RU2802575C1 - Новый штамм-продуцент даптомицина streptomyces baarnensis - Google Patents
Новый штамм-продуцент даптомицина streptomyces baarnensis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2802575C1 RU2802575C1 RU2023108641A RU2023108641A RU2802575C1 RU 2802575 C1 RU2802575 C1 RU 2802575C1 RU 2023108641 A RU2023108641 A RU 2023108641A RU 2023108641 A RU2023108641 A RU 2023108641A RU 2802575 C1 RU2802575 C1 RU 2802575C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- daptomycin
- streptomyces
- vancomycin
- producer
- Prior art date
Links
- 108010013198 Daptomycin Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N daptomycin Chemical compound C([C@H]1C(=O)O[C@H](C)[C@@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@H](C)CC(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CCCCCCCCC)C(=O)C1=CC=CC=C1N DOAKLVKFURWEDJ-QCMAZARJSA-N 0.000 title claims abstract description 38
- 229960005484 daptomycin Drugs 0.000 title claims abstract description 38
- 241000936785 Streptomyces baarnensis Species 0.000 title claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 2
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 abstract 4
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 abstract 4
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 abstract 4
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- 241000958215 Streptomyces filamentosus Species 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001156739 Actinobacteria <phylum> Species 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187392 Streptomyces griseus Species 0.000 description 1
- 241000204060 Streptomycetaceae Species 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 208000037815 bloodstream infection Diseases 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Abstract
Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 – продуцент даптомицина. Предложено также применение указанного штамма для получения даптомицина. Культивируют указанный штамм и выделяют даптомицин из культуральной жидкости с последующей очисткой. Группа изобретений обеспечивает увеличение продуктивности штамма-продуцента даптомицина, сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции антибиотика даптомицина, высокую биохимическую активность и повышенную устойчивость нового штамма к неблагоприятным факторам, в том числе при хранении и культивировании. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 6 пр.
Description
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается нового штамма-продуцента антибиотика даптомицина.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Даптомицин - антибиотик из группы циклических липопептидов. Активен в отношении клинически значимых грамположительных бактерий, включая штаммы, устойчивые к другим классам антимикробных препаратов. На сегодняшний день на территории Российской Федерации даптомицин применяется при осложненных инфекциях кожи и мягких тканей, при инфекциях кровотока, вызванных Staphylococcus aureus, включая бактериемию и правосторонний эндокардит (Данилов А.И. и др. Даптомицин: возможности и перспективы применения в клинической практике // Отзывы по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2019. - 17 (4): 83-87).
Из уровня техники известен мутантный штамм Streptomyces roseosporus BS_094 (регистрационный номер KACC91589P), полученный путем мутации дикого штамма Streptomyces roseosporus KCTC 9568 в качестве исходного штамма. Штамм BS_094 способен продуцировать даптомицин с максимальным выходом 2,5 г/л (KR20120058790, 01.10.2010).
Также известен штамм продуцент-даптомицина Streptomyces griseus, депонированный в Общем центре управления коллекцией культур микроорганизмов Китая под номером CGMCC17921. Выход даптомицина после ферментации указанного штамма может достигать примерно 0,0315 г/л. (WO2021000637, 07.01.2021).
Выход даптомицина после ферментации штамма-продуцента Streptomyces filamentosus, депонированного в Китайском общем центре сбора микробиологических культур под номером CGMCC № 16016, который был рассмотрен авторами настоящего изобретения в качестве ближайшего аналога, может достигать примерно 3,47 г/л (CN110777084, 11.02.2020).
Известен рекомбинантный штамм-продуцент даптомицина Streptomyces roseospora L31, депонированный под номером CGMCC No.14233 в Общем центре микробиологии Комитета по сбору микробиологических культур Китая. Выход даптомицина после ферментации штамма может достигать примерно 0,074 г/л (CN107267434, 20.10.2017).
Из уровня техники известен высокопродуктивный мутагенизированный штамм Streptomyces roseosporus WKL-126 (в настоящее время хранится в Китайском общем центре сбора микробиологических культур (CGMCC) под регистрационным номером 3731), который имеет производительность антибиотика около 2 г/л (CN102242073, 16.11.2011).
Цель настоящего изобретения - получение нового штамма микроорганизма, превосходящего по уровню накопления в культуральной жидкости даптомицина известные ранее штаммы.
Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение выхода антибиотика, сокращение времени ферментации, снижение количества примесей в субстанции, высокая биохимическая активность и повышенная устойчивость штамма к неблагоприятным факторам и при культивировании.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В процессе индуцированного мутагенеза и последующего ступенчатого отбора из штамма дикого типа, выделенного из образца дерново - луговой почвы (Мордовия), был выделен высокопродуктивный штамм Streptomyces baarnensis DAP 17-18, продуцирующий антибиотик даптомицин.
