RU2614694C1 - Preparation possessing neuroprotective properties in experiment and method of obtaining thereof - Google Patents
Preparation possessing neuroprotective properties in experiment and method of obtaining thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2614694C1 RU2614694C1 RU2015157140A RU2015157140A RU2614694C1 RU 2614694 C1 RU2614694 C1 RU 2614694C1 RU 2015157140 A RU2015157140 A RU 2015157140A RU 2015157140 A RU2015157140 A RU 2015157140A RU 2614694 C1 RU2614694 C1 RU 2614694C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- par1
- fibroin
- receptor agonist
- released
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102000032626 PAR-1 Receptor Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108010070519 PAR-1 Receptor Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 25
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 claims abstract description 11
- 102100036546 Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 Human genes 0.000 claims abstract 3
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 claims description 29
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 claims description 29
- 101001098529 Homo sapiens Proteinase-activated receptor 1 Proteins 0.000 claims description 11
- 101000713169 Homo sapiens Solute carrier family 52, riboflavin transporter, member 2 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100037136 Proteinase-activated receptor 1 Human genes 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 7
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 16
- 229940122985 Peptide agonist Drugs 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 25
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 16
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 9
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 7
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- HAGOWCONESKMDW-FRSCJGFNSA-N (2s)-4-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CC1=CC=CC=C1 HAGOWCONESKMDW-FRSCJGFNSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 4
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 3
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 3
- 208000036110 Neuroinflammatory disease Diseases 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000002020 Protease-activated receptors Human genes 0.000 description 3
- 108050009310 Protease-activated receptors Proteins 0.000 description 3
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 3
- 108010013296 Sericins Proteins 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000003959 neuroinflammation Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 2
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 2
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 2
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 2
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000239223 Arachnida Species 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100135641 Caenorhabditis elegans par-3 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 208000010496 Heart Arrest Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 101100406879 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) par-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710162991 PRKC apoptosis WT1 regulator protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000003790 Thrombin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000166 Thrombin receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 102000012607 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- -1 coatings Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 108091007231 endothelial receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940088592 immunologic factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000006674 lysosomal degradation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 230000010012 metabolic coupling Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 239000004090 neuroprotective agent Substances 0.000 description 1
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 101150093826 par1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 208000023516 stroke disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 239000003356 suture material Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000002227 vasoactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к области создания средств, включающих биодеградируемые матриксы на основе фиброина шелка и пептид-агонист рецептора ПАР1.The invention relates to biotechnology and medicine, in particular to the field of creating tools, including biodegradable matrices based on silk fibroin and peptide-agonist receptor PAR1.
Уровень техникиState of the art
На сегодняшний день большинство используемых в терапии разных заболеваний лекарств имеют серьезные недостатки, связанные с наличием многочисленных побочных эффектов и противопоказаний. Кроме того, лечение острых тяжелых заболеваний часто связано с ограничением терапевтического окна, в течение которого необходимо использовать лекарства. Это часто сопровождается невысокой эффективностью лечебного процесса и нежелательными осложнениям и дальнейшей инвалидизацией.To date, most drugs used in the treatment of various diseases have serious drawbacks associated with the presence of numerous side effects and contraindications. In addition, the treatment of acute serious illnesses is often associated with a limitation of the therapeutic window during which medications must be used. This is often accompanied by low efficiency of the treatment process and undesirable complications and further disability.
Сложная ситуация складывается при лечении инсультов и тяжелых воспалительных заболеваний и травм. Ишемический инсульт - острое нарушение мозгового кровообращения, сопровождается гибелью клеток мозга и нарушением его функций вследствие тромбоза или тромбоэмболии сосудов мозга. По данным ВОЗ от инсультов в мире ежегодно умирают около 6,4 млн человек. Ежегодная смертность от инсульта в нашей стране - одна из наиболее высоких в мире. Летальность в остром периоде инсульта в России достигает 35%, возрастая на 15% к концу первого года после перенесенного инсульта. Инсульт - лидирующая причина инвалидизации населения.A difficult situation arises in the treatment of strokes and severe inflammatory diseases and injuries. Ischemic stroke is an acute violation of cerebral circulation, accompanied by death of brain cells and impaired function due to thrombosis or thromboembolism of cerebral vessels. According to WHO, about 6.4 million people die every year from strokes in the world. The annual mortality from stroke in our country is one of the highest in the world. Mortality in the acute period of a stroke in Russia reaches 35%, increasing by 15% by the end of the first year after a stroke. Stroke is the leading cause of disability.
Оптимизация лечения ишемического инсульта и тяжелых воспалительных заболеваний - одна из самых актуальных проблем медицины и патофизиологии.Optimization of the treatment of ischemic stroke and severe inflammatory diseases is one of the most pressing problems of medicine and pathophysiology.
В настоящее время для лечения ишемического инсульта, который вызван окклюзией сосуда, кроме классического применения антиоксидантов и антикоагулянтов используют технологию или механического удаления тромба(ов) в сосудах мозга, или тромболитическую терапию с помощью тканевого активатора плазминогена (ТАП). ТАП - протеолитический фермент, (утвержденный FDA, США) стимулирует лизис тромбов, активируя образование протеазы - плазмина, и восстановление кровотока (реперфузию) окклюзированного сосуда. Проводить целенаправленный тромболизис с помощью ТАП - трудная и сложная задача из-за многообразия факторов риска. ТАП вызывает не только тромболизис, ангио- и нейрогенез, но также тяжелое побочное действие, приводя к нарушению гемато-энцефалического барьера, геморрагии и гибели нейронов мозга в моделях инсульта на животных.Currently, for the treatment of ischemic stroke, which is caused by vessel occlusion, in addition to the classical use of antioxidants and anticoagulants, technology is used either for mechanical removal of blood clot (s) in the vessels of the brain, or thrombolytic therapy using tissue plasminogen activator (TAP). TAP - a proteolytic enzyme (approved by the FDA, USA) stimulates the lysis of blood clots, activating the formation of a protease - plasmin, and the restoration of blood flow (reperfusion) of an occluded vessel. Conducting targeted thrombolysis using TAP is a difficult and difficult task due to the variety of risk factors. TAP causes not only thrombolysis, angio- and neurogenesis, but also severe side effects, leading to disruption of the blood-brain barrier, hemorrhage and death of brain neurons in animal stroke models.
Как показали эксперименты на животных с экспериментальной ишемией мозга и первые доклинические исследования (в США), введение вместе с ТАП в острый период инсульта белка крови - активированного протеина С (АПС) блокирует вызванную ТАП гибель нейронов и стабилизирует ГЭБ [Mosnier L.O., Griffin J.H. Protein С anticoagulant activity in relation to anti-inflammatory and anti-apoptotic activities // Front Biosci. 2006. V. 11. P. 2381-2399; Griffin J.H., Fernandez J.A., Gale A.J., Mosnier L.O. Activated protein С // J Thromb Haemost.5 Suppl 1. 2007. P. 73-80; Zlokovic B.V., Griffin J.H. Cytoprotective protein С pathways and implications for stroke and neurological disorders // Trends Neurosci. 2011. V. 34 (4). P. 198-209].As shown by animal experiments with experimental cerebral ischemia and the first preclinical studies (in the USA), administration of activated protein C - activated protein C (APS) together with TAP in the acute period of stroke blocks TAP-induced neuronal death and stabilizes the BBB [Mosnier L.O., Griffin J.H. Protein C anticoagulant activity in relation to anti-inflammatory and anti-apoptotic activities // Front Biosci. 2006. V. 11. P. 2381-2399; Griffin J.H., Fernandez J.A., Gale A.J., Mosnier L.O. Activated protein C // J Thromb Haemost. 5 Suppl. 1. 2007. P. 73-80; Zlokovic B.V., Griffin J.H. Cytoprotective protein C pathways and implications for stroke and neurological disorders // Trends Neurosci. 2011. V. 34 (4). P. 198-209].
