RU2842811C1 - Новые способы доставки в клетку - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к не встречающимся в природе проникающим в клетку пептидам (СРР), и может быть использовано для доставки полезной нагрузки в клетку млекопитающего. Предложен CPP, аминокислотная последовательность которого соответствует SEQ ID NO: 1 или аминокислотной последовательности с по меньшей мере 90% сходством с SEQ ID NO: 1, где аминокислоты в последовательности указанного пептида представляют собой комбинацию L- и D-форм или все находятся в D-форме. Изобретение обеспечивает получение СРР, способного транслоцироваться через клеточную мембрану млекопитающих с проникновением в клетку млекопитающих. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 табл., 2 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение в целом относится к проникающим в клетку пептидам и связанным с ними композициям.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Пептиды представляют собой перспективные диагностические и терапевтические средства в связи с их высокой активностью и специфичностью в отношении мишеней. Однако одной из проблем более широкого внедрения пептидов в качестве терапевтических средств является неспособность большинства пептидов получить доступ к различным тканям внутри органов (таких как глаз), поскольку различные слои тканей обычно выступают в качестве барьера для внутриклеточного проникновения пептидов. Кроме того, существующие пептиды и любая ассоциированная с ними полезная нагрузка обычно захватываются в и лизосомальных компартментах клетки.

[0003] Проникающие в клетку пептиды (СРР) представляют собой класс пептидов, которые облегчают поглощение/захват клеткой различных молекулярных полезных нагрузок (от наноразмерных частиц до небольших химических молекул, других пептидов, белков, олигонуклеотидов и фрагментов ДНК). «Полезная нагрузка» ассоциирована с пептидами либо с помощью химической связи посредством ковалентных связей, либо с помощью нековалентных взаимодействий. Функция СРР заключается в доставке полезной нагрузки в клетки, т.е. процессе, который обычно происходит посредством эндоцитоза. Применение в настоящее время является ограниченным в связи с отсутствием клеточной специфичности в опосредованной СРР доставке полезной нагрузки.

[0004] Неэффективность большинства подтвержденных in vitro форм СРР in vivo подтверждается отсутствием доставляющих СРР лекарственных средств в клинической практике. Проблема заключается в том, что проникновение in vitro одиночной клетки в условиях in vivo значительно усложняет проблему опосредованной СРР доставки. Канонические СРР, такие как R8, Tat и пенетратин, характеризуются захватом in vitro и in vivo, подтверждаемым с помощью отслеживания флуоресцентно меченого СРР. Однако в сочетании с терапевтическими полезными нагрузками ни один из этих примеров не привел к значимым функциональным изменениям при патологиях. По-видимому, применимость опосредованной СРР доставки полезной нагрузки ограничена существующими пептидами, и любая ассоциированная полезная нагрузка обычно захватывается в эндосомальные и лизосомальные компартменты клетки в комбинации с отсутствием клеточной специфичности.

[0005] Известно, что in vivo линейные СРР, содержащие катионные пептиды с плотным зарядом со смежными положительно заряженными аминокислотами, секвестрируются путем связывания с углеводами, захватываются эндосомами/лизосомами, и, как было продемонстрировано, связывают головные группы фосфолипидов, вызывая деформацию мембраны. Повышение активности СРР с помощью усиления их амфипатического характера, которое является известной стратегией дизайна для повышения поглощения in vitro, не приводит к улучшению доставки in vivo, возможно, в связи с токсичностью, вызванной повышенной деформацией и разрушением мембраны.

[0006] Кроме того, универсальное присутствие трипсиновой и сериновой эндопептидаз и других протеаз in vivo вызывает быстрое расщепление пептидов с высоким содержанием катионов.

[0007] Таким образом, для использования в полной мере преимуществ доставляемых проникающими в клетку пептидами терапевтических средств, существует текущая потребность в разработке композиций и способов доставки пептидов и ассоциированных с ними полезных нагрузок в ткани in vivo и в конкретные ткани внутри органов.

[0008] Настоящее изобретение направлено на получение улучшенных или альтернативных проникающих в клетку пептидов.

[0009] Предыдущее обсуждение предшествующего уровня техники предназначено только для облегчения понимания настоящего изобретения. Обсуждение не является признанием или допущением того, что какой-либо из упомянутых материалов представляет собой или представлял собой часть общеизвестных сведений на дату приоритета настоящей заявки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0010] Настоящее изобретение относится к выделенному не встречающемуся в природе проникающему в клетку пептиду (СРР), содержащему аминокислотную последовательность:

RRSRTARAGRPGRNSSRPSAPR [SEQ ID NO: 1],

и последовательности, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1.

[0011] Последовательности по настоящему изобретению могут характеризоваться на по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80% или 85% сходством и предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 90%, 95% или 98% сходством на аминокислотном уровне с SEQ ID NO: 1.

[0012] Предпочтительно СРР модифицирован с помощью одного или нескольких из следующего: использование неканонических аминокислот, жирных кислот, обнаруживаемых меток, олигонуклеотидов, холестерина и реакционноспособных групп.

[0013] Предпочтительно СРР конъюгирован с молекулой, представляющей интерес. Молекула, представляющая интерес, может быть выбрана из следующего: терапевтическое средство, олигонуклеотид, дополнительный пептид или белок, реакционноспособная группа, жирная кислота, холестерин или обнаруживаемая метка. Предпочтительно конъюгация осуществляется с помощью ковалентной связи или нековалентного взаимодействия.

[0014] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрена модифицированная клетка, содержащая СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательности, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, или СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательности, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, конъюгированные с молекулой, представляющей интерес.

[0015] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено применение СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательностей, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательностей, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, конъюгированных с молекулой, представляющей интерес, или модифицированной клетки, содержащей любое из них, при изготовлении лекарственного препарата или диагностического средства.

[0016] В настоящем изобретении предусмотрено применение СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательностей, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательностей, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, конъюгированных с молекулой, представляющей интерес, или модифицированной клетки, содержащей любое из них, в качестве лекарственного препарата или диагностического средства.

[0017] В настоящем изобретении предусмотрен набор, содержащий (i) СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательности, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательностей, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, конъюгированные с молекулой, представляющей интерес, или модифицированную клетку, содержащую любое из них; и (ii) инструкции по применению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0018] Дополнительные характеристики настоящего изобретения более полно описаны в следующем описании нескольких его неограничивающих вариантов осуществления. Настоящее описание включено исключительно в целях иллюстрации настоящего изобретения. Его не следует понимать как ограничение общего изложения, раскрытия или описания настоящего изобретения, как указано выше. Описание будет выполнено со ссылкой на прилагаемые графических материалы, на которых представлено следующее. На Фиг. 1 представлен график эффективности пропуска экзона 7 SMN1 через 48 ч после обработки конъюгатом пептид-SMN1 и SMN1 в отдельности.

На Фиг. 2 представлен график жизнеспособности клеток через 48 ч после обработки конъюгатом пептид-SMN1 и SMN1 в отдельности.

На Фиг. 3 представлен график эффективности пропуска экзона 7 Smn, получаемого под воздействием СРР под SEQ ID NO: 1, конъюгированного с Smn РМО in vivo в клетках RPE/сосудистой оболочки глаза.

На Фиг. 4 представлен график эффективности пропуска экзона 7 Smn, получаемого под воздействием СРР под SEQ ID NO: 1, конъюгированного с Smn РМО in vivo в клетках сетчатки.

На Фиг. 5 представлен график токсичности в отношении GFAP in vivo СРР под SEQ ID NO: 1, конъюгированного с Smn РМО, через пять дней после инъекции.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Подробное описание сути изобретения

Проникающие в клетку пептиды

[0019] Характеристики проникающих в клетку пептидов (СРР), например, линейных СРР, содержащих катионные пептиды с плотным зарядом со смежными положительно заряженными аминокислотами, отвечающими за повышение эффективности in vitro, часто не приводят к результатам in vivo. Эффективность СРР тесно ассоциирована с токсичностью, и требуется тонкий баланс между эффективностью и токсичностью для эффективных как in vitro, так и in vivo СРР. Одним из определяющих препятствий, которые необходимо преодолеть, является захват фрагмента полезной нагрузки СРР внутри эндосом и лизосом. В данном документе нами представлен анализ, который требует локализации полезной нагрузки СРР в ядре для осуществления функционального считывания и, таким образом, если оно является эффективным, то характеризуется эндосомальным/лизосомальным ускользанием и/или доставкой в ядро. Нами были идентифицированы СРР, которые обеспечивают успешную доставку полезной нагрузки в ядро клетки, такой как аминокислотная последовательность, содержащая антисмысловой олигонуклеотид.

[0020] Соответственно, предусмотрен выделенный не встречающийся в природе проникающий в клетку пептид (СРР), содержащий аминокислотную последовательность:

RRSRTARAGRPGRNSSRPSAPR [SEQ ID NO: 1],

и последовательности, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1.

[0021] Предпочтительно СРР содержит от 10 до 100 остатков. Например, СРР может содержать от 10 до 50 остатков, от 20 до 30 остатков, от 20 до 40 остатков, от 30 до 70 остатков, от 40 до 60 остатков или от 25 до 50 остатков.

[0022] Аналоги аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1 включают в себя аналоги, характеризующиеся аминокислотной последовательностью, в которой одна или несколько аминокислот заменены другой аминокислотой, при этом такие замены существенно не изменяют биологическую активность (способность проникать в клетку) молекулы. Эти аналоги аминокислотной последовательности предпочтительно содержат консервативные аминокислотные замены по сравнению с SEQ ID NO: 1.

[0023] В контексте настоящего изобретения аналогичная последовательность включает в себя аминокислотную последовательность ССР, которая характеризуется на по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 85% сходством и предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 90%, 95% или 98% сходством на аминокислотном уровне на протяжении по меньшей мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 100 или 200 аминокислот, с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1. В частности, сходство обычно следует рассматривать в отношении тех областей последовательности, которые, как известно, необходимы для функции СРР, кодируемой SEQ ID NO: 1, а не несущественных соседних последовательностей.

