RU2675232C2 - Способ для получения, разделения и исследования компонентов биологических жидкостей и устройство его осуществления - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована для получения, разделения и исследования компонентов биологических жидкостей. Для этого первоначально в биологическую жидкость вводят не более одного реагента. Затем перемешивают и ожидают выпадения преципитата в течение 5-10 минут. После чего разделяют на фракции при центрифугировании в течение 3-5 минут. Затем проводят исследования количественного и качественного состава фракций для диагностики патологических состояний. Также представлено одноразовое устройство для получения, разделения и исследования компонентов биологических жидкостей. Группа изобретений обеспечивает получение, разделение и исследование компонентов биологических жидкостей с целью диагностики патологических состояний. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 9 ил.

Description

Изобретение относится к медицине, в частности, к клинической медицинской безинвазивной диагностике островоспалительной патологии у взрослых и детей, а именно к способам для исследования биологических жидкостей, в частности мочи, и к устройствам для осуществления этих исследований в научно-исследовательских целях.

Известен комплекс лабораторных тестов, применяемый на практике, включающий общеклинический анализ крови и мочи, биохимическое исследование крови (общий белок, трансаминазы, билирубин, мочевина, глюкоза, электролиты), позволяющий судить по изменению абсолютных показателей и их отклонении от нормы в сторону повышения или понижения о состоянии больного [1-5].

Известны способы диагностики патологических состояний больных по составу белков крови и изменению их концентраций, в частности гаптоглобина и С-реактивного белка для диагностики заболеваний сердечно-сосудистой, мочеполовой, нервной систем, болезней легких, желудочно-кишечного тракта, крови, наследственной патологии [6].

Использование осадочных проб для выявления количественного состава различных белков плазмы крови применяется для диагностических целей.

Эти реакции основаны на денатурирующем действии различных реактивов, например, формалина, сулемы, тимола, красителей, на белки, приводящем к сдвигу изоэлектрической точки и потери растворимости с последующим выпадением в осадок преимущественно грубодисперсных белков γ-глобулинов и, в меньшей степени β-глобулинов и альбуминов. Следует отметить, что механизмы осадочных реакций в настоящее время окончательно не выяснены. Можно предположить, что они обусловлены изменением дисперсности не только плазменных белков, но и других компонентов крови, в частности липопротеидов, мукополисахаридов.

Осадочные пробы широко используются для диагностики воспалительного процесса. В частности, известна коллоидно-осадочная реакция Вельтмана [7], основанная на образовании преципитата белков под влиянием хлористого кальция.

Известна сулемовая проба (реакция Таката-Ара) [6], которая основана на способности альбумина плазмы крови поддерживать устойчивость коллоидного раствора хлорной ртути и карбоната натрия. При изменении соотношения между белковыми фракциями плазмы крови в сторону глобулинов, устойчивость коллоидов нарушается, что определяется по выпадению хлопьевидного преципитата. Недостатком этой реакции является невысокая специфичность при островоспалительных заболеваниях, высокий разброс показателей, в связи с чем, она практически не применяется для диагностики этих состояний.

Известна тимоловая проба [7], основанная на свойстве насыщенного раствора тимола в вероналовом буфере давать с сывороткой крови помутнение, которое оценивается нефелометрическим методом. Повышенные показатели тимоловой пробы наблюдаются при заболеваниях печени и отражают повышении в крови концентрации α-, β- и γ-глобулинов и липопротеидов.

Существенным недостатком этой пробы является отсутствие возможности ее применения для объективной количественной оценки компонентов плазмы крови, определяющих эту реакцию. Кроме того, длительность анализа, как минимум от 2 до 24 часов, резко снижает диагностическую ценность исследования для своевременной оценки состояния пациента и принятия решения.

Известен способ осаждения белков сульфатом аммония ([NH₄]₂SO₄) из плазмы крови (преципитация), который по данным [8] проходит по двум механизмам:

1. Взаимодействие сульфат-ионов с положительно заряженными аминокислотами повышает компактность молекулы белка (делает ее менее растворимой). Это взаимодействие более эффеективно при pH<pI.

2. Обезвоживание (дегидратация) - связывание молекул сульфата с молекулами Н₂О. Один ион SO₄ ^2- имеет 13-14 молекул Н₂О в первом гидратном слое, во втором - возможно больше. Если одна молекула сульфата координирует даже с 15 молекулами Н₂О, то 3М сульфат аммония связывает 45 из имеющихся в воде 55М Н₂О.