Рецепторы, активируемые протеиназами (ПАР), опосредуют регуляторное влияние сериновых протеиназ на клетки разных тканей [Coughlin S.R. Thromb. Haemost. 2005. V. 3 (8). P. 1800-1814]. Эти рецепторы были впервые открыты в начале 1990-х годов, на данный момент их известно 4 типа - ПАР - 1, 2, 3 и 4.Proteinase-activated receptors (PARs) mediate the regulatory effect of serine proteinases on cells of different tissues [Coughlin S.R. Thromb. Haemost. 2005. V. 3 (8). P. 1800-1814]. These receptors were first discovered in the early 1990s, at the moment they are known in 4 types - PAR - 1, 2, 3 and 4.
ПАР-рецепторы относятся к семейству семидоменных трансмембранных рецепторов, сопряженных с G-белками. Внеклеточный N-конец ПАР содержит пептидную связь «активационного сайта», которая расщепляется сериновой протеиназой. Вновь образованный N-конец, так называемый «привязанный лиганд», взаимодействуя со второй внеклеточной петлей рецептора, приводит к изменению конформации молекулы ПАР и его активации. Активация ПАР является необратимой, после активации рецептор интернализуется и подвергается лизосомальной деградации.PAR receptors belong to the family of seven-domain transmembrane receptors conjugated with G-proteins. The extracellular N-terminus of PAR contains the peptide bond of the “activation site”, which is cleaved by a serine proteinase. The newly formed N-terminus, the so-called “bound ligand”, interacting with the second extracellular loop of the receptor, leads to a change in the conformation of the PAR molecule and its activation. Activation of PAR is irreversible; after activation, the receptor is internalized and undergoes lysosomal degradation.
Из семейства рецепторов, активируемых протеиназами, ПАР1 является наиболее изученным. ПАР1 был впервые идентифицирован как рецептор тромбина.Of the proteinase-activated receptor family, PAR1 is the most studied. PAR1 was first identified as a thrombin receptor.
Настоящее изобретение подразумевает использование другого агониста ПАР1 - пептида, освобождаемого АПС при расщеплении ПАР1.The present invention contemplates the use of another PAR1 agonist, a peptide released by APS upon cleavage of PAR1.
В частном варианте реализации пептид, освобождаемый АПС при расщеплении ПАР1, имеет структуру NPNDKYEPF амида.In a particular embodiment, the peptide released by APS upon cleavage of PAR1 has an NPNDKYEPF amide structure.
Активированный протеин С (АПС) - сериновая протеиназа семейства трипсина образуется в фазе инициации свертывания крови в результате ограниченного протеолиза протеина С крови тромбином, связанным с тромбомодулином эндотелия. Активация протеина С комплексом тромбин-тромбомодулин существенно ускоряется при связывании протеина С с рецептором на эндотелии сосудов - эндотелиальным рецептором протеина С.Activated protein C (APS), a trypsin family serine proteinase, is formed during the initiation phase of blood coagulation as a result of limited proteolysis of blood protein C with thrombin associated with endothelial thrombomodulin. The activation of protein C with the thrombin-thrombomodulin complex is significantly accelerated by binding of protein C to the receptor on the vascular endothelium - the endothelial receptor of protein C.
В системе гемостаза АПС играет ключевую роль в реализации антикоагулянтной функции. АПС в присутствии кофактора - протеина S блокирует образование тромбина на ранней стадии свертывания крови механизмом отрицательной обратной связи [Hanson SR, Griffin JH, Harker LA, Kelly AB, Esmon CT, Gruber A.J Clin Invest. 1993. V. 92 (4). P. 2003-12], поскольку инактивирует необходимые кофакторы свертывания крови - факторы Va и VIIIa, специфично гидролизуя в каждом по три пептидные связи.In the hemostatic system, APS plays a key role in the implementation of anticoagulant function. APS in the presence of cofactor protein S blocks the formation of thrombin in the early stage of blood coagulation by the negative feedback mechanism [Hanson SR, Griffin JH, Harker LA, Kelly AB, Esmon CT, Gruber A.J Clin Invest. 1993. V. 92 (4). P. 2003-12], since it inactivates the necessary coagulation coagulation factors — factors Va and VIIIa, specifically hydrolyzing three peptide bonds in each.
Наряду с антикоагулянтными функциями АПС оказывает цитопротекторное, антиапоптотическое, противовоспалительное действие [Striggow F., Riek М., Breder J., Henrich-Noack P., Reymann K.G., Reiser G. The protease thrombin is an endogenous mediator of hippocampal neuroprotection against ischemia at low concentrations but causes degeneration at high concentrations // Proc Nat Acad Sci USA. 2000. V. 97. P. 2264-2269]. Недавние исследования показали, что АПС способен оказывать защитное действие при таких острых состояниях, как сепсис, диабетическая нейропатия, инсульт, рассеянный склероз и при прогрессирующих метастазах [Esmon СТ1, Glass JD. J Clin Invest. 2009. V. 119 (11). Р. 3205-7].Along with anticoagulant functions, APS has a cytoprotective, antiapoptotic, anti-inflammatory effect [Striggow F., Riek M., Breder J., Henrich-Noack P., Reymann KG, Reiser G. The protease thrombin is an endogenous mediator of hippocampal neuroprotection against ischemia at low concentrations but causes degeneration at high concentrations // Proc Nat Acad Sci USA. 2000. V. 97. P. 2264-2269]. Recent studies have shown that APS can have a protective effect in acute conditions such as sepsis, diabetic neuropathy, stroke, multiple sclerosis and progressive metastases [Esmon CT1, Glass JD. J Clin Invest. 2009.V. 119 (11). R. 3205-7].
Показано, что АПС является нейроунокпротектором в стрессированных нейронах и в эндотелии мозга при гипоксии [Magistretti P.J. Neuron-glia metabolic coupling and plasticity // Exp Physiol. 2011. V. 96 (4). P. 407-410]. Протекторное действие АПС было продемонстрировано не только на тканях мозга, но и в других органах и тканях. В экспериментах in vivo и in vitro показано защитное действие АПС на эндотелиальные клетки легких, слизистой желудка и пупочной вены, что приводило к восстановлению барьерных функций сосудистой стенки и улучшению кровотока в органах в условиях повреждающих воздействий, например эндотоксина, стресса, тромбина [Nakamura М., Gabazza Е.С., Imoto I., Yano Y., Taguchi O., Horiki N., Fukudome K., Suzuki K., Adachi Y.J Thromb Haemost. 2005. V. 3. Р. 2721-9].APS has been shown to be a neurounprotector in stressed neurons and in the brain endothelium during hypoxia [Magistretti P.J. Neuron-glia metabolic coupling and plasticity // Exp Physiol. 2011.V. 96 (4). P. 407-410]. The protective effect of APS was demonstrated not only on brain tissues, but also in other organs and tissues. In vivo and in vitro experiments, the protective effect of APS on the endothelial cells of the lungs, gastric mucosa and umbilical vein was shown, which led to the restoration of the barrier functions of the vascular wall and improved blood flow in organs under conditions of damaging effects, such as endotoxin, stress, thrombin [Nakamura M. , Gabazza E.S., Imoto I., Yano Y., Taguchi O., Horiki N., Fukudome K., Suzuki K., Adachi YJ Thromb Haemost. 2005. V. 3. R. 2721-9].
