RU2855110C1 - Трансплантат для восстановления хряща и кости субъекта и способ его изготовления - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу изготовления трансплантата для восстановления хряща и кости субъекта на основании клеточных сфероидов, содержащих аутологичные клетки надкостницы, а также к трансплантату для восстановления хряща и кости субъекта, включающему клеточные сфероиды, содержащие аутологичные клетки субпериостальной регенерационной бластемы надкостницы, полученные из надкостницы с использованием костного ин виво биореактора, заполненного гиалуроновой кислотой и сурамином. Изобретение обеспечивает создание трансплантата, на основе клеточных сфероидов из культивированных или некультивированных клеток субпериостальной бластемы, для эффективного восстановления хрящей и костей, в том числе восстановления субхондральной кости с покрывающим ее гиалиновым хрящом, обладающих выраженным регенеративным потенциалом, достаточным для регенерации поврежденного внутрисуставной части кости. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 пр.

Description

Область техники

Группа изобретений относится к области биомедицины, а именно к регенеративной медицине и бесскаффолдной тканевой инженерии, и может найти применение в травматологии и ортопедии, пластической хирургии, детской хирургии, челюстно-лицевой хирургии, стоматологии и отоларингологии, более конкретно группа изобретений относится к трансплантату для восстановления хряща и кости субъекта на основании клеточных сфероидов, содержащих аутологичные клетки надкостницы, а также к способу его изготовления.

Уровень техники

Известна плохая собственная способность комплекса суставного хряща и субхондральной кости к восстановлению. Травмы или костно-суставные заболевания часто ведут к повреждению суставного хряща, часто наблюдается последующая деградация хрящевого покрытия суставной поверхности, иногда затрагивающая и разрушающая субхондральную кость. Проявлением регрессивных изменений хряща служит его обызвествление (кальцинация, или минерализация), а также замещение дегенеративно измененной хрящевой ткани костной, происходит нарастание патоморфологических изменений суставной поверхности кости. Предполагают, что крайне слабая способность суставного хряща к репаративной регенерации связана с отсутствием сосудистой сети, которая не может обеспечить проникновение клеток-предшественников из крови, костного мозга в хрящевую ткань. Соответственно, присутствующие в хряще хондроциты, замурованные в окружающем естественном и интактном матриксе, не мигрируют в очаги поражения для регенерации и продукции нового тканеспецифического матрикса.

Ограниченные возможности спонтанного восстановления и отсутствие эффективных фармакологических средств, действующих на регенеративную способность хряща, побуждают ученых к поиску новых хирургических методов восстановления суставного хряща с использованием как тканевых, так и клеточных трансплантатов. Распространено мнение, что ни один из современных подходов к восстановлению хряща пока не позволил создать полноценную и долговременно функционирующую живую замену (регенерат) утраченному гиалиновому хрящу. Повреждение хряща в результате остеоартрита (ОА) всегда распространяется на субхондральную кость. Это имеет большое значение для одновременной регенерации двух тканей хряща и субхондральной кости.

В регенеративной медицине одной из основных проблем является поиск оптимального источника клеточного материала.

Известно, что надкостница обладает хондрогенным потенциалом, что позволяет восстанавливать или регенерировать хрящ с ее участием в поврежденных суставах, более того целые периостальные эксплантаты позволяют изучать хондрогенез в лабораторных условиях вне живого организма.

Собственная надкостница вместе с культурой аутологичных хондроцитов (оригинальная техника периостального лоскута с имплантацией аутологичных хондроцитов (ACI-P)) используется для лечения изолированных полнослойных дефектов хряща коленного сустава. Причем по эффективности метод не уступает более современной технологии матрикс-ассоциированной имплантации аутологичных хондроцитов (MACI) в любой момент проспективного наблюдения (Barié A, Kruck P, Sorbi R, Rehnitz C, Oberle D, Walker T, Zeifang F, Moradi B. Prospective Long-term Follow-up of Autologous Chondrocyte Implantation With Periosteum Versus Matrix-Associated Autologous Chondrocyte Implantation: A Randomized Clinical Trial. Am J Sports Med. 2020 Jul;48(9):2230-2241. doi: 10.1177/0363546520928337. PMID: 32667270).

Несмотря на многолетнюю историю клинического применения ACI-P, клеточное происхождение регенерированной ткани после периостальной трансплантации четко установлено не было. С целью изучения клеточного происхождения регенерированной ткани после периостальной трансплантации в эксперименте на крысах свободную надкостницу собирали из большеберцовой кости 10-недельных животных, экспрессирующих трансгенный зеленый флуоресцентный белок (GFP-), экспрессирующий трансгенные крысы Sprague Dawley (SD), и трансплантировали на полнослойные дефекты суставного хряща борозды надколенника у нормальных 10-недельных крыс SD. Надкостницу подшивали расположив слоем камбия к дефекту. Восстановленную ткань оценивали гистологически и гистохимически через 4 и 8 недель. GFP-положительные клетки, полученные из надкостницы донора, можно было легко обнаружить в восстановленной ткани с помощью флуоресцентного микроскопа. Через 4 и 8 недель после трансплантации вся площадь дефектов была устранена, при этом регенеративная ткань хорошо окрашивалась гистологически сафранином-О. Большинство клеток во всей области регенерированной ткани были GFP-положительными, что указывает на то, что очень немногие из клеток были GFP-негативными клетками, происходящими от крыс-реципиентов. Этот эксперимент убедительно демонстрирует, что большинство клеток в регенерированной ткани после периостальной трансплантации с использованием животных моделей происходят не из клеток хряща реципиента, а из периостальных клеток донора (Shinomiya R, Ochi M, Adachi N, Hachisuka H, Natsu K, Yasunaga Y. The cellular origin of cartilage-like tissue after periosteal transplantation of full-thickness articular cartilage defects: an experimental study using transgenic rats expressing green fluorescent protein. Acta Orthop. 2005 Dec;76(6):920-6. doi: 10.1080/17453670610046109. PMID: 16470452).

Использование клеточной трансплантации - пересадок хондроцитов не привело к получению идентичному интактному суставного хряща. Среди возможных объяснений, полученных при использовании современных методов клеточного восстановления хряща, является отсутствие интеграции хондроцитов с существующим хрящом и субхондральной костью. Вероятно, это связано с недостаточной способностью имплантированных клеток секретировать хрящевой матрикс и воспроизводить сложные события регенеративного ремоделирования хрящевой ткани. Отсутствие интеграции хондроцитов также может быть связано с неполной дифференцировкой хондрогениторных клеток или нестабильностью хондроцитарного фенотипа культивированных клеток. Имплантация недифференцированных клеток уже применялась у людей, и хотя через один-пять лет наблюдалось значительное улучшение результатов лечения пациентов, дефекты заполнялись фиброзно-хрящевой тканью. Известна проблема утечки клеточной суспензии может быть причиной потери или снижения жизнеспособности имплантированных клеток. Таким образом, клеточная терапия доказала свою осуществимость, но не показала превосходства над другими хирургическими методами в долгосрочной перспективе, что подчеркивает острую необходимость оптимизации различных комбинаций типов клеток, каркасов и/или хондрогенных факторов для ремонта и восстановления гиалиновых хрящей (Vinatier C, Bouffi C, Merceron C, Gordeladze J, Brondello JM, Jorgensen C, Weiss P, Guicheux J, Noël D. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy. Curr Stem Cell Res Ther. 2009 Dec;4(4):318-29. doi: 10.2174/157488809789649205. PMID: 19804369; PMCID: PMC3218613).