Согласно этому способу к 100 мл сыворотки крови добавляют 50 мл дегидратанта - насыщенного раствора сульфата аммония. Осадок удаляют центрифугированием, затем его растворяют в 50 мл дистиллированной воды и снова осаждают в 25 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Осаждение повторяют 4-5 раз. Затем препарат диализуют против соответствующего буфера. Иногда осаждение проводят при 40% насыщении соли, что увеличивает выход, но снижает чистоту препарата. Недостатки этого способа проявляются в том, что образующийся при центрифугировании преципитат всплывает, захватывая с собой белки. Осаждение сульфатом аммония неприменимо для белков, требующих присутствия Са²⁺, из-за нерастворимости сульфата кальция. Более того, этот способ не приемлем для осаждения белков в моче с целью диагностики или получения фракций отдельных компонентов.

Известен метод электрофореза на нерастворимых носителях, в частности, электрофорез в гелях: крахмальном по O. Smithies, [9]; полиакриламидном по Raymond, Weintraub [10]. Метод электрофореза плазмы крови в крахмальном геле позволяет выделить до 12 фракций, поддающихся анализу, а метод электрофореза в полиакриламидном геле - до 20 фракций. Количество фракций в моче выявляется примерно в два раза меньше, причем в этом случае, как правило, требуется предварительное концентрирование мочи в гелях или диализ, что само по себе отражается на нативности некоторых лабильных белков и увеличивает количество этапов и время подготовки к исследованию на 1-2 часа [11].

Несмотря на высокую разрешающую способность этих методов, они имеют ряд существенных недостатков. Одним из них является возможность анализа только микроколичеств нативных белков, сохраняющих растворимость. При потере даже частичной растворимости, разделение белков этими методам невозможно. Они остаются на линии старта и не пригодны для исследования.

Следует также обратить внимание на крайне низкий выход конечного продукта, даже при препаративном электрофорезе [12]. Этот способ имеет сложную процедуру анализа, а весь процесс исследования составляет от 60 мин до 2 часов.

Известен метод седиментации- оседания частиц дисперсной фазы в жидкости под действием гравитационного поля или центробежных сил, при этом скорость седиментации зависит от массы, размера, формы и плотности вещества частицы, вязкости и плотности среды, а также от ускорения, силы тяжести и действующих на частицы центробежных сил.

Известен метод дифференциального центрифугирования [13], основанный на различиях в скоростях седиментации частиц, различающихся друг от друга размерами и плотностью. Разделяемый материал, например, гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определенная фракция. В конце каждой стадии осадок отделяют от надосадочной жидкости и несколько раз промывают, чтобы в конечном итоге получить чистую осадочную фракцию. Основной недостаток этого метода, ограничивающий его использование в клинических диагностических целях - сложность и дороговизна оборудования, длительность и многоэтапность процесса выделения каждого компонента, пригодного для исследовательских или производственных целей. По этой причине широкое использование метода в практическом здравоохранении для диагностических целей невозможно.

В отличие от дифференциального и препаративного центрифугирования, целью которых является разделение веществ и их очистка, аналитическое ультрацентрифугирование применяется в основном для изучения седиментационных свойств биологических макромолекул и других структур [14]. Поэтому в аналитическом центрифугировании применяют роторы и регистрирующие системы особой конструкции; Они позволяют непрерывно наблюдать за седиментацией материала в центробежном поле. Аналитические ультрацентрифуги могут развивать скорость до 70000 об/мин, а ускорение достигает до 500000g. При этом имеется возможность с помощью двигателя варьировать скорость вращения ротора. Ротор вращается в вакуумной камере снабженной холодильной установкой, и имеет две ячейки аналитическую и балансировочную, установленные в строго вертикальном направлении параллельно оси вращения. Балансировочная ячейка служит для уравновешивания аналитической и представляет собой металлический блок с прецизионной системой. В ней имеются два индексных отверстия, находящиеся на строго определенном расстоянии от оси вращения. Аналитическая ячейка с емкостью в 1 см³, имеет секторальную форму. При правильной установке в роторе она создает практически идеальные условия седиментации.

Существенный недостаток способа аналитического центрифугирования заключается в целом ряде ограничений, определяющих невозможность его применения для широких клинических обследований. Основными факторами являются чрезвычайная дороговизна и сложность оборудования, необходимость специального персонала. Высокая скорость центрифугирования (70000 об/мин) неприемлема для анализа высокополимерных, объемных и механически неустойчивых компонентов плазмы крови (мочи), в частности протеогликанов и гликозоаминогликанов, пространственная структура которых необратимо разрушается при таких нагрузках, что приводит к искажению оценки их количественного содержания.

Проведение осадочных реакций известно для плазмы или сыворотки крови. Сведения по переводу растворимых компонентов мочи в агрегационное состояние для клинической диагностики в доступной нам литературе единичны, а седиментационное разделение осадка мочи на фракции - вообще не встречается. Сведения о технических устройствах и аппаратах для исследования фракционного состава компонентов мочи и проведения агрегационных реакций, также отсутствуют.

