RU2625725C1 - Способ быстрого количественного определения специфической активности лиофилизированной вакцины бцж - Google Patents
Способ быстрого количественного определения специфической активности лиофилизированной вакцины бцж Download PDFInfo
- Publication number
- RU2625725C1 RU2625725C1 RU2016133256A RU2016133256A RU2625725C1 RU 2625725 C1 RU2625725 C1 RU 2625725C1 RU 2016133256 A RU2016133256 A RU 2016133256A RU 2016133256 A RU2016133256 A RU 2016133256A RU 2625725 C1 RU2625725 C1 RU 2625725C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- atp
- vaccine
- lyophilized
- content
- specific activity
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 36
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 81
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 56
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 43
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 claims abstract description 30
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 claims abstract description 30
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 8
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 4
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 claims 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 231100000582 ATP assay Toxicity 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000006259 organic additive Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается способа быстрого количественного определения специфической активности лиофилизированной БЦЖ-вакцины, включающего реконструкцию лиофилизированной вакцины, удаление внеклеточного АТФ с использованием апиразы, экстракцию внутриклеточного АТФ, определение содержания внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методом и расчет специфической активности. Реконструкцию лиофилизированной вакцины проводят в физиологическом растворе, удаление внеклеточного АТФ проводят путем инкубации реконструированной вакцины с апиразой, экстракцию внутриклеточного АТФ проводят путем добавления ДМСО, определение содержания АТФ в полученном экстракте проводят по интенсивности сигнала биолюминесценции для смеси, включающей экстракт реконструированной БЦЖ-вакцины в ДМСО и раствора АТФ-реагента на основе люциферин-люциферазы, расчет содержания внутриклеточного АТФ в образце реконструированной вакцины проводят, используя значение интенсивности биолюминесцентного сигнала для АТФ-контроля, представляющего собой лиофилизированный препарат с известным содержанием АТФ, расчет удельного содержания внутриклеточного АТФ в анализируемом образце проводят с учетом массы лиофилизированной вакцины в анализируемом образце, далее проводят расчет специфической активности по соответствующей формуле. Изобретение обеспечивает сокращение длительности анализа до 2-х часов, упрощение и стандартизирование процедуры реконструкции лиофилизированной БЦЖ-вакцины, сокращение длительности и трудоемкости метода экстракции внутриклеточного АТФ и метода измерения сигнала биолюминесценции, унифицирование состава реагентов, используемых в анализе. 2 пр., 1 ил., 3 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам определения специфической активности лиофилизированной вакцины БЦЖ.
Вакцина на основе ослабленного штамма живых лиофилизированных бактерий Mycobacterum bovis (БЦЖ-вакцина) используется для вакцинации против туберкулеза и как иммунотерапевтический агент против рака мочевого пузыря. Одной из ключевых характеристик БЦЖ-вакцины является специфическая активность (жизнеспособность) лиофилизированных бактерий М. bovis BCG, которая характеризуется количеством колониеобразующих единиц в расчете на 1 мл суспензии вакцины (КОЕ/мл) или на 1 мг сухой биомассы (КОЕ/мг). Для характеризации специфической активности используют метод посева разведений суспензии вакцины на плотную питательную среду с последующей инкубацией клеток до образования видимых глазом колоний. Клетки микобактерий, в том числе и бактерий М. bovis BCG, растут медленно, длительность инкубации составляет 3-5 недель, после чего становится возможным завершение испытаний образцов вакцины. Кроме того, КОЕ-тест плохо воспроизводим не только из-за трудностей, связанных с культивированием микобактерий и сложным составом используемой для их роста питательной среды, но и из-за склонности этих организмов к агрегации.
В последнее десятилетие получил распространение альтернативный метод быстрого определения жизнеспособности клеток в БЦЖ-вакцине, основанный на биолюминесцентном измерении содержания внутриклеточного аденозин-5'-трифосфата (АТФ). Содержание внутриклеточного АТФ является основным индикатором жизнеспособности клеток. Биолюминесцентный метод позволяет измерять количество внутриклеточного АТФ в короткие сроки. За счет сокращения времени анализа данный метод позволяет существенно упростить процедуру определения специфической активности готового препарата, а также проводить контроль специфической активности полупродукта на разных этапах производственного цикла.