Наличие хондрогенного потенциала надкостницы связано с тем, что камбиальный слой надкостницы содержит клетки-предшественники хондроцитов, которые образуют хрящ во время развития конечностей и в период их роста при внутриутробном развитии, и делают это еще раз во время заживления костных переломов. Преимущества полнослойных периостальных трансплантатов для восстановления хряща заключаются в том, что эта соединительнотканная оболочка костей отвечает трем основным требованиям тканевой инженерии, одновременно является: источником клеток, каркасом для их доставки и удержания, а также источником местных факторов роста. Данные исследований in vivo показывают, что из надкостницы, трансплантированной в костно-хрящевые суставные дефекты, образуется хрящ, способный восстанавливать суставной хрящ, а в субхондральной области замещаться костью. Эта способность определяется искусственными факторами, такими как ориентация слоя камбия при пересадке, механобиологическими факторами, такими как использование непрерывного пассивного движения в послеоперационном периоде, а также возрастом животной модели. Исследования in vitro показали, что хондрогенный потенциал периостальных эксплантов определяется условиями культивирования клеток, особенностями донора и техническими факторами. Хондрогенез оптимизируют путем суспендирования эксплантов в агарозе в аэробных условиях с добавлением в среду фетальной телячьей сыворотки и факторов роста, в частности, трансформирующего фактора роста-бета 1. Роль физических факторов в настоящее время исследуется, установлено, что механическая среда имеет крайне важное значение. Важными донорскими факторами являются место забора трансплантата, размер периостального эксплантата и, что наиболее важно, возраст донора, так как клеточный состав надкостницы зависим от возраста (O'Driscoll SW. Articular cartilage regeneration using periosteum. Clin Orthop Relat Res. 1999 Oct;(367 Suppl):S186-203. doi: 10.1097/00003086-199910001-00020. PMID: 10546647).

Исследование клеточных событий на ранних стадиях периостального хондрогенеза и остеогенеза, вызванных переломом костей, произведено на хорошо стандартизированной модели перелома ребра у мышей. Установлено, что первоначальное клеточное событие проявлялось значительной пролиферацией в более глубоком слое, называемом «камбиальным слоем» надкостницы, о чем свидетельствуют многочисленные пролиферирующие клетки, положительные по ядерному антигену. Затем периостальный хрящ и кость регенерировали непосредственно из области наиболее дифференцированных клеток, т. е. зрелых остеобластов слоя камбия как вблизи, так и вдали от места перелома. Таким образом, периостальные остеобласты, по-видимому, обладают потенциалом дифференцироваться в хондрогенные и остеобластические линии. Таким образом, при начальных клеточных событиях в ответ на перелом кости возможна периостальная дифференцировка остеобластов в хондрогенную линию и участие остеоцитов в периостальном хряще и регенерации кости (Li M, Amizuka N, Oda K, Tokunaga K, Ito T, Takeuchi K, Takagi R, Maeda T. Histochemical evidence of the initial chondrogenesis and osteogenesis in the periosteum of a rib fractured model: implications of osteocyte involvement in periosteal chondrogenesis. Microsc Res Tech. 2004 Jul 1;64(4):330-42. doi: 10.1002/jemt.20088. PMID: 15481050).

Помимо очевидной остеогенной способности надкостницы, ее также можно использовать для стимулирования образования хряща, но для этого необходимо использовать особые локальные условия для регенерации, в том числе, хондротрофные условия или создать их подобие. В эксперименте на животных моделях свободные периостальные трансплантаты переносили на полностью хондрэктомированные суставные поверхности надколенников овец, наблюдали преобразование пересаженных фрагментов надкостницы в хрящи, возможно, надкостница реконструируется и становится частью регенерированного хряща. Одним из важнейших факторов, способствующих хондрогенезу в этом эксперименте признано движение суставов (Ritsilä VA, Santavirta S, Alhopuro S, Poussa M, Jaroma H, Rubak JM, Eskola A, Hoikka V, Snellman O, Osterman K. Periosteal and perichondral grafting in reconstructive surgery. Clin Orthop Relat Res. 1994 May;(302):259-65. PMID: 8168311).

В более ранних исследованиях периостальной трансплантации достоверно установлено, что формирование кости происходило энхондрально, т. е. через интерфазу хряща. Это может быть связано с быстротой пролиферации примитивных остеогенных клеток, поскольку васкуляризация происходила медленнее. Под влиянием низкого напряжения кислорода возникает тенденция у остеопрогениторных клеток дифференцироваться в фиброзные или хрящевые клетки (Poussa M, Rubak J, Ritsilä V. Differentiation of the osteochondrogenic cells of the periosteum in chondrotrophic environment. Acta Orthop Scand. 1981 Jun;52(3):235-9. doi: 10.3109/17453678109050098. PMID: 7282318).

Проблемой использования надкостницы как источника клеточного материала является изменение ее строения и клеточного состава в онтогенезе человека, в том числе и при старении. Известно, например, что к пожилому возрасту исчезает камбиальный слой надкостницы. Встает вопрос об установлении потенциал клеток, полученных из надкостницы человека пожилых пациентов, в качестве источника клеток для инженерии хрящевой ткани. Пригодна ли надкостница пожилых для дальнейшей переработки, можно ли путем оптимизации условий культивирования как для пролиферации, так и для дифференцировки добиться получения клеточного материала с достаточным регенеративным потенциалом. Надкостница была получена из большеберцовых костей девяти пациентов. Биопсии были подготовлены для обычного гистологического исследования. Клеткам, полученным из надкостницы, давали возможность вырасти из оставшейся ткани и размножали их в минимально необходимой среде, содержащей D-валин (MEM-DV). Для изучения пролиферации добавляли фетальную бычью сыворотку (FBS) или ее заменители, фактор роста фибробластов-2 (FGF-2), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1) и заменимые аминокислоты. Для дифференциации клеток использовали бессывороточную среду, дополненную одной или несколькими изоформами трансформирующего фактора роста-бета (TGF-b) и/или IGF-1. Образцы анализировали на экспрессию коллагенов типов I, II и X с помощью конкурентной RT-PCR, иммуногистохимически и гистологически с использованием окрашивания альциановым синим. Во всех образцах слой камбия практически не был обнаружен. Клетки надкостницы пролиферировали в сыворотке, содержащей MEM-DV. Оптимальная пролиферация была обнаружена, когда в эту среду добавляли 100 нг/мл FGF-2 и заменимые аминокислоты. Хондрогенез был обнаружен в 59% микромасс, культивированных с изомерами TGF-b, и в 83% образцов, культивированных в средах, к которым были добавлены две изоформы TGF-b. Удалось установить, что надкостница пожилых людей (средний возраст 66 лет, диапазон 41-76 лет), хотя обладает сниженными клеточностью и хондрогенным потенциалом, но при соблюдении определенных условий работы с клеточным материалом может быть рассмотрена, как привлекательный источник клеток для инженерии хрящевой ткани. Например, расширение клеток в культуральной питательной среде MEM-DV может способствовать отбору клеток-предшественников, что приведет к более высокому выходу хряща для применения в тканевой инженерии (Jansen EJ, Emans PJ, Guldemond NA, van Rhijn LW, Welting TJ, Bulstra SK, Kuijer R. Human periosteum-derived cells from elderly patients as a source for cartilage tissue engineering? J Tissue Eng Regen Med. 2008 Aug;2(6):331-9. doi: 10.1002/term.100. PMID: 18615820).

Периостальный хондрогенез, как и процесс образования любой ткани, следует определенному временному ходу событий - имеет фазовый характер, при этом крайне важным фактом является то, что пролиферация клеток регенерирующей надкостницы предшествует их дифференцировке. Важнейшая цель на современном этапе развития науки состоит в том, чтобы научиться управлять процессом периостального хондрогенеза, тщательно исследуя его регуляцию на клеточном и молекулярном уровнях. Полученные знания позволят не только контролировать периостальный хондрогенез локально, но и оптимизировать его не только для восстановления и регенерации хряща, но и для использования этого процесса, нарабатывая прогнозируемое количество клеточного материала в периостальном ин виво биореакторе, непосредственно в живом организме.