Для повышения секреции даптомицина штамм дикого типа подвергался индуцированному мутагенезу путем воздействия на него ультрафиолета при низких температурах. Полученному высокопродуктивному штамму был присвоен внутренний номер DAP 17-18.
Далее штамм DAP 17-18 был идентифицирован по макро- и микроморфологическим признакам, а родовая принадлежность была подтверждена секвенированием гена 16S рДНК.
По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм оказался наиболее близок к виду Streptomyces baarnensis.
Полученный новый штамм Streptomyces baarnensis был депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ас-2200.
Таким образом, одним из вариантов настоящего изобретения является штамм продуцент даптомицина Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200. Другим вариантом настоящего изобретения является применение штамма Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 для получения антибиотика даптомицина. Еще одним из вариантов настоящего изобретения является способ получение антибиотика даптомицина, который заключается в том, что осуществляют культивирование штамма Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 и очистку даптомицина от культуральной жидкости.
ТЕРМИНЫ и ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Ниже приведены термины, которые могут использоваться при описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.
Термин «антибиотик» включает в себя молекулу, которая может ингибировать рост, разрушать или приводит к гибели микроорганизмов, но не является смертельным для пациента в интервалах концентрации и дозировании, предполагаемых для введения. Согласно настоящему изобретению указанные антибиотики могут быть классифицированы как бактерицидные (т.е., непосредственно приводящие к гибели микроорганизма) или бактериостатические (т.е. предотвращающие деление и/или размножение микроорганизма). В контексте настоящего изобретения антибиотик не является токсичным для пациента, в интервалах вводимых концентраций и дозирования.
Использование термина «антибиотический» в контексте настоящего изобретения означает эффект или тип воздействия в лечении или профилактике инфекций, вызванных грамотрицательными и/или грамположительными бактериями.
Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).
Термин «культуральная жидкость» в контексте настоящего изобретения означает двухфазную газожидкостную питательную (или ферментационную) среду, в которую в процессе глубинного культивирования микроорганизмы выделяют продукты метаболизма (в т.ч. вторичные метаболиты).
Термин «биореактор» в контексте настоящего изобретения относится к сосуду или устройству, в котором осуществляются процесс глубинного культивирования микроорганизмов для наработки целевого продукта (в рамках настоящего изобретения, антибиотика даптомицина).
Термин «продуктивность штамма» в контексте настоящего изобретения относится к количеству полученного антибиотика, рассчитанному на единицу объема культуральной жидкости, при глубинном культивировании штамма (по настоящему изобретению Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200) в условиях биореактора, выраженному в граммах антибиотика на литр культуральной жидкости.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством двух фигур.
На Фиг. 1 изображены основные этапы скрининга штамма Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 и наработки даптомицина из его культуральной жидкости, полученной после глубинного культивирования.
На Фиг. 2 изображен снимок фиксированного, окрашенного метиленовым синим препарата. Увеличение в 1000 раз.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению предложен новый штамм-продуцент даптомицина - штамм Streptomyces baarnensis депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ас-2200.
Культурально-морфологические признаки штамма продуцента даптомицина: аэроб, окраска по Граму - положительная, через 8-10 суток культивирования на плотной среде образует типичные полностью спорулирующие колонии светло-розового цвета. Подошва колонии - тёмно-розового, почти бордового цвета. Форма колонии - круглая, часто - с центральным перевёрнутым куполом и круглым внешним валиком (короной), размер 4-8 мм.
Для хранения и приготовления посевного материала используется среда следующего состава, г/л: глюкоза - 1.0-3.5; сахароза 1.0-2.0; крахмал 1.0-3.0; солодовый экстракт - 5.0-20.0; дрожжевой экстракт - 2.0-6.0, карбонат кальция - 1.0-1.5; агар-агар - 10.0-30.0; рН среды до стерилизации - 5.0-8.0. Температура культивирования - 25-35°С, продолжительность - 8-10 суток.
ПРИМЕРЫ
Изобретение поясняется следующими иллюстративными примерами, которые не ограничивают заявленный объем охраны.
Пример 1. Способ селективного выделения из штамма-продуцента даптомицина из образца почвы.
Объектами исследования были образцы дерново-луговой почвы. Образцы почвы были отобраны в Республике Мордовия в летний период из верхних горизонтов почвы.
Для выделения штамма дикого типа - продуцента даптомицина из образцов почв использовали метод посева на твердые питательные среды. Гомогенизированный образец почвы массой 1 г помещали в колбу со 100 мл воды для инъекций, далее готовили разведение 1:300 и проводили посев на чашки с питательной средой Гаузе 1. В питательную среду добавляли антибиотики для ограничения роста и активности нежелательных микроорганизмов.