[0024] Аналогичные последовательности могут содержать последовательность, которая характеризуется на по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% идентичностью и предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 90%, 95% или 98% идентичностью с SEQ ID NO: 1 (т.е. идентичными остатками). Аналогичные последовательности могут содержать последовательность, которая характеризуется на по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% сходством и предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 90%, 95% или 98% сходством с SEQ ID NO: 1 (т.е. остатками, являющимися консервативными, со сходными физико-химические свойствами).

[0025] Сравнения сходства может быть проведено на глаз или чаще с помощью находящихся в свободном доступе программ сравнения последовательностей. Эти коммерчески доступные компьютерные программы могут вычислять % сходства между двумя или более последовательностями. % сходства может быть рассчитан для смежных последовательностей, т.е. одна последовательность выравнивается по отношению к другой последовательности, и каждая аминокислота в одной последовательности непосредственно сравнивается с соответствующей аминокислотой в другой последовательности, по одному остатку за один раз. Это называется выравниванием «без гэпов». Обычно такое выравнивание без гэпов проводится только на протяжении относительно небольшого количества остатков (например, менее чем 50 смежных аминокислот).

[0026] Хотя это очень простой и последовательный способ, он не принимает во внимание, что, например, в ином отношении в почти идентичной паре последовательностей одна вставка или делеция будет вызывать нарушение выравнивания следующих аминокислотных остатков, что потенциально что приводит к значительному снижению % сходства и идентичности при выполнении глобального выравнивания. Следовательно, большинство способов сравнения последовательностей предназначены для получения оптимальных выравниваний, которые учитывают возможные вставки и делеции, без чрезмерного осуществления штрафов за общую оценку сходства. Это достигается с помощью вставки «гэпов» при выравнивании последовательностей для того, чтобы попытаться свести к максимуму локальную гомологию.

[0027] Идентичность и сходство аминокислотной последовательности могут быть определены с помощью инструмента EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms, доступного в Европейском институте биоинформатики (EMBL-EBI), который представляет собой часть Европейской лаборатории молекулярной биологии. Этот инструмент доступен на веб-сайте по адресу www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/. Данный инструмент использует алгоритм глобального выравнивания Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970). Используются настройки по умолчанию, которые включают в себя штраф за открытие гэпа, составляющий 10,0, и штраф за продление гэпа, составляющий 0,5. Матрица по умолчанию «Blosum62» используется для аминокислотных последовательностей и матрицы по умолчанию.

[0028] Термин «проникающий в клетку пептид» (СРР) относится к пептиду, который способен проникать через клеточную мембрану. В одном примере СРР способен транслоцироваться через клеточную мембрану млекопитающих и проникать в клетку. В другом примере СРР может направлять конъюгат в требуемый субклеточный компартмент. Таким образом, СРР может направлять или облегчать проникновение молекулы, представляющей интерес, через фосфолипидную, клеточную, митохондриальную, эндосомальную, лизосомальную, везикулярную или ядерную мембрану. СРР может транслоцироваться через мембрану с полной и интактной аминокислотной последовательностью или в качестве альтернативы частично расщепленной.

[0029] СРР может направлять молекулу, представляющую интерес, извне клетки через цитоплазматическую мембрану в цитоплазму или требуемый субклеточный компартмент. В качестве альтернативы или в качестве дополнения СРР может направлять молекулу, представляющую интерес, через гематоэнцефалический, трансслизистый, гематоретинальный, кожный, желудочно-кишечный и/или легочный барьеры.

[0030] Способность СРР транслоцироваться через мембраны может быть энергозависимой или энергонезависимой, и/или зависимой от рецептора или независимой от рецептора. В некоторых примерах СРР представляет собой пептид, который, как продемонстрировано, транслоцируется через цитоплазматическую мембрану, что определяется способами, описанными в данном документе. СРР охватывают: (i) пептиды, которые интернализуются клетками, но впоследствии захватываются эндосомами или лизосомами; и (ii) пептиды, которые не только интернализуются клетками, но также способны ускользать от эндосомальных и/или лизосомальных компартментов после интернализации клетками и, кроме того, способны опосредовать внутриклеточную доставку в цитозоль и ядро, митохондрии, аппарат Гольджи и другие внутриклеточные компартменты.

[0031] В некоторых примерах пептид будет содержать от одной до двух, от одной до пяти или десять консервативных аминокислотных замен по отношению к любой последовательности, описанной в данном документе, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 консервативных аминокислотных замен. Консервативное замещение (также называемое консервативной мутацией или консервативной заменой) представляет собой аминокислотное замещение, при котором аминокислотный остаток замещается другим аминокислотным остатком, содержащим боковую цепь с аналогичными физико-химическими свойствами, что приводит к образованию белка с другими аминокислотными последовательностями, но который характеризуется аналогичными биохимическими свойствами (например, зарядом, гидрофобностью и размером).

[0032] Аминокислотные остатки, содержащие боковые цепи со сходными физико-химическими свойствами, известны из уровня техники и включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Консервативные аминокислотные замены включают в себя аминокислотные замены, которые были замещены не встречающимися в природе аминокислотами и непротеогенными аминокислотами, которые поэтому не входят в число обычных аминокислот, кодируемых генетическим кодом. Консервативные аминокислотные замены дополнительно включают в себя D-аминокислоты.

[0033] Термин «основная аминокислота» относится к любой аминокислоте, в том числе природным и не встречающимся в природе аминокислотам, которая характеризуется изоэлектрической точкой, составляющей более 6,3, как измерено в соответствии с Kice & Marvell "Modern Principles of organic Chemistry" (Macmillan, 1974) или Matthews and van Holde "Biochemistry" Cummings Publishing Company, 1996. В данное определение включены аргинин, лизин, гистидин и гомоаргинин (Har), а также их производные. Подходящие не встречающиеся в природе основные аминокислоты описаны в US 6858396.

[0034] В некоторых примерах аминокислотная последовательность любого из пептидов СРР состоит из 20-100 остатков, например, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или другого числа остатков от 20 до 100. В других примерах аминокислотная последовательность любого из вышеуказанных пептидов состоит из 30-70 остатков, например, 35, 40, 45, 48, 50, 52, 60, 65 или другого числа остатков от 30 до 70 остатков. В других примерах аминокислотная последовательность любого из вышеуказанных пептидов состоит из 40-60 остатков, например, 42, 43, 45, 48, 50, 52, 54, 57, 58 или другого числа остатков от 40 до 60 остатков. В некоторых примерах аминокислотная последовательность любого из вышеуказанных пептидов состоит из 35-50 остатков, например, 36, 38, 40, 42, 43, 45, 57, 58 или другого числа остатков от 35 до 50 остатков. В еще одних примерах аминокислотная последовательность любого из вышеуказанных пептидов состоит из 20-50 остатков, например, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 37, 38, 40, 42, 46, 48 или другого числа остатков от 20 до 50.

[0035] В одном примере аминокислотная последовательность пептида состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1. Во избежание сомнений следует понимать, что в таких примерах, хотя аминокислотная последовательность пептида состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1, пептид, тем не менее, может содержать химические модификации, которые не изменяют аминокислотную последовательность. Такие модификации включают в себя без ограничения: использование неканонических аминокислот, жирных кислот, обнаруживаемых меток, полинуклеотидов, холестерина и реакционноспособных групп; конъюгацию СРР с непептидными линкерами; конъюгацию СРР с молекулами, представляющими интерес (в том числе терапевтическими средствами, олигонуклеотидами и обнаруживаемыми метками). В других примерах СРР состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1.

[0036] В одном варианте осуществления ССР содержит несколько копий аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1, и последовательности, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, обозначаемые в данном документе как мультимерные пептиды. В некоторых примерах мультимерный пептид содержит от двух до десяти копий аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 копий аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления ССР содержит несколько копий аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1, и последовательности, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1.

Модифицированные СРР

[0037] СРР могут быть модифицированы с помощью использования неканонических аминокислот, жирных кислот, обнаруживаемых меток, полинуклеотидов, холестерина и реакционноспособных групп. Такие модифицированные пептиды могут придавать СРР дополнительные функциональные возможности, такие как облегчение обнаружения при проникновении пептида, локализация внутри клеток, усиление проникновения в клетку и/или снижение расщепления пептида in vitro или in vivo.

Неканонические аминокислоты

[0038] В некоторых примерах СРР представляет собой модифицированный пептид, содержащий неканоническую аминокислоту. Подходящие неканонические аминокислоты включают в себя без ограничения α-амино-н-масляную кислоту, норвалин, норлейцин, аллоизолейцин, трет-лейцин, орнитин, аллотреонин, β-аланин, β-амино-н-масляную кислоту, н-изопропилглицин, изосерин, саркозин, 6-аминогексановую кислоту, гамма-аминомасляную кислоту и 5-аминовалериановую кислоту.

Реакционноспособные группы

[0039] В других примерах модифицированный СРР может содержать реакционноспособную группу. Подходящие реакционноспособные группы включают в себя без ограничения азидные группы, реакционноспособные аминогруппы, реакционноспособные тиоловые группы и реакционноспособные карбонильные группы. В некоторых примерах реакционноспособные группы являются частью химического тэга. Подходящие химические тэги включают в себя без ограничения тэг SNAP, тэг CLIP, тэг Halo или тэг ТМР. В одном примере химический тэг представляет собой тэг SNAP или тэг CLIP. Слитые белки SNAP и CLIP обеспечивают специфическое ковалентное присоединение практически любой молекулы к белку или пептиду, представляющим интерес, как описано, например, в Correa 2015 (Methods Mol Biol, 1266: 55-79). В другом примере химический тэг представляет собой тэг Halo. Тэг Halo включает в себя модульную систему мечения белков, которая позволяет ковалентно связывать различные молекулы либо в растворе, либо в живых клетках, либо в химически фиксированных клетках. В другом примере химический тэг представляет собой тэг ТМР. Тэги ТМР способны метить с высокой селективностью внутриклеточные белки, а не белки клеточной поверхности.

Жирные кислоты

[0040] В некоторых примерах модифицированный СРР может содержать жирную кислоту. Подходящие жирные кислоты для модифицированных пептидов включают в себя без ограничения пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, каприловую кислоту, лауриновую кислоту, н-октановую кислоту и н-декановую кислоту.

Холестерин

[0041] В других примерах модифицированный СРР может содержать холестерин.