Использование эктопической регенерации хряща осуществлялось рядом авторов для создания достаточного количества гиалинового хряща хорошего качества для использования в аутологичной трансплантации, прежде всего для свободной хондропластики.

Прогресс в развитии регенеративных технологий связан, в том числе с разработкой костного биореактора. В исследовании на новозеландских белых кроликах со зрелым скелетом была продемонстрирована возможность выращивания новых костной или хрящевой тканей внутри биореактора. На переднемедиальной поверхности метафизарной и диафизарной большеберцовой кости обнажали надкостницу, иглу диаметром 5/8 дюйма диаметром 25 калибра изгибали под углом 45° на половине длины и присоединяли к 3-мл шприцу, наполненному раствором Рингера. Надкостницу прокалывали иглой, срезом вверх и отделяли от кости путем одновременного вливания жидкости между внутренним камбиальным слоем надкостницы и костью. Медленное продвижение иглы вперед с латеральными выметающими движениями и одновременным вводом раствора не только отслаивали надкостницу, но и формировали поднадкостничное пространство. После создания поднадкостничного пространства небольшого размера через имеющееся точечное отверстие в него вводили гель до полного растяжения (размеры биореактора 3 см в длину, 0,7 см в ширину и на 1 мм над плоскостью большеберцовой кости; объемом около 200 мм³). Отверстие в надкостнице заклеивали фибриновым клеем (Baxter Healthcare, Манделейн, Иллинойс), а разрез закрыли швами. Костный биореактор предназначен для наращивания костного поднадкостничного регенерата, но было установлено, что его заполнение гелем на основе гиалуронана (ГК или HA) приводило к наращиванию под надкостницей массы хрящевой гиалиновой ткани. Гель на основе HA, использованный в этих исследованиях, был приготовлен с использованием химически модифицированой HA (Genzyme) таким образом, чтобы она содержала альдегидные группы (HA-ALD) путем реакции с периодатом натрия и гидразидные группы (HA-ADH) путем взаимодействия с адипиновым дигидразидом. Гидрогели HA получали путем смешивания равных объемов 2% (масса/объем) водных растворов ГК-АЛД и ГК-АДГ. Сурамин (Bayer, Леверкузен, Германия) включали в свободную (0,4 моль/литр) и инкапсулированную в липосомы (0,4 моль/литр) формы. Заполнение костного биореактора таким гелем привело к образованию хряща внутри биореактора через 10 дней (Stevens MM, Marini RP, Schaefer D, Aronson J, Langer R, Shastri VP. In vivo engineering of organs: the bone bioreactor. Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Aug 9;102(32):11450-5. doi: 10.1073/pnas.0504705102. Epub 2005 Jul 29. PMID: 16055556; PMCID: PMC1183576).

Использование костных ин виво биореакторов с целью эктопической регенерации хряща для последующей свободной пересадки ограничено небольшим размером самого биореактора и проблематичным созданием достаточного количества гиалинового хряща хорошего качества, пригодного для использования в трансплантации. Ограничение количества и прогрессирование гипертрофии хрящевого регенерата, а именно гипертрофической дифференцировкой хондроцитов инженерной хрящевой ткани, вызванной спонтанным эндохондральным окостенением остаются важными недостатками, которые необходимо решать в этой области.

Несмотря на попытку модифицировать состав заполнителя костного биореактора и известный потенциал благоприятного влияния Агрекана и COMP на поднадкостничную микросреду для образования хряща in vivo в костном биореакторе с целью оптимизации подходов к регенерации хряща, авторы не смогли существенно улучшить свойства хрящевого регенерата (Caron MMJ, Janssen MPF, Peeters L, Haudenschild DR, Cremers A, Surtel DAM, van Rhijn LW, Emans PJ, Welting TJM. Aggrecan and COMP Improve Periosteal Chondrogenesis by Delaying Chondrocyte Hypertrophic Maturation. Front Bioeng Biotechnol. 2020 Aug 28;8:1036. doi: 10.3389/fbioe.2020.01036. PMID: 32984292; PMCID: PMC7483497).

Применение пересадок целых лоскутов надкостницы для восстановления хрящевой ткани сопряжено с целым рядом известных ограничений и осложнений. Например, наблюдение за пациентами, получающими периостальную заплату во время аутологичной имплантации хондроцитов, выявило повышенную скорость гипертрофии трансплантата, что часто требует проведения дополнительной операции на суставе со сбриванием (удалением) выпячивающих в полость сустава разросшихся тканей на восстановленном участке суставного хряща (C.R. Gooding, W. Bartlett, G. Bentley, J.A. Skinner, R. Carrington, A. Flanagan A prospective, randomised study comparing two techniques of autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects in the knee: periosteum covered versus type I/III collagen covered// Knee, 13 (2006), pp. 203-210; P.C. Kreuz, M. Steinwachs, C. Erggelet, S.J. Krause, C. Ossendorf, D. Maier, et al. Classification of graft hypertrophy after autologous chondrocyte implantation of full-thickness chondral defects in the knee// Osteoarthritis Cartilage, 15 (2007), pp. 1339-1347).

Свободные надкостничные трансплантаты большеберцовой кости использовались для восстановления дефектов трахеи, созданных у кроликов. Трансплантат располагался по окружности трахеи. Обнаружен высокий риск развития тяжелого костного стеноза трахеи при размещении периостальных трансплантатов по окружности трахеи (Haugen SE, Kufaas T, Svenningsen S. Free periosteal grafts in tracheal reconstruction: an experimental study. Prog Pediatr Surg. 1987; 21:47-9. doi: 10.1007/978-3-642-71665-2_6. PMID: 3107072).

Известен способ производства трехмерных живых хрящеподобных микротканей in vitro - хондросфер и их применения в качестве трансплантационного материала (US 7.887,843 B2 Method for in vitro production of three-dimentional vital cartilage tissue and use thereof as transplant material (co.don® AG, Teltow, DE). Данный патент защищает клеточные сфероиды из культивированных аутологичных хондроцитов суставного хряща в 96-и луночных планшетах из неадгезивного пластика. Требуется дополнительный технологический этап работы с клеточным материалом - взаимное слияние сфероидов в 24-х луночном планшете для увеличения размеров сфероидов, что свидетельствует об ограниченном потенциале самостоятельного роста сфероидов, полученных таким путем. Полученные сфероиды используют для частичного замещения (заполнения в плотности от 3 до 70 сфероидов на см2 ) дефектов суставных поверхностей костей с целью формирования нового хряща в зоне повреждения. Длительное пребывание хондроцитов в 3D-культуре может приводить к гибели клеток, особенно в центре сфероидов. Хрящевая ткань сустава содержит практически единственную популяцию дифференцированных клеток - хондроцитов, пролиферативный и регенеративные потенциалы которых ограничены.