Известен способ быстрого обнаружения жизнеспособных бактерий в БЦЖ-вакцине [CN 101793832 (A)], включающий следующие этапы: построение градуировочной зависимости в виде уравнения линейной регрессии зависимости сигнала биолюминесценции от концентрации АТФ с использованием стандартных растворов АТФ и биолюминесцентного реагента; растворение лиофилизированной БЦЖ-вакцины в буферном растворе для получения суспензии клеток; проведение экстракции внутриклеточного АТФ путем нагревания суспензии вакцины в буферном растворе, содержащем лизирующие добавки; измерение сигнала биолюминесценции для лизата вакцины с использованием биолюминесцентного реагента; определение концентрации АТФ в суспензии вакцины с использованием уравнения линейной регрессии; подсчет содержания жизнеспособных бактерий в образце БЦЖ-вакцины с использованием ранее полученных данных о содержании АТФ в одной клетке анализируемой вакцины.
Известный способ имеет ряд существенных недостатков. Одним из наиболее существенных является отсутствие стадии удаления внеклеточного АТФ, что ставит под сомнение достоверность получаемых по заявленному методу результатов.
Более близким к заявляемому является АТФ-способ быстрой оценки жизнеспособности препаратов лиофилизированной БЦЖ-вакцины, описанный в статье [Jensen S.E., Hubrechts P., Klein B.M., Haslow K.R. ((Development and validation of an ATP method for rapid estimation of viable units in lyophilized BCG Danish 1331 vaccine», Biologicals, 2008, том 36, c. 308-314]. Ключевой стадией известного способа, которая обеспечивает достижение хорошей корреляции между содержанием внутриклеточного АТФ и КОЕ, является предварительная инкубация реконструированной вакцины в питательной среде в течение 24 ч при 37°C. Затем экстрагируют внутриклеточный АТФ путем нагревания суспензии вакцины в буферном растворе, содержащем лизирующие добавки; измеряют сигнал биолюминесценции полученного экстракта с использованием биолюминесцентного реагента. Концентрацию внутриклеточного АТФ в суспензии вакцины рассчитывают с использованием градуировочной зависимости, полученной при использовании разбавлений АТФ-стандарта с известным содержанием АТФ и биолюминесцентного реагента. Содержание жизнеспособных клеток в вакцине рассчитывают по построенной заранее зависимости содержания внутриклеточного АТФ от величины КОЕ/мл, определенной методом посевов. Общая длительность анализа составляет 36-48 часов.
Известный АТФ-способ имеет ряд недостатков: длительная инкубация в питательной среде сложного состава, экстракция АТФ из клеток вакцины путем инкубирования пробы образца в горячем буферном растворе, содержащем лизирующие добавки, сложная методика расчета содержания внутриклеточного АТФ.
Ближайшим аналогом предлагаемому способу является способ быстрого обнаружения жизнеспособных клеток БЦЖ-вакцины [Kristopher Kolibab, Steven С. Derrick, William R. Jacobs, Sheldon L. Morris. Characterization of an intracellular ATP assay for evaluating the viability of live attenuated mycobacterial vaccine preparations. // Journal of Microbiological Methods, 2012. 90 p. 245-249], включающий реконструкцию лиофилизированной вакцины в растворе Саутона, содержащем сложную композицию минеральный солей, органических добавок и апиразы, с последующей инкубацией в течение 0,5-15 часов при комнатной температуре без перемешивания, в процессе которой происходит удаление внеклеточного АТФ. Далее путем обработки реконструированной вакцины кипящим Tris-ЭДТА буфером высвобождают внутриклеточный АТФ и измеряют его концентрацию с помощью биолюминесцентного реагента. Параллельно определяют количество КОЕ методом посевов разведений и строят зависимость содержания АТФ от величины КОЕ.
Недостатки ближайшего аналога: использование при реконструкции лиофилизированной вакцины сложной смеси растворов Саутона и апиразы может приводить к неполному разрушению внеклеточного АТФ за счет снижения активности апиразы компонентами раствора Саутона, температурный режим и оптимальная длительность стадии реконструкции не установлены, что снижает точность метода, при том что поддержание постоянной температуры является одним из важнейших параметров, определяющих правильное значение содержания внутриклеточного АТФ; использование кипящего Tris-ЭДТА буферного раствора усложняет и удлиняет проведение определения внутриклеточного АТФ.
