvN и inv имеют следующие последовательности:The polymerase chain reaction is carried out according to the standard method (MU 1.3.1794-03) using the above primers for terC, ilvN and inv genes. Oligonucleotide primers used for PCR amplification of terC, ilvN and inv fragments were calculated based on the nucleotide sequences of these genes in plague microbe strains Y. pestis CO92, KIM, Antiqua, Nepal516, Angola, 91001, Pestoides F and Y. pseudotuberculosis in the NCBI GenBank database. Using the calculated primers, amplification of terC, ilvN, and inv gene fragments is carried out in PCR and the sizes of the resulting gene fragments are determined. The terC, ilvN, and inv primers have the following sequences:
89-S - AATCAAATCTCGCCCAGC,89-S - AATCAAATCTCGCCCAGC,
89-As - GCTGCGTATCATTTCACC;89-As - GCTGCGTATCATTTCACC;
45-S - AGTGGTCTGCTTCTCTGG,45-S - AGTGGTCTGCTTCTCTGG,
45-As - CGGCATACACAGAATACC,45-As - CGGCATACACAGAATACC,
mv839 - TACCTGCACTCCCACAAC,mv839 - TACCTGCACTCCCACAAC,
invl007- CCCATACGCTGATCTACC.invl007- CCCATACGCTGATCTACC.
Полимеразную цепную реакцию с амплификацией фрагментов генов terC, ilvN и inv осуществляют по следующей программе: 1 цикл 94°С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 94°С 45 сек, 55°С 1 мин, 72°С 45 сек и завершающий цикл 3 мин при 72°С. Определение размеров образованных в ПЦР фрагментов генов terC, ilvN и inv у исследуемых штаммов проводят методом электрофореза в 3% агарозном геле относительно стандарта маркеров молекулярных масс с размером от 100 до 1000 п.н. Нами установлено, что типичные штаммы возбудителя чумы основного подвида имеют размеры образуемых в ПЦР фрагментов генов terC - 300 п.н., ilvN - 515 п.н. и inv - 877 п.н.; штаммы неосновных подвидов соответственно 389, 560 и 877; а штаммы псевдотуберкулезного микроба - 389, 560 и 169 (таблица). В дальнейшем дифференциацию исследуемого штамма проводят путем сравнения с данными представленными в таблице.The polymerase chain reaction with amplification of terC, ilvN, and inv gene fragments is carried out according to the following program: 1 cycle of 94 ° C for 5 min, then 35 cycles at 94 ° C for 45 sec, 55 ° C for 1 min, 72 ° C for 45 sec and final 3 min cycle at 72 ° C. The sizes of terC, ilvN, and inv genes formed in PCR are determined in the studied strains by electrophoresis in 3% agarose gel relative to the standard molecular weight markers with sizes from 100 to 1000 bp. We found that typical strains of the plague pathogen of the main subspecies have sizes of terC genes formed in PCR of 300 bp, ilvN - 515 bp and inv, 877 bp; strains of minor subspecies 389, 560 and 877, respectively; and strains of the pseudotuberculosis microbe - 389, 560 and 169 (table). In the future, the differentiation of the studied strain is carried out by comparison with the data presented in the table.
Сущность изобретения поясняется примерами.The invention is illustrated by examples.
Пример 1. Дифференциация штамма №1 (Модельный эксперимент).Example 1. Differentiation of strain No. 1 (Model experiment).
Выделение ДНК штамма №1 проводят стандартным методом с помощью лизирующего раствора на основе 6М гуанидинизотиоцианата с предварительным обеззараживанием культуры путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000 с последующим прогреванием при температуре 56°C в течение 30 мин. (Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности. МУ 1.3.1794-03).DNA isolation of strain No. 1 is carried out by the standard method using a lysing solution based on 6M guanidine isothiocyanate with preliminary disinfection of the culture by adding sodium thiolate to a concentration of 1: 10000, followed by heating at 56 ° C for 30 minutes. (Organization of work during PCR studies of material infected with microorganisms of the I-II pathogenicity groups. MU 1.3.1794-03).
Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме 25 мкл; реакционная смесь содержит: 1х буфер (10х ПЦР-буфер - 2,5 мкл), MgCl2 - 2,0 мМ, смесь dNTP - 0,3 мМ, олигонуклеотидные праймеры - 2 пмол, Taq DNA полимераза - 0,1 ед., исследуемой ДНК - 10 мкл. Продукты амплификации анализируют в 3% агарозном геле с добавлением этидиум бромида и просматривают в УФ-свете.The polymerase chain reaction is carried out in a volume of 25 μl; the reaction mixture contains: 1x buffer (10x PCR buffer - 2.5 μl), MgCl 2 - 2.0 mm, dNTP mixture - 0.3 mm, oligonucleotide primers - 2 pmol, Taq DNA polymerase - 0.1 units, test DNA - 10 μl. Amplification products are analyzed on a 3% agarose gel with the addition of ethidium bromide and viewed under UV light.
Определяют размеры образовавшихся фрагментов генов terC, ilvN и inv. Они составляют 300, 515, 877 п.н., что соответствует размерам фрагментов генов у штаммов основного подвида. Исследуемый штамм №1 относят к основному подвиду Y.pestis.The sizes of the formed terC, ilvN, and inv genes fragments are determined. They are 300, 515, 877 bp, which corresponds to the sizes of gene fragments in the strains of the main subspecies. The studied strain No. 1 belong to the main subspecies Y.pestis.
Пример 2. Дифференциацию штамма №2 проводят аналогично примеру №1.Example 2. Differentiation of strain No. 2 is carried out analogously to example No. 1.
Размеры образуемых в ПЦР фрагментов генов terC, ilvN и inv составляют 389, 560 и 877 п.н., что соответствует размерам фрагментов, образуемых у штаммов возбудителя чумы неосновных подвидов. Штамм №2 относят к неосновным подвидам Y.pestis.The sizes of terC, ilvN, and inv genes formed in PCR are 389, 560, and 877 bp, which corresponds to the sizes of fragments formed in the plague pathogen strains of minor subtypes. Strain No. 2 belong to the non-main subspecies of Y. pestis.
Пример 3. Дифференциацию штамма №3 проводят аналогично примеру №1.Example 3. Differentiation of strain No. 3 is carried out analogously to example No. 1.
Размеры образуемых в ПЦР фрагментов генов terC, ilvN и inv составляют 389, 560 и 169 п.н., что соответствует размерам фрагментов, образуемых у штаммов возбудителя псевдотуберкулеза. Штамм №3 относят к Y.pseudotuberculosis.The sizes of terC, ilvN, and inv genes formed in PCR are 389, 560, and 169 bp, which corresponds to the sizes of fragments formed in strains of the pseudotuberculosis pathogen. Strain No. 3 is assigned to Y. pseudotuberculosis.
Таким образом, заявленный способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов методом ПЦР, основанный на вариабельности последовательностей генов жизнеобеспечения terC, ilvN и inv позволяет быстро, эффективно и надежно проводить дифференциацию штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов и Y.pseudotuberculosis.Thus, the claimed method for the differentiation of strains of the causative agent of the plague of the main and minor subtypes by PCR, based on the variability of the sequences of the life support genes terC, ilvN and inv, allows quickly, efficiently and reliably to differentiate the strains of Y. pestis of the main and minor subtypes and Y. pseudotuberculosis.