Известна кювета для спектрофотометрии [15], в которой соотношение между объемами камеры для исходной жидкости и накопительной камерой составляет 2.5:1, что не позволяет проводить анализ небольших количеств осадка.

Известны криопробирки для хранения материала [16] и контейнеры с приспособлениями для перемешивания [10]. Однако в них отсутствует емкость для накопления осадка. Его приходится неоднократно сливать, что приводит к взбалтыванию и отрицательно влияет на результаты исследований.

Известен пластиковый контейнер [17], в котором осадок накапливается в месте перехода и падает вниз, однако он не предназначен для центрифугирования.

Известна пластиковая пробирка для центрифугирования [16], которая имеет цилиндрическую форму, но не имеет плоского дна, что не позволяет определить границы осадка при исследовании жидкостей с минимальным содержанием компонентов, в частности, в моче. При этом в пробирке отсутствуют камеры, что также не позволяет получить слой осадка в объеме пригодном для сканирования.

Кроме того, сканирование содержимого таких пробирок затруднено в центрифугах с угловым ротором из-за конструктивных форм ротора. Так, в центрифугах с угловым ротором конечное расположение фракций внутри пробирки, как правило, находится под углом выше 45° градусов по отношению к оси центрифугирования, что существенно снижает возможность обработки информации, качество и достоверность сканирования.

Известна гематокритная центрифуга с горизонтальной укладкой пробирок [5]. Однако она не приспособлена для фракционирования осадка, поскольку имеет неприемлемо малый внутренний диаметр капиллярной камеры, исключающий проведение осадочных реакций. Указанный недостаток не позволяет использовать ее и капилляры для работы с биологическими низко концентрированными жидкостями, в частности, мочой, поскольку не вмещает требуемые для исследования объемы жидкости.

Известен одноразовый концентратор Parasep [18] предназначенный для концентрирования кишечных паразитов методом центрифугирования через специализированный фильтр. Концентратор представляет собой разборную пластиковую пробирку, состоящую из трех элементов: пробирка для образца, в которую уже залита эфирформалиновая смесь и тритон-Х, фильтр со шпателем для образца, коническая емкость для сбора отфильтрованного материала. Пробирка с образцом для анализа герметично закрывается, для предотвращения протекания растворов на фильтре имеется контрольный замок. Концентратор помещается в центрифугу коническим концом вниз и центрифугируется. В процессе центрифугирования имеющиеся в пробе паразиты проходят через фильтр и скапливаются в нижнем коническом отсеке пробирки. Сетка фильтра, со специально подобранными по размеру ячейками (425 мкм), внутри пробирки расположена вертикально, что позволяет вести горизонтальную (латеральную) фильтрацию пробы. В результате чего, грубые частицы непереваренной пищи, клетчатка оседают в смесительной камере, а паразиты, их яйца беспрепятственно проходят через фильтр. Таким образом, паразиты концентрируются в поверхностном слое мелкодисперсного осадка, отбираются с помощью автоматизированной пипетки для микроскопирования и нанесения его на предметное стекло. Данное устройство неприменимо для получения и разделения фракций биологических жидкостей, поскольку фильтр препятствует свободному прохождению крупнодисперсного преципитата. Устройство не приспособлено для сканирования осадка после центрифугирования, не имеет делительной камеры, а отбор осадка производится микропипеткой, что исключает сохранность фракций.

Была поставлена задача создания способа для получения компонентов биологических жидкостей например, мочи, разделения их на вертикально расположенные фракции, последующего изучения с целью диагностики определенных патологических состояний. Кроме того, поставленная задача включала создание устройства для осуществления способа.

Поставленная задача достигнута тем, что в способе воздействовалии на биологические жидкости организма, например мочу, путем проведения одной или нескольких агрегационных реакций с добавлением дегидратантов до образования преципитата в течение 5-10 м, а затем его разделяли на горизонтальные фракции при центрифугировании под действием центробежных сил в течение 3-6 м.

Поставленная задача решалась также тем, что было создано устройство для проведения по меньшей мере одной агрегационной реакции, с последующим центрифугированием преципитата в горизонтальном положении и получением вертикально расположенных фракций отдельных компонентов мочи в камере, а также последующего сканирования фракций в этой же камере для изучения и диагностики определенных патологических состояний.

Решению поставленной задачи предшествовала следующая предпосылка. Было установлено, что при введении дегидратанта, например, сульфата аммония, в биологические жидкости происходит удаление воды из белковой молекулы, что снижает ее растворимость и приводит к образованию преципитата. Образовавшийся в процессе проведения агрегационной реакции преципитат, представляет собой рыхлые, крупнодисперсные ассоциаты. Было установлено, что образованные под действием определенных дегидратантов преципитаты в моче, крайне неустойчивы к механическим воздействиям. Даже при незначительных механических воздействиях: переливании из одной емкости в другую, вибрации, встряхивании, перемешивании, они распадаются на низкодисперсные микроагрегаты и в дальнейшем повторно не ассоциируют. Проведенные исследования показали, что нефелометрический показатель прозрачности биологической жидкости после проведения агрегационной реакции и слабом механическом воздействии на жидкость превышал аналогичное значение до ее проведения, что существенно искажает результат анализа.

