RU2828103C1 - Способ получения панели ДНК-зондов для определения хромосомных транслокаций, делеций и амплификаций - Google Patents
Способ получения панели ДНК-зондов для определения хромосомных транслокаций, делеций и амплификаций Download PDFInfo
- Publication number
- RU2828103C1 RU2828103C1 RU2023129808A RU2023129808A RU2828103C1 RU 2828103 C1 RU2828103 C1 RU 2828103C1 RU 2023129808 A RU2023129808 A RU 2023129808A RU 2023129808 A RU2023129808 A RU 2023129808A RU 2828103 C1 RU2828103 C1 RU 2828103C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- genome
- insdseq
- insdqualifier
- amplifications
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 title claims abstract description 7
- 206010061764 Chromosomal deletion Diseases 0.000 title claims abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 title description 14
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims abstract description 49
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 25
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 18
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract description 14
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 5
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 37
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 5
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 5
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 5
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 4
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 3
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 2
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 101000779641 Homo sapiens ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009575 Angelman syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150054472 HER2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000016679 Monosomy X Diseases 0.000 description 1
- 206010068052 Mosaicism Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 201000010769 Prader-Willi syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000037280 Trisomy Diseases 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000007904 chromosomal in situ suppression hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000008711 chromosomal rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000000750 constant-initial-state spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 210000000415 mammalian chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 208000030427 mucinous ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 201000010065 polycystic ovary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000092 prognostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 239000002966 varnish Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к молекулярной цитогенетике. Описан способ получения панели ДНК-зондов для определения хромосомных транслокаций, делеций и амплификаций, включающий разработку панели ДНК-зондов с использованием длинных до 15 т.п.н. последовательностей ПЦР-амплификатов с последующим формированием ДНК-библиотек на диагностируемые участки генома человека и контрольные локусы, причем указанный способ включает стадии: выбор целевых регионов генома; подбор и синтез олигонуклеотидных праймеров на целевые регионы генома; наработка ДНК-продуктов с помощью ПЦР длинных фрагментов; получение библиотеки фрагментов ДНК с помощью метода ферментативной фрагментации; лигирование синтезированных адаптерных последовательностей и амплификация библиотеки с помощью синтезированных целевых праймерных последовательностей; введение в геномную библиотеку флуоресцентной метки; проверка специфичности и интенсивности ДНК-зонда в реакции FISH. Заявленный способ может быть использован для определения хромосомных транслокаций, делеций и амплификаций на основе флуоресцентной гибридизации ДНК-зонда с регионом генома протяженностью более 30 т.п.н., в различных биологических образцах клеток человека. 1 ил.
Description
Изобретение относится к области молекулярной цитогенетики и может быть использовано для определения хромосомных транслокаций, делеций и амплификаций на основе флуоресцентной гибридизации ДНК-зонда с регионом генома протяженностью более 30 т.п.н., в различных биологических образцах клеток человека.
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) - метод, который используется для пространственного обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот в их клеточном окружении. Он стал мощным цитогенетическим подходом к анализу клеток и тканей на уровне генома и транскриптома [1]. В диагностике FISH считается золотым стандартом для выявления клеток, содержащих хромосомные перестройки [2] или хромосомные аберрации [3; 4]. Метод основан на гибридизации специфичных к участку нуклеиновых кислот комплементарных зондов (обычно последовательностей ДНК) с их мишенью внутри клетки. Зонды могут быть нацелены на ДНК (метафазные и интерфазные хромосомы), а также на РНК, что делает возможным изучение геномных последовательностей и профилей экспрессии генов в отдельных клетках. Реакцию можно визуализировать непосредственно с помощью радиоактивно или флуоресцентно меченых зондов или косвенно с помощью гистохимических хромогенов, связывания с антигеном или взаимодействия биотин-стрептавидин.