Препараты рекомбинантного АПС (рАПС, Зигрис) разрешены FDA (США) для лечения системного воспаления (сепсиса) у детей и взрослых. Было показано, что рАПС снижает смертность больных с тяжелым сепсисом. Однако недавно обнаружено, что ведение высоких концентраций рАПС на раннем этапе реперфузии не вызывало устойчивую нейропротекцию и не улучшало исход после глобальной ишемии головного мозга, остановки сердца и острого воспаления [Teschendorf Р, Padosch SA, 
Также были созданы модифицированные препараты рАПС, лишенные антикоагулянтной активности, но сохраняющие цитопротекторные свойства. Однако их преклинические исследования только начинаются и сохраняются возможности тяжелых побочных реакций на вводимый белок [Wang Т, Lee МН, Choi Е, Pardo-Villamizar СА, Lee SB, Yang IH, Calabresi PA, Nath A. PLoS One. 2012. V. 7 (8): e43950].Modified rAPS preparations were also created that lack anticoagulant activity, but retain cytoprotective properties. However, their preclinical studies are just beginning and the possibility of severe adverse reactions to the injected protein remains [Wang T, Lee MH, Choi E, Pardo-Villamizar CA, Lee SB, Yang IH, Calabresi PA, Nath A. PLoS One. 2012. V. 7 (8): e43950].
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей изобретения является создание средства, обладающего нейропротекторными свойствами в эксперименте, включающего биодеградируемый полимерный матрикс на основе фиброина с иммобилизированным пептидом-агонистом рецептора ПАР1, освобождаемым активированным протеином С, а также способа получения данного средства.The objective of the invention is to provide a means with neuroprotective properties in the experiment, including a biodegradable polymer matrix based on fibroin with an immobilized PAR1 receptor agonist peptide released by activated protein C, as well as a method for producing this agent.
Поставленная задача решается средством, обладающем нейропротекторными свойствами в эксперименте, включающим биодеградируемый полимерный матрикс на основе фиброина шелка с иммобилизированным пептидом-агонистом рецептора ПАР1, освобождаемого активированного протеина С, при этом соотношение фиброин:пептид составляет 99-99,9:0,1-1 мас. %.The problem is solved by a means having neuroprotective properties in the experiment, including a biodegradable polymer matrix based on silk fibroin with an immobilized PAR1 receptor agonist peptide released by activated protein C, and the ratio of fibroin: peptide is 99-99.9: 0.1-1-1 wt. %
Предпочтительно в качестве фиброина шелка использовать фиброин шелка кокона тутового шелкопряда Bombyx mori.It is preferable to use silk fibroin of silk Bombyx mori silkworm cocoon silk fibroin.
Поставленная задача решается также тем, что способ получения вышеуказанного средства включает приготовление биодеградируемого полимерного матрикса на основе фиброина шелка, иммобилизацию пептида-агониста рецепторов ПАР1 на носитель в водном растворе фиброина шелка с концентрацией от 0,05 до 0,2 мг/мл, при концентрации пептида от 1,0 до 1,5 мг/мл и сушку матрикса с иммобилизованным пептидом-агонистом рецепторов ПАР1.The problem is also solved by the fact that the method of obtaining the above funds includes the preparation of a biodegradable polymer matrix based on silk fibroin, immobilization of the PAR1 receptor agonist peptide on a carrier in an aqueous solution of silk fibroin with a concentration of 0.05 to 0.2 mg / ml, at a concentration peptide from 1.0 to 1.5 mg / ml; and drying the matrix with an immobilized PAR1 receptor agonist peptide.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является защита пептида-агониста рецептора ПАР1, освобождаемого активированным протеином С, от протеолиза и способность регулировать скорость выхода препарата в условиях эксперимента. А также расширение арсенала средств аналогичного назначения.The technical result achieved by using the invention is the protection of the PAR1 receptor agonist peptide released by activated protein C from proteolysis and the ability to regulate the release rate of the drug under experimental conditions. As well as expanding the arsenal of funds for similar purposes.
Регулировка скорости высвободившегося из матрицы пептида достигается тем, что подобраны оптимальные носители и способы иммобилизации пептида, а также их количественное содержание, которое обеспечивает необходимую скорость высвобождения пептида.The regulation of the speed of the peptide released from the matrix is achieved by selecting the optimal carriers and methods for immobilizing the peptide, as well as their quantitative content, which provides the necessary peptide release rate.
Для решения данной задачи на основе анализа научно-технической литературы и полученных ранее результатов экспериментальных исследований была определена аминокислотная последовательность для синтеза препаратов пептида-агониста ПАР1, освобождаемого АПС. Примененные методы синтеза, деблокирования, очистки и модификации пептидов позволяют быстро и с высоким выходами получить пептид-агонист рецепторов ПАР1, освобождаемого активированного протеина С.To solve this problem, based on an analysis of the scientific and technical literature and the results of experimental studies obtained earlier, the amino acid sequence was determined for the synthesis of preparations of the PAR1 agonist peptide released by APS. The methods used for the synthesis, deblocking, purification, and modification of peptides make it possible to quickly and with high yields to obtain the PAR1 receptor agonist peptide released by activated protein C.
Разнообразие форм полимерных носителей, используемых для иммобилизации пептида-агониста ПАР1, освобождаемого АПС, предполагает выбор наиболее оптимальной формы носителя, при иммобилизации на которые препарат будет демонстрировать наиболее оптимальный биологический эффект.The variety of forms of polymer carriers used to immobilize the PAR1 agonist peptide released by APS suggests the choice of the most optimal carrier form, upon immobilization of which the drug will demonstrate the most optimal biological effect.