Известны результаты исследований по высаливанию билихромопротеидов (фикоцианина и фикоэритрина) синезеленых водорослей [19], в которых преципитат претерпевал аналогичные изменения при незначительных механических воздействиях. Показано, что осадок вблизи точки осаждения очень неустойчив и растворяется даже от вибрации центрифуги.

Математическое подтверждение описанного явления агрегации и дезагрегации приведено в работах [20, 21].

Проведение одной агрегационной реакции в течение 5-10 м или нескольких последовательных агрегационных реакций осуществляли путем добавления разных реагентов из ряда дегидратантов.

Поставленная задача достигалась также тем, что в предполагаемом способе получали, разделяли и исследовали компоненты различных биологических жидкостей: мочу, плазму и сыворотку крови, лимфатическую и спинномозговую жидкость.

Особенности неустойчивого поведения преципитата обусловили проведение одной в течение 5-10 м или нескольких агрегационных реакций в моче непосредственно в реакционной камере устройства. При этом реакционную камеру предварительно устанавливали на горизонтальном столе ротора центрифуги. При низкоскоростном центрифугировании преципитат из реакционной камеры полностью переходил в сообщающуюся с ней делительную камеру, разделяясь на фракции под действием гравитационных сил (фракционируясь) в течение 3-5 м, что также обеспечивало решение поставленной задачи.

Установлено экспериментальным путем наилучшее соотношением между объемами реакционной и делительной камер, равное 20:1, при котором количество образовавшегося преципитата из всего объема биологической жидкости в реакционной камере умещается в делительной камере и располагается наилучшим образом для проведения исследований. При этом выполнение реакционной и делительной камер прямоугольной формы и квадратного сечения позволяет выдерживать соотношением между объемами реакционной и делительной камер, равное 20:1.

Поставленная задача достигалась также тем, что на одном конце реакционной камеры располагали отсек со скосом под углом не менее 50±5°, благодаря которому достигался наилучший переход образующего в ходе реакции преципитата из реакционной в делительную камеру. Кроме того, установка в реакционной камере пластины с отверстиями, центровочными выступами и магнитной полосой способствовало перемешиванию смеси биологической жидкости с реагентом и выпадению преципитата из всего объема биологической жидкости. Снабжение корпуса устройства штуцером с заглушкой позволило осуществить поэтапное введения реактивов и биологических жидких сред, а также предотвращение потери биологической жидкости при расположении устройства в горизонтальной положении на основании центрифуги. Выполнение заглушки на штуцере либо типа loc, либо эластичной обеспечило удобство эксплуатации устройства.

Расположение устройства в горизонтальном положении перпендикулярно оси вращения ротора центрифуги позволило получить разделение преципитата на фракции, при котором компоненты с одинаковым весом накапливаются в определенном месте камеры в вертикальном направлении параллельно оси устройства, что позволяет существенно повысить точность определения их количественного содержания при последующем сканировании.

При этом расположение не менее двух реакционных и делительных камер в плоскости горизонтального основания центрифуги в диаметрально противоположных направлениях позволяло проводить центрифугирование сбалансировано, а также увеличивать количество одновременно проводимых исследований.

Достижению поставленной задачи способствовало также одноразовое использование устройство для получения и разделения на фракции компонентов биологических жидкостей при проведении не менее одной агрегационных реакций для каждого образца биологической жидкости одного и того же пациента, а также одной и той же биологической жидкости разных пациентов.

На фиг. 1, 2 представлено устройство по варианту 1 с двумя неразъемными камерами, а на фиг. 3, 4 - по варианту 2 с двумя разъемными камерами. На фиг. 1 под цифрой 1 обозначен корпус устройства, 2 - реакционная камера, 3 - делительная камера, внутри реакционной камеры 2 свободно установлена пластина для перемешивания 4 с отверстиями 5, центровочными скосами 6 и магнитной полосой 7, на верхнем конце реакционной камеры установлен штуцер для ввода реагентов 8, с соединением типа luer и заглушкой 9, под цифрой 10 - переходный отсек со скосом 50±5°.

На фиг. 3, 4 переходный отсек 10 со скосом 50±5°. оканчивается резьбовым соединением типа luer-loc, в центре которого проходит втулка 12, к которой герметично присоединяется делительная камера 13. Соединение типа luer на конце штуцера 8 по обоим вариантам устройства дает возможность использования как заглушки 9 из эластичного материала, так и завинчивающиеся заглушки 14 типа loc.

