SA110310331B1 - طريقة لاكتشاف فيروس من نوع الورم الحليمي البشري (hpv) - Google Patents
طريقة لاكتشاف فيروس من نوع الورم الحليمي البشري (hpv) Download PDFInfo
- Publication number
- SA110310331B1 SA110310331B1 SA110310331A SA110310331A SA110310331B1 SA 110310331 B1 SA110310331 B1 SA 110310331B1 SA 110310331 A SA110310331 A SA 110310331A SA 110310331 A SA110310331 A SA 110310331A SA 110310331 B1 SA110310331 B1 SA 110310331B1
- Authority
- SA
- Saudi Arabia
- Prior art keywords
- hpv
- sequence
- oligonucleotide
- amplification
- human papillomavirus
- Prior art date
Links
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 title claims abstract description 147
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 147
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 99
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 99
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 32
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 31
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 16
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 8
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 241000272168 Laridae Species 0.000 claims 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 claims 1
- 241000722343 Human papillomavirus types Species 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 26
- 241000894007 species Species 0.000 description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 21
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 18
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 8
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- PKVZBNCYEICAQP-UHFFFAOYSA-N Mecamylamine hydrochloride Chemical compound Cl.C1CC2C(C)(C)C(NC)(C)C1C2 PKVZBNCYEICAQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- BUJRUSRXHJKUQE-UHFFFAOYSA-N 5-carboxy-X-rhodamine triethylammonium salt Chemical compound CC[NH+](CC)CC.[O-]C(=O)C1=CC(C(=O)[O-])=CC=C1C1=C(C=C2C3=C4CCCN3CCC2)C4=[O+]C2=C1C=C1CCCN3CCCC2=C13 BUJRUSRXHJKUQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 101100445488 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) ptr-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L magnesium;aluminum;dihydroxide;trihydrate Chemical compound O.O.O.[OH-].[OH-].[Mg+2].[Al] ADKOXSOCTOWDOP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- NDVRKEKNSBMTAX-BTVCFUMJSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O NDVRKEKNSBMTAX-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 1
- LYOKOJQBUZRTMX-UHFFFAOYSA-N 1,3-bis[[1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-(trifluoromethyl)propan-2-yl]oxy]-2,2-bis[[1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-(trifluoromethyl)propan-2-yl]oxymethyl]propane Chemical compound FC(F)(F)C(C(F)(F)F)(C(F)(F)F)OCC(COC(C(F)(F)F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)(COC(C(F)(F)F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)COC(C(F)(F)F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F LYOKOJQBUZRTMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150102326 1.1 gene Proteins 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001136792 Alle Species 0.000 description 1
- 101150019028 Antp gene Proteins 0.000 description 1
- 208000007879 Atypical Squamous Cells of the Cervix Diseases 0.000 description 1
- 241000252983 Caecum Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101100490488 Mus musculus Add3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100063504 Mus musculus Dlx2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 244000191761 Sida cordifolia Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000001648 catalysed chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000008696 hypoxemic pulmonary vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000001921 locked nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 208000026037 malignant tumor of neck Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MXWHMTNPTTVWDM-NXOFHUPFSA-N mitoguazone Chemical compound NC(N)=N\N=C(/C)\C=N\N=C(N)N MXWHMTNPTTVWDM-NXOFHUPFSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 208000009091 myxoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
يتعلق الاختراع الحالي بطريقة لاكتشاف فيروس من أنواع الورم الحليمي البشري human papillomavirus (HPV) و طقم لاكتشاف أنواع الورم الحليمي البشري المذكورة .
Description
Y —_ _ طريقة لاكتشاف فيروس من نوع الورم الحليمي البشري (HPV) A method for detection of human papillomavirus (HPV) type الوصف الكامل خلفية الاختراع يتعلق الاختراع الحالي بالكشف عنء انتساخ والحساب الكمي typing and quantitation للفيروسات الحلايمية البشرية human papillomavirus (HPV) في عينات إكلينيكية. وبشكل أكثر تحديداً ٠ يتعلق بمتواليات أوليجيونيوكليوتيد (Say oligonucleotide استخدامها في تفاعلات © التضخيم ويتم استخدامها للاكتشاف المتزامن ؛ الانتساخ و الحساب الكمي لمجموعة من genomes HPV و طقم تشخيص لها. تم تسجيل عدوى الفيروس الحليمي البشري (HPV) كسبب لسرطان الرقبة في الثمانينات. تم اعتبار العلاقة بين السرطانات الخبيثة والنمط الظاهري ل HPV بأنها هامة. تم تحديد أكثر من ١7١ نوع HPVs . تم تحديد ثلاثة عشر نوعاً منها على أنها ورمية في الأنسجة المخاطية الظهارية . ya تشتمل تلك الأنواع على الورم الحليمي البشري (HPV) نا غك لك كك (Yo كك £0( )0 (0A (01 (OY 4ه و 1 تقتصر العدوى infections بالفيروسات الحليمية البشرية على النسيج البطاني والذي يعمل على تقليل اتصالها بالجهاز المناعي Jl immune apparatus لا يتم توليد المناعة بشكل كبير. وبالتالي لا يكون علم الأمصال مفيداً في اختبار HPV . وبشكل مشابه؛ لا تكون المزرعة مفيدة Yo كتقنية تشخيص. وعلى الرغم من أنه من الممكن عمل دورة حياة الفيروس virus life cycle في المعمل فإن تقنية زراعة النسيج tissue culture تقنية Alle الدقة وتتطلب تمييز الخلية البطانية
ا - epithelial cell في المعمل. بالإضافة إلى ذلك فإن تكوين الورم في الرقبة عال الدرجة والسرطانات high grade cervical neoplasias and cancers الأخرى لا تنتج أي فيروس. وبالتالي يعتمد اختبار HPV على الكشف عن الأحماض النووية الفيروسية viral nucleic acids . أوضح اختبار HPV أن له حساسية عالية بالمقارنة PAP ,loaly (اختبار Papanicolaou ( © المتعلق بخلل التنسج في الرقبة عال الدرجة؛ على الرغم من الخاصية المنخفضة نتيجة التكافو العالي الخاص بالعدوى الحميدة أو عدوى HPV الانتقالية HPV infections المعتوصة. اعتمدت العديد من البلدان على اختبار HPV كاختبار تصفية ثانوي (إصابة) فيما يتعلق بتكوين الورم الملتبس واستخدامه في الفحص الأول الذي يمكن اقتراحه. يكون اختبار HPV السائد هو اختبار Digene HCH الحالي والذي يتم دعم الاستخدام الخاص به ٠ عن طريق العدد الكبير للمراجع العلمية المختصة به. وفي هذا الاختبار؛ يتم تهجين hybridised HPV DNA في العينة ب RNA المتمم وينتج عن ذلك نواتج تهجين DNA-RNA والتي يتم مسكها من خلال ١ لأجسام المضادة Je antibodies السطح الصلب solid surface حيث ترتبط بعد ذلك بمترافقات الجسم المضاد-الإنزيم والتي يتم اكتشافها عن طريق الوميض الكيميائي الحفزي الإنزيمي enzyme-catalysed chemiluminescence .. لا يقوم اختبار 1.011 بالتمييز بين الأنواع المختلفة ٠ من HPV المكونة للورم. من الممكن أيضاً أن يتم اكتشاف 11077 في WA مثبتة باستخدام التهجين في الموضع باستخدام مسبارات يتم ترقيمها إما بأجزاء fluorescence (التهجين باستخدام fluorescence في الموضع؛ of (FISH باستخدام مركبات haptens التي يمكن أن ترتبط بمترافق إنزيمى يعمل على توليد أجزاء مترسبة ملونة غير قابلة للذوبان في الموضع. يمكن أن يوفر التهجين في الموضع معلومات قيمة
عن موضع والحالة الفيزيائية HPV] » ولكن الأنواع الخاصة بالكشف عن العديد من أنواع HPV في نفس All هي أنواع غير تجريبية. يعبر العديد من اخصائيين الفحص عن تفضيل الاختبارات الخاصة بالنمط الظاهري في الفحص الثانوي الذي يسمح بالعدوى الانتقالية Ally تكون حميدة والتي يتم تمييزها العدوى الخاصة بنوع © معين والتي لا تكون حميدة. وبالإضافة؛ إلى ذلك؛ فإن بعض أنواع HPV ؛ وعلى نحو محدد HPVI6 والذي يعتبر أكثر تكويناً للورم. وفي النهاية؛ فإن استخدام اختبار النمط الظاهري يوفر معلومات عن الوبائيات والتي سوف تكون ذات قيمة خاصة عند مراقبة تأثير المعلومات الخاصة باللقاح في مقابل 1171716 و 1101718. تعتمد اختبارات النمط الظاهري HPV. المتاحة بشكل كبير على Lig PCR ذلك التهجين العكسي ٠ في بعض الأشكال . تستهدف خطوة PCR جينات 1.1 أو 851 . يتم PCR amplicons afi تحت ظروف تضخيم ويتم تهجينها لكي يتم تثبيت المسبارات على النسق الدقيق؛ أو شريحة غشاء أو في العيون الخاصة بطبق دقيق معياري microtiter plate يتم بعد ذلك اكتشاف amplicon المرتبط المرقم سواء أكان ذلك بشكل مباشر أو غير عن طريق التدفق الفلوري إذا تم ترقيم amplicon بأجزاء من fluorescent باستخدام مترافقات إنزيمية يتم ارتباطها بمرقم ويتم اكتشافها عن Gob ض Ve استخدام تقنيات قياس اللون أو قياس التألق colorimetric or luminometric techniques تشتمل تلك الاختبارات على معالجة amplicon PCR في معمل مفتوح يتطلب احتياطات صحية قاسية. ويرتبط ذلك مع تكلفة عالية لمتل تلك الاختبارات مما يجعل الاختبارات المتاحة في غير متناول الوصول إلى برامج فحص جماعي شائعة.
يكون اختبار الانتساخ الجيني الذي يكتشف mRNA من مكون الورم الفيروسي 156 و 17 باستخدام تضخيم معتمد على المتوالية sequence dependent amplification SDA متاحاً أيضاً. وبالرغم من ذلك؛ فإن تلك الطريقة تكتشف فقط عن خمسة من ثلاثة عشر نوعاً من الأنواع المكونة للورم وذلك فقط عندما يتم التعبير عن تكوين الورم بشكل فعال. © يصف الطلب الدولي رقم 1-٠٠٠١ ٠/198/87 بادئات PCR primers ومسبارات probes لاكتشاف أنواع HPV المتعددة عن طريق PCR في الزمن الفعلي. تشتمل تلك المجموعات على توليفة معقدة من البادئات. وفي الطريقة الخاصة بالاختراع الحالي؛ يكون من المطلوب فقط بادئ أمامي وأربعة بادئات عكسية. يختصر ذلك تكلفة إجراءات التحكم والصيانة. وبالإضافة إلى ذلك؛ فإن الجينات التي تم استهدافها في الطلب الدولي رقم DY V1100AY تكون بمثابة تغييرات ٠ في متوالية مستهدفة. ولم يتم أخذ تلك التغييرات في الاعتبار. وبالتالي فإن النتائج السلبية الخاطئة يمكن أن تحدث في العينات الإكلينتيكية clinical samples التي تشتمل على الصور المختلفة من متوالية HPV بخلاف متواليات النموذج الأصلي. وطبقاً للاختراع الحالي فإن تغييرات المتوالية التي تكون في المنطقة المستهدفة لجين 1.1 قد تم أخذها في الاعتبار قبل أن يتم تصميم البادئ والمسبار probe وكل الأوضاع من الصور المتغيرة والتي يتم تجنبها أو وضعها في الاعتبار عن طريق ٠ تعديلات خاصة بمتواليات البادئ. وبالإضافة إلى ذلك؛ وفي الطلب الدولي رقم 097/118887٠؟-١أ تم توضيح أن الحساسية التي تكون أقل من ٠٠١ نسخة في أنواع HPV المستهدفة التي تم الحصول عليها. وبالرغم من ذلك؛ فإن التجارب التي تم وصفها لا تشتمل على استخدام sale حاملة ل DNA . ويمكن أن يعطي ذلك تقديراً متفائلاً وغير حقيقي كما تم توضيحه في DNA البشري في العينات
الإكلينيكية All clinical samples تعمل على كبت الحساسية الخاصة ب PCR . يتم قياس الحساسية الخاصة بالطريقة طبقاً للاختراع الحالي في وجود 00 نانو جرام من DNA البشري والذي يناظر ٠١ x Ve *_ من الخلايا البشرية وبالتالي تحاكي بشكل دقيق ظروف العينة الإكلينيكية الغنية بالخلايا. وبالتالي؛ يوفر الاختراع الحالي حساسية تم تحسينها تحت ظروف © حقيقية.