Олигонуклеотиды

[0042] В некоторых примерах модифицированный СРР может содержать олигонуклеотид. В таких случаях олигонуклеотид может представлять собой антисмысловой олигонуклеотид, siRNA, microRNA, RNAi, олигонуклеотид на основе одноцепочечной ДНК или РНК, олигонуклеотид на основе двухцепочечной ДНК, mRNA или плазмиду.

Обнаруживаемые метки

[0043] В некоторых примерах модифицированный СРР может содержать обнаруживаемую метку. Термин «обнаруживаемая метка» относится к любому типу молекулы, которая может быть обнаружена с помощью оптической, флуоресцентной, изотопной визуализации или с помощью масс-спектроскопических методик, или с помощью выполнения простых ферментативных анализов. Можно использовать любую обнаруживаемую метку, известную из уровня техники. В некоторых примерах обнаруживаемая метка выбрана из репортерного белка, флуорофора, флуорогенного субстрата, люминогенного субстрата и биотина.

[0044] Обнаруживаемая метка может представлять собой репортерный белок. Подходящие репортерные белки включают в себя флуоресцентный белок, как описано в данном документе, β-лактамазу, как описано в Qureshi (2007), Biotechniques, 42 (1): 91-95, галоалкандегалогеназу или люциферазу. В некоторых примерах репортерный белок содержит аминокислотную последовательность β-лактамазы.

[0045] Обнаруживаемая метка может представлять собой флуоресцентный тэг. Например, флуоресцентный тэг может представлять собой флуорофор, такой как изотиоцианат флуоресцеина, тиосемикарбазид флуоресцеина, родамин, Texas Red, CyDye, такой как Су3, Су5 и Су5.5, Alexa Fluor, такой как Alexa488, Alexa555, Alexa594 и Alexa647, или флуоресцентный краситель ближнего инфракрасного диапазона. Флуоресцентный тэг может представлять собой флуоресцентный белок, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), AcGFP или TurboGFP, Emerald, Azami Green, ZsGreen, EBFP, Sapphire, T-Sapphire, ECFP, mCFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midori-Ishi Cyan, mTFPl (Teal), усиленный желтый флуоресцентный белок (EYFP), Topaz, Venus, mCitrine, YPet, PhiYFP, ZsYellowl, mBanana, Kusabira,ange, mOrange, dTomato, dTomato-Tandem, AsRed2, mRFPl, Jred, mCherry, HcRedl, mRaspberry, HcRedl, HcRed-Tandem, mPlum, AQ 143. Флуоресцентный тэг может представлять собой квантовую точку. Флуоресцентный тэг может содержать рН-чувствительный флуорофор, такой как нафтофлуоресцеин, pHrodo™ Green (ThermoFisher) и pHrodo™ Red (ThermoFisher). Флуоресцентные тэги могут быть обнаружены с использованием флуоресцентных микроскопов, таких как эпифлуоресцентные или конфокальные микроскопы, флуоресцентных сканеров, таких как ридеры микрочипов, спектрофлуориметры, ридеры микропланшетов и/или проточные цитометры.

[0046] Обнаруживаемая метка может представлять собой люминогенный субстрат. Подходящие люминогенные субстраты включают в себя без ограничения D-люциферин, L-люциферин, коэлентеразин.

[0047] Обнаруживаемая метка может представлять собой тэг эпитопа. Например, тэг эпитопа может представлять собой полигистидиновый тэг, такой как гексагистидиновый тэг или додекагистидиновый тэг, тэг FLAG, тэг Мус, тэг НА, тэг GST или тэг V5. Тэги эпитопов обычно обнаруживаются с помощью коммерческих доступных антител. Специалисту в данной области техники будет известно, что тэг эпитопа может облегчить очистку и/или обнаружение. Например, СРР, содержащий гексагистидиновый тэг, может быть очищен с использованием способов, известных из уровня техники, таких как приведение образца, содержащего белок, в контакт с никель-нитрилотриуксусной кислотой (Ni-NTA), которая специфически связывает гексагистидиновый тэг, иммобилизованный на твердой или полутвердой подложке, промывание образца с удалением несвязанного белка и последующее элюирование связанного белка. В качестве альтернативы или в качестве дополнения лиганд или антитело, которые связываются с тэгом эпитопа, могут быть использованы в способе аффинной очистки.

[0048] Обнаруживаемая метка может представлять собой массовый тэг или изобарический тэг. Такие тэги могут быть использованы для относительной абсолютной количественной оценки (iTRAQ). Массовый тэг представляет собой химическую метку, используемую для количественной оценки белков и пептидов на основе масс-спектрометрии. В таких способах масс-спектрометры распознают разницу в массе между меченой и немеченой формами белка или пептида, и количественная оценка достигается с помощью сравнения их соответствующих интенсивностей сигналов, как описано, например, в Bantscheff et al. 2007. Примеры массовых тэгов включают в себя TMTzero, TMTduplex, TMTsixplex и ТМТ 10-plex. Изобарический тэг для относительной абсолютной количественной оценки (iTRAQ) представляет собой химический тэг, используемый в количественной протеомике с помощью тандемной масс-спектрометрии для определения количества белков из разных источников в одном эксперименте, как описано, например, в Wiese et al. 2007.

Конъюгированные полезные нагрузки

[0049] СРР может быть конъюгирован молекулой, представляющей интерес (т.е. «полезной нагрузкой») для повышения доставки молекулы, представляющей интерес, в клетку. Молекулы, представляющие интерес, включают в себя терапевтическое средство, олигонуклеотид, дополнительный пептид или белок, реакционноспособную группу, жирную кислоту, холестерин или обнаруживаемую метку. Конъюгация может осуществляться посредством ковалентной связи или нековалентных взаимодействий. Например, СРР может быть конъюгирован с олигонуклеотидом посредством «пептидного линкера». Фрагмент может быть выполнен с возможностью воздействия на конкретную внутриклеточную мишень или для направления своего транспорта в конкретный субклеточный компартмент.

[0050] Молекула, представляющая интерес, может быть ковалентно связана с аминокислотой в пептиде СРР. В одном примере ковалентно связанная молекула, представляющая интерес, ковалентно связана с N-концом аминокислотной последовательности СРР. В другом примере ковалентно связанная молекула, представляющая интерес, ковалентно связана с С-концом аминокислотной последовательности СРР. В других примерах ковалентно связанная молекула, представляющая интерес, ковалентно связана посредством боковой цепи аминокислотного остатка СРР (например, во внутреннем остатке лизина или цистеина). Специалисты в данной области техники признают, что это может быть достигнуто с помощью различных химических реакций, в том числе без ограничения образования пептидной связи, образования амидной связи, связывания посредством реакционноспособных аминов, образования гидразона, образования дисульфида, эфирных связей, клик-химии (как катализируемые медью, так и активируемых штаммом), реакций Штаудингера, естественного химического лигирования и химических реакций конъюгации, таких как образование изопептидной связи SpyCatcher/SpyTag.

[0051] В некоторых примерах молекула, представляющая интерес, нековалентно связана с СРР, например, посредством нековалентных взаимодействий между одним или несколькими заряженными аминокислотными остатками в СРР и одной или несколькими функциональными группами молекулы, представляющей интерес, которые характеризуются противоположным зарядом по отношению к одному или нескольким аминокислотным остаткам СРР. Нековалентное взаимодействие может представлять собой электростатические взаимодействия, силы Ван-дер-Ваальса, взаимодействием с помощью пи-связи и гидрофобные взаимодействия.

Терапевтическое средство

[0052] В некоторых примерах конъюгированная молекула, представляющая интерес, может представлять собой терапевтическое средство, предпочтительно низкомолекулярное соединение (обычно размером менее чем приблизительно 900 дальтон). В некоторых примерах низкомолекулярное терапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство, цитотоксическую молекулу или цитостатическую молекулу.

Олигонуклеотиды

[0053] В некоторых примерах конъюгированная молекула, представляющая интерес, может представлять собой олигонуклеотид. Олигонуклеотид может представлять собой антисмысловой олигонуклеотид, siRNA, microRNA, RNAi, олигонуклеотид на основе одноцепочечной ДНК или РНК, олигонуклеотид на основе двухцепочечной ДНК, mRNA или плазмиду. Олигонуклеотид может включать в себя морфолиновые олигонуклеотиды (РМО), пептидные нуклеиновые кислоты (PNA), закрытые нуклеиновые кислоты (LNA) и 2'-O-метилолигонуклеотиды. Олигонуклеотиды могут содержать (i) модифицированную структуру остова, например, остов, отличный от стандартной фосфодиэфирной связи, обнаруженной во встречающихся в природе олиго- и полинуклеотидах, и/или (ii) модифицированные сахарные фрагменты, например, морфолиновые фрагменты, а не фрагменты рибозы или дезоксирибозы.

Пептиды или белки

[0054] В некоторых примерах конъюгированная молекула, представляющая интерес, может представлять собой белок или пептид. Белок или пептид может представлять собой проапоптотический пептид, нацеливающийся белок, цитотоксический белок, ферментативный белок, репортерный белок, ингибитор белок-белкового взаимодействия на основе пептида, пептид на основе протеолитической нацеливающейся химеры (PROTAC) и доминантно-негативный пептид.

[0055] В некоторых примерах ферментный белок может представлять собой ASS-1 (Quinonez and Thoene 2004) или бета-лактамазу (Stone et al. 2018); ингибитор взаимодействия пептидов может представлять собой пептид, блокирующий взаимодействие белков KRAS/SOS-1 (например, Leshchiner et al. 2015); пептидная последовательность пептида на основе протеолитической нацеливающейся химеры (PROTAC) может быть одной из Sakamoto et al. 2001 или Gu et al. 2018.

[0056] В некоторых примерах белок или пептид может представлять собой проапоптотический пептид.

[0057] В некоторых примерах белок или пептид может представлять собой нацеливающийся белок. Нацеливающийся белок может обеспечивать повышенную специфичность в отношении пептидных конъюгатов за счет связывания со специфическим антигеном клеточной поверхности (например, рецептором), который затем интернализуется в эндосомы. Примеры нацеливающихся белков включают в себя без ограничения аффитела, scFv, одноцепочечные антитела и другие белки, селективно связывающиеся с использованием альтернативных каркасов (например, пептидных аптамеров). В качестве альтернативы нацеливающийся белок может представлять собой нацеливающийся на геном белок (например, нацеливающийся на геном белок Cas9 или нацеливающийся на геном белок Cpf1).