Направленная доставка биологически активных молекул и лекарственных средств с контролируемой скоростью в течение заданного времени - основной приоритет в создании систем доставки лекарственных препаратов. Биополимеры должны быть биологически безопасны: обладать высокой биосовместимостью, способностью к биодеградации, быть не токсичными, не вызывать иммунной реакции при введении в организм. Поиск материалов с необходимыми свойствами привел к возрождению интереса к полимерам, созданным на основе шелка. Они обладают впечатляющими механическими свойствами, иммуногенность этих белков крайне низкая и конструкции на их основе разрушаются с образованием нетоксичных продуктов. Кроме того, при работе с данными биополимерами есть возможность получения водных растворов таких полимеров, чтобы избежать потери биологической активности инкапсулируемых веществ. Наибольший интерес среди биополимеров для создания систем направленной доставки препаратов вызывает такой биополимер природного происхождения, как шелк. Шелк является натуральным полимером, который синтезируется представителями отряда Lepidoptera и класса Arachnida. Большое практическое значение имеет шелк коконов бабочек семейства Saturnidae, к которым относится тутовый шелкопряд Bombyx mori. Шелк, производимый Bombyx mori, используется в текстильной промышленности, а также в медицинской практике в качестве шовного материала. Интерес к шелку как к материалу для биомедицинских изделий вызван его уникальными свойствами, выделяющими его среди других биосовместимых материалов. Шелк обладает высокой механической прочностью и эластичностью, при этом он значительно превосходит коллаген и многие другие натуральные и синтетические полимеры по этим показателям. Кроме того, шелк термостабилен, изделия из него могут стерилизоваться обработкой при температуре до 150°С. Шелк кокона тутового шелкопряда Bombyx mori состоит из двух белков: фиброина и серицина. Фиброин - это фибриллярный белок, формирущий нити, составляющие структурную основу шелка. Серицин - гидрофильный белок, соединяющий между собой между собой отдельные фибриллы фиброина. Серицин обладает иммуногенным действием, поэтому для изготовления биомедицинских используют фиброин, очищенный методом десерицинизации. Фиброин состоит из двух цепей: тяжелой (325 кДа) и легкой (25 кДа), соединенных дисульфидными связями. Также в состав фиброина входит гликопротеид Р25 массой 25 кДа, нековалентно связанный с цепями. В нативной форме молекула существует в виде комплекса из тяжелых и легких цепей и гликопротеида в соотношении 6:6:1. Фиброин позволяет создавать на основе его водных растворов прочные и одновременно гибкие структуры. Он может быть использован для изготовления различных изделий: волокон, в том числе нановолокон, покрытий, пленок, трубок, трехмерных матриксов, гелей и микрочастиц.Targeted delivery of biologically active molecules and drugs with controlled speed for a given time is the main priority in the creation of drug delivery systems. Biopolymers should be biologically safe: have high biocompatibility, the ability to biodegradation, be non-toxic, not cause an immune reaction when introduced into the body. The search for materials with the necessary properties has led to a revival of interest in polymers based on silk. They have impressive mechanical properties, the immunogenicity of these proteins is extremely low, and structures based on them are destroyed with the formation of non-toxic products. In addition, when working with these biopolymers, it is possible to obtain aqueous solutions of such polymers in order to avoid loss of biological activity of encapsulated substances. Of the greatest interest among biopolymers for creating systems for targeted drug delivery is such a biopolymer of natural origin, such as silk. Silk is a natural polymer, which is synthesized by representatives of the order Lepidoptera and class Arachnida. Of great practical importance is the silk of cocoons of butterflies of the Saturnidae family, which include the silkworm Bombyx mori. Silk produced by Bombyx mori is used in the textile industry as well as in medical practice as a suture material. Interest in silk as a material for biomedical products is caused by its unique properties that distinguish it from other biocompatible materials. Silk has high mechanical strength and elasticity, while it significantly exceeds collagen and many other natural and synthetic polymers in these indicators. In addition, silk is thermostable, products from it can be sterilized by treatment at temperatures up to 150 ° C. Silk cocoon silkworm Bombyx mori consists of two proteins: fibroin and sericin. Fibroin is a fibrillar protein that forms the threads that make up the structural basis of silk. Sericin is a hydrophilic protein that interconnects individual fibroin fibrils. Sericin has an immunogenic effect, therefore, for the manufacture of biomedical fibroin is used, purified by desericinization. Fibroin consists of two chains: heavy (325 kDa) and light (25 kDa), connected by disulfide bonds. Fibroin also contains P25 glycoprotein weighing 25 kDa, non-covalently linked to chains. In its native form, the molecule exists in the form of a complex of heavy and light chains and a glycoprotein in a ratio of 6: 6: 1. Fibroin allows you to create strong and at the same time flexible structures based on its aqueous solutions. It can be used for the manufacture of various products: fibers, including nanofibers, coatings, films, tubes, three-dimensional matrices, gels and microparticles.
В связи с этим одной из экспериментальных задач был выбор оптимальной биосовместимой и биодеградируемой полимерной матрицы на основе фиброина и способа иммобилизации синтезированного пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого активированного протеина С, на выбранных носителях. Для решения данной задачи на основе фиброина было создано три типа носителя: покрытие, пленка и трехмерный матрикс. Для осуществления иммобилизации пептида-агониста ПАР1, освобождаемого АПС, на носителе предложено несколько способов: иммобилизация пептида-агониста рецепторов ПАР1 на разных формах полимерного носителя проводилась путем погружения пленки и трехмерного матрикса в растворы, содержащие пептид, или нанесением такого раствора на полимерное покрытие из фиброина шелка. По результатам исследований функциональной активности высвободившегося из матрицы пептида были отобраны оптимальные носители и способы иммобилизации терапевтического агента на носителе. По результатам проведенных исследований установлено, что наиболее «удачным» носителем является трехмерный матрикс, а оптимальный способ иммобилизации пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого активированного протеина, - обработка полимерных носителей раствором пептида с концентрацией от 1,0 до 1,5 мг/мл в водном растворе фиброина шелка с концентрацией от 0,05 до 0,2 мг/мл с последующим высушиванием. Такой способ иммобилизации исследуемого пептида на полимерной матрице обеспечивает необходимую скорость высвобождения препарата.In this regard, one of the experimental tasks was the selection of the optimal biocompatible and biodegradable polymer matrix based on fibroin and a method for immobilizing the synthesized PAR1 receptor agonist peptide released by activated protein C on selected carriers. To solve this problem, three types of media were created on the basis of fibroin: coating, film and three-dimensional matrix. Several methods have been proposed for immobilizing a PAR1 agonist peptide released by APS on a carrier: immobilizing a PAR1 receptor agonist peptide on different forms of a polymer carrier by immersing a film and a three-dimensional matrix in solutions containing the peptide, or by applying such a solution to a fibroin polymer coating silks. Based on the results of studies of the functional activity of the peptide released from the matrix, optimal carriers and methods for immobilizing a therapeutic agent on a carrier were selected. According to the results of the studies, it was found that the three-dimensional matrix is the most “successful” carrier, and the optimal way to immobilize the PAR1 receptor agonist peptide released by the activated protein is to treat the polymer carriers with a peptide solution with a concentration of 1.0 to 1.5 mg / ml in an aqueous solution of silk fibroin with a concentration of from 0.05 to 0.2 mg / ml, followed by drying. This method of immobilization of the studied peptide on a polymer matrix provides the necessary rate of release of the drug.
Соотношение фиброина шелка и пептида лежит в интервале подобрано таким образом, чтобы получить средство, обладающее нейропротекторными свойствами в эксперименте, при этом не нарушая свойств полимерного матрикса на основе фиброина шелка.The ratio of silk fibroin to peptide lies in the range selected in such a way as to obtain a tool with neuroprotective properties in the experiment, while not violating the properties of the polymer matrix based on silk fibroin.
Существует несколько методов получения матриксов на основе фиброина. К их числу относятся метод выщелачивания, метод лиофилизации и метод замораживания-оттаивания. Иммобилизация пептидов в полимерные матрицы или микрочастицы позволяет защитить пептиды от разрушения, а также направленно регулировать скорость их выхода как в условиях in vitro так и in vivo.There are several methods for producing fibroin based matrices. These include the leaching method, the lyophilization method, and the freeze-thaw method. Immobilization of peptides into polymer matrices or microparticles allows protecting peptides from degradation, as well as directionally controlling their release rate both in vitro and in vivo.
Использование пептидов-агонистов ПАР1, освобождаемых АПС, обусловлено их дешевизной по сравнению с рекомбинантным и модифицированным АПС. Однако есть опасность их быстрого расщепления пептидазами в организме.The use of PAR1 agonist peptides released by APS is due to their cheapness compared to recombinant and modified APS. However, there is a danger of their rapid cleavage by peptidases in the body.