Более усовершенствованные Spherox (CO.DON AG) представляет собой продукт для имплантации аутологичных хондроцитов (ACI), состоящий из сфероидов человеческих хондроцитов, имеющих свой собственный матрикс. Тенденция первичных хондроцитов к дедифференцировке во время культивирования и высокая биологическая изменчивость, вызванная аутологичной природой исходного материала, усложняют разработку производственного процесса, который должен работать стабильно и обеспечивать выход продуктов, соответствующих их предполагаемой функции и высоким критериям качества для биомедицинских клеточных продуктов. Обнаружено, что время культивирования клеток является критическим параметром процесса биофабрикации клеточных сфероидов, который отрицательно коррелирует с эффективностью продукта. Последующий анализ пациентов III фазы клинических испытаний, которые лечились пересадками клеточных сфероидов из хондроцитов, изготовленными с более коротким временем культивирования монослоя и сфероидов, показал более высокие показатели среднего клинического улучшения, а также более высокий уровень ответа по сравнению с общей группой (Eschen C, Kaps C, Widuchowski W, Fickert S, Zinser W, Niemeyer P, Roël G. Clinical outcome is significantly better with spheroid-based autologous chondrocyte implantation manufactured with more stringent cell culture criteria. Osteoarthr Cartil Open. 2020 Feb 4;2(1):100033. doi: 10.1016/j.ocarto.2020.100033. PMID: 36474562; PMCID: PMC9718150).

Известны проблемы хондральных переломов, которые возникают при поверхностном повреждении суставной поверхности без повреждения субхондральной пластинки. Хондроциты в травмированной области размножаются и синтезируют больше белка внеклеточного матрикса. Однако, поскольку хондроциты не могут мигрировать из одной области в другую, полного восстановления гиалинового хряща не происходит, тем более, если повреждение обширное. Более тяжелая ситуация - остеохондральный перелом, который определяется как дефект суставной поверхности кости полной толщины, включающий повреждение и хряща, и кости, что приводит к серьезному повреждению хряща и вовлечению клеток костного мозга через осколки разрушенной кости. Поскольку в репарацию вовлекается сосудистая ткань, этот тип травмы вызывает выраженную воспалительную реакцию. Фибробласты замещают хондроциты в попытке восстановить ткань, что приводит к атипичному строению регенерата суставного хряща. Восстановленная ткань будет иметь более низкое содержание протеогликанов и измененные формы коллагена. Долгосрочным конечным результатом таких травм является нарушение функции сустава. Улучшить прогноз могут только регенеративные технологии ремонта суставной поверхности.

Регенеративные методы, такие как имплантация аутологичных хондроцитов (ACI) и трансплантация клеток, полученных из костного мозга (BMDCT), были разработаны для заживления поражений суставного хряща с регенерацией гиалинового хряща. BMDCT - это регенеративная методика, которая обеспечивает хорошие результаты без необходимости выполнения двух хирургических этапов и высоких затрат, как процедура ACI. В частности, согласно классификации Джаннини, поражения глубже 5 мм представляют собой критическую точку для регенеративных методик. Они часто требуют костной пластики или некоторых дополнительных процедур для достижения хорошего качества субхондральной кости, первого и важного шага к полному заживлению дефектов. Среди этих процедур было показано, что добавление деминерализованной костной матрицы (DBM) является остеоиндуктивным, в то время как коллагеновая мембрана, как было показано, частично регенерирует хрящ и кость.

Естественное заживление переломов происходит путем образования «мягкой мозоли», которая трансформируется в кость после регенеративного ремоделирования, который повторяет события индивидуального развития кости. Основными участниками мягкой мозоли являются клетки, полученные из надкостницы, содержащие мощные скелетные стволовые клетки. При этом клетки, полученные из надкостницы человека, используются для масштабируемого производства микросфероидов, которые дифференцируются в органоиды мозоли. Органоиды достигают автономии и демонстрируют способность образовывать эктопические костные микроорганы in vivo. Эта эффективность связана со специфическими генными сигнатурами, имитирующими те, которые обнаружены в развивающихся и заживающих длинных костях. Более того, органоиды каллюса спонтанно биосбориваются in vitro в крупные сконструированные ткани, способные залечивать дефекты длинных костей критических размеров у мышей. Регенерированная кость демонстрирует схожие морфологические свойства с нативной большеберцовой костью. Эти органоиды каллюса можно рассматривать как живые «биочернила», позволяющие снизу вверх производить многомодульные ткани со сложными геометрическими характеристиками и встроенными качественными характеристиками (Nilsson Hall G, Mendes L., Gklava C., Geris L., Luyten FP, Papantoniou I., «Developmentally Engineered Callus Organoid Bioassemblies Exhibit Predictive In Vivo Long Bone Healing», Advanced Science, (Weinh). 2020 Jan; 7(2): 1902295. Published online 2019 Dec 10. doi: 10.1002/advs.20190229).

Известен клеточный сфероид - трансплантат для восстановления хряща субъекта, включающий клеточные сфероиды на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта, полученного способом, описанном в описании патента (Патент № 2731314 C1 Российская Федерация, МПК A61F 2/30, C12N 5/07. Способ производства клеточных сфероидов для восстановления хрящей : № 2019134905 : заявл. 30.10.2019 : опубл. 01.09.2020 / А.В. Ковалев, С.А. Родионов ; заявитель ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ «МЕЖДУНАРОДНЫЙ ЦЕНТР МЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ И РАЗРАБОТОК» (ООО «МЦ МИИР»)). Сфероид состоит из 20000 клеток и имеет гетерогенный клеточный состав, включая не только адгезивные клетки камбиального, но и фибробласты фиброзного слоев. Культивирование клеток осуществлялось в присутствии ксеногенного продукта - эмбриональной телячья сыворотки и без использования сред для хондрогенной дифференцировки. Основным недостатком способа является небольшое количество клеток в камбиальном слое надхрящницы. Это биологические особенности нормального строения надхрящницы. Более того, у лиц старше 35 лет камбиальный слой может отсутствовать вовсе. Ввиду малой толщины камбиального слоя часто происходит забор фибробластов из соседнего фиброзного слоя надхрящницы, что увеличивает гетерогенность выделяемых клеточных культур, более того фибробласты при дальнейшем культивировании из-за большей скорости пролиферации постепенно могут замещать нужные камбиальные клетки на дне культуральных флаконов. Клеточный сфероид из 20000 клеток часто имеет гипоксическое ядро в своем центре, что ухудшает регенеративный потенциал сфероидов.

Известен СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА СФЕРОИДОВ ИЗ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК НАДКОСТНИЦЫ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА, авторов КОВАЛЕВ А.В., СМОРЧКОВ М.М. (патент: RU 2744664 С1). Эта группа изобретений, включающая способ получения трансплантата на основе клеточных сфероидов и трансплантат для восстановления скелетных соединительных тканей субъекта, полученный указанным способом. Способ включает выделение клеток из камбиального слоя надкостницы субъекта, их культивирование в адгезивной культуре с последующим переносом в агарозные лунки, где происходит их слияние с образованием клеточных сфероидов. Группа изобретений обеспечивает получение трансплантата в виде клеточных сфероидов из аутологичных клеток надкостницы субъекта, обладающих выраженным регенерационным потенциалом для эффективного восстановления скелетных соединительных тканей, в частности суставного хряща и кости. Главным недостатком данного изобретения является трудность получения скелетогенных клеток из надкостницы после прекращения роста скелета и при старении, когда количество таких клеток существенно снижено. Также, при получении сфероидов таким образом, в первичной культуре достаточно много оказывается малополезных для роста скелетных тканей фибробластов.

Таким образом, несмотря на имеющиеся примеры использованием надкостницы для восстановления хрящей и костей, в том числе с использованием надкостницы или клеточных продуктов на ее основе, все они характеризуются рядом недостатков и ограничений, также остается много препятствий для эффективного внедрения известных трансплантатов в клиническую практику, поэтому сохраняется необходимость в разработке и создании новых клеточных продуктов для решения указанных проблем, а также способов их получения.

Определения и термины

Различные термины, относящиеся к объектам настоящей группе изобретений, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данной группы изобретений, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

Используемый в данной заявке термин «сфероиды» относится к плотно упакованным клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных путем трехмерного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса реципиента. Тканевые (клеточные) сфероиды имеют тканеподобное строение - часто называют трехмерными микротканями, максимизирующими межклеточные взаимодействия.