[0058] В других примерах белок или пептид может представлять собой цитотоксический белок (например, буганин или дифтерийный токсин), который вызывает быструю клеточную смерть при интернализации и ускользании из эндосом.

[0059] В некоторых примерах белок или пептид может представлять собой доминантно-негативный пептид. Доминантно-негативные пептиды обычно действуют, препятствуя одной или нескольким функциям белка, из которого они получены, и/или функции взаимодействующего партнера полноразмерного белка. Обычно они действуют, препятствуя взаимодействию белка с одним или несколькими его партнерами по связыванию. В некоторых примерах доминантно-негативного пептид фактора транскрипции представляет собой противораковый пептид. Подходящие противораковые пептиды включают в себя без ограничения: Omomyc, активирующий фактор транскрипции 5 (ATF5), доминантно-негативный пептид d/n-ATF5-S1, как описано в Massler et al (2016), Clin Cancer Res, 22 (18): 4698-4711, доминантно-негативные пептиды, направленные против Ras-p21, такие как ras-p21 96-110 (PNC-2) и ras-p21 35-47, как описано Adler et al. (2008), Cancer Chemother Pharmacol, 62 (3): 491-498.

Реакционноспособные группы

[0060] В некоторых примерах конъюгир о ванная молекула, представляющая интерес, может представлять собой реакционноспособную группу. Подходящие реакционноспособные группы включают в себя без ограничения азидные группы, реакционноспособные аминогруппы, реакционноспособные тиоловые группы и реакционноспособные карбонильные группы. В некоторых примерах реакционноспособные группы являются частью химического тэга. Подходящие химические тэги включают в себя без ограничения тэг SNAP, тэг CLIP, тэг Halo или тэг ТМР. В одном примере химический тэг представляет собой тэг SNAP или тэг CLIP. Слитые белки SNAP и СЫР обеспечивают специфическое ковалентное присоединение практически любой молекулы к белку или пептиду, представляющим интерес, как описано, например, в Correa 2015 (Methods Mol Biol, 1266: 55-79). В другом примере химический тэг представляет собой тэг Halo. Тэг Halo включает в себя модульную систему мечения белков, которая позволяет ковалентно связывать различные молекулы либо в растворе, либо в живых клетках, либо в химически фиксированных клетках. В другом примере химический тэг представляет собой тэг ТМР. Тэги ТМР способны метить с высокой селективностью внутриклеточные белки, а не белки клеточной поверхности.

Жирные кислоты

[0061] В некоторых примерах конъюгированная молекула, представляющая интерес, может представлять собой жирную кислоту. Подходящие жирные кислоты для модифицированных пептидов включают в себя без ограничения пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, каприловую кислоту, лауриновую кислоту, н-октановую кислоту и н-декановую кислоту.

Холестерин

[0062] В некоторых примерах конъюгированная молекула, представляющая интерес, может представлять собой холестерин.

Обнаруживаемые метки

[0063] В некоторых примерах конъюгированная молекула, представляющая интерес, может представлять собой обнаруживаемую метку. Обнаруживаемая метка может представлять собой любой тип молекулы, которая может быть обнаружена с помощью оптической, флуоресцентной, изотопной визуализации или с помощью масс-спектроскопических методик, или с помощью выполнения простых ферментативных анализов. Можно использовать любую обнаруживаемую метку, известную из уровня техники. В некоторых примерах обнаруживаемая метка выбрана из репортерного белка, флуорофора, флуорогенного субстрата, люминогенного субстрата и биотина.

[0064] Обнаруживаемая метка может представлять собой репортерный белок. Подходящие репортерные белки включают в себя флуоресцентный белок, как описано в данном документе, β-лактамазу, как описано в Qureshi (2007), Biotechniques, 42 (1): 91-95, галоалкандегалогеназу или люциферазу. В некоторых примерах репортерный белок содержит аминокислотную последовательность β-лактамазы.

[0065] Обнаруживаемая метка может представлять собой флуоресцентный тэг. Например, флуоресцентный тэг может представлять собой флуорофор, такой как изотиоцианат флуоресцеина, тиосемикарбазид флуоресцеина, родамин, Texas Red, CyDye, такой как Су3, Су5 и Су5.5, Alexa Fluor, такой как Alexa488, Alexa555, Alexa594 и Alexa647, или флуоресцентный краситель ближнего инфракрасного диапазона. Флуоресцентный тэг может представлять собой флуоресцентный белок, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), AcGFP или TurboGFP, Emerald, Azami Green, ZsGreen, EBFP, Sapphire, T-Sapphire, ECFP, mCFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midori-Ishi Cyan, mTFPl (Teal), усиленный желтый флуоресцентный белок (EYFP), Topaz, Venus, mCitrine, YPet, PhiYFP, ZsYellowl, mBanana, Kusabira,ange, mOrange, dTomato, dTomato-Tandem, AsRed2, mRFPl, Jred, mCherry, HcRedl, mRaspberry, HcRedl, HcRed-Tandem, mPlum, AQ 143. Флуоресцентный тэг может представлять собой квантовую точку. Флуоресцентный тэг может содержать рН-чувствительный флуорофор, такой как нафтофлуоресцеин, pHrodo™ Green (ThermoFisher) и pHrodo™ Red (ThermoFisher). Флуоресцентные тэги могут быть обнаружены с использованием флуоресцентных микроскопов, таких как эпифлуоресцентные или конфокальные микроскопы, флуоресцентных сканеров, таких как ридеры микрочипов, спектрофлуориметры, ридеры микропланшетов и/или проточные цитометры.

[0066] Обнаруживаемая метка может представлять собой люминогенный субстрат. Подходящие люминогенные субстраты включают в себя без ограничения D-люциферин, L-люциферин, коэлентеразин.

[0067] Обнаруживаемая метка может представлять собой тэг эпитопа. Например, тэг эпитопа может представлять собой полигистидиновый тэг, такой как гексагистидиновый тэг или додекагистидиновый тэг, тэг FLAG, тэг Мус, тэг НА, тэг GST или тэг V5. Тэги эпитопов обычно обнаруживаются с помощью коммерческих доступных антител. Специалисту в данной области техники будет известно, что тэг эпитопа может облегчить очистку и/или обнаружение. Например, СРР, содержащий гексагистидиновый тэг, может быть очищен с использованием способов, известных из уровня техники, таких как приведение образца, содержащего белок, в контакт с никель-нитрилотриуксусной кислотой (Ni-NTA), которая специфически связывает гексагистидиновый тэг, иммобилизованный на твердой или полутвердой подложке, промывание образца с удалением несвязанного белка и последующее элюирование связанного белка. В качестве альтернативы или в качестве дополнения лиганд или антитело, которые связываются с тэгом эпитопа, могут быть использованы в способе аффинной очистки.

[0068] Обнаруживаемая метка может представлять собой массовый тэг или изобарический тэг. Такие тэги могут быть использованы для относительной абсолютной количественной оценки (iTRAQ). Массовый тэг представляет собой химическую метку, используемую для количественной оценки белков и пептидов на основе масс-спектрометрии. В таких способах масс-спектрометры распознают разницу в массе между меченой и немеченой формами белка или пептида, и количественная оценка достигается с помощью сравнения их соответствующих интенсивностей сигналов, как описано, например, в Bantscheff et al. 2007. Примеры массовых тэгов включают в себя TMTzero, TMTduplex, TMTsixplex и ТМТ 10-plex. Изобарический тэг для относительной абсолютной количественной оценки (iTRAQ) представляет собой химический тэг, используемый в количественной протеомике с помощью тандемной масс-спектрометрии для определения количества белков из разных источников в одном эксперименте, как описано, например, в Wiese et al. 2007.

Синтез

[0069] Любой СРР по настоящему изобретению может быть синтезирован с использованием химического способа, известного специалистам в данной области техники. Например, синтетические пептиды получают с использованием известных методик твердофазной, жидкофазной или пептидной конденсации или любой их комбинации, и они могут включать природные и/или не встречающиеся в природе аминокислоты.

[0070] Любой пептид по настоящему изобретению может быть экспрессирован рекомбинантными способами. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая пептид, может быть помещена в функциональное соединение с промотором или другой регуляторной последовательностью, способной регулировать экспрессию в клеточной системе или организме. Типичные промоторы, подходящие для экспрессии в бактериальных клетках, включают в себя, например, промотор lacz, промотор Ipp, чувствительные к температуре промоторы λL или λR, промотор Т7, промотор Т3, промотор SP6 или полуискусственные промоторы, такие как индуцируемый IPTG промотор tac или промотор lacUV5. Ряд других систем генных конструкций для экспрессии пептидов по настоящему изобретению в бактериальных клетках хорошо известен из уровня техники и описан, например, в Ausubel et al. (1988), и Sambrook et al. (2001).

[0071] Описаны многочисленные векторы экспрессии для экспрессии рекомбинантных пептидов в бактериальных клетках, и они включают в себя, например, PKC3, pKK173-3, рЕТ28, набор векторов pCR (Invitrogen), векторы pGEM-T Easy (Promega), набор векторов экспрессии pL (Invitrogen) или серию векторов pBAD/thio-TOPO, содержащих среди прочего индуцируемый арабинозой промотор (Invitrogen).

[0072] Типичные промоторы, подходящие для экспрессии в дрожжевых клетках, таких как, например, дрожжевая клетка, выбранная из группы, включающей Pichia pastoris, S. cerevisiae и S. pombe, включают в себя без ограничения промотор ADH1, промотор GAL1, промотор GAL4, промотор CUP1, промотор РН05, промотор nmt, промотор RPR1 или промотор TEF1.

[0073] Векторы экспрессии для экспрессии в дрожжевых клетках являются предпочтительными и включают в себя, например, вектор рАСТ (Clontech), вектор pDBleu-X, набор векторов pPIC (Invitrogen), набор векторов pGAPZ (Invitrogen), вектор pHYB (Invitrogen), вектор pYD-1 (Invitrogen) и векторы ТОРО pNMT-1, pNMT41, pNMT81 (Invitrogen), вектор pPC86-Y (Invitrogen), серию векторов pRH (Invitrogen), серию векторов pYESTrp (Invitrogen).