Связывание комплементарных зондов позволяет обнаруживать и визуализировать интересующую мишень внутри клеток. Эта визуализация может быть использована в диагностических целях, таких как пренатальная и постнатальная диагностика хромосомных аберраций, при выявлении анеуплоидии, транслокации, инсерции или делеции [5]. Некоторые примеры заболеваний, диагностируемых с помощью FISH, включают муковисцидоз, мышечную дистрофию Дюшенна, синдром Прадера-Вилли, синдром Ангельмана, синдром Лежена, трисомии 13, 16, 18, 21, моносомию X, синдром Тернера и различные онкологические заболевания. Кроме того, ген-специфические мишени могут быть использованы для обнаружения амплификаций генов, часто обнаруживаемых в опухолевых клетках. Примером может служить обнаружение изменений числа копий гена рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2) в качестве прогностического биомаркера при раке молочной железы [6] и яичников [7; 8]. FISH дополнительно играет роль в видовой идентификации микроорганизмов [9]. Таким образом, метод FISH является распространенным инструментом в клеточных биологических исследованиях, а также в диагностических приложениях, поскольку он предоставляет ценную количественную информацию о распределении нуклеиновых кислот внутри отдельных клеток. Большим преимуществом метода является его способность предоставлять пространственную информацию о содержимом клетки, обеспечивая тем самым возможность исследования мозаицизма по хромосомным нарушениям в клеточной популяции [1].
В некоторых случаях в область молекулярной патологии и молекулярной онкологии помимо FISH внедряется также и метод хромогенной гибридизации in situ (CISH). Оба метода основаны на одной и той же идее гибридизации ДНК-зонда, специфичного к определенному региону генома на геномной ДНК без лизиса клеток [10]. Основное различие между методами заключается в характере детекции результатов: с помощью обнаружения хромогенной окраски в проходящем свете с использованием пероксидазы хрена (HRP) и хромогенного субстрата в случае CISH или с помощью эпифлуоресцентной детекции ДНК-зондов, меченных флуорофорами, при использовании FISH. В случае FISH мечение ДНК-зонда может быть прямым с использованием нуклеотидтрифосфатов, конъюгированных с флуорофорами, либо непрямым, когда в ДНК-зонд вводятся нуклеотидтрифосфаты, конъюгированные с биотином или дигоксигенином, к которым в последующем присоединяются стрептавидин, конъюгированный с флуорофором, или меченные флуорофором антитела к дигоксигенину, соответственно. В случае CISH используется непрямой вариант мечения с использованием зондов, меченных биотином, для обнаружения которых используют стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP-стрептавидин). Для зондов с конъюгированным дигоксигенином используют первичное антитело к дигоксигенину, а затем вторичное антитело, конъюгированное с HRP. Результаты CISH анализируются под микроскопом со светлым полем [11; 12], тогда как FISH-анализ требует использования флуоресцентной микроскопии.
Тестирование генетических маркеров часто играет ключевую роль в принятии решений, касающихся пациентов, от стратификации риска для пациентов до проведения соответствующего лечения. Оба метода успешно используются в медицине [13]. Уровень соответствия между результатами FISH и CISH, рассчитанный в группе из 4460 пациентов с диагнозом рак молочной железы, был на уровне 96%, что свидетельствует о том, что метод CISH сопоставим с FISH. Большинство источников согласны и сообщают о почти одинаковой эффективности FISH и CISH при диагностики амплификаций генов. Однако CISH может показать более низкую чувствительность для низкоуровневых амплификаций вследствие, например, полисомии хромосомы 17 [13]. Аналогичные наблюдения были представлены для перестроек гена ALK (тирозинкиназа рецептора ALK), протестированных с использованием FISH и CISH. Чувствительность CISH была на уровне 94,4%, а специфичность - 100%.
Существенным вопросом в методике FISH является выбор соответствующего зонда, который определяет ценность теста для пациента. Каждый тип FISH-зонда позволяет обнаруживать различные хромосомные аберрации. Наиболее часто используются ДНК-зонды следующих типов:
1. Полнохромосомные, окрашивающие всю хромосому. Применяются для обнаружения хромосомных транслокаций.
2. Локус-специфичные, гибридизующиеся с отдельным локусом на хромосоме, в том числе, центромеро-специфичные.
3. Мультилокусные ДНК-зонды, специфичные к определенным типам повторяющихся последовательностей (панцентромерные, пантеломерные).
