SA515360970B1 - تركيب صيدلي يشتمل على إنزيم دي إميناز آرجينين رابط للألبومين يستهدف علاج السرطان - Google Patents

Abstract

يوفر الاختراع الحالي تركيبة صيدلية تحتوي على بروتين اندماجي دي إميناز آرجينين رابط للألبومين (AAD) albumin-binding arginine deiminase fusion protein لعلاج السرطان أو أمراض أخرى تعتمد على الآرجينين. يمكن تنقية بروتين اندماجي AAD من كل من أجزاء قابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان من بروتينات خام، يرتبط بألبومين المصل البشري (HSA) human serum albumin وله نشاط عالي بعمر نصفي أطول للاستنفاذ الفعال للآرجينين في خلايا السرطان. النشاطات الخاصة لـ دي إميناز آرجينين arginine deiminase ADI و AAD من النمط البري في الاختراع الحالي تساوي 8.4 و9.2 وحدة/مجم (عند أس هيدروجيني فسيولوجي 7.4)، على التوالي. يمكن استخدام AAD المستخدم في الاختراع الحالي في علاج العديد من السرطانات (على سبيل المثال سرطان البنكرياس pancreatic cancer ، سرطان الدم leukemia ، سرطان الرأس والرقبة head and neck cancer ، سرطان القولون colorectal cancer والمستقيم، سرطان الرئة lung cancer ، سرطان الثدي breast cancer ، سرطان الكبد liver cancer ، السرطان الأنفي البلعومي nasopharyngeal cancer ،سرطان المريء esophageal cancer سرطان البروستات

Description

— \ — تركيب صيدلي يشتمل على إنزيم دي إميناز آرجينين رابط للألبومين يستهدف علاج السرطان ‎Pharmaceutical composition comprising albumin-binding arginine deiminase for‏ ‎cancer targeting treatment‏ الوصف الكامل خلفية الاختراع يتعلق الاختراع الحالي بروتين اندماجي دي إميناز آرجينين رابط للألبومين ‎albumin (AAD)‏ ‎binding arginine deiminase (AAD)‏ والذي تم تعديله ‎ays‏ لخلق مادة لها نشاط عالي وعمر نصفي ‎dish‏ في الجسم الحي. يصف الاختراع الحالي كذلك تصاميم لهندسة الحمض ‎ ©‏ النووي ‎DNA acid nucleu‏ والبروتين لخلق بروتينات اندماجية ‎AAD‏ مختلفة. يمكن ‎Je‏ ‏البروتينات الاندماجية ‎AAD‏ وتنقيتها من جزء قابل للذوبان وجزء غير قابل للذوبان (أجسام مشتملة) لبروتينات خام. يتعلق الاختراع الحالي كذلك بتركيبات صيدلية تحتوي على إنزيم دي إميناز آرجينين ‎arginine deiminase‏ رابط للألبومين 800010-09 لعلاج معالج للسرطان ‎cancer‏ وعلاج أمراض تعتمد على الآرجينين ‎arginine‏ البشر وحيوانات أخرى. ‎٠‏ الإصابة بسرطان البنكرياس ‎pancreatic cancer‏ ؛ سرطان القولون ‎colon cancer‏ ؛ سرطان الكبد ‎liver cancer‏ ؛ سرطان الجلد 10161800178 وسرطان عنق الرحم ‎cervical cancer‏ في السكان في جميع انحاء العالم آخذة في الازدياد. هناك حاجة ماسة لعلاجات فعالة لهذه الأمراض. في العديد من أنواع السرطان التي تتضمن سرطان الدم ‎leukemia‏ ؛ سرطان الجلد؛ سرطان البنكرياس» سرطان القولون» سرطان الخلايا الكلوية ‎renal cell carcinoma‏ ؛ سرطانات الرثة ‎clung ٠‏ البروستاتا ‎prostate‏ ¢ الثدي ‎breast‏ ؛ الدماغ ‎brain‏ ؛ عنق الرحم ‎cervical‏ والكبد ‎WA «liver‏ السرطان عونية التغذية ‎cap cancer cells are auxotrophic‏ ‎arginine‏ حيث تفتقر للتعبير الجيني لسينثيتاز الأرجينينوساكسينات ‎argininosuccinate‏ ‎synthetase‏ (855)؛ مما يجعل هذه السرطانات أهداف ممتازة لعلاج استنفاذ الآرجينين. الآرجينين حمض أميني ‎amino acid‏ شبه ضروري للبشر وثدييات أخرى. يمكن تخليقه من ‎٠‏ سيترولين ‎pe citrulline‏ عملية ‎ge‏ خطوتين ‎Shae‏ بسينثاز آرجينينوساكسينات

ا ‎argininosuccinate synthase‏ إنزيمات دورة اليوريا ‎urea cycle enzymes‏ ‎(ASS) argininosuccinate synthase‏ ولياز أرجينينوساكسينات ‎argininosuccinate‏ ‎(ASL) lyase‏ يمكن أيض الآرجينين إلى أورنيثين ‎ornithine‏ بواسطة الإنزيم آرجيناز ‎enzyme arginase‏ « ويمكن تحويل الأورنيثين إلى سيترولين بواسطة كاربامويل ترانسفيراز 0 أورنيثين ‎(OTC) ornithine carbamoyltransferase‏ في الميتوكوندريا ‎mitochondria‏ . يمكن استخدام السيترولين لتخليق الآرجينين مرة أخرى. الخلايا العادية لا تتطلب ‎Jad sale‏ خارجي من الآرجينين للنمو بسبب النشاط التحفيزي الوفير من ‎ASS‏ و ا25. في المقابل؛ لا يقوم العديد من أنواع السرطانات بالتعبير الجيني ل ‎ASS‏ ولهذا فهي عونية التغذية للآرجينين. يعتمد نموها على الآرجينين الناتج فقط من الدورة الدموية. ولهذاء فإن استهداف آرجينين الدورة ‎٠‏ باستخدام الإنزيمات المحللة ‎copia SU‏ هو استراتيجية مجدية لمنع نمو الورم السلبي ‎negative‏ ‎tumor growth‏ ل ‎Feun et al., Curr.

Pharm.

Des. 14:1049-1057 [ ASS‏ ‎Kuo et al., Oncotarget. 1:246-251 (2010)‏ ;)2008([ يمكن تحليل الأرجينين بإنزيم الأرجينازء .دي كربوكسيلاز الأرجينين | ‎arginine‏ ‎«decarboxylase‏ ودي إميناز الأرجينين ‎(ADI) arginine deiminase‏ من بينها؛ يبدو ‎١٠‏ دي إميناز الأرجينين ‎(ADI)‏ بأعلى ألفة للآرجينين (قيمة ‎Km‏ منخفضة). يحول ‎ADI‏ الأرجينين إلى سيترولين وأمونيا 807010018 نواتج أيض )5 اليوريا ‎metabolites of the urea‏ ‎cycle‏ . وللأسف؛ يمكن إيجاد ‎ADI‏ فقط في بدائيات النواة على سبيل المثال ميكوبلازما اس بي. ‎.Mycoplasma sp.‏ هناك بعض المشاكل التي ترتبط بعزل وتنقية ‎ADI‏ من ‎lily‏ النواة ‎prokaryotes‏ . يفشل ‎ADI‏ المعزول ‎isolated‏ من بسودامونز بيوتيتا ‎Pseudomonas‏ ‎pudita ٠‏ في إظهار فاعلية في الجسم الحي بسبب نشاطه الإنزيمي المنخفض في الأس الهيدروجيني ‎pH‏ المحايد. الل الناتج من اسكورتشيا ‎JS‏ أا60 5006110018 غير نشط إنزيمياً وبالتالي يتطلب عدة عمليات تمسخ واستعادة طبيعة مما يزيد من تكلفة الإنتاج اللاحقة. وحيث تم العثور على ‎ADI‏ الأصلي في الكائنات الحية الدقيقة؛ فهو أنتيجيني ويتم تصفيته بسرعة من الدورة الدموية في المريض. الشكل الأصلي ‎ADIL‏ يكون مولد للمناعة عند الحقن في الدورة ‎Yo‏ البشرية بعمر نصفي قصير (- ؛ ساعات) ويثير تحييد الأجسام المضادة [ ‎Ensor et al.,‏ ب

له ‎Cancer Res. 62:5443-5450 (2002); Izzo et al., J.

Clin.

Oncol. 22:1815-‏ )2004( 1822[ يمكن معالجة هذه العيوب عن طريق الارتباط ببولي إيثيلين جليكول ‎pegylation‏ (056). من بين الأشكال المختلفة ل ‎ADI‏ المرتبط ببولي إيثيلين جليكول ‎pegylated‏ ؛ تبين أن ‎ADI‏ المرتبط ب ‎PEG‏ (الوزن الجزيئي ‎)٠٠٠٠٠١‏ من خلال ساكسينات © ساكينيميديل ‎(ADI-PEG 20) succinimidyl succinate‏ هو صيغة فعالة. ومع ذلك؛ ينخفض نشاط ‎ADI‏ بعد الارتباط ببولي إيثيلين جليكول بشكل كبير في حدود ‎Ensor et [ 969 ٠‏ ‎Cancer Res. 62:5443-5450 (2002)‏ ,.21]. أدت المحاولات السابقة لتخليق ‎ADI‏ ‏المرتبط ببولي إيثيلين جليكول إلى مواد والتي تكون غير متجانسة (بسبب الارتباط العشوائي ‎random attachment‏ للبولي إيثيلين جليكول على رواسب لايسين سطح البروتين ‎protein‏ ‎(surface Lys residues).‏ ومن الصعب أيضاً وصف وأداء مراقبة الجودة أثناء عملية التصنيع. أيضاً؛ فإن بي اي جي مكلف للغاية؛ مما يزيد بشكل كبير من تكلفة الإنتاج. بعد الحقن الوريدي ل ‎ADI‏ المرتبط ببولي إيثيلين جليكول في الجسم الحي؛ يتم ملاحظة تسرب وانفصال ‎PEG‏ حر وقد ‎ADI Ld,‏ (بدون ‎(PEG‏ مشكلة مناعية. لهذا هناك حاجة لتركيبات محسنة لعلاج السرطان؛ وعلى وجه الخصوص؛ تركيبات محسنة لعلاج السرطان والتي لها نشاط وعمر نصفي معزز في - الجسم الحي. الوصف العام للاختراع يتعلق الاختراع الحالي؛ زاد البروتين الاندماجي لإنزيم دي إميناز آرجينين رابط للألبومين ‎(AAD)‏ ‏من نشاطه والعمر النصفي البلازمي لاستنفاذ الأرجينين بفاعلية في ‎WAN‏ السرطانية ‎cancer‏ ‏5اا6. يمكن إيجاد ‎ADI‏ الأصلي في الكائنات الحية الدقيقة 11101001981115015 وهو أنتيجيني ‎٠٠‏ ويمكن تصفيته بسرعة من الدورة الدموية في المريض. يبني الاختراع الحالي بروتينات اندماجية ‎AAD‏ _مختلفة مع بروتين رابط للألبومين ‎albumin-binding‏ واحد أو اثنين للحفاظ على نشاط عالي مع عمر نصفي أطول في الجسم ‎all‏ (على الأقل 0 أيام من استنفاذ الآرجينين بعد حقنة واحدة). في الاختراع الحالي؛ لا يُظهر البروتين الرابط للألبومين في البروتين الاندماجي ‎AAD‏ ‏تأثير على نشاطه الإنزيمي المحدد ولكن يُظهر بدلاً من ذلك زيادة في العمر النصفي للدورة. ب

ده النشاطات المحددة للبروتين ‎alex)‏ ل ‎AAD ADI‏ _من النمط البري في الاختراع الحالي تساوي ‎AE‏ 5 ,4 وحدة/مجم (عند أس هيدروجيني ‎PH‏ فسيولوجي ‎(Vat‏ على التوالي. وبأوسع معانيه؛ يوفر الاختراع الحالي بروتين اندماجي دي إميناز آرجينين رابط للألبومين يشتمل على بروتين أول يشتمل على مكون أو اثنين مختارين من نطاق رابط للألبومين؛ ببتيد رابط للألبومين أو بروتين رابط للألبومين مدمجة مع بروتين ثاني يشتمل على دي إميناز آرجينين لتكوين بروتين اندماجي دي إميناز آرجينين رابط للألبومين بحيث يحتفظ البروتين الاندماجي دي إميناز الآرجينين الرابط للألبومين بنشاط دي إميناز الآرجينين ويكون أيضاً قادر على الارتباط بالألبومين المصلي ‎.serum albumin‏ يتعلق الاختراع الحالي كذلك بتركيبات صيدلية تحتوي على بروتين اندماجي دي إميناز أرجينين ‎٠‏ رابط للألبومين ‎AAD)‏ ) لعلاج السرطان المستهدف في البشر وحيوانات أخرى. الجانب الأول للاختراع الحالي هو بناء البروتين الاندماجي ‎AAD‏ المعدل بنشاط عالي ‎high activity‏ ضد خلايا السرطان ‎against cancer cells‏ الجانب الثاني للاختراع الحالي هو تتقية البروتين الاندماجي ‎AAD‏ بنقاء عالي من كل من أجزاء ‎ALE‏ للذوبان ‎soluble‏ وغير ‎ALE‏ للذوبان ‎insoluble‏ من البروتينات الخام ‎proteins‏ 00006. الجانب الثالث للاختراع الحالي هو إطالة ‎Vo‏ العمر النصفي للبروتين الاندماجي ‎AAD‏ حيث يمكنه الارتباط بالألبومين بشكل جيد جداً في الدورة الدموية. الجانب الرابع للاختراع الحالي هو توفير طريقة لاستخدام التركيبة الصيدلية المحتوية على ‎AAD‏ وفقاً للاختراع الحالي لعلاج السرطان عن طريق تعاطي التركيبة المذكورة لشخص يحتاج لهذا يعاني من أورام ‎tUMOrS‏ ؛ سرطانات ‎cancers‏ مختلفة أو أمراض ترتبط بأورام ‎diseases associated with tumors‏ أو سرطانات أو أمراض أخرى قائمة على ‎٠‏ الأرجينين ‎arginine‏ ‏يتم أيضاً تعديل البروتين الاندماجي ‎AAD‏ وفقاً للاختراع الحالي لتجنب التفكك إلى بروتين رابط للألبومين ‎ADI‏ بحيث يصبح أكثر ثباتاً وله عمر نصفي أطول في الدورة الدموية. يتم دمج ‎ADI‏ ‏بالنطاق/الببتيد ‎peptide‏ /البروتين الرابط للألبومين في منتج دمج ‎ad AAD‏ العمر النصفي البلازمي وتقليل استمناع منتج الاندماج. ‎Glas‏ ارتباط الألبومين ‎Albumin binding domain‏ ‎(ABD) Yo‏ هو ببتيد والذي يرتبط بالألبومين ‎albumin‏ الدم. هناك أشكال مختلفة من ‎ABD‏ ‏ب

-- تظهر قيم ألفة لألبومين مصل بشري مختلفة أو محسنة ‎.(HSA) human serum albumin‏ يمكن بناء أشكال مختلفة من ‎ABD‏ ويمكن دمجها مع ‎ADI‏ . وخلافاً ‎ADI‏ طبيعي الوجود؛ تسهل خاصية العمر النصفي الأطول هذه استتفاذ الآرجينين بفاعلية في الخلايا السرطانية؛ الخلايا الجذعية السرطانية ‎cancer stem cells‏ و/أو الخلايا الأولية للسرطان ‎cancer progenitor‏ ‎.cells o‏

يمكن استخدام التركيبة الصيدلية المحتوية على البروتين الاندماجي ‎AAD‏ للحقن الوريدي ‎(i.v.) intravenous‏ (لجرعة دواء سريعة المفعول ‎rapid—acting dosage of medication‏ ( والحقن العضلي ‎intramuscular‏ (.1.07) (لجرعة الدواء سريعة المفعول إلى حد ما وطويلة الأمد 1009-1854090). يمكن استخدام تطبيق البروتين الاندماجي ‎AAD‏ في الاختراع الحالي

‎٠‏ في علاج سرطانات مختلفة ‎Jie‏ سرطان البنكرياس» سرطان الدم؛ سرطان الرأس ‎Ally‏ سرطان القولون والمستقيم» سرطان الرئة؛ سرطان الثدي؛ سرطان البروستاتا؛ سرطان عنق الرحم؛ سرطان ‎cal)‏ السرطان الأنفي البلعومي؛ سرطان المرئ» وسرطان الدماغ. يتم توجيه الاختراع الحالي للبروتينات الاندماجية ‎AAD‏ ؛ لطرق لعلاج السرطان؛ لطرق و/أو تثبيط انبثاث نسيج سرطاني؛ وطرق لعلاج أمراض قائمة على الآرجينين.