[0074] Предпочтительные векторы для экспрессии в клетках млекопитающих включают в себя, например, набор векторов pcDNA (Invitrogen), серию векторов pTARGET (Promega) и набор векторов pSV (Promega).

[0075] Подходящие способы трансформации и трансфекции клеток-хозяев можно найти в Sambrook et al. 2001 и других лабораторных пособиях. В одном примере нуклеиновые кислоты могут быть введены в прокариотические клетки с использованием, например, электропорации или опосредованной хлоридом кальция трансформации. В другом примере нуклеиновые кислоты могут быть введены в клетки млекопитающих с использованием, например, микроинъекции, копреципитации фосфатом кальция или хлоридом кальция, опосредованной DEAE-декстраном трансфекции, опосредованной липосомами трансфекции, например, с использованием липофектамина (Invitrogen) и/или целлфектина (Invitrogen), опосредованного PEG поглощения ДНК, электропорации, трансдукции аденовиусами, вирусами герпеса, тогавирусами или ретровирусами и бомбардировки микрочастицами, например, с использованием покрытых ДНК вольфрамовых или золотых частиц. В качестве альтернативы нуклеиновые кислоты могут быть введены в дрожжевые клетки с использованием обычных методов, таких как, например, электропорация и опосредованная PEG трансформация.

[0076] После получения/экспрессии/синтеза любой белок или пептид по настоящему изобретению можно очистить с помощью известного из уровня техники способа, такого как HPLC. См., например, Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994).

Клеточная экспрессия

[0077] Также в данном документе описана модифицированная клетка, содержащая любой из СРР или СРР, конъюгированных с молекулой, представляющей интерес, описанной в данном документе.

[0078] Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрена модифицированная клетка, содержащая СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательности, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, или СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательности, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, конъюгированные с молекулой, представляющей интерес.

[0079] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено применение СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательностей, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательностей, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, конъюгированных с молекулой, представляющей интерес, или модифицированной клетки, содержащей любое из них, при изготовлении лекарственного препарата или диагностического средства.

[0080] В некоторых примерах модифицированная клетка представляет собой прокариотическую клетку. В других примерах модифицированная клетка представляет собой эукариотическую клетку. Подходящие эукариотические клетки включают в себя дрожжевые клетки и клетки млекопитающих, в том числе без ограничения клетки человека. В некоторых примерах модифицированные клетки млекопитающих происходят из клеточной линии. Подходящие клеточные линии включают в себя без ограничения ARPE-19, СНО-K1, HEK-293, COS7, HeLa, N2a и NIH 3Т3.

[0081] В некоторых примерах модифицированная клетка экспрессирует один или несколько генетически кодируемых СРР или СРР, конъюгированных с молекулой, представляющей интерес. В других примерах модифицированная клетка представляет собой первичную клетку млекопитающего.

[0082] В других примерах модифицированная клетка не содержит экзогенных нуклеиновых кислот, кодирующих СРР или СРР, конъюгированных с молекулой, представляющей интерес, а модифицируется с помощью белковой трансдукции СРР или СРР, конъюгированного с молекулой, представляющей интерес.

[0083] Предпочтительно модифицированные клетки представляют собой эукариотические клетки. Более предпочтительно эукариотические клетки представляют собой клетки млекопитающих. Наиболее предпочтительно клетки млекопитающих представляют собой клетки человека. В некоторых примерах клетки человека представляют собой стволовые клетки человека. Такие стволовые клетки человека включают в себя без ограничения эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и мезенхимальные стволовые клетки. В дополнительных примерах клетки человека включают в себя без ограничения кардиомиоциты, нейроны, гепатоциты и островковые клетки поджелудочной железы. В других примерах клетки млекопитающих представляют собой раковые клетки (например, раковые клетки человека).

Применение

[0084] В настоящем изобретении также предусмотрено любое из СРР, СРР, конъюгированных с молекулой, представляющей интерес, или модифицированных клеток для применения в качестве лекарственного препарата или диагностического средства. В настоящем изобретении также предусмотрено любое из СРР, СРР, конъюгированных с молекулой, представляющей интерес, или модифицированных клеток для применения в изготовлении лекарственного препарата или диагностического средства.

[0085] Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрено применение СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательностей, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательностей, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, конъюгированных с молекулой, представляющей интерес, или модифицированной клетки, содержащей любое из них, при изготовлении лекарственного препарата или диагностического средства.

[0086] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено применение СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательностей, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательностей, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, конъюгированных с молекулой, представляющей интерес, или модифицированной клетки, содержащей любое из них, в качестве лекарственного препарата или диагностического средства.

[0087] Последовательности по настоящему изобретению могут характеризоваться на по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80% или 85% сходством и предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 90%, 95% или 98% сходством на аминокислотном уровне с SEQ ID NO: 1.

[0088] Предпочтительно СРР модифицирован с помощью одного или нескольких из следующего: использование неканонических аминокислот, жирных кислот, обнаруживаемых меток, олигонуклеотидов, холестерина и реакционноспособных групп.

[0089] Предпочтительно СРР конъюгирован с молекулой, представляющей интерес. Молекула, представляющая интерес, может быть выбрана из следующего: терапевтическое средство, олигонуклеотид, дополнительный пептид или белок, реакционноспособная группа, жирная кислота, холестерин или обнаруживаемая метка. Предпочтительно конъюгация осуществляется с помощью ковалентной связи или нековалентного взаимодействия.

Наборы

[0090] В настоящем изобретении также предусмотрен набор, содержащий СРР по настоящему изобретению и инструкции по применению.

[0091] Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрен набор, содержащий (i) СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательности, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, СРР под SEQ ID NO: 1, и последовательностей, которые характеризуются на по меньшей мере 60% сходством с SEQ ID NO: 1, конъюгированные с молекулой, представляющей интерес, или модифицированную клетку, содержащую любое из них; и (ii) инструкции по применению.

[0092] Последовательности по настоящему изобретению могут характеризоваться на по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80% или 85% сходством и предпочтительно на по меньшей мере приблизительно 90%, 95% или 98% сходством на аминокислотном уровне с SEQ ID NO: 1.

[0093] Предпочтительно СРР модифицирован с помощью одного или нескольких из следующего: использование неканонических аминокислот, жирных кислот, обнаруживаемых меток, олигонуклеотидов, холестерина и реакционноспособных групп.

[0094] Предпочтительно СРР конъюгирован с молекулой, представляющей интерес. Молекула, представляющая интерес, может быть выбрана из следующего: терапевтическое средство, олигонуклеотид, дополнительный пептид или белок, реакционноспособная группа, жирная кислота, холестерин или обнаруживаемая метка. Предпочтительно конъюгация осуществляется с помощью ковалентной связи или нековалентного взаимодействия.

Определения

[0095] Термин «каноническая аминокислота» относится к аминокислоте, кодируемой непосредственно кодонами универсального генетического кода. Каноническими аминокислотами являются: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутаминовая кислота, глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин и валин.

[0096] Термин «эндогенный» или «эндогенно кодируемый» в отношении нуклеотидной или аминокислотной последовательности указывает на то, что рассматриваемая последовательность является нативной в отношении вируса, клетки или организма, которые не были экспериментально модифицированы для кодирования или экспрессии рассматриваемой аминокислотной последовательности.

[0097] Термин «не встречающийся в природе» в отношении пептида будет пониматься как означающий, что: (i) эндогенный ген или открытая рамка считывания, кодирующие аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности рассматриваемого пептида, отсутствуют; и (ii) фрагмент эндогенного белка, аминокислотная последовательность которого состоит из рассматриваемого пептида, отсутствует. Например, пептид, состоящий из аминокислотной последовательности фрагмента эндогенно экспрессируемого белка, считается не встречающимся в природе пептидом, если сам фрагмент белка не экспрессируется естественным образом или обычно не представляет собой побочный продукт эндогенно экспрессируемого белка.

[0098] Предполагается, что термин «пептид» включает в себя соединения, состоящие из аминокислотных остатков, связанных амидными связями. Пептид может быть природным или не встречающимся в природе, кодируемым рибосомой или полученным синтетическим путем. Обычно пептид будет состоять из от 2 до 200 аминокислот. Например, пептид может характеризоваться длиной в диапазоне от 10 до 20 аминокислот, или от 10 до 30 аминокислот, или от 10 до 40 аминокислот, или от 10 до 50 аминокислот, или от 10 до 60 аминокислот, или от 10 до 70 аминокислот, или 10 аминокислот, до 80 аминокислот, или от 10 до 90 аминокислот, или от 10 до 100 аминокислот, в том числе любой длиной в пределах указанного (указанных) диапазона (диапазонов). Пептид может содержать менее чем приблизительно 150 аминокислот, или менее чем приблизительно 125 аминокислот, или менее чем приблизительно 100 аминокислот, или менее чем приблизительно 90 аминокислот, или менее чем приблизительно 80 аминокислот, или менее чем приблизительно 70 аминокислот, или менее чем приблизительно 60 аминокислот, или менее чем приблизительно 50 аминокислотами или состоять из них.

[0099] Пептиды, как обозначается в данном документе, включают в себя «обратные» пептиды, в которых все L-аминокислоты заменены соответствующими D-аминокислотами, и «ретро-обратные» пептиды, в которых последовательность аминокислот является обратной, и все L-аминокислоты кислоты заменены D-аминокислотами.

[00100] Пептиды могут содержать аминокислоты как в L-, так и в D-форме. Например, как L-, так и D-формы могут использоваться для разных аминокислот в одной и той же пептидной последовательности. В некоторых примерах аминокислоты в пептидной последовательности находятся в L-форме, такой как природные аминокислоты. В некоторых примерах аминокислоты в пептидной последовательности представляют собой комбинацию L- и D-формы. В некоторых примерах все аминокислоты в пептидной последовательности находятся в D-форме.

[00101] Пептиды могут быть синтезированы с использованием хорошо известных методик твердофазного синтеза пептидов и методик очистки.

[00102] Термин «белок» следует понимать как включающий одну полипептидную цепь, т.е. ряд смежных аминокислот, связанных пептидными связями, или ряд полипептидных цепей, ковалентно или нековалентно связанных друг с другом (т.е. полипептидный комплекс). Например, ряд полипептидных цепей может быть ковалентно связан с использованием подходящей химической связи или дисульфидной связи. Примеры нековалентных связей включают в себя водородные связи, ионные связи, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные взаимодействия.