Иммобилизация пептидов в полимерные матрицы или микрочастицы позволяет защитить пептиды от разрушения, а также регулировать скорость их выхода в условиях in vitro. В связи с этим особую значимость приобретает правильный выбор полимерной матрицы.Immobilization of peptides into polymer matrices or microparticles helps to protect peptides from degradation, as well as to regulate their release rate in vitro. In this regard, the correct choice of the polymer matrix is of particular importance.
Использование полимерных матриц или микрочастиц на основе фиброинов шелка или полисахаридов - альгинатов и др. позволяет получать матрицы, которые являются не только биосовместимыми, но и биодеградируемыми, а следовательно, могут быть предложены для направленного нейропротекторного действия in vitro.The use of polymer matrices or microparticles based on silk fibroins or polysaccharides - alginates, etc. allows one to obtain matrices that are not only biocompatible, but also biodegradable, and therefore can be proposed for targeted in vitro neuroprotective action.
Однако до настоящего времени не были созданы препараты пептидов со свойствами АПС, иммобилизованные в биодеградируемые полимерные матрицы, и не было исследовано их нейропротекторное действие.However, to date, peptide preparations with APS properties immobilized into biodegradable polymer matrices have not been created, and their neuroprotective effect has not been investigated.
Клеточные культуры являются универсальным методом для исследования «физиологических» и патологических явлений, выяснения механизмов протекающих процессов. Для нейроисследований в качестве модельных клеток используют в основном такие виды клеток, как нейроны, астроциты и эндотелиальные клетки, что связано с тем, что данные типы клеток составляют единую функциональную единицу в организме при повреждениях нервных тканей.Cell cultures are a universal method for the study of "physiological" and pathological phenomena, to clarify the mechanisms of the processes. For neurostudies, cell types are mainly used as model cells such as neurons, astrocytes and endothelial cells, due to the fact that these cell types form a single functional unit in the body in case of damage to nerve tissues.
В качестве модели для изучения нейропротекторного действия синтезированного пептида были выбраны тучные клетки. Это связанно с тем, что именно тучные клетки наиболее активно вовлекаются в процессы заживления ран, поскольку способны в ответ на активацию иммунными и неиммунными факторами освобождать множество сильных медиаторов. Тучные клетки секретируют широкий спектр противоспалительных медиаторов, таких как гистамин, интерлейкины, В-гексозаминидаза и др., вазоактивных и ростовых факторов, про- и антикоагулянтов, имеющих разнообразные биологические функции, благодаря которым они играют важную роль в клеточных «ансамблях», вовлекающихся в процессы воспаления, свертывания крови и репарацию тканей.Mast cells were chosen as a model for studying the neuroprotective effect of the synthesized peptide. This is due to the fact that it is mast cells that are most actively involved in wound healing processes, since they are able to release many powerful mediators in response to activation by immune and non-immune factors. Mast cells secrete a wide range of anti-inflammatory mediators, such as histamine, interleukins, B-hexosaminidase, etc., vasoactive and growth factors, pro-and anticoagulants, which have various biological functions, due to which they play an important role in cellular “ensembles” involved in processes of inflammation, blood coagulation and tissue repair.
Известно, что дегрануляция и секреция медиаторов, в том числе предобразованного медиатора гистамина, происходит в ответ на воспаление и стимуляцию иммунными/неиммунными либераторами.It is known that degranulation and secretion of mediators, including the preformed histamine mediator, occurs in response to inflammation and stimulation by immune / non-immune liberators.
Как показано в лаборатории Линсберга (2009), гистамин и другие медиаторы, секретируемые тучными клетками при воспалении, являются нейротоксическими факторами. Поэтому выбор тучных клеток в качестве объекта исследования про- и антивоспалительных свойств препаратов вполне обоснован. Более того, данный тип клеток принимает участие во всех видах воспаления, например перитонита, нейровоспаления и т.д. При этом оценка эффекта препарата может осуществляться как на основе анализа высвобождения этими клетками медиаторов, воспаления, так и по их влиянию на другие клетки организма, например, нейроны при развитии нейровоспаления.As shown in Linsberg's laboratory (2009), histamine and other mediators secreted by mast cells in inflammation are neurotoxic factors. Therefore, the choice of mast cells as an object of study of the pro- and anti-inflammatory properties of drugs is well founded. Moreover, this type of cell is involved in all types of inflammation, such as peritonitis, neuroinflammation, etc. At the same time, the effect of the drug can be evaluated both on the basis of analysis of the release of mediators by these cells, inflammation, and on their effect on other cells of the body, for example, neurons during the development of neuroinflammation.
Таким образом в результате осуществления данного изобретения получают нейропротекторное средство, включающее биодеградируемый полимерный матрикс на основе фиброина с иммобилизированным пептидом-агонистом рецептора ПАР1, освобождаемого активированного протеина С. Наличие протекторного, противовоспалительного и пролиферативного действия делает такие средства востребованными в такой области, как регенеративная медицина. Данные пептиды могут быть включены в состав высокотехнологичных медицинских изделий в качестве дополнительного терапевтического агента, повышающего регенеративный потенциал изделия.Thus, as a result of the implementation of the present invention, a neuroprotective agent is obtained comprising a biodegradable polymer matrix based on fibroin with an immobilized PAR1 receptor agonist peptide released by activated protein C. The presence of protective, anti-inflammatory and proliferative effects makes such agents popular in a field such as regenerative medicine. These peptides can be included in high-tech medical devices as an additional therapeutic agent that increases the regenerative potential of the product.
Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.
На фиг. 1 показана калибровочная кривая поглощения пептида-агониста рецепторов ПАР1, конъюгированного с FITC, в ФСБ при 495 нм.In FIG. 1 shows a calibration curve for the absorption of the PAR1 receptor agonist peptide conjugated to FITC in FSB at 495 nm.
На фиг. 2 - калибровочная кривая поглощения пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, конъюгированного с FITC, в ДМЕМ при 495 нм.In FIG. 2 is a calibration curve of the absorption of the PAR1 receptor agonist peptide released by APS conjugated to FITC in DMEM at 495 nm.
На фиг. 3 - кинетика выхода пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, конъюгированного с FITC, из полимерного носителя в форме покрытия в ФСБ и культуральной среде ДМЕМ.In FIG. 3 - kinetics of the release of the PAR1 receptor agonist peptide released by APS conjugated to FITC from a polymer carrier in the form of a coating in PBS and DMEM culture medium.
На фиг. 4 - кинетика выхода пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, конъюгированного с FITC, из полимерного носителя в форме пленки в ФСБ и в культуральной среде ДМЕМ.In FIG. 4 - kinetics of the release of the PAR1 receptor agonist peptide released by APS conjugated to FITC from a polymer carrier in the form of a film in FSB and in a DMEM culture medium.
На фиг. 5 - кинетика выхода пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, конъюгированного с FITC, из полимерного носителя в форме трехмерного матрикса в ФСБ и в культуральной среде ДМЕМ.In FIG. 5 - kinetics of the release of the PAR1 receptor agonist peptide released by APS conjugated to FITC from a polymer carrier in the form of a three-dimensional matrix in FSB and in a DMEM culture medium.
На фиг. 6 - влияние нативной и иммобилизованных форм исследуемого пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, (АП9), на секрецию гистамина перитониальными тучными клетками при их активации липополисахаридом (ЛПС, 100 нг/мл). +, *, # - р<0,05 по сравнению с соответствующим контролем (условия без АП9).In FIG. 6 - the effect of the native and immobilized forms of the test peptide agonist of the PAR1 receptor released by APS (AP9) on histamine secretion by peritonial mast cells when activated by lipopolysaccharide (LPS, 100 ng / ml). +, *, # - p <0.05 compared with the corresponding control (conditions without AP9).
