RU2498309C2

RU2498309C2 - Способы выявления сердечных нарушений

Info

Publication number: RU2498309C2
Application number: RU2009145695/15A
Authority: RU
Inventors: Синьхуа ЯНЬ; Энтони О. КАДЖАНО
Original assignee: Акорда Терапьютикс, Инк.
Priority date: 2007-05-10
Filing date: 2008-05-12
Publication date: 2013-11-10
Also published as: CA2965208C; JP5749490B2; JP5998171B2; US9757429B2; JP6636402B2; US20160263192A1; CA2686959A1; JP2017026622A; AU2008251822A1; US20140378377A1; US11071770B2; BRPI0810631A2; US20190269759A1; JP2014122923A; US20110085976A1; JP6978553B2; RU2009145695A; JP2019010123A; US20180028610A1; US10258667B2

Abstract

Заявленная группа изобретений относится к области медицины и предназначена для выявления пациентов с повреждением сердца и оценки эффективности проводимой терапии. У пациентов определяют внутриклеточные уровни кардиального белка тропонина Т (cTnT) или кардиального белка тропонина I (cTnl) в сердечной ткани. Уменьшение этих показателей по меньшей мере на 50% относительно контрольных или нормальных является показателем повреждения сердца у пациента. Способ лечения включает выявление пациентов с повреждением сердца заявленным способом и введение терапевтически эффективного количества GGF2 и ингибитора протеасом. Увеличение внутриклеточных уровней белка cTnT или cTnl в сердечной ткани пациента после введения GGF2 является позитивным индикатором эффективности введения GGF2 для лечения пациента с повреждением сердца. Использование заявленной группы изобретений позволяет быстро и точно диагностировать повреждения сердца у пациента, а также быстро и точно оценить эффективность проводимого лечения. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 26 ил., 1 пр., 1 табл.

Description

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Настоящая заявка заявляет приоритет по 35 USC §119(e) предварительной заявки США, серийный номер 60/928541, поданной 10 мая 2007 года, при этом указанная заявка включена в настоящее изобретение путем ссылки во всей полноте.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области медицинской диагностики. Более конкретно, настоящее изобретение направлено на способ выявления повреждения сердца у пациента. Настоящее изобретение также относится к способам лечения пациентов с выявленным повреждением сердца. К области настоящего изобретения также принадлежат способы оценки эффективности проводимой терапевтической программы, разработанной для лечения больных с повреждением сердца.

УРОВЕНЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящей заявке приведены ссылки на ряд публикаций и патентных документов для более полного описания состояния области техники, к которой относится настоящее изобретение. Раскрытие каждой из этих публикаций и документов включено в настоящее изобретение в качестве ссылки.

Сердечная недостаточность находится в причинной связи со многими состояниями, поражающими сердце, включающими ишемическую болезнь сердца с инфарктом миокарда или без него; гипертонию; заболевания, инфекции или интоксикации, которые воздействуют на сердечную мышцу; и болезни сердечных клапанов. Сердечная недостаточность может возникать быстро, за считанные дни или недели, но чаще развивается медленно в течение нескольких лет, по мере постепенного и прогрессивного ослабевания сердца.

Терапевтические мероприятия, направленные на уменьшение количества раковых клеток у больного, часто, если не всегда, сопровождаются рядом вредных побочных эффектов. В действительности цитостатические препараты, применяемые в качестве химиотерапевтических средств для лечения различных раковых заболеваний, часто проявляют потенциально летальные побочные эффекты, включающие кардиотоксичность. Вещества, обычно применяемые для цитостатической терапии, включают антрациклины даунорубицин и его пролекарства, зорубицин, доксорубицин (адриамицин) и эпирубицин, и синтетический антибиотик митоксантрон. Например, антрациклины, которые относятся к классу химиотерапевтических препаратов на основе даунозамина и тетрагидро-нафтацен-диона. Указанные соединения применяют для лечения множества раковых заболеваний, включающих в себя лейкозы, лимфомы и солидные опухоли груди, матки, яичника и легкого. В дополнение к прогнозируемым побочным эффектам, которые наблюдаются у больных на фоне химиотерапии, таким как потеря волос и тошнота, терапевтические мероприятия, сопровождаемые введением антрациклина, имеют осложнения и ограничения, обусловленные выраженной кардиотоксичностью соединений этого класса. Кардиотоксичность, связанная с применением антрациклина, коррелирует с суммарной введенной дозой и часто является необратимой. Цитостатические эффекты и кардиотоксичность указанных соединений обусловлены, по меньшей мере частично, изменениями текучести и проницаемости мембран, которые вызваны связыванием антрациклина с компонентами клеточной мембраны. Также считается, что образование свободных радикалов в сердце и накопление метаболитов антрациклина способствуют повреждению сердца. Кардиотоксичность часто отражена на электрокардиограмме (ЭКГ) в виде отклонений и аритмий или в виде кардиомиопатии, которые могут в конечном счете приводить к острой сердечной недостаточности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к обеспечению новых способов диагностики для скрининга пациентов с целью идентификации наличия симптомов повреждения сердца. У пациентов с выявленными таким образом симптомами можно применять фармацевтические препараты для лечения повреждения сердца согласно приведенному в настоящем изобретении описанию. В конкретном аспекте настоящего изобретения представлены диагностические методики скрининга пациентов для выявления наличия симптомов повреждения сердца, например, обусловленных кардиотоксичностью, гипертонией, болезнями клапанов, инфарктом миокарда, вирусным миокардитом или склеродермой. В конкретном аспекте целью настоящего изобретения является выявление пациентов с симптомами кардиотоксичности, возникшей в результате химиотерапевтического лечения. Классификация таких пациентов призвана идентифицировать подгруппу пациентов, нуждающихся в терапевтическом воздействии для облегчения кратковременных и продолжительных кардиотоксичных эффектов. Идентифицированную таким образом подгруппу пациентов можно лечить фармацевтическими препаратами для лечения повреждения сердца, которая возникла в связи с применением кардиотоксических доз лекарств или химических агентов. Если ситуация, при которой у пациента выявляют патологию сердца, обусловлена постоянным состоянием, таким как гипертония, болезни клапанов, инфаркт миокарда, вирусный миокардит или склеродерма, также можно создавать подходящие рецептуры фармацевтических препаратов для лечения пациентов с повреждением сердца.

Настоящее изобретение также охватывает способ разделения пациентов на группы согласно степени или типу повреждения сердца, понимание чего для квалифицированного специалиста является руководством для выбора подходящей схемы лечения. Настоящее изобретение также включает в себя способ оценки эффективности схемы лечения.

Основой новых способов настоящего изобретения является открытие возможности использования в качестве индикаторов наличия поражения сердца изменений внутриклеточных уровней содержания кардиального тропонина I (cTnl) и кардиального тропонина T (cTnT) в интактной сердечной ткани. Более конкретно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что уменьшение внутриклеточного уровня cTnl и cTnT в интактной сердечной ткани служит диагностическим маркером для выявления пациентов, имеющих риск появления повреждения сердца. Можно проводить биопсию сердечной ткани пациента и тестировать образец in vitro или проводить анализ in vivo, используя протоколы молекулярных исследований, известные в данной области техники.

Применяется подход, при котором внутриклеточные уровни cTnl и cTnT, установленные для сердечной ткани пациента, сравнивают с уровнями в контрольной сердечной ткани, в которой экспрессируется дикий тип или выявлены нормальные уровни внутриклеточного cTnl и cTnT. Уменьшение уровней внутриклеточного cTnl и/или cTnT в сердечной ткани пациента легко определяют путем расчета уровней белка, что можно получить при использовании стандартных способов, и определить с помощью анализа, устанавливающего наличие статистически значимого снижения внутриклеточного уровня cTnl и cTnT в сердечной ткани пациента относительно контрольных уровней. Пациентам с доказанным сниженным внутриклеточным уровнем cTnl и/или cTnT назначается лечение подходящими композициями, которые выбирают для восстановления, по меньшей мере частичного, нормальной работы сердца, подтверждением чего является повышение внутриклеточного уровня cTnl и cTnT или восстановление нормального уровня внутриклеточного cTnl и cTnT.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения устанавливают контрольный или нормальный внутриклеточный уровень в сердечной ткани как cTnT, так и cTnl путем определения внутриклеточного уровня и cTnT, и cTnl в сердечной ткани пациента с нормально функционирующим сердцем. В другом варианте осуществления настоящего изобретения устанавливают контрольный или нормальный внутриклеточный уровень в сердечной ткани и cTnT и cTnl путем определения внутриклеточного уровня и cTnT и cTnl в сердечной ткани пациента до начала лечения, которое может стать причиной повреждения сердца.

В одном аспекте настоящего изобретения поражение сердца является результатом кардиотоксичности, гипертонии, болезней клапанов, инфаркта миокарда, вирусного миокардита или склеродермы. В дополнительном аспекте изобретения кардиотоксичность обусловлена применением химиотерапевтического препарата или облучением.

Также в объем настоящего изобретения входит оценка эффективности схемы лечения, разработанной, по меньшей мере, для частичного восстанавления нормальной работы сердца посредством измерения внутриклеточного уровня cTnl и cTnT в сердечной ткани получающего лечение пациента. Согласно настоящему изобретению, повышение внутриклеточного уровня cTnl и cTnT в сердечной ткани получающего лечение пациента относительно уровней, определенных до начала лечения, является положительным индикатором того, что терапевтическое действие направлено на восстановление работы сердца.

Подразумевается, что внутриклеточный уровень как cTnl, так и cTnT в сердечной ткани или оба внутриклеточных уровня и cTnl и cTnT в сердечной ткани можно использовать в качестве индикаторов активности и/или функции сердечной ткани. Это относится ко всем аспектам настоящего изобретения, включая в себя способы, направленные на оценку или диагностику повреждения сердца, способы, направленные на классификацию пациентов в отношении конкретных схем лечения, и способы, направленные на оценку эффективности схем лечения.