Локус-специфичные ДНК-зонды можно использовать для оценки количества копий отдельного региона хромосомы или целой хромосомы. Последняя задача реализуется при оценке анеуплоидии с помощью центромеро-специфичных ДНК-зондов, или ДНК-зондов, специфичных для отдельных регионов хромосом.
Таким образом, флуоресцентная гибридизация in situ представляет собой метод, незаменимый для обнаружения различных хромосомных аномалий, таких как анеуплоидии, слияние генов, а также хромосомных амплификаций и делеций. Благодаря постепенно внедряемым усовершенствованиям метод дает важную информацию, которую можно использовать не только для пренатальной и постнатальной диагностики, но и для подбора лучших методов лечения. Вследствие универсальности FISH, данный метод можно использовать для цитогенетического анализа, а также для гематологических (например, лейкемии, лимфомы, множественной миеломы) и солидных опухолей (например, рака молочной железы, немелкоклеточного рака легких, колоректального рака).
Подбор праймеров и синтез ДНК-зондов.
Ключевыми характеристиками ДНК-зонда для использования в FISH диагностике являются следующие:
1. Специфическая гибридизация только с целевым регионом генома.
2. Флуоресцентный сигнал, уверенно видимый под флуоресцентным микроскопом при увеличении 630x как в интерфазных ядрах, так и на метафазных хромосомах.
Поэтому для специфической гибридизации ДНК-зонд должен разрабатываться на основе знания о последовательности ДНК целевого региона. Генерация достаточно интенсивного флуоресцентного сигнала на целевой ДНК возможна при гибридизации ДНК-зонда с регионом генома протяженностью более 30 т.п.н.
Известен способ специфического декорирования выбранных хромосом млекопитающих и их обнаружения, идентификации и/или количественного определения выбранных индивидуальных хромосом посредством супрессионной гибридизации in situ (CISS) [14]. CISS гибридизация основана на предварительной гибридизации меченой ДНК с избыточным количеством C0t-1 ДНК соответствующего вида. В результате меченная повторяющаяся ДНК формирует дуплексы с C0t-l ДНК и, таким образом, выводится из процесса гибридизации с ДНК метафазных хромосом. Метод используется для обнаружения хромосом, фрагментов хромосом или хромосомных аберраций.
Известен способ выявления внутрихромосомного дисбаланса в интерфазных ядрах с использованием in situ гибридизации региона хромосомы, на которую предположительно влияет указанный дисбаланс [15]. Для этого применяют два зонда, меченные различными флуорохромами - специфичные для длинного плеча и короткого плеча хромосомы, соответственно. Способ также используется для обнаружения раковых клеток в биологическом образце и для диагностики онкопатологий.
Известен способ обнаружения генных перестроек [16]. Разработана серия ДНК-зондов для использования в диагностике и мониторинге различных типов лейкозов с использованием методов нозерн-блот анализа и FISH. Эти зонды используются для обнаружения перестроек, таких как транслокации, с участием региона 11q23 с другими участками хромосом, включая 4q21, 6q27, 9p22, 19p13.3, как в делящихся лейкозных клетках, так и в интерфазных ядрах. Представлены результаты нозерн-блоттингового анализа, демонстрирующие, что ген MLL имеет несколько транскриптов, размер которых отличает лейкозные клетки от нормальных. Также раскрыты слитые белки с участием гена MLL, домены белка MLL и антитела против MLL.
Известен способ, основанный на обнаружении последовательности-мишени с использованием ДНК-зонда, который получен способом, включающим получение двухцепочечных полинуклеотидов, которые, содержат комплементарные последовательности-мишени и повторяющиеся последовательности, фрагментацию указанных полинуклеотидов на фрагменты, денатурирование в отдельные нити с последующей гибридизацией с флуорохромами с использованием ISH, FISH и CGH [17].
Известен способ для профилирования отдельных хромосом с использованием специфичных для мишени ДНК зондов в биологических образцах, таких как внеклеточная ДНК из периферической крови беременной женщины или больного раком [18]. Способ относится к генерации хромосомных профилей либо по отдельности, либо в комбинации (мультиплекс).