Общее описание

[00103] Специалистам в данной области техники будет понятно, что настоящее изобретение, описанное в данном документе, допускает вариации и модификации, отличные от описанных конкретно. Настоящее изобретение включает в себя все такие варианты и модификации. Настоящее изобретение также включает в себя все стадии, характеристики, составы и соединения, упомянутые или указанные в настоящем описании, по отдельности или вместе, а также любые и все комбинации или любые две или более стадий или характеристик.

[00104] Каждый документ, ссылка, патентная заявка или патент, цитируемые в настоящем описании, явно включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме, что означает, что читатель должен читать и рассматривать их в качестве части настоящего описания. То, что документ, ссылка, заявка на патент или патент, цитируемые в настоящем описании, не повторяются в настоящем описании, выполнено только для краткости.

[00105] Любые инструкции производителя, описания, спецификации продуктов и таблицы продуктов для любых продуктов, упоминаемых в данном документе или в любом документе, включенном в данный документ посредством ссылки, тем самым включены в данный документ посредством ссылки и могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения на практике.

[00106] Настоящее изобретение не должно быть ограничено в объеме конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе. Данные варианты осуществления предназначены только для иллюстрации. Функционально равноценные продукты, составы и способы отчетливо находятся в объеме настоящего изобретения, как описано в данном документе.

[00107] Настоящее изобретение, описанное в данном документе, может включать в себя один или несколько диапазонов значений (например, размер, смещение, напряженность поля и т.д.). Под диапазоном значений следует понимать все значения в пределах диапазона, в том числе значения, определяющие диапазон, и значения, примыкающие к диапазону, которые приводят к тому же или практически такому же результату, что и значения, непосредственно примыкающие к тому значению, которое определяет границу диапазона. Соответственно, если не указано иное, числовые параметры, указанные в настоящем описании и формуле изобретения, представляют собой приближенные значения, которые могут варьироваться в зависимости от требуемых свойств, которые должны быть получены посредством настоящего изобретения. Следовательно, «приблизительно 80%» означает «приблизительно 80%», а также «80%». По меньшей мере каждый числовой параметр следует толковать с учетом количества значащих цифр и обычных подходов к округлению.

[00108] Во всем настоящем описании, если контекст не требует иного, слово «содержать» или варианты, такие как «содержит» или «содержащий», будут пониматься как подразумевающие включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение любого другого целого числа или группы целых чисел. Также отмечается, что в настоящем изобретении и, в частности, в формуле изобретения и/или пунктах, такие термины, как «содержит», «содержащийся», «содержащий» и т.п., могут иметь значение, приписываемое им в патентном праве США; например, они могут означать «включает в себя», «включавший в себя», «включающий в себя» и т.п.; и что такие термины, как «состоящий в основном из» и «состоит в основном из» имеют значение, приписываемое им в патентном праве США, например, они допускают использование элементов, не указанных в явном виде, но исключают элементы, которые встречаются в известном уровне техники или которые влияют на основную или новую характеристику настоящего изобретения.

[00109] Другие определения выбранных терминов, используемых в данном документе, могут быть найдены в подробном описании настоящего изобретения и применимы во всем тексте. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Термин «активное средство» может означать одно активное средство или может охватывать два или более активных средств.

[00110] Следующие примеры служат для более полного описания способа применения вышеописанного изобретения, а также для изложения наилучших предполагаемых способов осуществления различных аспектов настоящего изобретения. Следует понимать, что эти способы никоим образом не служат для ограничения фактического объема настоящего изобретения, а скорее представлены в иллюстративных целях.

ПРИМЕРЫ

[00111] Дополнительные характеристики по настоящему изобретению более полно описаны в следующих неограничивающих примерах. Настоящее описание включено исключительно в целях иллюстрации настоящего изобретения. Его не следует понимать как ограничение общего описания настоящего изобретения, как указано выше.

Пример 1

[00112] Потенциальные пептиды СРР связывали с фосфородиамидатным олигонуклеотидом (РМО), который нацеливается наэкзон 7 гена SMN1 (Flynn et al 2018), с использованием стимулируемой штаммом клик-химии (SPAAC) (Agard et al 2004, Dommerholt et al. 2016). Конъюгаты пептид-РМО инкубировали на клетках ARPE-19 в течение 2 дней в полной среде. Эффективность интернализации измеряли с помощью степени пропуска экзона 7 в транскрипте РНК гена SMN1 посредством экстракции РНК. Конъюгаты пептид-РМО с более высоким % транскрипта d7, чем при обработке РМО в отдельности, считались СРР.

Введение в анализ CPP-SMN1 in vitro

[00113] Ген выживаемости двигательных нейронов (SMN1) экспрессируется повсеместно и играет важную роль в сборке сплайсосомы и биогенезе рибонуклеопротеинов. Была объяснена регуляция сплайсинга гена SMN1 (Singh et al 2012). Вариант сплайсинга SMN1, в котором пропущен экзон-7, представляет собой известную изоформу, которая приводит к более короткому белку SMN, обозначаемому D7-SMN1. Пропуск экзонов с использованием проникающих в клетку пептидов, доставляемых морфолиновыми олигомерами с фосфородиамидатной группой (РМО), был признан перспективным способом тестирования эффективности СРР (Wu et al. 2007).

[00114] С использованием гена SMN1 нами был построен анализ пропуска экзона, нацеливающийся на ген SMN1 (Flynn et al 2018) в экзоне-7 с использованием морфолинового олигонуклеотид а с фосфородиамидатной группой (РМО), конъюгированного с различными СРР. Данный анализ использовали для идентификации СРР, которые могли бы эффективно доставлять полезную нагрузку РМО в ядро и вызывать пропуск экзонов SMN1. Эффективность доставки и функции определяли с помощью измерения изменений в транскрипте РНК D7-SMN1 с использованием экстракции РНК, образования cDNA и ПЦР с использованием специфических в отношении SMN1 праймеров. Эффективность интерпретировали таким образом, что более высоким был процент транскрипта D7-SMN1, тем более эффективной была доставка в ядро посредством СРР.

[00115] Учитывая характер этого анализа, характеристики природных L-пептидов являются нежелательными в связи с расщеплением протеазами в присутствии полных сред. Для адекватной оценки способности пептида представлять собой СРР, пептиды синтезировали либо в виде пептидов, содержащих смешанные L/D-аминокислоты, где все основные остатки представляли собой D-аминокислоты, либо в виде полностью содержащих D-аминокислоты пептидов. Оба подхода защищали пептиды от протеолитического расщепления во время инкубации на клетках.

Способы

Культура тканей млекопитающих

[00116] Клетки ARPE-19 получали из АТСС (АТСС® CRL-2302). Клеточные линии выдерживали во влажном инкубаторе при 37°С с 5% СО₂ и культивировали в полной среде (DMEM/F12 1:1, 10% FCS; 10 мМ HEPES, 1x GlutaMAX™, Pen/Strep 100 ЕД/мл; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США)

Синтез пептидов и РМО и конъюгация РРМО

[00117] СРР синтезировали с использованием стандартных способов на основе Fmoc SPPS (Pepscan GmbH, Lelystad, Нидерланды, и Mimotopes, Малгрейв, Виктория, Австралия). Все последовательности содержали С-концевой остаток азидолизина для того, чтобы сделать возможной связь с РМО; все N-концы ацетилировали, а С-концы амидировалины.

[00118] SMN1 РМО (ACTTTCCTTCTTTTTTATTTTGTCT) [SEQ ID NO: 2] с 5'-циклооктиновой ручкой производили компанией Gene Tools (Gene Tools LLC, Филомат, Орегон, США) с использованием способа, разработанного Summerton and Weller (1997).

[00119] Пептиды СРР с С-концевым азидолизином хемоселективно конъюгировали с 5'-циклооцитином РМО с использованием стимулируемой штаммом клик-химии (SPAAC; Agard et al. 2004; Dommerholt et al. 2016). Реакцию циклоприсоединения между азидо-функционализированным пептидом и циклооктин-функционализированным РМО проводили в течение 3-4 дней при 37°С в фосфатно-солевом буфере с 5% DMSO. Конъюгаты пептид-РМО (РРМО) отделяли от непрореагировавшего материала с помощью ионообменной хроматографии (IEX) и обессоливали. Конечные фракции анализировали с помощью аналитической HPLC с обращенной фазой и LC/MS.

Анализ эффективности SMN1 in vitro

[00120] Анализы с пропусками экзонов и обнаружение посредством PCR выполняли в соответствии с опубликованными протоколами (Mann et al 2002, Gene Med, 4, 644-654).

[00121] Иммортализованные клетки пигментного эпителия сетчатки (ARPE-19) обрабатывали различными концентрациями (4 мкМ, 2 мкМ, 1 мкМ, в двух повторностях) конъюгата СРР-РМО, и уровни транскриптов SMN1 оценивали через 48 часов после обработки посредством выделения и очистки РНК с последующим образованием cDNA и ПЦР.

[00122] Клетки высевали в 24-луночные планшеты (ARPE-19, 2,5×10⁴ клеток/лунка) в полной среде (DMEM/F12 1:1, 10% FCS; 10 мМ HEPES, 1x GlutaMAX™, Pen/Strep 100 ЕД/мл; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Клетки инкубировали в течение ночи (37°С, 5% CO₂) для обеспечения прикрепления клеток. В день анализа среду отсасывали и заменяли на СРР-РМО или РМО в отдельности, разведенные в среде для обработки (DMEM/F12 1:1, 10% FCS; 10 мМ HEPES, 1х GlutaMAX™, Pen/Strep 100 ЕД/мл; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), с последующей инкубацией (37°С, 5% СО₂) в течение 24 ч. На следующий день добавляли свежую среду в соотношении 1:1 и клетки возвращали в инкубатор еще на 24 ч.

[00123] Через 48 ч после обработки клеточную среду тщательно отсасывали и клетки промывали PBS. РНК из обработанных клеток получали с использованием коммерческих наборов для выделения РНК в соответствии с протоколом производителя (набор Bio-Rad Aurum total RNA 96; количественная оценка выхода РНК; набор Quant-iT RNA BR).