Claims (1)
89-S - AATCAAATCTCGCCCAGC,
89-As - GCTGCGTATCATTTCACC;
45-S - AGTGGTCTGCTTCTCTGG,
45-As - CGGCATACACAGAATACC;
inv839 - TACCTGCACTCCCACAAC,
invl007 - CCCATACGCTGATCTACC;
дифференциацию штаммов проводят путем сравнения размеров полученных фрагментов генов terC, ilvN и inv исследуемых штаммов с аналогичными фрагментами у типичных штаммов возбудителей чумы основного, неосновных подвидов и псевдотуберкулезного микроба, при этом типичные штаммы возбудителя чумы основного подвида имеют размеры образуемых в ПЦР фрагментов генов terC - 300 п.н., ilvN - 515 п.н. и inv - 877 п.н.; штаммы неосновных подвидов соответственно 389, 560 и 877; а штаммы псевдотуберкулезного микроба - 389, 560 и 169. A method of differentiating strains of the plague pathogen of the main and minor subspecies and the causative agent of pseudotuberculosis, including DNA isolation, PCR with amplification of gene fragments of the studied strain, characterized in that the nucleotide primers for the terC, ilvN and inv genes are used for PCR, having the following sequences:
89-S - AATCAAATCTCGCCCAGC,
89-As - GCTGCGTATCATTTCACC;
45-S - AGTGGTCTGCTTCTCTGG,
45-As - CGGCATACACAGAATACC;
inv839 - TACCTGCACTCCCACAAC,
invl007 - CCCATACGCTGATCTACC;
differentiation of strains is carried out by comparing the sizes of the obtained fragments of the terC, ilvN and inv genes of the studied strains with similar fragments in typical strains of the main plague pathogens, minor subspecies and pseudotuberculosis microbe, while typical strains of the main plague pathogen plague have sizes of terC gene fragments formed in PCR of 300 bp, ilvN - 515 bp and inv, 877 bp; strains of minor subspecies 389, 560 and 877, respectively; and pseudotuberculosis microbe strains - 389, 560 and 169.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010119796/10A RU2425891C1 (en) | 2010-05-17 | 2010-05-17 | Method of differentiation of strains of principal and nonprincipal causative plague agent and pseudotuberculosis agent by polymerase chain reaction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010119796/10A RU2425891C1 (en) | 2010-05-17 | 2010-05-17 | Method of differentiation of strains of principal and nonprincipal causative plague agent and pseudotuberculosis agent by polymerase chain reaction |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2425891C1 true RU2425891C1 (en) | 2011-08-10 |
Family
ID=44754555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010119796/10A RU2425891C1 (en) | 2010-05-17 | 2010-05-17 | Method of differentiation of strains of principal and nonprincipal causative plague agent and pseudotuberculosis agent by polymerase chain reaction |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2425891C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2496882C2 (en) * | 2012-09-17 | 2013-10-27 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method to differentiate strains of plague agent of primary subtype of medieval and antique biovars by method of polymerase chain reaction |
| RU2783710C1 (en) * | 2021-12-16 | 2022-11-16 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method for detecting the causative agent of pseudotuberculosis |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10124342A1 (en) * | 2001-05-18 | 2002-11-28 | Biotecon Diagnostics Gmbh | Amplification method for Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis, useful for their rapid detection and differentiation, also new primers and probes |
| WO2004106553A2 (en) * | 2002-08-01 | 2004-12-09 | The Regents Of The University Of California | Nucleotide sequences specific to yersinia pestis and methods for the detection of yersinia pestis |
| RU2288275C1 (en) * | 2005-03-29 | 2006-11-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method of assay of virulence loss by plague microorganism strain because of loss of pigmentation region |
| RU2332464C1 (en) * | 2007-08-20 | 2008-08-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (РосНИПЧИ "Микроб") | Method of plague and pseudotuberculosis microbe differentiation with parallel interspecies differentiation of plague microbe strains |
-
2010
- 2010-05-17 RU RU2010119796/10A patent/RU2425891C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10124342A1 (en) * | 2001-05-18 | 2002-11-28 | Biotecon Diagnostics Gmbh | Amplification method for Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis, useful for their rapid detection and differentiation, also new primers and probes |
| WO2004106553A2 (en) * | 2002-08-01 | 2004-12-09 | The Regents Of The University Of California | Nucleotide sequences specific to yersinia pestis and methods for the detection of yersinia pestis |