بالإضافة إلى ذلك يصف الطلب الدولي رقم 097/115887٠7”-١أ. استخدام أنبوب منفرد يصل من 13-plexgsi في اختبار 708 المتعدد. وبالرغم من ذلك؛ وطبقاً لحالة الفن؛ لم يتم توضيح جهاز قادر على إجراء هذا الاختبار. يمكن أن يتم إجراء الطريقة الخاصة بالاختراع الحالي على الأجهزة الموجودة التي يمكن الحصول عليها في الصورةٍ المقترحة أو الصور المتغيرة أو نظائر
٠ منها. في الطلب الدولي رقم رقم 5/115977 DEY ؛ يكون الجين المستهدف الذي تم استخدامه لاختبارات PCR هو LET وبالرغم من ذلك؛ يكون هذا الجين عبارة عن نقطة ساخنة خاصة بالحذف أو الإضافة أثناء تطور السرطان. تزيد احتمالية النتيجة السلبية الخاطئة وبالتالي تزيد شدة المرض. تستهدف الطريقة للاختراع الحالي جين 1.1 والذي يكون أقل عرضة للحذف.
YO وبالإضافة إلى ذلك؛ وفي الطلب الدولي رقم رقم 1185977/٠١٠7”-١أ ؛ تشتمل طرق اكتشاف وانتساخ HPV على تداول منتجات 0018 في المعمل المفتوح. ويشتمل ذلك على المخاطر المتمثلة في الملوثات. يتم إجراء الطريقة الخاصة بالاختراع الحالي في نظام مغلق يعمل على القضاء على المخاطر وبالتالي؛ إزالة تلك المخاطر والتأكيد على النتائج التي يمكن الاعتماد Lede والاستغناء عن العمل الزائد المطلوب للتوثيق وتسهيل عمل PCR في المعمل المفتوح. وبالاعتماد على ما تم
ا ذكره أعلاه؛ هناك حاجة في المجال لطرق جديدة؛ وبادئات ومسبارات وأطقم لاكتشاف وانتساخ 7 والذي يكون عال الحساسية؛ وقابل لإعادة الإنتاج وأقل سعراً من الاختبارات الموجودة والتى تكون مناسبة لبرامج الفحص الكتلية. الوصف العام للاختراع © يصف الاختراع الحالي تطور طريقة POR الكمية في الزمن الفعلي باستخدام بادئات توافقية و
مسبارات TaqMan محددة النوع -المتنوعة التي تسمح بالكشف الحساس و الكشف لمحدد و انتساخ ثلاثة عشر نوعاً من HPV مكونة للررم رمي (FA (FO TY (FY VA 5 HPV £6( اف (0A oT (oY 09 و LTT بالإضافة إلى ذلك؛ ؛ تكشف الطريقة الخاصة بالاختراع الحالي أنواع HPV مثل «YT VON YHPV 0 ل ل ل امف 08 CTA CTY علا VY الا AY
٠ وبشكل أكثر تحديداً ¢ يتعلق الاختراع الحالي بطريقة لاكتشاف و/أو انتساخ و/أو الحساب الكمي لوجود أنواع الفيروس الحليمي البشري (HPV) في عينة بيولوجية ؛ يشتمل الاختبار على الخطوات التالية : (i) تضخيم شظية حمض نووي amplification of a nucleic acid fragment من HPV في وجود polymerase DNA ¢ بادئ PCR أمامي مع أوليجيو نيوكليوتيد oligonucleotide من المتوالية
٠ رقم: ١ أو نظير له ¢ بادئ عكسي PCR 1 reverse primer مع oligonucleotide متوالية تم اختيارها من مجموعة تتكون من : متوالية رقم : oF المتوالية رقم : oF المتوالية رقم : of المتوالية رقم : © أو المتوالية رقم : + أو نظير منها أو مسبار probe مع متوالية oligonucleotide تم اختيارها من المجموعة التي تتكون من : المتوالية رقم : 7 المتوالية رقم Ar المتوالية رقم : 9؛ المتوالية رقم : ٠١ المتوالية رقم :
م - VY المتوالية رقم : AY المتوالية رقم : ٠١ المتوالية رقم : ٠5 المتوالية. رقم : (Vo المتوالية رقم ١ : » المتوالية رقم : OV المتوالية رقم : OA المتوالية رقم : 8 المتوالية رقم : ٠0 المتوالية رقم : (YY المتوالية رقم : (YY المتوالية رقم : YY المتوالية رقم : (Yo المتوالية رقم YT: المتوالية رقم : 7 المتوالية رقم : 30 المتوالية رقم : FY المتوالية رقم : 7 © المتوالية رقم : (YE © المتوالية رقم : (Yo المتوالية رقم : (TV المتوالية رقم : (FA المتوالية رقم : (YA المتوالية رقم 5٠: المتوالية رقم : 44 ؛ المتوالية رقم : ©5؛ المتوالية رقم : 1456؛ المتوالية رقم : 497 المتوالية رقم : (EA المتوالية رقم : 83( المتوالية رقم : ٠ المتوالية رقم : )0 المتوالية رقم : OY المتوالية رقم : ©2؛ المتوالية رقم : 27» Addl رقم : OY المتوالية رقم : ON المتوالية رقم : 4 المتوالية رقم : 11 المتوالية رقم : AY المتوالية رقم : AT المتوالية رقم : TE المتوالية رقم Ye : 18 المتوالية رقم : 173 المتوالية رقم : TA المتوالية رقم Ver المتوالية رقم : VY المتوالية رقم : VY المتوالية رقم : YY المتوالية رقم : (VE المتوالية رقم (Vor المتوالية رقم : VY المتوالية YA) المتوالية .رقم : 79 و المتوالية رقم : 40 أو نظير لها ؛ تم ترقيمها بصبغة fluorescence وجزيء مخمد quencher molecule ¢ و وسيلة تحكم داخلي ¢ 0 اكتشاف التغير في التألق الفلورسنتي detection of a change of fluorescence 5 تحديد نوع HPV ٠ . بالإضافة إلى ذلك؛ تشير الطريقة الخاصة بالاختراع الحالي إلى الكشف عن و/أو انتساخ و/أو التقدير الكمي المتزامن لرجرد HPV ف تف كف (TA )0 تف كت حب فى OF) 0A م و AYO عينة بيولوجية ؛ تشتمل الطريقة على التفاعلات المتوازية الأربعة التالية: التفاعل = ) تضخيم شظايا الحمض النووي amplification of the nucleic acid fragments
a — _ من oY ¢ YA HPV و 09 في وجود polymerase (i) حمض نووي nucleic acid (ii) بادئ PCR أمامي مع متوالية oligonucleotide من المتوالية رقم: ١ أو نظير لهاء iii) ( بادئ عكسي PCR reverse primer مع متوالية oligonucleotide رقم : 7 أو نظير لهاء (iv) © مسبار probe مع oligonucleotide من المتوالية رقم: Veh و 9 أو نظير له ؛ تم ترقيمه بحامل للفلور fluorophore و جزيء مخمد quencher molecule و ب) اكتشاف التغير في طول موجة التألق الفلوروسنتي detection of a change of fluorescence الذي يحدد نوع HPV 8 87 و 545؛ التفاعل FY ) تضخيم شظايا الحمض النووي amplification of the nucleic acid fragments ٠ .من TACVOTHPY و 13 في وجود polymerase (i) حمض نووي nucleic acid (ii) بادئ PCR أمامي مع oligonucleotide من المتوالية رقم: ١ أو نظير له ؛ gal ( iii) عكسي PCR reverse primer مع oligonucleotide من المتوالية رقم: ؟ أو نظير له ¢ (iv) ٠ مسبار probe مع oligonucleotide من المتوالية رقم: ١ ٠ و ١ أو نظير له ؛ تم ترقيمه بحامل للفلور fluorophore و جزيء مخمد quencher molecule و
= و١ ب) اكتشاف التغير في طول موجة التألق الفلوروسنتي detection of a change of fluorescence منه الذي يحدد نرع FA HPV 1ف 285 و 17 تفاعل 3؟-أ) تضخيم شظايا الحمض النووي amplification of the nucleic acid fragments من HPV 186016 و OA في وجود polymerase (i) © حمض نووي nucleic acid (ii) بادئ PCR أمامي مع oligonucleotide من المتوالية رقم ٠ أو نظير له ؛ tab ) iii) عكسي PCR reverse primer مع oligonucleotide من المتوالية رقم : ؛ أو نظير له ¢ iv) ) مسبار probe مع oligonucleotide من المتوالية رقم: ١5 ٠46 و ١١ أو نظير له ؛ تم ٠ ترقيمه بحامل للفلور fluorophore و جزيء مخمد quencher molecule و ب) اكتشاف التغير في طول موجة التألق الفلوروسنتي detection of a change of fluorescence منه الذي يحدد نوع VT HPV ¢ £0 و OA التفاعل ؛-ا ) تضخيم شظايا الحمض النووي من 7١ HPV ؛ 7778 و وسيلة تحكم داخلية في وجود : polymerase (i) ٠ حمض نووي nucleic acid (ii) بادئ PCR أمامي مع oligonucleotide من المتوالية رقم ٠ أو نظير له ؛
PCR reverse primer Se £52 ( iii) مع oligonucleotide من المتوالية رقم : © أو نظير له ‘ (iv) مسبار probe مع oligonucleotide من المتوالية رقم: OA OY 19 و Ye أو نظير ad تم ترقيمه بحامل للفلور fluorophore وجزيء مخمد quencher molecule و (v) © وسيلة تحكم داخلي و (ب) اكتشاف التغير في طول موجة التألق الفلوروسنتي detection of a change of fluorescence منه الذي يحدد نوع TO (TY 7١ HPV ووسيلة تحكم داخلية . يشير الاختراع الحالي أيضاً إلى بادئ لتضخيم HPV تم اختياره من مجموعة تتكون من : المتوالية رقم : ١ المتوالية رقم (Yi المتوالية رقم : © المتوالية رقم : cf المتوالية رقم : © و المتوالية رقم : 0٠ 10 بالإضافة إلى ذلك؛ ؛ يشير الاختراع إلى مسبار probe للكشف عن HPV و/أو انتساخ و/أو التقدير الكمي؛ تم اختيار المسبار من مجموعة تتكون من : متوالية رقم : لا المتوالية رقم : 6 المتوالية رقم :5 المتوالية رقم : ٠١ المتوالية رقم ١ المتوالية رقم : ONY المتوالية رقم AY: المتوالية رقم Veo المتوالية رقم Vo: المتوالية رقم : Yo خلا المتوالية رقم ب كال المتوالية رقم نمل المتوالية رقم 4 المتوالية رقم ١ المتوالية رقم ؛: YY المتوالية رقم : ١ المتوالية رقم : YY المتوالية رقم : ١ المتوالية رقم ١ المتوالية رقم : YY المتوالية رقم : ١٠ المتوالية رقم ١ المتوالية رقم : ١ المتوالية رقم : ل المتوالية رقم ١ المتوالية رقم FV: المتوالية رقم YA: المتوالية رقم Fa: المتوالية رقم yy -
of) المتوالية رقم :44:0 المتوالية رقم : ©5؛ المتوالية رقم ET المتوالية رقم : 57 المتوالية
رقم : 58 المتوالية رقم : 69؛ المتوالية رقم : con المتوالية رقم : ١©؛ المتوالية رقم : OF
المتوالية رقم : 00 المتوالية رقم : 0 المتوالية رقم : OV المتوالية رقم : (OA المتوالية رقم :
8 المتوالية رقم : )1 المتوالية رقم : AY المتوالية رقم : 17؛ المتوالية رقم : 64؛ المتوالية رقم
© : 10 المتوالية رقم : 13 المتوالية رقم : 18 المتوالية رقم : 7٠١ المتوالية رقم : VY
المتوالية رقم : (VY المتوالية رقم : VY المتوالية رقم : (VE المتوالية رقم : 75؛ المتوالية رقم :
٠لا المتوالية رقم : VA المتوالية رقم : VE ومتوالية رقم : 80 أو نظير لها .