Бластема - гетерогенная клеточная масса, которая в результате миграции и пролиферации временно формируется в месте повреждения и подвергается морфогенезу с образованием недостающего органа. Без бластемы органотипичная регенерация не произойдет. На фоне этих особенностей эпиморфная регенерация предполагает две основные трансформации в ответ на повреждение: 1) зрелую ткань в бластему и 2) бластему в регенерировавший орган. С этой точки зрения бластема является единственно известным и возможным связующим звеном между заживлением и морфогенезом. Один из фундаментальных вопросов, определяющих возможность эпиморфной регенерации, касается источника и активности клеток-предшественников, которые формируют бластему и способствуют регенерации, крайне важен способ регенерации, определяющий возможность эффективности бластемы.

Остеотрофический - стимулирующий рост костей, osteotrophic - Promoting bone growth.

Субхондральная кость - это слой кости, расположенный непосредственно под хрящом в суставе. Субхондральная кость - это костная ткань, лежащая под кальцифицированным хрящом, и включает как субхондральную кортикальную пластинку, так и субхондральную трабекулярную кость, хотя точного разграничения различий между этими двумя структурами не существует.

Интеграция - процесс объединения частей в целое, способ объединения частей в целое.

Интеграция тканей - важнейший процесс в области биоматериалов и тканевой инженерии. Он предполагает установление функциональной и структурной связи между имплантированным биоматериалом, тканеинженерной конструкцией и окружающими тканями хозяина.

Трансплантационная регенерация - регенерация по трансплантату, стимуляция регенерационного процесса или обеспечения самой возможности восстановления путем трансплантации тканей, которые в дальнейшем подвергаются разрушению и рассасыванию, создают модель (каркас), которая позволяет местным тканям осуществлять регенерацию, либо сам трансплантат является источником регенерации. Метод трансплантации используют для стимуляции регенерационного процесса или обеспечения самой возможности восстановления органа.

Олигомерный матриксный белок хряща (cartilage oligomeric matrix protein (COMP) является одним из белков тромбоспондина (TSP-5), который действует как ключевой компонент в синтезе и гомеостазе хрящевого внеклеточного матрикса, представляет собой неколлагеновый белок с молекулярной массой более 500 кДа, который входит в состав внеклеточного матрикса суставного хряща и некоторых других тканей (связок, сухожилий, мениска, синовиальной мембраны). Его основной функцией в матриксе соединительной ткани хряща является стабилизация трехмерной структуры коллагеновых волокон. COMP важен для развития хондрогенной пластинки роста, а мутации COMP связаны с псевдоахондроплазией скелетных заболеваний человека (PSACH) и множественной эпифизарной дисплазией (MED). Кроме того, повышение уровня COMP усиливает хондрогенную дифференцировку стволовых клеток костного мозга человека.

Хондроциты - это клетки, ответственные за образование хряща, и они имеют решающее значение для процесса эндохондрального окостенения, что полезно для развития костей, эти клетки заключены в небольшие полости внутри секретируемого ими матрикса. Кроме того, имитируя развитие скелета, хондроциты играют решающую роль в восстановлении переломов.

Хондротрофическое окружение, хондротрофные реципиентные среды (chondrotrophic en-vironments, chondrotrophic recipient milieus) - реципиентные зоны реберного хряща, ушного хряща и суставной поверхности кости, омываемой внутрисуставной синовиальной жидкостью (синовиальная жидкость рассматривается как идеальная аваскулярная среда) для пересадки, в том числе, свободных периостальных трансплантатов.

Хондрэктомия - хирургическое удаление суставного хряща, или, проводится ортопедами с 1950-х годов. Цель хондрэктомии - создать ровные и стабильные хрящевые края, перпендикулярные поверхности сустава, и соответствующим образом подготовить дно дефекта для оптимальной интеграции хрящевого регенерата.

Хондропластика - это хирургическая процедура по удалению поврежденного хряща в суставе с целью облегчить механические симптомы путем удаления рыхлых фрагментов хряща и удаления нестабильных дегенеративных хрящевых лоскутов, Поврежденная ткань удаляется, позволяя на ее месте вырасти здоровому хрящу (при небольших повреждениях).

Хоминг - это явление, при котором клетки мигрируют в орган, из которого они возникли, например, трансплантированные гемопоэтические клетки могут перемещаться и приживляться или обосноваться в костном мозге. Путем самонаведения трансплантированные гемопоэтические клетки могут перемещаться и приживаться (обосноваться) в костном мозге. В возвращении гемопоэтических стволовых клеток участвуют различные хемокины и рецепторы.

Трансплантация клеток - перспективный лечебный метод, позволяющим восстановить поврежденные ткани путем пересадок клеток (или их предшественников), несущих основную функциональную нагрузку или обладающих выраженным паракринным эффектом, стимулирующими регенерацию. Известны рецензируемые научные журналы с открытым доступом, в котором публикуются высококачественные статьи, посвященные широкому спектру тем фундаментальных и клинических исследований в области трансплантации клеток. А именно: Transplantology: Journal of Cell and Organ Transplantation; Cell and Stem Cell Transplantation; Cell Transplantation.

In vivo биореакторы - это устройства регенеративной медицины или гели, которые имплантируются в организм, контактируют с тканями организма, создают пространство, свободное от окружающих живых тканей, внутри этого искусственно созданного пространства происходит развитие регенератов.

Сурамин, suramin sodium - антипротозойное, антигельминтное лекарственное средство. Suramin Sodium - это натриевая соль сурамина, полисульфонированной нафтилмочевины с потенциальной противоопухолевой активностью. Сурамин блокирует связывание различных факторов роста, включая инсулиноподобный фактор роста I (IGF-I), эпидермальный фактор роста (EGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и фактор роста опухоли-бета (TGF-бета), с их рецепторами, тем самым подавляя пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. Этот агент также ингибирует ангиогенез, вызванный сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF) и основным фактором роста фибробластов (bFGF); ретровирусную обратную транскриптазу; разъединение G-белков от рецепторов; топоизомеразы; клеточный транспорт фолата ; и стероидогенез.

Костный биореактор - создаваемое операционным путем поднадкостничное пространство между внутренним камбиальным слоем надкостницы и костью, которое заполняется гидрогелем. В зависимости от состава гидрогеля, в поднадкостничном пространстве развивается либо костный, либо хрящевой регенерат. При формировании поднадкостничного пространства важно сохранить целостность этой соединительнотканной оболочки кости.

Среда для дифференцировки - это среда, способствующая переходу клеток от одного типа к другому, часто менее специализированный тип становится более специализированным по форме и функциям, в то время как среда для индукции обеспечивает сигналы, которые изменяют поведение клеток, форму, дифференцировку, митотическую активность, сигнальные каскады и/или экспрессию генов.

Субпериостальная регенерационная бластема - поднадкостничная гетерогенная клеточная масса, содержащая скелетогенные клетки, источником которой является активированный травмой и лишенный непосредственного контакта с костью гипертрофированный периост. Отслоенная надкостница способна сформировать субпериостальную регенерационную бластему (бластемный поднадкостничный регенерат) во временном промежутке между 3 и 8 сутками после травмы. Образование субпериостальной бластемы и полная регенерация костей после полного поднадкостничного вылущивания диафизов костей голени наблюдались в экспериментах на разных видах птиц и млекопитающих, которые проводились под руководством профессора А.Н. Студитского.

Первичные клеточные культуры - культуры, источником которых являются органы, ткани или клетки, непосредственно извлеченные из организма.