По обоим вариантам корпус 1 устройства выполнен из поликарбоната или другого ударопрочного прозрачного пластмассового материала. Внутри корпуса находятся сообщающиеся между собой реакционная - 2 и делительная - 3 камеры. Общий объем двух камер 2 и 3 может варьировать в различных пределах в зависимости от назначения и состава исследуемой биологической жидкости, однако в вариантах 1, 2 предлагаемого устройства их соотношение равно 10:0,5 мм³ (20:1). Общий наружный размер корпуса 1 устройства - 60×18×18 мм, что соответствует объему 10 мл. Этот объем вмещает достаточное для проведения агрегационной реакции количество мочи, реактива (дегидратанта) и позволяет получить достаточный для исследования объем преципитата.

Реакционная камера 2 имеет квадратное сечение и служит для проведения одной или нескольких агрегационных реакций путем добавления реактива (дегидратанта). Делительные камеры 3, 13 также имеют квадратное сечение и служат для накопления и разделения на фракции преципитата при центрифугировании.

Установленные размеры делительных камер 3, 13 обеспечивают накопление и разделение осадка на фракции и при этом исключают возможность взбалтывания рыхлого осадка при остановке и повторном запуске центрифуги.

Длины делительных камер 3, 13 составляют 25±0,5 мм при квадратном сечении 3×3 мм. Это обусловлено тем, что максимальная длина осадка в камере при проведении последовательно 2-х и даже 3-х агрегационных реакций не превысит этой величины. Кроме того, этого материала будет достаточно для проведения исследования, при этом также имеется запас в 5-7 мм, необходимый в случае повышенного количества компонента мочи. Меньшие размеры делительных камер 3, 13 уменьшат поверхность для сканирования и ухудшат точность исследования, а большие размеры увеличат возможность взбалтывания осадка при перемешивании, что снизит точность исследования.

Квадратная форма сечения реакционной камеры 2 более оптимальна, чем цилиндрическая, поскольку позволяет вместить существенно больший объем биологической жидкости при сохранении общих ограничительных размеров. Так, при диаметре камеры цилиндрической формы, например, равном 18 мм и длине 25 мм, ее объем составляет 6,3585 мл, в то время как камера с квадратным сечением, размером 18×18 мм. и длиной 25 мм, вмещает 8,1 мл.

Длина переходного отсека 10 взаимосвязана с величиной угла скоса этого отсека и составляет, предпочтительно 10±1 мм. Меньшая длина переходного отсека 10 приводит к ухудшению прохождения преципитата через него, вплоть до его задержки и накоплению на его стенках. Большая длина переходного отсека приводит к увеличению угла скоса переходного отсека 10, и влечет нецелесообразное увеличение длины всего устройства.

Длина реакционной камеры 2 связана с ее объемом, так при предпочтительной длине 25 мм, ее объем вместе с объемом переходного отсека соответственно составит 10±0,5 мл, что оптимально для проведения осадочных реакции и получения необходимого количества осадка преципитата для исследования.

Оптимальное соотношение, достигнутое между объемами реакционной камеры 2 и делительной камеры 3, 13 позволяет анализировать небольшие количества осадка, что достаточно для эффективного исследования. Так, как концентрация исследуемых компонентов моче в 5-10 раз меньше по сравнению с их концентрацией в плазме крови, то при исследовании плазмы крови для оптимального заполнения делительной камеры 3, 13 допустимо ее предварительной разведение.

Применение в реакционной камере 2 пластины 4 для перемешивания способствует повышению точности исследования за счет равномерного перемешивания реагентов и биологической жидкости. Эффект улучшения точности диагностики при перемешивании отмечается и доказывается тем, что без перемешивания агрегационная реакция проходит равномерно не во всех частях камеры. При этом в боковых участках камеры и в отсеке 10 реакция начинается через 30-60 сек или совсем не происходит. Время перемешивание ограничено 5±1 сек., поскольку при увеличении времени перемешивания более 10-12 секунд происходит необратимое разрушение образовавшегося рыхлого крупнодисперсного преципитата на низкодисперсные агрегаты и их частичное растворение, что приводит к искажению нефелометрических показателей (фиг. 5).

Проведенные исследования показали, что сразу после добавления к моче реактива (дегидратанта) начинается агрегационная реакция, которая проявляется в резком помутнении раствора и повышении нефелометрического показателя за счет снижения прозрачности.

Отверстия 5 в пластине 4 способствуют равномерному прохождению и перемешиванию биологической жидкости не только с боковых сторон пластины 4, но и в центре реакционной камеры 2. При необходимости контроля прохождения агрегационной реакции, одно из отверстий 5 позволяет беспрепятственно проходить лучу от внешнего фотооптического преобразователя через слой биологической жидкости внутрь устройства.