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Настоящее изобретение подкреплено следующими примерами. Стоит отметить, что данное средство находится на экспериментальной стадии изучения, что отражено в его назначении, и примеры носят экспериментальный характер.The present invention is supported by the following examples. It is worth noting that this tool is at the experimental stage of study, which is reflected in its purpose, and the examples are experimental in nature.
Пример 1. Приготовление средства, включающего биодеградируемый полимерный матрикс на основе фиброина с иммобилизированным пептидом-агонистом рецептора ПАР1, освобождаемым активированным протеином С, NPNDKYEPF амидом.Example 1. Preparation of an agent comprising a biodegradable polymer matrix based on fibroin with an immobilized PAR1 receptor agonist peptide released by activated protein C, NPNDKYEPF amide.
1 Этап. Подготовка рабочих растворов.
1.1. Подготовка раствора 1. Готовят раствор хлорида кальция в смеси этанола и воды. Молярное соотношение компонентов СаСl2:С2Н5OН:H2О=1:2:8.1.1.
1.2. Подготовка раствора 2. Готовят навеску нитей хирургических нестерильных (100% натуральный шелк) из расчета 150 мг на 1 мл раствора 1 и переносят в емкость с раствором 1. Инкубируют в течение 5 часов на водяной бане при 70°С. Полученный раствор центрифугируют 15 минут при 13400 об/мин и супернатант диализуют против дистиллированной воды, проводя 4 смены диализа. Полученный раствор центрифугируют 15 минут при 13400 об/мин и определяют концентрацию фиброина по оптической плотности при 280 нм. Доводят раствор до концентрации фиброина 2 мг/мл и используют на Этапе 2.1.2. Preparation of the
1.3. Подготовка раствора 3. Для приготовления раствора пептида навеску вещества массой 3,5 мг растворяют в 20 мкл ДМСО и доводят объем раствора до 200 мкл стерильной dH2O. И используют на стадии 2.1.3. Preparation of the
2. Этап. Обработка полимерного носителя.2. Stage. Processing a polymer carrier.
2.1. К 150 мкл раствора 3 (концентрация - 17,5 мг/мл) добавляют 375 мкл dH2O. Таким образом, получается раствор пептида с концентрацией 5 мг/мл2.1. To 150 μl of solution 3 (concentration - 17.5 mg / ml) 375 μl of dH 2 O is added. Thus, a peptide solution with a concentration of 5 mg / ml is obtained
2.2. В лунки 48-луночного планшета вносят по 27,2 мкл раствора пептида с концентрацией 5 мг/мл, 5 мкл раствора фиброина шелка с концентрацией 2 мг/мл и 67,8 мкл dH2О. Переносят в лунки с раствором пептида полимерные носители в виде пленки или трехмерного матрикса. Обработку полимерного покрытия проводят в лунках 48-луночного планшета, дно которых покрыто полимерной пленкой из фиброина шелка. Для этого вносят в такие лунки по 13,6 мкл раствора пептида с концентрацией 5 мг/мл, 2,5 мкл водного раствора фиброина шелка с концентрацией 2 мг/мл и 34,9 мкл dH2O. При этом количество вносимых растворов может варьироваться в следующих пределах: 20-30 мкл пептида, 2,5-10 мкл фиброина шелка, 60-77,5 мкл dH2O на 100 мкл получаемого раствора.2.2. 27.2 μl of a peptide solution with a concentration of 5 mg / ml, 5 μl of a silk fibroin solution with a concentration of 2 mg / ml and 67.8 μl of dH 2 O are added to the wells of a 48-well plate. Polymeric carriers are transferred to the wells with the peptide solution in the form of a film or a three-dimensional matrix. The processing of the polymer coating is carried out in the holes of the 48-well plate, the bottom of which is covered with a polymer film of silk fibroin. For this, 13.6 μl of a peptide solution with a concentration of 5 mg / ml, 2.5 μl of an aqueous solution of silk fibroin with a concentration of 2 mg / ml and 34.9 μl of dH 2 O are added to such wells. The amount of the introduced solutions may vary in the following ranges: 20-30 μl of the peptide, 2.5-10 μl of silk fibroin, 60-77.5 μl of dH 2 O per 100 μl of the resulting solution.
3. Этап. Сушка. Полимерные носители оставляют высушиваться в лунках 48-луночного планшета в течение 24 часов. Сушку проводили в ламинарном шкафу при комнатной температуре в течение 24 часов. Контроль высыхания образцов проводили путем взвешивания матриксов с иммобилизованным пептидом через 6, 9, 12, 18 и 24 часа. Было установлено, что через 18 и 24 часа масса образца не меняется.3. Stage. Drying. Polymeric carriers were allowed to dry in the wells of a 48-well plate for 24 hours. Drying was carried out in a laminar cabinet at room temperature for 24 hours. Drying of samples was controlled by weighing matrices with immobilized peptide after 6, 9, 12, 18, and 24 hours. It was found that after 18 and 24 hours the mass of the sample does not change.
4. Этап. Стерилизация. Проводят газовую стерилизацию с использованием этиленоксида по ГОСТ Р ИСО 18472-2009.4. Stage. Sterilization. Gas sterilization is carried out using ethylene oxide in accordance with GOST R ISO 18472-2009.
Пример 2. Исследование кинетики выхода пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, из полимерного носителя.Example 2. The study of the kinetics of the output of the peptide agonist receptor PAR1 released by APS from a polymer carrier.
Для исследования кинетики выхода пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, и оценки влияния среды инкубации на кинетику выхода пептида из полимерных носителей использовали пептид, конъюгированный с флуоресцеин изотиоцианатом (FITC), строили калибровочные кривые. Для этого готовили растворы пептида, конъюгированного с FITC, с концентрацией от 0,1 мкМ до 100 мкМ в ФСБ и в среде ДМЕМ и измеряли поглощение при 495 нм спектрофотометром для микрообъемов Thermo Scientific NanoDrop 2000, позволяющим проводить измерения в объемах 0,5-2,0 мкл. Соответствующие калибровочные кривые представлены на фиг. 1 и 2.To study the kinetics of the yield of the PAR1 receptor agonist peptide released by APS and to assess the effect of the incubation medium on the kinetics of the release of the peptide from polymer carriers, a peptide conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC) was used, and calibration curves were constructed. For this, solutions of the peptide conjugated to FITC with a concentration of 0.1 μM to 100 μM in FSB and in DMEM medium were prepared, and the absorption at 495 nm was measured with a Thermo Scientific NanoDrop 2000 microvolume spectrophotometer, allowing measurements in volumes of 0.5–2 , 0 μl. The corresponding calibration curves are shown in FIG. 1 and 2.