Раскрытие группы изобретений

Целью настоящей группы изобретений является разработка нового способа изготовления трансплантата в виде клеточных сфероидов из клеток субпериостальной бластемы, формируемой в костном ин виво биореакторе в гипоксических условиях, а также к самому трансплантату, полученному данным способом, для эффективного восстановления остеохондральный переломов и посттравматических остеохондральных дефектов внутри суставных поверхностей костей, костных и хрящевых тканей.

Техническим результатом группы изобретений является создание трансплантата, на основе клеточных сфероидов из культивированных или некультивированных клеток субпериостальной бластемы, для эффективного восстановления хрящей и костей, в том числе восстановления субхондральной кости с покрывающим ее гиалиновым хрящом, обладающих выраженным регенеративным потенциалом, достаточным для регенерации поврежденного внутрисуставной части кости.

Указанный технический результат достигается за счет способа изготовления трансплантата для восстановления хряща и кости субъекта на основании клеточных сфероидов, содержащих аутологичные клетки надкостницы, включающего:

- выращивание субпериостальной регенерационной бластемы надкостницы с использованием костного ин виво биореактора, стенками которой выступает надкостница;

- получение аутологичных клеток надкостницы из субпериостальной регенерационной бластемы надкостницы;

- получение сфероидов из аутологичных клеток надкостницы, с использованием агарозных луночных планшетов, с последующим формированием трансплантата,

при этом, при выращивании субпериостальной регенерационной бластемы надкостницы, костный ин виво биореактор заполняют гиалуроновой кислотой и сурамином, а количество аутологичных клеток на 1 сфероид составляет 4000-8000 клеток.

Также, технический результат достигается за счет самого трансплантата изготовленного данным способом, включающего клеточные сфероиды, содержащие аутологичные клетки надкостницы, полученные из надкостницы с использованием костного ин виво биореактора, заполненного гиалуроновой кислотой и сурамином, с количеством аутологичных клеток на 1 сфероид 4000-8000 клеток.

Надкостница, используемая в качестве источника аутологичных клеток для производства сфероидов является для кости камбиальной зоной, поставляющей прогениторные клетки для ее обновления и репаративной регенерации костной ткани, и, следовательно, содержащая большее количество камбиальных клеток.

Для увеличения клеточной массы с высоким регенеративным потенциалом надкостница используется в костном ин виво биореакторе в гипоксических условиях, при которых пространство биореактора заполнено гиалуронаном с сурамином в составе липосом, обеспечивает блокировку ангиогенеза, что позволяет развиваться только хрящевому регенерату в гипоксических условиях (костный регенерат без сосудов не образуется).

На границе гидрогель - внутренний слой надкостницы формируется клеточная масса - субпериостальная бластема. Клетки этой бластемы используются для получения получение аутологичных клеток надкостницы, и последующего получения трансплантата в виде клеточных сфероидов (4000-8000 клеток на 1 сфероид), с использованием агарозных луночных планшетов.

Итак, в качестве источника клеток в составе трансплантатов - клеточных сфероидов, согласно настоящему изобретению, используются клетки субпериостальной регенерационной бластемы. Рост такой бластемы может быть индуцирован в живом организме самого реципиента с помощью известного ин виво костного биореактора. Костный биореактор заполнялся гелем на основе гиалуроновой кислоты с добавлением сурамина, который изготавливался известным способом (Stevens M.M., Marini R.P., Schaefer D, Aronson J, Langer R, Shastri VP. In vivo engineering of organs: the bone bioreactor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 9;102(32):11450-5. doi: 10.1073/pnas.0504705102. Epub 2005 Jul 29. PMID: 16055556; PMCID: PMC1183576).

Полученные клеточные сфероиды обладают способностью формировать как костную (в остеотрофических условиях), так хрящевую часть (в хондротрофическом окружении) регенерата скелетных тканей. Костная часть регенерата формируется из клеточных сфероидов в реципиентной области, прилежащей к кровоснабжаемой части кости, что крайне важно для интеграции регенерата с костными трабекулами, близко расположенными к суставной поверхности кости. Хрящевая часть регенерата формируется из этих же клеточных сфероидов в хондротрофических условиях (со стороны полости сустава).

Созданные сфероиды могут быть использованы в реконструкции остеохондральных дефектов и эффективно восстанавливать сложный интерфейс между хрящом и субхондральной костью, что крайне важно для разработки эффективных технологий регенерации остеохондральных дефектов и регенеративных технологий восстановления структуры и функций суставов.

В частном случае, при формировании клеточных сфероидов используют некультивированные свежевыделенные аутологичные клетки, полученные из субпериостальной регенерационной бластемы, путем механической и ферментативной дезагрегации.

Также при формировании клеточных сфероидов могут использоваться культивированные адгезивные аутологичные клетки.

Клетки бластемы первичной культуры после биореактора проходят агрегацию в культуральной питательной среде, предпочтительно, содержащей 5-10% тромболизата с дальнейшем переносом культивированных клеток в агарозные лунки. Использование питательной среды, содержащей тромболизат, вместо сыворотки, позволяет улучшить клеточную дифференцировку.

Осуществление изобретение

В данном разделе описан способ получения с использованием костного ин виво биореактора в гипоксических условиях, заполненного гиалуроновой кислотой и липсомами с сурамином, трансплантата для восстановления хряща и кости субъекта, включающего клеточные сфероиды, содержащие культивированные аутологичные клетки субпериостальной регенерационной бластемы надкостницы, с количеством аутологичных клеток на 1 сфероид 4000-8000 клеток.

В общей виде способ включает следующие стадии:

- выращивание субпериостальной регенерационной бластемы надкостницы с использованием костного ин виво биореактора, стенками которой выступает надкостница, при этом костный ин виво биореактор заполняют гиалуроновой кислотой и сурамином;

- получение аутологичных клеток надкостницы из субпериостальной регенерационной бластемы надкостницы;

- получение сфероидов из аутологичных клеток надкостницы, с использованием агарозных луночных планшетов, с последующим формированием трансплантата,при этом количество аутологичных клеток на 1 сфероид составляет 4000-8000 клеток.

При этом при формировании клеточных сфероидов используют некультивированные свежевыделенные аутологичные клетки, полученные из субпериостальной регенерационной бластемы, путем механической и ферментативной дезагрегации, или культивированные адгезивные аутологичные клетки.

Вариант осуществления способа

Первая операция. В эксперименте на кроликах-самцах калифорнийской породы со зрелым скелетом в возрасте 8 месяцев использован известный прием- манипуляция с бережной отслойкой надкостницы - метод гидравлического подъема надкостницы (Marini R.P., Stevens M.M., Langer R., Shastri V.P. Hydraulic elevation of the periosteum: a novel technique for periosteal harvest. J Invest Surg. 2004 Jul-Aug;17(4):229-33. doi: 10.1080/08941930490472073. PMID: 15371165.) Для этого в условиях операционной осуществлялся хирургический доступ к внешней поверхности большеберцовой кости, чтобы обнажить надкостницу. Для этого игла 5/8 дюйма 25 калибра была согнута под углом 45° на половине ее длины и присоединена к 3-х мл шприцу, наполненному раствором Рингера. Надкостница была проколота иглой, причем острие иглы скошенной стороной направлено вверх, надкостница отделяется от поверхности большеберцовой кости введением раствора Рингера между внутренним камбиальным слоем надкостницы и костью, к наружной поверхности которой прилежит надкостница. С помощью подаваемого под надхрящницу раствора Рингера и продвижения кончика иглы постепенно создавали пространство под надхрящницей, далее с помощью более толстой иглы в пространство между надхрящницей и реберным хрящом вводили гель на основе гиалуроновой кислоты и сурамина до полного растяжения (размеры ин виво биореактора: длина 3 см, ширина 0,4 см, высота над плоскостью реберного хряща 4 мм). Отверстия в надкостнице ушивались рассасывающимися хирургическими нитями для предотвращения вытекания геля, и на сам разрез наложены хирургические швы.