Недостатки аналогов. Для разработки ДНК-зондов ключевым этапом является получение фрагментов ДНК, комплементарных целевому региону, на который проводится разработка ДНК-зонда. Для этого часто используются либо микродиссектированные хромосомы, либо клоны бактериальных или дрожжевых искусственных хромосом (BAC или YAC). В первом случае полученные фрагменты изобилуют повторами и редко могут быть амплифицированы полностью с приемлемой равномерностью покрытия всего региона. Во втором случае, получение новых клонов искусственных хромосом затруднительно и чаще всего используются BAC из уже созданных библиотек.
Наиболее близким к заявленному способу является способ изготовления зондов с использованием ПЦР амплификации коротких участков ДНК, размером до 200 п.н., комплементарных исследуемым локусам генома человека, для гибридизации хромосом для диагностики хромосомных аберраций [19]. Недостатками прототипа являются использование большого количества специфических праймеров для достижения формирования зонда протяженностью более 30 т.п.н. для генерации достаточно интенсивного флуоресцентного сигнала на целевой ДНК при гибридизации ДНК-зонда с регионом генома. Поэтому, заявленный способ получения ДНК-зондов для флуоресцентной гибридизации in situ основан на использовании ПЦР длинных фрагментов, который позволяет благодаря комбинации taq и pfu полимераз амплифицировать фрагменты геномной ДНК до 15 т.п.н.
Технической задачей изобретения является разработка технологии получения ДНК-зондов для флуоресцентной гибридизации in situ на основе амплификации длинных фрагментов геномной ДНК с последующей флуоресценцией.
Поставленная задача решена путем разработки ДНК-зондов на основе амплификации длинных до 15 т.п.н. фрагментов геномной ДНК. Разработанная технология получения ДНК-зондов для флуоресцентной гибридизации in situ включает два модуля: 1) общую платформу в виде универсальных адаптеров, лигируемых к ДНК-библиотеке и обеспечивающих быструю амплификацию любой ДНК-библиотеки в стандартных условиях; 2) разрабатываемый под каждый ДНК-зонд набор фрагментов целевого региона генома, предварительно амплифицируемых перед их сборкой в геномную библиотеку и лигированием адаптеров.
Такой подход обеспечивает следующие преимущества метода:
1. Снижение затрат времени и трудозатрат на повторную амплификацию множества фрагментов при разработке и производстве ДНК-зонда.
2. Простота производства ДНК-зонда.
3. Унифицированные условия производства ДНК-зондов на различные регионы генома.
4. Защиту геномной библиотеки от контаминации после этапа лигирования адаптеров за счет амплификации только фрагментов ДНК, содержащих адаптеры.
Техническим результатом изобретения является разработка простого, дешевого и эффективного метода получения флуоресцентных ДНК-зондов для проведения флуоресцентной гибридизации in situ, по сравнению с существующими аналогами.
Описание сущности изобретения
Способ получения ДНК-зондов включает несколько этапов: 1) выбор целевых регионов генома; 2) подбор и синтез олигонуклеотидных праймеров на целевые регионы генома; 3) отработка условий ПЦР получения фрагментов целевых последовательностей; 4) получение библиотеки фрагментов ДНК и ее фрагментация; 5) лигирование адаптеров и амплификация библиотеки; 6) введение в геномную библиотеку флуоресцентной метки; 7) проверка специфичности и интенсивности ДНК-зонда в реакции FISH.
Подбор праймеров проводится на специфические регионы хромосом. Суммарная длина амплифицированных фрагментов ДНК для создания ДНК-зондов должна превышать 30 т.п.н., чтобы ДНК-зонд был хорошо визуализирован в нужном регионе хромосомы при проведении FISH-анализа. Поэтому получаемые фрагменты должны быть близко расположены на хромосоме, но не перекрываться, поэтому на каждые 10 т.п.н. подбирается одна пара праймеров. Для получения последовательности нуклеотидов используется геномный браузер UCSC (University of California, Santa Cruz), который содержит информацию о последовательностях геномов. В дальнейшем полученная последовательность нуклеотидов используется для подбора праймеров с помощью стандартных биоинформатических программ (Primer-BLAST), которые предоставляет Национальный центр биотехнологической информации США (англ. National Center for Biotechnological Information, NCBI). Для проверки термодинамических свойств праймеров используется программа Vector NTI Advance 11.5.