Исследование кинетики выхода пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, и оценки влияния среды инкубации на кинетику выхода пептида из полимерных носителей проводили на образцах, синтезированных в соответствии с утвержденными лабораторными технологическими регламентами. В лунки 24-луночного планшета к экспериментальным образцам добавляли по 2 мл среды инкубации: ФСБ или культуральную среду ДМЕМ и инкубировали при 37°С в присутствии 5% СO2 56 часов. В течение первых 9 часов каждый час и через 20, 24, 32, 48 56 часов отбирали пробы для определения концентрации вышедшего пептида. Данные, полученные при анализе проб вышедшего из полимерных носителей пептида-агониста рецепторов ПАР1 в форме покрытия, пленки и трехмерного матрикса, представлены на фиг. 3-5.A study of the kinetics of the release of the PAR1 receptor agonist peptide released by APS and the effect of the incubation medium on the kinetics of the release of the peptide from polymer carriers was carried out on samples synthesized in accordance with the approved laboratory technological regulations. In the wells of the 24-well plate, 2 ml of incubation medium: PBS or DMEM culture medium was added to the experimental samples and incubated at 37 ° C in the presence of 5
Как видно из графиков на фиг. 3-5, среда инкубации не влияет на кинетику выхода пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, иммобилизованного на разных формах полимерного носителя. В течение первых 8-9 часов концентрация пептида в среде инкубации достигает почти максимальной: 29 мкМ. По результатам анализа установлено, что скорость выхода пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, иммобилизованного на полимерных носителях, зависит от типа носителя.As can be seen from the graphs in FIG. 3-5, the incubation medium does not affect the yield kinetics of the PAR1 receptor agonist peptide released by APS immobilized on different forms of the polymer carrier. During the first 8-9 hours, the concentration of the peptide in the incubation medium reaches almost maximum: 29 μM. According to the results of the analysis, the release rate of the PAR1 receptor agonist peptide released by APS immobilized on polymer carriers depends on the type of carrier.
Как видно из таблицы 1, применение препаратов пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, иммобилизованного на полимерном носителе, позволяет регулировать время высвобождения препарата и создавать оптимальные условия культивирования для различных типов клеток.As can be seen from table 1, the use of the preparations of the PAR1 receptor agonist peptide released by APS immobilized on a polymer carrier allows one to control the drug release time and create optimal culturing conditions for various cell types.
Пример 3. Исследование противовоспалительного действия иммобилизованной формы пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, на культивируемые клетки мозга животных (астроциты) и тучные клетки в норме и при провокации воспаления in vitro.Example 3. The study of the anti-inflammatory effect of the immobilized form of the peptide agonist receptor PAR1 released by APS on cultured animal brain cells (astrocytes) and mast cells is normal and in case of inflammation in vitro.
1. Материалы1. Materials
- Пептид-агонист рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС структуры NPNDKYEPF амид.- Peptide agonist of receptors PAR1 released by APS of NPNDKYEPF amide structure.
- Экспериментальные образцы средства, представляющего собой прозрачное полимерное покрытие толщиной 0,1 мм (=100 мкм) на культуральных стеклах диаметром 24 мм из фиброина шелка с иммобилизованный пептидом-агонистом рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС.- Experimental samples of the agent, which is a transparent polymer coating with a thickness of 0.1 mm (= 100 μm) on culture glasses with a diameter of 24 mm from silk fibroin with immobilized peptide-agonist receptor PAR1 released APS.
- Экспериментальные образцы средства, представляющего собой прозрачную пленку из фиброина шелка толщиной 0,2 мм (=200 мкм), диаметром 14 мм с иммобилизованным пептидом-агонистом рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС.- Experimental samples of the agent, which is a transparent film of silk fibroin 0.2 mm thick (= 200 μm), 14 mm in diameter with immobilized peptide-agonist receptor PAR1 released by APS.
- Экспериментальные образцы средства, представляющего собой трехмерный пористый матрикс из фиброина шелка толщиной 2 мм, диаметром 14 мм, с размером пор 50-100 мкм, степень пористости 94%, с иммобилизованным пептидом-агонистом рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС.- Experimental samples of the agent, which is a three-dimensional porous matrix of silk fibroin with a thickness of 2 mm, a diameter of 14 mm, a pore size of 50-100 μm, a porosity of 94%, with an immobilized APS receptor agonist peptide released by APS.
2. Выделение тучных клеток из перитонеальной полости самцов крыс2. Isolation of mast cells from the peritoneal cavity of male rats
Животных наркотизируют эфиром, декапитируют и обескровливают. В брюшную полость вводят 10 мл буфера Hepes-NaCL, брюхо слегка массируют в течение 2 минут. Перитонеальную жидкость собирают и центрифугируют в течение 5 минут при 800 об/мин при охлаждении. Супернатант отбрасывают, осадок суспендируют в 2 мл буфера Hepes-NaCL. Данную суспезию переносят в пробирки, содержащие 25% и 35% фиколл и центрифугируют в течение 10 минут при 1200 об/мин при охлаждении.Animals are anesthetized with ether, decapitated and bled. 10 ml of Hepes-NaCL buffer is injected into the abdominal cavity, the belly is lightly massaged for 2 minutes. The peritoneal fluid is collected and centrifuged for 5 minutes at 800 rpm while cooling. The supernatant is discarded, the precipitate is suspended in 2 ml of Hepes-NaCL buffer. This suspension was transferred to tubes containing 25% and 35% ficoll and centrifuged for 10 minutes at 1200 rpm under cooling.
Пул тучных клеток при центрифугировании проходит в слой фиколла, а другие клеточные элементы концентрируются на границе раздела фиколла. Осторожно собирают клеточные элементы с границы раздела и отбрасывают. Пул тучных клеток промывают в 5 мл сбалансированного раствора. После каждого промывания клетки центрифугируют по 10 минут при 1000, 900, 800 об/мин при охлаждении. Осадок тучных клеток после последнего промывания растворяют в малом объеме сбалансированного буфера. Далее производят подсчет тучных клеток в камере Горяева. После подсчета клеточную взвесь разводят сбалансированным буфером, исходя из необходимого количества клеток в эксперименте.The mast cell pool during centrifugation passes into the ficoll layer, and other cellular elements are concentrated at the ficoll interface. Carefully collect cell elements from the interface and discard. The mast cell pool is washed in 5 ml of a balanced solution. After each washing, the cells are centrifuged for 10 minutes at 1000, 900, 800 rpm while cooling. The mast cell pellet after the last wash is dissolved in a small volume of balanced buffer. Next, the mast cells are counted in the Goryaev’s chamber. After counting, the cell suspension is diluted with a balanced buffer, based on the required number of cells in the experiment.
Статистическая обработка данныхStatistical data processing
Статистическую обработку результатов проводят с использованием программы GraphPad Prism 6. Для анализа используют непараметрическую статистику: Ман-Уитни тест и тест Краскела-Уоллеса для несвязанных выборок. Каждый из экспериментов проводят не менее 3 раз. n - число независимых экспериментов.Statistical processing of the results is carried out using the
3. Алгоритм испытания3. Test algorithm
Тучные клетки, полученные от каждого животного, распределяли по экспериментальным группам. В каждой группе 300 мкл клеточной суспензии инкубировали в течение часа с исследуемыми веществами при 37°С. Реакцию останавливают трехкратным объемом ледяного сбалансированного буфера. Далее пробы центрифугируют при 400g в течение 10 минут, супернатант для определения содержания гистамина отбирают (1000 мкл) и переносят в охлажденные эппендорфы. К оставшимся 200 мкл добавляют 1000 мкл сбалансированного буфера, после этого осадок ресуспендируют и разрушают клетки кипячением на водяной бане в течение 5 минут. Затем вновь центрифугируют 10 минут при 400g и отбирают 1000 мкл супернатанта для анализа остаточного гистамина в отдельные эппендорфы.Mast cells obtained from each animal were divided into experimental groups. In each group, 300 μl of the cell suspension was incubated for one hour with the test substances at 37 ° C. The reaction is stopped by a three-fold volume of ice-cold balanced buffer. The samples are then centrifuged at 400g for 10 minutes, the supernatant for determining the histamine content was collected (1000 μl) and transferred to chilled eppendorfs. To the remaining 200 μl, add 1000 μl of balanced buffer, after which the pellet is resuspended and the cells are destroyed by boiling in a water bath for 5 minutes. Then centrifuged again for 10 minutes at 400g and 1000 μl of the supernatant were taken to analyze the residual histamine in separate eppendorfs.