Согласно настоящему изобретению показателем повреждения сердца также является снижение уровней cTnl и/или cTnT мРНК в сердечной ткани, что можно использовать для разделения популяции пациентов на группы. В этой связи частичное или полное восстановление нормального уровня cTnl и/или cTnT мРНК также является положительным индикатором терапевтической эффективности, как описано выше, в отношении уровней содержания белка.

Настоящее изобретение, в общем, относится к животным и более конкретно, к млекопитающим, и еще более конкретно, к людям. Соответственно, его субъектом предпочтительно является животное, включая в себя без ограничения таких животных, как коровы, свиньи, лошади, цыплята, кошки, собаки и т.д., и предпочтительно субъектом является млекопитающее, и наиболее предпочтительно, человек. Соответственно, термин "субъект" или "пациент" можно использовать в отношении человека.

В объем настоящего изобретения также входит комбинация схемы лечения, при которой глиальный фактор роста (GGF2) или домен, подобный эпидермальному фактору роста (EGFL), кодируемый геном нейрегулином, вводят в комбинации с ингибитором протеасомы для лечения повреждения сердца. Примером ингибитора протеасомы, применяемым в настоящем изобретении, является Proscript 519, представляющий собой мощный и селективный ингибитор протеасом. Другие ингибиторы протеасом, полезные для настоящего изобретения, включают в себя велкейд (Velcade™) и лактацистин. Дополнительные ингибиторы протеасом известны специалистам в данной области техники. Фактически ингибиторы протеасом уже применяются в качестве терапевтических средств для лечения многих болезней, включающих в себя некоторые раковые и нейродегенеративные заболевания.

В объем настоящего изобретения также входит использование GGF2 или домена, подобного эпидермальному фактору роста (EGFL), кодируемого геном нейрегулином, для изготовления лекарства для введения пациенту, у которого с помощью диагностических способов согласно настоящему изобретению выявлена патология сердца. Настоящее изобретение дополнительно охватывает использование GGF2 или домена, подобного эпидермальному фактору роста (EGFL), кодируемого геном нейрегулином, в комбинации с ингибитором протеасом для изготовления лекарства для введения пациенту, у которого с помощью диагностических способов согласно настоящему изобретению выявлена патология сердца.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из приведенного ниже описания предпочтительных вариантов его осуществления и из формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1A-1C показывают графики выживания (A), гистограммы (B-C) и иммуноблоты (C). В анализе выживания (A) мышам вводили единственную дозу доксорубицина (20 мг/кг, внутрибрюшинно (в/б)) с сопутствующей инъекцией гена нейрегулина-1 (NRG1) (0,75мг/кг, подкожно (п/к) ежедневно) или без указанной инъекции. Выживание в течение четырнадцати дней анализировали по методике Каплана-Мейера. Относительно определения сывороточного уровня креатинкиназы (КК) (B): сывороточные уровни КК измеряли у контрольных мышей, у мышей, получавших доксорубицин (Dox), и мышей, получавших Dox-NRG1 через четыре дня после инъекции доксорубицина. Фиг.1C показывает, что инъекция NRG1 облегчала индуцированную доксорубицином даун-регуляцию уровней белка cTnl, cTnT и cTnC у мышей. Мышам вводили доксорубицин (20 мг/кг, в/б) с сопутствующей инъекцией гена нейрегулина-1 (NRG1) (0,75мг/кг, подкожно (п/к) ежедневно) или без сопутствующей инъекции. Уровни белков cTnl, cTnT и cTnC измеряли анализом вестерн-блоттинг через пять дней после введения доксорубицина.

Фиг.2A-D показывают результаты иммуноблот-анализов для обнаружения указанных белков. Фиг.2A показывает, что NRG1 облегчал доксорубицин-индуцированную даун-регуляцию уровней белка cTnl и cTnT в кардиомиоцитах новорожденной крысы (КМНК). Клетки КМНК обрабатывали доксорубицином (1 мкМ) в присутствии или отсутствии NRG1 (20 нг/мл или 50 нг/мл). Уровни содержания белков cTnl и cTnT измеряли анализом вестерн-блоттинг через 48 часов после обработки доксорубицином. Фиг.2B показывает, что ингибирование erbB2 устраняло действие NRG1 на cTnl и cTnT. Клетки КМНК обрабатывали доксорубицином (1 мкМ) и NRG1 (20нг/мл) в присутствии или отсутствии, или AG879 (10 мкМ), или AG1478 (10 мкМ). Уровни содержания белка cTnl и cTnT измеряли в анализе вестерн-блоттинг. Как показано на фиг.2C, клетки КМНК обрабатывали доксорубицином и NRG1 в присутствии LY294002 (10 мкМ), Akti (5 мкМ), PD98059 (50 мкМ) и рапамицина (10 нМ). Уровни содержания белков cTnl и cTnT измеряли в анализе вестерн-блоттинг. Фиг.2D показывает введение в КМНК доксорубицина или доксорубицина + NRG1 в присутствии циклоксемида (5 мкг/мл), Z-VAD (100 мкМ) или MG1 32 (10 мкМ). Уровни содержания белков cTnl и cTnT измеряли анализом вестерн-блоттинг.

Фиг.3A-3D показывают иммуноблоты (A, C, D) и гистограммы (B). Фиг.3A представляет результаты введения в клетки КМНК доксорубицина (1 мкМ) в присутствии ингибиторов разных каспаз (20 мкМ). Уровни содержания белков cTnl и cTnT измеряли c помощью анализа вестерн-блоттинг. Фиг.3B показывает эффекты активации каспазы на клетки КМНК, обработанные доксорубицином. Клетки обрабатывали Dox, Dox+NRG1 или Dox+NRG1+LY. Активацию каспазы анализировали в тесте активации каспазы. Фиг.3C показывает, что NRG1 уменьшает высвобождение цитохрома С, индуцированное доксорубицином. Клетки КМНК обрабатывали Dox или Dox+NRG1. Высвобождение цитохрома С анализировали путем фракционирования клетки и анализом вестерн-блоттинг. Фиг.3D показывает, что NRG1 уменьшает индуцированное доксорубицином убиквитинилирование cTnl. Клетки КМНК обрабатывали Dox или Dox+NRG1. Клеточные лизаты подвергали иммунопреципитации с cTnl-антителом и исследовали с убиквитин-антителом.

Фиг.4A-4B показывают агарозные гели (A) и иммуноблоты (B) с пятнами бромида этидия.

Фиг.4A показывает, что NRG-1 ингибирует доксорубицин-индуцированную даун-регуляцию уровней мРНК cTnl, cTnT и кардиальных специфичных факторов транскрипции. Клетки КМНК обрабатывали Dox или Dox+NRG1. Уровни мРНК cTnl, cTnT, GATA4, MEF2c и NKX2,5 анализировали количественной полимеразной цепной реакцией в реальном времени РВ-ПЦР.

Фиг.4B показывает, что NRG1 ингибирует доксорубицин-индуцированное дефосфорилирование молекул трансляции. Клетки КМНК обрабатывали Dox, Dox+NRG1 или Dox+NRG1+LY. Уровни фосфорилирования mTOR, P70S6K, S6, 4EBP и EIF4G анализировали анализом вестерн-блоттинг.

Фиг.5A-5C показывают график выживания (A), гистограммы (B) и иммуноблот (C).

Фиг.5A показывает анализ выживания мышей с кардиомиоцит-специфической свехэкспрессией доминантного негативного PI3K (dnPDK) после лечения доксорубицином. Мышам вводили единственную дозу доксорубицина (20 мг/кг, в/б) с сопутствующим введением NRG1 (0,75 мг/кг, п/к) или без сопутствующего введения.

Выживание в течение четырнадцати дней анализировали по методике Каплана-Мейера. Фиг.5B показывает измерения гемодинамики у dnPI3K мышей, леченных доксорубицином. Мышам вводили единственную дозу доксорубицина (20 мг/кг, в/б). Измерения гемодинамики проводили через шесть дней после введения доксорубицина. Фиг.5C показывает уровни содержания белка cTnl у мышей dnPDK, которым вводили Dox или Dox+NRG1.

Фиг.6A-D показывают последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот GGF2.

Фиг.7 показывает последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот EGFL1.

Фиг.8 показывает последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот EGFL2.

Фиг.9 показывает последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот EGFL3.

Фиг.10 показывает последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот EGFL4.

Фиг.11 показывает последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот EGFL5.

Фиг.12 показывает последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот EGFL6.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Обычно когда пациент приходит в лечебное учреждение с жалобами на боль в груди, проводят следующие этапы диагностики для оценки состояния сердца пациента и определения тяжести всех выявленных нарушений. Для начала проводят опрос пациента для сбора полного перечня симптомов, чтобы медицинский работник мог исключить проблемы, не связанные с сердцем. Во-вторых, проводят электрокардиографическое исследование (ЭКГ), при котором регистрируются электрические волны, возникающие в сердце. ЭКГ является важным инструментом для определения степени тяжести болей в груди, связанных с болезнями сердца и для измерения степени поражения сердца. Данные анализов крови также имеют значение для обнаружения в сыворотке повышения уровней содержания некоторых факторов, таких как тропонины и креатинкиназа (КК), и более кардиоспецифичных изоформ креатинкиназы (КК-MB), которые являются показателями поражения сердца. Повышение в сыворотке уровней КК, КК-MB и тропонинов происходит вследствие высвобождения этих молекул после смерти сердечных мышечных клеток и служит, таким образом, сывороточным маркером некроза. Когда сердечная мышечная клетка умирает, например, в результате длительной ишемии, происходит разрыв клеточной мембраны с выходом содержимого цитозоля во внеклеточное жидкое пространство, откуда оно проникает в лимфатическую систему, и затем в циркулирующую кровь. В контексте диагностики также можно использовать тесты с получением изображений, включающие в себя эхокардиографию и перфузионную сцинтиграфию.