يشير الاختراع الحالي Lad إلى طقم تشخيص لاكتشاف و/أو انتساخ و/أو الحساب الكمي ل
OY HPV بيولوجية ؛ تشتمل على بادئات أمامية وعكسية ؛ مسبارات خاصة ب due في HPV كف كف (07 (0% (OF (OF لف (£0 (£8 (EY حك (fa (FA FO تخا ماص تك نكت اك ٠
نت (Ve TA TT آلاء آلا و (AY وسيلة تحكم موجبة داخلية 5 .polymerase DNA
شرح مختصر. للرسومات
سيتم OY) شرح الرسومات والجداول :
الأشكال )1172 توضح تحليلاً للعينات و منحنيات التضخيم الخاصة بنوع PCR التوافقي المتعدد ٠ المزدوج في الوقت الفعلي الخاص بالكشف المحدد عن أنواع OAV HPV لت TY متك
: و 17 حيث 04 (OA (0% (OY (0) (£0
الشكل رقم ١ : يوضح تضخيم amplification ل VA HPV في مجموعة تضخيم متزامن .١
د س١ الشكل رقم ١ : يوضح تضخيم ل OY HPV في مجموعة تضخيم متزامن .١ الشكل رقم ؟ : يوضح تضخيم ل HPV 095 في مجموعة تضخيم متزامن .١ الشكل رقم ؛ : يوضح تضخيم ل HPV 349 في مجموعة تضخيم متزامن 7. الشكل رقم 5 : يوضح تضخيم ل ©١ HPV في مجموعة تضخيم متزامن 7. © الشكل رقم + : يوضح تضخيم ل BOT HPV مجموعة تضخيم متزامن . الشكل رقم ١ : يوضح تضخيم ل HPV 67 في مجموعة تضخيم متزامن 7. الشكل رقم A : يوضح تضخيم ل VT HPV في مجموعة تضخيم متزامن .١ الشكل رقم 9 : يوضح تضخيم ل HPV £0 في مجموعة تضخيم متزامن 3. الشكل رقم ٠١ : يوضح تضخيم ل OA HPV في مجموعة تضخيم متزامن 7. ٠١ الشكل رقم ١١ : يوضح تضخيم ل ١ HPV في مجموعة تضخيم متزامن 4 . الشكل رقم VY : يوضح تضخيم ل VY HPV في مجموعة تضخيم متزامن ؛ الشكل رقم VY يوضح تضخيم ل VO HPV في مجموعة تضخيم متزامن 4 . الشكل رقم ٠6 : يوضح منحنيات التضخيم الخاصة بوسيلة تحكم داخلية . الأشكال أرقام 77-١١ : توضح مجموعات تضخيم وتخفيف من HPV VA HPV 136 HPV
- vg
XPTr و PTF مع بادئات من 56 HPV و 3# HPV (YY HPV 7١ الجدول رقم ١ : يشير إلى قائمة من المسارات التي تم توضيحها . الجدول رقم ؟ : يشير إلى قائمة من المسبارات التي تم توضيحها . الجدول رقم ؟ : يشير إلى تركيبة PCR المتعدد من مجموعة تضخيم متزامن ٠ مجموعة تضخيم © متزامن oF مجموعة تضخيم متزامن ؟ و مجموعة تضخيم متزامن 4 . الجدول رقم ؛ : يشير إلى طريقة تقييم توافقية في الزمن الفعلي على عينات إكلينيكية . الجدول رقم © : يشير إلى مجموعة ١١ HPV لصيغة خلط أساسية . الجدول رقم 76 : يشير إلى مجموعة oF HPV لصيغة خلط أساسية . الجدول رقم ١ : يشير إلى مجموعة oF HPV لصيغة خلط أساسية . Ve الجدول رقم A : يشير إلى مجموعة of HPV لصيغة خلط أساسية الجدول رقم 9 : يشير إلى الحساسية التحليلية لأنواع HPV المستهدفة . تقوم طريقة PCR في الزمن الفعلي الكمية الخاصة بالاختراع الحالي بكشف كل أنواع HPV المكونة للورم المخاطية التي تم التعرف عليها أقل من مستويات تصل إلى GUE لكل عينة أو ١٠ أقل. تكون الطريقة شبه كمية بشك أساسي حيث تتم قراءة النتائج في شكل قيم Cr والتي تكون نسبية بالنسبة للتركيز الأولي من DNA المستهدف. من الممكن أيضاً أن يتم عمل تفاعلات في
Che تضمين مجموعات تخفف خاصة بالنوع (الأنواع) المستهدفة لكي يتم Gob نمط كمي كامل عن إجراء منحنيات قياسية مستهدفة. يكون للطبيعة الكمية للطريقة العديد من المزايا. في الدراسات المختصة بالوبائيات من الممكن أن يتم تصميم قيمة مقطعية ثابتة لكل الأنواع؛ وبالتالي؛ القضاء على تقديرات التكافؤ المنحازة التي تنتج من اختلاف معين في النوع في الحساسية التحليلية. تم أيضاً اقتراح أنواع عالية العدوى من ©
HPV والتي تكون أكثر من 900060 ل61 لكل عينة والتي تكون مهمة من الناحية الإكلينيكية على الرغم من عدم حسم تلك النقطة. في الطريقة المتعددة التوافقية» من الممكن أن يتم ضبط الجزء المقطوع عند أي قيمة كمية مطلوبة. وفي Aled يمكن أن يكون استخدام الطريقة الكمية في تتبع لنمو العدوى والتأثيرات الخاصة بالمعالجة التالية.
٠ تكون الحساسية التحليلية للطريقة من ؛-4060 GU لكل الأنواع الموجودة في ©٠0٠0 نانو جرام من DNA البشري, والذي يكون مناظراً ل ٠١ x ve * خلية. وبالتالي Off وجود فيروس منفرد في 96 من WAN يمكن أن يعطي نتائج إيجابية. وعند تركيزات DNA البشرية المنخفضة المناظرة ل75, ” ٠١ * خلية؛ تقوم الحساسية على تحسين العامل الخاص ب .٠١ ويعني ذلك الوصول إلى نتائج إيجابية خاطئة نتيجة لوجود عينات WDA فقيرة والتي يمكن أن تمثل مشكلة.
٠ وعلى الرغم من ذلك؛ فمن الممكن أن يتطلب إجراء الاختبار في نمط كمي كامل وجود معايير خالة بتركيز DNA الخلوي. وبالمقارنة باختبار الإمساك المهجن (11011) hybrid capture ؛ وبالتالي تم اكتشاف أن HPV في عينات إكلينيكية أكثر كما هو متوقع في الحساسية الخاصة بالاكتشاف والطريقة المتعددة التوافقية طبقاً للاختراع الحالي lly تكون على الأقل في ترتيب أهمية أعلى. وبالتالي تغطي الطريقة طبقاً للاختراع كل أنواع HPV المولدة للورم في أحد الأمثلة. وفي الطريقة
— \ = —
التي تم تصميمها بشكل خاص لإعطاء أربعة أشكال من الأنبوب. يعطي ذلك استخدامات مفضلة خاصة ب ST) VY XA عيناً) و TEA) YE X ١١ عيناً) من الأشكال التي تكون قياسية في العديد من أجهزة PCR في الزمن الفعلي. وبالرغم من ذلك؛ من الوضاح أن الطريقة طبقاً للاختراع يمكن أن يتم استخدامها في شكل مختلف بدون الخروج من مجال الاختراع الحالي.
© بالإضافة إلى ذلك؛ وفي الطريقة الخاصة بالاختراع الحالي؛ فإن بادئ أمامي واحد على الأقل وأربعة بادئات عكسية تكون مطلوبة. ويعمل ذلك على تبسيط جودة التحكم وتقليل تكلفة التصنيع. وطبقاً لمتغيرات المتوالية المعروفة في الاختراع الحالي؛ تم الأخذ في الاعتبار المنطقة المستهدفة لجين 1.1 قبل تصميم البادئ والمسبار probe وكل مواضع التغييرات والتي يتم تجنبها أو حسابها فيما يتعلق بالتعديلات الخاصة بمتواليات المسبار. :
٠ تم قياس حساسية الطريقة طبقاً للاختراع في وجود 5٠٠0 نانو جرام من DNA البشري والذي يناظر ٠١ © V0 ' من الخلايا البشرية وبالتاي تحاكي بشكل جيد الظروف في العينة الإكلينيكية الغنية بالخلية. jag ذلك حساسية تم تحسينها Led يتعلق بكل المستهدفات من أنواع 11717. تستهدف الطريقة الخاصة بالاختراع Jal جين LT والذي يكون أكثر عرضة للحذف. يمكن استخدام البادئات الخاصة بالاختراع الحالي مع تعديلات إضافية لكي يتم الكشف عن الأنواع
٠ المرتبطة ب 11017 مثل « من بين أنواع أخرى HPV فت نت فى OF OF (£8 (EY (EY لت AY VF YY Va CTA في جهاز PCR في الزمن الفعلي المستخدم في الطريقة طبقاً للاختراع الحالي هناك اثنين من
_ 7 \ اس
القنوات اللونية الفارغة التي تسمح بإمكانية إضافة أنواع HPV المكونة للجين الخاص بالاختبار.
تكون المجموعة المتعددة التي تم وصفها في طلب الاختراع الحالي عبارة عن واحدة من عدد من
المجموعات المحتملة. على سبيل المثال؛ فإن البادئات التي يتم استخدامها في المجموعة © تكون
معروفة بأنها قادرة على تضخيم أنواع HPV وهفي 2 (YY (YY (YA HPV كك نمف (OA 08 © و +1 ووسيلة تحكم داخلية ١ HPV وبالتالي فإن أي من تلك الأنواع يمكن أم يتم تحديدها بتلك
المجموعة.
في الاختراع الحالي؛ يتم استخدام جهاز 708 في الزمن الفعلي بحيث يشتمل على أربعة قنوات
لونية.
وبالرغم من ذلك؛ فإن أجهزة 0018 في الزمن الفعلي يكون لها خمس أو ست أو سبع أو أكثر من ٠ القنوات اللونية والتي تكون متغيرات بديلة للقنوات اللونية الخاصة بالاختراع الحالي المحتملة. يمكن
أن يتم بعد ذلك دمج البادئات والمسبارات في ثلاثة أو اثنين من التفاعلات. يمكن أن يتم بعد ذلك
دمج البادئات والمسبارات في ثلاثة أو أثنين من التفاعلات الخاصة بالكشف عن أنواع HPV
مشابهة.
في الاختبار الحالي؛ يمكن أن يتم تحليل شكل ٠١0 عينة في يوم العمل وبالتالي جعل الاختبار Yo مناسباً أكثر للمعامل ذات الإمكانات المنخفضة إلى المتوسطة.
يمكن تعديل الدفعات الأكبر من العينات باستخدام شكل به 784 عينا من جهاز PCR في الزمن
الفعلي؛ بالرغم من القدرة المتاحة من أجهزة استخلاص DNA والتي تكون أكثر أهمية في تحديد
زمن تحليل PCR
YA — - يكون PCR في الزمن الفعلي عبارة عن اختبار نظام مقفل. وبالتالي من غير الضروري أن تتم معالجة العينات في المعمل المفتوح. وبالتالي يتم تقليل المشكلات الخاصة بتنفيذ PCR بشكل كبير ويقلل ذلك بدوره من المصادر التي ثم تكريسها للتحكم في الملوثات الكبيرة المرتبطة بتحليل PCR القبلي المفتوح. © تكون الطريقة الخاصة بالاختراع الحالي من بين أشياء gal لها قيمة في برامج الفحص حيث يكون من المفضلة الانتساخ الجيني ل HPV تم وصف النماذج المفضلة من الاختراع الحالي. وبالرغم من ذلك؛ سوف يكون من المفهوم أن الاختراع ليس مقتصراً على نماذج معينة وأن تغييرات متعددة يمكن أن يتم إجراؤها فيه من خلال ذوي المهارة في المجال بدون الخروج من مجال وفحوى الاختراع كما تم وصف ذلك في عناصر ٠ الحماية التالية. توضح الأمثلة التالية الاختراع ولكنها لا تحدده. الأمثلة المثال رقم plasmids :١ تم نقل المنطقة المستهدفة التي تشتمل على plasmid) ات من جينات 1.1 من 11017 35 «V1 دك لتك (FA (YO فى لف كف كف (OA 4م 5 33 إلى Escherichia coli DHS ألفا ٠ وتم عزلها عن طريق الطرد المركزي المتدرج لكثافة (Fritsch et al) caesium chloride أو لطقم .Qiagen HiSpeed Midi Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 284 تم تحديد تركيز DNA عن طريق القياس الضوئي الطيفي بالأشعة فوق البنفسجية.