Вторая операция. Проводится через 4-8 суток. Для извлечения клеток субпериостальной регенеративной бластемы надкостницы, проводится вторая хирургическая манипуляция. Проводиться хирургический доступ, надкостница, являющаяся стенкой ин виво биореактора, с субпериостальной регенерационной бластемой над гелем на основе гиалуроновой кислоты и сурамина полностью иссекается.

Надкостница с субпериостальной бластемой раскладывается на стерильном препаравальном столике, и при постоянном ее увлажнении производится выскабливание клеточной массы бластемы с внутренней поверхности надкостницы. На донорской поверхности кости иссеченная надкостница полностью регенерирует через несколько месяцев. Выделенная часть надкостницы с бластемой подвергается дальнейшей механической и ферментативной дезагрегации (с применением коллагеназы 1 типа).

При использовании культивированных адгезивных клеток субпериостальной регенерационной бластемы после центрифугирования, ресуспензирования производился посев выделенных клеток бластемы в культуральные флаконы с обработанной поверхностью. Для поддержания роста первичной клеточной культуры и на всех этапах пассирования использовались культуральные флаконы с невентилируемой крышкой и обработанной поверхностью (либо с вентилируемой крышкой при культивировании внутри мультигазового инкубатора), а также использовалась культуральная питательная среда следующего состава: ДМЕМ/F12 450 мл, L-глутамин 292 мг, 50 мл или 100 мл тромболизата, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл (при 100% влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона и газовая смесь для заполнения культурального флакона в составе 5% СО₂ и 10% кислорода и 85% азота - условия мультигазового инкубатора), замена питательной среды во флаконе проводиться не менее 1 раз в 3 суток.

Процедура приготовления лизата тромбоцитов производиться известным способом. Кровь собирали у тех же животных, которых использовали для выращивания субпериостальных бластем. Использовали антикоагулянт - 3,8% цитрат натрия (девять объемов крови на один объем цитрата). Подсчет тромбоцитов проводили с помощью полуавтоматического счетчика (ABX HoribaTM). Кровь центрифугировали в течение 10 минут при 1000 об/мин. Впоследствии плазму собирали и центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об/мин для получения PRP, подвергнутой быстрой заморозке в жидком азоте (-196 С), подвергнут быстрому оттаиванию при 37°С для получения лизата тромбоцитов, который затем подвергался ультрафильтрации через мембрану с порами 0,22 мм для удалить остатки цитоплазматической мембраны (Moroz A, Bittencourt RA, Almeida RP, Felisbino SL, Deffune E. Platelet lysate 3D scaffold supports mesenchymal stem cell chondrogenesis: an improved approach in cartilage tissue engineering. Platelets. 2013;24(3):219-25. doi: 10.3109/09537104.2012.686255. Epub 2012 May 30. PMID: 22646294).

Известно, что лизат тромбоцитов уменьшает дедифференцировку хондроцитов во время расширения in vitro, что имеет важное значение для инженерии хрящевой ткани (De Angelis E, Grolli S, Saleri R, Conti V, Andrani M, Berardi M, Cavalli V, Passeri B, Ravanetti F, Borghetti P. Platelet lysate reduces the chondrocyte dedifferentiation during in vitro expansion: Implications for cartilage tissue engineering. Res Vet Sci. 2020 Dec;133:98-105. doi: 10.1016/j.rvsc.2020.08.017. Epub 2020 Sep 6. PMID: 32961475, Hassan, G., Bahjat, M., Kasem, I. et al. Platelet lysate induces chondrogenic differentiation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells. Cell Mol Biol Lett 23, 11 (2018). https://doi.org/10.1186/s11658-018-0080-6).

Субкультивирование монослойной культуры клеток субпериостальной регенерационной бластемы осуществляют до третьего - пятого пассажа. После последнего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% аутологичной кроличьей сывороткой с последующим центрифугированием и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм, где в агарозных лунках из культивированных клеток формируются клеточные сфероиды, с которых количество аутологичных клеток на 1 сфероид составляет 4000-8000 клеток. Агрегация клеток и созревание сфероидов происходит в этих условиях 3D-культивирования на протяжении не более 7 суток.

Для использования клеточные сфероиды собирают из планшетов и переносят в пробирку, где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. После этого клеточные сфероиды перемещают с помощью аппликатора, имеющего просвет не менее 1 мм².

Осуществление заявленной группы изобретений, а также достижение заявленного технического результата подтверждено следующим примерами.

Пример 1

В эксперименте на кроликах-самцах калифорнийской породы в возрасте 8 месяцев проводился в условиях операционной экспериментальный хирургический доступ к передней поверхности большеберцовой кости. Обнажалась надкостница. С помощью шприца с иглой и раствора Рингера проводился гидравлический подъем надкостницы, после чего поднадхрящничное пространство заполнялось гелем на основе гиалуроновой кислоты и сурамина с формированием ин виво биореактора размерами - длиной 3-4 см, высота над поверхностью кости 4-7 мм). Отверстие в надхрящнице было дополнительно прошито рассасывающимися хирургическими нитями для предотвращения вытекания геля из-под надкостницы, рана послойно ушита. Приготовление геля на основе гиалуроновой кислоты осуществлялось известным способом (Stevens MM, Marini RP, Schaefer D, Aronson J, Langer R, Shastri VP. In vivo engineering of organs: the bone bioreactor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 9;102(32):11450-5. doi: 10.1073/pnas.0504705102. Epub 2005 Jul 29. PMID: 16055556; PMCID: PMC1183576).

Через 7 суток у кроликов после установки ин виво биореактора извлекают надкостницу с развившейся субпериостальной регенеративной бластемой. Надкостница растягивается на стерильном препаравальном столике, и при постоянном увлажнении в стерильных условиях производиться выскабливание клеточной массы с внутренней поверхности надкостницы. Выделенная и частично измельченная часть надкостницы с регенерационной бластемой подвергается дальнейшей механической и ферментативной дезагрегации (используется коллагеназа 1 типа). После центрифугирования, ресуспензирования выделенных клеток производили посев в культуральные флаконы с адгезивной поверхностью. Для поддержания роста первичной клеточной культуры и на всех этапах пассирования использовали культуральные флаконы с невентилируемой крышкой и обработанной поверхностью, использовали один состав культуральной питательной среды: ДМЕМ/F12 450 мл, L-глутамин 292 мг, 50 мл тромболизата кроликов, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл (при 100% влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона, использовали готовую газовую смесь для заполнения культурального флакона в составе 5% СО₂, 10% кислорода и 85% азота), замена питательной среды и газовой смеси в культуральном флаконе проводилась не менее 1 раз в 3 суток. Можно использовать готовую газовую смесь при использовании невентилируемых крышек культуральных флаконов, либо флаконы с вентилируемыми крышками помещаются в мультигазовый инкубатор.

Субкультивирование монослойной культуры клеток регенеративной бластемы, образуемой под надхрящницей, осуществлялось до 4 пассажа. После последнего пассажа клетки снимали с поверхности пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывали от трипсина/ЭДТА с помощью среды ДМЕМ с 10% аутологичной сывороткой с последующим центрифугированием и переносили в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в количестве 4000-8000 клеток на 1 лунку, в этих лунках клетки агрегировали в сфероиды и далее производилось 3D-культивирование клеток, Производство клеточных сфероидов с использованием агарозных 3D-чашек Петри® (3D Petri Dish®), агрегация клеток и созревание клеточных сфероидов в агарозных лунок проводилось с учетом рекомендаций производителя силиконовых форм (MicroTissues Inc.®).