Наиболее специфичными доступными маркерами некроза сердечной мышцы являются сердечные тропонины. Эти белки представляют собой компоненты контрактильного аппарата миокардиальных клеток. Было налажено производство и продажа двух сердечных тропонинов, cTnl и cTnT, и обнаружение этих маркеров считается надежным и специфичным исследованием для обнаружения минимального уровня повреждения миокарда. Сердечные тропонины, такие как КК-MB, высвобождаются из мертвых сердечных мышечных клеток после разрыва клеточной мембраны, и в конечном счете их можно обнаруживать в крови. Некроз может происходить в результате продолжительной ишемии миокарда, но также может быть результатом повреждения миокардиальных клеток вследствие других причин, таких как инфекция, травма или ишемическая болезнь сердца.

Настоящее изобретение в ряде аспектов отличается от методик, ранее описанных в данной области техники. В первую очередь его целью является измерение внутриклеточного уровня cTnl и cTnT в интактной сердечной ткани в отличие от измерения уровня указанных маркеров в сыворотке. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что уменьшение внутриклеточного уровня cTnl и cTnT в интактной сердечной ткани служат диагностическим маркером для выявления пациентов группы риска по повреждению сердца патологии или с наличием повреждения сердца. Такой подход значительно отличается от измерения уровней содержания указанных маркеров в сыворотке, повышение которых является показателем патологии сердца. Кроме того, повышение уровней содержания этих маркеров в сыворотке представляет собой кратковременный или промежуточный маркер поражения сердца, тогда как измерение внутриклеточных уровней cTnl и cTnT в интактной сердечной ткани служит устойчивым маркером, отражающим состояние сердца. Согласно настоящему изобретению, выявление пациентов со сниженным внутриклеточным уровнем cTnl и cTnT в интактной сердечной ткани также обеспечивает способ скрининга для разделения пациентов на группы с целью последующего лечения. Пациентам с доказанным сниженным внутриклеточным содержанием cTnl и cTnT показано лечение подходящими композициями, выбираемыми для восстановления, по меньшей мере частичного, нормальной работы сердца, проявлением чего является его восстановление.

Примером терапевтического агента, включаемым в такую композицию, является глиальный фактор роста 2 (GGF2). На фиг.6A-6D представлены последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот GGF2. Терапевтические композиции могут также включать в себя, например, другие полипептиды, такие как домены, подобные эпидермальному фактору роста (EGFL), кодируемые геном нейрегулином, что показано на фиг.7-12 и описано в патенте США (USPN) 5530109, который включен в настоящее изобретение во всей полноте.

Для более четкой формулировки параметров настоящего изобретения в нем использованы следующие определения:

В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения при использовании существительных в единственном числе эти понятия включают в себя ссылки на множественное число, если в контексте ясно не указано иначе. Таким образом, например, ссылка на термин "способ" включает в себя один или больше способов, и/или этапов того типа, который описан в настоящем изобретении и/или который будет очевиден для специалистов в данной области техники после прочтения настоящего раскрытия.

Композиции, содержащие молекулы или соединения настоящего изобретения, можно вводить в диагностических и/или терапевтических целях. Применение композиций в диагностических целях подразумевает их введение пациенту для определения наличия у пациента повреждения сердца и/или для дифференциации пациентов в отношении предполагаемых схем лечения. Для терапевтического применения композиции вводят пациенту при диагностированном наличии повреждения сердца в количестве, достаточном для лечения пациента, и, таким образом, по меньшей мере частично, устраняются симптомы заболевания и его осложнения. Количество, адекватное для достижения указанной цели, определяют как "терапевтически эффективное количество или доза". Количество, эффективное для такого применения, будет зависеть от степени тяжести заболевания, веса и общего состояния пациента.

Используемое в настоящем изобретении выражение "контрольный образец сердечной ткани" относится к образцу сердечной ткани с внутриклеточным содержанием cTnl и cTnT в пределах нормального диапазона. Нормальный диапазон или диапазон дикого типа внутриклеточных уровней cTnl и cTnT устанавливают на основе экспериментов, например, представленных в настоящем изобретении и известных в данной области техники, в которых используют сердечную ткань субъекта со здоровой работой сердца, что определяет практикующий специалист, в качестве стандарта, с которым сравнивают исследуемые образцы. Стандартные образцы нормальных сердец, например, можно получать при вскрытиях свежих трупов, не имеющих признаков заболевания сердца.

Аналогично, термин "контрольный или нормальный уровень" относится к уровням, которые установлены или определены согласно настоящему описанию и в данной области техники считается, что указанные уровни находятся в пределах диапазона, связанного со здоровым функционированием.

Согласно настоящему изобретению здоровое функционирование относится к здоровой работе сердца, которую может оценить практикующий специалист с использованием стандартных методик, таких как измерение систолического и диастолического артериального давления, измерение сывороточных уровней белков-индикаторов, таких как КК, КК-MB и тропонинов, регистрация ЭКГ и/или проведение теста с физической нагрузкой. Практикующий специалист будет знаком с показателями, которые обычно считаются нормальным уровнем содержания указанных белков в сыворотке.

Был проведен ряд исследований в отношении, например, уровня содержания КК в сыворотке, и установлены общие принципы подхода. В одном из таких исследований выявлено, что, например, у пациентов с подозрением на инфаркт миокарда (ИМ), имевших уровень креатинкиназы в сыворотке 280 МЕ/л или больше, наблюдался высокий риск ИМ; у пациентов с уровнем креатинкиназы в сыворотке от 80 до 279 МЕ/л существовал риск ИМ; пациенты с уровнем креатинкиназы от 40 до 79 МЕ/л имели меньший риск ИМ; и пациенты с уровнем креатинкиназы менее 40 МЕ/л имели гораздо меньший риск ИМ. В отношении считающихся нормой уровней содержания в сыворотке КК или тропонинов нужно подразумевать, что в разных лечебных учреждениях установлены слегка отличающиеся стандарты. Кроме того, практикующий специалист должен знать о принятом в конкретном лечебном учреждении стандарте (например, в конкретной клинике), в котором этот специалист работает.

Тропонин также считается чувствительным и специфичным маркером поражения сердца. В действительности, для диагностики ИМ обнаружение в сыворотке тропонина I (sTnl) считается более точным и представляет более полезную прогностическую информацию, чем показатели концентрации креатинкиназы-MB. Обнаружение sTnl также позволяет на ранних сроках выявить пациентов с острыми коронарными синдромами, имеющих повышенный риск летального исхода. Показатели sTnl более чувствительны, чем концентрации креатинкиназы-MB, для обнаружения незначительного ишемического повреждения миокарда у пациентов с небольшим повышением общей креатинкиназы, и их определение предотвращает большую частоту ложных диагнозов, связанных с использованием креатинкиназы-MB в качестве диагностического маркера в периоперационном периоде ИМ. В одном исследовании, например, пациенты с умеренным повышением уровня сывороточного тропонина I (0,4-2,0 мкг/л) демонстрировали значительно более высокую смертность и большую продолжительность пребывания в стационаре и в отделении интенсивной терапии при сравнении с пациентами без подобного повышения. В диапазоне умеренно повышенной концентрации тропонина более высокие титры были связаны с увеличенным риском смертности, большей продолжительностью пребывания в стационаре и в отделении интенсивной терапии и более высокой частотой возникновения инфаркта миокарда. У пациентов, в сыворотке которых обнаружена максимальная концентрация тропонина, равная или больше 2 мкг/л, лечение β-блокаторами и аспирином улучшало прогноз.

Что касается нормальных уровней внутриклеточного cTnl и cTnT, они были установлены путем изучения нормальной сердечной ткани с использованием стандартных способов определения уровней содержания белка, таких как способы, описанные в настоящем изобретении и известные в данной области техники. Сниженные уровни внутриклеточного cTnl и cTnT, как показатели поврежденного или больного сердца, определяют как снижение уровней указанных белков относительно установленного нормального уровня. В качестве примера, снижение уровня cTnl и/или cTnT в сердечной ткани по меньшей мере на 50% подвергается исследованию на повреждение относительно этих уровней в здоровой сердечной ткани (нормальный контроль) и служит положительным индикатором повреждения исследуемой сердечной ткани, и пациент, у которого удалили поврежденную ткань, получит пользу от терапевтического вмешательства, такого, как описано в настоящем изобретении. В более конкретном примере снижение уровня содержания cTnT по меньшей мере на 75% в сердечной ткани, исследуемой на повреждение, относительно уровня cTnT в здоровой сердечной ткани (контроль нормы), служит положительным индикатором повреждения исследуемой сердечной ткани, и пациент, у которого удалили поврежденную ткань, получит пользу от терапевтического вмешательства, такого, как описано в настоящем изобретении.

Практикующий специалист также будет знаком с большим объемом научной литературы, относящейся к действию и уровню содержания внутриклеточного cTnl и cTnT в сердечной ткани в норме и патологии. Примеры ссылок, которые относятся к внутриклеточному содержанию cTnl и cTnT в сердечной ткани в норме и патологии, включают следующие публикации: Latif et al. (2007, J Heart Lung Transplant 26:230-235); Birks et al. ( 2005, Circulation 112 (9 Suppl):I57-4); Day et al. (2006, Ann NY Acad Sci 1080:437-450); VanBuren et al. (2005, Heart Fail Rev 10:199-209); de Jonge et al. (2005, Int J Cardiol 98:465-470); Wen et al. (2008, J Biol Chem Apr 22, Epub ahead of print); Li et al. (2008, Biochem Biophys Res Commun 369:88-99); Robinson et al. (2007, Circ Res 101:1266-1273); Solzin et al. (2007, Biophys J 93:3917-3931); (Chen et al. (2007, Cardiovasc Toxicol 7:114-121); Solaro et al. (2007, Circ Res 101:114-115); Kubo et al. (2007, J Am Coll Cardio 49:2419-2426); Day et al. (2007, J Mol Med 85:911-921); Milting et al. (2006, Mol Call Cardiol 41:441-450), полное содержание каждой из которых включено в настоящее изобретение путем ссылки.