‎Vo‏ تتضمن طريقة الاختراع الحالي ‎Lad‏ استخدام ‎dads‏ من أدوية علاج كيميائي ‎chemotherapeutic drugs‏ مختلفة و/أو علاج إشعاعي ‎radiotherapy‏ مع البروتين الاندماجي ‎AAD fusion protein‏ ,@ للاختراع الحالي لإعطاء تأثير متآزر على علاج السرطان ‎.synergistic effect on cancer treatment‏ شرح مختصر للرسومات

‎Yo‏ شكل ‎١‏ يبين ‎med‏ التصميم ‎old‏ بروتينات اندماجية ‎AAD fusion proteins‏ مختلفة بنطاق 7 اإاببتيد ‎peptide‏ /إبروتين ‎protein‏ رابط للألبومين ‎aalsalbumin—binding‏ أو اثنين في هيكل ثلاثي الأبعاد ‎structure‏ ا17166-01016051003. ‎Say‏ دمج نطاق/ببتيد/بروتين رابط للألبومين واحد أو اثنين ‏ مع ‎ADL‏ لتكوين_ البروتين الاندماجي ‎AAD‏ . موضع النطاق/الببتيد/البروتين الرابط للألبومين يكون بعيد عن الموقع النشط ‎ADE‏ يمكن دمج

‏ب

‎١ —‏ النطاق/الببتيد/البروتين الرابط للألبومين بالطرف- ‎N‏ أو/والطرف- © من 801 . يعتمد الهيكل في هذا الشكل على الهيكل ميكوبلازما ارجينيني ‎ADI Mycoplasma arginini‏ (بنك بيانات البروتين: ‎ADI )( L(ILXY ١‏ أصلي؛ (ب) بروتين اندماجي ‎AAD‏ مع اثنين ‎ABD‏ أو ‎ABD‏ )¢ (ج) بروتين اندماجي ‎AAD‏ مع ‎ABD‏ أو ‎١ ABD‏ واحد عند الطرف-ل؛ (د) بروتين اندماجي مع ‎ABD‏ أو ‎١ ABD‏ واحد عند الطرف-6. شكل ¥ يبين محاذاة التتابع ‎ADIL‏ في بعض الأنواع البكتيرية ‎Lay‏ في ذلك ميكوبلازما ارجينيني ‎SEQ SEQ ID)‏ رقم ‎(YY‏ لاكتيكوكوس لاكتيس ‎SEQ) Lactococcus lactis‏ رقم ‎«((Y¢‏ ‏باسيلوس سيريس ‎SEQ) Bacillus cereus‏ رقم ‎(Yo‏ و باسيلوس ليتشنيفورمس ‎Bacillus‏ ‎SEQ) licheniformis‏ رقم ‎.)١١‏ ‏شكل ؟ يبين التصاميم وتتابعات الحمض الأميني لبروتينات اندماجية ‎AAD‏ مختلفة تنشأ من ميكوبلازما ارجينيني (أ إلى ه) وبروتين اندماجي ‎AAD‏ ينشأ من باسيلوس سيريس ‎Bacillus‏ ‏5 (و). شكل ؛ يبين تخليق البروتين الاندماجي ‎AAD‏ .في تجسيمين (أ) و(ب) باستخدام البروتينات الاندماجية- إنتثين وربط البروتين المعبر جينياً ‎expressed protein ligation‏ (0ا08؛ نطاق ‎١‏ ارتباط الكيتين ‎(chitin binding‏ في المخططات التالية؛ (ج) اندماج الطرف-؛ (د) اندماج الطرف-0ا؛ (ه) ربط البروتين المتوسط بالإنتثين. شكل © ‎py‏ خريطة البلازميد لناقل التعبير الجيني المبني لإنتاج البروتين الاندماجي ‎AAD‏ . شكل 1 يبين 0 ‎day A‏ جينية؛ (ب) تتابع نيوكليوتيد ‎SEQ) nucleotide‏ رقم 24 ( و(ج) تتابع حمض أميني ‎SEQ) amino acid‏ رقم .¢( ‎ADI : ADI) His—ABD-PolyN-ADI ADI‏ ‎Yo‏ ال ميكوبلازما ارجينيني ‎Mycoplasma arginini‏ ( شكل ‎V‏ يبين )1( خريطة جينية؛ (ب) تتابع نيوكليوتيد ‎SEQ)‏ )£0( و (ج) تتابع حمض أميني ‎SEQ)‏ رقم ‎)4١‏ من ‎ADI: ADI) His—ABD-PolyN-bcADI ADI - ABD‏ ال باسيلوس سيريس ‎(Bacillus cereus‏ ‎oy‏

—A— ‏قابل للذوبان‎ 964. - 5 AAD (1) ‏يبين التعبير الجيني والتنقية للبروتين الاندماجي:‎ A JSS ‏للذوبان (جسم‎ BB ‏و<9696 غير‎ (V5 ١ ‏درجة مئوية (الممرات‎ Yo ‏عند التعبير الجيني عند‎ ‏مئوية (الممرات ؛ و*)؛ (ب) البروتين الاندماجي‎ dap TY ‏اشتمال) عند التعبير الجيني عند‎ 50010077 ‏سلفات دوديسيل صوديوم‎ SL ST ‏في جل الرحلان الكهربائي لجل بولي‎ al AAD ٠ ‏ممر‎ :(SDS-PAGE) dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ‏هه‎ ‏واصمة وزن جزيئي.‎ oF ‏كيلودالتون)؛ ممر‎ oY A) ‏_نقي‎ AAD ‏بروتين اندماجي‎ ‏يستنفذ الآرجينين بفاعلية ويثبط نمو الأنواع‎ AAD ‏شكل 9 يوضح أن البروتين الاندماجي‎

Sal ‏المختلفة من خطوط خلية سرطان بشري في دراسات مزرعة نسيج معملية؛ تتضمن سرطان‎ human colon ‏(8375)؛_سرطان_القولون البشري‎ human melanoma ‏البشري‎ ‎human pancreatic cancer ‏وسرطان _البنكرياس البشري‎ «(HCT116) carcinoma ٠ .(Pancl) ‏جل بولي أكريلاميد‎ () : AAD ‏يبين نتائج ارتباط الألبومين للبروتين الاندماجي‎ ٠١ ‏شكل‎ ‎HSA ‏يبين الزيادة في كمية المعقد‎ (VY) ‏أصلي غير متغير الطبيعة‎ polyacrylamide gel ‏(تتابع الحمض الأميني مبين في‎ AAD ‏تزداد كمية البروتين الاندماجي‎ Laie )٠٠١( AAD + human serum ‏رقم: 7؟؛ شكل ؟أ) المضافة. النسب المولارية لألبومين المصل البشري‎ SEQ Vo ‏على التوالي.‎ eho) geo) (Yi) Ve) ‏تساوي‎ 1-١7 ‏في الممرات‎ AAD :) HSA) albumin ‏بيكومول؛ على التوالي؛ (ب) في‎ Yes ١ ‏ونال عند‎ )٠١١( HSA ‏و‎ ١ ‏الممرات‎ Jia ‏رقم: ٠؛؛ شكل “ه)ء البومين: نسبة‎ SEQ) AAD ‏تجربة أخرى تعتمد على البروتين الاندماجي‎ (0 ‏كافية للارتباط بكل الألبومين الموجود (ممر‎ 8:١ AAD ‏على مستويات‎ AAD ‏يمثل رسم بياني يبين استجابة الجرعة للبروتين الاندماجي‎ ١١ ‏شكل‎ ٠ ‏كافية لاستتفاذ آرجينين البلازما‎ AAD ‏ميكروجم من‎ ٠٠١ ‏آرجينين البلازما في الفثران. الجرعة‎ ‏لمدة © أيام على الأقل.‎ ‏ب‎

الوصف التفصيلي: تعريفات يشير المصطلح "خلية جذعية سرطانية ‎cancer stem cell‏ " إلى الخلية المتميزة بيولوجياً داخل النسخة الورمية والتي تكون قادرة على بدء واستمرارية نمو الورم في الجسم الحي (أي خلية بدء © السرطان ‎.(cancer—initiating cell‏ الأرجينين هو حمض أميني ‎amino acid‏ 40% ضروري للبشر ‎humans‏ وثدييات ‎mammals‏ ‏أخرى. ‎Ka‏ تخليقه من السيترولين ‎citrulline‏ من خلال عملية ثنائية الخطوات محفزة بإنزيمات دورة اليوريا ‎Shi‏ أرجينينوساكسينات ‎(ASS) argininosuccinate synthase‏ ولياز آرجينينوساكسينات ‎ASL) argininosuccinate lyase‏ ). يمكن أيض الآرجينين إلى أورنيثين ‎٠‏ بواسطة إنزيم ‎Ola)‏ ويمكن تحويل الأورنيثين إلى سيترولين بواسطة كاربامويل ترانسفيراز الأورنيثين ‎OTC) ornithine carbamoyltransferase‏ ) في الميتوكوندريا ‎.mitochondria‏ ‏يمكن استخدام السيترولين لتخليق الآرجينين مرة أخرى. لا تتطلب الخلايا الطبيعية ‎sale‏ إمداد خارجي من الآرجينين للنمو بسبب النشاط التحفيزي الوفير ل ‎ASL 5 ASS‏ . في المقابل؛ لا يقوم العديد من أنواع السرطان بالتعبير الجيني ل ‎ASS‏ وهي لهذا عونية التغذية للآرجينين. يعتمد ‎Vo‏ نموها فقط على الآأرجينين من الدورة الدموية. لهذاء فإن استهداف آرجينين الدورة باستخدام الإنزيمات الحالة للارجينين استراتيجيا مجدية لتثبيط نمو الورم سلبي ‎negative tumor growth‏ ‎ASS-‏ . يمكن تحليل الآأرجينين بواسطة دي إميناز الأرجينين ‎ADI) arginine deiminase‏ ). يحول ‎AD‏ الأرجينين ‎arginine‏ إلى سيترولين ‎citrulline‏ وأمونيا ‎ammonia‏ « نواتج أيض دورة ‎٠‏ اليوريا ‎«a; metabolites of the urea cycle‏ يمكن العثور على ‎ADI‏ فقط في بدائيات النواة على سبيل المثال م5 ‎Mycoplasma‏ هناك مشاكل عديدة ترتبط بعزل وتنقية دي إميناز الأرجينين من بدائيات النواة. فشل ‎ADI‏ المعزول من بسودامونز بيوتيتا في إظهار فاعلية في الجسم ‎all‏ بسبب نشاطه الإنزيمي المنخفض في الأس الهيدروجيني ‎pH‏ المتعادل. ‎ADI‏ ‏المنتج من اسكورتشيا كولي غير نشط إنزيمياً ويتطلب على التوالي عملية تمسخ واستعادة طبيعة ب

“yam

ADI ‏متعددة مما يزيد من التكلفة اللاحقة للإنتاج. العمر النصفي البلازمي للشكل الأصلي من‎

Ensor et al., Cancer Res. | ‏قصير (-؛ ساعات) عند الحقن في الدورة الدموية البشرية‎ .]62:5443-5450 (2002); Izzo et al., J. Clin. Oncol. 22:1815-1822 (2004)

Polyethylene glycol ‏يمكن معالجة هذه العيوب جزئياً بواسطة الارتباط ببولي إيثيلين جليكول‎

ADI ‏المرتبط ببولي إيثيلين جليكول» تبين أن‎ ADIL ‏من بين الأشكال المختلفة‎ (PEG) © succinimidyl ‏من خلال ساكسينات ساكينيميديل‎ )٠٠١٠٠٠١ ‏(الوزن الجزيئي‎ PEG ‏المرتبط ب‎ ‏بعد الارتباط‎ ADI ‏هو صيغة فعالة. ومع ذلك؛ ينخفض نشاط‎ (ADI -PEG 20) succinate

Ensor et al., Cancer Res. | )90659.7 ‏ببولي إيثيلين جليكول بشكل كبير (بنسبة‎

Wang et al., Bioconjug. Chem. 17:1447-1459 ‏62:5443-5450؛‎ (2002) ‏ساكسينات الساكسينيميديل بسهولة وفصله عن‎ PEG ‏أيضاً؛ يمكن تحليل رابط‎ .])2006( ٠ ‏البروتين» مما يسبب مشاكل مناعية بعد فترة قصيرة من الاستخدام في الجسم. لهذاء هناك حاجة‎ ‏لتركيبات محسنة لعلاج السرطان؛ وعلى وجه الخصوص» تركيبات محسنة لعلاج السرطان بنشاط‎ ‏بسبب نشاطه‎ al) ‏إظهار فاعلية في الجسم‎ AP. 0110118 ‏المعزول من بي. بيوتيكا‎ ADI ‏فشل‎ ‏المتعادل ويمكن تصفيته بسرعة من الدورة الدموية‎ pH ‏الإنزيمي القليل في الأس الهيدروجيني‎ Yo

Mycoplasma ‏المشتق من ميكوبلازما ارجينيني‎ ADI ‏للحيوانات التجريبية. يتم وصف‎

Takaku et al, Int. J. Cancer, 51:244-249 ‏من قبل‎ «JE ‏؛ على سبيل‎ arginini ‏ومع ذلك؛ فإن المشكلة المرتبطة بالاستخدام‎ LOEVEAYA ‏و الاختراع الامريكي رقم‎ (1992) ‏العلاجي لهذا البروتين المتغاير هي الاستضداد لها. التعديل الكيميائي ل انل .من ميكوبلازما‎ ( PEG) ‏؛ مع‎ cyanuric 00101106 ‏ارجينيني»؛ من خلال مجموعة ارتباط كلوريد سيانيوريك‎ ٠

Takaku et al., Jpn. J. Cancer Res., 84:1195-1200 (1993) ‏موصوف من قبل‎ ‏ومع ذلك؛ فإن البروتين المعدل كان ساماً عند أيضه بسبب إطلاق السيانيد من مجموعة ارتباط‎ ‏بسهولة‎ PEG ‏يمكن تحليل الرابط‎ ؛٠١‎ ADI -0]6 ‏كلوريد السيانويوريك. في المقابل؛ حتى ل‎ ‏مائياً وفصله عن البروتين؛ مما يسبب مشاكل مناعية بعد فترة قصيرة من الاستخدام في الجسم.‎ ‏ب‎

-١١- ‏لهذاء هناك حاجة لتركيبات والتي تحلل الأحماض الأمينية غير الضرورية والتي ليس لها مشاكل‎ ‏مرتبطة بالتقنية الصناعية السابقة.‎ ‏؛‎ pancreatic ‏في أنواع عديدة من السرطانات تتضمن سرطان الجلد 016180701718 البنكرياس‎ ‏؛ الخلايا الكلوية‎ prostate ‏؛ البروستاتا‎ breast ‏؛ الثذي‎ leukemia ‏؛ الدم‎ colon ‏القولون‎ ‎ie ‏السرطان‎ WA ‏؛ تكون‎ liver cancers ‏وسرطانات الكبد‎ renal cell carcinoma © ‏حيث تفتقر للتعبير الجيني لسينثاز‎ arginine since they lack cia SU ‏التغذية‎ ‏مما يجعلها أهداف ممتازة‎ «( ASS) argininosuccinate synthetase ‏الأرجينينوساكسينات‎ ‏لعلاج استتفاذ الأرجينين. في هذا الاختراع؛ يكون للبروتينات الاندماجية دي إميناز الأرجينين‎ ‏للاستنفاذ الفعلي للآرجينين في خلايا‎ Al gla ‏بأعمار نصفية‎ Se ‏نشاط‎ ) AAD) ‏الرابطة للألبومين‎ ‏السرطان.‎ ٠ ‏كيلودالتون)‎ 5 ٠ ‏حجم المونومر ل الل يكون في حدود 55 كيلودالتون ويوجد كدايمر (في حدود‎