Использование центровочных выступов 6 позволяет сохранить свободное положение пластины 4 при перемешивании без смещения, а также обеспечить проход жидкости по краям реакционной камеры 2.

Использование магнитной полоски 7 на пластине 4 обеспечивает ее возвратно-поступательное перемещение внутри реакционной камеры 2, необходимое для перемешивания, под действием переменного магнитного поля от внешнего источника.

Использование соединения 9 типа luer на конце штуцера 8 дает возможность использования как заглушки из эластичного материала, так и завинчивающейся заглушки типа loc.

Реакционную 2 и делительную 3, 13 камеры в сборе устанавливают в ложемент площадки ротора центрифуги в горизонтальном положении. Ложемент находится в положении, между элементами фотооптического преобразователя, при котором обеспечивается прохождение луча лазера через реакционную камеру 2 на фотоэлемент, установленный под площадкой ротора центрифуги. Центрифуга находится во включенном состоянии.

В реакционную камеру 2 через штуцер 8 вводится дегидратант, инициирующий агрегацию, и биологическая жидкость, например моча, до общего объема 10 мл. Закрывают заглушку 9 и включают пластину 4 для перемешивания, обеспечивающую возвратно-поступательное движение жидкости в реакционной камере 2 в течение не более 5±1 сек. При этом автоматически запускается таймер времени на 5-10 минут (предпочтительно - 8 мин). Эти временные ограничения обусловлены временем срабатывания фотооптического блока, состоящего из лазерного агрегометра и фоторезистора. После этого выдерживают экспозицию в интервале 10±1 мин. На 5-6 минуте агрегационная реакция практически полностью заканчивается. После истечения 6 минут, автоматически включается центрифугирование, которое продолжается в течение 60±1 сек. на скорости 1500 об/мин. Данная скорость обеспечивает ускорение силы тяжести не более 700 g, достаточное для решения поставленной задачи.

После прекращения центрифугирования устройство извлекали для сканирования на внешнем сканере.

В том случае, если устройство снабжено внешним сканером, ротор перемещается вращением доводчика до положения делительной камеры 3 над фотооптическим преобразователем сканера, что позволяет провести денситометрию фракций осадка. Однако, установка сканера непосредственно в центрифуге, существенно усложняет ее конструкцию и стоимость.

В противовес первоначальным реакционной 2 и делительной 3 камерам в плоскости площадки ротора диаметрально противоположно устанавливаются аналогичные реакционная 2 и делительная 3 камеры. На площадке ротора одновременно могут быть расположено несколько пар таких реакционных и делительных камер.

Перед началом работы несколько устройств по варианту 2 реакционные камеры 2 в них герметично соединяют с делительными камерами 13 через винтовые соединения 11. Устройства в сборе также устанавливают в ложементы площадки ротора центрифуги. Далее устройства работают так же, как по варианту 1. После остановки центрифуги делительные камеры 13 отсоединяют от реакционных 2 для сканирования на внешнем сканере.

При необходимости анализа нескольких компонентов одной биологической жидкости в одном устройстве исследование может быть продолжено за счет последовательного проведения следующих агрегационных реакций, позволяющих исследовать количественно и качественно другие компоненты той же биологической жидкости, например, липопротеины или мукопротеины и т.д.

В этом случае работа устройства по варианту 3 вначале осуществляется аналогичным образом, что и по вариантам 1, 2. Однако после завершения первоначального исследования биологическая жидкость в реакционной камере 2 не удаляют, делительная камера 13 отвинчивают для исследования, а вместо нее присоединяется новая делительная камера 13 после чего в реакционную камеру 2 через штуцер 8 вводят реактив другого состава, подобранный в соответствии с целью исследования, например, липопротеинов.

Новая порция фракций преципитата поступает в делительную камеру 13 и после окончания центрифугирования ее также сканируют (денситометрируют). Таким образом, на одном или нескольких устройствах могут быть последовательно проведены различные исследования количественного и качественного состава других компонентов биологической жидкости, например, липопротеинов, мукополисахаридов, липополисахаридов.

Пример работы способа и устройства по варианту 1.

Устройство выполнено из прозрачного пластмассового материала, в конкретном случае поликарбоната. Общий наружный размер устройства 70×20×15 мм с соотношением объемов между реакционной 2 и делительной камерами 3 - 10:0,5. Общий объем двух камер составляет 10 мл. Объем реакционной камеры 2 - 9.8 мл, а объем делительной камеры 3 - 0.2 мл.

Реакционную 2 и делительную 3 камеры устройства помещают в ложемент площадки ротора центрифуги. С противоположной стороны площадки ротора в противовес помещают аналогичные камеры 2, 3.

Во все реакционные камеры 2 через штуцеры 8 заливают 0,5 мл раствора дегидратанта, а затем вводят исследуемую биологическую жидкость, в конкретном примере - мочу в количестве 9,5 мл. Отверстия штуцеров 8 закрывают заглушками 9 из эластичного материала. Включают на 5 с внешний источник переменного магнитного поля, вызывающий возвратно-поступательные перемещения пластин 4 с магнитными полосками 7 внутри камер 2, что приводит к перемешиванию смесей.

После прекращения перемешивания смесей их выдерживается в покое в течение 5 м (время экспозиции). Длительность агрегационной реакции определяли лазерным агрегометром «Criofer-D», (фирмы Lobatse S.L., Испания), у группы здоровых людей (n=10) она находилась в пределах 5-6 м, в среднем 5,6+0,28, (Р>0,1), после чего практически прекращалась. Динамика реакции представлена на фиг. 6. Изменение прозрачности исследуемой мочи после агрегационной реакции представлено на фиг. 7, в этом случае экспозиция (до центрифугирования) составляла 2 м.

По истечении времени экспозиции включали центрифугирование со скоростью 1500 об/м (700 g) в течение 1 м. После остановки центрифуги реакционные 2 и делительные камеры 3 переносили на внешний сканер (денситометр) и исследовали компоненты фракций внутри делительных камер 3. Полученные значения обрабатывали, а результат выдавали в цифровом, графическом или фото-изображении. На фиг. 8 показано расположение фракций компонентов мочи после проведенной агрегационной реакции и центрифугирования при горизонтальном положении камер в центрифуге.

Пример работы способа и устройства по варианту 2.

Реакционную 2 и делительную 13 камеры устройства герметично соединяют с помощью соединения luer-lock 12 и в горизонтальном положении помещают в ложемент площадки ротора центрифуги. С противоположной стороны площадки ротора в противовес помещают аналогичные камеры 2, 13.

Во все реакционные камеры 2 через штуцеры 8 заливают 0,5 мл раствора дегидратанта, а затем вводят исследуемую биологическую жидкость, в конкретном примере - мочу в количестве 9,5 мл. Отверстия штуцеров 8 закрывают заглушками 9 из эластичного материала. Включают на 5 с внешне установленный источник переменного магнитного поля, вызывающий возвратно-поступательные перемещения пластин 4 с магнитными полосками 7 внутри камер 2, что приводит к перемешиванию смесей. После прекращения перемешивания смесей их выдерживается в покое в течение 5 м. По истечении этого времени включают центрифугирование со скоростью 1500 об/м (700 g) в течение 1 м. После остановки центрифуги делительные камеры 12 отвинчивают и исследуют получившиеся фракции на внешнем сканере (денситометре).

Пример работы способа и устройства по варианту 3.

Для получения, разделения на фракции и исследования, например, липопротеидов, поступают следующим образом. Первоначально выполняют весь цикл операций так же, как в варианте 2

Биологическую жидкость в реакционной камере 2 после первоначального цикла операций по получению, разделению и исследованию компонентов не удаляют. Отсоединяют делительные камеры 12 с фракциями и присоединяют аналогичные делительные камеры 13 (без фракций). Далее ведут процесс аналогичным образом, что и по варианту 2. Получение, разделение на фракции этой же пробы мочи с уже имеющимися в ней реактивами продолжают путем проведения последующих агрегационных реакций, за счет добавления других реактивов, которые не влияют друг на друга. Далее так же, как и в варианте 2, проводят операции центрифугирования и сканирования. Это позволяет исследовать количественно и качественно другие компоненты биологической жидкости, например такие, как мукополисахариды. На фиг. 9 показаны фракции компонентов мочи разных пациентов после проведения 4-х последовательных агрегационных реакций и центрифугирования.

Список использованной литературы:

1. Балаховский С.Д., Балаховский И.С., Методы химического анализа крови. Медгиз. 1953, с. 353-355.

2. Козлов А.В., "Протеинурия: методы ее выявления", лекция, Санкт-Петербург, СПбМАПО, 2000 г.

3. Новоселова О.В., Пятигорская М.Б., Михайлов Ю.Е., "Клинические аспекты выявления и оценки протеинурии", Справочник заведующего КДЛ, №1, январь 2007 г.

4. Пупкова В.И., Прасолова Л.М. - Методы определения белка в моче (обзор литературных данных). http:www.technomedica.com/publikazii/Pupkova.htm.

5. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е.А. Кост. Москва, "Медицина", 1975 г.

6. Долгов В.В., Шевченко О.П. Лабораторная диагностика нарушений обмена белков. Учебное пособие Медицинской академии последипломного образования РФ, М., 1997, с. 47, 53-55, 58-62.

7. Тимин О.А., Климентьева Т.К., Серебров В.Ю., Жаворонок Т.В., Кузьменко Д.И., Удинцев С.Н. Биохимические методы исследования в клинико-диагностических лабораториях: практическое пособие. - Томск: STT, 2002. - 244 с.

8. Dennison С.A Guide to Protein Isolation. Focus on Structural Biology. Volume 3, 2003

9. Cromatographic and Electroforetic Techniques. VII. - Zone Electrophoresis. Edd. J. Smith. Pr. inG. B. at the Pitman Press. Bath. 1968. P. 515.

10. Maypep. Г. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле. Изд-во: М.: Мир, 1971 г. с 248.

11. M.D. Poulik. The use of urea-starch-gel electrophoresis in studies of reductive cleavage of an α₂-macroglobulin. Biochim. Biophys. Acta, 44 [1960] p. 390-393.

12. K. Hanning. Preparative Electrophoresis. P. 423-465. В кн. Electrophoresis. Theory, Methods and Applications. T2. Academic Press Inc., N.Y. 10003. 1967.

13. Ходаков Г.С., Юдкин Ю.П. Седиментационный анализ высокодисперсных систем. М., 1981.

14. Шпикитер О.В. Методы исследования биополимеров с помощью аналитической ультрацентрифуги. В кн.: «Современные методы в биохимии». М., 1964.

15. Одноразовые кюветы для спектрофотометрии. Sainty International Group Jiangsu Yangzhou Sumex Imp. & Exp. Co., Ltd. Jiangsu, Китай.

16. Криопробирка для хранения биоматериала. ООО "АБТЕК", Россия.

18. Пластиковый контейнер. ООО "АБТЕК", Россия,

19. Одноразовые концентраторы Parasep Фирма Dasys LTD.

20. Регирер С.А. К вопросу о континуальных моделях суспензий. // Прикл. матем. мех. 1978, т. 42, №4. С. 679-688.

21. J.A.D. Wattis. An introduction to mathematical models of coagulation-fragmentation processes: a discrete deterministic mean-field approach// Physica D: Nonlinear Phenomena, 2006, V. 222, No 1-2, P. 1-20.

Claims (17)

1. Способ для получения, разделения и исследования компонентов биологических жидкостей путем проведения в них агрегационных реакций с помощью реагентов и разделения на фракции при центрифугировании, отличающееся тем, что первоначально в биологическую жидкость вводят не более одного реагента, перемешивают, ожидают выпадения преципитата в течение 5-10 м, разделяют на фракции при центрифугировании в течение 3-5 м, а затем проводят исследования количественного и качественного состава фракций для диагностики патологических состояний.

2. Способ по п. 1, отличающееся тем, что после завершения не менее одной агрегационной реакции и центрифугирования преципитат, разделенный на фракции, не удаляют, а вводят реагент другого состава в ту же биологическую жидкость, перемешивают, ожидают выпадения преципитата, вновь разделяют на фракции при центрифугировании, а затем проводят исследования.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости используют мочу.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости используют предварительно разведенную плазму крови.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости используют предварительно разведенную сыворотку крови.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости используют предварительно разведенную лимфатическую жидкость.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве биологической жидкости используют предварительно разведенную спинномозговую жидкость.

8. Способ по п. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве реактива используют реагент из ряда дегидратантов.

9. Одноразовое устройство для получения и разделения на фракции компонентов биологических жидкостей, включающее центрифугу, камеры, отличающееся тем, что реакционная и делительная камеры соединены между собой с помощью винтового соединения типа luer-loc, с соотношением между их объемами, равным 20:1, реакционная камера имеет отсек со скосом под углом не менее 50±5°, в ней установлена пластина для перемешивания с отверстиями, центровочными выступами и магнитной полосой, а корпус устройства снабжен штуцером с заглушкой.

10. Одноразовое устройство по п. 9, отличающееся тем, что реакционная и делительная камеры соединены между собой неразъемным соединением.

11. Одноразовое устройство по п. 9, отличающееся тем, что не менее двух реакционных и делительных камер, соединенных между собой, располагают в плоскости горизонтального основания центрифуги в диаметрально противоположных направлениях.

12. Одноразовое устройство по п. 9, отличающееся тем, что реакционная и делительная камеры выполнены прямоугольной формы.

13. Одноразовое устройство по п. 9, отличающееся тем, что реакционная и делительная камеры имеют квадратное сечение.

14. Одноразовое устройство по п. 9, отличающееся тем, что реакционная и делительная камеры выполнены из прозрачного пластмассового материала.

15. Одноразовое устройство по п. 9, отличающееся тем, что штуцер на конце снабжен соединением типа luer.

16. Одноразовое устройство по п. 9, отличающееся тем, что заглушка имеет соединение типа lос.

17. Одноразовое устройство по п. 9, отличающееся тем, что заглушка выполнена из эластичного материала.

Images