В другом варианте осуществления изобретения повышение внутриклеточного уровня cTnl и cTnT, определяемое путем анализа содержания белков до начала лечения, во время (или после) применения схемы лечения, показывает терапевтическую эффективность схемы лечения и является доказательством того, что лечение способствует восстановлению нормальной работы сердца. В действительности, повышение внутриклеточного уровня cTnl и cTnT можно использовать для замещения конечного показателя улучшения работы сердца (то есть в качестве биомаркера, предназначенного для замены ожидаемого клинического результата). При этом, если внутриклеточный уровень cTnl и cTnT остается сниженным или дополнительно снижается после терапевтического вмешательства, практикующий специалист будет пересматривать преимущества такой схемы лечения в отношении пациента, которому проводят лечение, и будет менять или, возможно, сокращать схему лечения.

Используемое в настоящем изобретении понятие "проведение профилактики" или "профилактика" относится к уменьшению риска приобретения или развития заболевания или нарушения (т.е. предупреждение развития по меньшей мере одного из клинических симптомов болезни у субъекта, который может подвергаться воздействию агента, вызывающего болезнь, или предрасположен к болезни, перед началом болезни.

Термин "профилактика" связан с "предотвращением" и относится к способу или процедуре, цель которой состоит в предотвращении болезни, в отличие от ее лечения или излечения. Неограничивающие примеры профилактических мероприятий могут включать в себя введение вакцин, введение низкомолекулярного гепарина стационарным больным с риском тромбоза, например обусловленным иммобилизацией, и введение противомалярийного средства, такого как хлорохин, перед посещением географической зоны, где малярия является эндемичной или существует высокий риск заражения малярией.

Понятие "проведение лечения" или "лечение" какой-либо болезни или нарушения в одном варианте осуществления относится к улучшению болезни или нарушения (т.е. прекращение болезни или уменьшение ее проявления, степени распространенности или тяжести по меньшей мере одного из ее клинических симптомов). В другом варианте осуществления "проведение лечения" или "лечение" относится к улучшению по меньшей мере одного физического параметра, который, возможно, является различимым для субъекта. Еще в одном варианте осуществления "проведение лечения" или "лечение" относится к изменению болезни или нарушения, как к физическому (например, стабилизация различимого симптома), к физиологическому (например, стабилизация физического параметра), так и к обоим изменениям.

Инвазивные методики выделения ткани

Биопсия миокарда является общепринятой процедурой, при которой осуществляют забор сердечной ткани из сердца посредством катетера, во время торакотомии или во время операции со вскрытием грудной клетки. Обычно эту процедуру используют для определения этиологии сердечной недостаточности. Проводят и гистологический, и биохимический анализ сердечной ткани. Результаты этих анализов полезны для диагностики причины сердечной недостаточности. Для обзора публикаций по теме биопсии миокарда в клинической практике см. статью Veinot (2002, Can. J. Cardiol. 18 (3):287-96), полное раскрытие которой включено со ссылкой в настоящее изобретение.

Результаты биопсии миокарда могут указывать на то, что возникновение сердечной недостаточности обусловлено такими причинами, как склеродерма, вирусный миокардит, лекарственная интоксикация или рядом других причин. Указанные диагнозы будут определять вид терапевтического вмешательства, если оно предусмотрено, которое может быть полезным и которое необходимо применять.

Биопсия миокарда (или кардиальная биопсия) является инвазивной процедурой, при которой можно использовать, например, биоптом (маленький катетер с захватывающим устройством на конце), чтобы получить небольшой кусочек сердечной мышечной ткани, пригодный для анализа. Биопсию миокарда можно применять для оценки отторжения сердечного трансплантата и диагностики миокардита (воспаления миокарда).

Практикующий специалист будет знаком с основным протоколом биопсии миокарда с использованием катетера, при этом биопсия по существу охватывает следующее: применяется местное анестезирующее средство для потери чувствительности участка шеи или паховой области пациента; в кровеносный сосуд анестезированной области специалист вставляет пластиковую канюлю интродуктора (короткую полую трубку, через которую вводят катетер); через канюлю вставляют биоптом и продвигают его к правому желудочку пациента; затем осуществляют забор образцов сердца, используя захватывающее устройство биоптома. Во время процедуры для правильного размещения биоптома обычно используют рентгеновскую камеру. Образцы имеют размер примерно с булавочную головку. После забора достаточного количества образцов катетер удаляют и останавливают местное кровотечение плотной давящей повязкой. Во время процедуры пациенты могут бодрствовать и находиться в сознании.

Для прогнозирования и диагностики наличия и степени повреждения миокарда после миокардиального события рутинными способами измеряют содержание определенных белков в циркулирующей крови. Эти белки включают в себя без ограничения креатинкиназу и тропонин. Обнаружение определенных подтипов указанных и других белков в циркулирующей крови представляет собой диагностику высвобождения этих белков из миокарда и, таким образом, диагностику повреждения. Обнаружение указанных белков-индикаторов в сыворотке обычно используют в острой ситуации при подозрении на кардиальное событие, что является доказанно полезным для назначения наиболее оптимального лечения пациента. Будучи полезными в острых случаях, показатели уровня кардиальных белков в циркулирующей крови в период позже, чем через несколько дней после кардиального события, не имеют какого-либо значения для диагностики и прогноза сердечной недостаточности и при этом не имеют какого-либо значения для определения этиологии заболевания сердца или надлежащего курса лечения. Поскольку уровень кардиальных белков в крови не повышается, за исключением острого периода сразу после кардиального события, измерение указанных белков в циркулирующей крови является малоинформативным в отношении состояния миокарда.

С другой стороны, настоящее изобретение описывает применение биопсии миокарда для предварительного выявления пациентов, которые могут реагировать на кардиопротективную, кардиовосстановительную и другую терапию сердечной недостаточности. Составление прогноза в отношении пациента, восприимчивого к указанным способам лечения, будет улучшать лечение, способствуя гарантии того, что конкретные виды лечения назначаются правильной группе пациентов и, что важно, ограничит число пациентов, получающих малозначимое лечение, и поэтому только подвергающее их риску потенциально серьезных побочных эффектов. Дополнительно, биопсия миокарда и определение содержания некоторых белков могут показывать, какие пациенты восприимчивы к конкретным видам лечения и кому из них необходимо продолжать лечение.

Данные, представленные в настоящем изобретении, показывают, что, как и предполагалось, некоторые белки, включающие в себя креатинкиназу и тропонин, можно обнаружить в циркулирующей крови непосредственно сразу после сердечного приступа.

Данные также показывают, что можно измерить устойчивое снижение уровня миокардиальных белков в образцах миокарда, взятых спустя продолжительное время после возвращения уровня кардиальных белков в циркулирующей крови к нормальным низким показателям. Эти данные также показывают, что лечение повреждений сердца нейрегулином может предотвратить снижение и восстановить содержание кардиального белка в больном сердце. Такое восстановление имеет корреляцию с улучшенным выживанием и физиологическими показателями сердца.

Кроме того, эти данные демонстрируют, что нейрегулин может восстанавливать содержание миокардиального тропонина после инсульта. Тропонин представляет собой ключевой белок, важный для сократительных свойств сердца. Таким образом, восстановление содержания тропонина важно для восстановления нормальной физиологии сердца. Использование измерения содержания миокардиального тропонина при биопсии миокарда для определения того, является ли сниженное содержание миокардиального тропонина компонентом ослабленной работы сердца, поможет делать прогноз, какие пациенты могут реагировать на кардиовосстановительную терапию, такую как введение нейрегулина. Дополнительно, измерение содержания миокардиального тропонина можно использовать в качестве исследования для определения, какие именно пациенты реагируют на кардиовосстановительную терапию, например, нейрегулин. Информация о благоприятном ответе пациентов на терапию поможет прогнозировать необходимость и время повторного лечения таких пациентов, их наблюдения или прекращения лечения. Можно использовать измерение содержания миокардиального тропонина для оптимизации дозирования конкретным пациентам, которые получают кардиовосстановительную терапию при болезни сердца. Аналогично, при хроническом состоянии болезни, когда происходит непрерывное снижение содержания миокардиального тропонина, поддержание уровня миокардиального тропонина может указывать на успех кардиовосстановительной терапии, такой как введение нейрегулина при наличии продолжающейся болезни. Подобным образом показатели миокардиального тропонина можно использовать для прогноза реакции на терапию и оптимизацию дозирования.

Введение доменов GGF2 или EGFL нейрегулина, например, можно начинать с дозы около 100 мг/кг и титровать указанные дозы до более высоких уровней, на основании реакции пациента, включающей в себя оценку внутриклеточных уровней содержания cTnl и cTnT в сердечной ткани пациента.

Уровни внутриклеточного содержания cTnl и cTnT в сердечной ткани после ее выделения можно определять способами, описанными в примерах, представленных в настоящем изобретении, и известными в данной области техники. Клеточные лизаты изолированной сердечной ткани или полученные из них преципитаты можно анализировать, например, используя множество способов, включающих в себя без ограничения, иммуноблот-анализ, энзим-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) и масс-спектрометрию. Фактически протокол ELISA был разработан для обнаружения кардиально-специфичного тропонина T, в котором задействовано высоко аффинное кардиально-специфичное антитело (М11.7). Порог чувствительности этого исследования ниже, чем пороги чувствительности протоколов ELISA первого поколения, в которых использовали перекрестно-реагирующее антитело 1B10 (0,0123 мкг/л по сравнению с 0,04 мкг/л, соответственно).

Способы обнаружения уровня тропонина I и T in vivo

Развитие технологии в области молекулярного отображения привело к возможности осуществления способов неинвазивных изображений с высокой разрешающей способностью in vivo, которые позволяют клиницистам проводить диагностику и оценку терапевтической эффективности на молекулярном и клеточном уровне. Фактически термин «молекулярная визуализация» в широком смысле определяется как характеристика и измерение in vivo биологических процессов на клеточном и молекулярном уровне. См. публикацию Weissleder et al. (Radiology 219:316-333, 2001), которая полностью включена в настоящее изобретение. Ядерная визуализация, например, которая включает в себя позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ), микро-ПЭТ, однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (ОЭКТ) и планарную визуализацию, в общем охватывает визуализацию эндогенного или экспрессируемого белка с использованием специфичных радиофармацевтических препаратов в качестве зондов обнаружения. Например, ПЭТ способна воспроизводить трехмерное изображение или карту функциональных процессов в организме, которая облегчает исследование клеточных компонентов и молекулярных взаимодействий внутри клеток в реальном времени. ПЭТ используют и в качестве медицинского оборудования и в качестве инструмента для исследования. Что касается применений в медицине, ПЭТ широко используют в клинической онкологии для визуализации опухолей и выявления метастазов и в клинической диагностике ряда заболеваний мозга, в особенности связанных с деменцией. Возможность повторного проведения у пациента исследования ПЭТ позволяет практикующему специалисту сравнивать результаты в течение продолжительного времени, например, для оценки развития болезни или эффективности выбранного протокола лечения. ПЭТ также используют в качестве исследовательского инструмента, для картирования нормальных функций мозга и сердца человека.