Праймеры подбираются с учетом следующих условий:
1) все праймеры должны иметь близкую температуру плавления и температуру отжига (±1°С);
2) длина праймера может варьировать от 18 до 24 н.;
3) внутренняя гомология не должна превышать 3 п.н.;
4) содержание GC-динуклеотидов может варьировать в диапазоне от 40% до 60%.
Исключаются праймеры с полипиримидиновыми или полипуриновыми протяженными участками, а также праймеры и сайты-мишени, температура плавления вторичной структуры которых выше, либо эквивалентна температуре плавления самого праймера. Кроме того, оценивается возможность гомо- и гетеродимеризации праймеров, так как это может привести к снижению выхода конечного продукта ПЦР.
Наработка ДНК-продуктов проводится с помощью ПЦР длинных фрагментов с использованием набора БиоМастер LR HS-ПЦР-Color (2×) (Биолабмикс, Россия). Наработка фрагментов проводится на амплификаторе SureCycler 8800 (Agilent Technologies, США). Для каждого набора праймеров подбирается индивидуальный режим, в зависимости от длины праймеров и чувствительности. Для обнаружения соответствующих бэндов проводится электрофорез в агарозном геле для всех амплифицированных фрагментов.
Далее проводится очистка ПЦР продукта после ПЦР длинных фрагментов c целью избавления от красителя с помощью переосаждения амплификатов этанолом.
Ферментативная фрагментация двухцепочечной ДНК необходима для образования фрагментов требуемой длины, для последующего построения качественных библиотек, поэтому используется от 10 до 1000 нг ДНК, растворенной в воде. Проведение фрагментации проводится с помощью набора реактивов FTP Display (ДНК Дисплей, Россия). Общий объем реакционной смеси должен составлять 50 мкл. Очистка полученных фрагментов проводится с помощью магнитных частиц Ampure XP (Beckman Coulter, США).
Лигирование адаптеров. В качестве адаптеров используются разработанные Y-образные адаптеры собственного дизайна, позволяющие эффективно амплифицировать большие количества целевых библиотек. Последовательности адаптеров: AdF - ATGGTGATTCTACTGTTTCTGTGACT, AdR - GTCACAGAATAATGCCGAGTCCA. Реакция лигирования проводится с помощью Т4 ДНК лигазы (Биолабмикс, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.
Получение ДНК-библиотек. Амплификация ДНК-библиотек проводится с помощью набора для проведения ПЦР БиоМастер HS-Taq ПЦР (2×) (Биолабмикс, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Последовательности праймеров: PrF - ATGGTGATTCTACTGTTTCTGTGAC, PrR - TGGACTCGGCATTATTCTGTGAC. Концентрацию ДНК определяют с помощью флуориметра Qubit 4.0 (Thermo, США).
Мечение ДНК-библиотек. Мечение ДНК-библиотек проводят с помощью реакции ник-трансляции с использованием флуоресцентных красителей Flu-12-дУТФ и TAMRA-5-дУТФ (Биосан, Россия). Реакционная смесь содержит 5 мкл смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (0,5 mM дАТФ, дЦТФ, дГТФ, 0,1 mM дТТФ) (Биосан, Россия), 5 мкл 10× буфера для ДНК-полимеразы I (Thermo, США), 1 мкл Flu-12-дУТФ или TAMRA-5-дУТФ (1 нМ/мкл) (Биосан, Россия), 5 мкл бычьего сывороточного альбумина (0,5 мг/мл), 5 мкл ДНК-азы I (0,02 ед./мл) (Thermo, США), 1 мкл ДНК-полимеразы I (10 ед./мкл) (Thermo, США), 1 мкг ДНК-библиотеки. Объем смеси доводят до 50 мкл деионизированной водой. Реакцию проводят при 15°С в течение 2 часов, и останавливают добавлением 1 мкл 0,5М ЭДТА (pH 8,0).