В изобретении решается задача оптимизации биолюминесцентного метода количественного определения специфической активности лиофилизированной вакцины БЦЖ.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является сокращение длительности и упрощение процедуры определения специфической активности БЦЖ-вакцины, что способствует снижению трудоемкости и стоимости контроля специфической активности лиофилизированной БЦЖ-вакцины.
Технический результат достигается тем, что в способе быстрого количественного определения специфической активности лиофилизированной БЦЖ-вакцины, включающего реконструкцию лиофилизированной вакцины, удаление внеклеточного АТФ с использованием апиразы, экстракцию внутриклеточного АТФ, определение содержания внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методом и расчет специфической активности, реконструкцию лиофилизированной вакцины проводят в физиологическом растворе в течение 15 минут при комнатной температуре без перемешивания, а затем в течение 60 минут при 37°C при перемешивании, удаление внеклеточного АТФ проводят путем инкубации реконструированной вакцины в течение 10 минут с апиразой при конечной концентрации апиразы 0,5-1 ед/мл, экстракцию внутриклеточного АТФ проводят путем добавления 100%-ного ДМСО до конечной его концентрации не менее 80 об. % и инкубации полученного экстракта в течение 1 минуты при комнатной температуре, определение содержания АТФ в полученном экстракте проводят по интенсивности сигнала биолюминесцении для смеси, включающей экстракт реконструированной БЦЖ-вакцины в ДМСО и раствора АТФ-реагента на основе люциферин-люциферазы при их объемном соотношении 1:5, расчет содержания внутриклеточного АТФ в образце реконструированной вакцины проводят, используя значение интенсивности биолюминесцентного сигнала для АТФ-контроля, представляющего собой лиофилизированный препарат с известным содержанием АТФ, по формуле:
где
- содержание АТФ в анализируемом образце БЦЖ-вакцины, пмоль;
где M - масса лиофилизированной вакцины,
а расчет специфической активности проводят по формуле:
где КОЕ - специфическая активность вакцины, млн КОЕ/мг;
(АТФ) - удельное содержание АТФ в вакцине, пмоль/мг;
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Предлагаемый способ быстрого количественного определения специфической активности лиофилизированной БЦЖ-вакцины включает несколько стадий: реконструкцию лиофилизированной вакцины, удаление внеклеточного АТФ с использованием апиразы, экстракцию внутриклеточного АТФ, определение содержания внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методом и расчет специфической активности.
Для осуществления предлагаемого способа используют флаконы с лиофилизированными биопрепаратами (АТФ-реагент, АТФ-контроль и апиразу) и флаконы с жидкими стерильными препаратами (деионизированной водой, физиологическим раствором (9%-ный водный раствор хлорида натрия, далее, физраствор) и диметилсульфоксидом). Использование реагентов, не требующих длительного приготовления и стерилизации, существенно сокращает длительность и трудоемкость анализа.
Приготовление раствора АТФ-реагента. Во флакон с лиофилизированным АТФ-реагентом медленно вводят 2 мл стерильной воды, выдерживают раствор в течение 10-15 минут без перемешивания, а затем содержимое флакона аккуратно перемешивают до однородности и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин перед использованием. Получают раствор АТФ-реагента на основе люциферин-люциферазы.
Приготовление раствора АТФ-контроля. Раствор АТФ-контроля готовят непосредственно перед проведением измерения биолюминесценции. Для этого во флакон с лиофилизированным АТФ-контролем вводят 1 мл физраствора, чтобы получить раствор, содержащий ~10 пмоль АТФ (точное содержание АТФ указывается в паспорте АТФ-контроля). Для измерения биолюминесценции АТФ-контроля в две пробирки вносят по 100 мкл раствора АТФ-контроля в физрастворе, в каждую пробирку добавляют по 20 мкл физраствора и по 1 мл ДМСО и перемешивают. Полученные две пробы раствора АТФ-контроля в ДМСО можно хранить не более 4 часов при комнатной температуре.
Приготовление раствора апиразы. Во флакон с лиофилизированной апиразой вносят 130 мкл физраствора и получают раствор апиразы с концентрацией 5 ед/мл.
Для проведения реконструкции ампулу с сухой лиофилизированной БЦЖ-вакциной вскрывают, вводят в нее 1 мл физраствора, выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре без перемешивания, затем в течение 60 мин при 37°C в термостатируемой качалке при перемешивании, после чего охлаждают полученную суспензию вакцины до комнатной температуры в течение 3-5 минут.