Альтернативные способы сканирования включают в себя рентгеновскую компьютерную томографию (КТ), магнитно-резонансную томографию (МРТ), функциональную магнитно-резонансную томографию (фМРТ) и ультразвуковое исследование. Изображения при сканировании, например, КТ и МРТ, хорошо подходят для визуализации органических анатомических изменений в организме, тогда как разрешение сканирующих устройств ПЭТ, например, ОЭКТ и фМРТ, как указано выше, позволяет обнаружить изменения на молекулярном уровне еще раньше, чем изменения, очевидные на анатомическом уровне. Сканирование, такое как ПЭТ, достигает этого предела при использовании молекулярных исследований с радиомеченными молекулярными зондами, которые показывают различные уровни захвата, в зависимости от типа и функции рассматриваемой ткани. Также можно визуализировать изменения регионарного кровотока в различных анатомических структурах и проводить их количественное определение путем ПЭТ-сканирования. Некоторые из вышеупомянутых способов сканирования можно применять в комбинации, в зависимости от совместимости используемых радиоизотопов, для получения более полной информации, что повышает точность клинической оценки. Это рассмотрено ниже в настоящем описании в отношении визуализации ОЭКТ.

Как указано выше, методики ядерной визуализации, такие как ПЭТ, микро-ПЭТ, ОЭКТ и планарной визуализации, нацелены на визуализацию эндогенного или экспрессируемого белка с использованием специфичных радиофармацевтических препаратов в качестве зондов обнаружения. Отображение маркерных генов, кодирующих внутриклеточные ферменты и отображение маркерных генов, кодирующих белки поверхности клетки или рецепторы, успешно используют во множестве экспериментальных систем для визуализации специфичных молекул in vivo. Также можно оценивать активность внутриклеточного фермента путем мечения побочных продуктов, являющихся показателями уровня и/или активности конкретного внутриклеточного фермента. В ПЭТ и микро-ПЭТ, например, используются позитрон-меченные молекулы для отображения процессов, вовлеченных в метаболизм, клеточную коммуникацию и экспрессию генов. Способы молекулярной визуализации описаны в публикации Kim (Korean J. Radiology 4:201-210, 2003), которая путем ссылки включена в настоящее изобретение во всей полноте.

Радионуклиды, используемые в ПЭТ-сканировании, обычно являются изотопами с коротким периодом полураспада, например, ¹¹C (~20 минут), ¹³N (~10 минут), ¹⁵O (~2 минуты) и ¹⁸F (~110 минут). Указанные радионуклиды включают в состав соединений, обычно задействованных в организме, таких как глюкоза, вода или аммиак, и затем их вводят в организм с целью проследить их распределение. Такие меченные соединения называют радиоиндикаторами. Короткий период полураспада этих радиоиндикаторов является ограничением для клинической ПЭТ, и прежде всего используют индикаторы, меченные ¹⁸F с периодом полураспада 110 минут, которые можно транспортировать на достаточное расстояние перед использованием, или меченные ⁸²Rb, которые можно создавать в портативном генераторе и использовать для исследований миокардиальной перфузии.

ОЭКТ представляет собой пример медицинской ядерной томографической техники визуализации, в которой используют гамма-лучи. Она очень сходна с общепринятой медицинской ядерной планарной визуализацией с использованием гамма-камеры. Вместе с тем, в отличие от планарного изображения, ОЭКТ может предоставлять реальную трехмерную информацию. Такая информация обычно представлена поперечными сквозными снимками пациента, но ее можно модифицировать в зависимости от требуемого вида. Изображение, полученное гамма-камерой, является 2-мерным видом 3-мерного распределения радионуклида. Поскольку получение ОЭКТ очень сходно с планарной визуализацией в гамма-камере, для любого протокола можно применять одни и те же радиофармацевтические препараты. Если проводят исследование пациента с использованием, например, альтернативного типа медицинской ядерной визуализации, но изображения не являются диагностическими, возможно проведение последовательного сканирования с использованием ОЭКТ путем реконфигурации камеры для получения изображения ОЭКТ, в то время как пациент остается на столе или перемещая пациента к устройству ОЭКТ.

ОЭКТ также можно использовать для получения стробоскопического изображения сердца. Для получения дифференцированной информации о сердце в разные периоды седечного цикла можно использовать стробоскопическую ОЭКТ миокарда и получать количественную информацию о миокардиальной перфузии, толщине и сократимости миокарда во время разных периодов сердечного цикла. Также ее используют для облегчения вычисления фракции изгнания левого желудочка, ударного объема и сердечного выброса.

Визуализация перфузии миокарда (MPI) является примером получения функционального изображения сердца, которое используется для диагностики ишемической болезни сердца. В основе MPI лежит принцип, что в условиях нагрузки ослабленная или больная сердечная мышца получает меньший объем кровотока, чем нормальный миокард. Коротко вводят кардиоспецифичный радиофармацевтический препарат, например, ^99mTc-тетрофосмин (фирмы Myoview™, GE healthcare) или ^99mTc-сестамиби (Cardiolite®, Bristol-Myers Squibb), и после этого введения повышают сердечный ритм для индукции нагрузки миокарда. Согласно стандартной практике, увеличение сердечного ритма обычно вызывают или с помощью физической нагрузки, или фармакологически путем применения аденозина, добутамина или дипиридамола. Проводимая после индукции нагрузки ОЭКТ показывает распределение радифармацевтического препарата и, соответственно, относительный кровоток в разных областях миокарда. Диагноз определяют путем сравнения изображений при нагрузке с последующим набором изображений, полученных в состоянии покоя.

Поскольку тропонин является структурным компонентом цитоскелета и ферментом, для измерения внутриклеточных уровней cTnl и cTnT in vivo предполагаются использовать способы молекулярного сканирования.

Фактически сердечный тропонин T присутствует в миоцитах в высоких концентрациях как в цитозольных, так и структурно-связанных белковых пулах. Цитозольный пул составляет 6%, тогда как количество в миофибриллах соответствует 94% общей массы тропонина T в кардиомиоците. В силу обычно высокого уровня присутствия тропонина T в миоцитах, мечение какого-либо одного или обоих пулов создаст достаточный сигнал, который будет визуализироваться с достоверной степенью точности и разрешения.

В одном из потенциальных подходов, предполагаемых для визуализации комплексов тропонина в сердечной ткани in vivo, используется преимущество связывающих свойств кальция (Ca²⁺) в указанном комплексе. Известно, что мышечное сокращение инициируется связыванием Ca²⁺ с тропонином (Tn) в поперечнополосатых мышцах, и более конкретно, путем связывания с Ca²⁺-связывающей субъединицей Tn (TnC), что приводит к связыванию миозина с актином, генерации возбуждения и сокращению. Степень возбуждения зависит от доступности связывающих участков миозина на актиновых филаментах, что регулируется положением тропомиозина (Tm) на поверхности актина. Ингибирующая субъединица Tn (TnI) связывается с актином в отсутствии Ca²⁺, присоединяясь к Tm, чтобы ингибировать связывание миозина. Связываясь с TnC, Ca индуцирует мощное взаимодействие TnI-TnC и ослабляет взаимодействие TnI-актин, что приводит к увеличению подвижности Tm и воздействию сильных миозин-связывающих участков на актин. Дополнительно, связывание миозина с актином приводит к образованию поперечных мостиков, которые, как считается, дополнительно перемещают Tm от блокирующих позиций и необходимы для максимальной активации актиновых филаментов в скелетных мышцах.

Ввиду вышеизложенных свойств практикующий специалист предположит использовать радионуклид Ca²⁺для визуализации in vivo цитоскелетных компонентов и, более конкретно, уровня тропонина в сердечной ткани. Альтернативно, можно применять радионуклидные метки в малых молекулах, которые специфично распознают как cTnl, так и cTnT, и вводить их пациентам для визуализации уровней внутриклеточного содержания указанных белков. Практикующий специалист может предположить ряд меченных зондов, полезных для способа настоящего изобретения, включающих в себя лиганды, антитела и субстраты cTnl или cTnT, и/или с белками, которые взаимодействуют с cTnl или cTnT.

Также можно использовать радиофармацевтические препараты, такие как препараты, описанные в патенте USPN 5324502, чтобы дать преимущество в визуализации тканей миокарда в способе настоящего изобретения. Как описано в USPN 5324502, такие радиофармацевтические препараты изготовляют путем образования липофильных, катионных комплексов ионов радиоактивных металлов с металл хелирующими лигандами, содержащими аддукты основания Шиффа триамины и тетраамины с необязательно замещенными салицилальдегидами. Эти липофильные, катионнные, радиоактивные комплексы проявляют высокий уровень захвата и удержания в миокардиальных тканях. Предпочтительно, комплексы галлия 68 (III) можно применять согласно настоящему изобретению для визуализации сердца с использованием позитронно-эмиссионной томографии. В аспекте настоящего изобретения такие радиофармацевтические препараты можно использовать в качестве средства для направленного захвата веществ, которые связываются с тропонинами в ткани сердца.

Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество агента и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретном варианте осуществления термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулирующим агентством федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее, для использования у животных, и более конкретно, у людей. Термин "носитель" относится к разбавителю, адьюванту, наполнителю или к среде, с которыми вводят препарат. Указанные фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла из нефти, масла животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло, вазелиновое масло, кунжутное масло и т.п. Если фармацевтическую композицию вводят внутривенно, предпочтительным носителем является вода. Также в качестве жидких носителей можно использовать солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, в особенности в растворах для инъекций.