Флуоресцентная in situ гибридизация. Препараты проводят через три смены раствора 2xSSC (0,3 M NaCl, 0,03 M цитрата натрия) по 5 минут при 37°С, после чего проводят инкубацию препарата в 0,01 % растворе пепсина (Sigma, США) в течение 10 минут при 37°С. Через 10 минут проводят постфиксацию препарата в 0,5% растворе параформальдегида (Sigma, США) при комнатной температуре в вытяжном шкафу также в течение 10 минут. Далее отмывают препарат от постфиксатора в фосфатно-солевом буфере (1xPBS). Следующим шагом является обезвоживание препарата по 5 минут в трёх растворах этанола (70 %, 80 %, 96 %) с увеличением концентрации. После инкубирования препараты подсушивают и на них наносится по 10 мкл ДНК-зондов в гибридизационной смеси, специфичных к определенным последовательностям. Препараты накрывают покровным стеклом и заклеивают по краям. Гибридизацию (75°С, 5 минут) и инкубацию (37°С, 24 часа) проводят во влажной камере с подогревом (Termobrite, Германия). После окончания инкубации проводится отмывка препаратов в растворе WT1 (0,4xSSC, 0,3% NP-40) 2 мин при 73°С и WT2 (2xSSC, 0,1% NP-40) 5 мин при 37°С. После отмывки препараты не высушивают и на них сразу наносят заключающий раствор Vectashield с красителем DAPI (Vectorlabs, США). После этого, препараты накрывают покровным стеклом, лишнюю жидкость убирают при помощи фильтровальной бумаги, стекло заклеивают по краям прозрачным лаком. Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа.
Эффективность разработанной технологии получения ДНК-зондов была подтверждена посредством разработки и получения с ее использованием ДНК-зонда на регион гена RB1 (13q14.2) (фиг.1).
Источники информации:
1. Huber D., Kaigala G.V. Rapid micro fluorescence in situ hybridization in tissue sections // Biomicrofluidics. 2018. Vol. 12. № 4. P. e042212.
2. Carter N.P., Ferguson-Smith M.A., Perryman M.T. et al. Reverse chromosome painting: a method for the rapid analysis of aberrant chromosomes in clinical cytogenetics // J. Med. Genet. 1992. Vol. 29. № 5. P. 299-307.
3. Weimer J., Kiechle M., Arnold N. FISH-microdissection (FISH-MD) analysis of complex chromosome rearrangements // Cytogenet. Cell Genet. 2000. Vol. 88. №№ 1-2. P. 114-118.
4. Cherif D., Bernard O., Berger R. Detection of single-copy genes by nonisotopic in situ hybridization on human chromosomes // Hum. Genet. 1989. Vol. 81. № 4. P. 358-362.
5. Meyer M.F., Gerresheim F., Pfeiffer A. et al. Association of polycystic ovary syndrome with an interstitial deletion of the long arm of chromosome 11 // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 2000. Vol. 108. № 8. P. 519-523.
6. Duffy M.J., Harbeck N., Nap M. et al. Clinical use of biomarkers in breast cancer: Updated guidelines from the European Group on Tumor Markers (EGTM) // Eur. J. Cancer. 2017. Vol. 75. P. 284-298.
7. Luo H., Xu X., Ye M. et al. The prognostic value of HER2 in ovarian cancer: A meta-analysis of observational studies // PLoS One. 2018. Vol. 13. № 1. P. e0191972.
8. Han C., Hsu J., Yao C. et al. HER2 gene amplification in primary mucinous ovarian cancer: a potential therapeutic target // Histopathology. 2010. Vol. 57. № 5. P. 763-774.
9. Frickmann H., Zautner A.E., Moter A. et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) in the microbiological diagnostic routine laboratory: a review // Crit. Rev. Microbiol. 2017. Vol. 43. №3. P. 263-293.
10. Summersgil B., Clarc J., Shipley J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays // Nat Protoc. 2008. Vol. 3. P. 220-234.