| RU2288275C1 (en) * | 2005-03-29 | 2006-11-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method of assay of virulence loss by plague microorganism strain because of loss of pigmentation region |
| RU2332464C1 (en) * | 2007-08-20 | 2008-08-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (РосНИПЧИ "Микроб") | Method of plague and pseudotuberculosis microbe differentiation with parallel interspecies differentiation of plague microbe strains |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2496882C2 (en) * | 2012-09-17 | 2013-10-27 | Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method to differentiate strains of plague agent of primary subtype of medieval and antique biovars by method of polymerase chain reaction |
| RU2783710C1 (en) * | 2021-12-16 | 2022-11-16 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method for detecting the causative agent of pseudotuberculosis |
| RU2840521C1 (en) * | 2024-10-24 | 2025-05-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Method for differentiating rockborn strain of canine distemper virus from other cdv strains |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9523131B2 (en) | PCR diagnostics of dermatophytes and other pathogenic fungi | |
| Iraola et al. | Application of a multiplex PCR assay for Campylobacter fetus detection and subspecies differentiation in uncultured samples of aborted bovine fetuses | |
| Ikryannikova et al. | Misidentification of alpha-hemolytic streptococci by routine tests in clinical practice | |
| Pisal et al. | Detection of mycoplasma contamination directly from culture supernatant using polymerase chain reaction | |
| CN111893198B (en) | Specific molecular target, detection primer set and rapid detection method for identification of Staphylococcus aureus | |
| RU2332464C1 (en) | Method of plague and pseudotuberculosis microbe differentiation with parallel interspecies differentiation of plague microbe strains | |
| RU2471872C1 (en) | Method for differentiating yersinia pestis strains of various subspecies and biovars by polymerase chain reaction and multilocus sequence typing | |
| JP2010046038A (en) | Method for detecting pathogenic bacteria of major disease injury of strawberry, and primer for detection | |
| US20130157265A1 (en) | Composition, method and kit for detecting bacteria by means of sequencing | |
| RU2550257C2 (en) | METHOD OF DIFFERENTIATING TYPICAL AND ATYPICAL STRAINS Yersinia pestis OF MEDIEVAL BIOVAR BY PCR METHOD WITH HYBRIDISATION-FLUORESCENT RECORDING RESULTS | |
| RU2425891C1 (en) | Method of differentiation of strains of principal and nonprincipal causative plague agent and pseudotuberculosis agent by polymerase chain reaction | |
| RU2415948C1 (en) | METHOD OF SUBSPECIFIC DIFFERENTIATION OF Yersinia pestis STRAINS BY MULTILOCUS SEQUENCE TYPING | |
| RU2404251C1 (en) | Method of identification and intrageneric differentiation of strains of species yersinia pestis | |
| RU2496882C2 (en) | Method to differentiate strains of plague agent of primary subtype of medieval and antique biovars by method of polymerase chain reaction | |
| RU2378384C2 (en) | Oligonucleotide primers, method and test system for detecting genome of african horse sickness virus by polymerase chain reaction in format of electrophoretic detection of amplification products | |
| RU2737775C1 (en) | Method for identifying yersinia pestis and yersinia pseudotuberculosis and simultaneous differentiation of yersinia pestis of main and central asian subspecies by multiplex pcr | |
| RU2404256C1 (en) | Method of subspecific differentiation of plague causative agent strains by sequencing method | |
| RU2736649C1 (en) | Method for genetic differentiation of yersinia pseudotuberculosis strains by molecular-genetic typing | |
| RU2552611C2 (en) | Method of subspecies differentiation of plague agent strains using polymerase chain reaction method | |
| CN110358851B (en) | Nucleic acid sequence, primer, method and kit for detecting bacillus cereus | |
| RU2765495C1 (en) | Method for the determination of francisella tularensis subspecies by multi-primer pcr | |
| JP2019140997A (en) | Primer set for detecting trichophyton gene by lamp method, kit containing the same and method for detecting trichophyton using the same | |
| RU2756854C1 (en) | Differentiation of francisella tularensis strains by molecular genetic typing | |
| RU2393231C1 (en) | Method for determination of genetic relationship of comma bacilli strains by sequencing genes flanking cluster of o-antigen biosynthesis genes | |
| Figueroa et al. | Principles and Applications of Genomic Diagnostic Techniques |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20130518 |