Из каждой ампулы с суспензией реконструированной вакцины отбирают по две пробы объемом 100 мкл и вносят в две пробирки, содержащие по 20 мкл раствора апиразы. Пробы инкубируют в течение 10 мин при конечной концентрации апиразы 0,5-1 ед./мл при комнатной температуре для разрушения апиразой внеклеточного АТФ.
Для экстракции внутриклеточного АТФ к одной пробе с суспензией реконструированной вакцины добавляют 1 мл ДМСО, перемешивают, через минуту отбирают 20 мкл экстракта вакцины в ДМСО, помещают в кювету люминометра, добавляют 100 мкл раствора АТФ-реагента, быстро перемешивают и измеряют сигнал биолюминесценции на люминометре. Те же процедуры экстракции и измерения сигнала биолюминесценции повторяют для второй пробы и рассчитывают среднее арифметическое для двух проб одного и того же образца вакцины, 
.
АТФ-контроль, как и вакцину, реконструируют в 1 мл физиологического раствора. В две пробирки отбирают по 100 мкл раствора АТФ-контроля, добавляют по 20 мкл физиологического раствора (вместо апиразы) и по 1 мл ДМСО, перемешивают и определяют сигнал биолюминесценции для АТФ-контроля аналогично определению сигнала биолюминесценции для суспензии реконструированной вакцины. Среднее арифметическое значение сигналов биолюминесценции для двух проб АТФ-контроля 
используют для расчета содержания внутриклеточного АТФ в образце лиофилизированной вакцины по формуле (1).
где 
- содержание АТФ в вакцине, пмоль;
Значение 
, пмоль, характеризует содержание АТФ в одной проанализированной ампуле вакцины. Используя известное значение массы вакцины в ампуле, рассчитывают удельное содержание АТФ в 1 мг массы вакцины по формуле (2)
где (АТФ), пикомоль/мг - содержание АТФ на 1 мг вакцины;
M - масса вакцины, мг (в одной ампуле).
Расчет специфической активности лиофилизированной вакцины проводят по формуле (3):
где КОЕ - специфическая активность вакцины, млн КОЕ/мг;
(АТФ) - содержание АТФ в вакцине, пмоль/мг;
Коэффициент пропорциональности 
получают предварительно при сопоставлении экспериментально полученных данных по специфической активности (млн КОЕ/мг), измеренных методом посевов, и данных по содержанию внутриклеточного АТФ (пмоль/мг), измеренных биолюминесцентным методом, для стандартных образцов анализируемой лиофилизированной БЦЖ-вакцины.
Ниже приведены конкретные примеры выполнения предлагаемого способа.
Пример 1. Определение специфической активности лиофилизированной вакцины по содержанию внутриклеточного АТФ
Приготовление раствора АТФ-реагента. Во флакон с лиофилизированным АТФ-реагентом (ТУ 2639-001-72144176-2010) медленно вводят 2 мл стерильной воды, выдерживают раствор в течение 10-15 минут без перемешивания, а затем содержимое флакона аккуратно перемешивают до однородности и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин перед использованием. В процессе работы флакон с раствором АТФ-реагента хранят при комнатной температуре в течение рабочего дня.
Приготовление раствора АТФ-контроля. Во флакон с лиофилизированным АТФ-контролем (ТУ 2639-002-72144176-2010) вводят 1 мл физраствора, получают раствор, содержащий 7,5 пмоль АТФ (содержание АТФ, указанное в паспорте АТФ-контроля). В две пробирки вносят по 100 мкл раствора АТФ-контроля в физиологическом растворе, в каждую пробирку добавляют по 20 мкл физиологического раствора и по 1 мл ДМСО и перемешивают. Полученные две пробы раствора АТФ-контроля в ДМСО хранят не более 4 часов при комнатной температуре.
Приготовление раствора апиразы. Во флакон с лиофилизированной апиразой вносят 130 мкл физиологического раствора и получают раствор апиразы с концентрацией 5 ед./мл. Раствор апиразы хранят при комнатной температуре не более 4 часов.