11. Rosa F.E., Santos R.M., Rogatto S.R. et al. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/Neu status in breast carcinomas // Braz. J. Med. Biol. Res. 2013. Vol. 46. P. 207-216.
12. Furrer D., Sanschagrin F., Jacob S. et al. Advantages and disadvantages of technologies for HER2 testing in breast cancer specimens: table 1 // Am. J Clin Pathol. 2015. Vol. 144. P. 686-703.
13. Saez A., Andreu F.J., Bare M.L. et al. HER-2 gene amplification by chromogenic in situ hybridisation (CISH) compared with fluorescence in situ hybridisation (FISH) in breast cancer - a study of two hundred cases // Breast. 2006. Vol. 15. P. 519-527.
14. Патент EP0444115 «In situ suppression hybridization and uses therefor», 10.07.2017г., авторы: Ward D.C., Lichter P., Cremer T. и Manuelidis L.
15. Патент US6605436 “Method and kit for detecting intrachromosome imbalance in interphase nuclei and their applications», 21.05.2003г., авторы: Truong K., Guilly Marie-No L., Malfoy B., Vielh Ph., Bourgeois C., Dutrillaux B.
16. Патент WO1993025713 “Compositions and methods for detecting gene rearrangements and translocations», 17.06.1993г., авторы Rowley J.D. и Diaz M.O.
17. Патент WO2007053245 «Methods and composition to generate unique sequence DNA probes, iabeling of DNA probes and the use of these probes», 20.09.2006г., авторы: Connelly M. C., Foulk B., Kagan M.T., Swennenhuis J.F., Terstappen L.W., Tibbe A.G. и Verrant J.A.
18. Патент EP3314024 «Method and system for multiplex profiling of chromosomes in biological samples using target-specific DNA probes», 23.06.2016г., автор Vallabhaneni Ramesh
19. Патент WO2018019610 «DNA probes for in situ hybridization on chromosomes», 14.07.2017, авторы: Weglöhner Wolfgang, Schindler Sabrina.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="2023-02МГ.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"
productionDate="2023-11-17">
<ApplicantFileReference>2023-02</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
бюджетное научное учреждение Томский национальный исследовательский
медицинский центр Российской академии наук</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federalnoe gosudarstvennoe byudjetnoe nauchnoe
uchrejdenie Tomskii nacionalnii issledovatelskii medicinskii centr
Rossiiskoi akademii nauk</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ получения панели ДНК-зондов
для определения хромосомных транслокаций, делеций и
амплификаций</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q9">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapien</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atggtgattctactgtttctgtgact</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapien</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtcacagaataatgccgagtcca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q11">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapien</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atggtgattctactgtttctgtgac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapien</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tggactcggcattattctgtgac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (1)
- Способ получения панели ДНК-зондов для определения хромосомных транслокаций, делеций и амплификаций, включающий разработку панели ДНК-зондов с использованием длинных до 15 т.п.н. последовательностей ПЦР-амплификатов с последующим формированием ДНК-библиотек на диагностируемые участки генома человека и контрольные локусы, причем указанный способ включает стадии: выбор целевых регионов генома; подбор и синтез олигонуклеотидных праймеров на целевые регионы генома; наработка ДНК-продуктов с помощью ПЦР длинных фрагментов; получение библиотеки фрагментов ДНК с помощью метода ферментативной фрагментации; лигирование синтезированных адаптерных последовательностей SEQ ID № 1, 2 и амплификация библиотеки с помощью синтезированных целевых праймерных последовательностей SEQ ID № 3, 4; введение в геномную библиотеку флуоресцентной метки; проверка специфичности и интенсивности ДНК-зонда в реакции FISH.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2828103C1 true RU2828103C1 (ru) | 2024-10-07 |