Подходящие фармацевтические наполнители включают в себя крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, натрия хлорид, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Если желательно, композиция также может содержать незначительное количество увлажняющих и эмульгирующих агентов или pH-буферных агентов. Такие композиции могут находиться в виде растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, рецептур длительного высвобождения и тому подобное. Рецептуру композиции можно создавать в виде суппозиториев, с общепринятыми связующими агентами и носителями, такими как триглицериды. Пероральная рецептура может включать в себя стандартные носители, такие как фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и т.д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в издании "Remington's Pharmaceutical Sciences" E. W. Martin, включенном отсылочно во всей полноте в настоящее изобретение. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество соединения, предпочтительно в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя, чтобы получить форму для надлежащего введения субъекту. Рецептура должна соответствовать способу введения.

В конкретном варианте осуществления рецептуру композиции создают согласно рутинной методике как фармацевтическую композицию, адаптированную для внутривенного введения людям. Обычно композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. Если это необходимо, композиция также может включать в себя солюбилизирующее вещество и средство для местной анестезии, такое как ксикаин, для уменьшения боли в участке инъекции. Обычно компоненты поставляются или отдельно, или их смешивают в монолитной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного вещества. Если композицию необходимо вводить путем вливания, ее можно отпускать во флаконе для инфузий, содержащем стерильную воду фармацевтического сорта или солевой раствор. Если композицию вводят путем инъекции, можно предоставлять ампулу стерильной воды для инъекции или солевой раствор, чтобы компоненты могли быть смешаны перед введением.

Соединения настоящего изобретения можно создавать в виде нейтральных или солевых форм.

Фармацевтически приемлемые соли включают в себя соли, образованные со свободными аминогруппами, такие как полученные из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, виннокаменной кислоты и т.д., и образованные со свободными карбоксильными группами, например, полученные из гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция, трехвалентного железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.

Количество соединения настоящего изобретения, которое будет эффективным для лечения повреждения сердца, можно определять стандартными клиническими методиками на основе настоящего описания. Кроме того, необязательно, можно применять исследование in vitro, чтобы облегчить определение оптимальных диапазонов дозы. Точная доза, которая будет использована в рецептуре, также будет зависеть от пути введения и степени тяжести заболевания или нарушения и должна назначаться согласно решению практикующего специалиста и особенностей каждого субъекта. Вместе с тем, подходящие диапазоны дозы для внутривенного введения обычно составляют около 20-500 микрограмм активного соединения на килограмм массы тела. Подходящий диапазон дозы для интраназального введения обычно составляет от около 0,01 пг/кг массы тела до 1 мг/кг массы тела. Суппозитории обычно содержат активный компонент в диапазоне от 0,5% до 10% веса, пероральные рецептуры предпочтительно содержат активный компонент в количестве от 10% до 95%. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых зависимости ответа от дозы, полученных in vitro или из тестовых систем моделей животных.

Известны различные системы для доставки, которые можно использовать для введения композиций настоящего изобретения, например, инкапсулирование в липосомах, микрочастицах, микрокапсулах, рекомбинантных клетках, способных к эспрессии соединения, рецептор-опосредованный эндоцитоз (см., например, публикации Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432), и конструкции нуклеиновой кислоты в качестве части ретровирусного или другого вектора. Способы введения могут быть энтеральными или парентеральными и включают в себя без ограничения внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, перидуральный и пероральный пути введения. Соединения можно вводить любым удобным путем, например, путем вливания или болюсной инъекции, абсорбцией через эпителиальные или кожнослизистые оболочки (например, через слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.) и можно вводить вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или локальным. Дополнительно, может быть желательным введение фармацевтических композиций настоящего изобретения в центральную нервную систему любым подходящим путем, включающим в себя интравентрикулярную и интратекальную инъекцию; интравентрикулярную инъекцию можно проводить с помощью внутрижелудочкового катетера, например, присоединенного к резервуару, такому как резервуар Оммайя (Ommaya). Также можно применять внутрилегочное введение, например, при помощи ингалятора или распылителя, и рецептуры с аэрозольным веществом.

В конкретном варианте осуществления может быть желательным локальное введение фармацевтических композиций настоящего изобретения, например, путем локального вливания во время хирургического вмешательства, местное применение, например, путем инъекции, посредством катетера или посредством имплантата, при этом указанный имплантат является пористым, непористым или гелеобразным материалом, включая мембраны, такие как силастиковые мембраны, или волокна.

В другом варианте осуществления соединение или вещество можно доставлять в пузырьке, в частности, в липосоме (см. Langer (1990) Science 249: 1527-1533; Treat et al., в книге Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, там же, pp. 317-327; см. в общем там же).

Еще в одном варианте осуществления соединение или вещество можно доставлять с помощью системы регулируемого высвобождения. В одном варианте осуществления можно использовать помпу (см. Langer, выше; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Engl. 14:201; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). В другом варианте осуществления можно использовать полимерные материалы (см. Medical Applications of Controlled Release. Langer and Wise (eds.). CRC Pres. Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.). Wiley. New York (1984); Ranger and Peppas. J. 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; также см. авторов Levy et al. (1985) Science 228: 190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25:351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105). Еще в одном варианте осуществления систему регулируемого высвобождения можно размещать вблизи терапевтической мишени, то есть больного сердца, таким образом, потребуется только одна фракция системной дозы (см., например, Goodson, в книге Medical Applications of Controlled Release, выше, том.2, стр.115-138 (1984)). Обсуждение других систем регулируемого высвобождения приведено в обзоре Langer (1990, Science 249:1527-1533).

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют то же значение, которое общепринято подразумевается рядовыми специалистами в области техники, к которому относится настоящее изобретение. Любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем изобретении, могут использоваться на практике или в тестах настоящего изобретения, но вместе с тем здесь приведено описание конкретных способов и материалов. Все публикации, упомянутые в настоящем изобретении, включены в него путем ссылки для раскрытия и описания способов и/или материалов в соответствии с тематикой цитируемых публикаций.

ПРИМЕР I

По ранним сообщениям авторов настоящего изобретения рекомбинантный ген нейрегулин-1 GGF2 улучшает выживание и работу сердца у мышей после введения доксорубицина. Согласно настоящему описанию, авторы настоящего изобретения исследовали возможность GGF2 предотвращать доксорубицин-индуцированную потерю кардиомиофибрилл in vivo и кардиомиоцитов in vitro. Представленные в настоящем изобретении результаты привели к новому открытию, что внутриклеточные уровни экспрессии специфичных кардиальных белков являются полезными индикаторами нормальной работы сердца. Более конкретно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что изменения внутриклеточного содержания кардиального тропонина I (cTnl) и кардиального тропонина T (cTnT) в интактной сердечной ткани можно использовать в качестве индикаторов поражения сердца. В конкретном аспекте настоящего изобретения показано, что уменьшение уровней внутриклеточного содержания cTnl и cTnT в интактной сердечной ткани являлось полезным диагностическим маркером для выявления пациентов группы риска или наличия у пациентов повреждения сердца. Затем проводили отбор таких пациентов для соответствующего профилактического или терапевтического вмешательства согласно настоящему описанию. Также можно использовать определение внутриклеточных уровней cTnl и cTnT в интактной сердечной ткани, чтобы способствовать оценке эффективности проводимого терапевтического вмешательства, поскольку восстановление нормального внутриклеточного уровня cTnl и cTnT будет положительным индикатором того, что эта терапия улучшает работу сердца или восстанавливает нормальную работу сердца.

Материалы и способы

Материалы

Мыши C57BL/6 и крысы линии Wistar были получены из лаборатории Charles River Laboratories.

Доксорубицин получали из Бедфорской лаборатории. Глиальный фактор роста 2 был получен в подарок от фирмы Acorda Therapeutics, Inc. MG 132, циклоксемид и актиномицин приобретали в компании Sigma. Компания Cell Signalling Technology поставляла LY294002 и PD 98059. Антитела заказывали у следующих поставщиков: тропонин I, GAT A4 и Nkx2,5 в фирме Santa Cruz Biotechnology; α-саркомерный актин, тропонин T, тропонин C, тропомиозин и кардиальный тропонин T в фирме Abeam; десмин и α-актинин в компании Sigma и кардиальный тропонин I в компании GeneTex. Среды МЕМ, раствор Хенка и эмбриональную бычью сыворотку получали из компании Invitrogen. Все остальные реактивы для клеточной культуры получали из компании Sigma.

Модели животных

Для исследований брали самцов мышей C57BL/6 в возрасте от восьми до десяти недель, из сердца которых забирали образцы. Для этого исследования использовали подострую модель доксорубициновой кардиотоксичности. Мышам вводили единственную дозу доксорубицина (20 мг/кг, внутрибрюшинно (в/б)). За двадцать четыре часа до введения, в день введения и каждый день после введения доксорубицина мышам вводили или GGF2 (0,75мг/кг, подкожно (п/к)), или плацебо (препарат буфера для GGF2). Мышей забивали через 4,5 дня после указанного введения доксорубицина. Сердечные образцы (n=3-4 на группу) собирали и мгновенно замораживали в жидком азоте.

Относительно тех исследований, в которых измеряли сердечные функции (как подробно описано ниже): мышам C57BL/6 в возрасте трех месяцев вводили единственную дозу доксорубицина (20 мг/кг, в/б). Глиальный фактор роста 2 (GGF2-Dox, 0,75 мг/кг, п/к, n=74) или плацебо (буфер, применяемый для растворения GGF2, плацебо-Dox, n=73) вводили мышам за один день накануне и однократно ежедневно после введения доксорубицина. Мышей, не получавших доксорубицин, использовали в качестве контроля (n=20). Сердечные функции оценивали с помощью прямой катетеризации левого желудочка (ЛЖ) через четыре дня и через две недели после указанного введения доксорубицина. Двухнедельное выживание анализировали по методике Каплана-Мейера.