Измерение сигнала биолюминесценции для АТФ-контроля 
. В кювету люминометра вносят 20 мкл раствора АТФ-контроля в ДМСО из первой пробы, добавляют 100 мкл раствора АТФ-реагента, быстро перемешивают и регистрируют сигнал биолюминесценции на люминометре, заносят в таблицу (повтор 1). Повторяют тот же эксперимент еще с одной порцией раствора АТФ-контроля из пробы №1 (повтор 2). Находят среднее арифметическое значение сигнала биолюминесценции для двух повторов. Находят среднее значение сигнала биолюминесценции для пробы №1, заносят в таблицу 1. Проводят аналогичные измерения с пробой №2 АТФ-контроля, находят среднее значение сигнала биолюминесценции для пробы №2. Среднее значение для двух проб используют как 
при расчете концентрации внутриклеточного АТФ в образце вакцины.
Проведение испытаний вакцины. Отбирают для анализа три ампулы из одной и той же партии лиофилизированной БЦЖ-вакцины, маркируют их (ампулы №1-3). Ампулы вскрывают, не допуская попадания стекла внутрь, добавляют в них по 1 мл стерильного физраствора, закрывают сверху фольгой, предварительно протертой спиртом, инкубируют 15 мин при комнатной температуре без перемешивания, затем в течение одного часа при 37°C в термостатируемой качалке при перемешивании (250 об/мин). Через 1 час инкубации ампулы извлекают из качалки, охлаждают на воздухе до комнатной температуры в течение 3-5 минут. В шесть пробирок вносят по 20 мкл раствора апиразы (активность 5 ед./мл). Из каждой ампулы с суспензией реконструированной вакцины отбирают по две пробы объемом 100 мкл и добавляют их в две пробирки с апиразой, аккуратно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин без перемешивания.
В первую пробирку (проба №1) с суспензией вакцины, обработанной апиразой, добавляют 1 мл ДМСО, перемешивают, инкубируют в течение 1 минуты, отбирают 20 мкл полученного экстракта вакцины в ДМСО, помещают в кювету люминометра, добавляют 100 мкл раствора АТФ-реагента, быстро перемешивают, измеряют сигнал биолюминесценции и вносят его величину в таблицу 2. Повторяют измерения с новой порцией экстракта из той же пробы №1 и находят среднее арифметическое для пробы №1. Аналогичным образом последовательно проводят измерения для пробы №2 из той же ампулы вакцины. Полученные результаты измерений вносят в таблицу 2 в колонки для пробы 2.
Затем находят среднее арифметическое для ампулы 1 и вносят в таблицу 3.
Выполняют аналогичные измерения для ампул №2 и №3.
Средние значения сигнала биолюминесценции для каждой ампулы вносят в таблицу 3
Рассчитывают содержание внутриклеточного АТФ в каждой ампуле по формуле (1):
где 7,5 - содержание АТФ-контроля в исходном образце АТФ-контроля (по паспорту);
Результаты вносят в Таблицу 3, колонка 4.
Рассчитывают содержание АТФ в 1 мг вакцины по формуле (2), используя известную величину массы вакцины в ампуле (0,5 мг):
M - масса вакцины, мг.
Результаты вносят в Таблицу 3, колонка 6.
Для проанализированного образца вакцины (трех проанализированных ампул) среднее значение содержания внутриклеточного АТФ составляет 40,6 пмоль/мг (Таблица 3, колонка 6, строка 6).
Рассчитывают специфическую активность данного образца вакцины по формуле (3):
Используя раннее полученный коэффициент K=0.36±0,02, имеем
Млн КОЕ/мг = (0,36 ± 0,02) × 40,6, пмоль/мг = (14,6±0,9) млн КОЕ/мг.
Величина специфической активности, определенной экспериментально методом посевов, для данной партии вакцины составляет (14,0±2,1) млн КОЕ/мг.
Сравнение величины специфической активности, полученной экспериментально и рассчитанной по результатам предлагаемого способа, показывает, что эти данные находятся в допустимом интервале определения величины КОЕ.