Посевы инкубировали при температурах 20-30°С до появления видимых колоний. Чистую культуру выводили путем последовательных пересевов до единичной колонии. Контроль чистоты культуры проводили микроскопически.
Пример 2. Получение высокопродуктивного штамма-продуцента даптомицина.
Путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора модификантов родительского дикого штамма был получен новый высокопродуктивный штамм - продуцент даптомицина DAP 17-18.
Для этого осуществляли воздействие УФ с длиной волны 250 нм (лампа Mineralight) водной суспензии спор и клеток родительского штамма, размещенного на расстоянии 55 см от лампы, в течение 20 минут при температуре 0°C. Полученному штамму был присвоен внутренний номер DAP 17-18. Результат микроскопических методов исследований представлен на Фиг. 2.
Пример 3. Идентификация штамма DAP 17-18 до вида с помощью анализа 16s РНК.
Выделение ДНК штамма DAP 17-18 для ПЦР проводили по стандартной методике (PCR Protocols. A Guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15).
Для секвенирования использовали консервативные праймеры для наработки 16S rDNA:
8f - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
926r - CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT
Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе АЕ3000 с режимами реакции:
1. 95°С – 3 мин
2. 35 циклов
95°С - 30 с
57°С - 30 с
72°С - 1 мин 30 с
3. 72°С - 5 мин.
Для анализа секвенированных последовательностей использовали специализированные филогенетические компьютерные программы. Для стабильности воспроизведения результатов проводили не менее трех повторов ПЦР-реакций.
Далее проводили электрофорез ПЦР исследуемых образцов в 1,0% агарозном геле, при напряженности электрического поля 5 В/см.
Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: Bacteria; Actinobacteria; Streptomycetales; Streptomycetaceae; Streptomyces.
Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank.
Обработку секвенированных последовательностей проводили при помощи биоинформатического программного обеспечения в открытом доступе - программы Blast (Basic Local Alignment Search Tool), предназначенной в т.ч. для определения степени филогенетической близости живых организмов.
По результатам анализа последовательностей вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм DAP 17-18 оказался наиболее близок к виду Streptomyces baarnensis.
Пример 4. Методика культивирования.
Проводили подготовку посевного материала путем посева культуры Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 в чашках Петри. Для этого агаризованную среду засевали исходной посевной культурой и инкубировали в термостате от 5 до 12 суток при температуре 25-34°С.
Далее проводили наработку культуры в колбах в жидкой среде в при 25-34°С в течение 24-48 часов на термостатируемой качалочной установке при 200-300 об/мин.
Далее проводили наработку посевной культуры в ферментере объемом 5/15 л, для этого проводили засев ферментера путем внесения посевной культуры в количестве 5-15% от объема среды в ферментере, при непрерывной подаче стерильного воздуха во время культивирования при перемешивании в течении 110-170 часов.
Контроль содержания антибиотика проводили методом ВЭЖХ. При максимальном накоплении антибиотика в среде процесс ферментации прекращали.
Пример 5. Определение содержания даптомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ.
Анализ содержания даптомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ проводили на колонке С18, 100 Å, 250*4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза А - 0,1 % ацетонитрила в 0,1 % водном растворе трифторуксусной кислоты. Подвижная фаза В: 0,1 % изопропилового спирта и 0,1 % подвижной фазы А в ацетонитриле скорость потока -1,5 мл/мин; длина волны детектирования - 214 нм.
Полученные усредненные данные представлены в Табл. 1.
| Таблица 1. Выход целевого продукта при глубинном культивировании | ||
| Штамм | Продуктивность штаммов (г/л культуральной жидкости ±0,2 г/л) | |
| в ферментере объемом 5 литров | в ферментере объемом 15 литров | |
| Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 | 5,3 5,7 5,4 |
6,6 6,8 6,4 |
Согласно литературным данным выход даптомицина после ферментации штамма Streptomyces filamentosus CGMCC № 16016 может достигать примерно 3,47 г/л (CN110777084, 11.02.2020).
Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что штамм микроорганизма по настоящему изобретению обладает высоким биотехнологическим потенциалом, значительно увеличенной продуктивностью и может применяться для промышленного производства антибиотика даптомицина.
Пример 6. Методика выделения даптомицина.
После культивирования микроорганизма Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 проводили отделение биомассы от культуральной жидкости с помощью микрофильтрации. Очищенную от биомассы культуральную жидкость переносили на стадию очистки, где проводили процесс ультрафильтрации, а отработанную биомассу утилизировали.
Очищенный раствор пропускали через колонку с гидрофобным сорбентом НР-20 дважды. Фракции элюирования анализировали методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие даптомицин с чистотой не менее 90 %, объединяли и переносили порционно в колбу ротационного испарителя. Удаляли растворитель в вакууме при температуре не выше 35°С. Далее проводили процесс ультрафильтрации. Очищенный раствор даптомицина концентрировали при помощи системы обратного осмоса. Состав охлаждали и дополнительно фильтровали.