و١ - JU) رقم ؟: العينات الإكلينيكية clinical samples كانت العينات الإكلينيكية عبارة عن عينات دموية تم إرسالها إلى معملنا للتحليل الروتيني HPV وذلك Les يتعلق بالفحص الثانوي JIA] التنسج منخفض الدرجة (LSIL) أو الخلايا المشابهة ASCUS) ؛ أو العينة غير الملائمة). تم تجميع العينات وتن نقلها في ناقل تحضيري رفيع من نوع © ©0717 (وسط (Crawley, UK « CYTYC وذلك طبقاً لتوصيات المُصنع. تم الطرد المركزي ل ٠ مل من العينة عند ©00١٠ لفة في الدقيقة لمدة ٠١ دقائق وتمت إعادة تعليق الحبيبات بعد ذلك في ٠ ميكرو لتر من محلول ملحي منظم من الفوسفات Jé phosphate buffered أن يتم استخلاص DNA باستخدام جهاز استخلاص 1118 ذاتي باستخدام طقم استخلاص MagNAPure (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany) LC DNA تم تخفيف DNA في ٠ ميكرو لتر. 0٠ ثم استخدام عينات إكلينيكية تم اختبارها سابقاً مع اختبار 11011 باستخدام PCR التوافقي ALS, الخط العكسي reverse line لكي يتم تقييم الاختبار. الشكل رقم ؟- اختبار الإمساك بالجزء المهجن تم إجراء اختبار الإمساك بالجزء المهجن الصحي (Digene, Gaithersburg, MD) باستخدام due بها YO مل من العينة Bala لتعليمات المصنع. Vo المثال رقم ؟: تصميم البادئ: لكي يتم تحديد المستهدفات المناسبة لبادئات PCR التوافقية؛ تمت محاذاة متواليات جينات 1.1 من أنواع ١ HPV نخد (OA (OT (OF (0) (£0 (YA (YO (FY (FY 09 و TT بالإضافة إلى 6 باستخدام (CLUSTALW ولكي_يتم توليد متواليات إدخال منفصلة لكل محاذاة من CLUSTAL + يتم استخدام متوالية النوع الحال للبروتين من نوع HPV في بحث BLAST Ye بالإضافة إلى تحديد متواليات الصورة المتغيرة غير النموذجية. تم بعد ذلك استخدام المتوالية عند
VI
المناسب. تم تحديد المناطق TUPAC: مواضع متغيرة عن طريق استبدال شفرة الغموض الخاصة مناطق محافظة بشكل كبير وتم ol genome 110716 على _6774- nt 6348 المناظرة ل اختيارها لوضع بادئات عكسية أمامية وعكسية على الترتيب. يمكن أن يؤدي ذلك إلى بناء بادئات وحيث أن زوج البادئ المذكور لم يتم تضخيمه فإن كل أنواع المستهدفات لا تفي PTE و 7 بالغرضء أو الظاهرة التي لا يتم عزوها غلى الاستقرار المنخفض للمجموعات التضخيم متزامن مع © PTY أو النسخ الأقل تحللاً من +77 التي تم التوصل إليها. تم وضع المتواليات في مجموعات بداخل مجموعات متجانسة على أساس المسافة الخاصة بالمتواليات المستهدفة من البادئ الأمامي والخلفي والتي تم عملها في : .CLUSTALW (http://www .ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) « HPV39¢ )١ (المجموعة HPV59¢ HPV52¢ HPVIS عن ple وكانت تلك المجموعات | ٠ (المجموعة 7) 110174511017164 .1101758 (المجموعة 7( و HPV66 5 11017561101 و110735_بالإضافة إلى وسيلة تحكم داخلية 117176 (المجموعة ؛). ولكل 1 وتم تحديد البادئات العكسية الخاصة بالمجموعات CLUSTAL مجموعة؛ يتم عمل محاذاة جديدة لكي يتم تقليل تحلل البادئ وتحسين الحساسية. تم الوصول إلى المواضع المنوعة عن طريق pyrimidine استخدام التأين أو قاعدة البطاقة التي لم تتم معالجتها أو باستخدام ثيامين في شكل Vo شامل (باستخدام الاستقرار الخاص بزوج القاعدة غير purine شكل 4 guanine شامل أو مختلطة. nucleotides دمج 0 (GT المخروطي .وتم الاحتفاظ بمتوالية PTrGrds PTrGr2 و PTrGrl يمكن أن يؤدي ذلك إلى تصميم بادئات ¥ الأساسية في المجموعة
Y \ —_— _ تم فحص منطقة مستهدفة بديلة مناظرة للمواضع 17370-744 على 110716 لكي يتم وضع البادئ العكسي. تم تصميم البادئ 7172 لكي يتم استهداف المنطقة المذكورة. تكون 7172 مناسباً لتضخيم أنواع تضخيم أنواع HPV تا عملت نت TO FY فى كف تف دف 4 و 0% © الجدول رقم :١ قائمة المتواليات an as ١ 5-TG(CT)AAA TAT CC(AT) GAT PTf TAT (AT)TI JAA ATG-3 Y 5-TGT AGC CAG TAT GG(CT) TTA | PTrGrlb TTG AA-3 v 5-TG(GT) AGC CAA TAA GGT TTA | PTiGr2 TTA AA-3 TGI AIC CAA TAI GG(CT) TTA | PTr957 -5 ‘ TTG AA -3 TGT AIC CAA TAT GGt TTA TTA | PTrGrd -5 AA-3 C(GT)G T(AG)G TAT CIC CAI PTr2 -5 < CAA GTA ACA AA-3 المثال رقم 10 تصميم المسبار probe : تم تصميم مسبارات TaqMan MGB باستخدام برنامج بادئ يعبر عن البادئ ) Applied (Biosystems, Foster City, CA) باستخدام amplicon مستهدف كتوالية إدخال وتحديدها بأنها ٠ طول amplicon الذي يكون أكبر من أو يساو 7٠١ زوج قاعدة.تم ضبط البرنامج لكي يتم الوصول إلى بادئات عند درجة حرارة تصل إلى ١٠م ومسبارات عند ١٠م أو أعلى Gao Ve) يكون من الضروري؛ لكي يتم التعويض عن عدم قدرةٍ البرنامج أن توجد المسبارات بدون بواديء
yy - - تحديد الموضع بشكل متزامن؛ وقد تم وضع المتوالية بين أقواس خاصة بمتواليات البادئ الوهمية. تم توفير مسبارات TaqMan MGB عن طريق Applied Biosystems وتم ترقيمها باستخدام FAM dls NED VIC sf إعادة ترقيمه Lad يتعلق بقنوات اللون القياسية ADNAN من مجموعات AB Prism 7000 في أجهزة PCR في الزمن الفعلي. تم تضمين مسبارات MGB في الرابطة © المحززة الفرعية Ally تعمل على رفع درجة حرارة المسبار probe وبالتالي السماح باستخدام مسبارات أقصر ٠ المسبارات المظلمة (وسيلة إخماد غير فلورية (non-fluorescent quencher تكون القناة الرابعة التي يتم استخدامها بشكل عادي كمرجع سلبي متاحة على مجموعات أجهزة ABI 0. تستخدم تلك القناة بشكل مثالي صبغة YL ROX تكون مسبارات MGB التي تم ترقيمها ب ALE ROX للحصول عليها. (Sly يتم تحقيق «Tm فغن اثنين من الطرق تم استخدامها. في ٠ الطريقة الأولى تم تصميم المسبارات في شكل مسبارات 31063 TagMan ؛ وتم تحديدها بعد ذلك بأنها مسبارات LNA على أساس اقتراحات خاصة بالموزعين (Sigma Genosys) 0 استخدام موقع الويب /00ع.«110:/108-00. تقوم مسبارات INA بتضمين deoxyribose في المادة الأساسية من فوسفات السكر التي تعمل على استقرار البنية الحلزونية وزيادة Tm وعلى نحو بديل؛ تم استخدام التعبير عن البادئ بشكل بديل لكي يتم تصميم مسبارات TagMan تقليدية باستخدام مجموعة نطية ٠ _من البرنامج خاصة بهذا الغرض ومسبارات أقل من YY زوج قاعدة تم تقييمها أيضاً. تم تصميم كل المسبارات باستخدام درجة حرارة 7١ + 7 م. كانت المسبارات التي تم ترقيمها ب ROX عبارة عن طرف ©” مرقم بالفلوروفور وتم إخماده مع 31102 عند طرف TY تمت مقارنة المسبارات المرشحة باستخدام محاذايات متوالية متعددة ل CLUSTALW من منطقة amplicon من الأنواع الثلاثة عشر المستهدفة من HPV و 117176 مع مواضع متغيرة تم تعليمها. ٠١ 5 اختيار متواليات المسبار probe المستهدفة من بين أنواع أخرى للاختبار الإضافي.
Cyr المثال رقم 11 برنامج PCR -6 تم إجراء كل التفاعلات الخاصة ب PCR على جهاز تحليل جيني من نوع 7000 ABI Prism أو (Applied Biosystems, Foster City. CA) YY. باستخدام الدالة المرجعية السالبة ROX والتي تم عدم تنشيطها لكي يتم السماح لقناة لون ROX أن تتغير لأغراض الاكتشاف. وفيما يتعلق بكل © التجارب الخاصة ببرنامج POR كان درجة الحرارة 56 م لمدة ١١ دقيقة ويلي ذلك £0 دورة من هوام ؛ ١٠١ ثانية؛ 45 © ثانيةء Te cae ثانية. وبالنسبة للتجارب التي تستخدم 57818 تم إجراء التحليل الخاص بالانفصال عند نهاية البرنامج. كان حجم التفاعل هو 5٠ ميكرو لتر من عينة DNA المستخدمة في كل التفاعلات. تم استخدام الخلطة الرئيسية الخاصة ب08 طبقاً لتعليمات المُصنع. ١ Testing of primers اختبار البادئات :٠ المثال رقم ٠ تانو مولار. تم اختبار الحساسية 0١0 عند تركيزات تصل إلى primers تم استخدام بادئات أضعاف من مجموعات ٠١ المستهدفة عن طريق التضخيم عند HPV التحليلية فيما يتعلق بأنواع
Sigma ( البشري DNA نانو جرام/ميكرو لتر من ٠٠١ في DNA plasmid التخفيف الخاصة الذي تم تضخيمه باستخدام 57138 الأخضر DNA تم اكتشاف -(Aldrich, St Louis, MI green qPCR F400 (Finnzymes, الأخضر من طقم Finnzymes DyNAmo SYBR باستخدام ٠ الذي تمت زراعته باستخدام تحليل منفصل. تم تحديد PCR باستخدام برنامج ( Espoo, Finland) الحساسية التحليلية كتركيز مستهدف منخفض الذي يعطي قمة انفصال خاصة بالنوع غير الملتبس. يكون المبدأ الخاص بالبادئ المقبول عند هذه المرحلة الخاصة بالتحليل هو حساسية تحليلية تصل إلى £40 GU أو أفضل Lag يتعلق بكل الأنواع المستهدفة HPV
امج - المثال رقم 1A تقييم مسبار probe والمعايرة تم أولاً استخدام المسبارات عند تركيزات تصل إلى ٠٠0 نانو مولار. تم إجراء الاختبار الخاص بالمسبارات عن طريق اختبار TagMan PCR باستخدام طقم Finnzymes DyNAmo probe PCR F450 (Finnzymes, Espoo, Finland) أو في التجارب التالية؛ تستخدم PerfeCta qPCR FastMix ٠١ UNG Quanta Mastermix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD) © أضعاف من التحليل التسلسلي من النوع المستهدف HPV في ٠٠١ نانو faba ميكرو لتر من DNA والبادئات القريبة. كانت إشارةٍ التضخيم الإيجابي من 4060 GU من المستهدف DNA هو المبدا الأقل فيما يتعلق بالمصادقة على اختبار المسبار مرة أخري. وعندما يتم استخدام تركيزات عالية في التفاعلات المتعددة» تنحو المسبارات أن تتداخل مع بعضها البعض. وبالتالي؛ فإن معايير المسبار يمكن ٠ إجراؤها لكي يتم تحديد تركيزات المسبار عند أقل حد لها التي يمكن استخدامها بدون فقد في الحساسية. تم اختبار تركيزات المسبار ٠٠١ oe Yeo و6 نانو مولار في مقابل 5006 و5665 E05 و6104 من النوع المستهدف. تم استخدام أقل تركيز من المسبار probe الذي يمكن استخدامه بدون فقد في الحساسية التحليلية في التفاعلات التضخيم متزامن. المثال رقم 9 : اختبار المسبارات في المجموعة المتعددة Ve وفيما يتعلق بالاختبار المتعدد؛ تم دمج المسبارات عند تركيزات مختارة مع بعضها ومع بادئات قريبة وتم اختبارها في مقابل مجموعات تخفيف من ثلاثة إلى أربعة أنواع من 11717 في تفاعلات PCR كانت المبادئ الخاصة بقبول توليفة من مجموعة متعددة هي الحساسية ل 4060 SGU أفضل وبتفاعل غير متشابك مع أنواع أخرى في المجموعة. حيث يتم اكتشاف الفقد غير المقبول للحساسية التحليلية أو التفاعل التبادلي في مجموعة Sammie تكرار التفاعلات باستخدام مسبارات