Пример 2. Определение коэффициента пропорциональности К между содержанием внутриклеточного АТФ (пмоль/мг), измеренным биолюминесцентным методом, и специфической активностью (млн КОЕ/мг), измеренной методом посевов, для анализируемого штамма лиофилизированной БЦЖ-вакцины
Для 48 образцов лиофилизированной БЦЖ-вакцины были определены специфические активности (млн КОЕ/мг) методом посева и содержание внутриклеточного АТФ (пмоль/мг) - биолюминесцентным методом. В качестве образцов БЦЖ-вакцины с активностью, соответствующей техническим требованиям на продукцию, были использованы препараты БЦЖ-вакцины, изготовленные в 2016 году, а в качестве образцов вакцины с низкой активностью были использованы препараты вакцины, хранившиеся длительное время по окончании срока их годности. На Фиг. 1 показано, что существует линейная зависимость между содержанием внутриклеточного АТФ (пмоль/мг) и специфической активностью (млн КОЕ, мг) с коэффициентом корреляции (R=0.95). Каждая точка соответствует экспериментальным данным для отдельных образцов вакцины и является усредненным результатом 2-3 независимых измерений. Наклон этой зависимости, коэффициент 
На основании существования линейной зависимости в широком интервале специфической активности БЦЖ-вакцины, простое линейное соотношение (формула 3) может быть использовано для расчета специфической активности (млн КОЕ/мг) по экспериментально измеренному значению содержания внутриклеточного АТФ (пмоль/мг):
Предлагаемый способ быстрого количественного определения специфической активности лиофилизированной БЦЖ-вакцины по сравнению с известными позволяет сократить длительность анализа до 2-х часов, упростить и стандартизировать процедуру реконструкции лиофилизированной БЦЖ-вакцины, сократить длительность и трудоемкость метода экстракции внутриклеточного АТФ и метода измерения сигнала биолюминесценции, унифицировать состав реагентов, используемых в анализе.
Claims (13)
- Способ быстрого количественного определения специфической активности лиофилизированной БЦЖ-вакцины, включающий реконструкцию лиофилизированной вакцины, удаление внеклеточного АТФ с использованием апиразы, экстракцию внутриклеточного АТФ, определение содержания внутриклеточного АТФ биолюминесцентным методом и расчет специфической активности, отличающийся тем, что реконструкцию лиофилизированной вакцины проводят в физиологическом растворе в течение 15 минут при комнатной температуре без перемешивания, а затем в течение 60 минут при 37°С при перемешивании, удаление внеклеточного АТФ проводят путем инкубации реконструированной вакцины в течение 10 минут с апиразой при конечной концентрации апиразы 0,5-1 ед./мл, экстракцию внутриклеточного АТФ проводят путем добавления 100%-ного ДМСО до конечной его концентрации не менее 80 об. % и инкубации полученного экстракта в течение 1 минуты при комнатной температуре, определение содержания АТФ в полученном экстракте проводят по интенсивности сигнала биолюминесценции для смеси, включающей экстракт реконструированной БЦЖ-вакцины в ДМСО и раствор АТФ-реагента на основе люциферин-люциферазы при их объемном соотношении 1:5, расчет содержания внутриклеточного АТФ в образце реконструированной вакцины проводят, используя значение сигнала биолюминесценции для АТФ-контроля, представляющего собой лиофилизированный препарат с известным содержанием АТФ, по формуле:
- (АТФ)вакцина = (АТФ)контроль × (Iвакцина/Iконтроль),
- где (АТФ)вакцина - содержание АТФ в анализируемом образце БЦЖ-вакцины, пмоль;
- (АТФ)контроль - содержание АТФ в АТФ-контроле, пмоль;
- Iвакцина и Iконтроль - значения интенсивностей сигналов биолюминесценции для экстракта вакцины и АТФ-контроля в ДМСО,
- расчет удельного содержания внутриклеточного АТФ в анализируемом образце (АТФ, пмоль/мг) проводят с учетом массы лиофилизированной вакцины в анализируемом образце по формуле:
-
- где М - масса вакцины,
- а расчет специфической активности проводят по формуле:
-
- где КОЕ - специфическая активность вакцины, млн КОЕ/мг;
- (АТФ) - удельное содержание АТФ в вакцине, пмоль/мг;
- К - предварительно определенный для данного штамма БЦЖ-вакцины коэффициент пропорциональности между удельным содержанием АТФ и специфической активностью, измеренной методом посевов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016133256A RU2625725C1 (ru) | 2016-08-12 | 2016-08-12 | Способ быстрого количественного определения специфической активности лиофилизированной вакцины бцж |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016133256A RU2625725C1 (ru) | 2016-08-12 | 2016-08-12 | Способ быстрого количественного определения специфической активности лиофилизированной вакцины бцж |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2625725C1 true RU2625725C1 (ru) | 2017-07-18 |