Выращивание 3D-культуры клеток, агрегация клеток и созревание клеточных сфероидов происходило в агарозных лунках Microtissue® на протяжении 5-8 суток.

Для трансплантации клеточные сфероиды собирали из агарозных лунок и переносили в пробирку, где они осаждались на дно без дополнительного центрифугирования. После этого сфероиды перемещают с помощью специального аппликатора, с просветом не менее 1 мм².

Аутотрансплантация сфероидов в экспериментальный дефект суставного хряща и субхондральной кости коленного сустава кроликов.

У подопытных кроликов калифорнийской породы хирургическим путем в условиях операционной с помощью скальпеля и кусачек формировали дефект суставной поверхности кости диаметром 3-5 мм. Дефект полностью заполнялся сфероидами. Морфологические гистологические исследования регенерата проводили через 4 и 6 месяцев после пересадки клеточных сфероидов. Перед гистологическим исследованием регенерата кости проводили микроКТ травмированной кости с последующей цифровой 3D-реконструкцией полученной серии изображений.

Обнаружено, что клеточные сфероиды из клеток бластемы надкостницы обеспечивают полную и полноценную регенерацию кости и хряща в этой области.

Пример 2

В эксперименте на кроликах-самцах калифорнийской породы в возрасте 8 месяцев проводился в условиях операционной экспериментальный хирургический доступ к передней поверхности большеберцовой кости. Обнажалась надкостница. С помощью шприца с иглой и раствора Рингера проводился гидравлический подъем надкостницы, после чего поднадхрящничное пространство заполнялось гелем на основе гиалуроновой кислоты и сурамина с формированием ин виво биореактора размерами - длиной 3-4 см, высота над поверхностью кости 4-7 мм). Отверстие в надхрящнице было дополнительно прошито рассасывающимися хирургическими нитями для предотвращения вытекания геля из-под надкостницы, рана послойно ушита. Приготовление геля на основе гиалуроновой кислоты осуществлялось известным способом, ссылка выше.

Через 7 суток у кроликов после установки ин виво биореактора извлекают надкостницу с развившейся субпериостальной регенеративной бластемой. Надкостница растягивается на стерильном препаравальном столике, и при постоянном увлажнении в стерильных условиях производиться выскабливание клеточной массы с внутренней поверхности надкостницы. Выделенная и частично измельченная часть надкостницы с регенерационной бластемой подвергается дальнейшей механической и ферментативной дезагрегации (используется коллагеназа 1 типа). После центрифугирования, ресуспензирования выделенных клеток производили посев в культуральные флаконы с адгезивной поверхностью. Для поддержания роста первичной клеточной культуры и на всех этапах пассирования использовали культуральные флаконы с невентилируемой крышкой и обработанной поверхностью, использовали один состав культуральной питательной среды: ДМЕМ/F12 450 мл, L-глутамин 292 мг, 50 мл Сыворотки крови эмбриональная телячья характеризованная (Cell Technologies), пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл (при 100% влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона, использовали готовую газовую смесь для заполнения культурального флакона в составе 5% СО₂, 10% кислорода и 85% азота), замена питательной среды и газовой смеси в культуральном флаконе проводилась не менее 1 раз в 3 суток. Можно использовать готовую газовую смесь при использовании невентилируемых крышек культуральных флаконов, либо флаконы с вентилируемыми крышками помещаются в мультигазовый инкубатор.

Субкультивирование монослойной культуры клеток регенеративной бластемы, образуемой под надхрящницей, осуществлялось до 4 пассажа. После последнего пассажа клетки снимали с поверхности пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывали от трипсина/ЭДТА с помощью среды ДМЕМ с 10% аутологичной сывороткой с последующим центрифугированием и переносили в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в количестве 4000-8000 клеток на 1 лунку, в этих лунках клетки агрегировали в сфероиды и далее производилось 3D-культивирование клеток, Производство клеточных сфероидов с использованием агарозных 3D-чашек Петри® (3D Petri Dish®), агрегация клеток и созревание клеточных сфероидов в агарозных лунок проводилось с учетом рекомендаций производителя силиконовых форм (MicroTissues Inc.®).

Выращивание 3D-культуры клеток, агрегация клеток и созревание клеточных сфероидов происходило в агарозных лунках Microtissue® на протяжении 5-8 суток.

Для трансплантации клеточные сфероиды собирали из агарозных лунок и переносили в пробирку, где они осаждались на дно без дополнительного центрифугирования. После этого сфероиды перемещают с помощью специального аппликатора, с просветом не менее 1 мм².

Аутотрансплантация сфероидов в экспериментальный дефект суставного хряща и субхондральной кости коленного сустава кроликов.

У подопытных кроликов калифорнийской породы хирургическим путем в условиях операционной с помощью скальпеля и кусачек формировали дефект суставной поверхности кости диаметром 3-5 мм. Дефект полностью заполнялся сфероидами. Морфологические гистологические исследования регенерата проводили через 4 и 6 месяцев после пересадки клеточных сфероидов. Перед гистологическим исследованием регенерата кости проводили микроКТ травмированной кости с последующей цифровой 3D-реконструкцией полученной серии изображений.

Обнаружено, что клеточные сфероиды из клеток бластемы надкостницы обеспечивают полную и полноценную регенерацию кости и хряща в этой области.

Claims (8)

1. Способ изготовления трансплантата для восстановления хряща и кости субъекта на основании клеточных сфероидов, содержащих аутологичные клетки надкостницы, в котором:

- выращивают субпериостальную регенерационную бластему надкостницы с использованием костного ин виво биореактора, стенками которой выступает надкостница;

- получают аутологичные клетки из субпериостальной регенерационной бластемы надкостницы путем ее механического измельчения и последующей ферментативной диссоциации клеток и последующего культивирования в виде адгезивных культур в культуральных флаконах с использованием питательной среды, включающей ДМЕМ/F12 450 мл, L-глутамин 292 мг, 50 мл тромболизата кроликов, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности над слоем питательной среды внутри культурального флакона, использовали готовую газовую смесь для заполнения культурального флакона в составе 5% СО₂, 10% кислорода и 85% азота, замена питательной среды и газовой смеси в культуральном флаконе проводилась не менее 1 раз в 3 суток;

- получают сфероиды из культивированных аутологичных клеток субпериостальной регенерационной бластемы надкостницы, с использованием агарозных луночных планшетов, в лунках которых клетки агрегируют в сфероиды и далее производят 3D-культивирование клеток, при этом производство клеточных сфероидов проводят с использованием агарозных 3D-чашек Петри, с последующим формированием трансплантата, для чего клеточные сфероиды собирают из агарозных лунок и переносят в пробирку, где осаждают их на дно,

при этом, при выращивании субпериостальной регенерационной бластемы надкостницы, костный ин виво биореактор заполняют гиалуроновой кислотой и сурамином, а количество аутологичных клеток на 1 сфероид составляет 4000-8000 клеток.

2. Способ по п. 1, в котором при формировании клеточных сфероидов используют некультивированные свежевыделенные аутологичные клетки, полученные из субпериостальной регенерационной бластемы.

3. Способ по п. 1, в котором при формировании клеточных сфероидов используют культивированные адгезивные аутологичные клетки, полученные из субпериостальной регенерационной бластемы, основой культуральной питательной среды которых является тромболизат в количестве 5-10% от объема питательной среды.

4. Трансплантат для восстановления хряща и кости субъекта, изготовленный способом по п. 1, включающий клеточные сфероиды, содержащие аутологичные клетки субпериостальной регенерационной бластемы надкостницы, полученные из надкостницы с использованием костного ин виво биореактора, заполненного гиалуроновой кислотой и сурамином, с количеством аутологичных клеток на 1 сфероид 4000-8000 клеток.