— Y Qo الخاص بالتداخل. تم اختبار المجموعات الناجحة probe في كل التوليفات لكي يتم تحديد المسبار من كل الأربعة عشر نوعاً من 1177 في الاختبار لكي يتم اكتشاف التفاعل 01 5,٠١ في مقابل التبادلي. وعندما تتم ملاحظة التفاعل التبادلي؛ يتم اختبار مسبار التفاعل التبادلي في مقابل في التفاعل لكي يتم تحديد ما إذا كان التفاعل التبادلي نتيجة HPV التبادلي لنوع (أنواع) Je Ll أو نتيجة التأثيرات الثانوية المسببة عن HPV تفاعل مباشر بين المسبار والتفاعل التبادلي لنوع © رفض المسبارات لكي يتم التدخل أو التفاعل التبادلي؛ sale) طريق المجموعة المتعددة. حيث تمت وتم تصميم اثنين من المسبارات وتم اختبارها كما تم وصف ذلك أعلاه. .١ تم اختبار المسبارات التي تم اختبارها كما هو موضح في الجدول رقم الجدول رقم . قائمة المسبارات رقم 1/8 TaqMan FAM 7 ATA CAC ACA GCT PTpl18(7) ١
MGB GCCAGGT
HPV18 TagMan FAM vy CTTCACCTGGCAGCT PTp18(8) ١
MGB G
HPV18 TagMan FAM 9 CACTGTGCCTCAATC PTp18(130) ١
MGB
HPV 18 TaqMan FAM ل ACTGTGCCTCAATCC PTpl18(131) ١
MGB
HPV18 | TaqMan | FAM Yo | ACCTGGCAGCTGTGT | PTpl8(177) ١
MGB
HPV52 TagMan | ROX/B 97 TCT AAC TCT GGC PTp 52 ١
MGB HQ2 AAT A
HPV52 LNA ROX/B A tc+Taa+Ctc+Tgget+Aa+Ta PTps2(4) ١
HQ2 c+Tgc
HPV539 | TagMan | NED q TAC TGA CAT ACG PTp 59(1) ١
MGB TGC C
HPV59 | TagMan NED 1 AGGCGAGAACAGGTT PTp59(77q) ١
MGB TTTGCCAGACA
اج ا 3 MGB ACT ل rrr + MGB HQ2 TGC AAA ض HQ2 aatAcc HQ2 +Acc MGB CGT G MGB GAC MGB 00 MGB AG MGB AGA AC MGB TATA MGB CAATGGT MGB CAAT — I MGB CCCAGAG HPVI16 | TagMan | FAM 33 CTGTTGGTGAAAATG PTp16(94) 7 ia MGB CGATT MGB T MGB AGT GC
~ YY -
HPV33 LNA ROX/B £A ctactTge+Cte+Ta+Tt+Ca PTp33(2) 102 +Aag+Cag
HPV33 | TaqMan | NED. | $4 | TGCCTCTATTCAAAGC | PTp33(8)
MGB | VIC AGTGC
HPV33 | TaqMan | VIC | °. | GGAACTACTGCCTCT | PTp33(10)
ATTCAAAGCAGTGCT
GC
HPV33 | TagMan | ROX AGAGGCTGTTCCCGA | PTp33(141)
TGACCTG
HPV33 | TaqMan | ROX | oY | TTCCCGATGACCTGTA | PTp33(149)
CATTAAAGGT
HPV33 LNA ROX/B tg+Cetctatt+Caaag+Cagtg PTp33(9) ¢/y
HQ2 Cc
HPVS8 | TagMan | NED | '% | TCC GGT AAT ACT PTp 58
MGB GCA G
HPVS8 | TaqMan CCAGTGAACCTTATG | PTpss(36)
MGB GG
HPVS8 | TaqMan AAAACTTGGCGAGGC | PTpS8(1 18m)
MGB TG
HPV58 | TagMan | NED AAGGGTCCGGTAATA | PTps8(156)
MGB 0
HPV58 | TaqMan ACTGCAGTTATCCAA | PTpss(170)
MGB AGTA
HPV45 | TaqMan | VIC ATA CAC ACA ACT | PTp4s3) | vr
MGB GCC A
MGB GT
HPV45 LNA aa+TactAca+CaatCtg+C PTP45(4) V/Y 102 cagg ct+AgetGettAattAtg+C ١ PTpds(s)
HQ2 gtgaa
TaqMan TGCGTGAAACCCCTG | PTpas(172Q) | ٠7+
GCAGTTG
ACACAGTACCTACGG | 1045027 | v/v
MGB ACCTA
HPV4S | TaqMan | VIC | 1° | CGCTAATATGCGTGA | PTpds(ied) | vr
MGB AAC
TTT
ا ا
YA - - Imes | [| ame] MGB TG MGB G ض MGB GCT AC en GAATCGGT (1159) MGB GC MGB TA MGB AATTAA MGB MGB CGG MGB GTCT HQ2 GTGGG HQ2 GAGGTGGG HQ2 TGGG HQ2 GCGAGGT تكون المجموعة التضخيم متزامن التي يتم بها تحديد أنواع معينة قد تم وضعها في العمود الأول. تمت كتابة متواليات الحمض النووي المغلقة (LNA™) Locked nucleic acid sequences بأحرف الحالة المنخفضة بالنسبة للوحدات البنائية العادية والأحرف الأمامية في الحالة العليا مع "+" للوحدات البنائية LNA . تم توضيح المسبارات التي تم استخدامها في خلط المجموعات المتنوعة © فيما يلي بخط كبير. يوضح الشكل الرمادي للنصل أن المسبار قد تم استبداله. تكون المركبات
الحاملة للفلور fluorophors المستخدمة (ROX 5 + VICFAM) عبارة عن تلك المستخدمة في الطريقة الحالية. وعلى نحو chu يمكن استخدام المركبات الحاملة للفلور وتوليفات من المركبات الحاملة للفلور كما هو معروف للما هر في المجال . بعد الدورات من ١-؟ من Bole) تصميم المسبارات /البادئات؛ تكون الصيغة التضخيم متزامن في الجدول © كما يلي: الجدول رقم ©: التركيبة الخاصة بخلائط POR التضخيم متزامن. المجموعة التضخيم متزامن HPV 39,51,56,66 .١ البادئ المتوالية متوالية التركيز رقم :ِ TAT CC(AT) GAT PTT هممر5-10)0 ٠ ١ ثانو مولا J TAT (AT)TI IAA ATG-3 v 5-TG(GT) AGC CAA TAA GGT TTA PTrGr2 م ا 7 id TTA AA-3 مسبار المتوالية متوالية | النوع | التركيز probe رقم Sie. | INA 5-ROX PTp CA+CA+GATAT+ACG+TG+CAA+A 394) 0 CC-3 مولار ٠ TagMan 5- FAM AGT GGT AAT GGC CGT PTp نانو MGB yy GAC-3 51(156) مولار slo.
TagMan VY 5- VIC CAA TAC CTG CAG AGT PTp MGB TAT A-3 56(2) مولار JR TaqMan 1 5- NED 116 GAA GGG 100 CAA T- PTp 66 MGB 3 0) مولار ٠ المجموعة التضخيم متزامن 7. 39,51,56,66 HPV
— ov. —- مولا Te 5-TG(CT)AAA TAT CC(AT) GAT PTT نو مودر TAT (AT)TI IAA ATG-3
Toe تأنه - | 5-TG(GT) AGC CAA TAA GGT TTA | 2 و ودر | TTA هه on] we .من | LNA 5 5-ROX PTp > CA+CA+GATAT+ACGHTG+CAA+A هود ا مولار CC-3 .بن | TaqMan 5- FAM AGT GGT AAT GGC CGT PTp > MGB ١ GAC-3 51(156) مولار .من | TagMan | yy 5- VIC CAA TAC CTG CAG AGT PTp نو ٠
MGB TAT A-3 56(2) مولار .بن | TaqMan | yy | 5-NED 116 GAA 000100 CAA T- | PTp 66 > MGB 3 (1) مولار HPV 16,45,58 المجموعة التضخيم متزامن ؟. = pr ثانو مولا Tes ١ 5-TG(CT)AAA TAT CC(AT) GAT PTE ودر TAT (AT)TI IAA ATG-3
To a ٠ . 5-101 AIC CAA TAI GG(CT) TTA | PTr957 و مدر TTG AA -3 sd vo. | TaqMan | و 5-FAM ATT TGC AGT AGA CCC | PTpl6(6)
MGB AGA G-3 نانو مولار .م | TaqMan | yo | 5- VIC GIG AAA CCC CTG GCA GT- | PTp45(6)
MGB 3 نانو مولار to. | TagMan | و 5-100 166661 AAT ACT GCA G3 | 8
MGB
مولار HPV 6,31,33,35 .4 المجموعة التضخيم متزامن
البادئ المتوالية متوالية التركيز رقم qe 5- TG(CT)AAA TAT CC(AT) ATT 0111+ ٠ ١ نانو مولار AT (AT)TI IAA ATG -3 in 5-101 AIC CAA TAT GGt TTA TTA | PTrGrd ٠ ° : نانو مولار AA-3 | المتوالية متوالية . C.off Kons.i Quantamix رقم Vy 5-TAG 160 AAA TCG CAC GTC T- PTp نانو 74 NED 6(154) 3 مولار ٠ YA 5-TCC GGT TCA ACA GCT AC-3 PTp 31 نانو 9-١ VIC مولار Voy y sil Yo. 5 5-ROX PTp 33(9) tg(+C)ctetatt(+C)aaag(+C)agtge-BHQ2 مولار ٠ 7 5- GTA CCA CTG GCA CAT TG-3 PTp 35(4) ثأنو | هلأ FAM مولار المثال رقم :٠ وسيلة التحكم الداخلية Internal Control تم استخدام genome يحتوي على plasmid من نوع HPV غير المكون للورم من 110176 في شكل © وسيلة تحكم داخلية. يكون تحديد واختبار مسبار probe التحكم الداخلي مثل المسبارات الأخرى. ولكي يتم تحديد التركيزات المناسبة من وسيلة التحكم الداخلية؛ تمت إضافة 6ع إلى تفاعلات المجموعة PCR 4 عند تركيزات تخفيف تصل إلى عشر مرات من 5,٠١ " 61 إلى 560 61 لكل تفاعل. تم استخدام الخليط المتعدد الذي يشتمل على وسيلة التحكم الداخلية في اختبار التضخيم باستخدام أنواع ٠١ X FO, FY YY HPV مرات تخفيف لكي يتم تحديد تركيزات التحكم الداخلية؛
ry — -— )13 وجدت أي منها؛ مما يؤدي إلى تقليل الحساسية التحليلية للأنواع المستهدفة. الجدول رقم :١١ التقييم في مقابل العينات الإكليتيكية clinical samples وبمجردٍ الوصول إلى الصيغة النهائية من الاختبار بالاعتماد على نتائج الاختبارات المذكورة أعلاه؛ يتم تقييم الاختبار على TY عينة إكلينيكية وتمت مقارنة النتائج باستخدام النتائج السابقة من اختبار © الإمساك للمركب الهجين HCH hybrid الخاصة بالنسخ باستخدام اختبار النقطة في السطر العكسي. الجدول رقم ؟: مقارنة النتائج الخاصة بالمجموعة المتعددة من PCR فيما يتعلق TV عينة إكلينيكية بالمقارنة باختبارالإمساك الهجين (HCH) والنتائج الخاصة بالنسخ السابق باستخدام نقطة الخط العكسية. لم تتم مقابلة نتائج عكسية متعلقة بالاختبارات السابقة. كان إحدى العينات سلبية وخاطئة ٠ بالنسبة لاختبار ]11011 وفي عينة واحدة يفشل الاختبار المتعدد في اكتشاف النوع الذي تم الحصول عليه عن طريق اختبار الطباعة السابق. أوضحت النتائج بالتالي أن © عينات من الاختبار المتعدد طبقاً للاختراع الحالي يتم اكتشافها في أنواع إضافية لم يتم اكتشافها في التحليل السابق. ١ جدول رقم : عينات إكلينيكية اختبار التوافق في الزمن الفعلي الخاص بالتقييم.
ا سخ — التصخيم متزامن ]| 6ل | 16ل ل ١ ااا سس ا ل لل 5ط | 35.52 6 الال ااا HPV3L.52 0-0 06731 | 1 + ا ا ا [Ty لط | HPVSLS6 ل TTT TT TE TT Te [Ty 51.66 TT TY TTT TY TTT TT TTT Te TTT Tw [HPV | Vv 39 TT 1 | 5ط 51لا لد HPVieds _ ااا ااا لاا لاا TTT Ye TT TTT TTT TY TTT TTT HPVAS | ya 0 45لا ل TTT TT TE ow | 6ط | __HPVI6 TTT TTY Cw | 00031 31 HPVSLSY | HPVSLS2,59 | oT vi TTT Ye TT TTT wy | لاطا | HPV وبالتالى؛ يقارن الجدول رقم ؛ ¢ نتائج مجموعة التضخيم المتزامن التوافقية PCR ل TV عينة؛ بالمقارنة باختبار 11011 وقد تم وضع النتائج السابقة وكتابتها باستخدام نقط خطية عكسية. هناك
مم -— موافقة كاملة خاصة بالنتائج ل YA عينة؛ منها © إيجابية و7 عينة سلبية. على الرغم من ذلك فإن هناك اثنين من عينات 11011 سلبية بينما أن نقطة الخط العكسية و1701 التضخيم متزامن التوافقية تعطي نتائج مثالية. في العينة رقم © يكشف اختبار المجموعة المتنوعة التوافقية عن أنواع زائدة لم يتم اكتشافها عن طريق الخط النقطي. كانت تلك الأنواع عبارة عن 1171766 (عينة واحدة) والتي لم © يتم تضمينها في اختبار النقطة الخطية العكسي؛ 11017752 (اثنين من العينات) و 1101756 (عينة واحدة)والتي يكون لأجلها خط الاختبار العكسي معروفاً بأنه يقلل الحساسية 5 HPV35 و 1101716 و110745 (واحدة في كل حالة). في واحدة من العينات؛ يفشل الاختبار المتعدد التوافقي في اكتشاف النوع (1171759) عن طريق النقطة العكسية الخطية. المثال رقم PCR alae) VY في الوقت الفعلي التوافقية Ye تتم استخدام الإجراء الحالي لكي يتم تحليل TY عينة إكلينيكية. كانت العينات عبارة عن عينات DNA _من clue الرقة_ التي تم استخلاصها باستخدام وسيلة استخلاص DNA آلية من -MagNAPure ١-يتم خلط Led PCR يتعلق بالمجموعات )¢ oF oY و ؛ تم تحضيرها في أنابيب منفصلة طبقاً للجداول التالية: \o الجدول رقم © المجموعة HPV ٠؛ صيغة الخلط الأساسية: تفاعل ٠٠ ميكرولتر.