Культура кардиомиоцитов новорожденных крыс

Кардиомиоциты новорожденных крыс диссоциировали, как описано ранее (Okoshi et al. Journal of Cardiac Failure. 2004; 10:51 1-518). Коротко, желудочки крыс линии Вистар в возрасте от 0 до 3 дней разлагали в трипсине и ДНКазе II. Клетки промывали и предварительно высевали на чашки диаметром 100 мм в среде МЕМ, содержащей 5% эмбриональной бычьей сыворотки. Через 30 минут миоциты суспендировали в этой же среде, содержащей бромдеоксиуридин 0,1 ммоль/л, и затем высевали в культуральные чашки диаметром 100 мм с плотностью 500-1000 клеток/мм². Через сорок восемь часов после диссоциации среду заменяли на МЕМ без сыворотки, содержащую 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и культивировали в течение ночи перед стимуляцией.

NRGl улучшал выживание и работу сердца у мышей, получавших доксорубицин.

Результаты настоящего изобретения показывают, что через две недели после введения доксорубицина выживаемость тестированных мышей, получавших доксорубицин, значительно снижалась по сравнению с нелеченными контрольными мышами. Сопутствующее введение NRGl (Dox-NRGl) при этом значительно повышало выживаемость мышей с доксорубициновым повреждением по сравнению с мышами, получавшими плацебо (Dox-плацебо) (фиг.1A). Работу сердца дополнительно оценивали через пять дней после инъекции доксорубицина, и в этой точке времени у получавших доксорубицин мышей выживаемость начинала снижаться. Как показано в Таблице 1, масса тела (МТ), вес сердца (ВС) и вес левого желудочка (ВЛЖ) были значительно уменьшены и у мышей Dox-плацебо, и у мышей Dox-NRGl по сравнению с контрольными мышами без введения. Показатели ВС и ВЛЖ, стандартизированные по длине голени (ДГ) (ВС/ДГ и ВЛЖ/ДГ), были значительно уменьшены у мышей Dox-плацебо по сравнению с мышами контроля. Однако указанные индексы не отличались у мышей контрольной группы и мышей Dox-NRGl. Систолическое давление в левом желудочке (ЛЖСД), сердечный выброс и минимум dP/dt min были значительно снижены у мышей Dox-плацебо по сравнению с контролем. Напротив, указанные индикаторы сердечной функции не имели значительных отличий между мышами Dox-NRGl и контрольными мышами, что указывает на улучшение систолической функции сердца у мышей NRGl (Dox-NRGl) по сравнению с мышами, которым вводили плацебо (Dox-плацебо). Также оценивали в качестве индекса поражения сердца уровни сывороточной креатинкиназы (КК), чтобы обеспечить дополнительную регистрацию сердечных функций. Как показано на фиг.1B, содержание КК было значительно повышено и у мышей Dox-плацебо, и у мышей Dox-NRGl по сравнению с контрольными мышами. При этом уровень КК был значительно ниже у мышей Dox-NRGl по сравнению с мышами Dox-плацебо. Эти результаты показывают, что введение NRG-1 значительно улучшает выживание и систолическую функцию сердца у мышей, получивших доксорубициновое повреждение.

Таблица 1 Гемодинамические измерения у мышей C57BL/6, получавших Dox+плацебо и Dox+NRGl
Группа	Контроль (n=8)	Dox+плацебо (n=9)	Dox+NRGl (n=8)
ВТ (г)	25±0,4	20±0,4^†	21±0,9^†
ДГ (мм)	16,7±0,6	16,3±0,2	16,0±0,0
ВС (мг)	110±3	83±3^†	89±3^†
ВЛЖ (мг)	88±2	70±1^†	75±3^†
ВС/ВТ (мг/г)	4,5±0,1	4,1±0,1^†	4,2±0,1
ВЛЖ/ВТ (мг/г)	3,6±0,1	3,5±0,1	3,6±0,1
ВС/ДГ (мг/мм)	6,6±0,3	5,1±0,1^†	5,7±0,2
ВЛЖ/ДГ (мг/мм)	5,4±0,2	4,4±0,1^†	4,8±0,2
ЛЖСД (систолическое давление в левом желудочке) (мм рт.ст.)	100±3	84±2*	91±4
ЛЖДС (диастолическое давление в левом желудочке) (мм рт. ст.)	3,9±1,4	3,6±0,9	4,1±1,1
dP/dt max (мм рт.ст./с)	10914±856	7067±884	9709±1181
dP/dt min (мм рт.ст./с)	7859±510	5021±602*	7211±725
EF (%)	27±2	17±2^†	20±2*
Сердечный выброс (мл/мин)	3276±469	1185±203^†	2052±423
Сердечный ритм ЧСС (уд./мин)	512±40	407±39	540±45
*p<0,05; †p<0,01 по сравнению с контролем

NRGl облегчает доксорубицин-индуцированную даун-регуляцию Tnl и cTnT в сердце in vivo.

Одним из механизмов доксорубицин-индуцированной кардиотоксичности является потеря кардиомиофибрилл. Согласно настоящему описанию, авторы изобретения исследовали, происходит ли ингибирование доксорубицин-индуцированной потери миофибрилл in vivo с помощью инъекции NRGl. Результаты, представленные в настоящем изобретении, показывают, что содержание кардиальных структурных белков, α-саркомерного актина, α-актинина, тропонина T (TnT), тропонина I (TnI), тропонина C (TnC) и тропомиозина было значительно уменьшено в тканях сердец, обработанных доксорубицином. Инъекция NRGl in vivo значительно повышала уровни белка cTnl, cTnT и cTnC в доксорубицин-поврежденных сердцах (фиг.1C), но не имела какого-либо эффекта на уровни белков α-саркомерного актина, α-актинина и тропомиозина.

NRGl прекращал доксорубицин-индуцированную даун-регуляцию белков cTnl и cTnT в кардиомиоцитах in vitro.

Для дополнительного изучения механизма ингибирования NRGl доксорубицин-индуцированной даун-регуляции cTnl и cTnT авторы настоящего изобретения проводили исследования in vitro с использованием культуры кардиомиоцитов новорожденной крысы (КМНК). Как показано на фиг.2A, доксорубицин значительно снижал уровни белка cTnl и cTnT в КМНК; при этом присутствие NRG1 сохраняло уровни содержания указанных белков в обработанных доксорубицином кардиомиоцитах. Эти результаты дополнительно показали, что эти эффекты NRGl блокируются ингибиторами для erbB2, PI3K, Akt, mTOR или ERK (фиг.2B и 2C), но не блокируются ингибиторами для erbB4 (фиг.2B), p38 или PKC. Приведенные результаты также показали, что профилактические и/или восстановительные эффекты NRGl блокировались циклоксемидом, ингибитором трансляции белка (фиг.2D), но не актиномицином D, ингибитором транскрипции. Доксорубицин-индуцированная даун-регуляция cTnl и cTnT прекращалась с помощью Z-VAD, ингибитором всех каспаз, и MG132, ингибитором протеасом (фиг.2D), но не бафиломицином А1, ингибитором лизосом.

NRGl ингибирует доксорубицин-индуцированную каспазу и деградацию протеасом cTnl и cTnT в кардиомиоцитах in vitro.

Поддержание уровня белка в клетке представляет собой динамический процесс. Он зависит от скорости синтеза и расщепления белка. Авторы настоящего изобретения исследовали механизм, посредством которого доксорубицин снижает уровни белков cTnl и cTnT, чтобы определить, вызван ли этот эффект усилением их расщепления и/или уменьшением их синтеза и блокирует ли NRGl какой-либо из приведенных эффектов доксорубицина.

Для изучения ингибирования NRGl доксорубицин-индуцированного расщепления каспазой cTnl и cTnT авторы настоящего изобретения вначале идентифицировали специфичные каспазы, отвечающие за доксорубицин-индуцированное расщепление cTnl и cTnT. Кардиомиоциты обрабатывали доксорубицином в присутствии специфичного ингибитора каспазы. Как показано на фиг.3 A, ингибиторы для каспазы-3, каспазы-6 или каспазы-9 (внутренний путь) блокировали доксорубицин-индуцированную даун-регуляцию и cTnl и cTnT. Дополнительно, даун-регуляция cTnl блокировалась ингибиторами каспазы-10 (внешний путь), каспазы-2, каспазы-13 или каспазы-5. С другой стороны, даун-регуляция cTnT также блокировалась каспазой-2 и каспазой-13. Затем авторы настоящего изобретения провели анализ возможной активации указанных каспаз доксорубицином и ингибирования NRGl активации этих каспаз. Тест активации каспаз in vitro показал, что доксорубицин значительно повышает активацию каспаз -3, -6 и -9, а также каспазы-10, -2 и -5. Введение NRGl в кардиомиоциты значительно ингибирует доксорубицин-индуцированную активацию указанных каспаз (фиг.3B). PI3K-ингибитор LY294002 устранял эти эффекты NRGl. Авторы настоящего изобретения дополнительно показали, что доксорубицин вызывает увеличение высвобождения цитохрома С в цитозоле в КМНК. Вместе с тем, обработка NRGl ингибирует указанный эффект доксорубицина (фиг.3C). Этот результат, в комбинации с результатами активации каспазы-3, -6 и -9, предполагает, что доксорубицин увеличивает пермеабилизацию внешней митохондриальной мембраны, которая может отвечать за активацию каспазы-3, -6 и -9, и NRGl блокирует указанные эффекты доксорубицина. Эти результаты показали, что NRG1 ингибирует доксорубицин-индуцированую активацию, и внутреннюю и внешнюю активацию каспаз, которые отвечают, по меньшей мере, частично, за расщепление cTnl и cTnT.

Авторы настоящего изобретения дополнительно показали, что доксорубицин-индуцированная даун-регуляция cTnl блокировалась MG132 (фиг.2D). Коротко, авторы настоящего изобретения изучали, увеличивает ли доксорубицин протеасомное расщепление cTnl и блокирует ли NRGl этот эффект. Как показано на фиг.3D, доксорубицин усиливал убиквитинилирование cTnl; обработка NRGl устраняла указанный эффект доксорубицина. Этот результат показывает, что NRGl уменьшает доксорубицин-индуцированное протеасомное расщепление cTnl.