[00124] Экстрагированную РНК очищали, оценивали количественно и затем разбавляли до 10 нг/мкл. cDNA получали с использованием коммерческого набора для обратной транскрипции в соответствии с протоколом производителя (BioRad iScript). Полученную cDNA использовали в качестве матрицы с праймерами, предназначенными для амплификации области, представляющей интерес, с самплификацией ДНК. Эффективность пропуска экзонов определяли с помощью количественной оценки полной длины (FL SMN1) и фрагмента с пропуском экзона-7 (D7-SMN1) гена SMN1 (анализатор нуклеиновых кислот LC-GX) и расчета процента. Чем более высоким был процент ДНК D7-SMN1, тем более высокой была эффективность доставки СРР.

Анализ жизнеспособности SMN1 in vitro

[00125] Клетки высевали в 96-луночные планшеты (ARPE-19, 4×10³ клеток/лунка) в полной среде (DMEM/F12 1:1, 10% FCS; 10 мМ HEPES, 1x GlutaMAX™, Pen/Strep 100 ЕД/мл; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Клетки инкубировали в течение ночи (37°С, 5% СО₂) для обеспечения прикрепления клеток. В день анализа среду отсасывали и заменяли на СРР-РМО или РМО в отдельности, разведенные в среде для обработки (DMEM/F12 1:1, 10% FCS; 10 мМ HEPES, 1x GlutaMAX™, Pen/Strep 100 ЕД/мл; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) при различных концентрациях (32, 16, 8, 4, 2 и 1 мкМ), с последующей инкубацией (37°С, 5% СО₂) в течение 24 ч. На следующий день добавляли свежую среду в соотношении 1:1 и клетки возвращали в инкубатор еще на 24 ч.

[00126] Через 48 ч после обработки жизнеспособность клеток измеряли с использованием коммерческого анализа для оценки жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, Австралия). Вкратце, реагент CellTiter-Glo лизирует клетки и генерирует люминесцентный сигнал, пропорциональный количеству присутствующей АТФ, которое, в свою очередь, прямо пропорционально количеству живых клеток, присутствующих в культуре. Все анализы проводили с помощью известного цитотоксического средства мелиттина (Renata et al. 2007), и контроля только в виде клеток. Жизнеспособность клеток использовали для определения уровня токсичности, вызываемой конъюгатами СРР-РМО, где высокая жизнеспособность соответствует низкой токсичности, а низкая жизнеспособность соответствует высокой токсичности соответственно.

Результаты

[00127] На Фиг. 1 и в Табл. 1 в дозе 4 мкМ, 2 мкМ и 1 мкМ СРР под SEQ ID NO: 1, конъюгированный с РМО SMN1, приводит к образованию более усеченного транскрипта D7-SMN1, чем РМО SMN1 в отдельности. Эффективность индуцированного пропуска экзона SMN1 соответствует кривой доза-ответ для применяемого конъюгата пептид-РМО. Конъюгат пептид-РМО является более эффективным (в 1,2 раза в дозе 2 мкМ) в индукции пропуска экзонов SMN1, чем обработка SMN1 РМО в отдельности. Таким образом, пептид, описанный под SEQ ID NO: 1, представляет собой эффективное средство для проникновения в клетку и доставку в ядро.

[00128] На Фиг. 2 и в Табл. 2 жизнеспособность клеток ARPE-19, обработанных конъюгатом пептид-РМО, по сравнению с РМО в отдельности в дозе 32 мкМ в течение 48 часов, отчетливо демонстрирует, что добавление конъюгата пептид-РМО является менее вредным (в 1,05 раза) в отношении жизнеспособности клеток, чем РМО в отдельности. Это указывает на то, что действия пептида по проникновению в клетку и доставку в ядро не являются вредными для нормального функционирования клеток и не вызывают характерной токсичности, обычно ассоциированной с проникающими в клетку катионными пептидами.

Пример 2

[00129] Анализ эффективности SMN1 in vitro, описанный в Примере 1, в равной степени применим к условиям in vivo, учитывая универсальное распространение гена Smn в организме мыши, при этом Smn представляет собой мышиный ортолог SMN1 человека. Использование природных L-пептидов является нежелательным в условиях in vivo в связи с наличием в организме большого количества протеаз. Для адекватной оценки способности пептида проникать в клетку пептиды синтезировали либо в виде пептидов, содержащих смешанные L/D-аминокислоты, где все основные остатки представляли собой D-аминокислоты, либо в виде полностью содержащих D-аминокислоты пептидов. Оба подхода формировали для защиты пептидов от протеолитического расщепления при системном введении животным.

[00130] Способность СРР-РМО доставлять полезную нагрузку Smn in vivo в клетку RPE позже в глазу оценивали с помощью введения в стекловидное тело мышей и измерения изменения уровней транскриптов Smn в слоях клеток сетчатки, RPE и сосудистой оболочки глаза через 5, 7, 21 и 28 дней. СРР по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 1) и контрольный СРР Pip6a (SEQ ID NO: 3), конъюгированный с Smn РМО (SEQ ID NO: 2), вводили путем интравитреальной инъекции в дозе 1,6 мкг (0,5 мкл объема) на глаз. В требуемой временной точке после обработки животных выбраковывали и иссекали глаза, гомогенизировали слои тканей и экстрагировали РНК с использованием того же протокола, что и в Примере 1.

[00131] Контрольный СРР Pip6a содержит не встречающиеся в природе аминокислоты (X и В):

RXRRBRRXRYQFLIRXRBRXRB [SEQ ID NO: 3],

Arg Ahx Arg Arg бета-Ala Arg Arg Ahx Arg Tyr Gin Phe Leu He Arg Ahx Arg бета-Ala

Arg Ahx Arg бета-Ala

X=Ahx = аминогексановая кислота; В = бета-Ala = бета-аланин

[00132] Эффективность доставки и функции в различных органах определяли с помощью измерения изменения транскрипта РНК Smn от полной длины до транскрипта РНК с фрагментом пропущенного экзона 7 (D7-Smn) с использованием экстракции РНК, образования cDNA и ПЦР с использованием специфических в отношении Smn праймеров. Эффективность интерпретировали таким образом, что чем более высоким был процент транскрипта D7-Smn, тем более эффективной была доставка в ткань посредством СРР.

[00133] Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) представляет собой белок цитоскелета промежуточных филаментов. Уровни GFAP значительно зависят от повреждения или стресса в некоторых типах клеток, и экспрессия GFAP стала важным маркером повреждения в центральной нервной системе. В глазе клетки глии Мюллера обычно экспрессируют низкие уровни GFAP, которые значительно повышаются после повреждения сетчатки. Пептиды, которые вызывают относительно повышенную экспрессию GFAP после введения в стекловидное тело (IVT), считаются более токсичными.

Способы

Синтез пептидов и РМО и конъюгация пептид-РМО

[00134] СРР синтезировали с использованием стандартных способов на основе Fmoc SPPS (Pepscan GmbH, Lelystad, Нидерланды, и Mimotopes, Малгрейв, Виктория, Австралия). Все последовательности содержали С-концевой остаток азидолизина для того, чтобы сделать возможной связь с РМО; все N-концы ацетилировали, а С-концы амидировалины.

[00135] Smn РМО (ACTTTCCTTCTTTTTTATTTTGTCT; SEQ ID NO: 2) с 5'-циклооктиновой ручкой производили компанией Gene Tools (Gene Tools LLC, Филомат, Орегон, США)

[00136] Пептиды СРР с С-концевым азидолизином хемоселективно конъюгировали с 5'-циклооцитином РМО с использованием стимулируемой штаммом клик-химии (SPAAC; Agard et al. 2004; Dommerholt et al. 2016), очищали с помощью ионообменной хроматографии и количественно оценивали с помощью LC-MS.

Анализ эффективности Smn in vivo (IVT введение)

[00137] Анализы с пропусками экзонов и обнаружение посредством RT-PCR выполняли в соответствии с опубликованными протоколами (Mann et al 2002, Gene Med, 4, 644-654).

[00138] Мыши (C57B/6; в возрасте 7 недель) получали от компании Australian BioResources (ABR). Выбранные СРР-РМО вводили в стекловидное тело в дозе 1,6 мкг (0,5 мкл) на глаз, от одной до трех мышей на группу обработки.

[00139] Через 48 часов после обработки мышей выбраковывали и собирали следующие глазные ткани; сетчатку, слой RPE или RPE/сосудистую оболочку глаза в комбинации. Ткани гомогенизировали и получали РНК с использованием коммерческих наборов для выделения РНК в соответствии с протоколом производителя (набор Bio-Rad Aurum total RNA 96; количественная оценка выхода РНК; набор Quant-iT RNA BR).

[00140] Экстрагированную РНК очищали, оценивали количественно и затем разбавляли до 10 нг/мкл. cDNA получали с использованием коммерческого набора для обратной транскрипции в соответствии с протоколом производителя (BioRad iScript). Полученную cDNA использовали в качестве матрицы с праймерами, предназначенными для амплификации области, представляющей интерес, с самплификацией ДНК. Эффективность пропуска экзонов определяли с помощью количественной оценки полной длины (FL Smn) и фрагмента с пропуском экзона-7 (D7-Smn) гена Smn (анализатор нуклеиновых кислот LC-GX) и расчета процента. Чем более высоким был процент ДНК D7-Smn, тем более высокой была эффективность доставки СРР.

Анализ токсичности в отношении GFAP in vivo

[00141] Экспрессию mRNA GFAP оценивали количественно посредством амплификации cDNA, полученной в виде части анализа эффективности Smn in vivo, описанного выше. ddPCR выполняли с использованием генератора и капель BioRad и ридера (QX200 DG8), а также термоциклеров (Т100), специфических зондов для мышиного Gfap (dMmuCPE5116126) и генов домашнего хозяйства Gapdh, Eefla1 и Rp127 (dMmuCPE5195283, dMmuCPE5101732 и dMmuCPES 197083), а также мастер-микса ddPCR для зондов (№1863024) и другие расходные материалы для ddPCR от BioRad (№1863005, 12001925, 1863004, 1864007).