ادوم تركيز البادئ 100 نانو مولار . تركيز المسبار YOu probe نانو مولار ل ٠ (HPVIS نانو مولار ل HPV352 و ٠٠١ نأنو مولار ل HPV59 Yo Rx-mix QuantaFast ميكرولتر 1٠ ميكرولتر qPCR ila ٠٠١ PTF بيكومول/ ١," ميكرولتر VA ميكرولتر ميكرولتر 0 206:1 بيكو ١" ميكرولتر VA ميكرولتر مول/ميكرو لتر المسبارات ١8+١5 (FY) ١8 +0, ميكرولتر YH FATS ميكرولتر )١(54 «(&)ex © بيكومول/ ميكرولتر oe الجدول رقم 1 المجموعة ١7 HPV صيغة الخلط الأساسية : تفاعل ٠٠ ميكرولتر . تركيز البادئ 1٠١0 نانو مولار . تركيز المسبار ٠ probe نانو مولار ل 1101739 ٠٠١ نانو مولار ل 1101751 ٠ نانو مولار ل 6 و ٠٠١ تاتنو مولار ل HPV66 Yo Rx-mix QuantaFast ميكرولتر ٠ ميكرولتر Cycling qPCR
Sr TERT ميكرولتر ٠٠١ 2 بيكومول/ oY ميكرولتر ,ا ميكرولتر ميكرولتر المسبارات 79 (4) Yoo ++ +8 oY +1+17+776؟ ميكرولتر ال 10 5( 47 0 ميكرولتر © بيكومول/ ميكرولتر جدول رقم ١7 المجموعة HPV ؛ صيغة الخلط الأساسية : تفاعل ٠٠ ميكرولتر . تركيز البادئ ٠٠90 نانو مولار . ١ © تركيز المسبار Yoo probe نانو مولار ل 1101716 You نانو مولار ل 1101745 و ov نانو مولار ل 1151758 Teme Yo ميكرولتر ميكرولتر Rx-mix QuantaFast Cycling qPCR ٠٠١ 7 بيكومول/ ¥ ,+ ميكرولتر ٠,8 ميكرولتر ميكرولتر سا م ميكرولتر المسبارات ١ 46 )1( VT ةراج 1+4 ٠١+ ميكرولتر oA (1) ميكرولتر © بيكومول/ ميكرولتر وار الجدول رقم A المجموعة of HPV صيغة الخلط الأساسية : تفاعل ٠ © ميكرولتر .
7١خ تركيز البادئ 300 نانو مولار . تركيز المسبار 9٠ probe نانو مولار ل 711077 00 نانو مولار ل 1101731 ١5١ نانو مولار ل 3 و ٠٠١ نانو مولار ل 1171735 Yo ميكرولتر Rls Se ٠ Rx-mix QuantaFast لتر Cycling qPCR ٠٠١ 7 بيكومول/ oY ميكرولتر VLA ميكرولتر ميكرولتر ٠٠١ 4 بيكومول/ Y ,0 ميكرولتر ,ا ميكرولتر ٍ ميكرولتر
المسبارات 6“ ((Vof) 8+ +9 1+ ١ر٠ +4+17 +71 ميكرولتر
نت FT (3)ء (£)¥o ميكرولتر
© بيكومول/ ميكرولتر ١" ميكرولتر اع ل
© | 7؟-برنامج PCR م ٠١ دقيقة ويلي ذلك fo دورة عند 36 م لمدة dnl Vo وعند © م
لمدة 70 ثانية؛ وعند ١6م لمدة Tv ثائية.آلة PCR في الزمن الفعلي LAB7300 تم استخدام إعداد الطبق ذي العيون ال 176 التالي: الصف (YY ؟: وسائل اكتشاف للمجموعة ١ الصف ؛» 0 وسائل اكتشاف للمجموعة ل
حم - الصف (AY 5 وسائل اكتشاف للمجموعة و الصف YY ONY ٠١ وسائل اكتشاف للمجموعة 4 . تم أيضاً إدخال عدد العينة لكل YY عينة. تم إجراء كل عينة في كل المجموعات. بالإضافة إلى ذلك؛ تم تضمين وسائل التحكم الخاصة في © كل مجموعة والتي تشتمل على كل أنواع HPV في المجموعة وفي وسائل التحكم السلبية.
وبالتالي؛ تم تضمين وسائل التحكم التالية: وسيلة التحكم من النوع الإيجابي وسيلة التحكم من النوع 9" التي تشتمل على 46 GU من OYA YT HPV لك (YY ماك (YQ فى )0( كلف 07 T7509 (0A لكل حجم مساو J © ميكرو لتر.
Yo وسائل تحكم المجموعة الموجبة: تشتمل على GU ¢ ver من HPV مل oy “و 5 o (المجموعة HPV 1 ١ حك oq «oY و 11 (المجموعة 1١ HPV « oY © ُو oA (المجموعة (v و HPV FO (FF (FY (المجموعة £( وقد تم استخدام تلك المجموعات مع المجموعات المناظرة CL وفيما يتعلق بكل مجموعة تضخيم متزامن ‘ فإن المجموعة المتعددة من النوع اك ومجموعة التحكم ومجموعة التحكم السلبية (لم يتم gal) إضافة (DNA قد تم تنفيذها.
Vo »#- تم خلط PCR كما تم وصف ذلك في )١( وجعلها في أجزاء مساوية؛ تمت Ala) £0 ميكرو لتر إلى كل عين ويلي ذلك إعداد الطبق. تمت إضافة © ميكرو لتر من العينات من DNA وتمت إضافة عينة المقارنة الموجبة طبقاً لإعداد
— 5ص — الطبق. تم إحكام غلق الطبق PCR وتم وضعه في PCR Al . يستغرق برنامج PCR حوالي ٠,9 ساعة. الاعتبارات اللوجيستية Logistic considerations كان الوقت المطلوب لاكتمال تحليل die 7٠ هو A ساعات-9,؛ ساعة لمعالجة ١١ die دقيقة © الإعداد (PCR 7,5 ساعة ¢ زمن إجراء PCR وساعة واحدة للتحليل. الخاص بهذه العينات والتي تصل إلى حوالي Ye ساعة في الزمن. تم توضيح تحليل العينات ومنحنيات التضخيم الخاصة بنوع PCR اللتضخيم المتزامن الشائع في الزمن الفعلي لاكتشاف أنواع معينة HPV ¢ تف مك دكت (FA (YO (FF £0( دف كف كف oA 04 و13 في الأشكال من YY يكون المحور الرأسي عبارة عن لوغارتم (التألق الفلورسنتى fluorescence ٠ ) أو جزء أساسي تم طرحة خاصة بقناة اللون المناسبة. يكون المحور الأفقي عبارة عن دورة PCR يتم تعليم الخط الأفقي باستخدام رأس سهم على المحور الرأسي من الناحية اليمنى والذي يكون بمثابة خط القيمة الحدية الذي يتم وضعه بشكل يدوي بعد تصحيح التألق الفلورسنتى fluorescence الأساسي ٠. تعتبر منحنيات التضخيم العابرة لخط القيمة الحدية عبارة عن قيمة موجبة وحلقة PCR جزيئية حيث يعبر محيط التضخيم عن خط القيمة الحدية والذي يكون بمثابة حلقة قيمة حدية (Cr) موجودة في التقرير المرفق ٠ يوضح الشكل رقم ¢ التضخيم الخاصة بوسيلة التحكم الداخلية؛ HPV6 النتائج الخاصة بالمجموعة التضخيم متزامن A HPV) او oy و 04 يوضح الشكل رقم ١ تضخيم VA HPV في مجموعة تضخيم متزامن .١ تكون اثنين من المنحنيات الموجبة عبارة عن وسائل تحكم موجبة. وبالتالي ليس هناك عينات موجبة من 1171718 .
ذا و © امد as الشكل رقم Y تصضخيم 1111/2 في مجموعات التضخيم المتزامن ١ 4 حيث تكون المنحنيات الموجبة متاحة. تكون المنحنيات بشكل البرتقالي والشكل الرمادي عبارة عن وسائل تحكم موجبة. تكون اثنين من المنحنيات الزرقاء عبارة عن عينات موجبة (العينة الرابعة (Ts التي بها 2 © يوضح الشكل رقم ؟ تضخيم 1101759 في مجموعة تضخيم متزامن .١ تكون Galil من المنحنيات الموجبة عبارة عن وسائل تحكم موجبة. لا يوجد عينات موجبة بها HPV59 النتائج الخاصة بمجموعة التضخيم المتزامن تى 1739طلى اف حم 17 يوضح الشكل رقم £ تضصخيم HPV39 في مجموعة التضخيم المتزامن . يكون المنحنى f لأخضر عبارة عن وسيلة تحكم موجبة تشتمل على أنواع مستهدفة من المجموعة 7. في مجموعة التحكم ٠ الثانية الموجبة يتم تضمين كل الأربعة عشر نوعاً المستهدفة من 1171739 التي لم يتم تضخيمها. يكون المنحنى الأسود عبارة عن عينة موجبة قوية (العينة (VA التي تشتمل على HPV39 يوضح الشكل رقم © التضخيم الخاص ب1171751 في مجموعة التضخيم المتزامن YARED تكون ستة من المنحنيات الموجبة مرئية. تكون المنحنيات الخضراء والبنية العابرة لخط القيمة الحدية عند الحلقة 79 Ble عن وسائل تحكم موجبة. تكون المنحنيات المتبقية الأربعة عبارة عن عينات موجبة من 11017751 وتكون اثنتين منها (العينة A و9 موجبة بشكل قوي). تكون المنحنيات السوداء والزرقاء الخاصة باثنين من العينات متطابقة. تخترق العينة Ye (المنحنى الأخضر) خط القيمة الحدية القريب من وسيلة التحكم الموجبة الذي يوضح أنها تشتمل على كميات مشابهة من 1171751 ( 60040050 ). تكون العينة VY (المنحنى الأحمر) موجبة بشكل ضعيف. يوضح الشكل رقم 1 تضخيم HPV56 في مجموعة تضخيم متزامن YY في المنحنيات الموجبة
— \ $ ب التي تكون مرئية. تكون المنحنيات الخضراء والبنية عبارة عن وسائل تحكم موجبة. تكون المنحنيات الزرقاء عبارة عنية عينة موجبة (العينة (A ترجع المنحنيات المسطحة إلى التأثير التنافسي لتركيزات عالية جداً من 1171751 في العينة المذكورة . يوضح الشكل رقم ١ تضخيم 1101766 في مجموعة التضخيم المتزامن ؟. تكون المنحنيات © الخضراء والبنية في أقصى اليمين عبارة عن وسائل تحكم موجبة. وتكون المنحنيات الحمراء عبارة عن عينة موجبة. النتائج الخاصة بمجموعة التضخيم المتزامن أت HPV تل £0 رمه بمثابة منحنيات موجبة وتكون مرئية. تكون المنحنيات البتية المنحنيات الحمراء عابرة hal القيمة Ye الحدية عند الحلقة TE وتكون بمثابة وسائل تحكم موجبة. يكون المنحنى البني أكثر استواءً من المتحنى الأحمر ويحتمل أن يكون ذلك بسبب أن وسيلة التحكم الموجبة يتم تمثيلها عن Gob المنحنى البني الذي يشتمل على كل الأنواع المستهدفة الأربعة عشر والتي تنتج جهداً as خاص بالتنافس. تكون المنحنيات السوداء والخضراء عبارة عن عينات موجبة ل11017716 (العينات ١ و١؟) والتي تكون واحدة منها موجبة بشكل ضعيف جداً. © يوضح الشكل رقم 9 تضخيم 1101745 في منحنيات المجموعة التضخيم متزامن oF 7 الموجبة والتي يمكن رؤيتها. تكون المنحنيات البنية والحمراء عبارة عن وسائل تحكم موجبة. تكون المنحنيات الخضراء عبارة عن عينة موجبة من 1171745 (العينة (YY يوضح الشكل رقم ٠١ تضخيم due 1171758 في المجموعة التضخيم متزامن “.تكون اثنين المنحنيات الموجبة عبارة عن وسائل تحكم موجبة.لا يوجد هناك عينات موجبة من 1171758.
اج - نتائج مجموعة التضخيم المتزامن VO (FY FY HPV of ومجموعة التحكم الداخلية (HPV6) يوضح الشكل رقم ١١ تضخيم 1171731 في المجموعة المتعددة 7,؛ من خلال المنحنيات الموجبة التي يمكن رؤيتها. تكون اثنين من المنحنيات الخضراء المشابهة عبارة عن وسائل تحكم موجبة. يكون المنحنى الأزرق عبارة عن عينة موجبة dul) 1( الذي يشتمل على كميات كبيرة من .HPV31 e
يوضح الشكل رقم ١١ تضخيم HPV33 المجموعة المتعددة ؛. تكون اثنين من المنحنيات الخضراء المشابهة عبارة عن وسائل تحكم موجبة والتي تكون Alia إشارات موجبة. ولا يوجد هناك عينات موجبة من 1]171733.
يوضح الشكل رقم ١ تضخيم 1101735 في العديد من المجموعات المتعددة £,F التي لها منحنيات
٠ موجبة يمكن رؤيتها. تكون اثنين من المنحنيات الخضراء المشابهة عبارة عن عينات موجبة. يكون
اللون الأحمر الداكن بمثابة عينة موجبة (العينة ؛) التي تشتمل على 1171735.