Для определения содержания гистамина в полученных пробах отбирают из эппендорфов по 500 мкл раствора и добавляют к нему 100 мкл 1N NaOH; туда же добавляют 25 мкл 0,1% раствора ортофталевого альдегида в этаноле. Образовавшийся флуорофор стабилизируют подкислением раствора. Для этого через 4 минуты добавляют 50 мкл 3N HCL. После добавления каждого реактива смесь тщательно перемешивают.To determine the histamine content in the obtained samples, 500 μl of a solution are taken from eppendorfs and 100 μl of 1N NaOH are added to it; 25 μl of a 0.1% solution of orthophthalic aldehyde in ethanol are added thereto. The resulting fluorophore is stabilized by acidification of the solution. To do this, after 4 minutes add 50 μl of 3N HCL. After adding each reagent, the mixture is thoroughly mixed.
Флуоресценцию измеряют на планшетном спетрофлуорометре при 460 нм, возбуждая при 355 нм. Полученные данные по влиянию нативной и иммобилизованных форм исследуемого пептида-агониста рецепторов ПАР1, освобождаемого АПС, (АП9), на секрецию гистамина перитониальными тучными клетками при их активации липополисахаридом представлены в виде гистограммы на фиг. 6.Fluorescence is measured on a plate spectrofluorometer at 460 nm, exciting at 355 nm. The data obtained on the effect of the native and immobilized forms of the test peptide agonist of the PAR1 receptor released by APS (AP9) on histamine secretion by peritonial mast cells upon their activation by lipopolysaccharide are presented as a histogram in FIG. 6.
Исследования показали, что использование средств, включающих биодеградируемый полимерный матрикс на основе фиброина с иммобилизированным пептидом-агонистом рецептора ПАР1, освобождаемым активированным протеином С, приводит к нейропротекторному действию на модели нейровоспаления, которое характерно для ряда патологических состояний.Studies have shown that the use of agents including a biodegradable polymer matrix based on fibroin with an immobilized PAR1 receptor agonist peptide released by activated protein C leads to a neuroprotective effect on the neuroinflammation model, which is characteristic of a number of pathological conditions.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015157140A RU2614694C1 (en) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | Preparation possessing neuroprotective properties in experiment and method of obtaining thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015157140A RU2614694C1 (en) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | Preparation possessing neuroprotective properties in experiment and method of obtaining thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2614694C1 true RU2614694C1 (en) | 2017-03-28 |
Family
ID=58505625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015157140A RU2614694C1 (en) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | Preparation possessing neuroprotective properties in experiment and method of obtaining thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2614694C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8722067B2 (en) * | 2007-05-29 | 2014-05-13 | Trustees Of Tufts College | Method for silk fibroin gelation using sonication |
| US20140234381A1 (en) * | 2011-06-22 | 2014-08-21 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Scaffold for subretinal cell transplantation and drug delivery |
-
2015
- 2015-12-31 RU RU2015157140A patent/RU2614694C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8722067B2 (en) * | 2007-05-29 | 2014-05-13 | Trustees Of Tufts College | Method for silk fibroin gelation using sonication |
| US20140234381A1 (en) * | 2011-06-22 | 2014-08-21 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Scaffold for subretinal cell transplantation and drug delivery |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| SOH U.J, TREJO J.A. Activated protein C promotes PAR1 cytoprotective signaling through b-arrestin and disheveled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad.Sci. 2011. V.108, 50. PР.E1372 -;E1380. * |
| ДУГИНА Т.Н и др. Влияние синтетического пептида-агониста рецептора тромбина, инкапсулированного в микрочастицы на основе сополимера молочной и гликолевой кислоты, на заживление экспериментальных кожных ран у мышей. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004. Т. 138, 11. С. 523-526. * |
| СТАШЕВСКАЯ К.С. и др. Биодеградируемые микрочастицы с иммобилизованным пептидом для заживления ран. Биомедицинская химия. 2006. Т. 52. 1. С.83-94. * |
| СТАШЕВСКАЯ К.С. и др. Биодеградируемые микрочастицы с иммобилизованным пептидом для заживления ран. Биомедицинская химия. 2006. Т. 52. 1. С.83-94. SOH U.J, TREJO J.A. Activated protein C promotes PAR1 cytoprotective signaling through b-arrestin and disheveled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad.Sci. 2011. V.108, 50. PР.E1372 -;E1380. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| He et al. | A novel gene recombinant collagen hemostatic sponge with excellent biocompatibility and hemostatic effect | |
| Wang et al. | A neuroprotective sericin hydrogel as an effective neuronal cell carrier for the repair of ischemic stroke | |
| Gu et al. | Neural stem cell-derived exosomes-loaded adhesive hydrogel controlled-release promotes cerebral angiogenesis and neurological function in ischemic stroke | |
| CN103951831B (en) | The preparation method and applications of sericin hydrogel | |
| Kumar et al. | Nanofibrous snake venom hemostat | |
| EP3682912B1 (en) | Use of self-assembling polypeptides as tissue adhesives | |
| US10493134B2 (en) | Compositions comprising collagen and PRP for tissue regeneration | |
| EP2822533B1 (en) | Biomaterials for delivery of blood extracts and methods of using same | |
| JP2001508301A (en) | Preparation of collagen | |
| WO2008113030A2 (en) | Treatment of leaky or damaged tight junctions and enhancing extracellular matrix | |
| RU2719562C2 (en) | Peptide dendrimers containing fibrinogen-binding peptides | |
| CN102369026A (en) | Pcl/pga hemostatic foams | |
| Lu et al. | Keratin-associated protein nanoparticles as hemostatic agents | |
| Clapacs et al. | Coiled coil crosslinked alginate hydrogels dampen macrophage-driven inflammation | |
| Lee et al. | Mesh-shaped absorbable hemostatic hydrogel patch fabricated with marine organism-derived protein biomaterials with contact-activated blood coagulation for application in visceral surgery | |
| Chen et al. | Preparation, characterization, and potential biomedical application of composite sponges based on collagen from silver carp skin | |
| JP2025531968A (en) | Use of silk fibroin fusion proteins in the preparation of topical medications for skin wounds | |
| Xu et al. | Biomimetic peptide nanoparticles participate in natural coagulation for hemostasis and wound healing | |
| RU2614694C1 (en) | Preparation possessing neuroprotective properties in experiment and method of obtaining thereof | |
| US20160000962A1 (en) | Hemostatic Compositions | |
| CN107592814B (en) | Hemostatic compositions | |
| CN117561073A (en) | Novel bioactive peptide combinations and their uses | |
| FR2854801A1 (en) | Injectable or implantable preparation, useful e.g. for filling or augmenting tissue, containing globin soluble at physiological pH | |
| Roy et al. | Injectable peptide hydrogels loaded with murine embryonic stem cells relieve ischemia in vivo after myocardial infarction | |
| Zhang et al. | Mussel-inspired hydrogels with wet adhesion and anti-inflammatory properties for oral and pressure ulcers |