AAD ‏تصميم بناء البروتين الاندماجي‎ [Das et al., Structure. 12:657-667 (2004)] ‏/يروتين رابط للألبومين واحد أو اثنين مع أو بدون‎ peptide ‏يندمج نطاق/ببتيد‎ .١ ‏مبين في شكل‎ ‏والجدير‎ . AAD ‏_لتكوين البروتين الاندماجي‎ ADI ‏رقم: 476 -495؛ مع‎ SEQ ‏رابط (روابط)»‎ ‏بالذكر أنه يمكن اختيار نطاق/ببتيد/بروتين رابط للألبومين خاص واحد أو اثنين على أساس نوع‎ ١ ‏نسيج السرطان المستهدف؛ الحجم المطلوب والعمر النصفي للبروتين الاندماجي الناتج؛ وسواء يتم‎ ‏الرابطة للألبومين المختار متماثلة أو‎ sald) ‏قد تكون‎ lead ‏اختيار النطاق أو البروتين الكامل.‎ ‏مختلفة. بمعنى؛ يمكن يمكن دمج بروتين وببتيد؛ اثنين من البروتينات؛ اثنين من النطاقات؛ نطاق‎ ‏ويكون قادر أيضاً على الارتباط بألبومين‎ ADI ‏وبروتين؛ الخ؛ طالما يحتفظ الجزئ الناتج بنشاط‎ ‏المصل بأي وظيفة لجزء واحد من البروتين الاندماجي متداخل مع الجزء الآخر من البروتين‎ ٠ ‏الاندماجي. موضع النطاق/الببتيد/البروتين الرابط للألبومين يكون بعيد عن الموقع النشط. يمكن‎ ‏دمج النطاق/الببتيد/البروتين الرابط للألبومين مع الطرف-ل أو/والطرف-6 ل 01 . هناك أشكال‎ human ‏ألفة مختلفة أو محسنة لألبومين المصل البشري‎ af ‏التي تظهر‎ ABD ‏مختلفة ل‎ ‏لا‎ . ADI ‏ويمكن دمجها مع‎ ABD ‏يمكن بناء أشكال مختلفة من‎ .(HAS) serum albumin ‏(على سبيل المثال بسودامونز اس‎ ADI ‏يمكن استخدام بعض الكائنات الحية الدقيقة المتمتعة ب‎ YO ‏ب‎

-١١7-

ADI ‏بسبب الإمراضية وتوليد الحمى المحتملة لها. قد يكون مصدر‎ «(Pseudomonas sp ‏بي‎ ‏كائنات حية دقيقة مختلفة؛ على سبيل المثال ميكوبلازما (على سبيل‎ (le ‏من؛ لكنه لا يقتصر‎ ‏ميكوبلازما‎ «Mycoplasma arthritidis ‏المثال ميكوبلازما ارجينيني؛ ميكوبلازما ارتريتيدس‎

Jed Jp Je) Lactococcus ‏لاكتيكوكوس‎ (Mycoplasma hominis ‏هومني‎ ‏سبيل المثال بسودامونز‎ Je) Jiseasws (Lactococcus lactis ‏لاكتيكوكوس لاكتيس‎ ©

Pseudomonas ‏بسودامونز بيوتيدا‎ (Pseudomonas plecoglossicida ‏بلكوجلوسيسيدا‎ ‏ستبتوكوكس‎ (Pseudomonas aeruginosa ‏بسودامونز اروجينوسا‎ 58 «Streptococcus pyogenes ‏(على سبيل المثال ستبتوكوكس بيوجينز‎ 5 ‏ستبتوكوكس. بنومونياي‎ Streptococcus pneumonia | ‏ستبتوكوكس بنومونيا‎ ‏مايكودكتيريوم‎ «Escherichia | ‏اسكورتشيا‎ (Streptococcus pneumoniae | ٠

Mycobacterium ‏(على_سبيل_المثال مايكودكتيريوم توبركولوسيس‎ Mycobacterium

Bacillus ‏سبيل المثال باسيلوس ليتشنيفورمس‎ Je) Bacillus ‏و باسيلوس‎ (tuberculosis

ADI ‏من المفضل أن يتم استنساخ‎ .(Bacillus cereus ‏؛ باسيلوس سيريس‎ licheniformis

Lactococcus ‏؛ لاكتيكوكوس لاكتيس‎ Mycoplasma arginini ‏من ميكوبلازما ارجينيني‎

Bacillus ‏باسيلوس سيريس‎ ¢ Bacillus licheniformis ‏؛ باسيلوس ليتشنيفورمس‎ lactis Vo ‏رقم:‎ SEQ) SEQ ‏أو أي توليفة منها. يتم وصف تتابعات الحمض الأميني لها ب‎ ¢ cereus ‏في النشرة‎ Lay ‏ومحاذاة التتابع لبعض تتابعات الحمض الأميني في شكل 7 هنا‎ (Yoo YY

Wang et al., Bioconjug. :Das et al., Structure. 12:657-667 (2004)]

Ni et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. «Chem. 17:1447-1459 (2006) [90:193-201 (2011) ٠٠ ‏ميكوبلازما ارجينيني الأصلي‎ ADE ‏يتم عرض التصميم وتتابع الحمض الأميني ل )1( بروتين‎ ‏المختلفة الناشئة من انل ميكوبلازما‎ AAD ‏(ب) البروتينات الاندماجية‎ «(YY ‏رقم:‎ SEQ) ‏الناشئ من باسيلوس سيريس‎ AAD ‏رقم: 50-77 ) و(ج) البروتين الاندماجي‎ SEQ) ‏ارجينيني‎ ‏مختلفة بنجاح. يتم‎ AAD ‏رقم: ١؛) في شكل ؟. يتم بناء بروتينات اندماجية‎ SEQ) ADI ‏ب‎ yy ‏.في هذه‎ AAD ‏في البروتين الاندماجي‎ ADI ‏إدراج رابط بين البروتين الرابط للألبومين‎ ‏التجسيمات.‎ ‏باستخدام البروتينات الاندماجية-‎ Lad ‏جديد‎ AAD ‏يتم تخليق بروتين اندماجي‎ al ‏من جهة‎ )١( ‏الجديد‎ AAD ‏إنتثين وربط بروتين معبر جينياً (شكل ؛). يمكن تكوين البروتين الاندماجي‎ ‏إيستر متفاعل عند الطرف-0) ل‎ of ‏للطرف-ان مع‎ cysteine ‏به راسب سيستاين‎ ADI ‏بتفاعل‎ © ‏متفاعل‎ thioester ‏به راسب سيستاين للطرف-لا مع ثيو إيستر‎ ABD ‏بتفاعل‎ (Y) ‏أو‎ « ABD ‏بواسطة رابطة تساهمية. في شكل‎ ABD ‏وال‎ ADI ‏بحيث يتم ربط‎ ADI ‏عند الطرف-6 ل‎

ABD ‏المتفاعل عند الطرف-6 ل‎ ji) ‏براسب سيستاين الطرف-لا مع الثيو‎ ADI ‏يتفاعل‎ cat ‏عند الطرف-لا ل‎ cysteine ‏؛ و»0- سيستاين‎ ABD ‏علامة الثيو إيستر عند الطرف<6) ل‎ ٠.

PTWINT ١ ‏مطلوبة لتسهيل ربط البروتين. يتم إنتاج هذه الأجزاء باستخدام ناقل بي توين‎ 80 ٠ ‏وفقاً لدليل الشركة المصنعة. وبالأخص» يتم تخليق الجين‎ (Biolabs ‏(انجلترا الجديدة بيولابس‎ ‏إنتثين -680 ويتم استنساخه في الناقل تحت سيطرة المعزز‎ - ABD ‏المرمز للبروتين الاندماجي‎

CBD- ‏إنتثين‎ - ABD ‏(شكل ؛ ج). يرتبط البروتين الاندماجي‎ E.coli ‏للتعبير الجيني في‎ 7

CBD- ‏-إنتثين‎ ABD ‏في عمود. يتم عرض تتابع الحمض الأميني ل‎ chitin ‏الناتج بالكينتين‎ ‏القابل للتحريض والاستخلاص من‎ thiol ‏رقم: 7؛) في شكل ؛أ. بعد انشقاق الثيول‎ SEQ) Vo ‏بالثيو إيستر المتفاعل عند الطرف-6 الخاص به (شكل‎ ABD ‏يتم الحصول على ال‎ sell (zt ‏واستنساخه‎ CBD- ‏-إنتثين‎ ABD ‏يتم تخليق الجين المرمز للبروتين الاندماجي‎ (al ‏من جهة‎ ‏في الناقل تحت سيطرة المعزز تي 7 للتعبير الجيني في اي. كولي (شكل ؛د). يرتبط البروتين‎ ‏-إنتثين-080 الناتج بالكيتين في عمود. يتم عرض تتابع الحمض الأميني ل‎ ABD ‏الاندماجي‎ ٠

PH ‏رقم: ؟؛) في شكل ؛ب. بعد الانشقاق عند أس هيدروجيني‎ SEQ) ©80- ‏-إنتثين‎ ABD ‏به 0- سيستاين عند‎ ADL ‏درجة مئوية؛ والاستخلاص من العمود؛ يتم الحصول على‎ Yo 5 V ‏بواسطة تفاعل‎ AAD ‏يتم إنتاج البروتين الاندماجي‎ pal ‏الخاص به (شكل ؛د).‎ No-call) at ‏ربط البروتين كما هو مبين في شكل‎

— \ ¢ — والأهم من ذلك؛ يمكن إنتاج البروتينات الاندماجية ‎AAD‏ وتنقيتها بطريقة ملائمة. على سبيل المثال؛ يتم اجراء التعبير الجيني للبروتين الاندماجي ‎AAD‏ بنجاح وتنقيته من اي. كولي في كل من جزء قابل للذوبان وجزء غير قابل للذوبان؛ وهذه النتيجة مبينة في شكل ‎A‏ علاوة على ذلك؛ يبين شكل + البروتين الاندماجي ‎AAD‏ _النقي المحلل بواسطة الرحلان © الكهربائي 61601000016515 لجل بولي أكريلاميد سلفات دوديسيل صوديوم ‎sodium dodecyl‏

AAD ‏يتم تحديد حجم البروتين الاندماجي‎ .)5105-865(511816 polyacrylamide gel النقي ‎oY, A‏ كيلودالتون. تحتوي التركيبة الصيدلية وفقاً للاختراع الحالي على بروتين اندماجي ‎AAD‏ بنشاط ‎Je‏ لاستنفاذ الآرجينين في خلايا ورم لعلاج السرطان. ‎٠‏ وقد وجد أن النشاط المحدد للبروتين الاندماجي ‎AAD‏ النقي مماثل لذلك الذي ل ا من النمطق البري. 1650 تمثل نصف أقصى تركيز مثبط. أى؛ تمثل تركيز البروتين الاندماجي ‎lhl AAD‏ لتثبيط ‎965٠‏ من خط خلايا السرطان. 1050 هي مقياس لمدى فاعلية الدواء. 0 البروتين الاندماجي ‎AAD‏ (تتابع الحمض الأميني مبين في ‎SEQ‏ رقم: ‎fv‏ شكل #7( لخطوط ‎WIA‏ سرطانية مختلفة (سرطان الجلد البشري؛ ايه 975 و 4-0061-28/ا5؛ سرطان ‎Yo‏ القولون البشري؛ 6 ؛ سرطان البنكرياس البشري؛ ‎Pancl‏ ؛ سرطان الكبد البشري؛ اك 1 ؛ سرطان عتق الرحم البشري؛ ‎(C-33A‏ مبينة في جدول ‎.١‏ ‏فاعلية البروتين الاندماجي ‎AAD‏ في المعمل على خطوط ‎WAY‏ السرطانية المختلفة موضحة في شكل ‎A‏ ‏توضح أن البروتين الاندماجي ‎AAD‏ يمكنه قتل العديد من أنواع السرطانات؛ بما في ذلك سرطان ‎٠‏ الجلد البشري؛ سرطان القولون البشري وخطوط خلايا سرطان البنكرياس. ‎ogy

اج \ _ جدول ‎١‏ ‏خط خلية السرطان 0 ‎ADD‏ (ميكروجم/مل) ‎ee‏ ‎em‏ ‎ee‏ ‏لدراسة ارتباط الألبومين؛ أثبتنا بنجاح أن البروتين الاندماجي ‎AAD‏ المصمم يمكنه الارتباط بألبومين المصل البشري (15/8) ). يبين شكل ‎٠١‏ أن البروتين الاندماجي ‎AAD‏ (تتابع الحمض © الأميني مبين في ‎SEQ‏ رقم: ‎fv‏ شكل 7ه) يرتبط ب ‎HSA‏ بسهولة. عند نسبة مولية ‎5:١‏ أو ‎٠5١‏ يتكون تكوين المعقد 80ْم- ‎HSA‏ وفقاً لبناء شكل ‎١‏ باستخدام تصميم جزئ الرابط. من المتوقع أن العمر النصفي للدورة الدموية للبروتين الاندماجي ‎AAD‏ في الدم يزداد بتكوين المعقد ‎HSA -AAD‏ غير التساهمي. وبالتالي؛ تم تخليق نسخة طويلة الأمد من البروتين الاندماجي ‎AAD‏ بنجاح. ‎٠‏ لا تظهر المنتجات التجارية فاعلية كبيرة عند مقارنتها بالتركيب الصيدلي المحتوي على البروتين الاندماجي ‎AAD‏ المحضر في هذا الاختراع. للاستخدامات في علاج السرطان؛ تعمل التركيبة الصيدلية المحتوية على البروتين الاندماجي ‎AAD‏ وفقاً للاختراع الحالي كعامل مضاد سرطان

— أ \ —

لاستنفاذ الآرجينين في أنسجة الورم. البروتين الاندماجي ‎AAD‏ مرشح جيد للاستخدام في توليفة

مع عوامل استهداف جزيئي أو سامة خلوياً أخرى.

أمثلة

يتم تقديم الأمثلة التالية عن طريق وصف تجسيمات محددة لهذا الاختراع بدون نية الحد من نطاق

0 هذا الاختراع بأي شكل من الأشكال.

يتعلق العديد من الأمثلة أدناه بطرق تحضير بروتين اندماجي دي إميناز آرجينين رابط للألبومين.

يمكن استخدام تقنيات مختلفة تتضمن الاستنساخ وربط البروتين المتوسط بالإنتثين. وعلى النحو

المستخدم ‎cla‏ يُستخدم المصطلح "استنساخ” على نطاق واسع ويشتمل على بناء جين اندماجي

يقوم بترميز البروتين الاندماجي دي إميناز آرجينين الرابط للألبومين؛ إدراج الجين الاندماجي في ‎٠‏ ناقل؛ إدراج الناقل في ‎SIS‏ حي مضيف والتعبير الجيني لبروتين يتضمن بروتين اندماجي دي

إميناز آرجينين رابط للألبومين. يمكن اجراء أشكال عديدة لهذه التقنية ولا تزال تقع ضمن

الاستنساخ المتوقع من قبل الاختراع الحالي.

١ ‏مثال‎

بناء الجين المرمز للنطاق/الببتيد ‎peptide‏ /البروتين الرابط للألبومين ‎albumin-binding‏ ‎ABD) domain ٠‏ (

يتم بناء الجين المرمز ‎ABD J‏ بواسطة دورتين ‎PCR‏ في الدورة الأولى؛ يحتوي خليط التفاعل

‎PCR‏ (إجمالي الحجم ‎Yo‏ ميكرولتر) على المواد التالية:

‎1 x iProof PCR buffer (Bio-Rad)

‎dNTP ‏ميكرومولار خليط‎ ٠ (Bio-Rad) Polymerase ‏بوليميراز‎ iProof DNA ‏وحدة من‎ v0 Yo

‎Yo‏ نانومولار من كل من النسب الضئيلة التالية:

‎ogy

CATGATGCGAATTCCTTAGCTGAAGCTAAAGTCTTAGCTAACAGAGAAC

T-3’

ABD-R2 reverse primer (SEQ ID NO: 02): 5- ‏هم‎ ‎TAGTCACTTACTCCATATTTGTCAAGTTCTCTGTTAGCTAAGACTTTAGC ‎3 7

ABD-F3 forward primer (SEQ ID NO: 03): 5-

GAACTTGACAAATATGGAGTAAGTGACTATTACAAGAACCTAATCAACA ٠

A-3’

ABD-R4 reverse primer (SEQ ID NO: 04): 5-

TACACCTTCAACAGTTTTGGCATTGTTGATTAGGTTCTTGTAATAGTCAC

-3 , ١ o

ABD-F5 forward primer (SEQ ID NO: 05): 5-

GCCAAAACTGTTGAAGGTGTAAAAGCACTGATAGATGAAATTTTAGCTG

C-3’

ABD-RG6 reverse primer (SEQ ID NO: 06): 9٠ ogy

م \ — -5 ‎AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-‏ ‏,9 3 يتم استخدام برنامج ‎PCR‏ التالي: ‎aA 2‏ درجة ‎Yo YEP‏ ثانية؛ ‎٠‏ دورة من ‎a A}‏ درجة ‎Ye YEP‏ ثواني 5.6 درجة ‎١ YEP‏ ثانية ‎VY‏ درجة مئوية ‎٠١‏ ثانية) في الدورة الثانية من ‎PCR‏ ؛ يحتوي خليط ‎PCR‏ (إجمالي الحجم ‎٠‏ © ميكرولتر) على المواد التالية: ‎x iProof PCR buffer (Bio-Rad);‏ 1 ‎٠ 0٠‏ ميكرومولار خليط ‎ANTP‏ ‎١‏ ميكرولتر من ‎PCR‏ متفاعل كقالب ل ‎DNA‏ من الدورة الأولى؛ ‎١‏ وحدة من ‎iProof DNA‏ بوليميراز ‎(Bio-Rad) Polymerase‏ ‎Yeo‏ نانومولار من كل من النسب الضئيلة التالية : ‎F7— ABD‏ برايمر أمامي ‎SEQ)‏ رقم: ‎١٠7‏ ): رد -5 ‎CATGATGCGAATTCCTTAGCTGAAGCTAAAGTCTTAGCTAACAGAGAAC‏ ‏1-1 ‎ABD‏ — 48 برايمر عكسي ‎SEQ) reverse primer‏ رقم: ‎٠6‏ ): -5 ‎AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG- ٠‏ ,9 3 ب

-؟و١-‏ يتم استخدام برنامج ‎PCR‏ التالي: ‎AA‏ درجة مثوية ‎Ve‏ ثانية؛ ‎YO‏ دورة من ‎AA}‏ درجة ‎٠١ Agia‏ ثواني؛ ‎٠١‏ درجة ‎٠١ Agile‏ ثانية؛ ‎VY‏ درجة مثوية ‎VY ofan ٠١‏ درجة مئوية * دقائق يتم الحصول على منتج ‎PCR‏ المحتوي على تتابع ال ظملانا من ‎(bp bp Y14) ABD‏ © وينقى بواسطة مجموعة استخلاص جل كايجين ‎DNA Qiagen‏ لغرض الاستنساخ. مثال ‎fy‏ ‏بناء للجين الاندماجي المرمز للبروتين الاندماجي ‎AAD‏ ‏في ‎PCR‏ الأولى؛ يحتوي خليط ‎PCR‏ (إجمالي الحجم ‎5٠‏ ميكرولتر) على المواد التالية: ‎iProof PCR x‏ مصد ‎Bio-Rad)‏ ( ‎5١ 00٠‏ ميكرومولار خليط ‎dNTP‏ ‎YO‏ نانوجم من مجموعة العوامل الوراثية ميكوبلازما ارجينيني ‎DNA‏ ؛ ‎١‏ وحدة من ‎iProof DNA‏ بوليميراز ‎Bio-Rad)‏ ( ‎٠١‏ نانومولار من كل من النسب الضكيلة التالية: ‎ADINde-F‏ برايمر أمامي ‎SEQ) forward primer‏ رقم: 9+(: ‎5’-ATCGATCGATGTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3> ٠‏ ‎ADIhis—R‏ برايمر عكسي ‎SEQ)‏ رقم: ‎:)٠١‏ ‏-55 ‎AGCTAAGGAATTCGCATCATGATGGTGATGGTGGTGGCTACCCCACTT‏ ‎AAC-3’‏ ‎٠‏ يتم استخدام برنامج ‎PCR‏ التالي: ا

=« \ _ ‎A‏ درجة ‎١ YEP‏ دقيقة؛ ‎yo‏ دورة من ‎an q A}‏ مثوية ‎A‏ ثواني» .5 درجة ‎Yo YEP‏ ثانية 7 درجة ‎an 7 fants 12 YEP‏ مثوية 25 دقائق يتم الحصول على منتج ‎PCR‏ بطول ‎bp ١780‏ وينقى بواسطة مجموعة استخلاص جل كايجين ‎DNA‏ . بعد ‎daa‏ يتم اجراء ‎Aull PCR‏ يحتوي خليط ‎PCR‏ (إجمالي الحجم 254 ميكرولتر) على المواد التالية: ‎Bio-Rad) das _ 10001 PCR x‏ ( ‎٠‏ ميكرومولار خليط ‎ANTP‏ ‏أ نانوجم من منتج ‎bp ‘YA.

PCR‏ ¢ ‎٠‏ نانوجم من منتج ‎bp 1714 PCR‏ ؛ ‎١ ٠‏ وحدة من ‎iProof DNA‏ بوليميراز ‎(Bio-Rad)‏ ‎Yoo‏ نانومولار من كل من النسب الضئيلة التالية: ‎ADINDE-F‏ برايمر أمامي ‎SEQ)‏ رقم: ‎:)١١‏ ‏06-3 حلم ‎١١‏ الحلم ‎١‏ ومطنعمة ‎6١01 611١١‏ امون اطون | خ- اذ ‎ABD-R10‏ برايمر عكسي ‎SEQ)‏ رقم: ‎:)1١ Y‏ ‎eo‏ -5 ‎AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-‏ ‎bl‏ 3 يتم استخدام برنامج ‎PCR‏ التالي: ‎A‏ درجة ‎١ YEP‏ دقيقة؛ ‎yo‏ دورة من ‎an q A}‏ مثوية ‎A‏ ثواني» .5 درجة ‎Yo YEP‏ ثانية ‎VY Yo‏ درجة مئوية ‎YY {dul fo‏ درجة مئوية 0 دقائق ‎oy‏

_ \ \ —_

يتم الحصول على منتج ‎PCR‏ بطول ‎bp VEYA‏ وينقى بواسطة مجموعة استخلاص جل

كايجين ‎DNA‏ . ثم يهضم بإنزيمات اقتطاع ‎Ndel‏ و ‎110011١‏ ويرتبط ب بلازميد ‎plasmid‏

‎pREST‏ (انفيتروجن ‎(Invitrogen‏ والذي يكون مهضوم سابقاً بنفس الإنزيمات. ثم يتم تحويل

‏منتج الارتباط إلى خلايا 8112 ‎E. coli‏ (023). يتم تأكيد تتابع الجين الاندماجي الذي تم

‏© تركيبه بواسطة تتابع ‎DNA‏ .

‏مثال "ب

‎His—ABD-PolyN-ADI # Lui.

‏يتم اجراء بناء ‎SEQ) His—ABD-PolyN-ADI‏ رقم: ‎fv‏ في شكل ‎(AY‏ بواسطة خطوتي

‏تداخل ‎PCR‏ ؛ يتم إدراج جزء ‎PCR‏ الناتج من الخطوة الأخيرة في الناقل 08138 بين المواقع ‎Ye‏ ندي ‎.BamHI‏ يتم عرض ‎day A‏ الجين؛ تتابع النيوكليوتيد وتتابع الحمض الأميني ل ‎His—‏

‎.1 ‏في شكل‎ ABD-PolyN-ADI

‏البرايمرات المتضمنة في بناء ‎His~ABD-PolyN—ADI‏ :

‏هز ‎ABD‏ ان دي اي - اف 0158801106 برايمر أمامي ‎SEQ)‏ رقم: ‎:)١١‏

‎5- ‎GGAGATATACATATGCATCATCACCATCACCATGATGAAGCCGTGGAT ٠

‎G-3’

‏880000-41 برايمر عكسي ‎SEQ)‏ رقم: ‎:(V¢‏

‎5-

‎TTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATC ‎-3’ Y.

‎:(Vo ‏رقم:‎ SEQ) ‏برايمر عكسي‎ ABDN-R2

‎5’~AGAACCGCCGCTACCATTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGA-3’

‎OLY

_— \ \ _ ‎ADIN-F‏ برايمر أمامي ‎SEQ)‏ رقم: ‎:)١6‏ ‏-5 ‎AATAATAACAATGGTAGCGGCGGTTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAG‏ ‎ADIBam-R G-3’‏ برايمر عكسي ‎SEQ)‏ رقم: ‎:)١١‏ ‎5’-TAGATCAATGGATCCTTACCACTTAACATCTTTACGTGATAAAG-3’ ©‏ في دورة ‎PCR‏ الأولى؛ يتم تحضير ‎5٠0‏ ميكرولتر من حجم التفاعل المحتوي على التركيز المعروف من المكونات في أنبوبتي ‎PCR‏ . في كل من الأنابيب؛ يتم خلط ‎iProof (dNTP‏ مصد ‎Bio-Rad)‏ )؛ بوليميراز ‎Bio-Rad) iProof DNA‏ )؛ برايمرات 01101615 وقالب ‎DNA‏ ‏واضافتها إلى ‎٠٠‏ ميكرولتر من ‎.ddH20‏ قالب ‎DNA‏ المستخدم في التفاعل هو ‎PET3a Jil‏ ‎Yo‏ يحتوي على الجين ‎ADI‏ من ميكوبلازما ارجينيني مع إزالة طفرة موقع ا1006_داخلية بدون تغيير تتابع البروتين للجين ‎ADI‏ . تحتوي أنبوبتي التفاعل على مخاليط البرايمر من (أ) ‎SEQ) pmol hisABDNde—F ٠١‏ رقم: 0 ب بيكومول ‎tad) SEQ) ABDnn—-R1‏ 2 0( و ‎Yo‏ بيكومول ‎tad) SEQ) ABDn-R2‏ ٠١)؛‏ و(ب) ‎٠١‏ بيكومول ‎SEQ) ADIN-F‏ رقم: ‎(V1‏ و١٠‏ بيكومول ‎SEQ) ABIDam-R‏ رقم: 7١١)؛‏ على التوالي. يتم ضبط برنامج ال ‎Bay PCR‏ للخطوات الموصى بها في الدليل مع درجة حرارة تلدين وامتداد (زمن) عند ‎٠٠0‏ درجة مئوية ‎٠١(‏ ثانية) و77 درجة مئوية )£0 ثانية)؛ على التوالي. المنتجين الناشئين بواسطة ‎PCR‏ بالحجم 7717 ‎bp YYYA 5 bp‏ . يتم استخلاص المنتجات واستخدامها كقالب للدورة التالية ل ‎PCR‏ . ‎٠‏ في خطوة التداخل الثانية؛ يتم تحضير خليط التفاعل بطريقة مماثلة للدورة الأولى باستثناء أن القالب المستخدم كان خليط من ‎١‏ بيكومول من ‎bp YYV‏ منتج ‎PCR‏ .و١‏ بيكومول من ‎١١78‏ ‏م منتج ‎PCR‏ ...من الدورة الأولى ل ‎PCR‏ . يتم تغيير البرايمرات إلى ‎٠١‏ بيكومول ‎SEQ) hisABDNde-F‏ رقم: ‎(VY‏ و١٠‏ بيكومول ‎SEQ) ADIBam-R‏ رقم: ‎(VV‏ ‎ogy‏

— \ — درجة حرارة التلدين والتمديد (زمن) هي 00 درجة مئوية ‎Yo)‏ ثانية) 5 ‎VY‏ درجة مئوية ‎٠١(‏ ثانية)؛ على التوالي. يتم إنتاج منتج ‎PCR‏ بحجم ‎bp ١484‏ _من التفاعل. يتم تنقية المنتج ‎PCR‏ ‏وهضمه بواسطة ‎gu‏ ثم الارتباط في البلازميد 0138 سابق الهضم. ثم يتم تحويل المنتج المرتبط في 8121 ‎(DE3) E. coli‏ لإنتاج البروتين معاد الاتحاد. ‎o‏ مثال ‎al‏ ‏استتساخ ‎His ~ABD~PolyN-bcADI‏ يتم اجراء بناء ‎SEQ) His—ABD-PolyN-bcADI‏ رقم: )8 في شكل 57( بواسطة خطوتي تداخل ‎PCR‏ ؛ يتم إدراج جزء ‎PCR‏ الناتج من الخطوة الأخيرة في الناقل 08138 بين المواقع ‎Ndel‏ و ‎BamHI‏ . يتم عرض خريطة الجين؛ تتابع النيوكليوتيد وتتابع الحمض الأميني ل ‎His—‏ ‎ABD-PolyN-bcADI ٠‏ في شكل ¥. البرايمرات المتضمنة في بناء ‎:His—ABD-PolyN-bcADI‏ ‎His—ABD-PolyN-bcADI‏ البرايمر الأمامي ‎SEQ)‏ رقم: ‎:)١٠8‏ ‏-5 ‎GGAGATATACATATGCATCATCACCATCACCATGATGAAGCCGTGGAT‏ ‎١‏ 6-3 ‎bcABDNN-R1‏ البرايمر العكسي ‎SEQ)‏ رقم: ‎:(V4‏ ‏-5 ‎TTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATC‏ ‏? 3 ‎bcABDN-R2 ٠‏ البرايمر العكسي ‎SEQ)‏ رقم: ‎:)٠١‏ ‎5’~TTTACCGCCGCTACCATTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGA-3’‏ ‎beADIN-F‏ البرايمر الأمامي ‎SEQ)‏ رقم: ‎:)١١‏

— ¢ \ — -5 ‎AATAATAACAATGGTAGCGGCGGTAAACATCCGATACATGTTACTTCAG‏ ‏نحم ‎bcADIBam-R‏ البرايمر العكسي ‎SEQ)‏ رقم: ‎:)7١‏ ‏ه ‎5’-TAGATCAATGGATCCCTAAATATCTTTACGAACAATTGGCATAC-3>‏ ‏في دورة ‎PCR‏ الأولى؛ يتم تحضير ‎5٠‏ ميكرولتر من حجم التفاعل المحتوي على التركيز المعروف من المكونات في أنبوبتي ‎PCR‏ .. في كل من الأنابيب؛ يتم خلط ‎«dNTP‏ مصد ‎Bio-Rad) iProof‏ )؛ بوليميراز ملانا ‎Bio-Rad) iProof‏ )؛ برايمرات ‎DNA ly‏ واضافتها إلى ‎5٠‏ ميكرولتر من ‎.ddH20‏ قالب ‎DNA‏ المستخدم في التفاعل هو ناقل ‎PET3a‏ ‎Ve‏ يحتوي على الجين ‎ADI‏ من باسيليس سيرياس ‎Bacillius cereus‏ مع إزالة طفرة موقع ‎Ndel‏ ‏داخلية بدون تغيير تتابع البروتين للجين ‎ADI‏ ‏تحتوي أنبوبتي التفاعل على مخاليط البرايمر من 0 ‎His—ABD-PolyN—-bcADI se Su Ye‏ ‎SEQ)‏ رقم: ‎A‏ )(« 0 ,+ بيكومول ‎SEQ) bcABDnn—-R1‏ رقم: 9 0( و ‎Yo‏ بيكومول ‎SEQ) bcABDN-R2‏ رقم: ١٠)؛‏ و(ب) ‎٠١‏ بيكومول ‎SEQ) becADIN-F‏ رقم: ‎(YY‏ و١٠‏ ‎١‏ بيكومول ‎SEQ) bcABIDam-R‏ رقم: ‎(YY‏ على التوالي. يتم ضبط برنامج ال 08 وفقاً للخطوات الموصى بها في الدليل مع درجة حرارة تلدين وتمديد ‎annealing and extension‏ ‎temperature‏ (زمن) عند ‎٠٠‏ درجة مئوية ‎٠١(‏ ثانية) و77 درجة مئوية ‎Ee)‏ ثانية)؛ على التوالي. المنتجين الناشئين بواسطة ‎PCR‏ بالحجم ‎bp YYY‏ و ‎bp ١750١‏ يتم استخلاص المنتجات واستخدامها كقالب للدورة التالية ل ‎PCR‏ . ‎٠‏ في خطوة التداخل الثانية؛ يتم تحضير خليط التفاعل بطريقة مماثلة للدورة الأولى باستثناء أن القالب المستخدم كان خليط من ‎١‏ بيكومول من ‎bp 77١7‏ منتج ‎PCR‏ و١‏ بيكومول من ‎١7*٠0‏ ‎bp‏ منتج ‎PCR‏ .من الدورة الأولى ‎PCR‏ . يتم تغيير البرايمرات إلى ‎٠١‏ بيكومول ‎His—‏ ‎SEQ) ABD-PolyN-bcADI‏ رقم: ‎(VA‏ و١٠‏ بيكومول ‎SEQ) bcADIBam—-R‏ رقم: ‎(YY‏ ‎oy‏

اج \ — درجة ‎Sha‏ التلدين والتمديد (زمن) هي ‎٠٠‏ درجة مئوية )0 ‎Y‏ ثانية) 5 ‎YY‏ درجة مئوية ‎(BT)‏ ‏على التوالي. يتم إنتاج منتج ‎PCR‏ بحجم ‎bp ١597‏ من التفاعل. يتم تنقية منتج ال ‎PCR‏ ‏وهضمه بواسطة ‎gu‏ ثم الارتباط في البلازميد 0138 سابق الهضم. ثم يتم تحويل المنتج ‎lag ll‏ في ‎(E. coli 8121 (DE3‏ لإنتاج البروتين معاد الاتحاد ‎recombinant protein‏ . © مثال ؟ التعبير الجيني وتنقية البروتين الاندماجي ‎AAD‏ ‏لتحضير مزرعة البذور؛ يتم زراعة السلالة ‎(E. coli BL2T(DE3‏ (التي تحمل البلازميد المرمز ‎plasmid encoding‏ للبروتين الاندماجي ‎AAD‏ (شكل *#) في © مل وسط ‎Yo TY » ١‏ درجة مثوية؛ ‎Yoo‏ لفة في الدقيقة؛ طوال الليل. يتم إضافة مزرعة البذور طوال الليل ‎(Je Y,0)‏ ‎Yo‏ إلى ‎You‏ مل من ‎XY‏ تي واي + ‎an TV‏ مثوية ‎al You‏ في الدقيقة 0,¥ ساعة (حتى ‎OD600‏ تساوي تقريبا 8,1 ‎.)٠,7-‏ عند الوصول إلى 010600؛ يتم إضافة ‎IPTG‏ إلى المزرعة (7© مل مولار تركيز نهائي). استمر النمو ‎YY sad‏ ساعة أخرى عند ‎Yo‏ درجة مئوية ثم يتم جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي. يتم إعادة تعليق كرية الخلية في ‎Yo‏ مل من ‎٠١‏ مل مولار منظم فوسفات صوديوم ‎sodium phosphate‏ ¢ أس هيدروجيني ‎pH‏ 7,4. يتم تحليل الخلايا ‎١‏ بالصوتنة. يتم جمع البروتين القابل للذوبان بعد الطرد المركزي ‎centrifugation‏ . ثم يتم تنقية البروتين الاندماجي (المحتوي على ‎Ade‏ هز ‎(His‏ بواسطة التحليل الكروماتوجرافي الانجذابي للنيكل. يبين جدول ‎Y‏ أن درجة حرارة الزرع هي عامل مهم في التأثير على قابلية ذوبان البروتين الاندماجي ‎AAD‏ (تتابع الحمض الأميني مبين في ‎SEQ‏ رقم: ‎cf‏ شكل ‎(AY‏ الناتج من مضيف التعبير الجيني. ‎Yo‏ لعزل الجزء القابل للذوبان من البروتين الاندماجي ‎AAD‏ ؛ يتم إعادة تعليق كرية الخلية في ‎Yo‏ ‎Je‏ من ‎٠‏ مل مولار منظم فوسفات صوديوم؛ أس هيدروجيني ‎pH‏ عا يتم تحليل الخلايا بالصوتنة. يتم تجميع الجزء القابل للذوبان بعد الطرد المركزي. ثم يتم تنقية البروتين الاندماجي ‎AAD‏ (يحتوي على علامة هز) بواسطة التحليل الكروماتوجرافي الانجذابي للنيكل. ا

— أ \ — لعزل الجزء غير القابل للذوبان من البروتين الاندماجي ‎AAD‏ ؛ يتم ‎sale)‏ تعليق كرية الخلية في ‎Je YO‏ من ‎٠٠١‏ مل مولار ‎«Tris-HCI‏ أس هيدروجيني ‎pH‏ كا ‎96١‏ تريتون اكس - ‎٠٠‏ حر 0. يتم تحليل الخلايا بالصوتنة. يتم تجميع الجزء غير القابل للذوبان (أجسام اشتمال) بالطرد المركزي. يتم فك البروتين بإعادة التعليق في ‎٠١‏ مل من ‎Yo‏ مل مولار 105-116 ؛ أس © هيدروجيني ‎pH‏ 72,4ء ‎١‏ مولار جوانيدين ‎HOI‏ ويتم وضعه في دوامة حتي يصبح قابل للذوبان. يتم فك طي البروتين بإضافة محلول البروتين المفكوك قطرة قطرة في محلول سريع المزج من ‎٠٠١‏ ‏مل من ‎٠١‏ مل مولار منظم فوسفات صوديوم؛ أس هيدروجيني ‎pH‏ 7,4. يتم ‎A‏ الجزء غير القابل للذوبان بواسطة الطرد المركزي. يتم اجراء تمليح البروتين بإضافة مسحوق سلفات أمونيوم ‎ammonium sulphate‏ صلب إلى ‎ald)‏ الطافية لتحقيق ‎967٠‏ تشبع. يتم جمع الجزء غير أ القابل للذوبان بالطرد المركزي ويعاد تعليقه في ‎٠‏ مل من ‎٠٠١‏ مل مولار منظم فوسفات صوديوم ‎sodium phosphate‏ ثم يتم تتقية البروتين ‎AAD ala)‏ (يحتوي على ‎(His tag idle‏ بواسطة التحليل الكروماتوجرافي الانجذابي للنيكل ‎-nickel affinity chromatography‏ جدول ؟ درجة حرارة الزرع ‎A) A)‏ ب (درجة مئوية) الإنتاجية ‎FR Rta BI CRY [PERN‏ سم ‎VY,‏ بس إل مل مزرحة ‎٠‏ قابل للذوبان 9690 قابل للذوبان 9690 جسم اشتمال 0 (ميكروجم/مل) ‎YY TA ٠٠١ ١‏ على 75؟ خلية مثال ؛

AAD ‏مقايسة نشاط الإنزيم وحركية الإنزيم للبروتين الاندماجي‎ Vo ب

ل لتعين نشاط الإنزيم للبروتين الاندماجي ‎AAD 5 ADI‏ 0( النمط البري في الاختراع الحالي؛ يتم استخدام مقايسة ثاني آسيتيل مونوكسيم ‎(DAM) diacetyl monoxime‏ — ثيوسيميكربازيد ‎(TSC) thiosemicarbazide‏ للكشف عن السيترولين ‎Lcitrulline‏ التفاعل مبين أدناه. ل - أرجينين ‎L-Arginine‏ دي إميناز أرجينين ‎ADI) arginine deiminase‏ ( أو © البروتين الاندماجي ‎AAD‏ ل- سيتزولين ‎Ammonia sd + L-Citrulline‏ يتم اجراء هذه المقايسة بإضافة عينة إلى كاشف لونء والتي يتم تحضيرها بخلط محلول كلوريد حديديك حمضي مع محلول ‎DAM-TSC‏ . وباختصار؛ يتم تحضين الإنزيم مع ‎٠١‏ مل مولار أرجينين ‎٠‏ مل مولار فوسفات صوديوم أس هيدروجيني ‎pH‏ 1,4 لمدة © دقائق عند ‎TY‏ درجة مثوية. يتم تسخين خليط التفاعل عند ‎٠٠١‏ درجة مئوية لمدة © دقائق لتطوير اللون والقراءة عند ‎Ye‏ 240 نانومتر (مسار الضوء ‎١ = light path‏ سم). يتم إنشاء منحنى معياري باستخدام تركيزات مختلفة من السيترولين. وحدة واحدة من الإنزيم الأصلي ‎ADI‏ تساوي كمية نشاط الإنزيم التي تحول ‎١‏ ميكرومول من الآرجينين إلى ‎١‏ ميكرومول من السيترولين كل دقيقة عند ‎TV‏ درجة مئوية في ظروف المقايسة. النشاطات المحددة للبروتين الاندماجي ‎AAD; ADI‏ من النمط البري في الاختراع ‎all‏ تساوي ‎AE‏ و5,7 وحدة/مجم (عند أس هيدروجيني ‎pH‏ 7,4 أس هيدروجيني ‎١‏ 1م فسيولوجي) على التوالي. يتم أيضاً تعيين النشاطات المحددة للبروتين الاندماجي انام ‎AAD‏ _من النمط البري عند مدى أس هيدروجيني ‎pH‏ مختلف (من الأس الهيدروجيني ‎PH‏ ‏5 إلى 3,5)؛ والأس الهيدروجيني ‎pH‏ الأمثل يكون عند ‎Te‏ لهذاء تشير النتائج إلى أن البروتين الاندماجي ‎AAD‏ يستنفذ الأرجينين بفاعلية؛ حيث لا يؤثر الاندماج مع البروتين الرابط للألبومين على نشاط إنزيم ‎ADI‏ ‎Yo‏ ثابت مكيليس ‎Km Michaelis‏ يمثل تركيز الركيزة الذي يكون ‎odie‏ معدل التفاعل نصف الحد الأقصى؛ ومقلوب قياس ألفة الركيزة للإنزيم. يشير ‎Km‏ الصغير إلى ألفة عالية ‎SO‏ ويعني أن المعدل سيقترب من معدل التفاعل الأقصى بسرعة أكثر. ولتعيين حركية الإنزيم أو قيمة ‎Km‏ يتم قياس نشاط البروتين الاندماجي ‎AAD ADI‏ _من النمط البري في تركيز مختلف لأرجينين ‎Tort) HS‏ ميكرومبلار» ‎٠٠٠١‏ ميكرومولار» ‎O00‏ ميكرومولار» ‎١١١ ses ae You‏ ‎YO‏ ميكرومولار؛ 17,5 ميكرومولار) عند أس هيدروجيني ‎pH‏ 7,4. قيم ‎Km‏ المقاسة للبروتين ا

_ \ A —_ الاندماجي ‎dual AAD‏ في شكل ‎SEQ) AY‏ رقم: ‎Lay cf‏ البروتين ‎ADI‏ من ميكوبلازما ارجينيني) والبروتين الاندماجي ‎AAD‏ _المبين في شكل أو ‎SEQ)‏ رقم: ‎o£)‏ ينشأ البروتين ‎ADI‏ من باسيلوس سيريس تساوي ‎١50604679‏ مل مولار و517١‏ مل مولار على التوالي. تقترح النتائج أن الاندماج ب ‎ABD‏ لا يؤثر على ألفة ارتباط البروتينات الاندماجية ‎AAD‏ المختلفة بالآرجينين. o ‏مثال‎ o مقايسة تكاثر الخلية والفاعلية المعملية للبروتين الاندماجي ‎AAD‏ على خطوط خلية السرطان يتم استخدام وسط مزرعة ‎DMEM‏ لإنماء خطوط الخلية ‎A‏ 375 و ‎YA= SK-mel‏ لسرطان الجلد البشري؛ ‎Pancl‏ لسرطان البنكرياس البشري و ‎C-33A‏ لسرطان عنق الرحم البشري. يتم استخدام الوسط لمزرعة ‎EMEM‏ خط خلية سرطان الكبد اس 1 ‎SK-hep‏ وسرطان عنق الرحم ‎٠‏ 0-338. يتم بذر ‎WIA‏ السرطان ‎)3٠٠١75-7(‏ في ‎٠٠١‏ ميكرولتر وسط مزرعة إلى فتحات أطباق 97 فتحة وتحضن لمدة ؛ ؟ ساعة. يتم استبدال وسط المزرعة بوسط يحتوي على تركيزات مختلفة من البروتين الاندماجي ‎AAD‏ يتم تحضين الأطباق لمدة ؟ أيام إضافية عند ‎TV‏ درجة

MTT ‏ثأني أكسيد كربون. يتم اجراء مقايسة ام تي تي‎ % o/s ‏في غلاف جوي من 90695 هوا‎ YEP لتقدير عدد الخلايا القابلة للحياة في المزرعة وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. يتم تحديد كمية ‎Vo‏ الإنزيم المطلوبة لتحقيق ‎٠‏ 965 تثبيط لنمو الخلية ب ‎AC50‏ ‎WS‏ هو مبين في جدول ‎١‏ وشكل ‎od‏ تشير النتائج إلى أن البروتين الاندماجي ‎AAD‏ يستنفذ ‏الآرجينين بفاعلية ويثبط نمو أنواع مختلفة من خطوط خلية السرطان البشري في دراسات مزرعة ‏النسيج المعملية. على سبيل ‎JE‏ سرطان الجلد البشري سرطان القولون البشري سرطان ‏البنكرياس البشري؛ سرطان الكبد البشري وسرطان ‎Bie‏ الرحم البشري؛ لكل منها قيم منخفضة من ‎ Y.‏ 650 (انظر جدول ‎of)‏ حيث يتم تثبيط كل أنواع السرطان هذه بالبروتين الاندماجي ‎AAD‏ ‏بسهولة. وكما هو متوقع؛ سيثبط البروتين الاندماجي ‎AAD‏ جميع أنواع السرطان القائمة على ‏الآرجينين (على سبيل المثال؛ السرطانات سلبية - ‎(AAS‏ ‏وكما هو مبين في الجدول ؟ وشكل ١٠ب‏ ‏وا

‎q —‏ \ _ ‎Lanes | No. of mole No. of mole | Albumin:‏ ‎of albumin of ADD‏ ‎AAD‏ ‎(pmole) (pmole)‏ ‎BE‏ ‎HE HE‏ مثال > تعيين العمر النصفي المعملي للبروتين الاندماجي ‎AAD‏ ‏يتم استخدام ‎Y=0) Balb/c (i‏ أسابيع) في هذه الدراسة ويتم السماح لها بالتأقلم لمدة أسبوع قبل التجربة . يتم فصل الفئران رلا ‎y=‏ ( إلى أربع مجموعات وتحقن ‎dad gs‏ صفر 6 )0 ‎Ov‏ أو 2 .ا ميكروجم من البروتين الاتدماجي ‎SEQ) AAD‏ رقم: ‎cen‏ شكل ‎AY‏ ( في ‎Yeo‏ ‏ميكرولتر ‎bp‏ اس ‎PBS‏ داخل الغشاء البريتوني؛ على التوالي. يتم جمع الدم من كل فأر عند الساعة صفر واليوم ‎.7-١‏ يتم الحصول على الأمصال بعد الطرد المركزي. ثم يتم نزع البروتين من الأمصال وتحليلها بواسطة محلل حمض أميني للآرجينين. وكما هو مبين في شكل ‎1١‏ يستنفذ البروتين الاتدماجي ‎SEQ) AAD‏ رقم : ‎YOKE cg‏ ه ‎٠‏ حتى أقل جرعة من ‎٠٠١‏ ميكروجم؛ آرجينين البلازما بفاعلية في اليوم ٠؛‏ © و©؛ مما يشير إلى با

=« اذ أن ‎ae AAD‏ استنفاذ الآرجينين في الجسم الحي بفاعلية لمدة © أيام على الأقل. يعود مستوى الآرجينين إلى الطبيعي تدريجياً في اليوم 6 واليوم ‎١‏ في كل مجموعات العلاج. مثال ‎V‏ ‏فاعلية البروتين الاندماجي ‎AAD‏ في الجسم الحي على الطعوم الأجنبية لخلية السرطان 0 يتم استخدام ‎oh‏ بالب/سي ‎V=0)‏ أسابيع) في هذه الدراسة ويتم السماح لها بالتأقلم لمدة أسبوع قبل التجربة. يتم تطعيم الفثران تحت الجلد بواسطة ‎TY OXY‏ خلية سرطان في ‎٠٠١‏ ميكرولتر وسط مزرعة جديد. بعد عشرة ‎olf‏ يتم فصل الفئران عشوائياً إلى مجموعة ضابطة ومجموعة علاج. تتلقي المجموعة الضابطة ‎٠٠١‏ ميكرولتر ‎BP‏ اس وتتلقي مجموعة العلاج ‎٠٠١‏ ميكرولتر بروتين ‎AAD ales)‏ داخل الغشاء البريتوني اسبوعياً. يتم قياس حجم الورم بواسطة الفرجار ويتم حساب حجم الورم باستخدام الصيغة: ‎x shall)‏ العرض7/)7. يتم الحصول على سحب الدم في اليوم © بعد كل علاج لقياس آرجينين البلازما. ا

Claims (1)

1. “yy ‏عناصر الحماية‎ ‏رابط‎ arginine deiminase fusion protein ‏بروتين اندماجي دي إميناز آرجينين‎ -١ ‏أول يشتمل على مكون أو اثنين مختارين من‎ ea ‏يشتمل على‎ albumin-binding ‏للألبومين‎ ‎albumin— ‏أو ببتيد رابط للألبومين‎ « albumin-binding peptide ‏نطاق رابط للألبومين‎ « albumin-binding protein ‏للألبومين‎ Lay, ‏أو بروتين (بروتينات)‎ binding peptide ‏لتكوين البروتين‎ arginine deiminase ‏منصهر بجزء ثاني يشتمل على دي إميناز آرجينين‎ © albumin-binding arginine deiminase ‏الاندماجي دي إميناز آرجينين الرابط للألبومين‎ ‏؛ وجزئ رابط واحد أو أكثر؛ يتم وضع الجزء الأول بعيداً عن الموضع الفعال‎ fusion protein ‏للجزء الثاني بواسطة جزئ الرابط المذكور بحيث يحتفظ البروتين الاندماجي دي إميناز آرجينين‎ ‏الرابط للألبومين بنشاط دي إميناز الآرجينين ويرتبط بمصل ألبومين بأي وظيفة لجزء واحد من‎ ‏من البروتين الاندماجي؛ بحيث يتم تجنب عملية بلمرة‎ AY ‏البروتين الاندماجي يتداخل مع الجزء‎ Ve ‏وبحيث يشتمل البروتين الاندماجي دي‎ OSA ‏غليكول البولي إيثيلين لذ دي إميناز آرجينين‎ albumin-binding arginine deiminase fusion ‏إميناز الآرجينين الرابط للألبومين‎ 6 JY YA ‏أو‎ ١7 ‏على تتابع حمض أميني مختار من 0ا 556 رقم: 77 أو‎ 00 EY) ‏رابط‎ arginine deiminase fusion protein ‏بروتين اندماجي دي إميناز أرجينين‎ YN ‏حيث يكون المكونين متماثلين.‎ ٠١ ‏وفقاً لعنصر‎ albumin-binding ‏للألبومين‎ ‏رابط‎ arginine deiminase fusion protein ‏بروتين اندماجي دي إميناز أرجينين‎ ." ‏يكون المكونين مختلفين.‎ Gua) ‏وفقاً لعنصر‎ albumin-binding ‏للألبومين‎ ‏رابط‎ arginine deiminase fusion protein ‏؛. بروتين اندماجي دي إميناز آرجينين‎ ‏حيث يكون النطاق الرابط للألبومين‎ ٠ ‏وفقاً لعنصر الحماية‎ albumin-binding ‏الألبومين‎ Yu £9 ‏أو‎ EA Jey ‏من المتواليات رقم 7؛ أو‎ albumin-binding domain ‏رابط‎ arginine deiminase fusion protein ‏بروتين الاندماجي دي إميناز أرجينين‎ .5 albumin— ‏حيث يكون ببتيد الرابط للألبومين‎ ١ ‏وفقاً لعنصر‎ albumin-binding ‏للألبومين‎ ‎£9 ‏أو‎ EA gy ‏من المتواليات رقم 7؛ أو‎ binding peptide ‏ب‎

   دج

   7. بروتين اندماجي دي إميناز أرجينين ‎arginine deiminase fusion protein‏ رابط للألبومين ‎albumin—binding‏ وفقاً لعنصر ‎٠١‏ حيث يكون بروتين الرابط للألبومين ‎albumin—‏ ‎binding protein‏ من المتواليات رقم 7؛ أو ‎EA Jy‏ أو £9 ‎WV‏ بروتين اندماجي دي إميناز أرجينين ‎arginine deiminase fusion protein‏ رابط 0 للألبومين ‎albumin-binding‏ وفقاً لعنصر ‎Gua)‏ يتضمن جزئ الرابط متوالية مختارة من ‎SEQ ID‏ رقم ‎oY Joy Jo.‏ أو ‎oF‏ أو متوالية حمض أميني ‎amino acid sequence‏ سيرين - جلايسين - سيرين ‎.serine—glycine-serine (SGS)‏ ‎WA‏ بروتين اندماجي دي إميناز آرجينين رابط للألبومين ‎albumin-binding arginine‏ ‎deiminase fusion protein‏ وفقاً لعنصر ‎Gua)‏ يشتمل كذلك على واحد على الأقل من ‎٠‏ البوليمرات بولي-إن ‎(Poly=N)‏ أو البولي هيستيدين ‎.(His tag)‏

   4. بروتين اندماجي دي إميناز آرجينين رابط للألبومين ‎albumin-binding arginine‏ ‎deiminase fusion protein‏ وفقاً لعنصر ‎٠١‏ حيث يشتمل الاندماج على جزء متبقي من ربيطة بروتين إنتثين -متوسط ‎intein—-mediated protein ligation‏ بين الجزء الأول والجزء الثاني.

   ‎.٠١ No‏ بروتين اندماجي دي إميناز أرجينين ‎arginine deiminase fusion protein‏ رابط للألبومين ‎albumin-binding‏ وفقاً لعنصر 9؛ حيث يشتمل بروتين إنتثين -متوسط ‎iNtein—‏ ‎mediated protein‏ على نطاق رابط للكيتين ‎.chitin‏

   ‎.١١‏ بروتين اندماجي دي إميناز أرجينين ‎arginine deiminase fusion protein‏ رابط للألبومين 8000010-5100109 وفقاً لعنصر ‎١‏ حيث يتم اختيار دي إميناز الآرجينين من دي ‎liad ٠‏ أرجينين ‎arginine deiminas‏ منتج من كائن حي دقيق ‎Microorganism‏ ميكوبلازما ‎Mycoplasma‏ أو لاكتيكوكوس ‎Lactococcus‏ أو بسودامونز ‎Pseudomonas‏ أو ستبتوكوكس | ‎Steptococcus‏ أو اسكورتشيا ‎Escherichia‏ أو _مايكودكتيريوم ‎Mycobacterium‏ أو باسيلوس ‎Bacillus‏ ‎NY‏ بروتين اندماجي دي إميناز آرجينين ‎arginine deiminase fusion protein‏ رابط ‎Yo‏ للألبومين ‎albumin-binding‏ وفقاً لعنصر ١٠؛‏ حيث يتم إنتاج دي إميناز الأرجينين من ميكوبلازما أرجينيني ‎Mycoplasma arginini‏ أو لاكتيكوكوس لاكتيس ‎Lactococcus lactis‏ ب py ‏أو‎ Bacillus cereus ‏أو باسيلوس سيريس‎ Bacillus licheniformis ‏أو باسيلوس ليتشنيفورمس‎ Mycoplasma ‏أو ميكوبلازما هومني‎ Mycoplasma arthritidis ‏ميكوبلازما أرثريتيدس‎ ‏أو ستبتوكوكس بنومونيا‎ 50601000005 pyogenes ‏أو ستبتوكوكس بيوجينز‎ hominis Streptococcus pneumoniae (sbi sa gis ‏أو ستبتوكوكس‎ Streptococcus pneumonia ‏أو بسودامونز بلكوجلوسيسيدا‎ Mycobacterium tuberculosis ‏أو مايكودكتيريوم توبركولوسيس‎ © ‏أو‎ Pseudomonas putida ‏أو بسودامونز بيوتيدا‎ Pseudomonas plecoglossicida ‏أو توليفة منها.‎ Pseudomonas aeruginosa ‏بسودامونز أروجينوسا‎ ‏رابط‎ arginine deiminase fusion protein ‏بروتين اندماجي دي إميناز أرجينين‎ NY ‏حيث يتم تكوين البروتين الاندماجي بتفاعل دي‎ ١٠١ ‏وفقاً لعنصر‎ albumin-binding ‏للألبومين‎ ‏الذي يحتوي على بيقة راسب سيستائين بالطرف-ان‎ arginine deiminase ‏إميناز الأرجينين‎ ٠ ‏متفاعل عند الطرف-سي للنطاق الرابط‎ thioester ‏ثيوايستر‎ ae N-terminal cysteine arginine deiminase ‏لكي يتم ربط دي إميناز الأرجينين‎ albumin-binding ‏للألبومين‎ ‏والنطاق الرابط للألبومين 81000010-5100109 بواسطة رابطة تساهمية.‎ ‏رابط‎ arginine deiminase fusion protein ‏بروتين اندماجي دي إميناز آرجينين‎ .4 ‏حيث يتم تكوين البروتين الاندماجي بتفاعل‎ ٠ ‏للألبومين 2000010-5100109 ؛ وفقاً لعنصر‎ Vo ‏نطاق الرابط للألبومين 8100010-09 الذي يحتوي على بيقة راسب سيستائين بالطرف-ان‎ ‏متفاعل عند الطرف-سي ل دي إميناز‎ thioester ‏مع ثيوايستر‎ N-terminal cysteine arginine deiminase ‏لكي يتم ربط دي إميناز الأرجينين‎ arginine deiminase ‏الأرجينين‎ ‏والنطاق الرابط للألبومين 81000010-5100109 بواسطة رابطة تساهمية.‎ ‏رابط‎ arginine deiminase fusion protein ‏البروتين اندماجي دي إميناز أرجينين‎ No Ys ‏تكوين البروتين الاندماجي‎ Cun) ‏وفقاً لعنصر الحماية‎ albumin-binding ‏للألبومين‎ ‏وبتفاعل دي إميناز الآرجينين الذي يحتوي على‎ fF ‏أرقام 7؛ و‎ SEQ ID ‏باستخدام المتواليات‎ ‏متفاعل عند‎ thioester ‏مع ثيو إيستر‎ N-terminal cysteine ‏راسب سيستائين بالطرف -ان‎ ‏بحيث يرتبط دي إميناز الأرجينين‎ albumin-binding ‏الطرف-6 للنطاق الرابط للألبومين‎ ‏والنطاق الرابط للألبومين بواسطة رابطة تساهمية.‎ arginine deiminase Yo ‏ب‎

   دوم

   . تركيبة صيدلانية تشتمل على البروتين الاندماجي دي إميناز آرجينين ‎arginine‏ ‎Ly, deiminase fusion protein‏ للألبومين ‎albumin-binding‏ وفقاً لعنصر الحماية 9؛ في حامل مقبول صيدلانياً. SPH" ‏حيث يكون للتركيبة رقم هيدروجيني‎ OT ‏التركيبة الصيدلانية وفقاً لعنصر الحماية‎ NY المدى من 5,5 إلى ‎Ao‏ ‎A‏ التركيبة الصيدلانية وفقاً لعنصر الحماية ‎OT‏ حيث يكون للتركيبة رقم هيدروجيني ‎PH‏ يبلغ كا

   ‏. التركيبة الصيدلانية وفقاً لعنصر الحماية ‎OT‏ حيث يكون للتركيبة رقم هيدروجيني 011 يبلغ 1,0 ‎ony

   دناه ‎Sy‏ ‎WE 8‏ & يخ ا ‎Na‏ © ‎OE LD zy SSN Hay‏ ‎A‏ ا ‎١ Se‏ € « § ال ‎a 8 3 REE RE A NY‏ ‎YY CR EN 3‏ = ا : ‎Bas eS‏ & : 0 ب ‎N hs 0 NY LL SN 8 EN‏ ‎Yo SEEN LB‏ - أل ‎sd‏ “ ا اس ا ‎pb‏ بن ‎per Shey‏ م \ ‎Ses. % NL‏ ‎ot ag ga She‏ ‎ARTES Sr SR RR Nae‏ 83 !8 ا ‎Tae as‏ 3 1 ل ا اللا 3 ‎LE‏ ما ال“ ‎gt Ley 8 RR " &‏ لالس ا ‎a‏ ‎SR J Ky‏ 3 § ال ب ‎oR pl‏ ومح - ‎Fl ee‏ ااا 5 1 — 1 > ا ليا 0 ا 8 ايا ‎eal‏ ‎oy‏

   بلا : الح ‎Raa‏ ‏: ب 0 من ان اذ و« احاح ‎NY Ax nw 8 Nn : Na 8 SN ey‏ ‎A SN 8 8 3‏ ا 1 ‎h . Sh wu‏ ‎Sey ARG SN Ny {‏ ؟ مي أ اا 8 ‎A‏ امي محم الج أ انا ‎Sine aE RRR‏ © الا يم الا ؟ مم ا لاد ا اكد م لي ا اللا 8 العا ‎iL‏ ‏3 ال ا الات اا ا 1 ا للا ‎CO‏ تا مج الا الات اننا لمذداد ‏ اكد الجا ا 0 العا 0 ‎Ny 0‏ ااا ‎IN 0 ١‏ & ‎aa)‏ ‎ah LES © i ny x mS &‏ : سي ‎hig TMT ES‏ } : 8 اا ‎TE‏ ال 1 اللاي بابس ذخأل ا لاب ‎Lf‏ ‏ييا مدي 8 اب د » ب ‎YEN‏ ‏3 = ‎id SEQ ID‏ ‎ot gies ARE‏ ‎LARRENVLANPEL BEY GUID TRIN] INNA ETVEGVEAT IEE AALY‏ ‎XEQID‏ رق ‎EY‏ ‎ARTY‏ ربط ‎ARYL ANE EL DE YGVSDY YE BONAR TVEGVR ALINE A ALF‏ فته تاذ اتا ادج 1 عون راط ا : ٍ : : تخ ‎KIL HIL‏ عت طلقا ‎SEL ID‏ ب 4 ‎ARTI‏ = = ‎GEREHEHEEHARNE AFARVLANREI EN YGVIDFYHRI INE AN TVEGSVEAL HT HT AATF‏ ‎ogy‏ et LY pe REN SE Ye A NY Rana Sg SRE EOE Fa I.

   AREER, he 33 NX ‏الخ‎ Ra SN RE RR ‏ا‎ Xe SE k ‏مي 8 ا‎ : 3 RRR 0 Be Nee RE & RS SN WN ‏الا ا‎ TTR NE AE ‏لي‎ a NR NRE SR et a ‏لس ال‎ + ‏إلى دج الت‎ ‏اتاج‎ EIN nt ‏الاج‎ ES LS PS AEN ay = ‏شي جا‎ Sod E 3 3 EN A ae Su Lod HF anki fee i NER Na Re § FR TT ‏ا ل‎ ES 2 ‏الما الا‎ ‏اي‎ SRY Ty ne AD A sl = ALLL NN NN NE Ea NM av 1 Hed RW ‏ج‎ ١لكشلا‎ ‏رق‎ ‏دين & ايح‎ ARD ARAN VE ANREL DE TGV TYE NL IN ARNT VEGVRALIDEIL ARLE $V SEG ID ‏راي‎ ART AORDEAVDANSLARAXVLANEE DRY GVEDY YEN BNNARKTVEGVES LINER AALE had SEGHID ‏وابطة‎ Gas ABD IAEA VEANRELDEYQVEDFY ERLE AK TVEGVESLKLEILAALR 3 ‏رقي‎ SEG ID ‏برايف‎ ARDY ‏قات فوطق اتات‎ ANEELDK YOY DEY RRL INE AKTVEGVEAIRKE ‏تف تيت‎ TF

   .ان حل وا جحلا ى, ا ا ‎AN } EY Ny‏ و > نج ‎We‏ لا نس لاا ‎a‏ ‎Neng pune 3 S . Wa‏ ‎NR 8 RIN 8 :‏ ا ال ‎em‏ ‎Te‏ ‎gL SRE Sete doy Te 8‏ ‎RD aa §‏ ب اال الا - ولا اا ادا ‎PW‏ ال ا ال 2 ‎Se‏ ‏المع ‎a‏ السو الت الاي أ اي اس الا أل اي لاب اي ‎DN‏ جح ال ‎aX Na‏ ' الا ال ‎be.

   EE‏ ‎Td‏ الي | ب ب ‎y Ye BY‏ ‎a) 1 ad Wii‏ ‎V5 oad SEQ ID‏ ‎ABD‏ ين رط ‎INS AKTVEGVEALIDEILAALP‏ عا لاوا ‎AEARVLANPEL‏ ‎ERY ad ERG in‏ ‎wad ABD‏ : » ‎AEARNVIANEEI DEYVGVADY VENI INNANTVEG VEAL IDET AALE‏ لكل تن دخات تيا ‎SEO ID‏ رقب ‎a aw 1‏ ‎VAFARVI ANEEIDR YW EDF TER LINEANTVEGVEAT KT HIF SAT F‏ ‎SEQ ID‏ قد ‎ABR‏ بر ‎CREE HHEHANLAEAR VL ANTE DK YOVSDEVKBE IH AKTVEGVEAL KL HEL a 4‏ ‎ogy‏

   _ Ad q — 3 ‏لابو الع وتاتلا‎ FE ‏تيع واد الى الاك الجاع‎ DY ‏اط‎ LOR ‏جع ا مه عراوك ايا‎ ١. ‏قبع‎ ‎i ee RG ENV REE IBV ‏ع‎ TMEOLLFDDIPYLETROERHDF ‏يد‎ ‎3 — NRHP EY ‏ا‎ EVE NL TROY LOQLLETDIT YI ‏راتيج‎ 58 3 --- 11772977 ‏تنو .وو ل لم ومع ار بجع يض امج اع‎ OVI ‏يا عع‎ ‏يدب‎ le het ‏حي‎ Lo] THe Is ‏ب لل بلا‎ 3 Fela Tx a Ee ww TE ‏الاي‎ ‎El VARA ICEL AAR TY ‏عجره‎ CE A RDN LI EER EE NS EN LSE ‏تيج‎ EES. IRF £5 FROVLEDNCAETVYIEMIATEVFEXSSY THEEFLERLLBERCYRPSRTYOOL -TEYLT- 133 SET IARNRGYSY LY LER ‏سج بوتت‎ LREEFVIR I LEE SOAT VHVARDTL-SEYTL-. 110 57 FRETERGOSASVLRLERETSERTDUR-L- VIER BRIL DR SEAN INERT -REFEL- ‏تخي‎ ‎(PEER SEE I SN EAE a HE ERT TNE ae I ‏ال‎ 13% 12} KETSSRLVE MES ITRINL ‏سات سي‎ IEE ERIL IVI THPRL AF TONPFRIVENRSE © 163 ‏الب اللي قدت‎ LUIGI ‏سامت‎ SORERVE FINS ‏اوعدن مود كرات‎ > 111 5150 ‏مض قمع وداج اجام بعس 1-177 ا‎ 169 2723 ‏ص مح كت اتا‎ TREE ‏لجع تك ا‎ HL BE ‏اس وه ست ا ب تعر ل لجع ورج عو‎ LY . ‏ماتيا مسرخيواجع اا ا دوو #دج#» :ا :تون‎ woe ow ITH 11375137 1-7-2177 317733772157777 ‏يخ‎ ‎372 ‏تا ار الوا لشي‎ WVHMANHPRFRD -- THINRORRUTTRIECODELI MIT TVAL 35 275 LIRR RE RRR ESE EY IIR RF EV PIN LOR 50 TIMEET IAT ‏ديج‎ ‎TRE LERNER ‏مد كود الست ام ع‎ RY ERAN BUR ‏لوا‎ OE ERR ‏ضعي‎ TORE RE HEA *# Eg ‏مويل و«#ج*‎ WW Eg _ »_ ‏ناد‎ WRERSR ‏وو‎ Wg Fx RAE SVSRRTO TEI AER IV AEE CAFE TAT INVERN TH IRL TE LE ‏لسكا‎ aan ‏فق‎ SUSERP SIRT ‏التو‎ YARN L STFS IVIAVE IHREN DY ERM NEDO RES. 2s 235 SVIRRT SARA TERI ARNT SRO-SEINNV LATE PRCA FNL ITY FIV IN BRET INF, 258 ‏موس اا الك قتع‎ RRS FORC- SH ‏تحشر معت‎ INKS AY MRL ‏امعو خض‎ 20 ‏ان ب بلي لكي‎ LIE SEK SPR x xu Ray ‏لاسا اج بلطلا ا لاب اجاج راج‎ 2 285 ‏الات‎ PRIN RL RGA FO ‏مج 13117775 اا سس‎ 3OWETERT. 385% ‏لوجع رلا لبا امس داق‎ SYR IER LT OLENA LER 7 ‏بار‎ LER LDL FEU SRG ‏دود ع جح رطق‎ 28% 77 ‏تسمتتمدد-5777-5033:3‎ 7 IHL ‏ا‎ TLGLIDTRL - IFCSSONEIR SABE ‏وجو‎

   ‎2p. ¥ « » LE] x PIE 0# ‏الال‎ >» SEE ‏ا ىوض كع ع عض و جح 5 ل‎ FAY ‏ب ار عر اعد لج اسح لمت لزت تالس‎ ELLE REG ‏ورت‎ I LSS ‏جحو © لجوجو ضوجعج وجح رج جاع‎ 3485 5 507 ‏جو الإومحمصويم‎ ‏كوي .الا _ يعي ع وعد 357255 555 ققة‎ ‏يل لب ذل لحب لم لبعد الي ليل‎ z & LEY. I SE SE. J ‏ب‎ LEE LE EN ‏بن‎ ‎Ips ‏تج‎ 48 ‏سيد مع عر‎ 408 ‏ته‎ S30 ‏عمج بد‎ #%d I] ‏الشكل؟‎ ‎ogy

   _ «=

   AD-linkee- ABD 1

   MEE REAR PKG HVE SERIE LES VIVHEFORET EY TTEER OE LIVERY LESHDARKER KO 757717077701650 1775777 SER REVVER LER RE AR LV E I MMA TREY LS EAH EL IV EN PR 71771 MET YR EF ‏لج‎ PHL I PY YL LS INGE IN EF UY HNO LOGUE ERTL TVI LAH TV ANKE CE FER TUR INV PRIN IME DTW EL THY DE IRE LE SP TAN DY SRE RI RLY HOGAE BG PERG LY LEG LL I NREL IO LACE AS OME T ERE THY BOTH LR TR EGY ‏لعلو‎ RA LC TE ‏جز عدن ارتو‎ LS RR IK NGS HH HAN BLE NE LOR ‏ا‎ EL ART ROVER ROT TATE

   الك ل ا ‎i‏ ‏ل

   7 سناد ‎UI RAR LIN LE BA TRE Rn aR ERG‏ ا ا ل ‎MEY ESE PRG LER I CELE‏ ‎OLAS SRARDEL BRFLEDRESVLSSRERVYVENE LER‏ ا جاتنا ‎INVVE LT‏ الك لتلا ‎HE ERE VE IMA TY LG TA LIV DEN EL Y FY DP ER SVR T I RY MEY BE‏ ‎TINO‏ الجا جا با ا وو لاوا 1 ‎RET LE SHEE SNEED IN TONY CUES LES‏ ‎LRN VANE ECE ERE DVR IN PRET LMI DTH LIM L DY OR PLY PLANT PE PWRY DLW‏ ‎HGGARPOEVERGUPLEGLIQE TINK VLIP TRURSAE CUE IEEE TPG TRY LARRY‏ ‎LOMO ARC MMP LS BEE RWAQHDEAVDAN‏ متو نت ‎VI GY SENET NARLE ARG TEV PFE‏ 8 متم ‎SY RHEL TENA EGVRERL TE‏ ااا لضم تتا ‎SLAY‏

   أ

   الشكا أت

   - * B ogy

   _ \ —_ ‏ا‎ FOE ADE Haken ABD ME ‏ل ل‎ SY NE PEE OY YT SARL FL LP SAT LR SHDABEVHED FY A EL EAR ENV LL LV A TY ‏وام ااي‎ LI EEF LEDS EW LS ER BY VV VEN LER EETVSRELVE IMMA TTR Y BES TEALHET IV DEMME TROPEASVONGO VT I EAMEIRYR ‏لت‎ SRP Y SN RRL IST PRY LI HLEL SIEGEDVEIN ENDL WWE EERTDLOTWTL ‏ا نما للا‎ EEE VY TRV ERRTH IME LE THETHE DK R PLC PLANT VE VRIDY OLY HEAR POPVENELELEGRIQE VINEE EVL I PLAGRGA SOME TERETREY DOTRY TA TR FRY VIGYSRMERTNAALERAGTEVLPERGHQLELGMGRARCHENE ‏بست _ انس‎ ‏ال تاثا لاتتقا لفق‎ LEY OV SOY ‏ل‎ RRL ‏لتر لاي‎ CGNRALI DET LAE 1 pe 0 { <٠ ! © EE TRS ‏بد‎ 4 ‏ب‎

   AD Hake ‏لاق اطخ‎ ‏ل‎ SV ‏ا‎ ORE ‏ا‎ 8 RE LAR EL DL A AEE A ‏ل‎ 0 PY EIEIO ENR LES HRSG VE IN I EY DLC BACHE L IVI FM PI TTR DP EAS VENOY TIT RYME Y RVR ORE TT LE EE ENE LI BY DES LR LE EGG VY I NRO LV SER YIN TV EL TRE OV AREER EER SYA I PRR OH LEH LE THE NMI OR OEE LY S PT ANDOVER EWR IN GAR BOVE LPL GLOSS INR OVE BL AGE CARCME I ERE THF DOR LAIR BOY GY RENE NAS EER TEV LEARN LS LONG NAR HSMP LAR KDVENADHDEAVDAN

   ادال ‎Te‏ جد وذ أو + ‎A Ta Ba‏ اند عجوي ‎dT‏ دجا ‎By ET BGC AE BOR TR NTE‏ ونوا تجن 9 ‎Tamas‏ د تجاع دوا واي ‎A‏ مدر يواد أ ا 7 ‎TRE LAA 1‏ تق تتا الال تتا ا ا اا نا ل احج ماك

   7س الشكل ‎av‏ ‎ogy‏

   ا ان الو الا الوا نع لل ‎LUNAR TYRES EARLY BRULARL‏ رع ‎BY‏ ازا ا ال ل الل تا أ إن اي 9 ‎re tim Ter amo or :‏ بوبجد د د بدت ل سرود ‎a‏ وس بريه ب سد حل ‎PORE TB Y U TPR LDELUFRR‏ ا ل ل ‎KS‏ لاا ا ا ‎VAR LOH BIEVVRLI DE VAETY INA EORANDEL I REN LEDSRREVLS‏ ا ‎BEHEVY VENT LEAR T ONE LYE IHG ERY LO TR ATH EL I VRP ERLY PRP VASNG‏ ل ‎IH IME EVR RET LES RYVISREPRGIRT‏ ااا ‎LY amy‏ ا ‎EVEERTDLG IVIL ARI VAR ECE PKEIVE‏ ‎ANIWEFRFHUTRIAHOGARN POPVENGLPLEGLLQS LL INEKUVLT FEAGEGASME TREETR‏ ‎FET LA LR EV IE RR NER TH AA LAGER EVIL FIN LO RON AR CMON La EED‏ ‎RW‏ ‎AY JE‏ ‎ty YO PTR‏ ‎SEY‏

   — ¢ ‏اج‎ ‏اا اح ا‎ 8 Sali ABD ‏بسن‎ ‎MI OE A DANS AE ARV LANE LORY GVA DY YEN LI HSA ETVECVRAL TORT LARLY 0 ‏راجا لمر احا اد سوا الجا سوا حب يس ديا أ عدا يلعاي انب حيو الج يو سح جايس حا جو اجا عن حيو جر اج وجرا جاب ما اح حي ص ا ا ل ا‎ x AOS ‏ا‎ HP THVT RR TOR TV LURE ROVEVE LT PIN LULL TDI PY LET IK RH ‏تتا اللو‎ GEV EN LE LAA EAL VE TRE REVI TL EEA IV VR HOTLY EYL ASY SHEEN TON IME GHEY ET SESE THY WE TR OH PPL RHE ‏تع كع‎ GLE INEM THE BARRE LEME VEY TINE PR FEHR LIN IY RY PT REEL ULRERT IE Va TE AR A ER LARK LU ER IK LEV L&T ‏حا‎ DRE T THEA TOO PEGE LY TLE RGR EET La I THER TS THE TEA LREV LG LS ERY LT RPOGHERVT ‏لت ااال ف‎ ERT LAT ARG TY IHR YV SH TLL BEER TEVIEVL A SE LARORES PRIMEES MEPRIVERNY 1 “1 و١لكشلا‎ ogy

   ABD ‏وتوا‎ Hix MACH IRAY DANS LARAKY LARRE LORY GUS IY Y HL LSNAR TY EGVEALL DET LRALEER ‏ا‎ I TEDALVAL PEGE RVR IAD TVPGAR PH SDNA TD LEVLORNGNEVIADRLFHSER HE IH VEG LEIS TAH RL LO EVD VAG ET LIMNEL I DE IR BCD YAVIGR EAE SVICE SFARGHPEFAPTTYTVEVRGLVRFLEARHRDPOAQATADR ‏مار لاا لا‎ 127 LEV ADA ‏اا أت الت‎ ME LD PPO ‏وو ب ال لا يت‎ TE ‏مووي‎ ‏ل ل ل‎ TINT RR

   اله 12 rly We ‏نح‎ \

   ogy

   مايص

   MRT ‏ا اتا‎ CUR ARG NT AT TACO LV TY ‏اوتا تل ا‎ NONSRISLAEAGA ‏باكرا أ‎ STAT TGRRVE I ROL LORKIFE TWAT NEL THY EEA ARVET FOTORRLVY LER TRL CRT IRA TANHE PL DI DOL DELS LES H IAL PRRLES SSLOLED EIERLSQSDI WDE IVE LIE I OVEEVE DLT VEG PHNEVAND 1 FVANGS FDRRE RGR T SEIGELESVIVUE PORE DY LT FAR LE LO FEAT LESH DARKE HKD FVATLEAND TRVVE TOL AR TY DAS RAR DR LI SERB HS E PV LS EERO ENP LEAK RT SES LVS DMs ‏ل نا‎ DUG HADEN EVI PM ENLY PURO EER ‏ا‎ TT HY MR RE RORET LP SRV ER RY BR BY PS LL AS IE TVR I LV SVR ES DLO TE LL ARN TYAN ERE ER RVR RR ME ‏ل‎ ML ‏ال‎ LY SR AN OV ER SY DL RG GAR BO PENG LE EGIL TIRE IL PT AGE GASOME TE SN THF DOIN LAT RPO TO STUER TAAL 7117770151511 CHEM LE RK IV KS af ‏الشكل‎ ‎- ‎oY

   —¢AN— ‏لا‎ ‏شت‎ NF : wa 1 ‏ا‎ ‏ا ات ال ا ا ا ا‎ eee... ‏و‎ ‎i Mia ¢ SE : > A : ‏لتم‎ ‏الخ ل‎ a ‏ل اا شا اللي‎ OY ‏ا‎ i TRE ‏جد‎ > SOM a sy pe FALL ‏إٍ الي‎ ‏لشكل - ا‎ ‏دف‎ pg) RANA > ‏ة‎ RRR ‏الب‎ 7 ‏الات‎ fe Dm IR ee ‏ا ل‎ 1 ‏ل‎ REE Ra ar TR ‏وجح ال‎ ‏رح‎ - ‏الشكل د‎ ogy

   : ~ م ب | > - ‎mh 0-1‏ 38 ه

   _— \ جم ‎SO EY JY‏ ا ‎Nad ERY‏ ‎SEEN‏ ‎F 5 RT‏ ‎i hw BS‏ ‎TREES See TT‏ اح ‎TA FUE SEN See‏ ‎i FEE Trade‏ ‎LE EEE TOWER‏ ‎ST IRE‏ ‎a,‏ ب ‎iF REE :‏ ا "8" ا وب ‎SEN : = EN‏ ب ‎i a‏ - ‎WR‏ ‎REY‏ 2 ‎ht SE‏ ‎Ha‏ ‎oe TEREX‏ ا 7 ‎i EEE‏ ‎a Ri‏ ‎i HE‏ ‎I SEER‏ و - ‎i 2‏ : ‎pET-38 =‏ : ال اا ‎i Se EER‏ م تمد تلص ‎SE‏ ‏ب 5 ‎oe bie‏ © ‎Sng bp ;‏ : ‎Cn 2 ْ = \ §‏ ‎Ra 0 3 Ei‏ ‎SEY‏

   — \ جم ‎ALIFE‏ ‎ARDS‏ ‎SEORS BY‏ ‎AB AI ADR‏ ا ‎oN : ;‏ ; 1 يمد ‎EE‏ ‎in Aes‏ = ‎JF EEL‏ ‎ogy‏

   مخ لين لاا ‎PTR‏ ‏الما ساد الحو د اداج الما ل ‎AE rae‏ ‎he‏ ام جح رح ‎TR‏ ا 1 ‎SEE T TOOT TASS TS‏ ااي لجراي اه 5 ‎OST REE TEER TTD ad‏ : و7 وعدا وو و بود للك وو لو وات لماج ورك رجلا حي اود اي وري لح ‎EF : ET‏ م نح عدت مرت و اتاج ‎La 3 Eg om TERRE Fp‏ ال ‎CTR BS‏ = ‎TA TE TT EAR Ro satan‏ : : ا ري رو اح ص ع صو اجر را ‎TTT ALT‏ رج ‎ORS TRESS TASETEREC TAT TRONS‏ وح ع سا بتر ‎Tren 5s a LEA RT STEERS TASET 3 AT TET‏ ‎GARCTTGACARATATREAS SA iy‏ 250 ‎AT TT TESTE ATTE fm‏ الج كي ااا 3 ا نا ‎CAREER TT ENTS T‏ وجح ‎ee‏ ال ‎CARHARTT IE ST TEATS ATOR TYT BIER‏ الوا مامت ال اال الكش جات حي ا ا 5 وب ال كين الي تار لاوا داربو اح خا : الج حي ا ‎NC conn‏ 8 ارج ا الال اجا الي ايم حا هم يح 6 تاه لما تح ‎METAR LTT TES‏ الج ا الا 0 1 ٍ ‎LETT REAR‏ ترجا ‎TET‏ 5 ‎ETT HIRE LINC ER oid mila‏ لت حر جح اجام ترجا د لجا ‎RST‏ العا اا ا حا ‎RET‏ لصح حت ار ‎Jct SS‏ اغا مجموجح وت : لذ لالط طح جا حي رص سا اتسرح اه احم ااا اجا اجا اج ‎nd . CELT‏ ‎Ta‏ ج ‎ee‏ تخرص اج ‎RN,‏ ع جات ااا داج اشيم .ال ال 3 ادم اديع يوري كاد ل وا ‎SACARACEATRATAACEAT AESATCAGTTOTAGTTCALSZAONS‏ ‎TORGT Ra ASE SASTT ROSETTES‏ ل الا ‎TRS‏ ا ‎SRE‏ برط ‎AT 1 1 ARS RATTAN 5 -‏ ذا ‎g‏ الكو كد ارا الال م جا اجا ا 8 ا ‎PERERA‏ وجح بدو ‎TO ARC TAT‏ تمع ورك م رادم ‎ATT ARES‏ . ‎X : ATR TTT ART AT Rip ay‏ ا احا ‎TET ROTTER‏ مجعو وجوج ‎TGA STITT TORS : FT TT TEAR‏ لح ‎ELT STIS‏ موجمج ججح لجو ا 1 ‎TRA RTT J‏ اه ليع ا ; ‎TUX‏ ‎TNR, TS TST‏ اك اتح يح ادا لدعت لد ال ع اه مت رج ا ا ا 2 ش واه ا ةا 3 اد ا رجض بجيو لكي دلجي كر امور لالب اوتا ‎ATO BOER TT‏ لي ‎a‏ رجا لمم ادق ضاخ ‎TFT‏ داح ماح ا ا جا ا ‎A SRN I CATE RATT EA TOES REET‏ ود ممع لضو أي لويم اماد ‎Er AR‏ : ; د ع طاح مح جبقوت ب لات ات ال دج اخ اجات الجا ال مط ا .ا ‎Abbi 2 2‏ لاق المحم اج باحق حامق عا ا ب ل كر د جك ا لبي دجا توي بيد اك موجهو موي اويا 0 ني طباظ حم سلا ‎mt‏ اال ا ال هنا ينا ‎NE‏ الا ا 0 ‎TATE pie‏ = ‎hie a‏ اج و ‎CARL SA Et‏ ا لب ‎TS BR‏ ممرج”*ج جم و2 رز جد ع ل حا ‎CEUARS OT‏ ا ‎BL EL PR‏ ا و ل ‎SALT‏ ‏سوج ودع مدخو عجوو وجي ‎TST AGAR RT SE:‏ ا ‎FRA: SARC‏ ‎SER TITRE TAG‏ ذم ‎CLR RIT SRE Le JER AL RTS BUT‏ = ‎TTTECARGATTEAGRAT AT TACT AAR 0337 i —‏ ‎CEE RE INGEN TTASTES + - TR TR BT RON‏ ‎a on ٍ py‏ ا ‎TER pag NORE ZANT‏ الك لجا ‎i‏ ‎Am‏ ل ‎NE SR2- SA AE‏ ال ير الا دي مي زاك ااا جح 2 0 تبي مرت ال ايديا ادوع لبي ذلك وو ا ‎SATS TONES‏ كام ‎SUTRA‏ ‏م و ‎TT AERC NN‏ ا ‎EES EER ETT ARTO T TRAC TA EA‏ ققد جحي لدبي ام أ فو للد ال الخ ع م اوج العا لد مرج ار اج ا شرج ‎EE‏ 8 لاج ا اتا اتوي اه المي ارط لاا 8 ون إل رج ا اجيم جا ا اش دج ا ا ‎Ta)‏ ماص أي م اج اما ‎A‏ له اي امار م اج ل اجاج ‎TE‏ جاجد ‎EWR‏ اال خا دج ‎TTR BTR EER RIE a‏ الو اا امارج تر اجا اجاج د قاط جاح ‎RTARTA‏ ‎ORCC TEAR TER TTR aan‏ ا ‎AITTOUATTAGSTRETRAET AE‏ ‎TTRAT‏ 0 ني الج وي د الي د و 8 انكر اشن ‎Nh Fe SS s ST RTT TA A RT‏ اذا ممع دا ةمج ميغ درج لمحن اد ا لا م ‎RT ET‏ ابوه البو ويا تلجت توا الو ادي الخ ‎ARRT TTR‏ يا ار جح ا ا 1 :0 7 ‎Roe JI.

   RRR NR‏ وا ل عد ع ‎a‏ جرال اتج ‎EY Sho JE RRR‏ ا د ‎ERE AA AR Rh a)‏ تجاحجويى مجح 7_7 جممققح ات ا ارج د اجاج ل اج اداض ا ‎pa 8 SE I I‏ 0 وصور و ور 6 الجاع إن + ادي لا ادر انحن انا نه اانا لايل با شد ات لا الاب د ‎SE RRO SRO SS E i ERAT TROT LNT mn‏ رع ‎tf .‏ اج اب اجا 2 . ‎SRL‏ 2213 2 : ‎TRIAS CAGTT SR el‏ ا ا جا ‎ARAL EEE CAST‏ ا ‎TEITTOTRAALASASTTEEOTTS EC TTC ALAR TROLURENS‏ د ‎i GA‏ 0 مط مرك ا ا ادال ‎ge‏ راي دا التي حا ب" ا ‎TET TT OTR]‏ جتحا ‎ET‏ ‎REE ROT TET‏ جار لشت اياج ءال جا لاخر جا سب 2 3 مو ادو مجان ماحد ‎ER TER,‏ ع ال اتا كن ‎ARST‏ دا ال يد وم ال ا ال 5 ‎AINA ky‏ 0 ادكو د جب ا لومي : ‎TARA TTOARRDS Lad‏ ‎TET Ta TATLOTE ET‏ ا ار ‎EE RL os Fa FIERY 03 RA ETT‏ . ‎ARTA ERERATIT EAST TEI TRESS ORS TTT SATE TTORRR RT‏ مط ير ذال نظا ل اا م ‎RS‏ ا الح التي حر 1 نا ترجا ا ‎TANNER TE LS ARES‏ راجا ‎or‏ ‎aac‏ دوج اود حت و : : ا الح الحم المح 1 الج د ال ‎ps niin‏ > م ارجا ‎TESTER RETIRE‏ راجا الا تا نا مضا ال متك ‎it‏ ل ‎EET TT TTRSE TT‏ سا ‎ET TA TEAS TT TESTER‏ وان ‎Aad EAE‏ اب ناب ندا الوديية وي م ل ل ا ل ض ‎bliin : py CESTORTISA REE. dr 3 1 ATTN ATT‏ يح تطخ عد رح ا ا ‎bh bE) SA SAS T IAA TOATTAAURASS‏ بج ‎men Sees us SR‏ ا يت لعج ‎ASAT TAT‏ ; اد جا ‎SR A NC TOT‏ ال ‎RE Ret WE II‏ اند رجحو الي لج ‎NER CORES‏ 0 2 8 .+ بجنا مرت مج حمق حا اج ا ‎SIATTROUTOTES PERE‏ ‎ER 8‏ بن عا ‎TREES STORES‏ 9 = نا لضا لاضع ‎REALL TUT * ~~‏ ا لح ‎TOSCO EAS TEEEE TORS SEE TE‏ اا اا 55 مجو عمجم 1 ا تن جا كيج أ اخ دي م ا ل ا وح وجوج جع عوجي حراج احج ‎TORI:‏ مادام اجا ‎TT‏ شح م جاه لاج اا داج الي رد اج الو اج وج جا مم ماق ‎RE om‏ ”احج ‎SR AST TT ET‏ : وغ البو بر اندض م ال اكد ره دأو ادا لد اا الا ل ل ل - بد ‎an a : TT LATTE RE Bs‏ ‎SEF COAT TARRIETTOTTS CATTOIAS TIAA‏ ‎SOTECARGUETTARSSTIUT i RE TET TENET TRE‏ مسجو حمق وح ‎rn‏ ‎ETO TT TAT RETA Re‏ = عوجت جد لجوجو ‎E20‏ لد ناح جالد لاج لشكا 8 با

   — جم

   NENHEHTEA VDA L ARAN VL REL DR FOVEDY YE NL ‏ل‎ TDR TL A%1 PRGSRNNINMIGRGGSTE DIE SE IR LE VL HEP GRE TI I TRA RL NEL FS A T LES HAR EHR QF CARL ANDINVVEL IIL ART FBLA SEAN BNL IEE LES EP LE 777 DL GI EADHEL ‏بوعل عد‎ EGR TTR ‏الع‎ LIN TPR Y DPS LE LS TAGGIN ‏اا عع و‎ ‏ال‎ VANE SEF RIVA INV PEF TRL MHL TTL TH DR DN FLY SP TAN FR PRD DL VNC ARFQPVENGLPLE CLLRS TIMER PVL IP TACECA SORE TERE THR DO THY LA TRPGVV IC YSRNE TNS AL ‏مسد توا عع دافم‎ RARCMBMPLUREDVER

   IE TO or {

   << did}

   ogy

   Teal ‏عدج‎ ‎i ‏الج مو فيط‎ ١ 3 ‏فم‎ 1 : id his ABT MIE- BED Li BAT hes Bam R Lob : 12 ‏اد‎ LEE i 0 ‏اتيم‎ 8: [oN 8 H ‏ا‎ 1 0 Fyn 0: bi : RN RN = by » 1 ‏ع‎ ‎8 ‏ا‎ ‏ا‎ ‏اال‎ 5g ogy

   ‎h —‏ جم

   ‎= Lo

   ‎A EER A TAT A AT AT A TRA T GRA OGTR FAT SU GAR CS SC TTR TRAST TARAS ‏اا‎ Tae IAS A ‏ايج‎ ACT TRAC EAA TS TRACT AEST ERI TATIRUARGAS UU TERT CASTERS ‏بلع‎ TET ‏متمد ممع‎ CAC TOA TAA TEA RAT TT TAS, TOCA TIACS TTCA0GT AT RA A RCA AT ‏تلت ترجا لق ترق الاح‎ GE AS A A TOO EA TAA TET TROT TO AGAR TTS A AT ‏ع‎ AS ‏الاج‎ TE TAT A Ta A AA A TARR AT THA OG AGA TTA TT TRA SA TT AT TET TT GA TE ‏ا حو ص ل براي‎ TAC AAT Ta TT RA A AS AGA ‏م‎ ‏عق لالتحال اا‎ A CE TT A A A Ty ORE T CTT AGT TTT IA TT TAGES A NC TROIS U TERE RT TAT ASE TANS AAT TTOC GAAS ETT TETTSS TLSTATITET AAS NGRATEECASACOSE ‏جا دجا ل لكت لجا‎ CRTRTCESACT ‏ا كنض مض ام عقت ل ل ااال الاي الوا تيال ممصم رد‎ CE AE TT ECE ‏راكد‎ Te TR ‏كرا‎ aR AS ‏كاي‎ AT TEE A ‏جع ا‎ CTE SGA ‏لوو دس ا دضو ا خرن‎ BTATG EE ‏ويج برح رج مك‎ DR ‏ا رع‎ AT TART TTR TA TTT TAC TORTIE AS AST GUT ‏وجيت‎ TE TTA ‏رخ‎ RE Ta A TR AGE TRAGER GAR AOR S TERR IGT RATS TTT TCA TEGAN TA AT AT TA BA TA TAT ARSE TT TRS AR SCATR A TETACC RE EET TAGS ES TER TARA TTT UCAS TT EARNEST ‏لقعا جا‎ SAG ‏عاد اميت ادا مالم دان‎ AAU BATTECRATIGRAGTATITCC TOGTACT ‏ويد ل د م اج الي ارج م اد لح و م دممح تق‎ ‏ححا عت‎ A ES TA I TT ‏قوع‎ RTS TA ‏ججح دع‎ RR ‏دوج جع ديع ومح‎ ‏و لح ع ات قمع رقت مجم جام رج يمون اا‎ SS TAGS ‏ل ع حت ا‎ TS NEC AS AGG Ta TEA A TE ‏مو‎ TA TT TT ‏مض عت مح‎ AGA TER ‏عمو‎ AC TOTT AA TT AAT TART TUT TANT ‏تا‎ RAT TEA RA ‏لاد‎ ATTA SOUT TRAGTEARATTIAR TT I TAT TCA Te TR AS A Te ‏م‎ TE TTL TOC TO STAR CAR TG ERA TEA TRAN TT FAR AAT FRR AA TOE CAG IST AGT ISTE ‏دق‎ ATA T RAT OAS TTA TE TATOO ARTROG I AT ‏ا ان‎ GE A A GE I AT ARE A ST RA TT RAGE EU I ARG TIA GRAT TATU TI TEE TISTE ARSE TA Te A Te ‏ابو اكد لوزي دلو ير‎ AA TTT TOG TAR AGATI TT TRS ~ 37

   ‏5 ا 0 الشكل "اب ب

   _ 7 جم سنتلل ‎IRE IL AAL‏ ا لا ااا ا ‎A RE‏ ال ‎HH DEA AN SL‏ ااا ‎Ea‏ 24 ا ‎PI TSE ICEL TV LL RRR Ey BNL TP La LF PY LP I TOE CHE FAT LEN RGVEVL VLE‏ ‎DN AGT EY LSE NE RL TON THE TOO VRE NE TET SK THUY ELA TECH Y PRY LISUET‏ ل ‎REEL‏

   EL PF TROPA ‏طم اا لو تا لما الوه ار‎ HE RFE ‏كين‎ LORD LFF IEGUDEL TLNEETI ATGVSARTESSATERLARNLFS ‏يع‎ IRE SIE ‏ل‎ TVD TR ET THR ‏ل‎ NET IY LER GED EEL I THR TH LE TEA EV LL BLL I A CI I A A REN DG ENT LA TAPGYYV VI Y DENY WANT LRCHEIEVIEV LS SEL SRG PRONE TSHETPTIVRRDT a= Le i ol I ‏نشكا‎

   PRL

   - ‏م‎ q — A I 1 faexkDe wp Lote ASA ogy

   _ h «= 'Y Yao BD) ‏ان"‎ 5 Ae ‏ب‎ ‎A a - a ‏أن تت‎ ً ‏ف‎ ‎1 & | a ‏اوري سيد‎ 1 ‏سيا‎ PAA 0 TW ‏ا‎ 0 ‏بس 1 لمج‎ REEL GAN BN SEE 8 : EE Su Bras a NN - 0 ‏سخ"‎ 3 ‏ا ايلا‎ LIES ٍ RY I ‏اس‎ ‎a 1 pd 3 0 ‏اللي‎ 0 z i! A Ya vy ‏الشكل؟ة‎

   3 0 % 2 3

   ا ال ا

   ‎oh .‏ ا ‎a=‏ ‏1 ا

   ‎- seeses EE.

   ‎ARTA ‎ogy

   ا ‎RE J‏ وات 55 ‎NE SF‏ ‎BH‏ 0 ‎Bug‏ 2&0 جه | ' ‎PR ef‏ ‎100ug‏ يق ~~ ]1 تا للح 7 ‎rrr = Cr nen‏ نالا ‎Tog Lb pes‏ ‎BAT EUG‏ « حل ‎gr va‏ في ‎IY‏ ‎1000ug‏ صنخ - - «:- ‎ied He‏ ‎i‏ ب ‎IS‏ 2 ]1 ‎A JE i‏ ا ‎EE - FE‏ ‎Rt‏ 1 ‎i‏ 3 ا ااا ‎roa Sa‏ ‎ite‏ 3 1 ذا ‎ALLL Lisa‏ : 1 : بسن = م« ‎LL‏ ‎VY FY or oo WA‏ « ‎yy J‏ ‎ogy‏

   مدة سريان هذه البراءة عشرون سنة من تاريخ إيداع الطلب وذلك بشرط تسديد المقابل المالي السنوي للبراءة وعدم بطلانها أو سقوطها لمخالفتها لأي من أحكام نظام براءات الاختراع والتصميمات التخطيطية للدارات المتكاملة والأصناف النباتية والنماذج الصناعية أو لائحته التنفيذية صادرة عن مدينة الملك عبدالعزيز للعلوم والتقنية ؛ مكتب البراءات السعودي ص ب ‎TAT‏ الرياض 57؟؟١١‏ ¢ المملكة العربية السعودية بريد الكتروني: ‎patents @kacst.edu.sa‏