Family
ID=
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2286798C2 (ru) * | 2004-07-08 | 2006-11-10 | Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук | Способ идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа) |
| RU2471871C2 (ru) * | 2005-01-12 | 2013-01-10 | Рамеш ВАЛЛАБХАНЕНИ | Способ и устройство для определения строения хромосом |
| WO2018019610A1 (de) * | 2016-07-25 | 2018-02-01 | InVivo BioTech Services GmbH | Dna-sonden für eine in-situ hybridisierung an chromosomen |
| CN108753967A (zh) * | 2018-06-08 | 2018-11-06 | 复旦大学附属中山医院 | 一种用于肝癌检测的基因集及其panel检测设计方法 |
| CN111647648A (zh) * | 2020-05-21 | 2020-09-11 | 北斗生命科学(广州)有限公司 | 一种用于检测乳腺癌基因突变的基因panel及其检测方法与应用 |
| CN112391471A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-02-23 | 深圳蓝图基因科技有限公司 | 一种乳腺癌易感基因筛查panel及其检测方法 |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2286798C2 (ru) * | 2004-07-08 | 2006-11-10 | Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук | Способ идентификации хромосомных транслокаций, приводящих к развитию злокачественных заболеваний крови (лейкозов), с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа (биочипа) |
| RU2471871C2 (ru) * | 2005-01-12 | 2013-01-10 | Рамеш ВАЛЛАБХАНЕНИ | Способ и устройство для определения строения хромосом |
| WO2018019610A1 (de) * | 2016-07-25 | 2018-02-01 | InVivo BioTech Services GmbH | Dna-sonden für eine in-situ hybridisierung an chromosomen |
| CN108753967A (zh) * | 2018-06-08 | 2018-11-06 | 复旦大学附属中山医院 | 一种用于肝癌检测的基因集及其panel检测设计方法 |
| CN111647648A (zh) * | 2020-05-21 | 2020-09-11 | 北斗生命科学(广州)有限公司 | 一种用于检测乳腺癌基因突变的基因panel及其检测方法与应用 |
| CN112391471A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-02-23 | 深圳蓝图基因科技有限公司 | 一种乳腺癌易感基因筛查panel及其检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11377689B2 (en) | Chemical compositions and uses thereof | |
| US20250361556A1 (en) | Varietal counting of nucleic acids for obtaining genomic copy number information | |
| Weiss et al. | Comparative genomic hybridisation | |
| EP3211086B1 (en) | Methods and composition to generate unique sequence dna probes, labeling of dna probes and the use of these probes | |
| US20210095341A1 (en) | Multiplex 5mc marker barcode counting for methylation detection in cell free dna | |
| US6451529B1 (en) | Genetic alterations associated with prostate cancer | |
| JP2005204652A (ja) | メチル化特異的プライマー伸長（ｍｓｐｅ）によるメチル化状況を検出するアッセイ | |
| CN102112628A (zh) | 先天性异常症的染色体缺失的检测方法 | |
| US20080274909A1 (en) | Kits and Reagents for Use in Diagnosis and Prognosis of Genomic Disorders | |
| RU2828103C1 (ru) | Способ получения панели ДНК-зондов для определения хромосомных транслокаций, делеций и амплификаций | |
| KR101064561B1 (ko) | 폐선암 수술 후 초기 재발 예측용 바이오마커 | |
| Murthy et al. | New approaches to fluorescence in situ hybridization | |
| Montironi et al. | Molecular techniques and prostate cancer diagnostic | |
| Pettus et al. | Multiple abnormalities detected by dye reversal genomic microarrays in prostate cancer: a much greater sensitivity than conventional cytogenetics | |
| US20220098676A1 (en) | Single-stranded oligonucleotide probes for chromosome or gene copy enumeration | |
| Rauch et al. | Methods for Analyzing DNA Cytosine Modifications Genome-wide | |
| US20260125756A1 (en) | Biomolecular probes and methods of detecting gene and protein expression | |
| WO2022001948A1 (zh) | 一种生物样本基因组dna或游离dna分子的甲基化检测方法和试剂盒 | |
| Bayani et al. | Fluorescence In Situ Hybridization | |
| Rodriguez et al. | Special Techniques | |
| HK40006962A (en) | Varietal counting of nucleic acids for obtaining genomic copy number information | |
| Peila | Comparative Genomic Hybridization to Detect Unbalanced Chromosomal Rearrangement | |
| WO2014048942A1 (en) | Probes for pten, pik3ca, met, and top2a, and method for using the probes |