Claims (3)
1. Штамм Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 – продуцент даптомицина.
2. Применение штамма по п.1 для получения даптомицина.
3. Способ получения даптомицина, включающий культивирование штамма по п.1 и выделение даптомицина из культуральной жидкости с последующей очисткой.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2802575C1 true RU2802575C1 (ru) | 2023-08-30 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120058790A (ko) * | 2010-11-30 | 2012-06-08 | 주식회사 빅바이오 | 답토마이신 생산성이 향상된 스트렙토마이세스 로제오스포러스 변이주 및 이를 이용한 답토마이신 생산방법 |
| CN110343638A (zh) * | 2019-07-01 | 2019-10-18 | 浙江大学 | 一株新的产达托霉素的链霉菌及其应用 |
| CN110777084A (zh) * | 2018-07-31 | 2020-02-11 | 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 | 一种a21978c高产菌株及其应用 |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120058790A (ko) * | 2010-11-30 | 2012-06-08 | 주식회사 빅바이오 | 답토마이신 생산성이 향상된 스트렙토마이세스 로제오스포러스 변이주 및 이를 이용한 답토마이신 생산방법 |
| CN110777084A (zh) * | 2018-07-31 | 2020-02-11 | 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 | 一种a21978c高产菌株及其应用 |
| CN110343638A (zh) * | 2019-07-01 | 2019-10-18 | 浙江大学 | 一株新的产达托霉素的链霉菌及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ДЕХНИЧ А.В. и др. Даптомицин: обзор фармакологических, клинических и микробиологических параметров. КЛИН МИКРОБИОЛ АНТИМИКРОБ ХИМИОТЕР. 2010, т.12, н.4, сс.295-313. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Muhammad et al. | ANTIBIOTIC PRODUCTION BY THERMOPHILIC BACILLUS SPECIE SAT-4. | |
| WO2023016387A1 (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其在制备1-脱氧野尻霉素中的应用 | |
| US10301690B2 (en) | Streptomyces filamentosus variant and method for producing daptomycin using same | |
| CN108165506A (zh) | 一种金黄链霉菌及其应用 | |
| RU2801749C1 (ru) | Новый штамм-продуцент ванкомицина amycolatopsis keratiniphila | |
| RU2789838C1 (ru) | Новый штамм-продуцент рамопланина actinoplanes ramoplaninifer | |
| EP2501821B1 (en) | Process for producing primycin, primycin component(s), precursors and metabolites thereof via fementation by the use of bacterial species saccharomonospora azurea | |
| RU2788348C1 (ru) | Новый штамм - продуцент ванкомицина amycolatopsis japonica | |
| RU2788347C1 (ru) | Новый штамм-продуцент хлорэремомицина kibdelosporangium aridum | |
| RU2850337C1 (ru) | Новый штамм-продуцент олеандомицина streptomyces lavenduligriseus | |
| KR101798485B1 (ko) | 미세조류의 배양 농도 또는 푸코잔틴 및 클로로필의 생산을 증대시키는 미생물 스타피아 또는 스타피아 배앙물 | |
| CN109312298B (zh) | 米氏硫胺素芽孢杆菌菌株及其用途 | |
| CN109554321B (zh) | 一种高产脂肽的基因工程菌及其应用 | |
| CN101961015B (zh) | 丰加霉素在防治番茄早疫病中的应用 | |
| KR102707891B1 (ko) | 항-남조류 활성 물질을 생산하는 신규 스트렙토마이세스 속 nibr000498259 균주 | |
| Farooq et al. | Antibacterial activity of Rhizopus specie isolated from rhizosphere of Mentha Piperita | |
| RU2784815C1 (ru) | Штамм Streptomyces sp. KMM 9044 - продуцент соединений, обладающих антибактериальной активностью | |
| RU2829879C1 (ru) | Штамм бактерий Anoxybacillus flavithermus - продуцент антимикробных соединений | |
| RU2722071C1 (ru) | Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 | |
| Balakrishnan et al. | Marine Actinomycete Streptomyces rubrogriseus Derived Bioactives are Effective Against Clinical Strains of MRSA | |
| CN120099131A (zh) | 一种从虾塘中产抗菌物质菌株的筛选、分离及发酵的方法 | |
| Das et al. | In vitro antimicrobial activity and molecular characterization of Bacillus amyloliquefaciens isolated from similipal biosphere reserve, Odisha, India | |
| CN120943798A (zh) | 一种珊瑚共生链霉菌来源的不饱和脂肪酸类化合物及其应用 | |
| HK40019555A (en) | Method for producing and purification of gramicidin s | |
| CN116098168A (zh) | 一种红树林链霉菌b4503菌株及其在防治香蕉枯萎病中的应用 |