يوضح الشكل رقم VE منحنيات تضخيم خاصة بوسيلة تحكم داخلية. تشتمل كل العينات على نفس كمية 1171/76 ويتم دمج كل العينات مما يوضح غياب التثبيط. تكون المنحنيات نحو الجانب الأيمن Ble عن مجموعة أساسية من المنحنيات التي توضح التثبيط الجزئي أو التنافس. تمت رؤية
VO خمسة من تلك المنحنيات. في واحد من المنحنيات (في العينة رقم ؛) فإن التضخيم الخاص بوسيلة
التحكم الداخلية يتم تثبيطه بشكل كامل. يسبب ذلك تثبيط بإشارة تضخيم قوية من 1101735 في نفس الأنبوب. تشتمل عينة مثبطة بشكل (Juli العينة رقم 4 على 1101751 والتي يكون لها تركيزات عالية غير عادية. على الرغم من أن 1 لم يتم تضمينها في المجموعة of وعلى الرغم من أن التشابه في متواليات البادئات يكون LES بشكل كبير لتوليد التضخيم التنافس في العينة الساخنة.
x _ $ — تكون العينات الثلاثة المتبقية (VW AF) عبارة عن عينات سالبة ويمكن أن تكون مثبطة بشكل جزئي. تكون وسيلة التحكم الداخلية 110176 التي تمت إضافتها بهذا الشكل عبارة عن تفاعل مزدوج للمجموعة ؛ عند مستويات من 54560 <+400 GU لكل تفاعل بدون تضمين الحساسية التحليلية © الخاصة ب 110731 أو HPV33 أو 1101735 . تم اختيار 5006 61 لكل تفاعل عند تركيز قياسي فيما يتعلق بوسيلة التحكم الداخلية internal control . الجدول رقم 18 الحساسية التحليلية HPV gil الحساسية التحليلية (GU) | الحساسية التحليلية (GU) ٠٠١( نانجرام/ ميكرولتر ٠١( ١ DNA نانجرام/ ميكرولتر بشري) DNA بشري)
— يي me 2 me التضخيم متزامن. تم إجراء POR يشير هذا الجدول إلى الحساسية التحليلية للعديد من تفاعلات
DNA التفاعلات باستخدام الصيغ المتعددة التي تم وصفها في الجداول من ©-8. كان المستهدف
DNA نانوجرام/ميكرو لتر من ٠٠١ في HPV plasmid أضعاف في التخفيف بالنسبة ٠١ هو البشري في العينة. تكون DNA نانو جرام على الترتيب من on ض البشري المناظر ل 500 أو الذي يعطي منحنى التضخيم الذي يمكن أن (GU) عن أقل رقم للنسخ le الحساسية التحليلية © يتم تمييزه بشكل واضع عن fluorescence | لأساسي. المثال رقم VY استخدام البادئ 77:2 تم إجراء التضخيم باستخدام التخفيف المتسلسل الخاص HPV16s و 111731911017718 و 1101733
PTr2 و PTE و 1101756 مع بادئات من HPV35 جرام من كل بادئ؛ sil 000 ميكرو لتر باستخدام ٠٠١ وبالتالي تم إجراء التضخيم في تفاعل Ve ٠٠١و مل مولار من 2ا0ع14 V,© » Amplitaq Gold (Applied Biosystems) ميكرو من 9 كما يلي PCR كان برنامج .Amplitag Gold في محلول منظم من ANTPs ميكرو مولار من
داج —
AY مء 0 ثانية (Lf. © ثانية ؛ VY ام و١ ثانية؛ 40 دورةء ٠١ ميكرو لتر من المادة
التي تم تضخيمها lly تم استخدامها عند ١,8 96 من جل الأجاروز وتم تعريضها إلى الاستشراد
الكهربي عند ١7١ فولت لمدة 90 دقيقة؛ وتمت تلطيخها ب5711 أخضر طبقاً لتعليمات المُصنع
وتم تصويرها فوتوغرافياً تحت ضوء 7٠00 نانو متر من الأشعة فوق البنفسجية. تم توضيح النتائج في الأشكال من .77-١١
وبالتالي يكون 7172 مناسباً لتضخيم أنواع HPV
المثال رقم VE طقم التشخيص
يمكن أن يكون لطقم التشخيص الخاص بالاختراع الحالي التصميم (JU ولكن من الواضح أنه
يمكن عليه إدخال العديد من التعديلات من خلال الماهر في المجال بدون الخروج من مجال ٠ وفحوى الاختراع.
يمكن أن يشتمل الطقم على أربعة صفوف كل من ستة أنابيب (الأنابيب )1-١ التي تشتمل على
كل مواد التفاعل الضرورية لاكتشاف أنوا ع HPV مك Yo «(YY (YY كك £0( اف OY
1 و oq (oA م
الجدول رقم ١ يشتمل على 00 ميكرو لتر بها بادئ أمامي PTF ومسبارات بادئ خلفي PTrGr1 ٠ بالإضافة إلى مسبارات 1171718 (مرقم FAM. (¢ 1101759 (مرقم (NED ومسبار LNA probe
بالنسبة ل1101752 (مرقم (ROX
الأنبوب 7: يشتمل على 550٠0 ميكرو لتر من المحلول الذي يشتمل على بادئ أمامي 7 وبادئ
عكسي PTIGr2 reverse primer بالإضافة إلى TagMan MGB (مرقم «(FAM 1171756 (مرقم
«(ROX (مرقم HPV39 الخاص ب LNA probe ومسبار ) NED مرقم ( HPV66 5 (VIC
أ لأنبوب ؟: يشتمل على 5.٠0 ميكرو لتر من محلول به بادئ أمامي 1 وبادئ عكسي reverse PTr primer بالإضافة إلى مسبارات TagMan MGB فيما يتعلق ب1101716 (مرقم (FAM 5 (مرقم (VIC و1101758 (مرقم NED الأنبوب ؛: يشتمل على 00 ميكرو لتر من المحلول المشتمل على بادئ أمامي PTE وبادئ © عكسي reverse primer 010:4 بالإضافة إلى مسبارات TagMan MGB الخاصة ب110735 (مرقم «(FAM ومرقم VIC 1101/31 ومسبار LNA probe الخاص ب110752 ( المرقم (ROX وبالإضافة إلى ذلك ؛ تم تضمين مسبار TagMan فيما يتعلق بوسيلة التحكم الداخلية 110176 ووسيلة التحكم الداخلية التي تستهدف تركيز يصل إلى 000 نسجة لكل ميكرو لتر. الأنبوب #: يشتمل على 7١0 ميكرو لتر من وسيلة التحكم الإيجابية التي يكون لها 500٠ نسخة Ve من أنواع نام نا VA نكت كك مادك كك £0( لف (OY تف ST 509 (OA الأنبوب رقم ١ يشتمل على 7500 ميكرو لتر من PCR XY الخلطة الرئيسية المشتملة على polymerase DNA ثابت Wha و deoxynucleotide triphosphates ى magnesium chloride ٠ وطبقاً للإجراء JU يمكن أن يتم تحليل YY عينة بشكل متزامن. يمكن أن تكون ثلاثة من تلك العينات عبارة عن وسائل تحكم سلبية. بالإضافة إلى ذلك؛ يتم استخلاص0718 من العينات -١ تم السماح لكل من الأنابيب من ١ إلى 1 بالذوبان عند درجة حرارة الغرفة.
— $V —
"- المجموعة :١ تم تحضير الخلطة الرئيسية من المثال رقم ١١ عن طريق إضافة 6009 ميكرو
لتر من الخلطة الرئيسية PCR (الأنبوب +) إلى الأنبوب ١ وتم الخلط في الاتجاه العكسي. ؟*-
المجموعة ؟: تم تحضير الخلطة الرئيسية من المثال رقم VY عن طريق إضافة 100 ميكرو لتر
من الخلطة الرئيسية POR (الأنبوب )١ إلى الأنبوب 7 وتم الخلط في الاتجاه العكسي. ؛-
© المجموعة ؟: تم تحضير الخلطة الرئيسية من المثال رقم ١١ عن طريق إضافة 08١0 ميكرو لتر
من الخلطة الرئيسية PCR (الأنبوب 7) إلى الأنبوب ؟ وتم الخلط في الاتجاه العكسي.
=O المجموعة 4: تم تحضير الخلطة الرئيسية من المثال رقم VY عن طريق إضافة Te ميكرو
لتر من الخلطة الرئيسية PCR (الأنبوب )١ إلى الأنبوب ؛ وتم الخلط في الاتجاه العكسي. +7- تم
نقل £0 ميكرو لتر من المجموعة ١ من الخلطة الرئيسية إلى كل عين من الصفوف من أ و ه من ٠ طبقه به 916 عيناً من 5٠0٠0 ميكرو لتر في طبق PCR البشري.
SV نقل £0 ميكرو لتر من المجموعة ¥ من الخلطة الرئيسية إلى كل عين من الصفوف من
ب ¢ و٠
4-تم نقل ©؛ ميكرو لتر من المجموعة ؟ من الخلطة الرئيسية إلى كل عين من الصفوف من ج ce yo
4-تم نقل 5؛ ميكرو لتر من المجموعة ؛ من الخلطة الرئيسية إلى كل عين من الصفوف من د
4 ْ
٠-تمت إضافة © ميكرو لتر من عينة ١ DNA إلى العين أ 6٠ ب Vz) ود١.
الم - )= تمت إضافة © ميكرو لتر من عينة DNA ؟ إلى العين أ 7 ب Yas Vz oF -٠ الاستمرار في إضافة العينات في نفس النمط للعيون Far من خلال أ AY -١ الاستمرار في إضافة العينات في نفس النمط للعيون د١-ح1؛ من خلال د١١-ح AY -٠8 تمت إضافة © ميكرو لتر من وسيلة التحكم الموجبة لكل العيون من د Ae -١١ -١# © تم الغلق المائع للتسرب ووضع آلة 20 في مكانها وبداية برنامج PCR - سوف يتم اكتشاف أنواع VA HPV و27 و59 في الصفوف rows من أ إلى ه. -١١ سوف يتم اكتشاف أنواع TA HPV 5 )81150750 الصفوف ب ؛ و. VA = سوف يتم اكتشاف وا VT HPV £0 و دفي الصفوف ج ؛ ز. 4- سوف يتم اكتشاف أنواع YY FY HPV © ؟ ووسيلة التحكم الداخلية في الصفوف د؛ ح. ٠ يجب أن يكون برنامج PCR عبارة عن: به نشاط polymerase ويتم إتلاف العينة: ٠١ دقائق عند o م ويلي ذلك 55 دورة من : المسخ لمدة 10 Al عند 8م التلدين: 7٠ ثانية عند £0 (a ٠ التمدد: ٠١ ثانية عند ٠ م
اق - يجب أن تتم برمجة آلة PCR لكي تعمل على جمع بيانات fluorescence في أربعة قنوات من الألوان والتي تم جعلها في أفضل صورة لكي يتم الكشف عن صبغات VIC: fluorescence FAM ROX 5 10 . يقصد من الأمثلة السابقة أنها أمثلة موضحة للاختراع فقط. يجب أن يتم فهم أن الشخص الماهر © في المجال يمكنه تعديل الطريقة أو الطقم أو المسبارات أو البادئات التي تم وصفها في هذه الوثيقة بدون الخروج عن المجال المقبول للاختراع الذي تم وصفه أعلاه وفي عناصر الحماية فيما يلي.
Claims (1)
- عناصر_ الحماية-١ ١ طريقة لاكتشاف و/أو انتساخ و/أو التقدير الكمي المتزامن لوجود الورم الحليمي البشري (VA « human papillomavirus (HPV) ~~ Y تمض كف كك نف تم نت كل oA co نت 7 YF و AYO عينة بيولوجية ؛ تشتمل الطريقة على التفاعلات المتوازية الأربعة التالية :amplification of the nucleic acid fragments تضخيم شظايا الحمض النووي ) أ-١ Je lal g : في وجود 2% 50Y¢ YA human papillomavirus (HPV) grill من الورم الحليمي ©nucleic acid حمض نووي polymerase (i) 1¢) من المتوالية رقم: oligonucleotide أمامي مع متوالية أوليجيو نيوكليوتيد PCR بادئ (if) ١old pli (iii) A بادئ عكسي PCR reverse primer مع متوالية أوليجيو نيوكليوتيد oligonucleotide 4 رقم «Yt(iii) ٠ مسبار probe مع أوليجيو نيوكليوتيد oe oligonucleotide المتوالية رقم: VeA و 5؛ تم ١١ ترقيمه بحامل للفلور fluorophore و جزيء مخمد quencher molecule وYY ب) اكتشاف التغير في طول موجة التألق الفلوري fluorescence the wavelength منه الذي VY يحدد نوع الورم الحليمي human papillomavirus (HPV)g dull ف 7و 249 ¢4 التفاعل FY ( تضخيم شظايا الحمض النووي amplification of the nucleic acid fragments VO من الورم الحليمي البشري human papillomavirus (HPV) 7108102076 و 11 في وجود : polymerase (i) ٠ حمض نووي nucleic acid (ii) ٠١ بادئ PCR أمامي مع أوليجيو نيوكليوتيد oligonucleotide من المتوالية Vial) (iil) ٠ بادئ عكسي PCR reverse primer مع أوليجيو نيوكليوتيد oligonucleotide من المتوالية 4 رقم: oF(iv) ٠ مسبار probe مع أوليجيو نيوكليوتيد (oligonucleotide المتوالية رقم: ١١ 1١ ٠١ و 7١ ؟اءتم ترقيمه بحامل للفلور fluorophore وجزيء مخمد quencher molecule و YY _ب) اكتشاف التغير في طول موجة التألق الفلوري fluorescence the wavelength منه الذي0VY يحدد نوع الورم الحليمي human papillomavirus (HPV) gull كى نف تم روحتA تفاعل 3؟-أ) تضخيم شظايا الحمض النووي amplification of the nucleic acid fragments من 2 _الورم الحليمي V1 human papillomavirus (HPV) grill £9¢ و ©A في وجودnucleic acid نووي aes polymerase (i) 3¢V من المتوالية رقم: oligonucleotide أمامي مع أوليجيو نيوكليوتيد PCR بادئ (ii) YY(iii) YA بادئ عكسي PCR reverse primer مع أوليجيو نيوكليوتيد (oligonucleotide المتوالية 4 رقم: 4NT و١١ NE من المتوالية رقم oligonucleotide أوليجيو نيوكليوتيد a= probe مسبار ( iv) Y. و quencher molecule و جزيء مخمد fluorophore تم ترقيمه بحامل للفلور ١TV =( اكتشاف التغير في طول موجة التألق الفلوري ai fluorescence the wavelength الذي TY يحدد نوع الورم الحليمي human papillomavirus (HPV) grill خم 5 ¢0A ؛؟؛؟ التفاعل Fe ( تضخيم شظايا الحمض النووي amplification of the nucleic acid fragments YO من الورم الحليمي البشري 7١ human papillomavirus (HPV) ¢ 7775 و وسيلة تحكم TT داخلية في وجود :nucleic acid حمض نووي polymerase (i) TVOV من المتوالية رقم: oligonucleotide أمامي مع أوليجيو نيوكليوتيد PCR (نن) بادئ VA(iii) 4 بادئ عكسي PCR reverse primer مع أوليجيو نيوكليوتيد oligonucleotide من المتوالية iad; fe ©)£ اد ) مسبار probe مع أوليجيو نيوكليوتيد oligonucleotide من المتوالية رقم: 197 018 15 و 7١ 7 تم ترقيمه بحامل للفلور fluorophore و جزيء مخمد quencher molecule و (v) EV وسيلة تحكم internal control Jah وgd (ب) اكتشاف التغير في طول موجة التألق الفلوري fluorescence the wavelength منه الذي £0 يحدد نوع الورم الحليمي البشري YO «YY «YY human papillomavirus (HPV) ووسيلة تحكمY — م _ £1 داخلية .internal control ١ ؟- طريقة طبقاً لعنصر الحماية dus) يتم إجراء التفاعلات المذكورة بشكل مواز وفي عبوات Y منفصلة. ١ *- طريقة طبقاً لأي من عناصر الحماية ١الى7؛ حيث المركبات الحاملة للفلور fluorophors " الأربعة عبارة عن ثنف710 NED: و .ROX ١ 4- طريقة طبقاً لأي من عناصر الحماية TIN حيث تكون وسيلة التحكم الداخلية عبارة عن " الورم الحليمي البشري human papillomavirus (HPV) 1 —o ١ طاقم تشخيص لاكتشاف و/أو انتساخ و/أو التقدير الكمي المتزامن لوجود الورم الحليمي Y البشري (Yo (YY «YY YA «YT human papillomavirus (HPV) حك قف اف أم OT دف 509 11 في die بيولوجية تشتمل على ١ لأربعة توليفات للمسبار probe البادئ كما هو
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO20091733A NO330943B1 (no) | 2009-04-30 | 2009-04-30 | En metode for detektering og/eller typebestemmelse og/eller kvantifisering av human papillomavirus (HPV) type, primere og prober derav samt diagnostisk sett og anvendelse derav. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SA110310331B1 true SA110310331B1 (ar) | 2014-08-18 |
Family
ID=43032356
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SA110310331A SA110310331B1 (ar) | 2009-04-30 | 2010-04-28 | طريقة لاكتشاف فيروس من نوع الورم الحليمي البشري (hpv) |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8895247B2 (ar) |
| EP (1) | EP2425017B1 (ar) |
| CN (1) | CN102459631B (ar) |
| AU (1) | AU2010242168B2 (ar) |
| BR (1) | BRPI1007637A2 (ar) |
| CA (1) | CA2760274A1 (ar) |
| CY (1) | CY1116083T1 (ar) |
| DK (1) | DK2425017T3 (ar) |
| EA (1) | EA201171239A1 (ar) |
| ES (1) | ES2534644T3 (ar) |
| HR (1) | HRP20150190T1 (ar) |
| IL (1) | IL216035A0 (ar) |
| MX (1) | MX2011011521A (ar) |
| MY (1) | MY160754A (ar) |
| NO (1) | NO330943B1 (ar) |
| NZ (1) | NZ596252A (ar) |
| PL (1) | PL2425017T3 (ar) |
| PT (1) | PT2425017E (ar) |
| SA (1) | SA110310331B1 (ar) |
| SG (1) | SG175825A1 (ar) |
| SI (1) | SI2425017T1 (ar) |
| WO (1) | WO2010126375A1 (ar) |
| ZA (1) | ZA201108225B (ar) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO330943B1 (no) | 2009-04-30 | 2011-08-22 | Unilabs Telelabs As | En metode for detektering og/eller typebestemmelse og/eller kvantifisering av human papillomavirus (HPV) type, primere og prober derav samt diagnostisk sett og anvendelse derav. |
| CN102994647B (zh) * | 2012-06-21 | 2014-11-19 | 宁波海尔施基因科技有限公司 | 一种人乳头瘤病毒(hpv)的分型定量检测试剂盒 |
| RU2520710C1 (ru) * | 2012-12-10 | 2014-06-27 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздравсоцразвития России) | Способ прогнозирования персистенции онкогенных типов вируса папилломы человека в цервикальном эпителии |
| CN104818342B (zh) * | 2015-03-23 | 2017-09-22 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 用于19种高危型人乳头瘤病毒(hpv)的检测试剂盒、检测体系及方法 |
| US10415105B2 (en) | 2015-06-30 | 2019-09-17 | uBiome, Inc. | Method and system for diagnostic testing |
| CN105603121B (zh) * | 2016-01-15 | 2019-02-12 | 艾康生物技术(杭州)有限公司 | 用于检测高危型hpv的方法、寡核苷酸和试剂盒 |
| US11441167B2 (en) * | 2019-11-20 | 2022-09-13 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for rapid identification and phenotypic antimicrobial susceptibility testing of bacteria and fungi |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0357611B1 (en) * | 1987-02-26 | 1995-04-26 | The University Of Sydney | A method of detection of carcinogenic human papillomavirus |
| US5484699A (en) | 1990-09-28 | 1996-01-16 | Abbott Laboratories | Nucleotide sequences useful as type specific probes, PCR primers and LCR probes for the amplification and detection of human papilloma virus, and related kits and methods |
| US5821087A (en) * | 1995-03-30 | 1998-10-13 | Merck & Co., Inc. | Production of recombinant human papillomavirus type II protein utilizing papillomavirus 6/11 hybrid DNA |
| WO1999014377A2 (en) * | 1997-09-16 | 1999-03-25 | Innogenetics N.V. | Detection and identification of human papillomavirus by pcr and type-specific reverse hybridization |
| DE19903056B4 (de) | 1999-01-26 | 2007-07-19 | Medeea Forschungs-Gmbh | HPV-Assay |
| GB0500996D0 (en) * | 2005-01-18 | 2005-02-23 | Delfts Diagnostic Labaratory B | Detection method and materials therefor |
| US7553955B2 (en) * | 2005-09-01 | 2009-06-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Molecular beacons, methods and kits for detecting DNA damage response |
| WO2007115582A1 (en) | 2006-04-11 | 2007-10-18 | Bio-Rad Pasteur | Hpv detection and quantification by real-time multiplex amplification |
| US20080003565A1 (en) | 2006-05-02 | 2008-01-03 | Government Of The Us, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Viral nucleic acid microarray and method of use |
| GB0702557D0 (en) | 2007-02-09 | 2007-03-21 | Health Prot Agency | Detection of human papillomavirus |
| WO2009011472A1 (en) | 2007-07-19 | 2009-01-22 | Hyunil Choi | Primers and proves for detection of high risk group geno-type human papillomavirus dna, a qualitative assay method of the same dna using them and a qualitative assay kit of the same dna |
| NO330943B1 (no) | 2009-04-30 | 2011-08-22 | Unilabs Telelabs As | En metode for detektering og/eller typebestemmelse og/eller kvantifisering av human papillomavirus (HPV) type, primere og prober derav samt diagnostisk sett og anvendelse derav. |
-
2009
- 2009-04-30 NO NO20091733A patent/NO330943B1/no not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-04-22 BR BRPI1007637A patent/BRPI1007637A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-04-22 CN CN201080024379.XA patent/CN102459631B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-04-22 MX MX2011011521A patent/MX2011011521A/es active IP Right Grant
- 2010-04-22 PL PL10769997T patent/PL2425017T3/pl unknown
- 2010-04-22 ES ES10769997.7T patent/ES2534644T3/es active Active
- 2010-04-22 AU AU2010242168A patent/AU2010242168B2/en not_active Ceased
- 2010-04-22 EA EA201171239A patent/EA201171239A1/ru unknown
- 2010-04-22 SG SG2011079480A patent/SG175825A1/en unknown
- 2010-04-22 US US13/266,943 patent/US8895247B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-04-22 PT PT107699977T patent/PT2425017E/pt unknown
- 2010-04-22 MY MYPI2011005207A patent/MY160754A/en unknown
- 2010-04-22 HR HRP20150190TT patent/HRP20150190T1/hr unknown
- 2010-04-22 DK DK10769997T patent/DK2425017T3/en active
- 2010-04-22 EP EP10769997.7A patent/EP2425017B1/en active Active
- 2010-04-22 SI SI201030881T patent/SI2425017T1/sl unknown
- 2010-04-22 WO PCT/NO2010/000147 patent/WO2010126375A1/en not_active Ceased
- 2010-04-22 CA CA2760274A patent/CA2760274A1/en active Pending
- 2010-04-22 NZ NZ596252A patent/NZ596252A/xx not_active IP Right Cessation
- 2010-04-28 SA SA110310331A patent/SA110310331B1/ar unknown
-
2011
- 2011-10-30 IL IL216035A patent/IL216035A0/en unknown
- 2011-11-09 ZA ZA2011/08225A patent/ZA201108225B/en unknown
-
2015
- 2015-02-19 CY CY20151100171T patent/CY1116083T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA201108225B (en) | 2013-01-30 |
| NZ596252A (en) | 2013-06-28 |
| PL2425017T3 (pl) | 2015-07-31 |
| WO2010126375A1 (en) | 2010-11-04 |
| MY160754A (en) | 2017-03-15 |
| NO20091733L (no) | 2010-11-01 |
| EP2425017A4 (en) | 2012-12-26 |
| AU2010242168B2 (en) | 2014-11-20 |
| US8895247B2 (en) | 2014-11-25 |
| HRP20150190T1 (hr) | 2015-06-05 |
| DK2425017T3 (en) | 2015-03-02 |
| BRPI1007637A2 (pt) | 2016-02-23 |
| EA201171239A1 (ru) | 2012-05-30 |
| EP2425017A1 (en) | 2012-03-07 |
| AU2010242168A1 (en) | 2011-12-01 |
| IL216035A0 (en) | 2012-01-31 |
| SG175825A1 (en) | 2011-12-29 |
| MX2011011521A (es) | 2012-04-19 |
| PT2425017E (pt) | 2015-02-27 |
| SI2425017T1 (sl) | 2015-05-29 |
| CN102459631B (zh) | 2014-07-02 |
| CY1116083T1 (el) | 2017-02-08 |
| CN102459631A (zh) | 2012-05-16 |
| CA2760274A1 (en) | 2010-11-04 |
| NO330943B1 (no) | 2011-08-22 |
| ES2534644T3 (es) | 2015-04-27 |
| EP2425017B1 (en) | 2014-11-19 |
| US20120100528A1 (en) | 2012-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Freeman et al. | Enhancement of detection and quantification of rotavirus in stool using a modified real‐time RT‐PCR assay | |
| SA110310331B1 (ar) | طريقة لاكتشاف فيروس من نوع الورم الحليمي البشري (hpv) | |
| WO2006075245A2 (en) | Systems, methods, and compositions for detection of human papilloma virus in biological samples | |
| CN110093459A (zh) | 用于快速检测13种高危型hpv的lamp引物组合及应用 | |
| US20060057561A1 (en) | Virus detection method, primers therefor and screening kit | |
| CN110592279B (zh) | 检测hpv的组合物、试剂盒及方法 | |
| EP1546413B1 (en) | Method and kit for quantitative and qualitative determination of human papillomavirus | |
| KR20210111249A (ko) | 인간 유두종바이러스를 검출하기 위한 조성물 및 방법 | |
| CN104928399A (zh) | 引物组、试剂盒及其在hpv全基因组检测中的用途 | |
| CN101956024B (zh) | 用于检测人乳头瘤病毒的试剂 | |
| CN117025845A (zh) | 检测甘薯褪绿矮化病毒rt-rpa-lfd方法的引物和探针 | |
| TWI757239B (zh) | 檢測ｈｐｖ之方法、擴增混合物及套組 | |
| Bogovac et al. | Prevalence of HPV 16 genomic variant carrying a 63 bp duplicated sequence within the E1 gene in Slovenian women. | |
| US20110300178A1 (en) | Hpv types and variants associated with cervical cancer and the uses thereof | |
| CN116855639A (zh) | 一种快速检测人腺病毒4型的引物、探针及试剂盒 | |
| CN116287442A (zh) | 一种用于检测人乳头瘤病毒的引物探针组合及其应用 | |
| WO2005100610A2 (en) | Virus detection method, primers therefor and screening kit |