Family
ID=59495543
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016133256A RU2625725C1 (ru) | 2016-08-12 | 2016-08-12 | Способ быстрого количественного определения специфической активности лиофилизированной вакцины бцж |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2625725C1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101793832A (zh) * | 2009-02-04 | 2010-08-04 | 中国科学院电子学研究所 | 一种快速检测卡介苗活菌含量的方法 |
-
2016
- 2016-08-12 RU RU2016133256A patent/RU2625725C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101793832A (zh) * | 2009-02-04 | 2010-08-04 | 中国科学院电子学研究所 | 一种快速检测卡介苗活菌含量的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JENSEN SE. et al. Development and validation of an ATP method for rapid estimation of viable units in lyophilised BCG Danish 1331 vaccine.Biologicals. 2008 Sep; 36(5): 308-14. doi: 10.1016/j.biologicals.2008.05.001. Epub 2008 Jul 9. HO MM. et al. Report of an international collaborative study to establish the suitability of using modified ATP assay for viable count of BCG vaccine.Vaccine. 2008 Aug 26; 26(36): 4754-7. doi: 10.1016/j.vaccine.2008.06.026. Epub 2008 Jun 27. KOLIBAB K. et al. Characterization of an intracellular ATP assay for evaluating the viability of live attenuated mycobacterial vaccine preparations.J Microbiol Methods. 2012 Sep; 90(3): 245-9. doi: 10.1016/j.mimet.2012.05.015. Epub 2012 May 28. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Truman et al. | Viable M. leprae as a research reagent | |
| CA2723402C (en) | Method for characterising the biological activity of helminth eggs, in particular trichuris eggs | |
| CN107314980A (zh) | 一种动物源性食品中多种抗生素残留检测试剂盒及检测方法 | |
| Jensen et al. | Development and validation of an ATP method for rapid estimation of viable units in lyophilised BCG Danish 1331 vaccine | |
| CN101255456A (zh) | 卷烟烟气致突变性的毒理学测定评价方法 | |
| Brack et al. | Effects of ultrahigh dilutions of 3, 5-dichlorophenol on the luminescence of the bacterium Vibrio fischeri | |
| Gemba et al. | Development of predictive models of biofilm formation by C. sakazakii, E. cloacae on surfaces used in the food industry and medicine | |
| RU2625725C1 (ru) | Способ быстрого количественного определения специфической активности лиофилизированной вакцины бцж | |
| Randhawa | Dimethyl sulfoxide (DMSO) inhibits the germination of Candida albicans and the arthrospores of Trichophyton mentagrophytes | |
| Wurster et al. | Drosophila melanogaster as a Rapid and Reliable In Vivo Infection Model to Study the Emerging Yeast Pathogen Candida auris | |
| CN106636378A (zh) | 用于检测番茄晚疫病菌的lamp引物组合物和应用 | |
| Maharjan et al. | Evaluation of OMNIgeneSPUTUM-stabilised sputum for long-term transport and Xpert MTB/RIF testing in Nepal | |
| Khodadadi et al. | Evaluation of usage of readily accessible Enterobacteriaceae differential and selective media for identifying Candida auris | |
| CN208250276U (zh) | 一种同步检测猪疫病的多种病原体的试剂盒 | |
| CN113215038B (zh) | 一种嗜热脂肪地芽孢杆菌及其用于快速检测样品中抗生素的方法 | |
| Ugarova et al. | Controlling BCG vaccine’s cell viability in the process of its production by an bioluminescent ATP assay | |
| Horrocks et al. | Metabolism of Lactobacillus and Gardnerella vaginalis in vaginal defined media | |
| JP2018502557A (ja) | ラクトバチルス・ラムノサスｇｇの、間欠滅菌され、インタクトかつ免疫学的に活性なバクテリア細胞の製造、ならびにそれの定性的かつ定量的な決定のための方法。 | |
| NL2037533B1 (en) | Characterization of cells | |
| RU2603104C2 (ru) | Способ биохемилюминесцентной оценки токсичности рубцовой жидкости in vitro | |
| Nafchi et al. | A modified ATP assay for test the potency of BCG vaccine | |
| CN117044677B (zh) | 一种基于公猪抗病性状的选育方法 | |
| Zare et al. | A rapid, reliable, and cost-effective method for monitoring Mycoplasma spp. growth in real-time using Resazurin fluorescence | |
| Mawhinney et al. | Screening for Taylorella equigenitalis in equine semen: An exploratory study | |
| CENGİZ et al. | Method decision for determining specific microorganisms in pharmaceutical products: an overview |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20180716 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |