RU2787103C1 - Способ получения лекарственной субстанции из листьев бархата амурского - Google Patents
Способ получения лекарственной субстанции из листьев бархата амурского Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787103C1 RU2787103C1 RU2022122629A RU2022122629A RU2787103C1 RU 2787103 C1 RU2787103 C1 RU 2787103C1 RU 2022122629 A RU2022122629 A RU 2022122629A RU 2022122629 A RU2022122629 A RU 2022122629A RU 2787103 C1 RU2787103 C1 RU 2787103C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- aqueous
- flacoside
- obtaining
- amur
- ethyl acetate
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 239000012907 medicinal substance Substances 0.000 title claims abstract description 8
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 44
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 229930188636 flacoside Natural products 0.000 claims abstract description 32
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 26
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 15
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 241000972672 Phellodendron Species 0.000 claims abstract description 10
- 238000004821 distillation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 241001093501 Rutaceae Species 0.000 claims abstract description 5
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 10
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 5
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000001929 anti-hepatotoxic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 3
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 abstract description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dichloroethane Chemical compound CC(Cl)Cl SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- -1 flavonoid glucoside Chemical class 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000012675 alcoholic extract Substances 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 3
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 229930003939 flavanonol Natural products 0.000 description 2
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BXWVSGUITWLTOD-CABCVRRESA-N Amurensine Chemical compound CN([C@H](C1=C2)CC=3C=C(C(=CC=33)O)OC)C[C@H]3C1=CC1=C2OCO1 BXWVSGUITWLTOD-CABCVRRESA-N 0.000 description 1
- HDQHRTXBXYQUNW-CABCVRRESA-N Amurensine Natural products O(C)c1c(O)cc2[C@H]3c4c(cc5OCOc5c4)C[C@H](N(C)C3)c2c1 HDQHRTXBXYQUNW-CABCVRRESA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- VMUUCEWEHPBFTQ-UHFFFAOYSA-N Dihydrophelloside Natural products CC(C)(CCc1c(OC2OC(CO)C(O)C(O)C2O)cc(O)c3C(=O)C(O)C(Oc13)c4ccc(O)cc4)OC5OC(CO)C(O)C(O)C5O VMUUCEWEHPBFTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010019728 Hepatitis alcoholic Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- POIRVLZGTSWEMG-UHFFFAOYSA-N Magnoflorin Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(O)C3=C2C1CC1=CC=C(OC)C(O)=C13 POIRVLZGTSWEMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- KQLPHCWQYRQMJW-UHFFFAOYSA-N Noricariside Natural products CC(C)(CCc1c(O)cc(O)c2C(=O)C(=C(Oc12)c3ccc(O)cc3)O)OC4OC(CO)C(O)C(O)C4O KQLPHCWQYRQMJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972673 Phellodendron amurense Species 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000002353 alcoholic hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N berberine Chemical compound C1=C2CC[N+]3=CC4=C(OC)C(OC)=CC=C4C=C3C2=CC2=C1OCO2 YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093265 berberine Drugs 0.000 description 1
- QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N berberine Natural products COc1ccc2C=C3N(Cc2c1OC)C=Cc4cc5OCOc5cc34 QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000731 choleretic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001989 choleretic effect Effects 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 150000002210 flavanonols Chemical class 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002443 hepatoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 239000000399 hydroalcoholic extract Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- QUCQEUCGKKTEBI-UHFFFAOYSA-N palmatine Chemical compound COC1=CC=C2C=C(C3=C(C=C(C(=C3)OC)OC)CC3)[N+]3=CC2=C1OC QUCQEUCGKKTEBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRDZTDZJQRPNCN-YIANMRPHSA-N phellamurin Chemical compound O([C@@H]([C@@H](O)C(=O)C=1C(O)=C2)C=3C=CC(O)=CC=3)C=1C(CC=C(C)C)=C2O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GRDZTDZJQRPNCN-YIANMRPHSA-N 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к способу получения лекарственной субстанции, получаемой из листьев бархата амурского (Phellodendron amurence Rupr) и листьев бархата амурского Лаваля (Phellodendron amurence var.Lavallei (Dode) Spague) семейства Рутовых (Rutaceae) и применяемой в качестве противовирусного и антигепатотоксического лекарственного средства Флакозид. Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка усовершенствованного способа получения субстанции флакозида из листьев бархата амурского, обладающей противовирусной активностью в отношении простого вируса герпеса и гепатита С, благодаря высокому содержанию основного действующего вещества фелламурина не менее 96% (метод ВЭЖХ). Технический результат достигается при использовании способа получения лекарственной субстанции из листьев бархата амурского (Phellodendron amurence Rupr) и листьев бархата амурского Лаваля (Phellodendron amurence var.Lavallei (Dode) Spague) семейства Рутовых (Rutaceae), включающего трехкратную экстракцию высушенного и измельченного сырья водным этиловым спиртом при соотношении сырье : экстрагент, равном 1:10, в концентрации 40-60% при температуре 20-60°С в течение двух часов, подачу на каждую последующую экстракцию свежего экстрагента в количестве, равном слитому извлечению, упаривание полученных экстрактов последовательно по мере поступления до объема 1/20, объединение водных кубовых концентратов и их обработку четыре раза смесью 1,2-дихлорэтаном с этиловым спиртом в соотношении 1:1:1, упаривание остатков органического растворителя, подщелачивание водных кубовых остатков 10-12% водным раствором гидрата окиси натрия до рН 7-7,68, четырехкратную обработку водных щелочных растворов этилацетатом в соотношении 1:0,5, объединение этилацетатных экстрактов, промывку водой, сушку над сернокислым натрием и упаривание, получение технического продукта флакозида кристаллизацией из смеси этилацетат : вода охлаждением, с последующей фильтрацией и промывкой охлажденным этилацетатом, сушку технического продукта, перекристаллизацию из водного этилового спирта и получение готового флакозида. 1 табл.
Description
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к способу получения лекарственной субстанции, получаемой из листьев бархата амурского (Phellodendron amurence Rupr) и листьев бархата амурского Лаваля (Phellodendron amurence var. Lavallei (Dode) Spague) семейства Рутовых (Rutaceae) и применяемой в качестве противовирусного и антигепатотоксического лекарственного средства «Флакозид».
Флакозид разрешен для медицинского применения у взрослых и детей как противовирусное средство при острых вирусных гепатитах А и Б, первичных и рецидивирующих формах простого герпеса экстрагенитальной и генитальной локализации, опоясывающем лишае, ветряной оспе и кори [1-2]. Основным действующим веществом «Флакозида» является флавоноидный глюкозид фелламурин - флаванонол (синоним - феллавин, 8-пренилдигидрокемпферол-7-глюкозид).
Особый интерес среди реликтовых растений Дальнего Востока представляет бархат амурский (Phellodendron Amurense). Во всех частях бархата амурского содержатся биологически активные вещества: алкалоиды берберин и пальматин, кумарины, сапонины, флавоноиды, фелламурин и амурензин, феллозид, дигидрофеллозяд, гликозиды, эфирное масло, норикаризид, феллодендрин, магнофлорин, обакунон, обакулактон, фитонциды, водорастворимые витамины. Благодаря содержанию этих биологически активных веществ, плоды бархата амурского способны оказывать желчегонное, антигепатотоксическое, а также гепатопротекторное действие [3].
Известно использование флакозида в различных комплексах на основе природных соединений растительного происхождения, обладающих противоинфекционным действием в отношении инфекций, передаваемым половым путем [6-9]. Кроме того, флакозид является одним из компонентов для лечения и профилактики заболевания печени, выбранного из группы, включающей гепатиты типов А, Б, С, и E и алкогольный гепатит [10-12]. Фелламурин проявляет противоопухолевую активность на клетках остеосаркомы [13].
Препарат оказывает выраженное иммуностимулирующее действие на гуморальное звено системы иммунитета [14].
В качестве прототипа выбран способ получения аналога флакозида феллавина путем экстракции листьев бархата амурского спиртом, заключающийся в экстракции растительного сырья 45-55% водным спиртом, в упаривании водно-спиртового извлечения до водного остатка, в последующей экстракции от неполярных соединений хлороформом, в извлечении суммы флавоноидов из водного остатка этилацетатом, в упаривании этилацетатных извлечений, в последующей кристаллизации целевого продукта из смеси этилацетат : вода при соотношении 1:1, с выходом целевого продукта 3% от сухого веса сырья. Недостатком прототипа является длительность экстракции путем настаивания сырья до 30 часов, использование токсического растворителя метанола. Экстракция хлороформом полностью не очищает водный кубовый остаток от смол, которые мешают кристаллизации и влияют на качество продукции [15].
Недостатком прототипа является длительность экстракции путем настаивания сырья до 30 часов, использование токсического растворителя метанола. Экстракция хлороформом полностью не очищает водный кубовый остаток от смол, которые мешают кристаллизации и влияют на качество продукции.
Задачей предлагаемого изобретения является усовершенствование способа получения лекарственной субстанции на основе листьев бархата амурского с содержанием фелламурина в сырье не ниже 1,0% повышение качества и выхода целевого продукта (до 70% от содержания в сырье, с содержанием фелламурина в готовом продукте не ниже 96%) для обеспечения заявленной биологической активности.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка усовершенствованного способа получения лекарственной субстанции из листьев бархата амурского, обладающей противовирусной активностью в отношении простого вируса герпеса и гепатита С, благодаря высокому содержанию основного действующего вещества фелламурина не менее 96% (метод ВЭЖХ). Усовершенствование технологии позволяет получить выход флакозида выше, чем в прототипе.
Технический результат достигается при использовании разработанного способа получения лекарственной субстанции на основе листьев бархата амурского (Phellodendron amurence Rupr) и листьев бархата амурского Лаваля (Phellodendron amurence var.Lavallei (Dode) Spague) семейства Рутовых (Rutaceae), включающий трехкратную экстракцию высушенного и измельченного сырья водным этиловым спиртом при соотношении сырье : экстрагент равном 1:10 в концентрации 40-60% при температуре 20-60 °С в течение двух часов, подачу на каждую последующую экстракцию свежего экстрагента в количестве равном слитому извлечению, упаривание полученных экстрактов последовательно по мере поступления до объема 1/20, объединение водных кубовых концентратов и их обработку четыре раза смесью 1,2-дихлорэтаном с этиловым спиртом в соотношении 1:1:1, упаривание остатков органического растворителя, подщелачивание водных кубовых остатков 10-12% водным раствором гидрата окиси натрия до рН 7-7,68, четырехкратную обработку водных щелочных растворов этилацетатом в соотношении 1:0,5, объединение этилацетатных экстрактов, промывку водой, сушку над сернокислым натрием и упаривание, получение технического продукта флакозида кристаллизацией из смеси водного раствора 1,2-этилацетат охлаждением, с последующей фильтрацией и промывкой охлажденным 1,2-этилацетатом, сушку технического продукта, перекристаллизацию из водного этилового спирта и получение готового флакозида.
Предложенное техническое решение иллюстрируется следующими примерами 1 и 2 получения лекарственного средства «Флакозид».
Пример 1.
Исходным сырьем являются листья бархата амурского, заготовленные в июле месяце (согласно фармакопейной статье). Высушенное измельченное сырье, проходящее сквозь сито 0,5-5 мм, с влажностью сырья W=9,5% в количестве 0,201 кг и содержанием фелламурина в сырье 3,7% помещают в плоскодонную колбу вместимостью 3,0 л.
Экстракцию проводят 40% водным спиртом этиловым в соотношении сырье-экстрагент (1:10) при комнатной температуре или при нагревании (45°С) в течение 2-х часов при постоянном перемешивании. Экстракцию проводят трехкратно. На каждую последующую экстракцию подают свежий экстрагент, равный объему слитого извлечения.
Водно-спиртовые извлечения фильтруют на воронке Бюхнера в колбу Бунзена в вакууме. В качестве фильтрующего материала используют серо-шинельное сукно. Получают от первой экстракции 1,7 л водно-спиртового извлечения, от второй экстракции 1,8 л водно-спиртового извлечения, от третьей экстракции получают 1,5 л водно-спиртового извлечения.
Полученные водно-спиртовые извлечения упаривают до 1/20 от первоначального объема, последовательно по мере поступления. Водно-кубовые концентраты объединяют и получают водно-кубовый остаток в количестве 0,250 л с плотностью p=1,05 г/см3. К водному кубовому остатку в количестве 0,250 л приливают 0,250 л спирта этилового 96,4% и 0,250 дихлорэтана, реакционную смесь помещают в делительную воронку вместимостью 2,0 л, затем перемешивают и отделяют нижний слой в количестве 0,250 л (1,2-дихлорэтановый экстракт). Обработку дихлорэтаном проводят 4 раза по 0,250 л. Получают 1,2-дихлорэтановый экстракт в количестве 1,0 л, который два раза промывают дистиллированной водой по 100 мл.
Промывную воду от дихлорэтана присоединяют к очищенному водному кубовому остатку и упаривают в вакууме до 0,450 л водного кубового остатка. 1,2-дихлорэтановый экстракт выводят из технологического процесса. Очищенный водный кубовый остаток подщелачивают 10-12% водным раствором гидрата окиси натрия до рН 7-7,68. Щелочной раствор обрабатывают этилацетатом, насыщенным водой в соотношении как (1:0,5) четыре раза. Полученные этилацетатные экстракты объединяют и промывают один раз 100 мл дистиллированной водой, затем экстракт высушивают над сернокислым натрием и упаривают в вакууме.
Получают 10,27 г суммы фенольных соединений, которую растворяют в 70 мл этилацетата на водяной бане при температуре 65°С, затем раствор переносят в коническую колбу вместимостью 300 мл туда же добавляют 70 мл горячей воды дистиллированной (65-70°С) и несколько кристалликов фелламурина. По мере остывания раствора начинается кристаллизация, затем раствор ставят в холодильник. Образовавшийся кристаллический осадок фильтруют в вакууме переносят в химический стакан, к осадку приливают холодный этилацетат (50 мл), перемешивают и фильтруют в вакууме, а затем сушат и получают технического флакозида 6,16 г.
Затем проводят перекристаллизацию технического продукта. 6,16 г флакозида помещают в круглодонную колбу и приливают в 40 мл 96,3% спирта этилового и растворяют на водяной бане при температуре 70°С, туда же в колбу добавляют 40 мл горячей (70°С) воды дистиллированной и вращают колбу на водяной бане до полного растворения, затем реакционную смесь фильтруют через складчатый бумажный фильтр самотеком в плоскодонную колбу вместимостью 200 мл, круглодонную колбу ополаскивают 20 мл горячего 50% водного этанола и присоединяют к фильтрату, добавляют несколько кристалликов фелламурина, охлаждают при комнатной температуре, помещают в холодильник и через 3-4 часа получают кристаллический продукт, который отфильтровывают в вакууме, переносят в химический стакан, к осадку приливают охлажденный 50% водный спирт этиловый в количестве 70 мл, тщательно перемешивают и фильтруют в вакууме.
Полученный влажный готовый продукт сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 70°С в течение 4 часов. Получают 4,94 г готового продукта «флакозида» с содержанием основного вещества 96,72%. Выход готового продукта от начала процесса 70,5%.
Идентификацию полученной субстанции "Флакозид" проводили методом ЯМР.
В 1Н ЯМР-спектре раствора флакозида в ДМСО присутствуют следующие сигналы: два трехпротонных сигнала при 1,49 и 1,56 м.д. (по три протонные единицы каждый), относятся к изопренильному остатку при С-8, синглет при 6,29 м.д. при С-6, два дублета при 6,78 м.д. и 7,31 м.д. (по две протонные единицы каждый) (протоны 3', 5', и 2', 6' соответственно) относятся к ароматическим протонам кольца В, Фенольные гидроксильные группы при С-4' и С-5 (сигналы в виде синглетов) 9,54 м.д. и 11,81 м.д. соответственно. Сигнал при С-5 со значением 11,81 м.д. относится к фенольной гидроксильной группе, значение которой относится к флаванонолам.
Фелламурин - (2R,3R)-3,5-дигидрокси-2-(4-гидроксифенил)-8-(3-метилбут-2-енил)-7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)оксан-2-ил]окси-2,3-дигидрохромен-4-он. Молярная масса 518,515 г/моль. Брутто формула С26Н30О11
Количественное определение фелламурина в готовом продукте проводили методом ВЭЖХ, в качестве внутреннего стандарта использовали рабочий стандартный образец фелламурина.
Полученная субстанция флакозид представляет собой мелкокристаллический порошок от белого цвета или белого с бежеватым оттенком, содержащий в качестве доминирующего компонента фелламурин. «Флакозид» используют для приготовления таблеток.
Пример 2.
Исходным сырьем являются листья бархата амурского, заготовленные в июле месяце (согласно фармакопейной статье). Высушенное измельченное сырье, проходящее сквозь сито 0,5-5 мм, с влажностью сырья W=9,5% в количестве 0,607 кг и содержанием фелламурина в сырье 3,7% помещают в плоскодонную колбу вместимостью 10,0 л.
Экстракцию проводят 50% водным спиртом этиловым в соотношении сырье-экстрагент (1:10) при комнатной температуре или при нагревании (45°С) в течение 2-х часов при постоянном перемешивании. Экстракцию проводят трехкратно. На каждую последующую экстракцию подают свежий экстрагент, равный объему слитого извлечения. Водно-спиртовые извлечения фильтруют на воронке Бюхнера в колбу Бунзена в вакууме. В качестве фильтрующего материала используют серо-шинельное сукно. Получают от первой экстракции 4,860 л водно-спиртового извлечения, от второй экстракции 4,7 л водно-спиртового извлечения, от третьей экстракции получают 4,8 л водно-спиртового извлечения.
Полученные водно-спиртовые извлечения упаривают до 1/20 от первоначального объема, последовательно по мере поступления. Водно-кубовые концентраты объединяют и получают водно-кубовый остаток в количестве 0,720 л с плотностью p=1,05 г/см3. К водному кубовому остатку в количестве 0,720 л приливают 0,720 л спирта этилового 96,4% и 0,720 1,2-дихлорэтана, реакционную смесь помещают в тубус вместимостью 5,0 л, затем перемешивают и отделяют нижний слой в количестве 0,720 л (1,2-дихлорэтановый экстракт). Обработку 1,2-дихлорэтаном проводят 4 раза по 0,720 л. Получают 1,2-дихлорэтановый экстракт в количестве 2,880 л, который два раза промывают дистиллированной водой по 288 мл.
Промывную воду от дихлорэтана присоединяют к очищенному водному кубовому остатку и упаривают в вакууме до 1,296 л водного кубового остатка. 1,2-дихлорэтановый экстракт выводят из технологического процесса. Очищенный водный кубовый остаток подщелачивают 10-12% водным раствором гидрата окиси натрия до рН 7-7,68, получают щелочной раствор с рН=7,61, который обрабатывают этилацетатом, насыщенным водой в соотношении как (1:0,5) четыре раза.
Полученные этилацетатные экстракты объединяют и промывают один раз 300 мл дистиллированной водой, затем экстракт высушивают над сернокислым натрием и упаривают в вакууме. Получают 36,8 г суммы фенольных соединений, которую растворяют в 330 мл этилацетата на водяной бане при температуре 65°С, затем раствор переносят в коническую колбу вместимостью 1,0 л туда же добавляют 330 мл воды дистиллированной (65-70°С) и несколько кристалликов фелламурина.
По мере остывания раствора начинается кристаллизация, затем колбу с раствором помещают в холодильник. Образовавшийся кристаллический осадок фильтруют в вакууме, переносят в химический стакан, к осадку приливают холодный этилацетат (150 мл), перемешивают и фильтруют в вакууме, а затем сушат и получают технического флакозида 22,91 г. Затем проводят перекристаллизацию технического продукта. 22,91 г флакозида помещают в круглодонную колбу, приливают 120 мл 96,3% спирта этилового и растворяют на водяной бане при температуре 70°С, туда же в колбу добавляют 120 мл горячей (70°С) воды дистиллированной и вращают колбу на водяной бане до полного растворения, затем реакционную смесь фильтруют через складчатый бумажный фильтр самотеком в плоскодонную колбу вместимостью 500 мл, круглодонную колбу ополаскивают 50 мл горячего 50% водного этанола и присоединяют к фильтрату, добавляют несколько кристалликов фелламурина, охлаждают при комнатной температуре, помещают в холодильник и через 3-4 часа получают кристаллический продукт, который отфильтровывают в вакууме, переносят в химический стакан, к осадку приливают охлажденный 50% водный спирт этиловый в количестве 150 мл, тщательно перемешивают и фильтруют в вакууме.
Полученный влажный готовый продукт сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 70°С в течение 4 часов. Получают 14,23 г готового продукта «флакозида» с содержанием основного вещества 97,38%. Выход готового продукта от начала процесса 70,0%.
Полученная субстанция флакозид представляет собой мелкокристаллический порошок от белого цвета или белого с бежеватым оттенком, содержащий в качестве доминирующего компонента фелламурин. «Флакозид» используют для приготовления таблеток.
Пример 3. Определение цитотоксической активности флакозида.
Цитотоксическую активность флакозида оценивали на культурах опухолевых клеток K562 (эритролейкемия человека) получена из биоколлекции ФГБНУ ВИЛАР (https://pm.cytogen.ru), чувствительных к цитостатикам и нормальных клеток. В качестве нормальных клеток использовали быстроделящиеся фибробласты кожи крыс. Цитотоксическую активность флакозида определяли спектрофотометрическим методом МТТ. Данная клеточная культура является стандартным объектом оценки цитотоксического действия противоопухолевых соединений (Федеральное руководство по доклиническому испытанию лекарственных средств, 2014). Культивирование клеток осуществлялось в стерильных условиях с использованием ламинарбокса ЛБ-В (Россия). Клетки инкубировали при 37 С в условиях 5% СО2. При культивировании клеток использовали стандартную среду DMEM с глутамином
(Dulbecco'sModifiedEaglemedium, ПанЭко, Россия) с добавлением 10% термоинактивированной эмбриональной телячей сыворотки (Sigma, США), антибиотиков гентамицина сульфата и стрептомицина сульфата (ООО «БиоХимФарм», Россия).
Жизнеспособность клеток определяли методом МТТ. Клетки выращивали в 25 см флаконах, после достижения монослоя проводили трипсинизацию и вносили по 200 мкл клеточной суспензии 10 тыс клеток на 1 мл в лунки плоскодонного планшета «COSTAR» и добавляли исследуемое вещество - флакозид на 24 ч. После инкубации в культуральную среду на 3 ч вносили 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (МТТ) до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Общий объем лунки составлял 200 мкл, по 2 тыс клеток на лунку. Затем жидкость из лунок удаляли пипетированием и вносили по 150 мкл диметилсульфоксида на 30 мин. МТТ восстанавливается за счет действия дегидрогеназ живых клеток до водонерастворимых кристаллов формазана. Оптическую плотность образцов регистрировали при длине волны 530 нм на планшетном анализаторе иммуноферментных реакций "УНИПЛАН" АИФР-01 (Россия). Оптическую плотность контрольных образцов (без тестируемого препарата) принимали за 100% выживаемость клеток, равную единице. Представлены данные трех экспериментов (n=4).
Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью программы GraphPadPrism 6. Достоверность отличий (Р) оценивали по критерию Стьюдента-Фишера (см. табл. 1).
Показано, что флакозид оказывает дозозависимое цитотоксическое действие на опухолевые клетки K562. Максимальный цитотоксический эффект проявлялся в концентрации 100 мкМ - 64% ингибирование жизнеспособности опухолевых клеток.
Литература:
1. Государственный реестр лекарственных средств-Том 1. - М. - 2004. - С. 80,441.
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Часть II. - М.: «Медицина». - 1993. - С. 401.
3. Шретер А.И. Целебные растения Дальнего Востока и их применение /А.И. Шретер - Владивосток: Дальневосточное книжное изд-во ИПК «Дальпресс», 2000. - 144 с.
4. Фатеева Т.В., Дерябин П.Г., Бортникова В.В., Крепкова Л.В., Мизина П.Г. Активность флакозида при вирусном гепатите С в экспериментах invitroll Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2019. - Т. 167. - №4. С. 463-466.
5. Карабаева В.В., Крепкова Л.В., Бабенко А.Н., Бортникова В.В., Фатеева Т.В., Мизина П.Г., Михеева Н.С., Карабаева О.Н. Ретроспективный анализ экспериментального и клинического изучения флакозида при вирусных гепатитах // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021. Т. 10. №4. С. 169-176.
6. Патент РФ №2401121.
7. Патент РФ №2200569.
8. Патент РФ №2200571.
9. Патент РФ №2200570.
10. Бортникова В.В., Карабаева В.В., Крепкова Л.В., Мизина П.Г., Бабенко А.Н., Михеева Н.С., Карабаева О.Н. Ретроспективный анализ клинического изучения лекарственного препарата «Флакозид» в терапии заболеваний гепатобилиарной системы. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021;10(3):100-104. https HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104": // HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104" doi HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104". HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104"org HYPERLINK "https://doi.org/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104"/10.33380/2305-2066-2021-10-3-100-104
11. Патент РФ №2391989.
12. Противовирусные органические соединения: учеб. пособие / Е.Н. Уломский, В.Л. Русинов, О.Н. Чупахин; [науч. ред. В.Н. Чарушин]; М-во образования и науки Рос. Федерации, Урал. федер. ун-т. - Екатеринбург: Изд-во Урал, ун-та, 2017. - 92 с.
13. Zhang H., Jiang H., Zhang H., Liu J., Hu X., Chen L. Anti-tumor efficacy of phellamurin in osteosarcoma cells: Involvement of the PI3K/AKT/mTOR pathway // European Journal of Pharmacology. 2019.172477. doi: 10.1016/j.ejphar.2019.172477.
14. Бортникова В.В., Крепкова Л.В. Экспериментальное токсикологическое изучение противовирусного фитопрепаратаФлакозид // Вестник РУДН, серия Медицина, 2008, №7, С. 96-101.
15. В.И. Глызин. Докторская диссертация, 1974. Получение лекарственных препаратов противовирусной активности из группы природных флавоноидов.
Claims (1)
- Способ получения лекарственной субстанции из листьев бархата амурского (Phellodendron amurence Rupr) и листьев бархата амурского Лаваля (Phellodendron amurence var.Lavallei (Dode) Spague) семейства Рутовых (Rutaceae), включающий трехкратную экстракцию высушенного и измельченного сырья водным этиловым спиртом при соотношении сырье : экстрагент, равном 1:10, в концентрации 40-60% при температуре 20-60°С в течение двух часов, подачу на каждую последующую экстракцию свежего экстрагента в количестве, равном слитому извлечению, упаривание полученных экстрактов последовательно по мере поступления до объема 1/20, объединение водных кубовых концентратов и их обработку четыре раза смесью 1,2-дихлорэтаном с этиловым спиртом в соотношении 1:1:1, упаривание остатков органического растворителя, подщелачивание водных кубовых остатков 10-12% водным раствором гидрата окиси натрия до рН 7-7,68, четырехкратную обработку водных щелочных растворов этилацетатом в соотношении 1:0,5, объединение этилацетатных экстрактов, промывку водой, сушку над сернокислым натрием и упаривание, получение технического продукта флакозида кристаллизацией из смеси этилацетат : вода охлаждением, с последующей фильтрацией и промывкой охлажденным этилацетатом, сушку технического продукта, перекристаллизацию из водного этилового спирта и получение готового лекарственного средства флакозида.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2787103C1 true RU2787103C1 (ru) | 2022-12-28 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CW XIAO et all.Antifungal Efficacy of Phellodendron amurense Ethanol Extract against Trichophyton mentagrophytes in Rabbits // Pak Vet J, 34(2): 219-223. НАУМОВА О.А. Фармакогностическое исследование плодов бархата амурского с целью контроля качества и стандартизации сырья //Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук, 2014;БОРТНИКОВА В.В. и др.Ретроспективный анализ клинического изучения лекарственного препарата "Флакозид" в терапии заболеваний гепатобилиарной системы. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2021;10(3):100-104. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shuaibu et al. | Trypanocidal activity of extracts and compounds from the stem bark of Anogeissus leiocarpus and Terminalia avicennoides | |
| CN106928246B (zh) | 一种化合物及其制备方法与用途 | |
| Shuaibu et al. | The use of microfluorometric method for activity-guided isolation of antiplasmodial compound from plant extracts | |
| US20100286255A1 (en) | Method for extracting secoisolariciresinol and dihydroquercetin from wood | |
| CN102138998A (zh) | 枳椇子总黄酮提取物及其在制备抗疲劳、抗缺氧或抗高原缺氧药物或食品中的应用 | |
| KR100524373B1 (ko) | 삼백초 추출물을 함유하는 항암제용 약학조성물 및 그의제조방법 | |
| Nyong et al. | Effect of methods of extraction on phytochemical constituents and antibacterial properties of Tetracarpidium conophorum seeds | |
| EP3281945B1 (en) | Phillygenin glucuronic acid derivative, preparation method and application thereof | |
| Aboalola et al. | Toxicological study of various crude extracts of Hyoscyamus gallagheri native to Oman | |
| Priya et al. | Phytochemical analysis and antimicrobial activity of Hibiscus rosa sinensis | |
| RU2787103C1 (ru) | Способ получения лекарственной субстанции из листьев бархата амурского | |
| Erenler et al. | Inhibitory effect of 6, 7-dimethoxy-5-hydroxyflavone on human cervix carcinoma in vitro | |
| Devi et al. | Anti-proliferative activity of chlorophyllin from Phyllanthus emblica L. against MCF-7 and Vero cell line | |
| US20110033566A1 (en) | Anti-bacterial composition comprising extract from barks of Alnus pendula Matsum | |
| US7387800B2 (en) | Sesquiterpenoid derivatives having adipocyte differentiation inhibitory effect | |
| Oluremi et al. | Anti-measles virus activity of 4-hydroxy-3-methoxy benzaldehyde (Vanillin) isolated from Xylopia aethiopica (Dunal) A. rich | |
| CN111777588B (zh) | 假臭草苯丙素类化合物及其应用 | |
| CN102432666B (zh) | 从合子草中分离的化合物及其制备方法和应用 | |
| Matchi et al. | Antischistosomal Evaluation of Stem Bark's Extract and Chemical Constituents from Anonidium mannii against Schistosoma mansoni | |
| CN106046071B (zh) | 一种苯丙素类化合物的制备方法 | |
| CN119431391B (zh) | 一对互为对映异构体的笼状𠮿酮类化合物及其制备方法和用途 | |
| CN105732736B (zh) | 一种苯丙素类化合物的制备方法 | |
| Oluremi et al. | Scientific African | |
| CN117986150B (zh) | 一种从东方泽泻中提取化合物泽泻生物碱a的方法及其应用 | |
| Ismeel | Cytogenetic and cytotoxic studies on the effect of phytoinvestigated active compounds of Hyoscyamus niger (in vivo and ex vivo) |