[00142] Результаты анализа получали с помощью программного обеспечения BioRad ddPCR в копиях/мкл. Затем их нормализовали в отношении генов домашнего хозяйства для сравнения между экспериментами. Пептиды, которые вызывают относительно повышенную экспрессию GFAP, считаются более токсичными.

Результаты

[00143] На Фиг. 3 и 4 и в Табл. 3 и 4 СРР под SEQ ID NO: 1, конъюгированный с Smn РМО, приводит к образованию более усеченного транскрипта D7-Smn, чем Smn РМО в отдельности. Конъюгат пептид-РМО является более эффективным в индукции пропуска экзонов Smn, чем обработка Smn РМО в отдельности, или конкурент СРР Pip6a (Betts et. al. 2012). Таким образом, пептид, описанный под SEQ ID NO: 1, представляет собой эффективное средство in vivo для проникновения в клетку и доставку в ядро.

[00144] На Фиг. 5 и в Табл. 5 СРР под SEQ ID NO: 1, конъюгированный с Smn РМО, вызывает очень незначительную экспрессию GFAP, не выше, чем РМО в отдельности через 5 дней, и намного ниже, чем конкурент СРР Pip6a. Таким образом, пептид, описанный под SEQ ID NO: 1, считается нетоксичным in vivo при интравитреальном введении в клинически значимых концентрациях.

Литературные источники:

• Verdurmen WPR, Thanos M, Ruttekolk IR, Gulbins E, Brock R. Cationic cell-penetrating peptides induce ceramide formation via acid sphingomyelinase: implications for uptake. J Control Release. 2010; 147: 171-179. doi: 10.1016/j.jconrel.2010.06.030.

• Zakeri, В.; Fierer, J.O.; Celik, E.; Chittock, E.C.; Schwarz-Linek, U.; Moy, V.T.; Howarth, M. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, E690-E697

• Milech, N.; Longville, B.A.C.; Cunningham, P.Т.; Scobie, M.N.; Bogdawa, H.M.; Winslow, S.; Anastasas, M.; Connor, Т.; Ong, F.; Stone, S.R.; et al. GFP-complementation assay to detect functional CPP and protein delivery into living cells. Sci. Rep. 2015, 5, 18329.

• Stone, S. R. et al. p-Lactamase tools for establishing cell internalization and cytosolic delivery of cell penetrating peptides. Biomolecules%, 51-62 (2018).

• Hoffmann K, Milech N, Juraja SM, Cunningham PT, Stone SR, Francis RW, Anastasas M, Hall CM, Heinrich T, Bogdawa HM, Winslow S, Scobie MN, Dewhurst RE, Florez L, Ong F, Kerfoot M, Champain D, Adams AM, Fletcher S, Viola HM, Hool LC, Connor T, Longville ВАС, Tan YF, Kroeger K, Morath V, Weiss GA, Skerra A, Hopkins RM, Watt PM. A platform for discovery of functional cell-penetrating peptides for efficient multi-cargo intracellular delivery. Sci Rep. 2018 Aug 22; 8 (1): 12538. doi: 10.1038/s41598-018-30790-2. PMID: 30135446; PMCID: PMC6105642.

• Guidotti G, Brambilla L, Rossi D. Cell-penetrating peptides: from basic research to clinics. Trends Pharmacol Sci. 2017; 38: 406-424. doi: 10.1016/j.tips.2017.01.003.

• van den Berg A, Dowdy SF. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr Opin Biotechnol. 2011; 22: 888-893. doi: 10.1016/j.copbio.2011.03.008.

• Erazo-Oliveras A, et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat Methods. 2014; 11: 861-867. doi: 10.1038/nmeth.2998.

• Wu et al. Cell-penetrating peptides as transporters for morpholino oligomers: effects of amino acid composition on intracellular delivery and cytotoxicity, Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 15: 5182-5191 doi: 10.1093/nar/gkm478

• Singh NN, Seo J, Rahn SJ, Singh RN (2012) A Multi-Exon-Skipping Detection Assay Reveals Surprising Diversity of Splice Isoforms of Spinal Muscular Atrophy Genes. PLoS One 7 (11): e49595. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049595

• Summerton, J. & Weller, D., 1997. Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties. Antisense & nucleic acid drug development, 7 (3), pp. 187-195

• Moulton, H.M. et al., 2004. Cellular uptake of antisense morpholino oligomers conjugated to arginine-rich peptides. Bioconjugate chemistry, 15 (2), pp. 290-299.

• Dommerholt, J., Rutjes, F.P.J.T. & Delft, F.L., 2016. Strain-Promoted 1,3-Dipolar Cycloaddition of Cycloalkynes and Organic Azides. Topics in Current Chemistry, 374 (2), pp. 1-20.

• Agard, N.J., Prescher, J.A. & Bertozzi, C.R., 2004. A strain-promoted [3+2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society, 126(46), pp. 15046-15047

• Roman C. Hillig, Brice Sautier, Jens Schroeder, Dieter Moosmayer, Andre Hilpmann, Christian M. Stegmann, Nicolas D. Werbeck, Hans Briem, Ulf Boemer, Joerg Weiske, Volker Badock, Julia Mastouri, Kirstin Petersen, Gerhard Siemeister, Jan D. Kahmann, Dennis Wegener, Niels Bohnke, Knut Eis, Keith Graham, Lars Wortmann, Franz von Nussbaum, and Benjamin Bader

• PNAS February 12, 2019 116 (7) 2551-2560; first published January 25, 2019 https://doi.org/10.1073/pnas.1812963116

• Leshchiner ES, Parkhitko A, Bird GH, Luccarelli J, Bellairs JA, Escudero S, Opoku-Nsiah K, Godes M, Perrimon N, Walensky LD. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proc Natl Acad Sci USA. 2015 Feb 10; 112 (6): 1761-6. doi: 10.1073/pnas. 1413185112. Epub 2015 Jan 26. PMID: 25624485; PMCID: PMC4330742.

• Shanshan Gu, Danrui Cui, Xiaoyu Chen, Xiufang Xiong, and Yongchao Zhao, PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery, BioEssays, 40 (4), 2018, https://doi.org/10.1002/bies.201700247

• K.M. Sakamoto, K.B. Kim, A. Kumagai, F. Mercurio, С.M. Crews, R.J. Deshaies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 8554.

• Renata M.S. Terra, Jorge A. Guimaraes, Hugo Verli, Structural and functional behavior of biologically active monomeric melittin, (2007,) Journal of Molecular Graphics and Modelling, 25 (6): 767-772

• Chandler, R., Tarasenko, Т., Cusmano-Ozog, K. et al. Liver-directed adeno-associated virus serotype 8 gene transfer rescues a lethal murine model of citrullinemia type 1. Gene Ther 20, 1188-1191 (2013) doi:10.1038/gt.2013.53

• Stone, S.R. et al. p-Lactamase tools for establishing cell internalization and cytosolic delivery of cell penetrating peptides. Biomolecules S, 51-62 (2018).

• Quinonez SC, Thoene JG. Citrullinemia Type I. 2004 Jul 7 [Updated 2016 Sep 1]. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., editors. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. Доступно по адресу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1458/

• Flynn LL, Mitrpant C, Pitout IL, Fletcher S, Wilton SD. Antisense Oligonucleotide-Mediated Terminal hitron Retention of the SMN2 Transcript. Mol Ther Nucleic Acids. 2018 Jun 1; 11: 91-102. doi: 10.1016/j.omtn.2018.01.011. Epub 2018 Jan 31. PMID: 29858094; PMCID: PMC5854547.

• Betts, C, Saleh, A. F., Arzumanov, A. A., Hammond, S. M., Godfrey, C, Coursindel, Т., et al. (2012). Pip6-PMO, A New Generation of Peptide-oligonucleotide Conjugates With Improved Cardiac Exon Skipping Activity for DMD Treatment. Molecular Therapy - Nucleic Acids, 1, e38-13. http://doi.org/10.1038/mtna.2012.30.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PYC Therapeutics Limited

<120> 285492 CPP PCT

<130> 285492

<160> 3

<170>PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 22

<212>Белок

<213>синтетический

<400> 1

Arg Arg Ser Arg Thr Ala Arg Ala Gly Arg Pro Gly Arg Asn Ser Ser Arg Pro

Ser Ala Pro Arg

1 5 10 15 20

<210> 2

<211> 25

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

actttccttcttttttattttgtct 25

<210> 3

<211> 22

<212>Белок

<213>синтетический

<220>

<221>misc_feature

<222> (2)..(2)

<223>Ahx представляет собой аминогексановую кислоту

<220>

<221>misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> бета-Ala представляет собой бета-аланин

<220>

<221>misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> бета-Ala представляет собой бета-аланин

<220>

<221>misc_feature

<222> (16)..(16)

<223>Ahx представляет собой аминогексановую кислоту

<220>

<221>misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> бета-Ala представляет собой бета-аланин

<220>

<221>misc_feature

<222> (20)..(20)

<223>Ahx представляет собой аминогексановую кислоту

<400> 3

Arg Ahx Arg Arg beta-Ala Arg Arg Ahx Arg Tyr Gln Phe Leu Ile Arg Ahx Arg

beta-Ala Arg Ahx Arg beta-Ala

1 5 10 15

<---

Claims (11)

1. Выделенный не встречающийся в природе проникающий в клетку пептид (CPP), где:

(1) аминокислотная последовательность указанного СРР соответствует SEQ ID NO: 1 или аминокислотной последовательности с по меньшей мере 90% сходством с SEQ ID NO: 1;

(2) аминокислоты в последовательности указанного пептида представляют собой комбинацию L- и D-формы или все находятся в D-форме; и

(3) указанный СРР способен транслоцироваться через клеточную мембрану млекопитающих с проникновением в клетку млекопитающих.

2. CPP по п. 1, где все аминокислоты в последовательности пептида находятся в D-форме.

3. CPP по п. 1, где аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 95% сходством с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.

4. СРР по любому из пп. 1-3, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1.

5. CPP по п. 1, где аминокислоты в последовательности пептида представляют собой комбинацию L- и D-формы.

6. Применение СРР по любому из пп. 1-5 для доставки полезной нагрузки в клетку млекопитающего.

7. Применение по п. 6, где полезная нагрузка включает антисмысловой олигомер.

8. Применение по п. 7, где антисмысловой олигомер представляет собой антисмысловой морфолиновый олигомер (PMO).