NRGl способствует доксорубицин-индуцированному снижению синтеза cTnl и cTnT в кардиомиоцитах in vitro.

Для дополнительного исследования возможного уменьшения с помощью доксорубицина транскрипции cTnl и cTnT и инвертирования с помощью NRGl этого эффекта доксорубицина измеряли содержание мРНК указанных белков в кардиомиоциты обработанных Dox-плацебо и Dox-NRGl. Как показано на фиг.4A, доксорубицин снижал содержание мРНК и cTnl, и cTnT. С другой стороны, NRGl сохранял уровень мРНК cTnl и cTnT в кардиомиоцитах, обработанных доксорубицином. Дополнительно NRGl поддерживал уровень мРНК в GATA4 и немного повышал уровень содержания мРНК в MEF2c и Nkx2.5 (фиг.4A), которые являются факторами транскрипции, важными для кардиальной специфичной генной транскрипции.

Результаты настоящего изобретения показали, что действие NRG1 на cTnl и cTnT блокировалось циклоксемидом (фиг.2D), с предположением, что NRGl повышал трансляцию указанных белков. Авторы оценили активацию ряда механизмов трансляции и соответствующих сигнальных путей в кардиомиоцитах, обработанных Dox-плацебо и Dox-NRG l. Как показано на фиг.4B, через 48 часов после обработки снижались уровни фосфорилирования mTOR (Ser 2448), P70S6K (Thr421/Ser424), S6 (Ser240/244) и eIF4G (Ser1108) в Dox-плацебо, но сохранялись в кардиомиоцитах, обработанных Dox-NRGl. LY294002 блокировал указанные эффекты NRG-I. Эти результаты предполагают, что NRG посредством PBK, сохранял активацию механизмов трансляции белка в доксорубицин-обработанных кардиомиоцитах, которые могут отвечать за поддержание уровней белка cTnl и cTnT.

Эти результаты показали, что NRGl способствовал доксорубицин-индуцированной даун-регуляции cTnl и cTnT посредством множества механизмов, которые включают в себя ингибирование активации внутренних и внешних каспаз, а также каспаз, активированных воспалением, ингибирование убиквитинилирования cTnl и увеличение транскрипции и активации передачи сигналов и механизмов трансляции. Эти результаты также предполагают, что PBK играет основную роль для NRGl в поддержании уровней содержания cTnl и cTnT в кардиомиоцитах.

Для дополнительного исследования роли PBK в опосредовании кардиопротективных эффектов NRGl in vivo, авторы настоящего изобретения использовали трансгенных мышей со специфичной сверхэкспрессией в кардиомиоцитах доминантного отрицательного PBK, которым вводили доксорубицин, как описано выше. Как показано на фиг.5A, уровень выживания был снижен у мышей dnPBK-Dox-плацебо по сравнению с мышами WT-Dox-плацебо. Введение NRGl (WT-Dox-NRG) повышало выживаемость у мышей WT (WT-Dox-плацебо) с интоксикацией доксорубицином (67% по сравнению с 33%). Удивительно, что величина этого повышения была больше, чем выживаемость, выявленная у самцов мышей C57BL/6 (фиг.1A). Результаты настоящего изобретения дополнительно показали, что такой рост уровня выживания снижался у мышей dnPBK, получавших доксорубицин (dnPBK-Dox-NRG: 56% по сравнению с мышами WT-Dox- NRG: 67%).

Также у этих мышей проводили оценку сердечных функций. Как показано на фиг.5B, показатели ЛЖСД, dP/dt max и dP/dt/в минуту, а также сердечный выброс, были в значительной степени снижены у мышей dnPBK-Dox-плацебо по сравнению с контрольными мышами dnPBK, чем у мышей WT-Dox-плацебо по сравнению с мышами WT, что указывает на более тяжелую дисфункцию сердца у мышей dnPBK-Dox-плацебо.

Авторы настоящего изобретения измерили содержание белка cTnl и cTnT у получавших доксорубицин мышей WT и dnPBK. Без введения доксорубицина уровни белка cTnl и cTnT были сходными в сердцах WT и dnPBK. Через две недели после инъекции доксорубицина в сердцах, обработанных dnPBK-Dox-плацебо, наблюдалось уменьшение содержания белка cTnl, по сравнению с сердцами, необработанными dnPBK. Поразительно, что введение NRGl тем не менее прекращало доксорубицин-индуцированное даун-регулирование cTnl в сердцах dnPBK (dnPI3K-Dox-NRG, фиг.5C). Не наблюдалось каких-либо изменений уровня содержания белка cTnT в сердцах мышей, получавших доксорубицин по сравнению с контрольными мышами в этом периоде.

Эти результаты показывают, что GGF2 специфично поддерживает уровень содержания белков TnT и TnI в поврежденных доксорубицином сердцах. Кроме того, эти результаты показывают, что GGF2 повышает выживаемость мышей, получавших доксорубицин, и это связано с улучшением работы сердца, что доказано у мышей, которым вводили и доксорубицин, и GGF2.

Выше приведено описание некоторых из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения и конкретных примеров, но не предполагается, что настоящее изобретение ограничено такими вариантами осуществления. Можно выполнять различные модификации настоящего изобретения, не отступая от его объема и сущности, что сформулировано в нижеприведенной формуле изобретения.

Claims

1. Способ скрининга популяции пациентов для выявления субпопуляции пациентов с симптомами повреждения сердца, включающий: определение внутриклеточных уровней кардиального белка тропонина Т (cTnT) или кардиального белка тропонина I (cTnl) в сердечной ткани пациента, при котором по меньше мере 50% уменьшение уровней внутриклеточного содержания белка cTnT или cTnl в сердечной ткани пациента относительно контрольных или нормальных внутриклеточных уровней белка cTnT или cTnl соответственно является показателем повреждения сердца и классифицирует пациента как члена субпопуляции пациентов, имеющих повреждение сердца.

2. Способ по п.1, в котором определение внутриклеточных уровней белка cTnT или cTnl в сердечной ткани проводят in vitro.

3. Способ по п.1, в котором определение внутриклеточных уровней белка cTnT или cTnl в сердечной ткани проводят in vivo.

4. Способ по п.1, в котором повреждение сердца является результатом кардиотоксичности, гипертонии, болезни клапанов сердца, инфаркта миокарда, вирусного миокардита или склеродермы.

5. Способ по п.4, в котором кардиотоксичность вызвана воздействием химиотерапевтического препарата или другим терапевтическим агентом, облучением или веществами, используемыми в нетерапевтических, восстановительных целях.

6. Способ по п.1, в котором контрольные или нормальные внутриклеточные уровни белка cTnT или cTnl в сердечной ткани устанавливают путем определения внутриклеточного содержания белка cTnT или cTnl в сердечной ткани пациента с нормальной работой сердца.

7. Способ по п.1, в котором контрольные или нормальные внутриклеточные уровни белка cTnT или cTnl в сердечной ткани устанавливают путем определения уровней внутриклеточного содержания белка cTnT или cTnl в сердечной ткани пациента до начала лечения, способного вызвать повреждение сердца.

8. Способ по п.1, в котором пациентом является млекопитающее.

9. Способ по п.8, в котором млекопитающим является человек.

10. Способ по п.1, дополнительно включающий лечение пациентов в субпопуляции пациентов с повреждением сердца композицией, содержащей по меньшей мере один терапевтический агент.

11. Способ по п.10, в котором по меньшей мере один терапевтический агент представляет собой глиальный фактор роста 2 (GGF2).

12. Способ диагностики пациента с подозрением на наличие повреждения сердца, включающий: определение уровней внутриклеточного содержания кардиального белка тропонина Т (cTnT) или кардиального белка тропонина I (cTnl) в сердечной ткани пациента и сравнения уровней внутриклеточного содержания белка cTnT или cTnl в сердечной ткани, которые определяют у пациента к содержанию в контрольных образцах сердечной ткани, при этом по меньшей мере 50% снижение внутриклеточных уровней белка cTnT или cTnl в сердечной ткани пациента относительно содержания в контрольных образцах сердечной ткани является показателем повреждения сердца у пациента и определяет, что пациент является кандидатом для терапевтического вмешательства для лечения повреждения сердца.

13. Способ по п.12, в котором уровни контрольного или нормального внутриклеточного содержания белка cTnT или cTnl в сердечной ткани устанавливают путем определения внутриклеточных уровней cTnT или cTnl в сердечной ткани пациента с нормальной работой сердца.

14. Способ по п.12, в котором пациентом является млекопитающее.

15. Способ по п.14, в котором млекопитающим является человек.

16. Способ определения эффективности введения GGF2 пациенту с повреждением сердца, включающий:
a) определение уровней внутриклеточного содержания кардиального белка тропонина Т (cTnT) или кардиального белка тропонина I (cTnl) в сердечной ткани пациента до введения GGF2 пациенту;
b) определение уровней внутриклеточного содержания белка cTnT или cTnl в сердечной ткани пациента после введения GGF2 пациенту; и с) сравнение внутриклеточных уровней белка cTnT или cTnl в сердечной ткани пациента до начала введения GGF2 пациенту с внутриклеточными уровнями белка cTnT или cTnl в сердечной ткани пациента после введения GGF2 пациенту, при котором увеличение внутриклеточных уровней белка cTnT или cTnl в сердечной ткани пациента после введения GGF2 является позитивным индикатором эффективности введения GGF2 для лечения пациента с повреждением сердца.

17. Способ по п.16, в котором пациентом является млекопитающее.

18. Способ по п.17, в котором млекопитающим является человек.

19. Способ лечения пациента с повреждением сердца, включающий определение по меньшей мере 50% снижения внутриклеточных уровней кардиального белка тропонина Т (cTnT) или кардиального тропонина I (cTnl) в сердечной ткани пациента относительно контрольных или нормальных внутриклеточных уровней белка cTnT или cTnl и введение терапевтически эффективного количества GGF2 и ингибитора протеасом.